CN109321581A

CN109321581A - 小麦TaRPP13基因及其在小麦抗白粉病育种中的应用

Info

Publication number: CN109321581A
Application number: CN201811371932.1A
Authority: CN
Inventors: 王振英; 刘晓颖; 范宝莉; 尚云涛; 兰桂霞; 张双力
Original assignee: Tianjin Normal University
Current assignee: Tianjin University; Tianjin Normal University
Priority date: 2018-11-19
Filing date: 2018-11-19
Publication date: 2019-02-12

Abstract

本发明公开了小麦TaRPP13基因及其在小麦抗白粉病育种中的应用。栽培小麦Brock中一个受白粉菌诱导应答的基因TaRPP13的cDNA全长3232bp；5’UTR长104bp和3’UTR长194bp，开放阅读框2934bp；编码一个977aa的多肽链，与乌拉尔图小麦、短柄草、玉米中的RPP13基因编码的氨基酸序列分别有93％、79％和66％的同源性。该多肽链具有coiled‑coil(CC),NB‑ARC和LRR蛋白结构域。白粉菌胁迫下该基因在抗病小麦和感病小麦中的表达在时间和表达量上差异明显，TaRPP13基因沉默导致抗病小麦Brock抗病性降低。该发明为小麦抗白粉病机理和抗病育种提供了新的遗传资源。

Description

小麦TaRPP13基因及其在小麦抗白粉病育种中的应用

国家自然科学基金项目（编号31071671）天津市科委重点项目（编号17JCZDJC34100）科技支撑项目（编号18YFZCNC01100）。

技术领域

本发明属于农业生物基因工程技术领域，特别涉及栽培小麦Brock中一个抗白粉病基因TaRPP13及其在小麦抗病育种中的应用。

背景技术

栽培小麦Brock强抗白粉病，对华北地区流行的15号优势小种免疫。抗白粉病特性分析证实，Brock存在一个抗白粉病新基因，位于染色体3BL上（Wang et al., PlantProduction Science, 2004, 7(3): 319; Wang et al., Plant Production Science,2005, 8(5): 578）。由于小麦中抗白粉病基因抗性退化和抗源的缺乏，克隆Brock中的新基因，对于抗病机理研究和抗白粉病育种都有重要意义，为此，我们利用RNA-Seq技术构建了抗白粉病小麦Brock白粉菌诱导下的转录组数据库，发现一个受白粉菌诱导表达上调的基因片段，该基因片段与拟南芥抗霜霉病基因RPP13同源。我们利用RACE技术获得了小麦中该基因全长cDNA序列，命名为TaRPP13。

RPP13基因为拟南芥抗霜霉病( RPP, recognition of Peronosporaparasitica)基因家族中的一员，属于抗病基因中的CC-NBS-LRR类型。该基因在禾本科植物，尤其是小麦中研究较少，但在首次发现该基因的模式植物拟南芥中有较为清晰的研究。RPP13基因具有非常明显的多态性，编码蛋白的多态性与该基因的多态性一致，RPP13基因的多态性主要体现在其LRR结构域的氨基酸具有较高多态性，这是因为RPPl3基因对应的病原菌群体较为复杂，RPP13 蛋白识别的病原无毒基因的产物ATR13具有与之相当的多态性水平，故该基因在与病原菌的致病基因相互协同进化过程中，受到了多样化的选择，导致其核苷酸差异大Allen,R.L.,P.Bittner-Eddy,L.Grenville-Briggs,J.Meitz,A.P.Rehmany,L.E.Rose,and J.L.Beynon,2004 Host-parasite coevolutionary conflict betweenArabidopsis and Downy Mildew[J].Science 306:1957.1960，因此在寄主与病原菌互作过程中一直保持较高的多态性水平。

到目前为止，未见关于栽培小麦中RPP13基因的相关序列和功能研究的报道。为此，我们在RNA-Seq的基础上，利用RACE方法，获得了抗白粉病小麦RPP13基因的全长cDNA，TaRPP13, 并对该cDNA进行了基因的结构分析、氨基酸序列推导、特征结构预测、基因沉默和白粉菌诱导实验，尤其在抗病小麦Brock、感病小麦京411以及由它们配制的近等基因系小麦中做了基因表达分析，并通过基因沉默技术验证了该基因对白粉菌抗性的贡献，认为TaRPP13为一个新的抗白粉病基因，参与了小麦对白粉菌的抗性反应。

发明内容

本发明的目的有3个：第一，公开了栽培小麦Brock中TaRPP13基因cDNA序列及其获得方法；第二，公开了栽培小麦Brock中TaRPP13基因编码的977aa多肽链氨基酸序列，该多肽链具有coiled-coil (CC), NB-ARC和LRR 蛋白结构域；第三，公开了栽培小麦Brock中TaRPP13基因在抗病小麦Brock、感病小麦京411以及由它们配制的近等基因系NIL（Brock×京411⁷）中的表达模式。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种栽培小麦Brock中一个抗白粉病基因TaRPP13 cDNA序列，其特征在于该cDNA全长3232bp；有一个长104bp的5’UTR和长194bp的3’UTR以及长 2934bp的开放阅读框；编码一个977aa的多肽链，所述的cDNA序列为：SEQ ID NO:1所示。该基因的编码区长 2934bp，编码977aa多肽链的氨基酸序列为：SEQ ID NO:2所示。

SEQ ID NO:1

CCGGGATCTGCAATTTCTGCGGAGAGCTACTGGGTAGGTGCTAGCTGAAGGTCGACAGTGGTCAGTTGGTGCTGCACTTAGTGGCGGCGGCGGGGAGATACATAATGGAGTTAGCCGTGGGCGCCTCGGAAGCCACCATCAAGTCCCTCC TGATAAAACTAGGCGGCCTTCTAGCGGAGGAGTACGCCCTGATTCGCGGCGTCCGCGGCGACATCCAGTTCATCAAC GACGAGCTCGCCAGCATGCAGGCCTTCCTCAGCAACCTGAGTCGCAGCGGCACCGACGGCCACGACGATCAGACGGA TGACTGGATGAAGCAGGTCCGCGACGTCTCCTACGACATCGAGGACTGCGTCGACGACTTCGCCCACGGCCTCCGCC CCGACCCACGCGGCGGCGGCCTGTGGTCCATGATCCGCAGGACTCTGTACGAGATCCAGACGTATTTCCCCCGCCGC AACATCGCCGCCCAGATCGTCCATCTCAAGCAACGGGCCCAGCATGTCGGCGAGCGGCGAGGCAGGTATGGCGTCCC AGATCCAATTCCCGGCAGGAAGAAGAGTAGCTCTGGTGGCGCCACCGGATACCTCGCCGCCGAGCACCAGGAGACAA CCCGTTGGCTCGTCGGCATCAAGGAGCCCGTGGGGGTGGAAGAGGATATGGAGGACCTTAAGAAATGGATCCTCTCT GACGAGAACAAGCAGCAGCTCGGAGTGCTGTCCATCGTTGGATTCGGTGGGGTGGGGAAAACCACCATTGCTATGGC GCTCTACCGAAAATACGGGGATCAGTTTCAGCGTCGAGCCATGGTCACCGTGTCACAGAACTCAGATTCTGAGGCAG TGCTCAGGGATATACTGAGTCAAGTCAAGCCCCAGGACAGCAGTGAGGAGCAGCGTGGTCAGCATAGTGCAGGTGCC GTCTCGGAGAAGACAAATCAGGCAGCACTTTTCAGAAGAACATTGAGCCGAATCATTTCGCCGACCCGAAATCAAGA GGAGGATCAGGAGAAGCACACAGGCATACAAACAGAGCTGTTTTTATTCTCTTCCGTTGGCAGGTACTTACTGTTAA TTGATGATGTGTGGTCATCGTCTACATGGCAGAATATCAAGAGATATTTTCCTGAAAATAATAATGGCAGCAGAATA ATTGTTACTACACGATTTCAAGCGGTCGCCACAACATGTTCTACTCACAAAGACAATGACCGTGTCCACCCAGTTAA TGTTCTTTCAGATGATGAACCAAGAAAGTTATTTCAGAAGAGCCTGTCAGAGTGCAAGGGTGCTACAAGCAATCAAC AAAGTTGGCATAACATTCCAGATAGGGTTTGGGGAATGTGTGGGGGCCTGCCACTAGCAGTTGTTACAATGGCAGGT CTTGTGGCATCCAAGCCTTTGAGGATCAAGGATGAATGGGCTACAGTTTGTGACTCATTGTTTCCAGAGCCAGAAAA ATGTCGTAAGCCGGAGGATTTTATGAGGATAATCAATTTTTGCTACCATGATTTGCCTAGTGATCTTAAGACTTGTT GTCTGTATTTAAGCATCTTTCCTAAGGGTCGCAAAACTAGCAGGAACCGGTTGATCAGGCGATGGATAGCTGAGGGG TTTGTCAGTGAGAAGCAGGGTTTGAGTGTTGAGGATGTTGCAGAGACGTGTTTTAATCAGCTCATTGAAAGGAAGAT AATGCGACCTGTAGAGCACAGCAGCAATGGAAGGGTGAAGAGCTGTCAGGTTCATGACATGGTCCTTGAGTACATCA TTTCCAAGGCAGCCGAAGAGGATTTCATCACTGTGATTGGTGGCTACTGGTCCATGGCAACACGTAGCAACAAAGTC CGCAGGCTTTCCCTCCACAACAGTGACTCCAAACATGCAAAGAAAGCAGCTAGCATGAACCTGTCACATGTACGATC ACTGACCGTGTTTGGAAGCCTGGGCCAACTACGTTTCAAGTCATTCAAGACTGGAATAGTGCAAGTACTAGACCTCG AAGGCTGCAGAGGTTTCAAGGCGAAACATGTGAGTGTCTCAGACATATGTGAAATGACTCTACTCAAGTACCTAAGC CTTCGAGGGACAGACGTCAGCAAATTACCCTCAAAAATTGGGAATCTCAAGTACTTAGAGACCCTAGACATAAGGGA GACAGAGATTCAGGAGCTCCCAAAAACTGTGGCTCAGCTGGAAAGGATAAGTAACATACTTGGTGGGGACAAGAAAA CACGGAAAACTCTGAAACTTCCTAAAGATGTCAAGGGAACAATGAAAGATCTACGCATATTGTCAGGGGTGGAGATT GTTGAGGGATCCACTGCTGCATCAGACCTTGGTTATTTCACCAGGTTGAGGAAGTTGGCCATTTATAAGCTCCACAA GGGTGATCAGATGTTCAAAGATTTACTCTCTTCTATCCAGTATCTCAGCGGCTACTCTCTCCAAACTCTTGTAATTG ATGATGATTCATCTGAATTCCTCAACACTCTGGATTCTATGACATCCCATCCGACAGACCTGAGAACTCTCGAGTTG TCTGGCAAGTTGTTTCAAGTACCCAAGTGGCTTCCAGACCTCAGTGAGCTCATCAAGTTAACTCTTTCAGCGACAGT TCTCCGGACAGATAGTTTACTGCTCCTTGGCAAGCTAGCGTCTCTGTTTTCCCTTACCTTTTCAATCAGTGCAGCAA ATAAGGATCCTGATATGGCGGCCATACTCGAGAAAAATAAGTCTGATTCTGGAGGACAGATCTTTGTTCCTGCTGGA GGGTTTGGCAAGCTCAAACTGCTTCGCATATTTGTACCTCTTCTTCCATCTCTGAACTTCTCAAAGAAGGCCATGCC GCAGCTCGAAAGGCTTGAGCTCCGTTTCAAAAGATTGGAAGGTGTTCATGGAATGGACAGACTCGGAAGCCTCCATG ATGTGCTCTTAACAGTTGATGACAAAGCAGGTGAACCTACAACGTCGATACTAGAAGATATGAAGGGAAGCTCATCG AGGAAGTATGCCCTAATTATTAACGAGTATCATGATTGAGTGGAATTGATTGCAAATCCGGCTAAAATTATCTTGTCTCTCATCTTGGGAGCGGAACTGGTTGCTGCTTGTATCTAAATTTGTAATTTACTCACTGTACTGGTGTATTATGGGTCAAATTGTAAGGGTGCATTAAGACCTTTAATATGTTGCATTTTAATAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAA

其中上述序列的下划线部分为编码序列，ATG示起始密码子，TGA示终止密码子。

SEQ ID NO:2

MELAVGASEATIKSLLIKLGGLLAEEYALIRGVRGDIQFINDELASMQAFLSNLSRSGTDGHDDQTDDWMKQV RDVSYDIEDCVDDFAHGLRPDPRGGGLWSMIRRTLYEIQTYFPRRNIAAQIVHLKQRAQHVGERRGRYGVPDPIPGRKKSSSGGATGYLAAEHQETTRWLVGIKEPVGVEEDMEDLKKWILSDENKQQLGVLSIVGFGGVGKTTIAMALYRKYG DQFQRRAMVTVSQNSDSEAVLRDILSQVKPQDSSEEQRGQHSAGAVSEKTNQAALFRRTLSRIISPTRNQEEDQEKH TGIQTELFLFSSVGRYLLLIDDVWSSSTWQNIKRYFPENNNGSRIIVTTRFQAVATTCSTHKDNDRVHPVNVLSDDE PRKLFQKSLSECKGATSNQQSWHNIPDRVWGMCGGLPLAVVTMAGLVASKPLRIKDEWATVCDSLFPEPEKCRKPED FMRIINFCYHDLPSDLKTCCLYLSIFPKGRKTSRNRLIRRWIAEGFVSEKQGLSVEDVAETCFNQLIERKIMRPVEHSSNGRVKSCQVHDMVLEYIISKAAEEDFITVIGGYWSMATRSNKVRRLSLHNSDSKHAKKAASMNLSHVRSLTVFGSLGQLRFKSFKTGIVQVLDLEGCRGFKAKHVSVSDICEMTLLKYLSLRGTDVSKLPSKIGNLKYLETLDIRETEIQEL PKTVAQLERISNILGGDKKTRKTLKLPKDVKGTMKDLRILSGVEIVEGSTAASDLGYFTRLRKLAIYKLHKGDQMFK DLLSSIQYLSGYSLQTLVIDDDSSEFLNTLDSMTSHPTDLRTLELSGKLFQVPKWLPDLSELIKLTLSATVLRTDSLLLLGKLASLFSLTFSISAANKDPDMAAILEKNKSDSGGQIFVPAGGFGKLKLLRIFVPLLPSLNFSKKAMPQLERLELRFKRLEGVHGMDRLGSLHDVLLTVDDKAGEPTTSILEDMKGSSSRKYALIINEYHD

其中部分为CC domain, 部分为NB-ARC domain, 部分为LRR domain为多肽链氨基酸序列的三个结构特征区。

本发明进一步公开了栽培小麦Brock中一个抗白粉病基因TaRPP13 cDNA序列在用于小麦对白粉菌的抗性反应方面的应用。实验结果显示：白粉菌胁迫下，TaRPP13 在抗病小麦中有较高的本底表达，8小时后持续高表达；而在感病小麦中，本底表达较低，4小时稍有升高，然后持续低表达；在由上述两个小麦配制的近等基因系NIL中，该基因的表达介于二者之间，但8小时后出现接近抗病亲本Brock的表达趋势，与NIL的抗病性趋于抗病亲本Brock相契合。利用病毒介导的基因沉默（VIGS）技术沉默抗病小麦中的TaRPP13基因，导致抗病小麦Brock感病：表现为基因沉默植株上接种白粉菌孢子7天后，成功侵染白粉菌孢子比例甚至已达到89.79%，成功侵染处发育出大量串珠状分生孢子，叶片上可用肉眼观察到明显菌斑。说明TaRPP13基因在小麦抗白粉病过程中有重要贡献。

附图说明

图1. 目标基因片段PCR电泳图；

M，DL5000 DNA Marker; 1, 约1400bp目标片段

图2. TaRPP13基因3’RACE电泳图；

M，DL5000 DNA Marker; 1, TaRPP13基因3’RACE片段

图3. TaRPP13基因5’RACE电泳图；

M，DL5000 DNA Marker; 1, TaRPP13基因5’RACE片段

图4. TaRPP13基因全长扩增电泳图；

M，DL5000 DNA Marker; 1-5, TaRPP13基因全长扩增结果

图5. TaRPP13基因结构、进化树及表达分析；

A. TaRPP13 蛋白结构具有CC domain, NB-ARC domain和 LRR repeats；

B. TaRPP13 蛋白进化树分析；

C. Brock中TaRPP13基因白粉菌侵染0, 2, 4, 8, 12, 24, 48 and 72小时的表达趋势

图6. TaRPP13基因在不同抗性小麦中的差异表达分析；

A. 白粉菌胁迫不同时间TaRPP13基因在抗病小麦Brock中的表达

B. 白粉菌胁迫不同时间TaRPP13基因在抗病NIL中的表达

C. 白粉菌胁迫不同时间TaRPP13基因在感病小麦京411中的表达

图7. TaRPP13基因沉默片段扩增结果；

M.DL-2,000 DNA Marker；1.2.PCR扩增结果

图8. VIGS体系中TaRPP13基因表达水平分析；

1,GKP-Buffer；2，BSMV:GFP；3，BSMV:TaRPP13

图9. 接种白粉菌7d后的TaRPP13基因沉默植株叶片形态；

A: TaRPP13实验组，B: GFP对照组，C:GKP-Buffer水稀释液对照组

图10. Brock中TaRPP13基因对白粉病抗性的贡献评价；

A-C：GKP-Buffer稀释液对照组（A.接种白粉菌48hr；B.接种白粉菌72hr；C.接种白粉菌7d） D-F：BSMV:GFP对照组（D.接种白粉菌48hr；E.接种白粉菌72hr；F.接种白粉菌7d）

G-I：BSMV:TaRPP13实验组（G.接种白粉菌48hr；H.接种白粉菌72hr；I.接种白粉菌7d）

图11. 接种白粉菌后畸形附着胞比例；

图12. 白粉菌成功侵染小麦叶片比例。

具体实施方式

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。

实施例1

TaRPP13基因序列获得

1 实验材料

1.1 植物材料和菌种

白粉菌敏感小麦品种京411，由中国农业大学杨作民教授惠赠。白粉菌抗性小麦品种Brock, 由Ray Johnson博士惠赠。白粉菌抗性杂交品种近等位基因系（Near-IsogenicLines，NILs）, 本实验室前期实验中，以感病品种京411为母本，与抗病品种Brock进行杂交，选取F1代中白粉菌抗性植株为母本，以京411为父本连续回交7代，所得子代自交1代后培育而成（制备方法可以参见张荣等小麦Brock 抗白粉病基因近等基因系的培育与分子检测，中国农业科学 2010,43(15):3059-3066）。

小麦白粉菌15号生理小种，由中国农业科学院植物保护研究所提供。大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α，购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司。

1.2 实验用引物

本实验所用引物全部由金唯智生物科技有限公司合成，基因测序工作全部交由金唯智生物科技有限公司完成。引物名称及序列如下：

表1 引物名称及序列

1.3 主要试剂盒和试剂：Promega M-MLV RTase cDNA Synthesis kit、RiboMAX TMLarge Scale RNA Production System-T7、pGEM-T Easy Vector System，购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司。Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit、FastStart Universal SYBR Green Master（ROX），购自上海罗氏制药有限公司。AxyPrepDNA Gel Extraction Kit、AxyPrep Plasmid Miniprep Kit、AxyPrep PCR Cleanup Kit，购自康宁生命科学中国。TriPure Isolation Reagent，购自上海罗氏制药有限公司。dNTPMixture、ExTaq聚合酶、rTaq Premix聚合酶、EcoRI内切酶、NheI内切酶、MluI内切酶、SpeI内切酶、DL-2000 DNA Marker、DL-5000 DNA Marker、λ-EcoT14Ⅰdigest Marker，购自大连宝生物工程有限公司。DEPC(焦碳酸二乙醋)、Tris(三羟甲基氨基甲烷)、EDTA(乙二胺四乙酸)、Ampicillin(氨苄青霉素)、X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)、IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)、氯化钙、丙三醇、酵母提取物、蛋白胨、琼脂、琼脂糖、考马斯亮蓝R-250，购自上海生工生物工程股份有限公司。乙醇、异丙醇、氯仿、异戊醇、氯化钠、冰乙酸、三氯乙酸、盐酸、氢氧化钠，购自天津市元立化工有限公司。

1.4 主要生物分析软件及相关网站

NCBI（National Center for Biotechnology Information）用于同源序列比对、EST查找、保守结构域分析等。Primer Premier 5.0软件，用于引物设计，查找。DNAMAN软件，用于核酸序列分析、氨基酸序列翻译等。LaserGene（DNA Star）软件，用于序列的格式转换、序列拼接、多重序列的比较等。

2 实验方法

2.1 小麦总RNA提取

培养小麦京411、Brock、NILS幼苗至二叶龄，在小麦叶片背面以毛笔轻刷的方式接种白粉菌，接种后的小麦继续放在适宜条件的培养箱中培养。分别在接种后0hr、2hr、4hr、8hr、12hr、24hr、48hr时称重取材，并迅速置于液氮中冷冻备用。总RNA的方法主要参照TriPureIsolation Reagent(TPIR)试剂操作手册进行。

2.2 反转录

本实验采用两套不同反转录体系，Promega M-MLV RTase cDNA Synthesis kit反转录产品主要用于半定量PCR实验。Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit反转录产品主要用于TaRPP13基因特异片段的扩增。

1. M-MLV反转体系参照Promega公司的 M-MLV RTase cDNA Synthesis kit使用说明进行。反应体系为：RNA 2μg，oligo(dT)₁₈（10μM） 10μl，混合后70℃保温5min，冰浴5min，随后加入以下组分：5×M-MLV Buffer 5μl，RNase Inhibitor（40U/μL) 0.6μl, dNTPMixture(10mM) 1.25μl, M-MLV Reverse Transcriptase（5U/μL) 1μl, 用ddH₂O补齐25μl。混合后42℃保温1hr，40℃保温5min，-80℃冰箱保存备用。

2. 参照Roche公司的Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit的反转体系如下：RNA 4μg，oligo(dT)₁₈1μl，用ddH₂O补齐11.4μl。65℃保温10min，冰浴5min，随后加入以下组分：5×Buffer 4μl，Protector RNase Inhibitor 0.5μl，dNTP Mixture 2μl，DTT 1μl，Transcriptor High Fidelity Reverse Transcriptase 1.1μl，用ddH₂O补齐20μl。混合样品后50℃保温1hr， 85℃保温5min，-80℃冰箱保存备用。

2.3 TaRPP13基因的获得及克隆

2.3.1 TaRPP13基因特异片段扩增

根据RNA-Seq方法获得的一个受白粉菌诱导表达上调的基因片段F22，根据参考序列设计基因特异引物22-F3、22-R3（见表1）。以染菌8hr的小麦Brock的cDNA为模板进行基因序列扩增。PCR反应体系：ExTaq 0.2μl，10×ExTaq Buffer 2.5μl，dNTP Mixture 2μl，22-F3和22-F3 各0.25μl，cDNA 1μl，用ddH₂O补齐25μl。反应程序：94℃ 5min变性；94℃ 1min，55℃1min，72℃ 1min 45s，35cycles；然后72℃延伸7min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

2.3.2 琼脂糖凝胶中DNA片段的回收：参阅AxyPrep DNA Gel Extraction Kit进行。

2.3.3 目的基因重组质粒构建、转化、筛选和鉴定测序：

本实验参照Promega公司的pGEM-T Easy Vector System说明书进行。反应体系：2×Ligation Buffer 2.5μl，pGEM-T-Easy（50mg/ml）0.5μl，纯化片段1.5μl，T4 DNA Ligase（3U/μL）0.5μl，总计5.0μl。将以上组分充分混合均匀后，置于16℃恒温循环水浴中，连接过夜。将重组质粒导入大肠杆菌感受态DH5α中，将菌涂于含有Amp、X-gal、IPTG的LB固体培养基上，37℃倒置培养16 hr。挑取白色菌落，分别接种于5ml含有Amp的LB液体培养基中，置于37℃摇床中，225rpm 振荡培养16hr。参照AxyPrep Plasmid Miniprep Kit使用说明进行质粒提取。重组质粒经过PCR和酶切验证，阳性克隆子送金唯智公司测序。

重组质粒的PCR验证：所用引物为pGEM-T Easy载体多克隆位点两侧的序列：T7、SP6，反应体系为：PCR反应体系：2 × rTaq Premix 10μl，T7 （10μM）1μl，SP6（10μM）1μl，重组质粒 1μl，用ddH₂O补齐20μl。反应程序：94℃ 5min变性；94℃ 30s，45℃ 30s，72℃ 1min45s，35cycles；然后72℃延伸7min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

重组质粒的酶切验证:用限制性内切酶EcoRI进行酶切验证，体系为：重组质粒17μl，EcoRI 1μl，10×H Buffer 2μl，用ddH₂O补齐20μl。将上述各组分混匀后，置于37℃恒温水浴锅中保温3hr。用1%琼脂糖凝胶电泳分析检测PCR验证和酶切验证结果，将符合目标大小的重组质粒进行测序，再对测序结果进行进一步分析。

2.3.4 TaRPP13基因的3’RACE和5’RACE扩增

根据获得的TaRPP13基因片段序列，用primer 5.0 设计特异引物进行PCR扩增。GSP2/AP和NP/AUAP 分别作为3’RACE-PCR第一轮和第二轮扩增的引物，GSP1/AAP和NP/AAP 分别作为5’RACE-PCR第一轮和第二轮扩增的引物。具体序列见表1。

3’RACE反应模板的制备，参照罗氏公司Transcriptor First Strand cDNASynthesis Kit说明书进行，体系如下：先向无RNA酶的100μl PCR管中加入以下组分：RNA 5μg，AP 1μl，用ddH₂O补齐13μl。微离后轻柔混匀，于PCR仪中65℃保温10min，，冰浴冷却5min；其后再加入以下组分：5×Buffer 4μl，Protector RNase Inhibitor 0.5μl，dNTPMixture 2μl，DTT 1μl，THFRT 1.1μl，用ddH₂O补齐20μl。轻柔混匀后在PCR仪中反应，50℃1h，85℃ 5min，随后冰浴5min；冷却后进行分装，-80℃冻存。

5’RACE反应模板的制备

（1）以oligo(dT)18为引物，以小麦总RNA为模板反转录合成cDNA；

（2）对上述所得cDNA进行纯化并回收；对回收后cDNA纯化产物3’末端加尾修饰（加入以下组分混匀后，于37℃保温4h以上：5× TdT Buffer 10μl，0.1% BSA 5μl，dCTP 0.5μl，TdT 1μl Purified cDNA 2μg。对加尾产物再次纯化回收并进行分装，-80℃冻存。

所有PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测、琼脂糖凝胶回收纯化、重组质粒的构建、转化、验证后送金唯智生物科技有限公司测序。获得的序列利用LaserGene软件进行序列拼接、多重序列的比较等工作，获得TaRPP13基因拼接全长cDNA序列。

2.3.5 TaRPP13基因的全长序列扩增

根据拼接的TaRPP13基因全长cDNA序列，设计上下游引物扩增基因全长。PCR扩增参数PCR程序： 94℃ 5min；35cycles of 94℃ 1min，65℃ 1min，72℃ 1.5min，72℃ 1.5min；72℃ 7min。

实验结果

3.1小麦总RNA的提取和cDNA制备

对RNA的完整性检验如下：取样品RNA 2μg，进行1%琼脂糖凝胶电泳检测完整性，再取2μg RNA进行适量稀释，使用Nano Drop 1000分光光度计检测RNA样品的纯度和浓度，所有样品的RNA浓度为1500~2000ng/μl， OD260/OD280比值为1.95~2.05，说明无DNA污染，OD260/OD230比值在2.05~2.15之间，说明样品无盐类等杂质的污染。样品RNA在提取过程中没有明显降解，且浓度纯度均符合后续反转录实验所需条件。利用M-MLV、Transcriptor HighFidelity cDNA Synthesis Kit等试剂盒，分别制备普通cDNA模板和RACE反应cDNA模板备用。

3.2 TaRPP13基因的克隆与分析

3.2.1 F22片段验证

本实验根据前期工作中获得的测序结果，重新对RNA-Seq差异片段F22进行序列验证，作为后续RACE扩增基础。PCR扩增结果如图1所示。由电泳图可以看出，在近1400bp位置有一条明亮条带，大小与预期相符，将该条带切胶回收纯化、与pGEM-T-easy载体连接、转化筛选阳性单克隆菌落、送公司测序并进行Blast比对。测序结果显示，该扩增条带与原F22片段基因序列一致，满足后续实验。

3.2.2 TaRPP13基因的3’RACE序列分析

以小麦的第一链cDNA为模板，以F22-GSP2和AP为引物进行3’RACE第一轮PCR扩增；以3’RACE第一轮PCR产物为模板，以F22-GSP3和AUAP为引物进行3’RACE第二轮PCR扩增。将PCR终产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析结果，如图2所示：1号泳道在近1800bp位置有一较为明亮条带，大小与预期相符，可能是实验所需条带。将该明亮条带切胶回收纯化、与pGEM-T-easy载体连接、转化筛选阳性单克隆菌落、送公司测序并进行Blast比对。测序结果显示，该条带与之前PCR扩增得到的F22基因片段有一定的重叠区域, 且序列的3’末端已出现串联的polyA结构，说明此次TaRPP13基因的3’RACE体系构建成功，已经成功获得TaRPP13基因的3’端。

3.2.3 TaRPP13基因的5’RACE序列分析

以经过加尾操作的小麦第一链cDNA为模板，以F22-GSP1和AAP为引物进行5’RACE第一轮PCR扩增；以5’RACE第一轮PCR产物为模板，以F22-GSP3和AUAP为引物进行5’RACE第二轮PCR扩增。将PCR终产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析结果，由图3可以看出，在近1500bp位置有一较为明亮条带，大小与预期相符。将该明亮条带切胶回收纯化、与pGEM-T-easy载体连接、转化筛选阳性单克隆菌落、送公司测序并进行Blast比对。测序结果显示，该条带与之前PCR扩增得到的F22基因片段有一定的重叠区域,且序列的5’末端已出现串联的polyC结构，说明此次TaRPP13基因的5’RACE体系构建成功，已经成功获得TaRPP13基因的5’端。

3.2.4 TaRPP13基因RACE序列的拼接及全长的获得

将3’、5’-RACE扩增所得序列及F22基因序列用MEGA5.2.2软件进行拼接和比对，得到TaRPP13基因的cDNA全长序列。根据所得全长序列设计特异性上下游引物，以Brock染菌8h的cDNA为模板，PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。由电泳图4可以看出，5条泳道在近3200bp位置有一较为明亮条带。将该条带切胶回收纯化后与pGEM-T-easy载体连接、转化筛选阳性单克隆菌落、送公司测序并进行Blast比对，测序结果显示，该条带大小为3232bp，序列包含已知的F22片段，将测序结果与拼接结果比对，序列信息一致。

3.2.5测序结果分析

TaRPP13全长3232bp，有一个长104bp的5’UTR和长194bp的3’UTR以及长 2934bp的开放阅读框；编码一个977aa的多肽链。与乌拉尔图小麦、短柄草、玉米中的RPP13基因编码的氨基酸序列分别有93％、79％和66％的同源性。该多肽链具有coiled-coil (CC), NB-ARC和LRR 蛋白结构域（图5A）。对不同植物品种RPP13蛋白进行系统发育分析, 该蛋白与二穗短柄草（Bd-RPP13, xp-010237386.1）关系最近，和乌拉尔图小麦（Tu_ PRPP13，EMS68464.1）关系较近，与双子叶植物如拟南芥等同源性较低 (图5B)。白粉菌诱导下，Brock中TaRPP13不同时间段表达分析发现，菌胁迫4小时表达量最低，随后开始增加，12小时达到峰值，24，48，72小时维持在较高水平（图5C）。

实施例2

TaRPP13基因在不同抗性小麦中的差异表达分析

1 实验材料与方法

1.1 植物材料和菌种（同实施例1）

1.2 TaRPP13基因在白粉菌诱导下的表达模式分析

培育小麦京411、Brock及NILs至二叶龄。将白粉菌分别均匀接种于叶片背面，分别在接种后0hr､2hr､4hr､8hr､12hr､24hr及48hr时，称重取材并迅速冻于液氮中。分别提取三个品种各7个时间点的RNA（同实施例1），以oligo(dT)18作为反转录引物，用M-MLV体系反转录成cDNA（同实施例1）。

根据TaRPP13基因序列中的非保守区段设计半定量RT-PCR引物semi-RPP13-F、semi-RPP13-R（见表1）。以Tabulin作为内参基因，设计引物Tatubulin-F、Tatubulin-R（见表1）。利用半定量RT-PCR对白粉菌诱导后不同小麦品种中的TaRPP13基因进行表达模式分析。对照组/样品组PCR反应体系：Taq 0.2μl，10×PCR Buffer 2μl，dNTP Mixture 1.8μl，Tatubulin-F/semi-RPP13-F 1μl，Tatubulin-R/semi-RPP13-R 1μl，cDNA 0.5μl，用ddH₂O补齐20μl。反应程序为：94℃ 5min变性；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 25s，28cycles；然后72℃延伸4min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。用2%琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。

2 实验结果

为了研究TaRPP13基因对白粉菌诱导的应答情况，本发明选取感病小麦京411、抗病小麦Brock及NIL作为实验材料，在TaRPP13基因非保守区段设计PCR引物semi-RPP13-F、semi-RPP13-R（见表1），以Tubulin作为内参，利用半定量RT-PCR的方法对TaRPP13基因在不同品种小麦及小麦接种白粉菌不同的时间段之后的表达情况进行了分析。

2.1 在抗病小麦Brock中，TaRPP13基因的表达情况

在Brock中，经白粉菌侵染后，TaRPP13基因的本底表达水平很高，除了在染菌后4hr，基因的表达水平明显下降，其余时间点的均维持较高的表达水平。结果如图6A所示。

2.2 在抗病小麦NIL中，TaRPP13基因的表达情况

在NIL中，染菌后TaRPP13基因的本底表达量很低，2hr时表达量逐渐上调，在4hr时达到表达高峰，8hr-48hr表达水平逐渐下降，但下调幅度不大。结果如图6B所示。

2.3 在感病小麦京411中，TaRPP13基因的表达情况

在京411中，染菌后TaRPP13基因表达水平很低，在4hr时表达水平明显上调，随后下降，8hr-48hr一直维持较低的表达水平。结果如图6C所示。

上述实验结果表明，TaRPP13基因在不同抗性小麦中的表达差异明显：白粉菌胁迫下，TaRPP13 在抗病小麦中有较高的本底表达，8小时后持续高表达；而在感病小麦中，本底表达较低，4小时稍有升高，然后持续低表达；在由上述两个小麦配制的近等基因系NIL中，该基因的本底表达介于二者之间，但8小时后出现接近抗病亲本Brock的表达趋势，与NIL的抗病性趋于抗病亲本Brock相契合。故TaRPP13基因与小麦对白粉菌的抗性反应密切相关。

实施例3

利用VIGS方法评价TaRPP13基因对白粉病抗性的贡献

1 材料与方法

1.1 VIGS重组载体构建

用于VIGS载体构建的大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus,BSMV)是一种正链RNA 病毒, 具有α､β 和γ 3个基因组。由于病毒基因组RNA不适宜直接操作，故将该病毒RNA反转录为cDNA后进行进一步的改造。其中，在γ链的γb的起始密码子处添加一处NheI酶切位点，用于插入克隆DNA片段。

1.根据TaRPP13基因序列，在基因的非保守区设计添加了NheI识别序列的引物RPP13-V-F、RPP13-V-R（序列见表1）。以含TaRPP13部分基因序列的质粒作为模板进行PCR扩增。PCR反应体系：ExTaq 0.2μl，10× ExTaq Buffer 2μl，dNTP Mixture 1.6μl，RPP13-V-F1μl，RPP13-V-R 1μl，质粒 1.2μl，用ddH₂O补齐20μl。反应程序为：94℃ 5min变性；94℃30s，58℃ 30s，72℃ 30s，35cycles；然后72℃延伸7min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。回收纯化目的DNA（同实施例1）。

2. Nhe I 酶切目的基因片段：10× M Buffer 2μl，Nhe I 1μl，DNA 1μg，用ddH₂O补齐20μl。将上述各组分混匀后，置于37℃恒温水浴锅中保温2hr。

3. 对酶切产物进行纯化回收参照AxyPrep PCR Cleanup Kit进行。

4. 制备BSMVγ载体

(1)大量扩培含有BSMVγ质粒的菌种，提取大肠杆菌中的质粒（同实施例1）。

(2) Nhe I 酶切BSMVγ质粒，体系为：10× M Buffer 2μl，Nhe I 1μl，质粒 2μg，用ddH₂O补齐20μl。将上述各组分混匀后，置于37℃恒温水浴锅中保温2hr。

(3)酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，回收纯化目的片段（同实施例1）。

(4) BSMVγ:PDS载体的去磷酸化，体系为：10× CIAP Buffer 2μl，CIAP 0.5μl，BSA 1μl，DNA 1μg，用ddH₂O补齐20μl。将上述各组分混匀后，置于37℃恒温水浴锅中保温2hr。

(5)对去磷酸化的产物进行纯化回收（同实施例1）。

(6) 目的基因片段与载体的重组，体系为T4 DNA Ligase 0.5μl，2× LigationBuffer 2.5μl，BSMV_γ载体 0.5μl，DNA 1.5μl，总体积5μl。将上述各组分混匀后，于16℃循环水浴中，连接过夜。

(7) 将连接产物转化入大肠杆菌感受态中，经筛选、验证，送金唯智生物科技有限公司测序（同实施例1）。

1.2 BSMV病毒的体外转录

1. 将含有BSMVα、BSMVβ、BSMVγ:PDS、BSMVγ:GFP和BSMVγ:RPP13重组载体的菌种接种于添加Amp(200mg/L)的LB液体培养基中，扩大培养后提取质粒。

2. 分别对以上质粒进行酶切线性化处理作为体外转录的模板，体系如下：

（1）10× M Buffer 2μl，Mlu I 1μl，BSMV_α5μg，用ddH₂O补齐20μl。

（2）10× M Buffer 2μl，Spe I 1μl，BSMV_β5μg，用ddH₂O补齐20μl。

（3）10× M Buffer 2μl，Mlu I 1μl，BSMV_γ5μg，用ddH₂O补齐20μl。

将上述各组分混匀后，置于37℃保温4hr；分别在上述酶切产物中加入去离子水将溶液体积补满至400μl；加入等体积Tris-平衡酚，轻柔充分混匀，置于4℃预冷离心机中，12000rpm，离心20min；吸取上清转移至新的EP管中，加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1,v/v/v），轻柔充分混匀，12000rpm，4℃离心20min；吸取上清转移至新的EP管中，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1,v/v），轻柔充分混匀，12000rpm，4℃离心20min；吸取上清转移至新的1.5mlEP管中，加入等体积预冷的异丙醇，充分混匀，静置于-20℃冰箱中醇沉过夜；将样品置于4℃预冷的离心机中，12000rpm，离心20min，弃上清液；加入预冷的75%乙醇1ml，轻轻吹洗沉淀，置于4℃预冷的离心机中，12000rpm，离心20min，弃上清液；自然晾干管内残余液体，用5μl去离子水溶解DNA沉淀。

3. BSMV病毒的体外转录

体外转录采用Promega公司的RiboMAX TM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒进行，反应体系为：5× Buffer 4μl，ATP，UTP，CTP和GTP各1.5μl，Enzyme Mix（T7）2μl，Ribo m7G cap Analog （40mM）1.5μl，质粒2μg，用ddH₂O补齐20μl。轻柔混匀上述各组分后，置于42℃恒温水浴中保温3hr。

1.3 BSMV病毒的摩擦接种

将BSMVα、BSMVβ与BSMVγ:TaRPP13转录产物等体积混合，作为TaRPP13实验组；将BSMVα、BSMVβ与BSMVγ:PDS转录产物等体积混合，作为PDS对照组用于观察叶片漂白状况跟踪基因沉默情况；将BSMVα、BSMVβ与BSMVγ:GFP转录产物等体积混合，作为GFP对照组用于观察病毒对白粉菌侵染的影响情况。将各转录产物混合物用DEPC水稀释4倍后再与2×GKPBuffer (50 mmol L^-1glycine, 30 mmolL^-1K₂HPO₄, pH 9.2, 1% bentonite, 1% celite)等体积混合，配置成摩擦接种工作液，各取8μl摩擦接种至小麦Brock的第二片叶片上。另将接种1×GKP Buffer的Brock小麦作为空白对照。接种完成后的小麦保湿24 h, 然后在已设定20℃、16 h光照/8 h 黑暗条件下的培养箱中培养, 定期观察小麦生长状况和接种BSMV:PDS植株叶片的光漂白情况。

1.4 VIGS沉默效率验证

1. 培养实验植株至第三片叶片完全展开，对接种BSMV∶PDS植株叶片漂白状况进行拍照记录，剪取实验材料第三片叶片，进行叶片的表型观察。

2. 将TaRPP13实验组、GFP对照组和GKP-Buffer水稀释液对照组的叶片取材，称重迅速冻于液氮。提取叶片总RNA，以oligo(dT)18作为反转录引物，合成cDNA（同实施例1）。

3. 利用半定量RT-PCR进行三组实验材料中的TaRPP13基因的表达模式分析（同实施例1）。

1.5基因沉默植株的白粉菌抗性检测

1. 在接种白粉菌48hr,72hr和7d的TaRPP13实验组、GFP对照组和GKP-Buffer水稀释液对照组的叶片上取3—4cm长的叶段。

2. 将叶片浸泡于脱色液（含0.15%三氯乙酸的乙醇：冰醋酸，75:25,v/v）中脱色48h，期间每12hr更换脱色液，直至叶片透明。

3. 将叶片置于考马斯亮蓝R-250染色液(0.75%三氯乙酸水溶液∶0.3%考马斯亮蓝R-250 甲醇溶液，1∶1, V/V）中染色4hr。

4. 用蒸馏水洗去叶片表面残余的染色液，将叶片置于保存液（冰醋酸∶甘油∶水，1∶4∶15, V/V/V）中保存。

5. 将叶片制成装片在显微镜下观察，统计白粉菌与叶片的互作情况。

2 实验结果

2.1 重组BSMV:TaRPP13载体的构建

本实验根据已获得TaRPP13基因序列，在基因的非保守区设计添加了NheI识别序列的引物RPP13-V-F、RPP13-V-R（见表1）。以含TaRPP13基因序列的重组质粒作为模板，扩增用于构建BSMV重组载体的目的基因片段，扩增结果如图7所示，目的片段大小约为250bp，随后将回收后的目的片段进行酶切形成粘性末端，BSMV载体同样经过酶切回收，与目的片段进行连接，通过进一步筛选、验证，挑选阳性克隆送测，序列与实验设计相符，重组载体BSMVγ:TaRPP13构建成功。

2.2沉默TaRPP13基因后的小麦植株的获得

本实验共设置四组接种不同重组病毒的植株进行研究，分别为BSMV:TaRPP13实验组、BSMV:PDS对照组、BSMV:GFP对照组和GKP-Buffer水稀释液对照组。将重组病毒摩擦接种于2叶龄小麦的第二片叶片，正常培养实验植株至第三片叶片完全展开，剪取第三片叶片，进行表型观察，除BSMV:PDS对照组叶片发生白化现象之外，其它组叶片均呈绿色。这是由于PDS是高等植物合成类胡萝卜素过程中的关键酶，该基因的缺失将使植株叶片的类胡萝卜素合成受阻，从而使植株失去了光保护作用而发生白化现象。接种重组病毒BSMV:PDS的植株叶片出现明显的白化现象，说明该基因沉默体系可以有效的从实验材料中沉默目的基因。

2.3 TaRPP13基因沉默效率验证

为了进一步确定内源基因的沉默效果，分别提取了实验组和对照组的小麦的第三片叶片的总RNA, 利用半定量RT-PCR进行实验材料中的TaRPP13基因的表达分析。结果如图8所示：相比于对照组来说，BSMV:TaRPP13实验组中的TaRPP13基因的表达水平明显降低，说明基于BSMV病毒的VIGS技术可以有效沉默小麦TaRPP13基因的表达。另外，在接种重组病毒BSMV:GFP后，TaRPP13基因的表达也有轻微下调，该现象可能是由于病毒的侵染对植株造成了影响。

2.4 TaRPP13基因沉默植株抗病分析

为了分析TaRPP13基因沉默后的植株对白粉菌侵染应答的变化，本研究对接种白粉菌7d后的BSMV:TaRPP13实验组和BSMV:GFP对照组以及GKP-Buffer水稀释液对照组的叶片进行表型观察，结果如图9所示，在接种白粉菌7d后，TaRPP13实验组植株的叶片上分布着大量乳白色菌斑（图9A），而在GFP对照组和GKP-Buffer水稀释液对照组的叶片上菌斑很少甚至没有（图9B,C），这说明在TaRPP13基因被沉默后，植株对白粉菌的抗病性显著降低。而GFP对照组也出现少量菌斑，可能是因为病毒的侵染对植株造成了影响，使得植株的抗病水平有所降低。

利用考马斯亮蓝染色法对接种白粉菌48hr、72hr和7d后的BSMV:TaRPP13实验组和BSMV:GFP对照组和GKP-Buffer水稀释液对照组的叶片进行细胞学观察。如图10所示，在接种白粉菌48hr后BSMV:TaRPP13实验组叶片上多数白粉菌孢子已发育出1~2根菌丝，而对照组叶片上的白粉菌孢子由于没有成功侵入已出现部分畸形附着胞；在接种白粉菌72hr后，BSMV:TaRPP13实验组叶片上多数白粉菌孢子可发育出十几至二十几根菌丝，在BSMV:GFP对照组中可以发现少量发育出1-2根菌丝的白粉菌孢子，而在GKP-Buffer水稀释液对照组中几乎很难找到发育出菌丝的白粉菌孢子，并且大量孢子都发育成了纤细型或分瓣型的畸形附着胞；在接种白粉菌7d后，实验组小麦叶片上可见明显病斑，白粉菌孢子成功侵染处已发育出大量串珠状分生孢子（图10I），在BSMV:GFP对照组叶片上仅出现极少数发育出菌丝或分生孢子的情况，而在GKP-Buffer水稀释液对照组中几乎没有这样的现象发生。细胞学观察结果说明，在抗病小麦Brock中沉默TaRPP13基因使得多数白粉菌可以成功侵染，显著降低了植株的抗病水平，而在BSMV:GFP对照组中，也有少量成功侵染的白粉菌，推测可能是由于病毒侵染导致植株抗病性降低所致，但这种情况发生数量较少，且成功侵染的白粉菌的发育情况也较实验组相对滞后，所以属于VIGS实验中不能避免的误差，并不影响对实验结果的分析。

根据细胞学观察结果进一步对植株和白粉菌的互作情况进行统计。统计结果如图11，12所示。与对照组相比，接种BSMV:TaRPP13的抗病小麦Brock上的白粉菌孢子的成功侵染比例明显增高，白粉菌附着胞畸形率显著下降。接种7d后，成功侵染白粉菌孢子比例甚至已达到89.79%，成功侵染处发育出大量串珠状分生孢子，并且在此处叶片上可用肉眼观察到明显菌斑（图9A）。因此，在抗病小麦Brock中沉默TaRPP13基因可以显著降低植株的抗病水平。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津师范大学

<120> 小麦TaRPP13基因及其在小麦抗白粉病育种中的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3232

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccgggatctg caatttctgc ggagagctac tgggtaggtg ctagctgaag gtcgacagtg 60

gtcagttggt gctgcactta gtggcggcgg cggggagata cataatggag ttagccgtgg 120

gcgcctcgga agccaccatc aagtccctcc tgataaaact aggcggcctt ctagcggagg 180

agtacgccct gattcgcggc gtccgcggcg acatccagtt catcaacgac gagctcgcca 240

gcatgcaggc cttcctcagc aacctgagtc gcagcggcac cgacggccac gacgatcaga 300

cggatgactg gatgaagcag gtccgcgacg tctcctacga catcgaggac tgcgtcgacg 360

acttcgccca cggcctccgc cccgacccac gcggcggcgg cctgtggtcc atgatccgca 420

ggactctgta cgagatccag acgtatttcc cccgccgcaa catcgccgcc cagatcgtcc 480

atctcaagca acgggcccag catgtcggcg agcggcgagg caggtatggc gtcccagatc 540

caattcccgg caggaagaag agtagctctg gtggcgccac cggatacctc gccgccgagc 600

accaggagac aacccgttgg ctcgtcggca tcaaggagcc cgtgggggtg gaagaggata 660

tggaggacct taagaaatgg atcctctctg acgagaacaa gcagcagctc ggagtgctgt 720

ccatcgttgg attcggtggg gtggggaaaa ccaccattgc tatggcgctc taccgaaaat 780

acggggatca gtttcagcgt cgagccatgg tcaccgtgtc acagaactca gattctgagg 840

cagtgctcag ggatatactg agtcaagtca agccccagga cagcagtgag gagcagcgtg 900

gtcagcatag tgcaggtgcc gtctcggaga agacaaatca ggcagcactt ttcagaagaa 960

cattgagccg aatcatttcg ccgacccgaa atcaagagga ggatcaggag aagcacacag 1020

gcatacaaac agagctgttt ttattctctt ccgttggcag gtacttactg ttaattgatg 1080

atgtgtggtc atcgtctaca tggcagaata tcaagagata ttttcctgaa aataataatg 1140

gcagcagaat aattgttact acacgatttc aagcggtcgc cacaacatgt tctactcaca 1200

aagacaatga ccgtgtccac ccagttaatg ttctttcaga tgatgaacca agaaagttat 1260

ttcagaagag cctgtcagag tgcaagggtg ctacaagcaa tcaacaaagt tggcataaca 1320

ttccagatag ggtttgggga atgtgtgggg gcctgccact agcagttgtt acaatggcag 1380

gtcttgtggc atccaagcct ttgaggatca aggatgaatg ggctacagtt tgtgactcat 1440

tgtttccaga gccagaaaaa tgtcgtaagc cggaggattt tatgaggata atcaattttt 1500

gctaccatga tttgcctagt gatcttaaga cttgttgtct gtatttaagc atctttccta 1560

agggtcgcaa aactagcagg aaccggttga tcaggcgatg gatagctgag gggtttgtca 1620

gtgagaagca gggtttgagt gttgaggatg ttgcagagac gtgttttaat cagctcattg 1680

aaaggaagat aatgcgacct gtagagcaca gcagcaatgg aagggtgaag agctgtcagg 1740

ttcatgacat ggtccttgag tacatcattt ccaaggcagc cgaagaggat ttcatcactg 1800

tgattggtgg ctactggtcc atggcaacac gtagcaacaa agtccgcagg ctttccctcc 1860

acaacagtga ctccaaacat gcaaagaaag cagctagcat gaacctgtca catgtacgat 1920

cactgaccgt gtttggaagc ctgggccaac tacgtttcaa gtcattcaag actggaatag 1980

tgcaagtact agacctcgaa ggctgcagag gtttcaaggc gaaacatgtg agtgtctcag 2040

acatatgtga aatgactcta ctcaagtacc taagccttcg agggacagac gtcagcaaat 2100

taccctcaaa aattgggaat ctcaagtact tagagaccct agacataagg gagacagaga 2160

ttcaggagct cccaaaaact gtggctcagc tggaaaggat aagtaacata cttggtgggg 2220

acaagaaaac acggaaaact ctgaaacttc ctaaagatgt caagggaaca atgaaagatc 2280

tacgcatatt gtcaggggtg gagattgttg agggatccac tgctgcatca gaccttggtt 2340

atttcaccag gttgaggaag ttggccattt ataagctcca caagggtgat cagatgttca 2400

aagatttact ctcttctatc cagtatctca gcggctactc tctccaaact cttgtaattg 2460

atgatgattc atctgaattc ctcaacactc tggattctat gacatcccat ccgacagacc 2520

tgagaactct cgagttgtct ggcaagttgt ttcaagtacc caagtggctt ccagacctca 2580

gtgagctcat caagttaact ctttcagcga cagttctccg gacagatagt ttactgctcc 2640

ttggcaagct agcgtctctg ttttccctta ccttttcaat cagtgcagca aataaggatc 2700

ctgatatggc ggccatactc gagaaaaata agtctgattc tggaggacag atctttgttc 2760

ctgctggagg gtttggcaag ctcaaactgc ttcgcatatt tgtacctctt cttccatctc 2820

tgaacttctc aaagaaggcc atgccgcagc tcgaaaggct tgagctccgt ttcaaaagat 2880

tggaaggtgt tcatggaatg gacagactcg gaagcctcca tgatgtgctc ttaacagttg 2940

atgacaaagc aggtgaacct acaacgtcga tactagaaga tatgaaggga agctcatcga 3000

ggaagtatgc cctaattatt aacgagtatc atgattgagt ggaattgatt gcaaatccgg 3060

ctaaaattat cttgtctctc atcttgggag cggaactggt tgctgcttgt atctaaattt 3120

gtaatttact cactgtactg gtgtattatg ggtcaaattg taagggtgca ttaagacctt 3180

taatatgttg cattttaata aaaaaaaaaa aaagaaaaaa aaaaaaaaaa aa 3232

<210> 2

<211> 977

<212> PRT

<213> 小麦TaRPP13多肽链氨基酸序列

<400> 2

Met Glu Leu Ala Val Gly Ala Ser Glu Ala Thr Ile Lys Ser Leu Leu

1 5 10 15

Ile Lys Leu Gly Gly Leu Leu Ala Glu Glu Tyr Ala Leu Ile Arg Gly

20 25 30

Val Arg Gly Asp Ile Gln Phe Ile Asn Asp Glu Leu Ala Ser Met Gln

35 40 45

Ala Phe Leu Ser Asn Leu Ser Arg Ser Gly Thr Asp Gly His Asp Asp

50 55 60

Gln Thr Asp Asp Trp Met Lys Gln Val Arg Asp Val Ser Tyr Asp Ile

65 70 75 80

Glu Asp Cys Val Asp Asp Phe Ala His Gly Leu Arg Pro Asp Pro Arg

85 90 95

Gly Gly Gly Leu Trp Ser Met Ile Arg Arg Thr Leu Tyr Glu Ile Gln

100 105 110

Thr Tyr Phe Pro Arg Arg Asn Ile Ala Ala Gln Ile Val His Leu Lys

115 120 125

Gln Arg Ala Gln His Val Gly Glu Arg Arg Gly Arg Tyr Gly Val Pro

130 135 140

Asp Pro Ile Pro Gly Arg Lys Lys Ser Ser Ser Gly Gly Ala Thr Gly

145 150 155 160

Tyr Leu Ala Ala Glu His Gln Glu Thr Thr Arg Trp Leu Val Gly Ile

165 170 175

Lys Glu Pro Val Gly Val Glu Glu Asp Met Glu Asp Leu Lys Lys Trp

180 185 190

Ile Leu Ser Asp Glu Asn Lys Gln Gln Leu Gly Val Leu Ser Ile Val

195 200 205

Gly Phe Gly Gly Val Gly Lys Thr Thr Ile Ala Met Ala Leu Tyr Arg

210 215 220

Lys Tyr Gly Asp Gln Phe Gln Arg Arg Ala Met Val Thr Val Ser Gln

225 230 235 240

Asn Ser Asp Ser Glu Ala Val Leu Arg Asp Ile Leu Ser Gln Val Lys

245 250 255

Pro Gln Asp Ser Ser Glu Glu Gln Arg Gly Gln His Ser Ala Gly Ala

260 265 270

Val Ser Glu Lys Thr Asn Gln Ala Ala Leu Phe Arg Arg Thr Leu Ser

275 280 285

Arg Ile Ile Ser Pro Thr Arg Asn Gln Glu Glu Asp Gln Glu Lys His

290 295 300

Thr Gly Ile Gln Thr Glu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Val Gly Arg Tyr

305 310 315 320

Leu Leu Leu Ile Asp Asp Val Trp Ser Ser Ser Thr Trp Gln Asn Ile

325 330 335

Lys Arg Tyr Phe Pro Glu Asn Asn Asn Gly Ser Arg Ile Ile Val Thr

340 345 350

Thr Arg Phe Gln Ala Val Ala Thr Thr Cys Ser Thr His Lys Asp Asn

355 360 365

Asp Arg Val His Pro Val Asn Val Leu Ser Asp Asp Glu Pro Arg Lys

370 375 380

Leu Phe Gln Lys Ser Leu Ser Glu Cys Lys Gly Ala Thr Ser Asn Gln

385 390 395 400

Gln Ser Trp His Asn Ile Pro Asp Arg Val Trp Gly Met Cys Gly Gly

405 410 415

Leu Pro Leu Ala Val Val Thr Met Ala Gly Leu Val Ala Ser Lys Pro

420 425 430

Leu Arg Ile Lys Asp Glu Trp Ala Thr Val Cys Asp Ser Leu Phe Pro

435 440 445

Glu Pro Glu Lys Cys Arg Lys Pro Glu Asp Phe Met Arg Ile Ile Asn

450 455 460

Phe Cys Tyr His Asp Leu Pro Ser Asp Leu Lys Thr Cys Cys Leu Tyr

465 470 475 480

Leu Ser Ile Phe Pro Lys Gly Arg Lys Thr Ser Arg Asn Arg Leu Ile

485 490 495

Arg Arg Trp Ile Ala Glu Gly Phe Val Ser Glu Lys Gln Gly Leu Ser

500 505 510

Val Glu Asp Val Ala Glu Thr Cys Phe Asn Gln Leu Ile Glu Arg Lys

515 520 525

Ile Met Arg Pro Val Glu His Ser Ser Asn Gly Arg Val Lys Ser Cys

530 535 540

Gln Val His Asp Met Val Leu Glu Tyr Ile Ile Ser Lys Ala Ala Glu

545 550 555 560

Glu Asp Phe Ile Thr Val Ile Gly Gly Tyr Trp Ser Met Ala Thr Arg

565 570 575

Ser Asn Lys Val Arg Arg Leu Ser Leu His Asn Ser Asp Ser Lys His

580 585 590

Ala Lys Lys Ala Ala Ser Met Asn Leu Ser His Val Arg Ser Leu Thr

595 600 605

Val Phe Gly Ser Leu Gly Gln Leu Arg Phe Lys Ser Phe Lys Thr Gly

610 615 620

Ile Val Gln Val Leu Asp Leu Glu Gly Cys Arg Gly Phe Lys Ala Lys

625 630 635 640

His Val Ser Val Ser Asp Ile Cys Glu Met Thr Leu Leu Lys Tyr Leu

645 650 655

Ser Leu Arg Gly Thr Asp Val Ser Lys Leu Pro Ser Lys Ile Gly Asn

660 665 670

Leu Lys Tyr Leu Glu Thr Leu Asp Ile Arg Glu Thr Glu Ile Gln Glu

675 680 685

Leu Pro Lys Thr Val Ala Gln Leu Glu Arg Ile Ser Asn Ile Leu Gly

690 695 700

Gly Asp Lys Lys Thr Arg Lys Thr Leu Lys Leu Pro Lys Asp Val Lys

705 710 715 720

Gly Thr Met Lys Asp Leu Arg Ile Leu Ser Gly Val Glu Ile Val Glu

725 730 735

Gly Ser Thr Ala Ala Ser Asp Leu Gly Tyr Phe Thr Arg Leu Arg Lys

740 745 750

Leu Ala Ile Tyr Lys Leu His Lys Gly Asp Gln Met Phe Lys Asp Leu

755 760 765

Leu Ser Ser Ile Gln Tyr Leu Ser Gly Tyr Ser Leu Gln Thr Leu Val

770 775 780

Ile Asp Asp Asp Ser Ser Glu Phe Leu Asn Thr Leu Asp Ser Met Thr

785 790 795 800

Ser His Pro Thr Asp Leu Arg Thr Leu Glu Leu Ser Gly Lys Leu Phe

805 810 815

Gln Val Pro Lys Trp Leu Pro Asp Leu Ser Glu Leu Ile Lys Leu Thr

820 825 830

Leu Ser Ala Thr Val Leu Arg Thr Asp Ser Leu Leu Leu Leu Gly Lys

835 840 845

Leu Ala Ser Leu Phe Ser Leu Thr Phe Ser Ile Ser Ala Ala Asn Lys

850 855 860

Asp Pro Asp Met Ala Ala Ile Leu Glu Lys Asn Lys Ser Asp Ser Gly

865 870 875 880

Gly Gln Ile Phe Val Pro Ala Gly Gly Phe Gly Lys Leu Lys Leu Leu

885 890 895

Arg Ile Phe Val Pro Leu Leu Pro Ser Leu Asn Phe Ser Lys Lys Ala

900 905 910

Met Pro Gln Leu Glu Arg Leu Glu Leu Arg Phe Lys Arg Leu Glu Gly

915 920 925

Val His Gly Met Asp Arg Leu Gly Ser Leu His Asp Val Leu Leu Thr

930 935 940

Val Asp Asp Lys Ala Gly Glu Pro Thr Thr Ser Ile Leu Glu Asp Met

945 950 955 960

Lys Gly Ser Ser Ser Arg Lys Tyr Ala Leu Ile Ile Asn Glu Tyr His

965 970 975

Asp

Claims

1.一种栽培小麦Brock中一个抗白粉病基因TaRPP13 cDNA序列，其特征在于该cDNA全长3232bp；有一个长104bp的5’UTR和长194bp的3’UTR以及长 2934bp的开放阅读框；编码一个977aa的多肽链，所述的cDNA序列为：SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的栽培小麦Brock中抗白粉病基因TaRPP13 cDNA序列，其特征在于，该基因的编码区长 2934bp，编码977aa多肽链的氨基酸序列为：SEQ ID NO:2所示。

3.权利要求1所述栽培小麦Brock中一个抗白粉病基因TaRPP13 cDNA序列在用于小麦抗病育种方面的应用。

4.权利要求1所述栽培小麦Brock中一个抗白粉病基因TaRPP13 cDNA序列在用于小麦对白粉菌的抗性反应方面的应用。