CN116240209A - 中国春小麦中受白粉菌强诱导的增强子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程领域,公开了中国春小麦中受白粉菌强诱导的增强子及其应用,该增强子具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。该增强子DNA序列来自于中国春小麦,在接种白粉菌后,基因表达水平明显增强。该CSPMIE增强子序列可望用于以下方面:(1)利用基因编辑技术编辑该序列,可改良中国春小麦对白粉菌的抗病性;(2)有利于中国春小麦和其它白粉菌敏感型小麦品种中抗病基因的挖掘和相关机制研究。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域,公开了一段中国春小麦中受白粉菌强诱导的增强子DNA序列及其应用。
背景技术
小麦白粉病,属于真菌性病害,在整个小麦生育期内,均可发生的一种比较常见的病害,对中国及全球小麦生产造成重大损失。中国春是一个非常重要的小麦地方品种,被广泛应用于小麦遗传学研究。它最早是从中国通传教士传入西方,起初被称为ChineseWhite,后来又被命名Chinese Spring并沿用至今,即中国春。中国春苗期为中感白粉病,易受白粉菌的侵染,影响其生产。
增强子是一段可直接与调控蛋白质相结合,并增强相关基因表达的DNA序列。增强子对相关基因表达的调控具有无距离和无方向性,这样增加了对其进行准确鉴定的难度,特别是诱导型增强子DNA序列。增强子等DNA调控元件通常位于基因组中开放染色质位点,部分调控元件可通过鉴定开放染色质位点方法进行识别。本发明利用白粉病诱导前后的中国春小麦叶片为研究材料,通过在全基因组水平鉴定开放染色质位点,挖掘出一个受白粉菌强诱导的增强子DNA序列。通过序列截短用于瞬时转化验证,确定了该增强子序列长度为139bp。
外源基因导入植物体基因组中的方法主要有:原生质体转化法、基因枪法、病毒介导法、农杆菌介导法和激光束转化法等。纳米是一种新型的化学材料,现已广泛应用于医学、制药以及农业领域。此外,已有报道显示,纳米可以通过包裹质粒,将外源基因递送到活体植物中,达到瞬时转化的目的。同样,我们将一定浓度的纳米与含有139bp增强子DNA序列的瞬时转化载体按一定比例进行混合,制成纳米共转化溶液,通过涂抹在中国春小麦叶片,结合白粉菌侵染,观察该增强子DNA序列在白粉菌侵染前后对GFP报道基因的表达水平的影响,从而确实其受白粉菌诱导的增强子活性。该增强子序列的鉴定对中国春及其它白粉菌敏感型小麦品种的白粉菌抗病性的改良具有非常重要的意义。
发明内容:
本发明的目的是提供一段中国春小麦中受白粉菌强诱导的增强子DNA序列。
本发明的另一个目的是提供装载该增强子DNA序列的瞬时表达载体。
本发明的又一目的是提供该增强子DNA序列在中国春及其它白粉菌敏感型小麦品种的白粉菌抗病性改良或生物育种中的应用。
本发明的目的可以通过如下技术方案实现:
一种受白粉菌强诱导的增强子,该增强子具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。该受白粉菌强诱导的增强子DNA序列(CSPMIE),来自于中国春小麦(Chinese Spring)。其核苷酸核心序列为:
5’ACAACAGTCGTGATGCCTCCCTACAAGTCCCTCCATTACTCTGATATTTTTCTTG ACAATTTTGCAAATGAGCACACGATCTACCTTGTAAACAAATATGAGTACATAAAGACTG GAAAAGGTACCCTGTGACTTTGAC—3’。
含有上述增强子的DNA序列(CSPMIE)的生物材料,所述的生物材料为重组载体、表达盒或重组菌。
所述的重组载体为瞬时表达载体,该瞬时表达载体是以Pjit163-hGFP为骨架载体,将上述的增强子DNA序列插入该骨架载体的KpnI和SacI酶切位点间所得。
上述的受白粉菌强诱导的增强子或上述的生物材料在改良白粉菌敏感型小麦品种对白粉菌的抗病性中的应用。
上述的受白粉菌强诱导的增强子或上述的生物材料在改良白粉菌敏感型小麦品种对白粉菌抗病性的抗病育种中的应用。
研究表明,所述的本发明鉴定的增强子DNA序列(CSPMIE)以及表达载体可用于改良中国春及其它白粉菌敏感型小麦品种的白粉菌抗病性以及中国春小麦中白粉菌相关的表观遗传学基础研究。
本发明的有益效果:
本发明首次报道了,从中国春小麦基因组中鉴定到一段受白粉菌强诱导的增强子DNA序列CSPMIE。将其插入瞬时表达载体pJIT163-hGFP。利用纳米介导的活体小麦叶片的瞬时转化体系,在接种白粉菌48h后,观察到了GFP信号大大增强。如对其核心基因序列进行编辑,可提高中国春小麦对白粉病的抗性,有利于中国春小麦中抗病基因的挖掘,最终有利于保障国家粮食产量及安全。
附图说明
图1为受白粉菌诱导的增强子DNA序列(CSPMIE)的瞬时表达载体的构建示意图。
图2为受白粉菌诱导的增强子DNA序列(CSPMIE)在活体中国春小麦幼苗叶片中瞬时表达结果;其中,A为中国春小麦白粉菌诱导前报告基因GFP的荧光信号;B为中国春小麦白粉菌诱导后报告基因GFP的荧光信号。
具体实施方式
实施例1克隆白粉菌强诱导的增强子DNA序列(CSPMIE)及载体构建
小麦是单子叶植物,基因组已完成测序。受白粉菌诱导的白粉菌强诱导的增强子DNA序列(CSPMIE)是由本发明技术人员根据MNase-seq鉴定出MNase超敏感位点(MNaseIhypersensitive sites,MHSs),多数位于基因组中开放性染色质位点,同时结合白粉菌侵染前后RNA-seq数据分析,得到了该增强子DNA序列。然后,利用PCR扩增方法,从中国春小麦基因组中,将该增强子DNA序列(CSPMIE)克隆到艾德莱pTOPO载体上,测序并比对序列,其核苷酸核心序列为:
5’ACAACAGTCGTGATGCCTCCCTACAAGTCCCTCCATTACTCTGATATTTTTCTTGA CAATTTTGCAAATGAGCACACGATCTACCTTGTAAACAAATATGAGTACATAAAGACTGG AAAAGGTACCCTGTGACTTTGAC—3’。
最后,用该增强子DNA特异的引物F(ATGGCGCCCACCGTGATGAT)和R(ACGGCGGAAGGATCCGGTGC)进行PCR扩增,并将扩增产物构建到瞬时转化载体上:以Pjit163-hGFP[1]为骨架载体,将所述的CSPMIE的增强子DNA序列插入骨架载体Pjit163-hGFP的KpnI和SacI酶切位点间所得,如图1所示。
实施例2纳米共转体系制备及转化
通过该方法转化了中国春小麦的活体叶片。
步骤:
1)培养正常生长的绿化苗,选取小麦生长五天左右的幼苗。同时纯化可用于转化用的由实施例1制备的质粒DNA;
2)取1.5ml tube配制纳米共转体系(Tween-20 3μl、纳米20μl、质粒10ng、ddH2O补齐500μl),37℃水浴锅孵育30min;
3)用小刷子蘸取混后质粒DNA(实施例1构建)的纳米溶液后,均匀地涂抹在小麦叶片上,每个做3个重复,用马克笔标记好涂抹区域,便于后面取样观察。
实施例3将涂抹后的小麦植株接种白粉菌及观察GFP信号
涂抹后的小麦植株接种白粉菌后放于培养箱里生长48h。用刀片取少许叶片,利用激光共聚焦荧光显微镜观察并记录白粉菌接种前后的GFP荧光信号强度。
结果显示,利用纳米介导的活体小麦叶片的瞬时转化体系,在接种白粉菌48h后,观察到了GFP信号大大增强,如图2所示。
如对其核心基因序列进行编辑,可提高中国春小麦对白粉病的抗性,有利于中国春小麦中抗病基因的挖掘,最终有利于保障国家粮食产量及安全。
实施例4该增强子在改良白粉菌敏感型小麦品种对白粉菌的抗病性中的应用
构建利用该增强子驱动的白粉菌抗性基因的超表达载体,通过纳米或农杆菌介导转化白粉菌敏感型小麦品种,进一步提高白粉菌敏感型小麦品种对白粉菌的抗病性。另外,通过比较白粉菌敏感型和抗性小麦品种中该增强子序列多态性,结合基因编辑技术,有利于提高白粉菌敏感型小麦品种对白粉菌的抗病性。
实验过程:
1)培养正常生长的绿化苗,选取感病材料,中国春小麦生长五天左右的幼苗叶片。
2)找一个在中国春中已经报道过的抗白粉病基因,将其克隆下来并测序。确保测序正确后,将其构建到小麦转基因载体上并提取质粒备用。
3)将上述质粒与含有该增强子载体的质粒(如实施例1构建的)按照一定比例(例如1:1)混合,制备成纳米共转化体系。
4)将其涂抹到材料的叶片上,并用不做处理的叶片以及只导入抗病基因的叶片做对照。每次做3个重复。
5)对材料接种白粉菌并放在适宜发病的生长条件下生长。
6)48h后,用显微镜观察叶片上的白粉菌菌丝生长状态并对比材料叶片的感病情况。发现将抗病基因与该增强子一起导入时,抗病效果更明显。
参考文献:
1.Yuan Fang,Ximeng Wang,等.Functional characterization of openchromatin in bidirectional promoters of rice.Scientific Reports,6:32088.
Claims (5)
1.一种受白粉菌强诱导的增强子,其特征在于,该增强子具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述增强子的生物材料,其特征在于,所述的生物材料为重组载体、表达盒或重组菌。
3.根据权利要求2所述的生物材料,其特征在于,所述的重组载体为瞬时表达载体,该瞬时表达载体是以Pjit163-hGFP为骨架载体,将权利要求1所述的增强子序列插入该骨架载体的KpnI和SacI酶切位点间所得。
4.权利要求1中所述的受白粉菌强诱导的增强子或权利要求2中所述的生物材料在改良白粉菌敏感型小麦品种对白粉菌的抗病性中的应用。
5.权利要求1中所述的受白粉菌强诱导的增强子或权利要求2中所述的生物材料在改良白粉菌敏感型小麦品种对白粉菌抗性的抗病育种中的应用。
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