CN108064301B - 使用稻启动子增加植物生长和产量的方法和组合物 - Google Patents

使用稻启动子增加植物生长和产量的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本文提供了用于改善植物生长的组合物和方法。组合物包含启动子序列，其以发育调控的方式直接表达操作性连接的核苷酸。也提供了用于表达感兴趣基因的表达构建体、多核苷酸和多肽，包含该表达构建体、多核苷酸和多肽的植物，和产生转基因植物的方法，该感兴趣基因的表达可改善农业性质，包括但不限于作物产量、生物和非生物胁迫耐受性、和早期活力。

Description

使用稻启动子增加植物生长和产量的方法和组合物
发明领域
本发明涉及用于控制参与植物生长和发育中涉及的核苷酸的表达的方法和组合物。
发明背景
持续增加的世界人口和日渐减少的农业可耕种土地供应推动开发具有增加的生物质和产量的植物。常规农作物和园艺改进手段采用选择性育种技术来鉴定具有所需特性的植物。然而，这种选择性育种技术具有几个缺陷，即，这些技术一般是费力的并且产生通常含有异源遗传组件的植物，其可能并不总是导致所需的性状从亲本植物传递下去。分子生物学的进展提供了调节植物种质的手段。植物遗传改造要求分离和操作遗传物质(一般是DNA或RNA的形式)并且随后向植物导入该遗传物质。这种技术具有向作物或植物递送各种改善的经济、农业或园艺性状的能力。
感兴趣的性状包括植物生物质和产量。产量通常定义为可测量的来自作物的有经济价值的产物。这可以量和/或质来定义。产量直接取决于几个因素，例如，器官的数量和尺寸、植物结构(例如，分枝数量)、种子产生、叶衰老等。根发育、营养摄入、胁迫耐受性和早期活力也可能是决定产量的重要因素。因此，优化上述因素可产生增加的植物产量。
种子产量的增加是特别重要的性状，因为许多植物的种子对于人和动物消耗而言是重要的。作物例如玉米、水稻、小麦、油菜和大豆占人类总热量摄入的超过一半，无论是通过直接消耗其种子还是通过消耗在经加工的种子上产生的肉制品。它们也是工业过程中使用的糖类、油脂和许多类型矿物质的来源。种子含有胚(新芽和根的来源)和胚乳(在萌发期间和幼苗的早期生长期间胚生长的营养源)。种子的发育涉及许多基因，并且需要将代谢物从根、叶和茎转移到生长的种子中。尤其是胚乳，其吸收了糖类、油脂和蛋白质的代谢前体并将它们合成储存大分子以填充谷粒。植物生物质的增加对于饲料作物如苜蓿、青贮玉米和干草而言重要。许多基因参与植物生长和发育。因此，需要调节这些基因以增加作物产量的方法。
发明内容
提供用于调节植物中基因表达的组合物和方法。所述方法增加植物生长，导致较高作物产量。组合物包含：用于发育调控的启动子的新型核苷酸序列、包含操作性地连接至编码和感兴趣的核苷酸序列的启动子的DNA构建体，和转化的植物、种子、植物部分和植物细胞，其具有稳定引入其基因组的、包含本发明的启动子序列的构建体。所述启动子可用于通过如下方式改变植物生长：调控一种或多种感兴趣的核苷酸和/或编码序列(尤其是光合作用相关基因)的表达水平和/或表达模式。编码植物光合作用中涉及的蛋白质的基因的表达可经调控，以增加植物生长、植物质，和植物产量。本文中描述利用这些启动子来调控编码光合蛋白质的基因的表达水平和/或发育表达概况的方法。
本发明的实施方式包括：
1.一种表达植物中感兴趣的基因的方法，其包括：用DNA构建体转化植物细胞，所述DNA构建体包含发育调控的启动子，所述发育调控的启动子所具有的序列包含SEQ IDNO:3、4、5、15、17、19或21所示的序列，其操作性地连接至用于感兴趣的基因的编码区域，和，从所述植物细胞再生转化的植物。
2.如实施方式1所述的方法，其中，所述编码区域编码光合作用中涉及的蛋白质。
3.如实施方式2所述的方法，其中，所述编码区域编码具有景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶活性的酶。
4.如实施方式3所述的方法，其中，所述编码区域包含SEQ ID NO:1的序列，或与SEQ ID NO:1具有至少80％相同性的序列。
5.如实施方式3所述的方法，其中，所述编码区域编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2具有至少80％相同性的序列。
6.如实施方式3所述的方法，其中，所述编码区域选自下组：SEQ ID NO:23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57和59，或与选自下组的序列具有至少80％相同性的序列：SEQ ID NO:23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57和59。
7.如实施方式3所述的方法，其中，所述编码区域编码选自下组的氨基酸序列：SEQID NO:24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和81-268，或与选自下组的序列具有至少80％相同性的序列：SEQ ID NO:24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和81-268。
8.如实施方式1所述的方法，其中，所述转化的植物是单子叶植物。
9.如实施方式1所述的方法，其中所述转化的植物是双子叶植物。
10.一种DNA构建体，其以操作性连接包含，
a.启动子序列，其以发育调控的方式驱动植物细胞内的表达，其中，所述启动子包含选自SEQ ID NO:3、4、5、15、17、19和21所示的DNA序列的序列，和，
b.编码光合作用中涉及的蛋白质的核酸序列。
11.如实施方式10所述的核酸序列，其中，所述编码光合作用中涉及的蛋白质的核酸序列包含SEQ ID NO:1的核酸序列，或与SEQ ID NO:1具有至少80％相同性的序列。
12.如实施方式10所述的核酸序列，其中，所述编码光合作用中涉及的蛋白质的核酸序列编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2具有至少80％相同性的序列。
13.如实施方式10所述的核酸序列，其中，所述编码光合作用中涉及的蛋白质的核酸序列包含SEQ ID NO:23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59的核酸序列，或与SEQ ID NO:23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57或59具有至少80％相同性的核酸序列。
14.如实施方式10所述的核酸序列，其中，所述编码光合作用中涉及的蛋白质的核酸序列编码SEQ ID NO:24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、81-267或268的的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、81-267或268具有至少80％相同性的序列。
15.如实施方式10所述的核酸序列，其中，所述启动子包含SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19，或SEQ IDNO:21的序列，或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19，或SEQ ID NO:21具有至少80％相同性的序列。
16.一种转化的植物，其具有稳定地纳入其基因组的DNA构建体，所述DNA构建体包含以发育调控的方式驱动植物中的表达的启动子，所述启动子操作性地连接至编码光合作用中涉及的蛋白质的核酸序列，其中，所述启动子包含选自SEQ ID NO:3、4、5、15、17、19和21所示的序列的序列。
17.如实施方式16所述的转化的植物，其中，所述启动子包含SEQ ID NO:3，SEQ IDNO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，或SEQ IDNO:21的序列，或与SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，或SEQ ID NO:21具有至少80％相同性的序列。
18.如实施方式16所述的转化的植物，其中，所述光合作用中涉及的蛋白质由SEQID NO:1的序列或与SEQ ID NO:1具有至少80％相同性的序列编码。
19.如实施方式16所述的转化的植物，其中，所述光合作用中涉及的蛋白质包含SEQ ID NO:2的序列，或与SEQ ID NO:2具有至少80％相同性的序列。
20.如实施方式16所述的转化的植物，其中，所述光合作用中涉及的蛋白质由SEQID NO:23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，或59的序列编码，或由与SEQ ID NO:23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，或59所示的序列具有至少80％相同性的序列编码。
21.如实施方式16所述的转化的植物，其中，所述光合作用中涉及的蛋白质包含SEQ ID NO:24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，81-267或268的的序列，或与SEQ ID NO:24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，81-267或268所示的序列具有至少80％相同性的序列。
22.一种调控植物生长的方法，其包括：将启动子序列插入植物细胞的核基因组，所述启动子位于感兴趣的光合基因的上游，以改变所述光合基因的表达，其中，所述启动子序列以发育调控的方式驱动植物中的表达，其中，所述启动子序列选自下组：SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，和SEQ ID NO:21。
23.如实施方式23所述的方法，其中，所述光合基因编码具有景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶活性的蛋白质。
24.如实施方式23所述的方法，其中，所述启动子序列选自下组：SEQ ID NO:3，SEQID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19和SEQID NO:21，或与SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21具有至少80％相同性的序列。
25.如实施方式24所述的方法，其中，所述景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶蛋白与SEQID NO:2具有至少80％的相同性。
26.一种调控植物生长的方法，其包括：将转录增强子序列插入植物细胞的核基因组，以改变编码景天庚酮糖1,7-二磷酸酶多肽的植物基因的表达。
27.一种调控植物生长的方法，其包括，通过如下方式调控编码景天庚酮糖1,7-二磷酸酶的植物基因的表达：调控已知与编码景天庚酮糖1,7-二磷酸酶多肽的所述基因相互作用的一种或多种转录因子的表达。
28.一种调控植物生长的方法，其包括，调控编码景天庚酮糖1,7-二磷酸酶的植物基因的表达，其中，所述表达通过如下方式被调控：在该植物基因组DNA中，于所述编码景天庚酮糖1,7-二磷酸酶多肽的基因的2kb以内的位置，插入转座元件DNA序列。
29.一种调控植物生长的方法，其包括，调控编码景天庚酮糖1,7-二磷酸酶多肽的植物基因的2kb以内的植物基因组的具体区域的结构或染色质含量。
30.一种调控植物生长的方法，其包括，改变植物的基因组的具体区域的2kb以内的DNA甲基化状态，从而改变编码景天庚酮糖1,7-二磷酸酶多肽的植物基因的表达。
31.如实施方式3所述的方法，其中，所述编码区域编码选自SEQ ID NO:81-103的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:81-103的序列具有至少80％相同性的序列。
32.如实施方式10所述的核酸序列，其中，所述编码光合作用中涉及的蛋白质的核酸序列编码选自SEQ ID NO:81-103的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:81-103的序列具有至少80％相同性的序列。
33.如实施方式16所述的转化的植物，其中，所述光合作用中涉及的蛋白质包含选自SEQ ID NO:81-103的序列，或与选自SEQ ID NO:81-103的序列具有至少80％相同性的序列。
34.如实施方式24所述的方法，其中，所述景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶蛋白与选自SEQ ID NO:81-103的序列具有至少80％相同性。
35.如实施方式2所述的方法，其中，所述编码区域编码在卡尔文本森循环中起作用的多肽。
36.如实施方式10所述的核酸序列，其中，所述编码光合作用中涉及的蛋白质的核酸序列编码在卡尔文本森循环中起作用的蛋白质。
37.如实施方式16所述的转化的植物，其中，所述光合作用中涉及的蛋白质是在卡尔文本森循环中起作用的蛋白质。
38.如实施方式36所述的方法，其中，所述在卡尔文本森循环中起作用的多肽选自下组：SEQ ID NO:2，24，26或81-155，或与选自下组SEQ ID NO:2，24，26或81-155的序列具有至少80％相同性的多肽。
39.如实施方式37所述的核酸序列，其中，所述在卡尔文本森循环中起作用的蛋白质选自下组：SEQ ID NO:2，24，26和81-155，或与选自下组SEQ ID NO:2，24，26和81-155的序列具有至少80％相同性的多肽。
40.如实施方式38所述的转化的植物，其中，所述在卡尔文本森循环中起作用的蛋白质选自下组：SEQ ID NO:2，24，26和81-155，或与选自下组SEQ ID NO:2，24，26和81-155的序列具有至少80％相同性的多肽。
41.如实施方式16-21中任一项所述的转化的植物的转化的种子。
发明详述
提供用于增加作物生物质和产量的组合物和方法。作物产量与光合代谢密切相关，因为光合作用是固定二氧化碳用于植物生长的途径。用于改善光合代谢的方法有潜力驱动植物生长和作物产量的显著改善。本发明的组合物包含用于植物启动子的新型核苷酸序列，所述启动子具体是发育调控的启动子，更具体是如SEQ ID NO:3，4，5，15，17，19或21所示的启动子序列，及其片段和变体。本发明的启动子序列有利于以发育调控的方式表达操作性连接的核苷酸序列。通过驱动编码光合作用中涉及的蛋白质的基因的表达，它们可用于操纵光合代谢和植物生长。
本发明的方法包括通过改变编码光合作用中涉及的蛋白质的基因的表达来操纵光合作用。尽管此类基因可采用强组成型启动子过表达，在许多情况中，采用非组成型启动子来驱动此类基因可能是有利的。特别感兴趣的非组成型启动子是以发育调控的方式驱动表达的本发明的启动子。此类发育调控的启动子可用于优先驱动感兴趣的至少一种核苷酸或基因在具体植物组织中的表达，所述组织处于可得到特别益处的时期。感兴趣的基因包括光合基因，因为这些基因中的许多在其表达中具有不同的发育高峰。通过采用本发明的启动子改变感兴趣的植物中的这些光合基因中一种或多种的表达水平和/或概况，光合代谢可被优化。这种光合代谢优化在作物植物中提供增加的植物生长和升高的产量。
本发明的组合物包括分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO:3、4、5、15、17、19和21所示的启动子核苷酸序列，及其片段和变体。"启动子"意指一种DNA调控区域，其通常包含能够指导RNA聚合酶II在合适的转录起始位点起始RNA合成具体编码序列的TATA箱。真核启动子是复杂的并且由包含相对于定义为+1的转录起始位点或帽位点5'上约35个碱基对处的TATA盒共有序列的组件。TATA基序是TATA-结合蛋白(TBP)作为几个多肽复合物(TFIID复合物)的部分结合并与结合启动子的其他序列元件的因子有效相互作用(直接或间接)的位点。这种TFIID复合物进而招募RNA聚合酶II复合物以位于TATA元件下游一般25-30个碱基对的转录起点并且促进延长由此产生RNA分子。一些polI基因的转录起点周围的序列(命名为INR)似乎提供因子的替代结合位点，其也招募TFIID复合物成员并因此“激活”转录。这些INR序列在缺少提供最终转录的核心启动子结合元件的功能性TATA元件的启动子中是特别相关的。已经提出含有功能性TATA和INR基序的启动子的转录活性最高效。(Zenzie-Gregory等(1992)J.Biol.Chem.267:2823-2830)。参见例如，美国专利号6,072,050，该文献通过引用纳入本文。
如本文所述，启动子还可包含其它识别序列，其通常位于所述TATA箱的上游或5'，称为上游启动子元件，其影响转录起始速率。应认识到，在鉴定到用于本文公开的启动子区域的核苷酸序列的情况下，分离和鉴定本文鉴定的具体启动子区域上游的5'未翻译区域中的其它调控元件处于现有技术内。因此，例如，本文公开的启动子区域还可包含上游调控元件和序列。启动子序列的变体包括与SEQ ID NO:3，4，5，15，17，19和21具有至少约90％，约95％，约98％序列相同性且包含TATA箱和必要的上游启动子元件的那些序列。"片段"是所述核酸序列的需要的部分。“变体”是指基本相似的序列。所述启动子序列的片段和变体保留生物活性，因此能够以发育调控的方式驱动感兴趣的基因的表达。
以发育调控的方式驱动表达意在表示，表达在不同成熟度或发育阶段的植物组织中的增加或减少。例如，在叶样品中，相对于较幼年的叶组织而言，可在较老化的叶组织中观察到增加的表达。在另一个实例中，可在成熟但尚未衰老的组织中观察到不同的表达峰，其中，老化的组织中的表达减少。
当在DNA构建体中组装本发明的启动子序列从而该启动子操作性地连接至感兴趣的核苷酸序列时，允许在用该DNA构建体稳定转化的植物细胞中表达所述核苷酸序列。“可操作连接”是指2个或更多个元件之间的功能性连接。例如，本发明的启动子和和感兴趣的异源性核苷酸之间的操作性连接是功能性连接，其允许表达该感兴趣的异源性核苷酸序列。操作性地连接的元件可以是连续的或非连续的。当用于两个蛋白质编码区域之间的接合时，述及“操作性地连接的”意在表示这些编码区域处于同一阅读框中。盒还可含有待共转化到植物中的至少一种其它基因。或者，可在多个表达盒或DNA构建体上提供其它基因。这种表达盒或构建体可提供多个限制位点和/或重组位点，用于在本发明的启动子区域的转录调节下插入感兴趣的异源核苷酸序列。表达盒还可含有可选择的标志物基因。
由此，本发明的启动子的核苷酸序列在表达盒中伴随感兴趣的核苷酸序列(通常是异源性核苷酸序列)一起提供，用于在感兴趣的植物中表达。"异源性核苷酸序列"意在表示并非天然地与所述启动子序列操作性地连接的序列。尽管该核苷酸序列就所述启动子序列而言是异源性的，其就植物宿主而言可以是同源性的，或原始的，或异源性的，或外来的。公认启动子还可驱动其同源性或原始核苷酸序列的表达。在该情况中，转化的植物将具有表型变化。异源性核苷酸序列包括但不限于，光合编码序列、杀虫性编码序列、除草剂-耐受性编码序列、用于次生代谢物的编码序列、营养质量编码序列、可见标志物编码序列，和可选择的标志物编码序列。
光合作用中涉及的基因包括但不限于，景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(SBPase)(SEQID NO:1-2，81-103)、果糖-1,6-二磷酸酶(FBPase)(SEQ ID NO:23-24，104-125)、果糖-1,6-双磷酸醛缩酶(FBP醛缩酶)(SEQ ID NO:25-26、126-155)、转酮醇酶(SEQ ID NO:27-28)、Rubisco小亚基(SEQ ID NO:29-30)、Rubisco大亚基(SEQ ID NO:31-32)、Rubisco活化酶(SEQ ID NO:33-34)、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)大亚基(SEQ ID NO:35-36、156-199)、AGPase小亚基(SEQ ID NO:37-38、200-221)、碳酸酐酶(SEQ ID NO:39-40、222-268)、PEP羧酶(PEPC)(SEQ ID NO:41-42)、丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)(SEQ ID NO:43-44)、苹果酸脱氢酶(SEQ ID NO:45-46)、苹果酸酶(SEQ ID NO:47-48)、磷酸甘油酸激酶(SEQ ID NO:49-50)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(SEQ ID NO:51-52)、丙糖磷酸异构酶(SEQ ID NO:53-54)、核酮糖5-磷酸异构酶(SEQ ID NO:55-56)、磷酸核酮糖激酶(SEQ ID NO:57-58)，和核酮糖5-磷酸3-差向异构酶(SEQ ID NO:59-60)。所述序列的变体、片段和同源物也可用于实践本发明。在一个实施方式中，感兴趣的基因包括卡尔文本森循环中涉及的那些基因。
在本发明的具体实施方式中，采用启动子来驱动编码景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(SBPase)的基因的表达。SBPase酶表示催化磷酸基团从景天庚酮糖-1,7-二磷酸移除以产生景天庚酮糖-7-磷酸酯的酶。SBPase酶的示例包括由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:81-103描述的多肽。
本发明的启动子也可表达所述多核苷酸的片段和变体及其编码的氨基酸序列。“片段”是指多核苷酸的部分或氨基酸序列的部分。“变体”是指基本相似的序列。对于多核苷酸，变体包括具有以下的多核苷酸：在5'和/或3'端处的缺失(即，截短)；在天然多核苷酸中一个或多个内部位点处的缺失和/或添加；和/或在天然多核苷酸中一个或多个位点处一个或多个核苷酸的取代。本文所用的“原始”多核苷酸或多肽分别包含天然产生的核苷酸序列或氨基酸序列。一般而言，本发明的特定多核苷酸的变体将与由本文他处所述的序列比对程序和参数确定的特定核苷酸有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列相同性。
“变体”氨基酸或蛋白是指通过在天然蛋白质的N-末端和/或C-末端处缺失(也称为截短)一个或多个氨基酸；在天然蛋白质的一个或多个内部位点处缺失和/或添加一个或多个氨基酸；或在天然蛋白质的一个或多个位点处取代一个或多个氨基酸衍生的氨基酸或蛋白质。本发明包括的变体蛋白质有生物活性，即它们继续具有原始蛋白质的所需生物活性。本发明的原始多肽的活性变体将与由本文所述的序列比对程序和参数确定的原始序列的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列相同性。本发明的蛋白质的生物活性变体与该蛋白质可相差少至1-15个氨基酸残基，少至1-10个，如6-10个，少至4、3、2或甚至1个氨基酸残基。
也可通过分析测序的基因组的现有数据库来鉴定变体序列。在这种方式中，可鉴定相应序列并用于本发明的方法中。
比对序列的比较方法是本领域熟知的。因此，可采用数学算法确定两个序列的序列相同性百分数。该数学算法的非限制性示例是Myers和Miller(1988)CABIOS 4:11-17的算法；Smith等.(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部比对算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的全局比对算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-2448的搜索局部比对方法；Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264的算法，由Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877改良。
这些数学算法的计算机实施手段可用于比较序列来确定序列相同性。这类实施手段包括但不限于：PC/Gene程序中的CLUSTAL(购自美国加利福尼亚州芒廷维尤的智慧遗传公司(Intelligenetics,Mountain View,California)；ALIGN程序(2.0版)和GCGWisconsin遗传软件包中的GAP,BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，10版(购自阿克赛勒里公司(Accelrys Inc.)，美国加利福尼亚州圣地亚哥Scranton路9685号)。可用默认参数来进行使用这些程序的比对。CLUSTAL程序由以下详细描述：Higgins等，(1988)Gene 73:237-244(1988)；Higgins等，(1989)CABIOS 5:151-153；Corpet等，(1988)Nucleic AcidsRes.16:10881-90；Huang等，(1992)CABIOS 8:155-65；和Pearson等，(1994)Meth.Mol.Biol.24:307-331。ALIGN程序基于Myers和Miller(1988)同上的算法。比较氨基酸序列时，PAM120权重残基表、缺口长度罚分12、和缺口罚分4可与ALIGN程序联用。Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215:403的BLAST程序基于Karlin和Altschul(1990)同上的算法。可利用BLASTN程序进行BLAST核苷酸搜索(评分＝100，字长＝12)，以获得与编码本发明蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。可利用BLASTX程序进行BLAST蛋白质搜索(评分＝50，字长＝3)，以获得与本发明蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为了获得缺口比对(出于比较目的)，可如Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25:3389所述利用缺口BLAST(在BLAST 2.0中)。或者，可利用PSI-BLAST(在BLAST 2.0中)进行迭代搜索，其用来检测分子之间的远近关系。参见Altschul等，(1997)同上。利用BLAST、缺口BLAST和PSI-BLAST程序时，可使用各程序(例如针对蛋白质的BLASTX，针对核苷酸的BLASTN)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。也可通过检查来人工进行比对。
所述基因和待通过本发明的启动子表达的编码区域可针对在感兴趣的植物中的表达来进行密码子优化。"密码子优化的基因"是这样的基因，其密码子使用频率经指定以模拟宿主细胞的优选的密码子使用频率。核酸分子可以是完全或部分优化的密码子。因为任一氨基酸(除了甲硫氨酸和色氨酸)均由多种密码子编码，所述核酸分子的序列可变化但不改变编码的氨基酸。密码子优化是在核酸水平上改变一种或多种密码子时，致使氨基酸不变，但在具体的宿主生物体中的表达增加。本领域普通技术人员将知晓密码子表格，并且，提供关于广泛生物体的偏好信息的其它参考文献是本领域中可得的(参见例如，Zhang等.(1991)Gene 105:61-72；Murray等.(1989)Nucl.Acids Res.17:477-508)。就植物中表达优化核苷酸序列的方法提供于例如美国专利号6,015,891和其中引用的参考文献。
本发明的启动子可用于重组多核苷酸。“重组多核苷酸”包含两个或更多个化学连接的核酸区段的组合，未发现这些区段在自然中直接接合。“直接接合”指2个核酸区段紧邻并且通过化学键互相连接。在具体实施方式中，重组多核苷酸包含感兴趣多核苷酸或其活性变体或片段，使得其他化学连接的核酸区段位于感兴趣多核苷酸的5’、3’或内部。或者，可通过删除序列来形成重组多核苷酸的化学连接的核酸区段。其他化学连接的核酸区段或删除以接合连接的核酸区段的序列可以是任意长度，包括，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多核苷酸。本文公开了用于制备这种重组多核苷酸的各种方法，例如，通过化学合成或通过遗传工程技术对多核苷酸的分离区段进行操作。在具体实施方式中，重组多核苷酸可包含重组DNA序列或重组RNA序列。“重组多核苷酸的片段”包含两个或更多个化学连接的氨基酸区段的组合中的至少一个，未发现这些区段在自然中直接接合。
“改变”或“调节”基因的表达水平是指上调或下调所述基因的表达。公认地，在一些情况中，通过增加编码光合作用中涉及的蛋白质的一种或多种基因的表达水平(即，上调表达)来增加植物生长和产量。类似地，在一些情况中，可通过降低编码光合作用中涉及的蛋白质的一种或多种基因的表达水平(即，下调表达)来增加植物生长和产量。因此，本发明包括上调或下调编码光合作用中涉及的蛋白质的一种或多种基因。此外，所述方法包括上调编码在感兴趣的植物中的光合作用中涉及的蛋白质的至少一种基因，和，下调编码在感兴趣的植物中的光合作用中涉及的蛋白质的至少一种基因。通过调节编码所需转基因植物中的光合作用中涉及的蛋白质的至少一种基因的浓度和/或活性，所述浓度和/或活性相对于不具有本发明导入的序列的原始对照植物、植物部分或细胞来说增大或减小至少约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％，或约90％，或更多。
一般认为，编码光合作用中涉及的蛋白质的基因的表达水平可通过采用一种或多种本发明的启动子来控制。例如，如果在具体的发育阶段需要30％的增加，将选择启动子以在该合适的发育阶段提供该合适的表达水平。感兴趣的光合基因的表达水平可直接检测，例如，通过测定植物中的光合基因转录本或编码的蛋白质的水平。所述测定的方法是本领域熟知的。例如，Northern印迹或定量逆转录酶-PCR(qRT-PCR)可用于评估转录本水平，而western印迹、ELISA测定或酶测定可用于评估蛋白质水平。
为了成功地对候选基因的表达水平和/或表达概况进行操作，可使用遗传工具，包括增强子元件。本发明描述了多种新型启动子，其通过对转录组学数据进行生物信息学分析来鉴定。可采用启动子中的至少一种来增加感兴趣的基因的表达。
使用本发明的组合物来改变植物中感兴趣基因，尤其是参与光合作用的基因的表达。因此，可与对照植物相比调节编码光合作用中涉及的蛋白质的基因的表达。“对象植物或植物细胞”是其中已经实现感兴趣基因的遗传改变如转化，或者是源自如此改变的植物或细胞并包含改变的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供了测量对象植物或植物细胞的表型变化的参照点。因此，根据本发明的方法，表达水平高于或低于对照植物中的表达水平。
一种对照植物或植物细胞可包含，例如：(a)野生型植物或细胞，即具有与用于产生对象植物或细胞的遗传改变的起始材料相同的基因型；(b)与起始材料有相同基因型的植物或植物细胞，但其已经用无效构建体(即，用对感兴趣性状没有已知影响的构建体，如包含标记基因的构建体)转化；(c)植物或植物细胞，其是对象植物或植物细胞的后代中的非转化分离体；(d)与对象植物或植物细胞在遗传上相同但没有接触会诱导感兴趣基因表达的条件或刺激的植物或植物细胞；或(e)在不表达感兴趣基因的条件下的对象植物或植物细胞本身。
虽然本发明以转化的植物描述，应认识到本发明的转化的生物体可包括植物细胞、植物原生质体、植物可再生的植物组织培养物、植物愈伤组织、植物块、和在植物或植物部分中完整的植物细胞如胚胎、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝条、果实、仁、谷穗、穗轴、外壳、柄、根、根尖、花粉囊等。谷粒是指由种植户处于生长或繁殖物种以外的目的产生的成熟种子。再生植物的后代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，只要这些部分包含导入的多核苷酸。
本发明涵盖分离的或基本纯化的多核苷酸或核酸组合物。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或其生物活性部分基本或本质上不含其天然产生环境中通常伴随多核苷酸或与之相互作用的组分。因此，通过重组技术产生时，分离或纯化的多核苷酸基本不含其它细胞物质或培养基，或者通过化学方法合成时基本不含化学物质前体或其他化学物质。任选地，“分离的”多核苷酸不含该多核苷酸源自的生物体基因组DNA中天然侧接所述多核苷酸(即位于多核苷酸5'和3'末端处的序列)的序列(任选蛋白编码序列)。
如上所述，本发明的启动子序列可用于以发育调控的方式调节基因表达。采用本发明的方法，可在感兴趣的植物中上调或下调编码光合作用中涉及的蛋白质的基因。可能希望上调编码光合作用中涉及的蛋白质的至少一种基因，但同时下调至少一种不同的基因，包括编码光合作用中涉及的蛋白质的基因。增加表达或上调感兴趣的基因的方法是本领域已知的并且可用于本发明的方法中。在一个实施方式中，可通过用包含操作性地连接至编码感兴趣的蛋白质的至少一个开放阅读框的本发明的启动子的表达盒对植物进行转化来实现上调。
为了下调表达，可构建与针对感兴趣的基因(尤其是感兴趣的光合基因)的序列的信使RNA(mRNA)的至少部分互补的反义构建形式。构建反义核苷酸以与相应mRNA杂交。可进行反义序列的修饰，至少该序列杂交并干扰相应mRNA的表达。由此，可使用与待沉默的相应序列有70％，较佳80％，更佳85％、90％、95％或更大的序列相同性的反义构建形式。此外，可使用反义核苷酸的部分来破坏靶基因的表达。
可使用本发明的多核苷酸来从其他植物中分离相应序列。由此，PCR、杂交和其他类似方法可用于根据此类序列与本文所示序列的序列同源性或相同性来鉴定该序列。根据该序列与本文所示完整序列或其变体和片段的序列相同性而分离的序列涵盖在本发明中。此类序列包括公开序列的直向同源物序列。“直向同源物”是指源自共同祖先基因且由于物种形成而在不同物种中发现的基因。当在不同物种中发现的基因的核苷酸序列和/或它们的编码蛋白质序列具有至少约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更大的序列相同性时，它们被认为是直向同源物。直向同源物的功能通常在物种之间高度保守。因此，本发明涵盖分离的核苷酸，其具有转录活化或增强子活性，并且与本文公开的序列或与其变体或片段具有至少约75％或更大的序列相同性。
可通过PCR分离变体序列。设计PCR引物和PCR克隆的方法是本领域熟知的并且公开于Sambrook等，(1989)《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)(第2版，纽约州普莱恩维尤的冷泉港出版社)。还参见Innis等编，(1990)《PCR方案：方法和应用指南》(PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications)(纽约学术出版社)；Innis和Gelfand编，(1995)《PCR策略》(PCR Strategies)(纽约学术出版社)；以及Innis和Gelfand编，(1999)《PCR方法手册》(PCR Methods Manual)(纽约学术出版社)。
也可通过分析测序的基因组的现有数据库来鉴定变体序列。由此，可鉴定对应的启动子序列或编码光合作用蛋白质的序列，并将其用于本发明方法中。比对序列的比较方法是本领域熟知的。因此，可采用数学算法，例如上述那些算法，来确定两个序列的序列相同性百分数。也可通过检查来人工进行比对。
本发明的启动子可在DNA构建体或表达盒中提供，用于在感兴趣的植物中表达编码光合蛋白质的基因。所述盒将包括本发明的启动子序列，其操作性地连接至感兴趣的基因，尤其是感兴趣的光合基因。盒还可含有至少一种待共转化到生物体中的额外基因。或者，可在多个表达盒上提供额外基因。这种表达盒可提供多个限制位点和/或重组位点，用于在本发明启动子的转录调节下插入多核苷酸。表达盒还可含有可选择的标志物基因。
表达盒将包括5'-3'方向的转录，转录和翻译起始区(即，本发明的启动子)，编码光合蛋白质的多核苷酸，和在植物中有功能的转录和翻译终止区(即，终止区)。
本领域已鉴定并熟知多种光合蛋白质。光合作用的代谢通路已被成熟研究，并且包括光捕获、电子转移、卡尔文本森循环、淀粉生物合成，和蔗糖生物合成。此外，光合微生物利用碳浓缩机制(CCM)，同时许多高等植物利用C4光合作用，其包括C4碳穿梭，或CAM光合作用，其包括用于暂时调节碳固定的通路。已经描述了光合作用的代谢通路，例如，在Taiz和Zeiger编.(2002)《植物生理学》(Plant Physiology)(马萨诸塞州桑德兰SinauerAssociates出版公司)。已标注多种光合蛋白质，包括景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(SBPase)(SEQ ID NO:1-2，81-103)、果糖-1,6-二磷酸酶(FBPase)(SEQ ID NO:23-24，104-125)、果糖-1,6-双磷酸醛缩酶(FBP醛缩酶)(SEQ ID NO:25-26、126-155)、转酮醇酶(SEQ ID NO:27-28)、Rubisco小亚基(SEQ ID NO:29-30)、Rubisco大亚基(SEQ ID NO:31-32)、Rubisco活化酶(SEQ ID NO:33-34)、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)大亚基(SEQ ID NO:35-36、156-199)、AGPase小亚基(SEQ ID NO:37-38、200-221)、碳酸酐酶(SEQ ID NO:39-40、222-268)、PEP羧酶(PEPC)(SEQ ID NO:41-42)、丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)(SEQ ID NO:43-44)、苹果酸脱氢酶(SEQ ID NO:45-46)、苹果酸酶(SEQ ID NO:47-48)、磷酸甘油酸激酶(SEQ IDNO:49-50)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(SEQ ID NO:51-52)、丙糖磷酸异构酶(SEQ ID NO:53-54)、核酮糖5-磷酸异构酶(SEQ ID NO:55-56)、磷酸核酮糖激酶(SEQ ID NO:57-58)，和核酮糖5-磷酸3-差向异构酶(SEQ ID NO:59-60)。此外，这些和其它光合蛋白质的调节物，以及编码这些和其它光合蛋白质的基因的调节物，可从本发明的启动子表达。此类调节剂可包括调节编码光合蛋白质的基因的表达的转录因子(参见例如，Dong等(2014)BiochemBiophys Res Commun450:453-458)，泛素连接酶(参见例如，Li等(2013)Plant BiotechnolJ 11:432-445)，激酶和转录后调控光合蛋白质的其它蛋白质(参见例如，Tiessen等(2003)Plant J35:490-500和Bergantino等(1995)J Biol Chem 270:8474-8481)，调节光合蛋白质的氧化还原状态的蛋白质如铁氧化还原蛋白和硫氧还蛋白(参见例如，Balmer等(2003)Proc Natl Acad Sci USA 100:370-375和Hirasawa等(1999)Biochemistry38:5200-5205)等。
本领域已知植物终止子并且包括来自根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)的Ti-质粒的那些，如真蛸碱合酶和胆脂碱合酶终止区。还参见Guerineau等，(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144；Proudfoot(1991)Cell 64:671-674；Sanfacon等.(1991)Genes Dev.5:141-149；Mogen等，(1990)Plant Cell 2:1261-1272；Munroe等，(1990)Gene91:151-158；Ballas等，(1989)Nucleic Acids Res.17:7891-7903；和Joshi等，(1987)Nucleic Acids Res.15:9627-9639。
如上所述，本发明的启动子可用于表达盒中，以转化感兴趣的植物。转化方案以及向植物中导入多肽或多核苷酸序列的方案可根据转化靶向的植物或植物细胞的类型变化，即，单子叶或双子叶。向植物细胞中导入多肽和多核苷酸的合适方法包括微注射(Crossway等，(1986)Biotechniques 4:320-334)、电穿孔(Riggs等，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:5602 5606)，农杆菌-介导的转化(美国专利号5,563,055和美国专利号5,981,840)，直接基因转化(Paszkowski等，(1984)EMBO J.3:27172722)，和弹道颗粒加速(参见例如，美国专利号4,945,050；美国专利号5,879,918；美国专利号5,886,244；和5,932,782；Tomes等，(1995)《植物细胞、组织和器官培养中的基础方法》(Plant Cell,Tissue,and OrganCulture:Fundamental Methods)，Gamborg和Phillips编(柏林的施普林格出版社(Springer-Verlag))；McCabe等，(1988)Biotechnology 6:923,926-926)；和Lec1转化(WO00/28058)。还参见Weissinger等，(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477；Sanford等，(1987)Particulate Science and Technology 5:2737(洋葱)；Christou等，(1988)PlantPhysiol.671,674:671-674(大豆)；McCabe等，(1988)Bio/Technology6:923,926-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P:175-182(大豆)；Singh等，(1998)Theor.Appl.Genet.96:319-324(大豆)；Datta等，(1990)Biotechnology 8:736,740(水稻)；Klein等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:43054309(玉米)；Klein等，(1988)Biotechnology 6:559-563(玉米)；美国专利号5,240,855；5,322,783；和5,324,646；Klein等，(1988)Plant Physiol.440,444:440-444(玉米)；Fromm等，(1990)Biotechnology 8:833,839-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等，(1984)Nature(伦敦)311:763-764；美国专利号5,736,369(谷类)；Bytebier等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5345-5349(百合)；De Wet等，(1985)《胚珠组织实验操作》(The Experimental Manipulation of OvuleTissues)，Chapman等编，(纽约朗文出版社(Longman,New York)，第197-209页(花粉)；Kaeppler等，(1990)Plant Cell Reports 9:415-418和Kaeppler等，(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-566(须-介导的转化)；D'Halluin等，(1992)Plant Cell 4:1495-1505(电穿孔)；Li等，(1993)Plant Cell Reports 12:250-255以及Christou和Ford(1995)Annals of Botany 75:407-413(水稻)；Osjoda等，(1996)Nature Biotechnology14:745-750(玉米，通过根癌农杆菌)；其全部通过引用纳入本文。“稳定转化”是指导入植物的核苷酸构建体整合到植物的基因组中并且能够被其后代遗传。
按照常规方式，已经转化的细胞可长成植物。参见，例如，McCormick等，(1986)Plant Cell Reports 5:81-84。由此，本发明提供了具有稳定整合到其基因组中的本发明的多核苷酸，例如，本发明的表达盒的转化的种子(也称为“转基因种子”)。
本发明可用于任何植物物种的转化，包括但不限于单子叶和双子叶。感兴趣植物物种的示例包括但不限于，玉米(Zea mays)，油菜种(例如，甘蓝型油菜(B.napus)、白菜型油菜(B.rapa)、芥菜型油菜(B.juncea))，尤其是用作菜籽油来源的那些油菜物种，苜蓿(Medicago sativa)，水稻(Oryza sativa)，黑麦(Secale cereale)，高粱(Sorghumbicolor,Sorghum vulgare)，粟(例如，珍珠粟(Pennisetum glaucum)，黍(Panicummiliaceum)，小米(Setaria italica)，穇子(Eleusine coracana))，向日葵(Helianthusannuus)，红花(Carthamus tinctorius)，小麦(Triticum aestivum)，大豆(Glycine max)，烟草(Nicotiana tabacum)，马铃薯(Solanum tuberosum)，花生(Arachis hypogaea)，棉花(Gossypium barbadense,Gossypium hirsutum)，甘薯(Ipomoea batatas)，木薯(Manihotesculenta)，咖啡(Coffea spp.)，椰子(Cocos nucifera)，菠萝(Ananas comosus)，柠檬树(Citrus spp.)，可可(Theobroma cacao)，茶(Camellia sinensis)，香蕉(Musa spp.)，鳄梨(Persea americana)，无花果(Ficus casica)，番石榴(Psidium guajava)，芒果(Mangifera indica)，橄榄(Olea europaea)，番木瓜(Carica papaya)，腰果(Anacardiumoccidentale)，澳洲坚果(Macadamia integrifolia)，杏(Prunus amygdalus)、甜菜(Betavulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、油棕榈(Elaeis guineensis)、杨树(Populus sp.)、桉树(Eucalyptus sp.)、燕麦(Avena sativa)、大麦(Hordeum vulgare)、蔬菜、观赏植物和针叶树。
在一个实施方式中，采用本发明的启动子来驱动SBPase编码区域的表达。用包含本发明的驱动SBPase编码区域的表达启动子的构建体转化的植物显示增加的植物产量，即，生物质，和增加的种子数量。
目前，已证明上调SBPase能增加植物产量，可采用用于增加感兴趣的植物中的内源性SBPase序列的表达的其它方法。植物的基因组中存在的SBPase基因的表达可通过在所述植物的基因组中存在的SBPase基因的上游插入转录增强子来改变。该策略将允许SBPase基因的表达，以维持其正常发育概况，同时显示升高的转录本水平。该策略将采用针对感兴趣的基因组序列指定的大范围核酸酶，通过在感兴趣的SBPase基因上游插入增强子元件来实现。
SBPase基因的表达的改变可通过采用精确基因组编辑技术以调节该内源性序列的表达来实现。由此，通过使用本领域已知的方法将核酸插入编码SBPase的天然植物序列附近。这类方法包括但不限于针对感兴趣植物基因组序列设计的大范围核酸酶(D’Halluin等，(2013)Plant Biotechnol J 11:933-941)；CRISPR-Cas9，TALEN，和其他精确编辑基因组的技术(Feng等，(2013)Cell Research 23:1229-1232,Podevin等，(2013)TrendsBiotechnology 31:375-383,Wei等，(2013)J Gen Genomics 40:281-289,Zhang等，(2013)WO 2013/026740)；Cre-lox位点-特异性重组(Dale等，(1995)Plant J 7:649-659；Lyznik等，(2007)Transgenic Plant J 1:1-9；FLP-FRT重组(Li等，(2009)Plant Physiol151:1087-1095)；Bxb1-介导的整合(Yau等，Plant J(2011)701:147-166)；锌指介导的整合(Wright等，(2005)Plant J 44:693-705)；Cai等，(2009)Plant Mol Biol69:699-709)；和同源重组(Lieberman-Lazarovich和Levy(2011)Methods Mol Biol701:51-65)；Puchta,H.(2002)Plant Mol Biol 48:173-182)。将利用所述核酸序列的插入来实现SBPase基因的过表达和/或改变的表达的所需结果。
增强子包括能够在插入植物的基因组时增强基因表达的任何分子。因此，可将增强子插入感兴趣的SBPase序列的上游或下游基因组区中以增强表达。相对于将增强表达的基因，增强子可以起顺式作用，并且可位于基因组内的任何位置。例如，增强子可位于增强表达的编码序列的约1Mbp以内、约100kbp以内、约50kbp、约30kbp、约20kbp、约10kbp、约5kbp、约3kbp、或约1kbp以内。增强子也可位于其增强表达的基因的约1500bp以内，或者可紧邻或位于其增强表达的基因的内含子以内。本发明的用于调节内源性SBPase或同源物表达的增强子包括经典增强子元件，如CaMV 35S增强子元件、巨细胞病毒(CMV)早期启动子增强子元件、和SV40增强子元件，还包括增强基因表达的内含子-介导的增强子元件如玉米shrunken-1增强子元件(Clancy,M.和Hannah,L.C.(2002)Plant Physiol.130(2):918-29)。可导入植物基因组以调节表达的增强子的其他示例包括PetE增强子(Chua等，(2003)Plant Cell 15:11468-1479)，或水稻α-淀粉酶增强子(Chen等，(2002)J.Biol.Chem.277:13641-13649)，或本领域已知的任何增强子(Chudalayandi,S.(2011)MethodsMol.Biol.701:285-300)。在一些实施方式中，本发明包括亚结构域、片段、或重复增强子元件(Benfrey等，(1990)EMBO J 9:1677-1684)。
本发明还提供用于通过将本发明的启动子插入植物基因组，使其调控内源性SBPase序列的表达，来调控植物中内源性SBPase的方法。如上所述，使用本文提供的序列确定启动子或增强子的插入位点的方法和在给定插入位点处将启动子或增强子序列插入植物基因组的方法是本领域已知的。
SBPase基因表达的改变还可通过以不改变该DNA序列的方式来调节该DNA来实现。此类变化可包括调节染色质含量或感兴趣的SBPase基因的染色质含量或结构和/或该SBPase基因周围的DNA的染色质含量或结构。众所周知，染色质含量或结构中的此类变化能够影响基因转录(Hirschhorn等(1992)Genes and Dev 6:2288-2298；Narlikar等(2002)Cell 108:475-487)。此类变化还可包括改变感兴趣的SBPase基因的甲基化状态和/或该SBPase基因周围的DNA的甲基化状态。众所周知的是，DNA甲基化中的此类变化能够改变转录(Hsieh(1994)Mol Cell Biol 14:5487-5494)。本领域技术人员显见的是，可施用对DNA做出的调节感兴趣的SBPase基因的转录其它类似改变(统称为“表观遗传学改变”)，以获得改变的SBPase基因表达概况的所需结果。
SBPase基因表达的改变还可通过采用转座元件技术来改变基因表达来实现。众所周知，转座元件能够改变附近DNA的表达(McGinnis等(1983)Cell34:75-84)。光合生物体中，编码SBPase的基因的表达的改变可通过在感兴趣的SBPase基因上游插入转座元件，造成所述基因的表达改变，来实现。
SBPase基因表达的改变还可通过使调节感兴趣的SBPase基因的表达的一种或多种转录因子错误表达来实现。应理解，转录因子表达的改变能够进而改变所述转录因子的靶基因的表达(Hiratsu等(2003)Plant J 34:733-739)。SBPase基因表达的改变可通过改变一种或多种转录因子的表达来实现，所述转录因子已知与感兴趣的SBPase基因相互作用(例如，WF-1转录因子；Miles等(1993)Plant Mol Biol 22:507-516)。
SBPase基因表达的改变还可通过在启动子上游插入在该感兴趣的植物物种中编码原始SBPase的开放阅读框来实现。这将通过采用针对感兴趣的基因组序列指定的大范围核酸酶，在感兴趣的启动子上游插入SBPase开放阅读框来实现。该策略已知并且已经在之前证明在预定位置处将转基因插入棉花基因组(D’Halluin等，(2013)Plant Biotechnol J11:933-941)。本领域技术人员将显见的是，可采用其它技术来获得在预定的基因组基因座处插入遗传元件的类似结果(例如，CRISPR-Cas9、TALEN和用于准确编辑基因组的其它技术)。
通过说明的方式，而非限制性方式提供以下实施例。
实验部分
实施例1–植物转化载体的构建
对来自来自二穗短柄草(Brachypodium distachyon)的编码SBPase蛋白的cDNA(Genbank条目XM_003564577；SEQ ID NO:2)进行密码子优化，获得SEQ ID NO:1的开放阅读框。采用在5’和3’末端添加的合适的限制性位点重新合成该开放阅读框，以便克隆。
驱动受发育调控的表达的稻启动子与合适的限制性位点在其5’和3’末端重新合成，以便克隆。重新合成来自稻基因座的Os12g19470的启动子(SEQ ID NO:4)，来自稻基因座Os01g45274的启动子(SEQ ID NO:3)，来自稻基因座Os07g37240的启动子(SEQ ID NO:5)，来自稻基因座Os08g10020的启动子(SEQ ID NO:13)，来自稻基因座Os12g17600的启动子(SEQ ID NO:15)，来自稻基因座Os02g10390的启动子(SEQ ID NO:17)，来自稻基因座Os04g56400的启动子(SEQ ID NO:19)，和来自稻基因座Os01g40310的启动子(SEQ ID NO:21)。此外，重新合成CaMV 35S启动子(SEQ ID NO:9)并将其融合至来自玉米泛素基因(SEQID NO:10)的5’未翻译区域(5’UTR)。还重新合成玉米泛素启动子(SEQ ID NO:12)。
稻3’未翻译区域(3’UTR)与在其5’和3’末端的合适的限制性位点重新合成，以便克隆。重新合成来自稻基因座Os12g19470的3’UTR(SEQ ID NO:6)、来自稻基因座Os01g45274的3’UTR(SEQ ID NO:7)、来自稻基因座Os07g37240的3’UTR(SEQ ID NO:8)、来自稻基因座Os08g10020的3’UTR(SEQ ID NO:14)、来自稻基因座Os12g17600的3’UTR(SEQID NO:16)、来自稻基因座Os02g10390的3’UTR(SEQ ID NO:18)、来自稻基因座Os04g56400的3’UTR(SEQ ID NO:20)，和来自稻基因座Os01g40310的3’UTR(SEQ ID NO:22)。此外，重新合成来自玉米泛素基因的3’UTR(SEQ ID NO:11)。
采用标准分子生物学方案，将密码子优化的SBPase开放阅读框(ORF)克隆进入本文所述的稻遗传元件的启动子和3’UTR之间。所述载体包含表1所述的遗传元件。将这些转基因盒克隆进入经修饰的pMDC99二元载体骨架。
Figure BDA0001215127950000201
Figure BDA0001215127950000211
表1：用于SBPase过表达的载体
实施例2–二穗短柄草的转化
将表1中描述的载体转化进入根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(菌株AGL-1)。利用所得的土壤杆菌细胞，将SBPase转基因盒插入二穗短柄草(B.distachyon)核基因组。培育转基因植物，并通过PCR来证实合适的转基因盒的存在。
通过PCR证实包含该SBPase转基因盒的转基因二穗短柄草植物生长至成熟，并允许其自花传粉以产生T1代种子。
实施例3–T1代二穗短柄草植物的培育
如同野生型(WT)二穗短柄草植物那样，在生长室中，于20小时明亮/4小时黑暗光周期中，在同一条件下从种子生长T1代二穗短柄草植物。允许所有植物成熟并自花授粉，然后在37℃烘箱中干燥地上生物质。从剩余的生物质分离种子。对地上总生物质称重，并且对种子数量计数。所得的生物质和种子计数示于表2。
Figure BDA0001215127950000212
Figure BDA0001215127950000221
表2：来自T1代130005、130006、130008、130009和130011植物，以及来自野生型(WT)二穗短柄草植物的地上生物质重量和种子数量。
实施例4–来自发育调控的启动子的SBPase蛋白累积的定量
用130008和130009载体转化的T1代二穗短柄草植物在野生型二穗短柄草植物旁边，以16小时明亮/8小时黑暗光周期生长。在植物发育过程中的不同时间点(种植后50天至93天范围)收集叶样品，并在液氮中速冻。在TBST缓冲液中，从速冻叶样品提取蛋白质。总蛋白质浓度利用标准Bradford试验(马萨诸塞州波士顿的波士顿生物制品公司(BostonBioproducts))，采用由已知量的牛血清白蛋白蛋白质构建的标准曲线来确定。在确定叶提取物中的总蛋白质浓度之后，通过ELISA试验测试50μg的总蛋白质的SBPase含量。对于这些ELISA试验，允许蛋白质结合至高结合性、透明96孔板(德国葛莱纳公司(Greiner Bio-One))，4℃过夜(约16小时)。在该结合阶段之后，所有孔在TBST缓冲剂中清洗三次，然后在室温(约25℃)与针对大肠杆菌中产生的重组SBPase所生成的一抗孵育1小时。然后，所有的孔在TBST缓冲剂中清洗三次，然后在室温(约25℃)与二抗孵育1小时，所述二抗偶联有辣根过氧化物酶(伊利诺州洛克福德的赛默飞世尔公司(Thermo Scientific))。在TBST缓冲剂中清洗三次之后，添加ABTS检测缓冲剂(伊利诺州洛克福德的赛默飞世尔公司)。允许其在室温孵育30分钟，然后在405nm读取所有孔的吸光度值。基于产自大肠杆菌的包含已知量的纯化的SBPase蛋白的标准曲线来确定SBPase浓度。这些ELISA试验显示，构建体130008和130009中的Os12g19470和Os01g45274启动子分别以发育调控方式驱动SBPase基因表达和蛋白质累积，从而对于测试的大多数发育时间点而言，转基因二穗短柄草品系中的SBPase蛋白水平与野生型植物中的SBPase蛋白水平基本相似，除了78天的时间点处转基因植物一致地显示高于野生型植物的SBPase水平。
实施例5–SBPase表达的改变
高等植物的基因组中存在的SBPase基因的表达通过在该高等植物的基因组中存在的SBPase基因的上游插入启动子来改变。SBPase基因显示与感兴趣的启动子相关联的发育表达概况。指定大范围核酸酶在SBPase开放阅读框上游的位点切割该基因组DNA。选择该位点，从而所述启动子的插入促进下游序列的转录。利用对于基因组DNA的大范围核酸酶驱动的切割来引导感兴趣的启动子的插入。指定转化构建体，从而感兴趣的启动子是侧接的DNA，其匹配该大范围核酸酶切割位点上游和下游的基因组DNA。利用该侧接DNA来引导用于在所需位点插入感兴趣的启动子的同源重组。由此，在SBPase基因上游的插入选自SEQ IDNO:3、4、5、13、15、17、19和21的一种或多种启动子，以驱动SBPase基因表达。
或者，该植物基因组中的整个原始SBPase启动子用感兴趣的启动子替代。指定一种或多种大范围核酸酶在原始SBPase启动子的上游和下游切割基因组DNA。利用这些切割来引导感兴趣的启动子在所述基因组中的所需位点处插入，从而用感兴趣的启动子替代原始SBPase启动子。感兴趣的启动子由DNA侧接，所述DNA与两个大范围核酸酶切割位点上游和下游的基因组DNA同源，从而侧接的DNA能引导同源重组。由此，选自SEQ ID NO:3、4、5、13、15、17、19和21的一种或多种启动子被插入SBPase基因的上游以驱动SBPase基因的表达。
实施例6–水稻(Oryza sativa)的转化
将载体130005、130006、130007、130008、130009、130010、130011、130012、130013和130014转化进入根癌土壤杆菌(菌株AGL-1)。利用所得的土壤杆菌细胞，将SBPase转基因盒插入水稻(O.sativa)核基因组。培育转基因植物，并通过PCR来证实合适的转基因盒的存在。
通过PCR证实包含该SBPase转基因盒的转基因植物生长至成熟，并允许其自花传粉以产生T1代种子。
实施例7–狗尾草(Setaria viridis)的转化、培育与表征
将载体130005、130006、130007、130008、130009、130010、130011、130012、130013和130014转化进入根癌土壤杆菌(菌株AGL-1)。利用所得的土壤杆菌细胞，将SBPase转基因盒插入狗尾草(S.viridis)核基因组。培育转基因植物，并通过PCR来证实合适的转基因盒的存在。
通过PCR证实包含该SBPase转基因盒的转基因植物生长至成熟，并允许其自花传粉以产生T1代种子。
种植T1代种子以培育所得的T1代植物。使T1代植物伴随合适的对照植物生长，以评估SBPase表达对于转基因狗尾草植物的表型上和发育上的作用。从狗尾草植物收集叶样品，并且从叶组织提取总RNA。采用该RNA和针对SBPase转基因盒指定的引物来进行定量RT-PCR。引物经指定以扩增从SBPase开放阅读框的3’区域跨越至SBPase基因的3’UTR下游的区域，以避免扩增原始狗尾草SBPase转录本。这些定量RT-PCR实验的结果显示通过感兴趣的启动子驱动的SBPase转基因的表达水平。
实施例8–采用发育调控的启动子对光合基因的表达的改变
本领域技术人员显见的是，上述实施例中描述的方法可用于改变景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(SBPase)基因以外的其它光合作用中涉及的基因的表达。基于对通过本文所述的本发明的发育调控启动子驱动植物中SBPase表达获得的数据，能预见这些相同启动子可用于光合作用中涉及的其它基因。这些基因包括但不限于，果糖-1,6-二磷酸酶(FBPase)(SEQ ID NO:23-24，104-125)，果糖-1,6-双磷酸醛缩酶(FBP醛缩酶)(SEQ ID NO:25-26，126-155)，转酮醇酶(SEQ ID NO:27-28)，Rubisco小亚基(SEQ ID NO:29-30)，Rubisco大亚基(SEQ ID NO:31-32)，Rubisco活化酶(SEQ ID NO:33-34)，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)大亚基(SEQ ID NO:35-36，156-199)，AGPase小亚基(SEQ ID NO:37-38，200-221)，碳酸酐酶(SEQ ID NO:39-40，222-268)，PEP羧酶(PEPC)(SEQ ID NO:41-42)，丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)(SEQ ID NO:43-44)，苹果酸脱氢酶(SEQ ID NO:45-46)，苹果酸酶(SEQID NO:47-48)，磷酸甘油酸激酶(SEQ ID NO:49-50)，甘油醛3-磷酸脱氢酶(SEQ ID NO:51-52)，丙糖磷酸异构酶(SEQ ID NO:53-54)，核酮糖5-磷酸异构酶(SEQ ID NO:55-56)，磷酸核酮糖激酶(SEQ ID NO:57-58)，和核酮糖5-磷酸3-差向异构酶(SEQ ID NO:59-60)。
将该实施例中所述的一种或多种光合基因克隆进入适用于植物转化的载体。所述一种或多种光合基因位于用以驱动所述一种或多种光合基因表达的感兴趣的启动子之一的下游。选自SEQ ID NO:3，4，5，13，15，17，19和21的一种或多种启动子位于植物转化载体的编码感兴趣的光合蛋白质的开放阅读框的上游。利用该植物转化载体来转化植物细胞，由此使植物再生。光合基因的表达通过所得的再生的植物中的感兴趣的启动子来驱动。表达所述光合基因或感兴趣的基因的植物伴随合适的对照植物生长，以评估光合基因表达的作用。
实施例9–对转基因二穗短柄草和转基因水稻中的SBPase转录本水平定量
培育用表1所示的载体之一转化的T1代二穗短柄草植物，并从生长的植物收集叶样品。从该叶样品提取总RNA，并将该RNA用于定量RT-PCR实验。指定用以特定扩增原始二穗短柄草SBPase基因的引物(SEQ ID NO:63-64)，以扩增SBPase转基因(SEQ ID NO:65-76)，或扩增二穗短柄草ubc18基因(SEQ ID NO:61-62)。该ubc18基因是组成型表达基因，并且用作定量RT-PCR实验的对照反应。这些定量RT-PCR实验获得示于表3的数据。
<u>表达水平</u>
原始SBPase 1.1
130006 7.8
130008 0.5
130009 0.5
130011 1.5
表3：转基因二穗短柄草中的SBPase表达水平
表3中的表达水平相对于二穗短柄草ubc18基因表达水平显示。转基因植物中，原始SBPase基因的表达未受影响，因此，对于测试的所有野生型和转基因植物的原始SBPase基因的表达水平取平均。表3中所示的转基因二穗短柄草130006、130008、130009和130011植物的表达水平仅针对SBPase转基因。
培育用表1所示的载体之一转化的T1代水稻植物，并从生长的植物收集叶样品。采用Wang等(2014)Nat Biotechnol 32:1158-1165所述方案的修改版从轮生叶产生的叶收集叶样品。将叶分割成等长五段，并且从各段提取总RNA。该RNA用于定量RT-PCR实验。指定用以特定扩增原始水稻SBPase基因的引物(SEQ ID NO:77-78)，以扩增SBPase转基因(SEQ IDNO:65-76)，或扩增水稻ubq5基因(SEQ ID NO:79-80)。该ubq5基因是组成型表达基因，并且用作用于定量RT-PCR实验的对照反应。这些定量RT-PCR实验获得示于表4的数据。
Figure BDA0001215127950000251
Figure BDA0001215127950000261
表4：转基因水稻中的SBPase表达水平
表4中的表达水平相对于水稻ubq5基因表达水平显示。叶经分段处理，从而段1是叶基部，而段5位于叶尖部。转基因植物中，原始SBPase基因的表达未受影响，因此，对于测试的所有野生型和转基因植物的原始SBPase基因的表达水平取平均。表4所示的130009和130014植物的表达水平仅针对SBPase转基因。
本说明书中涉及的所有专利申请和出版物指示本发明涉及领域技术人员的水平。所有发表物和专利申请通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的发表物或专利申请具体和单独地通过引用纳入本文那样。
虽然出于方便理解的目的，通过阐述和举例的方式详细描述了上述发明，但可明显看出，某些改变和修改应属于所附权利要求书的范围。

Claims (13)

1.一种在植物中表达感兴趣的基因的方法，其包括：用DNA构建体转化植物细胞，所述DNA构建体包含启动子序列，所述启动子序列是SEQ ID NO:3所示的核酸序列，其操作性地连接至编码功能蛋白的第二核酸序列，并且，重新产生转化的植物。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述第二核酸序列编码光合作用中涉及的蛋白质。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述第二核酸编码具有景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶活性的酶。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述第二核酸是SEQ ID NO: 1的序列。
5.如权利要求3所述的方法，其中，所述核酸序列编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述转化的植物是单子叶植物。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述转化的植物是双子叶植物。
8.一种DNA构建体，其以操作性连接包含，
a.在植物细胞中发挥功能的启动子，
b.编码光合作用中涉及的蛋白质的核酸序列，
其中，所述启动子是SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列。
9.如权利要求8所述的DNA构建体，其中，编码光合作用中涉及的蛋白质的所述核酸序列是SEQ ID NO:1的核酸序列。
10. 如权利要求8所述的DNA构建体，其中，编码光合作用中涉及的蛋白质的所述核酸序列编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
11.一种调控植物生长的方法，其包括，将启动子序列插入植物细胞的核基因组中感兴趣的光合基因的上游，以改变所述光合基因的表达，其中，所述启动子序列是：SEQ ID NO:3。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述光合基因编码具有景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶活性的蛋白质。
13. 一种分离的启动子序列，所述启动子序列是SEQ ID NO:3所示的核酸序列。
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