ES2715327T3

ES2715327T3 - Polinucleótidos, polipéptidos de aciltransferasa mejorados y métodos de uso

Info

Publication number: ES2715327T3
Application number: ES13851770T
Authority: ES
Inventors: Nicholas John Roberts; Amy Christina Curran; Somrutai Winichayakul; Marissa Roldan; Richard William Scott; David Taylor; Elizabeth-France Marillia
Original assignee: National Research Council of Canada; AgResearch Ltd
Current assignee: National Research Council of Canada; AgResearch Ltd
Priority date: 2012-10-30
Filing date: 2013-10-22
Publication date: 2019-06-03
Anticipated expiration: 2033-10-22
Also published as: CN104903451A; WO2014068439A3; AU2013340445A1; NZ706834A; IN2015DN03964A; EP2914726A2; US20150284736A1; MX354445B; CA2889985C; PL2914726T3; EP2914726A4; AR093290A1; US9896694B2; WO2014068439A2; BR112015009467B1; CA2889985A1; BR112015009467A2; MX2015005271A; AU2013340445B2; CN104903451B

Abstract

Una célula, célula vegetal o planta que comprende un polinucleótido que codifica una proteína DGAT1 quimérica que comprende: a) en su extremo N-terminal, una parte N-terminal de una primera proteína DGAT1 vegetal, y b) en su extremo C-terminal, una parte C-terminal de una segunda proteína DGAT1 vegetal, en donde la unión entre la parte N-terminal de la primera proteína DGAT1 y la parte C-terminal de la segunda proteína DGAT1 está cadena arriba del primer dominio transmembrana en la segunda proteína DGAT1 vegetal, y en donde la célula, la célula vegetal o la planta producen más triacilglicérido (TAG) que una célula, célula vegetal o planta de control.

Description

DESCRIPCION

Polinucleotidos, polipeptidos de aciltransferasa mejorados y metodos de uso

Campo tecnico

La invencion se refiere a composiciones y metodos para la manipulacion de la produccion de Kpidos celulares y/o el perfil de lfpidos celulares.

Antecedentes

El aceite vegetal es un producto economicamente importante, no solo debido a su amplia utilizacion en la industria alimentaria y como componente de ingredientes de piensos, sino que tambien tiene una amplia gama de aplicaciones como biocombustibles o en la fabricacion de diversos productos nutraceuticos e industriales. Dentro de la propia planta, el aceite es esencial para llevar a cabo una serie de procesos metabolicos que son vitales para el crecimiento y el desarrollo, especialmente durante la germinacion de las semillas y en las fases iniciales de crecimiento de la planta. Teniendo en cuenta su valor, existe un creciente interes de investigacion dentro del campo de la biotecnologfa para mejorar la produccion de aceite vegetal y hacer que el suministro sea mas sostenible.

El componente principal del aceite vegetal es el triacilglicerido (TAG). Es la principal forma de almacenamiento de lfpidos en las semillas oleaginosas y la principal fuente de energfa para la germinacion de semillas y el desarrollo de plantulas. La biosmtesis de TAG a traves de la ruta de Kennedy implica etapas de acilacion secuencial a partir del precursor sn-glicerol-3-fosfato (G3P). En primer lugar, el G3P se esterifica mediante una acil-CoA para formar ácido lisofosfatidico (LPA) en una reaccion catalizada por glicerol-3-fosfato aciltransferasa (GPAT, EC 2.3.1.15). A esto le sigue una segunda etapa de acilacion catalizada por la ácido lisofosfatfdico aciltransferasa (LPAT; EC 2.3.1.51) formando ácido fosfatfdico (PA), un intermedio clave en la biosmtesis de glicerolfpidos. Despues, el PA es desfosforilado por la enzima ácido fosfatfdico fosfatasa (PAP; EC3.1.3.4) para liberar el precursor inmediato de TAG, el sn-1,2-diacilglicerol (DAG). Por ultimo, el DAG es acilado en la posicion sn-3 por la enzima diacilglicerol aciltransferasa (DGAT; Ec 2.3.1.20) para formar TAG.

Dado que esta ultima accion catalttica es la unica etapa en la biosmtesis de TAG, la DGAT se denomina enzima formadora de triacilglicerol comprometida. Dado que DAG esta ubicado en el punto de ramificacion entre la biosmtesis de TAG y de fosfolfpidos de membrana, DGAT potencialmente juega un papel decisivo en la regulacion de la formacion de TAG en la ruta de smtesis de glicerolfpidos (Lung y Weselake, 2006, Lipids. diciembre de 2006; 41(12): 1073-88). Hay dos familias diferentes de protemas DGAT. La primera familia de protemas DGAT ("DGAT1") se relaciona con la acil-coenzima A:colesterol aciltransferasa ("ACAT") y se ha descrito en los documentos U.A. at. 6.100.077 y 6.344.548. Una segunda familia de protemas DGAT ("DGAT2") no esta relacionada con la familia DGAT1 y se describe en la publicacion de patente p Ct WO 2004/011671 publicada el 5 de febrero de 2004. Otras referencias a los genes DGAT y su uso en plantas incluyen los las publicaciones PCT No. WO2004/011.671, WO1898/055.631 y W02000/001.713, y en la publicacion de patente de Estados Unidos No. 20030115632.

DGAT1 es normalmente la principal enzima sintetizadora de TAG tanto en la semilla como en la hoja senescente (Kaup et al., 2002, Plant Physiol. 129 (4): 1616-26; para revisiones, vease Lung y Weselake 2006, Lipids. 41 (12): 1073-88; Cahoon et al., 2007, Current Opinion in Plant Biology. 10: 236-244; y Li et al., 2010, Lipids. 45: 145-157).

El aumento del rendimiento de los cultivos de semillas oleaginosas (colza, girasol, cartamo, soja, mafz, algodon, linaza, lino, etc.) ha sido un objetivo importante para la industria agncola durante decadas. Se han probado muchos enfoques (incluyendo la cna tradicional y mutacional, asf como la ingeniena genetica), normalmente con un exito modesto (Xu et al., 2008, Plant Biotechnol J., 6: 799-818 y referencias en su interior).

Aunque los biocombustibles lfquidos ofrecen una promesa considerable, la realidad de utilizar material biologico se ve atenuada por los usos competitivos y las cantidades disponibles. En consecuencia, plantas y microorganismos genomanipulados para abordar esto es el foco de multiples grupos de investigacion; en particular, la acumulacion de triacilglcerol (TAG) en tejidos vegetativos y levaduras y bacterias oleaginosas (Fortman et al., 2008, Trends Biotechnol 26, 375-381; Ohlrogge et al., 2009, Science 324, 1019-1020). El TAG es un lfpido neutro con el doble de la densidad energetica de la celulosa y se puede usar para generar biodiesel, un biocombustible deseable de alta densidad energetica con uno de los procesos de fabricacion mas simples y eficientes. La acumulacion de TAG genotecnologico en las hojas hasta ahora ha dado como resultado un aumento de 5-20 veces con respecto al tipo silvestre, utilizando diversas estrategias que incluyen: la sobreexpresion de los factores de transcripcion del desarrollo de semillas (LEC1, LEC2 y WRI1); silenciamiento de APS (un gen clave implicado en la biosmtesis de almidon); mutacion de CGI-58 (un regulador de la acumulacion de lfpidos neutros); y la regulacion positiva de la enzima de smtesis de TAG, DGAT (diacilglicerol O aciltransferasa, EC 2.3.1.20) en plantas y tambien en levaduras (Andrianov et al., 2009, Plant Biotech J 8, 1-11; Mu et al., 2008, Plant Physiol 148, 1042-1054; Sanjaya et al., 2011, Plant Biotech J 9, 874-883; Santos-Mendoza, et al., 2008, Plant J 54, 608-620; James et al., 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 107, 17833-17838; Beopoulos et al., 2011, Appl Microbiol Biotechnol 90, 1193-1206; Bouvier-Nave et al., 2000, Eur J Biochem 267, 85 96; Durrett et al., 2008, Plant J 54, 593-607). Sin embargo, se ha reconocido que para conseguir mayores aumentos en TAG, prevenir su catabolismo puede ser crucial en tejidos no oleaginosos y en una gama de fases de desarrollo (Yang y Ohlrogge, 2009, Plant Physiol 150, 1981-1989).

Manipular positivamente el rendimiento y la calidad de los triacilgliceridos (TAG) en eucariotas es diffcil de conseguir. La enzima diacilglicerol-O-aciltransferasa (DGAT) tiene la actividad espedfica mas baja de las enzimas de la ruta de Kennedy y se considera un "cuello de botella" en la smtesis de TAG.

Se han realizado intentos previos para mejorar DGAT1 mediante metodos biotecnologicos, con un exito limitado. Por ejemplo, Nykiforuk et al., (2002, Biochimica et Biophysica Acta 1580: 95-109) informaron sobre el truncamiento N-terminal de la DGAT1 de Brassica napus pero informaron una actividad aproximadamente un 50 % mas baja. McFie et al., (2010, JBC., 285: 37377-37387) informaron de que el truncamiento N-terminal de la DGAT 1 de raton produjo un aumento de la actividad espedfica de la enzima, pero tambien informaron de una gran disminucion en el nivel de protema que se acumulaba.

Xu et al., (2008, Plant Biotechnology Journal, 6:799-818) identificaron recientemente una secuencia de consenso (X-Leu-X-Lys-XX-Ser-XXX-Val) dentro de secuencia de DGAT1 de Tropaeolum majus (capuchina de jardm) (TmDGAT1)), como un motivo de direccionamiento tfpico de los miembros de la protema cinasa-1 relacionada con SNF1 (SnRK1), siendo Ser el residuo para fosforilacion. Las protemas SnRK1 son una clase de Ser/Thr protema cinasas que se han implicado cada vez mas en la regulacion global del metabolismo del carbono en las plantas, por ejemplo, la inactivacion de la sacarosa fosfato sintasa por fosforilacion (Halford & Hardie 1998, Plant Mol Biol. 37: 735-48. Revision). Xu et al., (2008, Plant Biotechnology Journal, 6:799-818) realizaron mutagenesis dirigida al sitio en seis supuestas regiones/motivos funcionales de la enzima T mDGAT 1. La mutagenesis de un residuo de serina (S197) en un supuesto sitio diana de SnRK1 dio como resultado un aumento del 38 %-80 % en la actividad de DGAT1, y la sobreexpresion de TmDGAT1 mutada en Arabidopsis produjo un aumento del 20 %-50 % en el contenido de aceite por semilla.

Kamisaka, et al. (2010. Applied microbiology and biotechnology 88.1 (2010): 105-115) describe como

Sena beneficioso proporcionar formas mejoradas de DGAT1, que superen una o mas de las deficiencias en la tecnica anterior, y que se puedan usar para aumentar la produccion de aceite celular.

Es un objetivo de la invencion proporcionar protemas DGAT 1 mejoradas y metodos para su uso para alterar al menos uno de la produccion de lfpidos celulares y el perfil de lfpidos celulares, y/o al menos proporcionar al publico una opcion util.

Sumario de la invencion

Los inventores han demostrado que es posible producir protemas DGAT1 quimericas con propiedades ventajosas respecto a cualquiera de las moleculas DGAT1 parentales usadas para producir las protemas DGAT1 quimericas. Las protemas DGAT1 quimericas de la invencion pueden expresarse en celulas para alterar el contenido de lfpidos y el perfil de lfpidos de las celulas, u organismos que contienen las celulas.

Polinucleotido que codifica un polipeptido

En el primer aspecto, la invencion proporciona una celula, celula vegetal o planta que comprende un polinucleotido que codifica una protema DGAT1 quimerica que comprende:

a) en su extremo N-terminal, una parte X-terminal de una primera protema DGAT1 vegetal, y

b) en su extremo C-terminal, una parte C-terminal de una segunda protema DGAT1 vegetal,

en donde la union entre la parte N-terminal de la primera protema DGAT1 y la parte C-terminal de la segunda protema DGAT 1 esta cadena arriba del primer dominio transmembrana en la segunda protema DGAT 1 vegetal.

y en donde la celula, la celula vegetal o la planta producen mas triacilglicerido (TAG) que una celula, celula vegetal o planta de control.

En una realización, la protema DGAT1 quimerica tiene al menos uno de:

i) actividad DGAT1 aumentada

ii) estabilidad aumentada

iii) propiedades de oligomerizacion alteradas

iv) propiedades de acumulacion de protemas celulares sustancialmente normales

v) propiedades de direccionamiento celular sustancialmente normales

con respecto a la primera DGAT1, la segunda DGAT1 o tanto la primera DGAT1 como la segunda DGAT1.

En una realizacion adicional, la protema DGAT1 quimerica tiene al menos uno de:

i) actividad DGAT1 aumentada

ii) estabilidad aumentada

iii) propiedades de oligomerizacion alteradas

iv) propiedades de acumulacion de protemas celulares sustancialmente normales

v) propiedades de direccionamiento celular sustancialmente normales

con respecto a la primera DGAT1.

En una realizacion adicional, la protema DGAT1 quimerica tiene al menos uno de:

i) actividad DGAT1 aumentada

ii) estabilidad aumentada

iii) propiedades de oligomerizacion alteradas

iv) propiedades de acumulacion de protemas celulares sustancialmente normales

v) propiedades de direccionamiento celular sustancialmente normales

con respecto a la segunda DGAT1.

En una realizacion adicional, la protema DGAT1 quimerica tiene al menos uno de:

i) actividad DGAT1 aumentada

ii) estabilidad aumentada

iii) propiedades de oligomerizacion alteradas

iv) propiedades de acumulacion de protemas celulares sustancialmente normales

v) propiedades de direccionamiento celular sustancialmente normales

con respecto a tanto la primera DGAT1 como la segunda DGAT1.

En una realización, la parte W-terminal de una primera protema DGAT1 es la region citoplasmica W-terminal de la primera protema DGATl. En una realización, la region citoplasmica W-terminal de la primera protema DGAT1 se extiende desde el extremo N de la primera protema DGAT1 hasta el extremo del dominio de union a acil-CoA de la primera protema DGAT1. En una realizacion adicional, la region citoplasmica W-terminal de la primera protema DGAT1 es la region cadena arriba del primer dominio transmembrana.

La posicion del dominio de union a acil-CoA y el primer dominio transmembrana, para una serie de protemas DGAT 1, se muestra en la figura 3.

En una realizacion adicional, la union entre la parte W-terminal de una primera protema DGAT1 y la parte C-terminal de una segunda protema DGAT 1 esta en el sitio de union a acil-CoA de la primera y la segunda protema DGAT 1. En una realizacion adicional, la union entre la parte W-terminal de una primera protema DGAT1 y la parte C-terminal de una segunda protema DGAT 1 esta en una posicion correspondiente en el sitio de union a acil-CoA de la primera y la segunda protema DGAT1.

En una realización, la union entre la parte W-terminal de una primera protema DGAT1 y la parte C-terminal de una segunda protema DGAT 1 esta dentro de la LSS (Leu-Ser-Ser) conservada en el sitio de union a acil-CoA de la primera y la segunda protema DGAT1.

En una realizacion preferida, la DGAT1 quimerica tiene un sitio de union a acil-CoA intacto.

En una realización, el sitio de union a acil-CoA en la DGAT1 quimerica es de la misma longitud que el sitio de union a acil-CoA en la primera protema DGAT1.

En una realizacion adicional, el sitio de union a acil-CoA en la DGAT1 quimerica es de la misma longitud que el sitio de union a acil-CoA en la segunda protema DGAT1.

En una realizacion preferida, el sitio de union a acil-CoA en la DGAT1 quimerica es de la misma longitud que el sitio de union a acil-CoA en la primera y la segunda protema DGAT 1.

En una realizacion adicional, el polipeptido de la invencion, cuando se expresa en la celula, tiene una especificidad de sustrato alterada con respecto a al menos una de las primera y segunda protemas DGAT1.

Construction

La divulgacion proporciona una construccion genetica que comprende un polinucleotido de la invencion como se ha descrito anteriormente.

Celulas

En una realizacion adicional, la invencion proporciona una celula que comprende un polinucleotido de la invencion. En una realizacion preferida, la celula expresa la DGAT1 quimerica.

En una realización, la protema DGAT1 quimerica, cuando se expresa en la celula, tiene al menos uno de:

i) actividad DGAT1 aumentada,

ii) estabilidad aumentada,

iii) propiedades de oligomerizacion alteradas,

iv) propiedades de acumulacion de protemas celulares sustancialmente normales, y

v) propiedades de direccionamiento subcelular sustancialmente normales

i) actividad DGAT1 aumentada,

ii) estabilidad aumentada,

iii) propiedades de oligomerizacion alteradas,

v) propiedades de direccionamiento subcelular sustancialmente normales

con respecto a la primera DGAT1, cuando se expresa en una celula.

i) actividad DGAT1 aumentada,

ii) estabilidad aumentada,

iii) propiedades de oligomerizacion alteradas,

v) propiedades de direccionamiento subcelular sustancialmente normales

con respecto a la segunda DGAT1, cuando se expresa en una celula.

En una realizacion adicional, la protema DGAT1 quimerica tiene al menos uno de:

i) actividad DGAT1 aumentada

ii) estabilidad aumentada

iii) propiedades de oligomerizacion alteradas

iv) propiedades de acumulacion de protemas celulares sustancialmente normales

v) propiedades de direccionamiento celular sustancialmente normales

con respecto a tanto la primera DGAT1 como la segunda DGAT1.

La celula produce mas TAG que una celula de control.

En una realización, la celula produce al menos un 5 % mas, al menos un 10 % mas, al menos un 15 % mas, al menos un 20 % mas, al menos un 25 % mas, al menos un 30 % mas, al menos un 35 % mas, al menos un 40 % mas, al menos un 45 % mas, al menos un 50 % mas, al menos un 55 % mas, al menos un 60 % mas, al menos un 65 % mas, al menos un 70 % mas, al menos un 75 % mas, al menos un 80 % mas, al menos un 85 % mas, al menos un 90 % mas, preferentemente al menos un 95 % mas, preferentemente al menos un 100 % mas, al menos un 105 % mas, al menos un 110 % mas, al menos un 115 % mas, al menos un 120 % mas, al menos un 125 % mas, al menos un 130 % mas, al menos un 135 % mas, al menos un 140 % mas, al menos un 145 % mas, al menos un 150 % mas lfpido que una celula de control.

En una realizacion adicional, la celula tiene un perfil lipfdico alterado con respecto a una celula de control.

En una realización, la proporcion de 16:0 en el triacilglicerol esta alterada con respecto a la de una celula de control.

En una realización, la proporcion de 16:0 en el triacilglicerol esta alterada en al menos el 1 %, preferentemente al menos el 2 %, mas preferentemente al menos el 3 %, mas preferentemente al menos el 4 %, mas preferentemente al menos el 5 %, mas preferentemente al menos el 6 %, mas preferentemente al menos el 7 %, mas preferentemente al menos el 8 %, mas preferentemente al menos el 9 %, mas preferentemente al menos el 10 %, mas preferentemente al menos el 11 %, mas preferentemente al menos el 12 %, mas preferentemente al menos el 13 %, mas preferentemente al menos el 14 %, mas preferentemente al menos el 15 %, mas preferentemente al menos el 16 %, mas preferentemente al menos el 17 %, mas preferentemente al menos el 18 %, mas preferentemente al menos el 19 %, mas preferentemente al menos el 20 %, con respecto a la de una celula de control.

En una realizacion adicional, el perfil lipfdico alterado tiene una proporcion de 16:0 en el triacilglicerol en el intervalo del 6 % al 16 %. En esta realización, la proporcion de 16:0 en el triacilglicerol esta alterada en el intervalo del 6 % al 16 %.

En una realizacion adicional, la proporcion de 18:0 en el triacilglicerol esta alterada con respecto a la de una celula de control.

En una realización, la proporcion de 18:0 en el triacilglicerol esta alterada en al menos el 1 %, preferentemente al menos el 2 %, mas preferentemente al menos el 3 %, mas preferentemente al menos el 4 %, mas preferentemente al menos el 5 %, mas preferentemente al menos el 6 %, mas preferentemente al menos el 7 %, mas preferentemente al menos el 8 %, mas preferentemente al menos el 9 %, mas preferentemente al menos el 10 %, mas preferentemente al menos el 11 %, mas preferentemente al menos el 12 %, mas preferentemente al menos el 13 %, mas preferentemente al menos el 14 %, mas preferentemente al menos el 15 %, mas preferentemente al menos el 16 %, mas preferentemente al menos el 17 %, mas preferentemente al menos el 18 %, mas preferentemente al menos el 19 %, mas preferentemente al menos el 20 %, con respecto a la de una celula de control.

En una realizacion adicional, el perfil lipfdico alterado tiene una proporcion de 18:0 en el triacilglicerol en el intervalo del 7 % al 15 %. En esta realización, la proporcion de 18:0 en el triacilglicerol esta alterada en el intervalo del 7 % al 15 %.

En una realizacion adicional, la proporcion de 18:1 en el triacilglicerol esta alterada con respecto a la de una celula de control.

En una realización, la proporcion de 18:1 en el triacilglicerol esta alterada en al menos el 1 %, preferentemente al menos el 2 %, mas preferentemente al menos el 3 %, mas preferentemente al menos el 4 %, mas preferentemente al menos el 5 %, mas preferentemente al menos el 6 %, mas preferentemente al menos el 7 %, mas preferentemente al menos el 8 %, mas preferentemente al menos el 9 %, mas preferentemente al menos el 10 %, mas preferentemente al menos el 11 %, mas preferentemente al menos el 12 %, mas preferentemente al menos el 13 %, mas preferentemente al menos el 14 %, mas preferentemente al menos el 15 %, mas preferentemente al menos el 16 %, mas preferentemente al menos el 17 %, mas preferentemente al menos el 18 %, mas preferentemente al menos el 19 %, mas preferentemente al menos el 20 %, con respecto a la de una celula de control.

En una realizacion adicional, el perfil lipfdico alterado tiene una proporcion de 18:1 en el triacilglicerol en el intervalo del 39 % al 55 %. En esta realización, la proporcion de 18:1 en el triacilglicerol esta alterada en el intervalo del 39 % al 55 %.

La celula de control puede ser cualquier celula del mismo tipo que no este transformada con el polinucleotido, o construccion, de la invencion para expresar la DGAT1 quimerica.

En una realización, la celula de control es una celula no transformada. En una realizacion adicional, la celula de control es una celula transformada para expresar la primera DGAT1. En una realizacion adicional, la celula de control es una celula transformada para expresar la segunda DGAT1.

Celulas tambien transformadas para expresar una oleosina

En una realización, la celula tambien esta transformada para expresar al menos una de: una oleosina, esteroleosina, caloleosina, polioleosina y una oleosina que incluye al menos una cistema introducida artificialmente (WO2011/053169).

Planta

En una realizacion adicional, la invencion proporciona una planta que comprende un polinucleotido de la invencion.

En una realizacion preferida, la planta expresa la DGAT1 quimerica.

En una realización, la protema DGAT1 quimerica, cuando se expresa en la planta, tiene al menos uno de: i) actividad DGAT1 aumentada,

ii) estabilidad aumentada,

iii) propiedades de oligomerizacion alteradas,

v) propiedades de direccionamiento subcelular sustancialmente normales

En una realización, la protema DGAT1 quimerica, cuando se expresa en la planta, tiene al menos uno de:

i) actividad DGAT1 aumentada,

ii) estabilidad aumentada,

iii) propiedades de oligomerizacion alteradas,

v) propiedades de direccionamiento subcelular sustancialmente normales

con respecto a la primera DGAT1.

i) actividad DGAT1 aumentada,

ii) estabilidad aumentada,

iii) propiedades de oligomerizacion alteradas,

v) propiedades de direccionamiento subcelular sustancialmente normales

con respecto a la segunda DGAT1.

i) actividad DGAT1 aumentada,

ii) estabilidad aumentada,

iii) propiedades de oligomerizacion alteradas,

v) propiedades de direccionamiento subcelular sustancialmente normales

con respecto a tanto la primera DGAT1 como la segunda DGAT1.

i) actividad DGAT1 aumentada,

ii) estabilidad aumentada,

iii) propiedades de oligomerizacion alteradas,

v) propiedades de direccionamiento subcelular sustancialmente normales

con respecto a tanto la primera DGAT1 como la segunda DGAT1.

La planta produce mas TAG, en al menos uno de sus tejidos o partes, que el tejido o parte equivalente en una planta de control.

En una realización, la planta produce al menos un 5 % mas, al menos un 10 % mas, al menos un 15 % mas, al menos un 20 % mas, al menos un 25 % mas, al menos un 30 % mas, al menos un 35 % mas, al menos un 40 % mas, al menos un 45 % mas, al menos un 50 % mas, al menos un 55 % mas, al menos un 60 % mas, al menos un 65 % mas, al menos un 70 % mas, al menos un 75 % mas, al menos un 80 % mas, al menos un 85 % mas, al menos un 90 % mas, preferentemente al menos un 95 % mas, preferentemente al menos un 100 % mas, al menos un 105 % mas, al menos un 110 % mas, al menos un 115 % mas, al menos un 120 % mas, al menos un 125 % mas, al menos un 130 % mas, al menos un 135 % mas, al menos un 140 % mas, al menos un 145 % mas, al menos un 150 % mas lfpido que una celula de control.

En una realización, el tejido es un tejido vegetativo. En una realización, la parte es una hoja. En una realizacion adicional, la parte es una rafz. En una realizacion adicional, la parte es un tuberculo. En una realizacion adicional, la parte es un bulbo. En una realizacion adicional, la parte es un tallo. En una realizacion adicional, la parte es un tallo de una planta monocotiledonea. En una realizacion adicional, la parte es un stovum (tallo y limbo de la hoja).

En una realizacion preferida, el tejido es tejido de semilla. En una realizacion preferida, la parte es una semilla. En una realizacion preferida, el tejido es tejido del endospermo.

En una realizacion adicional, la planta en su conjunto produce mas lfpidos que la planta de control en su conjunto.

En una realizacion adicional, la planta tiene un lfpido alterado, en al menos uno de sus tejidos o partes, con respecto a una planta de control.

En una realización, la proporcion de 16:0 en el triacilglicerol esta alterada con respecto a la de una planta de control.

En una realización l,a proporcion de 16:0 en el triacilglicerol esta alterada en al menos el 1 %, preferentemente al menos el 2 %, mas preferentemente al menos el 3 %, mas preferentemente al menos el 4 %, mas preferentemente al menos el 5 %, mas preferentemente al menos el 6 %, mas preferentemente al menos el 7 %, mas preferentemente al menos el 8 %, mas preferentemente al menos el 9 %, mas preferentemente al menos el 10 %, mas preferentemente al menos el 11 %, mas preferentemente al menos el 12 %, mas preferentemente al menos el 13 %, mas preferentemente al menos el 14 %, mas preferentemente al menos el 15 %, mas preferentemente al menos el 16 %, mas preferentemente al menos el 17 %, mas preferentemente al menos el 18 %, mas preferentemente al menos el 19 %, mas preferentemente al menos el 20 %, con respecto a la de una celula de control.

En una realización, el perfil lipfdico alterado tiene una proporcion de 16:0 en el triacilglicerol en el intervalo del 6 % al 16 %. En esta realización, la proporcion de 16:0 en el triacilglicerol esta alterada en el intervalo del 6 % al 16 %.

En una realizacion adicional, la proporcion de 18:0 en el triacilglicerol esta alterada con respecto a la de una planta de control.

En una realización, el perfil lipfdico alterado tiene una proporcion de 18:0 en el triacilglicerol en el intervalo del 7 % al 15 %. En esta realización, la proporcion de 18:0 en el triacilglicerol esta alterada en el intervalo del 7 % al 15 %.

En una realizacion adicional, la proporcion de 18:1 en el triacilglicerol esta alterada con respecto a la de una planta de control.

En una realización, el perfil lipfdico alterado tiene una proporcion de 18:1 en el triacilglicerol en el intervalo del 39 % al 55 %. En esta realización, la proporcion de 18:1 en el triacilglicerol esta alterada en el intervalo del 39 % al 55 %.

En una realizacion adicional, la planta en su conjunto tiene un perfil lipfdico alterado con respecto a la planta de control en su conjunto.

La planta de control puede ser cualquier planta del mismo tipo que no este transformada con el polinucleotido, o construccion, de la invencion para expresar la DGAT1 quimerica.

En una realización, la planta de control es una planta no transformada. En una realizacion adicional, la planta de control es una planta transformada para expresar la primera DGAT1. En una realizacion adicional, la planta de control es una planta transformada para expresar la segunda DGAT1.

Planta tambien transformada para expresar una oleosina

En una realización, la planta tambien esta transformada para expresar al menos una de: una oleosina, esteroleosina, caloleosina, polioleosina y una oleosina que incluye al menos una cistema introducida artificialmente (WO 2011/053169).

Polipeptido

En un aspecto adicional, la invencion proporciona una protema DGAT1 quimerica producida por la expresion del polinucleotido de la invencion descrito anteriormente en una celula, celula vegetal o planta, en donde la protema DGAT1 quimerica es capaz de aumentar la produccion de TAG en la celula, celula vegetal o planta, con respecto a la de la celula, celula vegetal o planta de control.

En una realización, la protema DGAT1 quimerica tiene al menos uno de:

i) actividad DGAT1 aumentada

ii) estabilidad aumentada

iii) propiedades de oligomerizacion alteradas

iv) propiedades de acumulacion de protemas celulares sustancialmente normales

v) propiedades de direccionamiento celular sustancialmente normales

En una realizacion adicional, la protema DGAT1 quimerica tiene al menos uno de:

i) actividad DGAT1 aumentada

ii) estabilidad aumentada

iii) propiedades de oligomerizacion alteradas

iv) propiedades de acumulacion de protemas celulares sustancialmente normales

v) propiedades de direccionamiento celular sustancialmente normales

con respecto a la primera DGAT 1.

En una realizacion adicional, la protema DGAT1 quimerica tiene al menos uno de:

i) actividad DGAT1 aumentada

ii) estabilidad aumentada

iii) propiedades de oligomerizacion alteradas

iv) propiedades de acumulacion de protemas celulares sustancialmente normales

v) propiedades de direccionamiento celular sustancialmente normales

con respecto a la segunda DGAT1.

i) actividad DGAT1 aumentada,

ii) estabilidad aumentada,

iii) propiedades de oligomerizacion alteradas,

v) propiedades de direccionamiento subcelular sustancialmente normales

con respecto a tanto la primera DGAT1 como la segunda DGAT1.

En una realización, la parte W-terminal de una primera protema DGAT1 es la region citoplasmica W-terminal de la primera protema DGAT1. En una realización, la region citoplasmica W-terminal de la primera protema DGAT1 se extiende desde el extremo N de la primera protema DGAT1 hasta el extremo del dominio de union a acil-CoA de la primera protema DGAT1. En una realizacion adicional, la region citoplasmica W-terminal de la primera protema DGAT1 es la region cadena arriba del primer dominio transmembrana.

En una realización, la union entre la parte W-terminal de una primera protema DGAT1 y la parte C-terminal de una segunda protema DGAT1 esta en el sitio de union a acil-CoA de la primera y la segunda protema DGAT1.

En una realizacion adicional, la union entre la parte W-terminal de una primera protema DGAT1 y la parte C-terminal de una segunda protema DGAT 1 esta en una posicion correspondiente en el sitio de union a acil-CoA de la primera y la segunda protema DGAT1.

Metodo para producir una DCAT1 quimerica

En el presente documento se describe un metodo para producir una protema DGAT1 quimerica, comprendiendo el metodo combinar:

a) una parte W-terminal de una primera protema DGAT1, y

b) una parte C-terminal de una segunda protema DGAT1.

La protema DGAT1 quimerica comprende:

a) en su extremo W-terminal, la parte W-terminal de una primera protema DGAT1, y

b) en su extremo C-terminal, la parte C-terminal de una segunda protema DGAT1.

La protema DGAT1 quimerica puede tener al menos uno de:

i) actividad DGAT1 aumentada

ii) estabilidad aumentada

iii) propiedades de oligomerizacion alteradas

iv) propiedades de acumulacion de protemas celulares sustancialmente normales

v) propiedades de direccionamiento celular sustancialmente normales

La protema DGAT1 quimerica puede tener al menos uno de:

i) actividad DGAT1 aumentada

ii) estabilidad aumentada

iii) propiedades de oligomerizacion alteradas

iv) propiedades de acumulacion de protemas celulares sustancialmente normales

v) propiedades de direccionamiento celular sustancialmente normales

con respecto a la primera DGAT 1.

La protema DGAT1 quimerica puede tener al menos uno de:

i) actividad DGAT1 aumentada

ii) estabilidad aumentada

iii) propiedades de oligomerizacion alteradas

iv) propiedades de acumulacion de protemas celulares sustancialmente normales

v) propiedades de direccionamiento celular sustancialmente normales con respecto a la segunda DGAT1.

La protema DGAT1 quimerica puede tener al menos uno de:

i) actividad DGAT1 aumentada

ii) estabilidad aumentada

iii) propiedades de oligomerizacion alteradas

iv) propiedades de acumulacion de protemas celulares sustancialmente normales

v) propiedades de direccionamiento celular sustancialmente normales

con respecto a tanto la primera DGAT1 como la segunda DGAT1.

El metodo puede comprender ensayar al menos uno de

i) actividad

ii) estabilidad

iii) propiedades de oligomerizacion

iv) propiedades de acumulacion de protemas celulares

v) propiedades de direccionamiento celular

de la protema DGAT1 quimerica.

El metodo puede comprender la etapa de seleccionar una protema DGAT1 quimerica que tiene al menos uno de: i) actividad DGAT1 aumentada

ii) estabilidad aumentada

iii) propiedades de oligomerizacion alteradas

iv) propiedades de acumulacion de protemas celulares sustancialmente normales

v) propiedades de direccionamiento celular sustancialmente normales

El metodo puede comprender la etapa de seleccionar una protema DGAT 1 quimerica que tiene al menos uno de: i) actividad DGAT1 aumentada

ii) estabilidad aumentada

iii) propiedades de oligomerizacion alteradas

iv) propiedades de acumulacion de protemas celulares sustancialmente normales

v) propiedades de direccionamiento celular sustancialmente normales

con respecto a la primera protema DGAT1.

ii) estabilidad aumentada

iii) propiedades de oligomerizacion alteradas

iv) propiedades de acumulacion de protemas celulares sustancialmente normales

v) propiedades de direccionamiento celular sustancialmente normales

con respecto a la segunda protema DGAT1.

ii) estabilidad aumentada

iii) propiedades de oligomerizacion alteradas

iv) propiedades de acumulacion de protemas celulares sustancialmente normales

v) propiedades de direccionamiento celular sustancialmente normales

con respecto a tanto la primera DGAT1 como la segunda DGAT1.

La parte W-terminal de la primera protema DGAT1 puede ser la region citoplasmica W-terminal de la primera protema DGAT1. La region citoplasmica W-terminal de la primera protema DGAT1 puede extenderse desde el extremo N de la primera protema DGAT1 hasta el extremo del dominio de union a acil-CoA de la primera protema DGAT1.

La region citoplasmica W-terminal de la primera protema DGAT1 puede ser la region cadena arriba del primer dominio transmembrana.

La union entre la parte W-terminal de una primera protema DGAT1 y la parte C-terminal de una segunda protema DGAT1 esta cadena arriba del primer dominio transmembrana.

La union entre la parte W-terminal de una primera protema DGAT1 y la parte C-terminal de una segunda protema DGAT1 puede estar en el sitio de union a acil-CoA de la primera y la segunda protema DGAT1.

La union entre la parte W-terminal de una primera protema DGAT1 y la parte C-terminal de una segunda protema DGAT 1 puede estar en una posicion correspondiente en el sitio de union a acil-CoA de la primera y la segunda protema DGAT 1.

La union entre la parte W-terminal de una primera protema DGAT1 y la parte C-terminal de una segunda protema DGAT1 puede estar dentro de la LSS (Leu-Ser-Ser) conservada en el sitio de union a acil-CoA de la primera y la segunda protema DGAT1.

La DGAT1 quimerica puede tener un sitio de union a acil-CoA intacto.

El sitio de union a acil-CoA en la DGAT 1 quimerica puede ser de la misma longitud que el sitio de union a acil-CoA en la primera protema DGAT1.

El sitio de union a acil-CoA en la DGAT 1 quimerica puede ser de la misma longitud que el sitio de union a acil-CoA en la segunda protema DGAT1.

El sitio de union de acil-CoA en la DGAT1 quimerica puede ser de la misma longitud que el sitio de union a acil-CoA en la primera y la segunda protema DGAT1.

Partes de plants

En una realizacion adicional, la invencion proporciona una parte, propagulo o progenie de una planta de la invencion, en donde la parte, propagulo o progenie comprende al menos uno del polinucleotido y la protema DGAT1 quimerica, en donde la parte, propagulo o progenie produce mas TAG que una parte, propagulo o progenie de control.

En una realizacion preferida, la parte, propagulo o progenie expresa al menos uno de un polinucleotido, o polipeptido de la invencion.

En una realizacion preferida, la parte, propagulo o progenie expresa una protema DGAT1 quimerica de la invencion.

La parte, propagulo o progenie produce mas TAG que una parte, propagulo o progenie de control, o parte, propagulo o progenie de una planta de control.

En una realización, la parte, propagulo o progenie produce al menos un 5 % mas, al menos un 10 % mas, al menos un 15 % mas, al menos un 20 % mas, al menos un 25 % mas, al menos un 30 % mas, al menos un 35 % mas, al menos un 40 % mas, al menos un 45 % mas, al menos un 50 % mas, al menos un 55 % mas, al menos un 60 % mas, al menos un 65 % mas, al menos un 70 % mas, al menos un 75 % mas, al menos un 80 % mas, al menos un 85 % mas, al menos un 90 % mas, preferentemente al menos un 95 % mas, preferentemente al menos un 100 % mas, al menos un 105 % mas, al menos un 110 % mas, al menos un 115 % mas, al menos un 120 % mas, al menos un 125 % mas, al menos un 130 % mas, al menos un 135 % mas, al menos un 140 % mas, al menos un 145 % mas, al menos un 150 % mas lfpido que una parte, propagulo o progenie de control, o parte, propagulo o progenie de una planta de control.

En una realizacion preferida, la parte, propagulo o progenie tiene un perfil lipfdico alterado con respecto a una parte, propagulo o progenie de control, o parte, propagulo o progenie de una planta de control.

En una realización, la proporcion de 16:0 en el triacilglicerol esta alterada con respecto a la de una parte, propagulo o progenie de control, o parte, propagulo o progenie de una planta de control.

En una realización, la proporcion de 16:0 en el triacilglicerol esta alterada en al menos el 1 %, preferentemente al menos el 2 %, mas preferentemente al menos el 3 %, mas preferentemente al menos el 4 %, mas preferentemente al menos el 5 %, mas preferentemente al menos el 6 %, mas preferentemente al menos el 7 %, mas preferentemente al menos el 8 %, mas preferentemente al menos el 9 %, mas preferentemente al menos el 10 %, mas preferentemente al menos el 11 %, mas preferentemente al menos el 12 %, mas preferentemente al menos el 13 %, mas preferentemente al menos el 14 %, mas preferentemente al menos el 15 %, mas preferentemente al menos el 16 %, mas preferentemente al menos el 17 %, mas preferentemente al menos el 18 %, mas preferentemente al menos el 19 %, mas preferentemente al menos el 20 %, con respecto a la de una parte, propagulo o progenie de control, o parte, propagulo o progenie de una planta de control.

En una realizacion adicional, la proporcion de 18:0 en el triacilglicerol esta alterada con respecto a la de una parte, propagulo o progenie de control, o parte, propagulo o progenie de una planta de control.

En una realización, la proporcion de 18:0 en el triacilglicerol esta alterada en al menos el 1 %, preferentemente al menos el 2 %, mas preferentemente al menos el 3 %, mas preferentemente al menos el 4 %, mas preferentemente al menos el 5 %, mas preferentemente al menos el 6 %, mas preferentemente al menos el 7 %, mas preferentemente al menos el 8 %, mas preferentemente al menos el 9 %, mas preferentemente al menos el 10 %, mas preferentemente al menos el 11 %, mas preferentemente al menos el 12 %, mas preferentemente al menos el 13 %, mas preferentemente al menos el 14 %, mas preferentemente al menos el 15 %, mas preferentemente al menos el 16 %, mas preferentemente al menos el 17 %, mas preferentemente al menos el 18 %, mas preferentemente al menos el 19 %, mas preferentemente al menos el 20 %, con respecto a la de una parte, propagulo o progenie de control, o parte, propagulo o progenie de una planta de control.

En una realizacion adicional, la proporcion de 18:1 en el triacilglicerol esta alterada con respecto a la de una parte, propagulo o progenie de control, o parte, propagulo o progenie de una planta de control.

En una realización, la proporcion de 18:1 en el triacilglicerol esta alterada en al menos el 1 %, preferentemente al menos el 2 %, mas preferentemente al menos el 3 %, mas preferentemente al menos el 4 %, mas preferentemente al menos el 5 %, mas preferentemente al menos el 6 %, mas preferentemente al menos el 7 %, mas preferentemente al menos el 8 %, mas preferentemente al menos el 9 %, mas preferentemente al menos el 10 %, mas preferentemente al menos el 11 %, mas preferentemente al menos el 12 %, mas preferentemente al menos el 13 %, mas preferentemente al menos el 14 %, mas preferentemente al menos el 15 %, mas preferentemente al menos el 16 %, mas preferentemente al menos el 17 %, mas preferentemente al menos el 18 %, mas preferentemente al menos el 19 %, mas preferentemente al menos el 20 %, con respecto a la de una parte, propagulo o progenie de control, o parte, propagulo o progenie de una planta de control.

En una realización, la planta de control es una planta no transformada. En una realizacion adicional, la planta de control es una planta transformada para expresar la primera protema DGAT1. En una realizacion adicional, la planta de control es una planta transformada para expresar la segunda protema DGAT1.

Preferentemente, la parte, propagulo o progenie de control es de una planta de control como se ha descrito anteriormente.

En una realización, la parte es de un tejido vegetativo. En una realización, la parte es una hoja. En una realizacion adicional, la parte es una rafz. En una realizacion adicional, la parte es un tuberculo. En una realizacion adicional, la parte es un bulbo. En una realizacion adicional, la parte es un tallo. En una realizacion adicional, la parte es un tallo de una planta monocotiledonea. En una realizacion adicional, la parte es un stovum (tallo y limbo de la hoja).

En una realizacion adicional, la parte es de un tejido reproductivo. En una realizacion adicional, la parte es una semilla. En una realizacion preferida, la parte es de o incluye tejido del endospermo.

Alimento para animates

En un aspecto adicional, la invencion proporciona un pienso para animales que comprende al menos uno de un polinucleotido, celula, celula vegetal, parte, propagulo y progenie de planta de la invencion en donde la celula, celula vegetal, planta, parte, propagulo o progenie de planta produce mas TAG que una celula, celula vegetal, planta, parte, propagulo o progenie de planta de control.

Materia prima de biocombustible

En un aspecto adicional, la invencion proporciona una materia prima de biocombustible que comprende al menos uno de un polinucleotido, celula, celula vegetal, parte, propagulo y progenie de planta de la invencion, en donde la celula, celula vegetal, planta, parte, propagulo o progenie de planta produce mas TAG que una celula, celula vegetal, planta, parte, propagulo o progenie de planta de control.

Lfpido

En la invencion, el lfpido es triacilglicerol o triglicerido (TAG), los terminos se usan indistintamente.

Metodos para producir lfpido

En un aspecto adicional, la invencion proporciona un metodo para producir TAG, comprendiendo el metodo expresar una protema DGAT1 quimerica en una celula, celula vegetal o planta de la invencion, en donde el TAG se produce como resultado de la expresion de la protema DGAT1 quimerica.

La expresion de la protema DGAT1 quimerica de la invencion en la planta conduce a la produccion del lfpido en la planta.

En una realización, el metodo incluye la etapa de transformar una celula vegetal o planta con un polinucleotido como se ha descrito anteriormente que codifica la protema DGAT1 quimerica.

En una realizacion adicional, el metodo incluye la etapa de extraer el lfpido de la celula, celula vegetal o planta, o de una parte, propagulo o progenie de la planta.

En una realizacion adicional, el lfpido se procesa a al menos uno de:

a) un combustible,

b) un producto oleoqmmico,

c) un aceite nutricional,

d) un aceite cosmetico,

e) un ácido graso poliinsaturado (PUFA), y

f) una combinacion de cualquiera de a) a e).

En un aspecto adicional, la invencion proporciona un metodo para producir TAG, comprendiendo el metodo extraer TAG de al menos uno de una celula, celula vegetal, planta, parte, propagulo y progenie de planta de la invencion, en donde el TAG se produce como resultado de la expresion de la protema quimerica DGAT1 en la celula, celula vegetal, planta, parte, propagulo o progenie de planta.

En una realizacion adicional, el lfpido se procesa a al menos uno de:

a) un combustible,

b) un producto oleoqmmico,

c) un aceite nutricional,

d) un aceite cosmetico,

e) un ácido graso poliinsaturado (PUFA), y

f) una combinacion de cualquiera de a) a e).

Descripcion detallada de la invencion

En esta memoria descriptiva, donde se ha hecho referencia a memorias descriptivas de patente, otros documentos externos u otras fuentes de informacion, esto generalmente tiene el proposito de proporcionar un contexto para discutir las caractensticas de la invencion. A menos que se especifique otra cosa, la referencia a dichos documentos externos no debe interpretarse como una admision de que dichos documentos, o dichas fuentes de informacion, en cualquier jurisdiccion, son tecnicas anteriores, o forman parte del conocimiento general comun en la tecnica.

El termino "que comprende" como se usa en esta memoria descriptiva significa "que consiste al menos en parte en". Cuando se interpreta cada afirmacion en esta memoria descriptiva que incluye el termino "que comprende", tambien pueden estar presentes otras caractensticas distintas de las procedidas por el termino. Los terminos relacionados tales como "comprenden" y "comprende" se deben interpretar de la misma manera. En algunas realizaciones, el termino "que comprende" (y los terminos relacionados tales como "comprenden" y "comprende") se puede reemplazar por "que consiste en" (y los terminos relacionados "consisten" y "consiste").

Definiciones

El termino "DGAT1", como se usa en el presente documento, significa acil CoA: diacilglicerol aciltransferasa (EC 2.3.1.20)

DGAT1 es normalmente la principal enzima sintetizadora de TAG tanto en la semilla como en la hoja senescente (Kaup et al., 2002, Plant Physiol. 129 (4): 1616-26; para revisiones, vease Lung y Weselake 2006, Lipids. 41 (12): 1073-88; Cahoon et al., 2007, Current Opinion in Plant Biology. 10: 236-244; y Li et al., 2010, Lipids. 45: 145-157). DGAT1 contiene aproximadamente 500 aminoácidos y tiene 10 dominios transmembrana predichos, mientras que DGAT2 tiene solo 320 aminoácidos y se predice que contendra solo dos dominios transmembrana; tambien se predijo que ambas protemas teman sus extremos N y C ubicados en el citoplasma (Shockey et al., 2006, Plant Cell 18: 2294 2313). Tanto DGAT1 como DGAT2 tienen ortologos en animales y hongos y son protemas transmembrana ubicadas en el RE.

En la mayona de las plantas dicotiledoneas, DGAT1 y DGAT2 parecen ser genes de una sola copia, mientras que normalmente hay dos versiones de cada uno en las grammeas que probablemente surgieron durante la duplicacion del genoma de la hierba (Salse et al., 2008, Plant Cell, 20:11-24).

La expresion "primera protema DGAT1" o "segunda protema DGAT1", como se usa en el presente documento, significa normalmente una DGAT1 de origen natural o nativa. En algunos casos, la secuencia de DGAT1 puede haberse ensamblado a partir de secuencias en el genoma, pero puede no expresarse en plantas. En una realización, la primera o la segunda protema DGAT1, por lo tanto, puede no ser una DGAT1 que este aislada de la naturaleza. En una realización, la "primera protema DGAT 1" o la "segunda protema DGAT 1" tiene la secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NO:1 a 29 o una variante de la misma. Preferentemente, la variante tiene al menos un 70 % de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NO:1 a 29. En una realizacion adicional, la "primera protema DGAT1" o "segunda protema DGAT 1" tiene la secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NO:1 a 29.

En una realización, la "primera protema DGAT1" o la "segunda protema DGAT1" esta codificada por un polinucleotido que comprende la secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NO:30 a 58 o una variante de la misma. Preferentemente, la variante tiene al menos un 70 % de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NO:30 a 58. En una realizacion adicional, la "primera protema DGAT1" o la "segunda protema DGAT1" esta codificada por un polinucleotido que comprende la secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NO:30 a 58.

En una realización, las secuencias de DGAT 1 quimerica comprenden la secuencia de cualquier SEQ ID NO:59 a 94 o una variante de la misma. Preferentemente, la variante tiene al menos un 70 % de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NO:59 a 94. En una realizacion adicional, las secuencias de DGAT1 quimerica tienen la secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NO:59 a 94.

En una realizacion adicional, las secuencias de polipeptidos DGAT 1 quimericos tienen la secuencia de cualquier SEQ ID NO:59, 61,66, 68, 70-72, 74-76, 78, 79, 82, 84-86, 88-90, 92 y 93 o una variante de la misma. Preferentemente, la variante tiene al menos un 70 % de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NO: 59, 61,66, 68, 70-72, 74-76, 78, 79, 82, 84-86, 88-90, 92 y 93. En una realizacion adicional, las secuencias de DGAT1 quimerica tienen la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO:59, 61,66, 68, 70-72, 74-76, 78, 79, 82, 84-86, 88-90, 92 y 93.

Aunque no se prefiere, la DGAT1 quimerica de la invencion puede incluir modificaciones adicionales en al menos una de:

a) la parte W-terminal de una primera protema DGAT1, y

b) la parte C-terminal de una segunda protema DGAT1.

Preferentemente, la DGAT1 quimerica de la invencion incluye un sitio de union acil-CoA funcional.

Las expresiones cadena arriba y cadena abajo son de acuerdo con la convencion normal para indicar hacia el extremo N de un polipeptido, y hacia el extremo C de un polipeptido, respectivamente.

Sitio de union a acil-CoA

La posicion del sitio de union a acil-CoA en una serie de secuencias de DGAT 1 se muestra en la figura 3.

Motivo conservado ESPLSS

En una realizacion preferida, el sitio de union a acil-CoA comprende el motivo conservado ESPLSS

Formulas generales del sitio de union a acil-CoA

En una realizacion preferida, el sitio de union a acil-CoA en la DGAT1 quimerica tiene la formula:

XXXESPLSSXXIFXXXHA,

en donde X es cualquier aminoácido.

XXXESPLSSXXIFXXSHA,

en donde X es cualquier aminoácido.

X¹X²X³ESPLSSX⁴X⁵IFX⁶X⁷X⁸HA,

donde X ⁱ= R, K, V, T, A, S o G; X²= A, T, V, I, N, R, S o L; X³= R o K; X⁴= D o G; X⁵= A, T, N o L; X⁶= K o R; X⁷= Q o H; y X⁸= S o esta ausente.

X¹X²X³ESPLSSX⁴X⁵IFX⁶X⁷SHA,

donde X ⁱ= R, K, V, T, A, S o G; X²= A, T, V, I, N, R, S o L; X³= R o K; X⁴= D o G; X⁵= A, T, N o L; X⁶= K o R; y X⁷= Q o H.

Metodos para producir proteinas DGAT1 quimericas

Metodos para producir proteinas quimericas, o las secuencias de polinucleotidos que las codifican, son bien conocidos por los expertos en la materia. Una protema DGAT1 quimerica se puede producir convenientemente combinando, usando tecnicas biologicas moleculares estandar tales como digestion de restriccion y ligamiento, secuencias que codifican proteinas DGAT1, y expresando a continuacion la protema DGAT1 quimerica. Como alternativa, las secuencias de polinucleotidos que codifican las proteinas DGATi quimericas pueden sintetizarse convenientemente, y las proteinas quimericas expresarse a partir de las secuencias sintetizadas. Para preparar multiples proteinas DGAT1 quimericas, las secuencias codificantes pueden sintetizarse para incluir sitios de restriccion que no alteren la secuencia de aminoácidos de las proteinas expresadas. Estos sitios de restriccion pueden utilizarse para combinar secuencias para la produccion y expresion de las proteinas quimericas. Estos y otros metodos similares para producir proteinas quimericas son conocidos por los expertos en la materia.

Las primera y segunda secuencias de proteinas DGATi, y los polinucleotidos codificantes, usados para producir las proteinas DGATi quimericas de la invencion, pueden seleccionarse de las desveladas en el presente documento. Como alternativa, pueden identificarse otras secuencias de DGAT 1 mediante metodos bien conocidos por los expertos en la materia, incluyendo busquedas en bases de datos bioinformaticas, asf como metodos de clonacion ffsica. Las primera y segunda secuencias de proteinas DGAT 1 pueden ser de cualquier especie, incluyendo plantas, animales y microorganismos.

La frase "actividad DGATi aumentada" significa actividad espedfica aumentada con respecto a la de la primera y/o segunda protema DGATi.

Un experto en la materia sabna como ensayar la "actividad espedfica" de la DGATi quimerica. Esto se puede hacer normalmente aislando, enriqueciendo y cuantificando la DGATi recombinante y usando despues este material para determinar la velocidad de formacion de triacilgliceridos y/o la desaparicion de sustratos precursores (incluyendo diversas formas de acil-CoA y DAG) segun Xu et al., (2008), Plant Biotechnology Journal. 6: 799-8i8.

La frase "estabilidad aumentada" significa que la protema DGATi quimerica es mas estable, cuando se expresa en una celula, que la primera y/o la segunda DGATi. Esto puede causar un aumento de la acumulacion de DGATi quimerica activa cuando se expresa en celulas, con respecto a cuando la primera y/o segunda DGAT i se expresa en celulas.

Los expertos en la materia saben como probar la "estabilidad" de la DGATi quimerica. Esto implicana normalmente expresar la DGATi quimerica en una celula, o celulas, y expresar la primera o segunda DGATi en una celula separada, o celulas del mismo tipo. La acumulacion de la quimerica y la primera o segunda protema DGATi en las celulas respectivas se puede medir, por ejemplo, mediante inmunotransferencia y/o ELISA. Un mayor nivel de acumulacion de la DGATi quimerica con respecto a la primera o la segunda DGATi, en el mismo punto temporal, indica que la DGATi quimerica tiene estabilidad aumentada. Como alternativa, la estabilidad tambien puede determinarse mediante la formacion de una estructura cuaternaria que tambien puede determinarse mediante analisis por inmunotransferencia.

La frase "propiedades de oligomerizacion alteradas" significa que la manera en que, o la medida en que la DGATi quimerica forma oligomeros, esta alterada con respecto a la primera y/o segunda DGATi.

i6

Los expertos en la materia saben como ensayar las "propiedades de oligomerizacion" de la DGAT1 quimerica. Esto se puede hacer normalmente mediante analisis por inmunotransferencia o cromatograffa de exclusion por tamano.

La frase "propiedades de acumulacion de protemas celulares sustancialmente normales" significa que la DGAT1 quimerica de la invencion conserva sustancialmente la misma acumulacion de protemas cuando se expresa en una celula, al igual que la primera y/o la segunda DGAT1. Es decir, no hay menos acumulacion de DGAT1 quimerica que la acumulacion de primera y/o segunda DGAT1, cuando cualquiera de las dos se expresa por separado en el mismo tipo de celula.

Un experto en la materia sabna como ensayar las "propiedades de acumulacion de protemas celulares" de la DGAT1 quimerica. Esto implicana normalmente expresar la DGAT1 quimerica en una celula, o celulas, y expresar la primera o segunda DGAT1 en una celula separada, o celulas del mismo tipo. La acumulacion de la quimerica y la primera o segunda protema DGAT1 en las celulas respectivas se puede medir, por ejemplo, mediante ELISA o inmunotransferencia. Un nivel sustancialmente similar de acumulacion de la DGAT1 quimerica con respecto a la primera o la segunda DGAT1, en el mismo punto temporal, indica que la DGAT1 quimerica tiene "propiedades de acumulacion de protemas celulares sustancialmente normales" aumentadas.

La frase "propiedades de direccionamiento subcelular sustancialmente normales" significa que la DGAT1 quimerica de la invencion conserva sustancialmente el mismo direccionamiento subcelular cuando se expresa en una celula, al igual que la primera y/o la segunda DGAT1. Es decir, la DGAT1 quimerica se dirige a los mismos compartimentos subcelulares que la primera y/o segunda DGAT1, cuando cualquiera de las dos se expresa por separado en el mismo tipo de celula.

Un experto en la materia sabna como ensayar las "propiedades de direccionamiento subcelular" de la DGAT1 quimerica. Esto implicana normalmente expresar la DGAT1 quimerica en una celula, o celulas, y expresar la primera o segunda DGAT1 en una celula separada, o celulas del mismo tipo. A continuacion se puede evaluar el direccionamiento subcelular de la protema DGAT1 quimerica y la primera o segunda en las celulas respectivas, por ejemplo, mediante ultracentrifugacion para separar y aislar fracciones subcelulares individuales y despues determinar el nivel de DGAT1 en cada fraccion. El "direccionamiento subcelular" sustancialmente similar de la DGAT1 quimerica con respecto a la primera o la segunda DGAT 1, en el mismo punto temporal, indica que la DGAT 1 quimerica tiene "la protema celular sustancialmente normal tiene "propiedades de direccionamiento subcelular sustancialmente normales" aumentadas.

Lfpido

En una realización, el lfpido es un aceite. En una realizacion adicional, el aceite es triacilglicerol (TAG)

Production de lfpido

La celula, celulas, tejidos, plantas y partes de planta de la invencion producen mas lfpido que las celulas, tejidos, plantas y partes de plantas de control.

Los expertos en la materia conocen bien los metodos para medir la produccion de lfpido. Esto se puede hacer normalmente mediante analisis espectral de masas-cromatograffa de gases con ester metilico de ácidos grasos (FAMES GC-MS). Los metodos adecuados tambien se describen en la seccion de ejemplos de esta memoria descriptiva.

Especificidad de sustrato

En determinadas realizaciones, Los polipeptidos de la invencion tienen una especificidad de sustrato alterada con respecto a las protemas DGAT1 parentales. Las protemas DGAT1 de plantas son relativamente promiscuas en terminos de los sustratos de ácidos grasos y las especies de DAG que son capaces de utilizar para generar TAG. Como tales, se puede considerar que tienen una especificidad de sustrato relativamente baja. Sin embargo, esto puede modificarse de modo que determinados ácidos grasos se conviertan en un sustrato preferido respecto a otros. Esto conduce a un aumento en las proporciones de los ácidos grasos preferidos en el TAG y disminuciones en las proporciones de las especies de ácidos grasos no preferidas. La especificidad de sustrato puede determinarse por analisis cuantitativo in vitro de la produccion de TAG despues de la adicion de cantidades espedficas y conocidas de sustratos purificados a cantidades conocidas de DGAT recombinante, segun Xu et al., (2008), Plant Biotechnology Journal. 6: 799-818.

Perfil lipidico

En una realizacion adicional, la celula, celulas, tejidos, plantas y partes de planta de la invencion tienen un perfil lipfdico alterado con respecto a las celulas, tejidos, plantas y partes de planta de control.

Los expertos en la materia conocen bien los metodos para evaluar el perfil lipfdico. Esto puede implicar evaluar la

proporcion o el porcentaje de al menos una de las especies de ácidos grasos 16:0, 16:1, 18:0, 18:1c9 presentes en el

kpido. Esto se puede hacer normalmente mediante analisis de ester metflico de ácidos grasos (FAME) (Browse et al.,

1986, Anal. Biochem. 152, 141-145). Los metodos adecuados tambien se describen en la seccion de ejemplos de esta

memoria descriptiva.

Celulas

La DGAT1 quimerica de la invencion, o como se usa en los metodos de la invencion, puede expresarse en cualquier

tipo de celula.

En una realización, la celula es una celula procariota. En una realizacion adicional, la celula es una celula eucariot En una realización, la celula se selecciona de una celula bacteriana, una celula de levadura, una celula fungica, u celula de insecto, una celula de alga y una celula vegetal. En una realización, la celula es una celula bacteriana. En

una realizacion adicional, la celula es una celula de levadura. En una realización, la celula de levadura es una celula

de S. ceriviseae. En otra realización, la celula es una celula fungica. En otra realización, la celula es una celula de

insecto. En otra realización, la celula es una celula de alga. En una realizacion adicional, la celula es una celula vegetal.

En una realización, la celula es una celula no vegetal. En una realización, el no vegetal se selecciona de E. coli, P.

pastoris, S. ceriviseae, D. salina y C. reinhardtii. En una realizacion adicional, el no vegetal se selecciona de P. pastoris,

S. ceriviseae, D. Salina y C. reinhardtii.

En una realización, la celula es una celula microbiana. En otra realización, la celula microbiana es una celula de alg de la division de Chlorophyta (algas verdes), Rhodophyta (algas rojas), Phaeophyceae (algas pardas),

Bacillariophycaeae (diatomeas) o Dinoflagellata (dinoflageladas). En otra realización, la celula microbiana es una

celula de alga de las especies Chlamydomonas, Dunaliella, Botrycoccus, Chlorella, Crypthecodinium, Gracilaria,

Sargassum, Pleurochrysis, Porphyridium, Phaeodactylum, Haematococcus, Isochrysis, Scenedesmus, Monodus,

Cyclotella, Nitzschia o Parietochloris. En otra realización, la celula de alga es Chlamydomonas reinhardtii. En otra

realizacion mas, la celula es del genero Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus,

Trichosporon, Eipomyces, Pythium, Schizochytrium, Thraustochytrium o Ulkenia. En otra realizacion mas, la celula es

una bacteria del genero Rhodococcus, Escherichia o una cianobacteria. En otra realizacion mas, la celula es una celula

de levadura. En otra realizacion mas, la celula es una celula sintetica.

Plantas

La primera y/o segunda secuencias de DGAT1, a partir de las cuales se producen las secuencias de DGAT1 quimerica,

pueden ser secuencias de DGAT1 de origen natural. Preferentemente, la primera y/o segunda DGAT1 secuencias son

de plantas. En determinadas realizaciones, las celulas en las que se expresan las protemas DGAT1 quimericas son

de plantas. En otras realizaciones, las protemas DGAT1 quimericas se expresan en plantas.

Las celulas vegetales, de las que se derivan la primera y/o la segunda protemas DGAT1, las plantas de las que se

derivan las celulas vegetales y las plantas en las que se expresan las protemas DGAT1 quimericas pueden ser de

cualquier especie vegetal.

En una realización, la celula vegetal o planta, se deriva de una especie de planta gimnosperma.

En una realizacion adicional, la celula vegetal o planta, se deriva de una especie de planta angiosperma.

En una realizacion adicional, la celula vegetal o planta, se deriva de una especie de planta dicotiledonea.

En una realizacion adicional, la celula vegetal o planta, se deriva de una especie de planta monocotiledonea.

Otras plantas preferidas son especies de plantas forrajeras de un grupo que comprende, pero sin limitarse a, los

siguientes generos: Zea, Lolium, Hordium, Miscanthus, Saccharum, Festuca, Dactylis, Bromus, Thinopyrum, Trifolium,

Medicago, Pheleum, Phalaris, Holcus, Glicina, Lotus, Plantago y Cichorium.

Otras plantas preferidas son las plantas leguminosas. La planta leguminosa o parte de la misma puede abarcar

cualquier planta de la familia de plantas Leguminosae o Fabaceae. Por ejemplo, las plantas pueden seleccionarse de

leguminosas forrajeras que incluyen, alfalfa, trebol; leucaena; leguminosas de grano que incluyen, judfas, lentejas,

altramuces, guisantes, cacahuetes, soja; leguminosas en floracion, incluyendo lupino, leguminosas farmaceuticas o

industriales; y especies de leguminosas de barbecho o abono verde.

Un genero particularmente preferido es Trifolium. Las especies de Trifolium preferidas incluyen Trifolium repens;

Trifolium arvense; Trifolium affine; y Trifolium occidentale. Una especie de Trifolium particularmente preferida es

Trifolium repens.

Otro genera preferido es Medicago. Las especies preferidas de Medicago incluyen Medicago sativa y Medicago truncatula. Una especie de Medicago particularmente preferida es Medicago sativa, comunmente conocida como alfalfa.

Otro genera preferido es Glycine. Las especies de Glycine preferidas incluyen Glycine max y Glycine wightii (tambien conocida como Neonotonia wightii). Una especie de Glycine particularmente preferida es Glycine max, comunmente conocida como soja. Una especie de Glycine particularmente preferida es Glycine wightii, comunmente conocida como soja perenne.

Otro genero preferido es Vigna. Una especie de Vigna particularmente preferida es Vigna unguiculata comunmente conocida como caupt

Otro genero preferido es Mucana. Especies de Mucana preferidas incluyen Mucana pruniens. Una especie de Mucana particularmente preferida es Mucana pruniens comunmente conocida como frijol terciopelo.

Otro genero preferido es Arachis. Una especie de Arachis particularmente preferida es Arachis glabrata comunmente conocida como cacahuete perenne.

Otro genero preferido es Pisum. Una especie preferida de Pisum es Pisum sativum, comunmente conocida como guisante.

Otro genero preferido es Lotus. Las especies de Lotus preferidas incluyen Lotus corniculatus, Lotus pedunculatus, Lotus glabar, Lotus tenuis y Lotus uliginosus. Una especie de Lotus preferida es Lotus corniculatus, comunmente conocida como cuernecillo. Otra especie de Lotus preferida es Lotus glabar, comunmente conocida como cuernecillo de hoja estrecha. Otra especie preferida de Lotus es Lotus pedunculatus, comunmente conocida como cuernecillo grande. Otra especie preferida de Lotus es Lotus tenuis, comunmente conocida como cuernecillo delgado.

Otro genero preferido es Brassica. Una especie preferida de Brassica es Brassica oleracea, comunmente conocida como col rizada forrajera y col forrajeras. Un genero preferido de Brassica es Camelina. Una especie preferida de Camelina es Camelina sativa.

Otras especies preferidas son los cultivos de semillas oleaginosas que incluyen, pero sin limitacion, los siguientes generos: Brassica, Carthumus, Helianthus, Zea y Sesamum.

Un genero preferido de semillas oleaginosas es Brassica. Una especie preferida de semilla oleaginosa es Brassica napus.

Un genero preferido de semillas oleaginosas es Brassica. Una especie preferida de semilla oleaginosa es Brassica oleraceae.

Un genero preferido de semillas oleaginosas es Carthamus. Una especie de semilla oleaginosa preferida es Carthamus tinctorius.

Un genero preferido de semillas oleaginosas es Helianthus. Una especie preferida de semilla oleaginosa es Helianthus annuus.

Un genero preferido de semillas oleaginosas es Zea. Una especie de semilla oleaginosa preferida es Zea mays. Un genero preferido de semillas oleaginosas es Sesamum. Una especie preferida de semilla oleaginosa es Sesamum indicum.

Un genero preferido de semillas de ensilaje es Zea. Una especie de semilla de ensilaje preferida es Zea mays. Un genero productor de grano preferido es Hordeum. Una especie productora de grano preferida es Hordeum vulgare. Un genero de pastoreo preferido es Lolium. Una especie de pastoreo preferida es Lolium perenne.

Un genero de pastoreo preferido es Lolium. Una especie de pastoreo preferida es Lolium arundinaceum.

Un genero de pastoreo preferido es Trifolium. Una especie de pastoreo preferida es Trifolium repens.

Un genero de pastoreo preferido es Hordeum. Una especie de pastoreo preferida es Hordeum vulgare.

Las plantas preferidas tambien incluyen plantas forrajeras o de alimentacion animal. Dichas plantas incluyen pero no se limitan a los siguientes generos: Miscanthus, Saccharum, Panicum.

Un genera de biocombustible preferido es Miscanthus. Una especie de biocombustible preferida es Miscanthus giganteus.

Un genera de biocombustible preferido es Saccharum. Una especie de biocombustible preferida es Saccharum officinarum.

Un genero de biocombustible preferido es Panicum. Una especie de biocombustible preferida es Panicum virgatum.

Partes, propagulos o progenie de planta

Se pretende que el termino "planta" incluya una planta completa, cualquier parte de una planta, una semilla, un fruto, propagulos y progenie de una planta.

El termino "propagulo" significa cualquier parte de una planta que se puede usar en la reproduccion o propagacion, ya sea sexual o asexual, incluyendo semillas y esquejes.

Las plantas de la invencion pueden cultivarse y autofecundarse o cruzarse con una cepa vegetal diferente y la progenie resultante, que comprende los polinucleotidos o construcciones de la invencion, y/o que expresan las secuencias de DGAT1 quimericas de la invencion, tambien forman parte de la presente invencion.

Preferentemente, las plantas, partes, propagulos y progenie de plantas comprenden un polinucleotido o construccion de la invencion, y/o expresan una secuencia de DGAT1 quimerica de la invencion.

Polinucleotidos y fragmentos

El termino "polinucleotido o polinucleotidos", como se usa en el presente documento, significa un polfmero de desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos mono o bicatenario de cualquier longitud pero preferentemente al menos 15 nucleotidos, e incluye como ejemplos no limitantes, secuencias codificantes y no codificantes de un gen, complementos de secuencias sentido y antisentido, exones, intrones, ADN genomico, ADNc, pre-ARNm, ARNm, ARNr, ARNip, miARN, ARNt, ribozimas, polipeptidos recombinantes, secuencias de ADN o ARN de origen natural aisladas y purificadas, secuencias de ARN y ADN sinteticas, sondas de ácido nucleico, cebadores y fragmentos.

Un "fragmento" de una secuencia de polinucleotidos proporcionada en el presente documento es una subsecuencia de nucleotidos contiguos.

El termino "cebador" se refiere a un polinucleotido corto, que generalmente tiene un grupo 3'OH libre, que hibrida con un modelo y se usa para cebar la polimerizacion de un polinucleotido complementario a la diana.

El termino "sonda" se refiere a un polinucleotido corto que se usa para detectar una secuencia de polinucleotidos que es complementaria a la sonda, en un ensayo basado en hibridacion. La sonda puede consistir en un "fragmento" de un polinucleotido como se define en el presente documento.

Polipeptidos y fragmentos

El termino "polipeptido", como se usa en el presente documento, abarca cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, pero preferentemente al menos 5 aminoácidos, incluyendo protemas de longitud completa, en las que los residuos de aminoácidos estan unidos por enlaces peptfdicos covalentes. Los polipeptidos de la presente invencion, o usados en los metodos de la invencion, pueden ser productos naturales purificados, o pueden producirse parcial o totalmente usando tecnicas recombinantes o sinteticas.

Un "fragmento" de un polipeptido es una subsecuencia del polipeptido que preferentemente realiza una funcion y/o proporciona una estructura tridimensional del polipeptido. El termino puede referirse a un polipeptido, un agregado de un polipeptido tal como un dfmero u otro multimero, un polipeptido de fusion, un fragmento de polipeptido, una variante de polipeptido, o un derivado del mismo capaz de realizar la actividad enzimatica anterior.

El termino "aislado" cuando se aplica a las secuencias de polinucleotidos o de polipeptidos descritas en el presente documento se usa para referirse a secuencias que se retiran de su entorno celular natural. Una molecula aislada se puede obtener mediante cualquier metodo o combinacion de metodos que incluyen tecnicas bioqmmicas, recombinantes y sinteticas.

El termino "recombinante" se refiere a una secuencia de polinucleotidos que se retira de las secuencias que la rodean en su contexto natural y/o se recombina con secuencias que no estan presentes en su contexto natural.

Una secuencia de polipeptidos "recombinante" se produce mediante la traduccion de una secuencia de polinucleotidos "recombinante".

El termino "derivado de" con respecto a los polinucleotidos o polipeptidos de la invencion que se derivan de un genero o especie particular, significa que el polinucleotido o polipeptido tiene la misma secuencia que un polinucleotido o polipeptido encontrado de forma natural en ese genero o especie. El polinucleotido o polipeptido, derivado de un genero o especie particular, por lo tanto, puede producirse de forma sintetica o recombinante.

Variantes

Como se usa en el presente documento, el termino "variante" se refiere a secuencias de polinucleotidos o polipeptidos diferentes de las secuencias espedficamente identificadas, en donde uno o mas nucleotidos o residuos de aminoácidos se delecionan, sustituyen o anaden. Las variantes pueden ser variantes alelicas de origen natural o variantes de origen no natural. Las variantes pueden ser de la misma o de otras especies y pueden abarcar homologos, paralogos y ortologos. En determinadas realizaciones, las variantes de los polipeptidos y polipeptidos de la invencion poseen actividades biologicas que son iguales o similares a las de los polipeptidos o polipeptidos de la invencion. El termino "variante" con referencia a polipeptidos y polipeptidos abarca todas las formas de polipeptidos y polipeptidos como se definen en el presente documento.

Variantes de polinucleotidos

Las secuencias de polinucleotidos variantes exhiben preferentemente al menos el 50 %, mas preferentemente al menos el 51 %, mas preferentemente al menos el 52 %, mas preferentemente al menos el 53 %, mas preferentemente al menos el 54 %, mas preferentemente al menos el 55 %, mas preferentemente al menos el 56 %, mas preferentemente al menos el 57 %, mas preferentemente al menos el 58 %, mas preferentemente al menos el 59 %, mas preferentemente al menos el 60 %, mas preferentemente al menos el 61 %, mas preferentemente al menos el 62 %, mas preferentemente al menos el 63 %, mas preferentemente al menos el 64 %, mas preferentemente al menos el 65 %, mas preferentemente al menos el 66 %, mas preferentemente al menos el 67 %, mas preferentemente al menos el 68 %, mas preferentemente al menos el 69 %, mas preferentemente al menos el 70 %, mas preferentemente al menos el 71 %, mas preferentemente al menos el 72 %, mas preferentemente al menos el 73 %, mas preferentemente al menos el 74 %, mas preferentemente al menos el 75 %, mas preferentemente al menos el 76 %, mas preferentemente al menos el 77 %, mas preferentemente al menos el 78 %, mas preferentemente al menos el 79 %, mas preferentemente al menos el 80 %, mas preferentemente al menos el 81 %, mas preferentemente al menos el 82 %, mas preferentemente al menos el 83 %, mas preferentemente al menos el 84 %, mas preferentemente al menos el 85 %, mas preferentemente al menos el 86 %, mas preferentemente al menos el 87 %, mas preferentemente al menos el 88 %, mas preferentemente al menos el 89 %, mas preferentemente al menos el 90 %, mas preferentemente al menos el 91 %, mas preferentemente al menos el 92 %, mas preferentemente al menos el 93 %, mas preferentemente al menos el 94 %, mas preferentemente al menos el 95 %, mas preferentemente al menos el 96 %, mas preferentemente al menos el 97 %, mas preferentemente al menos el 98 %, y de la forma mas preferente al menos el 99 % de identidad con una secuencia de la presente invencion. La identidad se encuentra en una ventana de comparacion de al menos 20 posiciones de nucleotidos, preferentemente al menos 50 posiciones de nucleotidos, mas preferentemente al menos 100 posiciones de nucleotidos, y de la forma mas preferente en toda la longitud de un polinucleotido de la invencion.

La identidad de la secuencia de polinucleotidos puede ser determinada de la siguiente manera. La secuencia de polinucleotidos en cuestion se compara con una secuencia de polinucleotidos candidata usando BLASTN (del conjunto de programas BLAST, version 2.2.5 [noviembre de 2002]) en bl2seq (Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250), que esta disponible publicamente en el sitio web del NCBI en Internet en ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/. Se utilizan los parametros por defecto del bl2seq excepto porque debe desactivarse la filtracion de partes de baja complejidad.

La identidad de las secuencias de polinucleotidos puede ser examinada usando los siguientes parametros de lmeas de comando de unix: bl2seq -i nucleotideseq1 -j nucleotideseq2 -F F -p blastn

El parametro -F F desactiva el filtrado de las secciones de baja complejidad. El parametro -p selecciona el algoritmo apropiado para el par de secuencias. El programa bl2seq notifica la identidad de la secuencia tanto en forma del numero como del porcentaje de nucleotidos identicos en una lmea "Identidades = ".

La identidad de la secuencia de polinucleotidos tambien puede calcularse a lo largo de la longitud completa del solapamiento entre las secuencias de polinucleotidos candidata y en cuestion mediante el uso de programas de alineacion de secuencias globales (por ejemplo, Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). Una implementacion completa del algoritmo de alineacion global de Needleman-Wunsch se encuentra en el programa Needle del paquete EMBOSS (Rice, P. Longden, I. y Bleasby, A. EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Trends in Genetics, junio de 2000, vol 16, n° 6. pags. 276-277) que puede obtenerse de Internet en http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/. El servidor del European Bioinformatics Institute tambien proporciona el servicio para llevar a cabo alineaciones globales de EMBOSS-needle entre dos secuencias en lmea en http:// www.ebi.ac.uk/emboss/align/.

Como alternativa, puede usarse el programa GAP, que computa una alineacion global optima de dos secuencias sin penalizar los huecos terminales. El GAP se describe en la siguiente publicacion: Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235.

Un metodo preferido para calcular el % de identidad de la secuencia de polinucleotidos se basa en alinear las secuencias a comparar usando Clustal X (Jeanmougin et al., 1998, Trends Biochem. Sci. 23, 403-5.)

Las variantes de polinucleotidos de la presente invencion tambien abarcan aquellas que exhiben una similitud con una o mas de las secuencias identificadas espedficamente que es probable que preserven la equivalencia funcional de esas secuencias y que razonablemente no podna esperarse que se produjeran por una probabilidad aleatoria. Dicha similitud de la secuencia con respecto a los polinucleotidos puede ser determinada mediante el uso del programa disponible publicamente bl2seq del conjunto de programas BLAST (version 2.2.5 [noviembre de 2002]) del sitio web del NCBI en Internet en ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/.

La similitud de las secuencias de polinucleotidos puede ser examinada usando los siguientes parametros de lmeas de comando de unix: bl2seq -i nucleotideseql -j nucleotideseq2 -F F -p tblastx

El parametro -F F desactiva el filtrado de las secciones de baja complejidad. El parametro -p selecciona el algoritmo apropiado para el par de secuencias. Este programa encuentra regiones de similitud entre las secuencias, y para cada una de dichas regiones notifica un "valor de E" que es el numero de veces esperado que se podna esperar ver dicha coincidencia al azar en una base de datos con un tamano de referencia fijo que contiene secuencias aleatorias. El tamano de esta base de datos es establecido por defecto en el programa bl2seq. Para unos valores de E pequenos, mucho menores de uno, el valor de E es aproximadamente la probabilidad de que dicha coincidencia sea aleatoria.

Las variantes de las secuencias de polinucleotidos preferentemente muestran un valor de E menor de 1 x 10 -6 mas preferentemente menor de 1 x 10 -9, mas preferentemente menor de 1 x 10 -12, mas preferentemente menor de 1 x 10 -15, mas preferentemente menor de 1 x 10 -18, mas preferentemente menor de 1 x 10 -21, mas preferentemente menor de 1 x 10 -30, mas preferentemente menor de 1 x 10 -40, mas preferentemente menor de 1 x 10 -50, mas preferentemente menor de 1 x 10 -60, mas preferentemente menor de 1 x 10 -70, mas preferentemente menor de 1 x 10 -80, mas preferentemente menor de 1 x 10 -90 y de la forma mas preferente menor de 1 x 10-100 cuando se compara con una cualquiera de las secuencias identificadas espedficamente.

Como alternativa, las variantes de los polinucleotidos de la presente invencion, o usadas en los metodos de la invencion, hibridan con la secuencia de polinucleotidos especificada, o con complementos de la misma en unas condiciones rigurosas.

La expresion "hibridan en unas condiciones rigurosas", y los equivalentes gramaticales de la misma, se refieren a la capacidad de una molecula de polinucleotido de hibridar con una molecula de polinucleotido diana (tal como una molecula de polinucleotido diana inmovilizada en una transferencia de ADN o de ARN, tal como una transferencia Southern o Northern) en unas condiciones definidas de temperatura y de concentracion salina. La capacidad para hibridar en unas condiciones de hibridacion rigurosas puede ser determinada hibridando inicialmente en unas condiciones menos rigurosas y aumentando despues la rigurosidad hasta la rigurosidad deseada.

Con respecto a las moleculas de polinucleotidos mayores de aproximadamente 100 bases de longitud, las condiciones de hibridacion rigurosa tfpicas no son mayores de entre 25 y 30 °C (por ejemplo, 10 °C) por debajo de la temperatura de fusion (Tm) del duplex nativo (vease en general, Sambrook et al., Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, 2a Ed. Cold Spring Harbor Press; Ausubel et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing,). La Tm de las moleculas de polinucleotidos mayores de aproximadamente 100 bases puede calcularse mediante la formula Tm = 81,5 0,41 % (G C-log (Na+). (Sambrook et al., Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, 2a Ed. Cold Spring Harbor Press; Bolton y McCarthy, 1962, PNAS 84:1390). Las condiciones rigurosas tfpicas para un polinucleotido mayor de 100 bases de longitud senan unas condiciones de hibridacion tales como un prelavado con una solucion 6X de SSC, SDS al 0,2 %; hibridacion a 65 °C, SSC 6X, SDS al 0,2 % durante una noche; seguido de dos lavados de 30 minutos cada uno con SSC 1X, SDS al 0,1 % a 65 °C y dos lavados de 30 minutos cada uno con un SSC 0,2X, SDS al 0,1 % a 65 °C.

Con respecto a las moleculas de polinucleotidos que tienen una longitud menor de 100 bases, condiciones de hibridacion rigurosas ejemplares son entre 5 y 10 °C por debajo de la Tm. De media, la Tm de una molecula de polinucleotido con una longitud menor de 100 pb se reduce en aproximadamente (500/longitud del oligonucleotido) °C.

Con respecto a los mimeticos de ADN conocidos como ácidos peptidonucleicos (APN) (Nielsen et al., Science. 6 de diciembre de 1991; 254 (5037): 1497-500), los valores de la Tm son mayores que para los dbridos de ADN-ADN o de ADN-ARN, y pueden calcularse mediante el uso de la formula descrita en Giesen et al., Nucleic Acids Res. 1 de noviembre 1998;26(21):5004-6. Condiciones de hibridacion rigurosas ejemplares para un dbrido de ADN-APN que tiene una longitud menor de 100 bases estan entre 5 y 10 °C por debajo de la T m.

Las variantes de los polinucleotidos de la presente invencion, o usadas en los metodos de la invencion, tambien abarcan polinucleotidos que difieren de las secuencias de la invencion pero que, como consecuencia de la degeneracion del codigo genetico, codifican un polipeptido que tiene una actividad similar a un polipeptido codificado por un polinucleotido de la presente invencion. Una alteracion en la secuencia que no modifica la secuencia de aminoácidos del polipeptido es una "variacion silenciosa". Excepto para ATG (metionina) y TGG (triptofano), pueden cambiarse otros codones para el mismo aminoácido mediante tecnicas reconocidas en la tecnica, por ejemplo, para optimizar la expresion del codon en un organismo huesped en particular.

Tambien se incluyen en la invencion las alteraciones en las secuencias de polinucleotidos que dan como resultado sustituciones conservativas de uno o de varios aminoácidos de la secuencia de polipeptido codificada sin alterar significativamente su actividad biologica. El experto en la materia sera consciente de los metodos para la elaboracion de sustituciones de aminoácidos fenotipicamente silenciosas (vease, por ejemplo, Bowie et al., 1990, Science 247, 1306).

Las variantes de polinucleotidos, debido a las variaciones silenciosas y a las sustituciones conservativas en la secuencia del polipeptido codificado, pueden determinarse usando el programa disponible publicamente bl2seq del conjunto de programas BLAST (version 2.2.5 [noviembre de 2002]) del sitio web del NCBI en Internet en ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/ a traves del algoritmo tblastx, como se ha descrito anteriormente.

Variantes de polipeptidos

El termino "variante", en referencia a los polipeptidos, abarca los polipeptidos de origen natural y los producidos de forma recombinante y sintetica. Las secuencias de polipeptidos variantes exhiben preferentemente al menos el 50 %, mas preferentemente al menos el 51 %, mas preferentemente al menos el 52 %, mas preferentemente al menos el 53 %, mas preferentemente al menos el 54 %, mas preferentemente al menos el 55 %, mas preferentemente al menos el 56 %, mas preferentemente al menos el 57 %, mas preferentemente al menos el 58 %, mas preferentemente al menos el 59 %, mas preferentemente al menos el 60 %, mas preferentemente al menos el 61 %, mas preferentemente al menos el 62 %, mas preferentemente al menos el 63 %, mas preferentemente al menos el 64 %, mas preferentemente al menos el 65 %, mas preferentemente al menos el 66 %, mas preferentemente al menos el 67 %, mas preferentemente al menos el 68 %, mas preferentemente al menos el 69 %, mas preferentemente al menos el 70 %, mas preferentemente al menos el 71 %, mas preferentemente al menos el 72 %, mas preferentemente al menos el 73 %, mas preferentemente al menos el 74 %, mas preferentemente al menos el 75 %, mas preferentemente al menos el 76 %, mas preferentemente al menos el 77 %, mas preferentemente al menos el 78 %, mas preferentemente al menos el 79 %, mas preferentemente al menos el 80 %, mas preferentemente al menos el 81 %, mas preferentemente al menos el 82 %, mas preferentemente al menos el 83 %, mas preferentemente al menos el 84 %, mas preferentemente al menos el 85 %, mas preferentemente al menos el 86 %, mas preferentemente al menos el 87 %, mas preferentemente al menos el 88 %, mas preferentemente al menos el 89 %, mas preferentemente al menos el 90 %, mas preferentemente al menos el 91 %, mas preferentemente al menos el 92 %, mas preferentemente al menos el 93 %, mas preferentemente al menos el 94 %, mas preferentemente al menos el 95 %, mas preferentemente al menos el 96 %, mas preferentemente al menos el 97 %, mas preferentemente al menos el 98 %, y de la forma mas preferente al menos el 99 % de identidad con una secuencia de la presente invencion. La identidad se encuentra en una ventana de comparacion de al menos 20 posiciones de aminoácidos, preferentemente al menos aproximadamente 50 posiciones de aminoácidos, mas preferentemente al menos 100 posiciones de aminoácidos, y de la forma mas preferente en toda la longitud de un polipeptido de la invencion.

La identidad de la secuencia de polipeptidos puede ser determinada de la siguiente manera. La secuencia de polipeptidos en cuestion se compara con una secuencia de polipeptidos candidata usando BLASTN (del conjunto de programas BLAST, version 2.2.5 [noviembre de 2002]) en bl2seq, que esta disponible publicamente en el sitio web del NCBI en Internet en ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/. Se utilizan los parametros por defecto del bl2seq excepto porque debe desactivarse la filtracion de regiones de baja complejidad.

La identidad de la secuencia de polipeptidos tambien puede calcularse a lo largo de la longitud completa del solapamiento entre las secuencias de polinucleotidos candidata y en cuestion mediante el uso de programas de alineacion de secuencias globales. EMBOSS-needle (disponible en http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/) y GAP (Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235.) como se discutio anteriormente, son tambien programas de alineacion de secuencias globales adecuados para calcular la identidad de secuencia de polipeptidos.

Un metodo preferido para calcular el % de identidad de la secuencia de polipeptidos se basa en alinear las secuencias a comparar usando Clustal X (Jeanmougin et al., 1998, Trends Biochem. Sci. 23, 403-5.)

Las variantes de polipeptidos de la presente invencion, o usadas en los metodos de la invencion, tambien abarcan aquellas que exhiben una similitud con una o mas de las secuencias identificadas espedficamente que es probable que preserven la equivalencia funcional de esas secuencias y que razonablemente no podna esperarse que se produjeran por una probabilidad aleatoria. Dicha similitud de la secuencia con respecto a los polinucleotidos puede ser determinada mediante el uso del programa disponible publicamente bl2seq del conjunto de programas BLAST (version 2.2.5 [noviembre de 2002]) del sitio web del NCBI en Internet en ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/. La similitud de las secuencias de polipeptidos puede ser examinada usando los siguientes parametros de lmeas de comando de unix: bl2seq -i peptideseql -j peptideseq2 -F F -p blastp

Las variantes de las secuencias de polipeptidos preferentemente muestran un valor de E menor de 1 x 10 -6 mas preferentemente menor de 1 x 10 -9, mas preferentemente menor de 1 x 10 -12, mas preferentemente menor de 1 x 10 -15, mas preferentemente menor de 1 x 10 -18, mas preferentemente menor de 1 x 10 -21, mas preferentemente menor de 1 x 10 -30, mas preferentemente menor de 1 x 10 -40, mas preferentemente menor de 1 x 10 -50, mas preferentemente menor de 1 x 10 -60, mas preferentemente menor de 1 x 10 -70, mas preferentemente menor de 1 x 10 -80, mas preferentemente menor de 1 x 10 -90 y de la forma mas preferente 1x10-100 cuando se compara con una cualquiera de las secuencias identificadas espedficamente.

El parametro -F F desactiva el filtrado de las secciones de baja complejidad. El parametro -p selecciona el algoritmo apropiado para el par de secuencias. Este programa encuentra regiones de similitud entre las secuencias, y para cada una de dichas regiones notifica un "valor de E" que es el numero de veces esperado que se podna esperar ver dicha coincidencia al azar en una base de datos con un tamano de referencia fijo que contiene secuencias aleatorias. Para unos valores de E pequenos, mucho menores de uno, esta es aproximadamente la probabilidad de que dicha coincidencia sea aleatoria.

Tambien se incluyen en la invencion sustituciones conservativas de uno o de varios aminoácidos de una secuencia de polipeptido descrita sin alterar significativamente su actividad biologica. El experto en la materia sera consciente de los metodos para la elaboracion de sustituciones de aminoácidos fenotfpicamente silenciosas (vease, por ejemplo, Bowie et al., 1990, Science 247, 1306).

Construcciones, vectores y componentes de los mismos

El termino "construccion genetica" se refiere a una molecula de un polinucleotido, habitualmente un ADN bicatenario, que puede tener insertada otra molecula de polinucleotido (la molecula de polinucleotido de inserto) tal como, pero sin limitacion, una molecula de ADNc. Una construccion genetica puede contener los elementos necesarios que permiten la transcripcion de la molecula de polinucleotido de inserto, y, opcionalmente, la traduccion del transcrito a un polipeptido. La molecula de polinucleotido de inserto puede derivar de la celula huesped, o puede derivar de una celula o de un organismo diferente y/o puede ser un polinucleotido recombinante. Una vez en el interior de la celula huesped, la construccion genetica puede quedar integrada en el ADN cromosomico del huesped. La construccion genetica puede estar unida a un vector.

El termino "vector" se refiere a una molecula de un polinucleotido, habitualmente un ADN bicatenario, que se usa para transportar la construccion genetica al interior de una celula huesped. El vector puede ser capaz de replicacion en al menos un sistema huesped adicional, tal como E. coli.

El termino "construccion de expresion" se refiere a una construccion genetica que incluye los elementos necesarios que permiten la transcripcion de la molecula de polinucleotido de inserto, y, opcionalmente, la traduccion del transcrito a un polipeptido. Una construccion de expresion comprende normalmente, en una direccion de 5' a 3':

a) un promotor funcional en la celula huesped en la que se transformara la construccion,

b) el polinucleotido a expresar, y

a) un terminador funcional en la celula huesped en la que se transformara la construccion.

La expresion "region codificante" o "marco abierto de lectura" (ORF) se refiere a la hebra sentido de una secuencia de ADN genomico o de una secuencia de ADNc que es capaz de producir un producto de transcripcion y/o un polipeptido bajo el control de las secuencias reguladoras apropiadas. La secuencia codificante puede, en algunos casos, ser identificada por la presencia de un codon de inicio de la traduccion en 5' y un codon de terminacion de la traduccion en 3'. Cuando se inserta en una construccion genetica, una "secuencia codificante" es capaz de ser expresada cuando esta unida operativamente a secuencias promotoras y terminadoras.

"Unido de forma operativa" significa que la secuencia a expresar esta colocada bajo el control de elementos reguladores que incluyen promotores, elementos reguladores espedficos de tejidos, elementos reguladores temporales, potenciadores, represores y terminadores.

La expresion "region no codificante" se refiere a secuencias no traducidas que estan cadena arriba del sitio de inicio de la traduccion y cadena abajo del sitio de terminacion de la traduccion. Estas secuencias tambien se denominan respectivamente UTR en 5' y UTR en 3'. Estas regiones incluyen elementos requeridos para el inicio y la terminacion de la transcripcion, la estabilidad del ARNm y para la regulacion de la eficiencia de la traduccion.

Los terminadores son secuencias que terminan la transcripcion, y se encuentran en los extremos no traducidos en 3' de los genes cadena abajo de la secuencia traducida. Los terminadores son unos importantes determinantes de la estabilidad del ARNm y, en algunos casos, se ha descubierto que tienen funciones reguladoras espaciales.

El termino "promotor" se refiere a elementos reguladores en cis no transcritos cadena arriba de la region codificante que regulan la transcripcion de genes. Los promotores comprenden elementos iniciadores en cis que especifican el sitio de inicio de la transcripcion y cajas conservadas, tales como la caja TATA, y los motivos a los que se unen factores de transcripcion. Los intrones dentro de las secuencias codificantes tambien pueden regular la transcripcion e influir en el procesamiento postranscripcional (incluyendo corte y empalme, recubrimiento con caperuzas y la poliadenilacion).

Un promotor puede ser homologo con respecto al polinucleotido a expresar. Esto significa que el promotor y el polinucleotido se encuentran unidos de forma operativa en la naturaleza.

Como alternativa, el promotor puede ser heterologo con respecto al polinucleotido a expresar. Esto significa que el promotor y el polinucleotido no se encuentran unidos de forma operativa en la naturaleza.

En determinadas realizaciones, los polinucleotidos/polipeptidos DGAT1 quimericos de la invencion pueden expresarse ventajosamente bajo el control de secuencias promotoras seleccionadas como se describe a continuacion.

Promotores especfficos de tejido vegetativo

Un ejemplo de un promotor espedfico de tejido vegetativo se encuentra en el documento US 6.229.067; y el documento US 7.629.454; y el documento US 7.153.953; y el documento US 6.228.643.

Promotores especfficos de polen

Un ejemplo de un promotor espedfico de polen se encuentra en el documento US 7.141.424; y el documento US 5.545.546; y el documento US 5.412.085; y el documento US 5.086.169; y el documento US 7.667.097.

Promotores especfficos de semillas

Un ejemplo de un promotor espedfico de semillas se encuentra en el documento US 6.342.657; y el documento US 7.081.565; y el documento US 7.405.345; y el documento US 7.642.346; y el documento US 7.371.928. Un promotor espedfico de semillas preferido es el promotor napin de Brassica napus (Josefsson et al., 1987, J Biol Chem. 262(25): 12196-201; Ellerstrom et al., 1996, Plant Molecular Biology, Volumen 32, volumen 6, pag. 1019-1027).

Promotores especfficos de frutos

Un ejemplo de un promotor espedfico de frutos se encuentra en el documento US 5.536.653; y el documento US 6.127.179; y el documento US 5.608.150; y el documento US 4.943.674.

Promotores especfficos de tejido no fotosintetico

Los promotores preferidos de tejido no fotosintetico incluyen aquellos expresados preferentemente en tejidos/organos no fotosinteticos de la planta.

Los promotores preferidos de tejido no fotosintetico tambien pueden incluir promotores reprimidos por la luz.

Promotores reprimidos por la luz

Un ejemplo de un promotor reprimido por la luz se encuentra en el documento US 5.639.952 y en el documento US 5.656.496.

Promotores especificos de races

Un ejemplo de un promotor espedfico de rafces se encuentra en el documento US 5.837.848; y los documentos US 2004/0067506 y US 2001/0047525.

Promotores especificos de tuberculos

Un ejemplo de un promotor espedfico de tuberculos se encuentra en el documento US 6.184.443.

Promotores especificos de bulbos

Un ejemplo de un promotor espedfico de bulbos se encuentra en Smeets et al., (1997) Plant Physiol. 113: 765-771. Promotores preferidos de rizomas

Un ejemplo de un promotor preferido de rizomas se encuentra en Jang et al., (2006) Plant Physiol. 142: 1148-1159.

Promotores especificos de endospermo

Un ejemplo de un promotor espedfico de endospermo se encuentra en el documento US 7.745.697.

Promotores de bulbos

Un ejemplo de un promotor capaz de impulsar la expresion en un bulbo se encuentra en Schenk et al., (2001) Plant Molecular Biology, 47: 399-412.

Promotores preferidos de tejido fotosintetico

Los promotores preferidos de tejido fotosintetico incluyen aquellos que se expresan preferentemente en tejidos fotosinteticos de las plantas. Los tejidos fotosinteticos de la planta incluyen hojas, tallo, brotes y partes de la planta por encima del suelo. Los promotores preferidos del tejido fotosintetico incluyen promotores regulados por la luz.

Promotores regulados por la luz

Los expertos en la materia conocen numerosos promotores regulados por la luz e incluyen, por ejemplo, promotores de protemas de union a clorofila a/b (Cab) y promotores de subunidades pequenas de Rubisco (SSU). Un ejemplo de un promotor regulado por la luz se encuentra en el documento US 5.750.385. Regulado por la luz en este contexto significa inducible por la luz o inducido por la luz.

Un "transgen" es un polinucleotido que se toma de un organismo y se introduce en un organismo diferente por transformacion. El transgen puede derivarse de la misma especie o de una especie diferente a la especie del organismo en el que se introduce el transgen.

Celulas huesped

Las celulas huesped pueden derivarse de, por ejemplo, bacterias, hongos, levaduras, insectos, mairnferos, algas u organismos vegetales. Las celulas huesped tambien pueden ser celulas sinteticas. Las celulas huesped preferidas son celulas eucariotas. Una celula huesped particularmente preferida es una celula vegetal, particularmente una celula vegetal en un tejido vegetativo de una planta.

Una "planta transgenica" se refiere a una planta que contiene material genetico nuevo como resultado de la manipulacion o transformacion genetica. El material genetico nuevo puede derivarse de una planta de la misma especie que la planta transgenica resultante, o de una especie diferente.

Metodos para aislar o producir polinucleotidos

Las moleculas de polinucleotidos de la invencion pueden aislarse usando diversas tecnicas conocidas por los expertos en la materia. A modo de ejemplo, dichos polinucleotidos pueden aislarse a traves del uso de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) descrita en Mullis et al., Eds. 1994 The Polymerase Chain Reaction, Birkhauser. Los polinucleotidos de la invencion pueden amplificarse usando cebadores, como se definen en el presente documento, derivados de las secuencias de polinucleotidos de la invencion.

Metodos adicionales para aislar polinucleotidos de la invencion incluyen el uso de todos, o de partes de, los polinucleotidos que tienen la secuencia establecida en el presente documento como sondas de hibridacion. La tecnica de hibridacion de sondas de polinucleotidos marcadas con polinucleotidos inmovilizados sobre soportes solidos, tales como filtros de nitrocelulosa o membranas de nailon, puede usarse para el cribado genomico o bibliotecas de ADNc. Condiciones de hibridacion y lavado ejemplares son: hibridacion durante 20 horas a 65 °C en SSC 5,0 X, dodecil sulfato sodico al 0,5 %, solucion de Denhardt 1 X; lavado (tres lavados de veinte minutos cada uno a 55 °C) en SSC 1,0 X, dodecil sulfato sodico al 1 % (p/v), y opcionalmente un lavado (durante veinte minutos) en SSC 0,5 X, dodecil sulfato sodico al 1 % (p/v), a 60 °C. Puede llevarse a cabo un lavado adicional opcional (durante veinte minutos) en unas condiciones de SSC 0,1 X, dodecil sulfato sodico al 1 % (p/v), a 60 °C.

Los fragmentos de polinucleotidos de la invencion pueden producirse mediante tecnicas bien conocidas en la tecnica tales como digestion con endonucleasas de restriccion, smtesis con oligonucleotidos y amplificacion por PCR.

Puede usarse una secuencia parcial de polinucleotidos, en los metodos bien conocidos en la tecnica para identificar la correspondiente secuencia de polinucleotidos de longitud completa. Dichos metodos incluyen metodos basados en la PCR, 5'RACE (Frohman MA, 1993, Methods Enzymol. 218: 340-56) y metodos basados en hibridacion, metodos basados en ordenador/base de datos. Ademas, a modo de ejemplo, una PCR inversa permite la adquisicion de secuencias desconocidas, flanqueantes de las secuencias de polinucleotidos divulgadas en el presente documento, partiendo de cebadores basados en una region conocida (Triglia et al., 1998, Nucleic Acids Res 16, 8186). El metodo usa varias enzimas de restriccion para generar un fragmento adecuado en la region conocida de un gen. Despues, el fragmento se circulariza mediante un ligamiento intramolecular y se usa como molde para PCR. Se disenan cebadores divergentes a partir de la region conocida. Con el fin de ensamblar ffsicamente clones de longitud completa, pueden usarse las metodologfas habituales de biologfa molecular (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2a Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987).

Puede ser beneficioso, cuando se produce una planta transgenica de una especie en particular, transformar dicha planta con una secuencia o secuencias derivadas de esa especie. El beneficio puede ser aliviar la preocupacion publica relativa a la transformacion entre especies cruzadas en la generacion de organismos transgenicos. Por estas razones entre otras, es deseable ser capaces de identificar y aislar los ortologos de un gen en particular en varias especies vegetales diferentes.

Las variantes (incluyendo los ortologos) pueden identificarse mediante los metodos descritos.

Metodos para identificar variantes

Metodos fisicos

Variantes de polipeptidos pueden identificarse usando metodos basados en PCR (Mullis et al., Eds. 1994 The Polymerase Chain Reaction, Birkhauser). Normalmente, la secuencia de polinucleotidos de un cebador, util para amplificar variantes de moleculas de polinucleotidos de la invencion mediante PCR, puede basarse en una secuencia que codifica una region conservada de la secuencia de aminoácidos correspondiente.

Metodos alternativos de cribado de bibliotecas, bien conocidos por los expertos en la materia, pueden emplearse (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2a Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987). Cuando se identifican variantes de la secuencia de la sonda, la hibridacion y/o la rigurosidad del lavado se reduciran normalmente con respecto a cuando se buscan coincidencias de secuencia exactas.

Las variantes de polipeptidos tambien pueden identificarse por metodos ffsicos, por ejemplo, cribando bibliotecas de expresion usando anticuerpos generados contra los polipeptidos de la invencion (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2a Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987) o identificando polipeptidos de fuentes naturales con ayuda de dichos anticuerpos.

Metodos informatizados

Las secuencias variantes de la invencion, incluyendo variantes de polinucleotidos y de polipeptidos, tambien pueden identificarse mediante metodos informatizados bien conocidos por los expertos en la materia, usando algoritmos de alineacion de secuencias y herramientas de busqueda de similitudes entre secuencias de dominio publico para buscar en bases de datos de secuencias de dominio publico (las bases de datos de dominio publico incluyen Genbank, EMBL, Swiss-Prot, PIR y otras). Veanse, por ejemplo, Nucleic Acids Res. 29: 1-10 y 11-16, 2001 para ejemplos de recursos en lmea. Las busquedas de similitudes recuperan y alinean las secuencias diana para compararlas con una secuencia a analizar (es decir, una secuencia de consulta). Los algoritmos de comparacion de secuencias usan matrices de puntuacion para asignar una puntuacion global a cada una de las alineaciones.

Un ejemplo de familia de programas util para identificar variantes en las bases de datos de secuencias es el conjunto de programas BLAST (version 2.2.5 [noviembre de 2002]) que incluye BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN y tBLASTX, que estan disponibles publicamente en (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/) o en el National Center for Biotechnology Information (NCBI), National Library of Medicine, Edificio 38A, Sala 8N805, Bethesda, MD 20894 Estados Unidos. El servidor del NCBI tambien proporciona el servicio para usar los programas para cribar varias bases de datos de secuencias disponibles publicamente. BLASTN compara una secuencia de nucleotidos de consulta frente a bases de datos de secuencias de nucleotidos.

BLASTP compara una secuencia de aminoácidos de consulta frente una base de datos de secuencias de protemas. BLASTX compara una secuencia de nucleotidos de consulta traducida en todos los marcos de lectura frente una base de datos de secuencias de protemas. tBLASTN compara una secuencia de protemas de consulta frente a bases de datos de secuencias de nucleotidos traducidas dinamicamente en todos los marcos de lectura. tBLASTX compara las traducciones de seis marcos de una secuencia de nucleotidos de consulta frente a las traducciones de seis marcos de una base de datos de secuencias de nucleotidos. Los programas BLAST pueden usarse con los parametros por defecto, o pueden alterarse los parametros segun se requiera para refinar el cribado.

El uso de la familia de algoritmos BLAST, incluyendo BLASTN, BLASTP y BLASTX, se describe en la publicacion de Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997.

Los "resultados positivos" de una o mas secuencias de bases de datos por parte de una secuencia consultada producida por BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN, tBLASTX, o un algoritmo similar, alinean e identifican partes de secuencias similares. Los resultados positivos estan ordenados segun el grado de similitud y la longitud de solapamiento de la secuencia. Los resultados positivos para una secuencia de una base de datos representan generalmente un solapamiento unicamente sobre una fraccion de la longitud de secuencia de la secuencia consultada.

Los algoritmos BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN y tBLASTX tambien producen unos valores "esperados" para las alineaciones. El valor esperado (E) indica el numero de resultados positivos que se podna "esperar" ver por azar cuando se busca en una base de datos del mismo tamano que contiene secuencias contiguas aleatorias. El valor esperado se usa como un umbral de significacion para la determinacion de si el resultado positivo con respecto a una base de datos indica una verdadera similitud. Por ejemplo, se interpreta que un valor de E de 0,1 asignado a un resultado positivo para un polinucleotido significa que en una base de datos del tamano de la base de datos cribada, podna esperarse observar 0,1 coincidencias en la parte alineada de la secuencia con una puntuacion similar simplemente por azar. Para las secuencias que tienen un valor de E de 0,01 o menos en las partes alineadas y emparejadas, la probabilidad de encontrar una coincidencia al azar en esa base de datos es del 1 % o menos usando el algoritmo BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN o tBLASTX.

Pueden llevarse a cabo multiples alineaciones de secuencias de un grupo de secuencias relacionadas con CLUSTALW (Thompson, J.D., Higgins, D.G. y Gibson, T.J. (1994) CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22:4673-4680, http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/clustalW/Top.html) o T-COFFEE (Cedric Notredame, Desmond G. Higgins, Jaap Heringa, T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment, J. Mol. Biol. (2000) 302: 205-217)) o PILEUP, que usa alineaciones progresivas por parejas. (Feng y Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 25, 351).

Hay disponibles aplicaciones informaticas de reconocimiento de patrones para encontrar motivos o secuencias distintivas. Por ejemplo, MEME (Multiple Em for Motif Elicitation) encuentra motivos y secuencias distintivas en un conjunto de secuencias, y MAST (Motif Alignment and Search Tool) usa estos motivos para identificar motivos similares o iguales en secuencias de consulta. Los resultados de MAST se proporcionan en forma de una serie de alineaciones con los datos estadfsticos apropiados y un resumen visual de los motivos encontrados. MEME y MAST se desarrollaron en la University of California, San Diego.

PROSITE (Bairoch y Bucher, 1994, Nucleic Acids Res. 22, 3583; Hofmann et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27, 215) es un metodo para identificar las funciones de protemas no caracterizadas traducidas de secuencias genomicas o de ADNc. La base de datos PROSITE (www.expasy.org/prosite) contiene patrones y perfiles biologicamente significativos y esta disenada para que pueda usarse con las herramientas computacionales apropiadas para asignar una nueva secuencia a una familia de protemas conocida o para determinar que dominio o dominios conocidos estan presentes en la secuencia (Falquet et al., 2002, Nucleic Acids Res. 30, 235). Prosearch es una herramienta que puede buscar en las bases de datos SWISS-PROT y EMBL con una secuencia patron o distintiva dada.

Metodos para aislar polipeptidos

Los polipeptidos de la invencion, o usados en los metodos de la invencion, que incluyen polipeptidos variantes, pueden prepararse usando metodos de smtesis de peptidos bien conocidos en la tecnica, tales como smtesis de peptidos directa usando tecnicas en fase solida (por ejemplo, Stewart et al., 1969, en Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco California, o smtesis automatizada, por ejemplo, usando un sintetizador de peptidos Applied Biosystems 431A (Foster City, California). Tambien se pueden producir formas mutadas de los polipeptidos durante dichas smtesis.

Los polipeptidos y polipeptidos variantes de la invencion, o usados en los metodos de la invencion, tambien pueden purificarse a partir de fuentes naturales usando diversas tecnicas que son bien conocidas en la tecnica (por ejemplo, Deutscher, 1990, Ed, Methods in Enzymology, Vol. 182, Guide to Protein Purification).

Como alternativa, los polipeptidos y polipeptidos variantes de la invencion, o usados en los metodos de la invencion, pueden expresarse de forma recombinante en celulas huesped adecuadas y separarse de las celulas como se discute a continuacion.

Metodos para producir construcciones y vectores

Las construcciones geneticas descritas en el presente documento comprenden una o mas secuencias de polinucleotidos de la invencion y/o polinucleotidos que codifican polipeptidos de la invencion, y pueden ser utiles para transformar, por ejemplo, bacterias, hongos, insectos, mairnferos u organismos vegetales. Se pretende que las construcciones geneticas descritas en el presente documento incluyan construcciones de expresion como se definen en el presente documento.

Los metodos para producir y usar construcciones geneticas y vectores son bien conocidos en la tecnica y se describen de forma general en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987).

Metodos para producir celulas huesped que comprenden polinucleotidos, construcciones o vectores

La invencion proporciona una celula huesped que comprende una construccion genetica o un vector de la invencion.

Las celulas huesped que comprenden construcciones geneticas, tales como construcciones de expresion, de la invencion, son utiles en metodos bien conocidos en la tecnica (por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987) para la produccion recombinante de polipeptidos de la invencion. Dichos metodos pueden implicar el cultivo de celulas huesped en un medio apropiado en unas condiciones adecuadas o conducentes a la expresion de un polipeptido de la invencion. El polipeptido recombinante expresado, que opcionalmente puede ser secretado en el cultivo, puede separarse despues del medio, de las celulas huesped o del medio de cultivo mediante metodos bien conocidos en la tecnica (por ejemplo, Deutscher, Ed, 1990, Methods in Enzymology, vol. 182, Guide to Protein Purification).

Metodos para producir celulas vegetales y plantas que comprenden construcciones y vectores

La invencion proporciona ademas celulas vegetales que comprenden una construccion genetica descrita en el presente documento, y celulas vegetales modificadas para alterar la expresion de un polinucleotido o de un polipeptido de la invencion o usado en los metodos de la invencion. Las plantas que comprenden dichas celulas tambien forman un aspecto de la invencion.

Los metodos para la transformacion de celulas vegetales, de plantas y de partes de las mismas con polinucleotidos se describen en Draper et al., 1988, Plant Genetic Transformation and Gene Expression. A Laboratory Manual Blackwell Sci. Pub. Oxford, p. 365; Potrykus y Spangenburg, 1995, Gene Transfer to Plants. Springer-Verlag, Berlin.; y en Gelvin et al., 1993, Plant Molecular Biol. Manual. Kluwer Acad. Pub. Dordrecht. Una revision sobre plantas transgenicas, incluyendo tecnicas de transformacion, se proporciona en Galun y Breiman, 1997, Transgenic Plants. Imperial College Press, Londres.

Metodos para la manipulacion genetica de plantas

Se encuentran disponibles varias estrategias de transformacion de plantas (por ejemplo, Birch, 1997, Ann Rev Plant Phys Plant Mol Biol, 48, 297, Hellens RP, et al., (2000) Plant Mol Biol 42: 819-32, Hellens R et al., Plant Meth 1: 13). Por ejemplo, se pueden disenar estrategias para aumentar la expresion de un polinucleotido/polipeptido en una celula vegetal, organo y/o en una fase de desarrollo particular donde/cuando se expresa normalmente o para expresar ectopicamente un polinucleotido/polipeptido en una celula, tejido, organo y/o en una fase de desarrollo particular que/cuando no se expresa normalmente. El polinucleotido/polipeptido expresado puede derivarse de la especie de planta que se va a transformar o puede derivar de una especie de planta diferente.

Las estrategias de transformacion pueden disenarse para reducir la expresion de un polinucleotido/polipeptido en una celula vegetal, tejido, organo o en una fase de desarrollo particular que/cuando se expresa normalmente. Dichas estrategias se conocen como estrategias de silenciamiento de genes.

Las construcciones geneticas para la expresion de genes en plantas transgenicas incluyen normalmente promotores para dirigir la expresion de uno o mas polinucleotidos clonados, terminadores y secuencias de marcadores seleccionables para detectar la presencia de la construccion genetica en la planta transformada.

Los promotores adecuados para uso en las construcciones descritas en el presente documento son funcionales en una celula, tejido u organo de una planta monocotiledonea o dicotiledonea e incluyen promotores espedficos de celulas, tejidos y organos, promotores espedficos del ciclo celular, promotores temporales, promotores inducibles, promotores constitutivos que son activos en la mayona de los tejidos vegetales, y promotores recombinantes. La eleccion del promotor dependera de la expresion temporal y espacial del polinucleotido clonado, segun se desee. Los promotores pueden ser aquellos normalmente asociados con un transgen de interes, o promotores que se derivan de genes de otras plantas, virus y bacterias y hongos patogenos para las plantas. Los expertos en la materia seran, sin excesiva experimentacion, capaces de seleccionar promotores que sean adecuados para uso en la modificacion y modulacion de rasgos de plantas usando construcciones geneticas que comprenden las secuencias de polinucleotidos de la invencion. Los ejemplos de promotores de plantas constitutivos incluyen el promotor 35S de CaMV, el promotor de la nopalina sintasa y el promotor de la octopina sintasa, y el promotor Ubi 1 del mafz. Los promotores de plantas que son activos en tejidos espedficos responden a senales internas de desarrollo o estres abiotico o biotico externo que se describen en la bibliograffa cientffica. Promotores ejemplares se describen, por ejemplo, en los documentos WO 02/00894 y WO2011/053169.

Los terminadores ejemplares que se usan comunmente en la construccion genetica de transformacion de plantas incluyen, por ejemplo, el terminador 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), los terminadores de nopalina sintasa u octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens, el terminador del gen de la zema de Zea mays, el terminador del gen de ADP-glucosa pirofosforilasa de Oryza sativa y el terminador PI-II de Solanum tuberosum.

Los marcadores seleccionables usados comunmente en la transformacion de plantas incluyen el gen de la neomicina fofotransferasa II (NPT II) que confiere resistencia a kanamicina, el gen aadA, que confiere resistencia a espectinomicina y a estreptomicina, la fosfinotricina acetil transferasa (gen bar) para resistencia a Ignite (AgrEvo) y Basta (Hoechstric), y el gen de la higromicina fosfotransferasa (hpt) para resistencia a higromicina.

El uso de construcciones geneticas que comprenden genes indicadores (secuencias codificantes que expresan una actividad extrana al huesped, habitualmente una actividad enzimatica y/o una senal visible (por ejemplo, luciferasa, GUS, GFP) que puede usarse para el analisis de la expresion del promotor en plantas y tejidos de las plantas tambien se contemplan. La bibliograffa sobre genes indicadores se revisa en Herrera-Estrella et al., 1993, Nature 303, 209, y Schrott, 1995, en: Gene Transfer to Plants (Potrykus, T., Spangenberg. Eds) Springer Verlag. Berlin, pag. 325-336.

Las siguientes son publicaciones representativas que describen protocolos de transformacion genetica que pueden usarse para transformar geneticamente las siguientes especies de plantas: arroz (Alam et al., 1999, Plant Cell Rep.

18, 572); manzana (Yao et al., 1995, Plant Cell Reports 14, 407-412); mafz (patentes de Estados Unidos N° de serie 5.177.010 y 5.981.840); trigo (Ortiz et al., 1996, Plant Cell Rep. 15, 1996, 877); tomate (patente de Estados Unidos N° de serie 5.159.135); patata (Kumar et al., 1996 Plant J. 9,: 821); yuca (Li et al., 1996 Nat. Biotechnology 14, 736); lechuga (Michelmore et al., 1987, Plant Cell Rep. 6, 439); tabaco (Horsch et al., 1985, Science 227, 1229); algodon (patentes de Estados Unidos N° de serie 5.846.797 y 5.004.863); grammeas (patentes de Estados Unidos N° 5.187.073 y 6.020.539); menta (Niu et al., 1998, Plant Cell Rep. 17, 165); plantas cftricas (Pena et al., 1995, Plant Sci.104, 183); alcaravea (Krens et al., 1997, Plant Cell Rep, 17, 39); platano (patente de Estados Unidos N° de serie 5.792.935); soja (patentes de Estados Unidos N° 5.416.011; 5.569.834; 5.824.877; 5.563.04455 y 5.968.830); pina (patente de Estados Unidos N° de serie 5.952.543); alamo (patente de Estados Unidos N° 4.795.855); monocotiledoneas en general (patentes de Estados Unidos N° 5.591.616 y 6.037.522); Brassica (patentes de Estados Unidos N° 5.188.958; 5.463.174 y 5.750.871); cereales (patente de Estados Unidos N° 6.074.877); pera (Matsuda et al., 2005, Plant Cell Rep. 24(1):45-51); Prunus (Ramesh et al., 2006 Plant Cell Rep. 25 (8): 821-8; Song y Sink 2005 Plant Cell Rep. 2006; 25(2):117-23; Gonzalez Padilla et al., 2003 Plant Cell Rep.22(1):38-45); fresa (Oosumi et al., 2006 Planta. 223 (6): 1219-30; Folta et al., 2006 Planta, 14 de abril; PMID: 16614818), rosa (Li et al., 2003), Rubus (Graham et al., 1995 Methods Mol Biol. 1995; 44: 129-33), tomate (Dan et al., 2006, Plant Cell Reports V25:432-441), manzana (Yao et al., 1995, Plant Cell Rep. 14, 407-412), colza (Brassica napus L.).(Cardoza y Stewart, 2006 Methods Mol Biol. 343:257-66), cartamo (Orlikowska et al, 1995, Plant Cell Tissue and Organ Culture 40:85-91), raigras (Altpeter et al, 2004 Developments in Plant Breeding 11(7):255-250), arroz (Christou et al, 1991 Nature Biotech. 9:957-962), mafz (Wang et al., 2009 en: Handbook of Maize pag. 609-639) y Actinidia eriantha (Wang et al., 2006, Plant Cell Rep.

25,5: 425-31). La invencion tambien contempla la transformacion de otras especies. Metodos y protocolos adecuados estan disponibles en la bibliograffa cienfffica.

Breve descripcion de las figuras

La figura 1 muestra la secuencia de ácido nucleico y la traduccion de tres marcos de la region transcrita de DGAT1 de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:128). Las secuencias codificantes de exones se muestran en negrita, subrayadas, bloques grises.

La figura 2 muestra la secuencia de ácido nucleico y la traduccion de tres marcos de la region transcrita de DGAT 1 corta de Zea mays (SEQ ID NO:129). Esta secuencia genomica tiene F469 delecionado y Q67 anadido en comparacion con las secuencias de ADNc (EU039830) y peptido (ABV91586) usadas realmente en esta patente. Las secuencias codificantes de exones se muestran en negrita, subrayadas, bloques grises.

La figura 3 muestra la secuencia pepffdica de la region citoplasmica W-terminal de varias DGAT1 de plantas que incluyen versiones tanto largas como cortas de las grammeas, asf como ejemplos de especies dicotiledoneas. El recuadro de la izquierda representa el sitio de union a acil-CoA (Nykiforuk et al., 2002, Biochimica et Biophysica Acta 1580:95-109). El recuadro de la derecha representa la primera region transmembrana (McFie et al., 2010, JBC., 285: 37377-37387). La flecha de la izquierda representa el ffmite entre el exon 1 y el exon 2. La flecha de la derecha representa el lfmite entre el exon 2 y el exon 3. Las secuencias sonAtDGAT1 (SEQ ID NO:130), BjDGAT1 (SEQ ID NO:131), BnDGAT 1-AF (SEQ ID NO:132), BjDGAT 1 (SEQ ID NO:133), TmajusDGAT1 (SEQ ID NO:134), EpDGAT 1 (SEQ ID NO:135), VgDGAT1 (SEQ ID NO:136), NtDGAT 1 (SEQ ID NO:137), PfDGAT 1 (SEQ ID NO:138), Zml (SEQ ID NO:139), SbDGAT 1 (SEQ ID NO:140), OsL (SEQ ID NO:141), OsS (SEQ ID NO:142), SbDGAT 1 (SEQ ID NO:143), ZmS (SEQ ID NO:144), PpDGAT 1 (SEQ ID NO:145), SmDGAT 1 (SEQ ID NO:146), EaDGAT 1 (SEQ ID NO:147), VvDGAT 1 (SEQ ID NO:148), GmDGAT 1 (SEQ ID NO:149), GmDGAT 1 (SEQ ID NO:150), LjDGAT 1 (SEQ ID NO:151), MtDGAT 1 (SEQ ID NO:152), JcDGAT 1 (SEQ ID NO:153), VfDGAT 1 (SEQ ID NO:154), RcDGAT 1 (SEQ ID NO:155), PtDGAT 1 (SEQ ID NO:156), Pt DGAT1 (SEQ ID NO:157).

La figura 4 muestra las estructuras de enlace lineal de los residuos de aminoácidos lisina (K) y arginina (R).

Ejemplos

Ejemplo 1: seleccion de secuencia DGAT1 de planta y prediccion del sitio de corte y empalme

La mayoffa de las secuencias de ácido nucleico y secuencias pepffdicas para las DGAT tipo 1 de planta se pueden encontrar por numero de acceso en bibliotecas de dominio publico (tabla 1). Para crear alineaciones iniciales se uso ClustalW (Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res., 22, 4673-4680); estas se editaron manualmente y se usaron para crear los modelos para buscar las secuencias DGAT, usando el paquete HMMER2 (HMMER 2.3.2 (octubre de 2003) Copyright© 1992-2003 HHMI/Washington University School of Medicine, disponible en Internet en http://hmmer.org). El emparejamiento inicial de las secuencias de protemas contra el ADN genomico con la prediccion de corte y empalme se realizo con el paquete GeneWise (Birney et al., 2004, Genome Res. 14: 988-995). Algunas de las secuencias recuperadas paredan tener errores; en particular, los sitios de corte y empalme predichos incorrectamente danan lugar a deleciones internas que probablemente danan como resultado protemas no funcionales. Si bien las DGAT de tipo 1 de dicotiledoneas y monocotiledoneas tienen 16 exones, existen algunas diferencias en la posicion del corte y empalme. El exon 8 en el gen DGAT 1 de dicotiledonea corresponde a los exones 8 y 9 en el gen DGAT1 de monocotiledonea, mientras que el exon 14 en el gen de monocotiledonea corresponde a los exones 13 y 14 en el gen de dicotiledonea. Se descubrio que el metodo mas preciso para determinar la probable secuencia codificante genuina a partir de datos genomicos fue usar Vector NTI Advance (Tm ) 11.0 (© 2008 Invitrogen Corporation) para traducir el genoma en los tres marcos de lectura directos y alinearlos con DGAT1 funcionales demostradas de especies dicotiledoneas o monocotiledoneas, segun corresponda (por ejemplo, ADNc de A. thaliana NM_127503, protema NP_179535 y ADNc de Z. mays EU039830, protema ABV91586). La secuencia genomica y las posiciones correspondientes de exon/intron para Arabidopsis thaliana que codifica NP_179535 y Zea mays que codifica ABV91586 que se pueden usar como modelo para determinar otras regiones de codificacion DGAT de plantas se muestran en las figuras 1 y 2, respectivamente. Se muestra un ejemplo del uso de este modelo para la determinacion de DGAT1 de Z. mays, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:39.

Tabla 1

Ejemplo 2: Produccion de protemas DGAT1 quimericas para expresion en celulas

Las construcciones de ácido nucleico que codifican las secuencias de aminoácidos, SEQ ID NO:30, 34, 39, 41, 42 y 44 (tabla 1) fueron optimizadas para la expresion en Saccharomyces cerevisiae por GeneArt AG (Alemania). Estas se disenaron para tener un sitio XhoI interno dentro del exon 1 que codifica la region de union a acil-Co W-terminal conservada (identificada por Weselake 2006) sin alterar la secuencia de aminoácidos leucina-serina-serina (LSS). La figura 3 muestra la alineacion de varias secuencias de DGAT1 de plantas. El recuadro de la izquierda muestra la posicion del sitio de union a acil-CoA.

Se diseno un sitio de EcoRI cadena arriba de la secuencia codificante en 5', mientras que un sitio Xbal se coloco cadena abajo del codon de terminacion en 3'. Los sitios de XhoI interno y EcoRI y Xbal flanqueantes se usaron para generar quimeras entre cada uno de los clones de DGAT1 originales; esencialmente esto fusiono la reputada region citoplasmica N-terminal (basada en Weselake et al 2006 y McFie et al, 2010) de una DGAT1 con la region luminal del RE C-terminal de una DGAT1 diferente. En algunas combinaciones, esto dio como resultado un cambio de un aminoácido en la region citoplasmica remanente cadena abajo del sitio de XhoI disenado. La supuesta region de union a acil-Co, DGAT1 de A. thaliana, DGAT1 de T.majus, DGAT1 de Z.mays-L y DGAT1 de O. sativa-L tienen una secuencia de aminoácidos identica cadena abajo del sitio XhoI (LSSDAiFKQs HA). Mientras que en DGAT1 de Z.mays-S y DGAT1 de O. sativa-S, el residuo de lisina (K) se reemplaza por un residuo de arginina (R) (LSSDAIFRQSHA). Dado que la posicion de este residuo esta ubicada 3' en el sitio de Xho I codificado por LLS, las quimeras derivadas de un original que contiene la lisina y un original que contiene el residuo de arginina daran como resultado efectivamente una sustitucion de este residuo. Esto se considero una interrupcion minima, ya que tanto la lisina como la arginina son aminoácidos grandes, hidrofilos, cargados positivamente, que contienen un grupo de amina o guanidinio libre, respectivamente, al final de una cadena lateral alifatica (figura 4). La lista completa de construcciones de intercambio de dominios de la region W-terminal/region C-terminal se encuentra en la tabla 2, con las SEQ ID NO:59-94 correspondientes.

Tabla 2

Las secuencias fueron sintetizadas por GENEART AG (Alemania) o GeneScript (EE. UU.). Las secuencias se optimizaron para la expresion en Saccharomyces cerevisiae y se flanquearon con sitios de restriccion apropiados incorporados apropiados para facilitar la clonacion en el vector pYES2.1 (Invitrogen).

Ejemplo 3: Expresion de secuencias DGAT1 quimericas en celulas

Expresion de construcciones en S. cerevisiae

Las construcciones de DGAT1 originales y las construcciones de DGAT1 quimericas se colocaron en el vector de expresion de levadura inducible por galactosa pYES2.1/V5-His TOPO® (Invitrogen). Esto dio como resultado la adicion de un epftopo V5 C-terminal en el marco y una marca de histidina 6x. El nombre de las construcciones quimericas y el numero de sus secuencias peptfdicas correspondientes se muestran en la tabla 2.

El mutante cuadruple de Saccharomyces cerevisiae (H1246) en el que se han alterado los cuatro genes de biosmtesis de lfpidos neutros (Sandager et al., 2002, The Journal of Biological Chemistry, 277: 6478-6482) se transformo segun Elble (1992, BioTechniques 13, 18-20) y se selecciono por la capacidad de crecer en ausencia de uracilo. De forma rutinaria, las celulas de levadura se cultivaron aerobicamente durante una noche en un medio sintetico con un 0,67 % de YNB, sin uracilo (SC-U) y que contema un 2 % de glucosa. Se usaron celulas de cultivo durante la noche para inocular 200 ml de medio de induccion (SC-U que contema un 2 % de galactosa y un 1 % de rafinosa) a una DO⁶⁰⁰inicial de 0,4. Se permitio que las celulas crecieran mas a 30 °C, con agitacion a 200 rpm hasta la fase estacionaria tardfa, normalmente 48 h. Las celulas se recogieron mediante centrifugacion a 1500 x g durante 5 minutos, a continuacion los sedimentos celulares se lavaron con agua destilada y se usaron inmediatamente para el analisis posterior o se mantuvieron a -80 °C hasta que se requirieron. Los sedimentos celulares para la extraccion de lfpidos neutros se liofilizaron durante 48 horas y se almacenaron en un congelador a -20 °C hasta que se requirieron.

Analisis lipfdico de S. cerevisiae

Aproximadamente 10 mg de material celular de levadura liofilizado se pesaron con precision y despues se rompieron usando perlas de vidrio mediante agitacion en vortice durante 1 minuto. Este lisado se extrajo en HCl metanolico caliente para el analisis de ester metflico de ácido graso (FAME) (Browse et al., 1986, Anal. Biochem. 152, 141-145).

Para el analisis del perfil de FA, se colocaron aproximadamente 50 mg de levadura liofilizada en un tubo con tapon de rosca de 13 mm, y se añadió un volumen igual de perlas de vidrio antes de agitar en vortice a alta velocidad en 3 rafagas de 1 minuto. Despues de la adicion de 50 |jg de patron interno TAG 19:0, se anadieron 2,4 ml de NaCl 0,17 M en MeOH y la mezcla se agito en vortice durante 15 segundos, seguido de la adicion a continuacion de 4,8 ml de heptano y se mezclaron todos los contenidos.

La solucion se incubo a continuacion en un bano de agua a 80 °C durante 2 h sin agitacion. Despues de la incubacion, la solucion se enfrio a temperatura ambiente. Despues del enfriamiento, la fase superior (fase lipfdica) se transfirio a un nuevo tubo con tapon de rosca y se evaporo a sequedad bajo una corriente de nitrogeno gaseoso. El residuo seco se disolvio a continuacion en 1 ml de heptano y se mezclo bien para la separacion SPE de TAG usando una columna de sflice Strata Si-1 (Phenomenwx, 8B-S012-EAK).

Despues de preacondicionar con metanol y equilibrar la columna de sflice con heptanos, se hizo pasar el extracto de TAG de 1 ml (incluidos 50 jg de patron interno TAG 17:0 a traves de la columna previamente equilibrada, seguido de 1,2 ml de heptano y despues 2 ml de cloroformo:heptano 1:9 v/v/) y se recogio el eluato. El eluato total recogido se evaporo a sequedad bajo la corriente de N gaseoso y el residuo se uso para la extraccion de FAME.

FAME de TAG extrafdo

Al residuo de TAG anterior, se le anadieron de 10 j l de patron interno 15:0 FA (4 mg/ml disueltos en heptano) y 1 ml de reactivo de HCl metanolico (1 N) que contema un 5 % de 2,2-dimeetoxipropano (como eliminador de agua).

A continuacion se lavo el tubo con N gaseoso, despues se sello inmediatamente con un tapon revestido de teflon y se calento a 80 °C en un bano de agua durante 1 h. Despues del enfriamiento, se anadieron 0,6 ml de heptano y 1,0 ml de NaCl al 0,9 % (p/v), la mezcla se agito en vortice y despues se centrifugo a 500 rpm durante 1 minuto.

A partir de la capa superior de heptano, se recogieron 100 |jl y se transfirieron a un inserto de vidrio de fondo plano colocado en un vial para el analisis por GC/MS de FAMES.

Extraction de protefnas y digestion con tripsina

Los sedimentos celulares de levadura se lavaron con tampon de lisis (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, glicerol al 5 %, PMSF 1 mM), despues se resuspendieron en 500 j l de tampon de lisis, se anadieron perlas de vidrio y las celulas se rompieron agitando en vortice 2x a velocidad media durante 30 segundos. Los residuos celulares se sedimentaron por centrifugacion a 1000 x g durante 5 minutos, el sobrenadante se transfirio a tubos nuevos y las membranas celulares totales se sedimentaron mediante ultracentrifugacion a 100.000 x g durante 1 h. Las protemas de membrana se resuspendieron en tampon de lisis con o sin detergente (dodecil maltosido al 1 %) y se cuantificaron en un fluorometro Qubit usando el kit de cuantificacion Qubit IT.

Se añadió tripsina para dar una concentracion final de 25 jg/m l a 50 j l de extracto de protema y la mezcla se incubo a 30 °C durante 30 minutos. La reaccion se termino mediante la adicion de un inhibidor de tripsina de Glycine max (Sigma-Aldrich n° de catalogo T6414) a una concentracion final de 0,4 jg / jl . Despues de la adicion del inhibidor de tripsina, se anadieron 4x de colorante de carga de SDS y 10x de agente reductor (Invitrogen), y la protema se incubo a 70 °C durante 10 minutos antes de SDS-PAGE seguido de inmunotransferencia. La transferencia se ensayo con un anticuerpo Anti V5-HRP (n° de catalogo R96125, Invitrogen) a una dilucion de 1:2500, o con un anticuerpo anti Kar2 (y-115) producido en conejo (SC-33630, Santa Cruz Biotechnology) a una dilucion de 1:200. Se uso anti Kar2 para detectar la protema de levadura Kar2, una protema localizada luminalmente en el RE (Rose et al., 1989, Cell 57,1211 1221) que sirve como control para demostrar la presencia de microsomas intactos.

Ejemplo 4: Expresion de DGAT1 quimerica en Brassica napus

La misma estrategia, como se describe en el ejemplo 2, se uso para generar diversas construcciones de DGAT1 quimericas para la expresion en las semillas de Brassica napus. Esto incluyo las DGAT1 originales de T. majus DGAT1, Z. mays-L DGAT1 y Z. mays-S DGAT1 (aminoácido SEQ ID NO: 34, 39 y 44 respectivamente, tabla 1) optimizadas para la expresion en Brassica napus por GeneArt AG. La construccion de T. majus se diseno para contener una mutacion puntual unica S¹⁹⁷A (Xu et al., 2008, Plant Biotechnology Journal, 6: 799-818). Todas las construcciones se disenaron para tener un Kozak optimizado, el intron UBQ10 de Arabidopsis thaliana y un codon de terminacion tetranucleotfdico segun Scott et al., (2010, Plant Biotechnology Journal, 8: 912-917) como se indica en la tabla 3 a continuacion.

Tabla 3

El mismo patron de digestion usado para generar las quimeras para expresion en S. cerevisiae (ejemplo 2) se uso en las construcciones optimizadas para B. napus para generar las quimeras Tm-ZmS; Tm-Zml; ZmS-Tm (S170A); Zml-T m (S189A); dando como resultado las secuencias de peptidos enumeradas en la tabla 4 (quimeras de DGAT 1, Region 1, para expresion en Brassica napus).

Tabla 4

Las DGAT originales y sus quimeras se transfirieron al vector binario compatible con Gateway®, pMD107 (cortesfa del Dr. Mark Smith, NRC Saskatoon, SK, Canada, S7N 0W9) que los coloco bajo el control del promotor napin espedfico de semillas (Ellerstrom et al., 1996, Plant Molecular Biology, Volumen 32, volumen 6, pag. 1019-1027).

Transformation de plantas

B. napus (cv. DH12075) se transformo mediante Agrobacterium tumefaciens (GV3101) usando el metodo de cultivo de cotiledon (adaptado del de Maloney et al., 1989, Plant Cell Rep. 8, 238-242). Las lmeas de control conteman un vector vacm y, cuando se identificaron, las lmeas hermanas nulas se usaron posteriormente como controles verdaderos.

Se produjeron aproximadamente 200 Imeas To transformadas y sus correspondientes semillas autofecundadas Ti se analizaron para determinar el contenido de aceite mediante GC. Se seleccionaron aproximadamente 50 lmeas transgenicas individuales (incluidas las lmeas de control) para la proxima generacion (10 plantas/lmea) basandose en su contenido de aceite o peso de semilla (8 lmeas).

Se cultivaron aproximadamente un total de aproximadamente plantas Ti y se cribaron por PCR para el numero de copias y la identificacion de lmeas hermanas nulas. Las semillas T²se analizaron por triplicado para determinar el contenido de aceite por RMN.

Ejemplo 5: Expresion de DGAT1 quimerica en Camelina sativa

La estrategia anterior tambien se puede usar para generar diversas construcciones de DGAT1 quimericas para expresion en las semillas de Camelina sativa y otras plantas.

Las secuencias con modificaciones fueron sintetizadas por GENEART AG (Alemania) o GeneScript (EE. UU.). Las secuencias se optimizaron para la expresion en especies de Brassica e incluyeron un intron (SEQ ID NO:105) de Arabidopsis thaliana DGAT1 - intron 3. Cada secuencia estaba flanqueada con sitios de recombinacion attL apropiados para permitir la clonacion de vectores adaptados a Gateway®.

Tabla 5

DGAT1 original DGAT1 original Modificacion de Mod C- Informacion Tipo de SEQ ID W-terminal C-terminal residuos terminal adicional secuencia NO: T.majus T. majus S197A ^V5-marca

_His+ intron NUCLEICA 106 T.majus T. majus S197A ^V5-marca

_HisORF solo NUCLEICA 107 T.majus T. majus S197A ^V5-marca

_HisPEPTfDICA 108 Z. mays-L Z. mays-L Ninguna ^V5-marca

_His+ intron NUCLEICA 109 Z. mays-L Z. mays-L Ninguna ^V5-marca

_HisORF solo NUCLEICA 110 Z. mays-L Z. mays-L Ninguna ^V5-marca

_HisPEPTfDICA 111 T.majus Z. mays-L Ninguna ^V5-marca

_His+ intron NUCLEICA 112 T.majus Z. mays-L Ninguna ^V5-marca

_HisORF solo NUCLEICA 113 T.majus Z. mays-L Ninguna ^V5-marca

_HisPEPTfDICA 114 Z. mays-L T. majus S189A ^V5-marca

_His+ intron NUCLEICA 115 Z. mays-L T. majus S189A ^V5-marca

_isORF solo NUCLE_HICA 116 Z. mays-L T. majus S189A ^V5-marca

_HisPEPTfDICA 117 Z. mays-S Z. mays-S Ninguna ^V5-marca

_His+ intron NUCLEICA 118 Z. mays-S Z. mays-S Ninguna ^V5-marcaORF solo NUCLEICA 119_His

Z. mays-S Z. mays-S Ninguna ^V5-marca

_HisPEPTfDICA 120 Z. mays-S T. majus S170A ^V5-marca

_His+ intron NUCLEICA 121 Z. mays-S T. majus S170A ^V5-marcaORF solo NUCLEICA 122_His

Z. mays-S T. majus S170A ^V5-marca

_HisPEPTfDICA 123 DGAT1 original DGAT1 original Modificacion de Mod C- Informacion Tipo de SEQ ID N-terminal C-terminal residuos terminal adicional secuencia NO:

T.majus Z. mays-S Ninguna ^V5-marca

_His+ intron NUCLEICA 124

T.majus Z. mays-S Ninguna ^V5-marca

_HisORF solo NUCLEICA 125

T.majus Z. mays-S Ninguna ^V5-marca

_HisPEPTfDICA 126

Las DGAT originales y sus formas modificadas se transfirieron al vector binario adaptado por Gateway, pRShl, compatible con Gateway® (Winichayakul et al., 2009, Biotechnol. Appl. Biochem. 53, 111-122) modificado por reemplazo del promotor CaMV35S reemplazado con el promotor Napin de Brassica napus (SEQ ID NO:127).

Transformacion de Camelina sativa

Se transformo C. sativa (cf. Calena) mediante Agrobacterium tumefaciens (GV3101) usando el metodo de inmersion floral (adaptado del metodo de Clough y Bent, 1998, Plant J. 16 (6): 735-745). Esencialmente, las semillas se sembraron en mezcla para enmacetado, en macetas de 10 cm en un ambiente controlado, aproximadamente 6 semanas despues de la siembra, las flores se sumergieron durante 5-14 minutos a vado (70-80 pulgadas de Hg) en un cultivo durante una noche de celulas de Agrobacterium GV3101 apropiadas resuspendidas en un tampon de inmersion floral. Despues de la transformacion al vado, las plantas se mantuvieron durante 24 h en condiciones de poca luz cubriendo parcialmente con una lamina de plastico negro. Las transformaciones al vado se pueden repetir tres veces a intervalos de aproximadamente 10-12 dfas, correspondientes a la duracion de la floracion. Las plantas se cultivaron en una mezcla para enmacetado en un ambiente controlado (16 horas de duracion del dfa, 21-24 °C, 65-70 % de humedad relativa).

Las semillas T¹producidas pueden recogerse y rastrearse en busca de transformantes mediante la germinacion y el crecimiento de las plantulas a 22 °C con luz continua en una placa de seleccion de medio MS de media concentracion (pH 5,6) que contema un 1 % (p/v) de sacarosa, 300 mg/l de timentina y 25 mg/l de DL-fosfinotricina para seleccionar para resistencia a los herbicidas. Las poblaciones de semillas autofecundadas T²tambien pueden analizarse mediante inmunotransferencia para detectar la presencia del epftopo V5.

Las semillas autofecundadas pueden analizarse para determinar el contenido de aceite por GC. Se pueden seleccionar aproximadamente 50 lmeas transgenicas individuales (incluidas las lmeas de control) para la proxima generacion (10 plantas/lmea) basandose en su contenido de aceite o peso de semilla. Las plantas T²se pueden cultivar y analizar por PCR para determinar el numero de copias y la identificacion de lmeas hermanas nulas. Las semillas de T²se pueden analizar por triplicado para el contenido de aceite por RMN o GC/MS.

Resultados

El intercambio de la region N-terminal de DGAT1 de la planta aumenta la produccion de lipidos en Saccharomyces cerevisiae

La region citoplasmica N-terminal se puede intercambiar entre diferentes DGAT1 de plantas para aumentar el rendimiento de lfpidos. Las tablas 5-11 muestran los rendimientos de lfpidos de diversas DGAT1 quimericas en las que la region citoplasmica N-terminal se derivo de una DGAT 1 de planta mientras que el resto de la protema se derivo de otra DGAT1 de planta. Los rendimientos de lfpidos se presentan como gramos de lfpidos producidos por litro (lo que, por lo tanto, compensa cualquier diferencia en la tasa de crecimiento) o se han normalizado como un porcentaje del rendimiento de lfpidos de la DGAT1 original no modificada correspondiente.

En la tabla 5 se muestra una comparacion de las DGAT1 originales y las DGAT1 quimericas preparadas usando un original donante para la region N-terminal y un original donante diferente para la region N-terminal. Los rendimientos de lfpidos a las 32 h se normalizaron frente al original que produce mas lfmpidos (Z. mays-L) y se presentan en orden ascendente.

En la tabla 6 se muestra una comparacion de DGAT1 originales de T. majus y DGAT1 quimericas preparadas usando T. majus como original donante para la region N-terminal o usando T. majus como original donante para la region C-terminal. Los rendimientos de lfpidos a las 32 h se normalizaron frente al rendimiento de lfpidos de la DGAT1 original de la region C-terminal.

En la tabla 7 se muestra una comparacion de DGAT1 originales de O. Sativa-L y DGAT1 quimericas preparadas usando O. Sativa como original donante para la region N-terminal o usando O. Sativa-L como original donante para la region C-terminal. Los rendimientos de lfpidos a las 32 h se normalizaron frente al rendimiento de lfpidos de la DGAT1 original de la region C-terminal. ND = No disponible.

En la tabla 8 se muestra una comparacion de DGAT1 originales de Z. mays-L y DGAT1 quimericas preparadas usando Z. mays-L como original donante para la region W-terminal o usando Z. mays-L como original donante para la region C-terminal. Los rendimientos de Kpidos a las 32 h se normalizaron frente al rendimiento de lfpidos de la DGAT 1 original de las regiones 2-4. ND = No disponible.

En la tabla 9 se muestra una comparacion de DGAT1 originales de O. sativa-S y DGAT1 quimericas preparadas usando O. sativa-S como original donante para la region W-terminal o usando O. sativa-S como original donante para la region C-terminal. Los rendimientos de lfpidos a las 32 h se normalizaron frente al rendimiento de lfpidos de la DGAT1 original de la region C-terminal. ND = No disponible.

En la tabla 10 se muestra una comparacion de DGAT1 originales de Z. mays-S y DGAT1 quimericas preparadas usando Z. mays-S como original donante para la region W-terminal o usando Z. mays-S como original donante para la region C-terminal. Los rendimientos de lfpidos a las 32 h se normalizaron frente al rendimiento de lfpidos de la DGAT1 original de la region C-terminal. ND = No disponible.

En la tabla 11 se muestra una comparacion de DGAT1 originales de A. thaliana y DGAT1 quimericas preparadas usando A. thaliana como original donante para la region W-terminal o usando A. thaliana como original donante para la region C-terminal. Los rendimientos de lfpidos a las 32 h se normalizaron frente al rendimiento de lfpidos de la DGAT1 original de la region C-terminal. ND = No disponible.

Tabla 5

O. sativa-S
105.96 Tabla 6

Tabla 7

Tabla 8

Tabla 9

Tabla 10

Tabla 11

El intercambio de la region N-terminal de las DGAT1 de planta altera la especificidad del sustrato

La capacidad para cambiar la especificidad del sustrato de las DGAT1 de la planta mediante el intercambio de las regiones N-terminales se muestra en la tabla 12 que demuestra que el perfil lipfdico del TAG extrafdo de las celulas de Saccharomyces cerevisiae que sobreexpresan las DGAT1 de la planta se determina predominantemente por el cual el donante de la region N-terminal. En los ejemplos dados, esto se ve espedficamente como un nivel relativamente alto de 16:0 y 18:0, pero un nivel bajo de 18:1c9 en el TAG extrafdo de celulas que expresan DGAT1 en las que la region N-terminal se derivo de Arabidopsis thaliana. En contraste, el TAG de las celulas que expresan DGAT1 en las que la region N-terminal se derivo de O. sativa-L tiene niveles relativamente bajos de 16:0 y 18:0, pero niveles altos de 18:1c9. Mientras que el TAG de las celulas que expresan DGAT1 en las que las regiones N-terminales se derivaron de T. majus tiene niveles intermedios de 16:0, 18:0 y 18:1c9.

Tabla 12

El intercambio de la region N-terminal de DGAT1 de la planta aumenta la produccion de llpidos en Brassica napus

La region N-terminal puede intercambiarse entre diferentes DGAT1 de la planta para elevar el contenido de aceite en las semillas de Brassica napus. Las tablas 13-14 muestran los contenidos de aceite de las semillas de diversas plantas transgenicas que conteman DGAT1 quimericas en las que la region N-terminal se derivo de una DGAT1 de planta mientras que el resto de la protema (la region C-terminal) se derivo de otra DGAT1 de planta. En la tabla 13, los contenidos de aceite de las semillas se presentan como % de materia seca (MS) y como porcentaje normalizado del contenido de aceite de las semillas de las originales de DGAT1 no modificadas correspondientes.

Tabla 13

En la tabla 14, los contenidos de aceite de las semillas se presentan basandose en % de MS y como porcentaje normalizado del contenido de aceite de las semillas de la hermana nula segregante correspondiente.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una celula, celula vegetal o planta que comprende un polinucleotido que codifica una protema DGAT1 quimerica que comprende:

a) en su extremo N-terminal, una parte N-terminal de una primera protema DGAT1 vegetal, y

en donde la union entre la parte N-terminal de la primera protema DGAT1 y la parte C-terminal de la segunda protema DGAT1 esta cadena arriba del primer dominio transmembrana en la segunda protema DGAT1 vegetal, y en donde la celula, la celula vegetal o la planta producen mas triacilglicerido (TAG) que una celula, celula vegetal o planta de control.

2. La celula, celula vegetal o planta de la reivindicacion 1, en donde la union entre la parte N-terminal de la primera protema DGAT1 y la parte C-terminal de la segunda protema DGAT1 esta en el sitio de union a acil-CoA de la primera y la segunda protemas DGAT1.

3. La celula, celula vegetal o planta de la reivindicacion 1, en donde la union entre la parte N-terminal de la primera protema DGAT1 y la parte C-terminal de la segunda protema DGAT1 esta en una posicion correspondiente en el sitio de union a acil-CoA de la primera y la segunda protemas DGAT 1.

4. La celula, celula vegetal o planta de la reivindicacion 2 o 3, en donde el sitio de union a acil-CoA en la DGAT1 quimerica es de la misma longitud que el sitio de union a acil-CoA de las primera y segunda protemas DGAT 1.

5. La celula, celula vegetal o planta de cualquier reivindicacion anterior, en donde la primera protema DGAT1 y la segunda protema DGAT1 tienen una secuencia con al menos un 70 % de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO:30 a 58.

6. La celula, celula vegetal o planta de cualquier reivindicacion anterior, en donde la protema DGAT1 quimerica tiene al menos uno de:

i) actividad DGAT1 aumentada

ii) estabilidad aumentada

iii) propiedades de oligomerizacion alteradas

iv) propiedades de acumulacion de protemas celulares sustancialmente normales

v) propiedades de direccionamiento celular sustancialmente normales con respecto a la primera DGAT1 vegetal, la segunda DGAT1 vegetal o tanto la primera DGAT1 vegetal como la segunda DGAT1 vegetal.

7. La celula, celula vegetal o planta de cualquier reivindicacion anterior, en donde se aplica al menos uno de los siguientes:

• la celula, o celula vegetal, tiene un perfil lipfdico alterado con respecto a una celula, o celula vegetal, de control, y

• la planta tiene un perfil lipfdico alterado, en al menos uno de sus tejidos o partes, o en su totalidad, con respecto a una planta de control.

8. La celula, celula vegetal o planta de cualquier reivindicacion anterior, en donde la celula, celula vegetal o planta de control esta transformada para expresar un polinucleotido que codifica una de la primera protema DGAT1 vegetal y la segunda protema DGAT1 vegetal.

9. Una protema DGAT1 quimerica producida mediante la expresion del polinucleotido en la celula, celula vegetal o planta de cualquier reivindicacion anterior, en donde la protema DGAT 1 quimerica es capaz de aumentar la produccion de TAG en la celula, celula vegetal o planta, con respecto a la de la celula, celula vegetal o planta de control.

10. Una parte, propagulo o progenie de la planta de cualquier reivindicacion anterior, en donde la parte, propagulo o progenie comprende al menos uno del polinucleotido y la protema DGAT1 quimerica, en donde la parte, propagulo o progenie produce mas TAG que una parte, propagulo o progenie de control.

11. Un pienso para animales o una materia prima de biocombustible que comprende al menos una de: la celula, celula vegetal o planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, la protema DGAT1 quimerica de la reivindicacion 9 y la parte, propagulo y progenie de planta de la reivindicacion 10, en donde la celula, celula vegetal, planta, parte, propagulo o progenie de planta produce mas TAG que una celula, celula vegetal, planta, parte, propagulo o progenie de planta de control.

12. Un metodo para producir triacilglicerido (TAG), comprendiendo el metodo expresar la protema DGAT1 quimerica en la celula, celula vegetal o planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el TAG se produce como resultado de la expresion de la protema DGAT1 quimerica.

13. El metodo de la reivindicacion 12, que incluye la etapa de extraer el TAG de la celula, celula vegetal o planta.

14. Un metodo para producir triacilglicerido (TAG), comprendiendo el metodo extraer TAG de al menos una de: una celula, celula vegetal o planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y la parte, propagulo y progenie de planta de la reivindicacion 10, en donde el TAG se produce como resultado de la expresion de la protema quimerica DGAT1 en la celula, celula vegetal, planta, parte, propagulo o progenie de planta.

15. El metodo de la reivindicacion 14, en el que el TAG se procesa a al menos uno de:

a) un combustible,

b) un producto oleoqmmico,

c) un aceite nutricional,

d) un aceite cosmetico,

e) un ácido graso poliinsaturado (PUFA), y

f) una combinacion de cualquiera de a) a e).