CN104404054A

CN104404054A - 玉米抗丝黑穗病相关基因ZmNL的克隆鉴定及其在抗丝黑穗病玉米育种中的用途

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Publication number: CN104404054A
Application number: CN201410675794.1A
Authority: CN
Inventors: 邸宏; 王振华; 于滔; 曾兴; 刘显君; 张�林
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2014-11-21
Filing date: 2014-11-21
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2034-11-21
Also published as: CN104404054B

Abstract

本发明公开了玉米抗丝黑穗病相关基因ZmNL的克隆鉴定及其在抗丝黑穗病玉米育种中的用途。研究表明，该基因位于玉米主效抗丝黑穗病区域(bni2.09)区域内，受到丝轴黑粉菌胁迫后，其表达量在抗病玉米材料中显著高于感病材料。其编码的蛋白为膜蛋白，多表达于内质网膜及质膜上，具有R蛋白的保守基序。原核表达试验证明该基因的编码蛋白能够抑制丝轴黑粉菌的生长。转化该基因的玉米株系人工接种丝轴黑粉菌后发病率显著低于未接种的受体对照材料。本发明所提出的ZmNL基因对玉米抗丝黑穗病的防治具有重要意义，可用于玉米抗丝黑穗病分子育种的研究。

Description

玉米抗丝黑穗病相关基因ZmNL的克隆鉴定及其在抗丝黑穗病玉米育种中的用途

技术领域

本发明涉及玉米抗丝黑穗病相关基因ZmNL的克隆鉴定及其在抗丝黑穗病玉米育种中的用途。本发明属于基因工程技术领域。

背景技术

玉米丝黑穗病(Sphacelotheca reiliana(Kühn)Clint.)是世界春播干旱、冷凉玉米产区普遍发生的真菌病害，也是我国玉米生产(北方春玉米区)上的主要病害之一。2002年仅因玉米丝黑穗病，东北三省直接损失玉米1.2亿kg，农民减收9600万元(以2002玉米单价，0.8元/kg)造成相当严重的经济损失(王晓鸣等，2003)。利用栽培措施和药物防治玉米丝黑穗病，既增加生产投入，又带来了环境污染。另外，前人研究已经发现在玉米种质中存抗丝黑穗病材料(王振华，2004；孙志超，2007；郭满库，2007；王燕，2010)。因此，加强培育和推广抗病品种是最为有效的措施，也是农业低碳和可持续发展的有效途径。抗病育种的关键在于对抗源的把握和对抗病规律的认识。

玉米丝黑穗病抗性属数量性状遗传，同时受到加性、显性和上位性效应协同控制^[8-12]，其中以加性和显性效应为主^[70]，同时抗病性与生态条件、水热条件有关，且易受母本类型和各种修饰因子的影响。目前，关于玉米丝黑穗病的分子遗传研究主要集中在玉米丝黑穗病抗病QTL定位和玉米丝黑穗病抗病相关候选基因挖掘两方面。

利用不同的抗丝黑穗病玉米种质构建的定位群体(BC，F2:3等)中已经初步定位了至少15个相关抗丝黑穗病的数量性状基因位点(QTL)，其中位于第2染色体的bin2.09区域的主效QTL，能在多个研究中被重复检测到，平均解释表型变异率35％左右(Lü等，1999；Lu等，1999；Li等，2008；Chen等,2008；Shi等，2010)；同时，结合分子生物信息学和功能基因组学也挖掘出一系列抗病QTL、抗病基因类似物(RGA，Resistance Gene Analog)和丝黑穗病抗性相关的候选基因(TUGs，tentative unique genes)(吉海莲等，2007；张书红等，2007)。

分子生物技术及生物信息技术的飞速发展为玉米丝黑穗病抗病候选基因的发掘提供了良好的平台。倪琛(2006)以对丝黑穗病表现明显抗性差异的玉米自交系Mo17(高抗)和黄早四(高感)为试材，采用SSH和cDNA芯片两种功能基因研究的方法，对同一试材幼苗期接种与不接种两种状态下所表达的差异基因进行比较分析，筛选到一些受玉米丝黑穗病原菌侵染所诱导表达的基因，主要为赤霉素激发转录蛋白、类成熟蛋白、衰老相关蛋白等。吉海莲等(2007)以玉米遗传连锁图谱BM22005Neighbors为参考图谱，通过映射整合不同试验中的抗玉米丝黑穗病QTL，构建QTL综合图谱。采用元分析技术结合生物信息学技术在2个“一致性”QTL区间内初步获得4个抗病位置候选基因。Wang等(2012)利用MaizeSNP50芯片对两年两地144个自交系在人工接种条件下的抗性表型和SNP基因型进行了全基因组关联分析，筛选到18个玉米丝黑穗病抗性相关候选基因，这些基因分别为抗病基因，抗病应答基因以及植物抗病功能基因。

目前，结合分子生物技术和生物信息技术，研究人员获得了一些抗性相关候选序列及基因，但并未真正意义上分离、克隆到主效抗病基因。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种与玉米抗丝黑穗病相关的基因，命名为ZmNL。

本发明的目的之二在于提供所述玉米ZmNL基因在抗丝黑穗病玉米育种中的应用，

本发明的目的之三在于提供所述ZmNL基因的编码蛋白在制备丝轴黑粉菌生长抑制剂中的用途。

本发明的目的之四在于提供一种利用所述的ZmNL基因进行抗丝黑穗病转基因玉米育种的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明以玉米自交系B73RefGen_v2染色体上2.09区域的DNA序列为研究对象，利用在线预测基因软件Fgenesh对该段核苷酸序列进行生物信息学分析，发现1个玉米抗丝黑穗病候选基因，命名为ZmNL。该ZmNL基因全长8640bp，转录起始于1993bp，终止于8264bp，具有典型的PolyA尾巴，为完整的基因。ZmNL基因包含两个外显子，一个内含子。根据预测获得的玉米抗丝黑穗病候选基因ZmNL的全长序列，通过进一步扩增最终获得玉米抗丝黑穗病候选基因ZmNL的cDNA编码区全长共 3156bp，序列组成见SEQ ID NO.1。研究表明，该基因位于玉米主效抗丝黑穗病区域(bni2.09)区域内，受到丝轴黑粉菌胁迫后，其表达量在抗病玉米材料中显著高于感病材料。其编码的蛋白为膜蛋白，多表达于内质网膜及质膜上，具有R蛋白的保守基序。原核表达试验证明该蛋白能抑制丝轴黑粉菌的生长，转化该基因的玉米株系人工接种丝轴黑粉菌后发病率显著低于未接种的受体对照材料。

因此，在上述研究的基础上，本发明提出了玉米ZmNL基因在抗丝黑穗病玉米育种中的应用，其中，所述的ZmNL基因含一个3156bp的完整开放阅读框ORF，ORF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

更进一步的，本发明还提出了玉米ZmNL基因的编码蛋白在制备丝轴黑粉菌生长抑制剂中的应用。

其中，优选的，所述的玉米ZmNL基因的编码蛋白为玉米ZmNL基因的原核表达蛋白。

再进一步的，本发明还提出了一种抗丝黑穗病转基因玉米的育种方法，包括以下步骤：

(1)合成或扩增得到玉米ZmNL基因，所述的ZmNL基因含一个3156bp的完整开放阅读框ORF，ORF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)构建含有玉米ZmNL基因的真核表达载体；

(3)通过转基因技术手段，将玉米ZmNL基因导入玉米自交系的基因组中，筛选并培育出抗丝黑穗病转基因玉米品种。

在本发明所述的育种方法，优选的，步骤(2)中所述的真核表达载体是在含有除草剂抗性基因Bar筛选标记的基础表达载体pTF101.1的基础上，引入玉米泛素Ubiquitin启动子和农杆菌胭脂碱合成酶基因T-nos终止子，然后与合成或扩增得到玉米ZmNL基因重组后得到的。

在本发明所述的育种方法，优选的，步骤(3)中所述的转基因技术手段为农杆菌介导的转化方法。

在本发明所述的育种方法，优选的，步骤(3)中所述的玉米自交系为高感丝黑穗病的玉米自交系黄早四。

本发明所提出的ZmNL基因对玉米抗丝黑穗病的防治具有重要意义，可用于玉米抗丝黑穗病分子育种的研究。

附图说明

图1是Fgenesh软件预测基因结果；

TSS为转录起始位点；CDSf为起始外显子；CDSI为末端外显子；

图2是丝轴黑粉菌胁迫下ZmNL基因的表达谱；

***表示p<0.001水平下差异显著

图3是ZmNL基因RT-PCR及RACE琼脂糖电泳检测；

a.RT-PCR电泳结果，b为5′RACE电泳结果，c为3′RACE电泳结果

M为分子量标准Trans 2k

图4是玉米抗丝黑穗病ZmNL基因编码蛋白的保守结构域图；

图5是ZmNL基因编码的氨基酸同其他植物同源性比较；

红框所示为ZmNL蛋白和大多数NBS-LRR类植物R蛋白具有的相同保守基序

图6是ZmNL蛋白的二级结构分析；

其中α-螺旋组成(h)、延伸链区(e)、无规则卷曲(c)和β-折叠(t)分别由蓝色、红色、黄色和红色标记

图7是ZmNL基因原核表达载体pET32a(+)-ZmNL构建流程图；

图8是图3-26pET32a(+)-ZmNL重组蛋白的诱导表达；

M为蛋白分子量标准marker，1为未诱导重组蛋白，2为诱导重组蛋白

图9是ZmNL基因表达蛋白对丝轴黑粉菌抑菌特性分析；

图10是ZmNL基因单子叶植物过表达载体PTU-ZmNL的物理图谱。

图11是部分转基因玉米植株Bar基因的PCR检测电泳图。

M为分子量标准Trans 2K，W为水对照，-为阴性对照，+为阳性对照，1-11为转基因植株。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1.玉米抗丝黑穗病候选基因ZmNL的预测

本发明以玉米自交系B73RefGen_v2染色体上2.09区域的DNA序列为研究对象，利用在线预测基因软件Fgenesh对该段核苷酸序列进行生物信息学分析，应用NCBI网站中的ORF Finder工具识别预测出的序列开放阅读框(ORF)，选择其中含有抗病保守结构域的序列，其中包括：锌指结构(参与核酸和锌离子结合)、DNA聚合酶(DNA聚合酶活性中心)、反转录酶(指示移动因子)、GTP活化蛋白(可以激活活性的酶原)、NBS及LRR结构(抗性保守结构域)等。

发现1个玉米抗丝黑穗病候选基因，命名为ZmNL。ZmNL基因预测结果如图1所示，ZmNL基因全长8640bp，转录起始于1993bp，终止于8264bp，具有典型的PolyA尾巴，为完整的基因。ZmNL基因包含两个外显子，一个内含子。

实施例2玉米抗丝黑穗病相关基因ZmNL的时空表达分析

为进一步揭示抗病候选基因ZmNL是否与玉米丝黑穗病原菌(丝轴黑粉菌)胁迫相关，本发明分别提取抗丝黑穗玉米近等基因系L282和感病轮回亲本黄早四在苗期人工接种丝轴黑粉菌后0d，1d，2d，3d，4d，5d，6d不同时间点叶片总RNA，以接种无菌水相同玉米材料同一时间点叶片总RNA为对照，反转录获得cDNA，玉米Actin1(Gene ID:100282267)基因作为内参，利用Real-time PCR方法分析ZmNL基因在抗、感材料，接种前、后的表达变化。

结果如图2表明在丝轴黑粉菌胁迫下，ZmNL基因在L282和黄早四中相对表达量整体均呈现先升高后下降趋势。0d时，L282中ZmNL基因的相对表达量为2.13，极显著高于黄早四，说明该基因的表达在抗、感材料之间存在本底差异。1-2d时，L282中ZmNL基因相对表达量呈逐渐上升态势，在2d时达到峰值，为4.29；而黄早四中该基因相对表达量先是小幅下降后迅速升高，同样在2d时达到峰值，为2.99，这期间L282中目的基因相对表达量始终极显著高于黄早四中的，说明该基因在抗病前期能够被显著诱导表达，可能参与早期抗病反应。3-6d时，黄早四中ZmNL基因相对表达量迅速下降至本底水平，而L282则是缓慢下降至与黄早四接近，但低于其本底水平，说明该基因并不能够被持续诱导表达，随着胁迫时间的延长，甚至处于抑制状态。

实施例3玉米抗丝黑穗病ZmNL基因全长cDNA序列的克隆

根据预测获得的玉米抗丝黑穗病候选基因ZmNL编码序列，首先利用Primer5软件设计mZmNLF/mZmNLR特异引物，然后进行ZmNL基因cDNA全长中间序列的扩增，预期扩增中间序列片段长度约为700bp。

以ZmNL基因预测序列为模板设计扩增该基因部分序列引物(mZmNL)，再根据以获得的序列设计基因特异引物(RACE GSP)，引物序列如下(表1)：

表1玉米ZmNL基因克隆引物序列

ZmNL基因cDNA全长中间序列RT-PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳结果表明，mZmNLF/mZmNLR引物扩增到一条大小与预期相符的特异条带(图3a)。将该特异条带进行凝胶回收、纯化、TA克隆至T载体，蓝白筛选转化子、提取转化子质粒DNA作为模板，通过酶切和质粒PCR鉴定阳性转化子，选择鉴定正确的阳性转化子送生物公司进行测序。测序结果经过去除载体序列后，得到的中间序列全长678bp，经过DNAMAN软件比对发现，该中间序列与预测的ZmNL基因序列高度一致，证明其确为ZmNL基因的中间序列。

在获得的ZmNL基因中间序列基础上利用Primer5软件设计基因特异引物5′RACE GSP和3′RACE GSP先后进行5′-RACE PCR和3′-RACE PCR，RACE PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳显示，5′-RACE和3′-RACE均获得2000bp左右的特异条带(图3b,c)，分别回收5′-RACE PCR和3′-RACE PCR产物，纯化后转化T载体，经蓝白筛选、质粒PCR和酶切多重验证后，挑选多个阳性克隆子进行测序。测序结果敲除载体序列后，5′-RACE PCR和3′-RACE PCR分别获得长度为2009bp和2020bp的序列，运用DNAMAN软件对获得的5'端序列、中间序列和3'端序列进行拼接，最终获得玉米抗丝黑穗病候选基因ZmNL的cDNA编码区全长共3156bp，序列组成见SEQ ID NO.1。

实施例4玉米抗丝黑穗病ZmNL基因表达蛋白的生物信息学分析

一、玉米抗丝黑穗病基因ZmNL编码蛋白理化性质

采用ExPASy Protparam对ZmNL基因编码蛋白进行基本的理化性质的预测和分析。结果表明：抗病候选基因ZmNL编码1051个氨基酸，相对分子量为116.5638kD，等电点8.47，为碱性蛋白；组成的原子是C(5132)H(8330)N(1462)O(1548)S(40)，一共16512个原子，理论半衰期30h，不稳定参数42.79，是不稳定蛋白，氨基酸中带正电荷氨基酸(Arg、Lys)133个，带负电荷氨基酸(Asp、Glu)125个。DNA Tool 6.0软件分析了ZmNL蛋白的氨基酸组成(表2)，结果显示其中包含的中性疏水性氨基酸、亲水性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸分别为44.9％、39.5％、11.8％、15.6％。说明抗病候选基因ZmNL编码蛋白为具有一定疏水能力不稳定的碱性蛋白。

表2玉米ZmNL基因编码蛋白氨基酸组成

二、抗病候选基因ZmNL编码蛋白保守结构域分析及与其它植物R蛋白的序列比对

利用NCBI中的CD-search搜索玉米抗病候选基因ZmNL编码蛋白的保守结构域。结果如图4所示，ZmNL蛋白具有NB-ARC、LRR等一系列保守结构域，其中LRR结构域含有连续4个的亮氨酸重复区域。ZmNL蛋白所包含的NB-ARC、LRR这些保守结构域绝大多数存在于植物R蛋白中，其结构高度保守，可能参与植物抗病信号转导和抗病作用的发挥。

本发明根据NCBI网站上公布的基因组数据，通过文献检索选择了不同物种的20条NBS-LRR类植物R蛋白，其详细信息见表3，通过生物信息学工具ClustalW对ZmNL蛋白与这20种已克隆的NBS-LRR类植物R蛋白进行同源序列比对。序列比对结果显示，ZmNL蛋白和大多数NBS-LRR类植物R蛋白具有相同的保守基序(图5红框所示)，分别对应为P-loop(GMGGVGKTT)、Kinase-2(LIVLDDVW)、Kinase-3a(GSR/KILVTTR)和疏水结构域HD(GLPLAL)。以上结果表明ZmNL蛋白和不同物种的R蛋白在功能结构域上是高度保守的。

通过对植物NBS-LRR类R基因进行综合分析认为，kinase-2基序中最后一个氨基酸残基可用于区分该NBS所属R基因类型，即当最后一个氨基酸为色氨酸(W)时，为典型的non-TIR-NBS-LRR类抗病基因，而当最后一个氨基酸为天冬氨酸(D)时，为典型的TIR-NBS-LRR类抗病基因。目前，在单子叶植物中并不存在含有TIR结构的NBS-LRR抗病基因，在玉米所有NBS-LRR基因中同样未发现具有TIR结构。本研究中，ZmNL基因编码蛋白kinase-2基序最后一个氨基酸为色氨酸，分析该基因为典型的non-TIR-NBS-LRR类抗病基因，同样符合以上规律。

表3NBS-LRR类植物R蛋白的完整编码区序列来源

进一步的进化树分析表明，ZmNL蛋白与其它已知R蛋白具有不同程度的相似性，其中与CC-NBS-LRR类的小麦抗叶锈病LR10蛋白的相似性最高为83％，并与同属CC-NBS-LRR类的拟南芥抗白斑病RPM1蛋白、马铃薯抗X病毒Rx蛋白、拟南芥抗霜霉病RPP8蛋白和RPP13蛋白、番茄抗枯萎病I2C-1蛋白、拟南芥抗假单孢菌RPS2蛋白、拟南芥RPS5蛋白、水稻抗白叶枯病XA1蛋白归为一大组，而其他TIR-NBS-LRR类抗病基因L6、M、N等则聚为一类。蛋白进化上的分组可能揭示其在功能上的异同。

三、玉米抗丝黑穗病基因ZmNL编码蛋白亚细胞定位

进入Psort数据库对抗病候选基因ZmNL编码蛋白进行亚细胞定位分析，结果如表4所示。表明：ZmNL蛋白最可能定位于内质网膜(可信度0.85)，其次定位于质膜中(可信度为0.79)，所以ZmNL蛋白为膜蛋白，其在微体(过氧化物酶体)和叶绿体类囊膜上也有分布，但可信度较低。近年来的研究表明，病原菌侵染能够引发内质网胁迫，继而引起细胞程序性死亡。因此，抗病候选基因ZmNL编码蛋白定位在内质网或质膜，可能通过参与内质网胁迫通路或改变质膜通透性来调控细胞程序性死亡，使得病原菌被限制在侵染点周围的坏死组织中，导致病原菌因缺少营养物质而死亡，最终抵抗病原菌的进一步入侵。

表4ZmNL蛋白的亚细胞定位

利用TMHMM Server v.2.0在线分析软件对抗病候选基因ZmNL编码蛋白进行跨膜结构域分析。结果发现，ZmNL蛋白可能不存在跨膜结构域，结合之前的亚细胞定位预测结果，说明ZmNL蛋白在内质网膜或质膜上合成后，并不进行跨膜转运，而是直接在内质网膜或质膜上行使功能，属于非跨膜蛋白类。

四、抗病候选基因ZmNL编码氨基酸的高级结构预测

利用SOPMA服务器对抗病候选基因ZmNL编码氨基酸的二级结构进行预测分析(图6)，统计分析发现ZmNL蛋白的二级结构主要是由α-螺旋组成(55.85％)、其次是无规则卷曲(32.35％)，再次是由延伸链区(9.90％)和β-折叠构成的β-片层(1.90％)，并无其他二级结构。SOPMA对ZmNL蛋白二级结构预测结果说明，ZmNL晶体可能是由α螺旋结构为基础构成的稳定空间构象。

由于ZmNL蛋白序列较长，Phyre²数据库中并未有相关全长的晶体结构，但通过比对搜索到两条与其部分序列相似度在95％以上的蛋白：apaf-1related killer dark和toll-like receptor 8，这两条蛋白序列的三维结构都已通过X-射线晶体衍射法和核磁共振得以确定，以此两条蛋白序列为模板，利用其结构信息拼接、构建靶序列ZmNL蛋白理想的三维空间模型。ZmNL蛋白的空间结构整体包括4个基团，由较多的α螺旋和β折叠盘绕而成，中间则由无规则卷曲连接。

五、抗病候选基因ZmNL侧翼序列分析

以玉米自交系B73RefGen_v2染色体上2.09区域的DNA序列为参考，选取抗病候选基因ZmNL起始密码子上游约2000bp的序列作为研究对象，通过P1antCARE分析ZmNL基因侧翼序列含有的潜在顺式作用元件，分析ZmNL基因诱导表达的潜在诱导因素。结果表明，在翻译起始密码子上游存在着多个可能的TATA-box和CAAT-box启动子元件；除此之外还含有抗病基因中大量存在的与病原应答相关的顺式作用元件，如茉莉酸甲酯应答元件TGACG(-882bp～-886bp)和CGTCA基序 (-1292bp～-1296bp)(转录起始位点为+1)；此外，侧翼序列还存在着应答防卫反应的顺式作用元件TC-rich repeat(-1025～-1033)。这些结果表明，ZmNL基因具有潜在应答生物胁迫或者非生物胁迫的功能，尤其是侧翼序列含有的激素应答元件和应答防卫反应元件，表明它们可能和抗病应答反应存在密切关系。

实施例5ZmNL基因原核表达载体构建和抗病性分析

一、构建原核表达载体pET32a(+)-ZmNL和在大肠杆菌中的诱导表达

按照图7进行原核表达载体pET32a(+)-ZmNL的构建。首先根据已克隆抗病候选基因ZmNL全长cDNA序列，设计特异引物扩增适用于构建原核表达载体的ORF，引物序列如下所示：

pZmNL-F：5'→3'CGGTTCGAAATGGACCTCGTGGTCGGCG

pZmNL-R：5'→3'ATAGCGGCCGCTTATAGGTCGTTGTACT

将扩增得到的ORF序列连接至pEASY-T1Simple载体上，构建重组质粒pEASY-T1Simple-ZmNL。然后选用Nsp V/Not I对重组质粒pEASY-T1Simple-ZmNL和原核基本表达载体pET32a(+)进行双酶切，获得ZmNL基因片段和pET32a(+)线性片段，并在T₄DNA连接酶的作用下将两者进行连接，构建重组子pET32a(+)-ZmNL。

将重组表达质粒pET32a(+)-ZmNL及pET32a(+)空载体转化E.coli稀有密码子表达菌株Transetta(DE3)，阳性菌在IPTG诱导下进行表达，提取重组总蛋白，进行SDS-PAGE分析，表达情况如图8所示，与转入空载体pET32a(+)的对照菌株泳道无特异条带相比，重组质粒pET32a(+)-ZmNL的宿主菌株表达的融合蛋白大小约为136kD，符合ZmNL分子量116kD，trx标签12kD，His标签0.8kD，表明表达菌株可高效表达产生重组蛋白，且外源基因具有完整的表达框。

二、玉米抗病候选ZmNL基因编码蛋白抗病性分析

本发明采用低温(28℃)诱导表达4h，将诱导后的菌体经超声波破碎后离心收集上清，利用His标签蛋白纯化试剂盒对目的融合蛋白进行纯化。用大肠杆菌中表达并分离纯化的抗病候选基因ZmNL编码蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)对玉米丝轴黑粉菌进行体外抑菌特性分析。将OD₆₀₀为0.4的丝轴黑粉菌混合交配型菌液均匀涂布于PDA培养基上，其上规律放置无菌牛津杯，适当用力使牛津杯1/4埋入培养基中，添加不同浓度无菌目的蛋白于牛津杯中。28℃暗培养1d，十字交叉法测量形成的抑菌圈直径。每个处理三次重复，每个平板测量三次。同时，以无菌1×PBS 溶液为对照。

结果显示，结果显示与对照相比，加入25μg、50μg和75μgZmNL蛋白对丝轴黑粉菌生长均有不同程度的抑制，随着ZmNL蛋白量的增加，抑菌圈直径呈递增趋势，且不同蛋白浓度所形成的抑菌圈直径与对照均具有极显著差异(图9)。

实施例6玉米抗丝黑穗病ZmNL基因对玉米的遗传转化

一、抗病候选ZmNL基因单子叶植物过表达载体的构建

本发明所采用含有除草剂抗性基因Bar筛选标记表达载体pTF101.1作为基础载体，在其基础上引入玉米泛素Ubiquitin启动子和农杆菌胭脂碱合成酶基因T-nos终止子，改造后的pTF101.1载体命名为PTU载体。根据In-Fusion技术原理设计特异引物，对抗病候选基因ZmNL全长质粒进行PCR反应，在ZmNL基因序列上下游外侧分别引入经SacΙ线性化的PTU载体两端各16个碱基，使克隆引物tZmNL与线性化PTU载体两端同源。引物序列如下所示：

tZmNL-F：5'→3'CCCGGGTACCGAGCTCATGGACCTCGTGGTCGGCG

tZmNL-R：5'→3'GGGGAAATTCGAGCTCTTATAGGTCGTTGTACTCG

以ZmNL全长质粒为模板进行PCR反应，回收目的条带，进行TA克隆，转化E.coli感受态，蓝白筛选阳性克隆测序。

获得与线性化PTU载体具有同源序列的ZmNL基因ORF全长。按照In-Fusion试剂盒说明，将上述PCR克隆产物重组连接到线性中间载体PTU，构建成单子叶植物过表达载体PTU-ZmNL(图10)，并采用热激法将其转入农杆菌EHA101感受态细胞。

二、玉米抗病候选ZmNL基因对玉米的遗传转化

制备吸光值OD₅₅₀＝0.3～0.4的含PTU-ZmNL质粒农杆菌菌液，加入终浓度100uM的AS。将高感丝黑穗病的玉米自交系黄早四种子经70％酒精、0.1％升汞、无菌水表面消毒后，无菌条件下小心划开玉米胚生长点处1～3mm，浸泡于无菌水中，37℃水浴4～5h。将事先制备的农杆菌工程菌液倒入种子种，28℃，200rpm振荡24h，取出种子置于MS固体培养基共培养2～4d。将发芽种子移栽混有蛭石和土的花盆中，暗培养1～2d，待苗拱土后，见光培养。剪取叶片提取总DNA，根据筛选标记BAR基因设计引物，进行PCR检测。PCR阳性植株自交繁殖获得T0代种子。将T0代种按照穗行种植于营养钵中成T1代株系，同时种植非转基因玉米自交系黄早四作为对照，3叶期时进行PCR检测，选取性状分离比符合3:1的转基因株系进行RT-PCR检测。将RT-PCR检测阳性株系和非转基因玉米自交系黄早四对照移栽到大田，进行田间人工菌土法接种丝黑穗病鉴定。行距70cm，株距20cm，行长4.0m，每行20穴，常规大田管理，乳熟期进行发病率调查。

结果表明，共获得7个性状分离比符合3:1的转基因株系，进行Bar基因的RT-PCR检测，均能扩增出439bp的Bar基因片段(见图11)，对照野生型黄早四则未见Bar基因特异条带，表明转入的ZmNL基因在T₁代转化植株中能够正常转录表达。

乳熟后期，以非转基因黄早四为对照，调查符合3:1性状分离比的7个黄早四T₁代转基因株系丝黑穗病发病率，结果见表5。野生型黄早四人工接种丝黑穗病的田间发病率为90.15％，7个T₁代转基因株系人工接种丝黑穗病的田间发病率值在70.59％-89.71％中间，其中YT6的发病率最低为70.59％，与黄早四相比抗病性提高了19.56％，7个黄早四T₁代转基因株系丝黑穗病平均发病率为80.58％，与黄早四相比抗病性提高了9.57％，以上结果说明，ZmNL基因的导入一定程度提高黄早四对丝黑穗病的抗性，说明该基因在植物抗病反应中具有一定重要作用。

表5T₁代转基因株系与非转基因对照田间接种发病率

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims

1.玉米ZmNL基因在抗丝黑穗病玉米育种中的用途，其特征在于，所述的ZmNL基因含一个3156bp的完整开放阅读框ORF，ORF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.玉米ZmNL基因的编码蛋白在制备丝轴黑粉菌生长抑制剂中的用途。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于所述的玉米ZmNL基因的编码蛋白为玉米ZmNL基因的原核表达蛋白。

4.一种抗丝黑穗病转基因玉米的育种方法，其特征在于包括以下步骤：

(2)构建含有玉米ZmNL基因的真核表达载体；

5.如权利要求4所述的育种方法，其特征在于步骤(2)中所述的真核表达载体是在含有除草剂抗性基因Bar筛选标记的基础表达载体pTF101.1的基础上，引入玉米泛素Ubiquitin启动子和农杆菌胭脂碱合成酶基因T-nos终止子，然后与合成或扩增得到玉米ZmNL基因重组后得到的。

6.如权利要求4所述的育种方法，其特征在于步骤(3)中所述的转基因技术手段为农杆菌介导的转化方法。

7.如权利要求4所述的育种方法，其特征在于步骤(3)中所述的玉米自交系为高感丝黑穗病的玉米自交系黄早四。