BR112015009467B1 - Proteína dgat1 quimérica e seu método de produção, uso de uma célula, célula de planta, planta, parte de planta, propágulo ou progênie expressando uma proteína dgat1 quimérica, e método para produzir triacilglicerídeo (tag) - Google Patents

Abstract

POLINUCLEOTÍDEOS ,POLIPEPTÍDEOS E MÉTODOS DE USO DE ACILTRANSFERASE APRIMORADOS. A presente invenção fornece proteínas DGAT1 quiméricas que compreendem: a) em suas extremidades N-terminal, uma porção N-terminal de uma primeira proteína DGAT1 e b) em suas extremidades C-terminal, uma porção C-terminal de uma segunda proteína DGAT1. As proteínas DGAT quiméricas mostram atividade aprimorada em relação a pelo menos uma dentre a primeira proteína DGAT1 e a segunda proteína DGAT1. As proteínas DGAT1 quiméricas da presente invenção podem ser expressas em células para aumentar o acúmulo de lipídio celular e/ou para modificar o perfil de lipídio celular. A presente invenção também fornece polinucleotídeos que codificam as proteínas DGAT1 quiméricas, células e composições que compreendem os polinucleotídeos ou as proteínas DGAT1 quiméricas e métodos que usam as proteínas DGAT1 quiméricas para produzir óleo.

Description

CAMPO DA TÉCNICA

[001] A invenção refere-se a composições e métodos para a manipulação de produção de lipídio celular e/ou perfil de lipídio celular. ANTECEDENTES

[002] O óleo vegetal é um produto economicamente importante não apenas devido a sua ampla utilização na indústria alimentícia e como um componente de ingredientes alimentícios, mas o mesmo também tem uma ampla faixa de aplicações como biocombustíveis ou na fabricação de vários produtos industriais ou nutracêuticos. Dentro da própria planta, o óleo é essencial para executar diversas processos metabólicos que são vitais para o crescimento e desenvolvimento particularmente durante a germinação de sementes e estágios de crescimento da planta precoces. Ao considerar seu valor, há um interesse de pesquisa crescente dentro do campo de biotecnologia para aprimorar a produção de óleo vegetal e tornar o abastecimento mais sustentável.

[003] O componente principal do óleo vegetal é o triacilglicerídeo (TAG). O mesmo é a forma principal do lipídio de armazenamento em sementes oleaginosas e a fonte primária de energia para germinação de semente e desenvolvimento de muda. A biossíntese de TAG através do caminho de Kennedy envolve etapas de acilação sequencial que inicia a partir do precursor sn-glicerol-3-fosfato (G3P). Em primeiro lugar, G3P é esterificado por meio de um acil-CoA para formar ácido lisofosfatídico (LPA) em uma reação catalisada por glicerol-3-fosfato aciltransferase (GPAT, EC 2.3.1.15). Isso é seguido por uma segunda etapa de acilação catalisada pelo ácido lisofosfatídico aciltransferase (LPAT; EC 2.3.1.51) que forma o ácido fosfatídico (PA), uma chave intermediária na biossíntese de glicerolipídios. O PA é, então, desfos- foualizado pela enzima ácido fosfatídico fosfatase (PAP; EC3.1.3.4) para liberar o precursor imediato para TAG, o sn-1,2-diacilglicerol (DAG). Finalmente, DAG é acilado na posição sn-3 pela enzima diacil- glicerol aciltransferase (DGAT; EC 2.3.1.20) para formar TAG.

[004] Visto que essa última ação catalística é apenas a etapa única na biossíntese de TAG, DGAT é denominado como a enzima de formação de triacilglicerol comprometido. Como DAG está localizado no ponto de ramificação entre TAG e as biossínteses de fosfolipídios de membrana, DGAT desempenha potencialmente um papel decisivo na regulação da formação de TAG na síntese de caminho de gliceroli- pídio (Lung e Weselake, 2006, Lipids. dezembro de 2006; 41(12):1073 a 88). Há duas diferentes famílias de proteínas de DGAT. A primeira família de proteínas de DGAT ("DGAT1") se refere à acil-coenzima A: colesterol aciltransferase ("ACAT") e foi descrita nos documentos n°s U.A. 6.100.077 e 6.344.548. Uma segunda família de proteínas de DGAT ("DGAT2") não é relacionada à família DGAT1 e é descrita na Publicação de Patente PCT n° WO 2004/011671 publicada no dia 5 de fevereiro de 2004. Outras referências aos genes DGAT e o uso dos mesmos em plantas incluem a Publicação PCT n°s WO2004/011.671, WO1998/055.631 e WO2000/001.713 e Publicação de Patente n° US 20030115632.

[005] DGAT1 é tipicamente a enzima de sintetização de TAG principal tanto na semente quanto folha senescente (Kaup et al., 2002, Plant Physiol. 129(4):1616 a 26; para revisões consulte Lung e Weselake 2006, Lipids. 41(12):1073 a 88; Cahoon et al., 2007, Current Opinion in Plant Biology. 10:236 a 244; e Li et al., 2010, Lipids. 45:145 a 157).

[006] A elevação do rendimento de sementes oleaginosas (canola, girassol, óleo de cártamo, soja, milho, algodão, linhaça, linho etc.) foi uma meta principal para a indústria agrícola por décadas. Muitas abordagens (incluindo melhoramento tradicional e mutacional bem como manipulação genética) foram testadas, tipicamente com sucesso modesto (Xu et al., 2008, Plant Biotechnol J., 6:799 a 818 e referências nos mesmos).

[007] Embora os biocombustíveis líquidos ofereçam promessa considerável, a realidade da utilização de material biológico é atenuada por meio de usos conflitantes e quantidades disponíveis. Consequentemente, manipular os microrganismos e as plantas voltados para isso são o foco de múltiplos grupos de pesquisa; em particular, o acúmulo de triacilglicerol (TAG) em tecidos vegetativos e leveduras oleaginosas e bactéria (Foutman et al., 2008, Trends Biotechnol 26, 375 a 381; Ohlrogge et al., 2009, Science 324, 1.019 a 1.020). TAG é um lipídio neutro com duas vezes a densidade energética de celulose e pode ser usado para gerar o biodiesel de um biocombustível desejável de alta densidade energética com um dentre os processos de fabricação mais simples e mais eficientes. O acúmulo de TAG de manipulação nas folhas resultou até o momento em um aumento de 5 a 20 dobras mediante a utilização de WT de uma variedade de estratégias que incluem: a sobre-expressão de fatores de transcrição de desenvolvimento de semente (LEC1, LEC2 e WRI1); silenciamento de APS (um gene-chave envolvido na biossíntese de amido); mutação de CGI- 58 (um regulador de acúmulo de lipídio neutro); e suprerregulação do TAG que sintetiza a enzima DGAT (diacilglicerol O aciltransferase, EC 2.3.1.20) em plantas e também em levedura (Andrianov et al., 2009, Plant Biotech J 8, 1 a 11; Mu et al., 2008, Plant Physiol 148, 1042 a 1054; Sanjaya et al., 2011, Plant Biotech J 9, 874 a 883; Santos- Mendoza, et al., 2008, Plant J 54, 608 a 620; James et al., 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107, 17833 a 17838; Beoporlos et al., 2011, Appl Microbiol Biotechnol 90, 1193-1206; Bouvier-Navé et al., 2000, Eur J Biochem 267, 85 a 96; Durrett et al., 2008, Plant J 54, 593 a 607). No entanto, foi reconhecido que, para alcançar aumentos adicionais em TAG, o impedimento de seu catabolismo pode ser crucial dentro de tecidos não oleaginosos e sobre uma faixa de estágios de desenvolvimento (Yang e Ohlrogge, 2009, Plant Physiol 150, 1981 a 1989).

[008] É difícil alcançar a manipulação de modo positivo do rendimento e qualidade de triacilglicerídeos; (TAG) em eucariotas. A enzima diacilglicerol-O-aciltransferase (DGAT) tem a menor atividade específica das enzimas de caminho de Kennedy e é considerada como um "gargalo" na síntese de TAG.

[009] As tentativas foram feitas anteriormente para aprimorar DGAT1 por meio de métodos biotecnológicos, com sucesso limitado. Por exemplo, Nykifouuk et al., (2002, Biochimica et Biophysica Acta 1580:95 a 109) relatou o truncamento de N-terminal da Brassica napus DGAT1, mas relatou aproximadamente 50% de menos atividade. McFie et al., (2010, JBC., 285:37.377 a 37.387) relatou que o truncamento de N-terminal do camundongo DGAT1 resultou no aumento de atividade específica da enzima, mas também relatou um grande declínio no nível de proteína que acumulou.

[0010] Xu et al., (2008, Plant Biotechnology Journal, 6:799 a 818) identificou recentemente uma sequência consenso (X-Leu-X-Lys-X-X- Ser-X-X-X-Val) dentro de sequencias de Tropaeolum majus (nastúrcio de jardim) DGAT1 (TmDGAT1) como um motivo de alvejamento típico de membros da quinase-1 de proteína relacionada a SNF1 (SnRK1) com Ser que é o resíduo para fosforilação. As proteínas de SnRK1 são uma classe de Ser/Thr proteínas quinases que foram cada vez mais implicadas na regulação global de metabolismo de carbono em plantas, por exemplo, a inativação de síntese de sacarose fosfato por meio da fosforilação (Halfoud & Hardie 1998, Plant Mol Biol. 37:735 a 748. Review). Xu et al., (2008, Plant Biotechnology Journal, 6:799 a 818) realizou mutagênese direcionada ao local em seis motivos/regiões funcionais putativas da enzima TmDGAT1. A mutagênese de um resíduo serina (S197) em um suposto local alvo de SnRK1 putativo resultou em um aumento de 38% a 80% na atividade de DGAT1 e sobre- expressão do TmDGAT1 mutado submetido a mutação em Arabi- dopsis resultou em um aumento de 20% a 50% no teor de óleo em uma base por semente.

[0011] Seria benéfico fornecer formas aprimoradas de DGAT1, que superam uma ou mais das deficiências na técnica anterior e que podem ser usadas para aumentar a produção de óleo celular.

[0012] É um objetivo da presente invenção fornecer o aumento de proteínas de DGAT1 e métodos para uso das mesmas para alterar pelo menos uma dentre produção de lipídio celular e perfil de lipídio celular e/ou pelo menos para fornecer o público com uma escolha útil.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0013] Os inventores mostraram que é possível produzir proteínas de DGAT1 quiméricas com propriedades vantajosas sobre qualquer uma das moléculas de DGAT1 parentais usadas para produzir as proteínas de DGAT1 quiméricas. As proteínas de DGAT1 quiméricas da presente invenção podem ser expressas em células para alterar o teor de lipídio e perfil de lipídio das células ou organismos que contêm as células.

POLINUCLEOTÍDEO QUE CODIFICA UM POLIPEPTÍDEO

[0014] No primeiro aspecto, a presente invenção fornece um poli- nucleotídeo isolado que codifica uma proteína de DGAT1 quimérica que compreende: a) em sua extremidade N-terminal, uma porção N-terminal de uma primeira proteína de DGAT1, e b) em sua extremidade C-terminal, uma porção C-terminal de uma segunda proteína de DGAT1.

[0015] Em uma modalidade, a proteína de DGAT1 quimérica tem pelo menos uma dentre: i) atividade de DGAT1 aumentada ii) estabilidade aumentada iii) propriedades de oligomerização alteradas iv) propriedades de acúmulo de proteína celular substancialmente normais v) propriedades de focalização celular substancialmente normais em relação à primeira DGAT1, a segunda DGAT1 ou tanto a primeira DGAT1 e a segunda DGAT1.

[0016] Em uma modalidade adicional, a proteína de DGAT1 quimérica tem pelo menos uma dentre: i) atividade de DGAT1 aumentada ii) estabilidade aumentada iii) propriedades de oligomerização alteradas iv) propriedades de acúmulo de proteína celular substancialmente normais v) propriedades de focalização celular substancialmente normais em relação à primeira DGAT1.

[0017] Em uma modalidade adicional, a proteína de DGAT1 quimérica tem pelo menos uma dentre: i) atividade de DGAT1 aumentada ii) estabilidade aumentada iii) propriedades de oligomerização alteradas iv) propriedades de acúmulo de proteína celular substancialmente normais v) propriedades de focalização celular substancialmente normais em relação à segunda DGAT1.

[0018] Em uma modalidade adicional, a proteína de DGAT1 quimérica tem pelo menos uma dentre: i) atividade de DGAT1 aumentada ii) estabilidade aumentada iii) propriedades de oligomerização alteradas iv) propriedades de acúmulo de proteína celular substancialmente normais v) propriedades de focalização celular substancialmente normais em relação tanto à primeira DGAT1 quanto à segunda DGAT1.

[0019] Em uma modalidade, a porção N-terminal de uma primeira proteína de DGAT1 é a região citoplasmática N-terminal da primeira proteína de DGAT1. Em uma modalidade, a região citoplasmática N- terminal da primeira proteína de DGAT1 se estende do N-terminal da primeira proteína de DGAT1 para a extremidade do domínio de ligação de acil-CoA da primeira proteína de DGAT1. Em uma modalidade adicional, a região citoplasmática N-terminal da primeira proteína de DGAT1 é a região a montante do primeiro domínio transmembrana.

[0020] A posição do domínio de ligação de acil-CoA e do primeiro domínio transmembrana, para diversas proteínas de DGAT1, é mostrada na Figura 3.

[0021] Em uma modalidade, a junção entre a porção N-terminal de uma primeira proteína de DGAT1 e a porção C-terminal de uma segunda proteína de DGAT1 está a montante do primeiro domínio transmembrana.

[0022] Em uma modalidade adicional, a junção entre a porção N- terminal de uma primeira proteína de DGAT1 e a porção C-terminal de uma segunda proteína de DGAT1 está no local de ligação acil-CoA da primeira e da segunda proteínas de DGAT1.

[0023] Em uma modalidade adicional, a junção entre a porção N- terminal de uma primeira proteína de DGAT1 e a porção C-terminal de uma segunda proteína de DGAT1 está em uma posição correspondente no local de ligação acil-CoA da primeira e da segunda proteínas de DGAT1.

[0024] Em uma modalidade, a junção entre a porção N-terminal de uma primeira proteína de DGAT1 e a porção C-terminal de uma segunda proteína de DGAT1 está dentro do LSS (Leu-Ser-Ser) conservado no local de ligação acil-CoA da primeira e da segunda proteínas de DGAT1.

[0025] Em uma modalidade preferencial, a DGAT1 quimérica tem um local de ligação acil-CoA intacto.

[0026] Em uma modalidade, a local de ligação acil-CoA na DGAT1 quimérica tem o mesmo comprimento do local de ligação acil-CoA na primeira proteína de DGAT1.

[0027] Em uma modalidade adicional, o local de ligação acil-CoA na DGAT1 quimérica tem o mesmo comprimento do local de ligação acil-CoA na segunda proteína de DGAT1.

[0028] Em uma modalidade preferencial, o local de ligação acil- CoA na DGAT1 quimérica tem o mesmo comprimento do local de ligação acil-CoA na primeira e na segunda proteínas de DGAT1.

[0029] Em uma modalidade adicional, o polipeptídeo da presente invenção, quando expressado na célula, tem especificidade de substrato alterada em relação a pelo menos uma dentre a primeira e a segunda proteínas de DGAT1.

CONSTRUCTO

[0030] Em uma modalidade adicional, presente invenção forne- ceum constructo genético que compreende um polinucleotídeo da presente invenção.

CÉLULAS

[0031] Em uma modalidade adicional, a presente invenção fornece uma célula que compreende um polinucleotídeo da presente invenção.

[0032] Em uma modalidade adicional, a presente invenção fornece uma célula que compreendeum constructo genético da presente invenção.

[0033] Em uma modalidade preferencial, a célula expressa a DGAT1 quimérica.

[0034] Em uma modalidade, a proteína de DGAT1 quimérica, quando expressada na célula, tem pelo menos uma dentre: i) atividade de DGAT1 aumentada, ii) estabilidade aumentada, iii) propriedades de oligomerização alteradas, iv) propriedades de acúmulo de proteína celular substancialmente normais, e v) propriedades de focalização subcelular substancialmente normais em relação à primeira DGAT1, à segunda DGAT1 ou tanto à primeira DGAT1 quanto à segunda DGAT1.

[0035] Em uma modalidade, a proteína de DGAT1 quimérica, quando expressada na célula, tem pelo menos uma dentre: i) atividade de DGAT1 aumentada, ii) estabilidade aumentada, iii) propriedades de oligomerização alteradas, iv) propriedades de acúmulo de proteína celular substancialmente normais, e v) propriedades de focalização subcelular substancialmente normais em relação à primeira DGAT1 quando expressada em uma célula.

[0036] Em uma modalidade, a proteína de DGAT1 quimérica, quando expressada na célula, tem pelo menos uma dentre: i) atividade de DGAT1 aumentada, ii) estabilidade aumentada, iii) propriedades de oligomerização alteradas, iv) propriedades de acúmulo de proteína celular substancialmente normais, e v) propriedades de focalização subcelular substancialmente normais em relação à segunda DGAT1 quando expressada em uma célula.

[0037] Em uma modalidade adicional, a proteína de DGAT1 quimérica tem pelo menos uma dentre: i) atividade de DGAT1 aumentada ii) estabilidade aumentada iii) propriedades de oligomerização alteradas iv) propriedades de acúmulo de proteína celular substancialmente normais v) propriedades de focalização celular substancialmente normais em relação tanto à primeira DGAT1 quanto à segunda DGAT1.

[0038] Em uma modalidade adicional, a célula produz mais lipídio do que faria uma célula de controle.

[0039] Em uma modalidade, a célula produz pelo menos 5%, mas preferencialmente, pelo menos 10%, mas preferencialmente, pelo menos 15%, mas preferencialmente, pelo menos 20%, mas preferencialmente, pelo menos 25%, mas preferencialmente, pelo menos 30%, mas preferencialmente, pelo menos 35%, mas preferencialmente, pelo menos 40%, mas preferencialmente, pelo menos 45%, mas preferencialmente, pelo menos 50%, mas preferencialmente, pelo menos 55%, mas preferencialmente, pelo menos 60%, mas preferencialmente, pelo menos 65%, mas preferencialmente, pelo menos 70%, mas preferencialmente, pelo menos 75%, mas preferencialmente, pelo menos 80%, mas preferencialmente, pelo menos 85%, mas preferencialmente, pelo menos 90%, mas preferencialmente, pelo menos 95%, mais preferen- cialmente, pelo menos 100%, mas preferencialmente, pelo menos 105%, mas preferencialmente, pelo menos 110%, mas preferencialmente, pelo menos 115%, mas preferencialmente, pelo menos 120%, mas preferencialmente, pelo menos 125%, mas preferencialmente, pelo menos 130%, mas preferencialmente, pelo menos 135%, mas preferencialmente, pelo menos 140%, mas preferencialmente, pelo menos 145%, mas preferencialmente, pelo menos 150% mais lipídio do que faria uma célula de controle.

[0040] Em uma modalidade adicional, a célula tem um perfil de lipídio alterado em relação a uma célula de controle.

[0041] Em uma modalidade, a produção de 16:0 no triacilglicerol é alterada em relação àquela em uma célula de controle.

[0042] Em uma modalidade, a produção de 16:0 no triacilglicerol é alterada por pelo menos 1%, preferencialmente, pelo menos 2%, mais preferencialmente, pelo menos 3%, mais preferencialmente, pelo menos 4%, mais preferencialmente, pelo menos 5%, mais preferencialmente, pelo menos 6%, mais preferencialmente, pelo menos 7%, mais preferencialmente, pelo menos 8%, mais preferencialmente, pelo menos 9%, mais preferencialmente, pelo menos 10%, mais preferencialmente, pelo menos 11%, mais preferencialmente, pelo menos 12%, mais preferencialmente, pelo menos 13%, mais preferencialmente, pelo menos 14%, mais preferencialmente, pelo menos 15%, mais preferencialmente, pelo menos 16%, mais preferencialmente, pelo menos 17%, mais preferencialmente, pelo menos 18%, mais preferencialmen-te, pelo menos 19%, mais preferencialmente, pelo menos 20% em relação àquela em uma célula de controle.

[0043] Em uma modalidade adicional, o perfil de lipídio alterado tem uma produção de 16:0 no triacilglicerol na faixa de 6% a 16%. Nessa modalidade, a produção de 16:0 no triacilglicerol é alterada dentro da faixa de 6% a 16%.

[0044] Em uma modalidade adicional, a produção de 18:0 no tria- cilglicerol é alterada em relação àquela em uma célula de controle.

[0045] Em uma modalidade, a produção de 18:0 no triacilglicerol é alterada por pelo menos 1%, preferencialmente, pelo menos 2%, mais preferencialmente, pelo menos 3%, mais preferencialmente, pelo menos 4%, mais preferencialmente, pelo menos 5%, mais preferencialmente, pelo menos 6%, mais preferencialmente, pelo menos 7%, mais preferencialmente, pelo menos 8%, mais preferencialmente, pelo menos 9%, mais preferencialmente, pelo menos 10%, mais preferencialmente, pelo menos 11%, mais preferencialmente, pelo menos 12%, mais preferencialmente, pelo menos 13%, mais preferencialmente, pelo menos 14%, mais preferencialmente, pelo menos 15%, mais preferencialmente, pelo menos 16%, mais preferencialmente, pelo menos 17%, mais preferencialmente, pelo menos 18%, mais preferencialmen-te, pelo menos 19%, mais preferencialmente, pelo menos 20%, em relação àquela em uma célula de controle.

[0046] Em uma modalidade adicional, o perfil de lipídio alterado tem uma produção de 18:0 no triacilglicerol na faixa de 7% a 15%. Nessa modalidade, a produção de 18:0 no triacilglicerol é alterada dentro da faixa de 7% a 15%.

[0047] Em uma modalidade adicional, a produção de 18:1 no tria- cilglicerol é alterada em relação àquela em uma célula de controle.

[0048] Em uma modalidade, a produção de 18:1 no triacilglicerol é alterada por pelo menos 1%, preferencialmente, pelo menos 2%, mais preferencialmente, pelo menos 3%, mais preferencialmente, pelo menos 4%, mais preferencialmente, pelo menos 5%, mais preferencialmente, pelo menos 6%, mais preferencialmente, pelo menos 7%, mais preferencialmente, pelo menos 8%, mais preferencialmente, pelo menos 9%, mais preferencialmente, pelo menos 10%, mais preferencialmente, pelo menos 11%, mais preferencialmente, pelo menos 12%, mais preferencialmente, pelo menos 13%, mais preferencialmente, pelo menos 14%, mais preferencialmente, pelo menos 15%, mais preferencialmente, pelo menos 16%, mais preferencialmente, pelo menos 17%, mais preferencialmente, pelo menos 18%, mais preferencialmente, pelo menos 19%, mais preferencialmente, pelo menos 20%, em relação àquela em uma célula de controle.

[0049] Em uma modalidade adicional, o perfil de lipídio alterado tem uma produção de 18:1 no triacilglicerol na faixa de 39% a 55%. Nessa modalidade, a produção de 18:1 no triacilglicerol é alterada dentro da faixa de 39% a 55%.

[0050] A célula de controle pode ser qualquer célula do mesmo tipo que não seja transformada com o polinucleotídeo, ou constructo, da presente invenção para expressar a DGAT1 quimérica.

[0051] Em uma modalidade, a célula de controle é uma célula não transformada. Em uma modalidade adicional, a célula de controle é célula transformada para expressar a primeira DGAT1. Em uma modalidade adicional, a célula de controle é célula transformada para expressar a segunda DGAT1.

CÉLULAS TAMBÉM TRANSFORMADAS PARA EXPRESSAR UMA OLEOSINA

[0052] Em uma modalidade, a célula também transformada para expressar pelo menos uma dentre: uma oleosina, esteroleosina, cale- osina, poliolefinas e uma oleosina que inclui pelo menos uma cistina introduzida artificialmente (WO2011/053169).

PLANTA

[0053] Em uma modalidade adicional, a presente invenção fornece uma planta que compreende um polinucleotídeo da presente invenção.

[0054] Em uma modalidade adicional, a presente invenção fornece uma planta que compreendeum constructo genético da presente invenção.

[0055] Em uma modalidade preferencial, a planta expressa a DGAT1 quimérica.

[0056] Em uma modalidade, a proteína de DGAT1 quimérica quando expressada na planta tem pelo menos uma dentre: i) atividade de DGAT1 aumentada, ii) estabilidade aumentada, iii) propriedades de oligomerização alteradas, iv) propriedades de acúmulo de proteína celular substancialmente normais, e v) propriedades de focalização subcelular substancialmente normais em relação à primeira DGAT1, à segunda DGAT1 ou tanto à primeira DGAT1 quando à segunda DGAT1.

[0057] Em uma modalidade, a proteína de DGAT1 quimérica quando expressada na planta tem pelo menos uma dentre: i) atividade de DGAT1 aumentada, ii) estabilidade aumentada, iii) propriedades de oligomerização alteradas, iv) propriedades de acúmulo de proteína celular substancialmente normais, e v) propriedades de focalização subcelular substancialmente normais em relação à primeira DGAT1.

[0058] Em uma modalidade, a proteína de DGAT1 quimérica quando expressada na planta tem pelo menos uma dentre: i) atividade de DGAT1 aumentada, ii) estabilidade aumentada, iii) propriedades de oligomerização alteradas, iv) propriedades de acúmulo de proteína celular substancialmente normais, e v) propriedades de focalização subcelular substancialmente normais em relação à segunda DGAT1.

[0059] Em uma modalidade, a proteína de DGAT1 quimérica quando expressada na planta tem pelo menos uma dentre: i) atividade de DGAT1 aumentada, ii) estabilidade aumentada, iii) propriedades de oligomerização alteradas, iv) propriedades de acúmulo de proteína celular substancialmente normais, e v) propriedades de focalização subcelular substancialmente normais em relação tanto à primeira DGAT1 quanto à segunda DGAT1.

[0060] Em uma modalidade, a proteína de DGAT1 quimérica quando expressada na planta tem pelo menos uma dentre: i) atividade de DGAT1 aumentada, ii) estabilidade aumentada, iii) propriedades de oligomerização alteradas, iv) propriedades de acúmulo de proteína celular substancialmente normais, e v) propriedades de focalização subcelular substancialmente normais em relação tanto à primeira DGAT1 quanto à segunda DGAT1.

[0061] Em uma modalidade adicional, a planta produz mais lipídio, em pelo menos um de seus tecidos ou partes, do que faria o tecido ou parte equivalente em uma planta de controle.

[0062] Em uma modalidade, a planta produz pelo menos 5%, mas preferencialmente, pelo menos 10%, mas preferencialmente, pelo menos 15%, mas preferencialmente, pelo menos 20%, mas preferencialmente, pelo menos 25%, mas preferencialmente, pelo menos 30%, mas preferencialmente, pelo menos 35%, mas preferencialmente, pelo menos 40%, mas preferencialmente, pelo menos 45%, mas preferen- cialmente, pelo menos 50%, mas preferencialmente, pelo menos 55%, mas preferencialmente, pelo menos 60%, mas preferencialmente, pelo menos 65%, mas preferencialmente, pelo menos 70%, mas preferencialmente, pelo menos 75%, mas preferencialmente, pelo menos 80%, mas preferencialmente, pelo menos 85%, mas preferencialmente, pelo menos 90%, mas preferencialmente, pelo menos 95%, mais preferencialmente, pelo menos 100%, mas preferencialmente, pelo menos 105%, mas preferencialmente, pelo menos 110%, mas preferencialmente, pelo menos 115%, mas preferencialmente, pelo menos 120%, mas preferencialmente, pelo menos 125%, mas preferencialmente, pelo menos 130%, mas preferencialmente, pelo menos 135%, mas preferencialmente, pelo menos 140%, mas preferencialmente, pelo menos 145%, mas preferencialmente, pelo menos 150% mais lipídio do que faria uma célula de controle.

[0063] Em uma modalidade, o tecido é um tecido vegetativo. Em uma modalidade, e parte é uma folha. Em uma modalidade adicional, a parte é uma raiz. Em uma modalidade adicional, a parte é um bulbo. Em uma modalidade adicional, a parte é um cormo. Em uma modalidade adicional, a parte é um pedúnculo. Em uma modalidade adicional, a parte é um pedúnculo de uma planta monocotiledónea. Em uma modalidade adicional, a parte é um stovum (pedúnculo e lâmina foliar).

[0064] Em uma modalidade preferencial, o tecido é tecido de semente. Em uma modalidade preferencial, a parte é uma semente. Em uma modalidade preferencial, o tecido é tecido endosperma.

[0065] Em uma modalidade adicional, a planta como um todo produz mais lipídio do que faria a planta de controle como um todo.

[0066] Em uma modalidade adicional, a planta tem um lipídio alterado, em pelo menos um de seus tecidos ou partes, em relação a uma planta de controle.

[0067] Em uma modalidade, a produção de 16:0 no triacilglicerol é alterada em relação àquela em uma planta de controle.

[0068] Em uma modalidade, a produção de 16:0 no triacilglicerol é alterada por pelo menos 1%, preferencialmente, pelo menos 2%, mais preferencialmente, pelo menos 3%, mais preferencialmente, pelo menos 4%, mais preferencialmente, pelo menos 5%, mais preferencialmente, pelo menos 6%, mais preferencialmente, pelo menos 7%, mais preferencialmente, pelo menos 8%, mais preferencialmente, pelo menos 9%, mais preferencialmente, pelo menos 10%, mais preferencialmente, pelo menos 11%, mais preferencialmente, pelo menos 12%, mais preferencialmente, pelo menos 13%, mais preferencialmente, pelo menos 14%, mais preferencialmente, pelo menos 15%, mais preferencialmente, pelo menos 16%, mais preferencialmente, pelo menos 17%, mais preferencialmente, pelo menos 18%, mais preferencialmen-te, pelo menos 19%, mais preferencialmente, pelo menos 20%, em relação àquela em uma célula de controle.

[0069] Em uma modalidade, o perfil de lipídio alterado tem uma produção de 16:0 no triacilglicerol na faixa de 6% a 16%. Nessa modalidade, a produção de 16:0 no triacilglicerol é alterada dentro da faixa de 6% a 16%.

[0070] Em uma modalidade adicional, a produção de 18:0 no tria- cilglicerol é alterada em relação àquela em uma planta de controle.

[0071] Em uma modalidade, a produção de 18:0 no triacilglicerol é alterada por pelo menos 1%, preferencialmente, pelo menos 2%, mais preferencialmente, pelo menos 3%, mais preferencialmente, pelo menos 4%, mais preferencialmente, pelo menos 5%, mais preferencialmente, pelo menos 6%, mais preferencialmente, pelo menos 7%, mais preferencialmente, pelo menos 8%, mais preferencialmente, pelo menos 9%, mais preferencialmente, pelo menos 10%, mais preferencialmente, pelo menos 11%, mais preferencialmente, pelo menos 12%, mais preferencialmente, pelo menos 13%, mais preferencialmente, pe- lo menos 14%, mais preferencialmente, pelo menos 15%, mais prefe-rencialmente, pelo menos 16%, mais preferencialmente, pelo menos 17%, mais preferencialmente, pelo menos 18%, mais preferencialmente, pelo menos 19%, mais preferencialmente, pelo menos 20%, em relação àquela em uma célula de controle.

[0072] Em uma modalidade, o perfil de lipídio alterado tem uma produção de 18:0 no triacilglicerol na faixa de 7% a 15%. Nessa modalidade, a produção de 18:0 no triacilglicerol é alterada dentro da faixa de 7% a 15%.

[0073] Em uma modalidade adicional, a produção de 18:1 no tria- cilglicerol é alterada em relação àquela em uma planta de controle.

[0074] Em uma modalidade, a produção de 18:1 no triacilglicerol é alterada por pelo menos 1%, preferencialmente, pelo menos 2%, mais preferencialmente, pelo menos 3%, mais preferencialmente, pelo menos 4%, mais preferencialmente, pelo menos 5%, mais preferencialmente, pelo menos 6%, mais preferencialmente, pelo menos 7%, mais preferencialmente, pelo menos 8%, mais preferencialmente, pelo menos 9%, mais preferencialmente, pelo menos 10%, mais preferencialmente, pelo menos 11%, mais preferencialmente, pelo menos 12%, mais preferencialmente, pelo menos 13%, mais preferencialmente, pelo menos 14%, mais preferencialmente, pelo menos 15%, mais preferencialmente, pelo menos 16%, mais preferencialmente, pelo menos 17%, mais preferencialmente, pelo menos 18%, mais preferencialmen-te, pelo menos 19%, mais preferencialmente, pelo menos 20%, em relação àquela em uma célula de controle.

[0075] Em uma modalidade, o perfil de lipídio alterado tem uma produção de 18:1 no triacilglicerol na faixa de 39% a 55%. Nessa modalidade, a produção de 18:1 no triacilglicerol é alterada dentro da faixa de 39% a 55%.

[0076] Em uma modalidade, a tecido é um tecido vegetativo. Em uma modalidade, a parte é uma folha. Em uma modalidade adicional, a parte é uma raiz. Em uma modalidade adicional, a parte é um bulbo. Em uma modalidade adicional, a parte é um cormo. Em uma modalidade adicional, a parte é um pedúnculo. Em uma modalidade adicional, a parte é um pedúnculo de uma planta monocotiledónea. Em uma modalidade adicional, a parte é um stovum (pedúnculo e lâmina foliar).

[0077] Em uma modalidade preferencial, o tecido é tecido de semente. Em uma modalidade preferencial, a parte é uma semente. Em uma modalidade preferencial, o tecido é tecido endosperma.

[0078] Em uma modalidade adicional, a planta como um todo tem um perfil de lipídio alterado em relação à planta de controle como um todo.

[0079] A planta de controle, pode ser qualquer planta do mesmo tipo que não seja transformada com o polinucleotídeo, ou constructo, da presente invenção para expressar a DGAT1 quimérica.

[0080] Em uma modalidade, a planta de controle é uma planta não transformada. Em uma modalidade adicional, a planta de controle é planta transformada para expressar a primeira DGAT1. Em uma modalidade adicional, a planta de controle é planta transformada para expressar a segunda DGAT1.

PLANTA TAMBÉM TRANSFORMADA PARA EXPRESSAR UMA OLEOSINA

[0081] Em uma modalidade, a planta também transformada para expressar pelo menos uma dentre: uma oleosina, uma esteroleosina, uma caleosina, poliolefinas e uma oleosina que inclui pelo menos uma Cisteína artificialmente introduzida (WO 2011/053169).

POLIPEPTÍDEO

[0082] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma proteína de DGAT1 quimérica que compreende: a) em sua extremidade N-terminal, uma porção N-terminal de uma primeira proteína de DGAT1, e b) em sua extremidade C-terminal, uma porção C-terminal de uma segunda proteína de DGAT1.

[0083] Em uma modalidade, a proteína de DGAT1 quimérica tem pelo menos uma dentre: i) atividade de DGAT1 aumentada ii) estabilidade aumentada iii) propriedades de oligomerização alteradas iv) propriedades de acúmulo de proteína celular substancialmente normais v) propriedades de focalização celular substancialmente normais em relação à primeira DGAT1, à segunda DGAT1 ou tanto à primeira DGAT1 e à segunda DGAT1.

[0084] Em uma modalidade adicional, a proteína de DGAT1 quimérica tem pelo menos uma dentre: i) atividade de DGAT1 aumentada ii) estabilidade aumentada iii) propriedades de oligomerização alteradas iv) propriedades de acúmulo de proteína celular substancialmente normais v) propriedades de focalização celular substancialmente normais em relação à primeira DGAT1.

[0085] Em uma modalidade adicional, a proteína de DGAT1 quimérica tem pelo menos uma dentre: i) atividade de DGAT1 aumentada ii) estabilidade aumentada iii) propriedades de oligomerização alteradas iv) propriedades de acúmulo de proteína celular substancialmente normais v) propriedades de focalização celular substancialmente normais em relação à segunda DGAT1.

[0086] Em uma modalidade, a proteína de DGAT1 quimérica quando expressada na planta tem pelo menos uma dentre: i) atividade de DGAT1 aumentada, ii) estabilidade aumentada, iii) propriedades de oligomerização alteradas, iv) propriedades de acúmulo de proteína celular substancialmente normais, e v) propriedades de focalização subcelular substancialmente normais em relação tanto à primeira DGAT1 quanto à segunda DGAT1.

[0087] Em uma modalidade, a porção N-terminal de uma primeira proteína de DGAT1 é a região citoplasmática N-terminal da primeira proteína de DGAT1. Em uma modalidade, a região citoplasmática N- terminal da primeira proteína de DGAT1 se estende do N-terminal da primeira proteína de DGAT1 para a extremidade do domínio de ligação de acil-CoA da primeira proteína de DGAT1. Em uma modalidade adicional, a região citoplasmática N-terminal da primeira proteína de DGAT1 é a região a montante do primeiro domínio transmembrana.

[0088] A posição do domínio de ligação de acil-CoA e do primeiro domínio transmembrana, para diversas proteínas de DGAT1, é mostrada na Figura 3.

[0089] Em uma modalidade, a junção entre a porção N-terminal de uma primeira proteína de DGAT1 e a porção C-terminal de uma segunda proteína de DGAT1 está a montante do primeiro domínio transmembrana.

[0090] Em uma modalidade, a junção entre a porção N-terminal de uma primeira proteína de DGAT1 e a porção C-terminal de uma segunda proteína de DGAT1 está no local de ligação acil-CoA da primeira e da segunda proteínas de DGAT1.

[0091] Em uma modalidade adicional, a junção entre a porção N- terminal de uma primeira proteína de DGAT1 e a porção C-terminal de uma segunda proteína de DGAT1 está em uma posição correspondente no local de ligação acil-CoA da primeira e da segunda proteínas de DGAT1.

[0092] Em uma modalidade, a junção entre a porção N-terminal de uma primeira proteína de DGAT1 e a porção C-terminal de uma segunda proteína de DGAT1 está dentro do LSS (Leu-Ser-Ser) conservado no local de ligação acil-CoA da primeira e da segunda proteínas de DGAT1.

[0093] Em uma modalidade preferencial, a DGAT1 quimérica tem um local de ligação acil-CoA intacto.

[0094] Em uma modalidade, o local de ligação acil-CoA na DGAT1 quimérica tem o mesmo comprimento do local de ligação acil-CoA na primeira proteína de DGAT1.

[0095] Em uma modalidade adicional, o local de ligação acil-CoA na DGAT1 quimérica tem o mesmo comprimento do local de ligação acil-CoA na segunda proteína de DGAT1.

[0096] Em uma modalidade preferencial, o local de ligação acil- CoA na DGAT1 quimérica tem o mesmo comprimento do local de ligação acil-CoA na primeira e segunda proteínas de DGAT1.

MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UMA DGAT1 QUIMÉRICA

[0097] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método para produzir uma proteína de DGAT1 quimérica, sendo que o método compreende combinar: a) uma porção N-terminal de uma primeira proteína de DGAT1, e b) uma porção C-terminal de uma segunda proteína de DGAT1.

[0098] Em uma modalidade preferencial, a proteína de DGAT1 quimérica compreende: c) em sua extremidade N-terminal, a porção N-terminal de uma primeira proteína de DGAT1, e d) em sua extremidade C-terminal, a porção C-terminal de uma segunda proteína de DGAT1.

[0099] Em uma modalidade, a proteína de DGAT1 quimérica tem pelo menos uma dentre: i) atividade de DGAT1 aumentada ii) estabilidade aumentada iii) propriedades de oligomerização alteradas iv) propriedades de acúmulo de proteína celular substancialmente normais v) propriedades de focalização celular substancialmente normais em relação à primeira DGAT1, à segunda DGAT1 ou tanto à primeira DGAT1 quanto à segunda DGAT1.

[00100] Em uma modalidade adicional, a proteína de DGAT1 quimérica tem pelo menos uma dentre: i) atividade de DGAT1 aumentada ii) estabilidade aumentada iii) propriedades de oligomerização alteradas iv) propriedades de acúmulo de proteína celular substancialmente normais v) propriedades de focalização celular substancialmente normais em relação à primeira DGAT1.

[00101] Em uma modalidade adicional, a proteína de DGAT1 quimérica tem pelo menos uma dentre: i) atividade de DGAT1 aumentada ii) estabilidade aumentada iii) propriedades de oligomerização alteradas iv) propriedades de acúmulo de proteína celular substanci- almente normais v) propriedades de focalização celular substancialmente normais em relação à segunda DGAT1.

[00102] Em uma modalidade adicional, a proteína de DGAT1 quimérica tem pelo menos uma dentre: i) atividade de DGAT1 aumentada ii) estabilidade aumentada iii) propriedades de oligomerização alteradas iv) propriedades de acúmulo de proteína celular substancialmente normais v) propriedades de focalização celular substancialmente normais em relação tanto à primeira DGAT1 quanto à segunda DGAT1.

[00103] Em uma modalidade adicional, o método compreende testar pelo menos uma dentre i) atividade ii) estabilidade iii) propriedades de oligomerização iv) propriedades de acúmulo de proteína celular v) propriedades de focalização celularda proteína de DGAT1 quimérica.

[00104] Em uma modalidade adicional, o método compreende a etapa de selecionar uma proteína de DGAT1 quimérica que tem pelo menos uma dentre: i) atividade de DGAT1 aumentada ii) estabilidade aumentada iii) propriedades de oligomerização alteradas iv) propriedades de acúmulo de proteína celular substancialmente normais v) propriedades de focalização celular substancialmente normais em relação à primeira DGAT1, à segunda DGAT1 ou tanto à primeira DGAT1 quanto à segunda DGAT1.

[00105] Em uma modalidade adicional, o método compreende a etapa de selecionar uma proteína de DGAT1 quimérica que tem pelo menos uma dentre: i) atividade de DGAT1 aumentada ii) estabilidade aumentada iii) propriedades de oligomerização alteradas iv) propriedades de acúmulo de proteína celular substancialmente normais v) propriedades de focalização celular substancialmente normais em relação à primeira proteína de DGAT1.

[00106] Em uma modalidade adicional, o método compreende a etapa de selecionar uma proteína de DGAT1 quimérica que tem pelo menos uma dentre: i) atividade de DGAT1 aumentada ii) estabilidade aumentada iii) propriedades de oligomerização alteradas iv) propriedades de acúmulo de proteína celular substancialmente normais v) propriedades de focalização celular substancialmente normais em relação à segunda proteína de DGAT1.

[00107] Em uma modalidade adicional, o método compreende a etapa de selecionar uma proteína de DGAT1 quimérica que tem pelo menos uma dentre: i) atividade de DGAT1 aumentada ii) estabilidade aumentada iii) propriedades de oligomerização alteradas iv) propriedades de acúmulo de proteína celular substancialmente normais v) propriedades de focalização celular substancialmente normais em relação tanto à primeira DGAT1 quanto à segunda DGAT1.

[00108] Em uma modalidade, a porção N-terminal de uma primeira proteína de DGAT1 é a região citoplasmática N-terminal da primeira proteína de DGAT1. Em uma modalidade, a região citoplasmática N- terminal da primeira proteína de DGAT1 se estende do N-terminal da primeira proteína de DGAT1 para a extremidade do domínio de ligação de acil-CoA da primeira proteína de DGAT1. Em uma modalidade adicional, a região citoplasmática N-terminal da primeira proteína de DGAT1 é a região a montante do primeiro domínio transmembrana.

[00109] A posição do domínio de ligação de acil-CoA e do primeiro domínio transmembrana, para diversas proteínas de DGAT1, é mostrada na Figura 3.

[00110] Em uma modalidade, a junção entre a porção N-terminal de uma primeira proteína de DGAT1 e a porção C-terminal de uma segunda proteína de DGAT1 está a montante do primeiro domínio transmembrana.

[00111] Em uma modalidade, a junção entre a porção N-terminal de uma primeira proteína de DGAT1 e a porção C-terminal de uma segunda proteína de DGAT1 está no local de ligação acil-CoA da primeira e da segunda proteínas de DGAT1.

[00112] Em uma modalidade adicional, a junção entre a porção N- terminal de uma primeira proteína de DGAT1 e a porção C-terminal de uma segunda proteína de DGAT1 está em uma posição correspondente no local de ligação acil-CoA da primeira e da segunda proteínas de DGAT1.

[00113] Em uma modalidade, a junção entre a porção N-terminal de uma primeira proteína de DGAT1 e a porção C-terminal de uma segunda proteína de DGAT1 está dentro do LSS (Leu-Ser-Ser) conser- vado no local de ligação acil-CoA da primeira e da segunda proteínas de DGAT1.

[00114] Em uma modalidade preferencial, a DGAT1 quimérica tem um local de ligação acil-CoA intacto.

[00115] Em uma modalidade, o local de ligação acil-CoA na DGAT1 quimérica tem o mesmo comprimento do local de ligação acil-CoA na primeira proteína de DGAT1.

[00116] Em uma modalidade adicional, o local de ligação acil-CoA na DGAT1 quimérica tem o mesmo comprimento do local de ligação acil-CoA na segunda proteína de DGAT1.

[00117] Em uma modalidade preferencial, o local de ligação acil- CoA na DGAT1 quimérica tem o mesmo comprimento do local de ligação acil-CoA na primeira e segunda proteínas de DGAT1.

PARTES DA PLANTA

[00118] Em uma modalidade adicional, a presente invenção fornece uma parte, propágulo ou progênie, de uma planta da presente invenção.

[00119] Em uma modalidade preferencial, a parte, propágulo ou progênie, compreende pelo menos um dentre um polinucleotídeo, constructo ou polipeptídeo da presente invenção.

[00120] Em uma modalidade preferencial, a parte, propágulo ou progênie, expressa pelo menos um dentre um polinucleotídeo, um constructo ou um polipeptídeo da presente invenção.

[00121] Em uma modalidade preferencial, a parte, propágulo ou progênie, expressa uma proteína de DGAT1 quimérica da presente invenção.

[00122] Em uma modalidade adicional, a parte, propágulo ou pro- gênie, produz mais lipídio do que faria uma parte, propágulo ou progê- nie, de controle, ou parte, propágulo ou progênie, de uma planta de controle.

[00123] Em uma modalidade, a parte, propágulo ou progênie, produz pelo menos 5%, mas preferencialmente, pelo menos 10%, mas preferencialmente, pelo menos 15%, mas preferencialmente, pelo menos 20%, mas preferencialmente, pelo menos 25%, mas preferencialmente, pelo menos 30%, mas preferencialmente, pelo menos 35%, mas preferencialmente, pelo menos 40%, mas preferencialmente, pelo menos 45%, mas preferencialmente, pelo menos 50%, mas preferencialmente, pelo menos 55%, mas preferencialmente, pelo menos 60%, mas preferencialmente, pelo menos 65%, mas preferencialmente, pelo menos 70%, mas preferencialmente, pelo menos 75%, mas preferencialmente, pelo menos 80%, mas preferencialmente, pelo menos 85%, mas preferencialmente, pelo menos 90%, mas preferencialmente, pelo menos 95%, mais preferencialmente, pelo menos 100%, mas prefe-rencialmente, pelo menos 105%, mas preferencialmente, pelo menos 110%, mas preferencialmente, pelo menos 115%, mas preferencialmente, pelo menos 120%, mas preferencialmente, pelo menos 125%, mas preferencialmente, pelo menos 130%, mas preferencialmente, pelo menos 135%, mas preferencialmente, pelo menos 140%, mas preferencialmente, pelo menos 145%, mas preferencialmente, pelo menos 150% mais lipídio do que faria uma parte, propágulo ou progê- nie, de controle, ou parte, propágulo ou progênie, de uma planta de controle.

[00124] Em uma modalidade adicional, à parte, propágulo ou pro- gênie, tem um perfil de lipídio alterado em relação a uma parte, propá- gulo ou progênie, de controle, ou parte, propágulo ou progênie, de uma planta de controle.

[00125] Em uma modalidade, a produção de 16:0 no triacilglicerol é alterada em relação àquela em uma parte, propágulo ou progênie, de controle, ou parte, propágulo ou progênie, de uma planta de controle.

[00126] Em uma modalidade, a produção de 16:0 no triacilglicerol é alterada por pelo menos 1%, preferencialmente, pelo menos 2%, mais preferencialmente, pelo menos 3%, mais preferencialmente, pelo menos 4%, mais preferencialmente, pelo menos 5%, mais preferencialmente, pelo menos 6%, mais preferencialmente, pelo menos 7%, mais preferencialmente, pelo menos 8%, mais preferencialmente, pelo menos 9%, mais preferencialmente, pelo menos 10%, mais preferencialmente, pelo menos 11%, mais preferencialmente, pelo menos 12%, mais preferencialmente, pelo menos 13%, mais preferencialmente, pelo menos 14%, mais preferencialmente, pelo menos 15%, mais preferencialmente, pelo menos 16%, mais preferencialmente, pelo menos 17%, mais preferencialmente, pelo menos 18%, mais preferencialmente, pelo menos 19%, mais preferencialmente, pelo menos 20%, em relação àquela em uma parte, propágulo ou progênie, de controle, ou parte, propágulo ou progênie, de uma planta de controle.

[00127] Em uma modalidade adicional, o perfil de lipídio alterado tem uma produção de 16:0 no triacilglicerol na faixa de 6% a 16%. Nessa modalidade, a produção de 16:0 no triacilglicerol é alterada dentro da faixa de 6% a 16%.

[00128] Em uma modalidade adicional, a produção de 18:0 no tria- cilglicerol é alterada em relação àquela em uma parte, propágulo ou progênie, de controle, ou parte, propágulo ou progênie, de uma planta de controle.

[00129] Em uma modalidade, a produção de 18:0 no triacilglicerol é alterada por pelo menos 1%, preferencialmente, pelo menos 2%, mais preferencialmente, pelo menos 3%, mais preferencialmente, pelo menos 4%, mais preferencialmente, pelo menos 5%, mais preferencialmente, pelo menos 6%, mais preferencialmente, pelo menos 7%, mais preferencialmente, pelo menos 8%, mais preferencialmente, pelo menos 9%, mais preferencialmente, pelo menos 10%, mais preferencialmente, pelo menos 11%, mais preferencialmente, pelo menos 12%, mais preferencialmente, pelo menos 13%, mais preferencialmente, pelo menos 14%, mais preferencialmente, pelo menos 15%, mais preferencialmente, pelo menos 16%, mais preferencialmente, pelo menos 17%, mais preferencialmente, pelo menos 18%, mais preferencialmente, pelo menos 19%, mais preferencialmente, pelo menos 20% em relação àquela em uma parte, propágulo ou progênie, de controle, ou parte, propágulo ou progênie, de uma planta de controle.

[00130] Em uma modalidade adicional, o perfil de lipídio alterado tem uma produção de 18:0 no triacilglicerol na faixa de 7% a 15%. Nessa modalidade, a produção de 18:0 no triacilglicerol é alterada dentro da faixa de 7% a 15%.

[00131] Em uma modalidade adicional, a produção de 18:1 no tria- cilglicerol é alterada em relação àquela em uma parte, propágulo ou progênie, de controle, ou parte, propágulo ou progênie, de uma planta de controle.

[00132] Em uma modalidade, a produção de 18:1 no triacilglicerol é alterada por pelo menos 1%, preferencialmente, pelo menos 2%, mais preferencialmente, pelo menos 3%, mais preferencialmente, pelo menos 4%, mais preferencialmente, pelo menos 5%, mais preferencialmente, pelo menos 6%, mais preferencialmente, pelo menos 7%, mais preferencialmente, pelo menos 8%, mais preferencialmente, pelo menos 9%, mais preferencialmente, pelo menos 10%, mais preferencialmente, pelo menos 11%, mais preferencialmente, pelo menos 12%, mais preferencialmente, pelo menos 13%, mais preferencialmente, pelo menos 14%, mais preferencialmente, pelo menos 15%, mais preferencialmente, pelo menos 16%, mais preferencialmente, pelo menos 17%, mais preferencialmente, pelo menos 18%, mais preferencialmen-te, pelo menos 19%, mais preferencialmente, pelo menos 20%, em relação àquela em uma parte, propágulo ou progênie, de controle, ou parte, propágulo ou progênie, de uma planta de controle.

[00133] Em uma modalidade adicional, o perfil de lipídio alterado tem uma produção de 18:1 no triacilglicerol na faixa de 39% a 55%. Nessa modalidade, a produção de 18:1 no triacilglicerol é alterada dentro da faixa de 39% a 55%.

[00134] A planta de controle pode ser qualquer planta do mesmo tipo que não seja transformada com o polinucleotídeo, ou constructo, da presente invenção para expressar a DGAT1 quimérica.

[00135] Em uma modalidade, a planta de controle é uma planta não transformada. Em uma modalidade adicional, a planta de controle é planta transformada para expressar a primeira proteína de DGAT1. Em uma modalidade adicional, a planta de controle é planta transformada para expressar a segunda proteína de DGAT1.

[00136] Preferencialmente, o controle da parte, propágulo ou pro- gênie, é proveniente de uma planta de controle conforme descrito acima.

[00137] Em uma modalidade, a parte é proveniente de um tecido vegetativo. Em uma modalidade, a parte é uma folha. Em uma modalidade adicional, a parte é uma raiz. Em uma modalidade adicional, a parte é um bulbo. Em uma modalidade adicional, a parte é um cormo. Em uma modalidade adicional, a parte é um pedúnculo. Em uma modalidade adicional, a parte é um pedúnculo de uma planta monocotile- dónea. Em uma modalidade adicional, a parte é um stovum (pedúnculo e lâmina foliar).

[00138] Em uma modalidade adicional, a parte é proveniente de um tecido reprodutivo. Em uma modalidade adicional, a parte é uma semente. Em uma modalidade preferencial, a parte é proveniente de ou inclui o tecido endosperma.

ALIMENTAÇÃO ANIMAL

[00139] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um insumo animal que compreende pelo menos um dentre um polinucleo- tídeo, constructo, célula, célula vegetal, parte de planta, propágulo e progênie da presente invenção.

INSUMO DE BIOCOMBUSTÍVEL

[00140] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um insumo de biocombustível que compreende pelo menos um dentre um polinucleotídeo, constructo, célula, célula vegetal, parte de planta, pro- págulo e progênie da presente invenção.

LIPÍDIO

[00141] Em uma modalidade, o lipídio é um óleo. Em uma modalidade adicional, o lipídio é triacilglicerol (TAG).

MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE LIPÍDIO

[00142] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método para produzir lipídio, em que o método compreende expressar uma proteína de DGAT1 quimérica da presente invenção em uma planta.

[00143] Em uma modalidade preferencial, a expressão da proteína de DGAT1 quimérica da presente invenção na planta leva à produção do lipídio na planta.

[00144] Em uma modalidade, o método inclui a etapa de transformar uma célula vegetal ou planta com um polinucleotídeo da presente invenção que codifica a proteína de DGAT1 quimérica.

[00145] Em uma modalidade adicional, o método inclui a etapa de extrair o lipídio da célula, célula vegetal ou planta, ou de uma parte, propágulo ou progênie, da planta.

[00146] Em uma modalidade, o lipídio é um óleo. Em uma modalidade adicional, o lipídio é triacilglicerol (TAG).

[00147] Em uma modalidade adicional, o lipídio é processado em pelo menos um dentre: a) um combustível, b) uma oleoquímica, c) um óleo nutritivo, d) um óleo cosmético, e) um ácido gorduroso poli-insaturado (PUFA), e f) uma combinação de qualquer um dentre a) a e).

[00148] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método para produzir lipídio, em que o método compreende extrair lipídio de pelo menos uma dentre uma célula, uma célula vegetal, uma planta, uma parte, propágulo e progênie, de planta da presente invenção.

[00149] Em uma modalidade, o lipídio é um óleo. Em uma modalidade adicional, o lipídio é triacilglicerol (TAG).

[00150] Em uma modalidade adicional, o lipídio é processado em pelo menos um dentre: a) um combustível, b) uma oleoquímica, c) um óleo nutritivo, d) um óleo cosmético, e) um ácido gorduroso poli-insaturado (PUFA), e d) uma combinação de qualquer um dentre a) a e).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00151] Neste relatório descritivo, em que a referência foi feita para os relatórios descritivos de patente, outros documentos externos ou outras fontes de informações, isto é, geralmente com a finalidade de fornecer um contexto para discutir os recursos da presente invenção. A menos que indicado especificamente o contrário, a referência a tais documentos externos não deve ser interpretada como uma admissão de que tais documentos, ou tais fontes de informações, em qualquer jurisdição, são da técnica anterior, ou provenientes da parte do conhecimento comum geral na técnica.

[00152] O termo "que compreende", conforme usado neste relatório descritivo, significa "que consiste em pelo menos parte de". Ao inter- pretar cada afirmação neste relatório descritivo, que inclui o termo "que compreende", os recursos diferentes de ou aqueles precedidos pelo termo também podem estar presentes. Os termos relacionados tal como "compreende" e "compreender" devem ser interpretados da mesma maneira. Em algumas modalidades, o termo "que compreende" (e termos relacionados tal como "compreende" e "compreender") pode ser substituído por "que consiste em" (e termos relacionados "consiste" e "consistir").

DEFINIÇÕES

[00153] O termo "DGAT1" conforme usado no presente documento significa acil CoA: diacilglicerol aciltransferase (EC 2.3.1.20)

[00154] DGAT1 é tipicamente a enzima de sintetização de TAG principal tanto na semente quanto na folha senescente (Kaup et al., 2002, Plant Physiol. 129(4):1.616 a 26; para revisões consulte Lung e Weselake 2006, Lipids. 41(12):1.073 a 88; Cahoon et al., 2007, Current Opinion in Plant Biology. 10:236 a 244; e Li et al., 2010, Lipids. 45:145 a 157).

[00155] DGAT1 contém aproximadamente 500 aminoácidos e tem 10 domínios transmembranas previstos se DGAT2 tiver apenas 320 aminoácidos e é previsto conter apenas dois domínios transmembra- nas; ambas as proteínas também foram previstas a terem seu N- terminal e seu C-terminal localizados no citoplasma (Shockey et al., 2006, Plant Cell 18:2294 a 2313). Tanto DGAT1 quanto DGAT2 têm ortólogos em animais e fungos e são proteínas transmembranas localizadas em ER.

[00156] Na maioria das plantas dicotiledóneas DGAT1 & DGAT2 parecem ser genes de cópia única enquanto há tipicamente duas versões de cada um nas gramíneas que surgem presumivelmente durante a duplicação do genoma de grama (Salse et al., 2008, Plant Cell, 20:11 a 24).

[00157] O termo "primeira proteína de DGAT1" ou "segunda proteína de DGAT1" conforme usado no presente documento significa tipicamente uma DGAT1 nativa ou de ocorrência de modo natural. Em alguns casos, a sequência DGAT1 pode ter sido montada a partir das sequências no genoma, mas não podem ser expressas em plantas. Em uma modalidade, a primeira ou a segunda proteínas de DGAT1 não podem, portanto, ser uma DGAT1 que é isolada da natureza.

[00158] Em uma modalidade, a "primeira proteína de DGAT1" ou a "segunda proteína de DGAT1" tem a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 29 ou uma variante das mesmas. Preferencialmente, a variante tem pelo menos 70% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 29. Em uma modalidade adicional, a "primeira proteína de DGAT1" ou a "segunda proteína de DGAT1" tem a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 29.

[00159] Em uma modalidade, a "primeira proteína de DGAT1" ou a "segunda proteína de DGAT1" é codificada por um polinucleotídeo que compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 30 a 58 ou uma variante das mesmas. Preferencialmente, a variante tem pelo menos 70% de identidade a qualquer uma das SEQ ID NOS: 30 a 58. Em uma modalidade adicional, a "primeira proteína de DGAT1" ou a "segunda proteína de DGAT1" é codifica por um polinucleotídeo que compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 30 a 58.

[00160] Em uma modalidade, as sequências de DGAT1 quimérica compreendem a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 59 a 94 ou uma variante das mesmas. Preferencialmente, a variante tem pelo menos 70% de identidade a qualquer uma das SEQ ID NOS: 59 a 94. Em uma modalidade adicional, as sequências de DGAT1 quimérica da sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 59 a 94.

[00161] Em uma modalidade adicional, as sequências de polipeptí- deo de DGAT1 quimérica têm a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 59, 61, 66, 68, 70 a 72, 74 a 76, 78, 79, 82, 84 a 86, 88 a 90, 92 e 93 ou uma variante das mesmas. Preferencialmente, a variante tem pelo menos 70% de identidade a qualquer uma das SEQ ID NOS: 59, 61, 66, 68, 70 a 72, 74 a 76, 78, 79, 82, 84 a 86, 88 a 90, 92 e 93. Em uma modalidade adicional, as sequencias de DGAT1 quimérica têm a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 59, 61, 66, 68, 70 a 72, 74 a 76, 78, 79, 82, 84 a 86, 88 a 90, 92 e 93.

[00162] Embora não preferencial, a DGAT1 quimérica da presente invenção pode incluir modificações adicionais em pelo menos uma dentre: a) a porção N-terminal de uma primeira proteína de DGAT1, e b) a porção C-terminal de uma segunda proteína de DGAT1.

[00163] Preferencialmente, a DGAT1 quimérica da presente invenção inclui um local de ligação de acil-CoA funcional.

[00164] Os termos a montante e a jusante estão de acordo com a convenção normal para significar em direção ao N-terminal de um po- lipeptídeo e em direção ao C-terminal de um polipeptídeo, respectivamente.

LOCAL DE LIGAÇÃO DE ACIL-CoA

[00165] A posição do local de ligação de acil-CoA em diversas sequências de DGAT1 é mostrado na Figura 3.

MOTIVO PRESERVADO ESPLSS

[00166] Em uma modalidade preferencial, o local de ligação de acil- CoA compreende o motivo preservado ESPLSS

FÓRMULA GERAL DE LOCAL DE LIGAÇÃO DE ACIL-CoA

[00167] Em uma modalidade preferencial, o local de ligação acil- CoA na DGAT1 quimérica tem a fórmula: XXXESPLSSXXIFXXXHA, em que X é qualquer aminoácido.

[00168] Em uma modalidade preferencial, o local de ligação acil- CoA na DGAT1 quimérica tem a fórmula: XXXESPLSSXXIFXXSHA, em que X é qualquer aminoácido.

[00169] Em uma modalidade preferencial, o local de ligação acil- CoA na DGAT1 quimérica tem a fórmula: X1X2X3ESPLSSX4X5IFX6X7X8HA, em que X1 = R, K, V, T, A, S ou G; X2 = A, T, V, I, N, R, S ou L; X3 = R ou K; X4 = D ou G; X5 = A, T, N, ou L; X6 = K ou R; X7 = Q ou H; e X8 = S ou é ausência.

[00170] Em uma modalidade preferencial, o local de ligação acil- CoA na DGAT1 quimérica tem a fórmula: X1X2X3ESPLSSX4X5IFX6X7SHA, em que X1 = R, K, V, T, A, S ou G; X2 = A, T, V, I, N, R, S ou L; X3 = R ou K; X4 = D ou G; X5 = A, T, N, ou L; X6 = K ou R; e X7 = Q ou H.

MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS DE DGAT1 QUIMÉRICAS

[00171] Os métodos para produção de proteínas quiméricas ou as sequências de polinucleotídeo que codificam as mesmas são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. A proteína de DGAT1 quimérica pode ser convencionalmente produzida combinando-se, com o uso de técnicas biológicas moleculares padrões tais como digestão de restrição e ligadura, as sequências que codificam as proteínas de DGAT1 e, desse modo, expressam a proteína de DGAT1 quimérica. Alternativamente, as sequências de polinucleotídeo que codificam as proteínas de DGAT1 quiméricas podem ser convencionalmente sintetizadas e as proteínas quiméricas expressadas a partir das sequências sintetizadas. Para formar múltiplas proteínas de DGAT1 quiméricas, as sequências de codificação podem ser sintetizadas para incluir locais de restrição que não alteram a sequência de aminoácido das proteínas expressadas. Esses locais de restrição podem ser utilizados para combinar sequências para produção e expressão das proteínas quiméricas. Esses métodos e similares para produção de proteínas quiméricas são conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00172] As sequências da primeira e da segunda proteína de DGAT1 e os polinucleotídeo de codificação, usados para produzir as proteínas de DGAT1 quiméricas da presente invenção, podem ser selecionadas a partir dos revelados no presente documento. Alternativamente, as sequências DGAT1 adicionais podem ser identificadas por meio de métodos bem conhecidos àqueles versados na técnica, que incluem pesquisa de banco de dados de bioinformática, bem como métodos de clonagem física. As sequências da primeira e da segunda proteína de DGAT1 pode ser de quaisquer espécies, incluindo plantes, animais e microrganismos.

[00173] A frase "atividade de DGAT1 aumentada" significa o aumento de atividade específica em relação àquela da primeira e/ou segunda proteína de DGAT1.

[00174] Um versado na técnica saberia como testar a "atividade específica" da DGAT1 quimérica. Isso pode ser tipicamente realizado por meio de isolamento, enriquecimento e quantificação da DGAT1 de recombinante com o uso, desse modo, desse material para determinar tanto a taxa de formação de triacilglicerídeo e/ou o desaparecimento dos substratos de precursor (que incluem várias formas de acil-CoA e DAG) como por Xu et al., (2008), Plant Biotechnology Journal. 6:799 a 818.

[00175] A frase "estabilidade aumentada" significa que a proteína de DGAT1 quimérica é mais estável, quando expressada em uma célula, do que a primeira e/ou segunda DGAT1. Isso pode levar a um acúmulo aumentada de DGAT1 quimérica ativa quando a mesma é expressada nas células, em relação a quando a primeira e/ou a segunda DGAT1 é expressada nas células.

[00176] Aqueles versados na técnica sabem como testar a "estabilidade" da DGAT1 quimérica. Isso deveria envolver tipicamente expressar a DGAT1 quimérica em uma célula, ou células e expressar a primeira ou a segunda DGAT1s em uma célula separada ou células do mesmo tipo. O acúmulo de quimérico e a primeira ou a segunda proteína de DGAT1 nas células respectivas pode, então, ser medido, por exemplo, por imunotransferência e/ou ELISA. Um nível maior de acúmulo da DGAT1 quimérica em relação à primeira ou à segunda DGAT1, no mesmo ponto no tempo, indica que a DGAT1 quimérica tem estabilidade aumentada. Alternativamente, a estabilidade tam-bém pode ser determinada pela formação de estrutura quaternária que também pode ser determinada por meio da análise de imuno- transferência.

[00177] A frase "propriedades de oligomerização alteradas" significa que a maneira em que, ou a extensão a qual a DGAT1 quimérica forma os oligômeros é alterada em relação à primeira e/ou à segunda DGAT1.

[00178] Aqueles versados na técnica sabem como testar as "propriedades de oligomerização" da DGAT1 quimérica. Isso pode ser tipicamente realizado por meio da análise de imunotransferência ou cro- matografia de exclusão de tamanho.

[00179] A frase "propriedades de acúmulo de proteína celular substancialmente normais" significa que a DGAT1 quimérica da presente invenção retém substancialmente a mesmo acúmulo de proteína quando expressada em uma célula, tal como a primeira e/ou a segunda DGAT1. Isto é, não há menos acúmulo de DGAT1 quimérica do que há acúmulo da primeira e/ou da segunda DGAT1, quando ambas são expressadas separadamente no mesmo tipo de célula.

[00180] Um versado na técnica saberia como testar as "propriedades de acúmulo de proteína celular" da DGAT1 quimérica. Isso envolveria tipicamente expressar a DGAT1 quimérica em uma célula, ou células e expressar a primeira ou a segunda DGAT1s em uma célula separada, ou células do mesmo tipo. O acúmulo de quimérico e a primeira ou a segunda proteína de DGAT1 nas células respectivas pode, então, ser medido, por exemplo por ELISA ou imunotransferência. Um nível substancialmente similar de acúmulo da DGAT1 quimérica em relação à primeira ou à segunda DGAT1, no mesmo ponto no tempo, indica que a DGAT1 quimérica tem aumentado as "propriedades de acúmulo de proteína celular substancialmente normais".

[00181] A frase "propriedades de alvejamento subcelular substancialmente normais" significa que a DGAT1 quimérica da presente invenção retém substancialmente o mesmo alvejamento subcelular quando expressada em uma célula, tal como a primeira e/ou segunda DGAT1. Isto é, a DGAT1 quimérica é alvejada para o(s) mesmo(s) comparti- mento(s) subcelular(es) tal como a primeira e/ou a segunda DGAT1, quando são expressadas separadamente no mesmo tipo de célula.

[00182] Um versado na técnica saberia como testar as "propriedades subcelulares de alvejamento" da DGAT1 quimérica. Isso envolveria tipicamente expressar a DGAT1 quimérica em uma célula, ou células e expressar a primeira ou a segunda DGAT1s em uma célula separada, ou células do mesmo tipo. O alvejamento subcelular do quimérico e a primeira ou a segunda proteínas de DGAT1 nas células respectivas podem, então, ser avaliados, por exemplo, por do uso da ultra- centrifugação para separar e do isolamento de frações subcelulares individuais que determina, desse modo, o nível de DGAT1 em cada fração. A "subfocalização celular" substancialmente similar da DGAT1 quimérica em relação à primeira ou à segunda DGAT1, no mesmo ponto no tempo, indica que a DGAT1 quimérica aumentou e a "proteína celular substancialmente normal" tem "propriedades subcelulares substancialmente normais".

LIPÍDIO

[00183] Em uma modalidade, o lipídio é um óleo. Em uma modalidade adicional, o óleo é triacilglicerol (TAG)

PRODUÇÃO DE LIPÍDIO

[00184] Em certas modalidades, a célula, células, tecidos, plantas e partes de planta da presente invenção produzem mais lipídio do que células de controle, tecidos, plantas e partes de planta.

[00185] Aqueles versados na técnica estão bem cientes dos métodos para medir a produção de lipídio. Isso pode ser tipicamente feito por análise espectral de massa de cromatografia a gás de éster de ácido metílico graxo quantitativo (FAMES GC-MS). Os métodos adequados também são descritos na seção exemplificativas deste relatório descritivo.

ESPECIFICIDADE DE SUBSTRATO

[00186] Em certas modalidades, os polipeptídeos da presente invenção têm especificidade de substrato alterada em relação às proteínas de DGAT1 parentais. As proteínas de DGAT1 de planta são relativamente misturadas em termos dos substratos de ácido graxo e espécies de DAG, as mesmas têm capacidade de utilização para gerar TAG. Tal como as mesmas podem ser consideradas a terem especificidade de substrato relativamente baixa. No entanto, isso pode ser modificado para que certos ácidos graxos se tornem um substrato preferencial em detrimento de outros. Isso leva a um aumento nas produções dos ácidos graxos preferenciais no TAG e a uma diminuição nas produções das espécies de ácido graxo não preferenciais. A especifi-cidade de substrato pode ser determinada por meio de análise quantitativa in vitro da produção de TAG que segue a adição de quantidades conhecidas e específicas de substratos purificados para quantidades conhecidas de DGAT recombinante, como por Xu et al., (2008), Plant Biotechnology Journal. 6:799 a 818.

PERFIL DE LIPÍDIO

[00187] Em uma modalidade adicional, a célula, células, tecidos, plantas e partes de planta da presente invenção têm um perfil de lipídio alterado em relação às células de controle, tecidos, plantas e partes de planta.

[00188] Aqueles versados na técnica estão bem cientes de métodos para avaliar o perfil de lipídio. Isso pode envolver avaliar a produção ou a porcentagem de pelo menos um dentre 16:0, 16:1, 18:0, 18:19 de espécies de ácido graxo presentes no lipídio. Isso pode ser tipicamente feito por meio da análise de éster de ácido metílico graxo (FAME) (Browse et al., 1986, Anal. Biochem. 152, 141 a 145). Os métodos adequados também são descritos na seção exemplificativa deste relatório descritivo.

CÉLULAS

[00189] A DGAT1 quimérica da presente invenção ou conforme usado nos métodos da presente invenção, pode ser expressada em qualquer tipo de célula.

[00190] Em uma modalidade, a célula é uma célula procariótica. Em uma modalidade adicional, a célula é uma célula eucariótica. Em uma modalidade, a célula é selecionada a partir de uma célula bacteriana, uma célula de levedura, uma célula fungicida, uma célula de inseto, célula de alga e uma célula vegetal. Em uma modalidade, a célula é uma célula bacteriana. Em uma modalidade adicional, a célula é uma célula de levedura. Em uma modalidade, a célula de levedura é uma célula S. ceriviseae. Em uma modalidade adicional, a célula é uma célula fungicida. Em uma modalidade adicional, a célula é uma célula de inseto. Em uma modalidade adicional, a célula é uma célula de alga. Em uma modalidade adicional, a célula é uma célula vegetal.

[00191] Em uma modalidade, a célula é uma célula não vegetal. Em uma modalidade, o não vegetal é selecionado a partir de E. coli, P. pastouis, S. ceriviseae, D. salina e C. reinhardtii. Em uma modalidade adicional, o não vegetal é selecionado a partir de P. pastouis, S. cerivi- seae, D. Salina e C. reinhardtii.

[00192] Em uma modalidade, a célula é uma célula microbiana. Em outra modalidade, a célula microbiana é uma célula de alga da divisão de Chlouophyta (alga verde), Rhodophyta (alga vermelha), Phae- ophyceae (alga marrom), Bacillariophycaeae (diatomáceas), ou Dino- flagellata (dinoflagelados). Em outra modalidade, a célula microbiana é uma célula de alga das espécies Chlamydomonas, Dunaliella, Bo- trycoccus, Chlouella, Crypthecodinium, Gracilaria, Sargassum, Pleuro- chrysis, Porphyridium, Phaeodactylum, Haematococcus, Isochrysis, Scenedesmus, Monodus, Cyclotella, Nitzschia ou Parietochlouis. Em outra modalidade, a célula de alga é Chlamydomonas reinhardtii. Em ainda outra modalidade, a célula é do gênero Yarrowia, Candida, Rho- dotouula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon, Lipomyces, Pythium, Schizochytrium, Thraustochytrium ou Ulkenia. Em ainda outra modalidade, a célula é uma bactéria do gênero Rhodococcus, Escherichia ou uma cianobactéria. Em ainda outra modalidade, a célula é uma célula de levedura. Em ainda outra modalidade, a célula é uma célula sintética.

PLANTAS

[00193] As sequências de primeira e/ou segunda DGAT1, a partir das quais as sequências de DGAT1 quimérica são produzidas, podem ser sequências DGAT1 que ocorrem naturalmente. Preferencialmente, as sequências da primeira e/ou segunda DGAT1 são provenientes de plantas. Em certas modalidades, as células em que as proteínas de DGAT1 quiméricas são expressadas são provenientes de plantas. Em outras modalidades, as proteínas de DGAT1 quiméricas são expressadas em plantas.

[00194] As células vegetais, a partir das quais a primeira e/ou segunda proteínas de DGAT1 são derivadas, das plantas a partir das quais as células vegetais são derivadas e as plantas em que as proteínas de DGAT1 quiméricas são expressadas podem ser provenientes de quaisquer espécies de planta.

[00195] Em uma modalidade, a célula vegetal ou planta é derivada de uma espécie de planta gimnosperma.

[00196] Em uma modalidade adicional, a célula vegetal ou planta é derivada de uma espécie de planta angiosperma.

[00197] Em uma modalidade adicional, a célula vegetal ou planta é derivada de uma espécie de planta dicotiledónea.

[00198] Em uma modalidade adicional, a célula vegetal ou planta é derivada de uma espécie de planta monocotiledóneas.

[00199] Outras plantas preferenciais são espécies de plantas forrageiras de um grupo que compreende, mas não se limita aos gêneros a seguir: Zea, Lolium, Houdium, Miscanthus, Saccharum, Festuca, Dac- tylis, Bromus, Thinopyrum, Trifolium, Medicago, Pheleum, Phalaris, Holcus, Glycine, Lotus, Plantago e Cichouium.

[00200] Outras plantas preferenciais são plantas leguminosas. A planta leguminosa ou parte da mesma pode abranger qualquer planta na família de planta Leguminosae ou Fabaceae. Por exemplo, as plantas podem ser selecionadas a partir de legumes forrageiros que incluem, alfalfa, trevo; leucaena; leguminosos que incluem, feijões, lentilhas, tremoços, ervilhas, amendoim, feijão de soja; legumes de florescência que incluem tremoço, legumes industriais e farmacêuticos e pousio ou espécies de legume de adubo verde.

[00201] Um gênero particularmente preferencial é Trifolium. As espécies de Trifolium preferenciais incluem Trifolium repens; Trifolium arvense; Trifolium affine e Trifolium occidentale. Uma espécie de Trifolium particularmente preferencial é Trifolium repens.

[00202] Outro gênero preferencial é Medicago. As espécies de Me- dicago preferenciais incluem Medicago sativa e Medicago truncatula. Uma espécie de Medicago particularmente preferencial é Medicago sativa, comumente conhecida como alfalfa.

[00203] Outro gênero preferencial é Glycine. As espécies de Glycine preferenciais incluem Glycine max e Glycine wightii (também conhecidas como Neonotonia wightii). Uma espécie de Glycine particularmente preferencial é Glycine max, comumente conhecida como feijão de soja. Uma espécie de Glycine particularmente preferencial é Glycine wightii, comumente conhecida como soja perene.

[00204] Outro gênero preferencial é Vigna. Uma espécie de Vigna particularmente preferencial é Vigna unguiculata comumente conhecida como feijão-de-corda.

[00205] Outro gênero preferencial é Mucana. Uma espécie de Mu- cana preferencial inclui Mucana pruniens. Uma espécie de Mucana particularmente preferencial é Mucana pruniens comumente conhecida como mucuna-preta.

[00206] Outro gênero preferencial é Arachis. Uma espécie de Ara- chis particularmente preferencial é Arachis glabrata comumente conhecida como amendoim perene.

[00207] Outro gênero preferencial é Pisum. Uma espécie de Pisum preferencial é Pisum sativum comumente conhecida como ervilha.

[00208] Outro gênero preferencial é Lotus. As espécies de Lotus preferenciais incluem Lotus couniculatus, Lotus pedunculatus, Lotus glabar, Lotus tenuis e Lotus uliginosus. Uma espécie de Lotus preferencial é Lotus couniculatus comumente conhecida como Birdsfoot Trefoil. Outra espécie de Lotus preferencial é Lotus glabar comumente conhecida como Trifólio Pé-de-Galinha de Folha Estreita. Outra espé- cie de Lotus preferencial é Lotus pedunculatus comumente conhecida como Trifólio Grande. Outra espécie de Lotus preferencial é Lotus tenuis comumente conhecida como Trifólio Delgado.

[00209] Outro gênero preferencial é Brassica. Uma espécie de Brassica preferencial é Brassica oleracea, comumente conhecida como couve forrageira e repolho. Um gênero de Brassica preferencial é Camelina. Uma espécie de Camelina preferencial é Camelina sativa.

[00210] Outras espécies preferenciais são culturas de semente oleaginosas que incluem, mas não se limitam ao gênero a seguir: Brassica, Carthumus, Helianthus, Zea e Sesamum.

[00211] Um gênero de semente oleaginosa preferencial é Brassica. Uma espécie de semente oleaginosa preferencial é Brassica napus.

[00212] Um gênero de semente oleaginosa preferencial é Brassica. Uma espécie de semente oleaginosa preferencial é Brassica oleraceae.

[00213] Um gênero de semente oleaginosa preferencial é Cartha- mus. Uma espécie de semente oleaginosa preferencial é Carthamus tinctouius.

[00214] Um gênero de semente oleaginosa preferencial é Helian- thus. Uma espécie de semente oleaginosa preferencial é Helianthus annuus.

[00215] Um gênero de semente oleaginosa preferencial é Zea. Uma espécie de semente oleaginosa preferencial é Zea mays.

[00216] Um gênero de semente oleaginosa preferencial é Sesa- mum. Uma espécie de semente oleaginosa preferencial é Sesamum indicum.

[00217] Um gênero de silagem preferencial é Zea. Uma espécie de silagem preferencial é Zea mays.

[00218] Um gênero de produção de grão preferencial é Houdeum. Uma espécie de produção de grão preferencial é Houdeum vulgare.

[00219] Um gênero de pastagem preferencial é Lolium. Uma espé- cie de pastagem preferencial é Lolium perenne.

[00220] Um gênero de pastagem preferencial é Lolium. Uma espécie de pastagem preferencial é Lolium arundinaceum.

[00221] Um gênero de pastagem preferencial é Trifolium. Uma espécie de pastagem preferencial é Trifolium repens.

[00222] Um gênero de pastagem preferencial é Houdeum. Uma espécie de pastagem preferencial é Houdeum vulgare.

[00223] As plantas preferenciais também incluem forragem ou plantas de insumo animal. Tais plantas incluem, mas não são limitadas aos gêneros a seguir: Miscanthus, Saccharum, Panicum.

[00224] Um gênero biocombustível preferencial é Miscanthus. Uma espécie de biocombustível preferencial é Miscanthus giganteus.

[00225] Um gênero biocombustível preferencial é Saccharum. Uma espécie de biocombustível preferencial é Saccharum officinarum.

[00226] Um gênero biocombustível preferencial é Panicum. Uma espécie de biocombustível preferencial é Panicum virgatum.

PARTES DE PLANTA, PROPÁGULOS E PROGÊNIE

[00227] O termo "planta" se destina a incluir uma planta completa, qualquer parte de uma planta, uma semente, uma fruta, propágulos e progênie de uma planta.

[00228] O termo "propágulo" significa qualquer parte de uma planta que pode ser usado na reprodução ou propagação, tanto sexual ou assexual, incluindo sementes e recortes.

[00229] As plantas da presente invenção podem ser cultivadas e tanto autofecundadas ou cruzadas com uma cepa de planta diferente e a progênie resultante, que compreende os polinucleotídeos ou cons- tructos da presente invenção, e/ou expressão de sequências de DGAT1 quiméricas da presente invenção, também formam uma parte da presente invenção.

[00230] Preferencialmente, as plantas, partes de planta, propágulos e progênie compreendem um polinucleotídeo ou constructo da presente invenção e/ou expressam uma sequência de DGAT1 quimérica da presente invenção.

POLINUCLEOTÍDEOS E FRAGMENTOS

[00231] O termo "polinucleotídeo(s)", conforme usado no presente documento, significa um polímero de ribonucleotídeo ou deoxiribonu- cleotídeo de ramificação simples ou dupla de qualquer comprimento, mas preferencialmente pelo menos 15 nucleotídeos, e inclui como exemplos não limitantes, sequências de codificação ou não codificação de um gene, complementos de sequências de senso e antissenso, exões, intrões, DNA genômico, DNAc, pre-mRNA, mRNA, rRNA, siRNA, miRNA, tRNA, ribozimas, polipeptídeos recombinantes, sequências de RNA ou DNA isoladas e purificadas de ocorrência natural, sequências de RNA e DNA sintéticas, sondas de ácidos nucleicos, iniciadores e fragmentos.

[00232] Um "fragmento" de uma sequência de polinucleotídeo fornecida no presente documento é uma subsequência de nucleotídeos contíguos.

[00233] O termo "iniciador" se refere a um polinucleotídeo curto, que tem geralmente um grupo isento de 3’OH, que é hibridizado para um modelo e usado para preparar a polimerização de um polinucleotí- deo complementar ao alvo.

[00234] O termo "sonda" se refere a um polinucleotídeo curto que é usado para detectar uma sequência de polinucleotídeo que é complementar à sonda, em um ensaio a base de hibridização. A sonda pode consistir em um "fragmento" de um polinucleotídeo como definido no presente documento.

POLIPEPTÍDEOS E FRAGMENTOS

[00235] O termo "polipeptídeo", conforme usado no presente documento, abrange cadeias de aminoácidos de qualquer comprimento, mas, preferencialmente, pelo menos 5 aminoácidos, que incluem proteínas de comprimento completo, em que os resíduos de aminoácido são ligados por ligações peptídicas covalentes. Os polipeptídeos da presente invenção, ou usados nos métodos da presente invenção, podem ser produtos naturais purificados, ou podem ser produzidos parcial ou completamente com o uso de técnicas recombinantes ou sintéticas.

[00236] Um "fragmento" de um polipeptídeo é uma subsequência do polipeptídeo que realiza preferencialmente uma função de e/ou fornece três estruturas dimensionais do polipeptídeo. O termo pode se referir a um polipeptídeo, um agregado de um polipeptídeo tal como um dímero ou outro multímero, uma polipeptídeo de fusão, um fragmento de polipeptídeo, um polipeptídeo variante ou derivado dos mesmos com capacidade para realizar a atividade enzimática acima.

[00237] O termo "isolado" conforme aplicado às sequencias de poli- nucleotídeo ou polipeptídeo reveladas no presente documento é usado para se referis às sequências que são removidas do seu ambiente celular natural. Uma molécula isola pode ser obtida por qualquer método ou combinação de métodos que inclui técnicas bioquímicas, recombi- nantes e sintéticas.

[00238] O termo "recombinante" se refere a uma sequência de poli- nucleotídeo que é removida das sequências que envolvem a mesma em seu contexto natural e/ou é recombinada com sequências que não estão presentes em seu contexto natural.

[00239] Uma sequência de polipeptídeo "recombinante" é produzida pela translação de uma sequência de polinucleotídeo "recombinante".

[00240] O termo "derivado de" em relação aos polinucleotídeos ou polipeptídeos da presente invenção que são derivados de uma espécie ou gênero particular, significa que o polinucleotídeo ou polipeptídeo tem a mesma sequência de um polinucleotídeo ou polipeptídeo encontrado naturalmente naquele gênero ou espécie. O polinucleotídeo ou polipeptídeo, derivado de uma espécie ou gênero particular, pode, portanto, ser produzido sintética ou recombinantemente.

VARIANTES

[00241] Conforme usado no presente documento, o termo "variante" se refere a sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas diferentes das sequências especificamente identificadas, em que um ou mais resíduos de nucleotídeos ou aminoácidos são deletados, substituídos ou adicionados. As variantes podem ser variantes alélicas de ocorrência natural, variantes de ocorrência não natural. As variantes podem ser da mesma espécie ou de espécies diferentes e podem englobar homólogos, parálogos e ortólogos. Em certas modalidades, as variantes dos polipeptídeos e os polipeptídeos possuem atividades biológicas iguais ou similares àquelas dos polipeptídeos ou polipeptídeos. O termo "variante" com referência a polipeptídeos e polipeptídeos engloba todas as formas de polipeptídeos e polipeptídeos como definido no presente documento.

VARIANTES DE POLINUCLEOTÍDEOS

[00242] As sequências variantes de polinucleotídeos preferencialmente exibem pelo menos 50%, mais preferencialmente pelo menos 51%, mais preferencialmente pelo menos 52%, mais preferencialmente pelo menos 53%, mais preferencialmente pelo menos 54%, mais preferencialmente pelo menos 55%, mais preferencialmente pelo menos 56%, mais preferencialmente pelo menos 57%, mais preferencialmente pelo menos 58%, mais preferencialmente pelo menos 59%, mais preferencialmente pelo menos 60%, mais preferencialmente pelo menos 61%, mais preferencialmente pelo menos 62%, mais preferencialmente pelo menos 63%, mais preferencialmente pelo menos 64%, mais preferencialmente pelo menos 65%, mais preferencialmente pelo menos 66%, mais preferencialmente pelo menos 67%, mais preferencialmente pelo menos 68%, mais preferencialmente pelo menos 69%, mais preferencialmente pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 71%, mais preferencialmente pelo menos 72%, mais preferencialmente pelo menos 73%, mais preferencialmente pelo menos 74%, mais preferencialmente pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 76%, mais preferencialmente pelo menos 77%, mais preferencialmente pelo menos 78%, mais preferencialmente pelo menos 79%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 81%, mais preferencialmente pelo menos 82%, mais preferencialmente pelo menos 83%, mais preferencialmente pelo menos 84%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 86%, mais preferencialmente pelo menos 87%, mais preferencialmente pelo menos 88%, mais preferencialmente pelo menos 89%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, mais preferencialmente pelo menos 93%, mais preferencialmente pelo menos 94%, mais preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 96%, mais preferencialmente pelo menos 97%, mais preferencialmente pelo menos 98%, e com a maior preferência possível pelo menos 99% de identidade com uma sequência da presente invenção. A identidade é encontrada em uma janela de comparação de pelo menos 20 posições de nucleotídeos, preferencialmente pelo menos 50 posições de nucleotídeos, mais preferencialmente pelo menos 100 posições de nucleotídeos e com a maior preferência possível em todo o comprimento de um polinucleotídeo da presente invenção.

[00243] A identidade de sequência de polinucleotídeos pode ser determinada da seguinte maneira. A sequência de polinucleotídeos pertinente é comparada a uma sequência de polinucleotídeos candidata com o uso de BLASTN (do pacote de programas BLAST, versão 2.2.5 [novembro de 2002]) em bl2seq (Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), "Blast 2 sequences - a new tool para comparing pro tein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174: páginas 247 a 250), o qual está disponível no site da NCBI na Internet em ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/. Utilizam-se os parâmetros padrão de bl2seq, exceto pelo filtro de partes de baixa complexidade, que deve ser desligado.

[00244] A identidade de sequências de polinucleotídeos pode ser examinada com o uso dos seguintes parâmetros de linha de comando do unix: bl2seq -i nucleotideseql -j nucleotideseq2 -F F -p blastn

[00245] O parâmetro -F F desliga a filtragem das seções de baixa complexidade. O parâmetro -p seleciona o algoritmo apropriado para o par de sequências. O programa bl2seq relata a identidade de sequência tanto como quantidade quanto como porcentagem de nucleo- tídeos idênticos em uma linha "Identities = ".

[00246] A identidade das sequências de polinucleotídeos também pode ser calculada por todo o comprimento da sobreposição entre as sequências de polinucleotídeos candidata e pertinente com o uso de programas de alinhamento global de sequências (por exemplo, Needleman, S. B. e Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, páginas 443 a 453). Uma implantação completa do algoritmo de alinhamento global Needleman-Wunsch é encontrada no programa Needle do pacote EMBOSS (Rice, P. Longden, I. e Bleasby, A. EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Trends in Genetics, junho de 2000, volume 16, n° 6, páginas 276 a 277), o qual pode ser obtido na Internet em http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/. O servi-dor do Instituto Europeu de Bioinformática também fornece a estrutura necessária para efetivar alinhamentos globais EMBOSS-needle entre duas sequências, online, em http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/.

[00247] Alternativamente o programa GAP pode ser usado, o qual computa um alinhamento global ideal das duas sequências sem pena- lizar os intervalos terminais. O GAP é descrito no trabalho a seguir: Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, páginas 227 a 235.

[00248] Um método preferencial para calcular a % de polinucleotí- deos da identidade de sequência; e baseado no alinhamento de sequências a ser comparadas com o uso de Clustal X (Jeanmougin et al., 1998, Trends Biochem. Sci. 23, páginas 403 a 405.)

[00249] As variantes de polinucleotídeo da presente invenção também englobam aquelas que exibem uma similaridade a uma ou mais das sequências especificamente identificadas com probabilidade de preservar a equivalência funcional dessas sequências e as quais não apresentem uma chance razoável de terem ocorrido aleatoriamente. Tal similaridade de sequência com relação aos polipeptídeos pode ser determinada com o uso do programa bl2seq disponível publicamente a partir do pacote de programas BLAST (versão 2.2.5 [novembro de 2002]) do site da NCBI na Internet, em ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/.

[00250] A similaridade de sequências de polinucleotídeos pode ser examinada com o uso dos seguintes parâmetros de linha de comando do unix: bl2seq -i nucleotideseql -j nucleotideseq2 -F F -p tblastx

[00251] O parâmetro -F F desliga a filtragem das seções de baixa complexidade. O parâmetro -p seleciona o algoritmo apropriado para o par de sequências. Esse programa encontra regiões de similaridade entre as sequências e, para cada região desse tipo, relata um "valor E", que é a quantidade de vezes prevista para uma possível correspondência por acaso em um banco de dados de um tamanho fixo de referência que contenha sequências aleatórias. O tamanho desse banco de dados é configurado por padrão no programa bl2seq. Para valores E pequenos, bem menores que um, o valor E é aproximadamente a probabilidade de tal correspondência aleatória.

[00252] As sequências de polinucleotídeos variantes preferencialmente exibem um valor E inferior a 1 x 10 -6 mais preferencialmente inferior a 1 x 10 -9, mais preferencialmente inferior a 1 x 10 -12, mais preferencialmente inferior a 1 x 10 -15, mais preferencialmente inferior a 1 x 10 -18, mais preferencialmente inferior a 1 x 10 -21, mais preferencialmente inferior a 1 x 10 -30, mais preferencialmente inferior a 1 x 10 -40, mais preferencialmente inferior a 1 x 10 -50, mais preferencialmente inferior a 1 x 10 -60, mais preferencialmente inferior a 1 x 10 - 70, mais preferencialmente inferior a 1 x 10 -80, mais preferencialmente inferior a 1 x 10 -90 e com a maior preferência possível inferior a 1 x 10 -100 em comparação com qualquer uma das sequências especificamente identificadas.

[00253] Alternativamente, os polinucleotídeos variantes da presente invenção, ou usados nos métodos da presente invenção, se hibridizam para as sequências de polinucleotídeos especificadas ou para complementos das mesmas sob condições rigorosas.

[00254] A expressão "se hibridiza sob condições rigorosas" e equivalentes ortogramaticais da mesma se referem à capacidade de uma molécula de polinucleotídeo de se hibridizar para uma molécula-alvo de polinucleotídeo (tal como uma molécula-alvo de polinucleotídeo imobilizada em um blot de DNA ou RNA, tal como um Southern blot ou Northern blot) sob condições definidas de temperatura e concentração de sal. A capacidade de se hibridizar sob condições rigorosas de hibri- dização pode ser determinada hibridizando-se inicialmente sob condições menos rigorosas e, então, aumentando-se a rigorosidade até a rigorosidade desejada.

[00255] Com relação às moléculas de polinucleotídeo maiores que aproximadamente 100 bases de comprimento, as condições rigorosas de hibridização típicas são de não mais que 25 a 30° C (por exemplo, 10° C) abaixo do ponto de fusão (Tm) do duplex nativo (consulte, de maneira geral, Sambrook et al., Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição. Cold Spring Harbor Press; Ausubel et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing,). O Tm para moléculas de polinucleotídeo maiores que aproximadamente 100 bases pode ser calculado com a Fórmula Tm = 81,5 + 0,41% (G + C-log (Na+). (Sambrook et al., Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Press; Bolton e McCarthy, 1962, PNAS 84:1390). As condições rigorosas típicas para polinucleotídeo maiores que 100 bases de comprimento seriam condições de hibridização tais como uma pré-lavagem em uma solução de SSC 6X, SDS a 0,2%; uma hibridização a 65 °C, SSC 6X, SDS a 0,2% de um dia para o outro; seguida por duas lavagens de 30 minutos cada em SSC 1X, SDS a 0,1% a 65 °C e duas lavagens de 30 minutos cada em SSC 0,2X, SDS a 0,1% a 65 °C.

[00256] Com relação a moléculas de polinucleotídeo com um comprimento inferior a 100 bases, as condições rigorosas de hibridização exemplificativas são de 5 a 10° C abaixo do Tm. Em média, o Tm de uma molécula de polinucleotídeo de comprimento inferior a 100 bp é reduzido em aproximadamente (500/comprimento de oligonucleotídeo) °C.

[00257] Com relação aos mimetizadores de DNA conhecidos como ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) (Nielsen et al., Science. 06 de dezembro de 1991;254(5037):1.497 a 1.500) os valores Tm são maiores que para híbridos de DNA com DNA ou de DNA com RNA, e podem ser calculados com o uso da Fórmula descrita em Giesen et al., Nucleic Acids Res. 1° de novembro de 1998;26(21): páginas 5.004 a 5.006. As condições rigorosas de hibridização exemplificativas para um híbrido de DNA com RNA com um comprimento inferior a 100 bases são de 5 a 10° C abaixo do Tm.

[00258] Os polinucleotídeos variantes da presente invenção, ou aqueles usados em métodos da presente invenção, também englobam polinucleotídeos que divergem das sequências da presente invenção, mas que, como uma consequência da degeneração do código genético, codificam um polipeptídeo com uma atividade similar àquela de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo da presente invenção. Uma alteração de sequência que não muda a sequência de aminoáci- dos do polipeptídeo é uma "variação silenciosa". Exceto pela ATG (metionina) e TGG (triptofano), outros códons para o mesmo aminoá- cido podem ser mudados por procedimentos reconhecidos na técnica, por exemplo, para aperfeiçoar a expressão de códons em um organismo hospedeiro particular.

[00259] As alterações de sequências de polinucleotídeos que resultam em substituições conservadores de um ou de vários aminoácidos na sequência codificada de polipeptídeo sem uma alteração significativa em sua atividade biológica também são incluídas na presente invenção. Um profissional habilidoso terá ciência de métodos para fazer substituições fenotipicamente silenciosas de aminoácidos (consulte, por exemplo, Bowie et al., 1990, Science 247, página 1306).

[00260] Os polinucleotídeos variantes causados por variações silenciosas e substituições conservadoras na sequência de polipeptí- deos codificada podem ser determinados com o uso do programa publicamente disponível bl2seq, do pacote de programas BLAST (versão 2.2.5 [novembro de 2002]) do site da NCBI na Internet em ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/ através do algoritmo tblastx, conforme descrito previamente.

VARIANTES DE POLIPEPTÍDEO

[00261] O termo "variante" com referência a polipeptídeos engloba polipeptídeos de ocorrência natural e aqueles produzidos por recombi- nação ou sinteticamente. As sequências de polipeptídeos variantes preferencialmente exibem pelo menos 50%, mais preferencialmente pelo menos 51%, mais preferencialmente pelo menos 52%, mais pre- ferencialmente pelo menos 53%, mais preferencialmente pelo menos 54%, mais preferencialmente pelo menos 55%, mais preferencialmente pelo menos 56%, mais preferencialmente pelo menos 57%, mais preferencialmente pelo menos 58%, mais preferencialmente pelo menos 59%, mais preferencialmente pelo menos 60%, mais preferencialmente pelo menos 61%, mais preferencialmente pelo menos 62%, mais preferencialmente pelo menos 63%, mais preferencialmente pelo menos 64%, mais preferencialmente pelo menos 65%, mais preferencialmente pelo menos 66%, mais preferencialmente pelo menos 67%, mais preferencialmente pelo menos 68%, mais preferencialmente pelo menos 69%, mais preferencialmente pelo menos 70%, mais preferen-cialmente pelo menos 71%, mais preferencialmente pelo menos 72%, mais preferencialmente pelo menos 73%, mais preferencialmente pelo menos 74%, mais preferencialmente pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 76%, mais preferencialmente pelo menos 77%, mais preferencialmente pelo menos 78%, mais preferencialmente pelo menos 79%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 81%, mais preferencialmente pelo menos 82%, mais preferencialmente pelo menos 83%, mais preferencialmente pelo menos 84%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 86%, mais preferencialmente pelo menos 87%, mais preferencialmente pelo menos 88%, mais preferencialmente pelo menos 89%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferen-cialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, mais preferencialmente pelo menos 93%, mais preferencialmente pelo menos 94%, mais preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 96%, mais preferencialmente pelo menos 97%, mais preferencialmente pelo menos 98% e com a maior preferência possível, pelo menos 99% de identidade com uma sequência da presente invenção. A identidade é constatada através de uma janela de comparação de pelo menos 20 posições de aminoácidos, preferencialmente pelo menos 50 posições de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos 100 posições de aminoácidos e com a maior preferência possível por todo o comprimento de um polipeptídeo da presente invenção.

[00262] A identidade de sequência de polipeptídeos pode ser determinada de a maneira a seguir. A sequência de polipeptídeos pertinente é comparada a uma sequência de polipeptídeos candidata com o uso de BLASTP (do pacote de programas BLAST, versão 2.2.5 [novembro de 2002]) em bl2seq, o qual está disponível publicamente através do site da NCBI na Internet em ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/. Utilizam-se os parâmetros padrão de bl2seq, exceto pelo filtro de regiões de baixa complexidade, que deve ser desligado.

[00263] A identidade das sequências de polipeptídeos também pode ser calculada por todo o comprimento da sobreposição entre as sequências de polinucleotídeos candidata e pertinente com o uso de programas de alinhamento global de sequências. O EMBOSS Needle (disponível em http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/) e o GAP (Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, páginas 227 a 235.), conforme descritos acima, também são adequados como programas de alinhamento global de sequências para calcular a identidade de sequência de polipeptídeos.

[00264] Um método preferencial para calcular a % de polipeptídeos da identidade de sequência; e baseado no alinhamento de sequências a ser comparadas com o uso de Clustal X (Jeanmougin et al., 1998, Trends Biochem. Sci. 23, páginas 403 a 405.)

[00265] As variantes de polipeptídeo da presente invenção, ou aqueles usados nos métodos da presente invenção, também englobam aquelas que exibem uma similaridade a uma ou mais das sequências especificamente identificadas com probabilidade de preser- var a equivalência funcional dessas sequências e as quais não apresentem uma chance razoável de terem ocorrido aleatoriamente. Tal similaridade de sequência com relação aos polipeptídeos pode ser determinada com o uso do programa bl2seq disponível publicamente a partir do pacote de programas BLAST (versão 2.2.5 [novembro de 2002]) do site da NCBI na Internet, em ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/. A similaridade de sequências de polipeptídeos pode ser examinada com o uso dos seguintes parâmetros de linha de comando do unix: bl2seq -i peptídeoseql -j peptídeoseq2 -F F -p blastp

[00266] As sequências de polipeptídeos variantes preferencialmente exibem um valor E inferior a 1 x 10 -6 mais preferencialmente inferior a 1 x 10 -9, mais preferencialmente inferior a 1 x 10 -12, mais preferencialmente inferior a 1 x 10 -15, mais preferencialmente inferior a 1 x 10 -18, mais preferencialmente inferior a 1 x 10 -21, mais preferencialmente inferior a 1 x 10 -30, mais preferencialmente inferior a 1 x 10 - 40, mais preferencialmente inferior a 1 x 10 -50, mais preferencialmente inferior a 1 x 10 -60, mais preferencialmente inferior a 1 x 10 -70, mais preferencialmente inferior a 1 x 10 -80, mais preferencialmente inferior a 1 x 10 -90 e com a maior preferência possível 1 x 10 -100 em comparação com qualquer uma das sequências especificamente identificadas.

[00267] O parâmetro -F F desliga a filtragem das seções de baixa complexidade. O parâmetro -p seleciona o algoritmo apropriado para o par de sequências. Esse programa encontra regiões de similaridade entre as sequências e, para cada região desse tipo, relata um "valor E", que é a quantidade de vezes prevista para uma possível correspondência por acaso em um banco de dados de um tamanho fixo de referência que contenha sequências aleatórias. Para valores E pequenos, bem menores que um, o mesmo é aproximadamente a probabilidade de tal correspondência aleatória.

[00268] As substituições conservadores de um ou de vários amino- ácidos de uma sequência de polipeptídeos descrita sem uma alteração significativa em sua atividade biológica também são incluídas na presente invenção. Um profissional habilidoso terá ciência de métodos para fazer substituições fenotipicamente silenciosas de aminoácidos (consulte, por exemplo, Bowie et al., 1990, Science 247, página 1306).

CONSTRUCTOS, VETORES E COMPONENTES DOS MESMOS

[00269] A expressão " constructo genético" se refere a uma molécula de polinucleotídeo, normalmente de DNA de fita dupla, que possa ser inserida em outra molécula de polinucleotídeo (a molécula de poli- nucleotídeo de inserção) tal como, mas sem limitação a uma molécula de DNAc. Um constructo genético pode conter os elementos necessários que possibilitam a transcrição da molécula de polinucleotídeo de inserção e, opcionalmente, a tradução da transcrição para um polipep- tídeo. A molécula de polinucleotídeo de inserção pode ser derivada de uma célula hospedeira, ou pode ser derivada de uma célula ou de um organismo diferente e/ou pode ser um polinucleotídeo recombinante. Uma vez dentro da célula hospedeira, o constructo genético pode se tornar integrado no DNA cromossomial hospedeiro. O constructo genético pode ser ligado a um vetor.

[00270] O termo "vetor" se refere a uma molécula de polinucleotí- deo, normalmente de DNA de fita dupla, que é usada para transportar o constructo genético para dentro de uma célula hospedeira. O vetor pode ter a capacidade de replicação em pelo menos um sistema hospedeiro adicional, tal como a E. coli.

[00271] A expressão "constructo de expressão" se refere aum cons- tructo genético que inclui os elementos necessários que possibilitam a transcrição da molécula de polinucleotídeo de inserção, e, opcionalmente, a tradução da transcrição para um polipeptídeo. Um constructo de expressão tipicamente compreende, em uma direção 5’ a 3’: a) um promotor funcional na célula hospedeira no qual o constructo será transformada, b) o polinucleotídeo a ser expressado, e c) um terminador funcional na célula hospedeira no qual o constructo será transformado,

[00272] As expressões "região de codificação" e "quadro de leitura abertura" (ORF) se referem à fita senso de uma sequência de DNA genômico ou uma sequência de DNAc com capacidade para produzir um produto de transcrição e/ou um polipeptídeo sob o controle das sequências regulatórias apropriadas. A sequência de codificação pode, em alguns casos, ser identificada pela presença de um códon de iniciação de tradução 5’ e um códon de parada de tradução 3’. Quando inserida emum constructo genético, uma "sequência de codificação" tem a capacidade para ser expressada quando ligada de maneira operacional às sequências promotora e terminadora.

[00273] "Ligada de maneira operacional" significa que a sequência a ser expressada é colocada sob o controle de elementos reguladores que incluem promotores, elementos reguladores específicos para tecido, elementos reguladores temporais, acentuadores, repressores e terminadores.

[00274] O termo "região sem codificação" se refere a sequências não traduzidas que são um montante do sítio de início de tradução e a jusante do sítio de parada de tradução. Essas sequências também são chamadas respectivamente de UTR 5’ e UTR 3’. Essas regiões incluem elementos necessários para a iniciação e a terminação da transcrição, para a estabilidade de mRNA e para a regulação da eficiência de tradução.

[00275] Os terminadores são sequências que terminam a transcrição e são encontradas nas extremidades não traduzidas 3’ de genes a jusante da sequência traduzida. Os terminadores são determinantes importantes de estabilidade de mRNA e, em alguns casos, constatou- se apresentarem funções de regulação espacial.

[00276] O termo "promotor" se refere a elementos cis-reguladores não transcritos a montante da região de codificação que regula a transcrição de gene. Os promotores compreendem elementos cis- iniciadores que especificam o sítio de iniciação de transcrição, caixas tais como a caixa TATA e unidades que são aglutinadas por fatores de transcrição. Os íntrons dentro de sequências de codificação também podem regular a transcrição e o processamento pós-transcricional de influência (incluindo divisão, capeamento e poliadenilação).

[00277] Um promotor pode ser homólogo com relação ao polinucle- otídeo a ser expressado. Isso significa que o promotor e o polinucleo- tídeo são encontrados ligados de maneira operacional na natureza.

[00278] Alternativamente, o promotor pode ser heterólogo com relação ao polinucleotídeo a ser expressado. Isso significa que o promotor e o polinucleotídeo não são encontrados ligados de maneira operacional na natureza.

[00279] Em certas modalidades, os polinucleotídeos/polipeptídeos quiméricos DGAT1 da presente invenção podem ser vantajosamente expressados sob o controle de sequências promotoras selecionadas conforme descrito abaixo.

PROMOTORES ESPECÍFICOS DE TECIDO VEGETAL

[00280] Um exemplo de um promotor específico vegetal é encontrado em US 6.229.067; US 7.629.454; US 7.153.953; e US 6.228.643.

PROMOTORES ESPECÍFICOS DE PÓLEN

[00281] Um exemplo de um promotor específico de pólen é encontrado em US 7.141.424; US 5.545.546; US 5.412.085; US 5.086.169; e US 7.667.097.

PROMOTORES ESPECÍFICOS DE SEMENTE

[00282] Um exemplo de um promotor específico de semente é en- contrado em US 6.342.657; US 7.081.565; US 7.405.345; US 7.642.346; e US 7.371.928. Um promotor específico de semente preferencial é o promotor napin da Brassica napus (Josefsson et al., 1987, J Biol Chem. 262(25):páginas 12.196 a 12.201; Ellerstrom et al., 1996, Plant Molecular Biology, volume 32, 6a edição, páginas 1.019 a 1.027). PROMOTORES ESPECÍFICOS DE FRUTAS

[00283] Um exemplo de um promotor específico de frutas é encontrado em US 5.536.653; US 6.127.179; US 5.608.150; e US 4.943.674.

PROMOTORES PREFERENCIAIS DE TECIDO NÃO FOTOSSIN- TÉTICO

[00284] Os promotores preferenciais de tecido não fotossintético incluem aqueles expressados preferencialmente em tecidos/órgãos não fotossintéticos da planta.

[00285] Os promotores preferenciais de tecido não fotossintético também podem incluir promotores com repressão de luz.

PROMOTORES COM REPRESSÃO DE LUZ

[00286] Um exemplo de um promotor com repressão de luz é encontrado em US 5.639.952 e em US 5.656.496.

PROMOTORES ESPECÍFICO DE RAIZ

[00287] Um exemplo de um promotor específico de raiz é encontrado em US 5,837,848; US 2004/0067506 e US 2001/0047525.

PROMOTORES ESPECÍFICOS DE TUBÉRCULOS

[00288] Um exemplo de promotor específico de tubérculo é encontrado em US 6.184.443.

PROMOTORES ESPECÍFICOS DE BULBO

[00289] Um exemplo de um promotor específico de bulbo é encontrado em Smeets et al., (1997) Plant Physiol. 113: páginas 765 a 771.

PROMOTORES PREFERENCIAIS DE RIZOMA

[00290] Um exemplo de um promotor preferencial de rizoma é encontrado Seong Jang et al., (2006) Plant Physiol. 142: páginas 1.148 a 1.159.

PROMOTORES ESPECÍFICOS DE ENDOSPERMA

[00291] Um exemplo de um promotor específico de endosperma é encontrado em US 7.745.697.

PROMOTORES DE CORMO

[00292] Um exemplo de um promotor com capacidade de acionar a expressão em um cormo é encontrado em Schenk et al., (2001) Plant Molecular Biology, 47: páginas 399 a 412.

PROMOTORES PREFERENCIAIS DE TECIDO FOTOSSINTÉTICO

[00293] Os promotores preferenciais de tecido fotossintético incluem os preferencialmente expressados em tecidos fotossintéticos de plantas. Os tecidos fotossintéticos da planta incluem folhas, caules, brotos e partes da planta acima do solo. Os promotores preferenciais de tecido fotossintético incluem promotores com regulação da luz.

PROMOTORES COM REGULAÇÃO DE LUZ

[00294] Vários promotores com regulação de luz são conhecidos às pessoas versadas na técnica e incluem, por exemplo, promotores de aglutinação de proteína a/b de clorofila (Cab) e promotores de pequena subunidade (SSU) da Rabisco. Um exemplo de um promotor com regulação de luz é encontrado em US 5.750.385. A regulação de luz, nesse contexto, significa uma luz induzível ou induzida.

[00295] Um "transgene" é um polinucleotídeo que é tirado de um organismo e introduzido em um organismo diferente através de transformação. O transgene pode ser derivado da mesma espécie ou de uma espécie diferente da espécie do organismo no qual o transgene é introduzido.

CÉLULAS HOSPEDEIRAS

[00296] As células hospedeiras podem ser derivadas, por exemplo, de organismos de bactérias, fungos, leveduras, insetos, mamíferos, algas ou plantas. As células hospedeiras também podem ser células sintéticas. As células hospedeiras preferenciais são células eucarióti- cas. Uma célula hospedeira particularmente preferencial é uma célula de planta, particularmente uma célula de planta em um tecido vegetal de uma planta.

[00297] Uma "planta transgênica" se refere a uma planta que contém um material genético novo como um resultado de manipulação ou transformação genética. O material genético novo pode ser derivado de uma planta da mesma espécie da planta transgênica resultante ou de uma espécie diferente.

MÉTODOS PARA ISOLAR OU PRODUZIR POLINUCLEOTÍDEOS

[00298] As moléculas de polinucleotídeo da presente invenção podem ser isoladas utilizando-se várias técnicas conhecidas às pessoas de habilidade comum na técnica. A título exemplificativo, tais polipeptí- deos podem ser isolados através do uso da reação de cadeia de poli- merase (PCR) descrita em Mullis et al., Eds. 1994 The Polymerase Chain Reaction, Birkhauser, o qual está incorporado no presente documento a título de referência. Os polipeptídeos da presente invenção podem ser amplificados com o uso de iniciadores, como definido no presente documento, derivados das sequências de polinucleotídeos da presente invenção.

[00299] Os métodos adicionais para isolar os polinucleotídeos da presente invenção incluem o uso do todo ou de porções dos polipeptí- deos que têm uma sequência estabelecida no presente documento como sondas de hibridização. A técnica de hibridização de sondas identificadas de polinucleotídeo para polinucleotídeos imobilizados em sustentações sólidas, tais como filtros de nitrocelulose ou membranas de nílon, pode ser usada para varrer as bibliotecas genômicas ou de DNAc. As condições exemplificativas de hibridização e lavagem são: hibridização por 20 horas a 65 °C em SSC 5X, sulfato de dodecila de sódio a 0, 5%, solução de Denhardt 1X; lavagem (três lavagens de vinte minutos cada a 55 °C) em SSC 1X, 1% (p/v) sulfato de dodecila de sódio e, opcionalmente, uma lavagem (por vinte minutos) em SSC 0,5X, sulfato de dodecila de sódio a 1% (p/v), a 60 °C. uma lavagem adicional ideal (por vinte minutos) pode ser conduzida sob condições SSC 0,1X, sulfato de dodecila de sódio a 1% (p/v), a 60 °C.

[00300] Os fragmentos de polinucleotídeo da presente invenção podem ser produzidos por procedimentos bem conhecidos na técnica, tal como a digestão de endonuclease por restrição, síntese de oligonu- cleotídeo e amplificação por PCR.

[00301] Uma sequência parcial de polinucleotídeos pode ser usada, em métodos bem conhecidos na técnica, para identificar a sequência de polinucleotídeos correspondente de comprimento completo. Tais métodos incluem métodos baseados em PCR, 5’RACE (Frohman MA, 1993, Methods Enzymol. 218: páginas 340 a 356), métodos baseados em hibridização e métodos baseados em computadores/bancos de dados. Ademais, a título exemplificativo, a PCR inversa permite a aquisição de sequências desconhecidas, que flanqueiam sequências de polinucleotídeos reveladas no presente documento, iniciando com iniciadores com base em uma região conhecida (Triglia et al., 1998, Nucleic Acids Res 16, 8186, que está incorporado no presente documento a título de referência). O método usa várias enzimas de restrição para gerar um fragmento adequado na região conhecida de um gene. O fragmento é então circularizado por ligação intramolecular e usado como um modelo de PCR. Os iniciadores divergentes são projetados a partir de uma região conhecida. A fim de montar fisicamente os clones de comprimento completo, pode-se utilizar abordagens padrão de biologia molecular (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Press, 1987).

[00302] Pode ser benéfico, ao produzir uma planta transgênica a partir de uma espécie particular, transformar tal planta com uma ou mais sequências derivadas dessa espécie. O benefício possível se re- fere à mitigação da opinião pública quanto à transformação entre espécies na geração de organismos transgênicos. Por esses motivos, entre outros, é desejável ter a capacidade de identificar e isolar ortólo- gos de um gene particular em várias espécies de planta diferentes.

[00303] As variantes (incluindo ortólogos) podem ser identificadas pelos métodos descritos.

MÉTODOS PARA IDENTIFICAR VARIANTES MÉTODOS FÍSICOS

[00304] Os polipeptídeos variantes podem ser identificados com o uso de métodos baseados em PCR (Mullis et al., Eds. 1994 The Polymerase Chain Reaction, Birkhauser). Tipicamente, a sequência de polinucleotídeos de um iniciador, útil para a amplificação de variantes de moléculas de polinucleotídeo da presente invenção através de PCR, pode ser baseada em uma sequência que codifica uma região conservada da sequência de aminoácidos correspondente.

[00305] Pode-se empregar métodos alternativos de varredura de biblioteca bem conhecidos às pessoas versadas na técnica (Sambro- ok et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Press, 1987). Ao identificar variantes da sequência de sonda, a rigorosidade da hibridização e/ou da lavagem tipicamente será reduzida em relação a quanto busca-se correspondências exatas de sequência.

[00306] As variantes de polipeptídeo também podem ser identificadas por métodos físicos, por exemplo, varrendo-se bibliotecas de expressão com o uso de anticorpos gerados contra polipeptídeos da presente invenção (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Press, 1987) ou identificando-se polipeptídeos a partir de fontes naturais com o auxílio de tais anticorpos.

MÉTODOS COM BASE EM COMPUTADOR

[00307] As sequências variantes da presente invenção, incluindo tanto variantes de polinucleotídeos quanto de polipeptídeos, também podem ser identificadas por métodos baseados em computador bem conhecidos às pessoas versadas na técnica, com o uso de algoritmos de alinhamento de sequência e ferramentas de busca de similaridade de sequência de domínio público para efetuar buscas em bancos de dados de sequência (os bancos de dados de domínio públicos incluem Genbank, EMBL, Swiss-Prot, PIR e outros). Consulte, por exemplo, Nucleic Acids Res. 29: páginas 1 a 10 e 11 a 16, 2001, para exemplos de recursos na Internet. As buscas por similaridade recolhem e alinham sequências-alvo para comparação com uma sequência a ser analisada (isto é, uma sequência para busca). Os algoritmos de com-paração de sequência usam matrizes de pontuação para conferir uma pontuação geral a cada um dos alinhamentos.

[00308] Uma família exemplificativa de programas úteis para identificar variantes em bancos de dados de sequências é o pacote de programas BLAST (versão 2.2.5 [novembro de 2002]), incluindo BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN e tBLASTX, os quais estão publicamente disponíveis em (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/) ou no Centro Nacional de Informação de Biotecnologia (NCBI), na Biblioteca Nacional de Medicina, Prédio 38A, Sala 8N805, Bethesda, MD 20894 EUA. O servidor NCBI também fornece a estrutura para usar os programas para varrer vários bancos de dados de sequências publicamente disponíveis. O BLASTN compara uma sequência de nucleotídeos objeto de busca com um banco de dados de sequência de nucleotídeos. O BLASTP compara uma sequência de aminoácidos objeto de busca com um banco de dados de sequência de proteínas. O BLASTX compara uma sequência de nucleotídeos objeto de busca traduzida em todos os quadros de leitura com um banco de dados de sequência de proteínas. O tBLASTN compara uma sequência de proteínas objeto de busca com um banco de dados de sequência de nucleotídeos com tradução dinâmica em todos os quadros de leitura. O tBLASTX compara as traduções de seis quadros de uma sequência de nucleotídeos objeto de busca com as traduções de seis quadros de um banco de dados de sequência de nucleotídeos. Os programas BLAST podem ser usados com parâmetros-padrão ou os parâmetros podem ser alterados conforme necessário para refinar a varredura.

[00309] O uso da família de algoritmos BLAST, incluindo BLASTN, BLASTP, e BLASTX, é descrito na publicação de Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: páginas 3.389 a 3.402, 1997.

[00310] Os "acertos" com uma ou mais sequências do banco de dados quanto à sequência de objeto de busca produzidos por BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN, tBLASTX, ou por um algoritmo similar, alinham e identificam porções similares de sequências. Os acertos são dispostos em ordem de grau de similaridade e de comprimento de sobreposição de sequência. Os acertos com sequências do banco de dados de maneira geral representam uma sobreposição de somente uma fração do comprimento da sequência com a sequência objeto de busca.

[00311] Os algoritmos BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN e tBLASTX também produzem valores "Previstos" para alinhamentos. O valor Previsto (E) indica a quantidade de acertos "previstos" que ocorram por acaso ao efetuar uma busca em um banco de dados do mesmo tamanho que contenha sequências contíguas aleatórias. O valor Previsto é usado como um limiar de importância para determinar se um acerto com um banco de dados indica uma similaridade real. Por exemplo, um valor E de 0,1 conferido a um acerto de polinucleotídeo é interpretado com o significado de que, em um banco de dados do tamanho do banco de dados varrido, espera-se que 0,1 correspondências com a porção alinhada da sequência com uma pontuação similar simplesmente por acaso. Para sequências com um valor E de 0,01 ou menos quanto a porções alinhadas e correspondidas, a probabilidade de encontrar uma correspondência por acaso nesse banco de dados é de 1% ou menos utilizando-se os algoritmos BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN ou tBLASTX.

[00312] Pode-se executar múltiplos alinhamentos de sequência de um grupo de sequências relacionadas com CLUSTALW (Thompson, J.D., Higgins, D.G. e Gibson, T.J. (1994) CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22: páginas 4.673 a 4.680, http://www-igbmc.u- strasbg.fr/BioInfo/ClustalW/Top.html) ou T-COFFEE (Cedric Notredame, Desmond G. Higgins, Jaap Heringa, T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment, J. Mol. Biol. (2000) 302: páginas 205 a 217)) ou PILEUP, which uses progressive, pairwise alignments. (Feng and Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 25, página 351).

[00313] Há aplicativos de software de reconhecimento de padrões disponíveis para encontrar unidades ou sequências identificadoras. Por exemplo, o MEME (Em Múltiplo para Elicitação de Unidade) encontra unidades e sequências identificadoras em um conjunto de sequências, e o MAST (Ferramenta de Busca e Alinhamento de Unidades) usa essas unidades para identificar unidades similares ou iguais em sequências-objetos de busca. Os resultados do MAST são fornecidos como uma série de alinhamentos com dados estatísticos apropriados e uma visão geral visualizável das unidades encontradas. O MEME e o MAST foram desenvolvidos na Universidade da Califórnia, em San Diego.

[00314] O PROSITE (Bairoch e Bucher, 1994, Nucleic Acids Res. 22, 3583; Hofmann et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27, página 215) é um método de identificação de funções de proteínas não caracterizadas traduzidas a partir de sequências genômicas ou de DNAc. O ban co de dados PROSITE (www.expasy.org/prosite) contêm padrões e perfis biologicamente significativos e é projetado de forma que possa ser usado com ferramentas computacionais apropriadas para conferir uma nova sequência a uma família conhecida de proteínas ou para determinar qual(is) domínio(s) estão presentes na sequência (Falquet et al., 2002, Nucleic Acids Res. 30, página 235). O Prosearch é uma ferramenta que por efetuar buscas em bancos de dados SWISS-PROT e EMBL com um dado padrão ou identificação de sequência.

MÉTODOS PARA ISOLAMENTO DE POLIPEPTÍDEOS

[00315] Os polipeptídeos da presente invenção, ou aqueles usados nos métodos da presente invenção, incluindo polipeptídeos variantes, podem ser preparados com o uso de métodos de síntese de peptídeo bem conhecidos na técnica, tais como a síntese direta de peptídeo com o uso de técnicas de fase sólida (por exemplo, Stewart et al., 1969, in Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco California, ou a síntese automatizada, por exemplo, com o uso de um Sintetizador de Peptídeos 431A de Biossistemas Aplicados (Foster City, California). As formas mutadas dos polipeptídeos também podem ser produzidas durante tais sínteses.

[00316] Os polipeptídeos e polipeptídeos variantes da presente invenção, ou aqueles usados nos métodos da presente invenção, também podem ser purificados a partir de fontes naturais com o uso de vários procedimentos bem conhecidos na técnica (por exemplo, Deu- tscher, 1990, Ed, Methods in Enzymology, Vol. 182, Guide to Protein Purification,).

[00317] Alternativamente, os polipeptídeos e polipeptídeos variantes da presente invenção, ou aqueles usados nos métodos da presente invenção, podem ser expressados de maneira recombinante em células hospedeiras adequadas e separados das células, conforme discutido abaixo.

MÉTODOS PARA PRODUZIR CONSTRUCTOS E VETORES

[00318] Os constructos genéticos da presente invenção compreendem uma ou mais sequências de polinucleotídeos da presente invenção e/ou polipeptídeos que codificam polinucleotídeos da presente invenção, e podem ser úteis para transformar, por exemplo, organismos de bactérias, fungos, insetos, mamíferos ou plantas. Os constructos genéticos da presente invenção se destinam a incluir constructos de expressão como definido no presente documento.

[00319] Os métodos para produzir e usar constructos genéticos e vetores são bem conhecidos na técnica e são descritos de maneira geral em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Press, 1987; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987).

MÉTODOS PARA PRODUZIR CÉLULAS HOSPEDEIRAS QUE COM-PREENDEM POLINUCLEOTÍDEOS, CONSTRUCTOSCONSTRUCTOS OU VETORES

[00320] A invenção fornece uma célula hospedeira que compreen- deum constructo genético ou um vetor da presente invenção.

[00321] As células hospedeiras que compreendem constructos genéticos, tal como constructos de expressão, da presente invenção, são úteis nos métodos bem conhecidos na técnica (por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Press, 1987; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987) para a produção recombinante de poli- peptídeos da presente invenção. Tais métodos podem envolver a cultura de células hospedeiras em um meio apropriado em condições adequadas ou condutíveis da expressão de um polipeptídeo da presente invenção. O polipeptídeo recombinante expressado, que pode opcio-nalmente ser secretado na cultura, pode então ser separado do meio, das células hospedeiras ou do meio de cultura através de métodos bem conhecidos na técnica (por exemplo, Deutscher, Ed, 1990, Methods in Enzymology, volume 182, Guide to Protein Purification).

MÉTODOS PARA PRODUZIR CÉLULAS DE PLANTA E PLANTAS QUE COMPREENDEM OS CONSTRUCTOS E OS VETORES

[00322] A invenção fornece adicionalmente células de planta que compreendemum constructo genético da presente invenção, e células de planta modificadas para alterar a expressão de um polinucleotídeo ou polipeptídeo da presente invenção, ou aqueles usados nos métodos da presente invenção. As plantas que compreendem tais células também formam um aspecto da presente invenção.

[00323] Os métodos para transformar as células de planta, as plantas e as porções das mesmas com polipeptídeos são descritos em Draper et al., 1988, Plant Genetic Transformation and Gene Expression. A Laboratory Manual. Blackwell Sci. Pub. Oxford, página 365; Po- trykus e Spangenburg, 1995, Gene Transfer to Plants. Springer-Verlag, Berlin.; e Gelvin et al., 1993, Plant Molecular Biol. Manual. Kluwer Acad. Pub. Dordrecht. Uma revisão com relação a plantas transgêni- cas, incluindo técnicas de transformação, é fornecida em Galun e Breiman, 1997, Transgenic Plants. Imperial College Press, Londres.

MÉTODOS PARA MANIPULAÇÃO GENÉTICA DE PLANTAS

[00324] Várias estratégias de transformação de plantas estão disponíveis (por exemplo, Birch, 1997, Ann Rev Plant Phys Plant Mol Biol, 48, página 297, Hellens RP, et al., (2000) Plant Mol Biol 42: páginas 819 a 832, Hellens R et al., Plant Meth 1: 13). Por exemplo, pode-se projetar estratégias para aumentar a expressão de um polinucleotí- deo/polipeptídeo em uma célula, órgão e/ou estágio particular de desenvolvimento de planta em que o mesmo é normalmente expressado ou para expressar ectopicamente um polinucleotídeo/polipeptídeo em uma célula, tecido, órgão e/ou em um estágio particular de desenvolvimento em que o mesmo não é normalmente expressado. O polinu- cleotídeo/polipeptídeo expressado pode ser derivado da espécie de planta a ser transformada ou pode ser derivado de uma espécie de planta diferente.

[00325] As estratégias de transformação podem ser projetadas para reduzir a expressão de um polinucleotídeo/polipeptídeo em uma célula, tecido, órgão ou em um estágio particular de desenvolvimento de planta em que o mesmo normalmente é expressado. Tais estratégias são conhecidas como estratégias de silenciamento de genes.

[00326] Os constructos genéticos para expressão de genes em plantas transgênicas tipicamente incluem promotores para acionar a expressão de um ou mais terminadores, sequências selecionáveis de distinção e polinucleotídeos clonados para detectar a presença deum constructo genético na planta transformada.

[00327] Os promotores adequados para uso nos constructos dessa invenção são funcionais em uma célula, tecido ou órgão de uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea e incluem promotores específicos para célula, tecido ou órgão, promotores específicos para ciclo celular, promotores temporais, promotores induzíveis, promotores constitutivos que são ativos na maioria dos tecidos de planta e promotores recom- binantes. A escolha do promotor dependerá da expressão temporal e espacial do polinucleotídeo clonado desejado. Os promotores podem ser aqueles normalmente associados a um transgene pertinente, ou promotores derivados de genes de outras plantas, vírus e bactérias e fungos patogênicos para plantas. As pessoas versadas na técnica, sem experimentação desnecessária, têm a capacidade de selecionar promotores adequados para uso na modificação e na modulação de características de plantas com o uso de constructos genéticos que compreendem as sequências de polinucleotídeos da presente invenção. Os exemplos de promotores constitutivos de planta incluem o promotor CaMV 35S, o promotor de nopalina sintase, o promotor de octopina sintase e o promotor Ubi 1 de milho. Os promotores de planta ativos em tecidos específicos respondem a sinais internos de desenvolvimento ou tensões bióticas ou abióticas externas são descritos na literatura científica. Os promotores exemplificativos são descritos, por exemplo, em WO 02/00894 e WO2011/053169, os quais estão incorporados no presente documento a título de referência.

[00328] Os terminadores exemplificativos comumente usados em constructos genéticos de transformação de plantas incluem, por exemplo, o terminador 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), os terminadores nopalina sintase ou octopina sintase da Agrobacterium tumefaciens, o terminador do gene zeina na Zea mays, o termi- nador ADP-glicose pirofosforilase da Oryza sativa e o terminador PI-II da Solanum tuberosum.

[00329] Os marcadores selecionáveis comumente usados na transformação de plantas incluem o gene neomicina fosfotransferase II (NPT II) que confere uma resistência contra a canamicina, o gene aa- dA, que confere resistência contra a espectinomicina e estreptomicina, a fosfinotricina acetil transferase (gene ba) para resistência contra Ignite (AgrEvo) e Basta (Hoechst), e o gene higromicina fosfotransferase (hpt) para resistência contra a higromicina.

[00330] O uso de constructos genéticos compreende genes repórter (sequências de codificação que expressam uma atividade estranha ao hospedeiro, normalmente uma atividade enzimática e/ou um sinal visível (por exemplo, luciferase, GUS, GFP) que podem ser usados para a análise de expressão de promotor em plantas e em tecidos de planta também é contemplado. A literatura sobre genes repórter é revisada em Herrera-Estrella et al., 1993, Nature 303, 209 e Schrott, 1995, Em: Gene Transfer to Plants (Potrykus, T., Spangenberg. Eds) Springer Verlag. Berline, páginas 325 a 336.

[00331] A seguir estão publicações representativas que revelam pro- tocolos de transformação genética que podem ser usados para transformar geneticamente a seguinte espécie de planta: Arroz (Alam et al., 1999, Plant Cell Rep. 18, página 572); maçã (Yao et al., 1995, Plant Cell Reports 14, páginas 407 a 412); milho (Patentes n°s de Série US 5.177.010 e 5.981.840); trigo (Ortiz et al., 1996, Plant Cell Rep. 15, 1996, página 877); tomate (Patente n° de Série US 5.159.135); batata (Kumar et al., 1996 Plant J. 9, : página 821); mandioca (Li et al., 1996 Nat. Biotechnology 14, página 736); alface (Michelmore et al., 1987, Plant Cell Rep. 6, página 439); tabaco (Horsch et al., 1985, Science 227, página 1229); algodão (Patentes n°s de Série US 5.846.797 e 5.004.863); gramíneas (Patentes n°s US 5.187.073 e 6. 020.539); men- da (Niu et al., 1998, Plant Cell Rep. 17, página 165); plantas cítricas (Pena et al., 1995, Plant Sci.104, página 183); alcaravia (Krens et al., 1997, Plant Cell Rep, 17, página 39); banana (Patente n° de Série US 5.792.935); soja (Patentes n°s US 5.416.011; 5. 569.834; 5.824.877; 5.563.04455 e 5.968.830); abacaxi (Patente n° de Série US 5.952.543); álamo (Patente n° US 4.795.855); monocotiledôneas em geral (Patentes n°s US 5.591.616 e 6.037.522); couves (Patentes n°s US 5.188.958; 5.463.174 e 5.750.871); cereais (Patente n° US 6.074.877); pera (Matsuda et al., 2005, Plant Cell Rep. 24(1): páginas 45 a 51); Prunus (Ra- mesh et al., 2006 Plant Cell Rep. 25(8): páginas 821 a 828; Song e Sink 2005 Plant Cell Rep. 2006; 25(2): páginas 117 a 123; Gonzalez Padilla et al., 2003 Plant Cell Rep.22(1): páginas 38 a 45); morango (Oosumi et al., 2006 Planta. 223(6):1219-30; Folta et al., 2006 Plant Apr 14; PMID: 16614818), rosa (Li et al., 2003), Rubus (Graham et al., 1995 Methods Mol Biol. 1995;44: páginas 129 a 133), tomate (Dan et al., 2006, Plant Cell Reports V25: páginas 432 a 441), maçã (Yao et al., 1995, Plant Cell Rep. 14, páginas 407 a 412), Canola (Brassica napus L.).(Cardoza e Stewart, 2006 Methods Mol Biol. 343: páginas 257 a 266), cártamo (Or- likowska et al, 1995, Plant Cell Tissue and Organ Culture 40: páginas 85 a 91), azevém (Altpeter et al, 2004 Developments in Plant Breeding 11(7): páginas 255 a 250), arroz (Christou et al, 1991 Nature Biotech. 9:páginas 957 a 962), milho (Wang et al., 2009 Em: Handbook of Maize páginas 609 a 639) e Actinidia eriantha (Wang et al., 2006, Plant Cell Rep. 25,5: páginas 425 a 431). A transformação de outras espécies também é contemplada pela presente invenção. Os métodos e protocolos adequados estão disponíveis na literatura científica.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00332] A Figura 1 mostra a sequência de ácidos nucleicos e a tradução de três quadros da região transcrita DGAT1 de Arabidopsis tha- liana (SEQ ID NO:128). As sequências de codificação exon são mostradas em blocos cinzentos, negrito e sublinhado.

[00333] A Figura 2 mostra a sequência de ácidos nucleicos e a tradução de três quadros da região transcrita curta DGAT1 de Zea mays (SEQ ID NO:129). Essa sequência genômica tem o F469 deletado e o Q67 adicionado em comparação com as sequências de DNAc (EU039830) e de peptídeo (ABV91586) de fato usadas nessa Patente. As sequências de codificação exon são mostradas em blocos cinzentos, negrito e sublinhado.

[00334] A Figura 3 mostra a sequência de peptídeos da região cito- plasmática N-terminal de vários DGAT1s de planta, incluindo tanto versões longas quanto curtas das gramíneas, assim como exemplos de espécies dicotiledôneas. A caixa à esquerda representa o local de ligação acil-CoA (Nykiforuk et al., 2002, Biochimica et Biophysica Acta 1580:páginas 95 a 109). A caixa à direita representa a primeira região transmembrana (McFie et al., 2010, JBC., 285: páginas 37377 a 37387). A seta à esquerda representa o limiar entre exon 1 e exon 2. A seta à direita representa o limiar entre exon 2 e exon 3. As sequências são AtDGAT1 (SEQ ID NO:130), BjDGAT1 (SEQ ID NO:131), BnDGAT1-AF (SEQ ID NO:132), BjDGAT1 (SEQ ID NO:133), TmajusDGAT1 (SEQ ID NO:134), EpDGAT1 (SEQ ID NO:135), VgDGAT1 (SEQ ID NO:136), NtDGAT1 (SEQ ID NO:137), PfDGAT1 (SEQ ID NO:138), ZmL (SEQ ID NO:139), SbDGAT1 (SEQ ID NO:140), OsL (SEQ ID NO:141), OsS (SEQ ID NO:142), SbDGAT1 (SEQ ID NO:143), ZmS (SEQ ID NO:144), PpDGAT1 (SEQ ID NO:145), SmDGAT1 (SEQ ID NO:146), EaDGAT1 (SEQ ID NO:147), VvDGAT1 (SEQ ID NO:148), GmDGAT1 (SEQ ID NO:149), GmDGAT1 (SEQ ID NO:150), LjDGAT1 (SEQ ID NO:151), MtDGAT1 (SEQ ID NO:152), JcDGAT1 (SEQ ID NO:153), VfDGAT1 (SEQ ID NO:154), RcDGAT1 (SEQ ID NO:155), PtDGAT1 (SEQ ID NO:156), Pt DGAT1 (SEQ ID NO:157).

[00335] A Figura 4 mostra as estruturas limitadas por linhas dos resíduos de aminoácido lisina (K) e arginina (R).

EXEMPLOS EXEMPLO 1: SELEÇÃO DE SEQUÊNCIA DGAT1 DE PLANTA E PREVISÃO DE SÍTIO DE DIVISÃO

[00336] A maioria das sequências de ácidos nucleicos e sequências de peptídeo para DGATs tipo 1 de planta pode ser encontrada pelo número de registro em bibliotecas de domínio público (Tabela 1). Para criar alinhamentos iniciais, usaram-se ClustalW (Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res., 22, páginas 4673 a 4680); manualmente editados e usados para criar os modelos para buscar as sequências DGAT, com o uso do pacote HMMER2 (HMMER 2.3.2 (outubro de 2003) Copyright © 1992-2003 HHMI/Escola de Medicina da Universidade de Washington, disponível na Internet em http://hmmer.org). A correspondência inicial de sequências de proteínas com o DNA genô- mico com previsão de divisão foi efetivada com o pacote GeneWise (Birney et al., 2004, Genome Res. 14: páginas 988 a 995). Algumas das sequências recolhidas aparentaram erros; em particular, sítios de divisão previstos de maneira incorreta, o que resultaria em deleções internas que, muito provavelmente, resultariam em proteínas não fun- cionais. Embora ambos os DGATs do tipo 1, de dicotiledôneas e mo- nocotiledôneas, tenham 16 exons, há algumas diferenças na posição da divisão. O Exon 8 no gene DGAT1 de dicotiledônea corresponde aos exons 8 e 9 no gene DGAT1 de monocotiledônea, ao passo que o exon 14 no gene de monocotiledônea corresponde aos exons 13 e 14 no gene de dicotiledônea. Constatou-se que o método mais preciso para determinar a sequência de codificação verdadeira a partir dos dados genômicos foi usar o Vector NTI Advance (TM) 11.0 (© 2008 In- vitrogen Corporation) para traduzir o genoma nos três quadros de leitura senso e alinhá-los com os DGAT1s funcionais demonstrados de espécies dicotiledônea ou monocotiledônea conforme apropriado (por exemplo, DNAc NM_127503 de e a proteína NP_179535 de A. thalia- na, e o DNAc EU039830 e a proteína ABV91586 de Z. mays). A se-quência genômica e as posições de limiar de exon/íntron correspondentes à Arabidopsis thaliana que codifica a NP_179535 e Zea mays que codifica ABV91586 que podem ser usadas como um modelo para determinar outras regiões de codificação de DGAT de planta são mostradas nas Figuras 1 e 2, respectivamente. Um exemplo desse uso de modelo é mostrado para a determinação dos DGAT1s de Z. mays SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 39. TABELA 1

EXEMPLO 2: PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS DGAT1 QUIMÉRICAS PARA EXPRESSÃO EM CÉLULAS

[00337] Os constructos de ácidos nucleicos que codificam as sequências de aminoácidos, SEQ ID NO: 30, 34, 39, 41, 42 e 44 (Tabela 1) foram aperfeiçoados para expressão em Saccharomyces cerevisiae através de GeneArt AG (Alemanha). As mesmas foram projetadas para ter um sítio XhoI interno dentro do exon 1 que codifica a região de aglutinação acil-Co N-terminal (identificada por Weselake, 2006) sem alterar a sequência de aminoácidos leucina-serina-serina (LSS).

[00338] A Figura 3 mostra o alinhamento de várias sequências de DGAT1 de plantas. A caixa à esquerda mostra a posição do sítio de aglutinação Acil-CoA.

[00339] Um sítio EcoRI foi geneticamente modificado a montante da sequência de codificação 5' ao passo que um sítio Xba I foi colocado a jusante do códon de parada 3'. Os sítios Xho I interno e Eco RI e Xba I de flanqueio foram usados para gerar quimeras entre cada um dos clones de DGAT1 originais; essencialmente, isso fundiu a chamada região citoplasmática N-terminal (com base em Weselake et al 2006 e McFie et al, 2010) de um DGAT1 com a região luminal RE C-terminal de um DGAT1 diferente. Em algumas combinações, isso resultou em uma mudança de aminoácido na região citoplasmática restante a jusante do sítio XhoI geneticamente modificado. A região aglutinante putativa acil-Co do DGAT1 da A. thaliana, do DGAT1 T.majus, do DGAT 1 de Z.mays-L e do DGAT1 de O. sativa-L apresentam uma sequência de aminoácidos idêntica a jusante do sítio Xho I (LSSDAIFKQSHA). Ao mesmo tempo, no DGAT1 de Z.mays-S e no DGAT1 de O. sativa-S, o resíduo lisina (K) seja substituído por um resíduo arginina (R)(LSSDAIFRQSHA). Dado que a posição desse resíduo localiza-se a 3' do sítio XhoI codificado por LLS, então as quimeras derivadas de um progenitor que contém o resíduo de lisina e um progenitor que con tém o resíduo de arginina efetivamente resulta em uma substituição desse resíduo. Isso foi considerado uma perturbação mínima dado que tanto a lisina quanto a arginina são aminoácidos básicos, hidrofílicos, de carga positiva e grandes que contém um grupo livre de amina ou guanidínio, respectivamente na extremidade de uma cadeia lateral ali- fática (Figura 4). A lista completa de constructos de troca de domínio de região N-terminal / C-terminal é encontrada na Tabela 2, com os correspondentes SEQ ID NOs: 59 a 94. TABELA 2

[00340] As sequências foram sintetizadas ou com GENEART AG (Alemanha) ou com GeneScript (EUA). As sequências foram aperfei-çoadas para a expressão em Saccharomyces cerevisiae e flanqueadas com sítios de restrição apropriados incorporados para facilitar a clonagem no vetor psim2.1 (Invitrogen).

EXEMPLO 3: EXPRESSÃO DE SEQUÊNCIAS QUIMÉRICA DE DGAT1 EM CÉLULAS EXPRESSÃO DE CONSTRUCTOS EM S. CEREVISIAE

[00341] Os constructos progenitores DGAT1 e os constructos quiméricos DGAT1 foram colocados no vetor de expressão de levedura psim2.1/V5-His TOPO® (Invitrogen) induzível por galactose. Isso resultou na adição de um epítopo V5 C-terminal em quadro e na identificação de histidina em 6x. O nome dos constructos quiméricos e a quantidade de suas sequências de peptídeos correspondentes são mostrados na Tabela 2.

[00342] O mutante quádruplo de Saccharomyces cerevisiae (H1246) em que todos os quatro genes de biossíntese lipídica neutros foram perturbados (Sanader et al., 2002, The Journal de Biological Chemistry, 277: páginas 6478 a 6482) foi transformado conforme Elble (1992, BioTechniques 13, 18-20) e selecionado pela capacidade de crescer na ausência de uracila. Rotineiramente, as células de levedura foram desenvolvidas de maneira aeróbia de um dia para o outro em um meio sintético com YNB de 0,67%, sem uracila (SC-U) e contendo 2% de glicose. As células da cultura de um dia para o outro foram usadas para inocular 200 ml do meio de indução (SC-U contendo 2% de galactose e 1% de rafinose) a um OD600 inicial de 0,4. Possibilitou- se que as células crescessem adicionalmente a 30 °C, com agitação a 200 rpm até a fase estacionária mais tardia, normalmente 48 horas. As células foram colhidas por centrifugação a 1.500 G por 5 minutos, então, os grânulos de célula foram lavados com água destilada e ou usados imediatamente para a análise subsequente ou mantido em -80 °C até se tornarem necessários. Os grânulos de células para extração lipídica neutra foram secados por congelamento por 48 horas e armazenadas em um congelador a -20 °C até se tornarem necessários.

ANÁLISE LIPÍDICA DE S. CEREVISIAE

[00343] Aproximadamente 10 mg de material celular de levedura secado por congelamento foram pesadas de maneira precisa e, então, perturbadas com o uso de esferas de vidro por turbilhonamento por 1 minuto. Esse lisado foi extraído em HCL metanólico quente para a análise por éster de metila de ácido graxo (FAME) (Browse et al., 1986, Anal. Biochem. 152, páginas 141 a 145).

[00344] Para a análise de perfil FA, aproximadamente 50 mg de levedura secada por congelamento foram colocadas em um tubo de tampa de rosca de 13 mm, e um volume igual de esferas de vidro foi adicionado antes do turbilhonamento em alta velocidade em 3 sessões de 1 minuto. Em seguida à adição de 50 μg de padrão interno TAG 19:0, 2,4 ml de NaCl a 0,17 M em MeOH foram adicionadas e a mistu- ra foi turbilhonada por 15 segundos e, em seguida, houve a adição então de 4,8 ml de heptano e o total do conteúdo foi misturado.

[00345] A solução foi então encubada em um banho com água a 80 °C por 2 horas sem agitação. Após a incubação, a solução foi arrefecida até a temperatura ambiente. Após o arrefecimento, a fase superior (fase lipídica) foi transferida a um novo tubo com tampa de rosca e evaporada até secar sob corrente de gás nitrogênio. O resíduo seco foi então dissolvido em 1 ml de heptano e misturado minuciosamente para a separação SPE TAG com o uso da Coluna de Sílica Strata Si-1 (Phenomenwx, 8B-S012-EAK).

[00346] Após o pré-condicionamento com metanol e o equilíbrio da coluna de sílica com heptanos, o extrato TAG de 1 ml (incluindo 50 μg 17:0 Padrão Interno de TAG passados através da coluna pré- equilibrada, seguido por 1,2 ml de heptano e, então, 2 ml de clorofór- mio:heptano (1:9 v/v/) e o eluato coletado. O eluato total coletado foi evaporado até secar sob a corrente de gás N e o resíduo usado para a extração de FAMEs.

FAMES DE TAG EXTRAÍDO

[00347] Ao resíduo TAG acima, 10 μl de padrão interno 15:0 FA (4 mg/ml dissolvidos em heptano) e 1 ml do reagente HCl metanólico (1N) contendo 5% de 2,2-dimetoxipropano (como coletor de água) foram adicionados.

[00348] O tubo então foi então descarregado com gás N, imediatamente selado com tampo revestido com Teflon e aquecido a 80 °C em um banho com água por 1 hora. Após o arrefecimento, 0,6 ml de heptano e 1,0 ml de NaCl a 0,9% (p/v) foram adicionados, a mistura foi então turbilhonada e girada a 500 rpm por 1 minuto.

[00349] A partir da camada superior de heptano, coletou-se e transferiu-se 100 μl para um vidro de fundo chato de inserção adaptado em um frasco para análise FAMES GC/MS.

EXTRAÇÃO DE PROTEÍNA E DIGESTÃO DE TRIPSINA

[00350] As gotículas de célula de levedura foram lavadas com tampão de lise (50 mm de fosfato de sódio, pH 7,4, 1 mm de EDTA, 5% de glicerol, 1 mm de PMSF) e, então, ressuspendidas em 500 μl de tampão de lise, as esferas de vidro foram adicionadas e as células foram perturbadas por turbilhonamento 2 vezes em velocidade média por 30 segundos. Os detritos de célula foram transformados em grânulos através de centrifugação a 1.000 G por 5 minutos, o sobrenadante foi transferido para novos tubos e as membranas de células totais foram transformadas em grânulos através de ultracentrifugação a 100.000 G por 1 hora. As proteínas da membrana foram ressuspendidas em tampão de lise com ou sem detergente (1% de dodecil-maltosídeo) e quantificadas em um fluorômetro Qubit com o uso do Kit Quantitativo IT da Qubit.

[00351] A tripsina foi adicionada para fornecer uma concentração final de 25 μg/ml para 50 μl de extrato de proteína e a mistura foi incubada a 30 °C por 30 minutos. A reação foi terminada através da adição do inibidor de tripsina de Glycine max (número de catálogo T6414 na Sigma-Aldrich) até uma concentração final de 0,4 μg/μl. Após a adição do inibidor de tripsina, um corante de carregamento SDS a 4x e um agente redutor a 10x (Invitrogen) foram adicionados, e a proteína foi incubada a 70 °C por 10 minutos antes de SDS-PAGE seguido por imunoblot. O blot foi sondado ou com um anticorpo anti-5-HRP (número de catálogo R96125, Invitrogen) em uma diluição de 1:2.500, ou um anticorpo anti-Kar2 (y-115) produzido em coelhos (SC-33630, Biotecnologia Santa Cruz) a uma diluição de 1:200. Usou-se anti-Kar2 para detectar a proteína Kar2 de levedura, uma proteína RE de localização luminal (Rose et al., 1989, Ce1l 57,1211-1221) que serve como um controle para demonstrar a presença de microssomos intactos.

EXEMPLO 4: EXPRESSÃO DE DGAT1 QUIMÉRICA EM BRASSICA NAPUS

[00352] A mesma estratégia descrita no exemplo 2 foi usada para gerar vários constructos quiméricos de DGAT1 para expressão nas sementes de Brassica napus. Isso incluiu os progenitores DGAT1s do DGAT1 de T. majus, DGAT1 de Z. mays-L e DGAT1 de Z. mays-S (SEQ ID NO de aminoácido: 34, 39 e 44, respectivamente, na Tabela 1) aperfeiçoados para expressão em Brassica napus pelo GeneArt AG. O constructo de T. majus foi geneticamente modificado para conter uma mutação pontual unitária S197A (Xu et al., 2008, Plant Biotechnology Journal, 6: páginas 799 a 818). Todos os constructos foram geneticamente modificados para ter um Kozak aperfeiçoado, um íntron UBQ10 de Arabidopsis thaliana e um códon de parada tetranucleotídi- co segundo Scott et al., (2010, Plant Biotechnology Journal, 8: páginas 912 a 917) conforme indicado na Tabela 3 abaixo. TABELA 3

[00353] O mesmo padrão de digestão usado para gerar as quimeras para expressão em S. cerevisiae (exemplo 2) foi usado nos cons- tructos aperfeiçoados de B. Napus para gerar as quimeras Tm-ZmS; Tm-ZmL; ZmS-Tm(S170A); ZmL-Tm(S189A); o que resultou nas sequências de peptídeos listadas na Tabela 4 (quimeras DGAT1 da Região 1 para expressão em Brassica napus). TABELA 4

[00354] Os DGATs progenitores e suas quimeras foram transferidos no vetor binário pMD107 compatível com Gateway® (cortesia do Dr. Mark Smith, NRC Saskatoon, SK, Canada, S7N 0W9) o qual os colocou sob o controle do promotor de napin específico de raízes (Ellerstrom et al., 1996, Plant Molecular Biology, volume 32, 6a edição, páginas 1.019 a 1.027).

TRANSFORMAÇÃO DE PLANTA

[00355] A B. napus (cv. DH12075) foi transformada através da Agrobacterium tumefaciens (GV3101) com o uso do método de cocul- tivação de cotiledônea (adaptado daquele em Maloney et al., 1989, Plant Cell Rep. 8, páginas 238 a 242). As linhas de controle continham um vetor vazio e, quando identificadas, linhas nulas similares eram subsequentemente usadas como controles verdadeiros.

[00356] Aproximadamente, 200 linhas transformadas T0 foram produzidas e seus correspondentes T1 analisaram-se sementes autofe- cundadas quanto ao teor de óleo através de GC. Aproximadamente 50 linhas transgênicas individuais (incluindo linhas de controle) foram selecionadas para a próxima geração (10 plantas/linha) com base em seu teor de óleo ou em seu peso de semente (8 linhas).

[00357] Um total de aproximadamente T1 plantas foram desenvolvidas e triadas por PCR quanto à quantidade de cópia e à identificação de linhas similares nulas. T2 sementes foram analisadas três vezes quanto ao teor de óleo por NMR.

EXEMPLO 5: EXPRESSÃO DE DGAT1 QUIMÉRICA EM CAMELINA SATIVA

[00358] A estratégia acima também pode ser usada para gerar vários constructos quiméricos de DGAT1 para expressão nas sementes de Camelina sativa e outras plantas.

[00359] As sequências com modificações foram sintetizadas ou com GENEART AG (Alemanha) ou com GeneScript (EUA). As sequências foram aperfeiçoadas para expressão em Brassica species e incluíam um íntron de DGAT1 de (SEQ ID NO:105) de Arabidopsis tha- liana - o íntron 3. Cada sequência foi flanqueada com sítios de recom- binação attL apropriados para possibilitar a clonagem de vetores adaptados Gateway®. TABELA 5

[00360] Os DGATs progenitores e suas formas modificadas foram transferidas no vetor binário adaptado para Gateway pRSh1 binário compatível com Gateway® (Winichayakul et al., 2009, Biotechnol. Appl. Biochem. 53, páginas 111 a 122) modificados por substituição do pro-motor CaMV35S substituído com o napin promotor de Brassica napus (SEQ ID NO:127).

TRANSFORMAÇÃO DE CAMELINA SATIVA

[00361] As C. sativa (cf. Calena) foram transformadas através de Agrobacterium tumefaciens (GV3101) com o uso do método de mergulho floral (adaptado daquele em Clough e Bent, 1998, Plant J. 16(6): páginas 735 a 745). Em essência, semearam-se sementes em mistura de pote em potes de 10 cm em um ambiente controlado e, aproximadamente 6 semanas após o plantio, as flores foram mergulhadas por 5 a 14 minutos sob vácuo (177 a 203 centímetros (70 a 80 polegadas) de Hg) em uma cultura feita de um dia para o outro de células GV3101 apropriadas de Agrobacterium ressuspendidas em um tampão de mergulho floral. Após a transformação em vácuo, as plantas foram mantidas por 24 horas sob condições de pouca luz através da cobertura parcial com uma folha plástica preta. As transformações a vácuo podem ser repetidas três vezes em intervalos de aproximadamente 10 a 12 dias, o que corresponde à duração da floração. As plantas foram desenvolvidas em mistura em potes em um ambiente controlado (duração de 16 por dia, 21 a 24 °C, 65 a 70% de humidade relativa).

[00362] As sementes T1 produzidas podem ser coletadas e varridas para transformantes pela germinação e desenvolvimento de mudas a 22 °C com luz contínua em um prato de seleção de meio MS de força média (pH 5,6) que contém 1%(p/v) de sacarose, 300 mg/L de timenti- na e 25 mg/l de DL-fosfinotricina para selecionar a resistência a herbicidas. As populações de sementes autofecundadas T2 também podem ser varridas por imunoblot quanto à presença do epítopo V5.

[00363] As sementes autofecundadas T2 podem ser analisadas quanto ao teor de óleo por GC. Aproximadamente 50 linhas transgêni- cas individuais (incluindo linhas de controle) podem ser selecionadas para a próxima geração (10 plantas/linha) com base em seu teor de óleo ou em seu peso de semente. T2 plantas podem ser desenvolvidas e triadas por PCR quanto à quantidade de cópia e à identificação de linhas similares nulas. T2 sementes podem ser analisadas três vezes quanto ao teor de óleo por NMR ou por GC/MS.

RESULTADOS TROCAR A REGIÃO N-TERMINAL DE DGAT1S DE PLANTA ACENTUA A PRODUÇÃO LIPÍDICA EM SACCHAROMYCES CEREVISIAE

[00364] A região citoplasmática N-terminal pode ser trocada entre diferentes DGAT1s de planta para aumentar o rendimento lipídico. As Tabelas 5 a 11 mostram os rendimentos lipídicos de vários DGAT1 quiméricos em que a região citoplasmática N-terminal foi derivado de um DGAT1 de planta embora o restante da proteína tenha sido deriva- do de outro DGAT1 de planta. Os rendimentos lipídicos estão presentes ou como gramas de lipídeos produzidas a cada litro (o que, portanto, compensa quaisquer diferenças na taxa de crescimento) ou foram normalizadas como um percentual do rendimento lipídico do DGAT1 progenitor não modificado correspondente.

[00365] Uma comparação de DGAT1s progenitoras e DGAT1 quiméricos feitos com o uso de um progenitor doador para a região N- terminal, e um progenitor doador diferente para a região N-terminal, é mostrada na Tabela 5. Os rendimentos lipídicos em 32 horas foram normalizados contra o progenitor de maior produção lipídica (Z. mays- L) e são apresentados em ordem ascendente.

[00366] Uma comparação de DGAT1s progenitoras com DGAT1 quiméricas de T. majus feita com o uso ou de T. majus como o progenitor doador para a região N-terminal ou com o uso de T. majus como o progenitor doador para a região C-terminal é mostrada na Tabela 6. Os rendimentos lipídicos a 32 horas foram normalizados contra o rendimento lipídico da DGAT1 progenitora da região C-terminal.

[00367] Uma comparação de DGAT1s progenitoras com DGAT1 quiméricas de O. Sativa-L feita com o uso ou de O. Sativa-L como o progenitor doador para a região N-terminal ou com o uso de O. Sativa- L como o progenitor doador para a região C-terminal é mostrada na Tabela 7. Os rendimentos lipídicos a 32 horas foram normalizados contra o rendimento lipídico da DGAT1 progenitora da região C- terminal. NA = indisponível.

[00368] Uma comparação de DGAT1s progenitoras com DGAT1 qui-méricas de Z. mays-L feita com o uso ou de Z. mays-L como o progenitor doador para a região N-terminal ou com o uso de Z. mays-L como o pro-genitor doador para a região C-terminal é mostrada na Tabela 8. Os ren-dimentos lipídicos a 32 horas foram normalizados contra o rendimento lipídico da DGAT1 progenitora das regiões 2 a 4. NA = indisponível.

[00369] Uma comparação de DGAT1s progenitoras com DGAT1 quiméricas de O. Sativa-S feita com o uso ou de O. Sativa-S como o progenitor doador para a região N-terminal ou com o uso de O. Sativa- S como o progenitor doador para a região C-terminal é mostrada na Tabela 9. Os rendimentos lipídicos a 32 horas foram normalizados contra o rendimento lipídico da DGAT1 progenitora da região C- terminal. NA = indisponível.

[00370] Uma comparação de DGAT1s progenitoras com DGAT1 quiméricas de Z. mays-S feita com o uso ou de Z. mays-S como o pro-genitor doador para a região N-terminal ou com o uso de Z. mays-S como o progenitor doador para a região C-terminal é mostrada na Tabela 10. Os rendimentos lipídicos a 32 horas foram normalizados contra o rendimento lipídico da DGAT1 progenitora da região C-terminal. NA = indisponível.

[00371] Uma comparação de DGAT1s progenitoras com DGAT1 quiméricas de A. thaliana feita com o uso ou de A. thaliana como o progenitor doador para a região N-terminal ou com o uso de A. thalia- na como o progenitor doador para a região C-terminal é mostrada na Tabela 11. Os rendimentos lipídicos a 32 horas foram normalizados contra o rendimento lipídico da DGAT1 progenitora da região C- terminal. NA = indisponível. TABELA 5

TABELA 6

TABELA 7

TABELA 8

TABELA 9

TABELA 10

TABELA 11

TROCAR A REGIÃO N-TERMINAL DE DGAT1s DE PLANTA ALTERA A ESPECIFICIDADE DO SUBSTRATO

[00372] A capacidade de mudar a especificidade de substrato dos DGAT1s de planta através da troca de regiões N-terminal é mostrada na Tabela 12, que demonstra que o perfil lipídico do TAG extraído de células de Saccharomyces cerevisiae que superexpressam DGAT1s de planta é determinado predominantemente pelo doador da região N-terminal. Nos exemplos dados, isso é especificamente visto como um nível relativa-mente alto de 16:0 e 18:0, mas um nível baixo de 18:1c9 no TAG extraído das células que expressam DGAT1s em que a região N-terminal foi derivada de Arabidopsis thaliana. Em contrapartida, o TAG de células que expressam DGAT1s em que a região N-terminal foi derivada de O. sativa-L apresentam níveis relativamente baixos de 16:0 e 18:0, mas ní-veis altos de 18:1c9. Apesar disso, o TAG das células que expressam DGAT1s em que as regiões N-terminais foram derivadas de T. majus apresentam níveis intermediários de 16:0, 18:0 e 18:1c9. TABELA 12

TROCAR A REGIÃO N-TERMINAL DE DGATIs DE PLANTA ACENTUA A PRODUÇÃO LIPÍDICA EM S. BRASSICA NAPUS

[00373] A região N-terminal pode ser trocada entre diferentes DGAT1s de planta para elevar o teor de óleo em sementes de Brassica napus. As Tabelas 13 e 14 mostram os teores de óleo das sementes de várias plantas transgênicas que contém DGAT1 quiméricas em que a região N-terminal foi derivada de um DGAT1 de planta ao passo que o restante da proteína (a região C-terminal) foi derivada de outro DGAT1 de planta. Na Tabela 13, os teores de óleo em semente são apresentados tanto como uma % de Matéria Seca (DM) quanto como uma porcentagem normalizada do teor de óleo em semente dos progenitores DGAT1 não modificados correspondentes. TABELA 13

[00374] Na Tabela 14, os teores de óleo são apresentados tanto como um % de base em DM quanto como uma porcentagem normalizada do teor de óleo em semente da semelhante nula segregadora correspondente. TABELA 14

DISCUSSÃO

[00375] Demostrou-se, portanto, que as proteínas DGAT1 quiméricas da presente invenção podem ser usadas para manipular o acúmulo lipídio celular e o perfil de lipídio celular. Mais especificamente, as mesmas podem ser usadas para alcançar níveis mais altos de acúmulo lipídico em células eucarióticas do que o que pode ser alcançado com o uso de proteínas DGAT1 não alteradas. Demonstrou-se também que, selecionando-se expressar proteínas DGAT1 quiméricas específicas, foi possível não somente aumentar o teor lipídico da célula eucariótica, mas também alterar o perfil lipídico dentro do TAG em acúmulo.

[00376] Há discussões quanto a produzir DGAT1s quiméricas de planta no documento US 2012/0156360 A1. No exemplo 11, os autores descrevem duas quimeras com o uso do N-terminal de um DGAT1 de milho e do C-terminal de um DGAT1 de avelã. Entretanto, a junção das quimeras é no domínio transmembrana putativo que está mais adiante a jusante da junção das quimeras descritas no presente documento. Ademais, não se apresentam dados com relação à atividade das DGAT1s quiméricas de planta no documento US 2012/0156360 A1. Portanto, não há revelações no documento US 2012/0156360 A1 quanto as moléculas de DGAT1 quimérica apresentadas no presente documento, ou das atividades alteradas específicas, ou do uso das quimeras da presente invenção para produzir os efeitos descritos no presente documento.

Claims (10)

1. Proteína DGAT1 quimérica, caracterizada pelo fato de que consiste de: (a) em sua extremidade N-terminal, uma porção N-terminal de uma primeira proteína DGAT1 com uma sequência selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 30 a 58, e (b) em sua extremidade C-terminal, uma porção C-terminal de uma segunda proteína DGAT1 com uma sequência selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 30 a 58, em que a primeira e a segunda proteínas DGAT1 em (a) e (b) são diferentes uma da outra, em que a junção entre a porção N- terminal de uma primeira proteína DGAT1 e a porção C-terminal de uma segunda proteína DGAT1 está a montante do primeiro domínio transmembrana, e em que a proteína quimérica aumenta a produção de triacilglicerídeo (TAG) quando é expressa em uma célula em relação à de uma célula controle.

2. Proteína DGAT1 quimérica, de acordo com a reivindica-ção 1, caracterizada pelo fato de que tem pelo menos um dentre: (i) atividade DGAT1 aumentada, (ii) estabilidade aumentada, (iii) propriedades de oligomerização alteradas, (iv) propriedades de acumulação de proteína celular subs-tancialmente normais, e (v) propriedades de focalização celular substancialmente normais, em relação à primeira DGAT1, à segunda DGAT1 ou a am-bas à primeira DGAT1 e à segunda DGAT1.

3. Uso de uma célula, célula de planta, planta, parte de planta, propágulo ou progênie expressando uma proteína DGAT1 qui-mérica, como definida na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para produção de TAG como resultado da atividade da proteína DGAT1 quimérica expressa.

4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos seguintes se aplica: (i) a célula ou célula de planta usada produz mais TAG do que uma célula ou célula de planta controle; (ii) a célula ou célula de planta usada tem um perfil de lipí-deos alterado em relação à célula ou à célula de planta controle; (iii) a planta usada produz mais TAG, em pelo menos um de seus tecidos ou partes, ou como um todo, do que uma planta controle; e (iv) a planta usada tem um perfil de lipídeos alterado, em pelo menos um de seus tecidos ou partes, ou como um todo, em relação à planta controle.

5. Método para produzir uma proteína DGAT1 quimérica, caracterizado por combinar: (a) uma porção N-terminal de uma primeira proteína DGAT1 com uma sequência selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 30 a 58, e (b) uma porção C-terminal de uma segunda proteína DGAT1 com uma sequência selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 30 a 58, em que a primeira e a segunda proteínas DGAT1 em (a) e (b) são diferentes uma da outra, em que a junção entre a porção N- terminal de uma primeira proteína DGAT1 e a porção C-terminal de uma segunda proteína DGAT1 está a montante do primeiro domínio transmembrana, e em que a proteína quimérica aumenta a produção de TAG quando é expressa em uma célula em relação à de uma célula controle.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a proteína DGAT1 quimérica tem pelo menos uma dentre: (i) atividade DGAT1 aumentada, (ii) estabilidade aumentada, (iii) propriedades de oligomerização alteradas, (iv) propriedades de acumulação de proteína celular subs-tancialmente normais, e (v) propriedades de focalização celular substancialmente normais, em relação à primeira DGAT1, à segunda DGAT1 ou a am-bas à primeira DGAT1 e à segunda DGAT1.

7. Método de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracteri-zado pelo fato de que compreende a etapa de seleção de uma proteína DGAT1 quimérica que tem pelo menos uma dentre: (i) atividade DGAT1 aumentada, (ii) estabilidade aumentada, (iii) propriedades de oligomerização alteradas, (iv) propriedades de acumulação de proteína celular subs-tancialmente normais, e (v) propriedades de focalização celular substancialmente normais, em relação à primeira DGAT1, à segunda DGAT1 ou a am-bas à primeira DGAT1 e à segunda DGAT1.

8. Método para produzir TAG, caracterizado pelo fato de que compreende expressar uma proteína DGAT1 modificada, como definida na reivindicação 1 ou 2, em uma célula, célula de planta ou planta para produzir TAG.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que inclui a etapa de extração do TAG produzido da célula, da célula de planta ou da planta.

10. Método, de acordo a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o TAG extraído é processado em pelo menos um dentre: (a) um combustível, (b) uma oleoquímica, (c) um óleo nutritivo, (d) um óleo cosmético, (e) um ácido graxo poli-insaturado (PUFA), e (f) uma combinação de qualquer um dentre (a) a (e).

Images