JPH03187381A - グルタミンシンテターゼインヒビター耐性に関するダイズ植物の遺伝子操作方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、遺伝子操作された植物の製造、特にグルタミ
ンシンテターゼインヒビター耐性の遺伝的特徴が付与さ
れた遺伝子操作されたダイズ植物及びその系統の植物の
製造に関する。

組換えＤＮＡ技術を用いて生物の遺伝的性質を変化させ
る技術により、近年植物について発展してきた。トラン
スジェニック植物及びその系を製造する技術は、より慣
用の従来用いられている植物の交配の技術に比べて、は
るかにコントロールされ、且つ同時にはるかに迅速な方
法で、新規で有用な植物を製造する可能性が提供される
。おそらく、さらに重要なことには、組換えＤＮＡ技術
は、有用な植物に、植物本来の遺伝的性質だけでなく、
地球上のあらゆる生命体の非常に多種の遺伝子プールに
見出される遺伝的性質を導入することをも可能にするの
で、遺伝子貯蔵庫の可能性が生じる。価値ある実施例に
おいては、−船釣な土壌菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ　　
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓにより製造されるＬｅｐ　
１ｄｏｐｔｅｒａｎに特有の蛋白質の毒の遺伝子コード
をタバコ及び綿の菌株に移して、毛虫の餌に毒性を付与
する植物を生産するようにすることができる。

しかしながら、最初に遺伝子操作された植物の利点が、
直ちに全ての植物種のトランスジェニック植物の製造に
結つくことはない。最初に遺伝子操作される植物は、原
則的にはタバコであり、別の土壌細菌であるＡｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの感染とい
う独特の方法を用いて製造されていた。

Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓは、ＤＮＡの一部分（以
下、ＴＤＮＡと記す）を宿主植物の細胞のゲノムに導入
し、該細胞がバクテリアの食料となる独特の群の物質、
オビン（ｏｐｉｎｅ）を製造する細胞を誘導する。

Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕ＋ｎのＴ−ＤＮＡを変化さ
せることにより、外来のＤＮＡを植物細胞に導入するた
めのベクターとして該バクテリアを使用することが可能
になる。この方法は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍの
ための適当な宿主である植物、即ち全ての双子葉の植物
であって、１個の形質転換した細胞から１個の完全な性
的に成熟した植物全体が再生しうる植物に有効である。

しかしながら、この技術の他の植物の種類への適用は、
何度も困難であることが証明されている。

Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの形質転換方法の使用にお
ける一つの問題は、選択マーカーが必要なことである。

いずれの形質転換方法においても、処理された細胞の全
てが形質転換される訳ではなく、形質転換された細胞又
は組織を非形質転換体から選択する必要がある。細菌由
来の選択可能なマーカー、例えばアミノグリコシド−３
−ホスホトランスフェラーゼｎ　（ＡＰＨｎ）　　（ネ
オマイシンホスホトランスフェラーゼとしても知られる
）遺伝子は、タバコ及び他のモデル種において選択マー
カーとして有効であることが証明されているが、他の重
要な栽培植物において都合の良い選択であることは証明
されていない。特に、ダイズにおいて選択マーカーとし
て有効に使用するのは困難である。近年になってようや
く、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ媒介形質転換により
形質転換された最初の非常に少数のトランスジェニック
ダイズ植物が報告された。ｆｌｉｎｃｈｅｅｅｔ　ａｔ
、、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：９１５−９２
２（１９８８）　ｏ従って、この方法は、さらに有効な
選択マーカーにより容易に使用されるようになるであろ
う。

近年、植物の遺伝子操作のための非常に有望な別の技術
が見出された。この技術は、ＤＮＡの植物細胞への物理
的移動を含む。ＤＮＡは植物細胞で正確に発現されるよ
うに製造され、その後、小さな金のビーズに塗布され、
担体シート上に積層される。その後、担体シートを電気
放電装置により加速し、担体シートを止めると、粒子は
適当に置かれた植物組織ターゲットに投げ出される。粒
子は植物細胞を殺すことなく侵入するのに充分小さい。

この方法に使用される装置は、ｌｃ［ａｂｅ等によるヨ
ーロッパ特許出願第２７０３５６号に記載されている。

この方法及び装置の使用は、＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒ　１
ｕｒｎ媒介形質転換に固有の組織の培養における植物の
再生の困難性及び遅延を防止しつつ、植物組織、例えば
分裂組織を遺伝子操作により変える可能性を提供する。

一旦栽培植物の遺伝子操作が可能になると、研究の理論
的領域は、重要な栽培植物を有用に形質転換しうる遺伝
子の確立へと向かう。明らかに収量の増加が目的である
場合、植物の活性及び生長を調節する遺伝子はあまり理
解されず、特徴づけられない。従って、別の目標は、栽
培植物の収量の価値を落とす要因、例えば昆虫又は災害
に対する抵抗性をトランスジェニック植物に与える遺伝
子でありうる。関連する目的は、トランスジェニック栽
培植物のみを残して競合する植物を農場から除去するの
に使用されつる選択的な広いスペクトルの除草剤に対し
て、抵抗性を付与することである。

そのような広いスペクトルの一つの型は、グルタミンシ
ンテターゼインヒビターのグループである。これらの除
草剤は、酵素であるグルタミンシンテターゼを不活性化
することにより植物毒性を示し、これはこれらの細胞に
おいてアンモニアの毒性レベルを上昇させる結果となる
。そのような除草剤として２種類の除草剤、即ち菌 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃ
ｕｓにより生産され、“Ｈｅｒｂｉａｃｅ”の商標名で
Ｍｅｉｊａ　５ｉｅｋａ　Ｌｔｄ、により市販されてい
るトリペプチドである除草剤バイアラホｘ　（ｂｉａｌ
ａｐｈｏｓ）　、並びにＨｏｅｃｈｓｔ　ＡＧから’Ｂ
ａ５ｔａ’の商標名で販売されている合成有機物質除草
剤であるホスフィノトリシン、即ちＰＰＴが商業的に生
産されている。

本発明は、トランスジェニックダイズが、ゲノム内に、
グルタミンシンテターゼインヒビター耐性の遺伝可能な
遺伝子の性質、並びに Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃ
ｕｓからの酵素ホスフィノトリシンアセチルトランスフ
ェラーゼのためのコード配列及びダイズ細胞に該コード
配列の発現を起こすのに有効なフランキング調節配列を
含む遺伝子の性質を含むことに要約される。

本発明の別の目的は、ダイズ植物及びその系統の植物に
グルタミンシンテターゼインヒビターに対する抵抗性の
遺伝可能な性質を付与する方法を提供することにある。

本発明のさらに別の目的は、ダイズの形質転換に有用な
選択マーカー遺伝子を提供することにある。

本発明の他の目的、利点及び特徴は、下記の説明及び添
付図面により明らかになるであろう。

本発明の技術は、ダイズの遺伝子の形質転換のためのシ
ステムと、グルタミンシンテターゼインヒビターに抵抗
性の性質を付与する遺伝子の両方を要求する。遺伝子的
に下記のダイズを形質転換する方法は、ＭｃＣａｂｅ等
のＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５：　９２３−９２
６　（１９８８）に記載された方法をベースとし、この
文献は本発明に参考文献として挿入される。本明細書に
おいて具体化されたグルタミンシンテターゼインヒビタ
ーに対する抵抗性のための遺伝子は、ホスフィノトリシ
ンアセチルトランスフェラーゼ、即ちＦＡＴに関する酵
素をコードするＢａｒ遺伝子である。酵素ＦＡＴは、そ
の遊離のアミノ基を活性化することによりホスフィノト
リシン、即ちＰＰＴを不活性化する。　Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐ　１ｃｕｓに見出される
Ｂａｒ遺伝子は、既にＤｅＢｌｏｃｋ等によりＢＭＢ［
１，６：２５１３−２５１８（１９８７）にマツピング
されている。

従って、本発明はこの菌の遺伝子コード領域をダイズに
コード領域を発現するのに有効なキメラ遺伝子構築物に
挿入すること、並びにキメラ遺伝子構築物をダイズ植物
の菌株に導入することを目的とする。この方法は著しい
不確実性を含んでいた。ダイズに生体内で抵抗性を与え
るＦＡＴ遺伝子の効果は不確実であった。ダイズ中の外
来遺伝子の発現及びダイズの生体内における酵素の有効
性は研究されていなかった。しかしながら、本発明にお
いて、ｂａｒ遺伝子がダイズ細胞中で有効に発現しうろ
こと、ＦＡＴ酵素がダイズ生体内でＰＰＴに対する抵抗
性を付与すること、並びにＰＰＴが、形質転換された細
胞が非常にキメラである植物組織の一部である場合でも
、Ｂａｒ遺伝子を発現する形質転換された細胞の有効な
選択剤として使用されうろことが見出された。

本発明の方法を始めるために、グルタミンシンテターゼ
抑制に対する抵抗性のための遺伝子を単離しなければな
らず、そのタンパク質コード領域を取り出さなければな
らない。これは、Ｂａｒ遺伝子をＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ　　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｓから回収することに
より最も便利に行うことができる。この特徴を有する宿
主菌はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）の受託番号Ｎｏ、２
１７０５のものである。該遺伝子のマツピングインフォ
メーションは出版されている。ＤｅＢｌｏｃｋ　ｅｔ　
ａｌ、、　ＢＭＢｏ、６：２５１３−２５１８　（１９
８７）及びＴｈｏｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、ＢＭＢｏ
、６：２５１９−２５２３　（１９８７）。

その後、生物、又は他の任意の源から得られたコード配
列を、植物細胞のコード配列を発現することができるキ
メラ植物発現ベクターに入れなければならない。これは
、適当なプロモーター及びターミネータ−配列を構築し
、それらを反対側のコード配列の末端にアニーリングす
ることによっても、または既に構築された植物発現ベク
ターに当該技術分野で周知の方法によってコード配列を
挿入することによっても遠戚しつる。適当な発現プロモ
ーターも当該技術分野で良く知られており、例えばＡｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔｕｎ＋ｅｆａｃｉｅｎｓ
から得られるツバリンシンテターゼプロモーター、及び
カリフラワーモザイクウィルスの３５ｓサブユニツト遺
伝子から得られるＣａＭＶ　３５Ｓプロモータである。

一般に使用されるターミネータ−は、Ａ、　ｔｕｍｅｆ
ａｃｉｅｎｓからのツバリンシンターゼ遺伝子から得ら
れるポリアデニル化配列である。他の有用な末端配列は
、カルボキシレート遺伝子（Ｓｏｙｂｅａｎ　ＳＳＵ　
３’　）のダイズの小さなサブユニットから誘導される
。他の有効な末端領域は当該技術分野の技術者に知られ
ているものである。ある種の非コード配列は植物に下流
側のコード領域の発現を強化することも見出されている
。そのような５′非コード領域の一つに、アルファルフ
ァモザイクウィルスの５′非コードリーダーがある。こ
れらの配列は全てダイズの機能に見出されている。いず
れにしても、これら配列又は当該技術分野の技術者に知
られている同等の配列が使用されると、コード配列はダ
イズ細胞のコード配列の発現に有効な適当なフランキン
グ調節配列に結合される。

上記のように、形質転換実験においては、形質転換され
たＨ胞又は組織の同定が方法な重要な部分でありうる。

選択可能なマーカーが好ましいが、化学的又は生物学的
に形質転換された組織を選択できるマーカーがない場合
は、その次に、比較的単純な分析により発見できる検出
可能なマーカーが好ましい。そのような検出可能なマー
カーを用いると、植物の遺伝子操作は植物に導入された
遺伝子の動向を調べることができ、それらの植物組織へ
の導入及び生殖への導入を追跡することができる。その
ような検出可能なマーカーの一つは、β−グルクロニダ
ーゼのための遺伝子、即ちｇｕｓである。植物組織に発
現されると、ｇｕｓ遺伝子は有効に発現され、ダイズに
検出されうることが調べられている。

キメラ遺伝子は、ＭｃＣａｂｅ等のＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ、　６：９２３−９２６　（１９８８）に開
示された方法にもとづく方法により最も有効にダイズを
形質転換することができる。この文献は本発明に参考文
献として挿入される。第１図及び第２図は、そのような
形質転換に使用される装置である。形質転換装置は、通
常１０で示されるスパーク放電粒子加速器であり、これ
はスパーク室１２を含み、該スパーク室１２内には狭い
間隔で配置される一組の電極１４が位置している。電極
１４は電気エネルギー源（図示せず）に連結されており
、シングルファラド範囲のコンデンサーの放電から非常
に短い高圧の電気エネルギーを、放電電圧を１〜５０ｋ
Ｖの範囲になるように調節しながら（自動トランスフォ
ーマ−により）供給することができる。スパーク室１２
は第一の開口１６を有し、その上にアクセスカバー２０
が配置されている。スパーク室１２は第二の開口１８を
有し、その上にアルミニウム蒸着マイラー又は同様の平
板シート材料であるキャリヤーシート２２が配置されて
いる。μｍ単位のキャリヤービーズ、好ましくは１〜３
μｍの金のビーズにキメラ発現遺伝子のＤＮＡを塗布し
、空気乾燥し、そしてキャリヤーシート２２の上面に塗
布する。キャリヤーシート２２の上方に、約２０ｍｍ離
して、保持スクリーン２４を配置する。保持スクリーン
２４のさらに上方のスパーク室の上部から２０ｍｍ〜３
０關上方には、形質転換すべき組織２８を入れるペトリ
皿又は他の容器の形状のターゲット２６を配置する。装
置全体を真空室（図示せず〉内に置き、５００ｍｍＨｇ
の減圧にする。ヘリウムガスを真空室内に流して、真空
室内の空気を置換する。

第１図の装置の操作において、約６μｍの純粋な蒸留水
３０の水滴を電極１４の末端の間に置く。

アクセスカバー２０は、水滴を置くために除去すること
ができ、その後、再び置く。ＤＮＡを付けた金のビーズ
を担持したキャリヤーシート２２をスパーク室の上部の
開口１８に置く。その後、真空室を減圧にして、ヘリウ
ムを導入する。その後、電気エネルギー源のスイッチを
入れ、高電圧の放電を電極１４の間に発生させ、水滴３
０を蒸発させ、スパーク室１２内に衝撃波を発生させる
。衝撃波はキャリヤーシート２２を保持スクリーン２４
に接触して停止するまで上方に運ぶ。金の粒子はそれら
の運動量によりキャリヤーシート２２を離れて標的組織
２８に移動する。その後、形質転換された組織を装置か
ら除去することができる。

種々の植物組織タイプを第１図及び第２図の装置により
形質転換することができる。放電の電力はスパーク放電
の電圧を調節することにより調整されうるので、粒子を
標的組織へ運ぶ力は、顕著な範囲に調整しうる。従って
、侵入の深さ及び量は、形質転換される組織の硬度及び
感度に依存して調整することができる。従って、この装
置は非常に広い組織のタイプ、例えば種、花粉、胚、カ
ルス組織、プロトプラスト又はあらゆる異化した植物組
織を形質転換することができる。苗又は胚の生長してい
る分裂組織は、望ましい完全な成熟した植物体を充分に
製造するので、有用な標的組織である。

加速粒子形質転換方法の問題の一つは、標的組織が形質
転換された場合に、標的組織が均一には形質転換されな
いことにある。結果はしばしば、植物のセクター又はセ
クション中の誘導され、他には誘導されない遺伝子を発
現するキメラ植物となることがむしろ多い。この結果、
たいていは植物の一部に誘導された遺伝子を発現し、他
の部分には発現しないキメラ植物が生じる。この結果に
より、単一の細胞よりもむしろ複数の細胞の領域、即ち
分裂組織が形質転換される事実、及び分裂細胞の統計的
な両分のみが形質転換される事実が論理的に示される。

標的組織から再生された植物、（以下ＲＯ植物と記す〉
のキメラ化は、完全に形質転換された植物が生じないこ
とを意味するものではない。キメラＲＯ植物を成熟する
まで生長させ、自家受粉させることにより、Ｒ１の子孫
が生産され、その全てはクローンであり、キメラではな
く、そのうちのいくらかは導入された遺伝子を有する。

従って、適するスクリーニングアッセーが、これらのＲ
１植物を同定するために行われなければならない。外来
遺伝子の存在のための小さな組織のセグメント分析のた
めの有用な分析は、Ｍｕｌｌｉｓ　ｅｔ　ａｌ、により
米国特許第４．６８３．１９５号及び米国特許第４．６
８３．２０２号に記載されているようなポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）分析である。

実施例 Ａ、　ｐｃＭｃ２１１４の構築 Ｂａｒ遺伝子をＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｈｙｇｒ
ｏｓｃｏｐｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ２１７０５）から、Ｄｅ
ＢＩｏｃｋ等による前掲書及び’ｊｈｏｍｐｓｏｎ等の
前掲書からのマツピング情報をベースとして単離した。

遺伝子を、菌のＤＮＡから、Ｂａｍ旧及びＰｓｔ　Ｉで
消化することにより得られる１、　６　Ｋｂの断片とし
て単離した。その後、この断片を、Ｂａｍ旧及びＰｓｔ
　Ｉにより消化されたｐＵｃ１８ベクターに連結した。

正確なフラグメントの存在は連結されたＤＮＡのＢ、ｃ
ｏｌｉへの形質転換及び選択培地上のＢａｒの抵抗性の
選択により確認した。プラスミドは、第３図に図示され
る派生を示し、ｐｃＭｃ３１０５で表される。

切り出されたＢａｒ遺伝子を便利な植物発現カセットベ
クターに連結するために、タンパク質コード配列の開始
部位にＮｃｏ　Ｉを配置するのが望ましい。これは、部
分的にオーバーラツプする一組の相補的なオゴヌクレオ
チドを合或し、これから５′末端のＮｃｏ　１部位、天
然の配列に天然に生じるＢｇｌ　Ｉ　Ｗ、位に対するＢ
ａｒコード配列部分、及び合成二重鎖の３′末端のＰｓ
ｔ　Ｉ　８位を含む二重鎖を形成することにより行われ
た。該二重鎖は、下記の配列を有する： ５’　−ＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＣＣＡＧＡＡＣＧＡＣＧ
Ｃ［’ＣＧＧＣ’（１’ＧＡＣＡＴＣ−３’−ＣＡＣＴ
ＣＧＧＧＴＣＴＴＧＣＴＧＣＧＧＧＣＣＧＧＣＴＧＴＡ
Ｇ−−ＣＧＣＣＧＴＧＣＣＡＣＣＧＡＧＧＣＧＡＧＡＴ
［：ＴＧＡＴＡＧＴＡＡＣＴＧＣ八　−３′−ＧＣＧＧ
ＣＡＣＧＧＴＧＧＣＴＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＴＣ
ＡＴＴＧ　−５’その後、この二重鎖ＤＮＡを、カリフ
ラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター（ｃａＭＶ
３５Ｓ）　、アルファルファモザイクウィルスからの５
′非コ一ドリーダー配列、Ｂ、Ｔ、　（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）毒性タンパク質のた
めのコード領域、及び＾、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓか
らのポリアデニル化領域を含む植物発現カセットプラス
ミドｐＡＭＶＢＴｓに挿入した。

Ｎｃｏ　Ｉ及びＰｓｔ　Ｉで消化することにより、Ｂ、
ｔ、コード領域をプラスミドから切り出し、その後、精
製した残りのプラスミドを合成二重鎖に連結して、ｐｃ
Ｍｃｌｏｏｌで表されるプラスミドを形成した。このプ
ラスミドは、Ｂ、Ｔ、配列がＢａｒコード領域の５′配
列であること以外はｐＡＭＶＢＴＳと似ている。このプ
ラスミドの部分的なりａｒコード領域の３′末端には、
末端配列の前にＢｇｌ　Ｉ　ＳＢｇｌ　ＩＩ及びＰｓｔ
　１部位がある。その後、プラスミドをＢｇｌ　Ｉ及び
Ｐｓｔ　Ｉの両方で開裂し、Ｂａｒ遺伝子キャリヤーｐ
ｃＭｃ３１０５からのＢｇｌ　Ｉ及びＰｓｔ　Ｉ断片を
これに挿入した。このプラスミドはｐＢａｒ　Ｉとして
示される。

植物細胞の経過分析により、遺伝子の機能によりコード
配列が発現することが示された。

その後、この遺伝子構築物をノバリンシンタゼからのポ
リアデニル化配列をダイズＳＳＵ遺伝子からの末端配列
で置き換える変形を行った。１３ｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ　
ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ９Ｍｏｌ、　ａｎｄ　Ａｐｐｌ、
Ｇｅｎｅｔ、、　１：４８３−４９８（１９８２）に記
載されたようなプラスミドｐｓＲＯ，８が得られた。末
端配列を、Ｅｃｏ　Ｒ１及びＯｄｅ　Ｉから得られる３
００塩基対の配列として単離した。この方法をＦｉｇ、
４に示した。その後、この断片をＫＩｅｎｏｗポリメラ
ーゼによりプラントエンドとし、Ｂａｍ旧リクリンカ結
合した。その後、断片をＢａｍ旧で切断して、ｐｔｌｃ
１９のＢａｍ旧部位に挿入し、ｐｃＭｃ２００５で表さ
れるプラスミドを製造した。この操作により、ダイズｓ
ｓｕ末端配列を、それを挟むＳｍａ　Ｉ及びＳａｌ　１
部位に関連付けられるｐＢａｒｌのツバリンシンターゼ
ターミネータ−と同じ配向になった。その後、Ｓｍａ　
Ｉ及びＳａｌ　Ｉ断片をρＣＭＣ２００５から単離し、
同様に消化されたプラスミ）’　ｐＡＭＶＣＡＴに連結
し、ツバリンシンターゼターミネータ−を置き換えた。

プラスミドｐＡＭＶＣＡＴは、コード配列が内部のＮｃ
ｏ　１部位を除去するように変形されたＴｎ５からのク
ロラムフェニコールトランスフェラーゼ遺伝子のための
ものであること以外は、ｐＡＭＶＢＴＳと似ている。

Ｂａｒ遺伝子配列自体を、追加のＣａＭＶ３５Ｓプロモ
ーターエンハンサ−断片をキメラＢａｒ遺伝子の５′末
端に添加することにより変化させた。この方法をＦｉｇ
、５に示した。ＣａＭＶ３５Ｓエンハンサ−断片を、ｐ
ＡＭＶＢＴＳをＨｃｏＲＩ及びＦｏｋ　Ｉで消化するこ
とにより、３６７塩基対断片を単離し、このプラントエ
ンドをタレノウポリメラーゼで充填することにより得た
。その後、プラントエンド断片をｐＵｃ１８のＳｍａ　
１部位に、挿入した断片のＥｃｏ　Ｒ１末端がｐ［Ｉｃ
１８からのＫｐｎ　Ｉ部位に最も近くなり、Ｆｏｋ　１
部位がＰ［ＩＣｌ３のＢａｍ旧部位に最も近くなるよう
な配置で挿入した。このプラスミドはｐｃＭｃ２０２２
で表され、その後、Ｘｈｏ　Ｉ及びＳａｌ　Ｉで消化し
て、３６７塩基対の断片を単離し、その後Ｘｈｏ　Ｉで
消化されたｐＢａｒ　１に挿入した。得られたプラスミ
ドは、ｐｃＭｃ２０５５で表される。プラスミドｐ［’
Ｍｃ２０５５は順に、Ｘｈｏ　１部位、ＣａＭＶ３５Ｓ
　ｘンハンサー、Ｘｂａ　Ｉ部位、Ｘｈｏ　ＩとＳａｌ
　Ｉの融合部位、ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ、ＡＭＶ　
５　’非コードリーダー配列、Ｎｃｏ　１部位、Ｂａｒ
コード領域、Ｓｍａ　Ｉ部位、及びツバリンシンターゼ
３′ターミネータ−を含む。Ｘｈｏ　Ｉ及びＳｍａ　Ｉ
で消化し、そして１４００塩基対のフラグメントを単離
することにより、ポリアデニル化ターミネータ−なしに
キメラ遺伝子を単離した。その後、この断片をＸｈｏ　
Ｉ及びＳｍａ　Ｉで消化したｐｃＭｃ２０６０に連結し
、これによりプロモーターＣＡＴ遺伝子配列をエンハン
サ−プロモーターＢａｒ遺伝子配列で置き換えた。この
プラスミドはｐｃＭｃ２０５８で表され、下記の配列を
有していた：Ｘｈｏ　１部位、ＣａＭＶ３５Ｓ　ｘンハ
ンサー、Ｘｂａ　１部位、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター
、ＡＭＶリーダー、Ｎｃｏ　１部位、Ｂａｒ　コード配
列、Ｓｍａ　１部位、ダイズｓｓｕターミネータ−１並
びにＸｂａ　Ｉ及びＳａｌ　１部位。従って、このプラ
スミドからのＸｂａ　Ｉ断片は、ダイズ細胞にＢａｒを
発現するのに有効な完全なキメラ植物発現遺伝子構築物
を表す。

その後、上記のＢａｒ遺伝子構築物を、Ｆｉｇ、６に示
すようにβ−グルクロニダーゼ（ｇｕｓ）のための遺伝
子を含む別の構築物に添加した。プラスミドｐｃＭｃ１
１００はダイズ植物及び細胞に発現することが見出され
たｇｕｓ発現カセットを含む。ｇｕｓ遺伝子構築物を、
該プラスミドＸｈｏ　Ｉ及びＳａｌ　Ｉで消化し、２６
０４塩基対断片を単離することにより単離し、その後、
該断片をＳａｌ　ｌで消化されたｐＵｃ１９に挿入した
。このプラスミドは、ｐｃＭｃ２１０５で表され、挿入
のＸｈｏＩ末端がｐＵｃ１９ポリリンカーの旧ｎｄＩＩ
［に最も近くなり、挿入のＳａｌ　Ｉ末端がボＩＪ　Ｉ
ＪンカーのＢｃｏ　Ｒｒに最も近くなるように位置した
ｇｕｓ挿入を含んでいた。

その後、上記のＢａｒ遺伝子構築物を、ｐＣＭＣ２０５
８をＸｂａ　Ｉで消化することにより１３５３塩基対と
して単離した。該断片をｐｃＭｃ２１０５のＸｂａ　１
部位に挿入して、ｐｃＭｃ２１１４で表されるプラスミ
ドを得た。このプラスミドは、下記の配列を下記の順で
含む＝ｐ［Ｉｃ１９ポリリンカーの旧ｎｄＩ［部位；５
ａｉｌ及びＸｈｏ　Ｉの融合体、ＣａＭＶ３５Ｓプロモ
ーター；　ＡＭＶ　５　’リーダー；４上−遺伝子コー
ド配列；ツバリンシンターゼターミネータ−１Ｓａｌ　
１部位；ＸｂａＩ部位；ダイズｓｓｕターミネーター；
５ａｌｔ部位；　Ｘｂａ１部位；ダイズｓｓｕターミネ
ーター；Ｓｍａ１部位；Ｂａｒ：＋−ド配列：ＡＭＶ　
５　’　　リーダー；　ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター；
ポリリンカーからのＸｂａ　Ｉ及びＢｃｏ　Ｒ１部位。

従って、該プラスミドは二つの機能性遺伝子、ｇｕｓ−
及びＢａｒ−を有し、これは互いにｐＵｃＩ９プラスミ
ド上で転写する。この機能性遺伝子は双方ともＣａＭＶ
３５Ｓプロモーター及びＡＭＶ　５　’リーダーを使用
するが、そのターミネータ−は異なっている。

Ｂ、植物の形質転換 植物組織の形質転換のためのＤＮＡを製造するためには
、プラスミドを担体粒子に塗布しなければならない。ｌ
μｇのｐｃＭｃ２１１４及び１μｌの２００ｍＭのＢＤ
ＴＡのアリコートを、１〜３μｍの金のビーズ（Ａｌｆ
ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）　１０　ｍｇに添加し
、混合し、その後窒素流で乾燥した。ＤＮＡが塗布され
た粒子を、１０ｍ１のエタノールを添加することにより
再懸濁し、それらを分散させるために粒子を粉砕した。

これにより得られたＤＮＡ粒子懸濁液を、１６３μｌの
懸濁液を均一に塗布することにより、１８ｍｍＸ　１８
ｍｍＸ０．５ｍ１ｌのサランコートアルミニウム蒸着マ
イラー担体シートにコーティングした。粒子を少なくと
も３０秒間キャリヤーシート上に沈降させた後、過剰の
エタノールを流し去り、ＤＮＡ及び担体粒子を塗布した
シートを空気乾燥した。使用した実際の形質転換方法は
、ＭｃＣａｂｅ等のＢ　ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ　１０ｇｙ
、　６　：　９２３−９２６　（１９８８）に記載され
た方法をベースとするが、乾燥した完全な種子の使用、
植物組織を製造するためのアフィジコリンの使用、及び
形質転換組織の選択のための選択マーカーとしてのＢａ
ｒ遺伝子の使用を含むいくつかの変形を伴う。乾燥種子
の使用は便利だからである。アフィジコリンは、外来の
ＤＮＡ挿入の前に、可逆的にＤＮＡ組換え体を停止させ
ることにより細胞分化を同期化させるために使用される
。Ｂａｒ遺伝子により、植物組織の有効な除草剤の選択
が可能になる。

詳細には、Ｗｉ　Ｉ　Ｉ　ｉａｍｓ種のダイズの種子を
２％の過塩素酸ナトリウムに５分間浸漬し、続いて蒸留
水により吸引しながら５回洗浄することにより、表面殺
菌を行った。その後、種子の請末端を１％寒天水溶液、
０．１％ＤＭＳＯ中の１０ｍｇ／ｌのアフィジコリン、
及びＣＣＢ　（０，４ｇ／ｌのカルベニシリン、０．１
ｇ／ｌのセフォタキシム、及び０．１ｇ／ｌのベノミル
）を含む培地に１日間接触させた。

その後、種子の被膜及び２枚の子葉を除去し、胚軸を露
呈した。その後、小者及び第一の葉を除去し、胚軸を、
Ｂａｒｗｈａｌｅ等のＰｌａｎｔａ、　１６７：４７３
−４８１（１９８６）に記載された基礎ＭＳ培地に、さ
らに０．１％のＤＭＳＯ中の１０ｍｇ／ｊ！のアフィジ
コリンを添加した培地に、胚軸が最初に入るように置い
た。該培地は、ＯＲ十アフィジコリンで表され、高レベ
ルのベンジルアミノプリン（１３，３μＭ）を含む。

さらに、アフィジコリンは細胞が段階において同期化さ
れるように形質転換の前にＤＮＡ複製物を懸濁するため
のものである（Ｓａｌａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｅｔｈ、Ｂ
ｎｔ。

１１８、８７−９６（１９８６））。該軸を、２５℃で
一晩、最初の６時間は暗所で、次の１２時間は明所でＯ
Ｒ＋アフィジコリン培地に保持した。その後、胚軸を培
地から除去し、ターゲット表面上の軸を、ＤＮＡの分裂
組織への粒子加速が起こるように適当な位置に保持する
ために、１２％のキサンタムグルー及びＣＣＢを用いて
、ターゲットプレート上に配置した。

キャリヤーシート２２上の、上記のように製造したプラ
スミドｐｃＭｃ２１１４のＤＮＡを、第１図の装置のス
パーク放電室の開口に置いた。二つの分離処理において
１６ｋＶでの放電を行った。最初の処理においては、１
２時間明所で培養した後、粒子上のＤＮＡを分裂胚軸中
に加速して入れた。その後、該胚軸を５〜６時間暗所に
戻し、その後、再ヒｐＣＭＣ’２１１４Ｄ　Ｎ　Ａ注入
処理した。第二の処理の後、胚軸を再生又は新芽誘導Ｍ
ＳＲ培地（ベンジルアミノプリンがＬ７μＭであり、ア
フィジコリンを含まないこと以外は同様の基礎培地）に
置き、暗所で２日間培養した。該胚軸を再びＭＳＲ培地
に置き、その後１６時間明所／８時間暗所のサイクルに
、新芽が出るまで、通常５〜６週間移した。

典型的には胚軸の移植片当たり３〜６個の新芽が存在し
た。

個々の新芽が１．５〜２ｃｍに達したら、それらの根本
で切断した。各々の切断した新芽からの根本の２〜３ｍ
ｍの切片をＧｕｓ遺伝子の発現について調べた。この分
析は、１ｍＭのＸ　−ｇｌｕｃ（ｃ１ｏｎｔｅｃｈＬａ
ｂｓ）　、０．１　ＭのＮａＰ［］４（ｐＨ７，０）　
、及び０．５ｍＭのフェロジアミドカリウム中、３７℃
で一晩茎の切片を培養することにより行った。その後、
新芽をラクトフェノール中で煮沸することにより洗浄し
、ｇｕｓ活性を示す青い付着物を調べた。

つのキメラな新芽は、ｇｕｓ遺伝子を良好に発現するの
に充分に形質転換された。ｇｕｓ発現新芽をダイズの苗
木上にグラフト化して、ダイズ植物の生長を調べたとこ
ろ、この植物はＢａｒも同様に発現していることが見出
された。

胚軸から切り取った各新芽の残りを、ＣＣＢ及び３ｍｇ
／ｌのバイアラフォス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）を含む１
／２の濃度のＭＳ培地に置いた。新芽を選択培地で約１
週間培養した。３ｍｇ／ｊ！のバイアラフォス上で約７
〜１０日間培養した後、形質転換していない新芽は全て
漂白され、枯死した。しかしながら、いくつかの新芽は
形質転換され、緑色であり、選択培地上での培養を通し
て健康であった。

その後、形質転換された新芽を急速な生長を助けるため
に健康なダイズの根茎上に接ぎ木した。

選択された新芽中のＢａｒ遺伝子の発現の確認のために
、約５〜１０ｍｇの葉又は新芽組織を各植物から除去し
、組織からの合計のＲＮＡを［：ｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ
及び５ａｃｃｈｉ、　Ａｎａｌｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍ−、
１６２：１５６−１５９　（１９８７）に記載された方
法により単離した。その後、この単離されたＲＮＡを、
にａｗａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ、。

ＰＮＡＳ、　８５　：　５６９８−５７０２　（１９８
８）に記載された、下記のようなＲＮＡポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）分析を用いて、Ｂａｒ遺伝子ＲＮＡの
存在について分析した。単離されたＲＮＡを１０μｌの
水に再懸濁し、その後、懸濁したＲＮＡを５０μｌの逆
転写分析中で用いてｃＤＮＡを製造した。この反応にお
いては、ＲＮＡ、５０ｍＭのＫＣＩ　、　２０ｍＭのＴ
ｒｉｓ−ＨＣＬ、　ｐＨ７，５，２，５ｍＭのＭｇＣ１
ｚ、１００μｇ／ｍｌのウシ胎児血清アルブミン、各々
１ｍＭのｄΔＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ。

１（１−５０ｐｍｏｌのＤＲ４６、及び１００単位のＭ
　ｕ　Ｌ　Ｖ逆転写酵素を使用した。ＤＲ４６は配列５
’　−ＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＡＣＴＡＴＣＡＧＡＴ−３
’の１重鎮のオリゴヌクレオチドであった。４２℃で３
０分間培養した後、反応物を９５℃で５分間加熱した。

その後、２５μｌのｃＤＮＡ反応混合物をＰＣＲ反応に
用いて、ｃＤＮＡ中の　Ｂａｒ遺伝子配列をアンプル化
（ａｍｐｌｉｆｙ）　　した。ＰＣＲ反応は、Ｂａｒ−
遺伝子ＤＮＡに特有の二つのオリゴヌクレオチドブライ
マー、ＤＲ４５及びＤＲ４６（上記の配列）を用いて行
われた。ＤＲ４５の配列を下記に示す：　５’　ＴＡＣ
ＡＴＣＧ　Ａ　Ｇ　Ａ　ＣＡ　Ａ　Ｇ　ＣＡ　ＣＧ　Ｇ
　Ｔ　Ｃ−３’。アンプル化領域は４８４塩基対の生成
物である。この分析の結果により、少なくとも形質転換
された新芽におけるＢａｒ遺伝子の存在及び正確な転写
が確認された。

Ｂａｒ酵素の発現は、ＤｅＢｌｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、
ＥＭＢＯ６：２５１３−２５１８　（１９８７）の方法
を用いて酵素自体を分析することにより確認された。新
芽がキメラであり、Ｂａｒ遺伝子により形質転換された
細胞又は部分と、形質転換されていない細胞又は部分と
を有することが予想される。

下記のプラスミドは、＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、　１２３（１１　
Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ
、　ＭＯ。

ＵＳＡ及びｔｈｅ　Ｃｅｔｕｓ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｃｕ１
ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。

Ｂｍｅｒｙｖ　ｉ　１１ｅ、　ＣＡ、　ＵＳＡに、下記
の受託番号で寄託されている。

ｐｃＭｃｌｌｏｏ　　６７６４１　１９８８年３月１日
　　３２９０ｐＡＭＶＢＴＳ　　５３６３７　１９８７
年６月２４日３１３７ｐｃＭｃ２１１４　６７９３６　
１９８９年４月２６日　　３５７５上記の寄託はブタペ
スト条約の下に行われた。

寄託された微生物は、実施態様であり、本発明を説明す
るものにすぎないので、本発明は寄託された微生物の範
囲に限定されるものではない。ここに記載したものに加
えて、種々の変法が明細書から当業者に自明であり、そ
れらは特許請求の範囲に入るものである。また、全ての
ヌクレオチドの大きさはおおよそのものであり、記載の
目的のためにのみ使用される。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の植物を製造するための形質転換方法を
実施するために有用な装置を示す模式図、第２図は第１
図の装置のスパーク放電室の上面図、第３ｒＩＩＪはプ
ラスミドｐｅａｒ　１を製造するためのプラスミド操作
を示す説明図、第４図はプラスミドｐｃＭｃ２０６０を
製造するためのプラスミド操作を示す説明図、第５図は
プラスミドｐ［：Ｍｃ２０５８を製造するためのプラス
ミド操作を示す説明図、第６図はプラスミドｐｃＭｃ２
１１４を製造するためのプラスミド操作を示す説明図で
ある。 １２・・・・・・スパーク室 １４・・・・・・電極 ２６・・・・・・ターゲット ２８・・・・・・組織

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）微生物からグルタミンシンテターゼインヒ
   ビター耐性の遺伝子からのタンパク質コード配列を単離
   すること、 （ｂ）ダイズ細胞に該コード配列を表すのに有効なキメ
   ラ遺伝子構築体を製造するためにフランキング調節配列
   にタンパク質コード配列を連結すること （ｃ）小さな担体粒子にキメラ遺伝子構築体の複製物を
   コーティングすること （ｄ）キメラ遺伝子構築体を有する小さな担体粒子を物
   理的に加速して、完全なダイズ植物に栽培できるダイズ
   の組織に入れること （ｅ）形質転換されていないダイズ組織に毒性を示すの
   に充分有効な量のグルタミンシンテターゼインヒビター
   を含む培地内でダイズ植物を栽培すること （ｆ）組織を完全なダイズ植物に栽培すること、及び （ｇ）ダイズ植物の耐性の存在を確認することを含むグ
   ルタミンシンテターゼインヒビターへの耐性についてダ
   イズ植物を遺伝子操作する方法。
2. （２）タンパク質コード配列が酵素ホスフィノトリシン
   アセチルトランスフェラーゼのためのものである請求項
   （１）記載の方法。
3. （３）コード配列が￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥　￥
   ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ￥菌由来のものである請求
   項（２）記載の方法。
4. （４）フランキング調節配列が、プロモーター、コード
   配列の５′側に位置する非翻訳発現エンハンサー、及び
   コード配列の３′側に位置するポリアデニル化配列を含
   む請求項（１）記載の方法。
5. （５）小さな担体粒子が１〜３μｍの金のビーズである
   請求項（１）記載の方法。
6. （６）粒子の物理的促進段階が、電気エネルギーのスパ
   ーク放電により推進力が提供される装置により、粒子が
   加速される力を調節するために調節可能な放電電圧で行
   われる請求項（１）記載の方法。
7. （７）工程（ｅ）において、培地がバイアラホスを含む
   請求項（１）記載の方法。
8. （８）バイアラフォスが培地１ｌ当たり約３ｍｇの濃度
   で存在する請求項（７）記載の方法。
9. （９）工程（ｄ）において使用されるダイズ組織がダイ
   ズの胚の分裂組織である請求項（１）記載の方法。
10. （１０）新芽にグルタミンシンテターゼインヒビターに
    よる選択を行う前に、処理されたダイズ組織の胚を新芽
    誘導培地で栽培して多数の新芽の形成を誘導する請求項
    （９）記載の方法。
11. （１１）グルタミンシンテターゼインヒビター耐性の遺
    伝的特徴をゲノム内に含むダイズ植物。
12. （１２）請求項（１１）記載のダイズ植物の種子。
13. （１３）￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥　￥ｈｙｇｒｏ
    ｓｃｏｐｉｃｕｓ￥からのＢａｒ遺伝子をゲノム内に含
    むダイズ植物。
14. （１４）請求項（１３）記載のダイズ植物の種子。