ELEMENTOS PROMOTORES NOVEDOSO® I?EETOlDOS DE RAÍZ Y MÉTODOS DE USO
DESCRIPCIÓN DE IA INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de la biología molecular vegetal/ más particularmente a la regulación de expresión de genes en vegetales. La expresión de secuencias de ADN en un huésped vegetal es dependiente de la presencia de un promotor enlazado operablemente que es funcional dentro del huésped vegetal. La selección de la secuencia promotora determinará cuando y donde dentro del organismo se expresa la secuencia de ADN. Así, en donde se desea la expresión continua a través de la células-vegetal, se utilizan promotores constitutivos. En contraste, en donde se desea la expresión del gen en respuesta a un estímulo, los promotores inducibles son los elementos reguladores de selección. En donde se desea la expresión en órganos o tejidos particulares, se utilizan promotores preferidos de tejido. Además del promotor de núcleo, pueden incluirse secuencias reguladoras o elementos promotores corriente arriba y/o corriente abajo de la secuencia promotora de núcleo pueden incluirse en construcciones de expresión de vectores de transformación para efectuar diversos niveles de expresión de secuencias de nucleótidos de interés en un vegetal transgénico. Frecuentemente es deseable tener la expresión
preferida de un tejido de una secuencia de ADN en órganos o tejidos particulares de un vegetal. Por ejemplo, la resistencia aumentada de un vegetal a la infección por patógenos transportados por tierra y por aire pudiera lograrse por la manipulación genética del genoma del vegetal para comprender un promotor preferido de tejido enlazado operablemente a un gen de resistencia a patógenos tal que las proteínas de resistencia a patógenos se expresan en el tejido vegetal deseado. Alternativamente, podría ser deseable inhibir la expresión de una secuencia de ADN nativo dentro de un tejido de vegetal para lograr un fenotipo deseado. Un número de laboratorios ha identificado elementos promotores y proteínas de enlace a ADN correspondientes que se limitan a tejidos específicos dentro del vegetal (véase* por ejemplo Weising, et al Z. Naturforsch C4ß:l; Oeda, et al EMBO J. 10:1793; Ta atsuji, et al EMBO J 11:241; Yanagisawa, et al Plant Mol. Biol. 19:545; Zhou, et al J. Biol. Chemr 267:23515; Consonni, et al Plant J. 3:335; Foley, et al Plant J. 3:669; Matsuoka et al Proc. Nati. Acad. Sci. 90:9586). Es probable que un gran numero de factores de enlace a ADN se limitaran a tejidos, condiciones ambientales o etapas de desarrollo específicas. Se considera importante por aquellos expertos en la técnica desarrollar unidades reguladoras de transcripción que restrinjan la expresión de gene a algunos tenidos de un vegetal. La capacidad para impulsar la
--'íores ón de genes eseecificos ?e tenido en vegetales se -onsi era que es de .mr rtcr.cia -.aronomica para aquellos exDertos en la técnica. Hasta ahora, Id regulad- r de la expresión de genes en raíces vegetales no se ha estudiado extensamente a pesar de la importancia de ^a ra " er el desarrollo de vegetales. En alg n grado esto ee atribúlele a una falta de funciones bioquímicas específicas de raí: fácilmente disponibles cuyos genes puedan clonarse, estudiarse y manipularse. Alterar genéticamente los vegetales a trabes del uso de técnicas de ingeniería genética y producir asi un vegetal con rasgos útiles requiere la disponibilidad de una diversidad de promotores . Una acumulación de promotores permitiría al investigador diseñar moléculas de ADN recombmante que sean capaces de expresarse en los niveles deseados y localidades celulares. Por lo tanto, una colección de promotores preferidos de tejido permitiría expresar un nuevo rasgo en el te" nc deseado. río n_ descrito elemento o elementos promotores que confieran específicamente la expresión preferida de ra.z. 5e han descrito elementos cortos que pueden contribuir a _a e^ ees-.i preferida de raíz; sin encalco, . : ce ?a ree-r~ad- _a identificación de las sect encías e_. e _f_c„c _eer ~ "£'.c_ -~ cara la expresión del gen =. c r. — . .:: í- _ __ 1- - -i t -_ . _ ^ ?rcc . Na ti . Acad. Sci .
t^ \ 8f-:789n véase tañóle" Diipl^f et al (1989) Mol Cell 3? cl . 9 : 2944-2949; N___ ard 3?..;_ran (1994) Nuclei c Acid Res . 2;?í 4 69-497; Oeda, et -1 EIIBO J. 10:1793; y Catron et al . (1993) Mol . Ce-1 £_o__. 13 : 222-1-2365). Asi, los métodos / composiciones dirigidas a a identificación, aislamiento v caracterización de promotores y elementos promotores que ruedan servir como regiones reguladoras para la expresión preferida de raíz de las secuencias de nucleotxdos de irteres se necesitan para la manipulación genética de los vegetales. Se proporcionar las composiciones y métodos para regular la expresión de secuencias de nucleótidos en un vegetal. Las composiciones comprenden secuencias de nucleotido novedosas de elementes promotores preferidos de tejido, particularmente preferidos de raíz (los RPE) y las unidades reguladoras de transcripción que comprenden los elementos promotores. Mas particularmente, se proporcionan promotores vegetales que comprenden _mo o más RPE que mejoran c suprimen la e-cpces op dirigida cor el promotor. Se proporcionan metidos para identificar y aislar elementos promotores de vegetales preferidos de tejido. Se orepercí - ?an tifcr:ac; cara expresar una secuencia de nc.ectidcs er . e * ~al _t_l?zando las secuencias prometer s "les:.-1"^, - _c c.-= : e. Los métodos comprenden :rars:crr.-r ~ --_ _- r__.-_- _ cr, un vector de
transformación que comprende ,r. secuencia de nucleótidos enlazada operablemente a uno le _:s promotores vegetales de la presente invención y regenerando un vegetal establemente ' transformado a partir de la célela vegetal transformada. En esta forma, pueden controlarse los niveles de expresión en una célula vegetal, órgano vegetal, tejido vegetal o semilla del vegetal . También se proporcionan vegetales, semillas y células vegetales transformadas que comprenden las unidades reguladoras de transcripción y les elementos promotores. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Fisura 1 representa secuencias seleccionadas para oliganucleótidos a partir de la Biblioteca de Oligonucleótidos Aleatoria (ROL) . La Figura 2 representa les resultados de la prueba transiente para la expresión de CRC en raíces, con construcciones que comprenden secuencias ROL seleccionadas. La Figura 3 representa les resultados de la prueba transiente para la expresión de CRC en brotes, con construcciones que comprenden sec encias ROL seleccionadas. Las composiciones de la presente invención se dirigen a secuencias ce nucleec^ees novedosa para elementos tejiae= preferidos, earfi ei. rre cte para elementos promotores preferidcs de ra_c _=s ??? promotores vegetales, que comprenden 2e= e_e~e. t.s pr^m-t _ec. Los elementos promotores
ie la invención pueden ..sar=e en combinación con un promotor :> * región regulador» ae transcr pción para dirigir la expresión en tejidos particulares ^ modular los niveles de transcripción de una secuencia ie nucleótidos operablemente enlazada. Esto es, los elementos promotores son útiles para mejorar o suprimir ia exprés cn de una secuencia operablemente enlazada. Como se utiliza en la presente, el término "vegetal" incluye la referencia a vegetales completos y SU progenie; células vegetales; partes y órganos vegetales, tales como embriones, polen, óvulos, semillas, flores, granos, maíz, mazorcas, espigas, hojas, cascaras, pedúnculo, tallos, raíces, puntas de raíz, anteras, seda y similares. La célula vegetal, como se utiliza en la presente, incluye adicicnalmente, sin limitación, células obtenidas a partir de o encontradas en: semillas, cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemat ca=, tejido de callo, hojas, raíces, brotes, ganetofitos, esporofitos, polen, y microsporos. También onece entenderse que las células vegetales incluyen células modificadas, tales como protoplastos, obtenidos a partir ?e los tejidos anteriores. La ciase de vegetales rae cveue .serse en los métodos de la invención es generalmente tan amplia como la clase de vegetales supere eres c.at^.e= para técnicas de trans ormable."., _rrcu„er. "s erales monocotiledónecs y
-.dicotiledóneos. Un vegetal particularmente preferido es Zea mays . Por "preferido de tejido" se quiere decir que la expresión impulsada por un promotor vegetal se mejora o suprime selectivamente en células o tejidos vegetales particulares, en comparación con otras células o tejidos. Por "preferido de raíz" se quiere decir que la expresión impulsada por un promotor vegetal se mejora o se suprime selectivamente en células o tejidos de raíz, en comparación a una o más células o tejidos sin raíz. Los tejidos de raíz incluyen pero no se limitan a al menos una tapa de raíz, meristemo apical, protodermo, meristemo base, procambio, endodermis, corteza, corteza vascular, epidermis y similares. Las raíces incluyen raíces primarias, laterales y adventicias. Por "elemento promotor preferido de raíz" o "RPE" se quiere decir un elemento promotor que mejora o suprime la expresión impulsada por un promotor en una célula vegetal en una forma preferida de raíz. Por "promotor" o "región de iniciación de transcripción" se quiere decir una región reguladora de ADN que comprende normalmente una casilla TATA capaz de dirigir el ARN polimerasa II para iniciar la síntesis de ARN en el ** sitio de iniciación de transcripción apropiado para una secuencia de codificación particular. Un promotor puede
comprender adicionalmente otras secuencias de reconocimiento generalmente indicadas corriente arriba o 5' a la casilla de TATA, y refiriéndose como "elementos promotores"- que influencian la expresión impulsada por el promotor de núcleo, 5 Los elementos promotores ubicados corriente arriba o 5' a la casilla TATA también se refieren, a elementos promotores corriente arriba. En modalidades particulares de la invención, los elementos promotores de la invención se colocan corriente arriba o 5' a la casilla TATA. Sin embargo,
10 la invención también abarca configuraciones de promotores vegetales en las cuales los elementos pifomotores se colocan corriente abajo o 3' hacia la casilla TATA. Por "unidad reguladora de transcripción" se quiere decir un promotor que comprende uno o más elementos
15 promotores. Por "promotor del núcleo" se quiere decir un promotor que no comprende elementos promotores distintos a la casilla TATA y el sitio de inicio de transcripción. Las unidades reguladoras de transcripción de la
20 invención comprenden los RPE, cuando se enlazan operablemente a una secuencia de nucleótidos de interés y se insertan dentro de un vector de transformación, controlan la expresión preferida de raíz de la secuencia de nucleótidos enlazada en las células de un vegetal establemente transformado con este
25 vector. Esto es, la expresión de esta secuencia enlazada se
n?tf*
mejora o suprime en célalas o tej - os de raíz en comparación a una o mas células o tejidos sin raíz, y en comparación a células o tejidos no transformados. Mientras que la secuencia de nucleótidos enlazada de interés es heterólcga a la secuencia del elemento promotor, puede ser nativa o extraña al huésped vegetal. La invención abarca la expresión de secuencias de codificación nativas, particularmente las secuencias de codificación relacionadas al fenotipo de resistencia a patógenos, enlazada a un promotor de la invención. El uso de los elementos promotores para expresar las secuencias de codificación nativas alterará al fenotipo del vegetal o célula vegetal transformada. Los elementos promotores de la invención pueden usarse con cualquier promotor, particularmente promotores vegetales. Tales promotores pueden ser nativos o sintéticos.
Por "promotor vegetal" se quiere aecir un promotor capaz de impulsar la expresión en una célula vegetal. En referencia a un prom.ctor, por "nativo" se quiere decir un promotor capaz de impulsar la expresión en una célula de interés, en donde la secuencia del nucleótido del prcmctor se encuentra en la c lula de interés en la naturaleza. ?e referencia _. _*r. prem.eter o región de iniciación de :r.e=:__rcr;:, e:r "s?r_tec_e~' -e auiere decir un promotor
capaz de impulsar la expresión en una célula de interés, en donde la-" secuencia de nuciectidos del promotor no se encuentra en la naturaleza. Un promotor sintético no puede aislarse a partir de ninguna célula a menos que se introduzca primero a la célula o a un ancestro de la misma. La invención abarca composiciones de ácido nucleico aislado o sustancialmente purificado que comprende combinaciones novedosas de elementos promotores, y unidades reguladoras de transcripción con elementos promotores. Particularmente, las secuencias de nucleótidos para los RPE se proporcionan incluyendo, RPE 15 (SEC. DE IDENT. N0.:1), RPE 14 (SEC. DE IDENT. N0.:2), RFE 19 (SEC. DE IDENT . NO.:3), RPE 29 (SEC. DE IDENT. NO.: 4), RFE 60 (SEC. DE IDENT. NO.: 5), RPE 2 (SEC. DE IDENT . NO.: 6), RPE 39 (SEC. DE IDENT. NO.: 7) y RPE 61 (SEC. DE IDENT. NO.:8). Una molécula de ácido nucleico "aislada" o "purificada" o porción biológicamente activa de la misma está sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recembinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetiza químicamente. Les elementes prometeres de la invención pueden actuar como mejoradores o supre=ores de expresión. Esto es, los elementes prcm.eteres d- esta invención pueden mejorar o _.— ^;_-_G Ü; de nucieótidos enlazadas operablemente a .:. prcm.eteres "e étales que comprenden los
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elementos promotores dependiendo de la selección del promotor particular, la construcción particular y la célula huésped. Los mejoradores son secuencias de nucleótidos que ! actúan para mejorar o aumentar la expresión dirigida por una región promotora. Este aumento o me oría puede determinarse al comparar el niver de expresión dirigido por un promotor de * muestra que comprende un mejorador putativo colocado en cualquier posición corriente arriba o corriente abajo del promotor, con relación a un promotor control que no comprende un mejorador putativo. Se conocen en la técnica elementos mejoradores para vegetales que incluyen, por ejemplo, la región ejoradora SV40, elemento mejorador 35S, y similares. Ejemplos particulares de los RFE de la invención que actúan como mejoradores incluyen RPE 14 ^SEC. DE IDENT. NO.:2), RPE 19 (SEC. DE IDEN . NO.: 3), RPE 29 (SEC. DE IDEN . NO.:4), RPE 60 (SEC. DE IDENT. NO.: 5), RPE 2 (SEC. DE IDENT . NO.: 6), y RPE 61 (SEC. DE IDENT. NO.:8), como se describe en el Ejemplo 3 posteriormente. Por "supresores" se quiere decir secuencias de nucleótidos que median la supresión o disminución en la expresión dirigida por una región promotora. Esto es, los supresores son los sitios de AEX a través de los cuales las proteínas represoras ue transcr__pc?ón ejercen sus efectos. Los =upresores oeeaen mediar _a supresión de la expresión al eno. s_ ... re ?n_c?e .e transcripción o sitios
activadores de transcripción, o pueden mediar la supresión de distintas ubicaciones con respecto a. estos sitios. Ejemplos particulares de un RPE de la invención que actúa como un supresor incluyen R?E 15 (SEC. DE IDENT. N0.:1) y RPE 39 (SEC. DE IDENT. MO. : ~¡ ) . La invención abarca los RPE multiméricos. Por "RPE multimérico" se quiere decir en la presente un elemento promotor que comprende una primera copia de un RPE de la presente invención, o un fragmento o variante del mismo; y al menos una segunda copia de un RPE de la presente invención, o un fragmento o variante del mismo. La invención también abarca promotores que comprenden los RPE multiméricos. Los RPE multiméricos incluyen pero no se limitan a aquellos que comprenden dos o más copias del mismo RPE; aquellos que comprenden una o más copias de al menos dos diferentes RPE; y cualquier combinación de fragmentes y variantes de los mismos. En este aspecto de la presente invención, cada RPE individual podría estar en ia erientación antisentido. Por "orientación" se quiere decir la configuración 51 a 3'
.sentido; o la (antisentido) de una secuencia de elemento promotor contenida en una hebra contigua, en relación a la configuración ue otres elementos promotores y/o la casilla TATA conteniea en esa eeora. La invención acarea _es RPE multiméricos en los cuales les elementes ccemeteres _.: .i'^iduales de la invención
se separan y/o flanquean por secuencias espaciadoras. Por "secuencia espadadora" se quiere decir la secuencia de nucleótidos contenida en un RPE multimérico que no es una secuencia de elemento promotor. La invención también abarca los RPE multiméricos que comprenden multímeros contiguos de elementos promotores individuales, no conteniendo con eso secuencias espaciadoras; las RPE multiméricas en las cuales uno o más elementos individuales se separan o flanquean por secuencias espaciadoras; y los RPE multiméricos que comprenden secuencias espaciadoras que son diferentes de las secuencias espaciadoras descritas en la presente. Los RPE pueden enlazarse operablemente a cualquier promotor de interés. Mientras que no es una limitación, puede ser preferible usar promotores de núcleo. Los promotores, particularmente los promotores de núcleo de interés, pueden derivarse de una diversidad de fuentes. Los promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, el promotor de núcleo del Rsyn7 (Patente Norteamericana No. 6,072,050); el promotor CaMV35S de núcleo (Odell et al . (1985) Nature 313: 810-812 ) ; actina de arroz (McElroy et al (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen et al . (1989) Plant Mol . Biol . 12:619-632 y Christensen et al . (1992) Plant Mol . Biol . 18:675-689); pEMU (Last et al . (1991) tneor. Appl . Genet . 81:581-588); MAS (Velten et al . (1984) EMBO J. 3:2723-2730) ; promotor ALS (Patente Norteamericana
No. 5,659,026), y similares. Otros promotores constitutivo incluyen, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466/785; 5,399,680; 5,268,463; y 5,608,142. Las secuencias de RPE aisladas de la presente invención, y las secuencias promotoras vegetales f» ^ comprenden las RPE, pueden modificarse para proporcionar u& rango de expresión de niveles de la secuencia de nucleótidos de interés. Así, puede utilizarse menos de las regiones promotoras completas y retenerse la capacidad para impulsar la expresión de la secuencia de codificación. Sin embargo, se reconoce que los niveles de expresión de ARNm puede» disminuirse con las sustracciones de las porciones de las secuencias promotoras. Igualmente, puede cambiarse la naturaleza general de la expresión. Las modificaciones de las secuencias de los elementos promotores de la presente invención y de las secuencias promotoras vegetales que comprenden los elementos promotores pueden proporcionarse para un rango de expresión. Generalmente, por "promotor débil" se quiere decir un promotor que impulsa la expresión de una secuencia de codificación a un ba o nivel. Por "bajo nivel" se quiere decir niveles de aproximadamente 1/10,000 copias hasta aproximadamente 1/100,000 copias hasta aproximadamente 1/500,000 copias. Inversamente, un promotor fuerte impulsa la
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expresión de una secuencia de codificación a un alto nivel, o a aproximadamente 1/10 copias nasta aproximadamente 1/100 copias hasta aproximadamente 1/1,000 copias. Las secuencias de nucleótidos para los promotores vegetales de la presente invención pueden comprender las secuencias indicadas en las SEC. DE IDENT. NOS.: 1-8 o cualquier secuencia que tenga identidad sustancial con las secuencias. Por "identidad sustancial" se quiere decir una secuencia que presenta equivalencia funcional y estructural sustancial con la secuencia indicada. Cualquier diferencia funcional o estructural entre las secuencias sustancialmenté idénticas no afecta la capacidad de la secuencia para funcionar como un promotor como se describe en la presente invención. Así, el promotor vegetal de la presente invención dirigirá la expresión preferida de raíz mejorada o reprimida de una secuencia de nucleótidos enlazada operablemente. Se consideran dos secuencias de nucieótidos RPE sustancialmente idénticas cuando tienen al menos aproximadamente 80%, de preferencia al menos aproximadamente 85%, de mayor preferencia al menos aproximadamente 90%, aún de mayor preferencia al menos aproximadamente 95%, y de mayor preferencia al menos aproximadamente 98% de identidad de la secuencia. Les fragmentes p cariantes de las secuencias de nucleotides PFE indicadas en la presente están también
lo
abarcadas por ia presente invención. Los promotores que comprenden fragmentos cíologicamente activos de los RPE de la invención también están abarcados por la presente invención. Por "fragmento" se quiere decir una porción de la secuencia de nucleótidos del elemento promotor que es más corta que la secuencia del elemento promotor de longitud completa. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden retener la actividad biológica y en consecuencia mejorar o suprimir 1.a expresión de una secuencia de nucleótidos enlazada operablemente a un promotor que comprende el fragmento del elemento promotor. Alternativamente, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos que son útiles como sondas de hibridización o cebadores PCR generalmente no retienen la actividad biológica. Así, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden variar de al menos aproximadamente 15, 20 o 25 nucleótidos, y hasta pero no incluyendo la longitud completa de una secuencia de nucleótidos de la invención. Puede prepararse una porción biológicamente activa de un promotor que comprende el fragmento del elemento promotor de la invención sintetizando un promotor que comprende una porción de una de las secuencias de RPE y valorando la actividad del fragmento. La invención abarca variantes de los RPE y de los promotores vegetales que comprenden los RPE. Por "variantes" se su ere decir sec .encías s-=tanciaimente idénticas. Las
variantes que ocurren naturalmente de las secuencias del elemento promotor pueden identificarse y/o aislarse con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, como* por ejemplo, con técnicas de PCR e hibridización como se delinea posteriormente. La invención abarca las variantes de los RPE y las secuencias promotoras vegetales descritas en la presente en las cuales los elementos promotores de la invención se sustituyen por una variante natural de ese elemento. Las variantes también abarcan las secuencias de nucleótidos sintéticamente derivadas, tales como aquellas generadas por mutagénesis dirigida al sitio o síntesis de oligonucleótidos automatizada. Los métodos para mutagénesis y alteraciones de la secuencia de nucleótido son bien conocidos en la técnica. Generalmente, las variantes de las secuencias de nucleótidos RPE de la invención tendrán al menos 80%, preferiblemente 85c, 90o, 95 , hasta 98% o más de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótido de RPE de la invención. Las variantes biológicamente activas de las secuencias de elementos promotores deben retener la actividad reguiadora promotora y asi me-erar o suprimir la expresión de una secuencia de nucleótides eperablemente enlazada a una unidad reguiadora ae transcripción que comprende elelemento promotor. La actividad prometerá puede medirse por análisis
de Northern blot. Véase por ejemplo, Sambrook et al . (1989) Mol ecular Cloning: A Labora tory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laooratory Press, Plamvievv, New York), incorporada eíi la presente para referencia. La expresión de proteínas indicativa de la actividad promotora puede medirse determinando la actividad de una proteína codificada por la secuencia de codificación enlazada operablemente al promotor particular; que incluye pero no se limita a tales ejemplos como GUS (b-glucoronidasa; Jefferson (1987) Plant Mol . Biol . Rep . 5:387), GFP (proteína de fluorescencia verde); Chalfie et al . (1994) Science 263:802), luciferasa (Riggs et al . (1987) Nucieic Acids Res . 15 (19) : 8115 y Luehrsen et al . (1992) Methods Enszymol . 216:397-414) , y los genes de maíz que codifican la producción de antocianina (Lud ig et al .t (1990) Science 247:449) . La invención también abarca secuencias de nucleótidos que se hibridizan a las secuencias del elemento promotor de la invención bajo condiciones severas, y mejoran o suprimen la expresión de una secuencia de nucleótidos enlazada operablemente a una unidad reguladora de transcripción que comprende el elemento promotor. Se conocen métodos de hibpaización en la técnica. Véase por ejemplo Sambrook et al . (1989) Molecul ar Zl oning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Earbor Lacoratory Press, Plainvie , New York) . Véase también Innis e ._ . , ;i990) PCT Prctccols ;
A Guide to Methods and Applica tions (Academic Press, New York); Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); e Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York) . Por 'condiciones severas' 'condiciones de* hibridización severas" se quiere decir condiciones bajo las cuales una sonda se hibridizará con su secuencia objetivo a un grado detectablemente mayor que a otras secuencias (por ejemplo al menos dos veces sobre la base) . Las condiciones severas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Al controlar la severidad de las condiciones de hibridización y/o lavado pueden identificarse secuencias objetivo que sean 100% complementarias con la sonda (sondeo homólogo) . Alternativamente, pueden ajustarse las condiciones de severidad para permitir algún desajuste en las secuencias de manera que se detecten grados de identidad inferiores (sondeo heterólogo) . Generalmente, una sonda es de menos de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, preferiblemente menos de 500 nucleótidos de longitud. Típicamente, las condiciones severas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menor de aproximadamente 1.5 M de ion Na, en forma típica de aproximadamente 0.01 a 1.0 M de concentración de ion Na (ü otras sales) a pH 7.0 hasta 8.3 y la temperatura es al menos
30°C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50
^^wfteoti o ) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleótidos) . Las condicionef severas st| ?Bfoién pueden lograrse con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Ejemplos de condiciones de baja severidad incluyen ibrídázación con u solución reguladora de 30 a 35% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS (dodecil sulfato sódico) a 37°C, -y un lavado en IX a 2X de SSC (20X SSC = 3.0 M de HaCl/0.3 M de citrato trisódico) de 50 a 55°C. Ejemplos de condiciones de seveáricteel moderada incluyen la hibridización en 40 45% de formamida
1.0 M de NaCl, 1% de SDS a 37°C, y un lacdo en 0.5X a IX de SSC de 55 a 60°C. Ejemplos de condiciones de? alta severidad incluyen la hibridización en 50% de farma iaa, 1 M de NaCl, 1% de SDS a 37°C, y un lavado en 0.1X de SSC ée 60 a 659C . La duración de la hibridización es generalmente menos de aproximadamente 24 horas, usualmente aproximadamente 4 a
'aproximadamente 12 horas. La especificidad es típicamente la función de los lavados pos-hibridización, siendo los factores críticos la concentración iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para híbridos ADN-ADN, la Tm puede aproximarse de la ecuación de Memkoth y Wahl (1984) Anal . Biocheé. 138:267-284: la Tm = 81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (% GC) 0.61 (% de form)-500/L; donde M es la molaridad de los cationes
*
v ">f?pn?valentes, de GC es el por ciento de nucleótidos d<| guanosma y citosina en el AEN, de form es el por ciento de ,, formamida en la solución de hibriaización, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La T es la temperatura (bajo <<t 5. concentración iónica definida y pH) a la cual 50% de una , secuencia objetivo complementaria se hibridiza a una sonda perfectamente ajustada. La T se reduce en aproximadamente 1°C durante cada 1 de desajuste; así, las condiciones de Tt,,' hibridización, y/o lavado pueden ajustarse para hibridizar a - 10 las secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con =90 de identidad, la Tm puede disminuirse 10°C. Generalmente, se seleccionan las condiciones de severidad para estar aproximadamente 5°C menores que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia 15 específica y su complemento en una concentración iónica definida y pH. Sin embargo, las condiciones rigurosamente severas pueden utilizar una hibridización y/o lavado a 1, 2, 3, o 4°C menos que el punto de fusión térmico (T,,) ; las condiciones moderadamente severas pueden utilizar una 20 hibridización y/o lavado a 6, "", 3, 9, o 10°C menos que el- punto de fusión térmico (T ; las condiciones de baja severidad pueden utilizar una hibridización y/o lavado a 11, 12, 13, 1-i, 15, e 20°C menos mu el punto de fusión térmico (T > . Usando la ecuacicn, las cemposiciones de hibridización 25 y lavado, y 1 eseada, aqeelles con experiencia común
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entenderán que se describen inherentemente las variaciones en la severidad de la hibridización y/o soluciones del lavado* Si el grado deseado de desajuste resulta en una Tm de menos de 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida) , se prefiere aumentar la concentración de SSC de manera que pueda usarse una temperatura superior. Una guía extensa a la hibridización de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization wi th Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, New York); y Ausubel et al . , eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York) . Véase Sambrook et al . (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York) . En general, la invención comprende secuencias que son al menos aproximadamente 80% homologas con las secuencias descritas en la presente y tienen actividad promotora © mejoradora. Para determinar el grado de identidad de dos secuencias, los métodos de alineación son bien conocidos en la técnica. Así, la determinación de por ciento de identidad entre dos secuencias cualquiera puede lograrse usando un algoritmo matemático. Ejemplos no limitantes preferidos de tales algoritmos matemáticos son el algoritmo de Myers and
Mol . Bíoí. 48:443-453; el método de búsqueda de similaridad de Pearson and Lipman (1988) Proc. Nati . Acad. Sci . 85:2444- 2448; el algoritmo de Karlin and Altschul (1990) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 872264, modificado como en Karlin and Altschul (1993) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 90:5873-5877. Pueden utilizarse implementos de computadora de estos algoritmos matemáticos para la comparación de las secuencias para determinar la identidad de secuencias. Tales implementos incluyen, pero no se limita a: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible a partir de Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Versión 8 (disponible a partir de Genetics Computer Group (GCG) , 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA) . Las alineaciones que usan estos programas pueden realizarse usando los parámetros de omisión. El programa CLUSTAL está bien descrito por Higgins et al . (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins et al . (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al . (1988) Nucleic Acids Res . 16:10881-90; Huang et al . (1992) CABIOS 8:155-65; y Pearson et al . (1994) Meth . Mol . Biol . 24:307-331. El programa ALIGN se basa en el algoritmo de Myers y Miller (1988) supra . Puede usarse una
tabla de residuo de peso PAM12r, una sanción de longitud de intervalo de 12, y una sanción de intervalo de 4 pueden, usarse con el programa ALIGM cuando se comparan las secuencias de aminoácidos. Los programas BLAST de Altschul et al (1990) J. Mol . Biol . 215:403 se basan en los algoritmos de Karlin y Altschul (1990) supra . La búsqueda de nucleótidos BLAST puede realizarse con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabras = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homologas a una secuencia de nucleótidos que codifica una protema de la invención. La búsqueda de proteínas BLAST puede lograrse con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabras = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a una proteína o polipéptido de la invención. Para obtener alineaciones en intervalos para propósitos de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en Altschul et al . (1997^ Nuclei c Acids Res . 25:3389. Alternativamente, puede usarse PSI-BLAST (en BLAST 2.0) para realizar una búsqueda repetida que detecta las relaciones distantes entre las moléculas. Véase Altschul et al . (1997) supra . Cuando se utiliza BLAST, Gappeo BLAST, PSI-BLAST, los parámetros de omisión de ios programas respectivos (por ejemplo, BLA-STN para secuencias de nuclecti es, ?LASTX para proteínas) pueden usarse. "ease ntt : »'^.r.ce? . l .nih.gov. La alineación tamrier. puede realizarse i- nu me te por inspección.
Para propósitos de la presente invención, la comparación de la secuencia de nucleótidos o proteínas para la determinación del por ciento oe identidad de secuencia con las secuencias descritas en la presente se hace preferiblemente usando el programa BLASTN (BLAST Versión 2 o posterior) con sus parámetros de omisión, o cualquier programa de comparación de secuencias equivalentes. Por "programa equivalente" se quiere decir cualquier programa de comparación de secuencias que, para dos secuencias cualquiera en cuestión, genera una alineación que tiene ajustes de residuos de nucleótidos o aminoácidos sustancialmente idénticos y un por ciento de identidad de secuencia sustancialmente idéntico cuando se compara con la alineación correspondiente generada por el programa preferido. Como se utiliza en la presente, "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico hace referencia a los residuos en las dos secuencias que son las mismas cuando se alinean para correspondencia máxima durante una ventana de comparación especificada. El término "identidad sustancial" de las secuencias de poimucleótidos quiere decir que un polinucleótido comprende una seeuenca que tiene ai menos 80% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 85%, de mayor preferencia a_ er.cs "^ , a_r_ de ->a\or preferencia al menos
95 , y de mayor preferencia al menos 98%, en comparación a una secuencia de la invención usanao uno de los programas de alineación descritos anteriormente usando parámetros estándar o de omisión. Otro indicio de que las secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas es si dos moléculas se hibridizan una con otra bajo condiciones severas. Generalmente, las condiciones severas se seleccionan para ser aproximadamente 5°C menos que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una concentración iónica definida y pH. Sin embargo, las condiciones severas abarcan temperaturas en el rango de aproximadamente 1°C hasta aproximadamente 20°C, dependiendo del grado deseado de severidad como se califica de otra forma en la presente. La invención proporciona métodos para identificar y aislar elementos promotores vegetales preferidos de tejido, que incluyen pero no se limitan a los elementos promotores preferidos de raíz. Los métodos de identificación y aislamiento de la invención se dirigen a la construcción y uso de bibliotecas de oligonucieótidos aleatorias (las ROL) , enlazando los oligonucleótidos con proteínas a partir de extractos nucleares crudos a partir de un tejido vegetal de interés, separando p aislando ecm.plejos enlazado en geles de prueba de cambio le movilidad electroforética (EMSA) , in o les cligcr.ucleot dcs enlazados a partir de
ransos de movilidad electrofcr tica específicos; repitiendo, el ciclo de enlace, separando, aislando, amplificando; y comparando la cantidad de formación de compuesto enlazada en 1 ?. ciclos progresivos para un rango de movilidad electroforética particular. En esta forma, en donde un rango particular presenta formación de complejo aumentada en ciclos progresivos, ese rango se valora para comprender loS promotores preferidos de tejido deseado. Pueden aislarse oligonucleótidos individuales a partir de esta población • enriquecida por clonación, enlazada operablemente con n promotor, y valorada para mejoramiento o represión de lá f expresión dirigida por el promotor. Aquellos oligonucleótidos capaces de mejorar o reprimir la expresión en una forma preferida de tejido se identifican como promotores preferidos de tejido, y se determina su secuencia. Las propuestas conocidas para identificar y aislar elementos promotores específicos de tejido a partir de secuencias promotoras son generalmente de mucho trabajo. Tales propuestas normalmente comienzan identificando los genes que están diferencialmente regulados, usando, por ejemplo, métodos de selección de biblioteca de ADNc diferenciales o sustractivoe e PCR basada en exhibición diferencial. Véase Liar.i and Pardee (1992) Science 257:967-971; eharina and Davis 1995 Pl ar. z Mol . Biol . 29:91-98. Estas ore :t?a*^ — _i idas por la clonación de
secuencias de flanqueo 5' genó icas que corresponden al ADNc deseado y terminando con una disección exhaustiva de las secuencias de flaqueo por medio de la interacción con factores -que actúan trans o pruebas de expresión funcional. En otros métodos conocidos, los sitios de enlace
ADN de los factores que actúan trans conocidos se determinan' usando métodos de enriquecimiento de enlaces repetitivos con bibliotecas de oligonucleótidos aleatorios. Véase, por ejemplo, Catron et al . (1993) Mol . Cell Biol . 13:2354-2365; Ko and Engel (1993) Mol Cel Biol 13:4011-4022; Niu and Guiltinan (1994) Nucleic Acid Res . 22:4969-497; Norby et al . (1992) Nucleic Acids Res . 20: 6311-6321 ; Oliphant et al (1989) Mol . Cel Biol . 9 : 2944-2949. Estas propuestas dependen de la disponibilidad de factores de enlace a ADN purificados o anticuerpos dirigidos a los factores de enlace ADN. Nallur et al . (1996) describe una técnica de selección múltiple (MuST) que enriquece los sitios de enlace del factor de transcripción a partir de una ROL usando extractos nucleares crudos. W097/44448 describe la utilización de las ROL y extractos nucleares para generar bibliotecas preferidas de tejido de elementos promotores, seleccionando elementos que enlazan extractos nucleares a partir de un tejido preferido, pero no otros tejidos. Otros han explotado las propuestas paralelas masivas de expresión perfilando y secuenci'ando el genoma completo para identificar
fl Sientos cis, comunes a los genes coordinadamente coátrolados. Véase Roth et ai. (1998) Nature Biotech 16: 939- 945. Los métodos de aislamiento e identificación de la presente invención no son dependientes de las secuencias genómicas, conocimiento previo de los factores que actúan trans particulares, o disponibilidad de los factores de enlace a ADN purificados o anticuerpos dirigidos a los factores de enlace a ADN para la identificación y aislamiento de los elementos promotores preferidos de tejido. Además, debido a que las poblaciones particulares de las secuencias se enriquecen en el curso del aislamiento y la identificación, la clonación subsecuente y el análisis de expresión es mucho menos laborioso y caro. Las secuencias de nucleótidos de los RPE y los promotores de la presente invención, así como las variantes y fragmentos de los mismos, son útiles en la manipulación genética de cualquier vegetal cuando se enlazan operablemente con una secuencia de nucleótidos cuya expresión debe controlarse para lograr una respuesta fenotípica deseada. Por "enlazado operablemente" se quiere decir que la transcripción o traducción de la secuencia de nucleótidos de interés está bajo la influencia de la secuencia promotora. En esta forma las secuencias de nucleótidos para los promotores de la invención se proporcionan en cassettes de expresión junto con
i\r secuencias de nucleótiaos de interés para la expresión en el vegetal de interés. Tales construcciones de nucleótidos o cassettes de expresión comprenderán una región de iniciación de transcripción en combinación con un elemento promotor enlazado operablemente a la secuencia de nucleótidos cuya expresión debe controlarse por los promotores descritos en la presente. Tal construcción se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para que la inserción de la secuencia de nucleótidos este bajo la regulación de transcripción de las regiones reguladoras. El cassette de expresión puede contener adicionalmente genes marcadores seleccionables . El cassette de transcripción incluirá en la dirección de transcripción 5' a 3' , una región de iniciación de transcripción y de traducción, uno o más elementos promotores, una secuencia de nucleótidos de interés, y una región de terminación de transcripción y traducción funcional en células vegetales. La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación de transcripción que comprende una o más de las secuencias de nucleótidos promotoras de la presente invención, puede ser nativa con la secuencia de ADN de ínteres, e puede derivarse de otra fuente. Las regiones de terminación convenientes están disponibles a partir del piasm.no Ti de A. tumefaciens , tales
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como las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina smtasa. Véase también, Guerineau et al . (1991) Mol . Gen . Genet . 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al . (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al . (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al . (1990) Gene 91:151-158; Bailas et al . 1989) Nucleic Acids Res . 17:7891- 7903; Joshi et al . (1987) Nucl eic Acid Res . 15:9627-9639. El cassette de expresión que comprende la unidad reguladora de transcripción de la invención enlazada operablemente a una secuencia de nucleótidos también puede contener al menos una secuencia de nucleótidos adicional para un gen a ser co-transformado dentro del organismo. Alternativamente, la o las secuencias adicionales pueden proporcionarse en otro cassette de expresión. Donde sea apropiado, la secuencia de nucleótidos cuya expresión debe estar bajo el control de la secuencia promotora de la presente invención, y cualquiera de la o las secuencias de nucleótidos adicionales puede optimizarse para la expresión aumentada en el vegetal transformado. Esto es, estas secuencias de nucleótidos pueden sintetizarse usando codones preferidos de vegetal para la expresión mejorada. Estén disponibles métodos en la técnica para sintetizar secuencias de nuclectidos preferidas de vegetal. Véase por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,380,831 y 5,436,391, y Murrap ec al . '1939, Nucleic Acids Res . 17:477-
498, incorporadas en la presente para referencia. Se sabe que las modificaciones de secuencia adicionales mejoran la expresión del gen en un huésped celular. Estas incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación espurias, señales de sitio de empalme exon-intron, repeticiones similares a transposon, y otras de tales secuencias bien caracterizadas que pueden ser perjudiciales a la expresión del gen. El contenido de G-C de la secuencia de nucleótidos de interés puede ajustarse a niveles promedio para un huésped celular dado, como se calcula con referencia a los genes conocidos expresados en la célula huésped. Cuando es posible, la secuencia se modifica para evitar estructuras de ARNm secundarias de horquilla predichas. Los cassettes de expresión pueden contener adicionalmente secuencias guía 5' en la construcción del cassette de expresión. Tales secuencias guía pueden actuar para mejorar la traducción. Se conocen en la técnica guías de traducción e incluyen: guías picornavirus, por ejemplo, guía EMCV (región 5' que no codifica encefalomiocarditis) (Elroy-Stein et al . (1989) Proc. Nat . ñcad. Sci . USA 86:6126-6130); guías potivirus, por ejemplo, guía TEV (Virus del Grabado del Tabaco) (Allison et al . (1986 ; guía MDMV (Virus Mosaico del Maíz Enano) [ Virol ogy 154:9-20 ; roteína de enlace a la ímmunoglobulina de cadena pesaaa humana (BiP) (Macejak y
fef¿) (1991) Na ture 353:90-94); guía no traducido del ARNav de proteína de recubrimiento del virus mosaico de la alfalfa (AMV AWT» 4) (Joblmg y Gehrke (1987) Nature 325:622-625); guía del virus mosaico del tabaco (TMV) (Gallie et al . (1989) Molecular Biology of RNA, páginas 237-256) ; y guía del virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) (Lommel et al . (1991) Virology 81:382-385). Véase también Della-Cioppa et al . (1987) Plant Physiology 84:965-968. También pueden utilizarse otros métodos conocidos para mejorar la traducción y/o estabilidad de ARNm, por ejemplo, intrones, y similares. Para preparar el cassette de expresión, pueden manipularse en los diversos fragmentos de ADN, para proporcionar las secuencias de ADN en la orientación apropiada y, cuando sea apropiado en la estructura de lectura apropiada. Hacia este fin, pueden emplearse adaptadores o enlazantes para unir los fragmentos de ADN, o pueden involucrarse otras manipulaciones para proporcionar sitios de restricción convenientes, eliminación de ADN superfluo, eliminación de sitios de restricción, o similares. Para este propósito, pueden involucrarse mutagénesis ín vi tro, reparación de cebador, restricción, templando, resustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones. Los promotores pueden usarse para impulsar genes reporteros o genes marcadores seleccionables. Ejemplos de genes reporteros adecuados conocidos en la técnica pueden
encontrarse en, por ejemplo, Jefferson et al. (1991) en Plant Molecular Biology Manual, ed. Gelvin et al. (Kluwer Academic Publishers), pp. 1-33; DeWet et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7:725-737; Goff et al. (1990) EMBO J. 9:2517-2522; y Kain et al. (1995) BioTechniques 19:650-655; y Chiu et al. (1996) Current Biology 6:325-330. Los genes marcadores seleccionables para la selección de células o tejidos transformados pueden incluir genes que confieren resistencia a antibióticos o resistencia a herbicidas. Ejemplos de genes marcadores seleccionables adecuados incluyen, pero no se limitan a, genes que codifican la resistencia a cloranfenicol (Herrera Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987-992); metotrexato (Herrera Estrella, et al. (1983) Nature 303:209-213; Meijer et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:807-820); higromicina (Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:103-108; Zhijian et al. (1995) Plant Science 108:219-227); estreptomicina (Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86-91); espectinomicina (Bretagne- Sagnard et ai. (1996) Transgenic Res. 5:131-137); bleomicina (Hille et al. (1990) Plant Mol. Biol. 7:171-176); sufona ida (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127-136); bromoxinil (Stalker et al. (1988) Science 242:419-423); glifosato (Shaw et al. (1986) Science 233:478-481) ; fosfinotricina (DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513-2518). Otros genes que podrían servir de utilidad en la
recuperación de eventos transgénicos pero que no pueden requerirse en el producto final incluyen, pero no se limitan a, ejemplos tales como GUS (b-glucoronidasa; Jefferson (1987) Plant Mol . Biol . Rep . 5:387), GFP (proteína de florescencia verde); Chalfie et al . (1994) Science 263:802), luciferasa (Riggs et al . (1987) Nucleic Acids Res . 15 (19) : 8115 y Luehrsen et al . (1992) Methods Enszymol . 216:397-414) , y los genes de maíz que codifican la producción de antocianina (Ludwig et al . (1990) Science 247:449). El cassette de expresión que comprende la unidad reguladora de transcripción de la presente invención enlazado operablemente a una secuencia de nucleótidos de interés puede usarse para transformar cualquier vegetal. En esta forma, pueden obtenerse, vegetales, células vegetales, tejido vegetal, semillas y similares genéticamente modificados. Los protocolos de transformación así como los protocolos para introducir secuencias de nucleótidos dentro de los vegetales pueden variar dependiendo del tipo de vegetal o célula vegetal, es decir, monocotiledóneo o dicotiledóneo, seleccionado para transformación. Los métodos adecuados para introducir secuencias de nucleótidos dentro de las células vegetales y la inserción subsecuente dentro del genoma vegetal incluyen la micromyección (Crossway et al . (1986) Bi otechmques 4:320-334), electroporación (Riggs et al . (1986) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 83:5602-5606,
?otojacter?ur.-tran formac?on med_ada (Townsend et al., Patente Norteamericana Mo . 5,2<_2, '22 >, transferencia de gen directa (Paszkows x et ai. (Ia»-) EMBO J. 3:2717-2722) , y aceleración de partículas balísticas (véase, por ejemplo, Sanford et al., Patente Norteamericana No. 4,945,050; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer mto Intact Plant Ceils vía Micropro ectile Be baroment, " en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Mezhoas, ed. Gamborg and Phillips (Spnnger-Verlag, Berlín); y McCabe et al. (1988) Biotecnnology 6:923-92o). Véase también Weissinger et al.
(1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-4-7; Sanford et al. (1987)
Particulate Science and Tecnnology 5:27-37 (cebolla);
Chpstou et al. (1988) Piant Physiol. 87:671-674 (soya);
McCabe et al. (1988) 3?c '7ecnncLog\ 6:923-926 (soya); Fmer and McMullen (1991) In Vitrc Cell Dev. Biol. 27P: 175-182
(soya); Smgh et al. (1998) Tneor. Appl. Genet. 96:319-324
.soya); Datta et al. ,1990) Biczecnnology 8:736-740 (arroz);
Klein et al. (1988) Proc. ¿Var_. Acad. Sci. USA 85:4305-4309
(maíz); Klein et ai. ,1988^ B^ zecnnology 6:559-563 (maíz) ; Temes, Patente Norteamericana Ic . 5,240,855; Buismg et al., Patentes Norteamericanas Ncs. 5,"22,"783 y 5,324,646; Tomes et ai. (1995) "Iirec: E A Traes fer mto Intact Plant Cells via Microprc-ectile Bemjear i ent", ee Plart Cell, Tissue, and Crear u^z^re: F raarer.zai .'.'ermas, ed. Gamborg (Sprmger- erla?, Ber.rr. -are ; "ie_~ a~ =>2. 1988) Plant Phxsioi.
?'
91:440-444 (maí Frem_m et I Q(j) Biotechnology 8:833-?f " 39 (maíz); Hooykaas-Van ¿legteran et al. (1984) Nature London) 311:163-" 64; Bptebier -=>t al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA '64:5345-5349 (Liliaceae1; De Wet et al. (1985) en The Experimental Manipulación of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Long an, New York), pp . 197-209 (polen); Kaeppler et al. (1990) Plant Ceil Repcrts °: 415-418 y Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada por bigotes) D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación) ; Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou and Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz via Agrobaczerium tumefaciens); todas las cuales se incorporan en la presente para referencia. En algunas modalidades preferidas a este respecto, los vectores proporcionan la expresión preferida. Tal expresión preferida puede ser la expresión inducible o temporalmente limitada o restringida a predominantemente algunos tipos de células o cualquier combinación de las anteriores. Particularmente preferidos entre los vectores inducibles son ios vectores que pueden inducirse para expresión per factores amcier.tales que son fáciles de manipular, tales cerne la temperatura y aditivos nutrientes. Una diversidad de rectores adecuados a este aspecto de la invención, ir.cl upen "eeferes de expresión constitutivos e
inducibles para uso en huespedes procarióticos y eucarióticos, son bien conocidos y se emplean rutinariamente por aquellos con experiencia en la técnica. Tales vectores incluyen, entre otros vectores de cromosoma, de episoma y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, a partir de bacteriófago, a partir de transposones, a partir de episomas de levadura, a partir de elementos de inserción, a partir de elementos de cromosoma de levadura, a partir de virus tales como baculovirus, virus de papova, tales como SV40, virus de vaccinia, adenovirus, virus de la viruela de aves de corral, virus y retrovirus de la pseudo-rabia, y vectores derivados a partir de combinaciones de los mismos, tales como aquellos derivados a partir de elementos genéticos de plásmido y bacteriófago, tales como cósmidos y fagémidos y binarios usados para transformaciones mediadas por Agrobacteri um . Todos pueden usarse para la expresión de acuerdo con este aspecto de la presente invención. Las células que se han transformado pueden cultivarse en vegetales de acuerdo con medios convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick et al . (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estos vegetales pueden cultivarse después, y polinizarse con la misma cepa transformada o cepas diferentes, e identificarse el híbrido resultante que tiene la expresión de la característica fenotípica deseada. Pueden
cultivarse dos o más generaciones para asegurar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantenga establemente y se herede y después se cosechen las semillas, para asegurar que se ha logrado la expresión de la característica fenotípica deseada. La presente invención puede usarse para la transformación de cualquier especie vegetal, que incluye, pero no se limita a, maíz Zea mays) , Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa , B. júncea) , particularmente aquellas especies de Brassica útiles como fuentes de semillas oleginosas, alfalfa (Medicago sativa) , arroz ( Oryza sativa) , centeno ( Sécale cereale) , sorgo ( Sorghum bicolor, Sorghum. vulgare) , mijo (por ejemplo, mijo perla (Pennisetum glaucum) , mijo proso ( Panicum miliaceum) , mijo carricera (Setaria i tálica) , mijo dedo (Eleusine coracana) ) , girasol (Helíanthus annuus) , cártamo ( Carthamus tinctorius) , trigo ( Tri ticum aestivum) , soya ( Glycine max) , tabaco (Nicotiana tabacum) , papa ( Solanum tuberosum) , cacahuate {Arachis hypogaea) , algodón ( Gossypi um barbadense, Gossypium hirsutum) , camote ( Ipomoea bata tus) , yuca (Manihot esculenta) , café ( Cofea spp.), coco ( Cocos nucífera) , pina (Ananas comosus) , árboles de cítrico ( Ci trus spp.), cacao ( Theobroma cacao) , té ( Camellia sinensis) , plátano (Musa spp.), aguacate ( Persea americana) , higo (Ficus casica) , guayaba (Psidium guajava) , mango (Mangifera indica) , oliva ( Olea europaea) , papaya
{Carica papaya • , mara . n ,... c.-r. um sccidentale) , acadamia ( Ma ca amia zr.z crúcelaa , .Icar.ra (Prunus amygdalus) , remolacha \Beta <~:icar? > , cana JP acucar (Saccnarum spp.), avenas, cebada, veaetales, plantas ornamentales, y coniferas. Los vegetales incluyen tomates (Lycopersicon escuientum) , lechuga por ejemplo, Lactuca sativa) , habas verdes (Phaseolus vulgaris , habas (Phaseolus li ensis) , chícharos (Lathyrus spp.), y miembros del género Cucu is tal co e pepino (C. sativas) , cantal. upe (C. cantalupensis) , y melón (C. meló . Las plantas ornamentales incluyen azalias
(Rhododendron spp.), hidrangeas (Macrophylla hydrangea) , hibisco (Hibiscus rosasanensisi , rosas (Rosa spp.), tulipanes
(Tulipa spp.), narcisos (Narciseus spp.), petunias (Petunia hybrida) , clavel (Dianthus caryophyllus) , nochebuena (Euphorbia pulcherpma) , y crisantemo. Las coniferas que pueden emplearse para practicar la presente invención incluyen, por ejemplo, pinos tales como pino del incienso {Pir.ue zaeda* , pino de tala Pzr.v.s elliotii) , pino ponderosa {Pir.vs ponderosa** , pino eonterta . Pinus contorta), y pino Monterey (Pir.us racXate/* ; abeto Douglas (Pseudotsuga menzzesi ) ; Sucota del Oeste • Ts ga canadensis) ; abeto Sitka •Picea clauca ; secoya S creta sempervirens) ; abetos "ereaoeres tales como acete ?e piara Abies a abílís) y abeto ce balsamina .-..cíes zaicar.ea ; _ cedros tales como cedro rojo
amarillo de A.laska
u
(C?-fffiaécyparte n; rl --~s ^ -f-r lemente, les vegetales d4**la presente m >:.c? n -c; letales de cultivo (por ejemplo, maíz, alfagra, i __, Brassica, soya, algodón, cártamo, cacahuete, scrgc, tr_g^, mi o, tabaco, etc.), de mayor preferencia vegetales le ^ai: y soya, aún de mayor preferencia vegetales de ma_z. Los vegetales de interés particular incluyen vegetales de grano que proporcionan semillas de interés, vegetales de semilla oleaginosa, y vegetales de leguminosas. Las semillas de ínteres incluyen semillas de grano, tales como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, etc. Los vegetales de semilla oleaginosa incluyen algodón, soya, cártamo, girasol, Brassica, maíz, alfalfa, palma, coco, etc. Los vegetales de leguminosas encimen frijoles y chícharos. Los frijoles incluyen guar, haba, fenogreco, soya, habas de jardín, caupí, garbanzo mungo, haba, haba fava, lentejas, garbanzo, etc. Las secuencias promotoras y los métodos descritos en ia presente son útiles para resular la expresión de una secuencia de r.ucleótidos de ínteres en un huésped vegetal en una formar preferida de tejido, mas particularmente en una forma preferida de ra_z. As_, _=• secuencia de nucleótidos enlazaoc cperablemenee a l^ pr-mctores descritos en la presente pue e ser e reo estructural que codifica una prote_na :~ _ "tries. 2~e-p_ __ .- c_-l=s genes inciuven, pero
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no ^ hitir . a, jer.es 111- ;?:_ m:? proteínas que confieren resistencia a ..a tense _n ..c: cea, tales como sequía, temperatura, salinidad, _. to in s cales como pesticidas y herbicidas, o a tensión curie., tales como ataques por hongos, virus, Pactarías, rnse-t.s, y nemátodos, y el desarrollo de enfermedades asocíalas con estos organismos. Alternativamente, la secuencia de nucleótidos enlazado operablemente a uno de ms promotores descritos en la presente puede ser una secuencia antisentido para un gen seleccionado. Asi, pueden construirse secuencias que son complementarias a, y se hibridizaran con, el ARN mensajero (ARNm) del gen seleccionado. Pueoen hacerse modificaciones de las secuencias antisentidc, siempre y cuando las secuencias se hibridizen e interfieran con la expresión de ARNm correspondiente. En esta forma, pueden usarse las construcciones antisentido que tienen 70c, preferiblemente 30 , de mayor preferencia ~ de similitud de secuencia con las secuencias de antisentidc correspondientes. Además, pueden usarse porciones ae les n_eleot?dos antisentido para desorganizar la expresión leí len objetivo. Generalmente, pueden usarse secuencias de al menos 50 nucleótidos, 100 nueleetides, 20 r nue_eetidc=, e mas. Cuando se suministran dentro le ana célula "? ¡retal, la expresión de la secuencia de A1N antiseetido pre"ier.e _a exprés ron normal de la secuencia de e_cl~ t_dc~ .? I" rara e_ 'en seleccionado. En esta
forma, se mnire la pi eie. . , ie la protema nativa
"^•codificada por e_ ,e?_ selecciona., para lograr una respuesta fenotipica deseada. Asi e. pr motor se enlaza a las secuencias de ADM an isen idc para reducir o inhibir la expresión de una protema nativa -n el vegetal. En una modalidad preferida de la presente invención, los promotores y/o elementos promotores preferidos de raíz se usan para mejorar e suprimir la expresión de secuencias de nucleotidos que codifican las proteínas directamente involucradas en rasgos agronómicamente importantes en raíz, o aquellos que codifican proteínas de raíz que afectan rasgos agronómicamente importantes en tejidos sin raíz. Se reconoce que los elementos promotores preferidos de tejido identificados y aislados de acuerdo a los métodos de la presente invención pueden usarse para mejorar o suprimir la expresión de rasgos agronómicamente importantes en una forma preferida de tejido. Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración y no a manera de limitación. EXPERIMENTAL EJEMPLO 1: Aislamiento e identificación de los RPE Diseñe " crecaracion de Biblioteca de
, „ , Ji.q. :ie „ T dos A_eatcna e una Biblioteca de
Ollgonucleótidos Aleatoria (ROL) para tener aproximadamente 30 nucleótidos de secuencia aleatorizada. La complejidad de la ROL es aproximadamente 1.15e+18 moléculas únicas. Se tomaron en cuenta dos consideraciones para diseñar esta ROL. *5 Primero, puede determinarse en control de transcripción por diversos complejos de transcripción que incluyen factores de transcripción múltiple, coactivadores, y otros factores asociados. La secuencia aleatoria larga en la ROL (aproximadamente 30 nucleótidos) permite la selección de 0 secuencias de enlace complejas por estos factores múltiples. Segundo, los elementos promotores puede ubicarse en diferentes posiciones a lo largo de la secuencia aleatoria. Por lo tanto, el espaciamiento de los elementos promotores puede probarse en el análisis de promotor funcional 5 subsecuente. Además, las secuencias espaciadoras que flanquean las secuencias aleatorizadadas de la ROL también se diseñaron cuidadosamente de manera que no contienen sitios de enlace de factor de transcripción conocidos. La ROL y los cebadores de flanqueo usados para amplificarse la ROL se 0 muestran posteriormente: nl9813 5 ' TGAGATCTGGATCCGTTC (N) 30GTCCTACGAATTCAGCTG3 ' nl9808 5 ' TGAGATCTGGATCCGTTC3 nl9811 5 ' CAGCTGAATTCGTAGGAC3 ' La estructura básica de cada oligonucleótido de la 5 ROL se muestra anteriormente como nl9813 (SEC. DE IDENT. NO;
Í)., en donde w (N) " designa la posición de la secuencia de oligonucleótidos aleatoria, en relación a las secuencias espaciadoras de flanqueo 5" y 3' (véase también Figura 1) . La ROL (nl9813) se templó con un cebador (nl9811) y se marcó con una enzima de Klenow en la presencia de a-P32-dCTP usando un protocolo estándar. La sonda marcada se purificó en gel después antes de usarse en reacciones de enlace ADN con proteínas nucleares de maíz. nl9808 y nl9811 designan pares cebadores usados para la amplificación PCR de la ROL, y contienen respectivamente los sitios BamHI y EcoRl, para propósitos de clonación. Preparación de Proteína Nuclear del Maíz: Se prepararon extractos nucleares de maíz usando un protocolo modificado a partir de Green et al . (1988) "In vitro DNA Footprinting" en Plant Molecular Biology Manual, ed. Gelvin, Schilperrort, y Verma (Kluwer Academic Publishers, Dordrecht) Bl l : 1-22. Brevemente se germinaron semillas de maíz innato A63 en la oscuridad a 24°C, se recolectaron las raíces de planta de semilla de cuatro días y se agregó 4X de volumen del Regulador de Homogenización (HB) (25 mM de Hepes/KOH pH 7.6, 10 mM de MgC12, 0.3 M de sacarosa, 0.5% de Tritón X-100, 5 mM de ß-mercaptoetanol, 1 mM de PMSF) . Los tejidos se disectaron en piezas pequeñas usando un mezclador Waring comercial a baja velocidad durante
10 sesundos [seg. y se ,lie :iasca una pasta con mortero y manilla. Los tejidos homogeneizados se filtraron a través de dos capas de m__racloth (CaiBiecnem.) y una capa de 70 µm de malla de nylon. Los extractos se centrifugaron en un rotor Sorval GSA a 4500 rpm, durante 15 minutos (mm.). Las pellas de los núcleos se resuspendieron después suavemente con una brocha de pintura en HB y se centrifugó como anteriormente. Este paso se repitió una vez. Después de la última centrifugación, ios núcleos se resuspendieron en un Regulador de Lisis Nuclear (15 mM de Hepes/KOH pH 7.6, 110 mM de KCl, 5 mM de MgC12, 1 mM de DTT, 1 mM de PMSF, 5 ug/ml de leupeptina, 2 ug/ml de aprotinma, 1 ug/ml de pepstatina A) . Se agregó NaCl en una forma por goteo hasta una concentración final de 0.5 M. Se extrajeron las proteínas nucleares de los núcleos por incubación de la mezcla de NaCl sobre hielo durante 40 min. con agitación suave. El extracto se centrifugó en un rotor Sorvai SS34, 16 K rpm, durante 30 mm. Los sobrenadantes se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -60°C. Los extractos nucleares congelados se descongelaron sobre hielo, y se agregó sulfato de amonio lentamente a los extractes nucleares hasta una concentración final de 0.35 mg/nu agitando a la vez. Las proteínas nucleares prec?p_tadas se centrifugaron en un rotor Sorval SS34 a 16k rpm durante 32 mm. Las pellas se resuspendieron en ur. Peiuiader ce Extracte Nuclear (NEB) (25 mM de Hepes/KOH
.1
pH ~.r, 40 mM de KCl, S.l mí-í je EITA, 10 de glicerol, 5 mM de ß-mercaptoetanoi » con 1 mM PM2F, 5 ug/ml de antipaina, 5 ug/ml de leupeptir.a y 5 ua/m__ le aprotmina y se dializó durante 6 horas en contra ce NE3 con 0.1 mM de PMSF. Se formaron alícuotas de los extractos nucleares dializados y se almacenaron a -80°C hasta su uso. Reacciones de Enlace a ALN y Proceso de Selección: Para las reacciones de enlace ADN, se incubaron
1-5 µg de extractos nucleares en un regulador NEB sobre hielo durante 5-20 min. con ei ollgonucleótido de la ROL marcada y en la presencia de 1 µg de poli(d?-dC), y 0.7 µg de dos pares de cebadores templados para secuencias de flanqueo de la ROL. Los pares cebadores fueren: Izquierda = nl9808 (secuencia proporcionada anteriormente) y nl9809 (GAACGGATCCAGATCTCA) Derecha = nl9811 (secuencia proporcionada anteriormente) y ni9310 (GTCCTACGAATTCAGCTC- Las reacciones de enlace se corrieron en geles de poliacplamida nativos de acuerde con un protocolo de EMSA (prueba de cambio de movilidad en electroforesis) estándar, básicamente como se describe en McKendree et al (1990) Plant
Ceil 2:207-214. El área del ¡el que corresponde a las 10 bandas. El ADN se eluyó
-. ? — ' Y- :ada canda de ¡reí, se amplificó por PCR usando
- : ^ c r* ctue i' - o ^ NO . : 10 ) y ni 9811 ( SEC .
O& IDENT. NO.: 11) er ra esencia de a-P -dCTP, v sel purificado. Las sondas de AEN marcadas resultantes se combinaron en tres reuniones que -orresponden a las bandas de alto, medio y bajo peso molecular. Estas tres reuniones de sondas se usaron separadamente para las siguiente vuelta del proceso de selección. Se realizaron seis vueltas de selección en la ROL con extractos nucleares de raíz de maíz. En la posición de la banda 3 del gel (un miembro de la reunión de peso molecular medio) , fue detectable un complejo de enlace a ADN específico. La prueba de cambio de movilidad electroforética (EMSA) mostró que las secuencias de enlace para este complejo específico se enriquecían progresivamente durante el proceso de selección. Clonación y Secuenciacion de los Oligonucleótidos de ROL Seleccionados: Después de seis vueltas de selección, los ollgonucleótidos seleccionados en ia banda 3 del gel (bandas de alto peso molecular) se clonaren en vectores de análisis de expresión utilizando el promotor de núcleo SynCorelI o el Promotor del Núcleo de Ubiquitina Rsyn7, y el activador CRC como un sistema reportero; descrito en la Patente Norteamericana No. 6, 2 ^2 , 05 C , e2 contenido de la cual se incorpora en la presente para referencia. Se recuperaron y secuenciaren diec?r.ue~e cienes, la alineación de secuencias moi : => =: - -ar presentes res clases de secuencias en
aproximadamente proporciones íauales dentro de la reunión seleccionada. Las secuencias de ADN seleccionadas en la primera clase eran casi idénticas. En la segunda clase de secuencias de ADN seleccionadas, un motivo principal (ACGGTAAA) estaba presente entre estas secuencias. Véase Figura 1. Ejemplo 2: Estudio de Enlace m i tro de los oligonucleótidos Seleccionados : Para probar si las secuencias clonadas eran sitios
10 de enlace verdaderos para el complejo nuclear observado, y para la afinidad relativa entre estas secuencias seleccionadas, las diecinueve secuencias clonadas se marcaron y probaron por enlace de proteínas nucleares de raíz. Se llevaron a cabo pruebas EMSA o cambio de banda básicamente
15 como se describe en 097/44448. Los resultados indican que los diecinueve olisonucleótidos seleccionados se enlazan más fuertemente por proteínas nucleares de raíz que en las secuencias seleccionadas aleatoriamente en la biblioteca de oiigonucleótidos aleatoria (ROL) . Las secuencias en la Clase
20 I son todas secuencias de enlace de alta afinidad, pero las afinidades de la secuencias en la Clase II varían (Figura 1)-. La alta afinidad está indicada per el hecho de que se enlazó más ADN por prcteir.a en el extracto nuclear como se determina a partir de las pruebas de cancro de gel. La baja afinidad
?<=, est; naieaoa or e. ere- menos ADN se enlazó por ia
f>¿oteina en extracto nuclear, estando la fracción enlazada en menor cantidad que la correspondiente a la alta afinidad, como se determina a partir de las pruebas de cambio de gel. Ejemplo 3: Pruebas transientes de los oligonucleótidos seleccionados: Para probar funcionalmente las secuencias de ADN seleccionadas por su actividad promotora in vivo, se seleccionó una secuencia que representa la Clase I y 8 secuencias de la Clase II para la prueba transiente por bombardeo con pistola de partículas. Brevemente, se bombardearon plantas de semilla de tres días de la línea W22 R-g Stadlercon 3 µg del plásmido experimental (ROL oligonucleótido: :Syncore: :AdhII: :CRC: :PinII) , 3µg de plásmido reportero (BzlL::LUC) y 1 µg de estándar interno (Ubi-Ubi::GUS). Véase Patente Norteamericana No. 6,072,050 para las construcciones básicas. Véase Tomes et al. (Tomes, D. et al . , IN: Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods, Eds. O.L. Gamborg and G.C. Phillips, Capítulo 8, pgs. 197-213 (1995)) para el proceso de bombardeo. Después de una incubación de 20 horas en la oscuridad, se prepararon extractos de proteína cruda a partir de las raíces. Se usaron extractos de 20 µl y 2 µl de tejido para las actividades de luciferasa (LUC) y GUS, respectivamente. La actividad promotora se expresó como una proporción de actividad LUC sobre actividad GUS. Las pruebas transientes indicaron que
todas las secuencias en la Clase II pueden activar la expresión del gen reportero en las raíces en algún grado. Generalmente, la afinidad de enlace para las proteínas nucleares se correlacionó positivamente con la actividad promotora, excepto para la secuencias de Clase I. Véase Figuras 1 y 2. Las pruebas transientes también muestran que las secuencias seleccionadas no elevaron la expresión del gen reportero en los brotes en comparación con los controles (Figura 3) . Con base en estas pruebas transientes, los elementos promotores de las SEC. DE IDENT. NOS.: 2, 3, 4, 5/ 6 y 8 se seleccionaron como mejoradores de expresión en raíz, y los elementos promotores de las SEC. DE IDENT. NOS.: 1 y 7 se seleccionaron como represores para expresión en raíz. Los elementos promotores aislados no tienen ajuste exacto con ninguna secuencia con bases en datos públicos. La secuencia CGGTAA está presente en el promotor PhyA de arroz, como se describe en Dehesh et al . (1990) Science 250:1397- 1399. Los elementos promotores descritos en la presente pueden conferir expresión de gen preferida de raíz. Los elementos promotores preferidos de raíz se indican en las SEC. DE IDENT. NOS.: 1-8. EJEMPLO 4: Transformación y Regeneración de Maíz Transgénico: Biolisticas : Los polmucleótidos de la invención contenidos
dentro de un vector se transforman en callo de maíz embriogénico por bombardeo de partículas, generalmente como se describe por Tomes, D. er ai . , IN: Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods, Eds. O.L. Gamborg and G.C. Phillips, Capitulo 8, pgs. 197-213 (1995) y como se delinea en forma breve posteriormente. Los vegetales de maíz transgénico se producen por bombardeo de embriones inmaduros embriogénicamente responsivos cor. partículas de tungsteno asociadas con plasmados de ADN. Los plasmados consisten de un gen marcador seleccionable y un gen estructural de interés. Preparación de Partículas: Se agregan quince mg de partículas de tungsteno
(General Electric), 0.5 a 1.8 µ, de preferencia 1 a 1.8 µ, y de mayor preferencia 1 µ, a 2 ml de ácido nítrico concentrado. Esta suspensión se sometió a sonicac ón a 0°C durante 20 minutos (Branson ?onifier Model 450, 40. de salida, ciclo de trabajo constante) . Las partículas de tungsteno se granular, por centrifugación a 10000 rpm (Biofuge) durante un minuto, y se elimina el sobrenadante. Dos mililitros de agua destilada estéril se agregan al granulo, y se usa scnicación oreve para resuspender las partículas. La suspensión se granula, se agrega un mililitro de etanol absoluto ai granulo, y se usa sonicación breve para resuspender las partículas. El lavado, granulado y resuspendiue de las partículas se realiza dos veces con agua
destilada estéril, y finalmente la¿_ partículas se resuspenden en dos mililitros de agua destilada estéril. Las partículas se subdividen en alícuotas de 250-ml y se almacenan congeladas . Preparación de la Asociación de Particula-ADN Plásmido: La existencia de partículas de tungsteno se somete a sonicación brevemente en un sonicador de baño de agua (Branson Sonifier Model 450, 20 de salida, ciclo de trabajo constante) y se transfieren 50 ml a un tubo del microcentrífuga. Todos los vectores fueron cis: esto es el marcador seleccionable y el gen de interés estaban en el mismo plásmido. Estos vectores se transformaron después sencillamente o en combinación. Se agregó ADN plasmado a las partículas para una cantidad de ADN final de 0.1 a 10 µg en 10 µL de volumen total, y se sometió a sonicación brevemente. De preferencia, se usa 10 µg (1 µg/µL en un regulador de TE) de ADN total para mezclar el ADN y las partículas para el bombardeo. Se agregan cincuenta microlitros (50 µL) de CaCl; de 2.5 M acuoso estéril y la mezcla se somete a sonicación brevemente y se agita con remolinos. Se agregan veinte microlitros (20 µL) de espermidina 0.1 M acuoso estéril y la mezcla se somete a sonicación brevemente y se agita con remolino. La mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos con sonicacion bret~e intermitente. La suspensión de
partículas se centrifuga, . los sorrenadantes se eliminan. Se agregan doscientos cincuenta mierclitros (250 µL) de etanol absoluto al granulo, seguido por sonicación breve. La suspensión se granula, el sobrenadante se elimina, y se agregan 60 ml de etanol absoluto. La suspensión se somete a sonicación brevemente antes de cargar la aglomeración de partículas-ADN sobre macroportadores . Preparación de Tejido: Embriones inmaduros de maíz de la variedad Tipo Alto II son el objetivo para la transformación mediada con bombardeo de partículas. Este genotipo es el Fx de dos líneas genéticas de raza pura, los parientes A y B, derivados de la cruza de dos congénitos de maíz conocidos, A188 y B73. Se seleccionan ambos parientes por alta competencia de embriogénesis somática, de acuerdo a Armstrong et al . , Maize Genetics Coop. News 65:92 (1991). Las mazorcas de los vegetales Fi son uniformes o pertenecientes, los embriones se disecan asépticamente a partir de caryopses cuando el esculeto se vuelve primero opaco. Esta etapa ocurre aproximadamente 9-13 días después de la polinización, y en forma mas general de aproximadamente 10 días después de la polmación, dependiendo de las condiciones del cultivo. Les embriones son de aproximadamente 0.75 a 1.5 milímetros de iarsc . Las mazorcas se esterilizan de la sucerrieie ")_ cp je erante 30 minutos, seguido
?1.
por tres lavados con agua destilada estéril. Les embrio es inmaduros se cultivan con ei escutelio orientado hacj.a arriba, en un medio de inducción embriogénico comprendido de sales básales N6, vitaminas de Eriksson, 0.5 mg/l de clorhidrato oe tlamina HCl, 30 gm/1 de sacarosa, 2.88 gm/1 L-prolma, 1 mg/l de ácido 2,4-diclorofenoxiacetico, 2 gm/1 de Gelrite, y 8.5 mg/l de AgNO,. Chu et al . , Sci. Sin. 18:659 (1975); Eriksson, Physiol. Plant 18:976 (1965). El medio se esteriliza en autoclave a 121°C durante 15 minutos y se dispensa en cajas de Petp de 10 X 25 mm. El AgNO se filtra - se esteriliza y se agrega al medio después de esterilizarse en autoclave. Los tejidos se cultivan en completa obscuridad a 28°C. Después de aproximadamente 3 a 7 días, de manera más normal aproximadamente 4 días, el escutelio de los embriones se hincha hasta aproximadamente el doble de su tamaño original y las protuberancias en la superficie coleorhizal del escutelio indica el nacimiento del tejido embriogénico. Hasta 100o de los embriones muestran esta respuesta, pero más comúnmente, la frecuencia de respuesta e oriogénica es aproximadamente 80° . Cuando se ooserva la respuesta embriogénica, los embriones se transfieren a un necio comprendido de medio de inducción modificado para contener 120 gm/1 de sacarosa. Los embriones se orienta- ccn el e~_o coleorhizal, el tejido
embriogénicamente responsivo, hacia arriba del medio de cultivo. Se ubican diez embriones por caja de Petri ßn el centro de una caja de Petri en un área de aproximadamente 2 cm de diámetro. Los embriones se mantienen en este medio durante 3-16 horas, de preferencia 4 horas, en oscuridad completa a 28 °C justo antes del bombardeo con partículas asociadas con los ADN plásmidos que contienen el gen o genes marcadores seleccionables y el gen o genes estructurales de interés. Para efectuar el bombardeo de partículas de los embriones, los aglomerados de partículas-ADN se aceleran usando un dispositivo de aceleración de partículas DuPbnt PDS-1000. La aglomeración de partículas-ADN se somete a sonicación brevemente y se depositaron 10 ml sobre macroportadores y el etanol se dejó evaporar. El macroportador se acelera sobre una malla para detener acero inoxidable por la ruptura de un diafragma polimérico (disco de ruptura) . La ruptura se efectúa por helio presurizado. La velocidad de la aceleración de partícula-ADN se determina con base en la presión de rompimiento del disco de rupturas. Se usan presiones del disco de ruptura de 200 a 1800 psi, prefiriéndose 650 a 1100 psi, y siendo más altamente preferido aproximadamente 900 psi. Se usan discos múltiples para efectuar un rango de presiones de ruptura. La repisa que contiene la placa con los embriones
- -$$ t coloca 5.1 cm por abajo del fondo de la plataforma macroportadora (repisa #3) . Para efectuar el bombardeo de t partículas de los embriones inmaduros cultivados, se instala en el dispositivo un disco de ruptura y un macroportador con $.* aglomerados secos de partículas-ADN. La presión de He su&itiistrada al dispositivo se ajusta a 200 psi por arriba de la presión de rompimiento del disco de ruptura. Una caja de Petri con los embriones objetivo se colocan dentro de la cámara de vacío y se ubican en la ruta proyectada de las
10 partículas aceleradas . Se crea un vacío en la cámara, de preferencia aproximadamente 28 en Hg. Después de la operación del dispositivo, se libera el vacío y se remueve la caja de Petri. Los embriones bombardeados permanecen sobre medios
15 osmóticamente ajustados durante el bombardeo, y 1 a 4 días subsecuentemente. Los embriones se transfieren a un medio de selección comprendido de sales básales N6, vitaminas de Eriksson, 0.5 mg/l de clorhidrato de tiamina, 30 gm/1 de sacarosa, 1 mg/l de ácido 2, -diclorofenoxiacético, 2 gm/1 de
20 Gelrite, 0.85 mg/l de AgN03 y 3 mg/l de bialaphos (Herbiace, Meiji) . Se agrega Bialaphos esterilizado por filtro, Los embriones se subcultivan en un medio de selección reciente a intervalos de 10 a 14 días. Después de aproximadamente 7 semanas, el tejido embriogénico, putativamente transformado
25 para el gen o genes marcadores seleccionables y un gen o
genes estructurales de interés, prolifera de aproximadamente 7 de los embriones bombardeados. El tejido transgénico putativo se rescata, y ei te ido derivado de embriones individuales se considera que es un evento y se propaga* independientemente en un medio de selección. Dos ciclos de propagación clonal se logran por selección visual para los fragmentos contiguos más pequeños del tejido embriogénico organizado. Se procesa una muestra de tejido de cada evento para recuperar ADN. El ADN se restringe con una endonucleaea de restricción y se sondea con las secuencias cebadoras diseñadas para amplificar las secuencias de ADN que empalman al menos una porción de un elemento promotor preferidos de raíz. El tejido embriogénico con secuencia amplificable se adelanta a la regeneración vegetal. Para la regeneración de vegetales transgénicos, el tejido embriogénico se subcuitiva en un medio que comprende sales y vitaminas MS (Murashige & Skoog, Physiol. Plant 15: 473 (1962)), 100 mg/l mio-inositol, 60 gm/1 de sacarosa,," 3 gm/1 de Gelrite, 0.5 mg/l de zeatina, 1 mg/l de ácido indol-3-acético, 26.4 ng/1 de ácido cis-trans-abscísico, y 3 mg/l en bialaphcs er. 100 X 25 mm en cajas de Petri, y se incuba en la oscuridad a 23° 2 hasta que puede verse el desarrollo de embriones somáticos maduros bien formados. Esto requiere acrcxinaoamer.ee 14 días. Los embriones somáticos
bien formados son opacos y de color crema, y están comprendidos de un escutelio y coleoptilo identificables. Los embriones se suocultxvan individualmente en un medio de germinación que comprende sales y vitaminas de MS, 100 mg/l 5 de mio-mositol, 40 gm/1 de sacarosa y 1.5 gm/1 de Gelrite en cajas de Petri de 100 X 25 mm y se incuba bajo un fotoperiodo de 16 horas de luz: 8 horas de obscuridad 40 einsteinsirf-seg"- de tubos fluorescentes blancos fríos. Después de aproximadamente 7 días, los embriones somáticos
10 han germinado y han producido un brote y raíz bien definidos. Los vegetales individuales se subcultivan en un medio de germinación en tubos de vidrio de 125 X 25 mm para permitir el desarrollo adicional del vegetal. Los vegetales se mantienen ba o un fotoperiodo de 16 horas de luz: 8 horas de
15 obscuridad y 40 me?nste?nsm"~seg~ de tubos fluorescentes blancos fríos. Después de aproximadamente 7 días, los vegetales están bien establecidos y se transplantan en suelo de horticultura, se endurecen y se ponen en macetas en una mezcla de suelo de invernadero comercial y se cultivan hasta
20 madurez sexual en un invernadero. Se usa una línea congénita de élite como un macho para polinizar los vegetales . transgénicos regenerados. Transformación mediada por Agrobacterium: Como una alternativa preferida al bombardeo de
25 partículas, los veeetales se transforman usando la
transformación mediada por Agrebacterium. Cuando se usa la transformación mediada por Agrobacterium, se emplea el método de Zhao (Patente PCT publicación W098/32326, el contenido de la cual se incorpora en la presente para referencia) . Brevemente, los embriones inmaduros se aislan a partir de maíz y los embriones se ponen en contacto con una suspensión de Agrobacterium (paso 1: el paso de infección). En este paso los embriones inmaduros se sumergen preferiblemente en una suspensión de Agrobacterium para la iniciación de la inoculación. Los embriones se co-cultivan durante un tiempo con el Agrobacterium (paso 2: el paso de co-cultivación) . Preferiblemente, los embriones inmaduros se cultivan en un medio sólido después del paso de infección. Después de este periodo de co-cultivación se contempla un paso de "descanso" opcional. En este paso de descanso, los embriones se incuban en la presencia de al menos un antibiótico que se conoce que inhibe el crecimiento de Agrobacterium sin la adición de un agente selectivo para transfomantes vegetales (paso 3: paso de descanso) . Preferiblemente los embriones inmaduros se cultivan en un medio sólido con antibiótico pero sin un agente de selección, para la eliminación de Agrobacterium y para una fase de descanso para las células infectadas. Después, los embriones inoculados se cultivan en un medio que contiene un agente selectivo y se recupera el callo transformado que crece (paso -: el paso de selección) .
Di
_nmaduros se cultivan en un
selectivo que resulta en el cultivo selectivo de las células transformadas. El callo se regenera .después en vegetales (paso 5: el paso de regeneraciones) y preferiblemente los callos cultivados en medios selectivos se cultivan en un medio sólido para regenerar los vegetales . Los vegetales regenerados se observan y cuentan por la actividad del gen de ínteres. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionada en la especificación son indicativas del nivel de aquellos expertos en la técnica al cual pertenece esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de* patente se incorporan en la presente para referencia en el mismo grado como si cada publicación o solicitud de patente fuera específica e individualmente indicada para ser incorporada para referencia. Aunque la invención anterior se ha descrito en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad y entendimiento, será obvio que pueden practicarse algunos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.
LISTA DE SECUENCIA <110> Pioneer Hi-Bre International , Inc .
<120> ELEMENTOS PROMOTORES NOVEDOSOS PREFERIDOS DE RAÍZ Y MÉTODOS DE USO
<130> 1166-PCT <150> US 60/177 , 473 ' <151> 2000-01-21 <160> 24 <170> FastSEQ for Windows Versión 3.0 <210> 1 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223 tandom oligonucleotide <400> l tgagatctgg atccgttcgg ggaagggaag gtgaaagcaa gaattaccgt cctacgaatt 60 cagctg 66 <210> 2 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> random oligonucleotide <400> 2 tgagatctgg atccgttcga caaaacggta aaaaagcggt agattaccgt cctacgaatt 60 cagctg 66 <210> 3 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223 > random oligonucleotide <400> 3 tgagatctgg atccgttcga caaaacggta aaactaaagg taactgacgt cctacgaatt 60 cagctg 66 <210> 4 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> random oligonucleotide
<400> 4 tgagatctgg atccgttcat tgtacagcgg taaaaatcgg gagtctgtcc tacgaattca 60 gctg 64 <210> 5 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> random oligonucleotide <400> 5 tgagatctgg atccgttcat gcggtaaata agtccatcgg aacgtgtgtc ctacgaattc 60 agctg 65 <210> 6 <211> 62 <2X2> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> random oligonucleotide <400> 6 tgagatctgg atccgttcgg taaaaatgag caggggatcg aaatgtccta cgaattcagc 60 tg 62 <210> 7 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> random oligonucleotide <400> 7 tgagatctgg atccgttcaa acagtgaaat ggggcacggt agaactagtc ctacgaattc 60 agctg 65 <210> 8 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> random oligonucleotide <400> 8 tgagatctgg atccgttcag aatagaaaga ggacggttaa aaactagtcc tacgaattca 60 gctg 64 <210> 9 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <221> misc_feature <222> (1) .7. (66)
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<223> n « A#T,C or © í' <400> 9 tgagatctgg atccgttcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnngt cctaogaatt 60 cagctg 66 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer with Ba HI site <400> 10 tgagatctgg atccgttc 18 <2!0> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer with EcoRl site <400> 11 cagctgáatt cgtaggac 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Seq?ence <22Q> <223> primer <400> 12 gaacggatc? agatctca 18 <2?0> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence 220> <223> primer <400> 13 gtcctacgaa ttcagctg 18 <210> 14 <2«> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ßynthetic seq?ences flanking a random oligonucleotide <400> 14 tgagatctgg atccgttcga gcagtaaaag taagaaaggc ccgtttcgtc ctacgaattc 60 agctg 6S
<210> 15 <2X%> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> syntíietic seq?ences flanking a random eít*" oligonucleotide <40O> 15 tgagatctgg aaccgttcgg ggaagggaag gtgaaagcaa gaattaccgt cctacgaatt 60 cagctg 66 <210> 16 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eynthetic ßequences flanking a random oligonucleotide <40O> 16 tgagatctgg attcgttcgg ggaagggaag gtgaaagcaa gaattaccgt cctacgaatt 60 cagctg 66 <210> 17 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ßynthetic ßequences flanking a random oligonucleotide <400> 17 tgagatctgg atecgttcgg ggaagggaag gtgaaagcaa gaattaccgt cctacgaatt 60 cagctg 66 <210> 18 <2«> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ßynthetic sequences flanking a random oligonucleotide -st
<400> 18 tgagatctgg atccgttcgg ggaagggaag gtgaaagcaa gaattaccgt cctaegaatt 60 cagctg 66 <210» 19 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ßynthetic sequences flanking a random oligonucleotide
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<223> n - A,T,C or G <400> 19 tgagatctgg atcngttcgg ggaagggaag gtgaaagcaa gaattaccgt cctaogaatt 60 cagctg 66 <210> 20 <211> 66 <212> DNA ?
<213> Artificial Sequence <220> <22Z> synthetic sequences flanking a random oligonucleotide <400> 20 tgagatctgg atccgttcgg ggaagggaag gtgaaagcaa gaattactgt cctacgaatt 60 cagctg 66 <210> 21 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequences flanking a random oligonucleotide <221> misc_feature <222> (1) ... (66) <223& n = A,T,C or G <400> 21 ngagatctgg atccgttcgg ggaagggaag gtgaaagcaa aaattaccgt cctacgaatt 60 cagctg 66 <210> 22 <211> 66 <212> DNA <213i Artificial Sequence <220> <223> eynthetic sequences flanking a random oligonucleotide <221> misc_feature <222> (1) .7. (66) <223> n = A,T,C or G <400> 22 ngagatctgg atccgttcgg ggaagggaag gtgaaagtaa gaattaccgt cctacgaatc 60 cagctg 66 <210> 23 <211> 66 < 12> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequences flanking a random
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