DE69733945T2 - Metabolismusregulierung durch verändern des gehaltes an trehalose-6-phosphat - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Glykolyse war einer der ersten Stoffwechselprozesse, der in biochemischem Detail in der Literatur beschrieben wurde. Obwohl der allgemeine Fluss der Kohlenhydrate im Organismus bekannt ist und obwohl alle Enzym des glykolytischen Wegs (der Wege) aufgeklärt wurden, konnte das Signal, das die Induktion des Stoffwechsels durch Stimulation der Glykolyse bestimmt, noch nicht aufgedeckt werden. Etliche Hypothesen, insbesondere basierend auf der Situation bei Hefen, wurden vorgestellt, jedoch konnte bis jetzt noch keine jenseits jeder Zweifel bewiesen werden.
  • Ein Einfluss auf die Richtung der Kohlenhydrat-Partitionierung beeinflusst nicht nur direkt die zellulären Prozesse der Glykolyse und der Kohlenhydratlagerung, sondern kann auch verwendet werden, um sekundäre oder abgeleitete Prozesse zu beeinflussen, wie z.B. Zellteilung, Biomasseerzeugung und Anhäufung von Lagerverbindungen, wodurch Wachstum und Produktivität bestimmt werden.
  • Insbesondere bei Pflanzen werden häufig die Eigenschaften eines Gewebes direkt durch Gegenwart von Kohlenhydraten beeinflusst und die Steuerung der Kohlenhydrat-Partitionierung in eine Richtung kann substanzielle Unterschiede ergeben.
  • Das Wachstum, die Entwicklung und der Ertrag von Pflanzen hängen von der Energie ab, die solche Pflanzen von einer CO2-Fixierung während der Fotosynthese ableiten können.
  • Die Fotosynthese findet vorrangig in den Blättern statt und in einem geringeren Ausmaß im Stamm, während andere Pflanzenorgane wie Wurzeln, Samen oder Knollen, nicht wesentlich zu der Fotoassimilation beitragen. Diese Gewebe sind vollständig von den fotosynthetisch aktiven Organen für Wachstum und Ernährung abhängig. Dies bedeutet dann, dass es einen Fluss von Produkten, abstammend aus der Fotosynthese (kollektiv bezeichnet als "Fotosynthat") zu den fotosynthetisch inaktiven Teilen der Pflanzen gibt.
  • Die fotosynthetisch aktiven Teile werden als "Quellen" bezeichnet und sie sind als Nettoexporteure von Fotosynthat definiert. Die fotosynthetisch inaktiven Teile werden als "Sinks" bezeichnet und sie werden als Nettoimporteure von Fotosynthat definiert.
  • Es wird angenommen, dass sowohl die Effizienz der Fotosynthese als auch die Kohlenhydrat-Partitionierung in einer Pflanze essenziell sind. Neue, sich entwickelnde Gewebe, wie junge Blätter oder andere Teile wie Wurzeln und Samen sind vollständig von der Fotosynthese in den Quellen abhängig. Die Möglichkeit der Beeinflussung der Kohlenhydrat-Partitionierung würde einen großen Einfluss auf den Phänotyp einer Pflanze ausüben, z.B. ihre Höhe, die Internodiumentfernung, die Größe und Form eines Blatts und die Größe und Struktur des Wurzelsystems.
  • Weiterhin ist die Verteilung der Photoassimilationsprodukte von großer Wichtigkeit für den Ertrag von Pflanzenbiomasse und Produkten. Ein Beispiel ist die Entwicklung beim Weizen über das letzte Jahrhundert. Seine photosynthetische Kapazität hat sich nicht deutlich verändert, jedoch ist der Ertrag des Weizenkorns deutlich angestiegen, d.h. der Ernteindex (Verhältnis von erntbarer Biomasse/Gesamt-Biomasse) ist angestiegen. Der dem zugrundeliegende Grund ist derjenige, dass das Sink-zu-Quellenverhältnis durch konventionelles Züchten verändert wurde, so dass der erntbare Sinks-, d.h. Samen, Teil anstieg. Der Mechanismus, der die Verteilung der Assimilationsprodukte und dementsprechend die Bildung von Sinks und Quellen reguliert, ist jedoch noch unbekannt. Es wird angenommen, dass der Mechanismus irgendwo in den Kohlenhydrat-Stoffwechselwegen und ihrer Regulierung lokalisiert ist. Durch Forschungen der letzten Zeit wurde deutlich, dass Hexokinasen eine Hauptrolle bei der Metaboliten-Signalbildung und Kontrolle des Stoffwechselflusses spielen könnten. Eine Anzahl von Mechanismen für die Regulierung der Hexokinase-Aktivität wurde postuliert (Graham et al. (1994), The Plant Cell 6: 761; Jang & Sheen (1994), The Plant Cell 6, 1665; Rose et al. Eur. J. Biochem. 199, 511–518, 1991; Blazquez et al. (1993), FEBS 329, 51; Koch, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol. (1996) 47, 509; Jang et al. (1997), The Plant Cell 9, 5). Eine dieser Theorien der Hexokinaseregulation, postuliert bei der Hefe, erwähnt Trehalose und deren verwandte Monosaccharide (Thevelein & Hohmann (1995), TIBS 20, 3). Es ist jedoch schwerlich zu vermuten, dass es sich hierbei um einen universellen Mechanismus handeln könnte, da angenommen wird, dass die Trehalosesynthese auf bestimmte Arten begrenzt ist.
  • Blazquez et al. (1993) FEBS. Band 329, Nr. 12, Seiten 51–54 betreffen die Rolle von Trehalose-6-phosphat bei der Glykolyse von Hefe.
  • Hohmann et al. (1996) Molecular Microbiology 20(5), Seiten 981–991 betreffen ebenfalls die Rolle von Trehalose-6-phosphat bei der Glykolyse von Hefe und beschreiben Hefemutanten, die im Hinblick auf die TPS- und TPP-Aktivität defizient sind.
  • So besteht immer noch ein Bedarf an einer Aufklärung des Signals, das die Modifikation der Entwicklung und/oder Zusammensetzung von Zellen, Geweben und Organen in vivo dirigieren kann.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Es wurde nun festgestellt, dass die Modifikation der Entwicklung und/oder Zusammensetzung von Zellen, Gewebe und Organen in vivo durch Einführung des Enzyms Trehalose-6-Phosphat-Synthase (TPS) und/oder Trehalose-6-Phosphatase-Phosphat (TPP) möglich ist, wodurch eine Veränderung der Stoffwechselwege des Saccharids Trehalose-6-Phosphat (T-6-P) induziert wird, was zu einer Veränderung der intrazellulären Verfügbarkeit von T-6-P führt. Die Erfindung stellt ein Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 8 bereit. Die Einführung von TPS, wodurch ein Anstieg der intrazellulären Konzentration von T-6-P induziert wird, führt zu einer Inhibition des Kohlenstoffflusses in glykolytischer Richtung, einer Stimulation der Fotosynthese, einer Inhibition des Wachstums, einer Stimulation der Sink-bezogenen Aktivität und einem Anstieg der Lagerung von Resourcen. Die Einführung von TPP, wodurch eine Verminderung der intrazellulären Konzentration von T-6-P eingeführt wird, führt zu einer Stimulation des Kohlenstoffflusses in glykolytischer Richtung, einem Anstieg der Biomasse und einer Verminderung der photosynthetischen Aktivität. Weiter wird ein Verfahren gemäß den Ansprüchen 42 bis 54 bereitgestellt. Die Niveaus an T-6-P können durch gentechnische Manipulation eines Organismus mit Genkonstrukten beeinflusst werden, die das Niveau von T-6-P beeinflussen können oder durch exogene (orale, topische, parenterale usw.) Zufuhr von Verbindungen, die diese Niveaus beeinflussen können.
  • Die Genkonstrukte, die in der Erfindung verwendet werden können, sind Konstrukte, die das Gen für die Trehalose-Phosphat-Synthase (TPS) beherbergen, dem Enzym, das in der Lage ist, die Reaktion von Glukose-6-Phosphat und UDP-Glukose zu T-6-P zu katalysieren. Andererseits wird ein Konstrukt, kodierend das Enzym Trehalose-Phosphat-Phosphatase (TPP), das die Reaktion von T-6-P zu Trehalose katalysiert, bei Expression eine Verminderung der Menge an T-6-P ergeben.
  • Alternativ können Genkonstrukte, die Antisinn-TPS oder TPP beherbergen, verwendet werden, um die intrazelluläre Verfügbarkeit von T-6-P zu regulieren.
  • Weiterhin wurde kürzlich berichtet, dass eine intrazelluläre Phospho-α-(1,1)-Glucosidase, TreA, von Bacillus subtilis, in der Lage war, T-6-P zu Glukose und Glukose-6-Phosphat zu hydrolysieren (Schöck et al., Gene, 170, 77–80, 1996). Ein ähnliches Enzym wurde bereits für E. coli beschrieben (Rimmele und Boos (1996), J. Bact. 176 (18), 5654).
  • Für eine Überexpression müssen heterologe oder homologe Genkonstrukte verwendet werden. Es wird angenommen, dass die endogenes T-6-P bildenden und/oder abbauenden Enzyme sich unter allosterer Regulation und Regulation durch kovalente Modifikation befinden. Diese Regulation kann durch eine Verwendung heterologer Gene umgangen werden.
  • Alternativ kann eine Mutation heterologer oder homologer Gene verwen det werden, um die Regulation zu verhindern.
  • Die Erfindung gibt auch die Möglichkeit, die Quellen-Sink-Beziehungen zu modifizieren und die Anordnung von Resourcen in Pflanzen neu zu gestalten. Die Erfindung betrifft auch eine Pflanze gemäß den Ansprüchen 28 oder 29. Die gesamte Kohlenstoffwirtschaft der Pflanze, einschließlich der Assimilaterzeugung in Quellengeweben und der Verwendung in Quellengeweben kann modifiziert werden, was zu einem erhöhten Biomasseertrag der geernteten Produkte führen kann. Unter Verwendung dieses Ansatzes kann ein erhöhtes Ertragspotenzial realisiert werden, wie auch ein verbesserter Ernteindex und Produktqualität. Diese Veränderungen in den Quellengeweben können zu Veränderungen in den Sinkgeweben z.B. durch einen erhöhten Export von Fotosynthase führen. Umgekehrt können Veränderungen in Sinkgewebe zu einer Veränderung des Quellengewebes führen.
  • Eine spezifische Expression in einer Zelleorganelle, einem Gewebe oder einem anderen Teil eines Organismus ermöglicht, dass die allgemeinen Wirkungen, die oben erwähnt wurden, auf spezifische lokale Applikationen gerichtet werden. Diese spezifische Expression kann etabliert werden, indem die Gene, kodierend für TPS, TPP oder die Antisinn-Gene für TPS oder TPP unter die Kontrolle eines spezifischen Promotors platziert werden. Dementsprechend stellt die Erfindung einen Klonierungsvektor gemäß den Ansprüchen 26 oder 27 bereit.
  • Eine spezifische Expression ermöglicht auch die simultane Expression von sowohl den TPS- als auch TPP-Enzymen in unterschiedlichen Geweben, wodurch das Niveau von T-6-P erhöht und das Niveau von T-6-P lokal erniedrigt wird.
  • Durch Verwendung spezifischer Promotoren ist es auch möglich, einen zeitlichen Unterschied zu erzeugen. Für diesen Zweck können Promotoren ver wendet werden, die spezifisch während einer bestimmten Periode der Organogenese der Pflanzenteile aktiv sind. Auf diese Weise ist es möglich, zunächst die Menge von Organen zu beeinflussen, die entwickelt werden und dann diesen Organen ein Auffüllen mit Lagermaterial, wie Stärke, Öl oder Proteinen zu ermöglichen.
  • Alternativ können induzierbare Promotoren verwendet werden, um die Expression der Gene der Erfindung selektiv an- oder auszuschalten. Eine Induktion kann z.B. durch Pathogene, Stress, Chemikalien oder Licht/Dunkel-Stimulie erreicht werden.
  • Definitionen
  • Hexokinase-Aktivität ist die enzymatische Aktivität, die in Zellen angetroffen wird, die die Reaktion von Hexose zu Hexose-6-Phosphat katalysiert. Hexosen beinhalten Glukose, Fruktose, Galaktose oder jeden anderen C6-Zucker. Es wird anerkannt, dass es viele Isoenzyme gibt, die alle einen Part in dieser biochemischen Reaktion spielen können. Durch Katalyse dieser Reaktion bildet die Hexokinase ein Schlüsselenzym bei der Hexose (Glukose) -Signalbildung.
  • Die Hexose-Signalbildung ist der regulatorische Mechanismus, durch den die Zelle die Verfügbarkeit von Hexose (Glukose) erfährt.
  • Die Glykolyse ist die Sequenz von Reaktionen, die Glukose zu Pyruvat unter gleichzeitiger Produktion von ATP umwandelt.
  • Cold-Sweetening ist die Anhäufung löslicher Zucker in Kartoffelknollen nach der Ernte, wenn sie bei niedrigen Temperaturen gelagert werden.
  • Die Lagerung von Resourcenmaterial ist das Verfahren, bei dem das Primärprodukt Glukose in die molekulare Form verstoffwechselt wird, die für die Lagerung in der Zelle oder in einem spezialisierten Gewebe geeignet ist. Diese Formen können divers sein. Im Pflanzenreich findet die Lagerung im wesentlichen in Form von Kohlenhydraten und Polykohlenhydraten statt, wie z.B. Stärke, Fruktan und Cellulose oder als einfachere Mono- und Disaccharide wie Fruktose, Saccharose und Maltose; in Form von Ölen, wie Arachidon- oder Ölsäure und in Form von Proteinen, wie Cruciferin, Napin und Samenlagerproteine in Raps. In tierischen Zellen werden auch polymere Kohlenhydrate, wie Glykogen gebildet, jedoch wird auch eine große Menge energiereicher Kohlenstoffverbindungen zu Fett und Lipiden umgebaut.
  • Biomasse ist die Gesamtmasse des biologischen Materials.
  • Beschreibung der Figuren
  • 1: Schematische Darstellung des Plasmids pVDH275, das das Neomycin-Phosphotransferase-Gen (NPTII) beherbert, flankiert von dem 35S- Blumenkohlmosaik-Virus-Promotor (P35S) und Terminator (T35S) als selektierbare Marker; eine Expressionskassette, umfassend den Erbsenplastocyanin-Promotor (pPCpea) und den Nopalin-Synthase-Terminator (Tnos); rechts (RB) und links (LB) T-DNA-Bordersequenzen und ein bakterielles Kanamycinresistenz (KanR) -Markergen.
  • 2: Northern-Blot-Analyse von transgenen Tabakpflanzen. Panel A zeigt die Expression von otsA-mRNA in Blättern von individuellen pMOG799 transgenen Tabakpflanzen. Die Kontrollspur "C" enthält Gesamt-RNA von einer nicht-transformierten N. Tabacum-Pflanze.
  • 3: Ausrichtung von Pflanzen-abgeleiteten, TPS kodierenden Sequenzen, verglichen mit der TPSyeast-Sequenz unter Verwendung des Wisconsin GCG-Sequenzanalysepakets (Devereux et al. (1984) A comprehensive set of sequence analysis programs of the VAX. Nucl. Acids Res., 12, 387). TPSatal 3/56 und 142 TPSrice3 (SEQ ID NO: 53) bzw. RiceTPS kodieren für Arabidopsis bzw. Reis-TPS-Enzyme, abgeleitet von der EST-Datenbanksequenz. TPSsun10, TPSse143, (SEQ ID NO: 44) und TPSse18 (SEQ ID NO: 42) kodieren für Sonnenblumen bzw. Selaginella TPS-Enzyme, abgeleitet von Sequenzen, isoliert durch PCR-Verfahren (siehe Beispiel 3).
  • 4: Ausrichtung von PCR-amplifizierten Tabak-TPS-cDNA-Fragmenten mit dem TPS kodierenden Hefe-TPS1-Gen. Kästen zeigen die Identität zwischen den Aminosäuren von allen vier aufgeführten Sequenzen.
  • 5: Ausrichtung von PCR-amplifizierten Tabak-TPP-cDNA-Fragmenten mit dem TPP-kodierenden Hefe-TPS2-Gen. Kästen zeigen eine Identität zwischen den Aminosäuren von allen vier aufgeführten Sequenzen.
  • 6: Ausrichtung eines Fragments der PCR-amplifizierten Sonnenblumen-TPS/TPP-Bipartit-cDNA (SEQ ID NO: 24) mit dem TPP-kodierenden Hefe-TPS2-Gen. Kästen zeigen eine Identität zwischen den Aminosäuren beider Sequenzen.
  • 7: Ausrichtung eines Fragments von Arabidopsis TPS1 und Reis EST-Klonen mit dem TPS kodierenden Hefe-TPS1-Gen. Kästen zeigen eine Identität zwischen den Aminosäuren aller drei Sequenzen.
  • 8: Ausrichtung eines Fragments der PCR-amplifizierten menschlichen TPS-cDNA (SEQ ID NO: 10) mit dem TPS kodierenden Hefe-TPS1-Gen. Kästchen zeigen eine Identität zwischen den Aminosäuren beider Sequenzen.
  • 9: Trehaloseanhäufung in Knollen von pMOG1027 (35S as-Trehalase) transgenen Kartoffelpflanzen.
  • 10: Hexokinase-Aktivität eines Wildtyp-Kartoffelknollen (Solanum tuberosum cv. Kardal) -Extrakts mit und ohne Zugabe von Trehalose-6-Phosphat.
  • 11: Hexokinase-Aktivität eines Wildtyp-Kartoffelknollen (Solanum tuberosum cv. Kardal) -Extrakts mit und ohne Zugabe von Trehalose-6-Phosphat. Fruktose oder Glukose wird als Substrat für den Assay verwendet.
  • 12: Hexokinase-Aktivität eines Wildtyp-Tabakblattextrakt (Nicotiana tabacum cv. SR1) mit und ohne Zugabe von Trehalose-6-Phosphat. Fruktose oder Glukose wird als Substrat für den Assay verwendet.
  • 13: Plot einer Tabak-Hexokinase-Aktivitätsmessung.
    Datenreihe 1: Tabakpflanzenextrakt
    Datenreihe 2: Tabakpflanzenextrakt + 1 mM Trehalose-6-phosphat
    Datenreihe 3: Kommerzieller Hexokinaseextrakt von Hefen (1/8 Einheit)
  • 14: Hexokinase-Aktivität eines Wildtyp-Reisblattextrakts (Oryza sativa) mit und ohne Zugabe von Trehalose-6-Phosphat. Die Experimente wurden im Duplikat unter Verwendung verschiedener Mengen Extrakte durchgeführt. Fruktose oder Glukose werden als Substrat für den Assay verwendet.
  • 15: Hexokinase-Aktivität eines Wildtyp-Maisblattextrakts (Zea mais) mit und ohne Zugabe von Trehalose-6-Phosphat. Fruktose oder Glukose werden als Substrat für den Assay verwendet.
  • 16: Fluoreszenzeigenschaften von Wildtyp (Dreieck), PC-TPS (Quadrat) und 35S-TPP (Kreuz) Tabakblättern. Die oberen beiden Panels zeigen die Elektronentransporteffizienz (ETE) bei den angegebenen Lichtintensitäten (PAR). Die Pflanzen wurden nach einer Dunkelperiode (oberes linkes Panel) und nach einer Lichtperiode (oberes rechtes Panel) gemessen. Die unteren Panels zeigen eine Reduktion der Fluoreszenz aufgrund der Assimilatanhäufung (nicht fotochemisches Quenching). Das linke und rechte Panel wie oben.
  • 17: Relative Sink-Aktivität von Pflanzenteilen von PC-TPS ("Hunger") und 35S-TPP ("satt") transgenen Tabakpflanzen. Angegeben ist die Netto-C-Anhäufung, ausgedrückt als Prozentzahl des gesamten C-Gehalts für verschiedene Pflanzenteile nach einer Periode von Licht (D) oder Licht + Dunkel (D + N).
  • 18: Tatsächliche Verteilung von Kohlenstoff in Pflanzenteilen von PC-TPS (Hunger) und 35S-TPP (satt) transgenen Tabakpflanzen. Angegeben ist die Netto-C-Anhäufung, ausgedrückt als Prozentzahl von gesamtem täglichem angehäuftem neuem C für verschiedene Pflanzenteile nach einer Periode von Licht (D) oder Licht + Dunkel (D + N).
  • 19: Reduzierte und verstärkte Samenbildung bei transgenen Salatlinien, die PC-TPS oder PC-TPP exprimieren im Vergleich mit Wildtyppflanzen. Das untere Panel zeigt die Blattmorphologie und Farbe.
  • 20: Profil von löslichen Zuckern (20/1) in Extrakten von transgenem Kopfsalat (oberes Panel) und transgenen Rüben (unteres Panel). In dem oberen Panel sind die Kontrollen GUS-transgene Linien, die mit Linien verglichen werden, die für PC-TPS und PC-TPP transgen sind. Im unteren Panel sind alle transgenen PC-TPS. Die Stärkeprofile werden in 20/2 dargestellt.
  • 21: Pflanzen und Blattmorphologie von transgenen Zuckerrübenlinien, die PC-TPS (TPS) oder PC-TPP (TPP) exprimieren, im Vergleich mit Wildtyppflanzen (Kontrolle). Der TPS A-Typ hat Blätter, die mit dem Wildtyp vergleichbar sind, während der TPS D-Typ deutlich kleinere Blätter zeigt. Die Blätter von der TPP-transgenen Linie haben eine hellgrünere Farbe, einen größeren Blattstiel und eine erhöhte Größe im Vergleich mit der Kontrolle.
  • 22: Pfahlwurzeldurchmesser von transgenen Zuckerrübenlinien (PC-TPS). Die oberen Panel A, B, C und D zeigen eine verminderte Blattgröße im Vergleich mit der Kontrolle (A). Im unteren Panel sind individuelle Klone der Kontrolle und der PC-TPS-Linie 286-2 dargestellt.
  • 23: Knollenertrag von pMOG799 (35S TPS) transgenen Kartoffellinien.
  • 24: Knollenertrag von pMOG1010 (35S TPP) und pMOG1124 (PC-TPP) transgenen Kartoffellinien.
  • 25: Knollenertrag von 22 unabhängigen Wildtyp S.tuberosum-Klonen.
  • 26: Knollenertrag von pMOG1093 (PC-TPS) transgenen Kartoffellinien im Vergleich mit dem Wildtyp. B, C, D, E, F, G zeigen eine Verminderung der Blattgröße im Vergleich mit dem Wildtyp (B/C) an.
  • 27: Knollenertrag von pMOG845 (Pat-TPS) transgenen Kartoffellinien (27-1) im Vergleich mit dem Wildtyp (27-2). B, C zeigen die Blattgrößen an.
  • 28: Knollenertrag von pMOG1129(845-11/22/28) transgenen Kartoffellinien.
  • 29: Querschnitt durch Blätter von TPP- (unteres Panel) und TPS- (oberes Panel) transgenen Tabakpflanzen. Zusätzliche Zellschichten und eine erhöhte Zellgröße sind in dem TPS-Querschnitt sichtbar.
  • 30: HPLC-PED-Analyse von Knollen, die für TPSE.coli transgen sind, vor und nach Lagerung bei 4°C. Kardal C, F, B, G und H sind nicht-transgene Kontrolllinien.
  • 31: Blattmorphologie, Farbe und Größe von Tabaklinien, die für 35S TPS (oberes Blatt), Wildtyp (mittleres Blatt) und für 35S TPP (unteres Blatt) transgen sind.
  • 32: Stoffwechselprofil von 35S TPS (pMOG799), 35S TPP (pMOG1010), Wildtyp (WT), PC-TPS (pMOG1177) und PC-TPP (pMOG1124) transgenen Tabaklinien. Dargestellt sind die Niveaus an Trehalose, löslichen Zuckern (32-1), Stärke und Chlorophyll (32-2).
  • 33: Knollenertrag von pMOG1027 (35S as-Trehalase) und pMOG1027(845-11/22/28) (35S as-Trehalase pat TPS) transgenen Kartoffellinien im Vergleich mit Wildtyp-Kartoffellinien.
  • 34: Stärkegehalt von pMOG1027 (35S as-Trehalase) und pMOG1027(845-11/22/28) (35S as-Trehalase pat TPS) transgenen Kartoffellinien im Vergleich mit den Wildtyp-Kartoffellinien. Die Sequenz aller Linien, wie angegeben, ist identisch zu 33.
  • 35: Ertrag von pMOG1028 (pat as-Trehalase) und pMOG1028(845-11/22/28) (pat as-Trehalase pat TPS) transgenen Kartoffellinien im Vergleich mit Wildtyp-Kartoffellinien.
  • 36: Ertrag von pMOG1092 (PC as-Trehalase) transgenen Kartoffellinien im Vergleich mit Wildtyp-Kartoffellinien, wie angegeben in 35.
  • 37: Ertrag von pMOG1130 (PC as-Trehalase PC TPS) transgenen Kartoffellinien im Vergleich mit Wildtyp-Kartoffellinien, wie angegeben in 35.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die Erfindung beschäftigt sich mit der Feststellung, dass der Stoffwechsel in vivo durch das Niveau von T-6-P modifiziert werden kann. Eine Abnahme der intrazellulären Konzentration an T-6-P stimuliert die glykolytische Aktivität. Demgegenüber wird ein Anstieg der T-6-P-Konzentration die glykolytische Aktivität inhibieren und die Fotosynthese stimulieren.
  • Diese durch Veränderungen in T-6-P-Niveaus etablierten Modifikationen werden sehr vermutlich ein Ergebnis der Signalfunktion der Hexokinase sein, deren Aktivität sich als durch T-6-P reguliert erwiesen hat. Ein Anstieg im Fluss durch Hexokinase (d.h. ein Anstieg der Menge Glukose), die in Glukose-6-Phosphat umgesetzt wird, hat erwiesenermaßen die photosynthetische Aktivität bei Pflanzen inhibiert. Weiterhin würde ein Anstieg des Flusses durch Hexokinase nicht nur die Glykolyse stimulieren, sondern auch die Zellteilungsaktivität.
  • Theorie der Trehalose-6-Phosphat-Regulation des Kohlenstoff-Stoffwechsels
  • In einer normalen Pflanzenzelle findet die Bildung von Kohlenhydraten im Prozess der Fotosynthese statt, worin CO2 fixiert und zu phosphorylierten Hexosen mit Saccharose als Endprodukt reduziert wird. Normalerweise wird diese Saccharose aus der Zelle zu Zellen oder Geweben transportiert, die durch Aufnahme dieser Saccharose die Kohlenhydrate als Baumaterial für ihren Stoffwechsel verwenden können oder in der Lage sind, die Kohlenhydrate zu lagern, z.B. als Stärke. In diesem Hinblick werden in den Pflanzen die Zellen, die in der Lage zur Fotosynthese und so zur Erzeugung von Kohlenhydraten sind, als Quellen bezeichnet, während Zellen, die die Kohlenhydrate konsumieren oder lagern, Sinks genannt werden.
  • In tierischen und den meisten mikrobiellen Zellen findet keine Fotosynthese statt und die Kohlenhydrate müssen von externen Quellen erhalten werden, entweder durch direkte Aufnahme von Sacchariden (z.B. Hefen und andere Mikroorganismen) oder durch Verdau von Kohlenhydraten (Tiere). Der Kohlenhydrattransport findet in der Regel in diesen Organismen in Form von Glukose statt, die aktiv über die Zellmembran transportiert wird.
  • Nach Eintritt in die Zelle ist einer der ersten Schritte im Stoffwechselweg die Phosphorylierung von Glukose zu Glukose-6-Phosphat, katalysiert durch das Enzym Hexokinase. Es wurde demonstriert, dass in Pflanzen Zucker, die durch Hexokinase (HXK) phosphoryliert werden, die Expression von Genen kontrollieren, die an der Fotosynthese beteiligt sind (Jang & Sheen (1994), The Plant Cell 6, 1665). Daher wurde vorgeschlagen, dass HXK eine duale Funktion haben könnte und als Schlüsselsensor sowie als Signaltransmitter von einer Kohlenhydrat-vermittelten Regulation der Genexpression funktionieren könnte. Es wird angenommen, dass diese Regulation in der Regel der Zelle Signale über die Verfügbarkeit des Ausgangsprodukts, d.h. Glukose, schickt. Ähnliche Wirkungen werden durch Einführung von TPS oder TPP beobachtet, die das Niveau an T-6-P beeinflussen. Weiterhin wurde gezeigt, dass in vitro T-6-P-Niveaus die Hexokinas-Aktivität beeinflussen. Durch Erhöhung des Niveaus an T-6-P empfängt die Zelle ein Signal, dass es einen Mangel an Kohlenhydrateingabe gibt. Demgegenüber führt eine Verminderung des Niveaus von T-6-P zu einem Signal, dass es viel Glukose gibt, was zu einer Herabregulierung der Fotosynthese führt: sie signalisiert, dass das Substrat für die Glykolyse und dementsprechend die Energiezufuhr für Prozesse, wie Zellwachstum und Zellteilung, ausreichend zur Verfügung ste hen. Es wird angenommen, dass diese Signalbildung durch einen erhöhten Fluss durch die Hexokinase initiiert wird (J. J. Van Oosten, öffentlicher Vortrag an der Reichsuniversität Utrecht vom 19. April 1996).
  • Die Theorie, dass die Hexokinase-Signalbildung bei Pflanzen durch Modulation des Niveaus an Trehalose-6-Phosphat reguliert werden könnte würde implizieren, dass alle Pflanzen die Gegenwart eines Enzymsystems benötigen, das das Signalmolekül Trehalose-6-Phosphat erzeugen und abbauen kann. Obwohl Trehalose allgemein in einer großen Vielzahl von Pilzen, Bakterien, Hefen und Algen angetroffen wird, wie auch bei einigen Nicht-Wirbeltieren, wurde nur ein sehr begrenzter Kreis von vaskulären Pflanzen als in der Lage zur Synthese dieses Zuckers vorgeschlagen (Elbein (1974), Adv. Carboh. Chem. Biochem. 30, 227). Ein Phänomen, das bis jetzt noch nicht verstanden wurde ist, dass trotz dieses anscheinenden Mangels an Trehalose synthetisierenden Enzymen alle Pflanzen Trehalasen zu enthalten scheinen, d.h. Enzyme, die in der Lage sind, Trehalose zu zwei Glukosemolekülen abzubauen.
  • Indirekte Beweise für die Gegenwart eines Stoffwechselwegs für Trehalose werden durch Experimente, wie hier präsentiert, erhalten, mit Trehalase-Inhibitoren, wie Validamycin A oder Transformation mit Antisinn-Trehalase.
  • Die Erzeugung von Trehalose würde behindert werden, wenn ihr Intermediat T-6-P die Stoffwechselaktivität zu sehr beeinflussen würde. Um hohe Niveaus an Trehalose ohne Beeinflussung der Partitionierung und Verteilung von Metaboliten durch Wirkung von Trehalose-6-Phosphat nachteilig zu beeinflussen, sollte man vorzugsweise ein Bipartit-TPS/TPP-Enzym überexprimieren. Ein solches Enzym würde einer genetischen Konstitution, wie sie in der Hefe angetroffen wird, ähneln, wo das TPS2-Genprodukt einen TPS- und TPP-homologen Bereich beherbergt, im Vergleich mit dem E. coli otsA- und otsB-Gen (Kaasen et al. (1994), Gene 145, 9). Unter Verwendung eines solchen Enzyms wird Trehalose-6-Phosphat anderen Zellkomponenten nicht frei zugänglich werden. Ein anderes Beispiel für ein solches Bipartitenzym wird von Zentella & Iturriaga gegeben (Plant Physiol. (1996), 111 Abstract 88), die eine 3,2 kb cDNA aus Selaginella lepidophylla isolierten, die eine putative Trehalose-6-Phosphat-Synthase/Phosphatase kodierte. Es wird auch betrachtet, dass die Konstruktion eines verkürzten TPS-TPP-Genprodukts, wobei nur die TPS-Aktivität beibehalten bleiben würde, so wirksam für eine Synthese von T-6-P sein würde, wie das otsA-Gen von E. coli, auch wenn es in einem homologen System verwendet wird.
  • Auf molekularem Niveau haben wird Daten, die anzeigen, dass neben ihrem Vorkommen in Selaginella auch in Arabidopsis, Tabak, Reis und Sonnenblumen Trehalose synthetisierende Gene vorliegen. Unter Verwendung degenerierter Primer, basierend auf konservierten Sequenzen zwischen TPSE.coli und TPSHefe waren wir in der Lage, Gene zu identifizieren, die putative Trehalose-6-Phosphat erzeugende Enzyme in Sonnenblumen und Tabak kodierten. Ein Sequenzvergleich ergab eine signifikante Homologie zwischen diesen Sequenzen, den TPS-Genen von Hefen und E.coli und EST- (exprimierte Sequencetags) Sequenzen von Arabidopsis und Reis (siehe auch Tabelle 6b, die die EST-Zahlen von angetroffenen homologen EST's enthält).
  • Kürzlich wurde ein Arabidopsisgen aufgeklärt (offenbart in der GENBANK, Zugangsnummer Y08568, dargestellt in SEQ ID NO: 39), das auf Basis seiner Homologie als Bipartitenzym angesehen werden kann.
  • Diese Daten zeigen an, dass anders als gegenwärtig angenommen, die meisten Pflanzen Gene enthalten, die Trehalose-Phosphat-Synthasen kodieren, die es ihnen ermöglichen, T-6-P zu synthetisieren. Wie durch die Anhäufung von Trehalose in TPS exprimierenden Pflanzen bewiesen, enthalten Pflanzen auch Phosphatasen, nicht-spezifisch oder spezifisch, die in der Lage dazu sind, T-6-P zu Trehalose zu dephosphorylieren. Die Gegenwart von Trehalase in allen Pflanzen könnte einen Turnover von Trehalose bezwecken.
  • Weiterhin stellen wir auch Daten bereit, dass T-6-P an einer Regulation der Kohlenhydrat-Stoffwechselwege in menschlichem Gewebe beteiligt ist. Wir haben ein menschliches TPS-Gen (dargestellt in SEQ ID NO: 10) aufgeklärt, das eine Homologie zu den TPS-Genen von Hefe, E. coli und Pflanzen zeigt. Weiterhin zeigen wir Daten, die ebenfalls zeigen, dass die Aktivität von Hexokinase im Säuger (Maus) -Gewebe beeinflusst wird.
  • Die Erzeugung von "Viel"-Signal durch Verminderung der intrazellulären Konzentration von Trehalose-6-Phosphat durch Expression des Enzyms TPP (oder Inhibition des Enzyms TPS) wird allen Zellsystemen signalisieren, den glykolytischen Kohlenstofffluss zu erhöhen und die Fotosynthese zu inhibieren. Dies ist sehr schön in dem experimentellen Teil dargestellt, wo z.B. in Experiment 2 transgene Tabakpflanzen beschrieben werden, worin das Enzym TPP mit einer erhöhten Blattgröße, vermehrter Zweigbildung einer Reduktion der Menge an Chlorophyll exprimiert wird. Da dieses "Viel"-Signal in Abwesenheit von einer ausreichenden Zufuhr von Glukose erzeugt wird, wird der Pool an Kohlenhydraten in der Zelle schnell abgebaut.
  • So wird unter der Annahme, dass das künstliche "Viel"-Signal anhält, die Reduktion der Kohlenhydrate schließlich das Wachstum und die Zelltei lung begrenzen, d.h. die Zellen werden ihre gesamten gelagerten Kohlenhydrate verbrauchen und werden sich in einen "Hunger"-Zustand begeben. So werden Blätter mit einer geringen Menge an gelagerten Kohlenhydraten gebildet. Andererseits zeigten Pflanzen, die ein Konstrukt mit einem Gen, kodierend für TPS exprimierten, dass die intrazelluläre Menge an T-6-P erhöht, eine Reduktion der Blattgröße, während die Blätter auch ein dunkleres Grün zeigten und eine erhöhte Menge an Chlorophyll enthielten.
  • Bei der Hefe ist eine Hauptrolle der Glukose-induzierten Signalbildung das Umschalten des Stoffwechsels von einer neogenetischen/respiratorischen Arbeitsweise zur fermentativen Weise. Etliche Signalwege sind an diesem Phänomen beteiligt (Thevelein und Hohmann, (1995) TIBS 20, 3). Neben der möglichen Rolle der Hexokinase-Signalbildung wurde gezeigt, dass der RAS-cyclische-AMP (cAMP) -Weg durch Glukose aktiviert wird. Die Aktivierung des RAS-cAMP-Wegs durch Glukose benötigt eine Glukose-Phosphorylierung, aber keinen weiteren Glukose-Stoffwechsel. Bis jetzt wurde gezeigt, dass dieser Weg die Trehalase und 6-Phosphofrukto-2-Kinase aktiviert (und dadurch die Glykolyse stimuliert), während die Fruktose-1,6-Bisphosphatase inhibiert wird (und dadurch eine Glukoneogenese verhindert), und zwar durch eine cAMP-abhängige Protein-Phosphorylierung. Diese Signal-Transduktionsroute und die Stoffwechselwirkungen, zu denen sie führen kann, können so als solche betrachtet werden, die parallel zu dem Hexokinasesignalweg wirken, von dem gezeigt wurde, dass er durch das Niveau an Trehalose-6-Phosphat beeinflusst wird.
  • Wie in unserer Erfindung dargestellt, zeigen transgene Pflanzen, die as-Trehalase exprimieren, ein ähnliches Phänomen, wie dunkelgrüne Blätter, erhöhten Ertrag, wie beobachtet, wenn ein TPS-Gen exprimiert wird. Es scheint auch, dass die Expression von as-Trehalase in Doppelkonstrukten die Wirkungen verstärkt, die durch Expression von TPS ausgelöst werden. Es wurde gezeigt, dass die Trehalaseaktivität z.B. in Pflanzen, Insekten, Tieren, Pilzen und Bakterien vorliegt, während nur in einer begrenzten Zahl von Arten die Trehalase angehäuft wird.
  • Bis jetzt ist die Rolle der Trehalase in Pflanzen unbekannt, obwohl dieses Enzym in fast allen Pflanzenarten vorliegt. Es wurde vorgeschlagen, dass es an Pflanzen-Pathogen-Wechselwirkungen und/oder Pflanzenverteidigungsreaktionen beteiligt ist. Wir haben ein Kartoffel-Trehalase-Gen isoliert und zeigen, dass die Inhibition der Trehalaseaktivität in dem Kartoffelblatt und Knollengeweben zu einer Erhöhung des Knollenertrags führt. Ei ne fruchtspezifische Expression der as-Trehalase bei der Tomate, kombiniert mit einer TPS-Expression, verändert die Fruchtentwicklung dramatisch.
  • Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird die Anhäufung von T-6-P bei Zellen ausgelöst, bei denen die Kapazität zur Erzeugung von T-6-P durch Einführung eines exprimierbaren Genkonstrukts, kodierend Trehalose-Phosphat-Synthase (TPS), eingeführt wurde. Jedes denkbare Trehalose-Phosphat-Synthase-Gen unter der Kontrolle von regulatorischen Elementen, die für die Expression von DNA in Zellen notwendig sind, entweder spezifisch oder konstitutiv, kann verwendet werden, solange es in der Lage ist, Trehalose-Phosphat-Synthase zu erzeugen, die zu einer T-6-P-Produktion in den Zellen in der Lage ist. Ein Beispiel eines offenen Leserahmens ist eines, kodierend an TPS-Enzym, wie dargestellt in SEQ ID NO: 2. Andere Beispiele sind die offenen Leserahmen, wie dargestellt in SEQ ID Nrn.: 10, 18–23, 41 und 45–53. Wie durch die oben erwähnten Sequenzen illustriert, ist wohlbekannt, dass mehr als eine DNA-Sequenz ein identisches Enzym kodieren kann, was tatsächlich durch die Degeneration des genetischen Codes ausgelöst wird. Falls gewünscht, kann der offene Leserahmen, der die Trehalose-Phosphat-Synthase-Aktivität kodiert, auf eine Kodon-Verwendung in dem gewählten Wirt angepasst werden, jedoch ist das nicht notwendig.
  • Die z.B. durch SEQ ID NO: 2 dargestellte isolierte Nukleinsäuresequenz kann zur Identifizierung von Trehalose-Phosphat-Synthase-Genen in anderen Organismen und darauffolgend Isolieren und Klonieren durch PCR-Verfahren und/oder Hybridisierung der DNA von anderen Quellen mit einem DNA- oder RNA-Fragment, erhältlich von dem E. coli-Gen, verwendet werden. Vorzugsweise werden solche DNA-Sequenzen durch Hybridisieren unter mehr oder weniger stringenten Bedingungen (beeinflusst durch Faktoren wie Temperatur und Ionenstärke der Hybridisierungsmischung) einem Screening unterzogen. Ob die Bedingungen stringent sind oder nicht, hängt auch von der Natur der Hybridisierung, d.h. DNA:DNA, DNA:RNA, RNA:RNA, wie auch der Länge des kürzesten Hybridisierungsfragments ab. Der Fachmann wird einfach in der Lage sein, eine Hybridisierungsvorschrift zu etablieren, die ausreichend stringent ist, um TPS-Gene zu isolieren, während eine nicht-spezifische Hybridisierung vermieden wird. Wenn an der Trehalose-Synthese von anderen Quellen involvierte Gene verfügbar werden, können diese auf ähnliche Weise verwendet werden, um ein exprimierbares Trehalose-Phosphat-Synthase-Gen gemäß der Erfindung zu erhalten. Im experimentellen Bereich werden mehr Details angegeben.
  • Quellen zur Isolation der Trehalose-Phosphat-Synthase-Aktivitäten beinhalten Mikroorganismen (z.B. Bakterien, Hefen, Pilze), Pflanzen, Tiere und ähnliche. Isolierte DNA-Sequenzen, die Trehalose-Phosphat-Synthase-Aktivität von anderen Quellen kodieren, können ähnlich in einem Verfahren zur Erzeugung von T-6-P gemäß der Erfindung verwendet werden. Als Beispiel werden Gene zur Erzeugung von T-6-P aus Hefe in der WO 93/17093 offenbart.
  • Ebenfalls offenbart werden Nukleinsäuresequenzen, die durch Modifikation der Nukleinsäuresequenz, repräsentiert in SEQ ID NO: 1, durch Mutation von ein oder mehr Kodons erhalten wurden, so dass dies zu Aminosäureveränderungen in dem kodierten Protein führt, solang die Mutation der Aminosäuresequenz nicht vollständig die Trehalose-Phosphat-Synthese-Aktivität unterdrückt.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann das Trehalose-6-Phosphat in einer Pflanzenzelle zu Trehalose durch Trehalose-Phosphat-Phosphatase kodierende Gene unter Kontrolle von regulatorischen Elementen umgewandelt werden, die für die Expression von DNA in Pflanzenzellen notwendig sind. Ein bevorzugter offener Leserahmen gemäß der Erfindung ist einer, der ein TPP-Enzym kodiert, dargestellt in SEQ ID NO: 4 (Kaasen et al. (1994) Gene, 145, 9). Es ist wohlbekannt, dass mehr als eine DNA-Sequenz ein identisches Enzym kodieren kann, was tatsächlich durch die Degeneration des genetischen Cods ausgelöst wird. Falls gewünscht, kann der offene Leserahmen, kodierend die Trehalose-Phosphat-Phosphatase-Aktivität, an eine Kodon-Verwendung in dem gewählten Wirt angepasst werden, jedoch ist dies nicht notwendig.
  • Die durch SEQ ID NO: 3 dargestellte isolierte Nukleinsäuresequenz kann verwendet werden, um Trehalose-Phosphat-Phosphatase-Gene in anderen Organismen zu identifizieren und sie darauffolgend zu isolieren und zu klonieren, durch PCR-Verfahren und/oder durch Hybridisieren von DNA von anderen Quellen mit einem DNA- oder RNA-Fragment, erhältlich von dem E. coli-Gen. Vorzugsweise werden solche DNA-Sequenzen durch Hybridisieren unter mehr oder weniger stringenten Bedingungen (beeinflusst durch Faktoren wie Temperatur und Ionenstärke der Hybridisierungsmischung) einem Screening unterzogen. Ob die Bedingungen stringent sind oder nicht, hängt auch von der Natur der Hybridisierung, d.h. DNA:DNA, DNA:RNA, RNA:RNA, wie auch der Länge des kürzesten Hybridisierungsfragments ab. Der Fachmann wird einfach in der Lage sein, eine Hybridisierungsvorschrift zu etablieren, die ausreichend stringent ist, um TPP-Gene zu isolieren, während eine nichtspezifische Hybridisierung vermieden wird. Wenn an der Trehalose-Synthese von an deren Quellen involvierte Gene verfügbar werden, können diese auf ähnliche Weise verwendet werden, um ein exprimierbares Trehalose-Phosphat-Phosphatase-Gen gemäß der Erfindung zu erhalten. Im experimentellen Bereich werden mehr Details angegeben.
  • Quellen zur Isolation der Trehalose-Phosphat-Synthase-Aktivitäten beinhalten Mikroorganismen (z.B. Bakterien, Hefen, Pilze), Pflanzen, Tiere und ähnliche. Isolierte DNA-Sequenzen, kodierend Trehalose-Phosphat-Phosphatase-Aktivität von anderen Quellen, können ähnlich verwendet werden.
  • Ebenfalls offenbart werden Nukleinsäuresequenzen, die durch Modifikation der Nukleinsäuresequenz, repräsentiert in SEQ ID NO: 3, durch Mutation von ein oder mehr Kodons erhalten wurden, so dass dies zu Aminosäureveränderungen in dem kodierten Protein führt, solang die Mutation der Aminosäuresequenz nicht vollständig die Trehalose-Phosphat-Phosphatase-Aktivität unterdrückt.
  • Andere Enzyme mit TPS- oder TPP-Aktivität werden durch die sogenannten Bipartitenzyme dargestellt. Es wird mit betrachtet, dass der Teil der Sequenz, der spezifisch für eine der zwei Aktivitäten kodiert, von dem Teil des Bipartitenzyms abgetrennt werden kann, der für die andere Aktivität kodiert. Eine Möglichkeit, um die Aktivitäten zu trennen, ist die Insertion einer Mutation in der Sequenz, die für die Aktivität kodiert, die nicht gewählt ist, wodurch das exprimierte Protein in dieser Aktivität nachteilig beeinflusst oder defizient ist und so nur die andere Funktion ausüben kann. Dies kann sowohl für die TPS- als auch die TPP-Aktivität kodierende Sequenz durchgeführt werden. So können die auf diese Weise erhaltenen kodierenden Sequenzen für die Bildung von neuen chimären, offenen Leserahmen verwendet werden, die zu einer Expression von Enzymen mit entweder TPS- oder TPP-Aktivität in der Lage sind.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung können insbesondere Pflanzen genetisch verändert werden, um die oben erwähnten Enzyme in spezifischen Teilen der Pflanze zu erzeugen und anzuhäufen. Bevorzugte Stellen für eine Enzymexpression sind Blätter und Lagerteile von Pflanzen. Insbesondere Kartoffelknollen werden als geeignete Pflanzenteile angesehen. Ein bevorzugter Promotor, um eine selektive TPS-Enzymexpression in Mikroknollen und Knollen von Kartoffeln zu erreichen, ist aus dem Bereich stromaufwärts vom offenen Leserahmen des Patatingens der Kartoffel erhältlich.
  • Ein weiterer geeigneter Promotor für eine spezifische Expression ist der Plastocyanin-Promotor, der für die photoassimilierenden Teile von Pflanzen spezifisch ist. Weiterhin wird mit betrachtet, dass die spezifi sche Expression in Pflanzenteilen eine günstige Wirkung auf das Pflanzenwachstum und die Reproduktion oder für die ökonomische Verwendung der Pflanzen ergeben kann. Promotoren, die in diesem Hinblick geeignet sind, sind: der E8-Promotor ( EP 0 409 629 ) und der 2A11-Promotor (van Haaren und Houck (1993), Plant Mol. Biol., 221, 625), die fruchtspezifisch sind; der Cruciferin-Promotor, der Napin-Promotor und der ACP-Promotor, die samenspezifisch sind; der PAL-Promotor, der Chalcon-Isomerase-Promotor, der blumenspezifisch ist; der SSU-Promotor und Ferredoxin-Promotor, die blattspezifisch sind; der TobRb7-Promotor, der wurzelspezifisch ist, der RolC-Promotor, der spezifisch für das Phloem ist und der HMG2-Promotor (Enjuto et al. (1995), Plant Cell 7, 517) und der Reis-PCNA-Promotor (Kosugi et al. (1995), Plant J. 7, 877), die für die Meristem-Gewebe spezifisch sind.
  • Eine andere Option gemäß dieser Erfindung ist die Verwendung induzierbarer Promotoren. Es sind Promotoren bekannt, die durch Pathogene, durch Stress, durch Chemikalien oder Licht/Dunkelstimuli induzierbar sind. Es wird mit betrachtet, dass für die Induktion spezifischer Phänomene, z.B. Sprossenbildung, Samenbildung, Samen setzen, Füllen von Lagergeweben, es günstig ist, die Aktivität der Gene der Erfindung durch externe Stimuli zu induzieren. Dies ermöglicht eine normale Entwicklung der Pflanze und die Vorteile der Induzierbarkeit der gewünschten Phänomene in kontrollierter Weise. Promotoren, die sich für diese Verwendung in einer solchen Vorschrift qualifizieren, sind die pathogen induzierbaren Promotoren, wie beschrieben in DE 4446342 (Pilz- und Auxin-induzierbares PRP-1), WO 96/28561 (Pilz-induzierbares PRP-1), EP 0 586 612 (Nematoden-induzierbar), EP 0 712 273 (Nematoden-induzierbar), WO 96/34949 (Pilz-induzierbar), PCT/EP96/02437 (Nematodem-induzierbar), EP 0 330 479 (Stress-induzierbar), US 5,510,474 (Stress-induzierbar), WO 96/12814 (Kälte-induzierbar), EP 0 494 724 (Tetracyclin-induzierbar), EP 0 619 844 (Ethylen-induzierbar), EP 0 337 532 (Salicylsäure-induzierbar), WO 95/24491 (Thiamin-induzierbar) und WO 92/19724 (Licht-induzierbar). Andere Chemikalien-induzierbare Promotoren werden in EP 0 674 608, EP 637 339, EP 455 667 und US 5,364,780 beschrieben.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden Pflanzenzellen mit Konstrukturen transformiert, die die Funktion von endogen exprimiertem TPS oder TPP inhibieren. Die Inhibition der unerwünschten endogenen Enzymaktivität wird auf eine Anzahl von Weisen erreicht, deren Wahl für die Erfindung nicht kritisch ist. Ein Verfahren zur Inhibition der Genexpression wird durch den sogenannten "Antisinn-Ansatz" erreicht. Hierbei wird eine DNA-Sequenz exprimiert, die eine RNA erzeugt, die zumindest teilweise komplementär zu der RNA ist, die die enzymatische Aktivität kodiert, die blockiert werden soll. Es wird bevorzugt, homologe Antisinn-Gene zu verwenden, da diese effizienter sind als heterologe Gene. Ein alternatives Verfahren zum Blockieren der Synthese von unerwünschten enzymatischen Aktivitäten ist die Einführung einer zusätzlichen Kopie eines endogenen Gens, das in der Pflanzen-Wirtszelle vorliegt, in das Genom der Pflanzen-Wirtszelle. Es wird oft beobachtet, dass eine solche zusätzliche Kopie eines Gens das endogene Gen stillegt: diese Wirkung wird in der Literatur als co-supprimierende Wirkung oder Co-Suppression bezeichnet. Details für das Verfahren einer Erhöhung der Substratverfügbarkeit werden in den Beispielen von WO 95/01446 bereitgestellt, hier durch Inbezugnahme inkorporiert.
  • Wirtszellen können alle Zellen sein, worin die Modifikation der Hexokinase-Signalbindung durch Veränderungen des Niveaus von T-6-P bewirkt wird. So werden alle eukaryontischen Zellen hier betrachtet. Von einem ökonomischen Standpunkt aus sind die für eine Produktion von Stoffwechselverbindungen besonders geeigneten Zellen besonders geeignet. Diese Organismen sind unter anderem Pflanzen, Tiere, Hefen, Pilze. Jedoch wird auch eine Expression in spezialisierten Tierzellen (wie z.B. den Pankreas-β-Zellen und Fettzellen), mit betrachtet.
  • Bevorzugte Pflanzenwirte unter den Spermatophyten sind die Angiospermae, insbesondere die Dicotyledoneae, umfassend inter alia die Solanaceae als repräsentative Familie und die Monocotyledoneae, umfassend inter alia die Gramineae als repräsentative Familie. Geeignete Wirtpflanzen, wie im Kontext der vorliegenden Erfindung definiert, beinhalten Pflanzen (wie auch Teile und Zellen der Pflanzen) und ihre Nachkommenschaft, die ein modifiziertes Niveau an T-6-P enthalten, z.B. durch Verwendung rekombinanter DNA-Verfahren zur Auslösung oder Verstärkung der Produktion von TPS oder TPP in der gewünschten Pflanze oder dem Pflanzenorgan. Ernten gemäß der Erfindung beinhalten diejenigen, die Blumen aufweisen, wie z.B. Blumenkohl (Brassica oleracea), Artischocke (Cynara scolymus), Schnittblumen, wie Nelke (Dianthus caryophyllus), Rose (Rosa spp), Chrysantheme, Petunie, Alstromeria, Gerbera, Gladiole, Lilie (Lilium spp), Hopfen (Humulus lupulus), Broccoli, Topfpflanzen, wie Rhododendron, Azalee, Dahlie, Begonie, Fuchsie, Geranie usw.; Früchte, wie z.B. Apfel (Malus, z.B. domesticus), Banane (Musa, z.B. Acuminata), Aprikose (Prunus armeniaca), Olive (Oliva sativa), Ananas (Ananas comosus), Kokosnuss (Cocos nucifera), Mango (Mangifera indica), Kiwi, Avocado (Persea americana), Beeren (wie z.B. Johannisbeeren, Ribes, z.B. Rubrum), Kirschen (z.B. Süßkirsche, Prunus, z.B. Avium), Gurke (Cucumis, z.B. Sativus), Trauben (Vitis, z.B. Vinifera), Zitrone (Citrus limon), Melone (Cucumis melo), Senf (Sinapis alba und Brassica nigra), Nüsse (wie z.B. Walnuss, Juglans, z.B. Regia; Erdnuss, Arachis hypogeae), Orange (Citrus, z.B. Maxima), Pfirsich (Prunus, z.B. Persica), Birne (Pyra, z.B. Communis), Pfeffer (Solanum, z.B. Capsicum), Pflaume (Prunus, z.B. Domestica), Erdbeere (Fragaria, z.B. Moschata), Tomate (Lycopersicon, z.B. Esculentum); Blätter, wie z.B. Alfalfa (Medicago sativa), Kohl (wie z.B. Brassica oleracea), Endivie (Cichoreum, z.B. Endivia), Lauch (Allium porrum), Kopfsalat (Lactuca sativa), Spinat (Spinacia oleraceae), Tabak (Nicotiana tabacum), Gräser, wie z.B. Festuca, Poa, Rai-Gras (wie z.B. Lolium perenne, Lolium multiflorum und Arrenatherum spp.), Gras für Freizeiteinrichtungen, Turf, Seealgen, Chikoree (Cichorium intybus), Tee (Thea sinensis), Sellerie, Petersilie (Petroselinum crispum), Schnittlauch (chevil) und andere Kräuter; Wurzeln, wie z.B. Pfeilwurz (Maranta arundinacea), Rüben (Beta vulgaris), Karotten (Daucus carota), Cassava (Manihot esculenta), Ginseng (Panax ginseng), Rübe (Brassica rapa), Rettich (Raphanus sativus), Yamwurz (Dioscorea esculenta), Süßkartoffel (Ipomoea batatas), Taro; Samen, wie z.B. Bohnen (Phaseolus vulgaris), Erbsen (Pisum sativum), Soja (Glycin max), Weizen (Triticum aestivum), Gerste (Hordeum vulgare), Mais (Zea mays), Reis (Oryza sativa), Buschbohnen und breite Bohnen (Vicia faba), Baumwolle (Gossypium spp.), Kaffee (Coffea arabica und C. canephora); Knollen, wie z.B. Kohlrabi (Brassica oleraceae), Kartoffel (Solanum tuberosum); knollenartige Pflanzen, wie die Zwiebel (Allium cepa), Frühlingszwiebel, Tulpe (Tulipa spp.), Narzissen (Narcissus spp.), Knoblauch (Allium sativum); Stängel, wie z.B. Korkeiche, Zuckerrrohr (Saccharum spp.), Sisal (Sisal spp.), Flachs (Linum vulgare), Jute; Bäume, wie z.B. Gummibaum, Eiche (Quercus spp.), Buche (Betula spp.), Erle (Alnus spp.), Esche (Acer spp.), Ulme (Ulmus spp.), Palmen, Farne, Efeu und ähnliche.
  • Die Transformation der Hefe und des Pilzes oder von Tierzellen kann durch normale, auf dem Gebiet bekannte Transformationsverfahren durch allgemein bekannte Vektorsysteme, wie z.B. pBluescript, pUC und virale Vektorsysteme, wie z.B. RSV und SV40, geschehen.
  • Das Verfahren der Einführung des exprimierbaren Trehalose-Phosphat-Synthase-Gens, des exprimierbaren Trehalose-Phosphat-Phosphatase-Gens oder irgendeinem anderen Sinn- oder Antisinn-Gen in eine empfangende Pflanzenzelle ist nicht entscheidend, solange das Gen in der Pflanzenzelle exprimiert wird.
  • Obwohl einige Ausführungsformen der Erfindung zur Zeit nicht praktikabel sein mögen, z.B. da einige Pflanzenarten sich noch einer genetischen Transformation widersetzen, ist die Durchführung der Erfindung in einer solchen Pflanzenart jedoch nur eine Frage der Zeit und nicht eine Frage des Prinzips, da die Zugänglichkeit der genetischen Transformation als solche nicht für die zugrundeliegenden Ausführungsformen der Erfindung von Bedeutung ist.
  • Die Transformation von Pflanzenarten ist jetzt Routine für eine beeindruckende Anzahl von Pflanzenarten, einschließlich sowohl der Dicotyledoneae, wie auch der Monocotyledoneae. Im Prinzip kann jedes Transformationsverfahren verwendet werden, um eine chimäre DNA gemäß der Erfindung in eine geeignete Vorläuferzelle einzuführen. Verfahren können geeigneterweise aus dem Calcium/Polyethylenglykol-Verfahren für Protoplasten (Krens et al. (1982), Nature 296, 72; Negrutiu et al. (1987), Plant Mol. Biol. 8, 363, der Elektroporation von Protoplasten (Shillito et al. (1985) Bio/Technol. 3, 1099), einer Mikroinjektion in Pflanzenmaterial (Crossway et al. (1986), Mol. Gen. Genet. 202), (DNA- oder RNA-beschichtete) Partikelbombardierung verschiedener Pflanzenmaterialien (Klein et al. (1987), Nature 327, 70), Infektion mit (nicht-integrativen) Viren, in Pflanzen-Agrobacterium tumefaciens vermitteltem Gentransfer durch Infiltration erwachsener Pflanzen oder Transformation reifer Pollen oder Mikrosporen ( EP 0 301 316 ) und ähnlichem gewählt werden. Ein bevorzugtes Verfahren gemäß der Erfindung umfasst den Agrobacterium-vermittelten DNA-Transfer. Insbesondere bevorzugt wird die Verwendung der sogenannten binären Vektortechnologie, wie offenbart in EP A 120 516 und dem US-Patent 4,940,838.
  • Obwohl die monocotyledonen Pflanzen als etwas widerspenstiger gegenüber einer genetischen Transformation angesehen werden, sind sie gegenüber einer Transformation doch zugänglich und fertile, transgene Pflanzen können aus transformierten Zellen oder Embryos oder anderem Pflanzenmaterial regeneriert werden. Zur Zeit sind bevorzugte Verfahren für die Transformation von Monocytoledonen Mikroprojektilbombardierung von Embryos, Explantaten oder Suspensionszellen und eine gerichtete DNA-Aufnahme- oder (Gewebe) -Elektroporation (Shimamoto et al. (1989), Nature 338, 274–276). Transgene Maispflanzen wurden durch Einführung des Streptomyces hygroscopicus-Bar-Gens, das die Phosphinothricin-Acetyltransferase kodiert (ein Enzym, das das Herbizide Phosphinothricin inaktiviert), in Embryozellen einer Mais-Suspensionskultur durch Mikroprojektilbombardierung (Gordon-Kamm (1990), Plant Cell, 2, 603) erhalten. Die Einführung des genetischen Materials in Aleuron-Protoplasten anderer monocotyledonen Ernten, wie z.B. Weizen und Gerste wurden berichtet (Lee (1989), Plant Mol. Biol. 13, 21). Weizenpflanzen wurden aus Embryo-Suspensionskultur durch Selektion eines Embryo-Callus für die Etablierung der Embryo-Suspensionskulturen regeneriert (Vasil (1990) Bio/Technol. 8, 429). Die Kombination mit Transformationssystemen für diese Ernten ermöglicht die Anwendung der gegenwärtigen Erfindung auf Monocotyledonen.
  • Monocotyledone Pflanzen, einschließlich kommerziell wichtiger Erntepflanzen, wie Reis und Mais, sind auch gegenüber einem DNA-Transfer durch Agrobakteriumstämme zugänglich (siehe WO 94/00977; EP 0 159 418 B1 ; Gould et al. (1991) Plant. Physiol. 95, 426–434).
  • Um transgene Pflanzen zu erhalten, die mehr als ein chimäres Gen konstitutiv exprimieren können, stehen eine Anzahl von Alternativen, einschließlich den folgenden zur Verfügung:
    • A. Die Verwendung von DNA, z.B. einer T-DNA auf einem binären Plasmid, mit einer Anzahl modifizierter Gene, physikalisch mit einem zweiten selektierbaren Marker-Gen gekoppelt. Der Vorteil dieses Verfahrens ist derjenige, dass die chimären Gene physikalisch gekoppelt sind und daher als einzelner Mendel-Lokus wandern.
    • B. Kreuzbestäubung transgener Pflanzen, die alle jeweils bereits in der Lage zur Expression von ein oder mehr chimären Genen sind, vorzugsweise gekoppelt an ein selektierbares Marker-Gen, mit Pollen von einer transgenen Pflanze, die ein oder mehr chimäre Gene enthält, gekoppelt an einen anderen selektierbaren Marker. Danach kann die Saat, die durch dieses Kreuzen erhalten wird, auf der Basis der Gegenwart der beiden selektierbaren Marker oder auf der Basis der Gegenwart der chimären Gene selbst selektiert werden. Die erhaltenen Pflanzen aus den gewählten Saaten können danach für weitere Kreuzungen verwendet werden. Im Prinzip befinden sich die chimären Gene nicht auf einem einzelnen Lokus und die Gene können daher als unabhängige Loki segregieren.
    • C. Die Verwendung einer Anzahl einer Vielzahl chimärer DNA-Moleküle, z.B. Plasmide, die jeweils ein oder mehr chimäre Gene aufweisen und eines selektierbaren Markers. Wenn die Frequenz der Co-Transformation hoch ist, dann ist die Selektion auf der Basis von nur einem Marker ausreichend. In anderen Fällen wird eine Selektion auf der Basis von mehr als einem Marker bevorzugt.
    • D. Aufeinanderfolgende Transformation transgener Pflanzen, die bereits ein erstes, zweites (usw.), chimäres Gen enthalten, mit neuer chimä rer DNA, optional umfassend ein selektierbares Marker-Gen. Wie in Verfahren B befinden sich die chimären Gene im Prinzip nicht auf einem einzelnen Lokus und die chimären Gene können daher als unabhängige Loki segregieren.
    • E. Kombinationen der oben erwähnten Strategien.
  • Die tatsächliche Strategie kann von etlichen Betrachtungen abhängen, wie einfach bestimmbar, wie z.B. den Zweck der Elternlinien (direktes Anzüchten, Verwendung in einem Züchtungsprogramm, Verwendung zur Erzeugung von Hybriden), ist jedoch im Hinblick auf die beschriebene Erfindung nicht kritisch.
  • Es ist bekannt, dass praktisch alle Pflanzen aus kultivierten Zellen oder Geweben regeneriert werden können. Die Mittel zur Regeneration variieren von Art zu Art der Pflanzen, jedoch wird im allgemeinen zunächst eine Suspension transformierter Protoplasten oder eine Petri-Schale, enthaltend transformierte Explantate, bereitgestellt. Schösslinge können direkt induziert werden oder indirekt aus dem Callus über eine Organogenese oder Embryogenese und darauffolgend Wurzeln bilden. Neben dem selektierbaren Marker wird das Kulturmedium im allgemeinen verschiedene Aminosäuren und Hormone, wie z.B. Auxin und Cytokine enthalten. Es ist auch vorteilhaft, Glutaminsäure und Prolin dem Medium zuzufügen, insbesondere für Arten wie Mais und Alfalfa. Eine effiziente Regeneration wird vom Medium, dem Genotyp und der Geschichte der Kultur abhängen. Wenn diese drei Variablen kontrolliert werden, ist die Regeneration in der Regel reproduzierbar und wiederholbar. Nach einem stabilen Einbau der transformierten Gensequenzen in die transgenen Pflanzen können die von ihnen vermittelten Charakterzüge auf andere Pflanzen durch sexuelle Kreuzung übertragen werden. Jedes einer Anzahl von Standard-Zuchtverfahren kann verwendet werden, abhängig von der zu kreuzenden Art.
  • Geeignete DNA-Sequenzen für die Kontrolle der Expression der pflanzenexprimierbaren Gene (einschließlich Markergenen), wie z.B. Transkriptions-Initiationsregionen, Enhancer, nicht-transkribierte Leader und ähnliche können von jedem Gen abstammen, das in einer Pflanzenzelle exprimiert wird. Ebenfalls beabsichtigt sind Hybridpromotoren, umfassend funktionelle Anteile verschiedener Promotoren oder synthetische Äquivalente davon. Außer den konstitutiven Promotoren können induzierbare Promotoren oder Promotoren, die anders im Hinblick auf ihr Expressionsmuster reguliert sind, z.B. Entwicklungs- oder Zelltyp-spezifische, für eine Expression der exprimierbaren Gene gemäß der Erfindung verwendet werden.
  • Um auf transformierte Zellen zu selektieren oder zu screenen wird es bevorzugt, ein Markergen einzuschließen, verbunden mit dem pflanzenexprimierbaren Gen gemäß der Erfindung, das in eine Pflanzenzelle transferiert werden soll. Die Wahl des geeigneten Markergens bei der Pflanzentransformation liegt im Wissen des durchschnittlichen Fachmanns; einige Beispiele für routinemäßig verwendete Marker-Gen sind die Neomycin-Phosphotransferase-Gene, die eine Resistenz gegenüber Kanamycin verleihen (EP-B 131 623), das Glutathion-S-Transferasegen von Rattenleber, das eine Resistenz gegenüber von Glutathion abgeleiteten Herbiziden verleiht (EP-A 256 223), die Glutaminsynthetase, die eine Überexpressionsresistenz gegenüber Glutaminsynthetase-Inhibitoren, wie Phosphinothricin verleiht (WO 87/05327), das Acetyl-Transferasegen von Streptomyces viridochromogenes, das eine Resistenz gegenüber dem selektiven Mittel Phosphinothricin (EP-A 275 957) verleiht, das Gen, das 5-Enolshikimat-3-Phosphat-Synthase (EPSPS) kodiert, und eine Toleranz gegen N-Phosphonomethylglycin verleiht, das bar-Gen, das eine Resistenz gegenüber Bialaphos verleiht (z.B. WO 91/02071) und ähnliche. Die tatsächliche Wahl des Markers ist nicht entscheidend, solange er in Kombination mit den Pflanzenzellen der Wahl funktionell (d.h. selektiv) ist.
  • Das Marker-Gen und das Gen von Interesse müssen nicht verbunden sind, da eine Co-Transformation nicht verbundener Gene (US-Patent 4,399,216) ebenfalls ein effizientes Verfahren bei einer Pflanzentransformation ist.
  • Bevorzugte Pflanzenmaterialien für die Transformation, insbesondere für Dicotyledonen-Erntepflanzen sind Blattscheibchen, die einfach transformiert werden können und eine gute regenerative Fähigkeit aufweisen (Horsch et al. (1985), Science 227, 1229).
  • Eine spezifische Verwendung der Erfindung wird auf die folgende Weise mit betrachtet: wie in den Beispielen gesehen werden kann, sind die Wirkungen der Expression von TPP (was zu einer Abnahme der intrazellulären T-6-P-Konzentration führt) eine erhöhte Blattgröße, eine erhöhte Verzweigung, was zu einem Anstieg der Zahl von Blättern führt, einen Anstieg der gesamten Blatt-Biomasse, ein Bleichen der reifen Blätter, einer Bildung kleinerer Blüten oder eine Sterilität. Diese Wirkungen sind insbesondere in den folgenden Fällen nützlich: erhöhte Blattgröße (und Anstieg der Zahl der Blätter) ist ökonomisch für blättrige Gemüse wie Spinat, Blattsalat, Lauch, Alfalfa, Silagemais wichtig; für Bodenbedeckung und Unkrautkontrolle durch Gras- und Gartenpflanzen; für Erntepflanzen, worin die Blätter als Produkt verwendet werden, wie z.B. Tabak, Tee, Hanf und Rosen (Parfüms!); für das "matting up" von kohlähnlichen Erntepflanzen, wie z.B. Blumenkohl.
  • Ein zusätzlicher Vorteil der Tatsache, dass diese Blätter in ihrer Stoffwechselaktivität stimuliert werden ist, dass sie dazu neigen, alle ihre intrazellulären Quellen aufzubrauchen, was bedeutet, dass sie einen niedrigen Stärkegehalt aufweisen. Für Pflanzen, die für den Verbrauch gedacht sind, ist eine Reduktion des Stärkegehalts im Hinblick auf die gegenwärtige Tendenz zu Nahrungsmitteln mit niedrigem Kaloriengehalt hin vorteilhaft. Eine solche Reduktion des Stärkegehalts hat auch Auswirkungen auf Geschmack und Textur der Blätter. Ein Anstieg der Protein/Kohlenhydrat-Balance, wie er durch die Expression von TPP erzeugt werden kann, ist insbesondere für stark blatthaltige Erntepflanzen, wie Silagemais, wichtig.
  • Eine erhöhte Verzweigung, die von einer Tendenz zu Stängeln mit größerem Durchmesser begleitet ist, kann bei den Erntepflanzen vorteilhaft sein, bei denen der Stängel für die Erzeugung eines ökonomisch attraktiven Produkts verantwortlich ist. Beispiele in dieser Kategorie sind alle Bäume für die erhöhte Produktion von Holz, das auch ein Ausgangsmaterial für die Papierproduktion ist; Erntepflanzen wie Hanf, Sisal, Flachs, die für die Produktion von Seilen und Leinen verwendet werden; Erntepflanzen wie Bambus und Zuckerrohr; Gummibäume, Korkeichen; für die Verhinderung eines Abflachens bei Ernten oder Ernteteilen, wie Körnern, Mais, Gemüsen und Erdbeeren.
  • Ein drittes Phänomen ist die erhöhte Bleichung der Blätter (ausgelöst durch eine Abnahme der Fotosynthese-Aktivität). Weniger gefärbte Blätter werden für Ernten bevorzugt wie Chikoree und Spargel. Ebenfalls für Schnittblumen kann das Bleichen der Blütenblätter wünschenswert sein, z.B. bei Alstromeria.
  • Eine Gesamtwirkung ist der Anstieg der Biomasse, der sich aus dem Anstieg der Stoffwechsel-Aktivität ergibt. Das bedeutet, dass die Biomasse aus verstoffwechselten Verbindungen wie Proteinen und Fetten besteht. Dementsprechend gibt es eine erhöhte Protein/Kohlenhydrat-Balance in den reifen Blättern, die ein Vorteil für Erntepflanzen ist, wie Silagemais und alle Futtermittel, die als Silage verwendet werden können. Eine ähnliche erhöhte Protein/Kohlenhydrat-Balance kann bei Früchten, Knollen und anderen essbaren Pflanzenteilen etabliert werden.
  • Außerhalb des Pflanzenreichs würde ein erhöhter Stoffwechsel für die Proteinproduktion in Mikroorganismen oder eukaryontischen Zellkulturen günstig sein. Sowohl die Produktion von endogenen als auch von heterologen Proteinen wird erhöht sein, was bedeutet, dass die Produktion heterologer Proteine in Kulturen von Hefe und anderen einzelligen Organismen auf diese Weise erhöht werden kann. Für Hefe würde dies eine effizientere Fermentation bedeuten, was zu einem erhöhten Alkoholertrag führen würde, was natürlich für Brauereiverfahren, die Alkoholproduktion und ähnliches günstig ist.
  • Bei Tieren oder Menschen wird mit in die Betrachtung einbezogen, dass Erkrankungen, die durch einen Defekt im Stoffwechsel ausgelöst werden, durch eine stabile Expression von TPP oder TPS in den betroffenen Zellen überwunden werden können. In menschlichen Zellen hängt der erhöhte Glukoseverbrauch vieler Tumorzellen zu einem großen Ausmaß von der Überexpression der Hexokinase ab (Rempel et al. (1996) FEBS Lett. 385, 233). Es wird mit betrachtet, dass der Glukosefluss in den Stoffwechsel von Krebszellen durch die Expression von Trehalose-6-Phosphat synthetisierenden Enzymen beeinflusst werden kann. Es wurde auch gezeigt, dass die Hexokinase-Aktivierung durch den cAMP/PKA (Protein-Kinase-A-Weg) potenziert werden kann. Daher kann die Inaktivierung dieses Signaltransduktionwegs die Glukoseaufnahme und die Proliferation von Neoplasien beeinflussen. Enzymaktivitäten in Säugerzellen, die in der Lage sind, Trehalose-6-Phosphat und Trehalose zu synthetisieren und Trehalose abzubauen, wurden z.B. in Kaninchen-Nieren-Cortex-Zellen gezeigt (Sacktor (1968) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60, 1007).
  • Ein anderes Beispiel kann in Defekten in der Insulinsekretion in Pankreas-β-Zellen angetroffen werden, worin die Produktion von Glukose-6-Phosphat, katalysiert durch Hexokinase, die vorherrschende Reaktion ist, die Anstiege der extrazellulären Glukoseniveaus mit der Insulinsekretion verkoppelt (Efrat et al. (1994), TIBS 19, 535). Ein Anstieg der Hexokinase-Aktivität, ausgelöst durch eine Verminderung von intrazellulärem T-6-P wird dann die Insulinproduktion in den Zellen stimulieren, die in einer Insulinsekretion defizient sind.
  • Auch in transgenen Tieren könnte eine erhöhte Protein/Kohlenhydrat-Balance vorteilhaft sein. Sowohl die Eigenschaften eines erhöhten Stoffwechsels als auch die verstärkte Produktion von Proteinen sind von großer Bedeutung bei der Tierzüchtung, wobei Tiere Fleisch so schnell wie möglich ansetzen sollten. Die Transformation des Enzyms TPP in Fleisch erzeugende Tiere, wie Hühner, Rinder, Schafe, Truthähne, Ziegen, Fisch, Hummer, Krabben, Shrimps, Schnecken usw. wird zu Tieren führen, die schneller wachsen und ein proteinhaltigeres Fleisch aufweisen.
  • Auf dieselbe Weise bedeutet dieser verstärkte Stoffwechsel eine Erhöhung der Verbrennungsrate von Kohlenhydraten und verhindert so eine Fettleibigkeit.
  • Weitere pflanzenspezifische Wirkungen von der Abnahme der intrazellulären T-6-P-Konzentration sind ein Anstieg der Zahl der Blüten (obwohl sie nicht zu einer Bildung von Samen zu führen scheinen). Ein Anstieg der Zahl der Blüten ist jedoch vorteilhaft für Schnittblumen und Topfpflanzen und auch für alle Pflanzen, die für eine Gartenbauzucht geeignet sind.
  • Eine weitere Wirkung dieses Blütenbildungsphänomens ist die Sterilität, da die Pflanzen keine Samen erzeugen. Sterile Pflanzen sind bei Hybridzüchtungen vorteilhaft.
  • Ein anderer ökonomisch wichtiger Aspekt ist die Unterdrückung einer Samenbildung von Kulturerntepflanzen wie Kopfsalat, Endivien und sowohl Freizeitanlagen- als auch Futtergrasen. Dies ist eine günstige Eigenschaft, da sie es möglich macht, Ernten zu züchten, ohne Stoffwechselbemühungen auf die Blütenbildung und die Samenproduktion zu verschwenden. Außerdem ist bei Erntepflanzen, wie Kopfsalat und Endivien und Grasen die kommerzielle Produkt/Anwendung nicht mit einer Samenbildung versehen.
  • Eine spezifische Expression von TPP in bestimmten Teilen (Sinks) der Pflanze kann zu zusätzlichen günstigen Wirkungen führen. Es wird mit in die Betrachtung einbezogen, dass die Expression von TPP durch einen Promotor, der früh aktiv ist, z.B. bei der Samenbildung ein verstärktes Wachstum des sich entwickelnden Samens ermöglicht. Eine ähnliche Wirkung würde durch Expression von TPP durch einen blütenspezifischen Promotor erhalten. Um es kurz zu fassen: exzessives Wachstum eines bestimmten Pflanzenteils ist möglich, wenn TPP durch einen geeigneten spezifischen Promotor exprimiert wird. Bei Früchten kann eine spezifische Expression zu einem erhöhten Wachstum der Haut in Relation zu Fleisch führen. Dies ermöglicht eine Verbesserung des Schälens der Frucht, was für automatische Schälindustriezweige vorteilhaft sein kann.
  • Die Expression von TPP während des Verfahrens der Keimung von öllagernden Samen verhindert einen Ölabbau. Bei dem Verfahren der Keimung ist der Glyoxylatzyklus sehr aktiv. Dieser Stoffwechselweg wandelt Acetyl-CoA über Malat zu Saccharose um, die transportiert werden kann und als Energiequelle während des Wachstums des Sämlings verwendet wird. Schlüsselenzyme in diesem Verfahren sind die Malatsynthase und die Isocitratlyase. Die Expression beider Enzyme wird vermutlich durch die Hexokinase-Signalbildung reguliert. Eine der Indikationen für diese Regulation ist, dass sowohl 2-Desoxyglukose als auch Mannose durch die Hexokinase phosphoryliert werden und ihr Signal transduzieren können, nämlich Reduktion der Malatsynthase und Isocitratlyase-Expression ohne weitere Verstoffwechselung. Die Expres sion von TPP in Samen, dadurch Verminderung der Inhibition der Hexokinase, dadurch Inhibition der Malatsynthase und Isocitratlyase erhält die Lagerung von Öl in den Samen aufrecht und verhindert eine Keimbildung.
  • Im Gegensatz zu den Wirkungen von TPP führte der Anstieg von T-6-P, ausgelöst durch Expression von TPS zu anderen Wirkungen, wie illustriert in den Beispielen. Hieraus kann gelernt werden, dass ein Anstieg der Menge von T-6-P zu einem Zwergwuchs oder abgekürztem Wachstum führt (insbesondere bei hoher Expression von TPS), zu einer Bildung von stärker Lanzett-förmigen Blättern, einer dunkleren Farbe aufgrund eines Anstiegs an Chlorophyll und einem Anstieg des Stärkegehalts. Es wurde bereits oben anerkannt, dass die Einführung eines Anti-Sinn-Trehalase-Konstrukt ebenfalls ähnliche Wirkungen wie die Einführung von TPS stimulieren wird. Daher werden die Anwendungen, die für TPS gezeigt oder indiziert sind, ebenfalls unter Verwendung von as-Trehalase etabliert. Außerdem verstärkt die Verwendung von Doppelkonstrukten aus TPS und as-Trehalase die Wirkungen eines einzelnen Konstrukts.
  • Ein Zwergwuchs ist ein Phänomen, das bei Gartenbaupflanzen wünschenswert ist, von denen die japanischen Bonsaibäume das typische Beispiel sind. Aber auch die Erzeugung von Miniblumen bei Pflanzen, wie Radiollainoides Roth, Rosen, Amaryllis, Hortensien, Birke und Palme werden ökonomische Anwendungen haben. Neben einem Zwergwuchs im Pflanzenreich ist dieser auch bei Tieren wünschenswert. Es ist auch möglich, eine Samenbildung in Kulturerntepflanzen, wie z.B. Kopfsalat, auszulösen. Dies ist günstig, da es eine schnelle Produktion von Samen ermöglicht. Idealerweise sollte die Expression von TPS für diese Wirkung sich unter Kontrolle eines induzierbaren Promotors befinden.
  • Der Verlust einer Apikal-Dominanz führt auch zu einer Bildung von multiplen Schösslingen, was von ökonomischer Wichtigkeit z.B. bei Alfalfa ist.
  • Eine Reduktion im Wachstum wird weiterhin für die Industrie von "Veggie Snacks" gewünscht, worin Gemüse in Form von Snacks verbraucht werden sollen. Cherry-Tomaten sind ein Beispiel für Gemüse mit reduzierter Größe, die auf dem Markt erfolgreich sind. Es kann auch mit in die Betrachtung einbezogen werden, dass auch andere Gemüse, wie Kohl, Blumenkohl, Karotten, Rüben und Süßkartoffel und Früchte, wie Äpfel, Birne, Pfirsich, Melone und etliche tropische Früchte wie Mangos und Bananen in verkleinerter Größe vermarktbar wären.
  • Ein reduziertes Wachstum wird für alle Zellen gewünscht, die für einen Organismus nachteilig sind, wie z.B. Zellen von Pathogenen und Krebs zellen. In diesem letzten Hinblick kann eine Rolle in der Regulation des Wachstums durch Veränderung des Niveaus an T-6-P gesehen werden. Ein Anstieg im T-6-P-Niveau würde das Wachstum und den Stoffwechsel von Krebsgewebe reduzieren. Eine Möglichkeit zur Erhöhung des intrazellulären Niveaus von T-6-P ist ein Knock-out des TPP-Gens solcher Zellen durch Einführung eines spezifischen Rekombinationsereignisses, das die Einführung einer Mutation in den endogenen TPP-Genen auslöst. Eine Weise, auf die dieses durchgeführt werden könnte, ist die Einführung einer DNA-Sequenz, die zur Einführung einer Mutation in dem endogenen Gen über einen krebszellspezifischen internalisierenden Antikörper in der Lage ist. Eine andere Möglichkeit ist eine gezielte Mikropartikelbombardierung mit der DNA. Drittens können krebszellspezifische virale Vektoren mit dieser DNA verwendet werden.
  • Das Phänomen einer dunkelgrüneren Farbe, das bei einer erhöhten Konzentration von T-6-P beobachtet wird ist eine Eigenschaft, die für Topfpflanzen wünschenswert ist und im allgemeinen für Pflanzen in Gartenbaukulturen und für Freizeitanlagen-Grase.
  • Ein Anstieg des Niveaus an T-6-P führt auch zu einem Anstieg der Lager-Kohlenhydrate, wie Stärke und Saccharose. Dies würde dann bedeuten, dass Gewebe, in denen Kohlenhydrate gelagert werden, in der Lage wären, mehr Material zu lagern. Dies kann durch die Beispiele illustriert werden, wo gezeigt wird, dass in Pflanzen eine erhöhte Biomasse von Lagerorganen, wie Knollen und verdickte Wurzeln, wie bei Rüben (Lagerung von Saccharose) gebildet werden. Die Erfindung stellt auch die Verwendung von Trehalose-6-Phosphat gemäß den Ansprüchen 30 bis 34 bereit.
  • Erntepflanzen, bei denen dies vorteilhaft wäre, sind Kartoffel, Zuckerrüben, Karotten, Chikoree und Zuckerrohr.
  • Eine zusätzlich ökonomisch wichtige Wirkung bei Kartoffeln ist die, dass festgestellt wurde, dass nach Transformation mit DNA, kodierend für das TPS-Gen (Erzeugung eines Anstiegs an T-6-P), die Menge an löslichen Zuckern abnimmt, selbst nach Ernte und Lagerung der Knollen bei kalten Bedingungen (4°C). Normalerweise würde eine noch kältere Lagerung notwendig sein, um ein frühzeitiges Sprossen zu verhindern, aber dies führt zu einen exzessiven Sweetening der Kartoffeln. Eine Reduktion der Menge der reduzierenden Zucker ist von einer vorrangigen Bedeutung für die Nahrungsmittelindustrie, da angesüßtes Kartoffelknollenmaterial für die Verarbeitung nicht geeignet ist, da eine Maillard-Reaktion zwischen den reduzierenden Zuckern und den Aminosäuren stattfinden wird, was zu der Bildung brauner Farbe führt.
  • Auf dieselbe Weise kann auch eine Inhibition der Aktivität der Invertase durch Transformation von Zuckerrüben mit einem Polynukleotid, kodierend für das Enzym TPS, erhalten werden. Die Inhibition der Invertase-Aktivität bei Zuckerrüben nach der Ernte ist ökonomisch sehr wichtig.
  • Weiterhin wird ein Verfahren gemäß den Ansprüchen 35 oder 36 bereitgestellt.
  • Bei Früchten und Samen kann ebenfalls die Lagerung verändert werden. Dies führt nicht nur zu einer erhöhten Lagerkapazität, sondern auch zu einer Veränderung der Zusammensetzung der gelagerten Verbindungen. Erntepflanzen, bei denen Verbesserungen im Ertrag der Samen besonders wichtig sind, sind Mais, Reis, Cerealien, Erbsen, Ölraps, Sonnenblumen, Soja und Gemüse. Weiterhin ist bei allen fruchttragenden Pflanzen die Anwendung einer Entwicklung einer Veränderung an Menge und Zusammensetzung der gelagerten Kohlenhydrate wichtig. Insbesondere bei Früchten ergibt die Zusammensetzung der gelagerten Produkte Veränderungen in Festigkeit und Solidität, was insbesondere bei weichen Früchten, wie Tomaten, Bananen, Erdbeeren, Pfirsichen, Beeren und Trauben wichtig ist.
  • Im Gegensatz zu den Wirkungen, die bei der Expression von TPP beobachtet werden, reduziert die Expression von TPS das Verhältnis von Protein/Kohlenhydrat in Blättern. Diese Wirkung ist bei blatthaltigen Erntepflanzen, wie Futtergrasen und Alfalfa wichtig. Weiterhin haben die Blätter eine reduzierte Biomasse, was für andere Freizeit-Grase von Wichtigkeit sein kann, jedoch haben sie noch wichtiger einen relativ höheren Energiegehalt. Diese Eigenschaft ist insbesondere für Erntepflanzen wie Zwiebel, Lauch und Silagemais wichtig.
  • Weiterhin kann auch die Lebensfähigkeit der Samen durch das Niveau an intrazellulär verfügbarem T-6-P beeinflusst werden.
  • Kombinationen einer Expression von TPP in einem Teil einer Pflanze und TPS in einem anderen Teil der Pflanze können synergistisch zur Erhöhung der oben beschriebenen Wirkungen wirken. Es ist auch möglich, die Gene sequenziell während der Entwicklung unter Verwendung spezifischer Promotoren zu exprimieren. Schließlich ist es auch möglich, die Expression von einem der involvierten Gene durch Platzieren der kodierenden Sequenz unter Kontrolle eines induzierbaren Promotors zu induzieren. Es wird mit in die Betrachtung einbezogen, dass Kombinationen der Verfahren der Anwendungen, wie beschrieben, für den Fachmann auf dem Gebiet offenbar sein werden.
  • Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele illustriert. Es wird betont, dass die Beispiele spezifische Ausführungsformen der Erfindungen darstellen, dass jedoch klar sein wird, dass Variationen dieser Beispiele und die Verwendung anderer Pflanzen oder Expressionssysteme durch die Erfindung abgedeckt sind.
  • Experimenteller Teil
  • DNA-Manipulationen
  • Alle DNA-Verfahren (DNA-Isolierung aus E.coli, Restriktion, Ligation, Transformation usw.) werden gemäß Standardprotokollen durchgeführt (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: a laboratory manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York).
  • Stämme
  • In allen Beispielen wird der E.coli x-12-Stamm DH5α für das Klonieren verwendet. Die für die Pflanzen-Transformationsexperimente verwendeten Agrobakterium tumefaciens-Stämme sind EHA 105 und MOG 101 (Hood et al. (1993) Trans. Research 2, 208).
  • Konstruktion des Agrobakterium-Stamms MOG101
  • Die Konstruktion des Agrobakteriumstamms MOG101 wird in WO 96/21030 beschrieben.
  • Klonierung des E.coli otsA-Gens und Konstruktion von pMOG799
  • In E.coli wird die Trehalose-Phosphat-Synthase (TPS) durch das otsA-Gen kodiert, lokalisiert im Operon otsBA. Die Klonierung und Sequenzbestimmung des otsA-Gens ist im Detail in Beispiel I von WO95/01446, hier durch Inbezugnahme inkorporiert, beschrieben. Um die Expression in Pflanzenzellen zu bewirken, wurde der offene Leserahmen mit den transkriptionsregulatorischen Elementen des CaMV 35S RNA-Promotors, des Translationsenhancers des ALMV-Leaders und dem Transkriptionsterminator des nos-Gens verbunden, wie im Detail in Beispiel I von WO95/01446 beschrieben, was zu pMOG799 führte. Eine Probe eines E.coli-Stamms, der pMOG799 beherbergte, wurde unter dem Budapester Vertrag beim Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, P.O. Box 273, 3740 AG Baarn, Niederlande, am Montag, 23. August 1993 hinterlegt: die Hinterlegungsnummer, die von der internationalen Hinterlegungsstelle vergeben wurde, ist CBS 430.93.
  • Isolierung eines Patatin-Promotors/Konstruktion von pMOG546
  • Ein Patatin-Promotorfragment wird aus chromosomaler DNA von Solanum tuberosum cv. Bintje unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion isoliert. Ein Satz Oligonukleotide, komplementär zu der Sequenz des stromaufwärts gelegenen Bereichs des λpat21-Patatin-Gens (Bevan et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14, 5564) wird synthetisiert, bestehend aus den folgenden Sequenzen:
  • Figure 00310001
  • Diese Primer werden verwendet, um ein DNA-Fragment von 1123 bp mit PCR zu amplifizieren unter Verwendung von einem chromosomalen DNA-Element, isoliert aus Kartoffel cv. Bintje als Matrize. Das amplifizierte Fragment zeigte einen hohen Ähnlichkeitsgrad zu der λpat21-Patatinsequenz und wird unter Verwendung von EcoRI-Linkern in einen pUC18-Vektor kloniert, was zu dem Plasmid pMOG546 führt.
  • Konstruktion von pMOG845
  • Die Konstruktion von pMOG845 wird in WO 96/21030 beschrieben.
  • Konstruktion von pVDH318, Plastocyanin-TPS
  • Das Plasmid pMOG798 (beschrieben in WO95/01446) wird mit HindIII verdaut und mit dem Oligonukleotid duplex TCV11 und TCV12 (siehe Konstruktion von pMOG845) ligiert. Der resultierende Vektor wird mit PstI und HindIII verdaut, gefolgt von einer Insertion des PotPiII-Terminators, was zu pTCV118 führt. Das Plasmid pTCV118 wird mit SmaI und HindIII verdaut, was ein DNA-Fragment, umfassend die TPS-kodierende Region und den PotPiII-Terminator, ergibt. BglII-Linker werden zugefügt und das resultierende Fragment wurde in den pflanzenbinären Expressionsvektor pVDH275 (1) inseriert, verdaut mit BamHI, was pVDH318 ergab. pVDH275 ist ein Derivat von pMOG23 (Sijmons et al. (1990), Bio/Technol. 8. 217), und beherbergt den NPTII-Selektionsmarker unter Kontrolle des 35S CaMV-Promotors und eine Expressionskassette, umfassend den Erbsen-Plastocyanin (PC) -Promotor und nos-Terminatorsequenzen. Der Plastocyanin-Promotor, der in pVDH275 vorliegt, wurde von Pwee & Gray (1993) Plant J. 3, 437 beschrieben. Dieser Promotor wurde in den binären Vektor unter Verwendung einer PCR-Amplifikation und Primern transferiert, die geeignete Klonierungsstellen enthalten.
  • Klonierung des E. coli otsB-Gens und Konstruktion von pMOG1010 (35S CaMV TPP)
  • Ein Satz Oligonukleotide, TPP I (5' CTCAGATCTGGCCACAAA 3') (SEQ ID NO: 56) und TPP II (5' GTGCTCGTCTGCAGGTGC 3')(SEQ ID NO: 57), wurde komplementär zu der Sequenz des E.coli TPP-Gens (SEQ ID NO: 3) synthetisiert. Diese Primer wurden verwendet, um ein DNA-Fragment von 375 bp, beherbergend den 3'-Teil der Kodierungsregion des E.coli TPP-Gens, mit PCR zu amplifizieren, wobei eine PstI-Stelle 10 bp stromabwärts vom Stopkodon eingeführt wurde, unter Verwendung von pMOG748 (WO 95/01446) als Matrize. Dieses PCR-Fragment wurde mit BglII und PstI verdaut und in pMOG445 ( EP 0 449 376 A2 Beispiel 7a) kloniert und mit BglII und PstI linearisiert. Der resultierende Vektor wurde mit PstI und HindIII verdaut und ein PotPiII-Terminator wurde inseriert (siehe Konstruktion pMOG845). Der vorher beschriebene Vektor wurde mit BglII und HindIII verdaut, das resultierende 1325 bp-Fragment wurde isoliert und zusammen mit dem 5'TPP PCR-Fragment isoliert und kloniert, verdaut mit SmaI und BglII in pUC18, linearisiert mit SmaI und HindIII. Der resultierende Vektor wurde pTCV124 genannt. Dieser Vektor wurde mit EcoRI und SmaI linearisiert und verwendet, um den 35S CaMV-Promotor zu inserieren (ein 850 bp EcoRI-"NcoI" (die NcoI-Stelle wurde durch Behandlung mit Mung-Bohnennuklease mit glatten Enden versehen) -Fragment, isoliert aus pMOG18, enthaltend den 35S CaMV-Doppelenhancer-Promotor). Dieser Vektor wurde pTCV127 genannt. Von diesem Vektor wurde ein 2,8 kb EcoRI-HindIII-Fragment isoliert, enthaltend die gesamte 35S TPP-Expressionskassette und in einen binären Vektor pMOG800 kloniert, was zu dem Vektor pMOG1010 führte.
  • Konstruktion von pVDH321, Plastocyanin (PC) TPP
  • Die BamHI-Stelle des Plasmids pTCV124 wurde durch BamHI-Verdau, Auffüllen und darauffolgende Religation entfernt. Der darauffolgende Verdau mit HindIII und EcoRI ergibt ein DNA-Fragment, umfassend den TPP-Kodierungsbereich und den PotPiII-Terminator. BamHI-Linker wurden zugefügt und das resultierende Fragment wurde in dem pflanzenbinären Expressionsvektor pVDH275 (verdaut mit BamHI) inseriert, was pVDH321 ergab.
  • Konstruktion eines Patatin TPP-Expressionsvektors
  • Ähnlich wie die Konstruktion des Patatin TPS-Expressionsvektors (siehe Konstruktion von pMOG845) wurde ein Patatin TPP-Expressionsvektor konstruiert, was zu einem binären Vektor (pMOG1128) führte, der nach Transformation eine Expression von TPP in knollenspezifischer Weise bewirken kann.
  • Konstruktion anderer Expressionsvektoren
  • Ähnlich wie die Konstruktion der oben erwähnten Vektoren können Genkonstrukte hergestellt werden, wobei unterschiedliche Promotoren verwendet werden, in Kombination mit TPS, TPP oder Trehalase unter Verwendung binärer Vektoren mit dem NPTII-Gen oder dem Hygromycin-Resistenzgen als selektierbares Markergen. Eine Beschreibung des binären Vektors pMOG22, der einen HPT-Selektionsmarker beherbergt, wird in Goddijn et al. (1993) Plant J. 4, 863, angegeben.
  • Triparentale Paarungen
  • Die binären Vektoren werden in triparentalen Paarungen mit dem E.coli-Stamm HB101, enthaltend das Plasmid pRK2013 (Ditta et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 7347) in Agrobacterium tumefaciens Stamm MOG101 oder EHA105 mobilisiert und für die Transformation verwendet.
  • Transformation von Tabak (Nicotiana tabacum cv. SR1 oder cv. Samsun NN)
  • Tabak wurde durch Co-Kultivierung von Pflanzengewebe mit dem Agrobacterium tumefaciens Stamm MOG101, enthaltend den binären Vektor von Interesse, wie beschrieben, transformiert. Die Transformation wurde unter Verwendung einer Co-Kultivierung von Tabakblattscheibchen durchgeführt, wie beschrieben von Horsch et al. (1985) Science 227, 1229. Die transgenen Pflanzen werden aus Schösslingen regeneriert, die auf Selektionsmedium, enthaltend Kanamycin, wachsen, verwurzelt und in Erde übertragen.
  • Transformation der Kartoffel
  • Kartoffel (Solanum tuberosum cv. Kardal) wurde mit dem Agrobakterium Stamm EHA 105, enthaltend den binären Vektor von Interesse, transformiert. Das zugrundeliegende Kulturmedium war MS30R3-Medium, bestehend aus MS-Salzen (Murashige und Skoog (1962) Physiol. Plant. 14, 473), R3-Vitaminen (Ooms et al. (1987) Theor. Appl. Genet. 73, 744), 30 g/l Saccharose, 0,5 g/l MES mit einem End-pH von 5,8 (eingestellt mit KOH), verfestigt, falls nötig, mit 8 g/l Daichin-Agar. Die Knollen von Solanum tuberosum cv. Kardal wurden geschält und durch Brennen in 96% Ethanol für 5 Sekunden oberflächensterilisiert. Die Flammen wurden in sterilem Wasser gelöscht und es wurden Scheiben von ungefähr 2 mm Dicke geschnitten. Scheibchen wurden mit einer Bohrung von dem vaskulären Gewebe geschnitten und 20 Minuten in MS30R3-Medium inkubiert, enthaltend 1–5 × 108 Bakterien/ml Agrobakterium EHA 105, enthaltend den binären Vektor. Die Knollenscheibchen wurden mit MS30R3-Medium gewaschen und auf verfestigtes Postkulturmedium (PM) transferiert. PM bestand aus M30R3-Medium, supplementiert mit 3,5 mg/l Zeatinribosid und 0,03 mg/l Indolessigsäure (IAA). Nach zwei Tagen wurden die Scheibchen in frisches PM-Medium mit 200 mg/l Cefotaxim und 100 mg/l Vancomycin übertragen. Drei Tage später wurden die Knollenscheibchen auf Schösslings-Induktionsmedium (SIM) übertragen, das aus PM-Medium mit 250 mg/l Carbenicillin und 100 mg/l Kanamycin bestand. Nach 4 bis 8 Wochen wurden Schösslinge, die aus den Scheibchen auftraten, ausgeschnitten und auf Wurzelbildungsmedium platziert (MS30R3-Medium mit 100 mg/l Cefotaxim, 50 mg/l Vanco mycin und 50 mg/l Kanamycin). Die Schösslinge wurden axenikal durch Meristemschnitte propagiert.
  • Transformation von Kopfsalat
  • Die Transformation von Kopfsalat wurde mit Lattuca sativa cv. Evola gemäß Curtis et al. (1994) J. Exp. Bot. 45, 1441 durchgeführt.
  • Transformation von Zuckerrüben
  • Für die Transformation von Zuckerrüben wurde Beta vulgaris (Erhaltpopulation) gemäß Fry et al. (1991) Dritter internationaler Kongress von ISPMB, Tucson USA Abstract No. 384, oder gemäß Krens et al. (1996), Plant Sci. 116, 97 durchgeführt.
  • Transformation von Lycopersicon esculentum
  • Die Tomaten-Transformation wurde gemäß Van Roekel et al. (1993) Plant Cell Rep. 12, 644 durchgeführt.
  • Transformation von Arabidopsis
  • Die Transformation von Arabidopsis thaliana wurde entweder durch das von Clarke et al. (1992) Plant. Mol. Biol. Rep. 10, 178 beschriebene Verfahren oder durch das von Valvekens et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5536 beschriebene Verfahren durchgeführt.
  • Induktion von Mikroknollen
  • Stammsegmente von in-vitro-Kartoffelpflanzen, die ein Hilfsmeristem beherbergten, wurden auf Mikroknollen-Induzierungsmedium übertragen. Mikroknollen induzierendes Medium enthält 1 × MS-Salze, supplementiert mit R3-Vitaminen, 0,5 g/l MES (End-pH = 5,8, eingestellt mit KOH) und verfestigt mit 8 g/l Daichin-Agar, 60 g/l Saccharose und 2,5 mg/l Kinetin. Nach 3 bis 5 Wochen Wachstum im Dunkeln bei 24°C hatten sich Mikroknollen gebildet.
  • Isolierung von Validamycin A
  • Es hat sich erwiesen, dass Validamycin A ein hoch spezifischer Inhibitor von Trehalasen von verschiedenen Quellen ist, im Bereich von (IC50) 10–6 M bis 10–10 M (Asano et al. (1987) J. Antibiot. 40, 526; Kameda et al. (1987) J. Antibiot. 40, 563). Mit der Ausnahme von Trehalase inhibiert es keine α- oder β-Glukohydrolase-Aktivität signifikant. Validamycin A wurde aus Solacol isoliert, einer kommerziellen landwirtschaftlichen Formulierung (Takeda Chem. Indust., Tokyo), wie beschrieben von Kendall et al. (1990) Phytochemistry 29, 2525. Das Verfahren involviert eine Ionenaustauschchromatographie (QAE-Sephadex A-25 (Pharmacia), Bettvolumen 10 ml, Äquilibrierungspuffer 0,2 mM Na-Pi, pH 7) aus einer 3%igen landwirtschaftlichen Formulierung von Solacol. Durch Beladen von 1 ml Solacol auf die Säule und eine Elution mit Wasser in 7 Fraktionen, ließ sich praktisch alles Validamy cin in Fraktion 4 wiedergewinnen. Basierend auf einer 100%igen Gewinnung wurde die Konzentration unter Verwendung dieses Verfahrens von Validamycin A auf 1 × 10–3 M in MS-Medium eingestellt, zur Verwendung in Trehalose-Anhäufungstests. Alternativ können Validamycin A und B direkt aus Streptomyces hygroscopicus var. limoneus gereinigt werden, wie beschrieben von Iwasa et al. (1971) J. Antibiot. 24, 119, dessen Inhalt hier durch Inbezugnahme inkorporiert ist.
  • Kohlenhydratanalyse
  • Die Kohlenhydrate wurden quantitativ durch Anionenaustauschchromatographie mit Puls-elektrochemischer Detektion bestimmt. Extrakte wurden durch Extraktion von homogenisiertem gefrorenem Material mit 80% EtOH hergestellt. Nach einer Extraktion für 15 Minuten bei Raumtemperatur wurde der lösliche Anteil evaporiert und in destilliertem Wasser gelöst. Die Proben (25 μl) wurden auf einem Dionex DX-300 Flüssigchromatograph analysiert, ausgerüstet mit einer 4 × 250 mm Dionex 35391 Carbopac PA-1-Säule und einer 4 × 50 mm Dionex 43096 Carbopac PA-1-Vorsäule. Die Elution wurde mit 100 mM NaOH bei 1 ml/min durchgeführt, gefolgt von einem NaAc-Gradienten. Die Zucker wurden mit einem Puls-elektrochemischen Detektor (Dionex, PED) nachgewiesen. Kommerziell erhältliche Kohlenhydrate (Sigma) wurden als Standard verwendet.
  • Stärkeanalyse
  • Die Stärkeanalyse wurde wie in Åman et al. (1994) Methods in Carbohydrate, Band X (Hrsg. BeMiller et al.), Seiten 111–115 beschrieben, durchgeführt.
  • Expressionsanalyse
  • Die Expression von Genen, eingeführt in verschiedene Pflanzenarten, wurde unter Verwendung von einer Northern-Blot-Analyse überwacht.
  • Trehalose-6-Phosphat-Phosphatase-Assay
  • TPP wurde bei 37°C durch Messung der Produktion von [14C]-Trehalose aus [14C]-Trehalose-6-Phosphat überprüft (Londesborough und Vuorio (1991) J. of Gen. Microbiol. 137, 323). Rohextrakte wurden in 25 mM Tris, HCl pH 7,4, enthaltend 5,5 mM MgCl2, hergestellt. Die Proben wurden auf eine Proteinkonzentration von 1 mg/ml in Extraktionspuffer, enthaltend 1 mg/ml BSA, verdünnt. Standard-Assay-Mischungen (50 μl Endvolumen) enthielten 27,5 mM Tris, HCl pH 7,4, 5,5 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA und 0,55 mM T-6-P (spezifische Aktivität 854 cpm/nmol). Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 5 μl Enzym initiiert und nach 1 Stunde durch Erwärmen für 5 Minuten in kochendem Wasser beendet. AG1-X8 (Format) Anionenaustauschharz (BioRad) wurde zugefügt und die Reaktionsmischungen wurden nach 20 Minuten Äquilibrierung bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Radioaktivität im Überstand der Proben (400 μl) wurde durch Flüssig-Szintillationszählen gemessen.
  • Herstellung von Pflanzenextrakten für Hexokinase-Assays
  • Gefrorenes Pflanzenmaterial wurde in flüssigem Stickstoff gemahlen und 30 Sekunden mit Extraktionspuffer homogenisiert (EB: 100 mM HEPES pH 7,0 (KOH), 1% (G/V) PVP, 5 mM MgCl2, 1,5 mM EDTA, 0,1% V/V β-MeOH) einschließlich Proteinase-Inhibitors-Complete (Boehringer Mannheim). Nach einer Zentrifugation wurden die Proteine im Überstand unter Verwendung von 80% Ammoniumsulfat ausgefällt und in Tris-HCl pH 7,4 gelöst und der Extrakt wurde über Nacht gegen 100 mM Tris-HCl pH 7,4 dialysiert. Ein Teil der Probe wurde in dem Hexokinase-Assay verwendet.
  • Hexokinase-Assay
  • Die Hexokinase-Aktivität wurde in einem Assay gemessen, enthaltend 0,1 M Hepes-KOH pH 7,0, 4 mM MgCl2, 5 mM ATP, 0,2 mM NADP+, 10 U/ml Creatin-Phosphatkinase (gelöst in 50% Glycerin, 0,1% BSA, 50 mM Hepes pH 7,0), 3,5 mM Creatin-Phosphat, 7 U/ml Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase und 2 mM Glukose, durch Messung des Anstiegs der OD bei 340 nm bei 25°C.
  • Wenn anstelle von Glukose als Substrat für die Hexokinasereaktion 2 mM Fruktose verwendet wurde, wurden 3,8 U/ml Phosphoglukose-Isomerase eingeschlossen. Alternativ wurde ein Hexokinase-Assay, wie von Gancedo et al. (1977) J. Biol. Chem. 252, 4443 beschrieben, verwendet.
  • Beispiel 1
  • Expression des E. coli-otsA-Gens (TPS) in Tabak und Kartoffel
  • Transgene Tabakpflanzen wurden erzeugt, die das otsA-Gen beherbergten, angetrieben von dem de35SCaMV-Promotor (pMOG799) oder dem Plastocyanin-Promotor (pVDH318).
  • Transgene Kartoffelpflanzen wurden erzeugt, die das otsA-Gen beherbergten, angetrieben von dem Kartoffelknollen-spezifischen Patatin-Promotor (pMOG845).
  • Tabakblattscheibchen wurden mit dem binären Vektor pMOG799 unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens transformiert. Transgene Schösslinge wurden auf Kanamycin selektiert.
  • Blätter von einigen auf Erde gezüchteten Pflanzen expandierten nicht vollständig in Lateralrichtung und führten zu einer Lanzett-förmigen Morphologie (31).
  • Weiterhin war die Apikaldominanz reduziert, was zu einem beeinträchtigten Wachstum führte und der Bildung etlicher axillärer Schösslinge. Sie ben von zweiunddreißig Pflanzen zeigten eine schwerwiegende Wachstumsreduktion und erreichten eine Pflanzenhöhe von 4 bis 30 cm zum Zeitpunkt der Blütenbildung (Tabelle 1). Tabelle 1 Trehalose-Anhäufung in Blattproben von otsA-transgenen Tabakpflanzen und ihre Pflanzenlänge zum Zeitpunkt der Blütenbildung
    Figure 00370001
    • ND:
    nicht bestimmt
  • Kontrollpflanzen erreichten Längen von 60 bis 70 cm zum Zeitpunkt der Blütenbildung. Weniger Samen wurde von den transgenen Linien mit dem beeinträchtigten Wachstums-Phänotyp erzeugt. Eine Northern-Blot-Analyse bestätigte, dass Pflanzen mit dem beeinträchtigten Wachstums-Phänotyp das otsA-Gen von E.coli exprimieren (2). Bei den Kontrollpflanzen konnte kein Transkript nachgewiesen werden. Die Funktionalität des eingeführten Gens wurde durch eine Kohlenhydratanalyse von Blattmaterial von 32 transgenen gewächshausgezüchteten Tabakpflanzen bewiesen, und ergab die Gegenwart von 0,02 bis 0,12 mg·g–1 Frischgewicht Trehalose der Pflanzen, die in ihrer Länge reduziert waren (Tabelle 1), was anzeigte, dass das Produkt der TPS-katalysierten Reaktion durch die Pflanzen-Phosphatasen dephosphoryliert wird. Ein weiterer Beweis für die Anhäufung von Trehalose im Tabak wurde durch Behandlung von Rohextrakten mit Schweine-Trehalase erhalten. Eine verlängerte Inkubation des Tabakblattextrakts mit Trehalase führte zu einem vollständigen Abbau von Trehalose (Daten nicht dargestellt). Trehalose wurde in den Kontrollpflanzen oder transgenen Tabakpflanzen ohne abweichenden Phänotyp nicht nachgewiesen.
  • Tabelle 18 Primäre PC-TPS-Tabaktransformanten
    Figure 00380001
  • Transgene pVDH318 Tabakpflanzen entwickelten ein beeinträchtigtes Wachstum und eine Entwicklung kleiner Blätter, die dunkelgrüner und leicht dicker waren als Kontrollblätter, einem Phänotyp ähnlich, zu den pMOG799 transgenen Pflanzen (Tabelle 1a). Eine weitere Analyse dieser Blätter zeigte ein erhöhtes Frisch- und Trockengewicht pro Blattbereich im Vergleich mit den Kontrollen (Tabellen 1a und 2). Die dunkelgrünen Blätter zeigen die Gegenwart von mehr Chlorophyll in den transgenen Blättern an (Tabelle 1b). Pflanzen, die für pMOG799 (35STPS) und pMOG1177 (PCTPS) transgen waren, wurden im Hinblick auf lösliche Kohlenhydrate, Chlorophyll, Trehalose und Stärke hin analysiert (32). pMOG1177 ist funktional identisch zu pVDH318.
  • Tabelle 1b Chlorophyllgehalt von N. tabacum Blättern (T0), transgen für PC-TPS
    Figure 00390001
  • Merke: Die Lichtbedingungen während des Wachstums werden die bestimmten Niveaus an Chlorophyll signifikant beeinflussen. Die kalkulierten Mengen von Chlorophyll können daher nur zwischen Pflanzen verglichen werden, die innerhalb eines Experiments geerntet und analysiert wurden.
  • Tabelle 2 Frischgewicht und Trockengewichtsdaten von Blattmaterial, das für Plastocyanin-TPSE. coli transgen ist N. tabacum cv. Samsun NN, transgen für PC-TPS
    Figure 00390002
  • Die Berechnung des Verhältnisses zwischen Länge und Breite der sich entwickelnden Blätter zeigt deutlich, dass Blätter von Pflanzen, die für PC-TPS transgen sind, eine stärkere Lanzett-Form aufweisen (Tabelle 3).
  • Knollenscheibchen der Kartoffel Solanum tuberosum cv. Kardal wurden mit Agrobacterium tumefaciens EHA105 transformiert, das den binären Vektor pMOG845 beherbergte. Die Transgene wurden mit Transformationsfrequenzen erhalten, die zu leeren Vektorkontrollen vergleichbar waren. Alle erhaltenen Pflanzen waren phänotypisch von den Wildtyp-Pflanzen nicht unterscheidbar, was anzeigte, dass die Verwendung eines gewebespezifischen Promotors den Phänotyp von Pflanzen verhindert, bei denen ein konstitutiver Promotor das TPS-Gen antreibt. Mikroknollen wurden an Stammsegmenten von transgenen und Wildtyp-Pflanzen induziert, kultiviert auf Mikroknollen induzierendem Medium, supplementiert mit 10–3 M Validamycin A. Als Kontrolle wurden Mikroknollen auf Medium ohne Validamycin A induziert. Mikroknollen, die auf Medium mit Validamycin A induziert wurden, zeigten erhöhte Niveaus Trehalose im Vergleich mit Mikroknollen, die auf Medium ohne Validamycin A gezüchtet wurden (Tabelle 4). Die Gegenwart geringer Mengen Trehalose in Wildtyp-Pflanzen zeigt die Gegenwart eines funktionellen Trehalose-Biosynthese-Wegs an. Tabelle 3 Tabakpflanzen (cv. Samson NN), transgen für pVDH318
    Figure 00410001
    • * typische TPS-Phänotypen; Verhältnis Länge/Breite Durchschnitt von Kontrollen ist 1,50
  • Tabelle 4 Trehalose (% Frischgewicht)
    Figure 00420001
  • Beispiel 2
  • Expression des E. coli otsB-Gens (TPP) in Tabak
  • Transgene Tabakpflanzen wurden erzeugt, die das otsB-Gen beherbergten, angetrieben von dem doppelt verstärkten 35SCaMV-Promotor (pMOG1010) und dem Plastocyanin-Promotor (pVDH321).
  • Tabakpflanzen (cv. Samsun NN), transformiert mit pMOG1010 zeigten im Gewächshaus die Entwicklung sehr großer Blätter (der Blattbereich war im Durchschnitt um ungefähr 140% vergrößert), die eine Chlorose zu entwickeln begannen, wenn vollständig entwickelt (31). Zusätzlich wurden dickere Stängel im Vergleich mit den Kontrollen gebildet, was in einigen Fällen zum Aufbrechen der Stängel führte. In einigen Fällen wurden multiple Stängel von der Basis der Pflanze her gebildet (Verzweigung) (Tabelle 5). Blattproben von Pflanzen, die große Blätter entwickelten, ergaben eine 5- bis 10fach erhöhte Trehalose-6-Phosphat-Phosphatase-Aktivität im Vergleich mit Kontrollpflanzen, was die Funktionalität des eingeführten Gens bewies. Das Trocken- und Frischgewicht pro cm2 der abnormal großen Blätter war vergleichbar zu den Kontrollblättern, was andeutete, dass der Anstieg in der Größe auf einen Anstieg von Trockenstoffen zurückzuführen ist und nicht auf einen erhöhten Wassergehalt. Die Infloreszenz war ebenfalls durch Expression von TPP beeinflusst. Die Pflanzen, die einen beeinträchtigten Phänotyp aufwiesen, vermutlich ausgelöst durch konstitutive Expression des TPP-Gens in allen Pflanzenteilen, entwickelten viele kleine Blüten, die nicht vollständig reiften und abfielen oder nekrotisierten. Die Entwicklung von Blüten und die Samenabsetzung schien bei den Pflanzen, die weniger beeinträchtigt waren, weniger beeinflusst zu sein. Tabelle 5 Tabakpflanzen, die für pMOG1010, de35S CaMV TPP transgen sind
    Figure 00430001
    Tabelle 6 Primäre PC-TPP-Tabaktransformanten
    Figure 00440001
    • wt
    = Wildtyp
  • Tabakpflanzen (cv. Samsun NN), transformiert mit pVDH321 zeigten im Gewächshaus ein Entwicklungsmuster, das mit den pMOG1010 transgenen Pflanzen vergleichbar war (Tabelle 6).
  • Pflanzen, die für pMOG1010 (35S-TPP) und pMOG1124 (PC-TPP) transgen waren, wurden im Hinblick auf Kohlenhydrate, Chlorophyll, Trehalose und Stärke analysiert (32A–D). Für die Chlorophyll-Daten siehe auch Tabelle 6a.
  • Tabelle 6a Chlorophyllgehalt von N. tabacum Blättern (T0), transgen für PC-TPP
    Figure 00450001
  • Merke: Die Lichtbedingungen während des Wachstums werden die bestimmten Niveaus an Chlorophyll signifikant beeinflussen. Die kalkulierten Mengen von Chlorophyll können daher nur zwischen Pflanzen verglichen werden, die innerhalb eines Experiments geerntet und analysiert wurden.
  • Beispiel 3
  • Isolierung von Genfragmenten, kodierend Trehalose-6-Phosphat-Synthasen von Selaginella lepidophylla und Helianthus annuus
  • Der Vergleich der TPS-Proteinsequenzen von E.coli und S. cerevisiae ergab die Gegenwart von etlichen konservierten Regionen. Diese Regionen wurden verwendet, um degenerierte Primer zu entwerfen, die in PCR-Amplifikationsreaktionen unter Verwendung genomischer DNA von E.coli und Hefe als Matrizen getestet wurden. Ein PCR-Programm wurde mit einer Temperaturrampe zwischen dem Annealings- und Verlängerungsschritt verwendet, um das Annealing der degenerierten Primer zu erleichtern.
  • Die PCR-Amplifikation wurde unter Verwendung der Primersets TPSdeg 1/5 und TPSdeg 2/5 unter Verwendung von cDNA von Selaginella lepidophylla als Matrize durchgeführt.
  • Verwendete degenerierte Primer (IUB code):
    Figure 00450002
  • PCR-Fragmente der erwarteten Größe wurden kloniert und sequenziert. Da eine große Zahl homologer Sequenzen isoliert wurde, wurde eine Southern- Blot-Analyse verwendet um zu bestimmen, welche Klone mit der Selaginella genomischen DNA hybridisierten. Zwei Klone wurden isoliert, wobei die Sequenz von Klon 8 in SEQ ID NO: 42 angegeben ist (PCR-Primer-Kombination 1/5) und wobei die Sequenz von Klon 43 in SEQ ID NO: 44 angegeben ist (PCR-Primer-Kombination 2/5), was auf dem Niveau der Aminosäuren Regionen mit einem hohen Prozentsatz einer Identität zu dem TPS-Gen von E.coli und Hefe ergab.
  • Ein TPS-Gen-Fragment wurde aus Helianthus annuus (Sonnenblume) isoliert, wobei die Primer-Kombination TPSdeg 2/5 in einer PCR-Amplifikation mit genomischer DNA von H. annuus als Matrize verwendet wurde. Sequenz und Southern-Blot-Analyse bestätigten die Homologie zu den TPS-Genen von E.coli, Hefe und Selaginella. Der Vergleich dieser Sequenzen mit EST-Sequenzen (exprimierte Squence-tags) von verschiedenen Organismen, siehe Tabelle 6b und SEQ ID NRN 45–53 und 41, zeigte die Gegenwart hoch-homologer Gene in Reis und Arabidopsis an, was unsere Erfindung unterstützt, dass die meisten Pflanzen TPS-homologe Gene enthalten (3).
  • Tabelle 6b
    Figure 00470001
  • Beispiel 4
  • Isolierung von Pflanzen-TPS- und TPP-Genen von Nicotiana tabacum
  • Fragmente von Pflanzen-TPS- und TPP-kodierender cDNA wurden isoliert, wobei PCR auf cDNA, abgeleitet von Tabakblatt-Total-RNA-Präparationen verwendet wurde. Die Spalte "als Nest" in Tabelle 7 zeigt an, ob eine zweite Runde von PCR-Amplifikationen notwendig war, mit dem Primer-Set 3 und 4, um das korrespondierende DNA-Fragment zu erhalten. Primer wurden in das Sequenzprotokoll (Tabelle 7) eingefügt. Klonierung und darauffolgende Sequenzanalyse der DNA-Fragmente, erhalten mit den Primer-Sets, wie erwähnt, ergaben substanzielle Homologie zu bekannten TPS-Genen (4 und 5).
  • Tabelle 7 Amplifikation von pflanzenabgeleiteten TPS- und TPP-cDNAs
    Figure 00480001
  • Beispiel 5
  • Isolierung eines Bipartit-TPS/TPP-Gens von Helianthus annuus und Nicotiana tabacum
  • Unter Verwendung der Sequenzinformation des TPS-Genfragments der Sonnenblume (Helianthus annuus) wurde ein Gesamtlängen-Sonnenblumen-TPS-Klon unter Verwendung von RACE-PCR-Technologie erhalten.
  • Die Sequenzanalyse dieses Gesamtlängenklons und eine Ausrichtung mit TPS2 von Hefe (6) und TPS- und TPP-kodierenden Sequenzen zeigen an, dass der isolierte Klon ein TPS/TPP-Bipartitenzym kodiert (SEQ ID NO: 24, 26 und 28). Der isolierte Bipartit-Klon (pMOG1192) wurde im Zentralbüro for Strain collections unter den Regeln des Budapester Vertrags mit der Hinterlegungsnummer CBS692.97 am 21. April 1997 hinterlegt. Darauffolgend untersuchten wir, ob eine andere Pflanzenart ebenfalls TPS/TPP-Bipartit-Klone enthält. Ein Bipartit-TPS/TPP-cDNA wurde aus Tabak amplifiziert. Ein DNA-Produkt der erwarteten Größe (d.h. 1,5 kb) wurde nach PCR mit den Primern TPS deg1/TRE-TPP-16 nachgewiesen und mit TPS deg2/TRE-TPP-15 (SEQ ID NO: 33) als Nest. Eine identische Bande erschien mit PCR mit TPS degl/TRE-TPP-6 (SEQ ID NO: 34) und mit TPS deg2/TRE-TPP-15 als Nest. Es wurde gezeigt, dass das letztere Fragment mit der Sonnenblumen-Bipartit-cDNA in einem Southern-Blot-Experiment hybridisierte. Zusätzlich wurde unter Verwendung von Computerdatenbanksuchen ein Arabidopsis Bipartit-Klon identifiziert (SEQ ID NO: 39).
  • Beispiel 6
  • Expression von pflanzenabgeleiteten TPS-Genen in Pflanzen
  • Ein weiterer Beweis für die Funktion der TPS-Gene der Sonnenblume und Selaginella lepidophylla wurde durch Isolation ihrer korrespondierenden Gesamtlängen-cDNA-Klone und darauffolgende Expression dieser Klone in Pflanzen unter Kontrolle des 35S CaMV Promotors erhalten. Die Anhäufung von Trehalose durch Expression des Seliganella-Enzyms wurde von Zentella und Iturriaga (1996) (Plant Physiol. 111, Abstract 88) berichtet.
  • Beispiel 7
  • Gene, die TPS und TPP bei monokotyledonen Arten kodieren
  • Eine Computersuche in Genbanksequenzen ergab die Gegenwart von etlichen Reis-EST-Sequenzen, homolog zu TPS1 und TPS2 von Hefe (7), die in dem Sequenzprotokoll beinhaltet sind (SEQ ID NO: 41, 51, 52 und 53).
  • Beispiel 8
  • Isolierung eines menschlichen TPS-Gens
  • Ein TPS-Gen wurde aus menschlicher cDNA isoliert. Eine PCR-Reaktion wurde an menschlicher cDNA unter Verwendung der degenerierten TPS-Primer deg2 und deg5 durchgeführt. Dies führte zu dem erwarteten TPS-Fragment mit 0,6 kb. Die Sequenzanalyse (SEQ ID NO: 10) und Vergleich mit der TPSzeast-Sequenz zeigte an, dass die isolierte Sequenz ein homologes TPS-Protein kodiert (8).
  • Beispiel 9
  • Inhibition der endogenen TPS-Expression durch Anti-Sinn-Inhibition
  • Die Expression von endogenen TPS-Genen kann durch die Anti-Sinn-Expression eines homologen TPS-Gens unter der Kontrolle von Promotorsequenzen inhibiert werden, die die Expression eines solchen Anti-Sinn-TPS-Gens in Zellen oder Gewebe antreiben, wo die Inhibition gewünscht wird. Für diesen Ansatz wird es bevorzugt, eine vollständig identische Sequenz zum TPS-Gen zu verwenden, das supprimiert werden soll, obwohl es nicht notwendig ist, die gesamte Kodierungsregion in einem Anti-Sinn-Expressionsvektor zu exprimieren. Fragmente einer solchen Kodierungsregion haben sich auch als funktional bei der Anti-Sinn-Inhibition der Genexpression erwiesen. Alternativ können heterologe Gene für den Anti-Sinn-Ansatz verwendet werden, wenn sie zu dem endogenen Gen ausreichend homolog sind.
  • Binäre Vektoren, die pMOG845 und pMOG1010 ähnlich waren, können verwendet werden, um sicherzustellen, dass die kodierenden Bereiche der einge führten Gene, die unterdrückt werden sollen, in umgekehrter Orientierung eingeführt werden. Alle Promotoren, die geeignet sind, um die Expression der Gene in Zielgeweben anzutreiben, sind ebenfalls für die Anti-Sinn-Expression der Gene geeignet.
  • Beispiel 10
  • Inhibition der endogenen TPP-Expression durch Anti-Sinn-Inhibition
  • Ähnlich zu der Konstruktion von Vektoren, die verwendet werden können, um die Anti-Sinn-Expression von TPS in Zellen und Geweben anzutreiben (Beispiel 9), können Vektoren konstruiert werden, die die Anti-Sinn-Expression von TPP-Genen antreiben.
  • Beispiel 11
  • Trehalose-Anhäufung in Wildtyp-Tabak- und Kartoffelpflanzen, gezüchtet auf Validamycin A
  • Beweise für die Gegenwart eines Trehalose-Biosynthese-Stoffwechselweges in Tabak wurden durch Kultivierung von Wildtyp-Pflanzen in Gegenwart von 10–3 M des Trehalase-Inhibitors Validamycin A erhalten. Die behandelten Pflanzen häuften sehr geringe Mengen Trehalose an, bis zu 0,0021% (Frischgewicht). Eine Trehalose-Anhäufung wurde nie bei irgendwelchen Kontrollpflanzen nachgewiesen, die ohne Inhibitor kultiviert wurden. Ähnliche Daten wurden mit Wildtyp-Mikroknollen erhalten, kultiviert in Gegenwart von Validamycin A. Zehn von siebzehn Zellinien akkumulierten im Durchschnitt 0,001% Trehalose (Frischgewicht) (Tabelle 4). Keine Trehalose wurde bei Mikroknollen beobachtet, die auf Medium ohne Validamycin A induziert wurden.
  • Beispiel 12
  • Trehalose-Anhäufung bei Kartoffelpflanzen, die für as-Trehalase transgen sind
  • Ein weiterer Beweis für die Gegenwart von endogenen Trehalose-Biosynthese-Genen wurde durch Transformationen von Wildtyp-Kartoffelpflanzen mit einem 35S CaMV Anti-Sinn-Trehalase-Konstrukt (SEQ ID NO: 54 und 55, pMOG1027; beschrieben in WO 96/21030) erhalten. Ein Kartoffelschössling, transgen für pMOG1027 zeigte eine Akkumulation von Trehalose bis zu 0,008% auf einer Frischgewichtsbasis. Die Identität des beobachteten Trehalose-Peaks wurde durch spezifisches Abbauen der angehäuften Trehalose mit dem Enzym Trehalase bestätigt. Knollen von einigen pMOG1027 transgenen Linien zeigten eine Akkumulation von geringen Mengen Trehalose (9).
  • Beispiel 13
  • Inhibition der Pflanzen-Hexokinase-Aktivität durch Trehalose-6-Phosphat
  • Um die regulatorische Wirkung von Trehalose-6-Phosphat auf die Hexokinase-Aktivität zu demonstrieren, wurden Pflanzenextrakte hergestellt und im Hinblick auf die Hexokinase-Aktivität in Abwesenheit und Gegenwart von Trehalose-6-Phosphat getestet.
    • • Kartoffelknollenextrakte wurden unter Verwendung von Fruktose ( 10, 11) und Glukose (11) als Substrat bewertet. Der Kartoffelknollen-Assay unter Verwendung von 1 mM T-6-P und Fruktose als Substrat wurde gemäß Gancedo et al. (1997) J. Biol. Chem. 252, 4443 durchgeführt. Die folgenden Assays an Tabak, Reis und Mais wurden gemäß dem in dem experimentellen Teil beschriebenen Assay durchgeführt.
    • • Tabakblattextrakte wurden unter Verwendung von Fruktose (12) und Glukose (12, 13) als Substrat bewertet.
    • • Reisblattextrakte wurden unter Verwendung von Fruktose und Glukose (14) als Substrat bewertet.
    • • Maisblattextrakte wurden unter Verwendung von Fruktose und Glukose (15) als Substrat bewertet.
  • Beispiel 14
  • Inhibition der Hexokinase-Aktivität in tierischen Zollkulturen durch Trehalose-6-Phosphat
  • Um die Regulation der Hexokinase-Aktivität in tierischen Zellen zu demonstrieren, wurden Gesamt-Zell-Extrakte aus Maus-Hybridom-Zollkulturen hergestellt. Ein Hexokinase-Assay wurde unter Verwendung von Glukose oder Fruktose als Substrat unter den von Gancedo et al. (siehe oben) beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Maus-Hybridom-Zellen wurden einem osmotischen Schock durch Exponieren eines Zellpellets gegenüber 20% Saccharose, gefolgt von destilliertem Wasser, unterzogen. Dieser rohe Proteinextrakt wurde in dem Hexokinase-Assay verwendet (50 μl Extrakt, korrespondierend zu ca. 200 μg Protein).
  • Tabelle 8 Inhibition der tierischen Hexokinase-Aktivität durch T-6-P
    Figure 00510001
  • Die erhaltenen Daten zeigten deutlich, dass die Hexokinase-Aktivität in Maus-Zellextrakten durch Trehalose-6-Phosphat inhibiert wird. Der T-6-P-Konzentrationsbereich, in dem dieser Effekt bemerkt wird, ist mit dem vergleichbar, der in rohen Pflanzenextrakten beobachtet wurde. Es wird kein Unterschied in der Effizienz der Hexokinase-Inhibition durch Trehalose-6-Phosphat unter Verwendung von Glukose oder Fruktose als Substrat für das Enzym beobachtet.
  • Beispiel 15
  • Fotosynthese und Respiration von TPS und TPP exprimierenden Tabakpflanzen
  • Unter Verwendung von Tabakpflanzen, die für 35S-TPP (1010-5), PC-TPS (1318-10 und 1318-37) transgen sind und Wildtyp Samsun NN-Pflanzen wurden die Wirkungen der Expression dieser Gene auf die Fotosynthese und Respiration in Blättern bestimmt.
  • Die Messungen wurden in einem Gasaustausch-experimentellen Ansatz durchgeführt. Die Geschwindigkeiten des Gasaustausches wurden auf der Basis von Unterschieden in der Konzentration zwischen hineingehender und herausgehender Luft unter Verwendung einer Infrarot-Gasanalyseausrüstung berechnet. Die Fotosynthese und Respiration wurden aus identischen Blättern gemessen. Von jeder transgenen Pflanze wurde das jüngste, voll entwickelte Blatt verwendet (Oberblatt) und ein Blatt, das 3 bis 4 Blatt-"Stockwerke" tiefer lag (unteres Blatt).
  • Die Fotosynthese wurde als Funktion der fotosynthetisch aktiven Lichtintensität (PAR) von 0 bis 975 μmol·m–2·s–1 (200 Watt·m–2) gemessen, in Vierfachen bei CO2-Konzentrationen bei 350 vpm und 950 vpm.
  • Die Respiration wurde unter Verwendung zweier unterschiedlicher Zeitskalen gemessen. Die Messungen, die während einer kurzen Dunkelperiode nach den Photosyntheseexperimenten durchgeführt wurden, werden als RD in Tabelle 9 kodiert. Diese Werte reflektieren eine sofortige Aktivität, da die Respiration substanziell während der Dunkelperiode variiert. Daher wurden die Werte für die gesamte Nachtperiode ebenfalls summiert, wie dargestellt in Tabelle 10 (nur bei 350 vpm CO2 gemessen).
  • Tabelle 9 Photosyntheserate und Respiration, STD ist die Standardabweichung
    Figure 00530001
  • Tabelle 10 Respiration während einer 12stündigen Dunkelperiode (mmol CO2)
    Figure 00530002
  • Im Gegensatz zu der Respiration in den oberen Blättern ist die Respiration von TPS-transgenen Pflanzen in den unteren Blättern signifikant höher als für den Wildtyp und TPP-Pflanzen (Tabelle 10), was eine sehr viel höhere Stoffwechselaktivität anzeigt. Der Abfall der Respiration während des Alterns der Blätter ist signifikant geringer bei den TPS-transgenen Pflanzen.
  • Außerdem unterschieden sich die photosynthetischen Eigenschaften signifikant zwischen einerseits TPS-transgenen Pflanzen und andererseits TPP- transgenen und Wildtyp-Kontrolle-Pflanzen. Die AMAX-Werte (Maximum der Fotosynthese bei Lichtsättigung), die Effizienz der Fotosynthese (EFF) und die Respirationsgeschwindigkeit während einer kurzen Dunkelperiode nach der Photosynthesemessung (RD) sind in Tabelle 9 dargestellt. Im Durchschnitt hatten die oberen TPS-Blätter einen 35% höheren AMAX-Wert im Vergleich mit den TPP- und Wildtyp-Blättern. Die unteren Blätter zeigen eine stärker erhöhte Rate der Fotosynthese (88%).
  • Um auszuschließen, dass Unterschiede in der Lichtabsorption die unterschiedlichen Photosyntheseraten auslösten, wurden Absorptionswerte mit einem SPAD-502 (Minolta) gemessen. Es wurden keine signifikanten Absorptionsunterschiede gemessen (Tabelle 11).
  • Tabelle 11 Absorptionswerte der transgenen Linien
    Figure 00540001
  • Beispiel 16
  • Chlorophyll-Fluoreszenz von TPS und TPP exprimierenden Tabakpflanzen
  • Unter Verwendung von Tabakpflanzen, die für 35S-TPP (1010-5), PC-TPS (1318-10 und 1318-37) transgen waren und Wildtyp Samsun NN-Pflanzen, wurden die Wirkungen der Expression dieser Gene auf die Chlorophyll-Fluoreszenz des Blattmaterials bestimmt. Zwei Eigenschaften der Fluoreszenz wurden gemessen:
    • 1) ETE (Elektronentransporteffizienz), als Maß für die Elektronentransportgeschwindigkeit und die Erzeugung reduzierender Kraft und
    • 2) nicht-fotochemisches Quenching, ein Maß für die Energieverteilung, ausgelöst durch Anhäufung von Assimilaten.
  • Die Pflanzen wurden in einem Gewächshaus mit zusätzlichem Licht von 100 μm m–2·s–1 (04:00–20:00 Stunden) gezüchtet. Tag/Nacht T = 21°C/18°C; R.H. ±75%. Während einer Nachtperiode vor den Messungen (Dauer 16 Stunden) wurden zwei Pflanzen von jedem Genotyp ins Dunkle übertragen und zwei Pflanzen ins Licht (±430 μmol m–2·s–1, 20°C, R.H. 70%). Die jüngsten vollreifen Blätter wurden gemessen. Die photochemische Effizienz des PSII (Photosystem II) und die "nicht-photochemischen Quenching" -Parameter wurden als Funktion einer ansteigenden Lichtintensität bestimmt. Bei jeder Lichtintensität wurde eine 300 Sekunden Stabilisationszeit genommen. Die Messungen wurden bei 5, 38, 236, 422 und 784 μmol m–2·s–1 PAR mit einer Frequenz von 3 Lichtblitzen pro min–1, 350 ppm CO2 und 20% O2 durchgeführt. Die Experimente wurden unter Verwendung identischer Pflanzen repliziert, wobei die Vorbehandlung vom Dunkeln zu Licht und umkehrt umgedreht wurde. Die Fluoreszenzeigenschaften sind in 16 dargestellt.
  • Die Abnahme der Elektronentransport-Effizienz (ETE) war zwischen TPP- und Wildtyp-Pflanzen vergleichbar. Die TPS-Pflanzen reagierten deutlich weniger auf einen Anstieg der Lichtintensität. Dieser Unterschied war bei der Lichtvorbehandlung am deutlichsten. Diese Beobachtungen stimmen mit den "nicht-photochemischen" Quenchingdaten überein. Die TPS-Pflanzen reagierten deutlich weniger auf die zusätzliche Zufuhr von Assimilaten durch Licht im Vergleich mit TPP- und Wildtyp-Pflanzen. Im Fall von TPS-Pflanzen war die negative Regulation der sich anhäufenden Assimilate auf die Fotosynthese signifikant reduziert.
  • Beispiel 17
  • Export und Lokalisierung von Assimilaten in TPS und TPP exprimierenden Tabakpflanzen
  • Unter Verwendung von Tabakpflanzen, die für 35S-TPP (1010-5) und PC-TPS (1318-37) transgen waren, wurden
    • 1) der Export von Kohlenstoff-Assimilaten aus einem vollständig ausgewachsenen Blatt (wodurch die "relative Quellenaktivität" angegeben wird, Koch (1996) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol. 47, 509) und
    • 2) die Nettoanhäufung der Photoassimilate in den Sinks ("relative Sink-Aktivität") während einer Licht- und einer Dunkelperiode bestimmt.
  • Entwicklungsstufe der Pflanzen: Blütenknospen gerade sichtbar. Verwendete Markierungstechnik: Steady-state high abundance 13C-labelling von Photosyntheseprodukten (De Visser et al. (1997) Plant Cell Environ 20, 37). Von beiden Genotypen wurden 8 Pflanzen unter Verwendung eines vollständig ausgewachsenen Blattes mit 5,1 Atom% 13CO2 während einer Lichtperiode (10 Stunden) markiert, falls geeignet, gefolgt von einer Dunkelperiode (14 Stunden). Nach dem Markieren wurden die Pflanzen wie folgt eingeteilt: 1) Schösslings-Spitze, 2) junges wachsendes Blatt, 3) junges, vollständig entwickeltes Blatt (oberhalb des markierten Blattes), 4) junger Stamm (oberhalb des markierten Blattes), 5) markiertes Blatt, 6) Petiol und Basis des markierten Blatts, 7) altes, alterndes Blatt, 8) andere und älteste Blätter, niedriger als das markierte Blatt, 9) Stamm, niedriger als das markierte Blatt, 10) Wurzelspitzen. Nummer, Frisch- und Trockengewicht und 13C Prozentzahl (Atom% 13C) des Kohlenstoffs wurden bestimmt. Neben allgemeinen Parametern wie Biomasse, Trockenstoffe und Anzahl der Blätter wurden die folgenden berechnet: 1) Export von C aus dem markierten Blatt; 2) relativer Beitrag von importiertem C in Pflanzenteilen; 3) absolute Menge von importiertem C in Pflanzenteile; 4) relative Verteilung von importiertem C während einer Lichtperiode und einer vollständigen Licht- und Dunkelperiode.
  • Die Biomasse oberhalb der Erde der TPP-Transgenen war 27% größer im Vergleich zu den TPS-Transgenen (P < 0,001); außerdem war das Wurzelsystem der TPP-Transgenen besser entwickelt. Die TPP-Pflanzen ergaben eine signifikant veränderte Trockenstoffverteilung, +39% Blatt und +10% Stamm-Biomasse im Vergleich mit TPS-Pflanzen. Die TPS-Pflanzen hatten eine größere Anzahl von Blättern, jedoch einen geringeren Blattbereich pro Blatt. Der Gesamt-Blattbereich pro TPS-Pflanze war vergleichbar mit dem Wildtyp (0,4 m2 pro Pflanze).
  • – Relative Quellenaktivität eines vollständig entwickelten Blatts
  • Die Nettoexportrate der Fotosynthate aus dem markierten Blatt wird durch die relative Abnahme von prozentualem "neuem C" während der Nacht (für TPP 39% und für TPS 56%) bestimmt und durch die gesamte fixierte Menge, die in der Pflanze vorliegt, unter Verwendung der Menge von "neuem C" in der Pflanze (ohne das markierte Blatt) als Maßstab. Nach einer Lichtperiode exportierten TPP-Blätter 37% im Vergleich zu 51% für TPS-Blätter (Tabelle 11). In einer folgenden Dunkelperiode stieg diese Prozentzahl auf jeweils 52% und 81%. Beide Verfahren unterstützen die Schlussfolgerung, dass TPS-transgene Pflanzen eine signifikant erhöhte Exportrate von Photosyntheseprodukten im Vergleich zu den TPP-transgenen Pflanzen aufweisen.
  • – Absolute Menge von "neuem C" in Pflanzenteilen
  • Der Export durch TPS-Transgene war signifikant höher im Vergleich zu TPP-Transgenen. Junge wachsende TPS-Blätter importieren C stärker im Vergleich zu jungen wachsenden TPP-Blättern.
  • – Relativer Anstieg von "neuem C" in Pflanzenteilen: Sink-Festigkeit
  • Der relative Beitrag von "neuem C" zu dem betroffenen Pflanzenteil ist in 17 dargestellt. Dieser Prozentsatz ist ein Maß für die Sink-Festigkeit. Eine signifikant höhere Sink-Festigkeit war in den TPS-Transgenen vorhanden, insbesondere in der Schösslingspitze, dem Stamm oberhalb und unterhalb des markierten Blatts und dem Petiol des markierten Blatts.
  • Tabelle 11 Quellenaktivität eines vollständig ausgewachsenen markierten Blatts: C-Anhäufung und Export. Tägliche Nettoanhäufung und Export von C-Assimilaten im markierten Blatt und der gesamten Pflanze (oberhalb der Erde) nach einer Steady-State 13C-Markierung während einer Lichtperiode (Tag). N = 4: LSD-Werte gaben die kleinsten signifikanten Unterschiede für P < 0,05 an
    Figure 00570001
  • – Relative Verteilung innerhalb der Pflanze, von "Neuem C" zwischen den Pflanzenteilen: Relative Sink-Festigkeit
  • Die Verteilung von fixiertem Kohlenstoff zwischen Pflanzenorganen (18) bestätigte die oben erwähnten Schlussfolgerungen. TPS-transgene Pflanzen zeigten einen relativ großen Export von Assimilaten zur Schösslingspitze, dem jungen wachsenden Blatt (Tag) und selbst dem ältesten Blatt (ohne axilläre Meristeme) und zum jungen und alten Stamm.
  • Beispiel 18: Kopfsalat
  • Leistung von Kopfsalatpflanzen, die für PC-TPS und PC-TPP transgen sind
  • Konstrukte, die in den Kopfsalat-Transformationsexperimenten verwendet wurden: PC-TPS und PC-TPP. PC-TPS-Transfene wurden während einer Regeneration durch Kultivierung von Explantaten auf 60 g/l Saccharose gerettet. Die Phänotypen von sowohl TPS- als auch TPP-transgenen Pflanzen sind deutlich von den Wildtyp-Kontrollen unterscheidbar; TPS-transgene Pflanzen haben dicke, dunkelgrüne Blätter und TPP-transgene Pflanzen haben hellgrüne Blätter mit einer glatteren Blattkante im Vergleich mit Wildtyp-Pflanzen.
  • Die Morphologie der Blätter und besonders vorherrschend der Blattkanten war deutlich durch die Expression von TPS und TPP beeinflusst. Blätter, die für PC-TPS transgen sind, waren deutlich stärker "eingekerbt" als die PC-TPP-transgenen Blätter, die eine glattere und rundere Morphologie aufwiesen (19). Blattextrakte von transgenen Kopfsalatlinien wurden im Hinblick auf Zucker und Stärke analysiert (20).
  • Beispiel 19: Zuckerrübe
  • Leistung von Zuckerrübenpflanzen, die für PC-TPS und PC-TPP transgen sind
  • Konstrukte, die in den Zuckerrüben-Transformationsexperimenten verwendet wurden: PC-TPS und PC-TPP. Die Transformationsfrequenzen, die mit sowohl TPS- als auch TPP-Konstrukten erhalten wurden, waren mit den Kontrollen vergleichbar. Die Phänotypen von sowohl TPS- als auch TPP-transgenen Pflanzen waren deutlich von den Wildtyp-Kontrollen unterscheidbar; die TPS-transgenen Pflanzen hatten dicke dunkelgrüne Blätter und die TPP-transgenen Pflanzen hatten hellgrün gefärbte Blätter mit etwas größeren Petiolen im Vergleich zu den Wildtyp-Pflanzen (21). Der Pfahlwurzeldurchmesser wurde für alle Pflanzen nach ca. 8 Wochen Wachstum im Gewächshaus bestimmt. Einige PC-TPS-transgene Linien mit einer Blattgröße ähnlich zu den Kontrollpflanzen, zeigten einen signifikant größeren Durchmesser der Pfahlwurzel (22). PC-TPP-transgene Linien bildeten eine kleinere Pfahlwurzel im Vergleich mit den nicht-transgenen Kontrollen. Blattextrakte der transgenen Zuckerrübenlinien wurden im Hinblick auf Zucker und Stärke analysiert (20).
  • Beispiel 20: Arabidopsis
  • Leistung von Arabidopsis-Pflanzen, die für PC-TPS und PC-TPP transgen sind
  • Die in den Arabidopsis Transformationsexperimenten verwendeten Konstrukte: PC-TPS und PC-TPP. Die Phänotypen von sowohl TPS- als auch TPP-transgenen Pflanzen waren deutlich von den Wildtyp-Kontrollen unterscheidbar; TPS-transgene Pflanzen hatten dicke dunkelgrüne Blätter und TPP-transgene Pflanzen hatten größere, ausgebleichte Blätter im Vergleich mit den Wildtyp-Pflanzen. Pflanzen mit hohen Niveaus einer TPP-Expression setzten keine Samen an.
  • Beispiel 21: Kartoffel
  • Leistung von Solanum tuberosum-Pflanzen, die for TPS- und TPP-Konstrukte transgen sind
  • Konstrukt: 35S-TPS pMOG799
  • Pflanzen, die für pMOG799 transgen waren, wurden im Gewächshaus gezüchtet und der Knollenertrag wurde bestimmt (23). Die Mehrzahl der transgenen Pflanzen zeigte kleinere Blattgrößen im Vergleich mit den Wildtyp-Kontrollen. Pflanzen mit kleineren Blattgrößen ergaben weniger Knollenmasse im Vergleich mit Kontrollinien (25).
  • Konstrukt: 35S-TPP pMOG1010 und PC-TPP pMOG1124
  • Pflanzen, die für pMOG1010 und pMOG1124 transgen waren, wurden im Gewächshaus gezüchtet und der Knolleneertrag wurde bestimmt. Der Knollener trag (24) war mit der Wildtyp-Kontrollinie vergleichbar oder geringer (25).
  • Konstrukt: PC-TPS pMOG1093
  • Pflanzen, die für pMOG1093 transgen waren, wurden im Gewächshaus gezüchtet und der Knollenertrag wurde bestimmt. Eine Anzahl transgener Linien mit Blättern mit einer Größe, vergleichbar zum Wildtyp (B-C) und die etwas dunkler grün in der Farbe waren, ergaben mehr Knollenmasse im Vergleich mit den Kontrollpflanzen (26). Pflanzen mit Blattgrößen, die kleiner (D-G) waren als bei Kontrollpflanzen ergaben weniger Knollenmasse.
  • Konstrukt: Pat-TPP pMOG1128
  • Mikroknollen wurden in vitro an Explantaten von pat-TPP-transgenen Pflanzen induziert. Die durchschnittliche Frischgewicht-Biomasse der gebildeten Mikroknollen war deutlich geringer im Vergleich zu den Kontrollinien.
  • Konstrukt: Pat-TPS pMOG845
  • Pflanzen, die für PMOG845 transgen waren, wurden im Gewächshaus gezüchtet und der Knollenertrag wurde bestimmt. Drei Pat-TPS-Linien erzeugten mehr Knollenmasse im Vergleich mit den Kontrollinien (27).
  • Konstrukt: PC-TPS Pat-TPS; pMOG1129(845-11/22/28)
  • Pflanzen, die PC-TPS und Pat-TPS simultan exprimierten, wurden durch Retransformation von Pat-TPS-Linien (resistent gegen Kanamycin) mit dem Konstrukt pMOG1129 erzeugt, das ein PC-TPS-Konstrukt beherbergte sowie ein Hygromycinresistenz-Markergen, was zu den Genotypen pMOG1129(845-11), pMOG1129(845-22) und pMOG1129(845-28) führte. Der Knollenmassenertrag variierte zwischen fast keinem Ertrag bis zu einem Ertrag, der im Vergleich mit den Kontrollpflanzen vergleichbar oder höher war (28).
  • Beispiel 22: Tabak
  • Leistung von N. tabacum-Pflanzen, transgen für TPS- und TPP-Konstrukte Wurzelsystem
  • Tabakpflanzen, die für 35S-TPP (pMOG1010) oder 35S-TPS (pMOG799) transgen waren, wurden im Gewächshaus gezüchtet. Die Wurzelgröße wurde direkt vor der Blütenbildung bestimmt. Linien, die für pMOG1010 transgen waren, zeigten eine signifikant kleinere/größere Wurzelgröße im Vergleich mit pMOG799 und nicht-transgenen Wildtyp-Tabakpflanzen.
  • Einfluss der Expression von TPS und/oder TPP auf die Blütenbildung
  • Tabakpflanzen, die für 35S-TPS, PC-TPS, 35S-TPP oder PC-TPP transgen waren, wurden im Gewächshaus kultiviert. Pflanzen, die hohe Niveaus des TPS-Gens exprimierten, ergaben signifikant geringere Wachstumsraten als die Wildtyp-Pflanzen. Die Blütenbildung und Seneszenz der niedrigeren Blätter war bei diesen Pflanzen verzögert, was zu einem grün bleibenden Phänotyp der normalerweise seneszierenden Blätter führte. Pflanzen, die hohe Niveaus des TPP-Gens exprimierten, machten keinerlei Blüten oder abweichende, sich nicht vollständig entwickelnde Blütenknospen, was zu einer Sterilität führte.
  • Einfluss der Expression von TPS und/oder TPP auf das Samensetzen
  • Tabakpflanzen, die für 35S-TPS, PC-TPS, 35S-TPP oder PC-TPP transgen waren, wurden im Gewächshaus kultiviert. Pflanzen, die hohe Niveaus des TPP-Gens exprimierten, zeigten schlechte oder keine Entwicklung von Blüten und eine Abwesenheit von Samensätzen.
  • Einfluss der Expression von TPS und/oder TPP auf die Samenkeimbildung
  • Tabakpflanzen, die für 35S-TPP (pMOG1010) oder PC-TPP transgen waren, wurden im Gewächshaus gezüchtet. Einige der transgenen Linien mit niedrigen Expressionsniveaus des Transgens blühten und setzten Samen. Bei der Keimung des S1-Samens wurde eine signifikant reduzierte Keimbildungsfrequenz beobachtet (oder es lag gar keine Keimbildung vor), im Vergleich mit einem S1-Samen, abgeleitet von Wildtyp-Pflanzen (Tabelle 12).
  • Tabelle 12 Keimbildung von transgenen 35S-TPP-Samen
    Figure 00610001
  • Einfluss der Expression von TPS und/oder TPP auf den Samenertrag
  • Der Samenertrag wurde für S1-Pflanzen bestimmt, die für pMOG1010-5 transgen waren. Im Durchschnitt ergab pMOG1010-5 4,9 g Samen pro Pflanze (n = 8) im Vergleich mit 7,8 g Samen pro Pflanze (n = 8) für Wildtyp-Pflanzen. Das "1000-Korn"-Gewicht beträgt 0,06 g für die Linie pMOG1010-5 im Vergleich mit 0,08 g für den Wildtyp-Samsun NN. Diese Daten können durch einen reduzierten Export von Kohlenhydrate aus den Quellblättern erklärt werden, was zu einer schlechten Entwicklung von Samen-"Sink"-Gewebe führt.
  • Einfluss der TPS- und TPP-Expression auf die Blattmorphologie
  • Segmente von im Gewächshaus gezüchteten PC-TPS-transgenen, PC-TPP-transgenen und nicht-transgenen Kontroll-Tabakblättern wurden fixiert, in Kunststoff eingebettet und Schnitte wurden hergestellt, um die Zellstrukturen unter Verwendung von Lichtmikroskopie zu studieren. Die Zellstrukturen und Morphologie von Querschnitten der PC-TPP-transgenen Pflanzen waren vergleichbar mit den bei Kontrollpflanzen beobachteten. Querschnitte von PC-TPS-Transgenen zeigten, dass die schwammige Parenchym-Zellschicht aus 7 Schichten von Zellen im Vergleich mit 3 Schichten beim Wildtyp und TPP-transgenen Pflanzen bestand (29). Diese Feststellung stimmt mit unserer Beobachtung überein, dass TPS-transgene Pflanzenlinien dickere und festere Blätter im Vergleich mit TPP- und Kontrollpflanzen bildeten.
  • Beispiel 23
  • Inhibition von Cold-Sweetening durch die Expression von Trehalose-Phosphat-Synthase
  • Transgene Kartoffelpflanzen (Solanum tuberosum cv. Kardal) wurden erzeugt, die das TPS-Gen unter Kontrolle des Kartoffelknollen-spezifischen Patatin-Promotors beherbergten (pMOG845; Beispiel 1). Transgene Pflanzen und Wildtyp-Kontrollpflanzen wurden im Gewächshaus gezüchtet und die Knollen geerntet. Proben des Knollenmaterials wurden für eine Zuckeranalyse direkt nach der Ernte genommen und nach 6 Monaten einer Lagerung bei 4°C. Daten, die sich aus der HPLC-PED-Analyse ergaben, sind in 30 dargestellt.
  • Was deutlich gezeigt ist, ist, dass Kartoffelpflanzen, die für TPSE.coli transgen sind, eine niedrigere Menge an Gesamtzucker (Glukose, Fruktose und Saccharose) aufweisen, die sich in den Knollen direkt nach der Ernte anhäufen. Nach einer Lagerperiode von 6 Monaten bei 4°C ist der Anstieg der löslichen Zucker signifikant geringer bei den transgenen Linien als bei den Wildtyp-Kontrollinien.
  • Beispiel 24
  • Verbesserte Leistung von 35S-TPS 35S-TPP (pMOG851) transgenen Tabakpflanzen unter Dürrebedingungen
  • Transgene Tabakpflanzen wurden erzeugt, die sowohl das TPS- als auch das TPP-Gen von E. coli unter Kontrolle des 35S-CaMV-Promotors beherbergten. Die Expression der TPS- und TPP-Gene wurde in den erhaltenen Linien unter Verwendung von Northern-Blot und Enzymaktivitätsmessungen verifiziert. Es wurde gezeigt, dass pMOG851-2 0,008 mg Trehalose/g–1 Frischgewicht anhäufte und pMOG851-5 0,09 mg Trehalose/g–1 Frischgewicht anhäufte. Die Expression beider Gene hatte eine ausgeprägte Wirkung auf die Pflanzenmorphologie und die Wachstumsleistung unter Dürrestress. Wenn sie unter Dürrestressbedingungen gezüchtet wurde, die durch Limitierung der Wasserzufuhr erzeugt wurden, ergaben die beiden getesteten transgenen Tabaklinien pMOG851-2 und pMOG851-5 Gesamt-Trockengewichte, die 28% (P < 0,01) und 39% (P < 0,001) höher waren als diejenigen von Wildtyp-Tabak. Diese Anstiege im Trockengewicht waren im wesentlichen auf eine erhöhte Blattproduktion zurückzuführen: Das Blatt-Trockengewicht war bis zu 85% höher bei pMOG851-5 transgenen Pflanzen. Es wurden keine signifikanten Unterschiede unter wohl gewässerten Bedingungen beobachtet.
  • Dürrestress-Experimente
  • F1-Saatmaterial, erhalten von einer Selbstbestäubung von primären Transformanten pMOG851-2 und pMOG851-5 (Goddijn et al. (1997) Plant Physiol. 113, 181) wurden in dieser Untersuchung verwendet. Die Saatmaterialien wurden 10 Minuten in 20% Haushaltsbleiche sterilisiert, fünfmal in sterilem Wasser gespült und auf einem Halbstärke-Murashige- und Skoog-Medium ausgesät, enthaltend 10 g/l Saccharose und 100 mg/l Kanamycin. Wildtyp-SR1-Samen wurden auf Platten ohne Kanamycin ausgesät. Nach zwei Wochen wurden Sämlinge von allen Linien in Erde übertragen (sandiger Lehm) und in einer Wachstumskammer bei 22°C bei ungefähr 100 μE m–2 Lichtintensität, 14 Stunden pro Tag, gezüchtet. Alle Pflanzen wurden in gleichen Mengen Erde gezüchtet, in 3,8 l Töpfen. Die Pflanzen wurden täglich mit halbstarker Hoagland's-Nährlösung gewässert. Die Sämlinge von pMOG851-2 und pMOG851-5 wuchsen etwas langsamer als die Wildtyp-Sämlinge. Da wir es als besonders wichtig ansahen, die Experimente in gleichen Entwicklungsstufen zu beginnen, initiierten wir die Dürrestress-Behandlungen bei jeder Linie, wenn die Sämlinge eine gleiche Höhe (10 cm) hatten, in einem gleichen Entwicklungszustand (4-blättrig) und mit einem gleichen Trockengewicht (wie aus zwei zusätzlichen Pflanzen von jeder Linie gemessen). Dies bedeutet, dass der Beginn der pMOG851-2-Behandlung zwei Tage später lag als beim Wildtyp und der von pMOG851-5 sieben Tage später als beim Wildtyp. Für jede Linie wurden sechs Pflanzen einem Dürrestress unterzogen, während vier als Kontrollen unter wohl gewässerten Bedingungen gehalten wurden. Die Wildtyp-Tabakpflanzen wurden einer Dürre ausgesetzt, indem sie um den Verwelkpunkt herum gehalten wurden: Wenn die untere Hälfte der Blätter verwelkte, wurde den Pflanzen so viel Nährlösung gegeben, dass die Pflanzen temporär ihren Turgor wieder erhielten. In der Praxis bedeutete dies die Zufuhr von 50 ml Nährlösung alle drei Tage; die Kontrollpflanzen wurden täglich gewässert, um sie in Feldkapazität zu erhalten. Die pMOG851-2- und pMOG851-5-Pflanzen wurden dann auf exakt dieselbe Weise wie der Wildtyp gewässert, d.h. sie wurden mit gleichen Mengen Nährlösung und nach gleichen Zeitintervallen wie beim Wildtyp versorgt. Die Stammhöhe wurde regulär während der gesamten Studieperiode gemessen. Alle Pflanzen wurden am selben Tag (32 Tage nach Beginn der Behandlung für die Wildtyp-Pflanzen) geerntet, da die Ernte der transgenen Pflanzen in einer späteren Stufe den Vergleich erschweren würde. Zum Zeitpunkt der Ernte wurde der Gesamt-Blattbereich unter Verwendung ei nes Delta-T-Devices leaf area meters (Santa Clara, CA) gemessen. Zusätzlich wurden Frischgewicht und Trockengewicht der Blätter, Stämme und Wurzeln bestimmt.
  • Ein zweites Experiment wurde im wesentlichen auf dieselbe Weise durchgeführt, um das Osmosepotenzial der Pflanzen zu analysieren. Nach 35 Tagen Dürrestress wurden Proben von den jüngsten reifen Blättern zu Beginn der Lichtperiode (n = 3) genommen.
  • Lufttrocknen der abgelösten Blätter
  • Der Wasserverlust aus luftgetrockneten abgelösten Blättern wurde für wohl gewässerte, vier Wochen alte pMOG851-2-, pMOG851-5- und Wildtyp-Pflanzen gemessen. Pro Pflanzenlinie wurden fünf Pflanzen verwendet und von jeder Pflanze wurden die zwei jüngsten reifen Blätter abgelöst und bei 25% relativer Feuchtigkeit an der Luft getrocknet. Das Frischgewicht von jedem Blatt wurde über 32 Stunden gemessen. Zur Zeit des Experiments wurden Proben von vergleichbaren wohlgewässerten Blättern für Osmosepotenzial-Messungen und zur Bestimmung des löslichen Zuckergehalts genommen.
  • Osmosepotenzial-Messungen
  • Blattproben für die Osmosepotenzial-Analyse wurden direkt in mit Deckel versehenen 1 ml-Spritzen gelagert und auf Trockeneis eingefroren. Direkt vor der Analyse wurde der Blattsaft in ein kleines Gefäß gedrückt, vermischt und verwendet, um eine Papierscheibe zu sättigen. Das Osmosepotenzial wurde dann in Wescor C52-Kammern bestimmt, wobei ein Wescor HR-33T-Taupunkt-Mikrovolt-Messgerät verwendet wurde.
  • Chlorophyll-Fluoreszenz
  • Die Chlorophyll-Fluoreszenz der Wildtyp-, pMOG851-2- und pMOG851-5-Pflanzen wurden für jede Pflanzenlinie nach 20 Tagen Dürrebehandlung gemessen, wobei ein Pulsmodulations (PAM) -Fluorometer verwendet wurde (Walz, Effeltrich, Deutschland). Vor den Messungen ließ man die Pflanzen zwei Stunden im Dunkeln, gefolgt von einer einstündigen Lichtperiode. Darauffolgend wurde das jüngste reife Blatt für 20 Minuten ans Dunkle adaptiert. Zu Beginn jeder Messung wurde ein kleiner (0,05 μmol m–2s–1, moduliert bei 1,6 KHz) Messlichtstrahl angeschaltet und das minimale Fluoreszenzniveau (F0) gemessen. Das maximale Fluoreszenzniveau (Fm) wurde dann gemessen, indem ein Sättigungslichtpuls von 4000 μmol m–2s–1, mit einer Dauer von 800 ms angelegt wurde. Nach weiteren 20 Sekunden, wenn sich das Signal nahe F0 entspannte, wurden kurze Sättigungspulse von Aktinlicht (800 ms Länge, 4000 μmol m–2s–1) wiederholt für 30 Sekunden mit 2sekündigen dunklen Intervallen gegeben. Die photochemischen (qQ) und nicht-photochemischen (qE) Quenchkomponenten wurden aus der Fluoreszenz/Zeitkurve gemäß Bolhar-Nordenkampf und Oquist (1993) bestimmt. Zum Zeitpunkt der Messung waren die fraglichen Blätter nicht sichtbar verwelkt. Statistische Daten wurden durch eine Einwegeanalyse der Varianz unter Verwendung des Programms Number Cruncher Statistical System (Dr. J. L. Hintze, 865 East 400 North, Kaysville, Utah 84037, USA) erhalten.
  • Eine Chlorophyll-Fluoreszenz-Analyse von Dürrestress ausgesetzten Pflanzen zeigte ein höheres photochemisches Quenching (qQ) und ein höheres Verhältnis einer variablen Fluoreszenz über die Maximal-Fluoreszenz (Fv/Fm) bei pMOG851-5, was eine effizienter arbeitende photosynthetische Maschinerie anzeigte (Tabelle 13).
  • Tabelle 13
  • Chlorophyll-Fluoreszenzparameter von Wildtyp (wt) und Trehalose anhäufenden (pMOG851-2, pMOG851-5) transgenen Tabakpflanzen. P (Wahrscheinlichkeits) -Werte wurden von ANOVA-Tests erhalten, die Unterschiede pro Pflanzenlinie zwischen Pflanzen analysierten, gezüchtet unter wohl gewässerten (Kontrolle) oder Trocken-Bedingungen, wie auch Unterschiede zwischen jeder der transgenen Linien und dem Wildtyp, gezüchtet unter wohl bewässerten oder trockenen Bedingungen. Fm: maximale Fluoreszenz; Fv: variable Fluoreszenz (Fm–F0): qQ: photochemisches Quenching: qE: nicht-photochemisches Quenching. Fm, Fv sind in willkürlichen Einheiten ausgedrückt (Chart mm).
  • Figure 00650001
  • Kohlenhydratanalyse
  • Zum Zeitpunkt der Ernte enthielten pMOG851-5-Pflanzen 0,2 mg·g–1 Trockengewicht Trehalose, während in pMOG851-2 und im Wildtyp die Trehaloseniveaus unterhalb der Nachweisgrenze lagen, sowohl unter Stress- als auch Nicht-Stress-Bedingungen. Der Trehalosegehalt bei den pMOG851-5-Pflanzen war vergleichbar bei gestressten und nicht gestressten Pflanzen (0,19 bzw. 0,20 mg·g–1 Trockengewicht). Unter gut gewässerten Bedingungen waren die Niveaus an Glukose und Fruktose bei pMOG851-5-Pflanzen zweimal höher als beim Wildtyp. Die Blätter von gestressten pMOG851-5-Pflanzen enthielten ungefähr dreifach höhere Niveaus von jedem der vier Nicht-Struktur-Kohlenhydrate Stärke, Saccharose, Glukose und Fruktose als Blätter von gestressten Wildtyp-Pflanzen. In den pMOG851-2-Blättern unterschieden sich die Kohlenhydratniveaus, wie die Chlorophyll-Fluoreszenzwerte nicht signifikant von denjenigen des Wildtyps. Gestresste Pflanzen aller Linien enthielten erhöhte Niveaus an Glukose und Fruktose im Vergleich mit nicht gestressten Pflanzen.
  • Osmotisches Potenzial von dürregestressten und Kontrollpflanzen
  • Während eines zweiten ähnlichen Experiments unter Gewächshausbedingungen zeigten die transgenen Pflanzen dieselben Phänotypen wie oben beschrieben und wiederum zeigten die pMOG851-5-Pflanzen eine sehr viel geringere Reduktion des Wachstums unter Dürrestress als die pMOG851-2- und Wildtyp-Pflanzen. Das Osmosepotenzial in den Blättern von mit Dürre gestressten pMOG851-5-Pflanzen (–1,77 ± 0,39 Mpa) was signifikant niedriger (P = 0,017) als bei Wildtyp-Blättern (–1,00 ± 0,08 Mpa); pMOG851-2 zeigte intermediäre Werte (–1,12 ± 0,05 Mpa). Ähnlich war unter gut gewässerten Bedingungen das osmotische Potenzial von pMOG851-5-Pflanzen (–0,79 ± 0,05 Mpa) signifikant niedriger (P = 0,038) als dasjenige der Wildtyp-Blätter (–0,62 ± 0,03 Mpa), wobei pMOG851-2 intermediäre Werte aufwies (–0,70 ± 0,01 Mpa).
  • Lufttrocknen abgelöster Blätter
  • Die Blätter von pMOG851-2, pMOG851-5 und dem Wildtyp wurden abgelöst und ihr Frischgewicht wurde über 32 Stunden unter Lufttrocknen gemessen. Die Blätter von pMOG851-2- und pMOG851-5-Pflanzen verloren signifikant weniger Wasser (P < 0,05) als Wildtyp-Blätter: nach 32 Stunden hatten die Blätter von pMOG851-5 und pMOG851-2 44% bzw. 41% ihres Frischgewichts beibehalten im Vergleich zu 30% für den Wildtyp. Zum Zeitpunkt des Experiments wurden Proben aus vergleichbaren, gut gewässerten Blättern für eine Osmosepotenzialbestimmung und Analyse von Trehalose, Saccharose, Glukose und Fruktose genommen. Die beiden transgenen Linien hatten niedrigere osmoti sche Potenziale als der Wildtyp (P < 0,05), wobei pMOG851-5 das niedrigste Wasserpotenzial aufwies (–0,63 ± 0,03 MPa), der Wildtyp das höchste (–0,51 ± 0,02 MPa) und pMOG851-2 dazwischen lag (–0,57 ± 0,04 MPa). Die Niveaus aller getesteten Zucker waren signifikant höher in den Blättern von pMOG851-5-Pflanzen als für Wildtyp-Blätter, was zu einem dreifach höheren Niveau der vier kombinierten Zucker führte (P = 0,002). pMOG851-2-Pflanzen enthielten zweifach höhere Niveaus der vier Zucker kombiniert (P = 0,09). Die Trehaloseniveaus betrugen 0,24 ± 0,02 mg·g–1 Trockengewicht bei pMOG851-5-Pflanzen und lagen unterhalb der Nachweisgrenze bei pMOG851-2 und dem Wildtyp.
  • Beispiel 25
  • Leistung von TPS- und TPP-transgenen Kopfsalatpflanzenlinien unter Dürrestress
  • Primäre TPS- und TPP-Transformanten und Wildtyp-Kontroll-Pflanzen wurden einem Dürrestress unterzogen. Linien, die für TPP transgen waren, erreichten ihren Verwelkpunkt zunächst, dann die Kontrollpflanzen, gefolgt von TPS-transgenen Pflanzen, was anzeigte, dass TPS-transgene Linien, wie bei anderen Pflanzenarten beobachtet, einen deutlichen Vorteil gegenüber den TPP- und Wildtyp-Pflanzen während Dürrestress aufweisen.
  • Beispiel 26
  • Samenbildung von Kopfsalatpflanzen wird bei Pflanzen beeinflusst, die für PC-TPS oder PC-TPP transgen sind
  • Die Samenbildung des Kopfsalats ist bei Pflanzen reduziert, die für PC-TPP transgen sind (Tabelle 14). Pflanzenlinien, die für PC-TPS transgen sind, zeigen eine erhöhte Samenbildung im Vergleich mit Wildtyp-Kopfsalatpflanzen.
  • Tabelle 14 Samenbildung von Kopfsalatpflanzen
    Figure 00680001
  • Beispiel 27
  • Leistung von Tomatenpflanzen, die für TPS und TPP transgen sind
  • Die Konstrukte, die bei den Tomaten-Transformationsexperimenten verwendet wurden, waren die folgenden: 35S-TPP, PC-TPS, PC-TPS as-Trehalase, PC-TPP, E8-TPS, E8-TPP, E8 TPS E8 as-Trehalase. Pflanzen, die für das TPP-Gen transgen waren, angetrieben durch den Plastocyanin-Promotor und den 35S-Promotor zeigten Phänotypen die ähnlich waren wie diejenigen, die bei anderen Pflanzen beobachtet wurden: Bleichen der Blätter, reduzierte Bildung von Blüten oder keine Blütenbildung, was zu kleinen Früchten oder einer Abwesenheit von Früchten führte. Eine geringe Zahl der 35S-TPP-transgenen Linien erzeugten extrem große Früchte. Diese Früchte zeigten ein erhöhtes Auswachsen des Pericarps. Pflanzen, die für das TPS-Gen transgen waren, angetrieben durch den Plastocyanin-Promotor und den 35S-Promotor bildeten keine kleinen lanzettförmigen Blätter. Einige stark beeinträchtigte Pflanzen bildeten einige kleine dunkelgrüne Blätter. Pflanzen, die für PC-TPS und PC-as-Trehalase transgen waren, bildeten kleinere und dunklere grüne Blätter als die Kontrollpflanzen.
  • Die Farbe und Blattkante der 35S- oder PC-angetriebenen TPS- und TPP-transgenen Pflanzen waren deutlich unterscheidbar ähnlich zu den bei anderen Ernten beobachteten.
  • Pflanzen, die das TPS- und TPP-Gen unter der Kontrolle des fruchtspezifischen E8-Promotors beherbergten, zeigten keine phänotypischen Unterschiede zu den Wildtyp-Früchten. Pflanzen, die für E8 TPS E8 as-Trehalase transgen waren, erzeugten abweichende Früchte mit gelber Haut und unvollständiger Reifung.
  • Beispiel 28
  • Leistung von Kartoffelpflanzen, die für as-Trehalase und/oder TPS transgen sind
  • Konstrukte: 35S as-Trehalase (pMOG1027) und 35S as-Trehalase Pat TPS (pMOG1027(845-11/22/28).
  • Pflanzen, die simultan 35S as-Trehalase und pat-TPS exprimierten, wurden durch Retransformation von pat-TPS-Linien (resistent gegen Kanamycin) mit dem Konstrukt pMOG1027 erzeugt, beherbergend das 35S as-Trehalase-Konstrukt und ein Hygromycin-Resistenz-Markergen, was zu den Genotypen pMOG1027(845-11), pMOG1027(845-22) und pMOG1027(845-28) führte. Mikroknollen wurden in vitro induziert und das Frischgewicht der Mikroknollen wurde bestimmt. Der durchschnittliche Frischgewichtertrag war für transgene Linien erhöht, die pMOG1027 (pMOG845-11/22/28) beherbergten. Die Frischgewicht-Biomasse von Mikroknollen, erhalten aus Linien, die für pMOG1027 transgen waren, war nur leicht höher als bei den Wildtyp-Kontroll-Pflanzen. Die resultierenden Pflanzen wurden in einem Gewächshaus gezüchtet und der Knollenertrag wurde bestimmt (33). Linien, die für 35S as-Trehalase oder eine Kombination von 35S as-Trehalase und pat-TPS transgen waren, ergaben signifikant mehr Knollenmasse als Kontrollinien. Die Stärkebestimmung ergab keinen Unterschied im Stärkegehalt von Knollen, erzeugt von Pflanzenlinien mit einem höheren Ertrag (34). Eine große Zahl der 1027(845-11/22/28) Linien erzeugte Knollen oberhalb der Erde aus den Axillärknospen der Blätter, was einen erheblichen Einfluss der bei der Pflanzenentwicklung verwendeten Konstrukte anzeigte. Pflanzenlinien, die ausschließlich für 35S as-Trehalase transgen waren, bildeten keine Knollen oberhalb der Erde.
  • Konstrukte: Pat as-Trehalase (pMOG1028) und Pat as-Trehalase Pat TPS (pMOG1028(845-11/22/28))
  • Pflanzen, die simultan Pat as-Trehalase und Pat-TPS exprimierten, wurden durch Retransformation von Pat-TPS-Linien (resistent gegen Kanamycin) mit dem Konstrukt pMOG1028 erzeugt, beherbergend das Pat as-Trehalase-Konstrukt und ein Hygromycin-Resistenz-Markergen, was zu den Genotypen pMOG1028(845-11), pMOG1028(845-22) und pMOG1028(845-28) führte. Die Pflanzen wurden im Gewächshaus gezüchtet und der Knollenertrag wurde bestimmt (35). Eine Anzahl von pMOG1028 transgenen Linien ergab signifikant mehr Knollenmasse als die Kontrollinien. Individuelle Pflanzen, die für sowohl Pat TPS als auch Pat as-Trehalase transgen waren, zeigten einen vari ierenden Knollenertrag von fast keinem Ertrag bis zu einem Ertrag, der mit dem der Kontrolllinien vergleichbar war oder höher lag (35).
  • Konstrukt: PC as-Trehalase (pMOG1092)
  • Pflanzen, die für pMOG1092 transgen waren, wurden im Gewächshaus gezüchtet und der Knollenertrag wurde bestimmt. Etliche Linien bildeten dunkelgrünere Blätter als die Kontrollen. Der Knollenertrag war im Vergleich zu den nicht-transgenen Pflanzen signifikant erhöht (36).
  • Konstrukt: PC as-Trehalase PC-TPS (pMOG1130)
  • Pflanzen, die für pMOG 1130 transgen waren, wurden im Gewächshaus gezüchtet und der Knollenertrag wurde bestimmt. Etliche transgene Linien entwickelten kleine dunkelgrüne Blätter und ein deutlich beeinträchtigtes Wachstum was anzeigte, dass die phänotypischen Wirkungen, die beobachtet werden, wenn Pflanzen mit TPS transformiert werden, deutlicher ausgeprägt sind, wenn das as-Trehalase-Gen simultan exprimiert wird (siehe Beispiel 21). Der Knollenmassenertrag variierte zwischen fast keinem Ertrag bis zu signifikant höherem Ertrag als bei den Kontrollpflanzen (37).
  • Beispiel 29
  • Überexpression einer Kartoffel-Trehalase-cDNA in N. tabacum Konstrukt: de35S CaMV Trehalase (pMOG1078)
  • Primäre Tabak-Transformanten, die für pMOG1078 transgen waren, zeigten einen anderen Phänotyp als Wildtyp-Tabak, einige Transgene hatten eine dunkelgrüne Blattfarbe und ein dickeres Blatt (die Morphologie des Blatts ist nicht lanzettförmig), was einen Einfluss der Trehalase-Gen-Expression auf den Pflanzen-Stoffwechsel anzeigte. Samen von selbst befruchteten primären Transformanten wurden ausgesät und auf Kanamycin selektiert. Der Phänotyp zeigte eine Mendel-Aufteilung in der S1-Generation.
  • Hinterlegungen
  • Die folgenden Hinterlegungen wurden unter dem Budapester Vertrag gemacht. Die Klone wurden im Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, P.O. Box 273, 3740 AG Baarn, Niederlande, am 21. April 1997 hinterlegt und erhielten die folgenden Nummern: Escherichia coli
    DH5alpha/pMOG1192 CBS 692.97
    DH5alpha/pMOG1240 CBS 693.97
    DH5alpha/pMOG1241 CBS 694.97
    DH5alpha/pMOG1242 CBS 695.97
    DH5alpha/pMCG1243 CBS 696.97
    DH5alpha/pMOG1244 CBS 697.97
    DH5alpha/pMOG1245 CBS 698.97
    Hinterlegte Klone:
    pMOG1192 beherbergt die Helianthus annuus TPS/TPP Bipartit-cDNA, inseriert in den Multi-Kopie-Vektor pGEM-T (Promega).
    pMOC1240 beherbergt das Tabak TPS "825" bp cDNA-Fragment, inseriert in pCRscript (Stratagene).
    pMOG1241 beherbergt das Tabak TPS "840" bp cDNA-Fragment, inseriert in pGEM-T (Promega).
    pMOG1242 beherbergt das Tabak TPS "630" bp cDNA-Fragment, inseriert in pGEM-T (Promega).
    pMOG1243 beherbergt das Tabak TPP "543" bp cDNA-Fragment, inseriert in pGEM-T (Promega).
    pMOG1244 beherbergt das Tabak TPP "723" bp cDNA-Fragment, inseriert in ein pUC18-Plasmid.
    pMOG1245 beherbergt das Tabak TPP "447"bp-Fragment, inseriert in pGEM-T (Promega).
    Liste relevanter pMOG###- und pVDH###-Klone 1. Binäre Vektoren
    pMOG23 Binärer Vektor (ca. 10 KB), beherbert den NPTII-Selektionsmarker
    pMOG22 Derivat von pMOG23, das NPTII-Gen wurde durch das HPT-Gen ersetzt, das eine Resistenz gegenüber Hygromycin verleiht.
    pVDH 275 Binärer Vektor, abgeleitet von pMOG23, beherbergt eine Plastocyanin-Promotor-nos-Terminator-Expressions-Kassette.
    pMOG402 Derivat von pMOG23, eine Punkt-Mutation in dem NPTII-Gen wurde wiederhergestellt, es liegt keine KpnI-Restriktionsstelle im Polylinker vor.
    pMOG800 Derivat von pMOG402 mit wiederhergestellter KpnI-Stelle im Polylinker.
    2. TPS/TPP-Expressionskonstrukte
    pMOG 799 35S-TPS-3'nos pMOG 810 Idem mit Hyg-Marker
    pMOG 845 Pat-TPS-3'PotPiII pMOG 925 Idem mit Hyg-Marker
    pMOG 851 35S-TPS-3'nos 35S-TPP(atg)
    pMOG 1010 de35S CaMV amv leader TPP(gtg) PotPiII pMOG 1142 Idem mit Hyg-Marker
    pMOG 1093 Plastocyanin-TPS-3'nos pMOG 1129 Idem mit Hyg-Marker
    pMOG 1177 Plastocyanin-TPS-3'PotPiII 3'nos
    pVDH 318 Identisch zu pMOG1177 Funktionell identisch zu pMOG1093
    pMOG 1124 Plastocyanin-TPP(gtg) 3'PotPiII 3'nos
    pVDH 321 Identisch zu pMOG1124
    pMOG 1128 Patatin TPP(gtg) 3'PotPiII
    pMOG 1140 E8-TPS-3'nos
    pMOG 1141 E8-TPP(gtg)-3'PotPiII
    3. Trehalase-Konstrukte
    pMOG 1028 Patatin as-Trehalase 3'POtPiII, Hygromycin-Resistenzmarker
    pMOG 1078 de35S CaMV amv leader-Trehalase 3'nos
    pMOG 1090 de35S CaMV amv leader as-Trehalase 3'nos pMOG 1027 Idem mit Hyg-Marker
    pMOG 1092 Plastocyanin-as-Trehalase-3'nos
    pMOG 1130 Plastocyanin-as-Trehalase-3'nos Plastocyanin-TPS-3'nos
    pMOG 1153 E8-TPS-3'nos E8-as-Trehalase-3'PotPiII
    • 1 Alle Konstrukte beherbergen den NPTII-Selektionsmarker, wenn nicht anders angegeben.
    • 2 Zwei Arten von TPP-Konstrukten wurden verwendet, wie beschrieben in Goddijn et al. (1997) Plant Physiol. 113, 181.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00730001
  • Figure 00740001
  • Figure 00750001
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  • Figure 01340001
  • Figure 01350001

Claims (54)

  1. Verfahren für die Stimulation des Kohlenstoffflusses in glykolytischer Richtung in einer Pflanzenzelle durch Verminderung der intrazellulären Verfügbarkeit von Trehalose-6-phosphat.
  2. Verfahren für die Inhibition des Kohlenstoffflusses in glykolytischer Richtung in einer Pflanzenzelle durch Erhöhung der intrazellulären Verfügbarkeit von Trehalose-6-phosphat.
  3. Verfahren zur Inhibition der Fotosynthese in einer Zelle durch Verminderung der intrazellulären Verfügbarkeit von Trehalose-6-phosphat.
  4. Verfahren für die Stimulation der Fotosynthese in einer Zelle durch Erhöhung der intrazellulären Verfügbarkeit von Trehalose-6-phosphat.
  5. Verfahren für die Stimulation der Sink-bezogenen Aktivität durch Erhöhung der intrazellulären Verfügbarkeit von Trehalose-6-phosphat.
  6. Verfahren für die Stimulation des Wachstums einer Pflanzenzelle oder eines Gewebes durch Verminderung der intrazellulären Verfügbarkeit von Trehalose-6-phosphat.
  7. Verfahren zur Erhöhung des Stoffwechsels von Pflanzenzellen durch Verminderung der intrazellulären Verfügbarkeit von Trehalose-6-phosphat.
  8. Verfahren zur Erhöhung des Ertrags von Pflanzen durch Erhöhung der intrazellulären Verfügbarkeit von Trehalose-6-phosphat.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 1, 3, 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Verminderung der intrazellulären Konzentration von Trehalose-6-phosphat durch einen Anstieg der Trehalose-Phosphat-Phosphatase (TPP) -Aktivität bewirkt wird.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Anstieg der TPP-Aktivität durch Transformation der Zellen mit einem Vektor oder einem Genkonstrukt, (der) das das Enzym TPP exprimieren kann, bewirkt wird.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen mit einem Vektor oder einem Genkonstrukt transformiert werden, umfassend ein heterologes Gen, das TPP kodiert.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 1, 3, 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Verminderung der intrazellulären Konzentration von Trehalose-6- phosphat durch eine Verminderung der Trehalose-Phosphat-Synthase (TPS) -Aktivität bewirkt wird.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Verminderung der TPS-Aktivität durch Transformation der Zellen mit einem Vektor oder Genkonstrukt bewirkt wird, (der) das ein Molekül exprimieren kann, das TPS inhibiert.
  14. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor oder das Genkonstrukt das Anti-Sinn-Gen von TPS umfasst.
  15. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Verminderung auf eine Mutation des endogenen TPP-Enzyms zurückzuführen ist.
  16. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Verminderung von Trehalose-6-phosphat durch eine relative Überexpression einer Phospho-α-(1,1)-glucosidase bewirkt wird.
  17. Verfahren gemäß Anspruch 2, 4, 5 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Erhöhung der intrazellulären Konzentration von Trehalose-6-phosphat durch eine Erhöhung der TPS-Aktivität bewirkt wird.
  18. Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Erhöhung entweder auf eine Mutation des endogenen TPS-Enzyms zurückzuführen ist oder dass der Anstieg der TPS-Aktivität durch Transformation der Zellen mit einem Vektor oder einem Genkonstrukt erreicht wird, (der) das das Enzym TPS exprimieren kann.
  19. Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen mit einem Vektor oder einem Genkonstrukt transformiert werden, umfassend ein heterologes Gen, das TPS kodiert.
  20. Verfahren gemäß Anspruch 2, 4, 5 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Anstieg der intrazellulären Konzentration von Trehalose-6-phosphat durch eine Verminderung der TPP-Aktivität bewirkt wird.
  21. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Verminderung der TPP-Aktivität durch Transformation der Zellen mit einem Vektor oder einem Genkonstrukt bewirkt wird, (der) das ein Molekül exprimieren kann, das TPP inhibiert.
  22. Verfahren gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor oder das Genkonstrukt das Anti-Sinn-Gen von TPP umfasst.
  23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle oder Zellen in einer Pflanze lokalisiert (ist) sind.
  24. Verfahren gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze eine transgene Pflanze ist.
  25. Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die transgene Pflanze durch Transformation mit Agrobacterium tumefaciens erzeugt wird.
  26. Klonierungsvektor, der ein Anti-Sinn-Gen für TPS umfasst, das bei Expression in einer Pflanzenzelle eine funktionale Aktivität des endogenen TPS-Gens der Pflanzenzelle verhindern kann.
  27. Klonierungsvektor, der ein Anti-Sinn-Gen für TPP umfasst, das bei Expression in einer Pflanzenzelle die funktionale Aktivität des endogenen TPP-Gens der Pflanzenzelle verhindern kann.
  28. Pflanze, dadurch gekennzeichnet, dass sie selbst oder einer ihrer Vorfahren mit einem Vektor oder einem Genkonstrukt transformiert ist, umfassend die Nukleotidsequenz, die für ein Anti-Sinn-Gen von TPP kodiert, wobei die Pflanze die Nukleotidsequenz immer noch enthält.
  29. Pflanze, dadurch gekennzeichnet, dass sie selbst oder einer ihrer Vorfahren mit einem Vektor oder einem Genkonstrukt transformiert ist, umfassend die Nukleotidsequenz, die für ein Anti-Sinn-Gen von TPS kodiert, wobei die Pflanze die Nukleotidsequenz immer noch enthält.
  30. Verwendung von Trehalose-6-phosphat zur Beeinflussung der Kohlenhydratverteilung in Pflanzenzellen.
  31. Verwendung von Trehalose-6-phosphat für eine Erhöhung der Biomasse.
  32. Verwendung von Trehalose-6-phosphat zur Beeinflussung der in vivo-Hexokinase-Aktivität bei Pflanzenzellen.
  33. Verwendung von Trehalose-6-phosphat zur Beeinflussung der in vivo-Hexokinase-Signalfunktion in Pflanzenzellen.
  34. Verwendung von Trehalose-6-phosphat zur Beeinflussung der Zellwandsynthese.
  35. Verfahren zur Verhinderung von Cold-Sweetening durch Erhöhung der intrazellulären Verfügbarkeit von Trehalose-6-phosphat.
  36. Verfahren für die Inhibition einer Invertase bei Rüben nach der Ernte durch Erhöhung der intrazellulären Verfügbarkeit von Trehalose-6-phosphat.
  37. Verfahren gemäß Anspruch 35 oder 36, dadurch gekennzeichnet, dass der Anstieg der intrazellulären Verfügbarkeit von T-6-P sich aus dem Anstieg der Trehalose-Phosphat-Synthase-Aktivität ergibt.
  38. Verfahren gemäß Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Regulation der Verfügbarkeit von T-6-P spezifisch in Kartoffelknollen verändert ist, vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass ein Gen, kodierend für Trehalose-Phosphat-Synthase spezifisch in den Knollen exprimiert wird, noch bevorzugter, dass das Gen das TPS-Gen aus Escherichia coli ist.
  39. Verfahren gemäß Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Regulation der Verfügbarkeit von T-6-P spezifisch in Rübenpfahlwurzeln verändert ist, vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass ein Gen, kodierend für Trehalose-Phosphat-Synthase spezifisch in den Pfahlwurzeln exprimiert wird.
  40. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression von TPP oder TPS auf ein spezifisches Gewebe begrenzt ist.
  41. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression von TPP oder TPS sich unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors befindet.
  42. Verfahren für die Stimulation des Kohlenstoffflusses in glykolytischer Richtung in einer Pflanzenzelle durch Expression von Trehalose-6-Phosphat-Phosphatase.
  43. Verfahren für die Inhibition des Kohlenstoffflusses in der glykolytischen Richtung in einer Pflanzenzelle durch Expression von Trehalose-6-Phosphat-Synthase.
  44. Verfahren für die Inhibition der Fotosynthese in einer Zelle durch die Expression von Trehalose-6-Phosphat-Phosphatase.
  45. Verfahren für die Stimulation der Fotosynthese in einer Zelle durch die Expression von Trehalose-6-Phosphat-Synthase.
  46. Verfahren für die Stimulation einer Sink-bezogenen Aktivität durch Expression von Trehalose-6-Phosphat-Synthase.
  47. Verfahren für die Stimulation des Wachstums einer Pflanzenzelle oder eines Pflanzengewebes durch Expression von Trehalose-6-Phosphat-Phosphatase.
  48. Verfahren für die Erhöhung des Stoffwechsels von Pflanzenzellen durch Expression von Trehalose-6-Phosphat-Phosphatase.
  49. Verfahren für die Verhinderung von Cold-Sweetening durch Expression von Trehalose-6-Phosphat-Synthase.
  50. Verfahren für die Verhinderung einer vorzeitigen Samenbildung durch Verminderung der intrazellulären Verfügbarkeit von Trehalose-6-phosphat.
  51. Verfahren für die Verhinderung einer vorzeitigen Samenbildung durch Expression von Trehalose-6-Phosphat-Phosphatase.
  52. Verfahren für die Induktion einer vorzeitigen Samenbildung durch Erhöhung der intrazellulären Verfügbarkeit von Trehalose-6-phosphat.
  53. Verfahren für die Induktion einer frühzeitigen Samenbildung durch Expression von Trehalose-6-Phosphat-Synthase.
  54. Verfahren zur Erhöhung des Ertrags von Pflanzen durch Transformation mit einem Enzym, kodierend für Trehalose-6-Phosphat-Phosphatase.
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Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5891717A (en) * 1996-01-19 1999-04-06 Betagene, Inc. Methods and compositions for inhibiting hexokinase
US5854067A (en) * 1996-01-19 1998-12-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Hexokinase inhibitors
IN1997CH00924A (en) * 1996-05-03 2005-03-04 Syngenta Mogen Bv Regulating metabolism by modifying the level of trehalose-6-phosphate
MX205414B (es) * 1996-05-08 2001-12-07 Univ Mexico Nacional Autonoma Metodo para incrementar de trehalosa de los organismos por medio de su transformacion con el adnc de la trehalosa-6-fosfato sintasa/fosfatasa de selaginella lepidophylla.
HUP0002948A3 (en) * 1997-05-02 2002-09-30 Syngenta Mogen Bv Regulating metabolism by modifying the level of trehalose-6-phosphate by inhibiting endogenous trehalase levels
ZA989782B (en) 1997-10-30 1999-05-04 Mogen Int Pre-and postharvest inhibition of remobilisation of storage compounds
WO1999023225A1 (en) * 1997-10-30 1999-05-14 Mogen International N.V. Novel high-fermenting microorganisms
AU2412499A (en) * 1997-10-30 1999-05-31 Mogen International N.V. Novel high-fermenting microorganisms
ZA989886B (en) * 1997-10-30 1999-04-30 Mogen Int Nuclear male sterile plants method of producing same and methods to restore fertility
DE19832334A1 (de) * 1998-07-17 2000-01-20 Norika Nordring Kartoffelzucht Glucosylglycerolphosphatsynthasegene zur Erzeugung der niedermolekularen Schutzsubstanz Glucosylglycerol und ihre Verwendung
EP1002867A1 (de) * 1998-10-15 2000-05-24 K.U. Leuven Research & Development Spezifische genetische Veränderung der Aktivität von Trehalose-6-phosphatsynthase und Expression in einer homologen und heterologen Umgebung
US7612255B2 (en) * 1999-02-03 2009-11-03 Jonathan Gressel Transgenic plants for mitigating introgression of genetically engineered genetic traits
ATE295880T1 (de) * 1999-09-01 2005-06-15 Monsanto Technology Llc Pflanzen -promotersequenzen aus mais, die selektiv die genexpression kontrollieren
BR0108825A (pt) * 2000-03-01 2002-12-10 Res & Dev I Inc Plantas transgênicas com produção de semente, biomassa e ìndice de colheita aumentados
GB0100105D0 (en) * 2001-01-04 2001-02-14 Leuven K U Res & Dev The use of plant TPS (Trehalose-6-phosphate syntase) as a selectable marker for plant transformation
DK1373488T3 (da) 2001-03-14 2009-08-17 Univ Florida Varmestabile mutanter af ezymer fra stivelsesbiosyntese
US8022272B2 (en) 2001-07-13 2011-09-20 Sungene Gmbh & Co. Kgaa Expression cassettes for transgenic expression of nucleic acids
ES2343313T3 (es) 2001-12-03 2010-07-28 University Of Florida Research Foundation, Inc. Variantes de la adp-glucosa pirofosforilasa que afectan a la sensibilidad al fosfato y otros parametros.
KR100440725B1 (ko) * 2002-06-20 2004-07-15 주식회사 그린진 바이오텍 비생물성 스트레스에 대한 단자엽 식물의 내성을증가시키는 방법
WO2004044143A2 (en) * 2002-11-06 2004-05-27 Cornell Research Foundation, Inc. Tps plant gene constructs and transformants
WO2005016268A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-24 Mitochroma Research, Inc. Alimentary compositions and methods for metabolic modulation
EP2366789A1 (de) * 2004-04-20 2011-09-21 Syngenta Participations AG Regulatorsequenzen zur Expression von Genprodukten in Pflanzenfortpflanzungsgewebe
EP1645633B1 (de) 2004-10-05 2011-09-21 SunGene GmbH Konstitutive Expressionskassette zur Regulierung der Expression in Pflanzen.
EP1655364A3 (de) 2004-11-05 2006-08-02 BASF Plant Science GmbH Expressionskassetten zur bevorzugten Expression in Pflanzensamen
EP1662000B1 (de) 2004-11-25 2011-03-30 SunGene GmbH Expressionskassetten zur bevorzugten Expression in pflanzlichen Schliesszellen
WO2006060376A2 (en) * 2004-12-03 2006-06-08 Syngenta Participations Ag Stress tolerance in plants through selective inhibition of trehalose-6-phosphate phosphatase
EP1666599A3 (de) 2004-12-04 2006-07-12 SunGene GmbH Expressionskassetten zur bevorzugten Expression in Mesophyll- und/oder Epidermiszellen in Pflanzen
EP2163634A1 (de) 2004-12-08 2010-03-17 SunGene GmbH Expressionskassetten zur vaskularen, gewebebevorzugten Expression bei Pflanzen
CN100355883C (zh) * 2004-12-10 2007-12-19 中国科学院上海生命科学研究院 水稻抗逆相关基因－海藻糖－6－磷酸磷酸化酶基因及其应用
EP1669456A3 (de) 2004-12-11 2006-07-12 SunGene GmbH Expressionskasseten für meristembevorzugte Expression in Pflanzen
AU2006203837B2 (en) 2005-01-07 2011-03-10 Cold Spring Harbor Laboratory Nucleotide sequences encoding Ramosa3 and sister of Ramosa3 and methods of use for same
CN102277377A (zh) 2005-02-09 2011-12-14 巴斯福植物科学有限公司 在单子叶植物中调控表达的表达盒
EP1856264B1 (de) 2005-02-26 2014-07-23 BASF Plant Science GmbH Expressionskassetten zur samenbevorzugten expression in pflanzen
CA2599405A1 (en) 2005-03-08 2006-09-14 Basf Plant Science Gmbh Expression enhancing intron sequences
EP1874938B1 (de) 2005-04-19 2012-04-04 BASF Plant Science GmbH Endosperm-spezifische Expression und/oder Expression in keimenden Embryos monokotyledoner Pflanzen
BRPI0608829A2 (pt) 2005-04-19 2011-03-15 Basf Plant Science Gmbh método para a expressão transgênica com especificidade intensificada em uma planta, uso de um construto de ácido nucleico quimérico, seqüência de ribonucleotìdeo quimérica, construto de expressão, vetor de expressão, organismo não-humano ou célula transformada, semente transformada, e, preparação farmacêutica
BRPI0614070A2 (pt) 2005-05-10 2018-07-31 Basf Plant Science Gmbh cassetes de expressão, sequência de nucleotídeos isolada, seqüência sintética reguladora de transcrição, métodos para proporcionar uma seqüência sintética de nucleotídeos reguladora de transcrição, e um cassete de expressão, vetor, organismo não-humano ou célula hospedeira transgênico(a), e, célula de planta ou planta transgênica
US8916748B2 (en) 2005-12-09 2014-12-23 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid molecules encoding polypeptides involved in regulation of sugar and lipid metabolism and methods of use VIII
US8515518B2 (en) * 2005-12-28 2013-08-20 Abbott Diabetes Care Inc. Analyte monitoring
US8160670B2 (en) 2005-12-28 2012-04-17 Abbott Diabetes Care Inc. Analyte monitoring: stabilizer for subcutaneous glucose sensor with incorporated antiglycolytic agent
ATE529522T1 (de) 2006-01-27 2011-11-15 Vib Vzw Verwendung von trehalose-6-phosphat-synthase zur modulation von pflanzenwachstum
CN101374952B (zh) * 2006-01-27 2011-07-06 福拉姆斯大学生物技术研究所 海藻糖-6-磷酸合酶调节植物生长的用途
EP2044204B1 (de) 2006-06-07 2014-04-30 Yissum Research Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. Pflanzliche expressionskonstrukte und verfahren zu deren nutzung
EP1873247A1 (de) * 2006-06-29 2008-01-02 VIB vzw Bifunktionelle Trehalosesynthase
WO2008071767A1 (en) * 2006-12-15 2008-06-19 Cropdesign N.V. Plants having enhanced seed yield-related traits and a method for making the same
ES2544249T3 (es) * 2006-12-15 2015-08-28 Cropdesign N.V. Plantas que tienen rasgos relacionados con un rendimiento de semilla mejorado y un procedimiento de producción de las mismas
US20100115664A1 (en) * 2007-02-08 2010-05-06 Basf Plant Science Gmbh Use of Trehalase Genes to Confer Nematode Resistance to Plants
US20110035840A1 (en) 2007-02-16 2011-02-10 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid sequences for regulation of embryo-specific expression in monocotyledoneous plants
WO2009089185A1 (en) 2008-01-03 2009-07-16 Proterro, Inc. Transgenic photosynthetic microorganisms and photobioreactor
US8367392B2 (en) 2008-09-05 2013-02-05 Transalgae Ltd. Genetic transformation of algal and cyanobacteria cells by microporation
BRPI0913562A2 (pt) * 2008-09-15 2015-08-04 Agriculture Victoria Serv Pty Modificação de biossíntese de frutana, aumentando a biomassa vegetal e intensificando a produtividade de vias bioquímicas em uma planta.
US20100257639A1 (en) * 2009-02-26 2010-10-07 Robert Edward Bruccoleri Methods and compositions for altering sugar beet or root crop storage tissue
CN102575258A (zh) 2009-06-30 2012-07-11 耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展有限公司 将dna引入植物细胞
CN102471777B (zh) 2009-07-10 2014-09-24 巴斯夫植物科学有限公司 用于在植物中胚乳-特异性表达的表达盒
US20120240287A1 (en) 2009-12-03 2012-09-20 Basf Plant Science Company Gmbh Expression Cassettes for Embryo-Specific Expression in Plants
CN102191228A (zh) * 2010-03-12 2011-09-21 北京北方杰士生物科技有限责任公司 来自大肠杆菌合成海藻糖的融合蛋白及其在培育矮化草坪草中的应用
AU2012364909B2 (en) 2011-02-15 2016-11-24 Hemosonics, Llc Characterization of blood hemostasis and oxygen transport parameters
EP2701514B1 (de) * 2011-04-26 2015-06-10 Isis Innovation Limited Änderung der trehalose-6-phosphatebene in pflanzen
US10420822B2 (en) 2011-06-13 2019-09-24 Ziolase, Llc Compositions and methods to prevent and treat biofilms
US20120315260A1 (en) * 2011-06-13 2012-12-13 Svetlana A. Ivanova Compositions and Methods to Prevent and Treat Biofilms
BR112014000580A2 (pt) * 2011-07-15 2017-03-01 Syngenta Participations Ag métodos para aumento da produtividade e tolerância ao estresse em uma planta
CN103975057A (zh) * 2011-09-13 2014-08-06 美国世多乐集团公司 通过施用海藻糖提高作物产量的方法
WO2013067259A2 (en) 2011-11-03 2013-05-10 Syngenta Participations Ag Regulatory nucleic acids and methods of use
US20150040268A1 (en) 2013-04-25 2015-02-05 Morflora Israel Ltd Methods and compositions for the delivery of nucleic acids to seeds
GB201511732D0 (en) 2015-07-03 2015-08-19 Rothamsted Res Ltd Treating water stress in plants
WO2017161091A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Spogen Biotech Inc. Methods for promoting plant health using free enzymes and microorganisms that overexpress enzymes
MY191843A (en) * 2016-11-28 2022-07-18 C Lecta Gmbh Trehalose phosphorylase
GB201621193D0 (en) 2016-12-13 2017-01-25 Rothamsted Res Ltd Induction of floral development in plants
AU2017383678A1 (en) * 2016-12-21 2019-07-18 Institute Of Crop Sciences, The Chinese Academy Of Agricultural Sciences Plant grain trait-related protein, gene, promoter and SNPs and haplotypes
WO2019068800A1 (en) 2017-10-05 2019-04-11 Biogemma IMPROVED YIELD IN PLANTS BY OVEREXPRESSION OF A TRHEHALOSE-6 PHOSPHATE SYNTHASE
CN111567338B (zh) * 2020-05-25 2021-07-06 华东师范大学 一种提高玉米高温胁迫下光合碳同化能力的方法
CN114868760B (zh) * 2022-05-13 2024-01-16 辽宁省农业科学院 6-磷酸-海藻糖的应用及提升普通菜豆产量和抗病性的培育方法

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU644619B2 (en) * 1989-12-21 1993-12-16 Advanced Technologies (Cambridge) Limited Modification of plant metabolism
DE4004800C2 (de) 1990-02-13 2000-12-21 Aventis Cropscience Gmbh Im Habitus und Ertrag veränderte transgene Pflanzen
ATE133198T1 (de) 1990-03-28 1996-02-15 Gist Brocades Nv Neue hefestämme mit erhöhtem trehalosegehalt, verfahren zur gewinnung solcher hefen und verwendung dieser hefen
GB9117159D0 (en) 1991-08-08 1991-09-25 Cambridge Advanced Tech Modification of sucrose accumulation
US6130368A (en) * 1992-02-14 2000-10-10 Btg International Ltd Transgenic plants producing trehalose
US5422254A (en) 1992-02-14 1995-06-06 Oy Alko Ab Method to increase the trehalose content of organisms by transforming them with the structural genes for the short and long chains of yeast trehalose synthase
FI943133A0 (fi) * 1994-06-29 1994-06-29 Alko Ab Oy Transgena vaexter
US6133034A (en) * 1992-05-27 2000-10-17 Calgene, Inc. Methods and compositions related to the production of trehalose
EP0577915A1 (de) * 1992-07-09 1994-01-12 N.V. Algist-Bruggeman Transformierte Hefestämme mit Spannungsbeständigkeit und/oder verbesserten Gärungsverhalten
CZ290830B6 (cs) * 1993-06-30 2002-10-16 Syngenta Mogen B.V. Nukleová kyselina, vektor, mikroorganismus, rostlinný DNA genom, buňka a rostlina, způsob jejího získávání a způsob výroby trehalózy z ní
AU697450B2 (en) * 1994-03-09 1998-10-08 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Processes for inhibiting and for inducing flower formation in plants
DE4444460A1 (de) 1994-11-29 1996-05-30 Inst Genbiologische Forschung Verfahren zur Steigerung des Ertrags sowie zur Veränderung des Blühverhaltens bei Pflanzen
IL116564A0 (en) * 1995-01-04 1996-03-31 Mogen Int Process for producing trehalose in plants
EP0784095A3 (de) * 1996-01-12 1997-12-29 Mogen International N.V. Erhöhte Trehalose Akkumulation in Pflanzen
US5854067A (en) * 1996-01-19 1998-12-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Hexokinase inhibitors
IN1997CH00924A (en) * 1996-05-03 2005-03-04 Syngenta Mogen Bv Regulating metabolism by modifying the level of trehalose-6-phosphate
MX205414B (es) * 1996-05-08 2001-12-07 Univ Mexico Nacional Autonoma Metodo para incrementar de trehalosa de los organismos por medio de su transformacion con el adnc de la trehalosa-6-fosfato sintasa/fosfatasa de selaginella lepidophylla.

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