ES2524065T3

ES2524065T3 - Gen de resistencia y usos del mismo

Info

Publication number: ES2524065T3
Application number: ES08844681.0T
Authority: ES
Inventors: Hendrikus Antonius Rikkerink; Elena Maria Hilario-Andrade; Andrew Patrick Dare; Susan Elizabeth Gardiner; Minsoo Yoon; Vincent Gerardus Maria Bus
Original assignee: New Zealand Insitiute for Plant and Food Research Ltd
Current assignee: New Zealand Insitiute for Plant and Food Research Ltd
Priority date: 2007-10-31
Filing date: 2008-10-28
Publication date: 2014-12-03
Anticipated expiration: 2028-10-28
Also published as: AU2008319517A1; EP2227485A4; US20100306875A1; CA2703701A1; US9512442B2; AU2008319517B2; WO2009058030A3; EP2227485A2; WO2009058030A2; EP2227485B1; AR069147A1; CA2703701C

Abstract

Polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 o un fragmento o una variante del mismo, en el que el fragmento o la variante confiere resistencia al oídio en una planta de Rosaceae, y en el que el fragmento comprende: a) una secuencia con una identidad de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 6 a lo largo de toda su longitud, b) una secuencia con una identidad de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 5 a lo largo de toda su longitud, c) la secuencia de SEQ ID NO: 6, o d) la secuencia de SEQ ID NO: 5, y en el que la variante comprende una secuencia con una identidad de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 1 a lo largo de toda su longitud.

Description

Gen de resistencia y usos del mismo

Campo técnico

La presente invención se encuentra en el campo de genes de resistencia a enfermedades de plantas

Técnica anterior

El desarrollo de variedades de manzano (Malus x domestica) que portan resistencia natural contra los patógenos y las plagas principales es un componente crucial de cualquier estrategia de mejora genética satisfactoria. Las dos enfermedades fúngicas más significativas del manzano son la sarna del manzano y el oídio. El oídio (provocado por Podosphaera leucotricha) es un problema particularmente grave en zonas de crecimiento de manzanos relativamente secas pero es prevalente en todas las regiones de crecimiento.

Se han identificado varias fuentes de resistencia al oídio en manzanos no comerciales y está en curso la mejora genética para incorporar estas resistencias en nuevas variedades comerciales usando diversas estrategias [11, 13, 26, 27].

En particular se han usado dos fuentes de resistencia en varios programas de cultivo diferentes. Estas fuentes de resistencia al oídio son: 1. Una plántula con polinización libre de Malus zumi (MAL68/5) que porta el locus de resistencia Pl2, y 2. Una plántula con polinización libre de Malus robusta (MAL59/9) que porta el locus de resistencia Pl1. El análisis genético de estas fuentes ha indicado que en algunos trasfondos genéticos al menos estos loci parecen segregar como un único locus dominante principal para resistencia [10, 24, 29]. Otros loci de resistencia al oídio que se han caracterizado genéticamente incluyen PlMIS [8], Pld [40], Pl8 [25] y Plw [15]. No se ha aislado ninguno de estos genes responsables de estas resistencias.

Hasta la fecha, se han clonado aproximadamente 70 genes de resistencia a partir de al menos 14 especies de plantas diferentes que confieren resistencia a diversas enfermedades [28]. Las proteínas codificadas se han agrupado en clases basándose en varios dominios característicos.

La primera clase consiste en genes que codifican para proteínas con características de serina/treonina (S/T) cinasas. Esta clase incluye el primer gen de resistencia a enfermedades de plantas clonado, Pto de tomate [29]. Esta clase también incluye dos parientes cercanos del gen Pto, los genes LhirPto [33] y Fen [30, 34], y el gen Rpg1 [4].

La segunda clase de genes de resistencia consiste en los que codifican para proteínas que contienen un sitio de unión a nucleótidos (NBS) central y una repetición rica en leucina (LRR) carboxilo-terminal. Los primeros de estos genes que se clonaron fueron los genes RPS2 de Arabidopsis thaliana [2] y N de Nicotiana tabacum [41]. El gen N representa el primer miembro de una subclase con dominios de receptor similar a Toll-interleucina-1 en el extremo amino-terminal. El gen RPS2 representa el primer miembro de la subclase CC-NBS-LLR con cremalleras de leucina

o motivos de superhélice (CC) en el extremo amino-terminal. Esta subclase se denomina también en ocasiones no TIR.

Una tercera clase principal de genes de resistencia, la clase xLRR, consiste en los que codifican para proteínas compuestas casi en su totalidad por repeticiones ricas en leucina (LRR) que se prevé que residen en un entorno extracelular basándose en su secuencia de aminoácidos [21]. El gen Cf-9 [22] fue el primer gen clonado en esta clase. La mayoría de los genes en esta clase se han clonado a partir de tomate (genes Cf) y confieren resistencia contra el moho de las hojas Cladosporium fulvum. El gen Vf del manzano confiere resistencia a la sarna del manzano y pertenece a la clase xLRR de genes de resistencia [1].

Una cuarta clase de genes de resistencia consiste en los que codifican para proteínas con un dominio de serina/treonina proteína cinasa amino-terminal con homología con el gen Pto, un dominio LRR carboxilo-terminal con homología con los genes Cf y una región transmembrana supuesta central [38]. Estos genes tienen todas las características de una cinasa receptora transmembrana. Las cinasas receptoras están implicadas a menudo en la señalización mediada por ligando de mamíferos (por ejemplo receptores hormonales) actuando la proteína cinasa como el dominio de señalización dentro de la célula y confiriendo el LRR especificidad en el entorno extracelular [3]. El gen Xa21 del arroz es un miembro de esta clase.

Recientemente se ha clonado un pequeño número de otros genes de resistencia a enfermedades que no se ajustan

Pro-l

exactamente en una de estas cuatro clases. Estos incluyen el gen mlo [5] de la cebada, el gen Hsl[6] de la remolacha y los genes Ve [23] del tomate. El gen mlo tiene una supuesta estructura transmembrana de 7 y no

Pro-l

comparte dominios con otros genes de resistencia clonados mientras que el gen Hslcontiene LRR y el gen Ve contiene LRR, secuencias PEST, cremalleras de leucina y posibles señales para la endocitosis mediada por receptor.

La resistencia al oídio en el manzano está sujeta a heterogeneidad a niveles fenotípico, y posiblemente también genético. Normalmente, la progenie resistente no puede identificarse de manera fiable basándose en fenotipos en vivero [20] o usando el desarrollo de síntomas (macroscópicos) sobre el terreno. Debido a esto, en ocasiones no se

5 clasifica la resistencia hasta que las plantas han madurado en la huerta a lo largo de varios años [10]. Esto hace el examen de la resistencia contra este importante patógeno del manzano mediante medios tradicionales especialmente difícil y lleva mucho tiempo.

La clonación de un gen para la resistencia contra el oídio constituiría un avance significativo y tendría varias ventajas 10 con respecto a las vías de mejora genética tradicionales para obtener resistencia.

Por tanto, un objetivo de la invención es proporcionar composiciones y métodos útiles para conferir resistencia al oídio en plantas y/o al menos proporcionar al público una elección útil para este fin.

15 Sumario de la invención

En el primer aspecto, la invención proporciona un polinucleótido aislado tal como se describe en las reivindicaciones, que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 o un fragmento o una variante del mismo, en el que el fragmento o la variante confiere resistencia al oídio en una planta de Rosaceae.

20 El polipéptido o la variante pueden tener una secuencia característica de una proteína de resistencia a enfermedades de la clase no TIR, o más preferiblemente una secuencia característica de una proteína de resistencia a enfermedades de la clase CC-NBS-LRR.

25 Preferiblemente, el fragmento comprende secuencias características de un dominio de superhélice (CC) y un dominio de sitio de unión a nucleótidos (NBS) de una proteína de resistencia a enfermedades de la clase no TIR. Más preferiblemente, el fragmento comprende secuencias características de un dominio de superhélice (CC) y un dominio de sitio de unión a nucleótidos (NBS) de una proteína de resistencia a enfermedades de la clase CC-NBS-LRR.

Preferiblemente, el dominio CC está en el extremo N-terminal del polipéptido en relación con el dominio NBS.

En una realización, el fragmento comprende una secuencia con una identidad de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 6 a lo largo de toda su longitud.

35 En una realización adicional, el fragmento comprende una secuencia con una identidad de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 5 a lo largo de toda su longitud.

En una realización adicional, el fragmento comprende la secuencia de SEQ ID NO: 6.

En una realización adicional, el fragmento comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5.

En una realización adicional, la variante comprende una secuencia con una identidad de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 1 a lo largo de toda su longitud.

En una realización adicional, el polipéptido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un polinucleótido aislado tal como se describe en las reivindicaciones, que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3 o un fragmento o una variante del mismo, en el que

50 el fragmento o la variante codifica para un polipéptido que confiere resistencia al oídio en una planta de Rosaceae.

El polinucleótido o la variante pueden codificar para un polipéptido con una secuencia característica de una proteína de resistencia a enfermedades de la clase no TIR o más preferiblemente una secuencia característica de una proteína de resistencia a enfermedades de la clase CC-NBS-LRR.

55 Preferiblemente, el fragmento codifica para un polipéptido que comprende secuencias características de un dominio de superhélice (CC) y un dominio de sitio de unión a nucleótidos (NBS) de una proteína de resistencia a enfermedades de la clase no TIR. Más preferiblemente, el fragmento codifica para un polipéptido que comprende secuencias características de un dominio de superhélice (CC) y un dominio de sitio de unión a nucleótidos (NBS) de

60 una proteína de resistencia a enfermedades de la clase CC-NBS-LRR.

En una realización, el fragmento comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos el 70% con 65 respecto a SEQ ID NO: 8 a lo largo de toda su longitud.

En una realización, el fragmento comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos el 70% con respecto a SEQ ID NO: 7 a lo largo de toda su longitud. En una realización adicional, el fragmento comprende la secuencia de SEQ ID NO: 8.

En una realización adicional, el fragmento comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7. En una realización, la variante comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 3 a lo largo de toda su longitud.

En una realización adicional, el polinucleótido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3.

En una realización adicional, la variante comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 2 a lo largo de toda su longitud. En una realización adicional, el polinucleótido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2. En un aspecto adicional, la invención proporciona un polipéptido aislado tal como se describe en las

reivindicaciones, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o un fragmento o una variante del

mismo, en el que el fragmento o la variante confiere resistencia al oídio en una planta. El polipéptido o la variante pueden tener una secuencia característica de una proteína de resistencia a enfermedades de la clase no TIR o más preferiblemente una secuencia característica de una proteína de resistencia a enfermedades de la clase CC-NBS-LRR.

Preferiblemente, el fragmento comprende secuencias características de un dominio de superhélice (CC) y un dominio de sitio de unión a nucleótidos (NBS) de una proteína de resistencia a enfermedades de la clase no TIR. Más preferiblemente, el fragmento comprende secuencias características de un dominio de superhélice (CC) y un dominio de sitio de unión a nucleótidos (NBS) de una proteína de resistencia a enfermedades de la clase CC-NBS-LRR.

Preferiblemente, el dominio CC está en el extremo N-terminal en relación con el dominio NBS.

En una realización, el fragmento comprende una secuencia con una identidad de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 6 a lo largo de toda su longitud. En una realización adicional, el fragmento comprende una secuencia con una identidad de al menos el 70% con

respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 5 a lo largo de toda su longitud. En una realización adicional, el fragmento comprende la secuencia de SEQ ID NO: 6. En una realización adicional, el fragmento comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5. En una realización adicional, la variante comprende una secuencia con una identidad de al menos el 70% con

respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 1 a lo largo de toda su longitud. En una realización adicional, el polipéptido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1. En un aspecto adicional, la invención proporciona un polinucleótido aislado tal como se describe en las

reivindicaciones, que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 6 o una variante del

mismo, en el que la variante confiere resistencia al oídio en una planta de Rosaceae. El polipéptido o la variante pueden comprender secuencias características de un dominio de superhélice (CC) y un dominio de sitio de unión a nucleótidos (NBS) de una proteína de resistencia a enfermedades de la clase no TIR o más preferiblemente secuencias características de un dominio de superhélice (CC) y un dominio de sitio de unión a nucleótidos (NBS) de una proteína de resistencia a enfermedades de la clase CC-NBS-LRR.

En una realización, la variante comprende una secuencia con una identidad de al menos el 70% con respecto a la

secuencia de SEQ ID NO: 6 a lo largo de toda su longitud. En una realización adicional, la variante comprende una secuencia con una identidad de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 5 a lo largo de toda su longitud.

En una realización adicional, el polipéptido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 6. En una realización adicional, el polipéptido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5.

En una realización adicional, el polipéptido comprende una secuencia con una identidad de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 1 a lo largo de toda su longitud.

5 Preferiblemente, el polipéptido codifica para un polipéptido con secuencias características de una proteína de resistencia a enfermedades de la clase CC-NBS-LRR.

10 En un aspecto adicional, la invención proporciona un polipéptido aislado tal como se describe en las reivindicaciones, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, o una variante del mismo, en el que la variante confiere resistencia al oídio en una planta de Rosaceae.

La variante puede comprender secuencias características de un dominio de superhélice (CC) y de sitio de unión a

15 nucleótidos (NBS) de una proteína de resistencia a enfermedades de la clase no TIR o más preferiblemente el polipéptido comprende secuencias características de un dominio de superhélice (CC) y de sitio de unión a nucleótidos de una proteína de resistencia a enfermedades de la clase CC-NBS-LRR.

En una realización, la variante comprende una secuencia con una identidad de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 6 a lo largo de toda su longitud. En una realización adicional, el polipéptido comprende una secuencia con una identidad de al menos el 70% con

25 respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 5 a lo largo de toda su longitud. En una realización adicional, el polipéptido comprende una secuencia con una identidad de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 1 a lo largo de toda su longitud.

30 Preferiblemente, el polipéptido comprende secuencias características de una proteína de resistencia a enfermedades de la clase CC-NBS-LRR. En una realización adicional, el polipéptido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 6. 35 En una realización adicional, el polipéptido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5. En una realización adicional, el polipéptido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1. En un aspecto adicional, la invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica para un polipéptido de la 40 invención. En un aspecto adicional, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende: a) un polinucleótido que comprende un fragmento, de al menos 15 nucleótidos de longitud, de un polinucleótido de la

45 invención; b) un polinucleótido que comprende un complemento, de al menos 15 nucleótidos de longitud, del polinucleótido de la invención; o

50 c) un polinucleótido que comprende una secuencia, de al menos 15 nucleótidos de longitud, que puede hibridarse

con el polinucleótido de la invención en condiciones de hibridación rigurosas. En un aspecto adicional, la invención proporciona un constructo genético que comprende un polinucleótido de la invención.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un constructo de expresión que comprende un polinucleótido de la invención.

En el presente documento se describe un constructo de ARNi que comprende un polinucleótido de la invención.

En el presente documento se describe un vector que comprende un constructo de expresión, constructo genético o constructo de ARNi de la invención.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una célula huésped que comprende un constructo de expresión o 65 constructo genético de la invención.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una célula huésped modificada genéticamente para expresar un polinucleótido o un polipéptido de la invención.

Preferiblemente, la célula huésped se modifica genéticamente para expresar un polinucleótido que codifica para un polipéptido que confiere resistencia al oídio en una planta.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una célula vegetal que comprende un constructo de expresión o constructo genético de la invención.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una célula vegetal modificada genéticamente para expresar un polinucleótido de la invención o un polipéptido de la invención.

Preferiblemente, la célula vegetal se modifica genéticamente para expresar un polinucleótido que codifica para un polipéptido que confiere resistencia al oídio en una planta.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una planta que comprende una célula vegetal de la invención.

Preferiblemente, la planta tiene resistencia al oídio aumentada.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para producir una célula vegetal o una planta con resistencia al oídio aumentada tal como se describe en las reivindicaciones, comprendiendo el método la transformación de una célula vegetal o una planta con un polinucleótido que codifica para un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o un fragmento o una variante del mismo, en el que el fragmento o la variante confiere resistencia al oídio en una planta de Rosaceae.

Preferiblemente, el polipéptido tiene una secuencia característica de una proteína de resistencia a enfermedades de la clase CC-NBS-LRR.

Preferiblemente, el fragmento comprende secuencias características de un dominio de superhélice (CC) y un dominio de sitio de unión a nucleótidos (NBS) de una proteína de resistencia a enfermedades de la clase no TIR. Más preferiblemente, el polipéptido comprende secuencias características de un dominio de superhélice (CC) y de sitio de unión a nucleótidos de una proteína de resistencia a enfermedades de la clase CC-NBS-LRR.

En una realización adicional, el fragmento comprende una secuencia con una identidad de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 5 a lo largo de toda su longitud.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para producir una célula vegetal o una planta con resistencia al oídio aumentada tal como se describe en las reivindicaciones, comprendiendo el método la transformación de una célula vegetal o una planta con un polinucleótido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3 o un fragmento o una variante del mismo, en el que el fragmento o la variante codifica para una proteína que confiere resistencia al oídio en una planta de Rosaceae.

En una realización, el fragmento comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos el 70% con respecto a SEQ ID NO: 8 a lo largo de toda su longitud.

En una realización, el fragmento comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos el 70% con respecto a SEQ ID NO: 7 a lo largo de toda su longitud.

En una realización adicional, el fragmento comprende la secuencia de SEQ ID NO: 8.

En una realización adicional, el fragmento comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7.

En una realización, la variante comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 3 a lo largo de toda su longitud.

En una realización adicional, la variante comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 2 a lo largo de toda su longitud.

En una realización adicional, el polinucleótido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para producir una célula vegetal o una planta con resistencia al oídio aumentada tal como se describe en las reivindicaciones, comprendiendo el método la transformación de una célula vegetal o una planta con un polinucleótido que codifica para un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o una variante del mismo, en el que la variante confiere resistencia al oídio en una planta de Rosaceae.

Preferiblemente, la variante comprende una secuencia característica de un dominio de superhélice (CC) y un dominio de sitio de unión a nucleótidos (NBS) de una proteína de resistencia a enfermedades de la clase CC-NBS-LRR.

En una realización, la variante comprende una secuencia con una identidad de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 6 a lo largo de toda su longitud.

En una realización adicional, el polipéptido comprende una secuencia con una identidad de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 5 a lo largo de toda su longitud.

En una realización adicional, el polipéptido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 6.

En una realización adicional, el polipéptido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5.

Preferiblemente, la variante codifica para un polipéptido con secuencias características de una proteína de resistencia a enfermedades de la clase CC-NBS-LRR.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para producir una célula vegetal o una planta con resistencia al oídio aumentada tal como se describe en las reivindicaciones, comprendiendo el método la transformación de una célula vegetal o una planta con un polinucleótido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 8 o una variante del mismo, en el que la variante codifica para un polipéptido que confiere resistencia al oídio en una planta de Rosaceae.

Preferiblemente, el polipéptido comprende secuencias características de un dominio de superhélice (CC) y un dominio de sitio de unión a nucleótidos (NBS) de una proteína de resistencia a enfermedades de la clase CC-NBS-LRR.

Preferiblemente, el dominio CC está en el extremo N-terminal de la proteína en relación con el dominio NBS.

En una realización, la variante comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 8 a lo largo de toda su longitud.

En una realización, el polinucleótido comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 7 a lo largo de toda su longitud.

En una realización, el polinucleótido comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 1 a lo largo de toda su longitud.

En una realización, el polinucleótido comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 2 a lo largo de toda su longitud.

En una realización, la variante comprende la secuencia de SEQ ID NO: 8.

En una realización, el polinucleótido comprende la secuencia de SEQ. ID NO: 7.

En una realización, el polinucleótido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1. En una realización, el polinucleótido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2. En el presente documento también se describe un método para seleccionar una planta con resistencia al oídio

aumentada, comprendiendo el método someter a prueba una planta para determinar la expresión alterada de un

polinucleótido de la invención. En el presente documento también se describe un método para seleccionar una planta con resistencia al oídio aumentada, comprendiendo el método someter a prueba una planta para determinar la expresión alterada de un polipéptido de la invención.

En el presente documento también se describe una célula vegetal o una planta producida mediante el método de la invención. Preferiblemente, la planta se modifica genéticamente para incluir un polinucleótido o un polipéptido de la invención.

En el presente documento también se describe un grupo de plantas seleccionadas mediante el método de la

invención. En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo producido frente a un polipéptido de la invención tal como se describe en las reivindicaciones.

Los polinucleótidos y las variantes de polinucleótidos de la invención pueden derivarse de cualquier especie. Los polinucleótidos y las variantes también pueden producirse de manera recombinante y también pueden ser los productos de enfoques de “transposiciones genéticas”.

El polinucleótido o la variante puede derivarse de una especie de planta. El polinucleótido o la variante puede derivarse de una especie de planta gimnosperma. El polinucleótido o la variante puede derivarse de una especie de planta angiosperma. El polinucleótido o la variante puede derivarse de una especie de planta monocotiledónea. El polinucleótido o la variante puede derivarse de una especie de planta dicotiledónea. Los polipéptidos y las variantes de polipéptidos de la invención pueden derivarse de cualquier especie. Los

polipéptidos y las variantes también pueden producirse de manera recombinante y también pueden expresarse a partir de los productos de enfoques de “transposiciones genéticas”. Los polipéptidos o las variantes de la invención pueden derivarse de especies de plantas. Los polipéptidos o las variantes de la invención pueden derivarse de especies de plantas gimnospermas. Los polipéptidos o las variantes de la invención pueden derivarse de especies de plantas angiospermas. Los polipéptidos o las variantes de la invención pueden derivarse de especies de plantas monocotiledóneas.

Los polipéptidos o las variantes de la invención pueden derivarse de especies de plantas dicotiledóneas. Las células vegetales y las plantas de la invención, incluyendo aquéllas de las que pueden derivarse polinucleótidos, polinucleótidos variantes, polipéptidos y polipéptidos variantes, e incluyendo células vegetales y plantas que van a transformase o seleccionarse, pueden ser de cualquier especie.

Las células vegetales y las plantas pueden ser de especies de gimnospermas. Las células vegetales y las plantas pueden ser de una especie de angiosperma. Las células vegetales y las plantas pueden ser de una especie de dicotiledónea. Las células vegetales y las plantas pueden ser de una especie frutal seleccionada de un grupo que comprende pero

no se limita a los siguientes géneros: Actinidia, Malus, Citrus, Fragaria, Vaccinium, Pyrus, Prunus, Rosa, Fragaria, Rubus, Cydonia Eriobotya, Mespilus, Photinia, Pyracantha, Sorbus, Humus, Ficus, Morus, Ulmus, Cucumus, Cucurbita, Arachis, Cicer, Lupinus, Cyamopsis, Lotus, Glycine, Phaseolus, Vigna, Medicago, Trifolium, Pisum, Vicia, Betula, Fagus, Juglans, Ricinus, Manihot, Hevea, Euphorbia, Saliceae.

Especies de plantas frutales particularmente preferidas son: Actidinia deliciosa, A. chinensis, A. eriantha, A. arguta, híbridos de las cuatro especies de Actinidia, Malus domestica, Malus zumi, Malus sylvestris, Malus sieversii y Malus sieboldii.

La familia de plantas más preferida es la Rosaceae.

El género más preferido es Malus.

10 Las especies de Malus más preferidas son Malus zumi y Malus domestica.

Las células vegetales y las plantas pueden ser de una especie de planta seleccionada de un grupo que comprende pero no se limita a los siguientes géneros: Brassica, Lycopersicon y Solanum.

15 Especies de plantas vegetales particularmente preferidas son: Lycopersicon esculentum y Solanum tuberosum.

Las células vegetales y las plantas de la invención pueden ser de especies monocotiledóneas.

Las células vegetales y las plantas pueden ser de una especie de cultivo seleccionada de un grupo que comprende 20 pero no se limita a los siguientes géneros: Glycine, Zea, Hordeum y Oryza.

Especies de plantas de cultivo particularmente preferidas son: Oryza sativa, Glycine max y Zea mays.

Descripción detallada

25 En esta memoria descriptiva cuando se ha hecho referencia a memorias descriptivas de patentes, otros documentos externos u otras fuentes de información, es generalmente para el fin de proporcionar un contexto para comentar las características de la invención. A menos que se indique específicamente lo contrario, no debe considerarse la referencia a tales documentos externos como una admisión de que tales documentos, o tales fuentes de

30 información, en cualquier jurisdicción, sean técnica anterior, o formen parte del conocimiento general común en la técnica.

El término “que comprende” tal como se usa en esta memoria descriptiva significa “que consiste al menos en parte en”. Cuando se interpreta cada afirmación en esta memoria descriptiva que incluye el término “que comprende”,

35 también pueden estar presentes características distintas a aquélla o aquéllas precedidas por el término. Términos relacionados tales como “comprender” y “comprende” deben interpretarse de la misma manera.

Polinucleótidos y fragmentos

40 El término “polinucleótido(s),” tal como se usa en el presente documento, significa un polímero de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos mono o bicatenario de cualquier longitud pero preferiblemente de al menos 15 nucleótidos, e incluye como ejemplos no limitativos, secuencias codificantes y no codificantes de un gen, complementos de secuencias sentido y antisentido, exones, intrones, ADN genómico, ADNc, pre-ARNm, ARNm, ARNr, ARNip, ARNim, ARNt, ribozimas, polipéptidos recombinantes, secuencias de ADN o ARN que se producen de

45 manera natural aisladas y purificadas, secuencias de ARN y ADN sintéticas, sondas de ácido nucleico, cebadores y fragmentos.

Un “fragmento” de una secuencia de polinucleótido proporcionado en el presente documento es una subsecuencia de la secuencia de polinucleótido que consiste en un tramo contiguo de nucleótidos de la secuencia de

50 polinucleótido, por ejemplo, una secuencia que tiene al menos 15 nucleótidos de longitud. Los fragmentos de la invención comprenden preferiblemente al menos 15 nucleótidos, preferiblemente al menos 20 nucleótidos, más preferiblemente al menos 30 nucleótidos, más preferiblemente al menos 50 nucleótidos, más preferiblemente al menos 50 nucleótidos y lo más preferiblemente al menos 60 nucleótidos de nucleótidos contiguos de un polinucleótido de la invención. Un fragmento de una secuencia de polinucleótido puede usarse en tecnología

55 antisentido, de silenciamiento génico, de triple hélice o de ribozimas, o como cebador, sonda, incluido en una micromatriz, o usado en métodos de selección basados en polinucleótido de la invención.

El término “cebador” se refiere a un polinucleótido corto, que tiene habitualmente un grupo 3’OH libre, que se hibrida con un molde y se usa para cebar la polimerización de un polinucleótido complementario a la diana.

60 El término “sonda” se refiere a un polinucleótido corto que se usa para detectar una secuencia de polinucleótido, que es complementaria a la sonda, en un ensayo basado en hibridación. La sonda puede consistir en un “fragmento” de un polinucleótido tal como se define en el presente documento.

65 Polipéptidos y fragmentos

El término “polipéptido”, tal como se usa en el presente documento, abarca cadenas de aminoácidos de cualquier longitud pero preferiblemente de al menos 5 aminoácidos, incluyendo proteínas de longitud completa, en las que los residuos de aminoácido están unidos mediante enlaces peptídicos covalentes. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser productos naturales purificados, o pueden producirse parcial o completamente usando técnicas recombinantes o sintéticas. El término puede referirse a un polipéptido, un agregado de un polipéptido tal como un dímero u otro multímero, un polipéptido de fusión, un fragmento de polipéptido, una variante de polipéptido,

o derivados de los mismos.

Un “fragmento” de un polipéptido es una subsecuencia del polipéptido más largo, que consiste en un tramo continuo de aminoácidos del polipéptido más largo, que realiza una función que se requiere para la actividad biológica y/o proporciona la estructura tridimensional del polipéptido más largo. El término puede referirse a un polipéptido, un agregado de un polipéptido tal como un dímero u otro multímero, un polipéptido de fusión, un fragmento de polipéptido, una variante de polipéptido, o derivado de los mismos que puede realizar la actividad enzimática anterior.

El término “aislado” tal como se aplica a las secuencias de polinucleótido o de polipéptido dadas a conocer en el presente documento se usa para referirse a secuencias que se retiran de su entorno celular natural. Una molécula aislada puede obtenerse mediante cualquier método o combinación de métodos incluyendo técnicas bioquímicas, recombinantes y sintéticas.

El término “recombinante” se refiere a una secuencia de polinucleótido que se retira de las secuencias que la rodean en su contexto natural y/o se recombina con secuencias que no están presentes en su contexto natural.

Una secuencia de polipéptido “recombinante” se produce mediante traducción a partir de una secuencia de polinucleótido “recombinante”.

El término “derivado de” con respecto a polinucleótidos o polipéptidos de la invención que se derivan de un género o una especie particular, significa que el polinucleótido o el polipéptido tiene la misma secuencia que un polinucleótido

o un polipéptido encontrado de manera natural en ese género o especie. El polinucleótido o el polipéptido, derivado de un género o una especie particular, puede producirse por tanto de manera sintética o recombinante.

Variantes

Tal como se usa en el presente documento, el término “variante” se refiere a secuencias de polinucleótido o de polipéptido diferentes de las secuencias identificadas específicamente, en las que se delecionan, sustituyen o añaden uno o más nucleótidos o residuos de aminoácido. Las variantes pueden ser variantes alélicas que se producen de manera natural, o variantes que no se producen de manera natural. Las variantes pueden ser de la misma especie o de especies diferentes y pueden abarcar homólogos, parálogos y ortólogos. Las variantes también pueden ser recombinantes que se producen de manera natural o que no se producen de manera natural entre alelos de estos homólogos, parálogos y ortólogos. En determinadas realizaciones, las variantes de los polipéptidos y polipéptidos de la invención presentan actividades biológicas que son iguales o similares a las de los polipéptidos o polipéptidos de la invención. El término “variante” con referencia a polipéptidos y polipéptidos abarca todas las formas de polipéptidos y polipéptidos tal como se define en el presente documento.

Variantes de polinucleótido

Las secuencias de polinucleótido variantes presentan una identidad preferiblemente de al menos el 70%, más preferiblemente de al menos el 71%, más preferiblemente de al menos el 72%, más preferiblemente de al menos el 73%, más preferiblemente de al menos el 74%, más preferiblemente de al menos el 75%, más preferiblemente de al menos el 76%, más preferiblemente de al menos el 77%, más preferiblemente de al menos el 78%, más preferiblemente de al menos el 79%, más preferiblemente de al menos el 80%, más preferiblemente de al menos el 81%, más preferiblemente de al menos el 82%, más preferiblemente de al menos el 83%, más preferiblemente de al menos el 84%, más preferiblemente de al menos el 85%, más preferiblemente de al menos el 86%, más preferiblemente de al menos el 87%, más preferiblemente de al menos el 88%, más preferiblemente de al menos el 89%, más preferiblemente de al menos el 90%, más preferiblemente de al menos el 91%, más preferiblemente de al menos el 92%, más preferiblemente de al menos el 93%, más preferiblemente de al menos el 94%, más preferiblemente de al menos el 95%, más preferiblemente de al menos el 96%, más preferiblemente de al menos el 97%, más preferiblemente de al menos el 98% y lo más preferiblemente de al menos el 99% con respecto a una secuencia de la presente invención. La identidad se encuentra a lo largo de la longitud completa de un polinucleótido de la invención.

La identidad de secuencia de polinucleótido puede determinarse de la siguiente manera. La secuencia de polinucleótido objetivo se compara con una secuencia de polinucleótido candidato usando BLASTN (del conjunto de programas BLAST, versión 2.2.5 [nov. de 2002]) en b12seq (Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), “Blast 2 sequences -a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250), que está disponible para el público en NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/). Se utilizan los parámetros por defecto de

b12seq excepto porque debe desactivarse el filtrado de partes de complejidad baja.

La identidad de secuencia de polinucleótido puede examinarse usando los siguientes parámetros de línea de comandos Unix:

b12seq -i nucleotideseq 1 -j nucleotideseq2 -F F -p blastn

El parámetro -F F desactiva el filtrado de secciones de baja complejidad. El parámetro -p selecciona el algoritmo apropiado para el par de secuencias. El programa b12seq notifica la identidad de secuencia tanto como el número como el porcentaje de nucleótidos idénticos en una línea “Identities = ”.

La identidad de secuencia de polinucleótido también puede calcularse a lo largo de toda la longitud de la superposición entre secuencias de polinucleótido candidato y objetivo usando programas de alineación global de secuencias (por ejemplo Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). Una implementación completa del algoritmo de alineación global de Needleman-Wunsch se encuentra en el programa Needle en el paquete EMBOSS (Rice, P. Longden, I. y Bleasby, A. EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Trends in Genetics, junio de 2000, vol 16, n.º 6. págs. 276-277) que puede obtenerse de http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/. El servidor del European Bioinformatics Institute también proporciona la infraestructura para realizar alineaciones globales mediante EMBOSS-needle entre dos secuencias en línea en http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/.

Alternativamente, puede usarse el programa GAP que calcula una alineación global óptima de dos secuencias sin penalizar huecos terminales. GAP se describe en el siguiente artículo: Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235.

Un método preferido para calcular el % de identidad de secuencia de polinucleótido se basa en alinear secuencias que van a compararse usando Clustal X (Jeanmougin et al., 1998, Trends Biochem. Sci. 23, 403-5).

Las variantes de polinucleótido de la presente invención también abarcan aquéllas que presentan una similitud con una o más de las secuencias identificadas específicamente que es probable que conserven la equivalencia funcional de aquellas secuencias y que, de manera razonable, no podría esperarse que se produjesen por azar. Tal similitud de secuencia con respecto a polipéptidos puede determinarse usando el programa b12seq disponible para el público del conjunto de programas BLAST (versión 2.2.5 [nov. de 2002]) de NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/).

La similitud de secuencias de polinucleótido puede examinarse usando los siguientes parámetros de línea de comandos Unix:

b12seq -i nucleotideseq 1 -j nucleotideseq2 -F F -p tblastx

El parámetro -F F desactiva el filtrado de secciones de baja complejidad. El parámetro -p selecciona el algoritmo apropiado para el par de secuencias. Este programa encuentra regiones de similitud entre las secuencias y para cada una de tales regiones notifica un “valor E” que es el número de veces esperado que podría esperarse observar una coincidencia de este tipo por casualidad en una base de datos de un tamaño de referencia fijo que contiene secuencias al azar. El tamaño de esta base de datos se ajusta por defecto en el programa b12seq. Para valores de E pequeños, mucho menores que uno, el valor E es aproximadamente la probabilidad de una coincidencia al azar de este tipo.

Las secuencias de polinucleótido variantes presentan preferiblemente un valor E de menos de 1 x 10-6 más

-9-12

preferiblemente de menos de 1 x 10, más preferiblemente de menos de 1 x 10, más preferiblemente de menos

-15 -18 -21

de 1 x 10, más preferiblemente de menos de 1 x 10, más preferiblemente de menos de 1 x 10, más

-30-40

-50 -60 -70

-80 -90

preferiblemente de menos de 1 x 10más preferiblemente de menos de 1 x 10y lo más preferiblemente de menos de 1 x 10-100 en comparación con una cualquiera de las secuencias identificadas específicamente.

Alternativamente, los polinucleótidos variantes de la presente invención se hibridan con las secuencias de polinucleótido especificadas, o complementos de las mismas en condiciones rigurosas.

El término “se hibridan en condiciones rigurosas”, y equivalentes gramaticales del mismo, se refiere a la capacidad de una molécula de polinucleótido para hibridarse con una molécula de polinucleótido diana (tal como una molécula de polinucleótido diana inmovilizada en una transferencia de ADN o ARN, tal como una transferencia de tipo Southern o transferencia de tipo Northern) en condiciones definidas de temperatura y de concentración de sal. La capacidad para hibridarse en condiciones de hibridación rigurosas puede determinarse hibridando inicialmente en condiciones menos rigurosas, luego aumentando la rigurosidad hasta la rigurosidad deseada.

Con respecto a moléculas de polinucleótido mayores de aproximadamente 100 bases de longitud, las condiciones

de hibridación rigurosas típicas son de no más de 25 a 30ºC (por ejemplo, de 10ºC) por debajo la temperatura de fusión (Tm) del dúplex nativo (véase generalmente, Sambrook et al., Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Ed. Cold Spring Harbor Press; Ausubel et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing,). La Tm para moléculas de polinucleótido mayores de aproximadamente 100 bases puede calcularse mediante la fórmula Tm = 81,5 + 0,41% (G + C-log (Na+). (Sambrook et al., Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Ed. Cold Spring Harbor Press; Bolton y McCarthy, 1962, PNAS 84:1390). Condiciones rigurosas típicas para polinucleótidos de más de 100 bases de longitud serían condiciones de hibridación tales como prelavado en una disolución de SSC 6 X, SDS al 0,2%; hibridación a 65ºC, SSC 6 X, SDS al 0,2% durante la noche; seguido por dos lavados de 30 minutos cada uno en SSC 1 X, SDS al 0,1% a 65º C y dos lavados de 30 minutos cada uno en SSC 0,2 X, SDS al 0,1% a 65ºC.

Con respecto a moléculas de polinucleótido que tienen una longitud de menos de 100 bases, condiciones de hibridación rigurosas a modo de ejemplo son de 5 a 10ºC por debajo de Tm. En promedio, la Tm de un molécula de polinucleótido de longitud de menos 100 pb se reduce en aproximadamente (500/longitud de oligonucleótido)ºC.

Con respecto a los imitadores de ADN conocidos como ácidos peptidonucleicos (APN) (Nielsen et al., Science. 6 de diciembre de 1991; 254(5037):1497-500) los valores de Tm son más altos que aquéllos para híbridos de ADN-ADN o ADN-ARN, y pueden calcularse usando la fórmula descrita en Giesen et al., Nucleic Acids Res. 1 de nov. de 1998; 26(21):5004-6. Condiciones de hibridación rigurosas a modo de ejemplo para un híbrido de ADN-APN que tiene una longitud de menos de 100 bases son de 5 a 10ºC por debajo de la Tm.

Polinucleótidos variantes de la presente invención también abarcan polinucleótidos que difieren de las secuencias de la invención pero que, como consecuencia de la degeneración del código genético, codifican para un polipéptido que tiene actividad similar a un polipéptido codificado por un polinucleótido de la presente invención. Una alteración de secuencia que no cambia la secuencia de aminoácidos del polipéptido es una “variación silenciosa”. Excepto para ATG (metionina) y TGG (triptófano), pueden cambiarse otros codones para el mismo aminoácido mediante técnicas reconocidas en la técnica, por ejemplo, para optimizar la expresión de codones en un organismo huésped particular.

También se incluyen en la invención alteraciones en la secuencia de polinucleótido que dan como resultado sustituciones conservativas de uno o varios aminoácidos en la secuencia de polipéptido codificada sin alterar significativamente su actividad biológica. Un experto en la técnica conocerá métodos para preparar sustituciones de aminoácido fenotípicamente silenciosas (véase, por ejemplo, Bowie et al., 1990, Science 247, 1306).

Pueden determinarse polinucleótidos variantes debidos a variaciones silenciosas y sustituciones conservativas en la secuencia de polipéptido codificada usando el programa b12seq disponible para el público del conjunto de programas BLAST (versión 2.2.5 [nov. de 2002]) de NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/) mediante el algoritmo tblastx tal como se describió anteriormente.

Variantes de polipéptido

El término “variante” con referencia a polipéptidos abarca polipéptidos que se producen de manera natural, producidos de manera recombinante y de manera sintética. Las secuencias de polinucleótido variantes presentan una identidad preferiblemente de al menos el 70%, más preferiblemente de al menos el 71%, más preferiblemente de al menos el 72%, más preferiblemente de al menos el 73%, más preferiblemente de al menos el 74%, más preferiblemente de al menos el 75%, más preferiblemente de al menos el 76%, más preferiblemente de al menos el 77%, más preferiblemente de al menos el 78%, más preferiblemente de al menos el 79%, más preferiblemente de al menos el 80%, más preferiblemente de al menos el 81%, más preferiblemente de al menos el 82%, más preferiblemente de al menos el 83%, más preferiblemente de al menos el 84%, más preferiblemente de al menos el 85%, más preferiblemente de al menos el 86%, más preferiblemente de al menos el 87%, más preferiblemente de al menos el 88%, más preferiblemente de al menos el 89%, más preferiblemente de al menos el 90%, más preferiblemente de al menos el 91%, más preferiblemente de al menos el 92%, más preferiblemente de al menos el 93%, más preferiblemente de al menos el 94%, más preferiblemente de al menos el 95%, más preferiblemente de al menos el 96%, más preferiblemente de al menos el 97%, más preferiblemente de al menos el 98% y lo más preferiblemente de al menos el 99% con respecto a una secuencia de la presente invención. La identidad se encuentra lo más preferiblemente a lo largo de la longitud completa de un polinucleótido de la invención.

La identidad de secuencia de polipéptido puede determinarse de la siguiente manera. La secuencia de polipéptido objetivo se compara con una secuencia de polipéptido candidato usando BLASTP (del conjunto de programas BLAST, versión 2.2.5 [nov. de 2002]) en b12seq, que está disponible para el público en NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/). Se utilizan los parámetros por defecto de b12seq excepto porque debe desactivarse el filtrado de regiones de complejidad baja.

También puede calcularse la identidad de la secuencia de polipéptido a lo largo de la longitud completa del solapamiento entre secuencias de polinucleótido candidato y objetivo usando programas de alineación global de secuencias. Tal como se mencionó anteriormente EMBOSS-needle (disponible en http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/) y GAP (Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications

in the Biosciences 10, 227-235.) también son programas de alineación global de secuencias adecuados para calcular la identidad de la secuencia de polipéptido.

Un método preferido para calcular % de identidad de secuencia de polipéptido se basa en alinear secuencias que van a compararse usando Clustal X (Jeanmougin et al., 1998, Trends Biochem. Sci. 23, 403-5.)

Las variantes de polipéptido de la presente invención también abarcan aquéllas que presentan una similitud con una

o más de las secuencias identificadas específicamente que es probable que conserven la equivalencia funcional de aquellas secuencias y que, de manera razonable, no podría esperarse que se produjesen por azar. Tal similitud de secuencia con respecto a polipéptidos puede determinarse usando el programa b12seq disponible para el público del conjunto de programas BLAST (versión 2.2.5 [nov. de 2002]) de NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/). La similitud de secuencias de polipéptido puede examinarse usando los siguientes parámetros de línea de comandos Unix:

bl2seq -i peptideseq1 -j peptideseq2 -F F -p blastp

Las secuencias de polipéptido variantes presentan preferiblemente un valor E de menos de 1 x 10-6 más

-9-12

-15 -18 -21

-30-40

-50 -60 -70

-80-90

preferiblemente de menos de 1 x 10, más preferiblemente de menos de 1 x 10y lo más preferiblemente de 1 x 10-100 en comparación con una cualquiera de las secuencias identificadas específicamente.

El parámetro -F F desactiva el filtrado de secciones de baja complejidad. El parámetro -p selecciona el algoritmo apropiado para el par de secuencias. El programa encuentra regiones de similitud entre las secuencias y para cada una de tales regiones notifica un “valor E” que es el número de veces esperado que podría esperarse observar una coincidencia de este tipo por casualidad en una base de datos de un tamaño de referencia fijo que contiene secuencias al azar. Para valores de E pequeños, mucho menores que uno, éste es aproximadamente la probabilidad de una coincidencia al azar de este tipo.

También se incluyen en la invención sustituciones conservativas de uno o varios aminoácidos de una secuencia de polipéptido descrita sin alterar significativamente su actividad biológica. Un experto en la técnica conocerá métodos para preparar sustituciones de aminoácido fenotípicamente silenciosas (véase, por ejemplo, Bowie et al., 1990, Science 247, 1306).

La función de una variante de polipéptido para conferir resistencia al oídio puede evaluarse mediante los métodos descritos en la sección de ejemplos en el presente documento.

Constructos, vectores y componentes de los mismos

El término “constructo genético” se refiere a una molécula de polinucleótido, habitualmente ADN bicatenario, que puede tener insertada en la misma, otra molécula de polinucleótido (la molécula de polinucleótido inserto) tal como, pero sin limitarse a, una molécula de ADNc o una molécula derivada de la región de ADN genómico que cubre, pero no se restringe a, el marco de lectura abierto y cualquier intrón y exón dentro de esa región. Un constructo genético puede contener los elementos necesarios que permiten transcribir la molécula de polinucleótido inserto, y, opcionalmente, traducir el transcrito en un polipéptido. La molécula de polinucleótido inserto puede derivarse de la célula huésped, o puede derivarse de una célula o un organismo diferente y/o puede ser un polinucleótido recombinante. Una vez dentro de la célula huésped, el constructo genético puede llegar a integrarse en el ADN cromosómico del huésped o expresarse de manera transitoria. El constructo genético puede unirse a un vector.

El término “vector” se refiere a una molécula de polinucleótido, habitualmente ADN bicatenario, que se usa para transportar el constructo genético al interior de una célula huésped. El vector puede ser capaz de replicarse en al menos un sistema huésped adicional, tal como E. coli.

El término “constructo de expresión” se refiere a un constructo genético que incluye los elementos necesarios que permiten transcribir la molécula de polinucleótido inserto, y, opcionalmente, traducir el transcrito en un polipéptido. Un constructo de expresión normalmente comprende en una dirección de 5’ a 3’:

a) un promotor funcional en la célula huésped en la que va a transformarse el constructo,

b) el polinucleótido que va a expresarse, y

c) un terminador funcional en la célula huésped en la que va a transformarse el constructo.

El término “región codificante” o “marco de lectura abierto” (ORF) se refiere a la hebra sentido de una secuencia de ADN genómico o una secuencia de ADNc que puede producir un producto de transcripción y/o un polipéptido bajo el

control de secuencias reguladoras apropiadas. La secuencia codificante se identifica por la presencia de un codón de inicio de la traducción en 5’ y un codón de terminación de la traducción en 3’. Cuando se inserta en un constructo genético, una “secuencia codificante” puede expresarse cuando se une operativamente a secuencias promotoras y terminadoras.

“Unido operativamente” significa que la secuencia que va a expresarse se sitúa bajo el control de elementos reguladores que incluyen promotores, elementos reguladores específicos de tejido, elementos reguladores temporales, potenciadores, represores y terminadores.

10 El término “región no codificante” se refiere a secuencias no traducidas que están aguas arriba del sitio de inicio de la traducción y aguas abajo del sitio de terminación de la traducción. Estas secuencias también se denominan respectivamente la 5’ UTR y la 3’ UTR. Estas regiones incluyen elementos requeridos para el inicio y la terminación de la transcripción y para la regulación de la eficacia de la traducción.

15 Los terminadores son secuencias que terminan la transcripción y se encuentran en los extremos no traducidos en 3’ de genes aguas abajo de la secuencia traducida. Los terminadores son determinantes importantes de la estabilidad de ARNm y en algunos casos se ha encontrado que tienen funciones reguladoras espaciales.

El término “promotor” se refiere a elementos cis-reguladores no transcritos aguas arriba de la región codificante que

20 regulan la transcripción génica. Los promotores comprenden elementos cis-iniciadores que especifican el sitio de inicio de la transcripción y pueden incluir cajas conservadas tales como la caja TATA, y motivos que se unen mediante factores de transcripción.

Un “transgén” es un polinucleótido que se extrae de un organismo y se introduce en un organismo diferente

25 mediante transformación. El transgén puede derivarse de la misma especie o de una especie diferente que la especie del organismo en el que se introduce en transgén.

Una “repetición invertida” es una secuencia que se repite, en la que la segunda mitad de la repetición está en la hebra complementaria, por ejemplo,

(5’)GATCTA.......TAGATC(3’)

(3’)CTAGAT.......ATCTAG(5’)

35 La transcripción de ultralectura producirá un transcrito que experimenta un apareamiento de bases complementarias para formar una estructura en horquilla siempre que haya un espaciador de 3-5 pb entre las regiones repetidas.

Células huésped

40 Las células huésped pueden derivarse de, por ejemplo, organismos bacterianos, fúngicos, insectos, de mamífero o vegetales.

Una “planta transgénica” se refiere a una planta que contiene material genético nuevo como resultado de manipulación o transformación genética. El material genético nuevo puede derivarse de una planta de la misma

45 especie que la planta transgénica resultante o de una especie diferente.

Los solicitantes han identificado un gen novedoso (SEQ ID NO: 2) que codifica para un polipéptido novedoso (SEQ ID NO: 1) que confiere resistencia al oídio a una planta. La SEQ ID NO: 3 muestra el ADNc/marco de lectura abierto que codifica para el polipéptido novedoso de SEQ ID NO: 1.

50 Los solicitantes también han mostrado que una secuencia de polinucleótido que codifica para un polipéptido truncado que comprende sólo el dominio de superhélice (CC) y el dominio de sitio de unión a nucleótidos (NBS) es suficiente para conferir resistencia al oídio a una planta.

55 La invención proporciona constructos genéticos, vectores que comprenden los polinucleótidos, incluyendo polinucleótidos codificados por el polipéptido truncado. La invención proporciona células huésped, células vegetales y plantas modificadas genéticamente que contienen las secuencias de polinucleótido, constructos genéticos y vectores novedosos. La invención también proporciona plantas que comprenden las células vegetales de la invención.

60 La invención proporciona plantas con resistencia al oídio alterada, en relación con plantas control adecuadas. La invención proporciona plantas con resistencia al oídio aumentada.

La invención también proporciona métodos para la producción de tales plantas, y métodos de selección de tales 65 plantas.

El término “oídio” tal como se usa en el presente documento se refiere a la enfermedad conocida comúnmente de varias especies de plantas provocada por organismos seleccionados de, pero sin limitarse a, los siguientes géneros

Podosphaera, Blumeria, Arthrocladiella, Brasiliomyces, Caespitotheca, Cystotheca, Erysiphe, Golovinomyces, Leveillula, Microsphaera, Neoerysiphe, Oidiopsis, Oidium, Ovulariopsis, Parauncinula, Phyllactinia, Pleochaeta, Reticuloidium, Sawadaea, Sphaerotheca, Typhulochaeta y Uncinula.

Preferiblemente, el patógeno causante es del género Podosphaera.

Preferiblemente, el patógeno causante es de la especie Podosphaera leucotricha.

El término “resistencia al oídio aumentada” significa que las plantas de la invención, o plantas producidas o seleccionadas mediante los métodos de la invención muestran una reducción de los síntomas de infección por oídio, cuando se exponen a patógenos causantes, con respecto a plantas control en las mismas condiciones.

Las plantas control adecuadas incluyen plantas no transformadas de la misma especie o variedad o plantas transformadas con constructos control, tales como, por ejemplo, constructos de vector vacío.

Con respecto a los métodos de selección de la invención, las plantas control adecuadas incluyen miembros no seleccionados de la población de la que se seleccionan las plantas seleccionadas.

Métodos para aislar o producir polinucleótidos

Las moléculas de polinucleótido de la invención pueden aislarse usando una variedad de técnicas conocidas por los expertos habituales en la técnica. A modo de ejemplo, tales polipéptidos pueden aislarse mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) descrito en Mullis et al., Eds. 1994 The Polymerase Chain Reaction, Birkhauser. Los polipéptidos de la invención pueden amplificarse usando cebadores, tal como se define en el presente documento, derivados de las secuencias de polinucleótido de la invención.

Métodos adicionales para aislar polinucleótidos de la invención incluyen el uso de todos, o partes de, los polipéptidos que tienen la secuencia expuesta en el presente documento como sondas de hibridación. La técnica de hibridar sondas de polinucleótido marcadas con polinucleótidos inmovilizados sobre soportes sólidos tales como filtros de nitrocelulosa o membranas de nailon, puede usarse para examinar una biblioteca genómica o de ADNc. Condiciones de hibridación y lavado a modo de ejemplo son: hibridación durante 20 horas a 65ºC en SSC 5,0 X, dodecilsulfato de sodio al 0,5%, solución de Denhardt 1 X; lavado (tres lavados de veinte minutos cada uno a 55ºC) en SSC 1,0 X, dodecilsulfato de sodio al 1% (p/v), y opcionalmente un lavado (durante veinte minutos) en SSC 0,5 X, dodecilsulfato de sodio 1% (p/v), a 60ºC. Puede realizarse un lavado adicional opcional (durante veinte minutos) en condiciones de SSC 1 X, dodecilsulfato de sodio al 1% (p/v), a 60ºC.

Los fragmentos de polinucleótido de la invención pueden producirse mediante técnicas bien conocidas en la técnica tales como digestión con endonucleasas de restricción, síntesis de oligonucleótidos y amplificación mediante PCR.

Puede usarse una secuencia de polinucleótido parcial, en métodos bien conocidos en la técnica para identificar la secuencia de polinucleótido de longitud completa correspondiente. Tales métodos incluyen métodos basados en PCR, 5’RACE (Frohman MA, 1993, Methods Enzymol. 218: 340-56) y métodos basados en hibridación, métodos basados en ordenadores/bases de datos. Además, a modo de ejemplo, la PCR inversa permite la adquisición de secuencias desconocidas, que flanquean las secuencias de polinucleótido dadas a conocer en el presente documento, partiendo de cebadores basados en una región conocida (Triglia et al., 1998, Nucleic Acids Res 16, 8186). El método usa varias enzimas de restricción para generar un fragmento adecuado en la región conocida de un gen. Entonces el fragmento se hace circular mediante ligación intramolecular y se usa como molde de PCR. Se diseñan cebadores divergentes a partir de la región conocida. Con el fin de ensamblar físicamente clones de longitud completa, pueden utilizarse enfoques de biología molecular convencionales (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Press, 1987).

Puede ser beneficioso, cuando se produce una planta transgénica a partir de una especie particular, transformar una planta de este tipo con una secuencia o secuencias derivadas de esa especie. El beneficio puede ser aliviar la preocupación pública con respecto a la transformación entre especies para generar organismos transgénicos. Adicionalmente, cuando el resultado deseado es la regulación por disminución de un gen, puede ser necesario utilizar una secuencia idéntica (o al menos altamente similar) a la de la planta, para la que se desea una reducción de la expresión. Por estos motivos entre otros, es deseable poder identificar y asilar ortólogos de un gen particular en varias especies de plantas diferentes.

Pueden identificarse variantes (incluyendo ortólogos) mediante los métodos descritos en el presente documento.

Métodos para identificar variantes

Métodos físicos

Pueden identificarse polipéptidos variantes usando métodos basados en PCR (Mullis et al., Eds. 1994 The Polymerase Chain Reaction, Birkhauser). Normalmente, la secuencia de polinucleótido de un cebador, útil para amplificar variantes de moléculas de polinucleótido de la invención mediante PCR, puede basarse en una secuencia que codifica para una región conservada de la secuencia de aminoácidos correspondiente.

Alternativamente, pueden emplearse métodos de examen de biblioteca, bien conocidos por los expertos en la técnica, (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Press, 1987). Cuando se identifican variantes de la secuencia de sonda, se reducirá normalmente la rigurosidad de hibridación y/o lavado en relación con cuando se buscan coincidencias de secuencia exactas.

También pueden identificarse variantes de polipéptido mediante métodos físicos, por ejemplo examinando bibliotecas de expresión usando anticuerpos producidos frente a polipéptidos de la invención (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Press, 1987) o identificando polipéptidos a partir de fuentes naturales con la ayuda de tales anticuerpos.

Métodos basados en ordenador

Las secuencias variantes de la invención, incluyendo variantes tanto de polinucleótido como de polipéptido, también pueden identificarse mediante métodos basados en ordenador bien conocidos por los expertos en la técnica, usando herramientas de búsqueda de similitud de secuencias para buscar en bases de datos de secuencias y algoritmos de alineación de secuencias de dominio público (las bases de datos de dominio público incluyen Genbank, EMBL, Swiss-Prot, PIR y otros). Véase, por ejemplo, Nucleic Acids Res. 29: 1-10 y 11-16, 2001 para ejemplos de recursos en línea. Las búsquedas de similitud recuperan y alinean secuencias diana para su comparación con una secuencia que va a analizarse (es decir, una secuencia de consulta). Los algoritmos de comparación de secuencias usan matrices de puntuación para asignar una puntuación global a cada una de las alineaciones.

Una familia de programas a modo de ejemplo útiles para identificar variantes en bases de datos de secuencias es el conjunto de programas BLAST (versión 2.2.5 [nov. de 2002]) que incluye BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN y tBLASTX, que están disponibles para el público a partir de (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/) o a partir del National Center for Biotechnology Information (NCBI), National Library of Medicine, edificio 38A, sala 8N805, Bethesda, MD 20894 EE.UU. El servidor de NCBI también proporciona la infraestructura para usar los programas para examinar varias bases de datos de secuencias disponibles para el público. BLASTN compara una secuencia de consulta de nucleótidos frente a una base de datos de secuencias de nucleótidos. BLASTP compara una secuencia de consulta de aminoácidos frente a una base de datos de secuencias de proteínas. BLASTX compara una secuencia de consulta de nucleótidos traducida en todos los marcos de lectura frente a una base de datos de secuencias de proteínas. tBLASTN compara una secuencia de consulta de proteína frente a una base de datos de secuencias de nucleótidos traducida de manera dinámica en todos los marcos de lectura. tBLASTX compara las traducciones en seis marcos de una secuencia de consulta de nucleótidos frente a las traducciones en seis marcos de una base de datos de secuencias de nucleótidos. Los programas BLAST pueden usarse con parámetros por defecto o los parámetros pueden alterarse según se requiera para depurar el examen.

El uso de la familia BLAST de algoritmos, incluyendo BLASTN, BLASTP y BLASTX, se describe en la publicación de Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997.

Los “resultados positivos” con una o más secuencias de bases de datos en una secuencia consultada producidas por BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN, tBLASTX o un algoritmo similar, alinean e identifican partes similares de secuencias. Los resultados positivos se disponen en orden del grado de similitud y de la longitud del solapamiento de secuencias. Los resultados positivos con una secuencia de base de datos representan generalmente un solapamiento a lo largo de sólo una fracción de la longitud de secuencia de la secuencia consultada.

Los algoritmos BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN y tBLASTX también producen valores “esperados (Expect)” para las alineaciones. El valor esperado (E) indica el número de resultados positivos que podría “esperarse” observar por casualidad cuando se busca en una base de datos del mismo tamaño que contiene secuencias contiguas al azar. El valor esperado se usa como umbral de significación para determinar si el resultado positivo con una base de datos indica similitud verdadera. Por ejemplo, un valor E de 0,1 asignado a un resultado positivo de polinucleótido se interpreta que significa que en una base de datos del tamaño de la base de datos examinada, podría esperarse observar 0,1 coincidencias a lo largo de la parte alineada de la secuencia con una puntuación similar simplemente por casualidad. Para secuencias que tienen un valor E de 0,01 o menos a lo largo de partes alineadas y coincidentes, la probabilidad de encontrar una coincidencia por casualidad en esa base de datos es del 1% o menos usando el algoritmo BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN o tBLASTX.

Pueden llevarse a cabo múltiples alineaciones de secuencias de un grupo de secuencias relacionadas con CLUSTALW (Thompson, J.D., Higgins, D.G. y Gibson, T.J. (1994) CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22:4673-4680, http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalW/Top.html) o T

COFFEE (Cedric Notredame, Desmond G. Higgins, Jaap Heringa, T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment, J. Mol. Biol. (2000) 302: 205-217)) o PILEUP, que usa alineaciones por emparejamiento, progresivas (Feng y Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 25, 351).

Se dispone de aplicaciones de software de reconocimiento de patrones para encontrar motivos o secuencias de firma. Por ejemplo, MEME (Multiple Em for Motif Elicitation) encuentra motivos y secuencias de firma en un conjunto de secuencias, y MAST (Motif Alignment and Search Tool) usa estos motivos para identificar motivos similares o iguales en secuencias de consulta. Los resultados de MAST se proporcionan como una serie de alineaciones con datos estadísticos apropiados y un resumen visual de los motivos encontrados. MEME y MAST se desarrollaron en la Universidad de California, San Diego.

Pueden detectarse regiones de superhélice (CC) dentro de proteínas utilizando el programa Pepcoil (Lupas A, van Dyke M & Stock J 1991. Science 252:1162-1164) que calcula probabilidades de que intervalos particulares de 28 residuos de aminoácido formen una estructura de superhélice.

PROSITE (Bairoch y Bucher, 1994, Nucleic Acids Res. 22, 3583; Hofmann et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27, 215) es un método de identificación de las funciones de proteínas no caracterizadas traducidas a partir de secuencias genómicas o de ADNc. La base de datos PROSITE (www.expasy.org/prosite) contiene patrones y perfiles biológicamente significativos y está diseñada de manera que puede usarse con herramientas informáticas apropiadas para asignar una nueva secuencia a una familia de proteínas conocida o para determinar qué dominio(s) conocido(s) está(n) presente(s) en la secuencia (Falquet et al., 2002, Nucleic Acids Res. 30, 235). Prosearch es una herramienta que puede buscar en las bases de datos SWISS-PROT y EMBL con una firma o un patrón de secuencia dado.

La función de un polinucleótido variante de la invención que codifica para un polipéptido que confiere resistencia al oídio puede analizarse mediante métodos dados a conocer en el presente documento y bien conocidos por los expertos en la técnica. Tales métodos pueden implicar transformar plantas susceptibles con polinucleótidos de la invención y someter a prueba la resistencia de plantas transformadas a la exposición con patógenos de oídio. Tales métodos se describen en la sección de ejemplos de esta memoria descriptiva.

Métodos para aislar polipéptidos

Los polipéptidos de la invención, incluyendo polipéptidos variantes, pueden prepararse usando métodos de síntesis de péptidos bien conocidos en la técnica tales como síntesis de péptidos directa usando técnicas en fase sólida (por ejemplo Stewart et al., 1969, en Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco California, o síntesis automática, por ejemplo usando un sintetizador de péptidos 431A de Applied Biosystems (Foster City, California). También pueden producirse formas mutadas de los polipéptidos durante tales síntesis.

Los polipéptidos y polipéptidos variantes de la invención también pueden purificarse a partir de fuentes naturales usando una variedad de técnicas que se conocen bien en la técnica (por ejemplo Deutscher, 1990, Ed, Methods in Enzymology, vol. 182, Guide to Protein Purification).

Alternativamente, los polipéptidos y polipéptidos variantes de la invención pueden expresarse de manera recombinante en células huésped adecuadas y separarse de las células tal como se menciona a continuación.

Métodos para producir constructos y vectores

Los constructos genéticos de la presente invención comprenden una o más secuencias de polinucleótido de la invención y/o polinucleótidos que codifican para polipéptidos de la invención, y pueden ser útiles para transformar, por ejemplo, organismos bacterianos, fúngicos, de insecto, de mamífero o vegetales. Se pretende que los constructos genéticos de la invención incluyan constructos de expresión tal como se define en el presente documento.

En la técnica se conocen bien métodos para producir y usar vectores y constructos genéticos y se describen de manera general en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Press, 1987; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987).

Métodos para producir células huésped que comprenden polinucleótidos, constructos o vectores

La invención proporciona una célula huésped que comprende un vector o constructo genético de la invención.

Las células huésped que comprenden constructos genéticos, tales como constructos de expresión, de la invención son útiles en métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Press, 1987; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987) para la producción recombinante de polipéptidos de la invención. Tales métodos pueden implicar el cultivo de células huésped en un medio apropiado en condiciones adecuadas para, o propicia para, la expresión

de un polipéptido de la invención. El polipéptido recombinante expresado, que puede secretarse opcionalmente en el cultivo, puede separarse entonces del medio, las células huésped o el medio de cultivo mediante métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo Deutscher, ed, 1990, Methods in Enzymology, vol. 182, Guide to Protein Purification).

Métodos para producir células vegetales y plantas que comprenden constructos y vectores

La invención proporciona además células vegetales que comprenden un constructo genético de la invención. Las plantas que comprenden tales células también constituyen un aspecto de la invención.

Se describen métodos para transformar células vegetales, plantas y partes de las mismas con polipéptidos en Draper et al., 1988, Plant Genetic Transformation and Gene Expresion. A Laboratory Manual. Blackwell Sci. Pub. Oxford, pág. 365; Potrykus y Spangenburg, 1995, Gene Transfer to Plants. Springer-Verlag, Berlín.; y Gelvin et al., 1993, Plant Molecular Biol. Manual. Kluwer Acad. Pub. Dordrecht. Se proporciona una revisión de plantas transgénicas, incluyendo técnicas de transformación, en Galun y Breiman, 1997, Transgenic Plants. Imperial College Press, Londres.

Métodos para la manipulación genética de plantas

Se dispone de varias estrategias de transformación de plantas (por ejemplo Birch, 1997, Ann Rev Plant Phys Plant Mol Biol, 48, 297, Hellens RP, et al (2000) Plant Mol Biol 42: 819-32, Hellens R et al Plant Met 1: 13). Por ejemplo, pueden diseñarse estrategias para aumentar la expresión de un polinucleótido/polipéptido en una célula, órgano y/o en una fase de desarrollo particular de la planta en los que se expresa normalmente o para expresar de manera ectópica un polinucleótido/polipéptido en una célula, tejido, órgano y/o en una fase de desarrollo particular en los que no se expresa normalmente. El polinucleótido/polipéptido expresado puede derivarse de la especie de planta que va a transformarse o puede derivarse de una especie de planta diferente.

Pueden diseñarse estrategias de transformación para reducir la expresión de un polinucleótido/polipéptido en una célula, tejido, órgano o en una fase de desarrollo particular de la planta en los que se expresa normalmente. Tales estrategias se conocen como estrategias de silenciamiento génico.

Los constructos genéticos para la expresión de genes en plantas transgénicas incluyen normalmente promotores para dirigir la expresión de uno o más polinucleótidos clonados, terminadores y secuencias de marcador seleccionable para detectar la presencia del constructo genético en la planta transformada.

Los promotores adecuados para su uso en los constructos de esta invención son funcionales en una célula, tejido u órgano de una planta monocotiledónea o dicotiledónea e incluyen promotores específicos de célula, tejido y órgano, promotores específicos del ciclo celular, promotores temporales, promotores inducibles, promotores constitutivos que son activos en la mayoría de los tejidos vegetales y promotores recombinantes. La elección del promotor dependerá de la expresión temporal y espacial del polinucleótido clonado, si así se desea. Los promotores pueden ser aquéllos asociados normalmente con un transgén de interés, o promotores que se derivan de genes de otras plantas, virus y bacterias y hongos patógenos de plantas. Los expertos en la técnica podrán seleccionar, sin demasiada experimentación, promotores que son adecuados para su uso en la modificación y modulación de rasgos de planta usando constructos genéticos que comprenden las secuencias de polinucleótido de la invención. Los ejemplos de promotores de planta constitutivos incluyen el promotor 35S de CaMV, el promotor de nopalina sintasa y el promotor de octopina sintasa, y el promotor Ubi 1 de maíz. Los promotores de plantas que son activos en tejidos específicos, responden a señales de desarrollo internas o tensiones abióticas o bióticas externas, se describen en la bibliografía científica. Promotores a modo de ejemplo se describen, por ejemplo, en el documento WO 02/00894.

Los terminadores a modo de ejemplo que se usan comúnmente en constructos genéticos de transformación de planta incluyen, por ejemplo, el terminador de 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), los terminadores de nopalina sintasa u octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens, el terminador del gen de zeína de Zea mays, el terminador de ADP-glucosa pirofosforilasa de Oryza sativa y el terminador de PI-II de Solanum tuberosum.

Los marcadores seleccionables usados comúnmente en la transformación de plantas incluyen el gen de neomicina fosfotransferasa II (NPT II) que confiere resistencia a kanamicina, el gen aadA, que confiere resistencia a espectinomicina y estreptomicina, la fosfinotricina acetil transferasa (gen bar) para la resistencia a Ignite (AgrEvo) y Basta (Hoechst), y el gen de higromicina fosfotransferasa (hpt) para la resistencia a higromicina.

También se contempla el uso de constructos genéticos que comprenden genes indicadores (secuencias codificantes que expresan una actividad que es extraña para el huésped, habitualmente una actividad enzimática y/o una señal visible (por ejemplo, luciferasa, GUS, GFP) que pueden usarse para el análisis de expresión de promotores en plantas y tejidos vegetales. La bibliografía sobre genes indicadores se revisa en Herrera-Estrella et al., 1993, Nature 303, 209, y Schrott, 1995, En: Gene Transfer to Plants (Potrykus, T., Spangenberg. Eds) Springer Verlag. Berline, págs. 325-336.

Las estrategias de silenciamiento génico pueden centrarse en el propio gen o en elementos reguladores que efectúan la expresión del polipéptido codificado. “Elementos reguladores” se usa en el presente documento en el sentido más amplio posible e incluye otros genes que interaccionan con el gen de interés.

Los constructos genéticos diseñados para disminuir o silenciar la expresión de un polinucleótido/polipéptido de la invención pueden incluir una copia antisentido de un polinucleótido de la invención. En tales constructos, el polinucleótido se ubica en una orientación antisentido con respecto al promotor y el terminador.

Un polinucleótido “antisentido” se obtiene invirtiendo un polinucleótido o un segmento del polinucleótido de manera que el transcrito producido será complementario con el transcrito de ARNm del gen, por ejemplo,

5’GATCTA 3’ (hebra codificante) 3’CTAGAT 5’ (hebra antisentido)

3’CUAGAU 5’ ARNm 5’GAUCUCG 3’ ARN antisentido

Los constructos genéticos diseñados para el silenciamiento génico también pueden incluir una repetición invertida. Una ‘repetición invertida’ es una secuencia que se repite donde la segunda mitad de la repetición está en la hebra complementaria, por ejemplo,

5’-GATCTA.........TAGATC-3’

3’-CTAGAT.........ATCTAG-5’

El transcrito formado puede experimentar apareamiento de bases complementarias para formar una estructura en horquilla. Habitualmente se requiere un espaciador de al menos 3-5 pb entre la región repetida para permitir la formación de la horquilla.

Otro enfoque de silenciamiento implica el uso de un ARN antisentido pequeño dirigido al transcrito equivalente a un ARNim (Llave et al., 2002, Science 297, 2053). El uso de tal ARN antisentido pequeño que se corresponde con un polinucleótido de la invención está expresamente contemplado.

El término constructo genético tal como se usa en el presente documento también incluye ARN antisentido pequeños y otros polipéptidos de este tipo que efectúan silenciamiento génico.

La transformación con un constructo de expresión, tal como se define en el presente documento, también puede dar como resultado el silenciamiento génico mediante un procedimiento conocido como supresión de sentido (por ejemplo Napoli et al., 1990, Plant Cell 2, 279; de Carvalho Niebel et al., 1995, Plant Cell, 7, 347). En algunos casos, la supresión de sentido puede implicar la sobreexpresión de toda o una parte de la secuencia codificante, pero también puede implicar la expresión de regiones no codificantes del gen, tales como un intrón o una región no traducida (UTR) en 5’ o 3’. Pueden usarse constructos de sentido parciales quiméricos para silenciar de manera coordinada múltiples genes (Abbott et al., 2002, Plant Physiol. 128(3): 844-53; Jones et al., 1998, Planta 204: 499505). También se contempla el uso de tales estrategias de supresión de sentido para silenciar la expresión de un polinucleótido de la invención.

Los insertos de polinucleótido en constructos genéticos diseñados para el silenciamiento génico pueden corresponder a la secuencia codificante y/o la secuencia no codificante, tal como secuencia de promotor y/o intrón y/o 5’ o 3’ UTR, o el gen correspondiente.

Otras estrategias de silenciamiento génico incluyen enfoques negativos dominantes y el uso de constructos de ribozima (McIntyre, 1996, Transgenic Res, 5, 257)

El silenciamiento pretranscripcional puede provocarse mediante mutación del propio gen o sus elementos reguladores. Tales mutaciones pueden incluir mutaciones puntuales, cambios de marco, inserciones, deleciones y sustituciones.

Las siguientes son publicaciones representativas que dan a conocer protocolos de transformación genética que pueden usarse para transformar genéticamente las siguientes especies de plantas: arroz (Alam et al., 1999, Plant Cell Rep. 18, 572); manzano (Yao et al., 1995, Plant Cell Reports 14, 407-412); maíz (patentes estadounidenses con

n. os de serie 5.177.010 y 5.981.840); trigo (Ortiz et al., 1996, Plant Cell Rep. 15, 1996, 877); tomate (patente estadounidense con n.º de serie 5.159.135); patata (Kumar et al., 1996 Plant J. 9, : 821); mandioca (Li et al., 1996 Nat. Biotechnology 14, 736); lechuga (Michelmore et al., 1987, Plant Cell Rep. 6, 439); tabaco (Horsch et al., 1985, Science 227, 1229); algodón (patentes estadounidenses con n.os de serie 5.846.797 y 5.004.863); pastos (patentes estadounidenses n.os 5.187.073 y 6.020.539); menta (Niu et al., 1998, Plant Cell Rep. 17, 165); plantas cítricas (Pena et al., 1995, Plant Sci.104, 183); alcaravea (Krens et al., 1997, Plant Cell Rep, 17, 39); plátano (patente estadounidense con n.º de serie 5.792.935); semilla de soja (patentes estadounidenses n.os 5.416.011; 5.569.834; 5.824.877; 5.563.04455 y 5.968.830); piña (patente estadounidense con n.º de serie 5.952.543); álamo (patente

estadounidense n.º 4.795.855); monocotiledóneas en general (patentes estadounidenses n. os 5.591.616 y 6.037.522); Brassica (patentes estadounidenses n. os 5.188.958; 5.463.174 y 5.750.871); cereales (patente estadounidense n.º 6.074.877); pera (Matsuda et al., 2005, Plant Cell Rep. 24(1):45-51); Prunus (Ramesh et al., 2006 Plant Cell Rep. 25(8):821-8; Song y Sink 2005 Plant Cell Rep. 2006 ;25(2):117-23; González Padilla et al., 2003 Plant Cell Rep.22(1):38-45); fresa (Oosumi et al., 2006 Planta. 223(6):1219-30; Folta et al., 2006 Planta 14 de abril; PMID: 16614818), rosa (Li et al., 2003), Rubus (Graham et al., 1995 Methods Mol Biol. 1995;44:129-33), tomate (Dan et al., 2006, Plant Cell Reports V25:432-441) y Actinidia eriantha (Wang et al., 2006, Plant Cell Rep. 25,5: 425-31). La invención también contempla la transformación de otras especies. Métodos y protocolos adecuados están disponibles en la bibliografía científica.

Pueden emplearse varios métodos adicionales conocidos en la técnica para alterar la expresión de un nucleótido y/o un polipéptido de la invención. Tales métodos incluyen pero no se limitan a Tilling (Till et al., 2003, Methods Mol Biol, 2%, 205), la tecnología denominada “Deletagene” (Li et al., 2001, Plant Journal 27(3), 235) y el uso de factores de transcripción artificiales tales como factores de transcripción de dedo de zinc sintéticos (por ejemplo Jouvenot et al., 2003, Gene Therapy 10, 513). Adicionalmente también pueden expresarse en plantas anticuerpos o fragmentos de los mismos, dirigidos a un polipéptido particular para modular la actividad de ese polipéptido (Jobling et al., 2003, Nat. Biotechnol., 21(1), 35). También pueden aplicarse enfoques de etiquetado de transposones. Adicionalmente, pueden identificarse péptidos que interaccionan con un polipéptido de la invención mediante tecnologías tales como presentación en fagos (Dyax Corporation). Tales péptidos que interaccionan pueden expresarse en o aplicarse a una planta para afectar la actividad de un polipéptido de la invención. Se contempla específicamente el uso de cada uno de los enfoques anteriores en la alteración de la expresión de un nucleótido y/o un polipéptido de la invención.

Los términos “alterar la expresión de” y “expresión alterada” de un polinucleótido o un polipéptido de la invención, pretenden abarcar la situación en la que se modifica el ADN genómico correspondiente a un polinucleótido de la invención, conduciendo así a una expresión alterada de un polinucleótido o un polipéptido de la invención. La modificación del ADN genómico puede ser mediante transformación genética u otros métodos conocidos en la técnica para inducir mutaciones. La “expresión alterada” puede referirse a un aumento o una disminución en la cantidad de ARN mensajero y/o de polipéptido producida y también puede dar como resultado una actividad alterada de un polipéptido debido a alteraciones en la secuencia de un polinucleótido y el polipéptido producido.

Métodos de selección de plantas

También se proporcionan métodos para seleccionar plantas con resistencia al oídio alterada. Tales métodos implican someter a prueba plantas para determinar la expresión alterada de un polinucleótido o un polipéptido de la invención. Tales métodos pueden aplicarse en una edad joven o fase de desarrollo temprana cuando la resistencia al oídio alterada puede no ser fácil de medir necesariamente.

La expresión de un polinucleótido, tal como un ARN mensajero, se usa a menudo como indicador de la expresión de un polipéptido correspondiente. Los métodos a modo de ejemplo para medir la expresión de un polinucleótido incluyen pero no se limitan a análisis de tipo Northern, RT-PCR y análisis de transferencia puntual (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Press, 1987). Por tanto, los polinucleótidos o partes de los polinucleótidos de la invención son útiles como sondas o cebadores, tal como se define en el presente documento, en métodos para la identificación de plantas con resistencia al oídio alterada. Los polinucleótidos de la invención pueden usarse como sondas en experimentos de hibridación, o como cebadores en experimentos basados en PCR, diseñados para identificar tales plantas.

Alternativamente, pueden producirse anticuerpos frente a polipéptidos de la invención. Los métodos para producir y usar anticuerpos son habituales en la técnica (véase por ejemplo: Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow A Lane, Eds, Cold Spring Harbour Laboratory, 1998). Tales anticuerpos pueden usarse en métodos para detectar expresión alterada de polipéptidos que modulan la resistencia al oídio en plantas. Tales métodos pueden incluir ELISA (Kemeny, 1991, A Practical Guide to ELISA, NY Pergamon Press) y análisis de tipo Western (Towbin & Gordon, 1994, J Immunol Métodos, 72, 313).

Estos enfoques para el análisis de la expresión de polinucleótidos o polipéptidos y la selección de plantas con resistencia al oídio alterada son útiles en programas de mejora genética convencionales diseñados para producir variedades resistentes.

Plantas

El término “planta” pretende incluir una planta entera, cualquier parte de una planta, propágulos y progenies de una planta.

El término “propágulo” significa cualquier parte de una planta que puede usarse en reproducción o propagación, o bien sexual o bien asexual, incluyendo semillas y esquejes.

Las plantas de la invención pueden hacerse crecer y o bien autofecundarse o bien cruzarse con un linaje de planta

diferente y los híbridos resultantes pueden identificarse con las características fenotípicas deseadas. Pueden hacerse crecer dos o más generaciones para garantizar que las características fenotípicas objetivo se mantienen de manera estable y se heredan. Las plantas que resultan de tales enfoques de mejora genética convencionales también constituyen un aspecto de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

La presente invención se entenderá mejor con referencia a los dibujos adjuntos en los que:

La figura 1 muestra un análisis de transferencia de tipo Southern de ADN genómico de una población de prueba de progenitores y progenies resistentes y susceptibles a oídio del cruce ‘Royal Gala’ X A689-24. Se digirieron muestras de ADN con DraI, y la transferencia de tipo Southern se hibridó con la sonda mflc9 (NBS). Carril 1; progenitor resistente a oídio (PM) A689-24. Carril 2; progenitor susceptible a PM ‘Royal Gala’. Carriles 3-5; progenies resistentes a PM. Carriles 6-8; progenies susceptibles a PM. Se muestran mediante flechas dos fragmentos de restricción polimórficos (aproximadamente 5,7 kb y 5,5 kb de tamaño) que supuestamente se segregan con el fenotipo de resistencia.

La figura 2A muestra un diagrama de un análisis de transferencia de tipo Southern de tamaños de fragmentos de restricción en el clon de cósmido pk4-051-2N. Se cortó el ADN del clon de cósmido con las endonucleasas de restricción indicadas, se separó mediante electroforesis en gel, se transfirió a una membrana de nailon N+ y se estudió con sonda con el clon de NBS mflc9. Carril 1; ApaI, carril 2; BamHI, carril 3; DraI, carril 4; EcoRV, carril 5; KpnI, carril 6; SalI, carril 7; SpeI, carril 8; XhoI, carril 9; NotIy SpeI, carril 10; NotIy XhoI, carril 11; HindIII, productos de digestión con endonucleasa de marcador Lambda. Se indican con flechas blancas tres fragmentos que se subclonaron.

La figura 2B muestra un diagrama esquemático de los sitios de restricción, la región codificante y la región secuenciada circundante del gen candidato Pl2.1. El marco de lectura abierto de 4,1 kb se muestra como una caja gris y el fragmento de ADN genómico de AvrII de 8,5 kb secuenciado que contiene un pequeño intrón de 95 pb (gris claro), los fragmentos de ADNc de 4,4 kb y una barra de escala de 2 kb en gris oscuro se indican debajo de la figura. Sitios de endonucleasas de restricción; P; SpeI, A; AvrII, D; DraI, X; XhoI, V; EcoRV, S; SacI, B; BamHI. La línea de puntos indica la posición del fragmento 2NA usado como sonda en análisis posteriores.

La figura 3 muestra la secuencia de ADN y la traducción de la región del gen candidato Pl2.1. Basándose en comparaciones entre el ADNc y la secuencia genómica, se muestra en gris un intrón en la 5’ UTR y la traducción deducida de un marco de lectura abierto de 1367 residuos ininterrumpido se muestra desde la base 2788 hasta la base 6891, mostrándose la traducción de aminoácidos en negrita como una línea adicional por debajo de la secuencia de ADN correspondiente. Las regiones subrayadas marcan la posición de los cebadores de P12.1 usados en el análisis. Tal como se menciona en el texto, se facilitan en el siguiente orden; 5’UTR, PI2.1 5’ utr F1, Pl2.1rt 5’F1, Pl2.1 5’ CCF1 y Pl2.1 3’ CCR1 (solapamiento en secuencias y se indica dentro de la misma región), F2 P2N, R2 P2N, R1-2NA, F1-2NA, Pl2.1 3’ utr R1 y 3’UTR respectivamente. Se muestran en cursiva dos sitios de restricción de XmnI usados para desarrollar el constructo de deleción en las posiciones 4796-4805 y 6156-6165.

La figura 4 muestra un análisis de unión de RFLP con un fragmento interno del cósmido pk051-2N de candidato de gen de resistencia Pl2.1 A. Transferencia de tipo Southern de ADN genómico digerido con EcoRV estudiado con sonda con el fragmento interno 2NA del cósmido R de candidato de gen. Carril 1 – marcador de 1 kb, carril 2; el progenitor susceptible ‘Royal Gala’; carril 3 – el progenitor resistente A689-24; carriles 4 a 9-progenies susceptibles; carriles 10 a 19-progenies resistentes; obsérvese que la progenie en el carril 6 se identificó posteriormente como probable sonda basándose en análisis de microsatélites. Las dos flechas en la derecha marcan dos fragmentos de restricción polimórficos (aproximadamente de 4,9 kb y 4,7 kb de tamaño) que se segregan con el fenotipo de resistencia. B. Análisis de segregación en la población ‘Pinkie’ X ‘Braeburn’. Transferencia de tipo Southern de ADN genómico cortado con la endonucleasa de restricción DraI y estudiado con sonda con el fragmento 2NA producido mediante amplificación por PCR de la región correspondiente a partir del clon de cósmido con cebadores Fl-2NA y R1 2NA. Carril 1; marcador de 1 kb, carril 2; marcador Lambda HindIII, carril 3; ‘Pinkie’, carril 4; ‘Braeburn’, carril 5; A689-24, carril 6 a carril 16; progenies de la población ‘Pinkie’ X ‘Braeburn’. Tres flechas negras a la izquierda indican RFLP que se segregan como conjunto unido estrechamente y que incluyen dos RFLP de tamaño idéntico que se segregan con resistencia en la población ‘Royal Gala’ X A689-24, el fragmento superior indicado por las flechas no se segrega en la población ‘Royal Gala’ X A689-24, pero se segrega en una razón de 3:1 en la población ‘Pinkie’ X ‘Braeburn’.

La figura 5A muestra un análisis de acontecimiento de cruzamientos meióticos en la región del gen de resistencia Pl2. Se analizaron muestras de ADN de progenie con los marcadores genéticos indicados a continuación. Leyenda; AC, el marcador SCAR NZscOPAC15/AZ16; el fenotipo de resistencia a oídio (acumulativo) de Pl2; N18, U2, y S5, los marcadores SCAR OPN18, NZscOPU02 y S5 respectivamente; XO el número real de cruzamientos caracterizados en la región indicada mediante la caja rellena. Se facilita en cursiva una distancia estimada basándose en el % de cruzamientos deducidos debajo del diagrama y la barra de color negro indica la región expandida en la figura 5B. Obsérvese que la distancia se calculó basándose en la proporción de cruzamientos en el

número total de progenies completamente caracterizadas para los marcadores flanqueantes implicados, en el caso de la región A que era 217 progenies, para las regiones B y C que eran el conjunto de datos completo de 443 progenies, y para la región D que era 190 progenies.

La figura 5B muestra un análisis más detallado de acontecimientos de cruzamientos meióticos en la región entre N18 y el gen de resistencia Pl2. Leyenda; igual que para la figura 5A; RV, los marcadores del fragmento de restricción de EcoRV de 4,9 kb y 4,7 kb, SNP, el marcador SNP derivado a partir del gen candidato Pl2.1 (obsérvese que aunque este marcador se muestra a la derecha del gen Pl2 podría estar en cualquier lado de este gen o en el propio gen). Se facilita en cursiva una distancia estimada basándose en el % de cruzamientos deducidos debajo del diagrama, la distancia entre el marcador SNP y el gen Pl2 está subrayada. Obsérvese que la distancia se calculó basándose en la proporción de cruzamientos de la siguiente manera, en el caso de cruzamientos de la región B1 en el conjunto de datos completo de 443 progenies, para la región B2 la proporción de cruzamientos en un subconjunto de 13 progenies con cruzamientos entre OPN18 y el gen de resistencia que también se analizaron para determinar la presencia del los marcadores RFLP de EcoRV (obsérvese que no se contaron 7 progenies con posibles acontecimientos de conversión de genes que implican esta región), y para la región C1 basándose en no hallar progenies con cruzamientos entre el marcador SNP y el fenotipo de oídio de las 411 que se analizaron para el marcador SNP, los marcadores NZscOPU02 y OPN18 flanqueantes y la puntuación de fenotipo de oídio (acumulativa).

La figura 6A muestra alineaciones de la proteína MxdPl2.1 con genes de resistencia conocidos y genes candidatos a partir de otras plantas. Se alinearon las secuencias de la región CC N-terminal y la región NBS central usando la matriz de puntuación Gonnet y la opción de alineación completa en ClustalX [39] que compara todas las secuencias mediante alineaciones por emparejamiento, construye un dendograma y luego realiza el alineación múltiple final usando el dendograma como guía. Se presentan las alineaciones usando Genedoc [31]. La secuencia de proteína consenso se muestra bajo la alineación con los grupos de similitud usados (1= DN 2= EQ 3= ST 4= KR 5= FYW 6= ILVM). Se indican motivos característicos en las regiones CC y NBS en negrita debajo de la secuencia consenso, usándose guiones para indicar la longitud aproximada de los motivos. Identificaciones de secuencia de Genbank para las abreviaturas en la alineación; MxdPI21 el gen candidato Pl2.1 del manzano, AthaQ9LRR4 (Arabidopsis, Q9LRR4), LescI2 (tomate, AAD27815), TaesPM3b (trigo, AAQ96158), OsatXA1 (arroz, BAA25068), OsatAAO379 (arroz, AAO37954), OsatP0514H (arroz, BAD52970).

La figura 6B muestra la alineación de las 32 supuestas repeticiones ricas en leucina (LRR) en Pl2.1 entre sí, las alineaciones se realizaron haciendo coincidir las repeticiones con la secuencia consenso LXXLXLXXC/N de núcleo de LRR mostrada encima de la primera LRR deducida. La secuencia C-terminal restante corta también se muestra tras la LRR 32 deducida. C) Se convirtieron las alineaciones ajustadas en árboles filogenéticos usando ClustalX [39], se amplificaron 1000 veces y se dibujaron mediante representación NJ [32], los árboles presentan valores amplificados y la barra en la esquina derecha es una escala para las longitudes de rama. Las abreviaturas son iguales que para A) con un identificador de motivo adicional al final del nombre; CC significa la región de superhélice, NB significa la región de sitio de unión a nucleótidos y LRR significa la región de repetición rica en leucina. El principio y el final de la región delecionada en el constructo de deleción PI2 están subrayados en LRR 5 y LRR 23 respectivamente.

La figura 7 muestra reacciones macroscópicas y microscópicas en plantas ‘Royal Gala’ no transformadas y ‘Royal Gala’ transgénicas para Pl2.1 infectadas con oídio. A)-B) Síntomas macroscópicos en ‘Royal Gala’ control (c) no transformada y transformada (t). C)-E) Síntomas microscópicos y reacciones con una barra de escala que muestra el tamaño. C) Crecimiento abundante de hifas en las hojas más jóvenes no transformadas de ‘Royal Gala’ (hojas 1-20). D) Línea A24, hojas más jóvenes, (hojas 1-20) casi sin esporas visibles. E) Línea A24, mitad de la planta (hojas 2040) con esporas visibles pero la mayoría sin germinar. F) Línea A24, vista aumentada 12 X de espora de oídio sin germinar marcada con la flecha de la vista E).

La figura 8 muestra reacciones microscópicas en plantas ‘Royal Gala’ transgénicas para Pl2.1 transformadas infectadas con oídio (barra de escala mostrada). A) Línea 24, campos de visión sin reacciones de respuesta hipersensible (HR) visibles en las hojas más antiguas (hojas 40-80). B)-F) campos de visión con reacciones de HR en las hojas más antiguas (hojas 40-80). B) Línea A24, que muestra una cadena de reacciones de HR asociadas con hifas que se ven más fácilmente en otro plano de visión. C) Línea A7, que muestra una hifa estrechamente asociada con una reacción de HR individual. D) Línea A7, la misma vista tomada en una exposición y plano de visión diferentes para resaltar la presencia de una hifa que sobresale desde la rama de hifas principal hasta debajo de la reacción de HR. E) Línea A5, que muestra una serie de reacciones de HR que se producen directamente debajo de las hifas de oídio. F) Línea A25, que muestra una cadena de reacciones de HR directamente debajo de una hifa que era más visible en un plano de visión diferente.

La figura 9 muestra imágenes microscópicas representativas de tejido de las hojas inoculadas con oídio para las plantas descritas en el ejemplo 4: A) Línea A25 de Pl2.1, hojas más jóvenes (hojas 1-20) sin esporas visibles. B) Línea microinjertada de Royal Gala control que muestra crecimiento abundante de hifas en las hojas más jóvenes no transformadas de ‘Royal Gala’ (hojas 1-20). C) Línea de deleción de DA4 Pl2.1, hojas más jóvenes (hojas 1-20) sin esporas visibles.

Ejemplos

Ahora se ilustrará la invención con referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplo 1: Aislamiento del gen de resistencia al oídio de la invención

Evaluaciones de población y material vegetal

Se usaron tres familias segregantes para el análisis de mapeo presentado a continuación. Dos de estas familias (S2 y S9) tienen los mismos progenitores (la variedad susceptible “Royal Gala” cruzada con el clon resistente al oídio A689-24) pero se derivaban de semillas generadas en años subsiguientes (1993 y 1994).

Se evaluó el fenotipo de oídio de cada individuo de las poblaciones una vez que se habían trasplantado las plántulas a la huerta durante de 2 a 6 años. Se puntuó el crecimiento del oídio cada año usando una escala de 5 puntos en la que 0 representa síntomas no visibles de crecimiento de oídio (planta resistente o que escapa) y 5 representa crecimiento abundante de oídio (planta susceptible). Se usó una puntuación promedio a lo largo de los años para someter a prueba la segregación del gen para someter a prueba la bondad de ajuste con el modelo de un único gen principal.

Es difícil asignar a las progenies puntuaciones intermedias (entre 1 y 2) a su clase de resistencia apropiada puesto que la evaluación sobre el terreno de la resistencia al oídio adolece de algunos problemas [10, 20]. Por tanto, se modificó la sugerencia de Dunemann et al. [10] de que las puntuaciones de 0 o 1 indican resistencia considerando una puntuación promedio de menos de o igual a 1 como resistente y una puntuación promedio mayor de 2 como susceptible, tratándose las puntuaciones entremedias como no concluyentes.

Según el método de Gardiner et al. [36], se usó un pequeño subconjunto de tres progenies resistentes y tres progenies susceptibles de estas 2 poblaciones para generar una mini-población que podría examinarse rápidamente mediante hibridación de tipo Southern con múltiples sondas.

Se usó una tercera población (“Pinkie” X “Braeburn”) para confirmar la cosegregación de fragmentos de restricción de “Pinkie” puesto que esta variedad contiene el gen Pl2 y era la fuente de ADN genómico de la gran biblioteca de insertos de ADN usada a continuación.

Aislamiento de ADN, cebadores y PCR

Se extrajo el ADN genómico de los progenitores y de las progenies de los cruces de manzano anteriores usando el kit de extracción de ADN de plantas Nucleon Phytopure (Amersham Biosciences) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Se adquirieron los cebadores usados para PCR de Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, EE.UU.). El nombre y la secuencia de los cebadores usados fueron tal como sigue; cebadores de SNP específicos de Pl2.1; R2 P2N (el sitio de apareamiento erróneo está subrayado) 5’ TCATAATTTACCGGCTTTCCTG 3’, F2 P2N 5’ TCTGATGACTTCGATGTTGAA 3’, cebadores de sonda 2NA; F1-2NA 5’ CACCACAAAAAGAGGCAGTG 3’ R1-2NA 5’ CATTGCTGGTCGATTTGATG 3’. Las condiciones de reacción y la secuencia de los cebadores SCAR se basaron en protocolos publicados tal como sigue; S5 [19] y NZscOPU02, OPN18, NZscOPAC16/OPAZ16 [16]. El marcador SNP específico usó las mismas condiciones especificadas para el marcador NZscOPU02, conteniendo la reacción de PCR formamida al 1%. El programa de PCR usado consistió en una etapa de desnaturalización inicial de 94ºC durante 4 min seguido por 30 ciclos de 94ºC durante 30 s, 52ºC durante 30 s y 72ºC durante 30 s y una etapa de extensión final de 72ºC durante 5 min. Se usaron dos conjuntos de cebadores específicos de Pl2.1 que juntos abarcan todo el marco de lectura abierto de Pl2.1 en reacciones de (RT)-PCR con transcriptasa inversa para evaluar si todo el transcrito de Pl2.1 (y por tanto todo el gen P12.1) está presente en los transformantes. El conjunto 1 amplifica la región desde justo fuera de la metionina de iniciación hasta el extremo 3’ del dominio de superhélice y el conjunto 2 amplifica desde el extremo 3’ de la región de superhélice hasta el principio de la región 3’ UTR. El nombre y la secuencia de estos pares de cebadores es: conjunto 1-P12.1 5’ utr F1 (GCGATTCGGTCTTTCTTTGA) y Pl2.1 3’ CCR1 (CTACACCAAAATTGACGGCATCTGT); conjunto 2-PI2.1 5’ CCF1 (CAAAAAAATACGAGCATACAGATGCC) y PI2.1 3’ utr R1 (AAAACATTCCTCGACAGATGA). Las reacciones de RT-PCR consistieron en 2 ul de ADNc diluidos en un volumen de reacción de 20 ul usando Taq polimerasa Platinum (Invitrogen, Carlsbad). Se usó el siguiente programa de PCR: un ciclo de desnaturalización inicial a 94ºC durante 4 min; seguido por 20 ciclos con rampa decreciente de temperaturas (touchdown) de 94ºC durante 30 s, de 65ºC a 55ºC (disminución de 0,5ºC en cada ciclo) durante 30 s, 72ºC durante 30 s; seguido por 10 ciclos a 94ºC durante 30 s, 55ºC durante 30 s y 72ºC durante 30 s, y una extensión final a 72ºC durante 5 min. Se realizó el análisis de expresión de transcritos con los transformantes y el control de la siguiente forma. Se establecieron reacciones de (qRT)-PCR cuantitativa en tiempo real y consistieron en 5 ul de ADNc diluidos usados en un volumen de reacción de 20 ul en una máquina de PCR en tiempo real ABI7700 siguiendo las instrucciones del fabricante (ABI, Foster City, EE.UU.). Se usó un par de cebadores específico de P12.1 para amplificar un producto de PCR específico de P12.1 de 135 pb. El programa de PCR usado fue tal como sigue; 10 min a 95ºC, seguido por 40 ciclos de una PCR de dos etapas que consiste en 95ºC durante 15 s y 60ºC durante 1 min. El nombre de los cebadores usados es P12.1rt 5’

F1 (secuencia AGGAATCGCGAAGT CTACCA) y P12.1 3’ CCR1 (secuencia facilitada anteriormente); Se usó un par de cebadores que amplifican un gen de actina de manzano como control interno. Se usó la misma configuración de condiciones de PCR y reacción para este control interno. El nombre y la secuencia de los cebadores usados son ACT2F (GCAGAGCGTGAAATTGTGAG) y ACT2R (ATGACCTGCCCATCTGGTAA).

Análisis de transferencia de tipo Southern, mapeo de RFLP, mapeo mediante PCR y análisis de unión:

Se realizaron digestos de restricción según las instrucciones del fabricante y transferencia de tipo Southern según el método de Sambrook et al. [35]. Se usó la misma técnica para generar transferencias de mini-poblaciones para examen rápido y transferencias que contenían todo el conjunto de progenies de las poblaciones S2, S9 y “Pinkie” X “Braeburn”. Se estimó el tamaño de los RFLP examinando luminogramas con el sistema de documentación de geles (BioRad) y usando carriles de marcadores etiquetados para estimar el tamaño de las bandas que hibridan. También se incluyeron en el análisis de mapeo varios marcadores SCAR existentes que se sabe que se unen estrechamente al gen de resistencia Pl2 basándose en el análisis anterior [16] y se puntuaron 456 progenies para los marcadores flanqueantes conocidos más próximos (SCAR N18 y NZscOPU2). En un caso, se usaron los datos de secuencia del gen candidato Pl2.1 y una base de datos de secuencias génicas de NBS desarrollada previamente por los solicitantes (datos no mostrados) para desarrollar una prueba de polimorfismo de un solo nucleótido basada en PCR para colocar con exactitud un gen candidato en el mapa genético de Pl2. Esta prueba usó los cebadores R2 P2N y F2 P2N facilitados anteriormente y el cebador R2 P2N contenía un apareamiento erróneo deliberado siguiendo el método de Drenkard et al. [9]. Puesto que los acontecimientos de conversión génica pueden interferir con el orden de los marcadores que están próximos entre sí, el orden de los marcadores a pequeña escala se basó en las progenies que contenían acontecimientos de recombinación que eran diagnósticos para el orden de marcador y usando esa información para desarrollar el orden de marcadores más moderado.

Examen de una biblioteca de cósmidos de “Pinkie”

Se examinó una biblioteca de cósmidos equivalentes heptaploides (SuperCos I 168.960 clones) generada por la digestión parcial con Sau3AI de ADN genómico del cv resistente “Pinkie” con el clon de NBS que reveló RFLP unidos a resistencia al oídio. Se usó una copia por duplicado de la biblioteca de cósmidos para generar 6 copias de una matriz de alta densidad (3X3) de placas de 384 pocillos en membranas Hybond N+ usando la herramienta HDR de 348 puntas de Biomek 2000 mediante el siguiente método. Se superpusieron membranas Hybond N+ sobre placas Omnitray de agar LB que contenían 75 ml de medio de agar LB solidificado. Posteriormente se inoculó el medio de cultivo de cuatro placas de microtitulación de 384 pocillos en puntos por duplicado en una única membrana Hybond (dejándose vacía una de las nueve posiciones disponibles). Entonces se hicieron crecer estas placas a 37ºC durante la noche y se retiraron las membranas y se procesaron mediante un método de hibridación de colonias [35]. Se llevó a cabo la hibridación usando ADN de inserto marcado con ECL y siguiendo las instrucciones del fabricante (MD Biosciences, Zúrich) para estudios con sonda y condiciones de lavado rigurosas.

Examen de clones de NBS para identificar RFLP que se segregan con resistencia al oídio

Los solicitantes construyeron anteriormente un árbol filogenético de las regiones de NBS de clones análogos al supuesto gen de resistencia de manzano que se aislaron mediante PCR (datos no mostrados). Se examinaron representantes de las principales ramas de este árbol filogenético a través de transferencias de mini-población mediante hibridación de tipo Southern con el fin de buscar polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) que supuestamente se segregan con el fenotipo de resistencia al oídio. Entonces se examinaron clones que generaron RFLP supuestamente asociados al gen de resistencia al oídio Pl2 a través de una población ampliada para someter a prueba si la cosegregación con el fenotipo permanecía de manera sistemática.

Extracción de ARN y clonación de ADNc

Se extrajo ARN de “Pinkie” mediante el método de Chang et al. [7]. Se usaron los datos de la secuencia de ADN de la supuesta región no traducida en 3’ de un EST homólogo con un alto grado de identidad de secuencia con Pl2.1 para identificar una pinza GC junto a la región de poli A que se usó para la transcripción inversa del ARN de “Pinkie”. Se usaron los datos de secuencia de ADN generados a partir del candidato de gen de resistencia Pl2.1 para diseñar dos cebadores de ADNc específicos; 3’ UTR (secuencia 5’ CTTGACCCAAACCAAAATATG 3’) y 5’ UTR (5’ TTGACTGTTGATCTTCCCTTC 3’). Estos cebadores se usaron para amplificar copias de ADNc del gen a partir del ARN obtenido mediante transcripción inversa de “Pinkie”. Se usó el siguiente programa de PCR para amplificar ADNc candidatos que coinciden con la secuencia de ADN de Pl2.1; 4 min a 95ºC, seguido por 30 ciclos de una PCR de tres etapas que consiste en 95ºC durante 30 s, 55ºC durante 30 s y 68ºC durante 90 s. las concentraciones de reacción fueron 0,2 uM para dNTP y 2 uM de cada cebador y se dirigió la amplificación mediante 2 unidades del sistema de ADN polimerasa Expand (Roche) en un volumen de reacción final de 50 ul.

Se extrajo el ARN de los transformantes usando 100 mg de tejidos de la hoja con el kit RNeasy Plant Mini (Qiagen, Hilden, Alemania). Entonces se usaron 500 ng de los ARN totales para obtener un ADNc de primera hebra usando SuperScriptII (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.). Se diluyó el ADNc sintetizado 10 veces en tampón TE y se almacenó a -20ºC hasta su uso adicional para el análisis mediante RT-PCR y qRT-PCR de los transformantes.

Secuenciación de ADN y análisis de secuencia

Se realizaron reacciones de secuenciación de ADN (usando cebadores universales directos, inversos o diseñados a medida para las reacciones de paseo con cebador) mediante un método de secuenciación de un ciclo según las instrucciones del fabricante usando la mezcla de secuenciación por ciclo de terminación ABI Big dye (Applied Biosystems, Foster City, CA) y se analizaron en secuenciadores y analizadores genéticos ABI PRISM ™ 377-XL o ABI3100. Se analizaron los resultados del secuenciador de ADN usando el software de análisis de secuenciación de ADN ABI PRISM ™ versión 3.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se realizó lectura automática de nucleótidos mediante el método de lectura automática de nucleótidos semiadaptativa y se importaron los archivos resultantes en el software Sequencher ™ 3.0 (Genecodes Corp., Ann Arbor, MI) donde las secuencias de reacciones de paseo con cebador y de cebador directo e inverso para el mismo clon se alinearon y se comprobaron y editaron manualmente. En el caso del análogo del gen de resistencia Pl2.1 se unieron todas las secuencias (incluyendo 3 copias de ADNc clonado independientemente, secuencias en 5’ y 3’) en un único proyecto para identificar supuestos sitios de inicio y terminación, el marco de lectura abierto y cualquier supuesto intrón/exón.

Análisis del fenotipo de oídio basándose en las progenies y la huerta

Se examinaron las progenies con 6 marcadores microsatélites y se identificó que 12 progenies tenían un perfil de marcadores que era incompatible con derivarse de un cruce entre “Royal Gala” y A689-24A689-24. Se eliminaron estas progenies de su consideración adicional. Se analizaron las progenies restantes de los cruces de S2 y S9 para determinar la resistencia al oídio sobre el terreno durante varias épocas de crecimiento desde 1998 hasta 2002 y se clasificaron como resistentes (que puntuaban un promedio de 1 o menos), susceptibles (que puntuaban un promedio de 2 o más) o no concluyentes. La puntuación de fenotipo de la mayoría de las 443 progenies las colocó supuestamente en las clases o bien resistentes o bien susceptibles (198 resistentes frente a 221 susceptibles). Teniendo en cuenta los datos de marcadores, las clases resistentes y susceptibles mostraron una concordancia del 97% y el 96% respectivamente entre el fenotipo previsto basándose en el perfil de marcadores y el fenotipo observado en la huerta. Por deducción, hay una alta probabilidad de que el alelo Pl2 asociado sea idéntico por descendencia (IBD) entre cada una (pero no entre dos) de estas dos clases. Basándose en esta interpretación, la resistencia al oídio se segregó en una razón sencilla de 1:1 (distribución Chi cuadrado de probabilidad =0,26) en esta población, lo que sugiere que el gen podría ser susceptible de clonarse mediante técnicas basadas en mapeo. Las 24 progenies restantes se trataron como no concluyentes puntuando un promedio de entre 1 y 2. El análisis de datos de marcadores genéticos de estas progenies confirmó que estas puntuaciones generaron el mayor grado de discordancia entre el perfil de marcadores y el fenotipo observado. Indicó que 10 de estas progenies mostraron alelos IBD del cromosoma que porta el alelo de resistencia de Pl2 y 14 mostraron alelos IBD del cromosoma que porta el alelo susceptible de Pl2.

Estrategia de mapeo e identificación de un RGA que se cosegrega con resistencia

Se determinó el genotipo de 443 progenies de las poblaciones S2 y S9 y se puntuaron según la presencia o ausencia de marcadores flanqueantes SCAR OPN18 y NZscOPU02. También se examinaron las progenies de estas poblaciones con varios fragmentos de dominio de sitio de unión a nucleótidos aislados previamente mediante PCR (datos no mostrados). Dado que se había desarrollado una gran base de datos de secuencias de NBS fue necesario desarrollar un procedimiento para priorizar los clones que iban a mapearse. Este procedimiento se basó en la posición de las secuencias de NBS en un árbol filogenético. Se eligieron catorce clones de NBS de ramas principales de un árbol filogenético construido (datos no mostrados). Estos se examinaron mediante hibridación a través de transferencias de tipo Southern de ADN genómico digerido con EcoRV y DraI que contenía un pequeño conjunto de exploración de progenies resistentes y susceptibles y los dos progenitores de los cruces de S2 y S9 (mini-población).

Uno de estos 14 clones originales, mflc9, mostró un posible patrón de cosegregación de fragmentos de restricción polimórficos con resistencia al oídio en la mini-población (figura 1). Dos fragmentos de RFLP en cada uno de dos digestos diferentes obtenidos mediante endonucleasa de restricción (fragmentos de EcoRV de 4,9 kb y 4,7 kb y fragmentos de DraI de 5,7 kb y 5,5 kb) estaban presentes en las progenies resistentes y ausentes de las progenies susceptibles. Se reveló una serie de 11 a 13 fragmentos de restricción con esta sonda, lo que sugiere la presencia de una gran familia génica de candidatos de genes de resistencia homólogos. Se confirmó una alta tasa de cosegregación de los RFLP de EcoRV con el fenotipo de resistencia y su ausencia en las progenies susceptibles (concordancia del 93%) mediante el análisis de un conjunto de datos ampliado de 150 individuos fenotipados usando transferencias de tipo Southern de ADN genómico. Se encontró una concordancia casi completa entre la presencia o ausencia de ambos marcadores SCAR OPN18 y NZscOPU02 y la presencia o ausencia de estos dos RFLP. Sólo un individuo mostró fragmentos de RFLP pero carecía de ambos marcadores SCAR OPN 18 y NZscOPU02.

Examen de biblioteca de cósmidos de Pinkie y secuenciación de una región de genes candidatos Pl2

Se usó el clon mflc9 como sonda de hibridación para examinar la biblioteca de cósmidos para determinar genes candidatos homólogos a la sonda con el fin de poder correlacionar los patrones de segregación de RFLP específicos

con un candidato de gen específico. El examen con mflc9 identificó dos clones positivos Pk4-051-2N y Pk4-051-4F. El mapeo de restricción y el análisis de hibridación de estos clones identificó que ambos contenían un fragmento de restricción con DraI de 5,7 kb que es el mismo tamaño que uno de los RFLP anteriores que supuestamente se cosegrega con el fenotipo de resistencia al oídio y por tanto es un candidato para el gen de resistencia Pl2. Los dos cósmidos mostraron perfiles de endonucleasas de restricción idénticos y los resultados para Pk4-051-2N se muestran en la figura 2A. El análisis de Pk4-051-2N identificó fragmentos de restricción de tamaño conveniente para subclonar que se hibridaban con la sonda mflc9 que se seleccionaron como dianas de subclonación iniciales (ApaI de 9 kb – carril 1, DraI de 5,7 kb – carril 3 y SpeI de 3,6 kb – carril 7). Las búsquedas en Blast iniciales con información de secuencia de estos clones sugirió la presencia de al menos un marco de lectura abierto con homología con gen de resistencia I2 a la enfermedad del marchitamiento del tomate conocida (Fusarium oxisporum) [37]. Se usaron análisis adicionales con enzimas de restricción de los clones de cósmidos (no presentados) para identificar estrategias de subclonación para regiones cerca del gen no contenidas en estos clones iniciales (AvrII, SacI). Se clonaron y secuenciaron estos fragmentos y en la figura 2B se muestra un mapa de restricción derivado de esta información de secuencia. En la figura 3 se muestra la secuencia de ADN completa del fragmento AvrII y su traducción en aminoácidos deducida.

Mapeo basado en PCR y mapeo de RFLP con el fragmento 2NA del gen candidato Pl2.1

Se usó un fragmento de la parte central del clon del gen candidato (2NA, posición mostrada en la figura 2B.) como sonda para el mapeo de RFLP adicional de este gen candidato y otros genes candidatos que pueden hibridarse con este fragmento. Esta región del gen mostró una identidad de 43% a nivel de proteína a lo largo de 133 residuos con una región identificada por Simons et al. [37] como región rica en leucina que contiene un posible dominio de cremallera de leucina dentro del gen I2 del tomate. Se digirió el ADN genómico de progenitores y progenies de las poblaciones S2 y S9 con la endonucleasa de restricción EcoRV y se analizaron los RFLP polimórficos que se segregan en estas poblaciones mediante hibridación y transferencia de tipo Southern con la sonda 2NA (figura 4A). Estos datos se añadieron a los datos derivados de las puntuaciones de fenotipo de oídio y a los datos de mapeo con SCAR. Los dos RFLP polimórficos puntuados (fragmentos de 4,9 kb y 4,7 kb) mostraron una cosegregación casi perfecta con el conjunto de marcadores flanqueantes que rodean al gen de resistencia. También se llevó a cabo un análisis de RFLP similar para investigar la cosegregación de RFLP de DraI en la población “Pinkie” X “Braeburn” (figura 4B.). Esto indicó que se cosegregan tres RFLP que incluían los fragmentos de DraI de 5,7 kb y 5,5 kb y un tercer fragmento de DraI de 6,2 kb. Se denominó al gen representado por el RFLP de 5,7 kb, Pl2.1 mientras que los fragmentos de 5,5 kb y 6,2 kb representan genes candidatos adicionales para la resistencia mediada por Pl2.

Se diseñó un marcador SNP basado en PCR que es probable que sea específico para el gen candidato Pl2.1 (fragmento de DraI de 5,7 kb) basándose en las secuencias de la región NBS del gen. Se identificó el sitio polimórfico comparando esta secuencia con la gran base de datos de otras secuencias de NBS de manzano. Se examinó este marcador a lo largo de todas las poblaciones S2 y S9 y los datos de este marcador junto con los datos del marcador RFLP (donde los marcadores podrían puntuarse confidencialmente) se integraron en un mapa genético. Se ordenaron previamente los marcadores flanqueantes unos con respecto a otros y el fenotipo de resistencia mediante JoinMap [16] mientras que se determinó el orden más moderado de los marcadores más próximos (basado en el gen candidato de resistencia) para el fenotipo de resistencia eligiendo el orden que requería implicar el menor número posible de acontecimientos de conversión génica o cruzamiento doble. Esto permitió identificar posibles acontecimientos de conversión génica. El orden génico resultante y el número y la ubicación deducidos de acontecimientos de cruzamiento meiótico se muestran en la figura 5. Basándose en este análisis sólo se encontraron 3 supuestos acontecimientos de cruzamiento entre el gen candidato Pl2 representado por los fragmentos de EcoRV y el fenotipo de resistencia y no se detectaron acontecimientos de cruzamiento entre el fragmento de DraI de 5,7 kb de Pl2.1, el marcador SNP de Pl2.1 y el fenotipo de resistencia.

Entre las progenies que no muestran acontecimientos de recombinación cerca del locus Pl2 hubo diez progenies (cinco resistentes y 5 susceptibles) en las que el fenotipo de las progenies no coincidía con el fenotipo previsto basándose en IBD. Progenies como estas se han etiquetado como progenies de incongruencia de genotipo-fenotipo (GPI) y en ocasiones se excluyeron de los análisis particulares para determinar la posición exacta de los genes de resistencia [12, 18].

Estas progenies pueden interpretarse de varias formas posibles o bien como acontecimientos de conversión génica (en cuyo caso se esperarían cambios en cualquier gen candidato pero no serían siempre necesariamente detectables mediante los métodos de presentación de marcadores usados), como un acontecimiento de cruzamiento doble entre los marcadores flanqueantes más próximos en cualquier lado y el gen de resistencia, o como una progenie en la que el fenotipo de resistencia no ha penetrado completamente. La falta de penetración del fenotipo de resistencia podría deberse a otros factores que se segregan en el contexto de la progenie, debido a la biología del patógeno, o a una combinación de factores cuantitativos que se unen para proporcionar resistencia en ausencia de un gen de resistencia principal. Se encontró evidencia de conversión génica en uno de los marcadores en torno al gen entre cuatro de las cinco progenies resistentes. Estas progenies de GPI podrían dar una evidencia engañosa frente a asociaciones entre genes candidatos y sus efectos fenotípicos, ya que no es posible distinguir entre muchas de estas posibilidades y sólo algunas de ellas eliminarían la posibilidad de que los genes candidatos sean responsables de la resistencia mediada por Pl2.

Sólo las recombinaciones que es probable que se deban a acontecimientos de cruzamiento meiótico se consideraron por tanto útiles para eliminar la posibilidad de genes candidatos. Tales acontecimientos de cruzamiento deben tener evidencia de recombinación en los marcadores flanqueantes así como posiblemente algunos de los marcadores génicos más próximos no derivados del/de los gene(s) principalmente responsable(s) del fenotipo de resistencia al oídio de Pl2. Considerando sólo tales acontecimientos de recombinación, no podría detectarse ningún acontecimiento de cruzamiento entre el gen candidato Pl2.1 y el fenotipo de resistencia. Por tanto, el análisis fue consecuente con que el gen candidato Pl2.1 es responsable del fenotipo de resistencia al oídio del locus Pl2. La secuencia de la proteína P12.1 de longitud completa se muestra en SEQ ID NO: 1. La secuencia del gen Pl2.1 se muestra en SEQ ID NO: 2. La secuencia del marco de lectura abierto/ADNc que codifica para Pl2.1 se muestra en SEQ ID NO: 3.

Se introdujeron constructos génicos que contenían la región codificante de Pl2.1 y regiones reguladoras en el sentido de 5’ y de 3’ en un vector de transformación de plantas con el fin de someter a ensayo la función génica mediante transformación.

Ejemplo 2: Caracterización de la proteína Pl2.1 y comparación con otros genes de resistencia conocidos de CC-NBS-LRR

Puede usarse la similitud con otros genes de resistencia conocidos para indicar la presencia de una serie de dominios de proteína requeridos para otorgar una capacidad para conferir resistencia. Las búsquedas en BlastP con las secuencias de proteína deducidas del gen candidato Pl2.1 identificaron varios genes de otras especies, incluyendo tres genes de resistencia conocidos, I2 de tomate [37], Pm3b de trigo [42] y Xa1 de arroz [44], como las coincidencias más próximas. El gen Q9LRR4 de Arabidopsis, con similitud con el gen de resistencia conocido RPP13, es la coincidencia más próxima en Arabidopsis (figura 6A).

El mayor grado de identidad fue en la región NBS donde Q9LRR4 fue la coincidencia más próxima con una identidad del 46% seguido por 12 (identidad del 42%), PM3b y Xa1 (identidad del 34% y el 33%, respectivamente).

Los niveles inferiores de identidad se encontraron entre las proteínas codificadas por estos genes en la región CC (32%, 25% y 18% para Q9LRR4, I2 y PM3b respectivamente), mientras que Xa1 contenía una región N-terminal mucho más larga que era difícil de alinear con las otras 3 proteínas.

En la región LRR, la proteína 12 fue la más similar a Pl2.1 con una identidad del 28%.

Los árboles filogenéticos diseñados a partir de estas alineaciones muestran una relación similar entre las proteínas independientemente de la región de alineación usada para diseñar el árbol (figura 6C). Los árboles y las alineaciones también contienen secuencias de dos proteínas de arroz (identificadas por sus números de registro AAO37954 y P0514H03.24) que se ha mostrado previamente [42] que pertenecen a un clado común con la proteína PM3b de trigo.

Ejemplo 3: Uso de polinucleótidos de la invención que codifican para la proteína Pl2.1 de longitud completa para conferir resistencia al oídio

Constructos de vector de transformación de plantas, análisis de transformación y transcripción

Se clonó un fragmento de AvrII de 8,5 kb que contenía todo el supuesto marco de lectura abierto del candidato del gen de resistencia Pl2.1 y 4,4 kb de la secuencia adyacente (2,8 kb en el extremo 5’ y 1,6 kb en el extremo 3’) en el vector binario de transformación de plantas pART27 [17] para generar el vector pPl2.1-clon10. Se introdujo este pPl2.1-clon10 en la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens y se seleccionaron los transformantes resistentes a kanamicina de manzano usando protocolos de transformación de plantas descritos anteriormente por Yao et al. [43]. Se analizaron los supuestos transformantes mediante PCR para determinar si se había introducido todo el gen Pl2.1 y se analizó la transcripción del gen mediante qRT PCR según el método de Zhang et al. [45].

Análisis funcional de transformantes con Pl2.1

Se generaron veinticinco líneas transformadas independientes de “Royal Gala” mediante transformación con el constructo pPl2.1-clon10. Se separaron los brotes individuales regenerados de cada callo y se multiplicaron mediante subcultivo para derivar múltiples copias de 25 líneas independientes. Se arrancaron de raíz brotes de cada copia de cada línea independiente y se transfirieron al invernadero para el crecimiento en condiciones controladas.

Para someter a prueba la presencia de un transgén de Pl2.1 intacto se retiró una hoja pequeña de cada una de las supuestas plantas transformadas en una fase temprana de crecimiento y se asilaron tanto el ADN como el ARN de esta hoja para el análisis basado en PCR posterior. El análisis mediante RT-PCR usando dos conjuntos de pares de cebadores específicos de Pl2.1 sugirió que todos los transformantes sometidos a prueba (un total de 8 líneas) tenían los transcritos de Pl2.1 de longitud completa. El análisis mediante qRT-PCR mostró que había un grado variable de

nivel de transcrito de Pl2.1 en estas líneas. La tabla 1 muestra una diferencia de hasta 9 veces entre las 11 líneas transformadas independientemente que se sometieron a prueba. El nivel de transcritos de Pl2.1 detectados en Royal Gala fue tan bajo que no es estadísticamente significativo con respecto al nivel inicial.

Tabla 1.

qPCR de transformantes

Línea de transformante: Expresión promedio Desviación estándar

A2: 0,32 0,068

A4: 0,35 0,023

A6: 0,65 0,036

A7: 0,30 0,034

A8: 0,39 0,037

A10: 0,34 0,036

A14: 1,97 0,111

A15: 0,22 0,032

A18: 0,45 0,009

A19: 1,06 0,024

A25: 0,64 0,063

Control: 0,01 0,005

Tabla 1. PCR cuantitativa (qPCR) de 11 líneas transformadas independientemente que portan el gen Pl2.1. Se evaluó el nivel de expresión relativo de 11 líneas independientes usando el par de cebadores Pl2.1rt 5’ F1 y Pl2.1 3’ CCR1 y se comparó con el control interno de actina (usando los cebadores ACT2F y ACT2R) y un control de Royal

10 Gala no transformado. Los valores se facilitan como razones en relación con la expresión del gen de actina en cada muestra que se estableció arbitrariamente en 1,0. Las deviaciones estándar se calcularon basándose en el análisis que se realizó por triplicado.

Se introdujeron representantes de las plantas transformadas y las plantas control en un invernadero con el fin de

15 someter a prueba el efecto del gen candidato sobre el fenotipo de oídio del huésped de “Royal Gala” normalmente susceptible.

Se generaron un mínimo de tres copias de 9 líneas independientes y se introdujeron en el invernadero junto con “Royal Gala” no transformada control. Se inició la exposición introduciendo plantas de “Royal Gala” muy infectadas

20 con oídio y se realizó un seguimiento del proceso de infección en las plantas transgénicas y control no infectadas durante un periodo de varios meses a nivel de síntomas macroscópicos.

En la primera época en el invernadero, se registraron los síntomas macroscópicos mediante inspección visual y se estimó la proporción de las 20 hojas superiores muy infectadas con oídio. Al final de la segunda época, se podaron

25 las plantas a una altura de 50 cm y se trataron con Hicane para inducir brotación uniforme [14].

En la tabla 2 se presentan los resultados de la monitorización de síntomas macroscópicos de estas plantas durante la primera época de primavera-verano.

30 Tabla 2.

Puntuación fenotípica macroscópica de transformantes

Meses tras la exposición

Línea: Descripción 1 2 6

“Royal Gala” A2: Transformante con Pl2.1 0*1 0 0

“Royal Gala” A3: Transformante con Pl2.1 0 0 0

“Royal Gala” A4: Transformante con Pl2.1 0 0 0

“Royal Gala” A5: Transformante con Pl2.1 0 0 0*2

“Royal Gala” A7: Transformante con Pl2.1 0 0 0

“Royal Gala” A8: Transformante con Pl2.1 0 0 0

“Royal Gala” A10: Transformante con Pl2.1 0 0 0

“Royal Gala” A24: Transformante con Pl2.1 0 0 0*2

“Royal Gala” A25: Transformante con Pl2.1 0 0 0

“Royal Gala”: No transformada 53 ± 15%*3 82% ± 8%*3 93% ± 3%*3

Tabla 2. Fenotipos de oídio de 9 líneas transformadas independientes de “Royal Gala” con el gen Pl2.1 en el primer año en el invernadero. Se mantuvieron las plantas por triplicado en un invernadero en el que se introdujeron plantas muy infectadas con oídio y se realizó un seguimiento de la infección de plantas transgénicas y control susceptibles 35 durante 6 meses. 0*1 limpio, sin síntomas visibles en ninguna hoja, *2 algo de crecimiento fúngico visible únicamente a simple vista *3 proporción (porcentaje) de las 20 hojas superiores infectadas con síntomas visibles con un

promedio de 3 plantas puntuadas (desviación estándar).

En la figura 7 se ilustran ejemplos del aspecto de estas plantas (paneles A y B). Los síntomas macroscópicos de la infección por oídio aparecieron de manera sistemática en las plantas control no transformadas y aparecieron en la mayor parte de sus hojas con el tiempo. En contraposición, no pudieron detectarse síntomas macroscópicos en ninguna de las líneas transformadas con el gen Pl2.1 en este primer año de infección. Los síntomas macroscópicos de la infección en plantas transgénicas con Pl2.1 fueron demasiado difíciles de detectar de manera regular con el fin de poder evaluar la respuesta del huésped cuando porta el gen candidato.

Se mantuvieron las plantas en el invernadero durante el invierno y se trataron con Hicane en primavera para inducir brotación. Se permitió que un ciclo de infección natural iniciara la infección en la segunda época en el invernadero. Se realizó un seguimiento de las infecciones mediante observaciones macroscópicas regulares de las plantas. Las plantas control susceptibles de nuevo llegaron a infectarse rápidamente con oídio. Se llevó a cabo un análisis microscópico detallado de tres meses en la segunda época de la respuesta de las plantas mediante inspección de varias hojas de cada planta procediendo desde la hoja más joven hasta las más antigua para determinar si había alguna espora o hifa presente, si estas esporas germinaban o si las hifas intentaban penetrar en el huésped y el intervalo de respuestas de las plantas control y transgénicas al oídio. En la figura 7 (paneles C a E) y en la figura 8 se presentan ejemplos de la respuesta de las plantas control y transgénicas con Pl2.1 a esporas de oídio detectadas mediante monitorización de los síntomas microscópicos durante este segundo periodo de infección.

En las plantas control, las hojas se cubrían habitualmente con crecimiento denso de hifas de oídio durante un periodo de algunas semanas (figura 7C). En contraposición, las plantas transgénicas que contenían el gen Pl2.1 contenían pocas o ninguna espora en las hojas más jóvenes (figura 7D). Pudieron detectarse algunas esporas en las hojas de edad media (figura 7E), pero en la mayoría de los casos, estas esporas no estaban germinando (figura 7F).

Esto dificultó inicialmente detectar si las plantas respondían con una reacción de hipersensibilidad a los intentos realizados por las esporas de penetrar en el huésped. Un examen más detallado de algunas de las hojas más antiguas de las plantas transgénicas (figura 8) reveló sin embargo números crecientes de esporas e hifas del oídio en germinación, si bien este crecimiento fue siempre mucho más lento y a un nivel muy inferior al encontrado en los controles susceptibles.

Incluso en las hojas más antiguas, había todavía muchas esporas sin germinar visibles y no era visible una respuesta obvia del huésped en la mayoría de los campos de visión (figura 8A). Sin embargo, algunas de las hifas en estas plantas estaban estrechamente asociadas con una respuesta que tiene las características de una respuesta hipersensible (HR), tal como se ilustra en las figuras 8B a 8F.

Dos de las nueve líneas mostraron finalmente algún signo de crecimiento fúngico que era visible únicamente a simple vista (líneas A5 y A24), pero incluso éstas eran claramente distinguibles de las plantas control que estaban muy infectadas en esta fase.

Estas observaciones concuerdan entre los duplicados de las líneas control y transformadas individuales. A nivel microscópico todas las líneas examinadas que contenían en gen Pl2.1 mostraron reacciones de tipo HR. En muchos casos, pudieron encontrarse varias reacciones de HR en un único campo de visión y habitualmente pudieron encontrarse algunos signos de crecimiento de hifas junto a o justo por encima de estas reacciones cuando se enfocaba el microscopio en diferentes planos de visión. En la figura 8 se muestra la variedad de reacciones de HR. Estos datos sugieren que el gen Pl2.1 es responsable de al menos una mayor parte de la respuesta de resistencia (si no de toda la respuesta) conferida por el locus Pl2 de resistencia al oídio y funciona, al menos en parte, mediante el mecanismo de una respuesta hipersensible.

Sumario

Se ha usado una estrategia de clonación basada en mapeo dirigido en manzano para identificar un gen para el locus Pl2 que se cosegrega con el fenotipo de resistencia de Pl2. Este gen candidato, denominado Pl2.1, se ha secuenciado completamente, consiste en un marco de lectura abierto continuo de más de 1300 aminoácidos y tiene todos los dominios característicos de un gen de resistencia frente a enfermedades de plantas en la clase de superhélice, dominio de unión a nucleótidos, repeticiones ricas en leucina (CC-NBS-LRR). Cuando se transformó este gen en plantas de manzano susceptibles, mostraron una resistencia potenciada al oídio en ensayos de invernadero asociada con reacciones de respuesta hipersensible. Este alelo del locus Pl2.1 confiere por tanto resistencia al oídio en manzanos. Este hallazgo constituye el primer gen de resistencia en plantas en la clase de NBS clonada a partir de Rosaceae para el que se ha confirmado una función y el primer gen de resistencia al oídio clonado dentro de Rosaceae.

Ejemplo 4: La expresión de una proteína Pl2.1 truncada, que incluye sólo un dominio de superhélice y uno de sitio de unión a nucleótidos, confiere resistencia al oídio en plantas transgénicas.

Los solicitantes también prepararon un constructo de deleción de Pl2.1 que expresaría una proteína Pl2.1 truncada.

Se usaron dos sitios de restricción XmnI identificados en la figura 3 para escindir un fragmento de 1,4 kb del gen Pl2.1 mientras se conservan sus secuencias originales promotora y de terminación. Además de escindir el fragmento de 1,4 kb, la escisión da como resultado que la mayor parte de la región de repetición rica en leucina restante quede fuera del marco con la parte N-terminal del gen Pl2.1. La figura 6B muestra dónde se producen estos 5 acontecimientos de deleción dentro de la región de repetición rica en leucina. Las plantas que portan este constructo modificado expresarían por tanto una proteína con sólo los dos primeros dominios (los dominios de superhélice y de sitio de unión a nucleótidos) intactos. Esto permitió que los solicitantes sometieran a prueba si los dos primeros dominios son suficientes para proporcionar resistencia. La secuencia del constructo de deleción de Pl2.1 se muestra en SEQ ID NO: 4. La secuencia de la proteína Pl2.1 truncada, expresada por el constructo de SEQ ID NO: 4, se

10 muestra en SEQ ID NO: 5. La secuencia de ADNc que codifica para la proteína Pl2.1 truncada se muestra en SEQ ID NO: 7. La secuencia de una proteína Pl2.1 truncada que se extiende desde el extremo N-terminal de longitud completa hasta el extremo del dominio de NBS se muestra en SEQ ID NO: 6. El ADNc que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 6 se muestra en SEQ ID NO: 8.

15 Se clonó el constructo de deleción de Pl2.1 en pART27, se introdujo en la cepa LBA4404 de A. tumefaciens y se usó para transformar manzano tal como se describe en el ejemplo 3.

Análisis funcional de la deleción de Pl2.1 y los transformantes con Pl2.1 de longitud completa

20 Se llevaron a cabo pruebas adicionales en el invernadero en la tercera época para evaluar el efecto de injertar y para comparar el desarrollo de síntomas en plantas transgénicas que portan un marco de lectura abierto completo de Pl2.1 con plantas que portan un alelo de deleción de Pl2.1 y que han perdido más de la mitad de la proteína en el marco de lectura correcto. Se usaron cinco de las líneas de plantas con Pl2.1 sometidas a prueba en el ejemplo 3 (líneas A3, A5, A7, A8 y A25) para preparar plantas para someterlas a prueba usando la prueba sencilla de injerto de

25 mesa en plantas madre Royal Gala, y se usaron cinco líneas de plantas que portan un alelo de deleción de Pl2.1 (líneas DA2, DA3, DA4, DA5 y DA6) para preparar plantas para someterlas a prueba usando la prueba sencilla de microinjerto en plantas madre Royal Gala para crear una comparación adecuada entre estos dos tipos de líneas y las líneas de control con injerto de mesa (línea B) y con microinjerto (línea M). En la tabla 3 se presentan los resultados de la monitorización de los síntomas macroscópicos de estas plantas durante la tercera época de

30 primavera-verano. En la figura 9 (paneles A, B y C) se ilustran ejemplos del aspecto microscópico de estas plantas. Los síntomas microscópicos de la infección del oídio aparecieron de manera sistemática en las líneas de control no transformadas con injerto y aparecieron en la mayoría de sus hojas a lo largo del tiempo. En contraposición, no pudieron detectarse síntomas microscópicos en ninguna de las líneas transformantes con injerto que portaban el gen Pl2.1 completo. Esto ilustra que el injerto es una prueba sencilla que puede acelerar el análisis de someter a prueba

35 la función de los genes de esta naturaleza. Además, no pudieron detectarse síntomas microscópicos en ninguna de las líneas transformantes con injerto que portaban el alelo de deleción de Pl2.1. Esto ilustra que la proteína Pl2.1 que soporta grandes deleciones de más de la mitad del gen Pl2.1 todavía puede proporcionar resistencia funcional. Esto también proporciona una fuerte evidencia de que las proteínas que incluyen sólo los dos primeros dominios son suficientes para proporcionar la función de resistencia.

Tabla 3.

Comparación fenotípica de transformantes con alelo de deleción o longitud completa de PL2.1

Días tras la exposición

Línea (clones): Descripción 40 60

Royal Gala A3 (2): Transformante con Pl2.1 0 0

Royal Gala A5 (2): Transformante con Pl2.1 0 0

Royal Gala A7 (1): Transformante con Pl2.1 0 0

Royal Gala A8 (1): Transformante con Pl2.1 0 0

Royal Gala A25 (2): Transformante con Pl2.1 0 0

Royal Gala B (3): Controles con injerto de mesa 60 90

Royal Gala DA2 (5): Alelo de deleción de Pl2.1 0 0

Royal Gala DA3 (2): Alelo de deleción de Pl2.1 0 0

Royal Gala DA4 (5): Alelo de deleción de Pl2.1 0 0

Royal Gala DA5 (3): Alelo de deleción de Pl2.1 0 0

Royal Gala DA6 (1): Alelo de deleción de Pl2.1 0 0

Royal Gala M (5): Controles con microinjerto 60 90

Tabla 3. Fenotipos de oídio de 5 líneas transformadas independientes de “Royal Gala” con el gen Pl2.1 de longitud completa 5 líneas transformadas independientes con el alelo de deleción de Pl2.1 en el tercer año en el invernadero. 45 Se usaron brotes transformados como microinjertos en rizomas M9. Cuando los brotes tenían aproximadamente 30 cm de longitud, se cortaron de nuevo los brotes y se injertaron esquejes de nudo individuales en plantas madre Royal Gala. Se realizaron injertos de mesa de transformantes con Pl2.1 de longitud completa mientras que se realizaron microinjertos de transformantes que portaban el alelo de deleción de Pl2.1. En las plantas control de Royal Gala se realizaron injertos de mesa y microinjertos al mismo tiempo. Se hicieron crecer estas plantas durante 50 tres meses más, luego se expusieron a esporas de oídio y se realizó un seguimiento de la infección de plantas

transgénicas y no transformadas durante 2 meses. Se puntuaron los fenotipos resultantes en lo que respecta a la tabla 2.

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25 Sumario de secuencias

SEQ ID NO: Tipo de secuencia Información Especie

1 polipéptido proteína Pl2.1 de longitud completa Malus zumi

2 polinucleótido gen Pl2.1 Malus zumi

3 polinucleótido marco de lectura abierto/ADNc que codifica para la Malus zumi proteína Pl2.1 de longitud completa

4 polinucleótido constructo de deleción de Pl2.1 para expresar la proteína Malus zumi Pl2.1 truncada de SEQ ID NO: 5

5 polipéptido proteína Pl2.1 truncada Malus zumi

6 polipéptido fragmento que contiene el dominio CC y el dominio NBS Artificial sólo de la proteína Pl2.1

7 polinucleótido ADNc que codifica para la proteína Pl2.1 truncada de Artificial SEQ ID NO: 5

8 polinucleótido ADNc que codifica para la proteína Pl2.1 truncada de Artificial SEQ ID NO: 5

9 polinucleótido cebador R2 P2N Artificial

10 polinucleótido cebador F2 P2N Artificial

11 polinucleótido cebador de sonda F1 2NA Artificial

12 polinucleótido cebador de sonda R1 2NA Artificial

13 polinucleótido cebador 1 -P12.1 5’ utr F1 Artificial

14 polinucleótido cebador Pl2.1 3’ CCR1 Artificial

15 polinucleótido cebador P12.1 5’ CCF1 Artificial

16 polinucleótido cebador P12.1 3’ utr R1 Artificial

17 polinucleótido cebador P12.1 rt 5’ F1 Artificial

18 polinucleótido cebador ACT2F Artificial

19 polinucleótido cebador ACT2R Artificial

20 polinucleótido 3’ UTR de cebador de ADNc Artificial

21 polinucleótido 5’ UTR de cebador de ADNc Artificial

Lista de secuencias 30 <110> The New Zealand Institute for Plant and Food Research Limited

<120> Gen de resistencia y usos del mismo

<130> SMK/FP6695431

<140> EP 08844681.0

<141>

<150> PCT/NZ2008/000284

5: <151> <150> NZ 563032

<151>

10: <150> NZ 571416

<151> 2

15: <160> 37 <170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

20: <211> 1367

<212> PRT

25: <213> Malus zumi <400> 1

<210> 2

<211> 8485

<212> ADN

<213> Malus zumi

<400> 2

<210> 3

<211> 4101

<212> ADN

<213> Malus zumi

<400> 3

<210> 4

<211> 7126

<212> ADN

<213> Malus zumi

<400> 4

<210> 5

<211> 685

<212> PRT

<213> Malus zumi

<400> 5

<210> 6

<211> 537

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 6

<210> 7

<211> 2055

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 7

<210> 8

<211> 1611

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 8

<210> 9

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 9

tcataattta ccggctttcc tg: 22

<210> 10

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 10

tctgatgact tcgatgttga a: 21

<210> 11

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 11 caccacaaaa agaggcagtg 20

<210> 12

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 12 cattgctggt cgatttgatg 20

<210> 13

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 13 gcgattcggt ctttctttga 20

<210> 14

<211> 25

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 14 ctacaccaaa attgacggca tctgt 25

<210> 15

<211> 26

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 15 caaaaaaata cgagcataca gatgcc 26

<210> 16

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 16 aaaacattcc tcgacagatg a 21

<210> 17

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 17 aggaatcgcg aagtctacca 20

<210> 18

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 18 gcagagcgtg aaattgtgag 20

<210> 19

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 19

atgacctgcc catctggtaa: 20

<210> 20

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 20

cttgacccaa accaaaatat g: 21

<210> 21

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 21

ttgactgttg atcttccctt c: 21

<210> 22

<211> 194

<212> PRT

<213> Malus zumi

<400> 22

<210> 23

<211> 197

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 23

<210> 24

<211> 195

<212> PRT

<213> Solanum lycopersicum

<400> 24 <210> 25

<211> 281

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 25 <210> 26

<211> 200

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 26 <210> 27

<211> 202

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 27 <210> 28

<211> 191

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 28

<210> 29

<211> 343

<212> PRT

<213> Malus zumi

<400> 29 <210> 30

<211> 334

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 30 <210> 31

<211> 337

<212> PRT

<213> Solanum lycopersicum

<400> 31

<210> 32

<211> 345

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 32 <210> 33

<211> 340

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 33 <210> 34

<211> 339

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 34

<210> 35

<211> 338

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 35 <210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Artificial

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = cualquier aminoácido

<220> <221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> xaa = cualquier aminoácido

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(8)

<223> Xaa = cualquier aminoácido

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> Xaa = cys de asn

<400> 36

<210> 37

<211> 817

<212> PRT

<213> Malus zumi

<400> 37

Claims

REIVINDICACIONES

1.-Polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 o un fragmento

o una variante del mismo, en el que el fragmento o la variante confiere resistencia al oídio en una planta de

Rosaceae, y en el que el fragmento comprende: a) una secuencia con una identidad de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 6 a lo largo de toda su longitud,

b) una secuencia con una identidad de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 5 a lo largo de toda su longitud, c) la secuencia de SEQ ID NO: 6, o

d) la secuencia de SEQ ID NO: 5, y en el que la variante comprende una secuencia con una identidad de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 1 a lo largo de toda su longitud.
2.-Polinucleótido aislado según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3 o un fragmento o una variante del mismo, en el que el fragmento o la variante codifica para un polipéptido que confiere resistencia al oídio en una planta de Rosaceae, y en el que el fragmento comprende:

a) una secuencia con una identidad de secuencia de al menos el 70% con respecto a SEQ ID NO: 8 a lo largo de

toda su longitud, b) una secuencia con una identidad de secuencia de al menos el 70% con respecto a SEQ ID NO: 7 a lo largo de toda su longitud,

c) la secuencia de SEQ ID NO: 8, o d) la secuencia de SEQ ID NO: 7, y en el que la variante comprende: e) una secuencia con una identidad de secuencia de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 3

a lo largo de toda su longitud, o

f) una secuencia con una identidad de secuencia de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 2 a lo largo de toda su longitud. 3.-Polipéptido aislado codificado por el polinucleótido según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de

aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o un fragmento o una variante del mismo, en el que el fragmento o la variante

confiere resistencia al oídio en una planta de Rosaceae, y en el que el fragmento comprende: a) una secuencia con una identidad de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 6 a lo largo de toda su longitud,

b) una secuencia con una identidad de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 5 a lo largo de toda su longitud, c) la secuencia de SEQ ID NO: 6, o

d) la secuencia de SEQ ID NO: 5, y en el que la variante comprende una secuencia con una identidad de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 1 a lo largo de toda su longitud.
4.-Polinucleótido aislado según la reivindicación 1, que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 6 o una variante del mismo con una identidad de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 6 a lo largo de toda su longitud, en el que la variante confiere resistencia al oídio en una planta de Rosaceae.
5.-Polinucleótido aislado según la reivindicación 4, que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 8 o una variante del mismo con una identidad de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 8 a lo largo de toda su longitud, en el que la variante codifica para un polipéptido que confiere resistencia al oídio en una planta de Rosaceae.
6.-Polipéptido aislado codificado por el polinucleótido según la reivindicación 4, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, o una variante del mismo con una identidad de al menos el 70% con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 6 a lo largo de toda su longitud, en el que la variante confiere resistencia al oídio en una planta de Rosaceae.
7.-Constructo genético que comprende un polinucleótido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 y 5.
8.-Célula huésped transgénica para, o transformada para comprender, el constructo según la reivindicación 7.
9.-Célula vegetal transgénica para, o transformada para comprender, el constructo según la reivindicación 7.
10.-Célula vegetal transgénica o transformada modificada genéticamente para expresar un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 y 5, o un polipéptido según las reivindicaciones 3 y 6.
11.-Planta transgénica o transformada que comprende una célula vegetal según la reivindicación 9 ó 10.
12.-Planta transgénica o transformada según la reivindicación 11, que tiene resistencia al oídio aumentada.
13.-Método para producir una célula vegetal o una planta transgénica o transformada con resistencia al oídio aumentada, comprendiendo el método la transformación de una célula vegetal o una planta con el polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 ó 5.
14.-Parte, propágulo o progenie de la planta transgénica o transformada según la reivindicación 11 ó 12, en la que la planta, parte, propágulo o progenie transgénica o transformada, se modifica genéticamente para incluir un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 y 5, o un polipéptido según las reivindicaciones 3 ó 6.
15.-Anticuerpo producido frente a un polipéptido según las reivindicaciones 3 ó 6, en el que el anticuerpo es específico para el polipéptido.