CN114349835A

CN114349835A - GhREM蛋白及其编码基因在调控棉花抗蚜性能中的应用

Info

Publication number: CN114349835A
Application number: CN202210016594.XA
Authority: CN
Inventors: 杨君; 马峙英; 吴立强; 王省芬; 张慧敏; 孙正文; 柯会锋; 王国宁; 孟成生
Original assignee: Hebei Agricultural University
Current assignee: Hebei Agricultural University
Priority date: 2022-01-07
Filing date: 2022-01-07
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2042-01-07
Also published as: CN114349835B

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体公开了GhREM蛋白及其编码基因在调控棉花抗蚜性能中的应用。本发明发现棉蚜在GhREM基因沉默棉苗上的繁殖数量显著高于未沉默植株，表明GhREM基因可影响棉蚜在棉花上的增殖，在改良棉花抗蚜性和棉花育种中具有重要应用价值。

Description

GhREM蛋白及其编码基因在调控棉花抗蚜性能中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地说，涉及GhREM蛋白及其编码基因在调控棉花抗蚜性能中的应用。

背景技术

棉蚜(Aphis gossypii Glover)是棉花上的重要害虫之一，以成蚜和若蚜在植物叶背面、嫩稍和嫩茎上刺吸为害。被棉蚜刺吸取食后的植物常发生叶片失绿变黄、皱缩畸形、卷曲不展，导致植株发育不良、生长受阻，造成产量和品质下降。棉蚜在取食的同时还会分泌蜜露，不仅影响植物光合和呼吸作用，还会滋生霉菌，显著降低棉纤维品质。棉蚜繁殖速度惊人，使得化学杀虫剂被高频使用，不仅导致耐药性棉蚜的大量出现，引起用药剂量的随意增高，而且极易造成环境污染。因此，研发抗蚜品种成为一种重要的防治选择。

Remorin蛋白是一种与质膜/脂筏相连，定位在膜微区的植物特异性寡聚丝状家族蛋白，通过免疫信号转导在植物生长、发育、生物和非生物胁迫等过程中发挥重要作用。Remorin的克隆与功能研究，不仅为揭示其介导的植物发育和抗逆作用机制提供新思路，还将为培育具有优异性状的作物提供新颖基因。

发明内容

本发明的目的是提供一种可有效调控棉花抗蚜性能的方法。

具体地，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供GhREM蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在调控棉花抗蚜性能中的应用。

第二方面，本发明提供GhREM蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在棉花抗蚜性能种质资源改良中的应用。

本发明中，所述GhREM蛋白具有以下任意一种氨基酸序列：

(1)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；或

(2)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。

所述GhREM蛋白的开放读码框具有以下任一种核苷酸序列：

(1)SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，或

(2)SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；

(3)在严格条件下可以与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。

第三方面，本发明提供一种改变棉花抗蚜性能的方法，其通过转基因、基因敲除、RNA干扰、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，控制植物对GhREM基因的表达。

所述转基因包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导或农杆菌介导的方法将包含所述GhREM基因的重组表达载体导入植物，获得转基因植物株系。

所述基因敲除包括利用DNA同源重组技术、Cre/LoxP技术或CRISPR/Cas9技术将所述GhREM基因敲除，获得转基因植物株系。

本发明的有益效果至少在于：

本发明提供了GhREM(Gossypium hirsutum Remorin)蛋白及其编码基因在调控棉花抗蚜中的应用。本发明从陆地棉农大棉8号中克隆得到GhREM基因，成功构建了病毒诱导GhREM基因沉默载体，并在棉花中沉默了该基因。棉蚜在GhREM基因沉默棉苗上的繁殖数量显著高于未沉默植株，表明GhREM基因可影响棉蚜在棉花上的增殖，在改良棉花抗蚜性和棉花育种中具有重要应用价值。

附图说明

图1为琼脂糖凝胶电泳检测用于GhREM沉默的基因片段的结果。其中，M：Maker；1，2，3：用于基因沉默载体构建的GhREM基因片段。

图2为棉蚜在两个棉花品种上的繁殖数量比较结果。***代表P＜0.001。

图3为GhREM在棉花中受棉蚜取食诱导表达的结果。***代表P＜0.001。

图4为GhREM在棉花中的表达检测结果。***代表P＜0.001。

图5为GhREM沉默后棉蚜繁殖数量统计结果。*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。

图6为棉蚜在GhREM沉默和非沉默(对照)棉苗上生长繁殖6天后的表型对比照片。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1

1材料与方法

1.1棉花材料

本试验所用棉花品种为农大棉8号(ND-8)，由河北农业大学棉花品种创新与产业化团队选育，审定编号为“冀审棉2006001号”。棉花资源品种Sulianmian12(SLM-12)和Huabanye(HBY)由河北农业大学棉花品种创新与产业化团队保存，公开于Ma ZY,He SP,Wang XF,Sun JL,Zhang Y,Zhang GY,Wu LQ,Li ZK,Liu ZH,Sun GF et al:Resequencinga core collection of upland cotton identifies genomic variation and lociinfluencing fiber quality and yield.Nat Genet 2018,50(6):803-813。

1.2棉蚜饲养

试验所用棉蚜取自河北农业大学棉花育种试验地，在室内25℃和45％～60％相对湿度，14h光照和10h黑暗的照明环境中继代培养。繁育8代后的棉蚜用于生物测定试验。

1.3棉花RNA提取和cDNA合成

将棉花叶片于研磨钵内，通过液氮研磨至粉末状后用于RNA提取。RNA提取使用天根生化科技(北京)有限公司的“RNAprep pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒”。通过琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop检测所提RNA的完整度和浓度。使用宝生物工程有限公司的PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒，将RNA反转录成cDNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.4PCR和荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)

PCR反应于ABI 2720型PCR仪中进行。PCR产物的回收使用

GelExtraction Kit。限制性内切酶EcoR I和Sac I购自Thermo Fisher Scientific公司。使用ABI QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪系统进行qPCR反应与检测。

Premix ExTaq^TM荧光定量试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。引物合成和核酸序列测定委托生工生物工程上海(股份)有限公司完成。

1.5蚜虫繁殖数量统计

具有2片真叶的棉苗用于接虫处理。每6株长势均匀的棉苗作为一次重复，共重复3次。每株棉苗接1头3龄若虫，接种操作如下：(1)首先晃动繁殖虫源棉株，使棉蚜自行掉落到白纸上，观察蚜虫是否有生命迹象；(2)用细毛笔将活跃的棉蚜接种至棉苗第一片真叶的正面；(3)待蚜虫固定取食后，将其放入养虫笼培养；(4)通过浇灌Hoagland营养液来补充棉苗生长所需养分。接种15d后统计虫口数量。

1.6病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)技术

按照Gao等(2011)的方法(参见Gao XQ,C.Britt Jr.R,Shan LB,He P:Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing assay in cotton.J Vis Exp2011(54):e2938)进行操作，以CLA1(Cloroplastos alterados 1)作为沉默对照基因。其中所用载体pTRV1和pTRV2，及农杆菌GV3101由河北农业大学棉花品种创新与产业化团队保存和提供。

向GhREM沉默和非沉默(对照)棉苗(两片真叶期)上，每株接种饥饿处理12h的雌性母蚜(每片真叶各接5头)。每6株设一次重复，共3次重复。每12h观察一次蚜虫定殖情况，连续观察统计6天。

2试验结果

2.1 GhREM的克隆与VIGS载体构建

以ND-8棉花cDNA为模板，利用引物REM-F(5′-ATGGCAGATGTCGAAGAACCCAA-3′，SEQID No.1)和REM-R(5′-TCAACAACAACCAAGGGTCTTGTTCGG-3′，SEQ ID No.2)进行PCR扩增。PCR产物通过胶回收后与

克隆载体连接(pEASY-GhREM)并测序。成功获得GhREM开放读码框，全长576bp(SEQ ID No.3)，可编码191个氨基酸残基(SEQ ID No.4)。

提取pEASY-GhREM质粒，并以之为模板，通过GhREM-F(5′-GAATTCGCAGATGTCGAAGAACCCAA-3′，SEQ ID No.5)和GhREM-R(5′-GAGCTCACTCCTCCGCTTTGAGAACA-3′，SEQ ID No.6)引物扩增，获得约500bp的扩增产物(琼脂糖凝胶电泳结果见图1)。使用限制性内切酶EcoR I和Sac I分别对胶回收的扩增产物和pTRV2载体进行双酶切，使用连接酶在16℃下连接4h。连接产物用大肠杆菌感受态细胞TOP10完成转化。提取测序正确的阳性克隆质粒pTRV2-GhREM，并将其转入农杆菌GV3101。

2.2 GhREM受棉蚜取食诱导表达

将棉蚜接种到SLM-12和HBY两个棉花资源品种。经过15天的繁殖调查结果显示，棉蚜在SLM-12上的繁殖数量显著高于HBY(图2)，表明SLM-12比HBY更适合于棉蚜繁殖，即HBY比SLM-12具有更好的抗蚜性。

通过qPCR检测GhREM在这两个棉花品种中的表达情况。如图3所示，在棉蚜取食后，GhREM在两个棉花中均发生了上调表达，且表达峰值均出现在取食后6h，表明GhREM的表达与棉蚜的取食相关。GhREM在抗蚜HBY品种中的表达显著高于SLM-12，表明GhREM与棉花的抗蚜性相关。

2.3沉默GhREM显著降低棉花对蚜虫的抗性

向两叶一心期的ND-8棉苗子叶中注射农杆菌7天后，CLA1沉默植株真叶表现白化，表明VIGS技术体系已发挥功能。

此时，对注射pTRV2-GhREM的棉苗进行qPCR检测。结果显示：GhREM的表达量仅为对照植株的30％(图4)，即GhREM的沉默效率达到70％。

对棉苗进行接蚜处理，连续观察并统计蚜虫的繁殖情况。结果显示：在接种蚜虫4.5天后，GhREM沉默棉苗上的蚜虫数量开始显著高于对照组，且这种显著趋势一直持续到第6天(参见图5，图6)。表明GhREM沉默显著降低了棉花的抗蚜性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 河北农业大学

<120> GhREM蛋白及其编码基因在调控棉花抗蚜性能中的应用

<130> KHP221110005.2

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcagatg tcgaagaacc caa 23

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcaacaacaa ccaagggtct tgttcgg 27

<210> 3

<211> 576

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcagatg tcgaagaacc caagaagctt gaatccgaaa tcccctccga ccctccgccg 60

ccacccaccg aagccgccgt ggaaaaatcc gtgactccac ctcctcctac tgaagaaaag 120

cccgccgact ctacggaaaa gcctcccgaa cccatcgaaa aggcggcaga gtcgacggag 180

aagaaaagca cggaggtgtc tgttgatcga gatgctgtgc ttgctagagt tgcgactgag 240

aagcgaattt cactaatcaa cgcttgggaa gaaagtgaaa aaagcaaagc tgagaacaaa 300

gcacagaaga agctttcttc tattgcggct tgggagaata ccaagaaagc agctatagag 360

gctgagctaa aaaggattga ggaaaagtta gacaagcaga aggccgagta tgtggaaaaa 420

atgaaaaaca aggcagcctt aatccacaag gaagcagaag agaagaaggc aatcgttgaa 480

gctaagcgag gggaggatgt tctcaaagcg gaggagttgg cggcaaagta ccgtgccacc 540

ggaaccactc cgaacaagac ccttggttgt tgttga 576

<210> 4

<211> 191

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ala Asp Val Glu Glu Pro Lys Lys Leu Glu Ser Glu Ile Pro Ser

1 5 10 15

Asp Pro Pro Pro Pro Pro Thr Glu Ala Ala Val Glu Lys Ser Val Thr

20 25 30

Pro Pro Pro Pro Thr Glu Glu Lys Pro Ala Asp Ser Thr Glu Lys Pro

35 40 45

Pro Glu Pro Ile Glu Lys Ala Ala Glu Ser Thr Glu Lys Lys Ser Thr

50 55 60

Glu Val Ser Val Asp Arg Asp Ala Val Leu Ala Arg Val Ala Thr Glu

65 70 75 80

Lys Arg Ile Ser Leu Ile Asn Ala Trp Glu Glu Ser Glu Lys Ser Lys

85 90 95

Ala Glu Asn Lys Ala Gln Lys Lys Leu Ser Ser Ile Ala Ala Trp Glu

100 105 110

Asn Thr Lys Lys Ala Ala Ile Glu Ala Glu Leu Lys Arg Ile Glu Glu

115 120 125

Lys Leu Asp Lys Gln Lys Ala Glu Tyr Val Glu Lys Met Lys Asn Lys

130 135 140

Ala Ala Leu Ile His Lys Glu Ala Glu Glu Lys Lys Ala Ile Val Glu

145 150 155 160

Ala Lys Arg Gly Glu Asp Val Leu Lys Ala Glu Glu Leu Ala Ala Lys

165 170 175

Tyr Arg Ala Thr Gly Thr Thr Pro Asn Lys Thr Leu Gly Cys Cys

180 185 190

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaattcgcag atgtcgaaga acccaa 26

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gagctcactc ctccgctttg agaaca 26

Claims

1.GhREM蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在调控棉花抗蚜性能中的应用。

2.GhREM蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在棉花抗蚜性能种质资源改良中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述GhREM蛋白具有以下任意一种氨基酸序列：

(1)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；或

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述GhREM蛋白的开放读码框具有以下任一种核苷酸序列：

(1)SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，或

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。

6.改变棉花抗蚜性能的方法，其特征在于，通过转基因、基因敲除、RNA干扰、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，控制植物对GhREM基因的表达。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述转基因包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导或农杆菌介导的方法将包含所述GhREM基因的重组表达载体导入植物，获得转基因植物株系。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述基因敲除包括利用DNA同源重组技术、Cre/LoxP技术或CRISPR/Cas9技术将所述GhREM基因敲除，获得转基因植物株系。