CZ345098A3 - Regulace metabolismu modifikací hladiny trehalosa-6-fosfátu - Google Patents

Regulace metabolismu modifikací hladiny trehalosa-6-fosfátu Download PDF

Info

Publication number
CZ345098A3
CZ345098A3 CZ19983450A CZ345098A CZ345098A3 CZ 345098 A3 CZ345098 A3 CZ 345098A3 CZ 19983450 A CZ19983450 A CZ 19983450A CZ 345098 A CZ345098 A CZ 345098A CZ 345098 A3 CZ345098 A3 CZ 345098A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
trehalose
tps
phosphate
tpp
gene
Prior art date
Application number
CZ19983450A
Other languages
English (en)
Inventor
Oscar Johannes Maria Goddijn
Jan Pen
Josephus Christianus Maria Smeekens
Maria Theresia Smits
Original Assignee
Mogen International N. V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mogen International N. V. filed Critical Mogen International N. V.
Publication of CZ345098A3 publication Critical patent/CZ345098A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
    • C12N15/8269—Photosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01028—Alpha,alpha-trehalase (3.2.1.28)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Cereal-Derived Products (AREA)

Description

Oblast techniky
Glykolýza byla jedním z prvních biochemických metabolických procesů, popsaných detailně v literatuře. Ačkoliv obecně je tok cukrů v organizmu znám a ačkoliv jsou objasněny všechny enzymy glykolytických cest, signál, který způsobuje indukci metabolismu stimulací glykolýzy nebyl zatím rozluštěn. Bylo navrženo několik hypotéz, založených na základě znalostí kvasinek, ale žádná z nich nebyla prokázána beze vší pochybnosti.
Vliv na řízení rozdělování cukrů neovlivňuje přímo pouze glykolytické buněčné procesy a skladování cukrů, ale může být použit na ovlivnění sekundárních či odvozených procesů jako je buněčné dělení, vytváření biomasy a akumulace zásobních látek, což znamená ovlivnění růstu a produktivity.
Zvláště u rostlin jsou vlastnosti pletiv přímo ovlivněny přítomností cukrů a řízení rozdělování cukrů může přinést obrovské rozdíly.
Růst, vývoj a výnos rostlin závisí na energii, kterou mohou takovéto rostliny získat z fixace C02 během procesu fotosyntézy.
Fotosyntéza probíhá především v listech a v menší míře ve stonku. Ostatní rostlinné orgány jako jsou kořeny, semena nebo hlízy podstatě nepřispívají k fotoasimílačnímu procesu. Tato pletiva jsou ve svém růstu a výživě kompletně závislá na fotosynteticky aktivních orgánech. To poté znamená, že existuje tok produktů odvozených od fotosyntézy (nazývaných obecně fotosyntáty) do fotosynteticky inaktivních částí rostliny. Fotosynteticky aktivní části jsou nazývány zdroji (sourses) a jsou popisovány jako čisti vývozci fotosyntátů.
Předpokládá se, že jak výkonnost fotosyntézy, tak také rozdělení cukrů v rostlinách je pro rostlinu nepostradatelné. Nově se vyvíjející pletiva jako např. mladé listy nebo jiné části rostliny jako kořeny a semena jsou kompletně závislé na fotosyntetických zdrojích. Možnost ovlivnění distribuce cukrů by měla obrovský vliv na fenotyp rostliny - na například její výšku, • ·
vzdálenost internodií, velikost a tvar listů a velikost a strukturu kořenového systému.
Kromě toho má distribuce fotoasimilačních produktů velkou důležitost na výnos rostlinné biomasy a plodů. Příkladem je vývoj pšenice během posledního století. Její fotosyntetická kapacita se nezmělnila nějak výrazně, ale výnos pšeničných zrn vzrostl podstatně. Zvýšil se poměr sklídítelné biomasy ku celkové biomase (sklizňový index). Důvodem v pozadí je skutečnost, že se působením klasického šlechtění změnil poměr sink-source, to znamená poměr zdrojů a pletiv využívajících tyto zdroje. Např. část rostliny , která se dá sklidit- tedy semena, se zvýšila. Mechanismus, který řídí distribuci asimilačních produktů a následně tvorbu sinků a zdrojů je nicméně neznámý. Předpokládá se, že je tento mechanismus lokalizován někde v metabolických cestách cukrů a jejich regulaci.
Z posledních výzkumů vyplývá, že hexokinasy mohou hrát hlavní roli v metabolické signalizaci a kontrole metabolických toků. Bylo postulováno množství mechanismů regulujících aktivitu hexokinas (Graham et al. (1994), The Plant Cell 6: 761; Jang and Sheen (1994), The Plant Cell 6: 1665; Rose et al. (1991) Eur.J.Biochem. 199:511518; Blazquez et al. (1993), FEBS 329:51; Koch (1996), Annu.
Rev.Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47:509; Jang et al. (1997) The Plant Cell 9:5).Jedna z těchto teorií hexokinasové regulace postulovaných v kvasinkách se zmiňuje o trehalose a s ní souvisejících monosacharidech (Thevelein and Hohmann (1995), TIBS 20:3). Je ovšem těžké si představit, že by toto byl univerzální mechanizmus, protože se předpokládá, že syntéza trehalosy je omezena pouze na určité druhy.
Zbývá zde tudíž stále potřeba objasnění signálu, který může řídit modifikaci vývoje a/nebo složení buněk, pletiv a orgánů in v i vo.
Dosavadní stav techniky
Vynález vychází z možnosti modifikace metabolismu in vivo hladinou T-6-P. Pokles intracelulární koncentrace T-6-P stimuluje glykolytickou aktivitu a naopak zvýšení koncentrace T-6-P inhibuje glykolytickou aktivitu a stimuluje fotosyntézu.
• · to ·· · · · · · · · · • · · · · · · · · · · • to ···· « · · · · ··· ···
Tyto modifikace způsobené změnami T-6-P jsou nejpravděpodobněji důsledkem signální funkce hexokinas, jejíchž aktivita, jak bylo ukázáno, je pomocí T-6-P regulována. Zvýšený tok prostřednictvím hexokinas, tj. zvýšeným množstvím glukosy, z které vzniká glukosa-6fosfát, inhibuje fotosyntetickou aktivitu v rostlinách. Navíc zvýšený tok přes hexokinasy nestimuluje pouze glykolýzu, ale také intenzitu dělení buněk.
Teorie regulace metabolismu uhlíku trehalosa-6-fosfátem.
V normální rostlinné buňce probíhá tvorba cukrů v průběhu fotosyntézy, při které je C02 vázán a redukován na fosforylované hexosy se sacharosou jako konečným produktem. Normálně je tato sacharosa transportována ven z buňky do buněk nebo pletiv, ve kterých díky tomuto přísunu sacharosy mohou využívat cukry jako stavební materiál pro jejich metabolismus nebo jsou schopny tyto cukry ukládat jako např.škrob. Z tohoto hlediska jsou rostlinné buňky produkující cukry považovány za zdroje, zatímco buňky, ve kterých se cukry spotřebovávají jsou nazývány sinkem.
V živočišných buňkách a ve většině buněk mikrobiálních fotosyntéza neprobíhá a cukry jsou získávány z externích zdrojů, buď přímým využitím sacharidů (např. kvasinky a další mikroorganismy) nebo štěpením cukrů (zvířata). Cukry jsou většinou transportovány ve formě glukosy, která je aktivně transportována přes buněčnou membránu.
K prvním krokům metabolické dráhy glukosy po vstupu do buňky je její fosforylace na glukosa-6-fosfát katalysovaná enzymem hexokinasou. Již dříve bylo prokázáno, že cukry fosforylované hexokinasami (HXK) v rostlinách řídí expresi genů účastnících se při fotosyntéze (Jang a Sheen (1994), The Plant Cell 6, 1665). Proto se předpokládá, že HXK mohou mít dvojí funkci a mohou působit jako klíčový senzor a přenašeč signálu regulace genové exprese řízené cukry. Tato regulace nejspíš normálně signalizuje buňce je-li dostupný počáteční produkt, tj. glukosa. Podobný účinek může být pozorován při zavedení TPS nebo TPP, které ovlivňují hladinu T-6-P. Navíc bylo ukázáno, že hladina T-6-P ovlivňuje aktivitu hexokinas in vitro. Zvyšováním hladiny T-6P buňka dostane signál, že je nedostatečný přísun cukrů. A naopak • ·
snižování hladiny T-6-P představuje signál nadbytku glukosy vedoucí ke snížení fotosyntézy: signalizuje, že substrát pro glykolýzu a následný přísun energie potřebné pro růst a dělení buněk je dostupný v dostatečné míře. Předpokládá se, že tato signalizace je spuštěna zvýšeným tokem přes hexokinasy (J.J. Van Oosten, přednáška na RijksUniversiteit Utrecht, 19.4. 1996).
Podle teorie založené na možnosti regulace hexokinasové signalizace u rostlin hladinou trehalosa-6-fosfátu, by všechny rostliny vyžadovaly přítomnost enzymatického systému schopného vytvářet a rozkládat signální molekulu trehalosa-6-fosfátu. Přestože je trehalosa běžně přítomná u mnoha druhů hub, bakterií, kvasinek, řas a některých bezobratlých, pouze u velmi omezeného okruhu cévnatých rostlin byla syntéza tohoto cukru prokázána (Elbein (1974), Adv. Carboh. Chem. Biochem. 30, 227). Stále zůstává nejasné, proč i přes zjevný nedostatek enzymů syntetizujících trehalosu obsahují všechny rostliny trehalasy, tj. enzymy schopné štěpit trehalosu na dvě molekuly glukosy.
Nepřímý důkaz přítomnosti metabolické dráhy pro trehalosu byl získán v experimentech s inhibitory trehalasy jako je Validamycin A nebe při transformaci anti-sense trehalasou prezentovaných v tomto dokumentu.
Tvorba trehalosy by mohla být bržděna, jestliže by její meziprodukt T-6-P mohl příliš ovlivnit metabolickou aktivitu. Aby se mohla trehalosa akumulovat ve vysokých koncentracích, aniž by bylo ovlivněno rozdělení a lokalizace metabolitů působením trehalosa-6fosfátu, měl by být ve velké míře exprimován dvoudílný enzym TPS/TPP. Takový enzym by byl svou genetickou stavbou podobný genu kvasinek, kde produkt genu TPS2 obsahuje TPS a TPP oblast homologní s geny otsA a otsB
E.coli (Kaasen et al. (1994), Gene 145, 9). Při použití takového enzymu nebude trehalosa-6-fosfát volně dostupný pro jiné buněčné komponenty. Jiný příklad takového bipartitního enzymu uvádí Zentella a Iturriaga (Plant Physiol. (1996), 111 abstrakt 88), kteří izolovali ze Selaginella lepidophylla cDNA o velikosti 3,2 kb kódující možnou trehalosa-6- fosfátsyntasu/fosfatasu. Lze také předpokládat, že konstrukce zkráceného produktu genu TPS-TPP, kterým by byla zajištěna aktivita pouze TPS, by byla pro syntézu T-6-P • ·
4 4 -44 4 4 4 · 4 4 • · ·' ·' 4 · · · 4 · · • 4 4444 4 4 4 4 4 444 444
4·· 4 4 4 4 4
4 44444 44 44 stejně účinná jako ostA gen z E.coli při použití v homologním systému.
Podle našich údajů na molekulární úrovni jsou geny pro syntézu trehalosy kromě Selagínella přítomny také v Arabidopsís, tabáku, rýži a slunečnici. Pomocí degenerovaných primeru založených na konzervovaných sekvencích mezi TPSE.con a TPSkvasin)cy jsme byli schopni identifikovat geny kódující možné enzymy produkující trehalosa-6fosfát u slunečnice a tabáku. Při porovnání sekvencí byla zjištěna významná homologie mezi těmito sekvencemi: TPS geny z kvasinek a E.coli a EST (expressed sequence tags) sekvencemi z Arabidopsís a rýže (viz též Tab. 6b, ve které jsou uvedena EST čísla zjištěných homologních EST).
Nedávno byl určen gen z Arabidopsís (GENBANK Acc. No. Y08568, popis v SEQ ID NO: 39), který je možné na základě jeho homologie považovat za bipartitní enzym.
Podle těchto údajů obsahuje většina rostlin, v rozporu se současnými názory, geny kódující trehalosa-fosfát syntasy, které jim umožňují syntetizovat T-6-P. Jak bylo dokázáno u rostlin exprimujících TPS a akumulujících trehalosu, rostliny obsahují specifické i nespecifické fosfatasy schopné defosforylovat T-6-P na trehalosu. Přítomnost trehalasy ve všech rostlinách by mohla zvýšit účinnost přeměny trehalosy.
Dále jsme také získali údaje o roli T-6-P při regulaci dráhy cukrů v lidských tkáních. Určili jsme lidský TPS gen (zobrazený v SEQ ID NO: 10) homologní k TPS genu z kvasinek, E. coli a rostlin. Dále jsme uvedli údaje o vlivu na aktivitu hexokinas v lidských (myších) tkáních.
Vytváření takového signálu snižováním vnitrobuněčné koncentrace trehalosa-6-fosfátu prostřednictvím exprese enzymu TPP (nebo inhibici enzymu TPS) bude signalizovat všem buněčným systémům zvýšení toku uhlíku přes glykolýzu a inhibici fotosyntézy. Toto je názorně ukázáno v experimentální části , kde např. v Příkladu 2 jsou popsány transgenní rostliny tabáku s expresí enzymu TPP, které mají větší listy, více se větví a mají snížený obsah chlorofylu. Pokud je však tento silný signál vytvářen při nedostatečném množství glukózy, je zásoba cukrů rychle spotřebována.
. ·
V případě, že tento uměle vytvořený „nadbytečný signál přetrvává, bude nakonec snížení obsahu cukrů limitující pro růst a .buněčné dělení, tj. buňky spotřebují všechny své zásobní cukry a budou hladovět. Proto se listy vytvářejí s nízkým obsahem zásobních cukrů. Naproti tomu mají rostliny exprimující konstrukt s genem pro TPS, který zvyšuje vnitrobuněčnou koncentraci T-6-P, redukovanou velikost listů, zatímco listy jsou tmavěji zelené a obsahují více chlorofylu.
U kvasinek je hlavním cílem glukosou indukované signalizace přepnutí metabolismu z neogenetického /respiračního způsobu na fermentativní způsob. Na tomto jevu se podílí několik signálních drah (Thevelein a Hohmann, (1995) TIBS 20, 3). Bylo zjištěno, že kromě možné role hexokinasové signální dráhy je glukosou aktivována také dráha RAScyklické-AMP (cAMP). Aktivace RAS-cAMP dráhy glukosou vyžaduje fosforylaci glukosy ale ne její další metabolismus. Zatím bylo prokázáno, že tato dráha aktivuje trehalasu a 6-fosfofrukto-2-kinasu (čímž stimuluje glykolýzu), zatímco je fruktosa-1,6-bísfosfatasa inhibována cAMP-dependentní fosforylaci proteinů (čímž brání glukoneogenezi). Tato dráha signální transdukce a metabolické změny, které může vyvolávat, může být považována za jednu z drah působících paralelně s hexokinasovou signální dráhou, která, jak bylo ukázáno, je ovlivněna hladinou trehalosa-6-fosfátu.
Jak je popsáno v našem vynálezu, transgenní rostliny exprimující astrehalasu se projevují podobně jako rostliny exprimující TPS gen, mají tmavozelené listy a vyšší výnos. Zdá se také, že exprese astrehalasy v dvojitých konstruktech zvyšuje účinky vyvolané expresí TPS. Aktivita trehalasy byla prokázána např. u rostlin, hmyzu, zvířat, hub a bakterií, ale pouze u omezeného počtu druhů je trehalosa akumulována.
Přestože je trehalasa přítomna u většiny rostlinných druhů, není její role v rostlinách dosud známá. Předpokládá se, že se účastní při interakci mezi patogenem a rostlinou a při obranné reakci rostliny. Z bramboru jsme izolovali gen pro trehalasu a ukázali, že inhibice aktivity trehalasy v pletivech listů a hlíz bramboru vede ke zvýšení výnosu hlíz. Exprese as-trehalasy specifické pro plody v kombinaci s expresí TPS změnila podstatně vývoj plodů rajčete.
Podle vynálezu dochází k akumulaci T-6-P v těch buňkách, kde obsah vznikajícího T-6-P byl vyvolán vnesením exprimovatelného konstruktu genu kódujícího trehalosa-fosfát-syntasu (TPS). Může být použit každý gen pro trehalosa-fosfát-syntasu řízený regulačními prvky nezbytnými pro expresi DNA v buňkách, buď specificky nebo konstitutivně, pokud je schopen produkovat trehalosa-fosfát-syntasu a tím T-6-P v uvedených buňkách. V souladu s vynálezem je příklad jednoho otevřeného čtecího rámce kódujícího TPS-enzym popsaného v SEQ ID NO:2. Dalšími příklady jsou otevřené čtecí rámce prezentované pod označením SEQ ID NO: 10, 18-23, 41 a 45-53. Je známou skutečností, jak ilustrují výše uvedené sekvence, že identický enzym může být kódován více než jednou sekvencí DNA, což je způsobeno degenerací genetického kódu. Otevřený čtecí rámec kódující trehalosa -fosfát-syntasu může být přizpůsoben použití kodonu u zvoleného hostitele, ale není to podmínkou.
Izolovaná sekvence nukleové kyseliny reprezentovaná například SEQ ID NO: 2 může být použita k identifikaci genů pro trehalosa fosfát-syntasu v jiných organismech a jejich následnou izolaci a klonování pomocí PCR technik a hybridizací DNA z jiných zdrojů s fragmentem DNA nebo
RNA získaným z genu E. coli. Přednostně je taková sekvence DNA hybridizována za více či méně přesných podmínek (ovlivněných faktory jako je teplota, iontová síla hybridizační směsí). Zda jsou přesné podmínky pro hybridizací potřebné závisí na povaze hybridizace, tj. DNA:DNA, DNA:RNA, RNA:RNA, stejně tak jako na délce nej kratšího hybridizujícího fragmentu. Odborníci pracující v tomto oboru snadno dokáží stanovit vhodné podmínky režimu hybridizace tak, aby byly izolovány TPS geny a současně se vyloučila možnost nespecifické hybridizace. Pro získání exprimovatelného genu pro trehalosa fosfát-syntasu je možné použít i další, v současnosti dostupné geny pocházející z jiných zdrojů, které se účastní syntézy trehalosy, a to podobným způsobem jak je popsáno v tomto vynálezu. Více podrobností je uvedeno v experimentální části.
Zdroje pro izolaci trehalosa -fosfát-syntasové aktivity zahrnují mikroorganismy (např. bakterie, kvasinky, houby), rostliny, zvířata a podobně. Pro produkci T-6-P mohou být podle vynálezu využity podobným způsobem i izolované sekvence DNA kódující
• · · trehalosa -fosfát-syntasovou aktivitu 2 jiných zdrojů. Jako přiklad mohou sloužit geny pro produkci T-6-P z kvasinek, které byly objeveny v WO 93/17093.
Vynález také obsahuje sekvence nukleových kyselin, které byly získány modifikací sekvence nukleové kyseliny prezentované v SEQ ID NO: 1 mutací jednoho nebo více kodonů tak, aby výsledkem byly změny aminokyselin u kódovaného proteinu. Mutace sekvence aminokyselin byla prováděna tak dlouho, až došlo k úplnému odstranění aktivity trehalosa -fosfát-syntasy.
Podle další části vynálezu může být trehalosa-6-fosfát v buňce přeměněn na trehalosu pomocí genů pro trehalosa-fosfát-fosfatasu řízenými regulačními prvky nezbytnými pro expresi DNA v buňkách. Preferovaným otevřeným čtecím rámcem je podle vynálezu rámec kódující enzym TPP prezentovaný v SEQ ID NO: 4 (Kaasen et al. (1994) Gene, 145, 9) . Je dobře známá skutečnost, že identický enzym kóduje více než jedna sekvence DNA, což je způsobeno degenerací genetického kódu. Otevřený čtecí rámec kódující trehalosa -fosfát-fosfatasu může být přizpůsoben použití kodonu u zvoleného hostitele, ale není to podmínkou.
Izolovaná sekvence nukleové kyseliny reprezentovaná v SEQ ID NO: 3 může být použita k identifikaci genů pro trehalosa -fosfátfosfatasu v jiných organizmech a jejich následnou izolaci a klonování pomocí PCR technik a hybridizací DNA z jiných zdrojů s fragmentem DNA nebo
RNA získaným z genu E. coli. Přednostně je taková sekvence DNA hybridizována za více či méně přesných podmínek (ovlivněných faktory jako je teplota, iontová síla hybridizační směsi). Zda jsou přesné podmínky pro hybridizaci potřebné závisí na povaze hybridizace, tj. DNA:DNA, DNA:RNA, RNA:RNA, stejně tak jako na délce nej kratšího hybridizujícího fragmentu. Podmínky režimu hybridizace musí být dostatečně striktní, aby byly izolovány TPS geny a současně se vyloučila možnost nespecifické hybridizace. K získání exprimovatelného genu pro trehalosa -fosfát- fosfatasu mohou být použity i další dostupné geny účastnící se při syntéze trehalosy, které pocházející z jiných zdrojů a to podobným způsobem jako v tomto vynálezu. Více podrobností je uvedeno v experimentální části.
Zdroje pro izolaci trehalosa -fosfát- fosfatasové aktivity zahrnuji mikroorganismy (např. bakterie, kvasinky, houby), rostliny, zvířata a podobně. Použít lze také izolované sekvence DNA kódující trehalosa -fosfát- fosfatasovou aktivitu z jiných zdrojů.
Vynález také obsahuje sekvence nukleových kyselin, které byly získány modifikací sekvence nukleové kyseliny prezentované v SEQ ID NO: 3 mutací jednoho nebo více kodonů tak, aby výsledkem byly změny aminokyselin u kódovaného proteinu. Mutace sekvence aminokyselin byla prováděna tak dlouho, až došlo k úplnému odstranění aktivity trehalosa -fosfát- fosfatasy.
Dalšími enzymy s TPS a TPP aktivitou jsou tzv. bipartitní enzymy.
Lze předpokládat, že část sekvence specificky kódující pouze jednu z těchto dvou aktivit, může být separována z části bipartitního enzymu kódujícího i druhou část. Jedním ze způsobů separace aktivit je vložení mutace do sekvence kódující aktivitu, která není zvolena. Touto mutací je pak zasažený exprimovaný protein poškozen nebo není aktivní a plní se zbylá funkce. Toto lze učinit u sekvencí kódujících jak TPS tak TPP aktivitu. Takto získané kódující sekvence mohou být použity pro tvorbu nového chimérického otevřeného čtecího rámce schopného exprimovat enzymy s TPS nebo TPP aktivitou.
Podle další části vynálezu mohou být rostliny geneticky pozměněné tak, aby produkovaly a akumulovaly výše zmíněné enzymy v určitých částech rostliny. Preferována je tato exprese enzymů v listech a zásobních orgánech rostlin. Za zvlášť vhodné části rostlin jsou považovány bramborové hlízy. Promotor, kterým je selektivně dosaženo exprese enzymu TPS v mikrohlízkách a hlízách bramboru, lze získat z oblasti proti směru transkripce (upstream) otevřeného čtecího rámce patatinového genu z bramboru.
Dalším vhodným promotorem pro specifickou expresi je plastocyaninový promotor, který je specifický pro fotoasimilující části rostlin. Předpokládá se také, že specifická exprese v jednotlivých částech rostlin může pozitivně působit na růst rostlin a reprodukci nebo ekonomické využití těchto rostlin.
Z tohoto hlediska jsou užitečné následující promotory: promotor E8 (EP 0 409 629) a promotor 2A11 (van Haaren a Houck (1993), Plant
Mol. Biol. 221, 625), které jsou specifické pro plody; kruciferinový promotor, napinový promotor a ACP promotor, které jsou specifické • 9 9 • 9 pro semena; PAL promotor; chalkon-izomerasový promotor specifický pro květy; SSU promotor a feredoxinový promotor, které jsou specifické pro listy; TobRb7 promotor specifický pro kořeny, RolC promotor specifický pro floém a HMG2 promotor (Enjuto et al. (1995), Plant Cell 7, 517) a PCNA promotor z rýže (Kosugi et al. (1995)
Plant J. 7, 877), které jsou specifické pro meristemová pletiva. Dalši možnosti při využiti tohoto vynálezu je aplikace indukovatelných promotorů. Jsou známy promotory indukované patogeny, stresem, chemickými nebo světelnými (světlo/tma) podněty. Lze předpokládat, že pro indukci specifických projevů, např. rašení, vybíhání, tvorba semen, ukládání do zásobních pletiv, je výhodné použít k indukci aktivity genů, které jsou předmětem vynálezu, vnější podněty. Tento přístup umožňuje normální vývoj rostlin a výhodnou řízenou indukcí požadovaného jevu. Promotory, které jsou určeny pro použití v takovém systému jsou promotory indukovatelné patogeny popsané v DE 4446342 (PRP-1 indukovaný houbami a auxinem), WO 96/28561 (PRP-1 indukovaný houbami), EP 0 586 612 (indukovaný nematody), EP 0 712 273 (indukovaný nematody), WO 96/12814 (indukovaný chladem), EP 0 494 724 (indukovaný teracyklinem), EP 0 619 844 (indukovaný etylénem), EP 0 337 532 (indukovaný kyselinou salicylovou), WO 95/24491 (indukovaný thiaminem) a WO 92/19724 (indukovaný světlem). Další chemicky indukovatelné promotory jsou popsány v EP 0 674 608, EP 637 339, EP 455 667 a v US 5, 364, 780. Podle dalšího provedení tohoto vynálezu, jsou buňky transformovány konstrukty, které inhibují funkci endogenně exprimované TPS nebo TPP. Inhibice nežádoucí endogenní enzymové aktivity může být dosazeno několika způsoby, jejichž výběr není pro vynález rozhodující. Jednou z metod inhibice genové exprese je tzv.antisense strategie. Při této metodě je exprimována sekvence DNA produkující RNA, která je alespoň částečně komplementární s RNA kódující enzymovou aktivitu, která má být inhibována. Přednostně jsou používány homologní anti-sense geny, protože jsou účinnější než geny heterologní. Další alternativní metodou blokování syntézy nežádoucí enzymové aktivity je vnesení další kopie endogenního genu přítomného v hostitelské rostlině do jejího genomu. Často je pozorováno, že takováto další kopie genu zeslabuje endogenní gen: tento efekt bývá v literatuře označován jako kosupresní efekt nebo i n • fl fl I fl · » flflfl • fl flfl flfl • · · · · a • · · · · « • ·· ··· ··« • · · « fl ·· ·· >>
kosuprese. Podrobnosti o postupu zvyšování dostupnosti substrátu jsou uvedeny v Příkladech WO 95/01446 zahrnutém zde citací. Hostitelskými buňkami mohou být jakékoli buňky, u kterých je možné modifikovat signalizaci hexokinasami prostřednictvím změn hladiny T6-P. Podle této teorie jsou tedy všechny eukaryotické buňky předmětem tohoto vynálezu. Z ekonomického hlediska jsou pro vynález nejvhodnější buňky, které jsou dobře využitelné k produkci metabolických látek. Mezi tyto organizmy mimo jiné patří rostliny, zvířata, kvasinky, houby. Možná je však také exprese ve specializovaných buňkách (pankreatické beta-buňky a tukové buňky).
K preferovaným hostitelským rostlinám ze Spermatophytae patří Angiospermae, zejména Dicotyledoneae, zahrnující kromě dalších Solanaceae jako reprezentativní čeleď, a dále Monocotyledoneae zahrnující kromě dalších reprezentativní čeleď Gramineae. Jak je definováno v tomto vynálezu, vhodné hostitelské rostliny (stejně tak jako jejich části a buňky) a jejich potomstvo, obsahují modifikovanou hladinu T-6-P, vyvolanou např. aplikací rekombinantních DNA technik vedoucích ke zvýšené produkci TPS a TPP v požadovaných rostlinách či jejich orgánech. K rostlinám dle vynálezu patří rostliny s květy jako je květák (Brassica oleracea), artyčok (Cynara scolymus), květiny k řezu jako karafiát (Dianthus caryophyllus), růže (Rosa spp), Chrysanthemum, Petunía, Alstromerla, Gerbera, Gladiolus, lilie (Lilium spp.), chmel (Humulus lupulus), brokolice; hrnkové rostliny jako Rhododendron, Azalia, Dahlia, Begonia, Fuchsia, Geranium, atd.; ovoce jako jabloň (Malus, např. domesticus), banánovník (Musa např. Acuminata), meruňka (Prunus armeniaca), oliva (Oliva sativa), ananas (Ananas comosus), kokosová palma (Cocos nucifera), mango (Mangifera indica), kiwi, avokádo (Persea americana), bobuloviny (jako např. rybíz, Ríbes, např. rubrum), třešeň (jako třešeň Prunus,např. avium), okurka (Cucumis např. sativus), vinná réva (Vitis, např. vinifera) , citrónovník (Citrus limon), meloun (Cucumis melo), hořčice (Sinapis alba a Brassica nigra), ořechy (jako ořešák vlašský, Juglans, např. regia; podzemnice olejná, Arachis hypogeae), pomerančovník (Citrus, např. maxima), broskvoň ( Prunus, např. persica) , hrušeň (Pyra,např. Communis), paprika (Solanum např. capsicum), švestka (Prunus, např. domestica), jahodník (Fragaria např. moschata), rajče (Lycopersicon, ! i • 9 99 ·· »· • 9 9. · 9 · · 9 · · ·
9·· 9 9 9 9 9 9 9 • 9 ···· 9 · 9 · 9 ··· ·9· • •9 9 9 9 9 9 • 9 9 ··· 99 99 9» např. esculentum); listové plodiny jako je vojtěška (Medicago sativa), zelí (jako Brassica oleracea), endivie (Cichoreum, např. endivia) , pór (Allium porrum) , salát (lactuca sativa), špenát (Spinacia oleracea), tabák (Nicotiana tabacum), trávy jako Festuca, Poa, luční trávy (jako Lolíum perene, Lolium multiflórům a Arrenatherum spp.), okrasné trávníky, trsnaté trávy, chaluhy, čekanka (Cichorium intybus), čajovník (Thea sinensis), celer, petržel (Petroselinum crispum) , pažitka a další koření; kořenové plodiny jako maranta (Maranta arundínacea), řepa (Beta vulgaris), mrkev (Daucus carota), kasava (Manihot esculenta), žen-šen (Panax ginseng) , tuřín (Brassica rapa), ředkvička (Raphanus sativus), jám (Dioscorea esculenta), sladké brambory (Ipomoea batatas), taro; semenné plodiny jako fazol (Phaseolus vulgaris) , hrách (Písum sativum), sója (Glycin max), pšenice (Triticum aestivum), ječmen (Hordeum vulgare) , kukuřice (Zea mays), rýže (Oryza sativa), bob (Vicia faba), bavlník (Gossypium spp.), kávovník (Coffea arabica a
C.canephora); hlíznaté rostliny jako kedluben (Brassica oleraceae), brambor (Solanum tuberosum); cibuloviny jako cibule (Allium cepa), cibule šalotka, tulipán (Tulipa spp.), narcis (Narcissus spp.), česnek (Allium sativum) ; stonkové plodiny jako korkový dub, cukrová třtina (Saccharum spp.), sisal (Sisal spp.), len (Linum vulgare), juta; stromy jako kaučukovník, dub (Quercus spp.), bříza (Betula spp.), olše (Alnus spp.), javor (Acer spp.), jilm (Ulmus spp.), palmy, kapradiny, břečtan a podobně.
Transformace kvasinek, hub nebo živočišných buněk se provádí pomocí běžných transformačních technik s použitím obecně známých vektorových systémů jako pBluescript, pUC a virových vektorových systémů jakojsou RSV a SV40.
Způsob vnesení exprese schopných genů trehalosafosfátsyntasy, trehalosafosfátfosfatasy nebo jakýchkoliv dalších sense nebo antisense genů do buněk tranformované rostliny není rozhodující pokud jsou geny exprimovány v uvedených rostliných buňkách.
Ačkoliv některé konkrétní formy vynálezu nemohou být uskutečnitelné v současnosti, např. protože některé rostlinné druhy vzdorují genetickým transformacím, je praxe vynálezu u takových rostlinných druhů pouze otázka času a ne otázka principu, protože
Ί • · ·
poddajnost genetickým transformacím jako jsou tyto není důležitá ve vztahu k zásadním konkrétním formám vynálezu.
Transformace rostlinných druhů je dnes běžná pro velké množství rostlinných druhů zahrnujících jak jednoděložné tak i dvouděložné rostliny. V zásadě může být použito jakékohokoliv způsobu transformace k vnesení chimérické DNA dle vynálezu do vhodné buňky předka. Způsob může být vybrán z metod používající vápník a polyetylenglykol pro protoplasty (Krens et al. , 1982, Nátuře 296,
72; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363), elektroporace protoplastů (Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3, 1099), miroinjekce do rostlinného materiálu (Crossway at al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202), bombardování různých rostlinných pletiv částicemi potaženými DNA nebo RNA (particle bombardment) (Klein et al., 1987, Nátuře 327, 70), infekce neintegrujícími se viry, přenos genů zprostředkovaný Agrobacterium tumefaciens infiltrací dospělých rostlin nebo transformací zralého pylu či mikrospor (EP 0 301 316) apod. Upřednostňovaná metoda dle vynálezu zahrnuje přenos DNA pomocí Agrobacterium. Zvláště se preferuje použití takzvané technologie binárního vektoru (binary vector technology) jak je popsána v EP A 120 516 a U.S. Patent 4,940,838.
Ačkoliv jsou jednoděložné rostliny pokládány za nepoddanější genetickým transformacím, jsou přístupné transformacím a plodné transgenní rostliny mohou být regenerovány z transformovaných buněk nebo embryí nebo jiné rostlinné hmoty. V současnosti je v případě jednoděložných rostlin upřednostňována metoda mikroprojektilového bombardování embryí, explantátů nebo suspenzí buněk a přímé vnesení DNA (direct DNA uptake) nebo elektroporace do pletiva (Shimamoto et al., 1989, Nátuře 338, 274-276). Transgenní rostliny kukuřice byly získány vnesením Streptomyces hygroscopicus bar genu, který kóduje fosfinotricinacetyltranferasy (enzym, který inaktivuje herbicid fosfinotricin) do embryogenních buněk suspenzní kultury kukuřice mikroprojektilovým bombardováním (Gordon-Kamm, 1990, Plant Cell 2, 603). Byly popsány vnesení genetického materiálu do aleruonových protoplastů dalších jednoděložných plodin jako jsou pšenice a ječmen (Lee, 1989, Plant Mol. Biol. 13, 21). Rostliny pšenice se regenerovaly z embryogení suspenzní kultury výběrem embryogenních kalusů pro založení embryogenních suspenzních kultur (Vasíl, 1990, • » ···· »· ·· *· » · · · · ·
I · · · · · ) · · · · · ··« I · * · ·· ·· ··
Bio/Technol. 8, 429). Kombinace s transformačními systémy pro tyto plodiny umožňuje aplikaci předkládaného vynálezu na jednoděložné rostliny.
Jednoděložné rostliny včetně komerčně důležitých plodin jako jsou rýže a kukuřice jsou také přístupné přenosu DNA pomocí kmenů Agrobacterium (vide WO 94/00977; EP 0 159 418 B1+; Gould et al., 1991, Plant Physiol. 95, 426-434).
K získání transgenních rostlin schopných konstitutivní exprese více než jednoho chimérického genu je dostupných mnoho alternativ včetně:
A. Použití DNA např. T-DNA na binárním plasmídu s množstvím modifikovaných genů fyzicky spojených s druhým selektovatelným značkovacím genem (selctable markér gen). Výhodou této metody je ta skutečnost, že jsou chimérické geny fyzicky spojené a tudíž migrují jako jeden Mendelovský lokus.
B. Cizosprášení transgenních rostlin, z nichž každá byla schopna exprese jednoho nebo více chimérických genů přednostně spojených se selektovatelným merkerovým genem pylem z transgenních rostlin, které obsahovaly jeden nebo více chimérických genů spojených s jiným selektovatelným markérem. Poté je možné selektovat semena, získaná tímto křížením, na základě přítomnosti těchto dvou selektovatelných markérů nebo na základě přítomnosti samotných chimérických genů. Rostliny získané z vyselektovaných semen mohou být poté použity k dalšímu křížení. Chimérické geny nejsou zpravidla na jediném lokusu a geny se mohou z tohoto důvodu segregovat jako nezávislé jednotky.
C. Použití mnoha rozmanitých chimérických molekul DNA, např. plasmidů, z nichž každý obsahuje jeden nebo více chimérických genů a selektovatelný markér. Jestliže je kotransformace vysoká, je selekce pouze na základě jednoho z markérů dostatečná. V ostatních případech je preferována selekce na základě více než jednoho markéru.
D. Následné transformace transgenních rostlin již obsahují první,m druhý atd. chimérické geny s novou chimérickou DNA, která může obsahovat selektovatelný markerový gen. Tak jako v případě metody B nejsou chimérické geny v zásadě na jediném lokusu a mohou se tudíž segragovat jako nezávislé entity.
E. Kombinace výše uvedených strategií.
toto * 44 ·· ·· • · « ·· · · to 4» · • · « · · « · <··· • · ···· · « · · · ··· ··to ··· ··· 4 9 ·· to 944 99 44 44
Konkrétní strategie může záviset na několika předpokladech, které mohou být jednoduše stanoveny jako jsou účel rodičovských linií (přímé pěstování, použití ve šlechtitelském programu, použití k účelu produkce hybridů), nejsou však kritické z hlediska popsaného vynálezu.
Je známo, že prakticky všechny rostliny mohou být regenerovány z buněčných suspenzí nebo tkáni. Způsoby regenerace se liší od rostliny k rostlině. Obecně, nejdříve jsou připraveny suspenze transformovaných protoplastů nebo petriho misky obsahující transformované explantáty. Výhonky mohou být indukovány přímo nebo nepřímo od kalusu přes organogenezi nebo embryogenezi a následně mohou zakořenit. Vedle selektovatelného markéru budou obecně rostlinné kultury obsahovat různé aminokyseliny a rostlinné hormony jako jsou auxin a cytokininy. Je také výhodné přidat do media glutamovou kyselinu a prolin, zvláště k takovým rostlinám jako jsou kukuřice a vojtěška. Účinnost regenerace bude závislá na médiu, genotypu a na historii kultury. Jestliže jsou tyto tři proměnné pod kontrolou, je regenerace obvykle reprodukovatelná a opakovatelná. Po stabilním vnesení sekvence transformujícího genu do transgenní rostliny mohou být takto získané vlastnosti přeneseny do dalších rostlin sexuálním křížením. V závislosti na rostlinném druhu, který se bude křížit, může být použita jakákoliv metoda z množství metod používaných ve standardním šlechtitelství.
Vhodné sekvence DNA kontrolující expresi rostlinných exprimovatelných genů (včetně markerových genů), jako jsou transkrípční iniciační oblasti, enhancery (zesilovače), netranskribované vedoucí sekvence (leader) apod., mohou být získány z kteréhokoliv genu, který se exprimuje v rostlinné buňce. Je možné použít také hybridní promotory kombinující funkční části různých promotorů nebo od nich odvozené syntetické ekvivalenty. Kromě konstitutivních promotorů mohou být ke kontrole exprese expreseschopných genů dle vynálezu použity indukovatelné promotory nebo promotory jejichž exprese je jinak regulovaná (např. vývojově nebo v závislosti na typu buněk specificky).K selekci nebo hledání transformovaných buněk se dává přednost zahrnutí markerových genů spojených s rostlinným exrimovatelným genem dle vynálezu tak, aby byl přenesen do rostlinné buňky. Výběr vhodného markeřového genu při • ·· φφφ φφφ • φ φφφφ · * · · φ φ φ transformaci rostlin není problém pro běžně erudovaného pracovníka. Běžně používané markerové geny jsou například geny pro neomycin fosfotransferasu způsobující odolnost vůči kanamycinu (EP-B 131 623), geny pro glutathin-S-transferasu z krysích jater způsobující odolnost vůči herbicidům odvozených od glutathionu (EP-A 256 223), geny pro glutaminsyntasu způsobující při overexpresi odolnost vůči inhibitorům glutaminsyntasy jako je např. fosfinothricin (WO 87/05327), gen pro acetyltransferasu z Streptomyces viridochromogenes udělující odolnost k látce fosfinothricinu (EP-A 275 957), gen kódující 5-enolšíkimat-3-fosfátsyntasu (EPSPS) udělující toleranci k N-fosfonometylglycinu, gen bar způsobující odolnost vůči látce Bialaphos (např. WO 91/02071) apod.. Konkrétní výběr markéru není kritický pakliže je funkční (případně selektivní) v kombinaci s vybranými rostlinnými buňkami.
Markerový gen a sledovaný gen nemusí být spojeny, protože kotransformace nespojených genů (U.S. Patent 4,399,216) je také účinný proces v rostlinné transformací.
Upřednostňovaným materiálem pro transformaci (zvláště dvouděložných plodin) jsou listové disky, které se mohou snadno transformovat a mají dobré regenerativní schopnosti (Horsch et al., 1985, Science 227, 1229).
Specifické použití vynálezu se předpokládá v následujících oblastech: jak je možné vidět na příkladech, vliv exprese TPP (což způsobí snížení vnitrobuněčné koncentrace T-6-P) se projevuje zvýšenou velikostí listů, zvýšeným větvením vedoucím ke zvětšení počtu listů, zvýšením celkové biomasy listů, vybělením zralých listů, vznikem více malých květů a sterilitou. Tyto efekty jsou zvláště použitelné v následujících případech: zvětšení listové plochy (a zvýšení počtu listů) je ekonomicky důležité u listových rostlin jako jsou např. špenát, salát, vojtěška, pórek, silážní kukuřice, dále u trávníků a zahradních rostlin při kontrolovaném pokrytí a regulaci plevele, dále u plodin, u kterých jsou listy používány jako produkt, jako je např. tabák, čaj, konopí a růže (parfémy!), dále k zakrytí plodin podobných kapustě (např. květák).
Další výhodou skutečnosti, že jsou tyto listy stimulovány ve své metabolické aktivitě je jejich tendence použít všechny své vnitrobuněčné zdroje , což znamená, že mají nízký obsah škrobu. U • · fr · · fr · · • · · « • · « rostlin, které jsou pěstovány pro konzumaci je ve světle dnešních trendů upřednostňujících nízkokalorické potraviny, snížení obsahu škrobu výhodou. Takové snížení obsahu škrobu má také vliv na chuť a strukturu listů. Zvýšení rovnováhy mezi proteiny a cukry ve prospěch proteinů (jaké může být dosaženo expresí TPP) je zvláště důležité u listnatých plodin jako je silážní kukuřice.
Zvýšené větvení, které je doprovázeno tendencí mít stonek s větším průměrem, může být výhodné u plodin, u kterých je stonek zodpovědný za vznik ekonomicky atraktivního produktu. Příkladem v této kategorii jsou všechny stromy pro zvýšenou produkci dřeva, což je základním materiálem pro výrobu papíru, dále je to např. konopí, sisal, len, které jsou důležité pro výrobu provazů, lan a látek, dále plodiny jako jsou bambus nebo cukrová třtina, kaučukovník, korkový dub, dále pro prevenci polehávaní plodin nebo částí plodin, jako jsou obilí, kukuřice, luštěniny a jahody.
snížením fotosyntetické aktivity). Méněbarevné listy jsou preferovány u plodin jako jsou čekanka a chřest. Také u řezaných květin může být blednutí korunních plátků žádané, např. u Alstromeria.
Globálním efektem je zvýšení biomasy vyplývající ze zvýšené metabolické aktivity. To znamená, že je biomasa složena z metabolisovaných látek jako jsou proteiny a tuky. Proto je tedy zvýšena rovnováha proteinů vůči sacharidům ve zralých listech což je výhodné u plodin jako je silážní kukuřice nebo veškerá píce, která se silážuje. Podobné zvýšení rovnováhy proteinů a sacharidů může být navozeno u ovoce, hlíz a ostatních jedlích částí rostlin.
Mimo rostlinnou říši může být zvýšený metabolismus užitečný pro produkci proteinů v kulturách mikroorganismů nebo eukaryotických buněk. Produkce jak endogenních tak také heterologních proteinů se bude zvýšena, což znamená, že produkce heterologních proteinů v kulturách kvasinek nebo jiných jednobuněčných organismů může být tímto způsobem zvýšena. U kvasinek by to vedlo k účinnější fermentaci, výsledkem čehož by byl vyšší výtěžek alkoholu, což je samozřejmě preferováno v pivovarnictví, výrobě lihu apod.
U zvířat nebo lidí se předpokládá, že nemoci způsobené defektním metabolismem mohou být překonány stabilní expresí TPP nebo TPS v zasažených tkáních. U lidských buněk je zvýšená spotřeba
4 · · • ·· • 4 ···· 4 glukosy u mnoha tumorových buněk závislá do velké míry na overexpresi hexokinasy (Rempel et al., 1996, FEBS Lett. 385, 233) Předpokládá se, že tok glukosy do metabolismu nádorových buněk může být ovlivněn expresí enzymů syntetizujících trehalosu-6-fosfát. Ukázalo se také, že aktivace hexokinasy je zesilována cAMP/PKA (drahou proteinkinasy A). Proto může inaktivace této signální dráhy mít vliv na dosažitelnost glukózy a tím na proliferaci neoplazií. Enzymové aktivity v savčích buňkách schopné syntetizovat trehalosu6-fosfát a trehalosu a degradovat trehalosu byly již prokázány např. u buněk ledvinové kůry králíků (Sacktor, 1968, Proč. Nati.
Acad.Sci.USA 60, 1007).
Další příklad může být nalezen u defektů v sekreci inzulínu pankreatickými beta buňkami, v kterých je produkce glukosa-6-fosfátu katalyzována hexokinasou rozhodující reakcí, která spojuje zvýšení hladiny extracelulární glukosy se sekrecí inzulínu (Efrat et al., 1994, TIBS 19, 535). Zvýšení hexokinasové aktivity způsobené snížením vnitrobuněčné T-6-P bude stimulovat produkci inzulínu u buněk, které jsou nedostatečné v sekreci inzulínu.
Také u transgenních zvířat by zvýšená rovnováha proteinů vůči sacharidům mohla být výhodná. Obě vlastnosti - zvýšený metabolismus a zvýšená produkce proteinů - jsou velice důležité v zemědělství, v kterém u zvířat musí být přírůstek masa co nejrychlejší.
Transformace enzymu TPP do zvířat produkujících maso jako např. do kuřat, skotu, ovcí, krocanů, koz, ryb, humrů, krabů, garnátů, šneků apod. povede ke zvířatům, které porostou rychleji a budou mít maso s větším obsahem bílkovin.
Stejným způsobem povede tento zvýšený metabolismus ke zvýšenému spalování sacharidů a tudíž k prevenci obezity.
Snížení koncentrace T-6-P má za následek, pro rostliny specifičtější, zvýšení počtu květů (ačkoliv tento proces zřejmě nevede ke vzniku semen). Zvýšený počet květů je nicméně žádoucí u řezaných květin a květináčových kvetoucích rostlin a také u všech rostlin vhodných pro zahradnictví.
Dalším výsledkem tohoto fenoménu kvetení je sterilita, protože rostliny neprodukují semena. Sterilní rostliny jsou výhodné při šlechtění hybridů.
• toto · · · · · · · · • to to to » · to · · · · • to ···· to · · * · ··* ··· • · · ··· · «
Jiným ekonomicky důležitým aspektem je omezení předčasného dozrávání kulturních plodin jako je hlávkový salát, endivie a jak rekreační tak i picni tráva. Tato vlastnost je výhodná, protože dovoluje plodinám růst bez nutnosti vynakládat metabolickou práci na kvetení a produkci semen. Kromě toho u plodin jako je hlávkový salát, endivie a tráva jsou komerční produkty (či komerční použití) nezralé.
Specifická exprese TPP v určitých částech rostliny (sinku), může mít další užitečné následky. Předpokládá se, že exprese TPP pomocí promotoru , který je aktivní v raném stádiu tvorby např. semen, dovolí zvýšený růst vyvíjejících se semen. Podobný efekt by měla exprese TPP pod promotorem specifickým pro květy. Vyjádřeno zkráceně: nadměrný růst určitých částí rostlin je možné, pokud TPP je exprimována v závislosti na vhodném promotoru. Exprese specifická pro plody by mohla vést ke zvýšenému růstu slupky v poměru k dužině. To by dovolilo zlepšení loupání ovoce, což by mohlo být výhodné pro automatické průmyslové loupání.
Exprese TPP během procesu klíčení semen obsahujících oleje omezuje jeho degradaci. Při procesu klíčení je glyoxalátový cyklus velmi aktivní. Tato metabolická dráha přeměňuje acetyl-CoA přes malát na sacharosu, která může být transportována a použita jako zdroj energie během růstu klíčních rostlin. Klíčové enzymy v tomto procesu jsou malátsyntasa a isocitrátlyasa. Exprese obou enzymů je, jak se předpokládá, regulována hexokinasovou signalizací. Jednou ze známek pro tuto regulaci je, že jak 2-deoxyglukosa tak i manosa jsou fosforylovány hexokinasou a jsou schopny převést svůj signál snížení exprese malátsyntasy a isocitrátlyasy - aniž by byly dále metabolizovány. Exprese TPP v semenech, tedy snížení inhibice hexokinasy, tedy inhibice malatsyntasy a isocitrátlyasy udržuje skladování olejů do semen a zamezuje klíčení.
V porovnání s efekty TPP působí zvýšení T-6-P způsobené expresí TPS jiné efekty jak se ilustrováno v Příkladech provedení vynálezu. Z těchto příkladů vyplývá, že zvýšení T-6-P způsobuje zakrslost nebo zakrnělý růst (zvláště při vysoké expresi TPS), tvorbu více zalomených listů, tmavší barvu způsobenou zvýšeným obsahem chlorofylu a zvýšený obsah škrobu. Jak je řečeno výše, vnesení trehalasových anti-sense konstruktů také stimuluje podobné
9 efekty jako vnesení TPS. Proto budou aplikace ukázané nebo naznačené pro TPS stejnou měrou platné pro anti-sense-trehalasu. Navíc, použití dvojitého konstruktu TPS a anti-sense-trehalasy zesiluje účinky jednotlivých konstruktů.
Zakrslost je úkaz, který je vyžadován u zahradních rostlin, mezi kterými jsou japonské bonsaje příslovečným příkladem. Vytvoření minikvětin u rostlin jako jsou růže, amarylis, hortensie, bříza a palma bude mít ekonomické šance. Vedle rostlinné říše je zakrslost také žádána u zvířat.
Je také možné indukovat předčasné dozrávání u kulturních plodin jako je hlávkový salát. To je výhodné, protože dovoluje rychlou produkci semen. Ideálně by exprese TPS pro tento efekt měla být pod kontrolou indukovatelného promotoru.
Redukce růstu je dále vyžadována pro průmysl „vegetariánských občersvení, u kterých je předpokládána konzumace zeleniny ve formě malých dávek. Třešňová rajčata (cherry-tomato) jsou příkladem zeleniny zmenšené velikosti úspěšné na trhu. Lze předpokládat, že by také další zelenina jako je hlávkové zelí, květák, mrkev, řepa a sladké brambory a ovoce jako jsou jablka, broskve, hrušky, melouny a některé tropické ovoce jako je mango a banány byly úspěšné v miniaturní velikosti na trhu.
Snížení růstu je požadováno u všech buněk, které jsou škodlivé pro organismus. Příkladem jsou patogeny a nádorové buňky. Z tohoto posledního hlediska může být viděna regulace růstu změnou hladiny T6-P. Zvýšení hladiny T-6-P sníží růst a metabolismus nádorové tkáně. Jedním ze způsobů jak zvýšit vnitrobuněčnou hladinu T-6-P je vyřadit gen TPP těchto buněk vnesením specifické rekombinantní události (event), která způsobí vnesení mutace do endogenního genu pro TPP. Jedním ze způsobů jak je možné toto provést je vnesení sekvence DNA schopné vnést mutaci do endogenního genu pomocí pro nádorové buňky specifických internalizujících protilátek. Jiným způsobem je cílené bombardování mikročásticemi s řečenou DNA. Za třetí může být použito pro nádorové buňky specifických virových vektorů obsahujících řečenou DNA.
Fenomén tmavšího zeleného zabarvení pozorovaného v souvislosti se zvýšenou koncentrací T-6-P je vlastnost, která je žádaná pro • · 9 ♦ ·· ·· · · » · · » · · · · ···· · · · · · · · • · ···· · · · · · 999 999 ··· · · · · · • · · ····· » · 9 9 květináčové kvetoucí rostliny a, obecně řečeno, pro druhy v zahradnictví a pro rekreační trávy.
Zvýšení hladiny T-6-P způsobí také zvýšení zásobních sacharidů jako jsou škrob a sacharosa. To poté znamená, že pletivo, v kterém jsou sacharidy skladovány je schopno skladovat více materiálu. To může být ilustrováno na Příkladu, kde je ukázáno, že se u rostlin tvoří zvýšená biomasa zásobních orgánů jako jsou hlízy a ztluštěné kořeny (jako v případě řepy - zásoba sacharosy).
Plodiny, u kterých by toto bylo velmi užitečné jsou brambory cukrová řepa, mrkev, čekanka a cukrová třtina.
Další ekonomicky důležitý efekt u brambor je, že po transformaci s DNA kódující gen pro TPS (vytvářející zvýšení T-6-P) bylo zjištěno, že množství rozpustných cukrů se snížilo, dokonce i po sklizni a skladování hlíz za nízkých teplot (4°C) . K prevenci klíčení by běžně bylo dokonce zapotřebí skladování za ještě nižších teplot, ale to vede k extenzivnímu sládnutí brambor. Snížení množství redukujících cukrů je otázkou zásadní důležitosti pro potravinářský průmysl, protože sladké bramborové hlízy nejsou vhodné pro zpracování z důvodu vzniku Maillardovy reakce, při které reagují vzájemně redukující cukry a aminokyseliny což vede ke hnědnutí.
Stejným způsobem může být dosaženo také inhibice aktivity invertasy, transformací cukrové řepy polynukleotidy kódujícími enzym TPS. Inhibice aktivity invertasy v cukrové řepě po sklizni je ekonomicky velice důležitá.
Také v ovoci a semenech může být ukládání pozměněno. Výsledkem není pouze zvýšená kapacita ukládání, ale i změna ve složení ukládaných látek. Plodiny, u kterých je zvýšení výnosu semen zvláště důležité jsou kukuřice, rýže, obilí, hrách, řepka olejka, slunečnice, sojové boby a luštěniny. Kromě toho jsou změny ve složení a množství ukládaných sacharidů důležité pro všechny rokliny poskytující ovoce. Zvláště u ovoce se změny v ukládaných látkách projeví ve změnách bytelnosti a tuhosti, což je zvláště důležité u měkkého ovoce jako jsou rajčata, banány, jahody, broskve a hroznové víno.
Opačný k vlivu pozorovanému při expresi TPP je vliv exprese TPS, která snižuje v listech poměr proteinů k sacharidům. Tento efekt je důležitý u listových plodin jako jsou picni trávy a • · • · · ·
9994 vojtěška. Listy mají také sníženou biomasu, což může být důležité u trav pěstovaných na trávnících (není nutné je tak často sekat). Důležitější však je, že mají také relativně zvýšený obsah energie. Tato vlastnost je zvláště výhodná pro plodiny jako jsou cibule, pórek a silážní kukuřice.
Dále poté může být hladinou vnitrobuněčné T-6-P ovlivněna životaschopnost semen.
Kombinací exprese TPP v jedné části rostliny a TPS v jiné části rostliny se výše popsané vlivy mohou synergizovat a zvyšovat.Je také možné pomocí specifických promotorů exprimovat geny sekvenčně během vývoje. Nakonec je také možné indukovat expresi kteréhokoliv genu z výše uvedených genů tak, že jej umístíme pod kontrolu indukovatelného promotoru. Předpokládá se, že kombinace popsaných způsobů aplikace bude zřejmá pro osoby zběhlé v oboru.
Vynález je dále ilustrovaný na příkladech. Zdůrazňuje se, že příklady ukazují speciální provedení vynálezu, že je ovšem zřejmé, že alternativy těchto příkladů a použití jiných rostlin nebo expresních systémů je chráněno tímto vynálezem.
Podstata vynálezu
Způsob modifikace vývoje a/nebo složení buněk, tkání a orgánů in vivo jinak než udělením schopnosti syntetizovat trehalasu, indukcí změn metabolické dostupnosti trehalosa-6-fosfátu.
Bylo zjištěno, že změna vývoje a/nebo obsahu buněk, tkání a orgánů in vivo je možná zavedením enzymu trehalosa-6-fosfátsyntasy (TPS) a/nebo trehalosa-6-fosfátfosfatasy (TPP) a tím indukcí změn v metabolických cestách sacharidu trehalosa-6-fosfátu (T-6-P). Tyto změny vedou ve zvýšení vnitrobuněčné dostupnosti T-6-P. Vnesení TPS indukuje zvýšení vnitrobuněčné koncentrace T-6-P a to způsobuje inhibici toku uhlíku v glykolytickém směru, stimulaci fotosyntézy, inhibici růstu, stimulaci aktivit vztahujících se k sinku a zvýšení ukládání zásob. Vnesení TPP indukuje snížení vnitrobuněčné koncentrace T-6-P. Toto snížení způsobuje stimulaci toku uhlíku ve směru glykolýzy, zvýšení biomasy a snížení fotosyntetické aktivity.
• · • ·
Hladiny T-6-P mohou být ovlivněny genetickým inženýrstvím organismů genovými konstrukty schopnými ovlivnit hladinu T-6-P nebo mohou být ovlivněny exogenně dodáváním látek schopných ovlivnit tuto hladinu.
Genetické konstrukty, které mohou být použity v tomto vynálezu jsou konstrukty nesoucí gen pro trehalosufosfátsyntasu (TPS), enzym, který je schopen katalyzovat reakci při které vzniká T-6-P z glukosy-6- fosfátu a UDP-glukózy. Na druhé straně konstrukt kódující enzym trehalosafosfátfosfatasu (TPP), který katalyzuje reakci při které vzniká trehalosa z T-6-P způsobí, v závislosti na expresi, snížení množství T-6-P.
Alternativně mohou být genové konstrukty nesoucí anti-sense TPS či TPP použity k regulaci vnitrobuněčné dostupnosti T-6-P.
Dále bylo nedávno oznámeno, že vnitrobuněčná fosfoalfa-(1,1)glukosidasa, TreA, z Bacillus subtolis byla schopna hydrolyzovat T6-P na glukózu a glukosa-6-fosfát (Schock et al., Gene, 177, 77-80, 1996). Podobný enzym byl už popsán u E. coli (Rimmele and Boos (1996), J.Bact. 176 (18), 5654-). Pro overexpresi musely být použity homologní nebo heterologní genové konstrukty. Je přijímáno, že vznik endogenního T-6-P a/nebo degradujících enzymů je pod alosterickou regulací a regulací přes kovalentní modifikaci. Tato regulace může být obejita použitím heterologních genů.
Ke zrušení regulace mohou být alternativně použity mutace heterologních nebo homologních genů.
Vynález také dává schopnost měnit vztah zdrojů a sinků a také rozdělení zdrojů v rostlině. Systém využívání uhlíku v celé rostlině včetně produkce asimilátů v zdrojových tkáních a jejich zužitkování ve zdrojových tkáních může být modifikován, což může vést ke zvýšení výnosu biomasy sklízených produktů. S použitím tohoto přístupu může být realizováno jak zvýšení výnosového potenciálu tak i zlepšení sklizňového indexu a zlepšení kvality produktu. Tyto změny v zdrojových tkáních mohou vést ke změnám v sink tkáních například zvýšením exportu fotosyntetických produktů. A obráceně, změny v sink tkáních mohou vést ke změnám ve zdrojových tkáních.
Specifická exprese v buněčných organelách, tkáních nebo jiných částech organismu dovoluje výše zmíněný obecný efekt směřovat do specifických lokálních aplikací. Tato specifická exprese může být zajištěna vnesením genů kódujících TPS, TPP nebo anti-sense genů pro
TPS nebo TPP kontrolovaných specifickými promotory.
Specifická exprese také dovoluje simultánní expresi obou (TPS a
TPP) enzymů v rozdílných tkáních a proto lokální zvýšení hladiny T6-P a snížení T-6-P.
S použitím specifických promotorů je také možné vytvořit dočasné rozdíly. Pro tyto účely mohou být použity promotory, které jsou specificky aktivní během určitého období organogeneze rostlinných částí. Tímto způsobem je možné nejdříve ovlivnit množství orgánů, které se vyvinou a poté umožnit těmto orgánům, aby se naplnily zásobním materiálem jako je škrob, olej či proteiny.
Alternativně je také možné použít inducibilní promotory k selektivnímu zapínání a vypínání exprese genů vynálezu. Indukce může být dosaženo například patogeny, stresem, chemikáliemi nebo stimulací světlem/tmou. Hexokinasová aktivita je enzymatická aktivita nalézající se v buňkách, které katalyzují reakci hexozy na hexosa-6-fosfát. Hexosy zahrnují glukosu, fruktosu, galaktosu nebo jakýkoliv jiný C6 cukr. Uznává se, že existuje mnoho isozymů, které všechny mohou hrát roli ve výše zmíněných biochemických reakcích. Katalyzováním této reakce hexokinasy tvoří klíčový enzym v hexosové (glukosové) signalizaci.
Hexosová signalizace je regulační mechanizmus, kterým buňky vnímají dostupnost hexos (glukos).
Glykolýza je sekvence reakcí, které přeměňují glukózu na pyruvát s průvodním vznikem ATP.
Chladové sládnutí je akumulace rozpustných cukrů v bramborových hlízách po sklizni, jestliže jsou tyto skladovány při nízké teplotě.
Ukládání zdrojových látek je proces, při kterém se primární produkt glukosa metabolizuje na molekulární formy, které jsou vhodné pro skladování v buňce nebo ve specializovaných tkáních. Tyto formy mohou být různé. V rostlinné říši mají zásoby formu polykarbonátů jako jsou škrob, fruktan nebo celulosa nebo formu jednodušších mono a disacharidů jako jsou fruktosa, sacharosa a maltosa. Dále se vyskytují ve formě olejů je arachidový nebo olejový olej a ve formě proteinů jako jsou kruciferin, napin a zásobní protein semen řepky. V živočišných buňkách také vznikají pokykarbonáty jako je glykogen.
• · • · • » · • ···*
Velké množství energeticky bohatých látek je ale také přeneseno do tuku a lipidů.
Biomasa je celková hmotnost biologického materiálu.
Přehled obrázků na výkresech
Obr.l: Schématické znázornění plasmídu pVDH275 nesoucího neomycinfosfotranferasový gen (NPTII), který je obklopený 35S promotorem viru tabákové mozaiky (p35S) a terminátorem (T35S) jako selektabilní markér. Expresní kazeta obsahuje plastocyaninový promotor z hrachu (pPCpea) a nopalinsyntasový terminátor (Tnos). Pravou (RB) a levou (LB) T-DNA hraniční sekvence a bakteriální gen pro kanamycinovou rezistenci (KanR) jako markerový gen.
Obr.2: Nothern blot analýza transgenních tabákových rostlin. Panel A znázorňuje expresi otsA mRNA v listech jednotlivých pMOG799 transgenních tabáků. Kontrolní linie C obsahuje celkovou RNA z netransformovaných rostlin N. tabacum.
Obr.3: Srovnání TPS kódující sekvence odvozené z rostliny s kvasinkovou TPS sekvencí při využití Wisconsin GCG sequence analysis package (Devereux et al. (1984) A comprehensive set of sequence analysis programs of the VAX. Nucl.Acid Res., 12, 387). TPSatal 3/56 a 142 TPSrice3 (SEQ ID NO:53) a RiceTPS kódují TPS enzymy Arabidopsís a rýže odvozené z databázových sekvencí EST. TPSsunlO, TPSsel43, (SEQ ID NO:44) and TPSsel8 (SEQ ID NO:42) kódují TPS enzymy slunečnice a Selagínella odvozené ze sekvencí izolovaných technikou PCR (viz příklad 3).
Obr.4: Vyrovnání tabákových TPS cDNA fragmentů získaných amplifikací PCR nesoucích TPS kódující kvasinkový TPS1 gen. Orámovaná políčka indikují identitu mezi aminokyselinami všech čtyř vyjmenovaných sekvencí.
Obr.5: Vyrovnání tabákových TPS cDNA fragmentů získaných amplifikací PCR nesoucích TPS kódující kvasinkový TPS2 gen. Orámovaná políčka ·* 9
9 9
9 9 9 • 9 9999 • 99 ♦ 9 0 9·· • 9 9 9 9 9 9
9 99 999 999
9 9 ·· •99 99 99 99 indikují identitu mezi aminokyselinami všech čtyř vyjmenovaných sekvencí.
Obr.6: Vyrovnání fragmentu PCR amplifikované slunečnicové TPS/TPP dvoudílné cDNA (SEQ ID NO: 24) s TPP kódujícím kvasinkovým TPS2 genem. Orámovaná políčka indikují identitu mezi aminokyselinami obou dvou sekvencí.
Obr.7: Vyrovnání fragmentu TPS1 Arabidopsis a EST klonů rýže s genem TPS1 kódujícím kvasinkovou TPS. Orámovaná políčka indikují identitu mezi aminokyselinami všech tří sekvencí.
Obr.8: Vyrovnání fragmentu lidské cDNA TPS amplifikované pomocí PCR (SEQ ID NO: 10) s genem TPS1 kódujícím kvasinkovou TPS. Orámovaná políčka indikují identitu mezi aminokyselinami obou dvou sekvencí.
Obr.9: Akumulace trehalosy v transgenních rostlinách brambor pMOG1027 (35S as-trehalase)
Obr.10: Hexokinasová aktivita extraktu z hlíz divokého typu brambor (Solanum tuberosum cv. Kardal) s přídavkem trehalosa-6-fosfátu a bez něj .
Obr.11: Hexokinasová aktivita extraktu z hlíz divokého typu brambor (Solanum tuberosum cv. Kardal) s přídavkem trehalosa-6-fosfátu a bez něj. Jako substrát pro stanovení je použita fruktosa nebo glukosa.
Obr.12: Hexokinasová aktivita extraktu z listů divokého typu tabáku (Nicotiana tabacum cv. SRÍ) s přídavkem trehalosa-6-fosfátu a bez něj. Jako substrát pro stanovení je použita fruktosa nebo glukosa.
Obr.13: Graf měření aktivity hexokinasy
Série dat 1: Extrakt z rostlin tabáku
Série dat 2: Extrakt z rostlin tabáku + 1 mM trehalosa-6- fosfát Série dat 3: Komerční hexokinasový extrakt z kvasinek (1/8 jednotky)
44 44
4 4 4 4 4
4 4 4 4 4
44 444 444
4 4 4
44 4·
4
4444 4
Obr.14: Hexokinasová aktivita extraktu z listů divokého typu rýže (Oryza sativa) s přídavkem trehalosa-6-fosfátu a bez něj. Extrakt byl prováděn dvojmo s použitím různého množství extraktu. Jako substrát pro stanovení je použita fruktosa nebo glukosa.
Obr.15: Hexokinasová aktivita extraktu z listů divokého typu kukuřice (Zea mays) s přídavkem trehalosa-6-fosfátu a bez něj. Extrakt byl prováděn dvojmo s použitím různého množství extraktu. Jako substrát pro stanovení je použita fruktosa nebo glukosa.
Obr.16: Fluorescenční charakteristiky tabákových listů divokého typu (trojúhelníky), PC-TPS (čtverečky) a 35S-TPP (kříšky). Horní dva panely ukazují efektivitu transportu elektronů (ETE) při indikovaných intenzitách světla (PAR). Rostliny byly měřeny po temné periodě (horní levý panel) a po světelné periodě (horní pravý panel). Spodní panely ukazují redukci fluorescence způsobenou akumulací asimilátů (nefotochemické zhášení) . Levý a pravý panel se liší stejně jako ve výše uvedenem popisu.
Obr.17: Relativní aktivita sinku jednotlivých částí rostlin transgenních tabáků PC-TPS (Famine) a 35S-TPP (Feast). Indikována je hrubá akumulace C vyjádřená jako procenta celkového obsahu C pro různé části rostlin po světelné periodě (D) nebo po světle + tma (D+N).
Obr.18: Aktuální distribuce uhlíku v jednotlivých částech rostlin transgenních tabáků PC-TPS (Famine) a 35SS-TPP (Feast). Indikována je hrubá akumulace C vyjádřená jako procenta celkové denní akumulace nového C pro různé části rostlin po světelné periodě (D) nebo po světle + tma (D+N).
Obr.19: Snížené a zvýšené předčasné dozrávání u transgenních linií hlávkového salátu exprimujícího PC-TPS nebo PC-TPP ve srovnání s rostlinami divokého typu. Spodní panel ukazuje morfologii a barvu listů.
0 0 00 00 00
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0000 000 0000
0 0000 0 0 0 0 0 000 000
000 000 0 0
0 00000 00 00
Obr.20: Profil rozpustných cukrů (Obr. 20/1) v extraktu transgenních linií hlávkového salátu (horní panel) a transgenních linií řepy (spodní panel). U horního panelu jsou kontroly GUS-transgenní linie, které jsou porovnávány s liniemi pro PC-TPS a PC-TPP. U spodního panelu jsou všechny transgenní rostliny PC-TPS. Profil škrobu je znázorněn na obr. 20/2.
Obr.21: Morfologie rostlin a listů transgenních linií cukrové řepy exprimující PC-TPS (TPS) nebo PC-TPP (TPP) v porovnání s divokým typům rostlin (Control). A-typ TPS má listy, které jsou srovnatelné s divokým typem zatímco D-typ TPS má jasně menší listy. Listy transgenních linií TPP mají světlejší zelenou barvu, větší řapíky a větší velikost v porovnání s kontrolou.
Obr.22: Průměr hlavního kořene trasngenních linií cukrové řepy (PCTPS). Na horním panelu indikují A,B,C, a D snižování velikosti listů v porovnání s kontrolou (A). Na spodním panelu jsou ukázány jednotlivé klony kontroly a linie PC-TPS 286-2.
Obr.23: Výnos hlíz transgenních bramborových linií pMOG799 (35S TPS) .
Obr.24: Výnos hlíz transgenních bramborových linií pMOGlOlO (35S TPP) a pMOG1124 (PC-TPP).
Obr.25: Výnos hlíz 22 nezávislých klonů divokého typu S. tuberosum.
Obr.26: Výnos hlíz transgenních bramborových linií pMOG1093 (PC-TPS) v porovnání s divokým typem. B,C,D,E,F,G indikuje snižující se velikost listů v porovnání s divokým typem (B/C).
Obr.27: Výnos hlíz transgenních bramborových linií pMOG845 (Pat-TPS) (Obr.27-1) v porovnání s divokým typem (Obr.27-2). B, C označují velikost listů.
Obr.28: Výnos hlíz transgenních bramborových linií pMOG1129 (84511/22/28).
·· toto ·· • · ···· • · · « · · • to· ··· · · * to· «· • ·· ·· ·· • to
Obr.29: Příčný řez listy TPP (spodní panel) a TPS transgenních rostlin tabáku. Další vrstva buněk a buněk jsou viditelné na příčném řezu TPS.
• · • ••to · (horní panel) zvětšená velikost
Obr. 30: Analýza HPLC-PED transgenních hlíz na TPSE.coii před a po skladování při 4°C. Kardal, C, F, B, G a H jsou netransgenní kontrolní linie.
Obr.31: Morfologie listu, barva a velikost transgenní linie tabáku. 35S TPS (horní list), divoký typ (prostřední list) a 35S TPP (spodní list).
Obr.32: Metabolické profily transgenních tabákových linií: 35S TPS (pMOG799), 35S TPP (pMOGlOlO), divokého typu (WT), PC-TPS (pMOG1177) a PC-TPP (pMOG1124) . Ukázány jsou hladiny trehalosy, rozpustných cukrů (Obr. 32-1), škrobu (starch) a chlorofylu (Chlorophyll) (Obr. 32-2).
Obr.33: Porovnání výnosu hlíz transgenních linií brambor pMOG1027 (35S as-trehalase) a pMOG1027(845-11/22/28)(35S as-trehalase pat TPS) s výnosem linií brambor divokého typu.
Obr.34: Porovnání obsahu škrobu transgenních linií brambor pMOG1027 (35S as-trehalase) a pMOG1027(845-11/22/28)(35S as-trehalase pat TPS) s liniemi brambor divokého typu. Sekvence všech znázorněných linií je identická s Obr.33.
Obr.35: Porovnání výnosu transgenních linií brambor pMOG1027 (35S as-trehalase) a pMOG1027(845-11/22/28)(35S as-trehalase pat TPS) s výnosem linií brambor divokého typu.
Obr.36: Porovnání výnosu transgenních linií brambor pMOG1092 (PC astrehalase) s výnosem linií brambor divokého typu jako v případě Obr. 35.
· • 4 • 9 4
Obr.37: Porovnání výnosu transgenních linií brambor pMOG1130 (PC as trehalase PC TPS) s výnosem linií brambor divokého typu jako v případě Obr. 35.
Příklady provedení vynálezu
DNA manipulace:
Všechny DNA postupy (izolace DNA z E. coli, restrikce, ligace, transformace, atd.) byly prováděny podle standardních protokolů (Sambrook et al. (1989) Molecular Clonning: a Laboratory manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York).
Kmeny:
Pro klonování E. coli K-12 je ve všech příkladech použit kmen DH5a. Pro transformaci rostlin jsou použity kmeny EHA 105 a MOG 101 Agrobacterium tumefaciens (Hood et al. (1993) Trans Research 2,
208) .
Konstrukce kmenu MOG101 Agrobacterium tumefaciens:
Konstrukce kmenu MOG101 Agrobacterium tumefaciens je popsána v WO 96/21030.
Klonování genu otsA E.coli a konstrukce pMOG799:
V E.coli je trehalosaphosphatsyntasa (TPS) kódována genem otsA lokalizovaným na operonu otsBA. Kolonování a sekvenování genu otsA je podrobně popsáno v Příkladu I ve WO95/01446 uvedeném zde citací. Pro zvýšení exprese v rostlinných buňkách byl otevřený čtecí rámec spojen s regulačním prvkem trankripce promotoru CaMV 35S RNA, zesilovačem translace leaderu ALMV a transkripčním terminátorem nos· genu, jak bylo podrobněji popsáno v Příkladu I ve WO95/01446, jehož výsledkem byl pMOG799. Vzorek kmenu E.coli obsahující pMOG799 byl uložen na základě Budapešťské dohody v Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, P.O. Box 273, 3740 AG Baarn, The Netherlands, v pondělí 23. srpna, 1993: evidenční číslo přidělené International Depositary Institution je CBS 430.93.
··· · · · · · Λ
J ··· ·ζ · ·*····· · i ····· · · Ζ ζ · ·
·..· :
Izolace promotoru patatinu a konstrukce pMOG546:
Část promotoru patatinu je izolována z chromozómové DNA Solárním tuberosum cv. Bintje pomocí polymerázové řetězové reakce. Je syntetizována sada oligonukleotidů komplementárních k protisměrné oblasti patatinového genu Xpat21 skládající se z následujících sekvencí:
5' AAG CTT ATG TTG CCA TAT AGA GTA G 3' PatB33.2 (SEQ ID
NO: 5 )
5' GTA GTT GCC ATG GTG CAA ATG TCC 3' PatATG.2 (SEQ ID NO: 6)
Tyto primery jsou použity pro PCR amplifikaci fragmentu DNA o velikosti 1123 bp, jako templát slouží chromozómová DNA izolovaná z bramboru kv. Bintje. Amplifikovaný fragment vykazuje vysoký stupeň podobnosti s patatinovou sekvencí Zpat 21 a je klonován pomocí EcoRI linkerů do vektoru pUC18, výsledkem čehož je plasmid pMOG546.
Konstrukce pMOG845:
Konstrukce pMOG845 je popsána v WO 96/21030.
Konstrukce pVDH318, plastocyanin-TPS:
Plazmid pMOG798 (popsaný v WO95/01446) je štěpen pomocí HindlII a spojen s oligonukleotidovým duplexem TCV11 a TCV12 (viz konstrukce pMOG845). Výsledný vektor je štěpen pomocí Pstl a HindlII a po následné inzerci terminátoru PotPilI vzniká pTCV118. Štěpením plazmidu pTCV118 pomocí Smál a HindlII je získána část DNA obsahující TPS kódující oblast a PotPilI terminátor. Dále byly přidány BGLII linkery a takto vytvořený fragment byl vnesen do rostlinného binárního expresního vektoru pVDH275 (Obr. 1) rozštěpen BamHI za vzniku pVDH318. pVDH275 je odvozený od pMOG23 (Sijmons et al. (1990), Bio/Technol. 8. 217) obsahující selekční markér NPTII řízený promotorem 35S CaMV a expresní kazetu obsahující plastocyaninový (PC) promotor z hrachu a nos terminační sekvenci. Plastocyaninový promotor obsažený v pVDH275 byl popsán Pwee a Gray (1993) Plant J. 3, 437. Tento promotor byl přenesen do binárního vektoru PCR amplifikaci a primery obsahujícími vhodná klonovaná místa.
i ····· · • · !
«· ·
Klonování otsB genu E. colí a konstrukce pMOGlOlO (35S CaMV TPP): Sada oligonukleotidú TPP I (5' CTCAGATCTGGCCACAAA 3') (SEQ ID NO:
56) a TPP II (5' GTGCTCGTCTGCAGGTGC 3') (SEQ ID NO: 57) byla syntetizována komplementárně k sekvenci genu TPP E.coli (SEQ ID NO: 3). Tyto primery byly použity pro PCR amplifikaci fragmentu DNA o 375bp nesoucí 3'část kódující oblasti TPP genu E.coli, vneseno bylo Pstl místo 10 bp po směru od stop kodonu s použitím pMOG748 (WO 95/01446) jako templátu. Tento PCR fragment byl rozštěpen pomocí BglII a Pstl a klonován do pMOG445 (EP 0 449 376 A2 příklad 7a) a línearizován pomocí BglII a Pstl. Výsledný vektor byl štěpen Pstl a HindlII a byl vložen terminátor PotPilI (viz konstrukce pMOG845). Výše popsaný vektor byl štěpen BglII a HindlII a výsledný fragment o 1325 bp byl izolován a klonován společně s 5'TPP PCR fragmentem štěpeným Smál a BglII v pUC18 línearizován Smál a HindlII. Výsledný vektor vyl nazván pTCV124. Tento vektor byl línearizován pomocí EcoRI a Smál a použit k vložen promotoru 35S CaMV (850 bp EcoRI'Ncol' (místo pro štěpení Ncol bylo znecitlivěno nukleázou z bobů) fragment izolovaný z pMOG18 obsahující 35S CaMV dvounásobně zesilující promotor). Tento vektor byl nazván pTCV127. Z tohoto vektoru byl izolován 2.8 kb EcoRI-HindllI fragment obsahující úplnou 35S TPP expresní kazetu a klonován v binárním vektoru pMOG800 za vzniku vektoru pMOGlOlO.
Konstrukce pVDH321, plastocyanin (PC) TPP
BamHI místo plazmídu pTCV124 bylo odstraněno štěpením, zaplněním a následnou religací. Následným štěpením byl získán fragment obsahující oblast kódující TPP a PotPilI terminátor. Po přidání BamHI linkerú byl výsledný fragment vložen do rostlinného binárního expresního vektoru pVDH275 (rozštěpeného BamHI) za vzniku pVDH321.
Konstrukce patatinového TPP expresního vektoru
Podobně jako při konstrukcí patatinového TPS expresního vektoru (viz konstrukce pMOG845), byl patatinový TPP expresní vektor konstruován za vzniku binárního vektoru (pMOG1128) který, po transformaci zvyšoval specificky v hlízách účinnost exprese TPP.
Ιί. *··· • · -.
• · · • ···· • ·
Konstrukce dalších expresních vektorů:
Podobně jako při konstrukci výše uvedeného vektoru, mohou být genové konstrukty vytvořeny s použitím různých promotorů v kombinaci s TPS, TPP nebo trehalasou pomocí binárních vektorů s NTPII genem nebo genem rezistence k hydromycinu jako selekční markéry. Popis binárního vektoru pMOG22 obsahujícího selekční markér HTP je uveden v Goddijn et al. (1993) Plant J. 4, 863.
Trojnásobné vektory:
Binární vektory jsou mobilizovány v „trojrodičovském,, smísení s kmenem E.coli HB101 obsahujícím plazmid pRK2013 (Ditta et al. (1980) Proč. Nati. Acad. Sci., USA 77, 7347) do Agrobacterium tumefacíens kmen MOG101 nebo EHA105 a to je použito k transformacím.
Transformace tabáku (Nicotiana tabacum cv.SR 1 nebo cv. Sansun NN) Tabák byl transformován společnou kultivací rostlinných pletiv s Agrobacterium tumefacíens kmenem MOG101 obsahujícím příslušný binární vektor jak bylo popsáno výše. Transformace byla provedena společnou kultivací listových disků tabáku tak jak popsal Horsch et al. (1985) Science 227, 1229. Transgenní rostliny byly regenerovány z výhonů rostoucích na selekčním médiu obsahujícím kanamycin, zakořeněny a převedeny do půdy.
Transformace bramboru
Brambor (Solanum tuberosum cv. Kardal) byl transformován kmenem EHA 105 Agrobacterium obsahujícím příslušný binární vektor. Jako základní médium bylo použito MS30R3 médium obsahující MS soli (Murashige a Skoog (1962) Physiol. Plant. 14, 473), R3 vitaminy (Ooms et al. (1987) Theor. Appl. Genet. 73, 744), 30 g/1 sacharózy, 0,5 g/1 MES, pH 5,8 (upraveno KOH) a případně zpevněno 8g/l agarem Daichin. Hlízy Solanum tuberosum cv. Kardal byly oloupány a povrchově sterilizovány opálením v 96% etanolu po dobu 5 sekund. Plameny byly uhašeny ponořením hlízy do sterilní vody a z hlíz byly nakrájeny řezy o tloušťce přibližně 2 mm. Disky vykrájené korkovrtem z vaskulárních pletiv byly inkubovány po dobu 20 min v MS30R3 médiu obsahujícím 1-5 x 10® bakterií/ ml Agrobacterium EHA 105 nesoucího binární vektor. Disky z hlíz byly opláchnuty médiem MS30R3 a • to přeneseny na zpevněné kultivační médium (PM - postculture medium). PM médium se skládalo z MS30R3 média obsahujícího 3,5 mg/1 zeatin ribozidu a 0,03 mg/1 indol octové kyseliny (IAA). Po dvou dnech byly disky přeneseny na čerstvé PM médium obsahující 200 mg/1 cefotaximu a 100 mg/1 vanomycinu. Po dalších třech dnech byly disky z hlíz přeneseny na médium indukující tvorbu výhonů (SIM), které se skládalo z PM média obsahujícího 250 mg/1 carbenicilinu a 100 mg/1 kanamycinu. Po 4-8 týdnech byly výhony regenerující z disků odděleny a přeneseny na kořenící médium (MS30R3 médium se 100 mg/1 cefotaximu, 50 mg/1 vanomycinu a 50 mg/1 kanamycinu). Výhony byly množeny merístemovými řízky.
Transformace salátu
Transformace salátu, Lattuca sativa cv. Evola, byla provedena podle Curtis et al. (1994) J. Exp. Bot. 45, 1441.
Transformace cukrovky
Transformace cukrovky, Beta vulgaris (udržovací populace), byla provedena podle E'ry et al.(1991) Third International Congress of ISPMB, Tucson, USA, abstrakt č. 384, nebo podle Krens et al. (1996), Plant Sci. 116, 97.
Transformace Lycopersicon esculentum
Rajče bylo transformováno podle Van Roekel et al. (1993) Plant Cell
Rep. 12, 644.
Transformace Arabidopsis
Transformace Arabidopsis thaliana byla provedena buď podle metody popsané Clarke et al. (1992) Plant Mol. Biol. Rep. 10, 178 nebo metodou popsanou Valvekens et al. (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85, 5536.
Indukce mikrohlízek
Stonkové řízky rostlin bramboru pěstovaných in vitro obsahující vedlejší meristem byly přeneseny na médium pro indukci mikrohlízek. Médium pro indukci mikrohlízek obsahovalo lx MS soli doplněné R3 vitaminy, 0,5 g/l MES (konečné pH 5,8 bylo upraveno KOH) a zpevněno g/l agarem Daichin a dále obsahovalo 60 g/l sacharózy a 2,5 mg/1 kinetinu. Mikrohlízky se vytvořily po 3 až 5 týdnech růstu ve tmě při 24°C.
Izolace Validamycinu A
Bylo zjištěno, že validamycin A je vysoce specifickým inhibitorem trehalas z různých zdrojů v rozsahu, (IC50) 10° M až ΙΟ'10 M (Asano et al. (1987) J. Antibiot. 40, 526; Kameda et al. (1987) J. Antibiot. 40, 563). S výjimkou trehalasy nebyly významně inhibovány aktivity žádné a- nebo β- glykohydrolasy. Validamycin A byl izolován ze Solacolu, komerčního zemědělského přípravku (Takeda Chem. Indust., Tokyo) jak podle postupu popsaného Kendall et al. (1990)
Phytochemistry 29, 2525. Postup zahrnoval iontoměničovou chromatografií (QAE-Sephadex A-25 (Pharmacia), bed vol. 10 ml, ekvilibrační pufr 0,2 mM Na-Pi, pH 7) z 3 % zemědělského přípravku Solacol. Na kolonu byl nanášen 1 ml Solacolu a eluován vodou v 7 frakcích, v podstatě veškerý Validamycin byl obsažen ve frakci 4. Na základě 100 % výtěžnosti při tomto postupu byla v testech akumulace trehalosy upravena koncentrace Validamycinu A v MS médiu na 1 . 103 M. Validamycin A a B může být také purifikován přímo ze Sreptomyces hygroscopicus var. limoneus podle metody popsané v Iwasa et al. (1971) J. Antibiot. 24, 119, jehož obsah je zde zahrnut citací.
Analýza glycidů
Obsah glycidů byl kvantitativně stanoven pomocí iontoměničové chromatografie pulsní elektrochemickou detekcí. Extrakty byly připraveny extrakcí zmraženého zhomogenizovaného materiálu 80 %
EtOH. Po 15 minutové extrakci při pokojové teplotě byla rozpustná frakce odpařena a rozpuštěna v destilované vodě. Vzorky (25 μΐ) byly analyzovány na kapalinovém chromatografu Dionex DX-300 s 4 x 250 mm Dionex 35391 carbopac PA-1 kolonou a 4 x 50 mm Dionex 43096 carbopac PA-1 předkolonou. Pro eluci byl použit 100 mM NaOH (1 ml/min) a poté NaAc gradient.
Cukry byly detekovány pulsním elektrochemickým detektorem (Dionex, PED) . Jako standard byly použity komerčně dostupné glycidy (Sigma).
Analýza škrobu
Škrob byl analyzován tak jak popsal Aman et al. (1994) Methods ín Carbohydrate Chemistry, Volume X (eds. BeMiller et al.) , pp. 111 115.
Analýza exprese
Exprese genů vnesených do různých rostlinných druhů byla hodnocena pomocí Northern blotu.
Stanovení trehalosa-6-fosfát fosfatasy
TPP byla stanovena měřením produkce [14C] trehalosy z [14C] trehalosa6-fosfátu při 37° C (Londesborough a Vuorio (1991) J. of Gen. Microbiol. 137, 323). Hrubý extrakt byl připraven v 25 mM Tris, HCl pH 7,4 obsahujícím 5,5 mM MgCl2. Vzorky byly zředěny na koncentrací proteinů 1 mg/ml extrakčním pufrem obsahujícím 1 mg/ml BSA. Standardní reakční směs (konečný objem 50 μΐ) obsahovala 27,5 mM Tris, HCl pH 7,4, 5,5 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA a 0,55 mM T-6-P (specifická aktivita 854 cpm/nmol). Reakce byla započata přidáním 5 μΐ enzymu a zastavena zahřátím ve vroucí vodě po dobu 5 minut. Po přidání AG1-X8 (formáte) iontoměniče (Biorad) a 20 minutové ekvilibraci při pokojové teplotě byly reakční směsi centrifugovány. Radioaktivita ve vzorcích supernatantu (400 μΐ) byla měřena scintilačním počítačem.
Příprava rostlinných extraktů pro stanovení hexokinas
Zmražený rostlinný materiál byl rozdrcen v kapalném dusíku a 30s homogenizován v extrakčním pufru (EP: 100 mM HEPES pH 7,0 (KOH), 1% (hm/obj) PVP, 5 mM MgCl2, 1,5 mM EDTA, 0,1 % obj/obj β-MeOH) obsahujícím Proteinase Inhibitors Complete (Boehringer Mannheim) . Po centrifugaci byly proteiny v supernatantu precipitovány 80 % síranem amonným, rozpuštěny v Trís-HCl pH 7,4 a extrakt dialyzován přes noc proti 100 mM Tris-HCl pH 7,4. Část vzorku byla použita pro stanovení hexokinas.
Stanovení hexokinas • · ···♦ · ; ; · · · • · · .· ·· ·· ·· · ··· ·
Aktivita hexokinas byla měřena při 25°C hodnocením změny absorbance (OD) při 340 nm ve směsi obsahující 0,1 M Hepes-KOH pH 7,0, 4 mM MgCl2, 5 mM ATP, 0,2 mM NADP+, 10 U/ml kreatinfosfátkinasy (rozpuštěné v 50 % glycerolu, 0,1 % BSA, 50 mM Hepes pH 7,0), 3,5 mM kreatinfosfátu, 7 U/ml glukosa-6-fosfát dehydrogenasy a 2 mM glukózy.
Byla-li pro stanovení aktivity hexokinas místo glukosy jako substrát použita 2 mM fruktosa, byly přidány 3,8 U/ml fosfoglukosaizomerasy. Hexokinasy byly též stanoveny metodou podle Gancedo et al. (1977) J. Biol. Chemm, 252, 4443.
Příklad 1
Exprese genu otsA (TPS) z E. coli v tabáku a bramboru
Transgenní rostliny tabáku byly vytvořeny vnesením otsA genu řízeného promotorem de35SCaMV (pMOG799) nebo plastocyaninovým promotorem (pVDH318).
Transgenní rostliny bramboru byly vytvořeny vnesením otsA genu řízeného patatinovým promotorem specifickým pro hlízy (pMOG845).
Listové disky tabáku byly transformovány binárním vektorem pMOG799 s použitím Agrobacteriwn tumefacíens. Transgenní výhony byly selektovány na kanamycinu.
Listy některých rostlin pěstovaných v půdě se nevyvinuly plně v laterálním směru, což vedlo k vytvoření jejich kopinaté morfologie (Obr. 31). Dále také potlačená apikální dominance vedla k zakslému růstu rostlin a vytváření axilárních výhonů. 7 ze 32 rostlin vykazovalo silně omezený růst s výškou rostlin 4-30 cm v době kvetení (Tab. 1).
• · ··· *· ·
Tabulka 1. Akumulace trehalosy ve vzorcích listů ofcsA transgenních rostlin tabáku a jejich výška v době kvetení
rostlina - linie trehalosa mg.g1 čerstvé váhy výška cm
kontrola 0, 00 60-70
799-1 0,04 ND
799-3 0, 02 10
799-5 0,08 4
799-15 0, 055 30
799-24 0, 02 12
799-26 0,05 25
799-32 0,055 30
799-40 0, 11 25
ND: nebylo hodnoceno
Kontrolní rostliny dosáhly v době kvetení výšky 60-70 cm. Transgenní linie se zakrslým fenotypem vytvářely menší množství semen. Analýza pomocí Northern blotu potvrdila, že rostliny se zakrslým fenotypem exprimují gen otsA z E. coli (Obr. 2).V kontrolních rostlinách nebyly transkripty zjištěny. Funkčnost vneseného genu byla potvrzena analýzou glycidů v listovém materiálu ze 32 transgenních rostlin tabáku pěstovaných ve skleníku, při které bylo zjištěno 0,02 až 0,12 mg.g“1 čerstvé váhy trehalosy v rostlinách s omezeným růstem (Tab. 1), což naznačuje, že produkt reakce katalyzované TPS je defosforylován fosfatasami rostliny. Další důkaz akumulace trehalosy v rostlinách tabáku byl získán po ošetření surových extraktů prasečí trehalasou. Výsledkem prodloužené inkubace extraktů z listů tabáku s trehalasou byla úplná degradace trehalosy (výsledky nejsou uvedeny). Přítomnost trehalosy nebyla prokázána v kontrolních rostlinách a rostlinách tabáku, které se nevyznačovaly aberantním fenotypem.
Tabulka la. Primární transformanty tabáku PC-TPS (dt=divoký typ)
Rostlina - linie List č. hm. (g) Ploch a listu (cm2) Počet odvětv ení Výška rostl in (cm) Barva listu Axilá rní výhon y Č.hm./ plochu (g/cm2) Sušin a (%) Sušina/ plochu (g/cm2)
kontr. 1 8,18 349,3 1 dt 0,023 7,21 0,0017
kontr. 2 10, 5 418,8 1 dt 0, 025 9, 52 0,0024
kontr. 3 9, 99 373, 8 1 dt 0, 027 12,91 0,0035
kontr. 4 9, 91 362, 9 1 dt 0, 027 9,59 0,0026
kontr. 5 9, 82 393, 8 1 dt 0, 025 11,51 0,0029
průměr 0,0254 10,14 0,0026
2 8,39 290 2 105 dt 0,029 12,16 0,0035
3 9, 34 296 1 123 dt 0,032 12,21 0,0039
4 8,36 254 2 130 dt četné 0, 033 10, 05 0,0033
6 2,28 106 5 90 dt 0,022 11,40 0,0025
8 5,21 133 4 100 tmavá četné 0, 039 7,49 0,0029
10 8,08 258 2 165 tmavá četné 0,031 12,25 0,0038
11 2, 61 64 12 95 tmavá četné 0,041 9, 20 0,0038
13 2, 83 92 1 150 tmavá četné 0, 031 8,48 0,0026
16 5,8 6+- 7209---+ lESSgsĚř tmavá četné 0,0-28.-
17 5,15 224 2 155 dt 0,023 11,65 0,0027
18 17,2 547 1 133 dt 0,031 10,35 0,0033
19 2,13 63 4 80 tmavá četné 0, 034 11,74 0,0040
20 3, 44 113 4 90 dt+tm četné 0, 030 8, 14 0,0025
21 9, 88 246 1 105 tmavá četné 0, 040 8,50 0,0034
22 13, 1 409 1 135 dt 0, 032 10, 68 0,0034
23 2,50 73 6 55 tmavá četné 0, 034 8,80 0,0030
24 8,76 286 2 130 dt 0,031 15,07 0,0046
27 7, 91 219 1 124 dt 0, 036 14,41 0,0052
28 10,0 269 2 117 tmavá četné 0, 038 8, 62 0,0032
29 4,17 142 1 85 tmavá četné 0, 029 10,07 0,0030
30 10,2 343 1 160 dt 0, 030 9,56 0,0029
32 1, 95 61 3 75 tmavá četné 0, 032 8,21 0,0026
33 2,85 96 5 95 dt+tm četné 0,030 11,23 0,0033
34 8,38 244 1 123 dt 0, 034 13,60 0,0047
35 5,59 173 3 126 dt 0, 032 14,49 0,0047
36 3,28 84 3 100 tmavá četné 0,039 11,28 0,0044
37 7,80 222 1 125 dt+tm četné 0,035 11,28 0,0040
39 3,70 131 2 123 dt 0, 028 17,84 0,0050
40 2,40 68,5 3 108 tmavá četné 0, 035 9,58 0,0034
průměr 0, 032 11,00 0,0035
Rostliny transgenního tabáku pVDH318 se vyznačovaly zakrslým vzrůstem a tvorbou malých listů, které byly tmavší a poněkud silnější než listy kontroly, fenotypem se podobaly transgenním rostlinám pMOG799 (Tab. Ia). Při další analýze těchto listů byl zjištěn vyšší obsah čerstvé váhy a sušiny na listovou plochu v porovnání s kontrolou (Tab. Ia a 2). Tmavší barva listů indikuje vyšší obsah chlorofylu v listech transgenních rostlin (Tab. Ib) .
V transformantech pMOG799 (35STPS) a pMOG1177 (PCTPS) byl analyzován obsah glycidů, chlorofylu, trehalosy a škrobu (Obr. 32). pMOG1177 je funkčně identický s pVDH318.
Tabulka 1b Obsah chlorofylu v listech transgenních rostlin PC-TPS N. tabacum (To)
Vzorek Chlorofyl (mg/g listu)
kontrola 1 0,59
PC TPS 10-1 0,75
PC TPS 10-2 0, 80
PC TPS 11 0,60
PC TPS 13 0,81
PC TPS 16 0, 90
PC TPS 19 0, 64
PC TPS 37 0, 96
Poznámka: světelné podmínky v průběhu růstu významně ovlivňují stanovený obsah chlorofylu. Proto může být obsah chlorofylu porovnáván pouze u rostlin sklizených a analyzovaných v rámci jednoho pokusu!
Tabulka 2: Čerstvá váha a obsah sušiny (DW) listového materiálu transgenních rostlin s genem pro plastocyanin-TPSE.coli
PC-TPS transgenní N.tabacum cv. Samsun NN
Transgen Kontrola
Čerstvá váha (g) 0, 83 0,78
Sušina (g) 0, 072 0,079
% sušiny 8,70 % 10,10 %
Č.HM./plocha 39 (139 %) 28 (100 %)
DW/plocha 3,46 (121 %) 2,87 (100 %)
plocha (jednotek) 208 275
Vypočtený poměr mezi délkou a šířkou vyvíjejících se listů indikuje, že listy transgenních rostlin PC-TPS jsou více kopinaté (Tab. 3).
Disky z hlíz bramboru Solanum tuberosum cv. Kardal byly transformovány Agrobacterium tumefaciens EHA105 obsahujícím binární vektor pMOG845. Transgeny byly získány s transformační frekvencí srovnatelnou s kontrolou obsahující pouze prázdný vektor. Z hlediska fenotypu byly všechny získané rostliny nerozeznatelné od divokého typu rostlin, což indikuje, že použití pletivově specifického promotoru brání vzniku fenotypů pozorovaných u rostlin, u kterých je TPS gen řízen konstitutivním promotorem. Mikrohlízky byly indukovány na stonkových řízcích transgenních a netransformovaných rostlin pěstovaných na médiu indukujícím tvorbu mikrohlízek obsahujícím 10'3M Validamycin A. Jako kontrola byla použita indukce mikrohlízek na médiu bez Validamycinu A. Mikrohlízky indukované na médiu obsahujícím Validamycin A vykazovaly zvýšenou hladinu trehalosy ve srovnání s mikrohlízkami vypěstovanými na médiu bez Validamycinu A (Tab. 4). Přítomnost malého množství trehalosy v netransformovaných rostlinách indikuje přítomnost funkční dráhy biosyntézy trehalosy.
Tabulka 3. Transgenní rostliny tabáku (cv. Samsun) s genem pro pVDH318
Transformant Délka (cm) Šířka (cm) Poměr
kontrola 1 12 8 1,50
kontrola 2 13 8, 5 1, 53
kontrola 3 12 7,5 1,60
kontrola 4 15 9 1,67
kontrola 5 25 16 1,56
kontrola 6 24 16, 5 1,45
kontrola 7 28 20 1,40
kontrola 8 25 16 1,56
kontrola 9 26 19 1,37
kontrola 10 21 15 1,40
1318-28 16 8,5 1, 88*
1318-29 11 6, 5 1,69
1318-30 19 14 1,36
1318-35 19 12 1,58
1318-39 21 16, 5 1, 27
1318-40 14 7 2,00*
1318-34 21 13 1, 62
1318-36' '13^5-- ~·' 7.
1318-37 17 9 1,89*
1318-4 20, 5 12 1,71
1318-23 14 4,5 3,78*
1318-22 27 18 1,50
1318-19 9 4 2,25*
1318-2 27 19 1, 42
1318-15 11 5 2,20*
1318-10 20 13 1,54
1318-3 25 18 1,39
1318-21 17 8,5 2,00*
1318-16 20 10 2, 00*
1318-6 19 10,5 1,81
1318-20 13 5 2, 60
1318-33 12 5 2,40
1318-27 23 20 1,15
1318-11 12 5 2,40*
1318-8 18, 5 6,5 2,85*
1318-24 27 17 1, 59
1318-13 15 7 2,14*
1318-17 24 16 1,50
1318-18 23 16,5 1,39
* - typický TPS fenotyp
Poměr délka/šířka u kontrol je 1,50.
Tabulka 4. Trehalosa (% čerstvé váhy)
+ Validamycin Ά - Validamycin Ά
845-2 0, 016
845-4 -
845-8 0,051 -
845-11 0, 015
845-13 0,011 -
845-22 0, 112 -
845-25 0,002
845-28 0,109 -
divoký typ Kardal 0,001 —
Příklad 2
Exprese genu otsB (TPP) z E. coli v tabáku:
Byly vytvořeny transgenní rostliny v vneseným genem otsB řízeným dvojnásobným 35SCaMV promotorem (pMOGlOlO) a plastocyaninovým promotorem (pVDH321).
Rostliny tabáku (cv.Samsun) transformované pMOGlOlO vytvářely ve skleníku výrazně velké listy (plocha listu dosahovala v průměru 140 %), na kterých se v začaly v době plného rozvoje vytvářet chlorózy (Obr. 31). Tyto rostliny měly také ve srovnání s kontrolními silnější stonky, což u některých vedlo až k jejich praskání. V některých případech vyrůstaly z báze rostliny další stonky (Tab. 5) . V listových vzorcích z rostlin vytvářejících velké listy byla zjištěna 5-10x vyšší aktivita trehalosa-6-fosfátfosfarasy ve srovnání s kontrolou, což dokazuje funkčnost vneseného genu. Suchá a čerstvá váha/cm2 abnormálně velkých listů byla srovnatelná s kontrolou, takže zvýšená velikost listu je způsobena zvýšeným obsahem sušiny a ne vody. Exprese TTP ovlivnila též květenství rostlin. Rostliny se zakrslým fenotypem, pravděpodobně způsobeným konstitutivní expresí TPP genu ve všech částech rostliny, vytvářely mnoho drobných květů, které se plně nevyvinuly a opadávaly nebo nekrotizovaly. Vývoj květů a tvorba semen byla méně rostlin méně zakrslých.
narušena u
Tabulka 5. Transgenní rostliny tabáku s genem pMOGlOlO, de 35S CaMV TPP
Linie Výška (cm) Plocha listu (cm2) Blednutí (5- silné) Počet odvětvení č.hm./ cm2(g) Sušina/ cm2 (g) Květy Norm. / Průměr stonku (mm)
1 63 489 5 + 0,096 0,0031 A 13
2 90 472 3 + 0, 076 0,0035 A 19
3 103 345 0 0, 072 0,0023 N 16
4 90 612 4 + 0,096 0,0039 A 5,6,7,8,1 4
5 104 618 1 + 0, 08 0,0035 N 17
6 110 658 3 + 0, 078 0,0035 N/A 19
7 120 427 0 0, 074 0,0037 N 18
8 90 472 2 + 0, 076 0,0023 A 6, 7,18
9 60 354 3 + 0, 092 0,0031 N 9,13
10 103 342 0 0, 084 0,0025 N 16
11 110 523 1 + 0, 076 0,0031 A 18
12 90 533 1 + 0, 098 0,0023 N 5,16
13 53 432 4 + 0,084 0,0043 A 5, 6,6,14
14 125 335 0 0, 086 0,0023 N 17
15 85 251 0 0, 094 0,0031 N 14
16 64 352 . 0 0_,
17 64 2 67 0 0,11 0,0018 N '···? ··.—r ·
18 71 370 2 0, 086 0,0032 A 5,7,8,14
19 92 672 4 + 0, 076 0,0034 N 16
20
21 94 517 4 + 0,07 0,0044 N 17
22 96 659 3 + 0, 082 0,0031 N 17
23 110 407 0 0, 082 0,0042 N 16
24 90 381 0 0,1 0,0034 A 15
25 120 535 0 0, 076 0,003 N 16
26 42 511 5 0, 08 0,0038 7 15
27 100 468 0 0, 086 0,0018 N 17
28 83 583 3 0, 072 0,0034 N/A 17
29 27 452 5 + 0,104 0,004 7 7,7,15
30 23 479 4 + 0,076 0,0027 7 6,6,7,9,1 4
31 103 308 1 0, 086 0,0027 N 14
32 48 286 0 0,108 0, 002 N 16
33 67 539 5 + 0,102 0,0056 A 18
34 40 311 5 + 0,084 0,0051 A 7,7,12
Tabulka 6. Primární transformanty tabáku PC-TPP
Rostlina - linie List č. hm. (g) Plocha listu (cm2) Počet odvětv ení Výška rostl in (cm) Barva listů Blednutí Č.hm./ plocha Sušina S Sušina/ plocha
Kontr. 1 8,18 349,37 0, 023 7,213
Kontr. 2 10,5 418,89 0, 025 9,524
Kontr. 3 9,99 373,87 0,027 12,913
Kontr. 4 9, 91 362,92 0,027 9,586
Kontr. 5 9,82 393,84 0, 025 11,507
průměr 0,0255 10,149 0,0026
11 11,5 338 3 114 dt 0,0340 6, 43 0,0022
12 20,1 742 světí blednutí 0,0272 9,82 0,0027
14 9, 61 345 1 150 dt 0,0279 11,65 0,0032
16 5,99 234 5 54 světí blednutí 0,0256 12,85 0,0033
17 9,10 314 3 105 dt 0,0290 8,79 0,0025
18 3,78 158 3 75 světí 0,0239 7,67 0,0018
19 2,98 130 1 70 světí 0,0229 10,74 0,0025
20 8,33 296 3 70 světí blednutí 0,0281 7,56 0,0021
22 11,5 460 1 117 světí blednutí 0,0251 3,03 0,0008
24 ··-·'·· 9,42 369 1 · 1-SStSt ď&g|j&Ěi8ag
25 15,9 565 1 170 dt 0,0282 9,54 θ', 0Ό27
26 8,07 343 2 155 dt 0,0235 15,37 0,0036
28 11,7 411 2 65 světí blednutí 0,0286 6, 90 0,0020
29 11, 6 420 1 117 světí blednutí 0,0277 3,53 0,0010
31 8,21 307 2 153 dt 0,0267 12,79 0,0034
32 4,03 175 1 70 světí 0,0230 18,86 0,0043
34 4,81 203 1 107 světí 0,0237 20,58 0,0049
35 7,86 307 3 130 světí 0,0256 11,45 0,0029
36 4,90 206 2 95 světí 0,0238 22,65 0,0054
37 13,9 475 1 135 dt 0,0293 4,82 0,0014
38 16,6 614 1 90 světí blednutí 0,0271 3,31 0,0009
39 14,9 560 1 112 dt blednutí 0,0267 6,08 0,0016
40 24,5 843 0,0292 9,80 0,0029
41 8,86 343 1 115 dt 0,0258 2,93 0,0008
42 6, 93 289 1 dt 0,0240 3,32 0,0008
43 11,3 433 136 135 dt 0,0261 6,73 0,0018
44 10,0 341 2 135 dt 0,0294 6,49 0,0019
45 9,40 327 2 135 dt 0,0287 8,51 0,0024
46 9,18 284 2 115 dt 0,0323 15,69 0,0051
průměr 0,027 9,60 0,0025
dt- divoký typ
Vývoj pVDH321 transformantů tabáku (cv. Samsun NN) ve skleníku byl srovnatelný s transgenními rostlinami pMOGlOlO (Tab. 6).
V transgenních rostlinách pMOGlOlO (35S-TPP) a pMOG1124 (PC-TPP) byl analyzován obsah glycidů, chlorofylu, trehalosy a škrobu (Obr. 32). Obsah chlorofylu je uveden v tabulce 6a.
Tabulka 6a. Obsah chlorofylu v listech transgenních rostlin PC-TPP N. tabacum (To)
Vzorek Chlorofyl (mg/g listu) Fenotyp listu
Kontrola 1 1,5 6 divoký typ
Kontrola 2 1, 40 divoký typ
Kontrola 3 1,46 divoký typ
Kontrola 4 1,56 divoký typ
Kontrola 5 1,96 divoký typ
PC TPP 12 0,79 blednutí
PC TPP 22 0,76 blednutí
PC TPP 25 1,30 divoký typ
PC TPP 37 0,86 divoký typ
PC TPP 38 0,74 blednutí
Poznámka: světelné podmínky během růstu mohou významně ovlivnit zjištěný obsah chlorofylu. Hodnoty chlorofylu mohou být proto porovnávány pouze u rostlin sklizených a analyzovaných v průběhu jednoho pokusu!
Příklad 3
Izolace částí genu kódujících trehalosa-6-fosfátsyntasy ze Selaginella lepidophylla a Helianthus annuus
Při porovnání sekvencí TPS proteinu z E. coli a S. cerevisiae byla zjištěna přítomnost několika konzervovaných oblastí. Tyto oblasti byly použity pro konstrukci degenerovaných primerů, které byly testovány pro PCR amplifikaci. Jako templát byla použita genomová
DNA z E.coli a kvasinek. K usnadnění annealingu degenerovaných primerů byl použit PCR program s postupně se měnící teplotou mezi annealingem a elongačním krokem.
Pro PCR amplifikaci byly použity sety primerů TPSdeg 1/5 a TPSdeg 2/5 a cDNA z Selaginella lepidophylla jako templát.
Použité degenerované primery (kód IUB):
TPSdegl: GAY ITI ATI TGG RTI CAY GAY TAY CA (SEQ ID NO:7)
TPSdeg2: TIG GIT KIT TYY TIC AYA YIC CIT TYC C (SEQ ID NO: 8
TPSdeg5: GYI ACI ARR TTC ATI CCR TCI C (SEQ ID NO: 9
PCR fragmenty předpokládané velikosti byly klonovány a sekvenovány. Velké množství takto získaných homologních sekvencí bylo poté analyzováno pomocí Southern blotu hybridizací s genomovou DNA ze Selaginella. Byly izolovány dva klony: klon 8, jehož sekvence je uvedena v SEQ ID NO:42 (kombinace PCR primerů 1/5) a klon 43, jehož sekvence jsou uvedeny SEQ ID NO: 44 (kombinace PCR primerů 2/5), které obsahovaly oblasti s vysokým procentem podobnosti s genem TPS z E.coli a kvasinek na úrovni aminokyselin.
Jeden fragment TPS genu byl izolován PCR amplifikaci z Helianthus anuus (slunečnice) pomocí kombinace primerů TPSdeg 2/5 a genomové DNA z H. anuus jako templátu. Sekvenční analýza a Southern blot potvrdily homologii mezi TPS genem z E. coli, kvasinkami a Selaginella.Z porovnání těchto sekvencí se sekvencemi EST (expressed sequence tags) z různých organizmů, viz Tab. 6b a SEQ ID NOS 45-53 a 41, vyplývá přítomnost vysoce homologních genů v rýži a Arabidopsis, což podporuje náš objev, že většina rostlin obsahuje geny homologní k TPS (Obr. 3).
Tabulka 6b.
dbEST ID. Genbank Organizmus Funkce
35567 D22143 Oryza sativa TPS
58199 D35348 Caenorhabditis elegans TPS
60020 D36432 Caenorhabditis elegans TPS
87366 T36750 Saccharomyces TPS
35991 D22344 Oryza sativa TPS
57576 D34725 Caenorhabditis elegans TPS
298273 H37578 Arabidopsis thaliana TPS
298289 H37594 Arabidopsis thaliana TPS
315344 T76390 Arabidopsis thaliana TPS
315675 T76758 Arabidopsis thaliana TPS
317475 R65023 Arabidopsis thaliana TPS
71710 D40048 Oryza sativa TPS
401677 D67869 Caenorhabditis elegans TPS
322639 T43451 Arabidopsis thaliana TPS
76027 D41954 Oryza sativa TPP
296689 H35994 Arabidopsis thaliana TPP
297478 H36783 Arabidopsis thaliana TPP
300237 T21695 =&řa b i dopsW
372119 U37923 Oryza sativa TPP
680701 AA054930 Brugia malayi trehalasa
693476 C12818 Caenorhabditis elegans trehalasa
311652 T21173 Arabidopsis thaliana TPP
914068 ΑΆ273090 Brugia malayi trehalasa
43328 T17578 Saccharomyces TPP
267495 H07615 Brassica napus trehalasa
317331 R64855 Arabidopsis thaliana TPP
15008 T00368 Caenorhabditis elegans trehalasa
36717 D23329 Oryza sativa TPP
71650 D39988 Oryza sativa TPP
147057 D49134 Oryza sativa TPP
401537 D67729 Caenorhabditis elegans trehalasa
680728 AA054884 Brugia malayi trehalasa
694414 C13756 Caenorhabditis elegans trehalasa
871371 AA231986 Brugia malayi trehalasa
894468 AA253544 Brugia malayi trehalasa
86985 T36369 Saccharomyces TPP
Příklad 4
Izolace rostlinných genů TPS a TPP z Nicotiana tabacum:
Části cDNA kódující TPS a TPP byly izolovány pomocí PCR z cDNA odvozené z celkové RNA z listů tabáku. Sloupec označený spojení v tabulce 7 udává, jestli byl k získání odpovídajícího fragmentu DNA nutný druhý cyklus PCR amplifikace se sadou primerů 3 a 4. Primery jsou zahrnuty v seznamu sekvencí (Tab. 7). Subklonování a následná sekvenční analýza DNA fragmentů získaných pomocí uvedených sad primerů vykazovaly značnou homologii se známými TPS geny (Obr. 4 a 5) .
Tabulka 7. Arnplifikace rostlinných TPS a TPP cDNA.
TPS-CDNA primer 1 primer 2 spoj e ní primer 3 primer 4
825 bp Tre-TPS-14 Deg 1 ne
SEQ ID. NO SEQ ID NO SEQ ID NO
22 & 23 30 7
840 bp Tre-TPS-14 Tre-TPS-12 ano Tre-TPS -13 Deg 5
SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO
18 & 19 30 31 32 9
630 bp Tre-TPS-14 Tre-TPS-12 ano Deg 2 Deg 5
SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO 8 SEQ ID NO
20 & 21 30 31 9
TPP- cDNA primer 1 primer 2 spojení
723 bp Tre-TPP -5 Tre-TPP-1.6 ne
SEQ ID NO 16 & SEQ ID NO SEQ ID NO
17 3 5 38
543 bp Tre-TPP -7 Tre-TPP-1.6 ne
SEQ ID NO 14 SEQ ID NO SEQ ID NO
3 6 38
447 bp Tre-TPI -1.1 Tre-TPP-16 ne
SEQ ID NO 12 SEQ ID NO SEQ ID NO
37 38
Příklad 5
Izolace dvojdílného genu TPS/TPP z Helianthus annuus a Nicotiana tabacum:
Celá délka TPS klonu slunečnice (Helianthus annuus) byla získána pomocí RACE-PCR technologie na základě údajů o sekvenci fragmentu tohoto genu.
Sekvenční analýza celé délky tohoto klonu a vyrovnání s TPS2 z kvasinek (Obr. 6) a sekvence kódující TPS a TPP ukazují, že izolovaný klon kóduje bipartitní enzym TPS/TPP (SEQ ID NO 24, 26 a 28). Izolovaný bipartitní klon (pMOG1192) byl uložen 21. dubna 1997 v Central Bureau for strain collections podle pravidel Budapešťské smlouvy pod číslem CBS692.97.
Dále jsme zjišťovali, jestli i jiné rostlinné druhy obsahují bipartitní klony TPS/TPP. Dvojdílná TPS/TPP cDNA byla amplifikována z tabáku. Po PCR amplifikaci s primery TPS degl/TRE-TPP-16 a spojení s TPS deg2/TRE-TPP-15 (SEQ ID NO: 33) byl detekován DNA produkt o předpokládané velikosti (tj. 1,5 kb). Stejný band se objevil po PCR s TPS degl/TRE-TPP-6 (SEQ ID NO: 34) a spojení s TPS deg2/TRE-TPP15. Tento druhý fragment hybridizoval s bipartitní cDNA ze slunečnice v Southern blotu. Dále byl také identifikován bipartitní klon (SEQ ID NO: 39) z Arabidopsis v počítačové databázi.
Příklad 6
Exprese rostlinného genu TPS v rostlinách
Další důkaz funkce TPS genů ze slunečnice a Selaginella lepidophylla byl získán při izolaci odpovídajících klonů cDNA plné délky a následné expresi těchto klonů řízené 35S CaMV promotorem v rostlinách. Akumulace trehalosy při expresi enzymu ze Selaginella popisují Zentella a Iturriaga (1996) (Plant Physiol. 111, Abstrakt 88) .
Příklad 7
Geny kódující TPS a TPP z jednoděložných druhů
V počítačové databázi sekvencí Genebank bylo nalezeno několik ESTsekvencí z rýže homologních s TPS1 a TPS2 z kvasinek (Obr. 7), které jsou uvedeny v seznamu sekvencí (SEQ ID. NO: 41, 51 52 a 53). Příklad 8
Izolace lidského TPS genu
TPS gen byl izolován z lidské cDNA, na které byla provedena PCR reakce s použitím degenerovaných TPS primerů deg2 a deg5 a získán TPS fragment o předpokládané délce 0,6 kb. Sekvenční analýza a porovnání s TPS sekvencí z kvasinek naznačuje, že izolovaná sekvence kóduje homologní TPS protein (Obr.8).
Příklad 9
Inhibice endogenní exprese TPS anti-sense inhibicí:
Exprese endogenních genů TPS může být inhibována anti-sense expresí homologního TPS genu řízeného takovými sekvencemi promotoru, které spouští expresi anti-sense TPS genu v buňkách nebo pletivech, ve kterých je inhibice požadována. Pro tento účel se dává přednost sekvenci zcela identické s potlačovaným TPS genem, i když není nutné exprimovat celou kódující oblast v anti-sense expresním vektoru. Bylo zjištěno, že fragmenty této kódující oblasti jsou také funkční při anti-sense inhibici exprese genu. Další možností při anti-sense strategii je využití heterologních genů, pokud jsou dostatečně homologní s endogenním genem.
K ověření opačné orientace kódujících oblastí potlačovaných vnesených genů je možné použít podobné binární vektory jako jsou pMOG845 a pMOGlOlO. Všechny promotory použitelné pro řízení exprese genů v cílových pletivech jsou vhodné i pro anti-sense expresi genů.
Příklad 10
Inhibice endogenní exprese TPP anti-sense inhibici
Podobně jako jsou konstruovány vektory, které mohou být použity k řízení anti-sense exprese tps v buňkách a pletivech (Příklad 9), mohou být konstruovány také vektory řídící anti-sense expresi genů TPP.
Příklad 11
Akumulace trehalosy v tabácích divokého typu a rostlinách bramboru pěstovaných na Validamycinu A:
Důkaz přítomnosti dráhy biosyntézy trehalosy v tabáku byl získán při pěstování divokého typu rostlin za přítomnosti 10’3 inhibitoru trehalasy Validamycinu A. Ošetřené rostliny akumulovaly velmi malá množství (do 0,0021 % č.hm.) trehalosy. Akumulace trehalosy nebyla nikdy zjištěna v kontrolních rostlinách pěstovaných bez inhibitoru. Podobné výsledky byly získány u mikrohlízek divokého typu pěstovaných v přítomnosti Validamycinu A. Deset linií ze sedmnácti akumulovalo v průměru 0,001% (č. hm.) trehalosy (Tab. 4). V mikrohlízkách indukovaných na médiu bez Validamycinu A nebyl zjištěn žádný obsah trehalosy.
Příklad 12
Akumulace trehalosy v transgenních rostlinách bramboru s genem pro as-trehalasu:
Další důkaz přítomnosti endogenních genů pro biosyntézu trehalosy byl získán transformací bramboru divokého typu 35S CaMV antitrehalosa konstruktu (SEQ ID NO:54 a 55, pMOG1027 popsaný v WO 96/21030) . Ve výhonech transgenního bramboru pMOG1027 byla zjištěna akumulace trehalosy do 0,008 % čerstvé hmotnosti. Identita píku trehalosy byla potvrzena specifickým štěpením akumulované trehalosy enzymem trehalasou. V hlízách některých transgenních linií pMOG1027 byla shledána akumulace malých množství trehalosy (Fig. 9).
Příklad 13
Inhibice aktivity rostlinných hexokinas trehalosa-6-fosfátem: Regulační působení trehalosa-6-fosfátu na hexokinasovou aktivitu bylo studováno v rostlinných extraktech měřením hexokinasové aktivity za přítomnosti či nepřítomnosti trehalosa-6-fosfátu.
Pří analýze extraktů z hlíz bramboru sloužila fruktosa (Obr. 10, Obr. 11) a glukosa (Obr. 11) jako substrát. Analýza v hlízách byla provedena podle Gancedo et al. (1997) J. Biol. Chem. 252, 4443, s použitím lmM T-6-P a fruktózy coby substrátu. Následující postupy u tabáku, rýže a kukuřice byly provedeny podle metody popsané v experimentální části.
- Při analýze extraktů z listů tabáku byla jako substrát použita fruktosa (Obr. 12) a glukosa (Obr.12 a Obr. 13).
- Při analýze extraktů z listů rýže byla jako substrát použita fruktosa a glukosa (Obr.14).
- Při analýze extraktů z listů kukuřice byla jako substrát použita fruktosa a glukosa (Obr.15).
Příklad 14
Inhibice aktivity hexokinas v živočišných buněčných kulturách trehalosa-6-fosfátem:
Pro demonstraci regulace hexokinasové aktivity v živočišných buňkách byly připraveny extrakty z myších hybridomových buněčných kultur. Aktivita hexokinas byla stanovena s použitím glukózy nebo fruktózy jako substrátu za podmínek, které popsali Gancedo et al. (viz výše) . U myších hybridomových buněk byl vyvolán osmotický šok umístěním buněčného peletu do 20 % sacharózy s následným opláchnutím destilovanou vodou. Tento hrubý extrakt proteinů byl použit při stanovení hexokinas (50μ1 extraktu odpovídalo asi 200 pg proteinů).
Tabulka 8. Inhibice živočišné hexokinasové aktivity T-6-P
Substrát Koncentrac e (mM) T-6-P (mM) Vo (ODU/min) Vi (ODU/min) Inhibice (%)
Glukosa 2 0,83 0, 0204 0, 0133 35
Glukosa 20 0, 83 o, 0214 0, 0141 35
Glukosa 100 0, 83 0, 0188 0, 0125 34
Fruktosa 20 0, 23 o, 0207 0, 0205 1
Fruktosa 20 0, 43 o, 0267 0, 0197 26
Fruktosa 20 0, 83 o, 0234 0, 0151 35
Fruktosa 20 1, 67 o, 0246 o, 0133 46
Uvedené výsledky jasně ukazují, že aktivita hexokinas v myších buněčných extraktech je inhibována trehalosa-6-fosfátem. Rozsah koncentrací T-6-P při kterých k inhibici dochází je srovnatelný s rozsahem zjištěným v hrubých rostlinných extraktech. Účinnost inhibice hexokinas trehalosa-6-fosfátem nezávisela na tom, zda byla použita glukosa nebo fruktosa jako substrát.
Příklad 15
Fotosyntéza a respirace u rostlin tabáku exprimujících gen pro TPS a TPP:
Účinek exprese těchto genů na fotosyntézu a respiraci byl hodnocen v listech transgennich rostlin tabáku 35S-TPP (1010-5), PC-TPS (1318-10 a 1318-37) a tabáku divokého typu Samsun NN.
Měření bylo prováděno v zařízení pro měření výměny plynů. Rychlost výměny plynů byla vypočítána na základě rozdílů koncentrací mezi vstupujícím a vystupujícím vzduchem pomocí infračerveného analyzátoru plynů. Fotosyntéza a respirace byly měřeny ve stejném listu. U každé transgenní rostliny byl pro stanovení použit jednak nejmladší plně vyvinutý list (vrchní list) a dále list o 3-4 patra níže (spodní list) .
Fotosyntéza byla měřena jako funkce fotosyntetícky aktivní světelné intenzity (PAR) od 0-975 pmol .m’2. s1 (200 Watt m'2) čtyřikrát při CO2 koncentracích 350 vpm a 950 vpm.
Respirace byla měřena pomocí dvou různých časových měřítek. Měření prováděná v průběhu krátkého období tmy v experimentech, ve kterých byla měřena fotosyntéza jsou v tabulce 9 označeny RD. Vzhledem k tomu, že se během období tmy respirace značně mění, vyjadřují tyto hodnoty okamžitou aktivitu. Z tohoto důvodu byly hodnoty za celé období tmy také sečteny, jak ukazuje tabulka 10 (měřeno pouze při 350 vpm CO2) .
Tabulka 9. Rychlost fotosyntézy a respirace, STD značí standardní odchylku.
vrchní list 350 ppm 950 ppm
μπιοί .m'2. s 1 STD pmol .m 2. s“1 STD
divoký typ RD 0,0826 0,048 1, 016 0,142
EFF 0, 060 0, 004 0, 087 0, 004
AMAX 11,596 0,588 19,215 0, 942
1010-5 RD 0,873 0,060 1,014 0,134
EFF 0, 059 0, 002 0, 090 0, 007
AMAX 12,083 1,546 18,651 1,941
1318-10 RD 0, 974 0,076 1,078 0,108
EFF 0,064 0,003 0, 088 0, 008
AMAX 16,261 2,538 24,154 1, 854
1318-37 RD 1,067 0,140 1, 204 0, 116
EFF 0,061 0, 002 0, 084 0,011
AMAX 16,818 2,368 25,174 2,093
spodní list
divoký typ RD 0, 0 438 . Ό7ΌΤ9’ *0“Γ5·26 ·
EFF 0, 068 0,002 0,085 0, 004
AMAX 6, 529 1,271 11,489 1, 841
1010-5 RD 0, 455 0, 068 0,562 0,118
EFF 0, 064 0, 002 0, 085 0, 006
AMAX 8,527 0,770 13,181 1,038
1318-10 RD 0, 690 0,057 0,828 0,086
EFF 0, 064 0, 008 0, 085 0 f 005
AMAX 11,562 1,778 20,031 1,826
1318-37 RD 0,767 0,033 0, 918 0, 099
EFF 0, 073 0,006 0, 103 0,004
AMAX 13,467 1, 818 19,587 1, 681
Tabulka 10. Respirace v průběhu 12 hodinového období tmy (mmol CO2),
STD značí standardní odchylku.
vrchní list STD spodní list STD
divoký typ 25,17 0,82 13,19 1, 98
1010-5 30,29 5,09 13,08 1,52
1318-10 28,37 4,50 20, 47 0,87
1318-37 32,53 2,01 17,7 1,03
Ve srovnání s divokým typem rostlin a rostlinami TPP, je u transgenních rostlin TPS respirace spodních listů významně vyšší než transpirace listů vrchních (Tab. 10), což naznačuje jejich vyšší metabolickou aktivitu. Pokles respirace během stárnutí listů je podstatně menší u transgenních rostlin TPS.
Rovněž fotosyntetické parametry se významně liší mezi transgenními rostlinami TPS na jedné straně a transgenními rostlinami TPP a divokým typem kontrolních rostlin na straně druhé. Hodnoty AMAX (maximum fotosyntézy při nasycení světlem), účinnost fotosyntézy (EFF) a rychlost respirace v průběhu krátkého období tmy následující po měření fotosyntézy (RD) jsou obsaženy v tabulce 9. V průměru jsou hodnoty AMAX v horních listech transgenních rostlin TPS o 35 % vyšší ve srovnání s transgenními rostlinami TPP nebo divokým typem rostlin. Spodní listy vykazují dokonce větší zvýšení rychlosti fotosyntézy (88%).
Aby se vyloučilo možné ovlivnění rychlosti fotosyntézy rozdíly v absorpci světla, byla absorpce měřena pomocí SPAD-502 (Minolta). Žádné významné rozdíly v absorpci nebyly zjištěny (Tab. 11).
Tabulka 11. Hodnoty absorpce u transgenních linií
1 absorpce vrchní list spodní list
divoký typ Samsun NN 84 83
1010-5 84 82
1318-10 85 86
1318-37 86 86
Příklad 16
Fluorescence chlorofylu v rostlinách tabáku exprimujících geny TPS a TPP:
V listovém materiálu transgenních rostlin tabáku 35S-TPP (1010-5), PC-TPS (1318-10 a 1318-37) a tabáku divokého typu Samsun NN byl hodnocen účinek exprese těchto genů na fluorescenci chlorofylu. Byly měřeny dvě charakteristiky fluorescence:
1) ETE (účinnost transportu elektronů), jako míra rychlosti transportu elektronů a tvorby redukčního ekvivalentu
2) nefotochemické zhášení jako míra disipace energie způsobené akumulací asimilátů.
Rostliny byly pěstovány ve skleníku a přisvětlovány 100 pmol .m'“. s1 (04:00 - 20:00 h). Den/noc T=21°C/18°C; R.H. ± 75 %. V průběhu noční periody předcházející měření (trvání 16 h), byly dvě rostliny od každého genotypu přeneseny do tmy a dvě rostliny na světlo ( ± 430 pmol .m'2. s'1, 20°C, R.H. 70 %). Pro měření byl použit nejmladší plně vyvinutý list na rostlině. Ukazatele fotochemické účinnosti fotosystému II (PSII) a nefotochemického zhášení byly stanoveny jako funkce zvyšující se světelné intenzity. Při každé intenzitě světla byly rostliny stabilizovány po dobu 300 s. Měření byla prováděna při 5, 38, 236, 422 a 784 pmol .m'2. s_1 za minutu, 350 ppm CO2 a 20 % O2, Při opakování experimentů byly použity tytéž rostliny a umístění rostlin ve tmě před vlastním měřením bylo zaměněno za umístění na světle a naopak. Ukazatele fluorescence znázorňuje Obr. 16.
Pokles účinnosti elektronového transportu (ETE) byl srovnatelný u rostlin TPP a divokého typu. Rostliny TPS reagovaly na zvyšující se světelnou intenzitu zřetelně méně. Tento rozdíl byl nejnápadnější při předchozím vystavení rostlin světlu. Tato pozorování jsou ve shodě s výsledky nefotochemického zhášení. Ve srovnání s transgenními rostlinami TPP a rostlinami divokého typu, reagovaly rostliny TPS jasně méně na dodatečný přísun asimilátů v důsledku ozáření. V případě rostlin TPS byla významně snížena negativní regulace fotosyntézy akumulujícími se asimiláty.
Příklad 17
Export a rozmístění asimilátů v rostlinách tabáku exprimujících geny TPS a RPP:
V transgenních rostlinách tabáku 35S-TPP (1010-5) a PC-TPS (1318-37) byl stanoven:
1) export uhlíkatých asimilátů z plně vyvinutého listu (vyjadřujícího relativní aktivitu zdroje, Koch (1996) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47, 509
2) čistá akumulace fotoasimilátů v pletivech sinku ( relativní aktivita sinku) v průběhu periody světla a tmy.
Vývojové stádium rostlin: květní pupeny právě viditelné. Použitá technika značení: značení produktů fotosyntézy uhlíkem 1JC za ustáleného stavu v přítomnosti přebytku uhlíku 1!C (De Visser et al. (1997) Plant Cell Environ. 20, 37). U obou genotypů byly pro značení použity plně vyvinuté listy osmi rostlin v průběhu světelné periody (10 hodin) následované periodou tmy (14 hodin). K značení bylo použito 5,1 atom% 13CO2. Po značení byly rostliny rozděleny do několika skupin: 1) vzrostný vrchol, 2) mladý rostoucí list, 3) mladý plně vyvinutý list (nad značeným listem), 4) mladý stonek (nad značeným listem), 5) značený list, 6) řapík a báze značeného listu, 7) stárnoucí list, 8) ostatní a starší listy níže položené než značený list, 9) stonek pod značeným listem, 10) kořenové špičky. Byla stanovena čerstvá váha, obsah sušiny a procentický obsah uhlíku 13C ( atom % 13C) . Kromě základních parametrů jako je biomasa a obsah sušiny, byl vypočítán: 1) export C ze značeného listu; 2) relativní přísun importovaného C do jednotlivých částí rostliny; 3) absolutní množství importovaného C do jednotlivých částí rostliny; 4) relativní distribuce importovaného C v průběhu světelné periody a celé fotoperiody.
Hmotnost nadzemní části transgenních rostlin TPP byla vyšší o 27 % ve srovnámí s transgeny TPS (P< 0,001); také kořenový systém těchto rostlin byl lépe vyvinut. U transgenních rostlin TPP byla zjištěna významně změněná distribuce sušiny v rostlině, +39% v listu a +10% v kořeni ve srovnání s rostlinami TPS. Rostliny TOS měly větší počet listů, ale menší listovou plochu. Celková plocha listu na rostlinu TPS byla srovnatelná s divokým typem rostliny (0,4 m2 rostlina“1).
Relativní aktivita zdroje u plně vyvinutých listů
Celková exportní rychlost fotoasimilátů ze značeného listu je určena relativním poklesem % nového C během noci (u TPP 39 % a u TPS 56 %) a celkovým množstvím vázaného nového C v rostlině (bez značeného listu). Po světelné periodě exportovaly listy rostlin TPP 37 % ve srovnání s 51 % u rostlin TPS (Tab. 11). V následující periodě tmy vzrostly tyto hodnoty na 52 % a 81 %. Obě metody potvrdily, že transgenní rostliny TPS mají ve srovnání s transgenními rostlinami TPP významně zvýšenou rychlost transportu produktů fotosyntézy.
Absolutní množství nového C v částech rostliny
Export u transgenů TPS byl významně vyšší ve srovnání s transgeny TPP. Mladé rostoucí listy rostlin TPS importovaly C silněji, než mladé listy rostlin TPP.
Relativní zvýšení nového C v částech rostlin: síla síňku
Relativní přísun nového C do jednotlivých částí rostlin je znázorněn v Obr. 17. Procentická hodnota vyjadřuje sílu síňku. Významně vyšší síla síňku byla shledána u transgenů TPS, a to zvláště ve vzrostných vrcholech, stonku nad a pod značeným listem a v řapíku značeného listu.
Tabulka 11: Zdrojová aktivita plně vyvinutého značeného listu:
akumulace C a jeho export. Celková denní akumulace a export uhlíkatých asimilátů ve značeném listu a celé rostlině (nadzemní část) po steady-state 13C-labeling v průběhu periody světla (den).
N=4: hodnoty LSD udávají nejmensí významný rozdíl pro P< 0,05
Čas Transgen Aktivita zdroje u rostoucího listu
(konec) nový C ve zdrojovém listu (% celkového C v listu) nový C exportova ný v noci (% ve dne) nový C ve zdrojovém listu (% nového C v rostlin ě) celkový export C do rostliny (% celkového nového C)
Den TPS 17,8 48,7 51
TPP 22,6 - 63,0 37
Den + noc TPS 7,8 56 16, 6 81
TPP 13, 8 39 48,4 52
LSD 0,05 2,4 6,1
Relativní distribuce nového C do jednotlivých částí rostliny: relativní síla sinku
Distribuce vázaného uhlíku mezi jednotlivými částmi rostliny potvrdila výše zmíněné závěry. U transgenů TPS byl zjištěn relativné větší export asimilátů do vzrostného vrecholu, mladých rostoucích listů (ve dne) a dokonce do nejstarších listů (bez axilárních meristémů) a také do mladého i starého stonku.
Příklad 18: salát
Projevy rostlin salátu transformovaných PC-TPS a PC-TPP:
Pro transformaci rostlin salátu byly použity konstrukty PC-TPS a PCTPP. Transgeny PC-TPS byly regenerovány na 60 g/1 sacharózy.
Fenotypy obou transgenů TPS a TPP byly snadno odlišitelné od netransformované kontroly; transgeny TPS měly silnější, tmavozelené listy a transformanty TPP světlezelené listy s hladším okrajem ve srovnání s listy kontrolních rostlin.
Exprese TPS a TPP zřetelně ovlivnila morfologii listů a nejvýrazněji okraje listů. Listy transgenních rostlin PC-TPS byly podstatně více zvrásněné, než listy transgenů PC-TPP, jejichž listy byly hladší a zaoblené (Obr. 19). V listových extraktech transgenních linií salátu byl analyzován obsah cukrů a škrobu (Obr. 20).
Příklad 19: cukrovka
Projev transgenních rostlin cukrovky PC-TPS a PC-TPP:
Pro transformaci rostlin cukrovky byly použity konstrukty PC-TPS a PC-TPP. Frekvence transformací byla u obou konstruktů TPS a TPP srovnatelná s kontrolami. Fenotyp obou transformantu TPS a TPP byl jasně odlišitelný od netransformovaných kontrol; transgeny TPS měly ve srovnání s kontrolou divokého typu tlustší tmavozelené listy a transgeny TPP světlezelené listy s delšími řapíky (Obr. 21). U všech rostlin pěstovaných ve skleníku byl ve stáří asi 8 týdnů měřen průměr kůlového kořene. Některé transgenní linie PC-TPS, jejichž velikost listů byla srovnatelná s kontrolou, vykazovaly významně větší průměr kůlového kořene (Obr. 22). Transgenní linie PC-TPP vytvářely ve srovnání s kontrolou divokého typu menší kůlový kořen.V listových extraktech transgenních linií cukrovky byl analyzován obsah cukrů a škrobu (Obr. 20).
Příklad 20: Arabidopsis
Projev transgenních rostlin Arabidopsis PC-TPS a PC-TPP:
Pro transformaci rostlin Arabidopsis byly použity konstrukty PC-TPS a PC-TPP. Fenotyp obou transformantů TPS a TPP byl jasně odlišitelný od kontrol divokého typu; transgeny TPS měly ve srovnání s kontrolou divokého typu tlustší tmavozelené listy a transgeny TPP větší bílé listy.
Rostliny s vyšší hladinou exprese TPP nevytvářely semena.
Příklad 21: brambor
Projev transgenních rostlin Solanum tuberosum nesoucích konstrukt pro TPS a TPP
Konstrukt: 35S-TPS pMOG799
Transgenní rostliny pMOG799 byly pěstovány ve skleníku a byl u nich stanoven výnos hlíz (Obr. 23). Většina transgenních rostlin měla ve srovnání s kontrolou divokého typu menší listy. Hmotnost hlíz sklizených z rostlin s menšími listy byla ve srovnání s kontrolou divokého typu nižší (Obr. 25).
Konstrukt: 35S-TPP pMOGlOlO a PC-TPP pMOG1124
Transgenní rostliny s pMOGlOlO a pMOG1124 byly pěstovány ve skleníku a byl u nich stanoven výnos hlíz. Výnos hlíz (Obr.24) byl srovnatelný nebo nižší než u kontroly divokého typu (Obr. 25).
Konstrukt: PC-TPS pMOG1093
Transgenní rostliny s pMOG1093 byly pěstovány ve skleníku a byl u nich stanoven výnos hlíz. Hmotnost hlíz byla vyšší u několika transgenních linií, jejichž velikost listů byla srovnatelná s kontrolou divokého typu (B-C) a těch, které měly poněkud tmavší listy (Obr. 26). U rostlin s menšími listy než kontrola (D-G) byl zjištěn nižší výnos hlíz.
Konstrukt: Pat-TPP pMOG1128
V explantátové kultuře transgenních rostlin pat-TPP byly v in vitro indukovány mikrohlízky. Průměrná čerstvá hmotnost vytvořených mikrohlízek byla ve srovnání s kontrolními liniemi podstatně nižší.
Konstrukt: Pat-TPS pMOG845
Transgenní rostliny pMOG845 byly pěstovány ve skleníku a byl u nich stanoven výnos hlíz. Zjištěná hmotnost hlíz byla u tří transgenních linií ve srovnání s kontrolními liniemi vyšší (Obr. 27).
Konstrukt: PC TPS Pat TPS; pMOG1129 (845-11/22/28)
Rostliny exprimující současně PC TPS a Pat-TPS byly vytvořeny retransformací Pat-TPS linií (rezistentních ke kanamycinu) konstruktem pMOG1129, který obsahoval konstrukt PC TPS a markerový gen pro rezistenci k hygromycinu, za vzniku genotypů pMOG1129 (84511), pMOG1129 (845-22) a pMOG1129 (845-28). Výnos hlíz se pohyboval od minimálního až po výnos srovnatelný nebo vyšší než výnos kontrolních rostlin.
Příklad 22: tabák
Projev transgenních rostlin N. tabacum nesoucích konstrukty TPS a TPP:
Kořenový systém
Transgenní rostliny 35S TPP (pMOGlOlO) nebo 35S TPS (pMOG799) byly pěstovány ve skleníku. Velikost kořenů byla stanovena těsně před začátkem kvetení. U transgenní linie pMOGlOlO byla zjištěna významně větší/menší velikost kořenů, než u transformantu pMOG799 a kontroly divokého typu.
Vliv exprese TPS a TPP na kveteni
Transgenní rostliny tabáku 35S-TPS, PC-TPS, 35S-TPP a PC-TPP byly pěstovány ve skleníku. Rostliny s vysokým stupněm exprese TPS genu rostly významně pomaleji ve srovnání s kontrolou divokého typu. Výsledkem zpožděného kvetení a senescence spodních listů těchto rostlin byl fenotyp „stále zelených jinak běžně stárnoucích listů. Rostliny s vysokou hladinou exprese TPP genu nevytvářely žádné květy, nebo tvořily aberantní nedokonale vyvinuté květní pupeny, v důsledku čehož byly sterilní.
Vliv exprese TPS a TPP na tvorbu semen
Transgenní rostliny tabáku 35S-TPS, PC-TPS, 35S-TPP a PC-TPP byly pěstovány ve skleníku. Rostliny s vysokou hladinou exprese TPP genu vytvářely květy málo nebo vůbec žádné a netvořily semena.
Vliv exprese TPS a TPP na klíčení semen
Transgenní rostliny tabáku 35S TPP (pMOGlOlO) nebo PC TPP byly pěstovány ve skleníku. Některé transgenní linie s nízkou hladinou exprese transgenu vytvářely květy a semena. V průběhu klíčení semen Sl generace byla významně snížena frekvence klíčení (nebo bylo klíčení inhibováno) v porovnání se semeny Sl u kontroly divokého typu (Tab. 12) .
Tabulka 12. Klíčení semen transgenních rostlin 35S-TPP
Varianta zbělení Rel. (TPP mRNA) klíčení
1010-2 + 15,8 opožděné
1010-3 5,3 opožděné
1010-4 + 4,2 opožděné
1010-5 + 5,2 opožděné
1010-6 + 3, 9 opožděné
1010-7 - 2, 8 opožděné
1010-8 + 6, 5 opožděné
1010-9 + 4,6 opožděné
1010-10 - 1,9 normální
1010-11 5,7 normální
1010-12 + 1,4 normální
1010-14 0,1 normální
1010-15 0,3 normální
1010-18 + 5,6 opožděné
1010-20 + 6,4 opožděné
1010-21 + 9,5 opožděné
1010-22 + 8,8 ne
1010-23 4,5 normální
1010-24 - 10,2 opožděné
1010-25 - 4,7 opožděné (méně)
1010-27 4,8 normální
1010-28 + 22,1 opožděné
1010-31 4 9,4 opožděné (méně)
1010-32 0, 3 opožděné (méně)
1010-33 + 14,7 opožděné
Vliv exprese TPS resp. TPP na výnos semen
U transgenních rostlin pMOG1010-5 v generaci SI byl stanoven výnos semen. Průměrný výnos semen transgenních rostlin pMOG1010-5 byl 4,9 g na rostlinu (n=8), zatímco u kontroly divokého typu 7,8 g na • · · · • · · · • * ···· · • · · • · · · · · • · * · · · • * · ··· ··· • · · · • ·· · · ·· rostlinu (n=8). Zjištěná hmotnost tisíce semen u linie pMOG1010-5 byla 0,06g a 0,08g u kontroly Samsun NN. Příčinou těchto výsledků může být snížený export cukrů ze zdrojových listů vedoucích k slabému rozvoji pletiv sinku.
Vliv exprese TPS a TPP na morfologii listu
Segmenty transgenních rostlin tabáku PC-TPS, PC-TPP a kontroly divokého typu pěstovaných ve skleníku byly fixovány, zality do pryskyřice a na řezech byly pomocí světelné mikroskopie studovány buněčné struktury. Buněčné struktury a morfologie pozorovaná na řezech transgenních rostlin PC-TPP byly srovnatelné s kontrolou. Na řezech transgenních rostlin PC-TPS byly pozorovány změny v morfologii houbového parenchymu, který se u těchto transformantů skládal ze sedmí vrstev buněk, zatímco u transformantů TPP a kontroly divokého typu jen ze tří vrstev (Obr. 29). Tato zjištění jsou v souladu s našimi předchozími pozorováními, kde transgenní line rostlin TPS vytvářely ve srovnání s rostlinami TPP a kontrolou tlustší a tužší listy.
Příklad 23
Inhibice chladového sládnutí expresí trehalosafosfátsyntasou
Transgenní rostliny bramboru (Solanum tuberosum cv. Kardal) byly vytvořeny vnesením TPS genu řízeného patatinovým promotorem specifickým pro hlízy (pMOG845; Příklad 1). Transgenní rostliny a kontroly divokého typu byly pěstovány ve skleníku a jejich hlízy sklizeny. Vzorky hlíz pro analýzu cukrů byly odebrány jednak bezprostředně po sklizni a poté po jejich šestiměsíčním skladování při 4°C. Výsledky HPLC-PED analýzy jsou zobrazeny na Obr. 30. Výsledky jasně ukazují, že transgenní rostliny bramboru s genem TPSE.coii mají nižší celkový obsah cukrů (glukosy, fruktosy a sacharosy) v hlízách bezprostředně po sklizni. Po šesti měsících skladování při 4°C bylo zvýšení obsahu rozpustných cukrů významně nižší u transgenních linií ve srovnání s kontrolními liniemi divokého typu.
··· ···· · » · · • · · · · · · · · · 9 • · ···· · · · 9 9 999 999 • · · 9 9 9 « e * · · · · · · · · « · β
Příklad 24
Zlepšení projevů transgenních rostlin tabáku 35S TPS a 35S TPP (pMOG851) v podmínkách stresu vyvolaného suchem:
Transgenní rostliny byly vytvořeny vnesením obou genů TPS a TPP z E.coli ovládaných promotorem 35S CaMV. Exprese genů TPS a TPP v takto získaných liniích byla potvrzena pomocí Northern blotu a měřením aktivity enzymů. pMOG851-2 akumulovala 0,008 mg . g1 č.hm trehalosy a pMOG851-5 akumulovala 0,09 mg . g'1 č.hm. Exprese obou genů měla zjevný vliv na morfologii rostlin a růst v podmínkách stresu suchem. Když byly rostliny pěstovány ve stresových podmínkách vyvolaných nedostatkem vody, obsah sušiny byl u obou transgenních linií vyšší; u pMOG851-2 o 28 % (p< 0,01) a u pMOG851-5 o 39 % (p<0,001), než u kontrolních rostlin tabáku divokého typu. Zvýšený obsah sušiny byl způsoben především zvýšenou produkcí listů: obsah sušiny v listech u pMOG851-5 byl vyšší až o 85%. Žádné významné rozdíly nebyly zjištěny při dostatečném zásobení rostlin vodou.
Stres vyvolaný suchem - experimentální část
V experimentech byla použita Fl semena získaná samoopylením primárních transformantů pMOG851-2 a pMOG851-5 (Goddijn et al.
(1997) Plant Physiol. 113, 181). Semena byla sterilizována po dobu 10 min ve 20 % komerčním bělidle, opláchnuta pětkrát sterilní vodou a vyseta na medium o poloviční koncentraci podle Murashige -Skooga obsahující 10 g . I'1 sacharosy a 100 mg. I1 kananycinu. Semena SRÍ divokého typu byla vyseta na plotny bez kanamycinu. Po dvou týdnech byly rostliny všech linií přesazeny do půdy (písčité zeminy) a pěstovány v kultivační místnosti při 22°C, intenzitě světla přibližně 100 μΕ-m'2 a 14 h dnu. Všechny rostliny byly pěstovány ve stejném množství půdy v květináčích o objemu 3,8 1. Rostliny byly denně zalévány živným roztokem podle Hoaglanda o poloviční koncentraci. Semenáčky pMOG851-2 a pMOG851-5 rostly o něco pomaleji než semenáčky tabáku divokého typu. Vzhledem k tomu, že jsme považovali za důležité zahájit experimenty ve stejné vývojové fázi rostlin, vyvolali jsme u všech linií stres suchem při stejné výšce semenáčků (10 cm), ve stejné vývojové fázi rostlin (4 listy) a stejné sušině (stanoveno ve dvou dalších rostlinách u každé linie).
··· ·· ·· «·
To znamená, že stres suchem byl u rostlin pMOG851-2 zahájen o dva dny později a pMOG851-5 o sedm dní později než u kontroly divokého typu. U každé linie bylo suchu vystaveno šest rostlin a čtyři rostliny byly pěstovány při dostatečném zásobení vodou jako kontroly.
Tabáky divokého typu byly vystaveny suchu tak dlouho, dokud nedosáhly bodu vadnutí: když spodní poloviny listů byly zvadlé, rostliny byly zality takovým množstvím živného roztoku, až znovu získaly turgor. V praxi to znamenalo zalití rostlin 50 ml živného roztoku každé tři dny, kontroly byly zalévány denně, aby měly dostatečnou zásobu vláhy. Rostliny pMOG851-2 a pMOG851-5 byly pak zalévány přesně stejným způsobem jako rostliny divokého typu, tj. byly zalévány stejným množstvím živného roztoku a ve stejných intervalech jako rostliny divokého typu. V průběhu celého sledovaného období byla pravidelně měřena výška stonku. Všechny rostliny byly sklizeny ve stejný den (32. den po zahájení ošetření u rostlin divokého typu), protože by sklizení transgenních rostlin v pozdějším stádiu komplikovalo porovnávání jednotlivých linií rostlin. Při tomto odběru byla měřena celková listová plocha pomocí zařízení na měření listové plochy Delta-T (Santa Clara, CA). Dále byla stanovena čerstvá hmotnost a obsah sušiny v listech, stoncích a kořenech.
Pro stanovení osmotického potenciálu rostlin byl proveden druhý experiment v podstatě stejným způsobem. Po 35 dnech stresu suchem byly na počátku světelné periody odebrány vzorky z nejmladších plně vyvinutých listů (n=3).
Vysýcháni, oddělených listů na vzduchu
Ve stáří čtyř týdnů byla u rostlin pMOG851-2, pMOG851-5 a rostlin divokého typu dobře zásobených vodou měřena ztráta vody z vysychajících oddělených listů. U každé linie rostlin bylo měření provedeno na pěti rostlinách. Z každé rostliny byly odebrány dva nejmladší plně vyvinuté listy a sušeny při 25 % relativní vlhkosti vzduchu. Po 32 hodinách byla u každého listu stanovena čerstvá hmotnost. V době experimentu byly odebrány vzorky ze srovnatelných listů dobře zásobených vodou, aby mohlo být provedeno měření osmotického potenciálu a stanoven obsah rozpustných cukrů.
Měření osmotického potenciálu
Vzorky listů pro stanovení osmotického potenciálu byly ihned po odebrání zmraženy na suchém ledu v uzavřených injekčních stříkačkách o objemu 1 ml. Těsně před analýzou byla šťáva z listů vymačkána do malé zkumavky, protřepána a použita pro nasáknutí papírového terčíku. Osmotický potenciál byl pak stanoven v komůrce Wescor C52 s pomocí Wescor HR-33 mikrovoltmetru pro stanovení rosného bodu.
Fluorescence chlorofylu
Fluorescence chlorofylu u rostlin divokého typu, pMOG851-2 a pMOG851-5 byla u každé linie měřena po 20 dnech sucha pomocí pulzního modulačního fluorometru (PAM) (Walz, Effeltrich, Německo). Před vlastním měřením byly rostliny ponechány ve tmě po dobu dvou hodin, pak jednu hodinu na světle a poté byl nejmladší plně vyvinutý list adaptován ve tmě 20 minut. Na začátku každého měření byl zapnut slabý měřící světelný paprsek (0,05 pmol m2 s1 modulovaný při 1,6 KHz) a byla měřena minimální hladina fluorescence (Fo). Maximální hladina fluorescence (Fm) byla pak měřena při aplikaci saturačního světelného pulsu o 4000 μτηοΐ m2 s1 po dobu 800 ms. Po dalších 20 s, když signál poklesl téměř na Fo, krátké saturační pulsy aktinického světla (trvající 800 ms, 4000 pmol m’2 s'1) byly opakovaně aplikovány po dobu 30 s s dvousekundovými intervaly. Složky fotochemického (qQ) a nefotochemického (qE) zhášení byly odečteny z křivky vyjadřující průběh fluorescence v čase podle Bolhar-Nordenkampf a Oquist (1993). V době měření listy nebyly viditelně zvadlé. Statistické výsledky byly získány pomocí jedocestné analýzy variance a programu Number Cruncher Statistical System (Dr. J.L. Hintze, 865 East 400 North, Kaysville, UT 84037, USA).
Při analýze fluorescence chlorofylu rostlin stresovaných suchem bylo zjištěno vyšší fotochemické zhášení (qQ) a vyšší poměr proměnlivé fluorescence k maximální fluorescenci (Fv /Fm) u rostlin pMOG851-5, což svědčí o vyšší efektivitě fotosyntetického aparátu (Tab. 13).
• · ···· · • · ·
Tabulka 13. Parametry fluorescence chlorofylu v rostlinách divokého typu (dt) a transgennich rostlinách tabáku akumulujících trehalosu (pMOG851-2, pMOG851-5). Hodnoty P (pravděpodobnosti) byly získány testem ANOVA analyzujícím rozdíly mezi liniemi rostlin pěstovanými v dostatku vody (kontrola) a v podmínkách sucha, a dále rozdíly mezi jednotlivými transgenními liniemi a divokým typem rostlin pěstovanými při dostatku vody a v podmínkách sucha. F„, : maximální fluorescence, Fv proměnlivá fluorescence (F,„ - Fo) · qo : fotochemické zhášení qE: nefotochemické zhášení. Fm a Fv jsou vyjádřeny v bezrozměrné jednotce (mm záznamu).
DT pMOG851-l pMOG851-5 8-51-2/DT 815-5
F,„ kontrola 174,4 180, 4 175, 6 ns ns
sucho 151,5 155,7 167,8 ns 0,0068
P (kontr. sucho) 0,0004 0,0000 ns
Fv kontrola 134,6 143, 3 142,8 ns ns
sucho 118,4 122, 1 135, 6 ns 0,0011
P (kontr. sucho) 0, 006 0,0000 ns
Fv /F„; kontrola 0,771 0,794 0,813 0,059 0,0052
sucho 0,782 0,784 0,809 ns 0,0016
P (kontr. sucho) ns ns ns
qs kontrola 15,2 23,8 29, 9 0,259 0,0085
sucho 25, 4 21, 6 23,5 ns ns
P (kontr. sucho) 0, 048 ns ns
q<? kontrola 91,3 92,4 90, 4 ns ns
sucho 73,69 78,5 92,75 ns 0,0005
P (kontr. sucho) 0,005 0, 006 ns
Analýza cukrů
V době odběru obsahovaly rostliny pMOG851-5 0,2 mg. g'1 č. hm. trehalosy, zatímco v pMOG851-2 a rostlinách divokého typu byla hladina trehalosy pod detekčním limitem jak ve stresujících tak v nestresujících podmínkách. Obsah trehalosy v rostlinách pMOG851-5 byl ve stresovaných a nestresovaných rostlinách srovnatelný (0,19 a 0,20 mg . g1 sušiny). Při dostatku vody hladiny glukosy a fruktosy byly v rostlinách pMOG851-5 dvounásobné oproti divokému typu.
V listech stresovaných rostlin pMOG851-5 byla zjištěna trojnásobná hladina všech čtyř nestrukturálních cukrů škrobu, sacharosy, glukosy a fruktosy proti listům stresovaných rostlin divokého typu.
V listech rostlin pMOG851-2 se hladina cukrů, stejně tak jako hodnot fluorescence, významně nelišila od hodnot nalezených v divokém typu. Ve stresovaných rostlinách všech linií byl naměřen zvýšený obsah glukosy a fruktosy ve srovnání s nestresovanými rostlinami.
Osmotický potenciál rostlin stresovaných suchem a kontrolních rostlin
V průběhu druhého podobného experimentu ve skleníkových podmínkách vykazovaly transgenní rostliny stejný fenotyp, jak již bylo popsáno výše, a opět u rostlin pMOG851-5 byla redukce růstu při stresu suchem mnohem menší, než u pMOG851~2 a rostlin divokého typu. Osmotický potenciál v listech rostlin pMOG851-5 stresovaných suchem (-1,77 ±0,39 Mpa) byl významně nižší (P=0,017) než v listech rostlin divokého typu (-1,00 ±0,08 Mpa); v rostlinách pMOG851-2 dosahoval středních hodnot (-1,12 ± 0,05 Mpa). Podobně při dostatečné zásobě vody byl osmotický potenciál rostlin pMOG851~5 (-0,79 ± 0,05 Mpa) významně nižší (P=0,038) než v listech rostlin divokého typu (-0,62 ± 0,03 Mpa) a listech rostlin pMOG851-2, kde dosahoval středních hodnot (-0,70 ± 0,01 Mpa),
Usychání oddělených listů
Listy rostlin pMOG851-2, pMOG851-5 a divokého typu byly odděleny a po 32 hodinovém vysychání byla měřena jejich čerstvá hmotnost. Listy rostlin pMOG851-2 a pMOG851-5 ztrácely významně méně vody (P< 0,05) než listy rostlin divokého typu: po 32 hodinách pMOG851-5 a pMOG8512 měly 44 % a 41 % procent jejich výchozí čerstvé hmotnosti ve • 4 • 44 srovnání s 30 % u divokého typu. V době experimentu byly též odebírány vzorky ze srovnatelných listů dostatečně zásobených vodou pro stanovení osmotického potenciálu a analýzu trehalosy, sacharosy, glukosy a fruktosy.
Obě transgenní linie měly nižší osmotický potenciál než rostliny divokého typu (P<0,05); nejnižší vodní potenciál (-0,63 ± 0,03 Mpa) byl zjištěn u pMOG851-5, nejvyšší (-0,51 ± 0,02 MPa) u rostlin divokého typu a střední hodnoty (-0,57 ± 0,04 MPa) dosáhl u pMOG8512. Obsah všech sledovaných cukrů byl významně vyšší v listech pMOG851-5, kde dosahoval, ve srovnání s listy divokého typu, trojnásobných hodnot u všech čtyř cukrů (P=0,002). Rostliny pMOG8512 obsahovaly dvakrát vyšší hladinu všech čtyř cukrů (P=0,09). Obsah trehalosy v rostlinách pMOG851-5 byl 0,24±0,02 mg.g1 sušiny, v rostlinách pMOG851-2 a rostlinách divokého typu pod detekčním limitem.
Příklad 25
Projev transgenních linií salátu TPS a TPP v podmínkách stresu suchem:
Primární transformanty TPS a TPP a kontroly divokého typu byly stresovány suchem. Nejdříve dosáhly bodu vadnutí transgenní linie TPP , potom kontrolní rostliny a nakonec transgenní rostliny TPS. Ná základě tohoto výsledku lze usuzovat, že transgenní linie TPS, stejně jako bylo pozorováno u jiných rostlinných druhů, jsou v podmínkách stresu vyvolaného suchem jasně ve výhodě oproti rostlinám TPP a rostlinám divokého typu.
Příklad 26
U transgenních linií salátu PC-TPS a PC-TPP je ovlivněno vybíhání rostlin
Vybíhání salátu bylo u transgenních rostlin PC-TPP sníženo (Tab.
14). Transgenní linie PC-TPS vybíhaly ve srovnání s kontrolami divokého typu více.
Tabulka 14. Vybíhání rostlin salátu
PC-TPP Celkový 1. 2. 3. 4. 5.
linie počet Normální Snížené Viditelné Možná Zcela
rostlin vybíhání vybíhání kvetení fasciace vegetativní
1A 4 4
2A 3 1 2
3A 2 2
4A 5 1 1 1 2
5A 5 1 1 3
7A 1 1
8A 5 4 1
9A 5 5
10A 3 1 2
11A 5 2 3
12A 4 4
|kontrola 5 5
Příklad 27
Projev transgenních rostlin rajčete TPS a TPP
K transformaci rajčete byly použity následující konstrukty: 35S TPP, PC-TPS, PC-TPS as-trehalasa, PC-TPP, E8-TPS, E8-TPP, E8 TPS E8 astrehalasa. Transgenní rostliny nesoucí TPP gen řízený plastocyaninovým promotorem a 35S promotorem měly podobný fenotyp jako byl pozorován u jiných rostlin: zbělení listů, redukovaná tvorba květů nebo jejich absence vedoucí k produkci malých plodů nebo k jejich absenci. Několik transgenních linií 35S-TPP vytvářelo extrémně velké plody. Tyto plody měly značně zvětšený perikarp. Transgenní rostliny nesoucí TPS gen řízený plastocyaninovým promotorem a promotorem 35S nevytvářely malé kopinaté listy. Některé silně zakrslé rostliny tvořily tmavozelené listy. Transgenní rostliny PC-TPS a PC - as-trehalasa tvořily menší a tmavší listy než kontrolní rostliny.
Barva a okraje listů rostlin TPS a TPP řízené promotory 35S nebo PC byly jasně rozpoznatelné stejně jako u ostatních plodin.
• · • · ·♦· *······· • · · · · · · ···· • ··*·· · · · · · ··· ··<
• · · · · a a · • · · · · · · · ·· aa
Rostliny nesoucí TPS a TPP geny řízené promotorem E8, který je specifický pro plody, nevykazovaly žádné odchylky fenotypu ve srovnání s plody rostlin divokého typu.
Transgenní rostliny E8 TPS E8 as-trehalasa tvořily aberantní plody se žlutou slupkou, které nedozrávaly.
Příklad 28
Projev transgenních rostlin bramboru s genem pro as-trehalasu nebo TPS
Konstrukty: 35S as-trehalasa (pMOGl027) a 35S as-trehalasa Pat TPS (PMOG1027 (845-11/22/28).
Rostliny exprimující současně 35S as-trehalasu a pat-TPS byly vytvořeny retransformací pat-TPS linií (rezistentních ke kanamycinu) konstruktem pMOGl027 obsahujícím konstrukt 35S as-trehalasa a markerový gen pro rezistenci k hygromycinu, za vzniku genotypů pMOG1027 (845-11), pMOG1027 (845-22) a. pMOG1027 (845-28).
Mikrohlízky byly indukovány in vitro a byla stanovena jejich čerstvá hmotnost. Průměrný výnos mikrohlízek vyjádřený jejich čerstvou hmotností byl vyšší u transgenních linií obsahujících pMOG1027 (pMOG845-ll/22/28). Čerstvá hmotnost mikrohlízek získaných z transgenních linií pMOG1027 byla oproti kontrole divokého typu pouze slabě zvýšena. Takto získané rostliny byly pěstovány ve skleníku a byl stanoven výnos hlíz (Obr. 33).Transgenní linie 35S as-trehalasa nebo v kombinaci 35S as-trehalasa a pat-TPS tvořily významně víc hmoty hlíz ve srovnání s kontrolními liniemi. Při analýze škrobu nebyl shledán žádný rozdíl v obsahu škrobu u linií s vyššími výnosy (Obr. 34). Velký počet linií 1027(845-11/22/28) tvořil hlízy z axilárních pupenů nad povrchem půdy, což svědčí o silném vlivu použitých konstruktů na vývoj rostlin. Linie transgenních rostlin pouze s 35S as-trehalasa nevytvářely hlízy nad povrchem půdy.
Konstrukty: Pat as-trehalasa (pMOGl028) a Pat as-trehalasa Pat TPS (pMOG1028(845-11/22/28))
Rostliny exprimující současně Pat as-trehalasa a Pat-TPS byly vytvořeny retransformací pat-TPS linií (rezistentních ke kanamycinu) konstruktem pMOGl028 obsahujícím konstrukt Pat as-trehalasa a
markerový gen pro rezistenci k hygromycinu, za vzniku genotypů pMOG1028 (845-11), pMOG1028 (845-22) a. pMOG1027 (845-28).
Rostliny byly pěstovány ve skleníku a byl stanoven výnos hlíz (Obr. 35). Několik transgenních linií pMOG1028 tvořilo významně víc hmoty hlíz ve srovnání s kontrolními liniemi. Výnos hlíz jednotlivých transgenních rostlin Pat TPS a Pat as-trehalasa byl různý a pohyboval se od téměř nulového výnosu až po výnos srovnatelný nebo vyšší než byl nalezen u linií kontroly divokého typu (Obr. 35).
Konstrukt: PC as-trehalasa (pMOGl092)
Transgenní rostliny pMOG1092 byly pěstovány ve skleníku a byl stanoven výnos hlíz. Několik linií tvořilo tmavěji zelené listy něž kontrola. Výnos hlíz byl ve srovnání s kontrolou divokého typu významně vyšší (Obr. 36).
Konstrukt: PC as-trehalasa PC-TPS (pMOG 1130)
Transgenní rostliny pMOG1130 byly pěstovány ve skleníku a byl stanoven výnos hlíz. Několik linií tvořilo malé tmavozelené listy a mělo silně zakrslý vzrůst, což svědčí o silnějším účinku současné exprese genů TPS a as-trehalasa na fenotyp rostlin (viz Příklad 21) . Výnos hlíz se pohyboval od téměř nulového výnosu až po výnos významně vyšší než výnos kontrolních rostlin (Obr. 37).
Příklad 29
Overexprese cDNA trehalasy z bramboru u N.tabacum:
Konstrukt: de35S CaMV trehalasa (pMOGl078)
Fenotyp primárních transformantů pMOG1078 byl odlišný od fenotypu tabáků divokého typu. Některé transgeny měly tmavozelené a tlustší listy (morfologie listů nebyla kopinatá), což ukazuje na vliv exprese genu pro trehalasu na metabolismus rostlin. Semena primárních transformantů byla vyseta a selektována na kanamycinu. Fenotyp se segregoval podle Mendelových zákonů v generaci Sl.
• · · • · · • · · « • · · · · · · • · · · · · · · ·· · ··· ·· ·· 4·
Uložení
Na základě budapešťské dohody byly klony uloženy 21. dubna 1997 v Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, P.O. Box 273 3740 AG Baarn, The Netherlands a byly označeny následujícím způsobem:
Escherichia coli
DH5alpha/pMOG1192 CBS 692.97
DHSalpha/pMOG1240 CBS 693.97
DHSalpha/pMOGl241 CBS 694.97
DHSalpha/pMOG1242 CBS 695.97
DHSalpha/pMOG1243 CBS 696.97
DHSalpha/pMOG1244 CBS 697.97
DH5alpha/pMOG1245 CBS 698.97
Uložené pMOG1192 pMOG1240 pMOG1241
PMOG1242 pMOG1243 pMOG1244 pMOG1245 klony:
obsahující TPS/TPP bipartitní cDNA z Helianthus annuus vloženou v multi-copy vectoru pGEM-T (Promega). obsahující TPS 825 bp cDNA fragment z tabáku vložený v pCRscript (Stratagene).
obsahující TPS 840 bp cDNA fragment z tabáku vložený v pGEM-Τ (Promega).
obsahující TPS 630 bp cDNA fragment z tabáku vložený v pGEM-T (Promega).
obsahující TPP 543 bp cDNA fragment z tabáku vložený v pGEM-T (Promega).
obsahující TPP 723 bp cDNA fragment z tabáku vložený v a pUC18 plasmid.
obsahující TPP 447 bp fragment z tabáku vložený v pGEM T (Promega).
Seznam příslušných pMOG### a pVDH### klonů
1. Binární vektory pMOG23 Binární vektor (ca.10 Kb) obsahující selekční markér. NPTII pMOG22 pVDH 275 pMOG402 pMOG800
4444 4
Derivát pMOG23, kde NPTII-gen byl nahrazen genem HPT-pro rezistenci k hygromycinu
Binární vektor odvozený z pMOG23, obsahující plastocyaninový promotor- nos terminátor v expresní kazetě
Derivát pMOG23, bodová mutace NPTII-genu byla opravena, v polylinkeru není restrikční místo KpnI
Derivát pMOG402 s opraveným místem KpnI v polylinkeru
pMOG 799
pMOG 810
pMOG 845
pMOG 925
pMOG 851
pMOG 1010
pMOG 1142
pMOG 1093
pMOG 1129
pMOG 1177
pVDH 318
pMOG 1124
pVDH 321
pMOG 1128
pMOG 1140
pMOG 1141
2. Expresní konstrukty TPS / TPP 35S-TPS-3'nos1 tentýž s Hyg markérem Pat-TPS-3'PotPilI tentýž s Hyg markérem 35S-TPS-3'nos 35S-TPP(atg)2 pMOG 1010 de35S CaMV amv leader TPP(gtg) PotPilI pMOG 1142 tentýž s Hyg markérem pMOG 1093 Plastocyanin- TPS-3'nos pMOG 1129 tentýž s Hyg markérem pMOG 1177 Plastocyanin- TPS-3'PotPilI 3'nos identický s pM0G1177 funkčně identický s pM0G1093 pMOG 1124 Plastocyanin- TPP(gtg) 3'PotPiII 3'nos identický s pM0G1124 pMOG 1128 Patatin TPP(gtg) 3'PotPilI pMOG 1140 E8-TPS-3'nos pMOG 1141 E8-TPP(gtg)-3'PotPilI
3. Trehalasa -konstrukty pMOG 1028 Patatin as-trehalase 3'PotPilI, markér rezistence k hygromycinu pMOG 1078 de35S CaMV amv leader trehalase 3'nos pMOG 1090 de35S CaMV amv leader as-trehalase 3'nos pMOG 1027 tentýž s Hyg markérem pMOG 1092 Plastocyanin- as trehalase-3'nos pMOG 1130 Plastocyanin- as trehalase-3’nos Plastocyanin-TPS-3'nos pMOG 1153 E8-TPS-3'nos E8-as trehalase-3'PotPilI
• 9 » ·· • ·· · · · « 9 · • · · · · 9 9 9 9
9999 9 9 9 99 999 999 • 9 9 9 9 9 • 999 99 99 99 1 Všechny konstrukty obsahují selekční markér NPTII, pokud není uvedeno jinak 2 Dva typy TPP konstruktů byly použity tak, jak popsali Goddijn et al. (1997) Plant Physiol.113, 181.
φ φ
• · · · ·
Seznam sekvencí (1) Obecné informace:
(i) Žadatel:
(A) Jméno: MOGEN International nv (B) Ulice: Einsteinweg 97 (C) Město: Leiden (D) Země: Holandsko (E) PSČ (ZIP): 2333 CB (F) Telefon: 071-5258282 (G) Telefax: 071-5221471 (ii) Název vynálezu: Regulace metabolismu změnou hladiny trehalosy-6 fosfátu (iii) Počet sekvenci: 57 (iv) Forma vhodná pro počítačové zpracování (A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (vi) Předcházející údaje o žádosti (A) Číslo žádosti: EP 96.201.255.8 (B) Datum registrace: 3.5.1996 (vi) Předcházející údaje o žádosti (A) Číslo žádosti: EP 96.202.128.3 (B) Datum registrace: 26.7.1996 (vi) Předcházející údaje o žádosti (A) Číslo žádosti: EP 96.202.395.8 (B) Datum registrace:29.8.1996 (2) Informace o SEQ ID NO:1:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 1450 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetický: Ne (ix) Vlastnosti:
(A) Jméno/Klíč: CDS (B) Umístění: 21..1450 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:1:
• · · 0 0 0 · · · · · • · · · 0 0 · 00·0 0 0 0·0· ♦ 0 0 0 0 ·0· 000 000 000 0 0 00 0 00000 00 00
ATÁAAACTCT CCCCGGGACC ATG ACT ATG AGT CGT TTA GTC GTA GTA TCT ' 50
Met Thr Met Ser Arg Leu Val Val Val Ser
10
AAC Asn CGG ATT GCA Ala CCA Pro 15 CCA Pro GAC Asp GAG Glu CAC His GCC GCC AGT GCC Ala GGT Gly GGC Gly 25 CTT Leu 98
Arg Ile Ala 20 Ala Ser
GCC GTT GGC ATA CTG GGG GCA CTG AAA GCC GCA GGC GGA CTG TGG TTT 146
Ala Val Gly Ile Leu Gly Ala Leu Lys Ala Ala Gly Gly Leu Trp Phe
30 35 40
GGC TGG AGT GGT GAA ACA GGG AAT GAG GAT CAG CCG CTA AAA AAG GTG 194
Gly Trp Ser Gly Glu Thr Gly Asn Glu Asp Gin Pro Leu Lys Lys Val
45 50 55
AAA AAA GGT AAC ATT ACG TGG GCC TCT TTT AAC CTC AGC GAA CAG GAC 242
Lys Lys Gly Asn Ile Thr Trp Ala Ser Phe Asn Leu Ser Glu Gin Asp
60 65 70 t
CTT GAC GAA TAC TAC AAC CAA TTC TCC AAT GCC GTT CTC TGG CCC GCT 290
Leu Asp Glu Tyr Tyr Asn Gin Phe Ser Asn Ala Val Leu Trp Pro Ala
75 80 85 90
TTT CAT TAT CGG CTC GAT CTG GTG CAA TTT CAG CGT CCT GCC TGG GAC 338
Phe His Tyr Arg Leu Asp Leu Val Gin Phe Gin Arg Pro Ala Trp Asp
95 100 105
GGC TAT CTA CGC GTA AAT GCG TTG CTG GCA GAT AAA TTA CTG CCG CTG 386
Gly Tyr Leu Arg Val Asn Ala Leu Leu Ala Asp Lys Leu Leu Pro Leu
110 115 120
TTG CAA GAC GAT GAC ATT ATC TGG ATC CAC GAT TAT CAC CTG TTG CCA 434
Leu Gin Asp Asp Asp Ile Ile Trp Ile His Asp Tyr His Leu Leu Pro
125 130 135
TTT GCG CAT GAA TTA CGC AAA CGG GGA GTG AAT AAT CGC ATT GGT TTC 482
Phe Ala His Glu Leu Arg Lys Arg Gly Val Asn Asn Arg Ile Gly Phe
140 145 150 r
TTT CTG CAT ATT CCT TTC CCG ACA CCG GAA ATC TTC AAC GCG CTG CCG ’ 530
Phe Leu His Ile Pro Phe Pro Thr Pro Glu Ile Phe Asn Ala Leu Pro
155 160 165 170
ACA TAT GAC ACC TTG CTT GAA CAG CTT TGT GAT TAT GAT TTG CTG GGT 578
Thr Tyr Asp Thr Leu Leu Glu Gin Leu Cys Asp Tyr Asp Leu Leu Gly
175 180 185
TTC CAG ACA GAA AAC GAT CGT CTG GCG 'ttc CTG GAT TGT CTT TCT AAC 626
Phe Gin Thr Glu Asn Asp Arg Leu Ala Phe Leu Asp Cys Leu Ser Asn
190 195 200
CTG ACC CGC GTC ACG ACA CGT AGC GCA AAA AGC CAT ACA GCC TGG GGC 674
Leu Thr Arg Val Thr Thr Arg Ser Ala Lys Ser His Thr Ala Trp Gly
205 210 215
• · • · · • ···· 9 • ··
AAA GCA TTT CGA Arg ACA GAA GTC Val 225 TAC Tyr CCG Pro ATC GGC Ile Gly ATT Ile 230 GAA Glu CCG Pro AAA Lys GAA '· · Glu 722
Lys Ala 220 Phe Thr Glu
ATA GCC AAA CAG GCT GCC GGG CCA CTG CCG CCA AAA CTG GCG CAA CTT 770
Ile Ala Lys Gin Ala Ala Gly Pro Leu Pro Pro Lys Leu Ala Gin Leu
235 240 245 250 •
AAA GCG GAA CTG AAA AAC GTA CAA AAT ATC TTT TCT GTC GAA CGG CTG 818
Lys Ala Glu Leu Lys Asn Val Gin Asn Ile Phe Ser Val Glu Arg Leu
255 260 265
GAT TAT TCC AAA GGT TTG CCA GAG CGT TTT CTC GCC TAT GAA GCG TTG 866
Asp Tyr Ser Lys Gly Leu Pro Glu Arg Phe Leu Ala Tyr Glu Ala Leu
270 275 280
CTG GAA AAA TAT CCG CAG CAT CAT GGT AAA ATT CGT TAT ACC CAG ATT 914
Leu Glu Lys Tyr Pro Gin His His Gly Lys Ile Arg Tyr Thr Gin Ile
285 290 295 !
GCA CCA ACG TCG CGT GGT GAT GTG CAA GCC TAT CAG GAT ATT CGT CAT 962
Ala Pro Thr Ser Arg Gly Asp Val Gin Ala Tyr Gin Asp Ile Arg His
300 305 310
CAG CTC GAA AAT GAA GCT GGA CGA ATT AAT GGT AAA TAC GGG CAA TTA 1010
Gin Leu Glu Asn Glu Ala Gly Arg Ile Asn Gly Lys Tyr Gly Gin Leu
315 320 325 330
GGC TGG ACG CCG CTT TAT TAT TTG AAT CAG CAT TTT GAC CGT AAA TTA 1058
Gly Trp Thr Pro Leu Tyr Tyr Leu Asn Gin His Phe Asp Arg Lys Leu
335 340 345
CTG ATG AAA ATA TTC CGC TAC TCT GAC GTG GGC TTA GTG ACG CCA CTG 1106
Leu Met Lys Ile Phe Arg Tyr Ser Asp Val Gly Leu Val Thr Pro Leu
350 355 360
CGT GAC GGG ATG AAC CTG GTA GCA AAA GAG TAT GTT GCT GCT CAG GAC 1154
Arg Asp Gly Met Asn Leu Val Ala Lys Glu Tyr Val Ala Ala Gin Asp
365 370 375 -
CCA GCC AAT CCG GGC GTT CTT GTT CTT TCG CAA TTT GCG GGA GCG GCA 1202
Pro Ala Asn Pro Gly Val Leu Val Leu Ser Gin Phe Ala Gly Ala Ala
380 385 390
AAC GAG TTA ACG TCG GCG TTA ATT GTT AAC CCC TAC GAT CGT GAC GAA 1250
Asn Glu Leu Thr Ser Ala Leu Ile Val Asn Pro Tyr Asp Arg Asp Glu
395 400 405 410
GTT GCA GCT GCG CTG GAT CGT GCA TTG ACT ATG TCG CTG GCG GAA CGT 1298
Val Ala Ala Ala Leu Asp Arg Ala Leu Thr Met Ser Leu Ala Glu Arg
415 420 425
ATT TCC CGT CAT GCA GAA ATG CTG GAC GTT ATC GTG AAA AAC GAT ATT 1346
Ile Ser Arg His Ala Glu Met Leu Asp Val Ile Val Lys Asn Asp Ile
430 435 440
4444
4 4 4 4 4
4 4 4 4 4
44 444 444
4 4 4
44 44 ·· · • 4 4 • · 4 · • · 444· 4
4 ·
4
•ÁAČ CAC TGG CAG GAG TGC TTC ATT AGC GAC CTA AAG CAG ATA GTT ČCG ' 1394
Asn His Trp Gin Glu Cys Phe Ile Ser Asp Leu Lys Gin Ile Val Pro
445 450 455
CGA AGC GCG GAA AGC CAG CAG CGC GAT AAA GTT GCT ACC TTT CCA AAG 1442
Arg Ser Ala Glu Ser Gin Gin Arg Asp Lys Val Ala Thr Phe Pro Lys
460 465 470 *
CTC TGC AG 1450
Leu Cys
475
(2) Informace o SEQ ID NO: 2:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 476 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D)Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein
(xi) Popis . sekvence: SEQ ID NO: 2:
Met Thr Met Ser Arg Leu Val Val Val Ser Asn Arg Ile Ala Pro Pro
1 5 10 15
Asp Glu His Ala Ala Ser Ala Gly Gly Leu Ala Val Gly Ile Leu Gly
20 25 30
Ala Leu Lys Ala Ala Gly Gly Leu Trp Phe Gly Trp Ser Gly Glu Thr
35 40 45
Gly Asn Glu Asp Gin Pro Leu Lys Lys Val Lys Lys Gly Asn Ile Thr
50 55 60
Trp Ala Ser Phe Asn Leu Ser Glu Gin Asp Leu Asp Glu Tyr Tyr Asn
65 70 75 80
Gin Phe Ser Asn Ala Val Leu Trp Pro Ala Phe His Tyr Arg Leu Asp
85 90 95
Leu Val Gin Phe Gin Arg Pro Ala Trp Asp Gly Tyr Leu Arg Val Asn
100 105 110
Ala Leu Leu Ala Asp Lys Leu Leu Pro Leu Leu Gin Asp Asp Asp Ile
115 120 125
Ile Trp Ile His Asp Tyr His Leu Leu Pro Phe Ala His Glu Leu Arg
130 135 140
Lys Arg Gly Val Asn Asn Arg Ile Gly Phe Phe Leu His Ile Pro Phe
145 150 155 160
Pro Thr Pro Glu Ile Phe Asn Ala Leu Pro Thr Tyr Asp Thr Leu Leu
165 170 175
• ·· « • · • to · ·· « · ·· ·· • «to ·
• • · • • • · • ·· to
* • · · « to · • to to • ··to to to to
• • • • • · • •
·· » • · · • · ·· ·< k
Glu Gin Leu Cys Asp Tyr Asp Leu Leu Gly Phe Gin Thr Glu Asn Ásp
180 185 190
Arg Leu Ala Phe Leu Asp Cys Leu Ser Asn Leu Thr Arg Val Thr Thr
195 200 205
Arg Ser Ala Lys Ser His Thr Ala Trp Gly Lys Ala Phe Arg Thr Glu
210 215 220
Val Tyr Pro Ile Gly Ile Glu Pro Lys Glu Ile Ala Lys Gin Ala Ala
225 230 235 240
Gly Pro Leu Pro Pro Lys Leu Ala Gin Leu Lys Ala Glu Leu Lys Asn
245 250 255
Val Gin Asn Ile Phe Ser Val Glu Arg Leu Asp Tyr Ser Lys Gly Leu
260 265 270
Pro Glu Arg Phe Leu Ala Tyr Glu Ala Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Gin
275 280 285
His His Gly Lys Ile Arg Tyr Thr Gin Ile Ala Pro Thr Ser Arg Gly
290 295 300
Asp Val Gin Ala Tyr Gin Asp Ile Arg His Gin Leu Glu Asn Glu Ala
305 310 315 320
Gly Arg Ile Asn Gly Lys Tyr Gly Gin Leu Gly Trp Thr Pro Leu Tyr
325 330 335
Tyr Leu Asn Gin His Phe Asp Arg Lys Leu Leu Met Lys Ile Phe Arg
340 345 350
Tyr Ser Asp Val Gly Leu Val Thr Pro Leu Arg Asp Gly Met Asn Leu
355 360 365
Val Ala Lys Glu Tyr Val Ala Ala Gin Asp Pro Ala Asn Pro Gly Val
370 375 380
Leu Val Leu Ser Gin Phe Ala Gly Ala Ala Asn Glu Leu Thr Ser Ala
385 390 395 400
Leu Ile Val Asn Pro Tyr Asp Arg Asp Glu Val Ala Ala Ala Leu Asp
405 410 415
Arg Ala Leu Thr Met Ser Leu Ala Glu Arg Ile Ser Arg His Ala Glu
420 425 430
Met Leu Asp Val Ile Val Lys Asn Asp Ile Asn His Trp Gin Glu Cys 435 440 445
Phe Ile Ser Asp Leu Lys Gin Ile Val Pro Arg Ser Ala Glu Ser Gin 450 455 460
Gin Arg Asp Lys Val Ala Thr Phe Pro Lys Leu Cys
465 470 475 ·· ·· • · · · • · · · *·· ··· • · *· ·· ·· • · ·♦· ·· «
• · » * · •···· ♦ • * (2)Informace o SEQ ID NO:3:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 835 párů bázi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetický: Ne (ix) Vlastnosti:
(A) Jméno/Klíč: CDS (B) Umístění: 18..818 (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:3:
ATAAAACTCT CCCCGGG ATG ACA GAA CCG TTA ACC GAA ACC CCT GAA CTA Met Thr Glu Pro Leu Thr Glu Thr Pro Glu Leu
10
TCC GCG AAA TAT GCC TGG TTT TTT GAT CTT GAT GGA ACG CTG GCG GAA Ser Ala Lys Tyr Ala Trp Phe Phe Asp Leu Asp Gly Thr Leu Ala Glu
20 25
ATC AAA CCG CAT CCC GAT CAG GTC GTC GTG CCT GAC AAT ATT CTG CAA Ile Lys Pro His Pro Asp Gin Val Val Val Pro Asp Asn Ile Leu Gin
35 40
GGA CTA CAG CTA CTG GCA ACC GCA AGT GAT GGT GCA TTG GCA TTG ATA Gly Leu Gin Leu Leu Ala Thr Ala Ser Asp Gly Ala Leu Ala Leu Ile
50 55
TCA GGG CGC TCA ATG GTG GAG CTT GAC GCA CTG GCA AAA CCT TAT CGC Ser Gly Arg Ser Met Val Glu Leů Asp Ala Leu Ala Lys Pro Tyr Arg
65 70 75
TTC CCG TTA GCG GGC GTG CAT GGG GCG GAG CGC CGT GAC ATC AAT GGT Phe Pro Leu Ala Gly Val His Gly Ala Glu Arg Arg Asp Ile Asn Gly
85 90
AAA ACA CAT ATC GTT CAT CTG CCG GAT GCG ATT GCG CGT GAT ATT AGC Lys Thr His Ile Val His Leu Pro Asp Ala Ile Ala Arg Asp Ile Ser
100 105
GTG CAA CTG CAT ACA GTC ATC GCT CAG TAT CCC GGC GCG GAG CTG GAG Val Gin Leu His Thr Val Ile Ala Gin Tyr Pro Gly Ala Glu Leu Glu
110 115 120
GCG AAA GGG ATG GCT TTT GCG CTG CAT TAT CGT CAG GCT CCG CAG CAT
Ala Lys Gly Met Ala Phe Ala Leu His Tyr Arg Gin Ala Pro Gin His
125 130 135
146
194
242
338
386
434
• • · 9 • • • 9 9 99 9 9 99 9 9 99 9 9
9 9 • 9 9 9 9 9 · • 9
• • • 999 9 9 9 9 9 999 9 9 9
0 0 9 0 9 9 • 9
*9 9 999 99 9 · 99
GAA GAC GCA Ala TTA ATG Leu Met ACA Thr 145 TTA GCG CAA Gin CGT Arg ATT Ile 150 ACT Thr CAG Gin ATC Ile TGG Trp Cca · . Pro 155 482
Glu 140 Asp Leu Ala
CAA ATG GCG TTA CAG CAG GGA AAG TGT GTT GTC GAG ATC AAA CCG AGA 530
Gin Met Ala Leu Gin Gin Gly Lys Cys Val Val Glu Ile Lys Pro Arg
160 165 170
GGT ACC AGT AAA GGT GAG GCA ATT GCA GCT TTT ATG CAG GAA GCT CCC 578
Gly Thr Ser Lys Gly Glu Ala Ile Ala Ala Phe Met Gin Glu Ala Pro
175 180 185
TTT ATC GGG CGA ACG CCC GTA TTT CTG GGC GAT GAT TTA ACC GAT GAA 626
Phe Ile Gly Arg Thr Pro Val Phe Leu Gly Asp Asp Leu Thr Asp Glu
190 195 200
TCT GGC TTC GCA GTC GTT AAC CGA CTG GGC GGA ATG TCA GTA AAA ATT 674
Ser Gly Phe Ala Val Val Asn Arg Leu Gly Gly Met Ser Val Lys Ile
205 210 215
GGC ACA GGT GCA ACT CAG GCA TCA TGG CGA CTG GCG GGT GTG CCG GAT 722
Gly Thr Gly Ala Thr Gin Ala Ser Trp Arg Leu Ala Gly Val Pro Asp
220 225 230 235
GTC TGG AGC TGG CTT GAA ATG ATA ACC ACC GCA TTA CAA CAA AAA AGA 770
Val Trp Ser Trp Leu Glu Met Ile Thr Thr Ala Leu Gin Gin Lys Arg
240 245 250
GAA AAT AAC AGG AGT GAT GAC TAT GAG TCG TTT AGT CGT AGT ATC TAA 818
Glu Asn Asn Arg Ser Asp Asp Tyr Glu Ser Phe Ser Arg Ser Ile *
255 260 265
CCGGATTGCA CCTGCAG 835
270 (2)Informace o SEQ ID NO:4:
(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 272 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D)Topologie: lineární (ii)Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:4:
Met Thr Glu Pro Leu Thr Glu Thr Pro Glu Leu Ser Ala Lys Tyr Ala 1 5 io 15
Trp Phe Phe Asp Leu Asp Gly Thr Leu Ala Glu Ile Lys Pro His Pro 20 m ·· • 4
4
44* •
4«
4 • 4
444
4· 4 • 4 4 • ·4· · »4·· ·
4 4 • · · • *4 · · • 4 · • · ·
4 4
444 4·
Ásp Gin Val Val Val Pro Asp Asn 40 Ile Leu Gin Gly Leu 45 Gin Leu Léů
35
Ala Thr Ala Ser Asp Gly Ala Leu Ala Leu Ile Ser Gly Arg Ser Met
50 55 60
Val Glu Leu Asp Ala Leu Ala Lys Pro Tyr Arg Phe Pro Leu Ala Gly
65 70 75 80
Val His Gly Ala Glu Arg Arg Asp Ile Asn Gly Lys Thr His Ile Val
85 90 95
His Leu Pro Asp Ala Ile Ala Arg Asp Ile Ser Val Gin Leu His Thr
100 105 110
Val Ile Ala Gin Tyr Pro Gly Ala Glu Leu Glu Ala Lys Gly Met Ala
115 120 125
Phe Ala Leu His Tyr Arg Gin Ala Pro Gin His Glu Asp Ala Leu Met
130 135 140
Thr Leu. Ala Gin Arg Ile Thr Gin Ile Trp Pro Gin Met Ala Leu Gin
145 150 155 160
Gin Gly Lys Cys Val Val Glu Ile Lys Pro Arg Gly Thr Ser Lys Gly
165 170 175
Glu Ala Ile Ala Ala Phe Met Gin Glu Ala Pro Phe Ile Gly Arg Thr
180 185 190
Pro Val Phe Leu Gly Asp Asp Leu Thr Asp Glu Ser Gly Phe Ala Val
195 200 205
Val Asn Arg Leu Gly Gly Met Ser Val Lys Ile Gly Thr Gly Ala Thr
210 215 220
Gin Ala Ser Trp Arg Leu Ala Gly Val Pro Asp Val Trp Ser Trp Leu
225 230 235 240
Glu Met Ile Thr Thr Ala Leu Gin Gin Lys Arg Glu Asn Asn Arg Ser
245 250 255
Asp Asp Tyr Glu Ser Phe Ser Arg Ser Ile *
260 265 (2)Informace ο SEQ ID NO:5:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 27 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA • · · · • ·· · ·99 • 9
(iii)Hypotetický: Ne (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:5:
AAGCTTATGT TGCCATATAG AGTAGAT (2)Informace o SEQ ID NO:6:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 29 párů bázi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: Ne (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:6:
GTAGTTGCCA TGGTGCAAAT GTTCATATG (2)Informace o SEQ ID NO:7:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 26 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence; Ne (xi)Popis sekvence: SEQ ID N0:7:
GAYITIATIT GGRTICAYGA YTAYCA (2)Informace o SEQ ID NO:8:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 28 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO;8:
• · · ♦ ·
9 ·· · *·*
TIGGITKITT YYTICAYAYI CCITTYCC (2)Informace o SEQ ID NO:9:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 22 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:9:
GYIACIARRT TCATICCRTC IC ,22 (2)Informace o SEQ ID NO:10:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 743 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (vi)Původní zdroj:
(A)Organizmus: Homo sapiens (ix) Vlastnosti:
(A) Jméno/Klíč: CDS (B) Umístění: 1..743 (D) Další informace:/částečná (xi)Popis sekvence
SEQ ID NO:10:
GAC Asp 1 GTG Val ATG TGG ATG CAC His GAC Asp TAC Tyr CAT His TTG ATG GTG Val TTG Leu CCT ACG TTC Phe 48
Met Trp Met 5 Leu 10 Met Pro Thr 15
TTG AGG AGG CGG TTC AAT CGT TTG AGA ATG GGG TTT TTC CTT CAC AGT 96
Leu Arg Arg Arg Phe Asn Arg Leu Arg Met Gly Phe Phe Leu His Ser
20 25 30
CCA TTT CCC TCA TCT GAG ATT TAC AGG ACA CTT CCT GTT AGA GAG GAA 144
Pro Phe Pro Ser Ser Glu Ile Tyr Arg Thr Leu Pro Val Arg Glu Glu
35 40 45
• 9 • · • 9
192
O · · · · · • · · · · · • 9 · ··· · · · • · · · • 9 l· 9·
ΑΤΑ CTC AAG Lys GCT Ala TTG Leu CTC Leu TGT GCT GAC ATT GTT GGA TTC Phe CAC His ACT Thr TTT Phe
Ile Leu 50 Cys 55 Ala Asp Ile Val Gly 60
GAC TAC GCG AGA CAC TTC CTC TCT TGT TGC AGT CGG ATG TTG GGT TTA
Asp Tyr Ala Arg His Phe Leu Ser Cys Cys Ser Arg Met Leu Gly Leu
65 70 75 80
GAG TAT CAG TCT AAA AGA GGT TAT ATA GGG TTA GAA TAC TAT GGA CGG
Glu Tyr Gin Ser Lys Arg Gly Tyr Ile Gly Leu Glu Tyr Tyr Gly Arg
85 90 95
ACA GTA GGC ATC AAG ATT ATG CCC GTC GGG ATA CAT ATG GGT CAT ATT
Thr Val Gly Ile Lys Ile Met Pro Val Gly Ile His Met Gly His Ile
100 105 110
GAG TCC ATG AAG AAA CTT GCA GCG AAA GAG TTG ATG CTT AAG GCG CTA
Glu Ser Met Lys Lys Leu Ala Ala Lys Glu Leu Met Leu Lys Ala Leu
115 120 125 1
AAG CAG CAA TTT GAA GGG AAA ACT GTG TTG CTT GGT GCC GAT GAC CTG
Lys Gin Gin Phe Glu Gly Lys Thr Val Leu Leu Gly Ala Asp Asp Leu
130 135 140
GAT ATT TTC AAA GGT ATA AAC TTA AAG CTT CTA GCT ATG GAA CAG ATG
Asp Ile Phe Lys Gly Ile Asn Leu Lys Leu Leu Ala Met Glu Gin Met
145 150 155 160
CTC AAA CAG CAC CCC AAG TGG CAA GGG CAG GCT GTG TTG GTC CAG ATT
Leu Lys Gin His Pro Lys Trp Gin Gly Gin Ala Val Leu Val Gin Ile
165 170 175
GCA AAT CCT ACG AGG GGT AAA GGA GTA GAT TTT GAG GAA ATA CAG GCT
Ala Asn Pro Thr Arg Gly Lys Gly Val Asp Phe Glu Glu Ile Gin Ala
180 185 190
GAG ATA TCG GAA AGC TGT AAG AGA ATC AAT AAG CAA TTC GGC AAG CCT
Glu Ile Ser Glu Ser Cys Lys Arg Ile Asn Lys Gin Phe Gly Lys Pro
195 200 205
GGA TAT GAG CCT ATA GTT TAT ATT GAT AGG CCC GTG TCA AGC AGT GAA
Gly Tyr Glu Pro Ile Val Tyr Ile Asp Arg Pro Val Ser Ser Ser Glu
210 215 220
CGC ATG GCA TAT TAC AGT ATT GCA GAA TGT GTT GTT GTC ACG GCT GTG
Arg Met Ala Tyr Tyr Ser Ile Ala Glu Cys Val Val Val Thr Ala Val
225 230 235 240
AGC GAC GGC ATG AAC TTC GTC TC
Ser Asp Gly Met Asn Phe Val
245
240
288
336
384
432
480
528
576
624
672
720
743 • 9 (2)Informace o SEQ ID NO:11:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 247 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D)Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:11:
Asp 1 Val Met Trp Met 5 His Asp Tyr His Leu 10 Met Val Leu Pro Thr 15 Phe
Leu Arg Arg Arg Phe Asn Arg Leu Arg Met Gly Phe Phe Leu His Ser
20 25 30
Pro Phe Pro Ser Ser Glu Ile Tyr Arg Thr Leu Pro Val Arg Glu Glu
35 40 45
Ile Leu Lys Ala Leu Leu Cys Ala Asp Ile Val Gly Phe His Thr Phe
50 55 60
Asp Tyr Ala Arg His Phe Leu Ser Cys Cys Ser Arg Met Leu Gly Leu
65 70 75 80
Glu Tyr Gin Ser Lys Arg Gly Tyr Ile Gly Leu Glu Tyr Tyr Gly Arg
85 90 95
Thr Val Gly Ile Lys Ile Met Pro Val Gly Ile His Met Gly His Ile
100 105 110
Glu Ser Met Lys Lys Leu Ala Ala Lys Glu Leu Met Leu Lys Ala Leu
115 120 125
Lys Gin Gin Phe Glu Gly Lys Thr Val Leu Leu Gly Ala Asp Asp Leu
130 135 140
Asp Ile Phe Lys Gly Ile Asn Leu Lys Leu Leu Ala Met Glu Gin Met
145 150 155 160
Leu Lys Gin His Pro Lys Trp Gin Gly Gin Ala Val Leu Val Gin Ile
165 170 175
Ala Asn Pro Thr Arg Gly Lys Gly Val Asp Phe Glu Glu Ile Gin Ala
180 185 190
Glu Ile Ser Glu Ser Cys Lys Arg Ile Asn Lys Gin Phe Gly Lys Pro
195 200 205
Gly Tyr Glu Pro Ile Val Tyr Ile Asp Arg Pro Val Ser Ser Ser Glu
210 215 220
Arg Met Ala Tyr Tyr Ser Ile Ala Glu Cys Val Val Val Thr Ala Val
225 230 235 240 t i «··· · ··
Ser Asp Gly Met Asn Phe Val 245 (2)Informace o SEQ ID NO:12:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 395 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (vi)Původní zdroj:
(A) Organizmus: Nicotiana tabacum (B) Druh: Samsun NN (F)Typ pletiva: List (ix) Vlastnosti:
(C) Jméno/Klíč: CDS (D) Umístění: 1..395 (D) Další informace:/částečná
(xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:12:
GCG Ala 1 AAA Lys CCG Pro GTG Val ATG AAA CTT TAC AGG GAA GCA ACT GAC GGA TCA TAT 48
Met 5 Lys Leu Tyr Arg Glu 10 Ala Thr Asp Gly Ser 15 Tyr
ATA GAA ACT AAA GAG AGT GCA TTA GTG TGG CAC CAT CAT GAT GCA GAC 96
Ile Glu Thr Lys Glu Ser Ala Leu Val Trp His His His Asp Ala Asp
20 25 30
CCT GAC TTT GGC TCC TGC CAG GCA AAG GAA TTG TTG GAT CAT TTG GAA 144
Pro Asp Phe Gly Ser Cys Gin Ala Lys Glu Leu Leu Asp His Leu Glu <·
35 40 45
AGC GTA CTT GCA AAT GAA CCT GCA GTT GTT AAG AGG GGC CAA CAT ATT 192
Ser Val Leu Ala Asn Glu Pro Ala Val Val Lys Arg Gly Gin His Ile
50 55 60
GTT GAA GTC AAG CCA CAA GGT GTG ACC AAA GGA TTA GTT TCA GAG AAG 240
Val Glu Val Lys Pro Gin Gly Val Thr Lys Gly Leu Val Ser Glu Lys
65 70 75 80
GTT CTC TCG ATG ATG GTT GAT AGT GGG AAA CCG CCC GAT TTT GTT ATG 288
Val Leu Ser Met Met Val Asp Ser Gly Lys Pro Pro Asp Phe Val Met
85 90 95
TGC ATT GGA GAT GAT AGG TCA GAC GAA GAC ATG TTT GAG AGC ATA TTA 336
ϊ Cys Ile Gly Asp Asp Arg Ser Asp Glu Asp Met Phe Glu Ser Ile Leu
i 100 105 110
00· 0·· ·· · • 0· • 0 0· • 0 0 0 0·
AGC ACC GTA TCC AGT CTG TCA GTC ACT GCT GCC CCT GAT GTC TTT GCC Ser Thr Val Ser Ser Leu Ser Val Thr Ala Ala Pro Asp Val Phe Ala
115 120 125
TGC ACC GTC GG Cys Thr Val
130 (2)Informace o SEQ ID NO:13:
(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 131 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D)Topologie: lineární
384
395 (ii)Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:13:
Ala 1 Lys Pro Val Met 5 Lys Leu Tyr Arg Glu Ala Thr Asp Gly Ser Tyr
10 15
Ile Glu Thr Lys Glu Ser Ala Leu Val Trp His His His Asp Ala Asp
20 25 30
Pro Asp Phe Gly Ser Cys Gin Ala Lys Glu Leu Leu Asp His Leu Glu
35 40 45
Ser Val Leu Ala Asn Glu Pro Ala Val Val Lys Arg Gly Gin His Ile
50 55 60
Val Glu Val Lys Pro Gin Gly Val Thr Lys Gly Leu Val Ser Glu Lys
65 70 75 80
Val Leu Ser Met Met Val Asp Ser Gly Lys Pro Pro Asp Phe Val Met
85 90 95
Cys Ile Gly Asp Asp Arg Ser Asp Glu Asp Met Phe Glu Ser Ile Leu
100 105 110
Ser Thr Val Ser Ser Leu Ser Val Thr Ala Ala Pro Asp Val Phe Ala
115 120 125
Cys Thr Val 130 (2)Informace o SEQ ID NO:14:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 491 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mJRNA
• • • • • • • · • « • · 9 9 · · 9 9 · • · 9> 9 • (· · · • 9 • 9 • · • •9 • 4 • 9 9 • ·* • · • · • · 9 9 9 • • * • · • · • · 9 9 9 • 4 9
(iii)Hypotetický: Ne
(iii)Antisence: Ne
(vi)Původní zdroj:
(A) Organizmus: Nicotiana tabacum
(B)Druh: Samsun NN
(F)Typ pletiva: List
(ix) Vlastnosti:
(A) Jméno/Klič : CDS
(B) Umístění : 1..491
(D) Další informace:/částečná
(xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:14:
GGG CTG TCG GCG GAA CAC GGC TAT TTC TTG AGG ACG AGT CAA GAT GAA 48
Gly Leu Ser Ala Glu His Gly Tyr Phe Leu Arg Thr Ser Gin Asp Glu
1 5 10 15 i
GAA TGG GAA ACA TGT GTA CCA CCA GTG GAA TGT TGT TGG AAA GAA ATA 96
Glu Trp Glu Thr Cys Val Pro Pro Val Glu Cys Cys Trp Lys Glu Ile
20 25 30
GCT GAG CCT GTT ATG CřA CTT TAC ACT GAG ACT ACT GAT GGA TCA GTT 144
Ala Glu Pro Val Met Gin Leu Tyr Thr Glu Thr Thr Asp Gly Ser Val
35 40 45
ATT GAA GAT AAG GAA ACA TCA ATG GTC TGG TCT TAC GAG GAT GCG GAT 192
Ile Glu Asp Lys Glu Thr Ser Met Val Trp Ser Tyr Glu Asp Ala Asp
50 55 60
CCT GAT TTT GGA TCA TGT CAG GCT AAG GAA CTT CTT GAT CAC CTA GAA 240
Pro Asp Phe Gly Ser Cys Gin Ala Lys Glu Leu Leu Asp His Leu Glu
65 70 75 80
AGT GTA CTA GCT AAT GAA CCG GTC ACT GTC AGG AGT GGA CAG AAT ATA 288
Ser Val Leu Ala Asn Glu Pro Val Thr Val Arg Ser Gly Gin Asn Ile
85 90 95 c
GTG GAA GTT AAG CCC CAG GGT GTA TCC AAA GGG CTT GTT GCC AAG CGC 336
Val Glu Val Lys Pro Gin Gly Val Ser Lys Gly Leu Val Ala Lys Arg
100 105 110
CTG CTT TCC GCA ATG CAA GAG AAA GGA ATG TCA CCA GAT TTT GTC CTT 384
Leu Leu Ser Ala Met Gin Glu Lys Gly Met Ser Pro Asp Phe Val Leu
115 120 125
TGC ATA GGA GAT GAC CGA TCG GAT GAA GAC ATG TTC GAG GTG ATC ATG 432
Cys Ile Gly Asp Asp Arg Ser Asp Glu Asp Met Phe Glu Val Ile Met
130 135 140
AGC TCG ATG TCT GGC CCG TCC ATG GCT CCA ACA GCT GAA GTC TTT GCC 480
Ser Ser Met Ser Gly Pro Ser Met Ala Pro Thr Ala Glu Val Phe Ala
145 150 155 160
«· · · · ·· · • · <* · · · · • « «· ··· ♦ · * • · · · · « · » · · ·· ··
TGC ACC GTC GG .491
Cys Thr Val (2)Informace o SEQ ID N0:15:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 163 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D)Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:15:
Gly Leu 1 Ser Ala Glu 5 His Gly Tyr Phe Leu Arg 10 Thr Ser Gin Asp 15 Glu
Glu Trp Glu Thr Cys Val Pro Pro Val Glu Cys Cys Trp Lys Glu Ile
20 25 30
Ala Glu Pro Val Met Gin Leu Tyr Thr Glu Thr Thr Asp Gly Ser Val
35 40 45
Ile Glu Asp Lys Glu Thr Ser Met Val Trp Ser Tyr Glu Asp Ala Asp
50 55 60
Pro Asp Phe Gly Ser Cys Gin Ala Lys Glu Leu Leu Asp His Leu Glu
65 70 75 80
Ser Val Leu Ala Asn Glu Pro Val Thr Val Arg Ser Gly Gin Asn Ile
8 5 90 95
Val Glu Val Lys Pro Gin Gly Val Ser Lys Gly Leu Val Ala Lys Arg
100 105 110
Leu Leu Ser Ala Met Gin Glu Lys Gly Met Ser Pro Asp Phe Val Leu
115 120 125
Cys Ile Gly Asp Asp Arg Ser Asp Glu Asp Met Phe Glu Val Ile Met
130 135 140
Ser Ser Met Ser Gly Pro Ser Met Ala Pro Thr Ala Glu Val Phe Ala
145 150 155 160
Cys Thr Val (2)Informace o SEQ ID NO:16:
(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 361 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární * · • · · · · ·
(ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Ne (iii) Antisence: Ne (vi)Původní zdroj:
(A) Organizmus: Nicotiana tabacum (B) Druh: Samsun NN (F)Typ pletiva: List (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:16:
TTTGATTATG ATGGGACGCT GCTGTCGGAG GAGAGTGTGG ACAAAACCCC GAGTGAAGAT 60
GACATCTCAA TTCTGAATGG TTTATGCAGT GATCCAAAGA ACGTAGTCTT TATCGTGAGT 120
GGCAGAGGAA AGGATACACT TAGCAAGTGG TTCTCTCCGT GTCCGAGACT CGGCCTATCA 180
GCAGAACATG GATATTTCAC TAGGTGGAGT AAGGATTCCG AGTGGGAATC TCGTCCATAG‘ 240
CTGCAGACCT TGACTGGAAA AAAATAGTGT TGCCTATTAT GGAGCGCTAC ACAGAGCACA 300
GATGGTTCGT CGATAGAACA GAAGGAAACC TCGTGTTGGC TCATCAAATG CTGGCCCCGA 360
A 361 (2)Informace o SEQ ID NO:17:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 118 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (vi)Původní zdroj:
(A) Organizmus: Nicotiana tabacum (B) Druh: Samsun NN (F)Typ pletiva: List (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:17:
GGAAACCCAC AGGATGTAAG CAAAGTTTTA GTTTTTGAGA TCTCTTGGCA TCAAGCAAAG 60 TAGAGGGAAG TCACCCGATT CGTGCTGTGC GTAGGGATGA CAGATCGGAC GACTTAGA 118 φφ ·· (2)Informace ο SEQ ID NO:18:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 417 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA .{lid )Hypotetic.ký.: .Ne (iii) Antisence: Ne (vi)Původní zdroj:
(A) Organizmus·: Nicotiana tabacum (B) Druh: Samsun NN (F)Typ pletiva: List (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:18:
TTGTGGCCGA TGTTCCACTA CATGTTGCCG TTCTCACCTG ACCATGGAGG CCGCTTTGAT 60
CGCTCTATGT GGGAAGCATA TGTTTCTGCC AACAAGTTGT TTTCACAAAA AGTAGTTGAG 120
GTTCTTAATC CTGAGGATGA CTTTGTCTGG ATTCATGATT ATCATTTGAT GGTGTTGCCA 180
ACGTTCTTGA GGAGGCGGTT CAATCGTTTG AGAATGGGGT TTTTCCTTCA CAGTCCATTC 240
CTTCATCTGA GATTTACAGG ACACTTCCTG TTAGAGAGGA AATACTCAAG GCTTTGCTCT 300
GTGCTGACAT TGTTGGATTC CACACTTTTG ACTACGCGAG ACACTTCCTC TCTTGTTGCA 360
GTCGATTTTG GGTAGAGTAC AGTCTAAAAA AAGTTATATT GGGTTAAAAT ACTATGG 417
(2)Informace o SEQ ID NO:19:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 411 párů bázi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (vi)Původní zdroj:
(A) Organizmus: Nicotiana tabacum (B) Druh: Samsun NN (F)Typ pletiva: List
(xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:19:
GGGTCATATT
GCAATTTGAA
GAACTTAAAG
GGCTGTGTTG
TACGGCTGAG
TGAGCCTATA
TATTGCAGGA
GATCCATGAA
GGGAAAACTG
CTTCTAGCTA
GTCCAAGATT
ACATCGGAAA
GTTTATATTG
TGTGTTGTGG
GAAATTGCAG
TGTTGTTAGG
TGGAACAGAT
GCAAATCCTA
GCTGTAAGAG
ATAGGCCCGT
TCACGCTGTG
CGAAAGAGTG
TGCCGATGAC
GCTCAAACAT
CGAGGGGTAA
AATCAATAAG
GTCAAGCAGT
AGCGATGGCA
ATGCTTTAAT
CTGGATATTT
CACCCCAAGT
AGGAGTAGAT
CAATTCGGCA
GAACGCATGG
TGAATCTGTT
GCGTAAAGCA
TCAAAGGTAT
GGCAAGGGCA
TTTGACGAAA
AGCCTGGATA
CATATTACAG
C
120
180
240
300
360
411 (2)Informace o SEQ ID NO:20:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 405 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (vi)Původní zdroj:
(A) Organizmus: Nicotiana tabacum (B) Druh: Samsun NN (F)Typ pletiva: List (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:20:
TGGGGTGGTT
GCGAAAGATC
CAGGCACTTC
TACATAGGCC
TATGGGGCAG
GTGCAGCATT
TAAAGGCTCA
CCTGCATACG
TTACAGCTCT
CTCTCGTGTT
TCGATATTAT
CTTCAGCAAG
TAATCATCAG
TTTGAATTTA
CCGTTTCCTT
CTTGAATTCA
GCAGTCGGAT
GGCAGGACTG
TCTTGAGTCT
GGGGAGGACA
TTACCATGGA
CTTCTGAGAT
ATTTGATTGG
GTTAGGTATT
TAATATAAAA
TCCTGAAACG
TTGTTGCTGG
ACAACTCTAT
ATATAAAACT
GTTCCACACT
TCTTATGATC
ATTCTGCCAG
GAGGCAAAAT
GATTGATGAC
TGCAC
TTGCCTATTC
TTTGACTATG
AAAAAGGGGT
CGGGTATTCA
CTCGGAACTC
TGGACATATT
120
180
240
300
360
405 ,>·> * » «· ·» ·* ·· ♦ · · » » · ' « · · ♦ · · φ · · · ··« ··· • · · * * (2)Informace ο SEQ ID NO:21:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 427 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (vi)Původní zdroj:
(A) Organizmus: Nicotiana tabacum (B) Druh: Samsun NN (F)Typ pletiva: List (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:21:
ATCATATGGG GCAGCTTCAG CAATCTTGAT CTTCCTGAAA CGGAGGCAAA AGTCTTCGGA 60
ACTCGGCAGC AGTTTAATCA TCAGGGGAGG ACATTGTTGC TGGGAGTTGA TGACATGGAC 120
ATATTTAAAG GCATCAGTTT GAAGTTATTA GCAATGGAAC AACTTCTATT GCAGCACCCG 180
GAGAAGCAGG GGAAGGTTGT TTTGGTGCAG ATAGCCAATC CTGCTAGAGG CAAAGGAAAA 240
GATGTCAAAG AAGTGCAGGA AGAAACTCAT TGACGGTGAA GCGAATTAAT GAAGCATTTG 300
GAAGACCTGG GTACGAACCA GTTATCTTGA TTGATAAGCC ACTAAAGTTT TATGAAAGGA 360
TTGCTTATTA TGTTGTTGCA GAGTGTTGCC TAGTCACTGC TGTCAGCGAT GGCATGAACC 420
TCGTCTC 427 (2)Informace o SEQ ID NO:22:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 315 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (vi)Původní zdroj:
(A) Organizmus: Nicotiana tabacum (B) Druh: Samsun NN (F)Typ pletiva: List (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:22:
·♦ ·· ·· • 9 9 ·
9 9 9 9 · • « » · · · · · · 9 9 · ·
99 · · ·*
GATGTGGATG CATGACTACC AATCCAAGAG GGGGTATATT GGTCTTGACT ATTATGGTAA 60
ACTGTGACCA TTAAAATCCT TCCAGTTGGT ATTCACATGG GACAACTCCA AAATGTTATG 120
TCACTACAGA CACGGGAAAG AAAGCAAAGG AGTTGAAAGA AAAATATGAG GGGAAAATTG 180
TGATGTTAGG TATTGATGAT ATGGACATGT TTAAAGGAAT TGGTCTAAAG TTTCTGGCAA 240
TGGGGAGGCT TCTAGATGAA AACCCTGTCT TGAGGGGTAA AGTGGTATTG GTTCAATCAC 300
CAGGCCTGGA AATTA 315
(2)Informace o SEQ ID NO:23:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 352 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (vi)Původní zdroj:
(A) Organizmus: Nicotiana tabacum (B) Druh: Samsun NN (F)Typ pletiva: List (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:23:
AGAAGTAAAG GGAGTGAGTC CCCGAGGTTC AAAAAGAGGT CAACAGAATT GCAGTGAAAT 60
TAATAAAAAA TATGGCAAAC CGGGGTACAA GCCGATTGTT TGTATCAATG GTCCAGTTTC 120
GACACAAGAC AAGATTGCAC ATTATGCGGT CTTGAGTGTG TTGTTGTTAA ť TGCTGTTAGA 180
GATGGGATGA ACTTGGTGCC TTATGAGTAT ACGGTCTTTA GGCAGGGCAG CGATAATTTG 240
GATAAGGCCT TGCAGCTAGA TGGTCCTACT GCTTCCAGAA AGAGTGTGAT TATTGTCTTG 300
AATTCGTTGG GTGCTCGCCA TCTTTAGTGG CGCCATCCGC GTCAACCCCT GG 352
(2)Informace o SEQ ID NO:24:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 2640 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA
100 • · · • · * • · · · • · ·*·♦ ·
9· (iii)Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (vi)Původní zdroj:
(A)Organizmus: Helianthus annuus (F)Typ pletiva: List (ix) Vlastnosti:
(A) Jméno/Klíč: CDS (B) Umístění: 171..2508 (ix) Vlastnosti:
(A) Jméno/Klíč: nejisté (B) Umístění: nahrazeno (2141..2151, (ix) Vlastnosti:
(A) Jméno/Klíč: nejisté (B) Umístění: nahrazeno (2237..2243, (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:24:
„ccatnnntta) „actnaaa)
GGATCCTGCG GTTTCATCAC ACAATATGAT ACTGTTACAT CTGATGCCCC TTCAGATGTC 60
CCAAATAGGT TGATTGTCGT ATCGAATCAG TTACCCATAA TCGCTAGGCT AAGACTAACG 120
ACAATGGAGG GTCCTTTTGG GATTTCACTT GGGACGAGAG TTCGATTTAC ATG CAC Met His 176
ATC Ile AAA GAT GCA TTA Leu CCC Pro GCA GCC GTT GAG GTT TTC TAT GTT GGC GCA 224
Lys Asp Ala 5 Ala Ala 10 Val Glu Val Phe Tyr 15 Val Gly Ala
CTA AGG GCT GAC GTT GGC CCT ACC GAA CAA GAT GAC GTG TCA AAG ACA 272
Leu Arg Ala Asp Val Gly Pro Thr Glu Gin Asp Asp Val Ser Lys Thr
20 25 30
TTG CTC GAT AGG TTT AAT TGC GTT GCG GTT TTT GTC CCT ACT TCA AAA <· 320
Leu Leu Asp Arg Phe Asn Cys Val Ala Val Phe Val Pro Thr Ser Lys
35 40 45 50
TGG GAC CAA TAT TAT CAC TGC TTT TGT AAG CAG TAT TTG TGG CCG ATA 368
Trp Asp Gin Tyr Tyr His Cys Phe Cys Lys Gin Tyr Leu Trp Pro Ile
55 60 65
TTT CAT TAC AAG GTT CCC GCT TCT GAC GTC AAG AGT GTC CCG AAT AGT 416
Phe His Tyr Lys Val Pro Ala Ser Asp Val Lys Ser Val Pro Asn Ser
70 75 80
CGG GAT TCA TGG AAC GCT TAT GTT CAC GTG AAC AAA GAG TTT TCC CAG 464
Arg Asp Ser Trp Asn Ala Tyr Val His Val Asn Lys Glu Phe Ser Gin
85 90 95
101
4 • 4
444·
AAG Lys GTG Val 100 ATG Met GAG GCA GTA ACC AAT GCT Thr Asn Ala 105 AGC Ser AAT Asn TAT Tyr 110 GTA Val TGG Trp ATA Ile CAT His ' 512
Glu Ala Val
GAC TAC CAT TTA ATG ACG CTA CCG ACT TTC TTG AGG CGG GAT TTT TGT 560
Asp Tyr His Leu Met Thr Leu Pro Thr Phe Leu Arg Arg Asp Phe Cys
115 120 125 130
CGT TTT AAA ATC GGT TTT TTT CTG CAT AGC CCG TTT CCT TCC TCG GAG 608
Arg Phe Lys Ile Gly Phe Phe Leu His Ser Pro Phe Pro Ser Ser Glu
135 140 145
GTT TAC AAG ACC CTA CCA ATG AGA AAC GAG CTC TTG AAG GGT CTG TTA 656
Val Tyr Lys Thr Leu Pro Met Arg Asn Glu Leu Leu Lys Gly Leu Leu
150 155 160
AAT GCT GAT CTT ATC GGG TTC CAT ACA TAC GAT TAT GCC CGT CAT TTT 704
Asn Ala Asp Leu Ile Gly Phe His Thr Tyr Asp Tyr Ala Arg His Phe
165 170 175
CTA ACG TGT TGT AGT CGA ATG TTT GGT TTG GAT CAT CAG TTG AAA AGG 752
Leu Thr Cys Cys Ser Arg Met Phe Gly Leu Asp His Gin Leu Lys Arg
180 185 190
GGG TAC ATT TTC TTG GAA TAT AAT GGA AGG AGC ATT GAG ATC AAG ATA 800
Gly Tyr Ile Phe Leu Glu Tyr Asn Gly Arg Ser Ile Glu Ile Lys Ile
195 200 205 210
AAG GCG AGC GGG ATT CAT GTT GGT CGA ATG GAG TCG TAC TTG AGT CAG 848
Lys Ala Ser Gly Ile His Val Gly Arg Met Glu Ser Tyr Leu Ser Gin
215 220 225
CCC GAT ACA AGA TTA CAA GTT CAA GAA CTA AAA AAA CGT TTC GAA GGG 896
Pro Asp Thr Arg Leu Gin Val Gin Glu Leu Lys Lys Arg Phe Glu Gly
230 235 240
AAA ATC GTG CTA CTT GGA GTT GAT GAT TTG GAT ATA TTC AAA GGT GTG 944
Lys Xle Val Leu Leu Gly Val Asp Asp Leu Asp Ile Phe Lys Gly Val
245 250 255
AAC TTC AAG GTT TTA GCG TTG GAG AAG TTA CTT AAA TCA CAC CCG AGT 992
Asn Phe Lys Val Leu Ala Leu Glu Lys Leu Leu Lys Ser His Pro Ser
260 265 270
TGG CAA GGG CGT GTG GTT TTG GTG CAA ATC TTG AAT CCC GCT CGC GCG 1040
Trp Gin Gly Arg Val Val Leu Val Gin Ile Leu Asn Pro Ala Arg Ala
275 280 285 290
CGT TGC CAA GAC GTC GAT GAG ATC AAT GCC GAG ATA AGA ACA GTC TGT 1088
Arg Cys Gin Asp Val Asp Glu Ile Asn Ala Glu Ile Arg Thr Val Cys
295 300 305
GAA AGA ATC AAT AAC GAA CTG GGA AGC CCG GGA TAC CAG CCC GTT GTG 1136
Glu Arg Ile Asn Asn Glu Leu Gly Ser Pro Gly Tyr Gin Pro Val Val
310 315 320
102 * · ·♦
• · • · • • • ·· · • * ·· • · 9 9
TTA ATT GAT GGG CCC GTT TCG TTA AGT GAA AAA GCT GCT TAT TAT f GCT 1184
Leu Ile Asp Gly Pro Val Ser Leu Ser Glu Lys Ala Ala Tyr Tyr Ala
325 330 335
ATC GCC GAT ATG GCA ATT GTT ACA CCG TTA CGT GAC GGC ATG AAT CTT 1232
Ile Ala Asp Met Ala Ile Val Thr Pro Leu Arg Asp Gly Met Asn Leu
340 345 350
ATC CCG TAC GAG TAC GTC GTT TCC CGA CAA AGT GTT AAT GAC CCA AAT 1280
Ile Pro Tyr Glu Tyr Val Val Ser Arg Gin Ser Val Asn Asp Pro Asn
355 360 365 370
CCC AAT ACT CCA AAA AAG AGC ATG CTA GTG GTC TCC GAG TTC ATC GGG 1328
Pro Asn Thr Pro Lys Lys Ser Met Leu Val Val Ser Glu Phe Ile Gly
375 380 385
TGT TCA CTA TCT TTA ACC GGG GCC ATA CGG GTC AAC CCA TGG GAT GAG 1376
Cys Ser Leu Ser Leu Thr Gly Ala Ile Arg Val Asn Pro Trp Asp Glu
390 395 400 -
TTG GAG ACA GCA GAA GCA TTA TAC GAC GCA CTC ATG GCT CCT GAT GAC 1424
Leu Glu Thr Ala Glu Ala Leu Tyr Asp Ala Leu Met Ala Pro Asp Asp
405 410 415
CAT AAA GAA ACC GCC CAC ATG AAA CAG TAT CAA TAC ATT ATC TCC CAT 1472
His Lys Glu Thr Ala His Met Lys Gin Tyr Gin Tyr Ile Ile Ser His
420 425 430
GAT GTA GCT AAC TGG GCT CGT AGC TTC TTT CAA GAT TTA GAG CAA GCG 1520
Asp Val Ala Asn Trp Ala Arg Ser Phe Phe Gin Asp Leu Glu Gin Ala
435 440 445 450
TGC ATC GAT CAT TCT CGT AAA CGA TGC ATG AAT TTA GGA TTT GGG TTA 1568
Cys Ile Asp His Ser Arg Lys Arg Cys Met Asn Leu Gly Phe Gly Leu
455 460 465
GAT ACT AGA GTC GTT CTT TTT GAT GAG AAG TTT AGC AAG TTG GAT ATA 1616
Asp Thr Arg Val Val Leu Phe Asp Glu Lys Phe Ser Lys Leu Asp Ile
470 475 480
GAT GTC TTG GAG AAT GCT TAT TCC ATG GCT CAA AAT CGG GCC ATA CTT 1664
Asp Val Leu Glu Asn Ala Tyr Ser Met Ala Gin Asn Arg Ala Ile Leu
485 490 495
TTG GAC TAT GAC GGC ACT GTT ACT CCA TCT ATC AGT AAA TCT CCA ACT 1712
Leu Asp Tyr Asp Gly Thr Val Thr Pro Ser Ile Ser Lys Ser Pro Thr
500 505 510
GAA GCT GTT ATC TCC ATG ATC AAC AAA CTG TGC AAT GAT CCA AAG AAC 1760
Glu Ala Val Ile Ser Met Ile Asn Lys Leu Cys Asn Asp Pro Lys Asn
515 520 525 530
ATG GTG TTC ATC GTT AGT GGA CGC AGT AGA GAA AAT CTT GGC AGT TGG 1808
Met Val Phe Ile Val Ser Gly Arg Ser Arg Glu Asn Leu Gly Ser Trp
535 540 545
103 ·* ·· * · <
1856 • · • · · •···· ·
TTC Phe GGC Gly GCG TGT GAG AAA CCC GCC Ala ATT Ile 555 GCA GCT GAG CAC GGA TAC TTT Phe
Ala Cys 550 Glu Lys Pro Ala Ala Glu His Gly 560 Tyr
ΑΤΑ AGG TGG GCG GGT GAT CAA GAA TGG GAA ACG TGC GCA CGT GAG AAT
Ile Arg Trp Ala Gly Asp Gin Glu Trp Glu Thr Cys Ala Arg Glu Asn
565 570 575
AAT GTC GGG TGG ATG GAA ATG GCT GAG CCG GTT ATG AAT CTT TAT ACA
Asn Val Gly Trp Met Glu Met Ala Glu Pro Val Met Asn Leu Tyr Thr
580 585 590
GAA ACT ACT GAC GGT TCG TAT ATT GAA AAG AAA GAA ACT GCA ATG GTT
Glu Thr Thr Asp Gly Ser Tyr Ile Glu Lys Lys Glu Thr Ala Met Val
595 600 605 610
TGG CAC TAT GAA GAT GCT GAT AAA GAT CTT GGG TTG GAG CAG GCT AAG
Trp His Tyr Glu Asp Ala Asp Lys Asp Leu Gly Leu Glu Gin Ala Lys
615 620 625
GAA CTG TTG GAC CAT CTT GAA AAC GTG CTC GCT AAT GAG CCC GTT GAA
Glu Leu Leu Asp His Leu Glu Asn Val Leu Ala Asn Glu Pro Val Glu
630 635 640
GTG AAA CGA GGT CAA TAC ATT GTA GAA GTT AAA CCA CAG GTA CCC CAT
Val Lys Arg Gly Gin Tyr Ile Val Glu Val Lys Pro Gin Val Pro His
645 650 655
GGG TTA CCT TCT TGT TAT GAC ATT CAT AGG CAC AGA TTT GTA GAA TCT
Gly Leu Pro Ser Cys Tyr Asp Ile His Arg His Arg Phe Val Glu Ser
660 665 670
TTT AAC TTA AAT TTC TTT AAA TAT GAA TGC AAT TAT AGG GGG TCA CTG
Phe Asn Leu Asn Phe Phe Lys Tyr Glu Cys Asn Tyr Arg Gly Ser Leu
675 680 685 690
AAA GGT ATA GTT GCA GAG AAG ATT TTT GCG TTC ATG GCT GAA AAG GGA
Lys Gly Ile Val Ala Glu Lys Ile Phe Ala Phe Met Ala Glu Lys Gly
695 700 705
AAA CAG GCT GAT TTC GTG TTG AGC GTT GGA GAT GAT AGA AGT GAT GAA
Lys Gin Ala Asp Phe Val Leu Ser Val Gly Asp Asp Arg Ser Asp Glu
710 715 720
GAC ATG TTT GTG GCC ATT GGG GAT GGA ATA AAA AAG GGT CGG ATA ACT
Asp Met Phe Val Ala Ile Gly Asp Gly Ile Lys Lys Gly Arg Ile Thr
725 730 735
AAC AAC AAT TCA GTG TTT ACA TGC GTA GTG GGA GAG AAA CCG AGT GCA
Asn Asn Asn Ser Val Phe Thr Cys Val Val Gly Glu Lys Pro Ser Ala
740 745 750
GCT GAG TAC TTT TTA GAC GAG ACG AAA GAT GTT TCA ATG ATG CTC GAG
Ala Glu Tyr Phe Leu Asp Glu Thr Lys Asp Val Ser Met Met Leu Glu
755
765
770
1904
1952
2000
2048
2096
2144
2192
2240
2288
2336
2384
2432
2480
760
104 ··
9
9 • 9
99 ·
9«9 99
AAG CTC GGG TGT CTC AGC AAC CAA GGA T GATGATCCGG AAGCTTCTCG 2528
Lys Leu Gly Cys Leu Ser Asn Gin Gly
775
TGATCTTTAT GAGTTAAAAG TTTTCGACTT TTTCTTCATC AAGATTCATG GGAAAGTTGT 2588
TCAATATGAA CTTGTGTTTC TTGGTTCTGG ATTTTAGGGA GTCTATGGAT CC 2640 (2)Informace o SEQ ID NO:25:
(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 779 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D)Topologie: lineární (ii)Typ molekuly: protein
Popis sekvence: SEQ ID NO:25 J
Met His Ile Lys Asp Ala Leu Pro Ala Ala Val Glu Val Phe Tyr Val
1 5 10 15
Gly Ala Leu Arg Ala Asp Val Gly Pro Thr Glu Gin Asp Asp Val Ser
20 25 30
Lys Thr Leu Leu Asp Arg Phe Asn Cys Val Ala Val Phe Val Pro Thr
35 40 45
Ser Lys Trp Asp Gin Tyr Tyr His Cys Phe Cys Lys Gin Tyr Leu Trp
50 55 60
Pro Ile Phe His Tyr Lys Val Pro Ala Ser Asp Val Lys Ser Val Pro
65 70 75 80
Asn Ser Arg Asp Ser Trp Asn Ala Tyr Val His Val Asn Lys Glu Phe
85 90 95
Ser Gin Lys Val Met Glu Ala Val Thr Asn Ala Ser Asn Tyr Val Trp
100 105 110
Ile His Asp Tyr His Leu Met Thr Leu Pro Thr Phe Leu Arg Arg Asp
115 120 125
Phe Cys Arg Phe Lys Ile Gly Phe Phe Leu His Ser Pro Phe Pro Ser
130 135 140
Ser Glu Val Tyr Lys Thr Leu Pro Met Arg Asn Glu Leu Leu Lys Gly
145 150 155 160
Leu Leu Asn Ala Asp Leu Ile Gly Phe His Thr Tyr Asp Tyr Ala Arg
165 170 175
His Phe Leu Thr Cys Cys Ser Arg Met Phe Gly Leu Asp His Gin Leu
180 185 190
105 «· « · • · ·· • · · • · · · • · ···* · • · · ·· ·
Lys Arg Gly Tyr 195 Ile Phe Leu Glu 200 Tyr Asn Gly Arg Ser 205 Ile Glu Ile
Lys Ile Lys Ala Ser Gly Ile His Val Gly Arg Met Glu Ser Tyr Leu
210 215 220
Ser Gin Pro Asp Thr Arg Leu Gin Val Gin Glu Leu Lys Lys Arg Phe
225 230 235 240
Glu Gly Lys Ile Val Leu Leu Gly Val Asp Asp Leu Asp Ile Phe Lys
245 250 255
Gly Val Asn Phe Lys Val Leu Ala Leu Glu Lys Leu Leu Lys Ser His
260 265 270
Pro Ser Trp Gin Gly Arg Val Val Leu Val Gin Ile Leu Asn Pro Ala
275 280 285
Arg Ala Arg Cys Gin Asp Val Asp Glu Ile Asn Ala Glu Ile Arg Thr
290 295 300
Val Cys Glu Arg Ile Asn Asn Glu Leu Gly Ser Pro Gly Tyr Gin Pro
305 310 315 320
Val Val Leu Ile Asp Gly Pro Val Ser Leu Ser Glu Lys Ala Ala Tyr
325 330 335
Tyr Ala Ile Ala Asp Met Ala Ile Val Thr Pro Leu Arg Asp Gly Met
340 345 350
Asn Leu Ile Pro Tyr Glu Tyr Val Val Ser Arg Gin Ser Val Asn Asp
355 360 365
Pro Asn Pro Asn Thr Pro Lys Lys Ser Met Leu Val Val Ser Glu Phe
370 375 380
Ile Gly Cys Ser Leu Ser Leu Thr Gly Ala Ile Arg Val Asn Pro Trp
385 390 395 400
Asp Glu Leu Glu Thr Ala Glu Ala Leu Tyr Asp Ala Leu Met Ala Pro
405 410 415
Asp Asp His Lys Glu Thr Ala His Met Lys Gin Tyr Gin Tyr Ile Ile
420 425 430
Ser His Asp Val Ala Asn Trp Ala Arg Ser Phe Phe Gin Asp Leu Glu
435 440 445
Gin Ala Cys Ile Asp His Ser Arg Lys Arg Cys Met Asn Leu Gly Phe
450 455 460
Gly Leu Asp Thr Arg Val Val Leu Phe Asp Glu Lys Phe Ser Lys Leu
465 470 475 480
Asp Ile Asp Val Leu Glu Asn Ala Tyr Ser Met Ala Gin Asn Arg Ala
485 490 495
106 ·· • · · · • 9999 · • 9 • 99 ·· • 9 ·· Λ
9 9 ·
9 9 ·
999 999
Ile Leu Leu Asp Tyr Asp Gly Thr Val Thr Pro Ser Ile Ser 510 Lys Ser
500 505
Pro Thr Glu Ala Val Ile Ser Met Ile Asn Lys Leu Cys Asn Asp Pro
515 520 525
Lys Asn Met Val Phe Ile Val Ser Gly Arg Ser Arg Glu Asn Leu Gly
530 535 540
Ser Trp Phe Gly Ala Cys Glu Lys Pro Ala Ile Ala Ala Glu His Gly
545 550 555 560
Tyr Phe Ile Arg Trp Ala Gly Asp Gin Glu Trp Glu Thr Cys Ala Arg
565 570 575
Glu Asn Asn Val Gly Trp Met Glu Met Ala Glu Pro Val Met Asn Leu
580 585 590
Tyr Thr Glu Thr Thr Asp Gly Ser Tyr Ile Glu Lys Lys Glu Thr Ala
595 600 605
Met Val Trp His Tyr Glu Asp Ala Asp Lys Asp Leu Gly Leu Glu Gin
610 615 620
Ala Lys Glu Leu Leu Asp His Leu Glu Asn Val Leu Ala Asn Glu Pro
625 630 635 640
Val Glu Val Lys Arg Gly Gin Tyr Ile Val Glu Val Lys Pro Gin Val
645 650 655
Pro His Gly Leu Pro Ser Cys Tyr Asp Ile His Arg His Arg Phe Val
660 665 670
Glu Ser Phe Asn Leu Asn Phe Phe Lys Tyr Glu Cys Asn Tyr Arg Gly
675 680 685
Ser Leu Lys Gly Ile Val Ala Glu Lys Ile Phe Ala Phe Met Ala Glu
690 695 700
Lys Gly Lys Gin Ala Asp Phe Val Leu Ser Val Gly Asp Asp Arg Ser
705 710 715 720
Asp Glu Asp Met Phe Val Ala Ile Gly Asp Gly Ile Lys Lys Gly Arg
725 730 735
Ile Thr Asn Asn Asn Ser Val Phe Thr Cys Val Val Gly Glu Lys Pro
740 745 750
Ser Ala Ala Glu Tyr Phe Leu Asp Glu Thr Lys Asp Val Ser Met Met
755 760 765
Leu Glu Lys Leu Gly Cys Leu Ser Asn Gin Gly
770 775
107
(2)Informace o SEQ ID NO:26:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 2130 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (vi)Původní zdroj:
(A)Organizmus: Helianthus annuus (ix) Vlastnosti:
(A) Jméno/Klíč: CDS (B) Umístění: 171..2130 (D)Další informace:/částečná (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:26:
GGATCCTGCG GTTTCATCAC ACAATATGAT ACTGTTACAT CTGATGCCCC TTCAGATGTC 60
CCAAATAGGT TGATTGTCGT ATCGAATCAG TTACCCATAA TCGCTAGGCT AAGACTAACG 120
ACAATGGAGG GTCCTTTTGG GATTTCACTT GGGACGAGAG TTCGATTTAC ATG CAC 176
Met His 1
ATC Ile AAA Lys GAT Asp 5 GCA Ala TTA Leu CCC Pro GCA GCC GTT GAG GTT TTC TAT GTT GGC GCA 224
Ala Ala 10 Val Glu Val Phe Tyr 15 Val Gly Ala
CTA AGG GCT GAC GTT GGC CCT ACC GAA CAA GAT GAC GTG TCA AAG ACA 272
Leu Arg Ala Asp Val Gly Pro Thr Glu Gin Asp Asp Val Ser Lys Thr
20 25 30
TTG CTC GAT AGG TTT AAT TGC GTT GCG GTT TTT GTC CCT ACT TCA AAA 320
Leu Leu Asp Arg Phe Asn Cys Val Ala Val Phe Val Pro Thr Ser Lys
35 40 45 50
TGG GAC CAA TAT TAT CAC TGC TTT TGT AAG CAG TAT TTG TGG CCG ATA 368
Trp Asp Gin Tyr Tyr His Cys Phe Cys Lys Gin Tyr Leu Trp Pro Ile
55 60 65
TTT CAT TAC AAG GTT CCC GCT TCT GAC GTC AAG AGT GTC CCG AAT AGT 416
Phe His Tyr Lys Val Pro Ala Ser Asp Val Lys Ser Val Pro Asn Ser
70 75 80
CGG GAT TCA TGG AAC GCT TAT GTT CAC GTG AAC AAA GAG TTT TCC CAG 464
Arg Asp Ser Trp Asn Ala Tyr Val His Val Asn Lys Glu Phe Ser Gin
85 90 95
108
• · ·· • • • • · · • · • · ·· ··
AAG GTG ATG GAG GCA GTA ACC AAT GCT AGC AAT TAT GTA TGG ATA CAT 512
Lys Val Met Glu Ala Val Thr Asn Ala Ser Asn Tyr Val Trp Ile His
100 105 110
GAC TAC CAT TTA ATG ACG CTA CCG ACT TTC TTG AGG CGG GAT TTT TGT 560
Asp Tyr His Leu Met Thr Leu Pro Thr Phe Leu Arg Arg Asp Phe Cys
115 120 125 130
CGT TTT AAA ATC GGT TTT TTT CTG CAT AGC CCG TTT CCT TCC TCG GAG 608
Arg Phe Lys Ile Gly Phe Phe Leu His Ser Pro Phe Pro Ser Ser Glu
135 140 145
GTT TAC AAG ACC CTA CCA ATG AGA AAC GAG CTC TTG AAG GGT CTG TTA 656
Val Tyr Lys Thr Leu Pro Met Arg Asn Glu Leu Leu Lys Gly Leu Leu
150 155 160
AAT GCT GAT CTT ATC GGG TTC CAT ACA TAC GAT TAT GCC CGT CAT TTT 704
Asn Ala Asp Leu Ile Gly Phe His Thr Tyr Asp Tyr Ala Arg His Phe
165 170 175 -
CTA ACG TGT TGT AGT CGA ATG TTT GGT TTG GAT CAT CAG TTG AAA AGG 752
Leu Thr Cys Cys Ser Arg Met Phe Gly Leu Asp His Gin Leu Lys Arg
180 185 190
GGG TAC ATT TTC TTG GAA TAT AAT GGA AGG AGC ATT GAG ATC AAG ATA 800
Gly Tyr Ile Phe Leu Glu Tyr Asn Gly Arg Ser Ile Glu Ile Lys Ile
195 200 205 210
AAG GCG AGC GGG ATT CAT GTT GGT CGA ATG GAG TCG TAC TTG AGT CAG 848
Lys Ala Ser Gly Ile His Val Gly Arg Met Glu Ser Tyr Leu Ser Gin
215 220 225
CCC GAT ACA AGA TTA CAA GTT CAA GAA CTA AAA AAA CGT TTC GAA GGG 896
Pro Asp Thr Arg Leu Gin Val Gin Glu Leu Lys Lys Arg Phe Glu Gly
230 235 240
AAA ATC GTG CTA CTT GGA GTT GAT GAT TTG GAT ATA TTC AAA GGT GTG 944
Lys Ile Val Leu Leu Gly Val Asp Asp Leu Asp Ile Phe Lys Gly Val
245 250 255 -
AAC TTC AAG GTT TTA GCG TTG GAG AAG TTA CTT AAA TCA CAC CCG AGT 992
Asn Phe Lys Val Leu Ala Leu Glu Lys Leu Leu Lys Ser His Pro Ser
260 265 270
TGG CAA GGG CGT GTG GTT TTG GTG CAA ATC TTG AAT CCC GCT CGC GCG 1040
Trp Gin Gly Arg Val Val Leu Val Gin Ile Leu Asn Pro Ala Arg Ala
275 280 285 290
CGT TGC CAA GAC GTC GAT GAG ATC AAT GCC GAG ATA AGA ACA GTC TGT 1088
Arg Cys Gin Asp Val Asp Glu Ile Asn Ala Glu Ile Arg Thr Val Cys
295 300 305
GAA AGA ATC AAT AAC GAA CTG GGA AGC CCG GGA TAC CAG CCC GTT GTG 1136
Glu Arg Ile Asn Asn Glu Leu Gly Ser Pro Gly Tyr Gin Pro Val Val
310 315 320
109
TTA ATT GAT GGG CCC GTT TCG Ser TTA Leu 330 AGT Ser GAA Glu AAA Lys GCT Ala GCT Ala 335 TAT Tyr TAT Tyr GCT Ala 1184
Leu Ile Asp 325 Gly Pro Val
ATC GCC GAT ATG GCA ATT GTT ACA CCG TTA CGT GAC GGC ATG AAT CTT 1232
Ile Ala Asp Met Ala Ile Val Thr Pro Leu Arg Asp Gly Met Asn Leu
340 345 350
ATC CCG TAC GAG TAC GTC GTT TCC CGA CAA AGT GTT AAT GAC CCA AAT 1280
Ile Pro Tyr Glu Tyr Val Val Ser Arg Gin Ser Val Asn Asp Pro Asn
355 360 365 370
CCC AAT ACT CCA AAA AAG AGC ATG CTA GTG GTC TCC GAG TTC ATC GGG 1328
Pro Asn Thr Pro Lys Lys Ser Met Leu Val Val Ser Glu Phe Ile Gly
375 380 385
TGT TCA CTA TCT TTA ACC GGG GCC ATA CGG GTC AAC CCA TGG GAT GAG 1376
Cys Ser Leu Ser Leu Thr Gly Ala Ile Arg Val Asn Pro Trp Asp Glu
390 395 400
TTG GAG ACA GCA GAA GCA TTA TAC GAC GCA CTC ATG GCT CCT GAT GAC 1424
Leu Glu Thr Ala Glu Ala Leu Tyr Asp Ala Leu Met Ala Pro Asp Asp
405 410 415
CAT AAA GAA ACC GCC CAC ATG AAA CAG TAT CAA TAC ATT ATC TCC CAT 1472
His Lys Glu Thr Ala His Met Lys Gin Tyr Gin Tyr Ile Ile Ser His
420 425 430
GAT GTA GCT AAC TGG GCT CGT AGC TTC TTT CAA GAT TTA GAG CAA GCG 1520
Asp Val Ala Asn Trp Ala Arg Ser Phe Phe Gin Asp Leu Glu Gin Ala
435 440 445 450
TGC ATC GAT CAT TCT CGT AAA CGA TGC ATG AAT TTA GGA TTT GGG TTA 1568
Cys Ile Asp His Ser Arg Lys Arg Cys Met Asn Leu Gly Phe Gly Leu
455 460 465
GAT ACT AGA GTC GTT CTT TTT GAT GAG AAG TTT AGC AAG TTG GAT ATA 1616
Asp Thr Arg Val Val Leu Phe Asp Glu Lys Phe Ser Lys Leu Asp Ile
470 475 480
GAT GTC TTG GAG AAT GCT TAT TCC ATG GCT CAA AAT CGG GCC ATA CTT 1664
Asp Val Leu Glu Asn Ala Tyr Ser Met Ala Gin Asn Arg Ala Ile Leu
485 490 495
TTG GAC TAT GAC GGC ACT GTT ACT CCA TCT ATC AGT AAA TCT CCA ACT 1712
Leu Asp Tyr Asp Gly Thr Val Thr Pro Ser Ile Ser Lys Ser Pro Thr
500 505 510
GAA GCT GTT ATC TCC ATG ATC AAC AAA CTG TGC AAT GAT CCA AAG AAC 1760
Glu Ala Val Ile Ser Met Ile Asn Lys Leu Cys Asn Asp Pro Lys Asn
515 520 525 530
ATG GTG TTC ATC GTT AGT GGA CGC AGT AGA GAA AAT CTT GGC AGT TGG 1808
Met Val Phe Ile Val Ser Gly Arg Ser Arg Glu Asn Leu Gly Ser Trp
535 540 545
110
TTC Phe GGC Gly GCG Ala TGT Cys 550 GAG Glu AAA Lys CCC Pro GCC Ala ATT GCA GCT GAG Ala Glu CAC His GGA Gly 560 TAC Tyr TTT Phe 1856
Ile 555 Ala
ATA AGG TGG GCG GGT GAT CAA GAA TGG GAA ACG TGC GCA CGT GAG AAT 1904
Ile Arg Trp Ala Gly Asp Gin Glu Trp Glu Thr Cys Ala Arg Glu Asn
565 570 575
AAT GTC GGG TGG ATG GAA ATG GCT GAG CCG GTT ATG AAT CTT TAT ACA 1952
Asn Val Gly Trp Met Glu Met Ala Glu Pro Val Met Asn Leu Tyr Thr
580 585 590
GAA ACT ACT GAC GGT TCG TAT ATT GAA AAG AAA GAA ACT GCA ATG GTT 2000
Glu Thr Thr Asp Gly Ser Tyr Ile Glu Lys Lys Glu Thr Ala Met Val
595 600 605 610
TGG CAC TAT GAA GAT GCT GAT AAA GAT CTT GGG TTG GAG CAG GCT AAG 2048
Trp His Tyr Glu Asp Ala Asp Lys Asp Leu Gly Leu Glu Gin Ala Lys
615 620 625
GAA CTG TTG GAC CAT CTT GAA AAC GTG CTC GCT AAT GAG CCC GTT GAA 2096
Glu Leu Leu Asp His Leu Glu Asn Val Leu Ala Asn Glu Pro Val Glu
630 635 640
GTG AAA CGA GGT CAA TAC ATT GTA GAA GTT AAA C 2130
Val Lys Arg Gly Gin Tyr Ile Val Glu Val Lys
645 650 (2)Informace o SEQ ID NO:27:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 653 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D)Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:27:
Met 1 His Ile Lys Asp 5 Ala Leu Pro Ala Ala Val Glu 10 Val Phe Tyr 15 Val
Gly Ala Leu Arg Ala Asp Val Gly Pro Thr Glu Gin Asp Asp Val Ser
20 25 30
Lys Thr Leu Leu Asp Arg Phe Asn Cys Val Ala Val Phe Val Pro Thr
35 40 45
Ser Lys Trp Asp Gin Tyr Tyr His Cys Phe Cys Lys Gin Tyr Leu Trp
50 55 60
Pro Ile Phe His Tyr Lys Val Pro Ala Ser Asp Val Lys Ser Val Pro
65 70 75 80
Asn Ser Arg Asp Ser Trp Asn Ala Tyr Val His Val Asn Lys Glu Phe
85 90 95
111 • · frfr > frfr · » · · · • frfr · · » •
• fr ··
Ser Gin Lys Val Met Glu 100
Ile His Asp Tyr His Leu 115
Phe Cys Arg Phe Lys Ile 130
Ser Glu Val Tyr Lys Thr 145 150
Leu Leu Asn Ala Asp Leu 165
His Phe Leu Thr Cys Cys 180
Lys Arg Gly Tyr Ile Phe 195
Lys Ile Lys Ala Ser Gly 210
Ser Gin Pro Asp Thr Arg 225 230
Glu Gly Lys Ile Val Leu 245
Gly Val Asn Phe Lys Val 260
Pro Ser Trp Gin Gly Arg 275
Arg Ala Arg Cys Gin Asp 290
Val Cys Glu Arg Ile Asn 305 310
Val Val Leu Ile Asp Gly 325
Tyr Ala Ile Ala Asp Met 340
Asn Leu Ile Pro Tyr Glu 355
Pro Asn Pro Asn Thr Pro
370
Ile Gly Cys Ser Leu Ser
385 390
Ala Val Thr Asn Ala Ser Asn 105
Met Thr Leu Pro Thr Phe Leu 120 125
Gly Phe Phe Leu His Ser Pro 135 140
Leu Pro Met Arg Asn Glu Leu 155
Ile Gly Phe His Thr Tyr Asp 170
Ser Arg Met Phe Gly Leu Asp 185
Leu Glu Tyr Asn Gly Arg Ser 200 205
Ile His Val Gly Arg Met Glu 215 220
Leu Gin Val Gin Glu Leu Lys 235
Leu Gly Val Asp Asp Leu Asp 250
Leu Ala Leu Glu Lys Leu Leu 265
Val Val Leu Val Gin Ile Leu 280 285
Val Asp Glu Ile Asn Ala Glu 295 300
Asn Glu Leu Gly Ser Pro Gly 315
Pro Val Ser Leu Ser Glu Lys 330
Ala Ile Val Thr Pro Leu Arg 345
Tyr Val Val Ser Arg Gin Ser 360 365
Lys Lys Ser Met Leu Val Val
375 380
Leu Thr Gly Ala Ile Arg Val 395
Tyr Val Trp 110
Arg Arg Asp
Phe Pro Ser
Leu Lys Gly 160
Tyr Ala Arg 175
His Gin Leu 190
Ile Glu Ile
Ser Tyr Leu
Lys Arg Phe 240
Ile Phe Lys 255
Lys Ser His 270
Asn Pro Ala
Ile Arg Thr
Tyr Gin Pro 320
Ala Ala Tyr 335
Asp Gly Met 350
Val Asn Asp
Ser Glu Phe
Asn Pro Trp 400
112 ·» • · · ··
Asp Glu Leu Glu Thr Ala Glu Ala 405 Leu Tyr 410 Asp Ala Leu Met Ala 415 Pro
Asp Asp His Lys Glu Thr Ala His Met Lys Gin Tyr Gin Tyr Ile Ile
420 425 430
Ser His Asp Val Ala Asn Trp Ala Arg Ser Phe Phe Gin Asp Leu Glu
435 440 445
Gin Ala Cys Ile Asp His Ser Arg Lys Arg Cys Met Asn Leu Gly Phe
450 455 460
Gly Leu Asp Thr Arg Val Val Leu Phe Asp Glu Lys Phe Ser Lys Leu
465 470 475 480
Asp Ile Asp Val Leu Glu Asn Ala Tyr Ser Met Ala Gin Asn Arg Ala
485 490 495
Ile Leu Leu Asp Tyr Asp Gly Thr Val Thr Pro Ser Ile Ser Lys Ser
500 505 510
Pro Thr Glu Ala Val Ile Ser Met Ile Asn Lys Leu Cys Asn Asp Pro
515 520 525
Lys Asn Met Val Phe Ile Val Ser Gly Arg Ser Arg Glu Asn Leu Gly
530 535 540
Ser Trp Phe Gly Ala Cys Glu Lys Pro Ala Ile Ala Ala Glu His Gly
545 550 555 560
Tyr Phe Ile Arg Trp Ala Gly Asp Gin Glu Trp Glu Thr Cys Ala Arg
565 570 575
Glu Asn Asn Val Gly Trp Met Glu Met Ala Glu Pro Val Met Asn Leu
580 585 590
Tyr Thr Glu Thr Thr Asp Gly Ser Tyr Ile Glu Lys Lys Glu Thr Ala
595 600 605
Met Val Trp His Tyr Glu Asp Ala Asp Lys Asp Leu Gly Leu Glu Gin
610 615 620
Ala Lys Glu Leu Leu Asp His Leu Glu Asn Val Leu Ala Asn Glu Pro
625 630 635 640
Val Glu Val Lys Arg Gly Gin Tyr Ile Val Glu Val Lys
645 650 (2)Informace o SEQ ID NO:28:
{i) Charakteris t i .ka s^-kyenc^ (AjDélka: 390 párů bází (tí)Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární
113 ί 9 9 9 »·· *·· • · · • ···· * • v (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (vi)Původní zdroj:
(A)Organizmus: Helianthus annuus (ix) Vlastnosti:
(A) Jméno/Klíč: CDS (B) Umístění: 3..258 (D)Další informace:/částečná (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:28:
TT GCA GAG AAG ATT TTT GCG TTC ATG GCT GAA AAG GGA AAA CAG GCT 47
Ala Glu Lys Ile Phe Ala Phe Met Ala Glu Lys Gly Lys Gin Ala
5 10 15 .
GAT TTC GTG Val TTG Leu AGC Ser 20 GTT GGA GAT GAT AGA AGT GAT GAA GAC ATG TTT 95
Asp Phe Val Gly Asp Asp Arg 25 Ser Asp Glu Asp Met 30 Phe
GTG GCC ATT GGG GAT GGA ATA AAA AAG GGT CGG ATA ACT AAC AAC AAT 143
Val Ala Ile Gly Asp Gly Ile Lys Lys Gly Arg Ile Thr Asn Asn Asn
35 40 45
TCA GTG TTT ACA TGC GTA GTG GGA GAG AAA CCG AGT GCA GCT GAG TAC 191
Ser Val Phe Thr Cys Val Val Gly Glu Lys Pro Ser Ala Ala Glu Tyr
50 55 60
TTT TTA GAC GAG ACG AAA GAT GTT TCA ATG ATG CTC GAG AAG CTC GGG 239
Phe Leu Asp Glu Thr Lys Asp Val Ser Met Met Leu Glu Lys Leu Gly
70 75
TGT CTC AGC AAC CAA GGA T GATGATCCGG AAGCTTCTCG TGATCTTTAT 288
Cys Leu Ser Asn Gin Gly . 85
GAGTTAAAAG
TTTTCGACTT TTTCTTCATC AAGATTCATG GGAAAGTTGT TCAATATGAA
348
CTTGTGTTTC
TTGGTTCTGG ATTTTAGGGA GTCTATGGAT CC
390 (2)Informace o SEQ ID NO:29:
(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 85 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D)Topologie: lineární (ii)Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:29:
114 • # · * ·» «· ·* «·· ♦ · · · · · * * • · · · · « · ·»·· • · ···· < · · · * ··· ··· ·· · · · · * • · 9 99 · · · 9 9 ·9
Ala 1 Glu Lys Ile Phe 5 Ala Phe Met Ala Glu 10 Lys Gly Lys Gin Ala 15 Asp
Phe Val Leu Ser 20 Val Gly Asp Asp Arg 25 Ser Asp Glu Asp Met 30 Phe Val
Ala Ile Gly 35 Asp Gly Ile Lys Lys 40 Gly Arg Ile Thr Asn 45 Asn Asn Ser
Val Phe 50 Thr Cys Val Val Gly 55 Glu Lys Pro Ser Ala 60 Ala Glu Tyr Phe
Leu 65 Asp Glu Thr Lys Asp 70 Val Ser Met Met Leu 75 Glu Lys Leu Gly Cys 80
Leu Ser Asn Gin Gly 85
(2)Informace o SEQ ID NO:30:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:30:
CCAIGGRTTI ACICKDATIG CICC (2)Informace o SEQ ID NO:31:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 23 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:31:
ATHGTIGTIW SIAAYMRIYT ICC
115 • mm * • · · · · • · φ · * · φ φφ «φφ φφφ φ φ · · *· «· ·· (2)Informace ο SEQ ID ΝΟ:32:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:32:
YTITGGCCIA TITTYCAYTA (2)Informace o SEQ ID NO:33:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:33: TGRTCIARIA RYTCYTTIGC (2)Informace o SEQ ID NO:34:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (xi)Popis sekvence: SEQ ID N0:34:'
TCRTCIGTRA ARTCRTCICC
116 « · · • •999 9 > ·· · · ·· · • · · * ··· ·· ·* (2)Informace o SEQ ID NO:35:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:35:
TTYGAYTAYG AYGGIACIYT 20 (2)Informace o SEQ ID NO:36:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:36:
GGIYTIWBNG CIGARCAYGG (2)Informace o SEQ ID NO:37:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:37:
ATIGCIAARC CIGTIATGAA 9n
117 (2)Informace o SEQ ID NO:38:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů bázi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:38:
CCIACXGTRC AIGCRAAIAC 20 (2)Informace o SEQ ID NO:39:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 2982 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (vi)Původní zdroj:
(A)Organizmus: Arabidopsis thaliana (ix) Vlastnosti:
(A) Jméno/Klíč: CDS (B) Umístění: 64..2982 (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:39:
ATAAACTTCC TCGCGGCCGC CAGTGTGAGT AATTTAGTTT
TGGTTCTGTT TTGGTGTGAG
CGT ATG CCT Pro GGA Gly AAT AAG TAC AAC Tyr Asn TGC Cys AGT Ser TCT TCT CAT ATC CCA CTC 108
Met 1 Asn Lys 5 Ser 10 Ser His Ile Pro Leu 15
TCT CGA ACA GAA CGC CTC TTG AGA GAT AGA GAG CTT AGA GAG AAG AGG 156
Ser Arg Thr Glu Arg Leu Leu Arg Asp Arg Glu Leu Arg Glu Lys Arg
20 25 30
AAG AGC AAC CGA GCT CGT AAT CCT AAT GAC GTT GCT GGC AGT TCC GAG 204
Lys Ser Asn Arg Ala Arg Asn Pro Asn Asp Val Ala Gly Ser Ser Glu
35 40 45
118
AAC Asn TCT GAG AAT GAC TTG CGT Arg TTA GAA GGT GAC AGT Ser TCA AGG CAG TAT 252
Ser Glu Asn Asp 50 Leu Leu 55 Glu Gly Asp Ser 60 Arg Gin Tyr
GTT GAA CAG TAC TTG GAA GGG GCT GCT GCT GCA ATG GCG CAC GAT GAT 300
Val Glu Gin Tyr Leu Glu Gly Ala Ala Ala Ala Met Ala His Asp Asp
65 70 75
GCG TGT GAG AGG CAA GAA GTT AGG CCT TAT AAT AGG CAA CGA CTA CTT 348
Ala Cys Glu Arg Gin Glu Val Arg Pro Tyr Asn Arg Gin Arg Leu Leu
80 85 90 95
GTA GTG GCT AAC AGG CTC CCA GTT TCT CCC GTG AGA AGA GGT GAA GAT 396
Val Val Ala Asn Arg Leu Pro Val Ser Pro Val Arg Arg Gly Glu Asp
100 105 110
TCA TGG TCT CTT GAG ATC AGT GCT GGT GGT CTA GTC AGT GCT CTC TTA 444
Ser Trp Ser Leu Glu Ile Ser Ala Gly Gly Leu Val Ser Ala Leu Leu
115 120 125
GGT GTA AAG GAA TTT GAG GCC AGA TGG ATA GGA TGG GCT GGA GTT AAT 492
Gly Val Lys Glu Phe Glu Ala Arg Trp Ile Gly Trp Ala Gly Val Asn
130 135 140
GTG CCT GAT GAG GTT GGA CAG AAG GCA CTT AGC AAA GCT TTG GCT GAG 540
Val Pro Asp Glu Val Gly Gin Lys Ala Leu Ser Lys Ala Leu Ala Glu
145 150 155
AAG AGG TGT ATT CCC GTG TTC CTT GAT GAA GAG ATT GTT CAT CAG TAC 588
Lys Arg Cys Ile Pro Val Phe Leu Asp Glu Glu Ile Val His Gin Tyr
160 165 170 175
TAT AAT GGT TAC TGC AAC AAT ATT CTG TGG CCT CTG TTT CAC TAC CTT 636
Tyr Asn Gly Tyr Cys Asn Asn Ile Leu Trp Pro Leu Phe His Tyr Leu
180 185 190
GGA CTT CCG CAA GAA GAT CGG CTT GCC ACA ACC AGA AGC TTT CAG TCC 684
Gly Leu Pro Gin Glu Asp Arg Leu Ala Thr Thr Arg Ser Phe Gin Ser
195 200 205
CAA TTT GCT GCA TAC AAG AAG GCA AAC CAA ATG TTC GCT GAT GTT GTA 732
Gin Phe Ala Ala Tyr Lys Lys Ala Asn Gin Met Phe Ala Asp Val Val
210 215 220
AAT GAG CAC TAT GAA GAG GGA GAT GTC GTC TGG TGC CAT GAC TAT CAT 780
Asn Glu His Tyr Glu Glu Gly Asp Val Val Trp Cys His Asp Tyr His
225 230 235
CTT ATG TTC CTT CCT AAA TGC CTT AAG GAG TAC AAC AGT AAG ATG AAA 828
Leu Met Phe Leu Pro Lys Cys Leu Lys Glu Tyr Asn Ser Lys Met Lys
240 245 250 255
GTT GGA TGG TTT CTC CAT ACA CCA TTC CCT TCG TCT GAG ATA CAC AGG 876
Val Gly Trp Phe Leu His Thr Pro Phe Pro Ser Ser Glu Ile His Arg
260 265 270
119 ····
ACA Thr CTT Leu CCA TCA CGA TCA GAG CTC CTT CGG Leu Leu Arg 280 TCA Ser GTT Val CTT GCT GCT Leu Ala Ala 285 GAT Asp 924
Pro Ser Arg 275 Ser Glu
TTA GTT GGC TTC CAT ACA TAT GAC TAT GCA AGG CAC TTT GTG AGT GCG 972
Leu Val Gly Phe His Thr Tyr Asp Tyr Ala Arg His Phe Val Ser Ala
290 295 300
TGC ACT CGT ATT CTT GGA CTT GAA GGA ACA CCT GAG GGA GTT GAG GAT 1020
Cys Thr Arg Ile Leu Gly Leu Glu Gly Thr Pro Glu Gly Val Glu Asp
305 310 315
CAA GGC AGG CTC ACT CGT GTA GCT GCT TTT CCA ATT GGC ATA GAT TCT 1068
Gin Gly Arg Leu Thr Arg Val Ala Ala Phe Pro Ile Gly Ile Asp Ser
320 325 330 335
GAT CGG TTT ATA CGA GCA CTT GAG GTC CCC GAA GTC AAA CAA CAC ATG 1116
Asp Arg Phe Ile Arg Ala Leu Glu Val Pro Glu Val Lys Gin His Met
340 345 350
AAG GAA TTG AAA GAA AGA TTT ACT GAC AGA AAG GTG ATG TTA GGT GTT 1164
Lys Glu Leu Lys Glu Arg Phe Thr Asp Arg Lys Val Met Leu Gly Val
355 360 365
GAT CGT CTT GAC ATG ATC AAA GGG ATT CCA CAA AAG ATT CTG GCA TTC 1212
Asp Arg Leu Asp Met Ile Lys Gly Ile Pro Gin Lys Ile Leu Ala Phe
370 375 380
GAA AAA TTT CTC GAG GAA AAT GCA AAC TGG CGT GAT AAA GTG GTC TTA 1260
Glu Lys Phe Leu Glu Glu Asn Ala Asn Trp Arg Asp Lys Val Val Leu
385 390 395
TTG AAA ATT GCG GTG CCA ACA AGA CCT GAC GTT CCT GAG TAT CAA ACA 1308
Leu Lys Ile Ala Val Pro Thr Arg Pro Asp Val Pro Glu Tyr Gin Thr
400 405 410 415
CTC ACA AGC CAA GTT CAT GAA ATT GTT GGC CGC ATT ATT GGT CGT CTC 1356
Leu Thr Ser Gin Val His Glu Ile Val Gly Arg Ile Ile Gly Arg Leu
420 425 430
GGG ACA CTG ACT GCA GTT CCA ATA CAT CAT CTG GAT CGG TCT CTG GAC 1404
Gly Thr Leu Thr Ala Val Pro Ile His His Leu Asp Arg Ser Leu Asp
435 440 445
TTT CAT GCT TTA TGT GCA CTT TAT GCC GTC ACA GAT GTT GCG CTT GTA 1452
Phe His Ala Leu Cys Ala Leu Tyr Ala Val Thr Asp Val Ala Leu Val
450 455 460
ACA TCT TTG AGA GAT GGG ATG AAT CTT GTC AGT TAT GAG TTT GTT GCT 1500
Thr Ser Leu Arg Asp Gly Met Asn Leu Val Ser Tyr Glu Phe Val Ala
465 470 475
TGC CAA GAG GCC AAA AAG GGC GTC CTC ATT CTC AGT GAA TTT GCA GGT 1548
Cys Gin Glu Ala Lys Lys Gly Val Leu Ile Leu Ser Glu Phe Ala Gly
480 485 490 495
120
9 9 9 ·· · • 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 999 999 « 9 9 9 · ·
999 99 99 99
9
9999
GCT Ala GCA Ala CAG Gin TCT CTG GGT GCT GGA GCT ATT CTT GTG AAT Asn CCT TGG AAC Pro Trp Asn 510 1596
Ser Leu 500 Gly Ala Gly Ala Ile 505 Leu Val
ATC ACA GAA GTT GCT GCC TCC ATT GGA CAA GCC CTA. AAC ATG ACA GCT 1644
Ile Thr Glu Val Ala Ala Ser Ile Gly Gin Ala Leu Asn Met Thr Ala
515 520 525
GAA GAA AGA GAG AAA AGA CAT CGC CAT AAT TTT CAT CAT GTC AAA ACT 1692
Glu Glu Arg Glu Lys Arg His Arg His Asn Phe His His Val Lys Thr
530 535 540
CAC ACT GCT CAA GAA TGG GCT GAA ACT TTT GTC AGT GAA CTA AAT GAC 1740
His Thr Ala Gin Glu Trp Ala Glu Thr Phe Val Ser Glu Leu Asn Asp
545 550 555
ACT GTA ATT GAG GCG CAA CTA CGA ATT AGT AAA GTC CCA CCA GAG CTT 1788
Thr Val Ile Glu Ala Gin Leu Arg Ile Ser Lys Val Pro Pro Glu Leu
560 565 570 575
CCA CAG CAT GAT GCA ATT CAA CGG TAT TCA AAG TCC AAC AAC AGG CTT 1836
Pro Gin His Asp Ala Ile Gin Arg Tyr Ser Lys Ser Asn Asn Arg Leu
580 585 590
CTA ATC CTG GGT TTC AAT GCA ACA TTG ACT GAA CCA GTG GAT AAT CAA 1884
Leu Ile Leu Gly Phe Asn Ala Thr Leu Thr Glu Pro Val Asp Asn Gin
595 600 605
GGG AGA AGA GGT GAT CAA ATA AAG GAG ATG GAT CTT AAT CTA CAC CCT 1932
Gly Arg Arg Gly Asp Gin Ile Lys Glu Met Asp Leu Asn Leu His Pro
610 615 620
GAG CTT AAA GGG CCC TTA AAG GCA TTA TGC AGT GAT CCA AGT ACA ACC 1980
Glu Leu Lys Gly Pro Leu Lys Ala Leu Cys Ser Asp Pro Ser Thr Thr
625 630 635
ATA GTT GTT CTG AGC GGA AGC AGC AGA AGT GTT TTG GAC AAA AAC TTT 2028
Ile Val Val Leu Ser Gly Ser Ser Arg Ser Val Leu Asp Lys Asn Phe
640 645 650 655
GGA GAG TAT GAC ATG TGG CTG GCA GCA GAA AAT GGG ATG TTC CTA AGG 2076
Gly Glu Tyr Asp Met Trp Leu Ala Ala Glu Asn Gly Met Phe Leu Arg
660 665 670
CTT ACG AAT GGA GAG TGG ATG ACT ACA ATG CCA GAA CAC TTG AAC ATG 2124
Leu Thr Asn Gly Glu Trp Met Thr Thr Met Pro Glu His Leu Asn Met
675 680 685
GAA TGG GTT GAT AGC GTA AAG CAT GTT TTC AAG TAC TTC ACT GAG AGA 2172
Glu Trp Val Asp Ser Val Lys His Val Phe Lys Tyr Phe Thr Glu Arg
690 695 700
ACT CCC AGG TCA CAC TTT GAA ACT CGC GAT ACT TCG CTT ATT TGG AAC 2220
Thr Pro Arg Ser His Phe Glu Thr Arg Asp Thr Ser Leu Ile Trp Asn
705 710 715
121
4« · · · ·· · »4 · 44 4 • 4
44
TAC Tyr 720 AAA Lys TAT Tyr GCA GAT Ala Asp ATC GAA TTC GGG AGA CTT CAA GCA AGA Arg GAT Asp TTG Leu 735 2268
Ile 725 Glu Phe Gly Arg Leu 730 Gin Ala
TTA CAA CAC TTA TGG ACA GGT CCA ATC TCT AAT GCA TCA GTT GAT GTT 2316
Leu Gin His Leu Trp Thr Gly Pro Ile Ser Asn Ala Ser Val Asp Val
740 745 750
GTC CAA GGA AGC CGC TCT GTG GAA GTC CGT GCA GTT GGT GTC ACA AAG 2364
Val Gin Gly Ser Arg Ser Val Glu Val Arg Ala Val Gly Val Thr Lys
755 760 765
GGA GCT GCA ATT GAT CGT ATT CTA GGA GAG ATA GTG CAT AGC AAG TCG 2412
Gly Ala Ala Ile Asp Arg Ile Leu Gly Glu Ile Val His Ser Lys Ser
770 775 780
ATG ACT ACA CCA ATC GAT TAC GTC TTG TGC ATT GGT CAT TTC TTG GGG 2460
Met Thr Thr Pro Ile Asp Tyr Val Leu Cys Ile Gly His Phe Leu Gly
785 790 795
AAG GAC GAA GAT GTT TAC ACT TTC TTC GAA CCA GAA CTT CCA TCC GAC 2508
Lys Asp Glu Asp Val Tyr Thr Phe Phe Glu Pro Glu Leu Pro Ser Asp
800 805 810 815
ATG CCA GCC ATT GCA CGA TCC AGA CCA TCA TCT GAC AGT GGA GCC AAG 2556
Met Pro Ala Ile Ala Arg Ser Arg Pro Ser Ser Asp Ser Gly Ala Lys
820 825 830
TCA TCA TCA GGA GAC CGA AGA CCA CCT TCA AAG TCG ACA CAT AAC AAC 2604
Ser Ser Ser Gly Asp Arg Arg Pro Pro Ser Lys Ser Thr His Asn Asn
835 840 845
AAC AAA AGT GGA TCA AAA TCC TCA TCA TCC TCT AAC TCT AAC AAC AAC 2652
Asn Lys Ser Gly Ser Lys Ser Ser Ser Ser Ser Asn Ser Asn Asn Asn
850 855 860
AAC AAG TCC TCA CAG AGA TCT CTT CAG TCA GAG AGA AAA AGT GGA TCC 2700
Asn Lys Ser Ser Gin Arg Ser Leu Gin Ser Glu Arg Lys Ser Gly Ser
865 870 875
AAC CAT AGC TTA GGA AAC TCA AGA CGT CCT TCA CCA GAG AAG ATC TCA 2748
Asn His Ser Leu Gly Asn Ser Arg Arg Pro Ser Pro Glu Lys Ile Ser
880 885 890 895
TGG AAT GTG CTT GAC CTC AAA GGA GAG AAC TAC TTC TCT TGC GCT GTG 2796
Trp Asn Val Leu Asp Leu Lys Gly Glu Asn Tyr Phe Ser Cys Ala Val
900 905 910
GGT CGT ACT CGC ACC AAT GCT AGA TAT CTC CTT GGC TCA CCT GAC GAC i.844
Gly Arg Thr Arg Thr Asn Ala Arg Tyr Leu Leu Gly Ser Pro Asp Asp
915 920 925
GTC GTT TGC TTC CTT GAG AAG CTC GCT GAC ACC ACT TCC TCA CCT TAA 2892
Val Val Cys Phe Leu Glu Lys Leu Ala Asp Thr Thr Ser Ser Pro ★
930 935 940
122
2940 ·· ·· ·· • · 0 0 0 0
0 0 0 0 0
00 000 · · ·
0 0 0
00 0· ··
TAT Tyr CCC Pro 945 GAG Glu ACA Thr GTG Val TCA Ser AGT Ser 950 GAG TTC ATG Met TAA ★ CCC AAT AAA AAC TAT Tyr
Glu Phe Pro 955 Asn Lys Asn
TGT TTT GTA ACA AAA AGC AGC CAT TAC CAG ACT CTT TAG TGG
Cys Phe Val Thr Lys Ser Ser His Tyr Gin Thr Leu * Trp
960 965 970
2982 (2)Informace ο SEQ ID NO :40:
(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 973 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D)Topologie: lineární (ii)Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:40:
Met Pro Gly Asn Lys Tyr Asn Cys Ser Ser Ser His Ile Pro Leu Ser 1 5 10 15
Arg Thr Glu Arg Leu Leu Arg Asp Arg Glu Leu Arg Glu Lys Arg Lys 20 25 30
Ser Asn Arg Ala Arg Asn Pro Asn Asp Val Ala Gly Ser Ser Glu Asn 35 40 45
Ser Glu Asn Asp Leu Arg Leu Glu Gly Asp Ser Ser Arg Gin Tyr Val 50 55 60
Glu Gin Tyr Leu Glu Gly Ala Ala Ala Ala Met Ala His Asp Asp Ala
70 75 80
Cys Glu Arg Gin Glu Val Arg Pro Tyr Asn Arg Gin Arg Leu Leu Val
90 95
Val Ala Asn Arg Leu Pro Val Ser Pro Val Arg Arg Gly Glu Asp Ser 100 105 110
Trp Ser Leu Glu Ile Ser Ala Gly Gly Leu Val Ser Ala Leu Leu Gly 115 120 125
Val Lys Glu Phe Glu Ala Arg Trp Ile Gly Trp Ala Gly Val Asn Val 130 135 140
Pro Asp Glu Val Gly Gin Lys Ala Leu Ser Lys Ala Leu Ala Glu Lys
145 150 155 160
Arg Cys Ile Pro Val Phe Leu Asp Glu Glu Ile Val His Gin Tyr Tyr
165 170 175
Asn Gly Tyr Cys Asn Asn Ile Leu Trp Pro Leu Phe His Tyr Leu Gly
180 185 190
123 • ···· to · • toto toto ·* • toto · · · · · • · · to to to · • to to * ··· ··» • to · · · • •to ·· ·· ·*
Leu Pro Gin Glu 195 Asp Arg Leu Ala 200 Thr Thr Arg Ser Phe 205 Gin Ser Gin
Phe Ala Ala Tyr Lys Lys Ala Asn Gin Met Phe Ala Asp Val Val Asn
210 215 220
Glu His Tyr Glu Glu Gly Asp Val Val Trp Cys His Asp Tyr His Leu
225 230 235 240
Met Phe Leu Pro Lys Cys Leu Lys Glu Tyr Asn Ser Lys Met Lys Val
245 250 255
Gly Trp Phe Leu His Thr Pro Phe Pro Ser Ser Glu Ile His Arg Thr
260 265 270
Leu Pro Ser Arg Ser Glu Leu Leu Arg Ser Val Leu Ala Ala Asp Leu
275 280 285
Val Gly Phe His Thr Tyr Asp Tyr Ala Arg His Phe Val Ser Ala Cys
290 295 300
Thr Arg Ile. Leu Gly Leu Glu Gly Thr Pro Glu Gly Val Glu Asp Gin
305 310 315 320
Gly Arg Leu Thr Arg Val Ala Ala Phe Pro Ile Gly Ile Asp Ser Asp
325 330 335
Arg Phe Ile Arg Ala Leu Glu Val Pro Glu Val Lys Gin His Met Lys
340 345 350
Glu Leu Lys Glu Arg Phe Thr Asp Arg Lys Val Met Leu Gly Val Asp
355 360 365
Arg Leu Asp Met Ile Lys Gly Ile Pro Gin Lys Ile Leu Ala Phe Glu
370 375 380
Lys Phe Leu Glu Glu Asn Ala Asn Trp Arg Asp Lys Val Val Leu Leu
385 390 395 400
Lys Ile Ala Val Pro Thr Arg Pro Asp Val Pro Glu Tyr Gin Thr Leu
405 410 415
Thr Ser Gin Val His Glu Ile Val Gly Arg Ile Ile Gly Arg Leu Gly
420 425 430
Thr Leu Thr Ala Val Pro Ile His His Leu Asp Arg Ser Leu Asp Phe
435 440 445
His Ala Leu Cys Ala Leu Tyr Ala Val Thr Asp Val Ala Leu Val Thr
450 455 460
Ser Leu Arg Asp Gly Met Asn Leu Val Ser Tyr Glu Phe Val Ala Cys
465 470 475 480
Gin Glu Ala Lys Lys Gly Val Leu Ile Leu Ser Glu Phe Ala Gly Ala
485 490 495
124 • · · · · · * · . . · · « « · ··· ··« • · · · ·» ·· ·♦
Ala Gin Ser Leu Gly 500 Ala Gly Ala Ile 505 Leu Val Asn Pro Trp Asn 510 Ile
Thr Glu Val Ala Ala Ser Ile Gly Gin Ala Leu Asn Met Thr Ala Glu
515 520 525
Glu Arg Glu Lys Arg His Arg His Asn Phe His His Val Lys Thr His
530 535 540
Thr Ala Gin Glu Trp Ala Glu Thr Phe Val Ser Glu Leu Asn Asp Thr
545 550 555 560
Val Ile Glu Ala Gin Leu Arg Ile Ser Lys Val Pro Pro Glu Leu Pro
565 570 575
Gin His Asp Ala Ile Gin Arg Tyr Ser Lys Ser Asn Asn Arg Leu Leu
580 585 590
Ile Leu Gly Phe Asn Ala Thr Leu Thr Glu Pro Val Asp Asn Gin Gly
595 600 605
Arg Arg Gly Asp Gin Ile Lys Glu Met Asp Leu Asn Leu His Pro Glu
610 615 620
Leu Lys Gly Pro Leu Lys Ala Leu Cys Ser Asp Pro Ser Thr Thr Ile
625 630 635 640
Val Val Leu Ser Gly Ser Ser Arg Ser Val Leu Asp Lys Asn Phe Gly
645 650 655
Glu Tyr Asp Met Trp Leu Ala Ala Glu Asn Gly Met Phe Leu Arg Leu
660 665 670
Thr Asn Gly Glu Trp Met Thr Thr Met Pro Glu His Leu Asn Met Glu
675 680 685
Trp Val Asp Ser Val Lys His Val Phe Lys Tyr Phe Thr Glu Arg Thr
690 695 700
Pro Arg Ser His Phe Glu Thr Arg Asp Thr Ser Leu Ile Trp Asn Tyr
705 710 715 720
Lys Tyr Ala Asp Ile Glu Phe Gly Arg Leu Gin Ala Arg Asp Leu Leu
725 730 735
Gin His Leu Trp Thr Gly Pro Ile Ser Asn Ala Ser Val Asp Val Val
740 745 750
Gin Gly Ser Arg Ser Val Glu Val Arg Ala Val Gly Val Thr Lys Gly
755 760 765
Ala Ala Ile Asp Arg Ile Leu Gly Glu Ile Val His Ser Lys Ser Met
770 775 780
Thr Thr Pro Ile Asp Tyr Val Leu Cys Ile Gly His Phe Leu Gly Lys
785 790 795 800
125 ·« ·· · 4 4
4 4 4 ··· 444 • 4 · • ···· · • 4 4 • · · • 44 ··
Asp Glu Asp Val Tyr Thr
805
Pro Ala Ile Ala Arg Ser 820
Ser Ser Gly Asp Arg Arg 835
Lys Ser Gly Ser Lys Ser 850
Lys Ser Ser Gin Arg Ser 865 870
His Ser Leu Gly Asn Ser 885
Asn Val Leu Asp Leu Lys 900
Arg Thr Arg Thr Asn Ala 915
Val Cys Phe Leu Glu Lys 930
Pro Glu Thr Val Ser Ser 945 950
Phe Val Thr Lys Ser Ser 965
Phe Phe Glu Pro Glu Leu Pro 810
Arg Pro Ser Ser Asp Ser Gly 825
Pro Pro Ser Lys Ser Thr His 840 845
Ser Ser Ser Ser Asn Ser Asn 855 860
Leu Gin Ser Glu Arg Lys Ser 875
Arg Arg Pro Ser Pro Glu Lys 890
Gly Glu Asn Tyr Phe Ser Cys 905
Arg Tyr Leu Leu Gly Ser Pro 920 925
Leu Ala Asp Thr Thr Ser Ser 935 940
Glu Phe Met * Pro Asn Lys 955
His Tyr Gin Thr Leu * Trp 970
Ser Asp Met 815
Ala Lys Ser 830
Asn Asn Asn
Asn Asn Asn
Gly Ser Asn 880
Ile Ser Trp 895
Ala Val Gly 910
Asp Asp Val
Pro * Tyr
Asn Tyr Cys 960 (2)Informace o SEQ ID NO:41:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 300 párů bázi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iíi)Hypotetický: Ne (iii) Antisence: Ne (vi)Původní zdroj:
(A) Organizmus: Oryza sativa (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:41:
ATAAACTTCC TCGGACCAAA GAAGAGCATG TTGGTTGTGT CGGAGTTTAT
CCTTCACTGA GTGGAGCCAT TCGTGTTAAC CCGTGGAATA TCGAGGCAAC
TGGTTGCTCA
TGCAGAGGCA
120
126 «« «· • * · · • · · · ··· ··· • · · • ···· · • · • · « »»· ·· ·· ·♦
- r
CTGAATGAGG CCATCTCAAT GTCAGAGCGT AAAAGCAGCT GAGGCACGAA AAACATTACČ • 180
GTTATGTCAG CACCCATGAT GTTGCATATT GGTCTAAGAG CTTTGTACAG GACCTGGAGA 240
GGGCTTGCAA GGATCACTTT AGGAAACCAT GCTGGGGCAT TGGATTGGAT TTCGCTCAGG 300
(2)Informace o SEQ ID NO:42:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 627 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (vi)Původní zdroj:
(A)Organizmus: Selaginella lepidophylla (ix) Vlastnosti:
(A) Jméno/Klíč: CDS (B) Umístění: 4..627 (D)Další informace:/částečná (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:42
ATT ATG Met 1 TGG Trp GTG CAT GAT TAC CAC CTC TGT CTG GTC CCT CAG ATG ATC 48
Val His Asp 5 Tyr His Leu Cys Leu 10 Val Pro Gin Met Ile 15
CGC CAA AAG CTG CCA GAT GTG CAG ATT GGC TTC TTC CTC CAC ACC GCT 96
Arg Gin Lys Leu Pro Asp Val Gin Ile Gly Phe Phe Leu His Thr Ala
20 25 30
TTT CCC TCG TCA GAG GTC TTC CGC TGC TTG GCC GCA CGA AAG GAG CTG • '144
Phe Pro Ser Ser Glu Val Phe Arg Cys Leu Ala Ala Arg Lys Glu Leu
35 40 45
CTG GAC GGC ATG CTT GGT GCC AAC TTG GTT GCT TTC CAG ACG CCA GAG 192
Leu Asp Gly Met Leu Gly Ala Asn Leu Val Ala Phe Gin Thr Pro Glu
50 55 60
TAT GCA CAC CAC TTC CTC CAG ACG TGC AGT CGC ATT TCT CTG CTG AAG 240
Tyr Ala His His Phe Leu Gin Thr Cys Ser Arg Ile Ser Leu Leu Lys
65 70 75
CAA CCG AGG AAG GCG TTC AGC TCG TTT CGT CAA TGT CTG GTC ATA ATG 288
Gin Pro Arg Lys Ala Phe Ser Ser Phe Arg Gin Cys Leu Val Ile Met
80 85 90 95
127
CAA Gin GAA Glu GCG Ala CTA Leu CGA Arg 100 GGG Gly TCA Ser AGA Arg AGG TCA TCG Ser TTG Leu CGC Arg GTG ACA AGC ' • 336
Arg Ser 105 Val Thr 110 Ser
TGA CAA CAT CGC GTG TAC GCG AGA AGC TTC TGT CGT ACG AGC TGT TCT 384
* Gin His Arg Val Tyr Ala Arg Ser Phe Cys Arg Thr Ser Cys Ser
115 120 125
TGA ACA AGA ACC CAC AGT GGA GGG ACA AGG TCG TTC TCA TTC AGG TTG 432
* Thr Arg Thr His Ser Gly Gly Thr Arg Ser Phe Ser Phe Arg Leu
130 135 140
CGA CCT CCA CGA CTG AGG ATT CTG AGC TTG CTG CGA CCG TAT CCG AAA 480
Arg Pro Pro Arg Leu Arg Ile Leu Ser Leu Leu Arg Pro Tyr Pro Lys
145 150 155
TTG TTA CAC GTA TTG ACG CTG TGC ACT CGA CGC TCA CAC ACA CCC ACT 528
Leu Leu His Val Leu Thr Leu Cys Thr Arg Arg Ser His Thr Pro Thr
160 165 170 175
CGT CTT CCT CAG GCA AGA CAT TGC GTT CTC GCA GTA CCT CGC ACT TCT 576
Arg Leu Pro Gin Ala Arg His Cys Val Leu Ala Val Pro Arg Thr Ser
180 185 190
CTC GAT CGC CGA TGC TCT TGC AAT CAA CTG TTC GAT GGC ATG AAC CTC 624
Leu Asp Arg Arg Cys Ser Cys Asn Gin Leu Phe Asp Gly Met Asn Leu
195 200 205
GTC 627
Val (2)Informace o SEQ ID NO:43:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 208 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D)Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:43:
Met 1 Trp Val His Asp 5 Tyr His Leu Cys Leu 10 Val Pro Gin Met Ile 15 Arg
Gin Lys Leu Pro 20 Asp Val Gin Ile Gly 25 Phe Phe Leu His Thr 30 Ala Phe
Pro Ser Ser 35 Glu Val Phe Arg Cys 40 Leu Ala Ala Arg Lys 45 Glu Leu Leu
Asp Gly Met Leu Gly Ala Asn Leu Val Ala Phe Gin Thr Pro Glu Tyr
5θ 55 60
128
Ala 65 His His Phe Leu Gin 70 * · 4 4 4 4 4 4 Thr 4 4 4 • 44 4 444 4 · 4 Cys « 4 4 4 · 4 · 4 4 4 4 4 4 4 Ile 75 4 4 4 · 4 · 4 4 4 4 4 4 Ser 4 4 4 · 4 4 4 4 4 4 4 4 Leu Leu Lys Gin 80
4 · Ser 4 · 4 4 4 4 4 4 Arg
Pro Arg Lys Ala Phe Ser Ser Phe Arg Gin Cys Leu Val Ile Met Gin
85 90 95
Glu Ala Leu Arg Gly Ser Arg Arg Ser Ser Leu Arg Val Thr Ser ★
100 105 110
Gin His Arg Val Tyr Ala Arg Ser Phe Cys Arg Thr Ser Cys Ser ★
115 120 125
Thr Arg Thr His Ser Gly Gly Thr Arg Ser Phe Ser Phe Arg Leu Arg
130 135 140
Pro Pro Arg Leu Arg Ile Leu Ser Leu Leu Arg Pro Tyr Pro Lys Leu
145 150 155 160
Leu His Val Leu Thr Leu Cys Thr Arg Arg Ser His Thr Pro Thr Arg
165 170 175
Leu Pro Gin Ala Arg His Cys Val Leu Ala Val Pro Arg Thr Ser Leu
180 185 190
Asp Arg Arg Cys Ser Cys Asn Gin Leu Phe Asp Gly Met Asn Leu Val
195 200 205 (2)Informace o SEQ ID NO:44:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 645 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly; cDNA k mRNA (iií)Hypotetický: Ne (iii) Antisence: Ne (vi)Původní zdroj:
(A) Organizmus: Selaginella lepiddophyla (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:44:
GGGTGGTTCT TGCACACGCC GTTTCCCTCG TCTGAGATTT ACAGAACGCT GCCGCTGCGG 60
GCCGAGCTGC TCCAAGGCGT CTTAGGCGCG GACTTAGTGG GGTTCCACAC ATACGACTAT 120
GCAAGGCACT TTGTTAGCGC GATGCACACG GATACTCGGG CTGGAAGGCA CTCCCAGGGT 180
GTCGAGGATC AAGGGAAGAT CACGCGAGTG GCTGCCTTCC CCGTGGATCG ATTCGGAGCG 240
ATTTATCGAC GCGTAGAGAC CGATGCGGTC AAGAAACACA TGCAAGAGCT GAGCCAGGTT 300
129 • · · ···· · · · · • · · « ··· ·«·· • · ···· 9 9 9 9 9 999 999
9 9 9 9 9 9 9
9 9 99 9 99 9 9 9 9
TTGCTGTCGT AAGGTTATGT TGGGGTGGAT AGGCTTGACA TGATTAAAGG AATTCCACAG • 360
AAGCTGCTAG CCTTTGAAAA ATTCCTCGAG GAGAACTCCG AGTGGCGTGA TAAGGTCGTC 420
CTGGTGCAAA TCGCGGTGCC GACTAGAACG GACGTCCTCG AGTACCAAAA GCTTACGAGC 480
CAGGTTCACG AGATTGTTGG TCGCATAAAT GGACGTTTCG GCTCCTTGAC GGCTGTTCCT 540
ATCCATCACC TCGATCGGTC CATGAAATTT CCGGAGCTTT GTGCGTTATA TGCAATCACT 600
GATGTCCTGC TCGTGACATC CCTGCGCGAC GGCATGAACT TCGTC 645
(2)Informace o SEQ ID NO:45:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 498 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (vi)Původní zdroj:
(A) Organizmus: Arabidopsís thaliana
(xi)Popis sekvence: GCCGTTGTGG ATTCATCGCC SEQ ID NO: TCGCACAAGC 45: ACTCTTGTCG TGTCTGAGTT TATTGGATGC 60
TCACCTTCTT TGAGTGGTGC CATTAGGGTG AATCCATGGG ATGTGGATGC TGTTGCTGAA 120
GCGGTAAACT CGGCTCTTAA AATAGTGAGA CTGAGAAGCA ACTACGGCAT GAGAAACATT 180
ATCATTATAT TAGCACTCAT GATGTTGGTT ATTGGGCAAA GAGCTTTATG CAGGATCTTG 240
AGAGAGCGTG CCGAGATCAT TATAGTAAAC GTTGTTGGGG GATTGGTTTT GGCTTGGGGT '300
TCAGAGTTTT GTCACTCTCT CCAAGTTTTA GGAAGCTATC TGTGGACACA TTTGTTCCAG 360
TTTATAGGAA AACCACAGAG AGGGCTAATA TTCTTTTATA ATGGTACTCT TTGTTCCGAA 42.0
AGCTCATTGT TCAAGATCCA GCAACGGGTT CCTTGTCCTA AGCCCCTTAA GGCCCCATAA 480
CCGGTGTTTT (2)Informace TTAGTGAG o SEQ ID NO :46: 498
(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 463 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární
130 • · « ·· · :
• φ · · · · !
• > φφφφ φ · · * • · · · ·_ · »· < ·♦· ·· iii)Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii)Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (vi)Původní zdroj:
(A)Organizmus: Arabidopsis thaliana
(xi)Popis GCCGTTGTGG sekvence: ATTCATCGCC SEQ ID NO:· TCGCACAAGC 46: ACTCTTGTCG TGTCTGAGTT TATTGGATGC 60
TCACCTTCTT TGAGTGGTGC CATTGGGTGA ATCCATGGGA TGTGGATGCT GTTGCTGAAG 120
CGGTAAACTC GGCTCTTAAA ATGAGTGAGA CTGAGAAGCA ACTACGGCAT GAGAAACATT 180
ATCATTATAT TAGCACTCAT GATGTTGGTT ATTGGGCAAA GAGCTTTATG CAGGATCTTG 240
AGAGAGCGTG CCGAGATCAT TATAGTAAAC GTTGTTGGGG GATTGGTTTT GGTTTGGGGT 300
TCAGAGTTTT TGTCACTCTC TCCAAGTTTA GGAAGCTATC TTGGGACAAT TGTTCCAGTT 360
TTTAGGGAAA ACACAGGGAA GGTTATTTCC TTGATTATAA TGGACCTTGT CCAAGCCCCA 420
TTTTTAAGGC CCAGGAACCG GGTTTTTTTT TCTTAAAGCC CCT 463
(2)Informace o SEQ ID NO:47:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 394 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly:' cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (vi)Původní zdroj:
(A)Organizmus: Arabidopsis thaliana (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:47:
GGTATTGATG TAGAGGAAAT ACGTGGTGAA ATCGAAGAAA GCTGCAGGAG GATCAATGGA 60
GAGTTTGGGA AACCGGATAT CAACCTATCA TATATATTGA TACCCGGTTT CGATTAATGA 120
AATAAATGCT TATACCATAT TGCTGAGTGC GTGGTCGTTA CAGCTGTTAG AGATGGTATG 180
AACCTTACTC CCTACGAATA TATCGTTTGT AGACAAGGTT TACTTGGGTC TGAATCAGAC 240
TTTAGTGGCC CAAAGAAGAG CATGTTGGTT GCATCAAGTT TATTTGGATG TCCCCTTTCG 300
131 • · • · · (2)Informace o SEQ ID NO:48:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 428 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (vi)Původní zdroj:
(A)Organizmus: Arabidopsis thaliana (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:48:
AAGTCCGTTG TGGATTCACG CCTCGCACAA GCACTCTTGT CGTGTCTAGT TTATTGGATG
CTCACCTTCT TTAGTGGTGC CATTAGGGTG AATCCATGGA TGTGGATGCT GTTGCTGAAG
CGGTAAACTC GGCTCTTAAA ATAGTGAGAC TGAGAAGCAA CTACGGCATG AGAAACATTA
TCATTATATT AGCACTCATG ATGTTGGTTA TTGGGCAAAG AGCTTTATGC AGGACTTAGA
GAGCGTGCCG AGATCATTAT AGTAAACGTT GTTGGGGGAT TGGTTTTGGT TTGGGGTTCA
AGTTTTGTCA CTCTCTCCAA GTTTTAGGAA GCTATCTTGT GGACACATTG TTCCAGTTTA
TAGAAACACA GGGAAGGGGC TATATTCTTG TTTAAATGGG ACCCCTTGTC CCTAAAAGTC
CCATTTGT (2)Informace o SEQ ID NO:49:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 481 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (vi)Původní zdroj:
(A) Organizmus: Arabidopsis thaliana
120
180
240
300
360
420
428
132 • · · 0 0 0 0
0 0 0 0 0 ·
000000 · · *
0 0 0 0 0 • 0 0 000 00 (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:49:
CAAACGAAGA GCTTCGTGGG AAAGTGGTTC TCGTGCAGAT TACTAATCCT GCTCGTAGTT 60
CAGGTAAGGA TGTTCAAGAT GTAGAGAAAC AGATAAATTT ATTGCTGATG AGATCAATTC 120
TAAATTTGGG AGACCTGGTG GTTATAAGCC TATTGTTTTG TAATGGACCT GTTAGTACTT 180
TGGATAAAGT TGCTTATTAC GCGATCTCGG AGTGTGTTGT CGTGAATCTG TGAGAGATGG 240
GATGAATTTG GTGCCTTATA AGTACACAGT GACTCGGCAA GGGAGCCCTG CTTTGGATGC 300
AGCTTTGGTT TTGGGGAGGA TGATGTTAGG AAGAGTGTGA TTATTGTTTC TGAGGTTCAA 360
CCGGTTGTCC TCCATCTCTA GTGGTGCGAT CCCTTTTAAT CCGTGGACAT CGATCAGCAC 420
TTACGCCATG AGCTTCAAAT CCGGTTTCCG CAAAGGGAAA ATTGCCCCGA GCTTAAGGCC 480
A 481 (2)Informace o SEQ ID NO:50:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 395 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (vi)Původní zdroj:
(A)Organizmus: Arabidopsis thaliana (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:50:
AGACCTGGTG GTTATAAGCC TATTGTGTTT GTCAATGGAC CTGTTAGTAC TTTGGATAAA 60
TTGCTTATTA CGCGATCTCG GAGTGTGTTG TCGTGAATCT GTGAGAGATG GGATGAATTT 120
GGTGCCTTAT AAGTACACAG TGACTCGGCA AGGGAGCCCT GCTTTGGATG CAGCTTTAGG 180
TTTTGGGGAG GATGATGTTA GGAAGAGTGT GATTATTGTT TCTAGTTCAT CGGTTGTCTC 240
CATCTCTGAG TGGTGCGATC CGTTAATCCG TGGAACATCG TGCAGTCACT AAACGCCATG 300
AGCCTGCAAT ACGATGTCGC AAAGGGAAAA TCTTTGCCAC CAGAAGCATC ATAAGTACAT 360
AAAGCCTCAC AATTGCCTAT TTGGGCCGGG GTTTT 395
133
44
4 4 4
4 4 4
(2)Informace o SEQ ID NO:51:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 431 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (vi)Původní zdroj:
(A) Organizmus: Oryza sativa (ix) Vlastnosti:
(A) Jméno/Klíč: misc_feature (B) Umístění: 1 (D)Další informace:/standard_name=GENBANK ID:D22143 (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:51:
GGGAATGGAG GGTCTCCGAG CTGCAGCAGC AATTTGAGGG GAAGACTGTG TTGCTCGGTG 60
TGGATGACAT GGATATCTTC AAGGGTATCA ACTTGAAGCT TCTTGCCTTC GAGAATATGT 120
TGAGGACACA TCCCAAGTGG CAGGGGCGGG CAGTGTTGGT GCAAATTGCT AATCCGGCCC 180
GTGGAAAGGG TAAGGATCTT GAAGCCATCC AGGCTGAGAT TCATGAGAGC TGCAAGAGGA 240
TTAATGGAGA GTTTGGCCAG TCAGGATACA GCCCTGTTGT CTTCATTGAC CGTGATGTGT 300
CAAGTGTGGA GGAAGATTGC CTACTACACA ATAGCAGAAT GTGTGGTGGT GACTGCTGTT 360
AGGGATGGGA TTGACTTGAC ACCATATGGA TATATTGTCT GTAGGGCAGG GGTCTTACTC 420
ACATCAGAGG T 431
(2)Informace o SEQ ID NO:52:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 496 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne
134
·· · • · 4 • ···· · (vi)Původní zdroj:
(A) Organizmus: Oryza sativa (ix) Vlastnosti:
(A) Jméno/Klič: misc_feature (B) Umístění: 1 (D)Další informace:/standard_name=GENBANK ID:D40048 (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:52:
CTACCGTTCC CTCCCTGTTC GCGACGAGAT CCTCAAATCA CTGCTAAACT GCGATCTGAT 60
TGGGTTCCAC ACCTTTGATT ACGCGCGGCA TTTCCTGTCC TGCTGCAGCC GGATGCTGGG 120
GATCGAGTAC CAGTCGAAGA GGGGATATAT CGGTCTCGAT TACTTTGGCC GCACTGTTGG 180
GATAAAGATC ATGCCTGTTG GGATTAACAT GACGCAGCTG CAGACGCAGA TCCGGCTGCC 240
TGATCTTGAG TGGCGTGTCG CGAACTCCGG AAGCAGTTTG ATGGGAAGAC TGTCATGCTC 300
GGTGTGGATG ATATGGACAT ATTTAAGGGG ATTAATCTGA AAGTTCTTGC GTTTTGAGCA 360
GATGCTGAGG ACACACCCAA AATGGCAGCC AAGGCAGTTT TGGTGCAGAT TCAAACCAAG 420
GGTGGTTGTT GGGAGGACTT AGGTACAGCT AGATATGAGT TCAGGGGTAA TGACATTTCA 480
GGCGGTATTT CCTTGG 496 (2)Informace o SEQ ID NO:53:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 288 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA' k mRNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (vi)Původní zdroj:
(A)Organizmus: Oryza sativa (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:53:
GGACCAAAGA AGAGCATGTT GGTTGTGTCG GAGTTTATTG GTTGCTCACC TTCACTGAGT 60
GGAGCCATTC GTGTTAACCC GTGGAATATC GAGGCAACTG CAGAGGCACT GAATGAGGCC 120
ATCTCAATGT CAGAGCGTAA AAGCAGCTGA GGCACGAAAA ACATTACCGT TATGTCAGCA 180
CCCATGATGT TGCATATTGG TCTAAGAGCT TTGTACAGGA CCTGGAGAGG GCTTGCAAGG 240 ATCACTTTAG GAAACCATGC TGGGGCATTG GATTGGATTT CGCTCAGG t 288
135 • · · • frfrfr · « frt ·· frfr • · · · · fr· · • frfr · · · · fr · ·· frfrfr ··· • frfr frfr • frfr frfr ·· ·· (2)Informace o SEQ ID NO:54:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 2207 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: dva (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Ne (iii)Antisence: Ne (vi)Původní zdroj:
(A) Organizmus: Solanum tuberosum (B) Druh: Kardal (ix) Vlastnosti:
(A) Jméno/Klíč: CDS (B) Umístění: 161..1906 (D)Další informace:/částečná (ix) Vlastnosti:
(A) Jméno/Klíč: CDS (B) Umistění: 842..850 (D)Další informace:/function= „putative glycosylationsite (funkce=pravděpodobné místo glykosylace) (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:54:
CTTTTCTGAG TAATAACATA GGCATTGATT TTTTTTCAAT TAATAACACC TGCAAACATT 60
CCCATTGCCG GCATTCTCTG TTCTTACAAA AAAAAACATT TTTTTGTTCA CATAAATTAG 120
TTATGGCATC AGTATTGAAC CCTTTAACTT GTTATACAAT ATG GGT AAA Met Gly Lys GCT ATA Ala Ile 175
5
ATT TTT ATG ATT TTT ACT Thr ATG TCT ATG AAT ATG ATT AAA Lys GCT GAA ACT 223
Ile Phe Met Ile Phe 10 Met Ser Met Asn 15 Met Ile Ala Glu 20 Thr
TGC AAA TCC ATT GAT AAG GGT CCT GTA ATC CCA ACA ACC CCT TTA GTG 271
Cys Lys Ser Ile Asp Lys Gly Pro Val Ile Pro Thr Thr Pro Leu Val
25 30 35
ATT TTT CTT GAA AAA GTT CAA GAA GCT GCT CTT CAA ACT TAT GGC CAT 319
Ile Phe Leu Glu Lys Val Gin Glu Ala Ala Leu Gin Thr Tyr Gly His
40 45 50
AAA GGG TTT GAT GCT AAA CTG TTT GTT GAT ATG TCA CTG AGA GAG AGT 367
Lys Gly Phe Asp Ala Lys Leu Phe Val Asp Met Ser Leu Arg Glu Ser
55 60 65
136 ·0
0 0 0 • 0 0 4
000 004
0
00
0 • 0 ·
0 0«
0 0000 0
0 0
0 « 00 0 4 0 4
4 0
0 0
0 0 «00 00
CTT TCA GAA ACA GTT Val GAA GCT Glu Ala 75 TTT Phe AAT AAG CTT CCA AGA GTT Val GTG AAT 415
Leu 70 Ser Glu Thr Asn Lys Leu 80 Pro Arg Val Asn 85
GGT TCA ATA TCA AAA AGT GAT TTG GAT GGT TTT ATA GGT AGT TAC TTG 463
Gly Ser Ile Ser Lys Ser Asp Leu Asp Gly Phe Ile Gly Ser Tyr Leu
90 95 100
AGT AGT CCT GAT AAG GAT TTG GTT TAT GTT GAG CCT ATG GAT TTT GTG 511
Ser Ser Pro Asp Lys Asp Leu Val Tyr Val Glu Pro Met Asp Phe Val
105 110 115
GCT GAG CCT GAA GGC TTT TTG CCA AAG GTG AAG AAT TCT GAG GTG AGG 559
Ala Glu Pro Glu Gly Phe Leu Pro Lys Val Lys Asn Ser Glu Val Arg
120 125 130
GCA TGG GCA TTG GAG GTG CAT TCA CTT TGG AAG AAT TTA AGT AGG AAA 607
Ala Trp Ala Leu Glu Val His Ser Leu Trp Lys Asn Leu Ser Arg Lys
135 140 145
GTG GCT GAT CAT GTA TTG GAA AAA CCA GAG TTG TAT ACT TTG CTT CCA 655
Val Ala Asp His Val Leu Glu Lys Pro Glu Leu Tyr Thr Leu Leu Pro
150 155 160 165
TTG AAA AAT CCA GTT ATT ATA CCG GGA TCG CGT TTT AAG GAG GTT TAT 703
Leu Lys Asn Pro Val Ile Ile Pro Gly Ser Arg Phe Lys Glu Val Tyr
170 175 180
TAT TGG GAT TCT TAT TGG GTA ATA AGG GGT TTG TTA GCA AGC AAA ATG 751
Tyr Trp Asp Ser Tyr Trp Val Ile Arg Gly Leu Leu Ala Ser Lys Met
185 190 195
TAT GAA ACT GCA AAA GGG ATT GTG ACT AAT CTG GTT TCT CTG ATA GAT 799
Tyr Glu Thr Ala Lys Gly Ile Val Thr Asn Leu Val Ser Leu Ile Asp
200 205 210
CAA TTT GGT TAT GTT CTT AAC GGT GCA AGA GCA TAC TAC AGT AAC AGA 847
Gin Phe Gly Tyr Val Leu Asn Gly Ala Arg Ala Tyr Tyr Ser Asn Arg
215 220 225
AGT CAG CCT CCT GTC CTG GCC ACG ATG ATT GTT GAC ATA TTC AAT CAG 895
Ser Gin Pro Pro Val Leu Ala Thr Met Ile Val Asp Ile Phe Asn Gin
230 235 240 245
ACA GGT GAT TTA AAT TTG GTT AGA AGA TCC CTT CCT GCT TTG CTC AAG 943
Thr Gly Asp Leu Asn Leu Val Arg Arg Ser Leu Pro Ala Leu Leu Lys
250 255 260
GAG AAT CAT TTT TGG AAT TCA GGA ATA CAT AAG GTG ACT ATT CAA GAT 991
Glu Asn His Phe Trp Asn Ser Gly Ile His Lys Val Thr Ile Gin Asp
265 270 275
GCT CAG GGA TCA AAC CAC AGC TTG AGT CGG TAC TAT GCT ATG TGG AAT 1039
Ala Gin Gly Ser Asn His Ser Leu Ser Arg Tyr Tyr Ala Met Trp Asn
280 285 290
137 • 4 4·
4 4 4 «4 4
4«· • « ¢414 •
• 44
AAG Lys CCC Pro 295 CGT Arg CCA Pro GAA TCG TCA ACT ATA Ile GAC AGT GAA ACA GCT TCC Ser GTA Val 1087
Glu Ser Ser 300 Thr Asp Ser Glu 305 Thr Ala
CTC CCA AAT ATA TGT GAA AAA AGA GAA TTA TAC CGT GAA CTG GCA TCA 1135
Leu Pro Asn Ile Cys Glu Lys Arg Glu Leu Tyr Arg Glu Leu Ala Ser
310 315 320 325
GCT GCT GAA AGT GGA TGG GAT TTC AGT TCA AGA TGG ATG AGC AAC GGA 1183
Ala Ala Glu Ser Gly Trp Asp Phe Ser Ser Arg Trp Met Ser Asn Gly
330 335 340
TCT GAT CTG ACA ACA ACT AGT ACA ACA TCA ATT CTA CCA GTT GAT TTG 1231
Ser Asp Leu Thr Thr Thr Ser Thr Thr Ser Ile Leu Pro Val Asp Leu
345 350 355
AAT GCA TTC CTT CTG AAG ATG GAA CTT GAC ATT GCC TTT CTA GCA AAT 1279
Asn Ala Phe Leu Leu Lys Met Glu Leu Asp Ile Ala Phe Leu Ala Asn
360 365 370
CTT GTT GGA GAA AGT AGC ACG GCT TCA CAT TTT ACA GAA GCT GCT CAA 1327
Leu Val Gly Glu Ser Ser Thr Ala Ser His Phe Thr Glu Ala Ala Gin
375 380 385
AAT AGA CAG AAG GCT ATA AAC TGT ATC TTT TGG AAC GCA GAG ATG GGG 1375
Asn Arg Gin Lys Ala Ile Asn Cys Ile Phe Trp Asn Ala Glu Met Gly
390 395 400 405
CAA TGG CTT GAT TAC TGG CTT ACC AAC AGC' GAC ACA TCT GAG GAT ATT 1423
Gin Trp Leu Asp Tyr Trp Leu Thr Asn Ser Asp Thr Ser Glu Asp Ile
410 415 420
TAT AAA TGG GAA GAT TTG CAC CAG AAC AAG AAG TCA TTT GCC TCT AAT 1471
Tyr Lys Trp Glu Asp Leu His Gin Asn Lys Lys Ser Phe Ala Ser Asn
425 430 435
TTT GTT CCG CTG TGG ACT GAA ATT TCT TGT TCA GAT AAT AAT ATC ACA 1519
Phe Val Pro Leu Trp Thr Glu Ile Ser Cys Ser Asp Asn Asn Ile Thr
440 445 450
ACT CAG AAA GTA GTT CAA AGT CTC ATG AGC TCG GGC TTG CTT CAG CCT 1567
Thr Gin Lys Val Val Gin Ser Leu Met Ser Ser Gly Leu Leu Gin Pro
455 460 465
GCA GGG ATT GCA ATG ACC TTG TCT AAT ACT GGA CAG CAA TGG GAT TTT 1615
Ala Gly Ile Ala Met Thr Leu Ser Asn Thr Gly Gin Gin Trp Asp Phe
470 475 480 485
CCG AAT GGT TGG CCC CCC CTT CAA CAC ATA ATC ATT GAA GGT CTC TTA 1663
Pro Asn Gly Trp Pro Pro Leu Gin His Ile Ile Ile Glu Gly Leu Leu
490 495 500
AGG TCT GGA CTA GAA GAG GCA AGA ACC TTA GCA AAA GAC ATT GCT ATT 1711
Arg Ser Gly Leu Glu Glu Ala Arg Thr Leu Ala Lys Asp Ile Ala Ile
505 510 515
138 • ·
• · • · • · • · • · • · 9 9 9 9 • · · · • • • • • • · • • • • • · · • · • · • · • • 9 • · • · • · · • • · • 9 • • • · · • • ·
Thr Glu Ala Ala Gin Asn Arg Gin Lys Ala Ile Asn Cys Ile Phe Trp
385 390 395 400
Asn Ala Glu Met Gly Gin Trp Leu Asp Tyr Trp Leu Thr Asn Ser Asp
405 410 415
Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Lys Trp Glu Asp Leu His Gin Asn Lys Lys
420 425 430
Ser Phe Ala Ser Asn Phe Val Pro Leu Trp Thr Glu Ile Ser Cys Ser
435 440 • A, 445
Asp Asn Asn Ile Thr Thr Gin Lys Val Val Gin Ser Leu Met Ser Ser
450 455 460
Gly Leu Leu Gin Pro Ala Gly Ile Ala Met Thr Leu Ser Asn Thr Gly
465 470 475 480
Gin Gin Trp Asp Phe Pro Asn Gly Trp Pro Pro Leu Gin His Ile Ile
485 490 495
Ile Glu Gly Leu Leu Arg Ser Gly Leu Glu Glu Ala Arg Thr Leu Ala
500 505 510
Lys Asp Ile Ala Ile Arg Trp Leu Arg Thr Asn Tyr Val Thr Tyr Lys
515 520 525
Lys Thr Gly Ala Met Tyr Glu Lys Tyr Asp Val Thr Lys Cys Gly Ala
530 535 540
Tyr Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Met Ser Gin Thr Gly Phe Gly Trp Ser
545 550 555 560
Asn Gly Val Val Leu Ala Leu Leu Glu Glu Phe Gly Trp Pro Glu Asp
565 ’ 570 575
Leu Lys Ile Asp Cys 580 (2)Informace o SEQ ID NO:56:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 18 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: Ne (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:56:
CTCAGATCTG GCCACAAA
139
Pro Arg
Ile Gly
Pro Met
Asn Ser 130
Asn Leu 145
Tyr Thr
Phe Lys
Leu Ala
Val Ser 210
Tyr Tyr. 225
Asp Ile
Pro Ala
Val Thr
Tyr Ala 290
Glu’ Thr 305
Arg Glu
Trp Met
Leu Pro
Ala Phe 370
Val Val Asn Gly Ser Ile Ser
Ser Tyr Leu Ser Ser Pro Asp 100 105
Asp Phe Val Ala Glu Pro Glu 115 120
Glu Val Arg Ala Trp Ala Leu 135
Ser Arg Lys Val Ala Asp His 150
Leu Leu Pro Leu Lys Asn Pro 165
Glu Val Tyr Tyr Trp Asp Ser 180 185
Ser Lys Met Tyr Glu Thr Ala 195 200
Leu Ile Asp Gin Phe Gly Tyr 215 .Ser^sn ;^^bi,^Se.r.<Gln. Pro Pro
Phe Asn Gin Thr Gly Asp Leu 245
Leu Leu Lys Glu Asn His Phe 260 265
Ile Gin Asp Ala Gin Gly Ser 275 280
Met Trp Asn Lys Pro Arg Pro 295
Ala Ser Val Leu Pro Asn Ile 310
Leu Ala Ser Ala Ala Glu Ser 325
Ser Asn Gly Ser Asp Leu Thr 340 345
Val Asp Leu Asn Ala Phe Leu 355 360
Leu Ala Asn Leu Val Gly Glu
375
Lys Ser Asp Leu Asp Gly Phe
95
Lys Asp Leu Val Tyr Val Glu 110
Gly Phe Leu Pro Lys Val Lys 125
Glu Val His Ser Leu Trp Lys 140
Val Leu Glu Lys Pro Glu Leu 155 160
Val Ile Ile Pro Gly Ser Arg 170 175
Tyr Trp Val Ile Arg Gly Leu 190
Lys Gly Ile Val Thr Asn Leu 205
Val Leu Asn Gly Ala Arg Ala 220
Val Leu Ala Thr Met Ile .y/jg 23 5
Asn Leu Val Arg Arg Ser Leu 250 255
Trp Asn Ser Gly Ile His Lys 27 5
Asn His Ser Leu Ser Arg Tyr 285
Glu Ser Ser Thr Ile Asp Ser 300
Cys Glu Lys Arg Glu Leu Tyr 315 320
Gly Trp Asp Phe Ser Ser Arg 330 335
Thr Thr Ser Thr Thr Ser Ile 350
Leu Lys Met Glu Leu Asp Ile 365
Ser Ser Thr Ala Ser His Phe 380
140
(2)Informace o SEQ ID NO:57:
(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 18 párů bázi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: Ne (xi)Popis sekvence: SEQ ID N0:6:
GTGCTCGTCT GCAGGTGC

Claims (98)

  1. PATENOVÉ NÁROKY
    1. Způsob modifikace vývoje a/nebo složení buněk, tkání a orgánů in vivo jinak než udělením schopnosti syntetizovat trehalasu, indukcí změn metabolické dostupnosti trehalosa-6-fosfátu.
  2. 2. Způsob stimulace toku uhlíku v buňkách v glykolytickém směru snížením vnitrobuněčné dostupnosti trehalosa-6-fosfátu.
  3. 3. Způsob inhibice toku uhlíku v buňkách v glykolytickém směru zvýšením vnitrobuněčné dostupnosti trehalosa-6-fosfátu.
  4. 4. Způsob inhibice fotosyntézy v buňkách snížením vnitrobuněčné dostupnosti trehalosa-6-fosfátu.
  5. 5. Způsob stimulace fotosyntézy v buňkách zvýšením vnitrobuněčné dostupnosti trehalosa-6-fosfátu.
  6. 6. Způsob stimulace aktivit spojených se spotřebou (sink-related activity) zvýšením vnitrobuněčné dostupnosti trehalosa-6-fosfátu.
  7. 7. Způsob stimulace růstu buněk nebo tkání snížením vnitrobuněčné dostupnosti trehalosa-6-fosfátu.
  8. 8. Způsob získání zakrslých organismů zvýšením vnitrobuněčné dostupnosti trehalosa-6-fosfátu.
  9. 9. Způsob zvýšení metabolismu buněk snížením vnitrobuněčné dostupnosti trehalosa-6-fosfátu.
  10. 10. Způsob podle nároků 2,4,7 nebo 9 charakterizovaný tak, že se uvedené snížení vnitrobuněčné koncentrace trehalosa-6-fosfátu uskuteční zvýšením aktivity trehalosafosfátfosfatasy (TPP).
    • · ···· • · • « • · • · ·»· ·* ·· ·· • · · · • · · · ··· ··· • · • · • * ··
  11. 11. Způsob podle nároku 10, charakterizovaný tak, že se zvýšení aktivity TPP dosáhne transformací uvedených buněk vektorem schopným exprese enzymu TPP.
  12. 12. Způsob podle nároku 11, charakterizovaný tak, že se uvedené buňky transformují vektorem obsahujícím heterologní gen kódující TPP.
  13. 13. Způsob podle nároku 2,4,7 nebo 9, charakterizovaný tak, že se uvedené snížení vnitrobuněčné koncentrace trehalosa-6-fosfátu uskuteční snížením aktivity trehalosafosfátsyntasy (TPS).
  14. 14. Způsob podle nároku 13, charakterizovaný tak, že se snížení aktivity TPS uskuteční transformací uvedených buněk vektorem schopným exprese molekuly, která inhibuje TPS.
  15. 15. Způsob podle nároku 14, charakterizovaný tak, že uvedený vektor obsahuje anti-sense gen TPS.
  16. 16. Způsob podle nároku 10, charakterizovaný tak, že se uvedené znížení dosáhne mutací endogenního enzymu TPP.
  17. 17. Způsob podle nároku 10, charakterizovaný tak, že se uvedené znížení trehalosa-6-fosfátu uskuteční relativní overexpresí fosfo-alfa-(1,1)glukosidasy.
  18. 18. Způsob podle nároku 3, 5, 6 nebo 8, charakterizovaný tak, že se uvedené zvýšení vnitrobuněčné koncentrace trehalosa-6-fosfátu uskuteční zvýšením aktivity TPS.
  19. 19. Způsob podle nároku 18, charakterizovaný tak, že se uvedené zvýšení aktivity TPS dosáhe transformací uvedených buněk vektorem schopným exprese enzymu TPS.
    • · * · · • · ··· ···
  20. 20. Způsob podle nároku 19, charakterizovaný tak, že se uvedené buňky transformují vektorem obsahujícím heterologní gen kódující TPS.
  21. 21. Způsob podle nároku 3, 5, 6 nebo 8, charakterizovaný tak, že se uvedené zvýšení vnitrobuněčné koncentrace trehalosa-6-fosfátu uskuteční snížením aktivity TPP.
  22. 22. Způsob podle nároku 21, charakterizovaný tak, že se uvedené snížení aktivity TPP uskuteční transformací uvedených buněk vektorem schopným exprese molekuly, která inhibuje TPP
  23. 23. Způsob podle nároku 22, charakterizovaný tak, že uvedený vektor obsahuje anti-sense gen TPS.
  24. 24. Způsob podle nároku 16, charakterizovaný tak, že se uvedené zvýšení dosáhne mutací endogenního enzymu TPS.
  25. 25. Způsob podle kteréhokoliv nároku 1-24, charakterizovaný tak, že je uvedená buňka nebo buňky lokalizována v rostlině.
  26. 26. Způsob podle nároku 25, charakterizovaný tak, že jsou uvedené rostliny rostliny transgenní.
  27. 27. Způsob podle nároku 26, charakterizovaný tak, že jsou uvedené transgenní rostliny produkovány transformací Agronbacterium tumefaciens.
  28. 28. Způsob podle kteréhokoliv nároku 1-24, charakterizovaný tak, že je uvedená buňka nebo buňky lokalizována v živočichovi, přednostně v savci, ještě přednostněji v lidské bytosti.
  29. 29. Způsob podle kteréhokoliv nároku 1-24, charakterizovaný tak, ěe uvedené buňky jsou miroorganismy, přednostně mikroorganismy vybrané ze skupiny obsahující bakterie, mikroby, kvasinky, plísně, buněčné kultury, oocyty, spermatické buňky, hybridomy, Protista a kalusy.
    » · ·
  30. 30. Klonovací vektor, který obsahuje gen kódující TPP, uvedený gen není kvasinkovým TPP genem.
  31. 31. Klonovací vektor podle nároku 30, charakterizovanáý tak, že obsahuje nukleotidové sekvence vybrané ze skupiny nukleotidových sekvencí zobrazených v SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 a částí kodujích TPP v dvoudílných enzymech, jak jsou kodovany v SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:39, SEQ ID
    NO:42, SEQ ID NO:44.
  32. 32. Klonovací vektor, který obsahuje anti-sense gen kódující TPS, který je po expresi schopný zamezit funkční aktivitě endogenního genu pro TPS.
  33. 33. Klonovací vektor, který obsahuje gen TPP, charakterizovaný ta, že obsahuje nukleotidové sekvence vybrané ze skupiny nukleotidových sekvencí zobrazených v SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44.
  34. 34. Klonovací vektor, který obsahuje anti-sense gen kódující TPP, který je po expresi schopný zamezit funkční aktivitě endogenního genu pro TPP.
  35. 35. Rostlina charakterizovaná tak, že ona nebo její předchůdci jsou transformovány vektorem obsahujícím nukleotidovou sekvenci kódující TPP, přičemž uvedený gen není kvasinkový gen pro TPP, ale uvedená roslina stále obsahuje uvedenou nukleotidovou sekvenci.
  36. 36. Rostlina charakterizovaná tak, že ona nebo její předchůdci jsou transformovány vektorem obsahujícím nukleotidovou sekvenci kódující anti-sense gen TPP a uvedená roslina stále obsahuje uvedenou nukleotidovou sekvenci.
    • · · • · · • · ♦ · • · · · · · 9 • · ·
  37. 37. Rostlina charakterizovaná tak, že ona nebo její předchůdci jsou transformovány vektorem obsahujícím nukleotidovou sekvenci kódující anti-sense gen TPS a uvedená roslina stále obsahuje uvedenou nukleotidovou sekvenci.
  38. 38. Použití trehalosa-6-fosfátu k ovlivnění rozdělení karbohydrátů v buňkách.
  39. 39. Použití trehalosa-6-fosfátu ke zvýšení biomasy.
  40. 40. Použití trehalosa-6-fosfátu k ovlivnění aktivity hexokinasy in vivo.
  41. 41. Použití trehalosa-6-fosfátu k ovlivnění funkce hexokinasove signalizace in vivo.
  42. 42. Použití trehalosa-6-fosfátu k ovlivnění syntézy buněčné stěny.
  43. 43. Použití látek ovlivňujících vnitrobuněčnou dostupnost trehalosa-6 fosfátu ke zvýšení biomasy.
  44. 44. Použití látek ovlivňujících vnitrobuněčnou dostupnost trehalosa-6 fosfátu k ovlivnění aktivity hexokinasy.
  45. 45. Použití látek ovlivňujících vnitrobuněčnou dostupnost trehalosa-6 fosfátu k ovlivnění fofosyntézy.
  46. 46. Použití látek ovlivňujících vnitrobuněčnou dostupnost trehalosa-6 fosfátu k ovlivnění toku uhlíku v glykolytické cestě.
  47. 47. Způsob prevence chladového sládnutí zvýšením vnitrobuněčné dostupnosti trehalosa-6-fosfátu.
    • * · · · · • · toto·· • · · ··· ···
    9 9 9 9
    99 99 99
  48. 48. Způsob inhibice invertasy v řepě po sklizni zvýšením vnitrobuněčné dostupnosti trehalosa-6-fosfátu.
  49. 49. Použití látek ovlivňujících vnitrobuněčnou dostupnost trehalosa-6fosfátu k ovlivnění chladového sládnutí nebo inhibici invertasy.
  50. 50. Způsob podle nároku 47 nebo 48, charakterizovaný tak, že zvýšení vnitrobuněčné dostupnosti trehalosa-6-fosfátu je výsledkem zvýšení aktivity trehalosafosfátsyntasy.
  51. 51. Způsob podle nároku 47, charakterizovaný tak, že je regulace dostupnosti trehalosa-6-fosfátu specificky zvýšená v bramborových hlízách.
  52. 52. Způsob podle nároku 51, charakterizovaný tak, že je gen kodujici trehalosafosfátsyntasu specificky exprimován ve hlízách.
  53. 53. Způsob podle nároku 52, charakterizovaný tak, že uvedený gen je gen pro TPS z Escherichia coli.
  54. 54. Způsob podle nároku 48, charakterizovaný tak, že je regulace dostupnosti trehalosa-6-fosfátu specificky zvýšená v hlavním kořenu řepy.
  55. 55. Způsob podle nároku 54, charakterizovaný tak, že je gen kodujici trehalosafosfátsyntasu specificky exprimován v hlavním kořeni.
  56. 56. Způsob akumulace trehalosy, charakterizovaný ta, že se organismus transformuje sekvencí DNA kódující dvoudílný enzym TPS-TPP.
  57. 57. Způsob podle nároku 56, charakterizovaný tak, že uvedený gen je dvoudílný gen z Arabidopsis thalíana • · • · • · · · · • · · · · • ·
  58. 58. Způsob podle nároku 56, charakterizovaný tak, že uvedený gen je dvoudílný gen z Selaginella lepidophylla.
  59. 59. Způsob podle nároku 56, charakterizovaný tak, že uvedený gen je lidský dvoudílný gen.
  60. 60. Způsob podle nároku 56, charakterizovaný tak, že uvedený gen je dvoudílný gen z Helianthus annuus.
  61. 61. Způsob zamezení metabolického řízení během produkce trehalosy expresí sekvence DNA kódující dvoudílný enzym TPS-TPP.
  62. 62. Způsob podle nároku 1-24, charakterizovaný tak, že je exprese TPP nebo TPS omezena na specifickou tkáň.
  63. 63. Způsob podle nároku 1-24, charakterizovaný tak, že exprese TPP nebo TPS je pod kontrolou indukovatelného promotoru.
  64. 64. Způsob stimulace toku uhlíku v buňkách v glykolytickém směru expresí trehalosa-6-fosfátfosfatasy.
  65. 65. Způsob inhibice toku uhlíku v buňkách v glykolytickém směru expresí trehalosa-6-fosfátsyntasy.
  66. 66. Způsob inhibice fotosyntézy v buňkách expresí trehalosa-6fosfátfosfatasy.
  67. 67. Způsob stimulace fotosyntézy v buňkách expresí trehalosa-6fosfátsyntasy.
  68. 68. Způsob stimulace aktivit spojených se spotřebou (sink-related activity) expresí trehalosa-6-fosfátsyntasy.
    • * * · · • · · · • · · · · · • · · • · · • * · · · • flfl · · · « • fl 9
    9 99 * · «
  69. 69. Způsob stimulace růstu buněk nebo tkání expresí trehalosa-6fosfátfosfatasy.
  70. 70. Způsob získání organismů redukované velikosti expresí trehalosa-6fosfátsyntasy.
  71. 71. Způsob zvýšení metabolismu buněk expresí trehalosa-6fosfátfosfatasy.
  72. 72. Způsob zamezení chladového sládnutí expresí trehalosa-6fosfátsyntasy.
  73. 73. Způsob zamezení předčasného dozrávání snížením vnitrobuněčné dostupnosti trehalosa-6-fosfátu.
  74. 74. Způsob zamezení předčasného dozrávání expresí trehalosa-6fosfátfosfatasy.
  75. 75. Způsob indukce předčasného dozrávání zvýšením vnitrobuněčné dostupnosti trehalosa-6-fosfátu.
  76. 76. Způsob indukce předčasného dozrávání expresí trehalosa-6fosfátsyntasy.
  77. 77. Způsob zvýšení výnosu rostlin jejich transformací enzymem kódujícím trehalosa-6-fosfátfosfatasu.
  78. 78. Způsob zvýšení výnosu rostlin zvýšením vnitrobuněčné dostupnosti trehalosa-6-fosfátu.
  79. 79. Polynukleotid kódující trehalosa-6-fosfátsyntasu, charakterizovaný tak, že to je dvoudílný enzym mající mutaci v části kódující trehalosa-6-fosfátfosfatasu.
    • · • · • 4 4 • 4 4*
    4 4 44 4
    4 4 4
    44 4
    4 4 · 4 « ·
    4 4 4 4 · 4
    4 44 444 444
    4 4 4 4
    44 44 44
  80. 80. Polynukleotid kódující trehalosa-6-fosfátfosfatasu, charakterizovaný tak, že to je dvoudílný enzym mající mutaci v části kódující trehalosa-6-fosfátsyntasu.
  81. 81. Polynukleotid podle nároku 79 nebo 80, charakterizovaný tak, že dvoudílný gen je lidský TPS/TPP.
  82. 82. Polynukleotid podle nároku 81, charakterizovaný tak, že lidský TPS/TPP obsahuje aminokyselinovou sekvenci podle SEQ ID NO:11.
  83. 83. Polynukleotid podle nároku 82, charakterizovaný tak, že obsahuje polynukleotidovou sekvenci SEQ ID NO:10.
  84. 84. Polynukleotid podle nároku 79 nebo 80, charakterizovaný tak, že dvoudílný gen je TPS/TPP gen Arabidopsis thaliana.
  85. 85. Polynukleotid podle nároku 84, charakterizovaný tak, že lidský TPS/TPP obsahuje aminokyselinovou sekvenci podle SEQ ID NO:40.
  86. 86. Polynukleotid podle nároku 85, charakterizovaný tak, že obsahuje polynukleotidovou sekvenci SEQ ID NO:39.
  87. 87. Polynukleotid podle nároku 79 nebo 80, charakterizovaný tak, že dvoudílný gen je TPS/TPP gen Selaginella lepidophylla.
  88. 88. Polynukleotid podle nároku 87, charakterizovaný tak, že lidský TPS/TPP obsahuje aminokyselinovou sekvenci podle SEQ ID NO:43 nebo odtud pocházející mutein.
  89. 89. Polynukleotid podle nároku 88, charakterizovaný tak, že obsahuje polynukleotidovou sekvenci SEQ ID NO:42 nebo SEQ ID NO:44.
  90. 90. Polynukleotid podle nároku 79 nebo 80, charakterizovaný tak, že dvoudílný gen je TPS/TPP gen Helianthus annuus.
    «44 4444 «·«· • 444 444 4 · 4 ·
    4 4 4444 4 4 4 4 4 4· 4 4 4 4
    444 444 4 4
    44 4 44444 44 44
  91. 91. Polynukleotid podle nároku 90, charakterizovaný tak, že lidský TPS/TPP obsahuje aminokyselinovou sekvenci podle SEQ ID NO:25 nebo odtud pocházející mutein.
  92. 92. Polynukleotid podle nároku 91, charakterizovaný tak, že obsahuje polynukleotidovou sekvenci SEQ ID NO:24 nebo SEQ ID NO:26 nebo SEQ ID NO:28.
  93. 93. Vektor přechovávající polynukleotid podle kteréhokoliv nároku 7992.
  94. 94. Hostitelský organismus obsahující vektor podle nároku 93.
  95. 95. Hostitelský organismus podle nároku 94, charakterizovaný tak, to je Agrobacterium tumefaciens.
  96. 96. Buňka transformovaná hostitelským organismem podle nároku 94 nebo 95.
  97. 97. Buňka podle nároku 96, charakterizovaná tak, že to je rostlinná buňka.
  98. 98. Rostlina nebo část rostliny, regenerovaná z rostlinné buňky podle nároku 97.
CZ19983450A 1996-05-03 1997-05-02 Regulace metabolismu modifikací hladiny trehalosa-6-fosfátu CZ345098A3 (cs)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP96201225 1996-05-03
EP96202128 1996-07-26
EP96202395 1996-08-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ345098A3 true CZ345098A3 (cs) 2000-01-12

Family

ID=27237548

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19983450A CZ345098A3 (cs) 1996-05-03 1997-05-02 Regulace metabolismu modifikací hladiny trehalosa-6-fosfátu

Country Status (24)

Country Link
US (4) US6833490B1 (cs)
EP (1) EP0901527B1 (cs)
JP (1) JP2000510691A (cs)
KR (1) KR20000010758A (cs)
CN (1) CN1267558C (cs)
AR (1) AR006937A1 (cs)
AT (1) ATE301718T1 (cs)
AU (2) AU718379B2 (cs)
BR (1) BR9710959A (cs)
CA (1) CA2253348C (cs)
CZ (1) CZ345098A3 (cs)
DE (1) DE69733945T2 (cs)
DK (1) DK0901527T3 (cs)
ES (1) ES2243997T3 (cs)
IL (1) IL126781A0 (cs)
IN (1) IN1997CH00924A (cs)
MA (1) MA24248A1 (cs)
MX (1) MX9809128A (cs)
NO (1) NO985097L (cs)
NZ (1) NZ332677A (cs)
PL (1) PL329913A1 (cs)
SK (1) SK148498A3 (cs)
TR (4) TR199902037T2 (cs)
WO (1) WO1997042326A2 (cs)

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5854067A (en) * 1996-01-19 1998-12-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Hexokinase inhibitors
US5891717A (en) * 1996-01-19 1999-04-06 Betagene, Inc. Methods and compositions for inhibiting hexokinase
IN1997CH00924A (en) * 1996-05-03 2005-03-04 Syngenta Mogen Bv Regulating metabolism by modifying the level of trehalose-6-phosphate
MX205414B (es) * 1996-05-08 2001-12-07 Univ Mexico Nacional Autonoma Metodo para incrementar de trehalosa de los organismos por medio de su transformacion con el adnc de la trehalosa-6-fosfato sintasa/fosfatasa de selaginella lepidophylla.
JP2001523110A (ja) * 1997-05-02 2001-11-20 モーヘン インターナショナル エヌ．ブイ． 内在性トレハラーゼレベルの阻害によるトレハロース−６−リン酸のレベルの改変による代謝の調節
ZA989782B (en) 1997-10-30 1999-05-04 Mogen Int Pre-and postharvest inhibition of remobilisation of storage compounds
ZA989886B (en) * 1997-10-30 1999-04-30 Mogen Int Nuclear male sterile plants method of producing same and methods to restore fertility
WO1999024558A2 (en) * 1997-10-30 1999-05-20 Mogen International N.V. Novel high-fermenting microorganisms
WO1999023225A1 (en) * 1997-10-30 1999-05-14 Mogen International N.V. Novel high-fermenting microorganisms
DE19832334A1 (de) * 1998-07-17 2000-01-20 Norika Nordring Kartoffelzucht Glucosylglycerolphosphatsynthasegene zur Erzeugung der niedermolekularen Schutzsubstanz Glucosylglycerol und ihre Verwendung
EP1002867A1 (en) 1998-10-15 2000-05-24 K.U. Leuven Research & Development Specific genetic modification of the activity of trehalose-6-phosphate synthase and expression in a homologous or heterologous environment
US7612255B2 (en) * 1999-02-03 2009-11-03 Jonathan Gressel Transgenic plants for mitigating introgression of genetically engineered genetic traits
ES2241644T3 (es) 1999-09-01 2005-11-01 Monsanto Technology Llc Secuencias reguladoras para el control selectivo de la expresion de genes en plantas.
EA200200932A1 (ru) * 2000-03-01 2003-02-27 Рисерч Энд Дивелопмент Инститьют, Инк. Трансгенные растения с повышенными урожайностью семян, биомассой и индексом урожайности
GB0100105D0 (en) * 2001-01-04 2001-02-14 Leuven K U Res & Dev The use of plant TPS (Trehalose-6-phosphate syntase) as a selectable marker for plant transformation
PT1373488E (pt) 2001-03-14 2009-07-31 Univ Florida Mutantes termoestáveis de enzimas de biossíntese de amido
US8022272B2 (en) 2001-07-13 2011-09-20 Sungene Gmbh & Co. Kgaa Expression cassettes for transgenic expression of nucleic acids
CA2468727A1 (en) 2001-12-03 2003-06-12 University Of Florida Research Foundation, Inc. Variants of adp-glucose pyrophosphorylase affecting phosphate sensitivity and other parameters
KR100440725B1 (ko) * 2002-06-20 2004-07-15 주식회사 그린진 바이오텍 비생물성 스트레스에 대한 단자엽 식물의 내성을증가시키는 방법
WO2004044143A2 (en) * 2002-11-06 2004-05-27 Cornell Research Foundation, Inc. Tps plant gene constructs and transformants
WO2005016268A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-24 Mitochroma Research, Inc. Alimentary compositions and methods for metabolic modulation
CN101023175B (zh) * 2004-04-20 2012-02-29 辛根塔参与股份公司 用于在植物繁殖组织中表达基因产物的调控序列
EP1645633B1 (en) 2004-10-05 2011-09-21 SunGene GmbH Constitutive expression cassettes for regulation of plant expression
EP1655364A3 (en) 2004-11-05 2006-08-02 BASF Plant Science GmbH Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
EP1662000B1 (en) 2004-11-25 2011-03-30 SunGene GmbH Expression cassettes for guard cell-preferential expression in plants
CN101115385A (zh) * 2004-12-03 2008-01-30 先正达参股股份有限公司 植物通过选择性抑制海藻糖-6-磷酸磷酸酶的胁迫耐性
EP1666599A3 (en) 2004-12-04 2006-07-12 SunGene GmbH Expression cassettes for mesophyll- and/or epidermis-preferential expression in plants
EP1669455B1 (en) 2004-12-08 2009-10-28 SunGene GmbH Expression cassettes for vascular tissue-preferential expression in plants
CN100355883C (zh) * 2004-12-10 2007-12-19 中国科学院上海生命科学研究院 水稻抗逆相关基因－海藻糖－6－磷酸磷酸化酶基因及其应用
EP1669456A3 (en) 2004-12-11 2006-07-12 SunGene GmbH Expression cassettes for meristem-preferential expression in plants
AU2006203837B2 (en) 2005-01-07 2011-03-10 Cold Spring Harbor Laboratory Nucleotide sequences encoding Ramosa3 and sister of Ramosa3 and methods of use for same
EP2184361A3 (en) 2005-02-09 2010-07-14 BASF Plant Science GmbH Expression cassettes for regulation of expression in monocotyledonous plants
CA2598307C (en) 2005-02-26 2014-12-30 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
CN101137752B (zh) 2005-03-08 2013-04-03 巴斯福植物科学有限公司 增强表达的内含子序列
EP1874938B1 (en) 2005-04-19 2012-04-04 BASF Plant Science GmbH Starchy-endosperm and/or germinating embryo-specific expression in mono-cotyledonous plants
US9085774B2 (en) 2005-04-19 2015-07-21 Basf Plant Science Gmbh Methods controlling gene expression
US7790873B2 (en) 2005-05-10 2010-09-07 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
EP2522722A3 (en) * 2005-12-09 2012-12-12 BASF Plant Science GmbH Nucleic acid molecules encoding polypeptides involved in regulation of sugar and lipid metabolism and methods of use VIII
US8160670B2 (en) 2005-12-28 2012-04-17 Abbott Diabetes Care Inc. Analyte monitoring: stabilizer for subcutaneous glucose sensor with incorporated antiglycolytic agent
US8515518B2 (en) * 2005-12-28 2013-08-20 Abbott Diabetes Care Inc. Analyte monitoring
CN101374952B (zh) * 2006-01-27 2011-07-06 福拉姆斯大学生物技术研究所 海藻糖-6-磷酸合酶调节植物生长的用途
BRPI0707297A2 (pt) 2006-01-27 2011-05-03 Vib Vzw E K U Leuven Uso de uma trehalose-6-fosfato sintase de classe ii vengetal
WO2007141790A2 (en) 2006-06-07 2007-12-13 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Plant expression constructs and methods of utilizing same
EP1873247A1 (en) * 2006-06-29 2008-01-02 VIB vzw Novel bifunctional trehalose synthase
WO2008071767A1 (en) * 2006-12-15 2008-06-19 Cropdesign N.V. Plants having enhanced seed yield-related traits and a method for making the same
BRPI0720084A2 (pt) * 2006-12-15 2014-01-21 Cropdesign Nv Métodos para rendimento de semente aumentado em plantas em relação às plantas de controle, e para a produção de uma planta transgênica, planta, parte da planta ou célula da planta, molécula de ácido nucleico isolada, polipeptídeo isolado, construção, usos de uma construção e de um ácido nucleico, partes colhíveis de uma planta, e, produtos
MX2009007565A (es) * 2007-02-08 2009-07-22 Basf Plant Science Gmbh Uso de genes de trehalasa para proporcionar a las plantas resistencia contra nematodos.
CA2675926A1 (en) 2007-02-16 2008-08-21 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid sequences for regulation of embryo-specific expression in monocotyledonous plants
EP2238231B1 (en) 2008-01-03 2016-03-23 Proterro, Inc. Transgenic photosynthetic microorganisms and photobioreactor
US8367392B2 (en) 2008-09-05 2013-02-05 Transalgae Ltd. Genetic transformation of algal and cyanobacteria cells by microporation
NZ591777A (en) 2008-09-15 2012-12-21 Agriculture Victoria Serv Pty Modification of fructan biosynthesis, increasing plant biomass, and enhancing productivity of biochemical pathways in a plant
US20100257639A1 (en) * 2009-02-26 2010-10-07 Robert Edward Bruccoleri Methods and compositions for altering sugar beet or root crop storage tissue
SG177412A1 (en) 2009-06-30 2012-02-28 Yissum Res Dev Co Introducing dna into plant cells
CN102471777B (zh) 2009-07-10 2014-09-24 巴斯夫植物科学有限公司 用于在植物中胚乳-特异性表达的表达盒
EP2507375A4 (en) 2009-12-03 2013-04-24 Basf Plant Science Co Gmbh EXPRESSION CASSETTES FOR EMBRYOSPECIFIC EXPRESSION IN PLANTS
CN102191228A (zh) * 2010-03-12 2011-09-21 北京北方杰士生物科技有限责任公司 来自大肠杆菌合成海藻糖的融合蛋白及其在培育矮化草坪草中的应用
EP2676143B1 (en) 2011-02-15 2023-11-01 Hemosonics, Llc Characterization of blood hemostasis and oxygen transport parameters
PT2701514E (pt) * 2011-04-26 2015-09-25 Isis Innovation Modificação dos níveis de trealose-6-fosfato em plantas
US10420822B2 (en) 2011-06-13 2019-09-24 Ziolase, Llc Compositions and methods to prevent and treat biofilms
US20120315260A1 (en) * 2011-06-13 2012-12-13 Svetlana A. Ivanova Compositions and Methods to Prevent and Treat Biofilms
CA2841782A1 (en) * 2011-07-15 2013-01-24 Syngenta Participations Ag Methods of increasing yield and stress tolerance in a plant
KR20140067124A (ko) * 2011-09-13 2014-06-03 스톨러 엔터프라이지즈, 인크. 트레할로스의 적용에 의한 작물 수량의 향상 방법
HUP1400505A2 (en) 2011-11-03 2015-03-02 Syngenta Participations Ag Polynucleotides, polypeptides and methods for enhancing photossimilation in plants
US20150040268A1 (en) 2013-04-25 2015-02-05 Morflora Israel Ltd Methods and compositions for the delivery of nucleic acids to seeds
GB201511732D0 (en) 2015-07-03 2015-08-19 Rothamsted Res Ltd Treating water stress in plants
IL304057A (en) 2016-03-16 2023-08-01 Spogen Biotech Inc Methods for promoting plant health using free enzymes and microorganisms that cause overexpression of enzymes
TW201819627A (zh) * 2016-11-28 2018-06-01 德商Ｃ 樂克塔股份有限公司 海藻糖磷酸化酶
GB201621193D0 (en) 2016-12-13 2017-01-25 Rothamsted Res Ltd Induction of floral development in plants
CA3049172A1 (en) * 2016-12-21 2018-06-28 Institute Of Crop Sciences, The Chinese Academy Of Agricultural Sciences Plant grain trait-related protein, gene, promoter and snps and haplotypes
CA3078280A1 (en) 2017-10-05 2019-04-11 Biogemma Improved yield in plants by overexpressing a trehalose-6 phosphate synthase
CN111567338B (zh) * 2020-05-25 2021-07-06 华东师范大学 一种提高玉米高温胁迫下光合碳同化能力的方法
CN114868760B (zh) * 2022-05-13 2024-01-16 辽宁省农业科学院 6-磷酸-海藻糖的应用及提升普通菜豆产量和抗病性的培育方法

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU644619B2 (en) 1989-12-21 1993-12-16 Advanced Technologies (Cambridge) Limited Modification of plant metabolism
DE4004800C2 (de) * 1990-02-13 2000-12-21 Aventis Cropscience Gmbh Im Habitus und Ertrag veränderte transgene Pflanzen
DE69116413T2 (de) 1990-03-28 1996-05-30 Gist Brocades Nv Neue Hefestämme mit erhöhtem Trehalosegehalt, Verfahren zur Gewinnung solcher Hefen und Verwendung dieser Hefen
GB9117159D0 (en) 1991-08-08 1991-09-25 Cambridge Advanced Tech Modification of sucrose accumulation
FI943133A0 (fi) * 1994-06-29 1994-06-29 Alko Ab Oy Transgena vaexter
US5422254A (en) * 1992-02-14 1995-06-06 Oy Alko Ab Method to increase the trehalose content of organisms by transforming them with the structural genes for the short and long chains of yeast trehalose synthase
US6130368A (en) * 1992-02-14 2000-10-10 Btg International Ltd Transgenic plants producing trehalose
US6133034A (en) * 1992-05-27 2000-10-17 Calgene, Inc. Methods and compositions related to the production of trehalose
EP0577915A1 (fr) * 1992-07-09 1994-01-12 N.V. Algist-Bruggeman Souches de levures transformées de manière à posséder une résistance au stress et/ou un pouvoir fermentatif amélioré
DE69434173T2 (de) 1993-06-30 2005-05-19 Syngenta Mogen B.V. Herstellung von trehalose in pflanzen
EP0748381A1 (en) 1994-03-09 1996-12-18 Hoechst Schering AgrEvo GmbH Processes for inhibiting and for inducing flower formation in plants
DE4444460A1 (de) 1994-11-29 1996-05-30 Inst Genbiologische Forschung Verfahren zur Steigerung des Ertrags sowie zur Veränderung des Blühverhaltens bei Pflanzen
IL116564A0 (en) 1995-01-04 1996-03-31 Mogen Int Process for producing trehalose in plants
EP0784095A3 (en) 1996-01-12 1997-12-29 Mogen International N.V. Enhanced accummulation of trehalose in plants
US5854067A (en) 1996-01-19 1998-12-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Hexokinase inhibitors
IN1997CH00924A (en) * 1996-05-03 2005-03-04 Syngenta Mogen Bv Regulating metabolism by modifying the level of trehalose-6-phosphate
MX205414B (es) * 1996-05-08 2001-12-07 Univ Mexico Nacional Autonoma Metodo para incrementar de trehalosa de los organismos por medio de su transformacion con el adnc de la trehalosa-6-fosfato sintasa/fosfatasa de selaginella lepidophylla.

Also Published As

Publication number Publication date
IL126781A0 (en) 1999-08-17
WO1997042326A3 (en) 1998-03-12
SK148498A3 (en) 2000-05-16
US8124840B2 (en) 2012-02-28
MA24248A1 (fr) 1998-04-01
US6833490B1 (en) 2004-12-21
PL329913A1 (en) 1999-04-26
TR199902037T2 (xx) 2000-10-23
TR199802220T2 (xx) 1999-03-22
US20040093641A1 (en) 2004-05-13
TR199902036T2 (xx) 1999-10-21
CN1267558C (zh) 2006-08-02
DE69733945D1 (de) 2005-09-15
IN1997CH00924A (en) 2005-03-04
EP0901527A2 (en) 1999-03-17
AU4514800A (en) 2000-09-14
US20080138903A1 (en) 2008-06-12
CA2253348A1 (en) 1997-11-13
AR006937A1 (es) 1999-09-29
CA2253348C (en) 2009-07-21
EP0901527B1 (en) 2005-08-10
KR20000010758A (ko) 2000-02-25
US7247770B2 (en) 2007-07-24
ES2243997T3 (es) 2005-12-01
AU718379B2 (en) 2000-04-13
JP2000510691A (ja) 2000-08-22
DE69733945T2 (de) 2006-04-13
NZ332677A (en) 2001-04-27
US20130191944A1 (en) 2013-07-25
NO985097L (no) 1998-12-30
DK0901527T3 (da) 2005-12-19
AU2898897A (en) 1997-11-26
TR199902035T2 (xx) 1999-10-21
WO1997042326A2 (en) 1997-11-13
NO985097D0 (no) 1998-11-02
BR9710959A (pt) 2004-06-15
CN1221454A (zh) 1999-06-30
ATE301718T1 (de) 2005-08-15
MX9809128A (es) 1999-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ345098A3 (cs) Regulace metabolismu modifikací hladiny trehalosa-6-fosfátu
AU738098B2 (en) Regulating metabolism by modifying the level of trehalose-6-phosphate by inhibiting endogenous trehalase levels
JPH10501978A (ja) トレハロース産生トランスジェニック植物
JP2001000192A (ja) ヒマワリファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子を有する植物ベクターとその製造方法
US8889949B2 (en) Method for increasing resistance of monocot plants against abiotic stresses, TPSP fusion enzyme gene constructs, and transformants
AU727509B2 (en) Method for increasing the trehalose content in organisms by means of their transformation with the cDNA of trehalose- 6-phosphate synthase/phosphatase from selaginella lepidophylla
PL179629B1 (pl) mogacy podlegac ekspresji w roslinie, wektor do klonowania, mikroorganizm zawierajacy taki wektor, sposób otrzymywania rosliny lub komórki roslinnej, zrekombinowany roslinny genomowy DNA, komórka roslinna, kultura komórek roslinnych, sposób konserwowania rosliny lub czesci rosliny,sposób wytwarzania trehalozy i wyizolowana sekwencja DNA kodujaca aktywnosc syntazy trehalozofosforanowej PL PL PL PL PL PL PL PL
WO2012085806A1 (en) Methods to obtain drought resistant plants
US6130368A (en) Transgenic plants producing trehalose
EP0748381A1 (en) Processes for inhibiting and for inducing flower formation in plants
KR100468307B1 (ko) 트레할로스를생성하는유전자도입식물
US20040123350A1 (en) A method for increasing an abiotic-resistance in monocot plant
AU4892100A (en) Enhanced accumulation of trehalose in plants
MXPA97000296A (en) Increased accumulation of trehalosa in plan
MX2010014428A (es) Metodo para la seleccion positiva de celulas vegetales geneticamente transformadas de maiz y otras especies.

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic