JPH09508786A

JPH09508786A - バショウ種のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）形質転換

Info

Publication number: JPH09508786A
Application number: JP7516370A
Authority: JP
Inventors: アーンツェン，チャールズ、ジェイ; メイ，グレガリ、ディー
Original assignee: ザ、テクサス、エイアンドエム、ユーニヴァーサティ、システィム
Priority date: 1993-12-09
Filing date: 1994-12-09
Publication date: 1997-09-09
Also published as: EP0731632B1; EP0731632A4; EP0731632A1; AU1433395A; DE69429012D1; AU693506B2; DE69429012T2; CA2177267A1; ATE208131T1; EP1087016A2; WO1995015678A1; CA2177267C; US5792935A; ES2164759T3; PT731632E; EP1087016A3

Abstract

(57)【要約】バショウ植物を形質転換する方法を提供する。特には、バショウ植物分裂組織を傷つけて、遺伝子操作したＴ−ＤＮＡを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の接触を促進する方法を提供する。この方法はバショウ植物を形質転換して薬剤製品を産生するようにするために、又はバショウ植物の果実の表現型の特性を変化させるために、用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称バショウ種のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（AGROBACTERIUM TUMEFACIENS）形質転換発明の背景１．発明の分野本発明は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaci ens）（根頭がん腫病菌）を用いる、バナナ又はプランテーンのようなバショウ種を形質転換するための方法に関する。２．先行技術の記載バナナとプランテーンは、バショウ属（Genus Musa）に属する多年性の巨大草本である。これらの果実は発展途上国の四番目に重要な食糧である。バナナの全世界生産の約１０％（１９９０年には９百万トン以上、価格で４０億米国ドル以上）は、輸出市場に入り、熱帯および亜熱帯地域の重要な収入源となっている。バショウ種が発展途上国で食糧の安全確保にこのような多大な貢献をし、また輸出収益を提供するという事実に照らして、これらの作物が伝統的な作物の育種からは何の利益ももたらされないということは注目すべきパラドックスである。全世界の生産高は、しばしば天然から集め、栽培植物化し、そしてクローン繁殖により維持された未改良のクローンに完全に依存している。バイオテクノロジーにより劇的な遺伝子の改良を可能にしうる重要作物に関して、バショウ種ほど新規なアプローチに対する機会に恵まれているものはほとんどない。食用バナナが、エム・アクミナタ（M．accuminata）とエム・バルビシアナ（M．balbisiana）の２つの種に由来することは一般的な合意がある。食用バナナには、３つの異なる染色体の倍数レベル（２Ｎ＝２２、３Ｎ＝３３及び４Ｎ＝４４）がある。これらは、体細胞突然変異による変異性を受けながら、数百年間栄養繁殖してきた。三倍体は、最も数が多くかつ広く利用されている栽培品種である（世界輸出貿易に使用されるデザート用バナナを含む）。従来法を使用してバショウを育種するための努力は、低い稔性、染色体の倍数レベル、及び遺伝子の変異性の欠如を含む障害に立ち向かっている。ほとんど全ての受け入れられる栽培品種は、種なしで、不稔性で、クローン繁殖性の植物であるため、従来法による育種の努力は、遺伝子の特徴についてほとんど性状解析されていない未改良の材料から始めなければならない。食糧作物として生産されている現在受け入れられている種なし栽培品種において遺伝子の改良を可能にすれば、非常に有利であろう；この原稿は、これを可能にするバショウの再現性ある迅速な遺伝子形質転換のための系を記載している。伝統的な品種改良は、バショウ種に関しては遅れていたが、植物組織培養の手段の適用は、作物改良に対して著しく有効であった。胚レスキュー法（Embryo rescue）、細胞懸濁培養、及び関連する細胞培養法が、作物品種改良における制限を克服するための研究活動において使用され、その結果、新規な表現型を有する遺伝子変種が選択されてきた。未組織（カルス、細胞及びプロトプラスト）培養中で成長した植物細胞は、遍在する遺伝子変化又はソマクローナル（somaclonal）な変異を受ける。この遺伝子の変異性は、新規な生殖質を生み出すが、遺伝子の均一性が必要である目的の栽培品種のクローン繁殖には明確にマイナスの特徴である。このため、バショウの増殖に先進国及び発展途上国で現在広く使用されている芽端（Shoot-tip）培養法が開発された。特徴としてこれらの微小繁殖法（micropropagation procedures）は、植物組織を未分化状態で成長させる時間が短くてすみ、子孫中のソマクローナルな変異のレベルが非常に低い。以下に記載される形質転換系の開発において、我々は現在商業的に広く使用されている微小繁殖法を模倣するような系を考案しようとした。我々の目標は、予期しないソマクローナルな変異性を導入する確率が低い、現存する価値ある栽培品種を標的とする遺伝子の改変に有用であろう系を利用可能にすることであった。グラム陰性土壌細菌アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterlum tumefaciens）の毒性株は、双子葉植物及びある種の単子葉植物に感染することが知られている。このエー・ツメファシエンス（A．tumefaciens）中の腫瘍誘発因子は、そのＤＮＡの幾つかを宿主植物細胞中に移入させることにより機能するプラスミドである。このプラスミド（Ｔｉプラスミド）、及びエー・ツメファシエンス（A．tumefaciens）の種々の株の毒性は、Ｔ−ＤＮＡの動員（mobilizati on）と移入を担当するＴｉプラスミドのｖｉｒ領域により部分的に決定される。外来遺伝子は、Ｔｉプラスミドを介して動員されて感受性の宿主に受け渡される。Ｔｉプラスミドは、宿主植物の遺伝子操作のためのベクターとして使用することができる。多くの場合、天然のエー・ツメファシエンス（A．tumefaciens）Ｔｉプラスミドを変性して無毒化プラスミド（即ち、腫瘍形成又は病害を引き起こさないプラスミド）を作成する。一般には、エー．ツメファシエンス（A．tumefaciens）の宿主範囲は双子葉植物種に限定されると想定されていた。イネ科（Gramineae）のような幾つかの単子葉植物の形質転換に成功は限定されている（米国特許第5,187,073号及び5,177 ,010号を参照）。Hooykaas-Van Slogterenら，Nature，311，763（1984）は、ユリ科（Liliaceae）及びヒガンバナ科（Amaryllidaceae）の単子葉植物種のエー・ツメファシエンス（A．tumefaciens）で感染した創傷部位の小さな腫脹の生成を報告した。Hernalsteensらは、エー・ツメファシエンス（A．tumefaciens）のＣ５８株で感染した、ユリ科の一員である単子葉植物のアスパラガス・オフィチナリス（Asparagus officinalis）の培養幹断片が、腫瘍性増殖を発現したことを報告した［EMBO Journal，3，3039(1984)］。DeCleeneとDeLeyは、The Botani cal Review，42，389(1976)でユリ目(Lilialesとサトイモ目（Arales）の単子葉植物はエー・ツメファシエンス（A．tumefaciens）による感染に感受性であるが、一般に単子葉植物はエー・ツメファシエンス（A．tumefaciens）感染に非感受性であることを示している。単子葉植物の種が双子葉植物に特徴的な創傷応答（細菌中のｖｉｒ遺伝子発現の活性化、形質転換、及び導入された遺伝子が植物細胞の染色体中に融合している組織の再生に関する能力を持つ）を示さないため、アグロバクテリウムによる単子葉植物の形質転換は困難であることが言及されている［Potrykus，Bio/Technology 8:515（1990）］。どの範囲まで他の単子葉植物をアグロバクテリウムに感受性にさせうるかを予測するために利用可能なデータは不充分である。Chilton［Proc．Natl．Acad．Sci．90:3119（1993 ）］は、細菌と植物細胞の間の微妙な化学的な信号通信にとって宿主植物の化学が重要であることを言及している。この状況は、異なるＴｉプラスミドベクター間の土壌感染（agroinfection）効率の差のため更に複雑なものとなっている。C hiltonは、単子葉植物の形質転換には多くの不確実性があることを教示しており、このためバショウを形質転換することができると前もって予測することは不可能である。この不確実性のため、他の試験していない単子葉植物、例えばバショウで細菌遺伝子移入が起こるかどうか前もって予測することはできない。エー・ツメファシエンス（A．tumefaciens）での感染による単子葉植物のバショウ科（バナナ及びプランテーンのような）のどの植物の形質転換も、誰も報告していない。これまではバショウ種はエー・ツメファシエンス（A．tumefaciens ）による形質転換に感受性ではないと一般に考えられていた。実際、先行技術は、エー・ツメファシエンス（A．tumefaciens）を使用してバショウを形質転換することはできないとしている［Biotech．and Devel．Monitr.，14:14−16(1993) ］。バショウの遺伝子形質転換をもたらすための方法を開発する必要がある。これらの普及した熱帯植物中への外来遺伝子の挿入を可能にすることは、遺伝子工学による病害や害虫抵抗性及び改変された果実の表現型を作成するための試みを可能にするので、非常に重要であろう。本発明のこれらの有利な点や他の有利な点は、以下の詳細な説明から明らかになろう。発明の概要本発明の目的は、バショウ植物を形質転換するための方法を提供することである。本発明の更に別の目的は、形質転換したバショウ植物を提供することである。したがって、本発明は、バショウ植物を形質転換する方法を提供し、この方法は、傷ついたバショウ植物組織を作成し、形質転換と再生の能力を有するバショウ植物細胞にアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaci ens）の接触を促進するために、バショウ植物からの分裂組織を傷つけ；そしてこの傷ついたバショウ植物組織に少なくとも１つの形質転換能力のあるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を適用してこのバショウ植物を形質転換する（この少なくとも１つの形質転換能力のあるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）は、少なくとも１つのＴｉプラスミドを含み、この少なくとも１つのＴｉプラスミドは、バショウ植物の形質転換を行うために少なくとも１つの遺伝子操作したＴ−ＤＮＡよりなる）。本発明はまた、バショウ植物を形質転換する方法であって、少なくとも１つの遺伝子操作したＴ−ＤＮＡが更に、選択薬剤耐性をコードする遺伝子、少なくとも１つのスクリーニング可能なマーカーをコードする遺伝子、及びこれらの組合せよりなる群から選択される少なくとも１つの第２の遺伝子よりなる方法を提供する。本発明はまた、バショウ植物を形質転換する方法であって、少なくとも１つの遺伝子操作したＴ−ＤＮＡが更に、選択薬剤耐性をコードする遺伝子よりなり、そして更に、少なくとも１つの遺伝子操作したＴ−ＤＮＡで形質転換した耐性組織を選択するために、選択薬剤耐性をコードする少なくとも１つの遺伝子に応答性のある少なくとも１つの選択薬剤の存在下で形質転換したバショウ植物組織を再生することよりなる方法を提供する。本発明はまた、バショウ植物に由来しない少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子、バショウ植物に由来する少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子、少なくとも１つの固有のバショウ遺伝子の改変した遺伝子発現をコードする少なくとも１つの遺伝子、及びこれらの組合せよりなる群から選択される、少なくとも１つの遺伝子をゲノム中に含む細胞を含むバショウ植物（及びその子孫）を提供する。また、Ｂ型肝炎表面抗原、ノルウォークウイルス（Norwalk virus）キャプシドタンパク質、インスリン、インターロイキン、成長ホルモン、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｈＰＧ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、血液凝固第VIII 因子、血液凝固第IX因子、ｔＰＡ、インスリン、及びこれらの組合せよりなる群から選択される少なくとも１つの薬剤でバショウ植物を形質転換する方法が提供される。また、少なくとも１つの薬剤で形質転換した植物が提供される。また、植物の果実の表現型の特性を変化させる少なくとも１つの遺伝子でバショウ植物を形質転換する方法が提供される。また、改変した表現型の特性を有する果実を持つ形質転換した植物が提供される。また、除草性及び／又は病害耐性を植物に与えるためにバショウ植物を形質転換する方法が提供される。また、形質転換したバショウ植物を、キメラの特徴の存在を同定するのに充分な時間成長させて、形質転換したバショウ植物を、少なくとも１つの完全な植物に再生可能な分裂組織を有し、非キメラ組織を産生するために均一に形質転換された細胞を有する切片に分割することにより非キメラ組織を産生させ、この非キメラ組織を非キメラ植物に成長させる、バショウ植物を形質転換する方法が提供される。これらの及び他の目的及び有利な点を、以下の詳細な説明において記載する。図面の簡単な説明図１は、アグロバクテリウムが媒介した遺伝子形質転換後の個々の再生植物のＮＰＴ−IIドットブロットアッセイを示す。各ウェル（スポット）は、個々の植物からの葉組織の抽出物を含有する。Ａ、Ｂ、及びＣ列は全て、１００mg/l硫酸カナマイシンで選択後回収した推定されるバナナ形質転換体からの抽出物を含有する。Ｄ列は、形質転換していない対照バナナ植物からの抽出物を含有する。試料Ｅ−１及びＥ−２は、比較のために示した、形質転換していないタバコ植物と形質転換したタバコ植物である。異なる推定再生体間の反応の強度の変動は、ＮＰＴ−II発現のレベルの相伴う変動と共に、バナナ染色体中へのＴ−ＤＮＡの無作為の染色体挿入のためとされる。図２は、バナナ分裂組織のアグロバクテリウムが媒介した形質転換体から誘導した個々の植物からの葉組織の抽出物におけるβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）活性を示す。個々の植物は数により同定される。ＧＵＳ活性は、酵素β−グルクロニダーゼによる生成物［４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）］への基質［４−メチル −ウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）］のモル変換の速度として蛍光測定法により測定される。この活性は、産生した生成物のモル数／分／アッセイ混合物中に含まれる全タンパク質（mg）として表される。図３は、陰性対照（形質転換していない）、陽性対照（ＮＴＰ−IIを含むトランスジェニックタバコ植物）、及び１００mg/lカナマイシンで再生したアグロバクテリウムにより形質転換したバナナ植物からのゲノムＤＮＡのサザンブロットのオートラジオグラフを示す。１０μｇの各ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して、別々のレーンにのせた。これらのＤＮＡをＮＰＴ−IIの１．０kbＰｓｔＩ断片に対してハイブリダイズさせた。ＮＰＴ−II活性（レーン１〜７及びレーン９）を示す植物（トランスジェニックバナナ及びトランスジェニックタバコ）からのＤＮＡは、ＮＰＴ−II断片へのハイブリダイゼーションを示した。形質転換していない（陰性対照）バナナ植物（レーン８）は、検出可能なハイブリダイゼーションを示さなかった。図４は、陽性対照（アグロバクテリウムゲノムＤＮＡ）、陰性対照（形質転換していないバナナ植物）、及び１００mg/lカナマイシンで再生したアグロバクテリウムにより形質転換したバナナ植物からのゲノムＤＮＡのサザンブロットのオートラジオグラフを示す。１μｇのアグロバクテリウムＤＮＡと１０ugの植物ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して、別々のレーンにのせた。これらのＤＮＡを、アグロバクテリウムからのｖｉｒＢ．ＤＮＡを含有する１．０kbＢａｍＨＩ／ＢａｇｌII断片に対してハイブリダイズさせて、ｖｉＢ断片へのハイブリダイゼーションを証明した（レーン１）。形質転換していない（陰性対照）バナナ植物（レーン２）も、トランスジェニックバナナ植物（レーン３〜５）も検出可能なハイブリダイゼーションを証明しなかった。発明の詳細な説明本発明の方法は、安定な形質転換したバショウ種の作成に関する。バショウという用語は、バナナとプランテーンを含む。形質転換に適したバショウの組織は、成長するバナナ又はプランテーンの芽培養物の頂端分裂組織、不定分裂組織、及び球茎のような分裂組織を含むが、これらに限定されない。適切な組織はまた、少なくとも１つの完全な植物に再生可能である必要がある。横方向又は軸方向の分裂組織も適している。本方法は、切開（例えば、縦方向の二等分）、切断、穿刺、及び／又は微小粒子衝撃（micro-Particle bombardment）のような方法（これらに限定されない）により分裂組織を傷つける（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobact erium tumefaciens）による感染を促進するため）ことを含む。切開した組織に微小粒子を撃ち込むことにより、傷つける効果が増強されうる。微小粒子衝撃は、当業者に公知の任意の方法により実施することができる。この方法は、タングステン又は金の微小粒子衝撃を含むがこれらに限定されない。傷つけることにより、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）により形質転換する能力のある露出組織が提供されるのみでなく、細菌の毒性を誘発する化合物の産生を刺激されることも予想される。傷つけた後、分裂組織を、約１〜約８日間、好適には約２〜約６日間、最も好適には約４日間という適切なインキュベーション期間、適切なインキュベーション温度及び適切な照明法でインキュベートすることができる。適切なインキュベーション温度は、約２５℃〜約２９℃、好適には約２６ ℃〜約２８℃、最も好適には約２７℃である。適切な照明法は、約１４時間〜約１８時間、好適には約１５時間〜約１７時間、最も好適には約１６時間である。別の実施態様においては、前もってインキュベーションすることなくこの傷ついた組織をエー・ツメファシエンス（A．tumefaciens）で処理する。本方法は、この傷ついた組織に少なくとも１つの形質転換能力のあるエー・ツメファシエンス（A．tumefaciens）を適用して植物を形質転換することを含む。適切なエー・ツメファシエンス（A．tumefaciens）株の選択は当業者が行うことができる。適切な株は、目的の遺伝子を効率的に送達できるものである。適切なエー・ツメファシエンス（A．tumefaciens）株は、バショウで遺伝子を発現させるプラスミドを有するＬＢＡ４４０４、Ｃ５８、及びＡ２８１株を含むが、これらに限定されない。このエー・ツメファシエンス（A．tumefaciens）は、少なくとも１つの遺伝子操作したＴ−ＤＮＡを含む少なくとも１つのＴｉプラスミドよりなる。エー・ツメファシエンス（A．tumefaciens）は、指先、綿棒、注射により、及び／又は同時栽培（co-cultivation）により手作業の適用のような（これらに限定されない）当業者に公知の任意の方法により適用することができる。エー・ツメファシエンス（A．tumefaciens）の適用は、適切な時間行われる。適切なインキーベーション時間は、約１５〜約６０分間、好適には約２０〜約４５分間、最も好適には約３０分間である。遺伝子操作されたＴ−ＤＮＡは、植物を形質転換する１つ以上の遺伝子を有してよい。これらは、例えば、バショウ植物に由来しない少なくとも１つのタンパク質、バショウ植物に由来する少なくとも１つのタンパク質をコードする少なくとも１つの第１の遺伝子、バショウ植物における遺伝子発現を改変する少なくとも１つの遺伝子、及びその組合せであってよい。遺伝子操作されたＴ −ＤＮＡはまた、選択薬剤耐性をコードする少なくとも１つの第２の遺伝子、少なくとも１つのスクリーニング可能なマーカーをコードする少なくとも１つの遺伝子、及びその組合せよりなってよい。本発明の１つの好適な実施態様において、分裂組織は、エー・ツメファシエンス（A．tumefaciens）の毒性を誘発する少なくとも１つの化合物で処理することができる。適切な化合物は、アセトシリンゴン（acetosyringone）又はエー・ツメファシエンス（A．tumefaciens）の毒性を誘発する他の植物抽出物を含むが、これらに限定されない。感染を成功させるために他の添加物を適用することができ、これらはオクタピン（octapine）、ノパリン、及びロイシノピン（leucinop ine）のようなオピンを含むが、これらに限定されない。このような毒性誘発性化合物による処理は、このような化合物を含む培地中で組織を同時栽培することにより行うことができる。組織を、上記で概説したように適切なインキュベーション温度で、上記で概説したように適切な時間インキュベートする。別の実施態様においては、毒性誘発性化合物の存在下で同時栽培は行われない。ある実施態様においては、形質転換した組織を植えて成長させる。好適な別の実施態様においては、形質転換した組織を、当業者に公知の方法を用いて選択を可能にする条件でインキュベートする。例えば、組織を、選択再生培地中でインキュベートすることができる。少なくとも１つの抗生物質耐性遺伝子を用いる選択を使用することができる。カナマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、カルベニシリン、ヒグロマイシン及びこれらの組合せのような（これらに限定されない）少なくとも１つの抗生物質耐性遺伝子配列を挿入することができる。また、除草剤耐性をコードする少なくとも１つの遺伝子を挿入することができる。これらは、ホスフィノトリチン（phosphinothricin）、グリホセート（glyphosate）のような（これらに限定されない）除草剤、及び少なくとも１つのスルホニル尿素類及びこれらの組合せを含む。選択再生培地は、抗生物質耐性形質転換体の選択には適切な抗生物質のような少なくとも１つの適切な選択成分、又は除草剤耐性形質転換体には少なくとも１つの除草剤よりなる。選択薬剤の選択は、植物に移入した耐性遺伝子に依存する。発芽したバショウ再生体を、抗生物質及び／又は除草剤よりなる再生培地に移して、トランスジェニック小植物の選択を可能にすることができる。再生培地は、小植物を再生するために好適な条件を提供する当業者に公知の培地である。適切な再生培地は、参照により本明細書に組み込まれるNovak，F.J．ら，Bio/Tech nology 7，154（February 1989）に記載されたようなＭＳ培地を含むが、これに限定されない。発芽した再生体は、再生培地中で充分な時間インキュベートすることができる。充分な時間とは、小植物の形成が可能な時間である。次に成長しているバショウ再生体を、根形成（rooting）培地に移すことができる。根形成培地は、根の形成を誘発するのに好適な条件を提供する当業者に公知の培地である。適切な根形成培地は、参照により本明細書に組み込まれるNovak，F.J．ら（上記文献）に記載されたようなＳＨ培地を含むが、これに限定されない。成長している再生体は、根形成培地中で充分な時間インキュベートすることができる。充分な時間とは、根の形成が可能な時間である。好適な実施態様においては、標準的生化学的方法により、バショウ再生体は、添加した遺伝子、又はその産物の存在について測定される。バショウ種の形質転換のために開発された方法には少なくとも３つの主要な利点がある。第１は、バナナとプランテーンの全ての市販の栽培品種に適用可能であることである。更に、本方法は、ソマクローナル変異を誘発することができる細胞段階を経ることなくバナナ又はプランテーン中に遺伝子の導入が可能である。更に、植物の再生までの遺伝子導入の全工程が短い（約２ケ月未満）。本発明の方法は、１つ以上の遺伝子でバショウ植物を形質転換するために使用することができる。本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、天然由来のヌクレオチド配列又は合成ヌクレオチド配列を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される「ヌクレオチド配列」は、当業者には共通に認識されるように天然の又は修飾した核酸の鎖のことをいう。形質転換体を同定する能力を改善するために、目的の発現可能な遺伝子として、又はこの遺伝子に加えて、選択可能な又はスクリーニング可能マーカーを使用してもよい。このような遺伝子は、マーカーが化学的方法（即ち、除草剤、抗生物質などのような選択薬剤の使用）により選択可能な特性を与えるかどうか、又は観察又は検査により同定できる単純な特性（例えば、Ｒ遺伝子座特性）であるかどうかに依存して、選択可能な又はスクリーニング可能なマーカーのいずれかをコードしてよい。適切なマーカー遺伝子の多くの例が当業者に公知であり、本発明の実施に使用することができる。本発明に関連して使用可能な選択可能なマーカーは、カナマイシン耐性をコードしカナマイシン、Ｇ４１８などを使用して選択することができるＮＰＴ−II遺伝子；ビアラホス（bialaphos）耐性をコードするバー（bar遺伝子；グリホセート耐性をコードする突然変異ＥＰＳＰ合成酵素遺伝子などを含むが、これらに限定されない。スクリーニング可能なマーカーの例は、ベーターグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）又はＲ遺伝子座遺伝子を含み、これらは宿主細胞中のアントシアニン色素（赤色）の産生を制御する産物をコードする。「選択可能な」又は「スクリーニング可能なマーカー」遺伝子という用語には、形質転換した宿主細胞を同定又は選択する手段として、その分泌を検出することのできる分泌可能なマーカーをコードする遺伝子も含まれる。例として、抗体相互作用により同定することができる抗原、又は触媒的に検出することのできる酵素を分泌することのできるマーカーを含む。植物に送達させる特定の遺伝子の選択は、しばしば形質転換の目的に依存する。バショウに由来しないポリペプチドをコードする遺伝子、バショウに由来するポリペプチドをコードする遺伝子、遺伝子発現を改変する遺伝子及びこれらの組合せを、バショウに適用することができる。遺伝子発現を改変する遺伝子は、少なくとも１つのリボザイムをコードする遺伝子、アンチセンスヌクレオチドをコードする遺伝子、及び米国特許第5,231,020号に記載されたようなトランスイッチ（transwitch）として作用する遺伝子を含むが、これらに限定されない。本方法は、バショウ植物に由来しないポリペプチドをコードする遺伝子で植物を形質転換するために使用することができる。本明細書で使用される「ポリペプチド」とは、ポリペプチド又はタンパク質のことをいう。これは、リパーゼ、メラニン、色素、抗体、ホルモン、薬剤（例えば、インターロイキン、ＥＰＯ、Ｇ −ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｈＰＧ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、血液凝固第VIII因子、血液凝固第IX因子、ｔＰＡ、ｈＧＨ、受容体、インスリン、ワクチン、抗生物質など（これらに限定されない）のような、重要なタンパク質又は他の商業的利用のための製品の生産を含む。有用なワクチンは、Ｂ型肝炎表面抗原及びノルウォークウイルス（Norwalk virus）キャプシドタンパク質を含むが、これらに限定されない。この遺伝子はまた、融合タンパク質をコードしてもよい。使用できるタンパク質をコードする配列は、当業者に公知であるか、又は標準的配列決定法により得ることができる。あるいはまた、本方法は、天然の産物を独自の産物に変換することができる酵素を産生するために使用することができる。これは、例えば、薬剤として有用な二次代謝産物の産生を含む。あるいは、本方法は、果実の風味の改変、又は植物の色素若しくは植物の他の表現型の特性の改変に至る、細胞の代謝を改変するために使用することができる。このような特性は、可視的特性、環境又はストレス関連特性、病害関連特性、及び成熟特性を含むが、これらに限定されない。これらは例えば、ペプチド、タンパク質、脂肪酸、脂質、ロウ、油、デンプン、糖類、炭水化物、風味、におい、芳香、毒素、カロテノイド色素、ホルモン、細胞壁ポリマー、遺伝子制御分子、フラボノイド、貯蔵タンパク質、フェノール酸、クマリン、アルカロイド、キノン、リグニン、グルコシノレート（glucosin olates）、タンニン、脂肪族アミン、セルロース、多糖類、糖タンパク質及び糖脂質の合成又は代謝を担当する遺伝子を含む。例えば、脂肪酸又は脂質の産生における改変（及び、例えば、こうして改変された油産生性植物の脂肪酸組成の改変）は、特定の鎖伸長酵素又は不飽和化（de saturation）酵素の合成を阻止することにより操作することができる。また、デンプンの合成も改変することができ、糖類（及び、例えば、こうして改変された食用植物の糖含量）も改変することができる。同様に、芳香を与える揮発性分子の産生を操作することができる。別の実施態様において、本方法は、植物に商業的に望ましい、農業経済的に重要な幾つかの特性を付加するための植物の形質転換のために使用される。このような特性は、除草剤耐性、収量増加、害虫及び病害耐性、物理的外見、食物含有量、組成などを含むが、これらに限定されない。例えば、除草剤耐性をコードする１つ以上の遺伝子を組み込むことができる。バー（bar）及びグリホセート耐性ＥＰＳＰ合成酵素遺伝子は、良い例である。導入することができる強力な害虫耐性遺伝子には、バチルス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）結晶毒素遺伝子があり、これは、鱗翅目又は鞘翅目などの害虫に対する耐性を提供することができる。ササゲ（cowpea）トリプシン阻害物質（ＣｐＴＩ）のような強力な殺虫作用を有することを特徴とするタンパク質をコードする遺伝子は、ルートウォーム（ro otworm）抑止剤としての用途が見い出され；アベルメクチンをコードする遺伝子は、トウモロコシのルートウォーム抑止剤として特に有用であることが判る。幾つかの例において、形質転換したバショウ植物は、キメラ性である。「キメラ性」とは、多様な遺伝子型の組織を有する植物、又は遺伝子的に異なる細胞の混合物よりなる個体をいう。キメラ植物は、例えば、バショウ植物に由来しない少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子、バショウ植物に由来する少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子、少なくとも１つの固有のバショウ植物遺伝子の改変された遺伝子発現をコードする少なくとも１つの遺伝子、及びこれらの組合せの、植物ゲノムの領域中への挿入の結果であり、これにより、生じたトランスジェニック植物に含まれる細胞のわずかな部分での遺伝子発現の減少、不完全性、又は改変を導く。更に、キメラ植物は、分裂組織の単一細胞の形質転換から生じることもあり、ここではこの分裂組織（形質転換した細胞と形質転換していない細胞よりなる）が「キメラ」形質転換植物に再生する。キメラ植物は、当業者に公知の方法により同定することができる。これらは、外来遺伝子産物の酵素的分析、サザン及びノーザンハイブリダイゼーション分析、及び同じ形質転換した植物内の異なる細胞系統の組織の組織化学的分析を含むが、これらに限定されない。ある場合には、キメラ植物は、植物の特徴の肉眼的観察により同定することができる。例えば、植物の選択した部分は、発育阻害されているか、又は低成長であることがある。当業者に公知のこれらの幾つかの場合に、これらのキメラの特徴を持たないバショウ植物を開発することが望まれることもある。形質転換したキメラ植物からの形質転換した非キメラ植物の作成は、キメラの特徴の存在を同定するのに充分な時間、形質転換したバショウ植物を成長させて、この形質転換したキメラバショウ植物を、完全な植物に再生することができる少なくとも１つの分裂組織を有し、かつ非キメラ組織を産生するために均一に形質転換された細胞を有する切片に分割し、この非キメラ組織を非キメラ植物に成長させることにより実施することができる。本明細書で使用される「充分な時間」とは、当業者には公知の時間であり、約２日間〜約４５日間、好適には約１０日間〜約３０日間、最も好適には約１４日間〜約２１日間を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される「分割」とは、ナイフ、外科用メス又はミクロトームによるような、物理的切断のことをいう。以下の実施例は、本発明の教示するところを説明するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。実施例１本実施例は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefa ciens）を使用するバナナの形質転換を記載している。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ−II（ＮＰＴ−II）とベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をバナナで発現した。市販のキャベンディッシュ（Cavendish）クローン「グランド・ナイン（Grand Nain）」（ＡＡＡ）を芽端（shoot tip）培養として微小繁殖させた。参照により本明細書に組み込まれるNovak，F.J．ら，Bio/Technology 7，154-159(1989) に記載されたように、前胚発生性カルス（pro-embryogenic calli）から誘導した懸濁培養物を作成して維持した。分裂組織の先端（大きさ２〜５mm）をインビトロ（試験管内）芽端培養物から切り取り、２〜４個の葉原基の付いた分裂組織の半球状物と、下にある限られた量の球茎組織を得た；次にこれらを縦方向に二等分した。あるいはまた、頂端分裂組織を含まない切り取った球茎組織（多くの不定芽を含有する）を、厚さ２〜３mmの薄片に切った。プラスミドｐＢＩ１４１は、イネアクチン１（Ａｃｔ１）プロモーターの制御下にＧＵＳ遺伝子と、ＮＯＳプロモーターの制御下にＮＰＴ−II遺伝子を含有した。このバイナリーベクターは、ｐＡｃｔ１ＦのＸｈｏ１／Ｘｂａ１断片を、Ｘｂａ１／ＨｉｎｄIIIで消化したｐＢＩ１００中に挿入することにより作成した。プラスミドｐＢ３Ｇは、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下にバー（bar）とＧＵＳ遺伝子の両方を含有した。頂端分裂組織の縦方向の二等分物、又は成長しているバナナ芽培養物の不定芽組織を、あつらえ設計した装置で裸の微小粒子と共に１０cmの距離で撃ち込んだ。アグロバクテリウムと共に組織をインキュベートする前に、裸の微小粒子と共に撃ち込み、選択培地で成長する小植物の割合を更に増強した。これらの組織に３日間の回復期間を与えた。回復後、アセトシリンゴン（ＡＳ）１００μＭの存在下で、ｐＢＩ１４１を含むアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４株の希釈（１：１０）した一晩培養物と共に、分裂組織又は不定芽部分を３０分間同時栽培した。接種後、参照により本明細書に組み込まれるNovak，F.J．ら，Bio/Technology 7，154-159(1989)に記載されたように、ＡＳ１００μＭを含有する非選択Ｓ２７再生培地に植物組織を移して、暗所で２７℃で４日間インキュベートした。次に分裂組織又は不定芽組織を、硫酸カナマイシン１００mg/lとカルベニシリン５００mg/lを含有する選択再生培地に移した。再生芽を、Novak（上記文献）により記載されるように硫酸カナマイシン１００mg/lとカルベニシリン５００mg/lを含有する根形成培地に移した。選択培地で根を形成する小植物をＮＰＴ−II活性について測定した。アセトシリンゴン（ＡＳ）の存在下又は非存在下でアグロバクテリウムと共にインキュベートした二等分した頂端分裂組織又は球茎組織を使用して予備実験を行った。ＡＳは、選択薬剤に耐性のある再生小植物の数を増加させることが判った。これはＡＳがバナナ細胞のアグロバクテリウムが媒介する遺伝子の形質転換を増強したことを示している。推定バナナ形質転換体を、参照により本明細書に組み込まれるpeng，J．Wenら，Plant Mol．Biol．Rep.，11(1)，38-47(1993)により記載されたものを改変したプロトコルによりＮＰＴ−II活性の存在について測定した。その改変で、選択培地で根形成する小植物からの葉組織を単離して、すぐに液体Ｎ₂中で凍結した。抽出緩衝液（５０mMリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、１０mMβ−メルカプトエタノール、１０mMＥＤＴＡ、０．２％トリトン−Ｘ１００）の存在下で、使い捨てコンテス（Kontes）組織粉砕機で試料をホモジナイズすることによりタンパク質抽出物を調製した。４℃で４分間試料を遠心分離して、各抽出物５０μ ｌを別々のマイクロ遠心分離管に添加した。Pengらに記載されたように、測定の残りの手順を実施した。ＮＰＴ−II活性を検出した植物を、参照により本明細書に組み込まれるJeffer son，R.A.，Plant Mol．Biol．Rep.，5，387-405（1987）に記載された標準法によりＧＵＳ酵素活性の存在について更に分析した。参照により本明細書に組み込まれるFeinberg，A.P.とVogelstein，B.，Anal． Biochem.，132，6-13(1983)に記載されたＣＴＡＢプロトコルによりＮＰＴ−II 活性を示した小植物の葉からゲノムＤＮＡを単離した。ＤＮＡ試料（１０μｇ）を適切な制限酵素で消化して、０．７％アガロースゲルで電気泳動して、供給業者の推奨手順でゼータプローブ（Zeta Probe）（登録商標）（バイオラド（BioR ad）、リッチモンド、カリフォルニア州）ナイロン膜に移した。１．０kbのＥｃｏＲＶ／ＳｓｔＩＧＵＳ断片から、ランダムプライムした放射標識プローブを作成した。膜をハイブリダイズさせ、供給業者の推奨手順で洗浄した。標準法を用いてオートラジオグラフィーにより結果を可視化した。形質転換実験は、典型的には５０個の微小繁殖したバナナ小植物で行い、ここから１００個の二等分した頂端分裂組織と２０〜４０個の球茎片を得た。アグロバクテリウムとの同時栽培後、全ての小植物再生工程で選択薬剤として硫酸カナマイシン（１００mg/l）を用いた。頂端分裂組織片の７０％が微小繁殖培地で芽を形成し；これらの５０％は選択根再生培地中で活発に根が成長した。球茎薄片の４０％が選択微小繁殖培地で芽を形成し、この内４０％は選択根再生培地で根を形成した。この選択培地で根を形成した小植物を、ＮＰＴ−IIの酵素活性について測定した（図１）。選択した植物の約６６％は、容易に検出可能なレベルの酵素活性を示した。カナマイシン含有培地で根の成長と高レベルのＮＰＴ−II活性に基づいて選択した、推定トランスジェニックバナナ小植物を、ＧＵＳ酵素活性について更に評価した（図２）。形質転換していない対照からの葉組織は低レベルのバックグラウンドＧＵＳ活性を示した（平均値：４ −メチルウンベリフェロン２０pmol/分/mgタンパク質）。個々の形質転換体は、形質転換していない対照に近いレベルから４−メチルウンベリフェロン１０００ pmol/分/mgタンパク質以上までの範囲のＧＵＳ活性を示した。対照と推定トランスジェニック植物からのゲノムＤＮＡを単離し、ＮＰＴ−II 遺伝子の存在について分析した（図３）。各試料からのゲノムＤＮＡ１０μｇを望ましい制限酵素で消化し、１．０kbＮＰＴ−II断片とハイブリダイズさせた。試験した各再生体（ＮＰＴ−II活性を示すことが前もって判っている）は、ＮＰＴ−II断片とハイブリダイズする配列を含有していた。試験した試料中のＮＰＴ−II断片のハイブリダイゼーションが混入している残ったアグロバクテリウムの存在のためかどうかを決定するために、上記試料からのゲノムＤＮＡを細菌の毒性遺伝子ｖｉｒＢとハイブリダイズさせた。再生した植物試料ではｖｉｒＢのハイブリダイゼーションは検出できなかったが、アグロバクテリウムゲノムＤＮＡを含有する陽性対照レーンは容易に検出可能なシグナルを与えた（図４）。実施例２本実施例では、ＧＵＳの代わりにＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡＧ）をコードする遺伝子を有するプラスミドを含むエー・ツメファシエンス（A．tumefaciens）で組織を形質転換したことを除いて、分裂組織を実施例１に記載されたように処理した。ＨＢｓＡＧをコードするＴｉベクター（ｐＨＢ１０１）の構築は以前に記載されており［Masonら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 8 9，11745-11749(1992)］、構築に使用したＨＢｓＡＧ遺伝子の配列は公表されている［Pasekら，Nature 282，575-579(1979)］。アグロバクテリウムのＬＢＡ４４０４株細胞を直接法［Anら，Methods Enzymol．153，292-305(1987)］（参照により本明細書に組み込まれる）により、大腸菌クローンから調製したプラスミドで形質転換して、このプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。実施例１に記載されたように、プラスミドｐＨＢ１０１（ＨＢｓＡＧをコードする）を有するアグロバクテリウムにより分裂組織を形質転換した。小植物をカナマイシン１００mg/lで選択的に再生した。これらの推定形質転換体は選択薬剤１００ mg/lを含有する培地で根形成できたが、形質転換していない対照はこの条件下で死んだ。２０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．１５ＭのＮａＣｌ、２０mMアスコルビン酸ナトリウム、０．１％トリトンＸ−１００、及び０．５mMフッ化フェニルメチルスルホニルを含有する５容量の緩衝液中で４℃で、テン−ブローク（ Ten-Broek）擦り合わせガラスホモジナイザー（クリアランス：０．１５mm）で均質化して、葉組織からタンパク質を抽出した。このホモジネートを１０００× ｇで５分間遠心分離して、上澄液を２７，０００×ｇで１５分間遠心分離した。この２７，０００×ｇ上澄液を１００，０００×ｇで１時間遠心分離して、ペレットを抽出緩衝液に再懸濁した。クーマシー色素結合アッセイ（バイオラド（Bi o-Rad））により、異なる画分のタンパク質を測定した。陽性対照（ヒト血清から誘導したＨＢｓＡＧ）を標準として使用して、アウスザイム（Auszyme）モノクローナルキット（アボット（Abbott）、ノースシカゴ（North Chicago）、イリノイ州）でＨＢｓＡＧを測定した。陽性対照を希釈して、ＨＢｓＡＧレベルを測定当り０．０９〜１．８ngにして、発色後の４９２nm の吸光度をこの範囲で直線関係にした。ＨＢｓＡＧの存在について、選択培地で再生した小植物を測定した。ｐＨＢ１０１で形質転換したバショウ植物で抗原陽性物質を検出した。実施例３これは予言的な実施例である。分裂組織を、ホスフィノトリチン（phosphinot hricin）アセチルトランスフェラーゼとＧＵＳをコードする遺伝子を有するプラスミドを含むエー・ツメファシエンス（A．tumefaciens）で形質転換した。バー（bar）遺伝子は、ホスフィノトリチンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）をコードする；これは、トランスジェニック植物中に導入されると除草剤バスタ（Basta）に対する耐性を与える。ＰＡＴをコードするＴｉプラスミドの構築に使用されたバー（bar）遺伝子の配列は、最近公表された［Whiteら，Nuc ．Acids．Res．64，675-678(1990)］。ＰＡＴをコードする配列を含有するＴｉプラスミド（ｐＩＢＴ−１１５）の作成に、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーターとノパリン合成酵素（ＮＯＳ）ターミネーターの制御下にバー（bar）遺伝子を含有するプラスミド（ｐＤＥ１１０）を使用した。ＣａＭＶプロモーター、ＰＡＴをコードする配列及びＮＯＳターミネーターを含有するＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII断片を、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII消化によりｐＤＥ１１０から放出させた。過剰のｄＮＴＰの存在下でこの断片をＤＮＡポリメラーゼクレノウ断片で処理して、平滑末端断片を生成した。ＣａＭＶプロモーターの制御下にＧＵＳ遺伝子を含有するＰＢＩ２１（クローンテク・ラボラトリーズ（CLONETECH Laboratories）、パロアルト、カリフォルニア州）を、制限酵素ＰｓｔＩでの消化により線形にした。消化後、過剰のｄＮＴＰの存在下で１２℃で、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより、生じた３’−ＯＨ突出部をプラスミドから取り除いた。ひとまとめにして、これらの処理により平滑末端を有する線形プラスミド（ｐＢＩ１２１）を得た。更に、この処理により、ｐＢＩ１２１のＰｓｔＩ／ＰｓｔＩ断片にあるＮＰＴ −II遺伝子とそのＮＯＳターミネーターの大部分が放出した。平滑末端ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII ＣａＭＶ−ＰＡＴ−ＮＯＳ断片をＮＰＴ−IIの少ないｐＢＩ１２１中に連結して、ｐＩＢＴ−１１５を得た。アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４株細胞を、大腸菌クローンから調製したプラスミドで直接法［Anら，Methods Enzymol．153，292-305(1987)］により形質転換して、このプラスミドの構造を制限酵素消化により確認した。分裂組織を、選択薬剤としてカナマイシンをホスフィノトリチン（phosphinothricin）に置換するほかは実施例１に記載されたように、プラスミドｐＩＢＴ１１５（バー（bar）とＧＵＳ遺伝子の両方をコードする）を有するアグロバクテリウムにより形質転換した。ホスフィノトリチン０．５mg/lで小植物を選択再生させた。これらの椎定形質転換体は、除草剤０．５ mg/lを含有する培地で根形成させることができるが、それに対して形質転換していない対照はこれらの条件下で死んだ。続いて、少数の植物を土壌で育て、約１０cmの高さに成長した時、葉序に直接化学物質を適用することにより除草剤耐性を試験した。形質転換していない対照は葉の褐色化で重度の損傷が明らかであるが、推定形質転換体は目に見える症状はなかった。また、対照植物に除草剤を適用すると、娘植物（「台芽」）の同時の増殖と共に頂端分裂組織の成長が阻害された；これらの作用は推定形質転換体では観察しなかった。ｐＩＢＴ１１５はＧＵＳ遺伝子をコードするため、我々はこれらの植物で組織化学的染色実験を行い、ＧＵＳの存在について評価した。全ての除草剤耐性植物では強い染色を観察したが、これに比べて形質転換していない対照では同じ組織化学的アッセイの条件下で全く染色されなかった。実施例４実施例１のように誘導した分裂組織の形質転換によりキメラ植物を得た。即ち、細胞集団中の唯一の細胞のみがＮＰＴIIＤＮＡを受け取るが、生じる酵素活性によりカナマイシン分解を起こして周囲の細胞を保護し、こうして形質転換した細胞と形質転換していない細胞の両方を含有する植物の再生が可能になった。形質転換していない可能性のある細胞と細胞誘導体を除くための条件を設定するために、２つの追加的レベルの淘汰圧を使用することができる：即ち、選択薬剤の存在下での根形成法、及び続いての細胞のわずかな小集団からの新規植物の形成を引き起こす追加的な１回以上の芽再生。これらの実験のために、３×５mmの芽端と厚さ２〜３mmの球茎薄片を、アグロバクテリウムとの同時栽培後、カナマイシン１００mg/lで回復させた根形成した推定形質転換植物から切り取った。これらを、同じレベルのカナマイシンも含有する芽形成培地に移した。比較のため、形質転換していない対照の分裂組織又は球茎薄片を、１００mg/lまでの範囲のカナマイシン濃度に移入した。対照植物の阻害効果は、成長阻害と葉の黄色化を含んだ；１００mg/lで根の成長は完全に阻害された。少数の椎定形質転換体は、このレベルの阻害剤で活発な根の成長を示した。典型的な実験において、カナマイシンで根を形成した組織の約４０％が活発に根を形成した。これらのデータは、残りの６０％がキメラであり、抗生物質耐性根を生じさせる分裂組織を含有していなかったことを示した。幾つかの場合には、推定形質転換体を根形成培地でカナマイシン選択に長期に暴露後（４週間以上）、新規な芽の二次的な発生や、以前には緑色組織のほんの小さな部分から起こる根の発生と共に、多くの分裂芽組織の死を個々の試料で観察した。我々は、この現象を、アグロバクテリウムで媒介した形質転換事象から生じた始原細胞株由来の分裂組織から発生する新規小植物の成長と連結された、形質転換していない組織の死であると解釈した。１００mg/lカナマイシンで再生して根形成した小植物が抗生物質分解に対応する酵素活性の証拠を示したかどうか決定することは重要であった。我々は、ＮＰＴII遺伝子を含む、ｐＢＩ１４１によるアグロバクテリウムで媒介した形質転換後に得られた複数の個々の形質転換体を分析した。選択培地で根形成した植物を、ＮＰＴの酵素活性について測定した（Pengら、上記文献）。選択培地で根を形成した推定形質転換体の約６６％が容易に検出可能なレベルの酵素活性を示した。更に繁殖させるためのこれらのＮＰＴ測定に基づいて、個々の植物を選択し；高レベルの酵素活性を示した植物を更に分裂組織培養した。これは小頂端分裂組織と球茎薄片への各推定形質転換体の切開を含み；次にこれらの組織を１００mg /lカナマイシンを含有する芽形成培地に移した。続いて、活発に成長している緑色の芽を選択し、小さい（３×５mm）頂端分裂組織と球茎薄片に切開して、新規な芽を発生させて、続いて、１００mg/lカナマイシンで根形成させた。典型的な実験を開始するのに使用した元の５０個の植物から、この第２回目の根形成（ro oting）選択後５個の活発に成長している推定形質転換体を得た。次に、更なる酵素的及びサザン解析によりこれらを個々に分析し、全ての場合に、頂端分裂組織を常に保存して複数のクローンで繁殖した誘導体を誘導するため微小繁殖させた。本明細書に記載された方法において、本発明の概念から逸脱することなく、当業者は多くの他の変形や変更を行うことができる。したがって、前述の説明は本発明を説明するためにあり、本発明の範囲を限定する意図がないことは明瞭に理解すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．バショウ植物を形質転換する方法であって、ａ．傷ついたバショウ植物組織を作成し、形質転換と再生の能力を有するバショウ植物細胞にアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefa ciensの接触を促進するために、バショウ植物からの分裂組織を傷つけ；そしてｂ．この傷ついたバショウ植物組織に少なくとも１つの形質転換能力のあるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を適用してこのバショウ植物を形質転換する［この少なくとも１つの形質転換能力のあるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）は、少なくとも１つのＴｉプラスミドと少なくとも１つの毒性遺伝子を含み、この少なくとも１つのＴｉプラスミドは、バショウ植物の形質転換を行うために少なくとも１つの遺伝子操作したＴ−ＤＮＡよりなる］ことを特徴とする方法。２．少なくとも１つの遺伝子操作したＴ−ＤＮＡが、バショウ植物に由来しない少なくとも１つのポリペプチドをコードする遺伝子、バショウ植物に由来する少なくとも１つのポリペプチドをコードする遺伝子、少なくとも１つの固有のバショウ遺伝子の発現を改変する遺伝子、及びこれらの組合せよりなる群から選択される、少なくとも１つの第１の遺伝子を含む、請求の範囲第１項記載の方法。３．少なくとも１つの遺伝子操作したＴ−ＤＮＡが、選択薬剤耐性をコードする遺伝子、少なくとも１つのスクリーニング可能なマーカーをコードする遺伝子、及びこれらの組合せよりなる群から選択される、少なくとも１つの第２の遺伝子を更に含む、請求の範囲第２項記載の方法。４．少なくとも１つの遺伝子操作したＴ−ＤＮＡが、選択薬剤耐性をコードする少なくとも１つの遺伝子を更に含み、そして更に、少なくとも１つの遺伝子操作したＴ−ＤＮＡで形質転換した耐性組織を選択するために、選択薬剤耐性をコードする少なくとも１つの遺伝子に応答性のある少なくとも１つの選択薬剤の存在下で形質転換したバショウ植物組織を再生することよりなる方法である、請求の範囲第２項記載の方法。５．バショウ植物が、バナナ及びプランテーンよりなる群から選択される、請求の範囲第１項記載の方法。６．分裂組織が、頂端分裂組織、不定分裂組織、及びこれらの組合せよりなる群から選択される、請求の範囲第１項記載の方法。７．切開により傷をつける、請求の範囲第１項記載の方法。８．更に、少なくとも１つの形質転換する能力のあるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を適用する前ではあるが、分裂組織を傷つけた後に、微小粒子を分裂組織に撃ち込むことよりなる、請求の範囲第１項記載の方法。９．更に、傷ついたバショウ植物組織を、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）と、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの少なくとも１つの毒性遺伝子を誘発する少なくとも１つの化合物と共に同時栽培することよりなる、請求の範囲第１項記載の方法。１０．アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の少なくとも１つの毒性遺伝子を誘発する少なくとも１つの化合物が、アセトシリンゴン（acetosyringone）である、請求の範囲第９項記載の方法。１１．バショウ植物に由来しない少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの第１の遺伝子が、少なくとも１つの除草剤に対する耐性をコードする、請求の範囲第２項記載の方法。１２．少なくとも１つの除草剤が、ホスフィノトリチン（phosphinothricin）、グリホセート（glyphosate）、スルホニル尿素類、及びこれらの組合せよりなる群から選択される、請求の範囲第１１項記載の方法。１３．バショウ植物に由来しない少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの第１の遺伝子が、少なくとも１つの薬剤をコードする、請求の範囲第２項記載の方法。１４．少なくとも１つの薬剤が、Ｂ型肝炎表面抗原、ノルウォークウイルス（Norwalk virus）キャプシドタンパク質、インスリン、インターロイキン、成長ホルモン、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｈＰＧ− ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、血液凝固第VIII因子、血液凝固第IX因子、ｔＰＡ、インスリン、及びこれらの組合せよりなる群から選択される、請求の範囲第１３項記載の方法。１５．少なくとも１つのスクリーニング可能なマーカーをコードする少なくとも１つの第２の遺伝子が、ＧＵＳ、ＣＡＴ、及びこれらの組合せよりなる群から選択される、請求の範囲第３項記載の方法。１６．選択薬剤耐性をコードする少なくとも１つの第２の遺伝子が、抗生物質耐性をコードする、請求の範囲第３項記載の方法。１７．抗生物質耐性をコードする少なくとも１つの第２の遺伝子が、カナマイシン、ヒグロマイシン、及びこれらの組合せよりなる群から選択される少なくとも１つの抗生物質に対する耐性をコードする、請求の範囲第１６項記載の方法。１８．選択薬剤耐性をコードする少なくとも１つの第２の遺伝子が、除草剤耐性をコードする、請求の範囲第３項記載の方法。１９．除草剤耐性をコードする少なくとも１つの第２の遺伝子が、ホスフィノトリチン（phosphinothricin）、グリホセート(glyphosate）、スルホニル尿素類、及びこれらの組合せよりなる群から選択される少なくとも１つの除草剤に対する耐性をコードする、請求の範囲第１８項記載の方法。２０．少なくとも１つの遺伝子操作したＴ−ＤＮＡが、少なくとも１つの工業的酵素ををコードする、請求の範囲第１項記載の方法。２１．少なくとも１つの遺伝子操作したＴ−ＤＮＡが、少なくとも１つの融合タンパク質をコードする、請求の範囲第１項記載の方法。２２．少なくとも１つの遺伝子操作したＴ−ＤＮＡが、バショウ植物中の少なくとも１つの化合物と相互作用してこの少なくとも１つの化合物の二次代謝産物を生成する少なくとも１つのタンパク質をコードする、請求の範囲第１項記載の方法。２３．少なくとも１つの遺伝子操作したＴ−ＤＮＡが、バショウ植物の果実の少なくとも１つの表現型特性を変化させる少なくとも１つのタンパク質をコードする、請求の範囲第１項記載の方法。２４．少なくとも１つの表現型特性が、手触り、風味、色素、及びこれらの組合せよりなる群から選択される、請求の範囲第２３項記載の方法。２５．少なくとも１つの表現型特性が、バショウ植物の果実の成熟に影響を与える、請求の範囲第２３項記載の方法。２６．バショウ植物に由来しない少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子、バショウ植物に由来する少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子、少なくとも１つの固有のバンョウ遺伝子の改変した遺伝子発現をコードする少なくとも１つの遺伝子、及びこれらの組合せよりなる群から選択される、少なくとも１つの遺伝子をゲノム中に含む細胞を含む、請求の範囲第１項記載の方法により産生されたバショウ植物。２７．更に、ａ）キメラの特徴の存在を同定するのに充分な時間、形質転換したバショウ植物を成長させて；ｂ）完全な植物に再生可能な少なくとも１つの分裂組織を有し、非キメラ組織を産生するために均一に形質転換された細胞を有する切片に分割することにより非キメラ組織を産生させ；そしてｃ）この非キメラ組織を非キメラ植物に成長させることよりなる、請求の範囲第１項記載の方法。２８．請求の範囲第１項記載の方法により作成された形質転換植物。２９．請求の範囲第２６項記載の形質転換植物の栄養的に誘導された子孫。３０．請求の範囲第２６項記載の形質転換植物から得られる植物の部分。