KR20000010758A - 트레할로스-6-포스페이트 수준의 변경에 의한 대사 조절 - Google Patents

트레할로스-6-포스페이트 수준의 변경에 의한 대사 조절

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KR20000010758A
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오스카 요하네스 마리아 고디엔
얀 펜
요세퍼스 크리스티아너스 마리아 스미켄스
마리아 테레시아 스미츠
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레오 지오르트 멜처스
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Abstract

본 발명은 세포 대사에서 탄소 흐름의 조절 분야에 관한 것이다. 세포내 사카라이드 트레할로스-6-포스페이트 (T-6-P)의 이용성에서의 변화를 유도하면 생체내 세포, 조직 및 기관의 발생 및(또는) 조성의 변경이 유도된다는 것을 발견하였다. 이러한 변화는 T-6-P를 형성할 수 있는 효소인 트레할로스 포스페이트 신타제 (TPS) 및 T-6-P를 트레할로스로 분해하는 트레할로스 포스페이트 포스파타제 (TPP)를 도입하거나 억제함으로써 유도될 수 있다. 해당 작용을 통한 탄소의 흐름은 T-6-P의 세포내 수준의 감소에 의하여 촉진된다.

Description

트레할로스-6-포스페이트 수준의 변경에 의한 대사 조절
해당작용은 문헌에 생화학적으로 자세하게 설명되는 최초의 대사 과정 중 하나이다. 생물체에서의 탄수화물의 일반적인 흐름은 알려져 있으며, 해당작용 경로의 모든 효소가 밝혀져 있지만 해당작용을 촉진함으로써 물질대사의 유도를 결정하는 시그날은 아직 해명되지 않았다. 여러 가설, 특히 효모를 근거로 한 가설이 제안되었지만, 아직까지 확증되지 못하였다.
탄수화물 분배 방향에 대한 영향은 세포내 해당작용 과정 및 탄수화물 저장에 직접 영향을 미칠뿐만 아니라 세포 분열, 바이오매스 생성 및 저장 화합물의 축적과 같은 2차 또는 유도 과정에 영향을 미쳐 성장 및 증식을 결정하는데 사용될 수 있다.
특히, 식물체에서 때때로 탄수화물의 존재에 의하여 조직의 성질이 직접 영향을 받고, 탄수화물의 분배의 조정은 실질적인 차이를 일으킨다.
식물의 성장, 발생 및 수율은 식물이 광합성 동안 CO2고정으로부터 유도할 수 있는 에너지에 의존한다.
광합성은 주로 잎에서 일어나고, 줄기에서도 적은 양으로 일어나는 반면, 뿌리, 종자 또는 괴경과 같은 다른 식물 기관은 광동화 과정에 기본적으로 기여하지 않는다. 이들 조직들은 완전히 그들의 성장 및 영양에 대하여 광합성적으로 활성인 기관들에 의존한다. 이것은 광합성으로부터 유도된 생성물 (총괄하여 광합성 산물)이 광합성적으로 불활성인 식물의 부분으로 유동된다는 것을 의미한다.
광합성적으로 활성인 부분을 "공급원"으로 명명하고, 이들을 광합성 산물의 순 공급자라고 정의한다. 광합성적으로 불활성인 부분을 "싱크(sink)"로 명명하고, 이들을 광합성 산물의 순 수요자라고 정의한다.
식물에서의 광합성의 효율뿐만 아니라 탄수화물의 분배 모두는 필수적인 것으로 생각된다. 어린 잎과 같은 새롭게 발생하는 조직 또는 뿌리 및 종자와 같은 다른 부분은 완전히 공급원에서의 광합성에 의존한다. 탄수화물 분배의 영향의 가능성은 식물의 표현형, 예를 들면, 그 높이, 마디간 거리, 크기 및 형태, 및 뿌리 시스템의 크기 및 구조에 커다란 영향을 미친다.
더욱이, 광동화 산물의 분포는 식물 바이오매스 및 생성물의 수율에 매우 중요하다. 예를 들면, 밀에서의 지난 세기의 개선이 있다. 그의 광합성 용량은 크게 변하지 않았지만, 밀 곡식의 수율은 실질적으로 크게 증가하였다. 즉, 수확 지수 (수확가능한 바이오매스/총 바이오매스의 비율)가 증가하였다. 이러한 이유는 싱크-대-공급원 비율이 수확가능한 싱크 (예를 들면, 종자) 부분이 증가하도록하는 종래의 재배에 의해 변경되었기 때문이다. 그러나, 동화 산물의 분포 및 그에 따른 싱크 및 공급원 형성을 조절하는 기작은 아직까지 알려져 있지 않다. 이러한 기작은 탄수화물 대사 경로 및 그 조절에 어느 정도 관련된다고 생각된다. 최근의 연구에서, 헥소키나제가 대사산물의 시그날링 및 대사 흐름의 조절에 중요한 역할을 할 수 있다는 것이 분명해지고 있다. 헥소키나제 활성의 조절을 위하여 많은 기작이 가정되어 있다 (Graham et al. (1994), The Plant Cell 6: 761; Jang & Sheen (1994), The Plant Cell 6, 1665; Rose et. al. Eur. J. Biochem. 199, 511-518, 1991; Blazquez et al. (1993), FEBS 329, 51; Koch, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. (1996) 47, 509; Jang et al, (1997), The Plant Cell 9, 5). 효모에서 가정된 헥소키나제 조절에 대한 이러한 가설 중 하나는 트레할로스 및 그 관련 모노사카라이드를 언급하고 있다 (Thevelein & Hohmann (1995), TIBS 20, 3). 그러나, 트레할로스 합성은 특정의 종에 제한되는 것으로 생각되기 때문에 이것을 보편적인 기작으로 보기는 어렵다.
따라서, 생체내에서의 세포, 조직 및 기관의 발생 및 조성의 변형을 지배할 수 있는 시그날을 해명할 필요가 여전히 남아있다.
발명의 요약
생체 내에서의 세포, 조직 및 기관의 발생 및 조성의 변형은 트레할로스-6-포스페이트 신타제 (TPS) 및(또는) 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제 (TPP)를 도입하여 사카라이드 트레할로스-6-포스페이트 (T-6-P)의 대사 경로의 변경을 유도하여 T-6-P의 세포내 이용성을 변경함으로써 가능하다는 것을 발견하였다. TPS를 도입함으로써 T-6-P의 세포내 농도의 증가를 유도하면 해당작용 방향의 탄소의 흐름의 억제, 광합성의 촉진, 성장의 억제, 싱크 관련 활성의 촉진 및 원료 저장이 증가된다. TPP를 도입함으로써 세포내 T-6-P 농도의 감소를 유도하면 해당작용 방향의 탄소 흐름의 촉진, 바이오매스의 증가 및 광합성 활성의 감소가 초래된다. T-6-P의 수준은 T-6-P의 수준에 영향을 미칠 수 있는 유전자 구축물을 사용하는 생물체의 유전공학에 의하여, 또는 이 수준에 영향을 미칠 수 있는 화합물을 외부에서 (경구, 국소, 비경구 등) 공급함으로써 영향받을 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 유전자 구축물은 글루코스-6-포스페이트 및 UDP-글루코스로부터 T-6-P로의 반응을 촉매할 수 있는 효소인 트레할로스 포스페이트 신타제 (TPS)의 유전자를 함유하는 구축물이다. 다른 한편, T-6-P로부터 트레할로스로의 반응을 촉매하는 효소인 트레할로스 포스페이트 포스파타제 (TPP)를 코딩하는 구축물은 발현시 T-6-P의 양을 감소시킨다.
이외에, 안티센스 TPS 또는 TPP를 함유하는 유전자 구축물은 세포내 T-6-P의 이용성을 조절하는 데 사용될 수 있다.
더욱이, 바실러스 섭틸러스 (Bacillus subtilis)기원의 세포내 포스포-알파-(1,1)-글리코시다제, TreA는 T-6-P를 글루코스 및 글루코스-6-포스페이트로 가수분해할 수 있다는 것이 최근에 보고되었다 (Scheock et al., Gene, 170, 77-80, 1996). 유사한 효소가 이미 이. 콜리에 대해서도 설명되어 있다 (Rimmele and Boos (1996), J. Bact. 176 (18), 5654-).
과다표현의 경우에, 이종 또는 동종의 유전자 구축물이 사용된다. 내생 T-6-P 형성 및(또는) 분해 효소는 알로스테릭 (allosteric)한 조절 및 공유 개질을 통한 조절하에 있다. 이러한 조절은 이종 유전자를 사용함으로써 회피할 수 있다.
이외에, 이종 또는 동종의 유전자의 돌연변이가 이 조절을 폐지하는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 식물에서의 공급원-싱크 관련 및 원료 배급을 변형할 수 있는 능력을 제공한다. 공급원 조직에서의 동화물 생성 및 공급원 조직에서의 이용을 포함하는 식물의 전체 탄소 효율은 변경될 수 있으며, 이것은 수확 산물에서의 바이오매스 수율의 증가를 초래할 수 있다. 이러한 접근법을 사용하여, 수율 잠재력의 증가가 실현될 수 있을 뿐만 아니라 수확 지수 및 수확물 품질을 개선할 수 있다. 공급원 조직에서의 이들 변화는 예를 들면 광합성 효소의 공급을 증가함으로써 싱크 조직에서의 변화를 이끌어낼 수 있다. 역으로, 싱크 조직에서의 변화는 공급원 조직에서의 변화를 초래할 수 있다.
생물체의 세포 소기관, 조직 또는 다른 부분에서의 특이 발현은 특정한 국소 용도에 대하여 상기 언급했던 일반적인 효과를 가능하게 한다. 이러한 특이 발현은 TPS, TPP를 코딩하는 유전자 또는 TPS 또는 TPP의 안티센스 유전자를 특정한 프로모터 하에 둠으로써 달성될 수 있다. 또한, 특이 발현은 상이한 조직에서 TPS 및 TPP 효소 모두의 동시 발현을 가능하게 하여 T-6-P의 수준을 증가시키고, 국소적으로 T-6-P의 수준을 감소시킬 수 있다.
특정한 프로모터를 사용함으로써, 일시적인 차이를 구축하는 것도 가능하다. 이러한 목적의 경우, 식물 부분의 기관형성의 특정 기간 동안 특이적으로 활성인 프로모터를 사용할 수 있다. 이러한 방법으로 먼저 발생할 기관의 양에 영향을 주고, 그 후 이들 기관을 전분, 오일 또는 단백질과 같은 저장 물질로 채울 수 있다.
이외에, 유도성 프로모터가 본 발명의 유전자 발현을 개시 또는 정지하기 위하여 사용될 수 있다. 유도는 예를 들면, 병원균, 스트레스, 화학물질 또는 명/암 자극에 의하여 달성될 수 있다.
<정의>
- 헥소키나제 활성은 헥소스의 헥소스-6-포스페이트로의 반응을 촉매하는 세포내에서 발견되는 효소 활성이다. 헥소스는 글루코스, 프럭토스, 갈락토스 또는 임의의 다른 C6-당을 포함한다. 상기 생화학 반응에 작용할 수 있는 많은 이소자임이 존재한다. 이러한 반응을 촉매함으로써 헥소키나제는 헥소스 (글루코스) 시그날링에 있어서 핵심 효소를 형성한다.
- 헥소스 시그날링은 세포가 헥소스 (글루코스) 이용성을 감지하는 것에 의한 조절 기작이다.
- 해당작용은 글루코스를 ATP의 생성과 함께 피루베이트로 전환시키는 일련의 반응이다.
- 저온 감미는 수확 후 저온에서 보관시 가용성 당이 감자 괴경에 축적되는 것이다.
- 원료 물질의 저장은 기본 산물인 글루코스가 세포내 또는 분화된 조직에서의 저장에 적합한 분자 형태로 대사되는 과정이다. 이들 형태는 다양할 수 있다. 식물계에서 저장은 주로 탄수화물 및 전분, 프럭탄 및 셀룰로스와 같은 폴리카르보하이드레이트 또는 더욱 단순한 모노- 및 디-사카라이드 등의 프럭토스, 수크로스 및 말토스의 형태; 아라키산 또는 올레산 오일과 같은 오일의 형태로 및 쿠르시페린, 나핀 및 평지씨에서의 종자 저장 단백질과 같은 단백질의 형태로 일어난다. 또한, 동물 세포에서 글리코겐과 같은 중합성 탄수화물이 또한 형성될 수 있으며, 에너지가 풍부한 다량의 탄소 화합물이 지방 및 지질로 전환된다.
- 바이오매스는 생물학적 물질의 총 매스이다.
도 1은 선택 마커로서 35S 카울리플라우워 모자이크 바이러스 프로모터 (P35S) 및 터미네이터 (T35S)가 플랭크 되어 있는 네오마이신-포스포트랜스퍼라제 유전자 (NPTII); 완두 플라스토시아닌 프로모터 (pPCpea) 및 노팔린 신타제 터미네이터 (Tnos)를 포함하는 발현 카셋트; 오른쪽 (RB) 및 왼쪽 (LB) T-DNA 보더 서열 및 세균성 카나마이신 내성 (KanR) 마커 유전자를 함유하는 플라스미드 pVDH275를 나타내는 도식도이다.
도 2는 트랜스제닉 담배 식물체의 노던 블럿 분석이다. 패널 A는 각각의 pMOG799 트랜스제닉 담배 식물체의 잎에서 otsA mRNA의 발현을 나타낸다. 대조군 레인 "C"는 형질전환되지 않은 엔. 타바쿰 (N. tabacum) 식물체로부터의 총 RNA를 함유한다.
도 3은 위스콘신 GCG 서열 분석 패키지 (Devereux et al. (1984) A comprehensive set of sequence analysis program of the VAX. Nucl. Acids Res., 12, 387)을 사용하여 TPSyeast서열과 비교한 식물 유래의 TPS 코딩 서열의 구성을 나타낸다. 각각 아라비돕시스 및 벼 TPS 효소에 대한 TPSata3/56 및 142 TPSrice3 (서열 53) 및 RiceTPS 코드는 EST 데이터베이스 서열로부터 유래한다. 각각, 해바라기 및 셀라기넬라 (Selaginella) TPS 효소에 대한 TPSsun10, TPSse143 (서열 44) 및 TPSse 18 (서열 42) 코드는 PCR 기법 (참조. 실시예 3)에 의해 분리된 서열로부터 유래한다.
도 4는 TPS 코딩 효모 TPS1 유전자와 PCR 증폭된 담배 TPS cDNA 단편의 배열을 나타낸다. 박스는 4가지 목록 서열 모두의 아미노산 사이의 동일성을 나타낸다.
도 5는 TPP 코딩 효모 TPS2 유전자와 PCR 증폭된 담배 TPP cDNA 단편의 배열을 나타낸다. 박스는 4가지 목록 서열 모두의 아미노산 사이의 동일성을 나타낸다.
도 6은 TPP 코딩 효모 TPS2 유전자와 PCR 증폭된 해바라기 TPS/TPP 이성분 cDNA (서열 24) 단편의 배열을 나타낸다. 박스는 두 아미노산 사이의 동일성을 나타낸다.
도 7은 TPS 코딩 효모 TPS1 유전자와 아라비돕시스 TPS1 및 벼 EST 클론의 단편의 배열을 나타낸다. 박스는 3가지 서열 모두의 아미노산 사이의 동일성을 나타낸다.
도 8은 TPS 코딩 효모 TPS1 유전자와 PCR 증폭된 인간 TPS cDNA 단편 (서열 10)의 배열을 나타낸다. 박스는 두 서열의 아미노산 사이의 동일성을 나타낸다.
도 9는 pMOG1027 (35S as-트레할라제) 트랜스제닉 감자 식물체 괴경에서의 트레할로스 축적을 나타낸다.
도 10은 트레할로스-6-포스페이트가 첨가 및 첨가되지 않은 야생형 감자 괴경 (Solanum tuberosum cv. Kardl) 추출물에서의 헥소키나제 활성을 나타낸다.
도 11은 트레할로스-6-포스페이트가 첨가 및 첨가되지 않은 야생형 감자 괴경 (Solanum tuberosum cv. Kardl) 추출물에서의 헥소키나제 활성을 나타낸다. 분석용 기질로서 프럭토스 또는 글루코스가 사용되었다.
도 12는 트레할로스-6-포스페이트가 첨가 및 첨가되지 않은 야생형 담배 잎 (Nicotiana tabacum cv. SR1) 추출물에서의 헥소키나제 활성을 나타낸다. 분석용 기질로서 프럭토스 또는 글루코스가 사용되었다.
도 13은 담배 헥소키나제 활성도 측정의 플롯을 나타낸다.
데이터 시리즈 1: 담배 식물체 추출물
데이터 시리즈 2: 담배 식물체 추출물 + 1 mM 트레할로스-6-포스페이트
데이터 시리즈 3: 시판되는 효모로 부터의 헥소키나제 추출물 (1/8 단위)
도 14는 트레할로스-6-포스페이트가 첨가 및 첨가되지 않은 야생형 벼 잎 (Oryza sativa) 추출물에서의 헥소키나제 활성을 나타낸다. 실험은 상이한 양의 추출물을 사용하여 중복 수행되었다. 분석용 기질로서 프럭토스 또는 글루코스가 사용되었다.
도 15는 트레할로스-6-포스페이트가 첨가 및 첨가되지 않은 야생형 옥수수 잎 (Zea mais) 추출물의 헥소키나제 활성을 나타낸다. 분석용 기질로서 프럭토스 또는 글루코스가 사용되었다.
도 16은 야생형 (삼각형), PC-TPS (사각형) 및 35S-TPP (X) 담배 잎의 형광 특성을 나타낸다. 상부의 두 패널은 지시된 광강도 (PAR)에서 전자수송능 (ETE)을 나타낸다. 식물체를 암기 (상부 왼쪽 패널) 및 명기 (상부 오른쪽 패널) 후에 측정하였다. 하부 패널은 동화물 축적 (비광화학 켄칭)에 의한 형광의 감소를 나타낸다. 왼쪽 및 오른쪽 패널은 상기와 같다.
도 17은 PC-TPS (결핍) 및 35S-TPP (풍부)의 트랜스제닉 담배 식물체의 식물 부분의 상대 싱크 활성도를 나타낸다. 명 (D) 또는 명 + 암 (D + N)의 기간 후에 여러 식물체 부분에 대하여 총 C-함량의 백분율로 나타낸 순 C-축적을 가리킨다.
도 18은 PC-TPS (결핍) 및 35S-TPP (풍부)의 트랜스제닉 담배 식물체의 식물 부분에서의 실제 탄소 분포를 나타낸다. 명 (D) 또는 명 + 암 (D + N)의 기간 후에 여러 식물체 부분에 대하여 총 일일 축적된 새로운 C의 백분율로 나타낸 순 C-축적을 가리킨다.
도 19는 야생형 식물체에 비교하여 PC-TPS 또는 PC-TPP를 발현하는 트랜스제닉 상추 주에서의 감소된 및 강화된 추대 (bolting)를 나타낸다. 하부 패널은 잎 형태 및 색상을 나타낸다.
도 20은 트랜스제닉 상추 (상부 패널) 및 트랜스제닉 사탕무 (하부 패널) 주의 추출물에서의 가용성 당의 프로파일을 나타낸다 (도 20/1). 상부 패널에서, 대조군은 PC-TPS 및 PC-TPP에 대한 트랜스제닉 주에 비교되는 GUS-트랜스제닉 주이다. 하부 패널에서, 모든 트랜스제닉은 PC-TPS이다. 전분 프로파일은 도 20/2로 나타낸다.
도 21은 야생형 식물체에 비교하여 PC-TPS (TPS) 또는 PC-TPP (TPP)를 발현하는 트랜스제닉 사탕무 주의 식물 및 잎의 형태를 나타낸다. TPS-A형은 야생형에 필적하며, TPS D-형은 분명히 작은 잎을 가진다. TPP 트랜스제닉 주의 잎은 더 엷은 녹색을 띠며, 대조군에 비교하여 더 큰 잎꼭지 및 증가된 크기를 갖는다.
도 22는 트랜스제닉 사탕무의 주근의 직경을 나타낸다 (PC-TPS). 상부 패널에서, A, B, C 및 D는 대조군 (A)에 비교할 때 잎 크기가 감소하는 것을 나타낸다. 하부 패널에서, 대조군 및 PC-TPS 주 286-2의 클론을 나타낸다.
도 23은 pMOG799 (35S TPS) 트랜스제닉 감자 주의 괴경 수율을 나타낸다.
도 24는 pMOG1010 (35S TPP) 및 pMOG1124 (PC-TPP) 트랜스제닉 감자 주의 괴경 수율을 나타낸다.
도 25는 22개의 독립적인 야생형 에스. 튜버로섬 (S. tuberosum) 클론의 괴경 수율을 나타낸다.
도 26은 야생형에 비교하여 pMOG1093 (PC-TPS) 트랜스제닉 감자 주의 괴경 수율을 나타낸다. B, C, D, E, F, G 는 야생형 (B/C)에 비교할 때 잎 크기의 감소를 나타낸다.
도 27은 야생형 (도 27-2)에 비교하여 pMOG845 (Pat-TPS) 트랜스제닉 감자 (도 27-1)의 괴경 수율을 나타낸다. B, C는 잎의 크기를 나타낸다.
도 28은 pMOG1129 (845-11/22/28) 트랜스제닉 감자 주의 괴경 수율을 나타낸다.
도 29는 TPP (하부 패널) 및 TPS (상부 패널) 트랜스제닉 담배 식물체의 잎의 단면도를 나타낸다. TPS 단면에서 부가적인 세포 층 및 증가된 세포 크기를 확인할 수 있다.
도 30은 4 ℃에서 보관하기 전후에 TPS이.콜리의 괴경 트랜스제닉의 HPLC-PED 분석을 나타낸다. Kardal C, F, B, G 및 H는 비트랜스제닉 대조군이다.
도 31은 35S TPS에 대한 트랜스제닉 (상부 잎), 야생형 (중간 잎) 및 35S TPP에 대한 트랜스제닉 (하부 잎) 담배 주의 잎 형태, 색상 및 크기를 나타낸다.
도 32는 35S TPS (pMOG799), 35S TPP (pMOG1010), 야생형 (WT), PC-TPS (pMOG1177) 및 PC-TPP (pMOG1124) 트랜스제닉 담배 주의 대사 프로파일을 나타낸다. 트레할로스, 가용성 당 (도 32-1), 전분 및 클로로필 (도 32-2)을 나타낸다.
도 33은 야생형 감자 주와 비교하여 pMOG1027 (35S as-트레할라제) 및 pMOG1027 (845-11/22/28) (35S as-트레할라제 pat TPS) 의 괴경 수율을 나타낸다.
도 34는 야생형 감자 주와 비교하여 pMOG1027 (35S as-트레할라제) 및 pMOG1027 (845-11/22/28) (35S as-트레할라제 pat TPS)의 전분 함량을 나타낸다. 나타낸 모든 주의 순서는 도 33과 동일하다.
도 35는 야생형 감자 주와 비교한 pMOG1028 (pat as-트레할라제) 및 pMOG1028 (845-11/22/28) (pat as-트레할라제 pat TPS) 트랜스제닉 감자 주의 수율을 나타낸다.
도 36은 도 35에 나타낸 것처럼 야생형 감자 주에 비교되는 pMOG1092 (PC as-트레할라제) 트랜스제닉 감자 주의 수율을 나타낸다.
도 37은 도 35에 나타낸 것처럼 야생형 감자 주에 비교되는 pMOG1130 (PC as-트레할라제 PC TPS) 트랜스제닉 감자 주의 수율을 나타낸다.
본 발명은 생체 내에서의 대사가 T-6-P의 수준에 의해 변경될 수 있다는 발견에 관한 것이다. T-6-P의 세포내 농도 감소는 해당작용활성을 자극한다. 반대로, T-6-P의 농도 증가는 해당작용활성을 억제하고 광합성을 촉진할 것이다.
T-6-P 농도 변화에 의해 달성되는 상기 변경은 활성이 T-6-P에 의해 조절되는 것으로 밝혀진 헥소키나제의 시그날링 기능의 결과일 가능성이 가장 크다. 글루코스-6-포스페이트에 반응하는 헥소키나제를 통한 유량의 증가 (즉, 글루코스 양의 증가)는 식물에서의 광합성 활성을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 헥소키나제를 통한 유량의 증가는 해당을 자극할 뿐만 아니라 세포 분열 활성도 자극할 것이다.
트레할로스-6-포스페이트의 탄소 대사 조절 이론
정상 식물 세포에서, 탄수화물의 형성은 CO2가 고정되고 최종 생성물로서 수크로스와 함께 인산화된 헥소스로 환원되는 광합성 과정에서 발생한다. 일반적으로, 상기 수크로스는 세포로부터 수크로스 공급을 통하여 탄수화물을 대사를 위한 합성 재료로서 사용할 수 있거나 탄수화물을 예를 들어 전분으로서 저장할 수 있는 세포 또는 조직으로 이송된다. 이 경우에, 식물에서 광합성 능력을 갖기 때문에 탄수화물을 생성시킬 수 있는 세포는 공급원으로서 언급되고, 탄수화물을 소비 또는 저장하는 세포는 싱크로서 언급된다.
동물 및 대부분의 미생물 세포에서는 광합성이 발생하지 않고, 탄수화물은 사카라이드로부터 직접 섭취 (예를 들면, 효모 및 기타 미생물) 또는 탄수화물의 소화 (동물)에 의해 외부 공급원으로부터 공급받아야 한다. 탄수화물의 수송은 세포막을 통해 능동 수송되는 글루코스의 형태로 상기 유기체에서 발생한다.
세포 내로 유입된 후, 대사 경로의 제1 단계 중의 하나는 효소 헥소키나제에 의해 촉매되는 글루코스의 글루코스-6-포스페이트로의 인산화이다. 식물에서 헥소키나제(HXK)에 의해 인산화되는 당은 광합성에 관련된 유전자의 발현을 조절하는 것으로 입증되었다 (Jang & Sheen (1994), The Plant Cell 6, 1665). 이에 대해, HXK가 이중 기능을 갖고 유전자 발현에 대한 탄수화물 매개 조절의 중요한 센서 및 시그날 전달물질로서 작용할 수 있다는 사실이 제시되었다. 이러한 조절은 일반적으로 출발 물질, 즉 글루코스의 가용성에 대해 세포에 시그날을 보내는 것으로 생각된다. 유사한 효과가 T-6-P의 수준에 영향을 끼치는 TPS 또는 TPP의 도입에 의해 관찰된다. 또한, 시험관내 T-6-P 수준은 헥소키나제 활성에 영향을 주는 것으로 밝혀졌다. T-6-P의 수준을 증가시킴으로써 세포는 탄수화물 공급이 부족하다는 시그날을 감지한다. 반대로, T-6-P 수준의 감소는 글루코스가 풍부하다는 시그날을 발생시켜 광합성을 하향 조절한다. 즉, T-6-P 수준의 감소는, 해당을 위한 기질 및 세포 성장 및 세포 분열과 같은 과정을 위한 에너지 공급이 충분하다는 시그날을 보낸다. 이러한 시그날링은 헥소키나제를 통한 유입량의 증가에 의해 개시되는 것으로 생각된다 (J.J. Van Oosten, public lecture at RijksUniversiteit Utrecht dated April 19, 1996).
식물에서 헥소키나제 시그날링이 트레할로스-6-포스페이트의 수준 조절을 통해 조절될 수 있다는 이론은 모든 식물이 시그날 분자 트레할로스-6-포스페이트를 생성 및 분해시킬 수 있는 효소계의 존재를 필요로 한다는 것을 의미한다. 트레할로스가 일반적으로 광범위한 진균, 세균, 효모 및 조류, 및 일부 척추동물에서 발견되지만, 극히 제한된 범위의 도관 식물만이 상기 당을 합성할 수 있는 것으로 제안되었다 (Elbein (1974), Adv. Carboh. Chem. Biochem. 30, 227). 현재까지 이해되지 않는 현상은 트레할로스 합성 효소가 분명히 결여되었음에도 불구하고 모든 식물은 트레할로스를 분해하여 2개의 글루코스 분자를 생성시킬 수 있는 효소인 트레할라제를 함유하는 것으로 보인다는 것이다.
트레할로스 대사 경로의 존재에 대한 간접적인 증거는 발리다마이신 A와 같은 트레할라제 억제제를 사용한 본원에서 제시되는 실험 또는 안티센스 트레할라제를 사용한 형질전환에 의해 얻을 수 있다.
트레할로스의 생성은 그의 중간체 T-6-P가 대사 활성에 너무 많이 영향을 끼친다면 방해될 것이다. 바람직하게는, 트레할로스-6-포스페이트의 작용에 의해 대사산물의 분배 및 할당에 영향을 끼치지 않으면서 높은 수준의 트레할로스를 축적시키기 위해서는 이성분성 TPS/TPP 효소를 과다발현시켜야 한다. 이러한 효소는 이. 콜리 otsA 및 otsB 유전자에 비해 TPS2 유전자 생성물이 TPS 및 TPP 상동 영역을 함유하는, 효모에서 발견되는 유전 구성과 유사할 것이다(Kaasen et al. (1994), Gene 145, 9). 상기 효소를 사용하면 트레할로스-6-포스페이트는 다른 세포 성분에 자유롭게 사용되지 않을 것이다. 상기 이성분성 효소의 다른 예는 트레할로스-6-포스페이트 신타제/포스파타제로 추정되는 효소를 코딩하는 셀라기넬라 레피도필라 (Selaginella lepidophylla)로부터 3.2 kb cDNA를 단리한 젠텔라 및 이투리아가 (Zentella and Iturriaga, Plant Physiol. (1996), 111 Abstract 88)에 의해 제시되었다. 또한, TPS 활성만을 갖는 절단된(truncated) TPS-TPP 유전자 생성물의 구조는 상동 시스템에 사용될 경우에도 이. 콜리의 otsA 유전자만큼 T-6-P의 합성에 효능이 있을 것이라는 것으로 생각된다.
분자 수준에서, 본 발명자들은 셀라기넬라 외에 트레할로스 합성 유전자는 아라비돕시스(Arabidopsis), 담배, 벼 및 해바라기에도 존재함을 나타내는 데이터를 확보하였다. TPS이.콜리와 TPS효모사이의 보존 서열을 기초로 한 변성 프라이머를 사용하여 본 발명자들은 해바라기 및 담배에서 트레할로스-6-포스페이트 생성 효소로 추정되는 효소를 코딩하는 유전자를 동정할 수 있었다. 서열 비교를 통하여 효모 및 이. 콜리의 TPS 유전자와 아라비돕시스 및 벼의 EST (발현 서열 태그) 서열 사이에 상당한 상동성이 있음을 확인하였다 (발견된 상동성 EST의 EST 번호를 포함하는 표 6b 참조).
최근에 아라비돕시스 유전자는 그의 상동성을 기초로 하여 이성분성 효소로서 간주될 수 있다는 것이 규명되었다 (GENBANK Acc. No. Y08568, 서열 3). 이들 데이터는 현재의 지식과 대조적으로 대부분의 식물은 T-6-P를 합성할 수 있는 트레할로스-포스페이트-신타제를 코딩하는 유전자를 함유한다는 것을 나타낸다. TPS 발현 식물에서 트레할로스의 축적에 의해 입증된 바와 같이, 식물도 T-6-P를 트레할로스로 탈인산화시킬 수 있는 비특이적 또는 특이적 포스파타제를 함유한다. 모든 식물에서의 트레할라제의 존재는 트레할로스의 대사회전을 달성할 수 있게 한다.
또한, 본 발명자들은 T-6-P가 인간 조직에서 탄수화물 경로의 조절에 관련된다는 데이터를 제공한다. 본 발명자들은 효모, 이. 콜리 및 식물의 TPS 유전자와 상동성을 보이는 인간 TPS 유전자 (서열 10)를 규명하였다. 또한, 본 발명자들은 포유동물 (마우스) 조직에서 헥소키나제의 활성도 영향받는다는 데이터를 제공한다.
효소 TPP의 발현 (또는 효소 PTS의 억제)를 통한 트레할로스-6-포스페이트의 세포내 농도의 저하에 의한 "풍부한" 시그날의 생성은 해당작용에서의 탄소 흐름을 증가시키고 광합성을 억제하는 시그날을 모든 세포계에 보낼 것이다. 이것은 예를 들면 실험 2에서 효소 TPP가 발현되어 잎 크기의 증가, 분지(分枝)의 증가 및 클로로필의 양의 감소를 갖는 트랜스제닉 담배가 기술되는 실험부에서 분명하게 제시된다. 그러나, "풍부한" 시그날은 글루코스의 충분한 공급의 부재 하에 생성되기 때문에, 세포 내의 탄수화물의 풀은 신속하게 고갈된다.
따라서, 인공적으로 "풍부한 시그날"이 유지된다고 가정하면, 탄수화물의 감소는 성장 및 세포 분열을 최종적으로 제한할 것이다. 즉, 세포는 그의 저장 탄수화물을 모두 사용하여 "기아" 상태가 될 것이다. 따라서, 잎은 저장된 소량의 탄수화물을 가진 상태로 형성된다. 한편, TPS를 코딩하는 유전자를 갖는 구축물을 발현하여 세포내 T-6-P의 양이 증가하는 식물은 잎 크기의 감소를 보이면서 잎이 암녹색이 되고, 클로로필의 함량이 증가하였다.
효모에서, 글루코스 유도 시그날링의 주된 역할은 신생/호흡 방식에서 발효 방식으로 대사를 전환시키는 것이다. 몇 개의 시그날링 경로가 상기 현상에 관련된다 (Thevelein and Hohmann, (1995) TIBS 20, 3). 헥소키나제 시그날링의 가능한 역할 외에, RAS-시클릭-AMP (cAMP) 경로는 글루코스에 의해 활성화되는 것으로 밝혀졌다. 글루코스에 의한 RAS-cAMP 경로의 활성화는 글루코스 인산화를 필요로 하지만, 추가의 글루코스 대사는 필요로 하지 않는다. 현재까지, 상기 경로는 트레할라제 및 6-포스포프럭토-2-키나제를 활성화시키지만(이에 의해 해당 작용을 자극함), cAMP 의존적 단백질 인산화에 의해 프럭토스-1,6-비스포스파타제는 억제된다(이에 의해 글루코스 신생 합성을 억제함)는 것이 밝혀졌다. 따라서, 이러한 신호 전달 경로 및 이에 의해 발생할 수 있는 대사 효과는 트레할로스-6-포스페이트의 수준에 의해 영향받는 것으로 밝혀진 헥소키나제 시그날링 경로와 동시에 작용하는 것으로서 생각할 수 있다.
본 명세서에서 기술되는 바와 같이, 안티센스 트레할라제를 발현하는 트랜스제닉 식물은 TPS 유전자를 발현할 때 관찰되는 것과 유사한 암녹색 잎, 생산량의 증가를 보인다. 또한, 이중 구축물에서 안티센스 트레할라제의 발현은 TPS의 발현에 의해 발생하는 효과를 증강시키는 것으로 보인다. 트레할로스는 제한된 수의 종에서만 축적되지만, 트레할라제 활성은 예를 들어 식물, 곤충, 동물, 진균 및 세균에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 현재까지, 식물에서 트레할라제의 역할은 이 효소가 대부분의 모든 식물종에 존재함에도 아직 알려지지 않았다. 이 효소는 식물 병원체 유인 및(또는) 식물 방어 반응에 관련되는 것으로 제안되었다. 본 발명자들은 감자 트레할라제 유전자를 단리하고 감자 잎 및 괴경 조직에서 트레할라제 활성의 억제가 괴경 생산량을 증가시킨다는 것을 발견하였다. TPS 발현과 조합된 토마토에서의 트레할라제의 과실 특이적 발현은 과실 생산을 크게 변경시켰다.
본 발명의 한 실시형태에 따르면, T-6-P은 트레할로스-포스페이트-신타제 (TPS)를 코딩하는 발현가능 유전자 구축물의 도입에 의해 T-6-P 생산능이 도입된 세포에서 축적된다. 세포에서 특이적으로 또는 구성적으로 DNA의 발현에 필요한 조절 성분의 조절 하에 임의의 트레할로스 포스페이트 신타제 유전자는 세포에서 T-6-P를 생성시킬 수 있는 트레할로스 포스페이트 신타제를 생성시킬 수 있는 한 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 개방 해독 프레임의 한 예는 서열 2로 나타낸 TPS 효소를 코딩하는 것이다. 다른 예는 서열 10, 18 내지 23, 41 및 45 내지 53에 나타낸 개방 해독 프레임이다. 상기 서열에 나타낸 바와 같이, 하나 이상의 DNA 서열이 동일한 효소를 코딩할 수 있고, 이것은 유전자 코드의 동의성(degeneracy)에 의해 야기된다는 것은 잘 알려져 있다. 바람직한 경우, 트레할로스 포스페이트 신타제 활성을 코딩하는 개방 해독 프레임은 선택된 숙주에서의 코돈 사용법에 적합하게 할 수 있지만, 이것은 필수조건은 아니다.
예를 들어 서열 2로 나타낸 단리된 핵산 서열을 사용하여 다른 유기체에서 트레할로스 포스페이트 신타제 유전자를 동정한 후, PCR 기술에 의해 및(또는) 다른 공급원으로부터의 DNA와 이. 콜리 유전자로부터 수득할 수 있는 DNA 또는 RNA 단편과의 혼성화에 의해 단리 및 클로닝할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 DNA 서열은 다소 엄격한 조건 (온도 및 혼성화 혼합물의 이온 세기와 같은 인자에 의해 영향받음) 하에 혼성화시켜 스크리닝된다. 조건의 엄격성 여부는 또한 혼성화 특성, 즉 DNA:DNA, DNA:RNA, RNA:RNA 및 가장 짧은 혼성화 단편의 길이에 좌우된다. 당업계의 숙련가는 비특이적 혼성화를 방지하면서 TPS 유전자를 단리할 수 있도록 충분히 엄격한 혼성화 조건을 용이하게 구축할 수 있다. 다른 공급원으로부터의 트레할로스 합성에 관련된 유전자를 사용할 수 있기 때문에, 이들 유전자는 유사한 방법으로 본 발명에 따라 발현가능 트레할로스 포스페이트 신타제 유전자를 수득할 수 있다. 보다 상세한 내용은 실험 부분에서 설명한다.
트레할로스 포스페이트 신타제 활성을 단리하기 위한 공급원은 미생물(예를 들어 세균, 효모, 진균), 식물, 동물 등을 포함한다. 다른 공급원으로부터 단리된 트레할로스 포스페이트 신타제 활성을 코딩하는 DNA 서열은 본 발명에 따라 T-6-P를 생성하는 방법과 유사하게 사용할 수 있다. 예로서, 효모로부터 T-6-P를 생성하기 위한 유전자는 국제 특허 공개 제WO93/17093호에 기재되어 있다.
또한, 본 발명은 아미노산 서열의 변이가 트레할로스 포스페이트 신타제 활성을 완전히 제거하지 않는 한, 하나 이상의 코돈을 변이시켜 코딩되는 단백질의 아미노산을 변경시킴으로써 서열 1에 나타낸 핵산 서열을 변형시켜 수득되는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태에 따르면, 세포 내의 트레할로스-6-포스페이트는 세포에서 DNA의 발현에 필요한 조절 성분의 조절 하에 트레할로스 포스페이트 포스파타제를 코딩하는 유전자에 의해 트레할로스로 전환될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 개방 해독 프레임은 서열 4로 나타낸 TPP 효소를 코딩하는 것이다 (Kaasen et al. (1994) Gene, 145, 9). 하나 이상의 DNA 서열이 동일한 효소를 코딩할 수 있고, 이것은 유전자 코드의 동의성에 의해 발생한다는 것은 공지되어 있다. 필요한 경우, 트레할로스 포스페이트 포스파타제 활성을 코딩하는 개방 해독 프레임은 선택된 숙주의 코돈 사용법에 적합하게 할 수 있지만, 이것은 필수조건은 아니다.
예를 들어 서열 3으로 나타낸 단리된 핵산 서열을 사용하여 다른 유기체에서 트레할로스 포스페이트 포스파타제 유전자를 동정한 후, PCR 기술에 의해 및(또는) 다른 공급원으로부터의 DNA와 이. 콜리 유전자로부터 수득할 수 있는 DNA 또는 RNA 단편과의 혼성화에 의해 단리 및 클로닝할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 DNA 서열은 다소 엄격한 조건 (온도 및 혼성화 혼합물의 이온 세기와 같은 인자에 의해 영향받음) 하에 혼성화시켜 스크리닝된다. 조건의 엄격성 여부는 또한 혼성화 특성, 즉 DNA:DNA, DNA:RNA, RNA:RNA 및 가장 짧은 혼성화 단편의 길이에 좌우된다. 당업계의 숙련가는 비특이적 혼성화를 방지하면서 TPP 유전자를 단리할 수 있기에 충분히 엄격한 혼성화 조건을 용이하게 구축할 수 있다. 다른 공급원으로부터의 트레할로스 합성에 관련된 유전자를 사용할 수 있기 때문에, 이들 유전자는 본 발명에 따라 유사한 방법으로 발현가능 트레할로스 포스페이트 포스파타제 유전자를 수득할 수 있다. 보다 상세한 내용은 실험 부분에서 설명한다.
트레할로스 포스페이트 포스파타제 활성을 단리하기 위한 공급원은 미생물(예를 들어 세균, 효모, 진균), 식물, 동물 등을 포함한다. 다른 공급원으로부터 단리된 트레할로스 포스페이트 포스파타제 활성을 코딩하는 DNA 서열도 유사하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 아미노산 서열의 변이가 트레할로스 포스페이트 포스파타제 활성을 완전히 제거하지 않는 한, 하나 이상의 코돈을 변이시켜 코딩되는 단백질의 아미노산을 변경시킴으로써 서열 3에 나타낸 핵산 서열을 변형시켜 수득되는 핵산 서열을 포함한다.
TPS 또는 TPP 활성을 갖는 다른 효소는 소위 이성분성 효소로 언급된다. 상기 2개의 효소의 활성 중 하나를 특이적으로 코딩하는 서열의 일부는 다른 하나의 활성을 코딩하는 이성분성 효소의 일부로부터 분리할 수 있다. 활성을 분리하는 한가지 방법은 발현되는 단백질이 손상되거나 선택되지 않는 활성이 결핍되어 단지 다른 하나의 기능만을 수행하도록 선택되지 않는 활성을 코딩하는 서열에 변이를 삽입하는 것이다. 이것은 TPS 활성 및 TPP 활성 코딩 서열 모두에 대하여 실시할 수 있다. 따라서, 이와 같은 방식으로 수득되는 코딩 서열은 TPS 또는 TPP 활성을 갖는 효소를 발현할 수 있는 신규한 키메라 개방 해독 프레임의 형성에 사용할 수 있다.
본 발명의 또다른 실시형태에 따르면, 특히 식물을 유전전으로 변이시켜 식물의 특정 부분에서 상기 효소를 생성하여 축적시킬 수 있다. 효소가 발현되는 바람직한 부위는 식물의 잎 및 저장 부분이다. 특히 감자 괴경은 적합한 식물 부분으로 생각된다. 감자의 미세한 괴경 및 괴경에서 선택적인 TPS 효소 발현을 달성하기 위해 바람직한 프로모터는 감자의 파타틴(patatin) 유전자의 개방 해독 프레임의 상류 영역으로부터 수득할 수 있다.
특이적 발현에 적합한 다른 프로모터는 식물의 광합성 부분에 특이적인 플라스토시아닌 프로모터이다. 또한, 식물 부분에서의 특이적 발현은 식물 성장 및 번식에 대해 또는 상기 식물의 경제적 용도를 위해 유익한 효과를 발생시킬 수 있다. 이러한 측면에서 유용한 프로모터는 과실 특이적인 E8-프로모터 (EP 0 409 629) 및 2A11-프로모터 (van Haaren and Houck (1993), Plant Mol. Biol., 221, 625); 종자 특이적인 크루시페린 프로모터, 나핀 프로모터 및 ACP 프로모터; PAL-프로모터; 꽃 특이적인 칼콘-이소머라제 프로모터; 잎 특이적인 SSU 프로모터 및 페레독신 프로모터; 뿌리 특이적인 TobRb7 프로모터, 체관부 특이적인 RolC 프로모터 및 분열조직 특이적인 HMG2 프로모터 (Enjuto et al. (1995), Plant Cell 7, 517) 및 벼 PCNA 프로모터 (Kosugi et al. (1995), Plant J. 7, 877)이다.
본 발명의 또다른 방법은 유도가능 프로모터를 사용하는 것이다. 병원체, 스트레스, 화학물질 또는 명/암 자극에 의해 유도가능한 프로모터는 공지되어 있다. 특정 현상, 예를 들어 발아, 추대 (bolting), 종자 세팅, 저장 조직의 충전의 유도를 위해 외부 자극에 의해 본 발명의 유전자의 활성을 유도하는 것이 유익하다. 이것은 식물의 정상적인 발생 및 목적하는 현상의 제어 하의 유도 가능성이라는 잇점을 가능하게 한다. 상기 방법에 사용할 수 있는 프로모터는 DE 4446342 (진균 및 옥신 유도가능 PRP-1), WO 96/28561 (진균 유도가능 PRP-1), EP 0 586 612 (선충 유도가능), EP 0 712 273 (선충 유도가능), WO96/34949 (진균 유도가능), PCT/EP96/02437 (선충 유도가능), EP 0 330 479 (스트레스 유도가능), US 5,510,474 (스트레스 유도가능), WO96/12814 (저온 유도가능), EP 0 494 724 (테트라싸이클린 유도가능), EP 0 619 844 (에틸렌 유도가능), EP 0 337 532 (살리실산 유도가능), WO95/24491 (티아민 유도가능) 및 WO92/19724 (광 유도가능)에 기재된 병원체 유도가능 프로모터이다. 다른 화학물질 유도가능 프로모터는 EP 0 674 608, EP 637 339, EP 455 667 및 US 5,364,780에 기재되어 있다.
본 발명의 또다른 실시형태에 따르면, 세포는 세포내에서 발현된 TPS 또는 TPP의 기능을 억제하는 구축물로 형질전환된다. 원하지 않는 세포내 효소 활성의 억제는 많은 방법에 의해 달성되고, 이러한 방법의 선택은 본 발명에 중요하지 않다. 유전자 발현 억제의 한 방법은 소위 '안티센스 방법'을 통하여 달성된다. 이 방법에서는, 차단될 효소 활성을 코딩하는 RNA에 적어도 부분적으로 상보성인 RNA를 생성시키는 DNA 서열이 발현된다. 이종 유전자보다 효과적이기 때문에 동종 안티센스 유전자를 사용하는 것이 바람직하다. 원하지 않는 효소 활성의 합성을 차단하는 다른 방법은 식물 숙주에 존재하는 내생 유전자의 추가의 1카피를 식물 숙주의 게놈 내에 도입하는 것이다. 이러한 유전자의 추가의 1카피는 내생 유전자의 발현 효과가 나타나지 않도록 한다. 이러한 효과는 문헌에 동시 억제 효과 또는 동시 억제로서 언급되어 있다. 기질 가용성을 증강시키는 방법은 본원에 참고로 포함되는 WO95/01446의 실시예에 상세하게 기재되어 있다.
숙주 세포는 헥소키나제-시그날링의 변이가 T-6-P 수준의 변경을 통하여 달성될 수 있는 임의의 세포일 수 있다. 따라서, 모든 진핵세포는 본 발명의 대상이 된다. 경제적 측면에서, 대사 화합물의 생성에 가장 적합한 세포가 본 발명에 가장 적합하다. 이들 유기체는 무엇보다도 식물, 동물, 효모, 진균이다. 그러나, 특정 동물 세포(예를 들어 췌장 베타세포 및 지방세포)에서의 발현도 고려된다.
스페르마토피태 (Spermatophytae) 중에서 바람직한 식물 숙주는 대표 과로서 솔라나세애(Solanaceae)를 포함하는 안지오스페르매(Angiospermae), 특히 쌍자엽식물 (Dicotyledoneae) 및 대표 과로서 그라미네에(Gramineae)를 포함하는 단자엽 식물 (Monocotyledoneae)이다. 본 명세서에서 정의된 바와 같은 적합한 숙주 식물은 예를 들어 목적 식물 또는 식물 기관에서 TPS 또는 TPP의 생성을 야기하거나 증강시키기 위해 재조합 DNA 기술에 의해 변형된 수준의 T-6-P를 함유하는 식물 (및 이 식물의 일부 및 세포) 및 그의 자손체를 포함한다. 본 발명에 따른 작물은 꽃양배추 (브라시카 올레라세아(Brassica oleracea), 솜엄겅퀴 (Cynara scolymus), 자른 꽃, 예를 들어 카네이션 (Dianthus caryophyllus), 장미 (로사(Rosa) 종), 크리산테뮴, 페츄니아, 알스트로메리아, 게르베라, 글라디올러스, 백합 (릴륨(Lilium) 종), 호프 (Humulus lupulus), 브로콜리, 화분 식물, 예를 들어 진달래속, 진달래, 달리아, 베고니아, 수령초, 게라늄 등과 같은 꽃; 사과 (말루스(Malus), 예를 들어 도메스티쿠스(domesticus)), 바나나 (무사(Musa), 예를 들어 아쿠미나타(Acuminata)), 살구 (프루누스 아르메니아카(Prunus armeniaca), 올리브 (올리바 사티바(Oliva sativa)), 파인애플 (Ananas comosus), 코코넛 (Cocos nucifera), 망고 (Mangifera indica), 키위, 아보카도 (Persea americana), 장과(berry) (예를 들어 씨없는 건포도, Ribes, 예를 들어 rubrum), 체리 (예를 들어 스위트 체리, Prunus, 예를 들어 avium), 오이 (Cucumis, 예를 들어 sativus), 포도 (Vitis, 예를 들어 vinifera), 레몬 (Citrus limon), 멜론 (Cucumis melo), 겨자 (Sinapis alba 및 Brassica nigra), 견과 (예를 들어 호두, Junglans, 예를 들어 regia; 땅콩, Arachis hypogeae), 오렌지 (Citrus, 예를 들어 maxima), 복숭아 (Prunus, 예를 들어 persica), 배 (Pyra, 예를 들어 Communis), 후추 (Solanum, 예를 들어 capsicum), 서양자두 (Prunus, 예를 들어 domestica), 딸기 (Fragaria, 예를 들어 moschata), 토마토 (Lycopersicon, 예를 들어 esculentum)와 같은 과실; 잎, 예를 들어 알팔파 (Medicago sativa), 양배추 (예를 들어 Brassica oleracea), 꽃상추 (Cichoreum, 예를 들어 endivia), 부추 (Allium porrum), 상추 (Lactuca sativa), 시금치 (Spincia oleraceae), 담배 (Nicotiana tabacum), 화본과, 예를 들어 페스투카, 포아, 독보리 (예를 들어 Lium perenne, Lolium multifloru 및 Arrenatherum spp.), 아메니티 그라스, 잔디, 해초, 치커리 (Cichorium intybus), 차 (Thea sinensis), 셀러리, 파슬리 (Petroselinum crispum), 체빌 및 기타 허브; 뿌리, 예를 들어 칡 (Maranta arundinacea), 사탕무 (Beta vulgaris), 당근 (Daucus carota), 카사바 (Manihot esculenta), 인삼 (Panax ginseng), 순무 (Brassica rapa), 무 (Raphanus sativus), 얌 (Dioscorea esculenta), 고구마 (Ipomoea batatas), 타로토란; 종자, 예를 들어 콩 (Phaseolus vulgaris), 완두 (Pisum sativum), 대두 (Glycin max), 밀 (Triticum aestivum), 보리 (Hordeum vulgare), 옥수수 (Zea mays), 벼 (Oryza sativa), 강낭콩 및 잠두 (Vicia faba), 면화 (Gossypium 종), 커피 (Coffea arabica 및 C. canephora); 괴경, 예를 들어 구경 양배추 (Brassica oleraceae), 감자 (Solanum tuberosum); 구근 식물, 예를 들어 양파 (Allium cepa), 골파, 튜울립 (Tulipa 종), 수선 (Narcissus 종), 마늘 (Allium sativum); 줄기, 예를 들어 코르크나무, 사탕수수 (Saccharum 종), 사이잘삼 (Sisal 종), 아마 (Linum vulgare), 황마; 나무, 예를 들어 고무 나무, 오크 (Quercus 종), 너도밤나무 (Betula 종), 오리나무 (Alnus 종), 물푸레나무 (Acer 종), 느릅나무 (Ulmus 종), 야자, 양치류, 담쟁이덩굴 등을 포함한다.
효모 및 진균 또는 동물 세포의 형질전환은 pBluescript, pUC, 및 RSV 및 SV40와 같은 바이러스 벡터계와 같은 공지의 벡터계를 통한 일반적인 현재의 형질전환 기술을 통하여 수행할 수 있다.
발현가능 트레할로스-포스페이트 신타제 유전자, 트레할로스-포스페이트-포스파타제 유전자 또는 임의의 다른 센스 또는 안티센스 유전자를 싱크 식물 세포로 도입하는 방법은 상기 유전자가 상기 식물 세포에서 발현되는 한 중요하지 않다.
본 발명의 일부 실시형태가 예를 들어 일부 식물종이 아직까지 유전자 형질전환을 수용하지 않기 때문에 현재 실시가능한 상태가 아닐 수 있지만, 유전자 형질전환에 대한 허용은 본 발명의 기초를 이루는 실시형태와는 아무런 관련이 없기 때문에 상기 식물 종에서의 본 발명의 실시는 단지 시간의 문제일 뿐 중요한 문제가 아니다.
식물종의 형질전환은 현재 쌍자엽식물 및 단자엽식물 모두를 포함하여 많은 식물종에 대해서 용이하게 수행된다. 원칙적으로, 본 발명에 따른 키메라 DNA를 적합한 조상 세포에 도입하기 위해서 임의의 형질전환 방법을 사용할 수 있다. 이들 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al. (1982), Nature 296, 72; Negrutiu et al. (1987), Plant Mol. Biol. 8, 363, electroporation of protoplasts (Shillito et al. (1985) Bio/Technol. 3, 1099), 식물체에 대한 미세주입 (Crossway et al. (1986), Mol. Gen. Genet. 202), 상이한 식물체의 (DNA 또는 RNA-코팅) 입자 폭격 (Klein et al. (1987), Nature 327, 70), (비통합성) 바이러스의 감염, 성체 식물 침투에 의한 아그로박테리움 튜머페신즈(Agrobacterium tumefaciens) 매개 유전자 이전 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환 (EP 0 301 316) 등으로부터 적합하게 선택할 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개 DNA 이전을 포함한다. 특히 바람직한 방법은 EP A 120 516 및 US 특허 4,940,838에 기재된 바와 같은 소위 바이너리 벡터 기술을 사용하는 것이다.
유전자 형질전환에 대해 다소 저항성인 것으로 생각되었지만, 단자엽 식물은 형질전환에 순응하고, 형질전환 세포 또는 배, 또는 다른 식물체로부터 재생될 수 있다. 현재 바람직한 단자엽 식물의 형질전환 방법은 배, 외식편 또는 현탁 세포의 미세추진 폭격, 및 DNA 직접 도입 또는 (조직) 일렉트로포레이션(electroporation) (Shimamoto et al. (1989), Nature 338, 274-276)이다. 트랜스제닉 옥수수는 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 (제초제 포스피노트리신)을 불활성화시키는 효소)를 코딩하는 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) bar 유전자를 미세추진 폭격에 의해 옥수수 현탁 배양의 배 세포에 도입함으로써 수득되었다 (Gordon-Kamm (1990), Plant Cell, 2, 603). 유전 물질의 밀 및 보리와 같은 다른 단자엽 작물의 호분 원형질체 내로의 도입이 문헌에 보고되었다 (Lee (1989), Plant Mol. Biol. 13, 21). 밀은 배 생성 현탁 배양물의 구축을 위한 배 생성 캘루스를 선발하여 배 생성 현탁 배양으로부터 재생되었다 (Vasil (1990) Bio/Technol. 8, 429). 이들 작물에 대한 형질전환 시스템을 조합하여 본 발명을 단자엽 식물에 대해 적용할 수 있다.
벼 및 옥수수와 같은 상업적으로 중요한 작물을 포함하여 단자엽 식물은 아그로박테리움 균주에 의한 DNA 이전에 순응한다 (WO94/00977; EP 0 159 418 B1; Gould et al. (1991) Plant. Physiol. 95, 426-434 참조).
하나 이상의 키메라 유전자를 구성적으로 발현할 수 있는 트랜스제닉 식물을 얻기 위해서 하기 방법을 포함하여 많은 방법을 사용할 수 있다:
A. 2원성 플라스미드 상에 제2 선택가능 마커 유전자에 물리적으로 결합된 많은 변형 유전자와 함께 DNA 예를 들어 T-DNA의 사용. 이 방법의 잇점은 키메라 유전자가 물리적으로 결합하여 하나의 멘델 로커스로서 이동할 수 있다는 것이다.
B. 제2 선택가능 마커에 결합된 하나 이상의 키메라 유전자를 함유하는 트랜스제닉 식물의 화분을 사용하여, 바람직하게는 제1 선택가능 마커 유전자에 결합된 하나 이상의 키메라 유전자를 이미 각각 발현할 수 있는 트랜스제닉 식물의 이화 수분. 이어서, 상기 교배에 의해 수득되는 종자는 2개의 선별가능 마커의 존재를 기초로 또는 키메라 유전자 자체의 존재를 기초로 하여 선택될 것이다. 선택된 종자로부터 수득된 식물은 추가의 교배에 사용될 수 있다. 원칙적으로, 키메라 유전자는 하나의 로커스 상에 존재하지 않기 때문에 독립적인 로커스로서 분리될 수 있다.
C. 많은 키메라 DNA 분자, 예를 들어 각각 하나 이상의 키메라 유전자 및 선택가능 마커를 갖는 플라스미드의 사용. 동시 형질전환의 빈도가 높으면, 마커 하나만을 기초로 한 선택으로 충분하다. 다른 경우에는 2 이상의 마커를 기초로 한 선택이 바람직하다.
D. 선택가능 마커 유전자를 임의로 포함하는 새로운 키메라 DNA를 사용하여 제1, 제2 등의 키메라 유전자를 이미 함유하는 트랜스제닉 식물의 연속 형질전환. 상기 방법 B에서와 같이, 키메라 유전자는 원칙적으로 하나의 로커스에 존재하지 않고, 키메라 유전자는 따라서 독립적인 로커스로서 분리될 수 있다.
E. 상기 언급한 전략의 조합.
실제 전략은 모계의 목적과 같이 용이하게 결정될 수 있는 여러 고려 조건(직접 성장, 교배 프로그램에 사용, 하이브리드 생성에 사용)에 따라 결정될 수 있지만, 본 발명에 있어서 중요한 것은 아니다.
실제로 모든 식물은 배양 세포 또는 조직으로부터 재생될 수 있다는 것이 공지되어 있다. 재생 수단은 식물종에 따라 상이하지만, 일반적으로 형질전환된 원형질체의 현탁액 또는 형질전환된 외식편을 함유하는 페트리 플레이트가 먼저 제공된다. 발아는 직접 유도될 수 있거나 또는 기관 생성 또는 배 생성을 통하여 캘루스로부터 간접적으로 유도된 후 뿌리내리게 된다. 선택가능 마커 다음으로, 배양 배지는 일반적으로 상이한 아미노산 및 호르몬, 예를 들어 옥신 및 싸이토키닌을 함유할 것이다. 또한, 특히 옥수수 및 알팔파와 같은 종을 위해 배지에 글루탐산 및 프롤린을 첨가하는 것이 유리하다. 효율적인 재생은 배지, 유전형 및 배양의 연혁에 따라 상이할 것이다. 이들 3가지 변수가 조절된다면, 재생은 일반적으로 재현가능하다. 형질전환되는 유전자 서열이 트랜스제닉 식물 내로 안정적으로 도입된 후에, 이들 서열이 부여하는 특성은 교배에 의해 다른 식물로 이송될 수 있다. 교배되는 종에 따라서 많은 표준 교배 기술을 사용할 수 있다.
식물 발현가능 유전자 (마커 유전자를 포함함)의 발현 조절을 위한 적합한 DNA 서열, 예를 들어 전사 개시 영역, 인핸서, 비전사 리더 등은 식물 세포에서 발현되는 임의의 유전자로부터 유도될 수 있다. 또한, 상이한 프로모터의 기능 부분을 조합한 하이브리드 프로모터 또는 그와 균등한 합성 프로모터도 포함된다. 컨스터튜티브 발현 프로모터 외에, 유도가능 프로모터 또는 그의 발현 패턴에서 예를 들어 발생학적으로 또는 세포종 특이적으로 조절되는 프로모터를 사용하여 본 발명에 따른 발현가능 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
형질전환된 세포의 선발 또는 스크리닝을 위해, 식물 세포에 이송되는 본 발명에 따른 다른 식물 발현가능 유전자에 결합된 마커 유전자를 포함하는 것이 바람직하다. 표준적인 당업계의 숙련가는 식물 형질전환에 적합한 마커 유전자를 용이하게 선택할 수 있다. 통상 사용되는 마커 유전자의 일부 예는 카나마이신 내성을 부여하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 (EP-B 131 623), 글루타티온 유도 제초제에 대한 내성을 부여하는 쥐 간으로부터의 글루타티온-S-트랜스퍼라제 유전자 (EP-A-256 223), 과다발현시 포스피노트리신과 같은 글루타민 합성 효소 억제제에 대한 내성을 부여하는 글루타민 합성 효소 (WO87/05327), 선택제 포스피노트리신에 대한 내성을 부여하는 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes)로부터의 아세틸 트랜스퍼라제 유전자 (EP-A-275 957), N-포스포노메틸글리신에 대한 내성을 부여하는 5-에놀쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS)를 코딩하는 유전자, 비알라포스에 대한 내성을 부여하는 bar 유전자 (예를 들어 WO91/02071) 등이다. 마커의 실제 선택은 마커가 선택되는 식물 세포와 조합하여 기능성(선택적)인 한 중요하지 않다.
마커 유전자 및 목적 유전자는 연결될 필요는 없는데, 그 이유는 연결되지 않은 유전자의 동시 형질전환(US 특허 4,399,216호)도 식물 형질전환에 효과적인 방법이기 때문이다.
특히 쌍자엽 작물에 대한 형질전환에 바람직한 식물체는 용이하게 형질전환되어 양호한 재생 능력을 가질 수 있는 옆편이다 (Horsch et al. (1985), Science 227, 1229).
실시예에서 알 수 있는 바와 같이 TPP(세포내 T-6-P 농도의 감소를 야기함)의 발현 효과는 잎 크기의 증가, 분지의 증가와 이에 따른 잎 수의 증가, 전체 잎의 생중량의 증가, 성숙 잎의 백색화, 보다 작은 꽃의 형성 및 불임으로서, 본 발명의 특정 용도를 고려할 수 있다. 이러한 효과는 특히 유용한데, 잎 크기의 증가 (및 잎 수의 증가)는 시금치, 상추, 부추, 알팔파, 목초용 옥수수와 같은 옆 채소; 잔디 및 정원 식물에 의한 지면 장식 및 잡초 제거; 잎이 제품으로서 사용되는 작물, 예를 들어 담배, 차, 삼 및 장미(향수); 양배추 유사 작물, 예를 들어 꽃양배추의 교배에 대해 경제적으로 중요하다.
상기 잎의 대사 활성이 자극된다는 사실의 다른 잇점은 잎이 그의 모든 세포내 자원을 소비시켜 전분 함량이 낮다는 것이다. 섭취용 식물의 경우, 전분 함량의 감소는 저칼로리 식품에 대한 현재의 경향의 측면에서 유리하다. 이러한 전분 함량의 저하는 또한 잎의 맛 및 조직에 영향을 끼친다. TPP의 발현에 의해 생성될 수 있는 단백질/탄수화물 균형의 증가는 목초용 옥수수와 같은 잎 작물에 특히 중요하다.
보다 직경이 큰 줄기를 갖는 경향을 수반하는 분지의 증가는 줄기가 경제적 가치가 있는 제품의 생산에 중요한 작물에 유리할 수 있다. 이러한 범주의 예는 제지용 원료로도 사용될 수 있는 목재 생산의 증가를 위한 모든 나무; 로프 및 아마포의 생산에 사용되는 삼과 같은 작물, 사이잘삼, 아마와 같은 작물, 대나무 및 사탕수수와 같은 작물, 고무 나무, 코르크 나무이고, 작물 또는 낟알, 옥수수, 콩 및 딸기와 같은 작물의 일부 쓰러짐을 예방함에도 유리하다. 제3의 현상은 잎의 백색화 증가(광합성 활성의 감소에 의해 발생)이다. 착색이 부족한 잎은 치커리 및 아스파라거스와 같은 작물에 바람직하다. 또한, 자른 꽃의 경우, 예를 들어 알스트로메리아에서 꽃잎의 백색화가 바람직할 수 있다.
전체적인 효과는 대사 활성의 증가로부터 발생하는 생중량의 증가이다. 이것은 생중량이 단백질 및 지방과 같은 대사된 화합물로 구성된다는 것을 의미한다. 따라서, 성숙 잎에서 단백질/탄수화물 균형이 증가하고, 이것은 목초용 옥수수와 같은 작물 및 생각될 수 있는 모든 사료에 잇점을 갖는다. 이와 유사한 단백질/탄수화물 균형의 증가는 과실, 괴경 및 다른 섭취가능 식물 부분에서 확립될 수 있다.
식물계 외에, 대사의 증가는 미생물 또는 진핵세포 배양물에서 단백질 생산에 유익할 것이다. 내생 및 이종 단백질의 생산 모두가 증가할 것이고, 이것은 효모 또는 다른 단세포 생물의 배양에서 이종 단백질의 생산이 상기 방식으로 증강될 수 있다는 것을 의미한다. 효모의 경우, 이것은 보다 효율적인 발효를 제공하여 알콜 수율을 증가시키고, 이것은 물론 양조 공정, 알콜 생산 등에 유리한 것이다.
동물 또는 인간에서 대사 결핍에 의해 발생하는 질병은 이환된 세포에서의 TPP 또는 TPS의 안정적인 발현에 의해 극복할 수 있다. 인간 세포에서, 많은 종양의 글루코스 소비의 증가는 헥소키나제의 과다발현에 크게 의존한다 (Rempel et al. (1996) FEBS Lett. 385, 233). 글루코스의 암세포 대사로의 유입은 트레할로스-6-포스페이트 합성 효소의 발현에 의해 영향받을 수 있다. 또한, 헥소키나제 활성화는 cAMP/PKA(단백질 키나제 A 경로)에 의해 가능하게 된다. 따라서, 상기 시그날 트랜스덕션 경로의 불활성화는 글루코스 흡수 및 종양 형성의 증가에 영향을 줄 수 있다는 것이 밝혀졌다. 트레할로스-6-포스페이트 및 트레할로스를 합성하고 트레할로스를 분해할 수 있는 포유동물 세포의 효소 활성은 예를 들어 토끼 신장 피질 세포에서 규명되었다 (Sacktor (1968) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60, 1007).
또다른 예는 헥소키나제에 의해 촉매되는 글루코스-6-포스페이트의 생산이 세포외 글루코스 수준의 증가를 인슐린 분비로 연결시키는 주반응인 췌장 베타세포에서의 인슐린 분비의 결함에서 발견될 수 있다. 세포내 T-6-P의 감소에 의해 발생하는 헥소키나제 활성의 증가는 인슐린 분비가 불충분한 세포에서의 인슐린 생산을 자극할 것이다.
또한, 트랜스제닉 동물에서 단백질/탄수화물 균형의 증가는 유리할 수 있다. 대사의 증가 및 단백질 생산의 증강의 특성은 동물이 가능한 한 빨리 비육되어야 하는 축산업에서 매우 중요하다. 효소 TPP의 식육 생산 동물, 예를 들어 닭, 소, 양, 칠면조, 염소, 어류, 바다가재, 게, 새우, 달팽이 등으로의 형질 전환은 보다 신속하게 성장하고 보다 단백질이 풍부한 식육을 제공하는 동물을 가능하게 할 것이다.
동일한 방식으로, 상기 대사의 증가는 탄수화물의 연소 속도를 증가시키고 따라서 비만을 억제한다는 것을 의미한다.
세포내 T-6-P 농도의 감소로부터 발생하는 식물 특이적인 효과는 (종자의 형성에는 이르는 것 같지는 않지만) 꽃의 수의 증가이다. 그러나, 꽃의 수의 증가는 자른 꽃 및 꽃 감상용 화분 식물 및 원예에 적합한 모든 식물에 유리하다.
상기 개화 현상의 다른 효과는 불임인데, 이것은 식물이 종자를 생산하지 않기 때문이다. 불임 식물은 잡종 교배에 유리하다.
경제적으로 중요한 특징은 상추, 꽃상추와 같은 작물 및 잔디 및 사료용 목초의 추대를 억제하는 것이다. 이것은 개화 및 종자 생산에 대사 노력을 소비하도록 함이 없이 작물을 성장시킬 수 있기 때문에 유용한 특성이다. 또한, 상추, 꽃상추 및 목초와 같은 작물에서 상업적 제품/용도는 추대되지 않은 것이다.
식물의 특정 부분(수용부)에서의 TPP의 특정 발현은 추가의 유리한 효과를 제공한다. 예를 들어 종자 형성시에 초기에 활성을 갖는 프로모터에 의한 TPP의 발현이 발생하는 종자의 성장을 증가시킨다는 것을 생각할 수 있다. 유사한 효과가 꽃 특이적인 프로모터에 의해 TPP를 발현시킴으로써 수득될 것이다. 특정 식물 부분의 과도한 성장은 TPP가 적합한 특정 프로모터에 의해 발현되는 경우에 가능하다. 과실에서, 특정 발현은 과육에 대하여 과피의 성장을 증가시킬 수 있다. 이것은 과실의 박리를 개선시켜 자동 박피 산업에 유리할 수 있다.
오일 저장 종자의 발아 과정 동안 TPP의 발현은 오일 분해를 억제한다. 발아 과정에서, 글리옥실레이트 싸이클은 매우 활발하게 발생한다. 이 대사 경로는 아세틸-CoA를 말레이트를 통해 수크로스로 전환시키고, 수크로스는 수송되어 묘목의 성장 중에 에너지 공급원으로서 사용될 수 있다. 상기 과정에서 중요한 효소는 말레이트 신타제 및 이소시트레이트 리아제이다. 두 효소의 발현은 헥소키나제 시그날링에 의해 조절되는 것으로 생각된다. 이러한 조절의 한 증거는 2-데옥시글루코스 및 만노스가 헥소키나제에 의해 인산화되어 그들의 시그날을 변환시키고, 추가로 대사되지 않으면서 말레이트 신타제 및 이소시트레이트 리아제 발현이 감소된다. 종자에서 TPP의 발현 및 이에 의한 헥소키나제의 억제 감소 및 이에 의한 말레이트 신타제 및 이소시트레이트 리아제의 억제는 오일의 종자내 저장을 유지시켜 발아를 억제한다.
TPP의 효과와 대조적으로, TPS의 발현에 의해 발생하는 T-6-P의 증가는 실시예에 예시된 바와 같은 다른 효과를 발생시킨다. 이로부터, T-6-P 양의 증가는 성장 방해 또는 발육 저지 (특히 TPS의 높은 발현시에), 바늘형 잎의 형성, 클로로필의 증가 및 전분 함량의 증가에 의한 보다 어두운 색깔을 발생시킨다는 것을 알 수 있다. 상기 기술한 바와 같이, 안티센스 트레할라제 구축물의 도입은 TPS 도입과 유사한 효과를 촉진시킬 것이다. 따라서, TPS에 대해 나타낸 적용법은 안티센스 트레할라제를 사용함으로써 동일하게 달성될 것이다. 또한, TPS 및 안티센스 트레할라제의 이중 구축물을 사용하면 하나의 구축물의 효과를 강화시킨다.
성장 방해는 일본 본사이(bonsai) 나무가 대표적인 예인 원예 식물에서 요구되는 현상이다. 그러나, 다종자 목초, 장미, 아마릴리스, 호르텐시아(Hortensia), 자작나무 및 야자와 같은 식물에서 작은 꽃의 생성은 경제적인 기회를 제공할 것이다. 식물계 외에, 성장 방해는 동물에서도 유용하다. 상추와 같은 작물에서 추대를 유도하는 것도 가능하다. 이것은 종자의 신속한 생산을 가능하게 하기 때문에 유리하다. 상기 효과에 대한 TPS는 이상적으로는 유도가능 프로모터의 조절 하에 발현되어야 한다. 성장 우세의 상실은 많은 싹을 형성시키고, 이것은 알팔파의 경우 경제적으로 중요하다.
성장 저하는 야채가 스낵의 형태로 소비되는 것으로 생각되는 "야채 스낵" 산업에 요구된다. 체리-토마토는 상업적으로 성공한 크기가 작아진 예이다. 또한, 양배추, 꽃양배추, 당근, 사탕무 및 고구마와 같은 다른 야채 및 사과, 배, 복숭아, 멜론과 같은 과일 및 망고 및 바나나와 같은 몇몇 열대 과일도 소형 크기로 시판할 수 있을 것이다.
발육 저지는 기관에 해로운 모든 세포, 예를 들어 병원체 세포 및 암세포에 요구된다. 이러한 면에서, T-6-P 수준을 변화시킴으로써 성장 조절에서의 기능을 알 수 있다. T-6-P 수준의 증가는 암조직의 성장 및 대사를 감소시킬 것이다. T-6-P의 세포내 수준을 증가시키는 한 방법은 내생 TPP 유전자 내에 변이를 도입하는 특정 재조합을 도입함으로써 상기 세포의 TPP 유전자를 제거하는 것이다. 이를 수행할 수 있는 한 방법은 암세포 특이적 흡수 항체를 통하여 내생 유전자에 변이를 도입할 수 있는 DNA 서열을 도입하는 것이다. 또다른 방법은 상기 DNA를 사용한 표적 미립자 폭격이다. 제3의 방법은 상기 DNA를 갖는 암세포 특이적 바이러스 벡터를 사용하는 것이다.
T-6-P의 농도 증가와 함께 발견되는 암녹색 현상은 꽃 관상용 식물 및 일반적으로 원예 식물종 및 잔디에 바람직한 특성이다.
또한, T-6-P의 수준 증가는 전분 및 수크로스와 같은 저장 탄수화물의 증가를 야기한다. 이것은 탄수화물 저장 조직이 많은 물질을 저장할 수 있게 된다는 것을 의미한다. 이것은 식물에서 괴경 및 사탕무에서와 같은 두꺼운 뿌리(수크로스의 저장)와 같은 저장 기관의 생중량이 증가된다는 것을 보여주는 실시예에 의해 입증될 수 있다.
이와같은 상황이 매우 유리한 작물은 감자, 사탕무, 당근, 치커리 및 사탕수수이다.
감자에서 추가로 경제적으로 중요한 효과는 TPS 유전자 (T-6-P를 증가시킴)를 코딩하는 DNA로 형질전환된 후에 저온 조건 (4℃) 하에서 괴경의 수확 및 저장 후에도 가용성 당의 양이 감소한다는 것이 발견되었다. 일반적으로, 조기 발아를 억제하기 위해 저온 저장이 필요하지만, 이것은 감자의 단맛을 과도하게 만든다. 환원당과 아미노산 사이에 마일라드 (Maillard) 반응이 발생하여 갈색화를 야기하기 때문에 단맛의 감자 괴경은 가공에 적합하지 않고, 따라서 환원당의 양의 감소는 식품산업에 매우 중요하다.
동일한 방식으로, 인버타제의 활성 억제는 효소 TPS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 사탕무를 형질전환시켜 수득할 수 있다. 수확 후에 사탕무에서 인버타제 활성의 억제는 경제적으로 매우 중요하다.
또한, 과실 및 종자에서 저장은 변경될 수 있다. 이것은 저장 능력의 증가 및 저장되는 화합물의 조성의 변화를 야기한다. 종자 생산량의 증가가 특히 중요한 작물은 옥수수, 벼, 씨리얼, 완두, 평지씨, 해바라기, 대두 및 콩류이다. 또한, 모든 과일 생산 식물은 저장된 탄수화물의 양 및 조성을 변화시키는 적용성이 중요하다. 특히, 과실의 경우 저장된 생성물의 조성은 과실의 단단함 및 고형성에 변화를 주고, 이것은 토마토, 바나나, 딸기, 배, 장과류 및 포도와 같은 연한 과일에 특히 중요하다.
TPP의 발현에 따라 관찰되는 효과에 대조적으로, TPS의 발현은 잎에서의 단백질/탄수화물의 비율을 저하시킨다. 이 효과는 사료용 목초 및 알팔파와 같은 잎 작물에서 중요하다. 또한, 잎의 생중량은 감소하는데, 이것은 잔디에 중요할 수 있지만, 더 중요한 것은 이들이 비교적 증가된 에너지 함량을 갖는다는 것이다. 이러한 특성은 양파, 부추 및 사료용 옥수수에 특히 유리하다.
또한, 종자의 생육력도 세포내에서 유용한 T-6-P의 수준에 의해 영향받을 수 있다.
식물의 일부에서의 TPP 및 식물의 다른 일부에서의 TPS의 발현의 조합은 상기 효과를 증가시키는 시너지 효과를 발휘할 수 있다. 또한, 특정 프로모터를 사용하여 발생 중에 연속적인 유전자를 발현시킬 수도 있다. 최종적으로, 유도가능 프로모터의 조절 하에 유전자 서열을 위치시켜 관련된 유전자 중의 어느 하나의 발현을 유도할 수 있다. 상기 적용 방법의 조합은 당업계의 숙련가에게 자명할 것이다.
본 발명은 추가로 하기 실시예에 의해 예시된다. 실시예는 본 발명의 특정 실시형태를 나타낸 것으로서, 이들 실시예의 변형 및 다른 식물 또는 발현 시스템의 사용은 본 발명에 분명하게 포함된다.
실험
DNA 조작
모든 DNA 처리 (이. 콜리로부터의 DNA 단리, 제한효소 처리, 라이게이션, 형질전환 등)는 표준 프로토콜에 따라 수행하였다 (샘브룩 (Sambrook) 등의 문헌 [Molecular Cloning (1989): a laboratory manual, 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, 미국 뉴욕주 소재] 참조).
균주
모든 실시예에서 이. 콜리 K-12 균주인 DH5α를 클로닝에 사용하였다. 식물 형질전환 실험에 사용된 아그로박테리움 튜머페신즈 (Agrobacterium tumefaciens) 균주는 EHA 105 및 MOG 101이었다 (후드 (Hood) 등의 문헌 [Trans. Research 2, 208 (1993)] 참조).
아그로박테리움 균주 MOG101의 작제
아그로박테리움 균주 MOG101의 구축은 국제 특허 출원 공개 제WO96/21030호에 기술되어 있다.
이. 콜리의 otsA 유전자의 클로닝 및 pMOG799의 구축
이. 콜리에서 트레할로스 포스페이트 신타제 (trehalose phosphate synthase, TPS)는 otsBA 오페론에 위치하는 otsA 유전자에 의해 코딩된다. ostA 유전자의 클로닝 및 서열 결정은 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되어 있는 국제 특허 출원 공개 제WO95/01446호의 실시예 I에 상세하게 기술되어 있다. 식물 세포에서의 그의 발현을 달성하기 위하여 개봉 판독 프레임은 국제 특허 출원 공개 제WO95/01446호의 실시예 I에 더 상세하게 기술되어 있는 바와 같이 CaMV 35S RNA 프로모터의 전사 조절 요소, ALMV 리더의 번역 인핸서, 및 nos-유전자의 전사 터미네이터에 결합시켜 pMOG799를 수득한다. pMOG799를 포함하는 이. 콜리 균주의 샘플은 네델란드 3740 아게 바른 피.오. 박스 273 오스테르스트라트 1에 소재하는 센트랄 뷰로 푸어 심멜쿨투레스에 1993년 8월 23일 월요일에 부다페스트 조약 하에 기탁되었으며 국제 수탁 협회에 의해 부여된 수탁 번호는 CBS 430.93이다.
파타틴 프로모터의 단리/pMOG546의 구축
파타틴 프로모터 단편은 솔라늄 투베로숨 씨브이. 빈체 (Solanum tuberosum cv. Bintje)의 염색체 DNA로부터 폴리머라제 체인 반응을 사용하여 단리시켰다. 하기 서열로 이루어진 λpat21 파타틴 유전자의 상류 부위의 서열에 상보성인 올리고뉴클레오티드의 세트 (베반 (Bevan) 등의 문헌 [Nucl. Acids Res. 14, 5564 (1986)] 참조)를 합성시켰다.
5' AAG CTT ATG TTG CCA TAT AGA GTA G 3' PatB33.2 (서열 5)
5' GTA GTT GCC ATG GTG CAA ATG TTC 3' PatATG.2 (서열 6)
상기 프라이머를 사용하고 주형으로서 감자 씨브이. 빈체로부터 단리시킨 염색체 DNA를 사용하여 1123bp의 DNA 단편을 PCR로 증폭시켰다. 증폭된 단편은 λpat21 파타틴 서열과 고도의 유사성을 나타내며 EcoRI 링커를 사용하여 pUC18 벡터 내로 클로닝시켜 플라스미드 pMOG546을 구축하였다.
pMOG845의 구축
pMOG845의 구축은 국제 특허 출원 공개 제96/21030호에 기술되어 있다.
pVDH318, 플라스토시아닌-TPS의 구축
플라스미드 pMOG798 (국제 특허 출원 공개 제WO95/01446호에 기술되어 있음)을 HindIII로 절단시키고 올리고뉴클레오티드 이중가닥 TCV11 및 TCV12에 라이게이션시켰다 (pMOG845의 구축법 참조). 생성된 벡터를 PstI 및 HindIII로 절단시킨 후 PotPiII 터미네이터를 삽입시킴으로써 pTCV118을 구축하였다. 플라스미드 pTCV118을 SmaI 및 HindIII로 절단시켜 TPS 코딩 영역 및 PotPiIII 터미네이터를 포함하는 DNA 단편을 수득하였다. BglII 링커를 첨가하였고 생성된 단편을 BamHI으로 절단된 식물 2원 발현 벡터 (도 1)인 pVDH275에 삽입시켜 pVDH318을 구축하였다. pVDH275는 35S CaMV 프로모터, 및 완두의 플라스토시아닌 (PC) 프로모터 및 nos 터미네이터 서열을 포함하는 발현 카세트의 조절 하의 NPTII 선발 마커를 포함하는 pMOG23의 유도체이다 (시몬스 (Sijmons) 등의 문헌 Bio/Technol. 8, 217 (1990)] 참조). pVDH275에 존재하는 플라스토시아닌 프로모터는 퓌 및 그레이 (Pwee & Gray)의 문헌 [Plant J. 3, 437 (1993)]에 기술되어 있다. 상기 프로모터는 PCR 증폭 및 적당한 클로닝 부위를 포함하는 프라이머를 사용하여 2원 벡터로 옮겼다.
이. 콜리 otsB 유전자의 클로닝 및 pMOG1010의 구축 (35S CaMV TPP)
올리고뉴클레오티드 세트인 TPP I (5' CTCAGATCTGGCCACAAA 3') (서열 번호: 56) 및 TPP II (5'- GTGCTCGTCTGCAGGTGC 3') (서열 번호: 57)을 이. 콜리의 TPP 유전자 (서열 번호 3)의 서열에 상보적으로 합성시켰다. 상기 프라이머를 사용하고 주형으로서 pMOG748 (국제 특허 공개 출원 제WO95/01446호)를 사용하여 이. 콜리의 TPP 유전자의 코딩 영역의 3' 부분을 포함하고, 종결 코돈의 10 bp의 하향의 PstI 부위를 도입하는 375 bp의 DNA 단편을 PCR로 증폭시켰다. 상기 PCR 단편은 BglII 및 PstI으로 절단시켜 pMOG445에 클로닝시켰고 (유럽 특허 출원 제0 449 376 A2의 실시예 7a) BglII 및 PstI으로 선형화하였다. 생성된 벡터를 PstI 및 HindIII로 절단시켰고 PotPiII 터미네이터를 삽입시켰다 (pMOG845의 구축법 참조). 상기한 벡터를 BglII 및 HindIII로 절단시켰고 생성된 1325 bp의 단편을 단리시켰으며 SmaI 및 BglII로 절단시킨 5'TPP의 PCR된 단편과 함께 SmaI 및 HindIII로 선형화시킨 pUC18에 클로닝시켰다. 그 결과 생성된 벡터를 pTCV124라고 칭하였다. 상기 벡터를 EcoRI 및 SmaI으로 선형화하였고 이것은 35S CaMV 프로모터를 삽입시키는 데 사용되었다 (35S CaMV 이중 인핸서 프로모터를 포함하는 pMOG18로부터 단리시킨 850 bp의 EcoRI-'NcoI' (NcoI 부위는 멍빈 (mungbean) 뉴클레아제 처리에 의해 블런트(blunt)로 만듦)). 상기 벡터를 pTCV127로 칭하였다. 상기 벡터로부터 완전한 35S TPP 발현 카세트를 포함하는 2.8 kb의 EcoRI-HindIII 단편을 단리시켰고 2원 벡터인 pMOG800에 클로닝하여 벡터 pMOG1010을 구축하였다.
pVDH321, 플라스토시아닌 (PC) TPP의 구축
플라스미드 pTCV124의 BamHI 부위를 BamHI 절단, 필링-인 (filling-in) 및 그 이후의 재라이게이션으로 제거하였다. 그 후 HindIII 및 EcoRI으로 절단시켜 TPP 코딩 영역 및 PotPiII 터미네이터를 포함하는 DNA 단편을 수득하였다. BamHI 링커를 첨가하였고 그 결과 생성된 단편을 식물 2원 발현 벡터인 pVDH275 (BamHI으로 절단)에 삽입시켜 pVDH321을 수득하였다.
파타틴 TPP 발현 벡터의 구축
파타틴 TPS 발현 벡터의 구축방법과 유사하게 (pMOG845의 구축 참조) 파타틴 TPP 발현 벡터를 구축하여 형질전환 후에 괴경에 특이적인 방식으로 TPP가 발현되게 할 수 있는 2원 벡터 (pMOG1128)을 수득하였다.
다른 발현 벡터의 구축
상이한 프로모터가 사용되는 상기 벡터의 구축과 유사하게 NPTII 유전자 또는 선별가능한 마커 유전자로서 히그로마이신 내성 유전자를 포함하는 2원 벡터를 사용하여 TPS, TPP 또는 트레할라제와 함께 유전자 구축물을 제조하였다. HPT 선발 마커를 포함하는 2원 벡터인 pMOG22가 고딘 (Goddijn) 등의 문헌 [Plant J. 4, 863 (1993)]에 기술되어 있다.
삼점 교배
2원 벡터는 삼점 교배에 있어서 플라스미드 pRK2013을 포함하는 이. 콜리 균주 HB101 (디타 (Ditta) 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 7347 (1980)] 참조)로 아그로박테리움 튜머페신즈 균주 MOG101내로 이동시켰고 형질전환용으로 사용하였다.
담배 (니코티아나 타바쿰 (Nicotiana tabacum) 씨브이. SR1 또는 씨브이. 삼순 (Samsun) NN)의 형질전환
담배는 기술되어 있는 바와 같이 관심있는 식물 조직과 2원 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜머페신즈 균주 MOG101을 함께 공동배양시킴으로써 형질전환시켰다. 형질전환은 호르쉬 (Horsch) 등의 문헌 [Science 227, 1229 (1985)]에 기술된 바와 같이 담배 잎 디스크의 공동배양법을 사용하여 수행하였다. 형질전환 식물은 카나마이신을 포함하는 선발 배지 상에서 자라는 새순 (shoot)으로부터 재생시켰고 뿌리를 내리게 하였으며 토양으로 옮겼다.
감자의 형질전환
감자 (솔라눔 투베로숨 (Solanum tuberosum) 씨브이. 카르달 (Kardal))는 관심있는 2원 벡터를 포함하는 아그로박테리움 균주 EHA 105로 형질전환시켰다. 기본 배양 배지는 필요할 경우 8 g/ℓ의 다이친 (Daichin) 아가로 고체화되는, MS 염 (무라시게 (Murashige) 및 스쿡 (Skoog)의 문헌 [Physiol. Plant. 14, 473 (1962)] 참조), R3 비타민 (옴스 (Ooms) 등의 문헌 [Theor. Appl. Genet. 73, 744 (1987)] 참조), 30 g/ℓ의 수크로스, 최종 pH가 5.8 (KOH로 조정됨)인 0.5 g/ℓ의 MES로 이루어진 MS30R3 배지였다. 솔라눔 투베로숨 씨브이. 카르달의 괴경의 껍질을 벗겨 96%의 에탄올에서 5초 동안 그을림으로써 표면을 살균시켰다. 멸균수에서 화염을 끄고 두께가 약 2 mm인 조각으로 잘랐다. 디스크는 구멍을 뚫어 도관 조직으로부터 잘라내었고 2원 벡터를 포함하는 아그로박테리아 EHA 105의 ml 당 1 x 108내지 5 x 108의 박테리아를 포함하는 MS30R3 배지에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 괴경 디스크는 MS30R3 배지로 세척시켰고 후배양용의 고체화 배지 (PM)로 옮겼다. PM은 3.5 mg/ℓ의 제아틴 리소사이드 및 0.03 mg/ℓ의 인돌 아세트산 (IAA)가 보충된 M30R3 배지로 이루어진다. 2일 후 디스크를 200 mg/ℓ의 세포탁심 및 100 mg/ℓ의 반코마이신을 포함하는 신선 PM 배지로 옮겼다. 3일 후에 괴경 디스크를 250 mg/ℓ의 카르베니실린 및 100 mg/ℓ의 카나마이신을 포함하는 PM 배지로 이루어진 새순 유도 배지 (shoot induction media, SIM)으로 옮겼다. 4 내지 8주 후에 디스크로부터 나타나는 새순을 절제하여 뿌리를 내리게 하는 배지 (100 mg/ℓ의 세포탁심, 50 mg/ℓ의 반코마이신 및 50 mg/ℓ의 카나마이신을 포함하는 MS30R3 배지)에 두었다. 새순은 분열조직 절단에 의해 무균적으로 증식시켰다.
상추의 형질전환
상추인 라투카 사티바 씨브이. 에볼라 (Lattuca sativa cv. Evola)의 형질전환을 커티스 (Curtis) 등의 문헌 [J. Exp. Bot. 45, 1441 (1994)]에 따라 수행하였다.
사탕무의 형질전환
사탕무인 베타 불가리스 (Beta vulgaris, 보존 집단)의 형질전환은 프라이 (Fry) 등의 문헌 [Third International Congress of ISPMB, Tucson USA Abstract No. 384 (1991)] 또는 크렌스 (Kresn) 등의 문헌 [Plant Sci. 116, 97 (1996)]에 따라 수행하였다.
리코레르시콘 에스쿨렌툼 (Lycopersicon esculentum)의 형질전환
토마토 형질전환은 반 로에켈 (Van Roekel) 등의 문헌 [Plant Cell Rep. 12, 644 (1993)]에 따라 수행하였다.
아라비돕시스 (Arabidopsis)의 형질전환
아라비돕시스 탈리아나의 형질전환은 클라크 (Clarke) 등의 문헌 [Plant. Mol. Biol. Rep. 10, 178 (1992)]에 기술되어 있는 방법 또는 발브켄스 (Valvekens) 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5536 (1988)]에 기술되어 있는 방법 중 어느 한 방법에 따라 수행하였다.
미세괴경의 유도
보조 분열조직을 포함하는 실험실내 감자 식물의 줄기 단편을 미세괴경 유도 배지에 옮겼다. 미세괴경 유도 배지는 R3 비타민, 0.5 g/ℓ의 MES (KOH로 최종 pH를 5.8로 조정함)가 보충되고 8 g/ℓ의 다이친 아가, 60 g/ℓ의 수크로스 및 2.5 mg/ℓ의 키네틴으로 고체화된 1 X MS-염을 포함한다. 24℃에서 암실에서의 3 내지 5주의 배양 후 미세괴경이 형성되었다.
발리다마이신 A의 단리
발리다마이신 A는 다양한 공급원으로부터의 트레할라제의 고도의 특이적 억제제이며 IC50의 범위가 10－6M 내지 10－10M인 것으로 밝혀졌다 (아사노 (Asano) 등의 문헌 [J. Antibiot. 40, 526 (1987)]; 가메다 (Kameda) 등의 문헌 [J. Antibiot. 40, 563 (1987)] 참조). 트레할라제를 제외하고는 발리다마이신 A는 어떤 α- 또는 α-글리코히드롤라제 활성도 현저하게 억제하지 않는다. 발리다마이신 A는 켄달 등의 문헌 [Phytochemistry 29, 2525 (1990)]에 기술되어 있는 바와 같이 시판되는 농업용 조성물 (일본 도꾜 소재의 Takeda Chem. Indust. 사)인 솔라콜 (Solacol)로부터 단리하였다. 방법은 솔라콜의 3%의 농업용 조성물로부터의 이온 교환 크로마토그래피 (QAE-세파덱스 A-25 (파마시아 사), 베드 부피 10 ml, 평형 완충제: pH가 7인 0.2 mM의 Na-Pi)를 포함한다. 칼럼 상에 1 ml의 솔라콜을 로딩하고 7개의 분획물로 물을 사용하여 용출시키면 실질적으로 모든 발리다마이신이 분획 4에서 회수되었다. 100%의 회수율을 기준으로 상기 방법을 사용하여 트레할로스 축적 시험에 사용하기 위하여 발리다마이신 A의 농도를 MS-배지 중 1.10－3M로 조정하였다. 별법으로 본 명세서에 참고로써 그 내용이 인용되어 있는 이와사 (Iwasa) 등의 문헌 [J. Antibiot. 24, 119 (1971)]에 기술되어 있는 바와 같이 발리다마이신 A 및 B를 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스 (Streptomyces hygroscopicus) 변종 리모네우스 (limoneus)로부터 직접적으로 정제할 수 있다.
탄수화물 분석
탄수화물은 펄스 (pulsed) 전기 화학적 검출법으로 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정량적으로 측정하였다. 추출물은 균질화한 냉동 재료를 80%의 EtOH로 추출함으로써 제조하였다. 실온에서 15분 동안 추출한 후 용해성 분획물을 증발시키고 증류수에 용해시켰다. 25 μl의 샘플을 4×250 mm의 디오넥스 (Dionex) 35391 카보팩 (carbopac) PA-1 칼럼 및 4×50 mm의 디오넥스 43096 카보팩 PA-1 예비칼럼이 갖추어진 디오넥스 DX-300 액체 크로마토그래프 상에서 분석하였다. 용출은 100 mM의 1 ml/분에서 NaOH로, 이어서 NaAc 구배로 수행하였다. 당은 펄스 전기화학적 검출기 (디오넥스, pulsed electrochemical detector, PED)로 검출하였다. 시그마사로부터 구매 가능한 탄수화물을 표준물로서 사용하였다.
전분 분석
전분 분석은 아만 (Aman) 등의 문헌 [Methods in Carbohydrate Chemistry, 제X권 (편집자: 베밀러 (BeMiller) 등), 제111 내지 115페이지 (1994)]에 기술되어 있는 바와 같이 수행하였다.
발현 분석
다양한 식물 종에 도입된 유전자의 발현은 노던 (Northern) 블롯 분석법을 사용하여 모니터하였다.
트레할로스-6-포스페이트 포스파타제 분석
TPP는 [14C]트레할로스-6-포스페이트로부터의 [14C]트레할로스의 생성을 측정함으로써 37℃에서 분석하였다 (론데스보로우 (Londesborough) 및 부오리오 (Vuorio)의 문헌 [J. of Gen. Microbiol. 137, 323 (1991)] 참조). 샘플은 1 mg/ml의 BSA를 포함하는 추출 완충제 중 단백질 농도가 1 mg/ml이 되도록 희석시켰다. 표준 분석 혼합물 (50 μl의 최종 부피)은 27.5 mM의 트리스, pH가 7.4인 HCl, 5.5 mM의 MgCl2, 1 mg/ml의 BSA 및 0.55 mM의 T-6-P (854 cpm/nmol의 비활성)를 포함하였다. 반응은 5 μl의 효소를 첨가함으로써 시작하였고 1시간 후에 끓는 물에서 5분 동안 가열함으로써 종결시켰다. AG1-X8 (포르메이트) 음이온 교환 수지 (바이오라드 (BioRad)사)를 첨가하였고 반응 혼합물을 실온에서의 평형 20분 후 원심분리시켰다. 400 μl의 샘플의 상청액에서의 방사능을 액체 섬광 카운팅 (liquid scintillation counting)으로 측정하였다.
헥소키나제 분석을 위한 식물 추출물의 제조
냉동 식물 재료를 액체 질소에서 미분화하였고 Proteinase Inhibitors Complete (뵈링거 만하임 (Boehringer Mannheim)사)를 포함하는 추출용 완충제 (EB: pH 7.0 (KOH)의 100 mM의 HEPES, 1% (w/v)의 PVP, 5 mM의 MgCl2, 1.5 mM의 EDTA, 0.1% (v/v)의 β-MeOH)를 사용하여 30초 동안 균질화하였다. 원심분리 후 상청액 중의 단백질을 80%의 황산암모늄을 사용하여 침전시켰고 pH가 7.4인 트리스-HCl에 용해시켰으며 추출물을 pH가 7.4인 100 mM의 트리스-HCl에 대하여 밤새 투석시켰다. 샘플의 일부를 헥소키나제 분석에 사용하였다.
헥소키나제 분석
헥소키나제 활성은 0.1 M의 HEPES-KOH (pH 7.0), 4 mM의 MgCl2, 5 mM의 ATP, 0.2 mM의 NADP+, 10 U/ml의 크레아틴 포스페이트 키나제 (50% 글리세롤, 0.1% BSA, pH가 7.0인 50 mM Hepes에 용해되어 있음), 3.5 mM의 크레아틴 포스페이트, 7 U/ml의 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 및 2 mM의 글루코스를 포함하는 분석물에서 25℃에서 340 nm에서의 OD 증가치를 측정함으로써 측정하였다.
2 mM의 과당을 헥소키나제 반응용의 기질로서 글루코스 대신에 사용하는 경우, 3.8 U/ml의 포스포글루코스 이소머라제를 포함하였다. 별법으로 간세도 (Gancedo) 등의 문헌 [J. Biol. Chem. 252, 4443 (1977)]에 기술되어 있는 바와 같은 헥소키나제 분석법을 사용하였다.
<실시예 1>
담배 및 감자에서의 이. 콜리 otsA 유전자 (TPS)의 발현
de35SCaMV 프로모터 (pMOG799) 또는 플라스토시아닌 프로모터 (pVDH318)에 의해 작동되는 otsA 유전자를 포함하는 형질전환 담배 식물을 제조하였다.
감자의 괴경에 특이적인 파타틴 프로모터에 의해 작동되는 otsA 유전자 (pMOG845)를 포함하는 형질전환 감자 식물을 제조하였다.
담배 잎 디스크는 아그로박테리움 튜머페신즈를 사용하여 2원 벡터인 pMOG799로 형질전환시켰다. 형질전환 새순은 카나마이신 상에서 선발하였다.
토양에서 재배된 몇몇 식물의 잎은 측면 방향으로 완전히 넓어지지 않아 란셋 모양의 형태가 되었다 (도 31). 또한 정상 우성이 감소되어 성장이 저지되었고 다수의 엽액 새순이 형성되었다. 32개의 식물 중 7개에서 개화시의 식물 높이가 4 내지 30 cm에 이르러 심각한 성장 감소를 나타내었다 (표 1).
otsA 형질전환 담배 식물의 잎 샘플에서의 트레할로스 축적 및 개화시의 그의 식물 길이.
식물 주 트레할로스 (mg/g-1의 습윤 중량) 길이 (cm)
대조군 0.00 60 내지 70
799-1 0.04 ND
799-3 0.02 10
799-5 0.08 4
799-15 0.055 30
799-24 0.02 12
799-26 0.05 25
799-32 0.055 30
799-40 0.11 25
ND: 결정되지 않음.
대조 식물의 길이는 개화시에 60 내지 70 cm에 이르렀다. 형질전환 주에서는 종자가 덜 생성되었고 성장이 저지된 표현형이 나타났다. 노던 블롯 분석으로 저지 표현형을 갖는 식물이 이. 콜리의 otsA 유전자를 발현한다는 것을 확인하였다 (도 2). 대조 식물에서는 전사물을 전혀 검출할 수 없었다. 도입 유전자의 기능성은 온실에서 배양한 32개의 형질전환 담배 식물로부터의 잎 재료의 탄수화물 분석으로 증명하였는데, 길이가 감소된 식물에서 0.02 내지 0.12 mg/g-1의 습윤 중량을 갖는 트레할로스가 존재한다는 것이 나타났고 (표1) 이는 TPS-촉매화 반응의 생성물이 식물의 포스파타제에 의해 탈포스포릴화된다는 것을 나타낸다. 담배에서의 트레할로스의 축적에 대한 다른 증거는 조 추출물을 돼지 트레할라제로 처리함으로써 얻어졌다. 담배 잎 추출물을 트레할라제와 함께 장기간 인큐베이션시키면 트레할로스가 완전히 분해되었다 (데이타는 나타내지 않음). 트레할로스는 대조 식물 또는 발육이상의 표현형이 없는 형질전환 담배 식물에서는 검출되지 않았다.
PC-TPS의 1차 담배 형질전환체
식물주 잎 fw(g) 잎 면적 (cm2) 가지의 수 식물의 길이 (cm) 잎 색상 보조 새순 Fw/면적(g/cm2) 건조 물질 (%) 건조 물질/면적 (g/cm2)
대조 1 8.18 349.37 1 wt 0.023 7.21 0.0017
대조 2 10.5 418.89 1 wt 0.025 9.52 0.0024
대조 3 9.99 373.87 1 wt 0.027 12.91 0.0035
대조 4 9.91 362.92 1 wt 0.025 9.59 0.0026
대조 5 9.82 393.84 1 wt 0.0254 11.51 0.0029
평균 10.148 0.0026
2 8.39 290 2 105 wt 0.029 12.16 0.0035
3 9.34 296 1 123 wt 0.032 12.21 0.0039
4 8.36 254 2 130 wt 많음 0.033 10.05 0.0033
6 2.28 106 5 90 wt 0.022 11.40 0.0025
8 5.21 133 4 100 어두움 많음 0.039 7.49 0.0029
10 8.08 258 2 165 어두움 많음 0.031 12.25 0.0038
11 2.61 64 12 95 어두움 많음 0.041 9.20 0.0038
13 2.83 92 1 150 어두움 많음 0.031 8.48 0.0026
16 5.86 209 3 130 어두움 많음 0.028 10.58 0.0030
17 5.15 224 2 155 wt 0.023 11.65 0.0027
18 17.2 547 1 133 wt 0.031 10.35 0.0033
19 2.13 63 4 80 어두움 많음 0.034 11.74 0.0040
20 3.44 113 4 90 wt+어두움 많음 0.030 8.14 0.0025
21 9.88 246 1 105 어두움 많음 0.040 8.50 0.0034
22 13.1 409 1 135 wt 0.032 10.68 0.0034
23 2.50 73 6 55 어두움 많음 0.034 8.80 0.0030
24 8.76 286 2 130 wt 0.031 15.07 0.0046
27 7.91 219 1 124 wt 0.036 14.41 0.0052
28 10.0 269 2 117 어두움 많음 0.038 8.62 0.0032
29 4.17 142 1 85 어두움 많음 0.029 10.07 0.0030
30 10.2 343 1 160 wt 0.030 9.56 0.0029
32 1.95 61 3 75 어두움 많음 0.032 8.21 0.0026
33 2.85 96 5 95 wt+어두움 많음 0.030 11.23 0.0033
34 8.38 244 1 123 wt 0.032 13.60 0.0047
35 5.59 173 3 126 wt 0.030 14.49 0.0047
36 3.28 84 3 100 어두움 많음 0.034 11.28 0.0044
37 7.80 222 1 125 wt+어두움 많음 0.032 11.28 0.0040
39 3.70 131 2 123 wt 0.039 17.84 0.0050
40 2.40 68.5 3 108 어두움 많음 0.035 9.58 0.0034
평균 0.028 11.00 0.0035
형질전환용의 pVDH318로 형질전환된 담배 식물은 성장 발육이 저지되어 발생하였고 대조 잎보다 더 암녹색이고 약간 더 두꺼운 작은 잎이 발생하였는데, 이는 pMOG799 형질전환 식물과 유사한 표현형이다 (표 1a). 상기 잎을 더 분석하였더니 대조군과 비교하여 잎 면적 당 습윤 중량 및 건중량이 증가하였음이 나타났다 (표 1a 및 2). 암녹색의 잎은 형질전환 잎에서 클로로필이 더 존재한다는 것을 나타낸다 (표 1b). pMOG799 (35STPS) 및 pMOG1177 (PCTPS)의 형질전환 식물을 용해성 탄수화물, 클로로필, 트레할로스 및 전분에 대하여 분석하였다 (도 32). pMOG1177은 기능적으로 pVDH318과 동일하였다.
PC-TPS로 형질전환된 엔. 타바쿰 잎의 클로로필 함량 (To)
샘플 클로로필 (mg/잎의 g)
대조군 1 0.59
PC TPS 10-1 0.75
PC TPS 10-2 0.80
PC TPS 11 0.60
PC TPS 13 0.81
PC TPS 16 0.90
PC TPS 19 0.64
PC TPS 37 0.96
주: 재배 동안의 광 조건은 클로로필의 결정 수준에 현저하게 영향을 미칠 것임. 따라서 클로로필의 계산양은 단지 1회의 실험 이내에서 수확되고 분석된 식물들 사이에서만 비교할 수 있음.
플라스토시아닌-TPS이. 콜리로 형질전환된 잎 재료의 습윤 중량 및 건중량 데이터
PC-TPS로 형질전환된 엔. 타바쿰 씨브이. 삼순 엔엔
형질전환체 대조군
습윤 중량 (g) 0.83 0.78
건중량 (g) 0.072 0.079
건조 물질 (%) 8.70 % 10.10 %
습윤 중량/면적 39 (139%) 28 (100%)
건중량/면적 3.46 (121%) 2.87 (100%)
면적 (유닛) 208 275
발생 잎의 길이 및 폭 사이의 비율을 계산해보면 PC-TPS로 형질전환된 식물의 잎이 더 란셋 모양을 갖는다는 것이 나타난다 (표 3).
감자인 솔라눔 투베로숨 씨브이. 카달 괴경 디스크를 2원 벡터인 pMOG845를 포함하는 아그로박테리움 튜머페신즈 EHA105로 형질전환시켰다. 형질전환체는 결여 (empty) 벡터 대조군에 필적한 형질전환 빈도로 얻어졌다. 수득된 모든 식물은 야생형과 표현형상 구별할 수 없었는데 이는 조직에 특이적인 프로모터를 사용함으로써 컨스티튜티브 (constitutive) 프로모터가 TPS 유전자를 작동시키는 식물에서 관찰되는 표현형이 방지되었음을 나타낸다. 미세 괴경은 10-3M의 발리다마이신 A가 보충된 미세괴경 유도 배지 상에서 배양된 형질전환 식물 및 야생형 식물의 줄기 단편 상에서 유도하였다. 대조군으로서 발리다마이신 A가 없는 배지 상에서 미세괴경을 유도하였다. 발리다마이신 A를 포함하는 배지 상에서 유도된 미세괴경은 발리다마이신 A가 없는 배지 상에서 성장한 미세괴경과 비교하여 트레할로스의 수준이 상승되었음이 나타났다 (표 4). 야생형 식물에서 트레할로스가 소량 존재한다는 것은 기능적인 트레할로스 생합성 경로가 존재한다는 것을 나타낸다.
pVDH318로 형질전환된 담배 식물 (씨브이. 삼순 엔엔)
형질전환체 길이 (cm) 폭 (cm) 비율 1/w
대조 1 12 8 1.50
대조 2 13 8.5 1.53
대조 3 12 7.5 1.60
대조 4 15 9 1.67
대조 5 25 16 1.56
대조 6 24 16.5 1.45
대조 7 28 20 1.40
대조 8 25 16 1.56
대조 9 26 19 1.37
대조 10 21 15 1.40
1318-28 16 8.5 1.88*
1318-29 11 6.5 1.69
1318-30 19 14 1.36
1318-35 19 12 1.58
1318-39 21 16.5 1.27
1318-40 14 7 2.00*
1318-34 21 13 1.62
1318-36 13.5 7 1.93*
1318-37 17 9 1.89*
1318-4 20.5 12 1.71
1318-23 14 4.5 3.78*
1318-22 27 18 1.50
1318-19 9 4 2.25*
1318-2 27 19 1.42
1318-15 11 5 2.20*
1318-10 20 13 1.54
1318-3 25 18 1.39
1318-21 17 8.5 2.00*
1318-16 20 10 2.00*
1318-6 19 10.5 1.81
1318-20 13 5 2.60*
1318-33 12 5 2.40*
1318-27 23 20 1.15
1318-11 12 5 2.40*
1318-8 18.5 6.5 2.85*
1318-24 27 17 1.59
1318-13 15 7 2.14*
1318-17 24 16 1.50
1318-18 23 16.5 1.39
* 전형적인 TPS 표현형 ; 대조군의 비율 1/w 평균은 1.50임.
트레할로스 (습윤 중량 %)
+발리다마이신 A -발리다마이신 A
845-2 0.016 -
845-4 - -
845-8 0.051 -
845-11 0.015 -
845-13 0.011 -
845-22 0.112 -
845-25 0.002 -
845-28 0.109 -
야생형 카르달 0.001 -
<실시예 2>
담배에서의 이. 콜리 otsB 유전자 (TPP)의 발현
이중 증강된 35SCaMV 프로모터 (pMOG1010) 및 플라스토시아닌 프로모터 (pVDH321)에 의해 작동되는 otsB 유전자를 포함하는 형질전환 담배 식물을 만들었다.
pMOG1010으로 형질전환된 담배 식물 (씨브이. 삼순 엔엔)은 온실에서 완전히 발생되었을 경우 백화 현상으로 발전하기 시작하는 매우 큰 잎 (잎의 면적은 평균 약 140%까지 증가하였음)의 발생을 나타내었다 (도 31). 또한 대조군과 비교하여 더 두꺼운 줄기가 형성되었으며 몇몇 경우 줄기가 가득해진다. 몇몇 경우 다중 줄기가 식물의 기저부로부터 형성되었다 (가지의 분기, 표 5). 큰 잎을 발생시키는 식물의 잎 샘플에서 대조 식물과 비교하여 5 내지 10배 증강된 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제 활성이 나타났는데 이는 도입된 유전자의 기능성을 증명하는 것이다. 비정상적으로 큰 잎의 cm2당 건중량 및 습윤 중량은 대조 잎에 필적하였는데 이는 크기에서의 증가가 건조 물질의 증가 때문이지 물 함량의 증가 때문이 아니라는 것을 나타낸다. 개화도 또한 TPP의 발현에 의해 영향을 받았다. 모든 식물 부분에서 TPP 유전자의 컨스티튜티브 발현에 의해 아마도 야기된, 발육 저지 표현형을 갖는 식물에서는 완전히 성숙하지 않고 떨어지거나 회사되는 많은 작은 꽃이 발생되었다. 꽃 및 결실의 발생은 발육 저지가 덜 된 식물에서 영향을 덜 받는 것으로 보인다.
pMOG1010, de35S CaMV TPP로 형질전환된 담배 식물
주 길이(cm) 잎 면적(cm2) 표백(5-심각성) 가지화 Fw/cm2(g) DW/cm2(g) 개화정상(Norm.)/ 줄기 직경(mm)
1 63 489 5 + 0.096 0.0031 A 13
2 90 472 3 + 0.076 0.0035 A 19
3 103 345 0 0.072 0.0023 N 16
4 90 612 4 + 0.096 0.0039 A 5,6,7,8,14
5 104 618 1 + 0.08 0.0035 N 17
6 110 658 3 + 0.078 0.0035 N/A 19
7 120 427 0 0.074 0.0037 N 18
8 90 472 2 + 0.076 0.0023 A 6,7,18
9 60 354 3 + 0.092 0.0031 N 9,13
10 103 342 0 0.084 0.0025 N 16
11 110 523 1 + 0.076 0.0031 A 18
12 90 533 1 + 0.098 0.0023 N 5,16
13 53 432 4 + 0.084 0.0043 A 5,6,6,14
14 125 335 0 0.086 0.0023 N 17
15 85 251 0 0.094 0.0031 N 14
16 64 352 0 + 0.076 0.0028 A 9,13
17 64 267 0 0.11 0.0018 N 15
18 71 370 2 0.086 0.0032 A 5,7,8,14
19 92 672 4 + 0.076 0.0034 N 16
20
21 94 517 4 + 0.07 0.0044 N 17
22 96 659 3 + 0.082 0.0031 N 17
23 110 407 0 0.082 0.0042 N 16
24 90 381 0 0.1 0.0034 A 15
25 120 535 0 0.076 0.003 N 16
26 42 511 5 0.08 0.0038 ? 15
27 100 468 0 0.086 0.0018 N 17
28 83 583 3 0.072 0.0034 N/A 17
29 27 452 5 + 0.104 0.004 ? 7,7,15
30 23 479 4 + 0.076 0.0027 ? 6,6,7,9,14
31 103 308 1 0.086 0.0027 N 14
32 48 286 0 0.108 0.002 N 16
33 67 539 5 + 0.102 0.0056 A 18
34 40 311 5 + 0.084 0.0051 A 7,7,12
PC-TPP의 일차 담배 형질전환체
식물주 잎 fw(g) 잎 면적 (cm2) 가지의 수 식물 길이 (cm) 잎 색상 표백 Fw/면적 건조 물질 (%) 건조 물질 (면적)
대조 1 8.18 349.47 0.023 7.213
대조 2 10.5 418.89 0.025 9.524
대조 3 9.99 373.87 0.027 12.913
대조 4 9.91 393.84 0.027 9.586
대조 5 9.82 0.025 11.507
평균 0.0255 10.149 0.0026
11 11.5 338 3 114 wt 0.0340 6.43 0.0022
12 20.1 742 엷음 표백 0.0272 9.82 0.0027
14 9.61 345 1 150 wt 0.0279 11.65 0.0032
16 5.99 234 5 54 엷음 표백 0.0256 12.85 0.0033
17 9.10 314 3 105 wt 0.0290 8.79 0.0025
18 3.78 158 3 75 엷음 0.0239 7.67 0.0018
19 2.98 130 1 70 엷음 0.0029 10.74 0.0025
20 8.33 296 3 70 엷음 표백 0.0281 7.56 0.0021
22 11.5 460 1 117 엷음 표백 0.0251 3.03 0.0008
24 9.42 369 1 155 wt 0.0255 10.62 0.0027
25 15.9 565 1 170 wt 0.0282 9.54 0.0027
26 8.07 343 2 155 wt 0.0235 15.37 0.0036
28 11.7 411 2 65 엷음 표백 0.0286 6.90 0.0020
29 11.6 420 1 117 엷음 표백 0.0277 3.53 0.0010
31 8.21 307 2 153 wt 0.0267 12.79 0.0034
32 4.03 175 1 70 엷음 0.0230 18.86 0.0043
34 4.81 203 1 107 엷음 0.0237 20.58 0.0049
35 7.86 307 3 130 엷음 0.0256 11.45 0.0029
36 4.90 206 2 95 엷음 0.0238 22.65 0.0054
37 13.9 475 1 135 wt 0.0293 4.82 0.0014
38 16.6 614 1 90 엷음 표백 0.0271 3.31 0.0009
39 14.9 560 1 112 wt 표백 0.0267 6.08 0.0016
40 24.5 843 0.0292 9.80 0.0029
41 8.86 343 1 115 wt 0.0258 2.93 0.0008
42 6.93 289 1 wt 0.0240 3.32 0.0008
43 11.3 433 136 135 wt 0.0261 6.73 0.0018
44 10.0 341 2 135 wt 0.0294 6.49 0.0019
45 9.40 327 2 135 wt 0.0287 8.51 0.0024
46 9.18 284 2 115 wt 0.0323 15.69 0.0051
평균 0.027 9.60 0.0025
wt=야생형
pVDH321로 형질전환시킨 담배 식물 (씨브이. 삼순 엔엔)은 온실에서 pMOG1010 형질전환 식물에 필적하는 발생 양상을 나타내었다 (표 6).
pMOG1010 (35S-TPP) 및 pMOG1124 (PC-TPP)로 형질전환된 식물을 탄수화물, 클로로필, 트레할로스 및 전분에 대하여 분석하였다 (도 32). 클로로필 데이터에 대하여 표 6a를 또한 참조하기 바란다.
PC-TPP로 형질전환된 엔. 타바쿰 잎의 클로로필 함량 (To)
샘플 클로로필 (mg/잎의 g) 잎 표현형
대조군 1 1.56 야생형
대조군 2 1.40 야생형
대조군 3 1.46 야생형
대조군 4 1.56 야생형
대조군 5 1.96 야생형
PC TPP 12 0.79 표백성
PC TPP 22 0.76 표백성
PC TPP 25 1.30 야생형
PC TPP 37 0.86 야생형
PC TPP 38 0.74 표백성
주: 재배 동안의 광 조건은 클로로필의 결정 수준에 현저하게 영향을 미칠 것임. 따라서 클로로필의 계산양은 단지 1회의 실험 이내에서 수확되고 분석된 식물들 사이에서만 비교할 수 있음.
<실시예 3>
트레할로스-6-포스페이트 신타제를 코딩하는 유전자 단편의 셀라기넬라 레피도필라 (Selaginella lepidophylla) 및 헬리안투스 애누스 (Helianthus annuus)로부터의 단리
이. 콜리 및 에스. 세레비지에 (S. cerevisiae)의 TPS 단백질 서열의 비교에서 여러 보존 영역이 존재함이 나타났다. 상기 영역을 사용하여 주형으로서 이. 콜리 및 효모의 게놈 DNA를 사용하여 PCR 증폭 반응에서 시험되는 동의성의 프라이머를 고안하였다. 어닐링 (annealing) 및 신장 단계 사이의 온도 램프와 함께 PCR 프로그램을 사용하여 동의성의 프라이머의 어닐링을 촉진하였다.
PCR 증폭은 주형으로서 셀라기넬라 레피도필라의 cDNA를 사용하고 프라이머 세트인 TPSdeg 1/5 및 TPSdeg 2/5를 사용하여 수행하였다.
사용된 동의성의 프라이머 (IUB 코드):
TPSdeg1: GAY ITI ATI TGG RTI CAY GAY TAY CA (서열 7)
TPSdeg2: TIG GIT KIT TYY TIC AYA YIC CIT TYC C (서열 8)
TPSdeg3: GYI ACI ARR TTC ATI CCR TCI C (서열 9)
기대되는 크기의 PCR 단편을 클로닝하여 서열결정하였다. 다수의 상동성 서열이 단리되었기 때문에 서던 블롯 분석을 사용하여 셀라기넬라 게놈 DNA와 혼성화하는 클론을 결정하였다. 2개의 클론을 단리하였고 아미노산 수준에서 이. 콜리 및 효모의 TPS 유전자와 높은 퍼센트로 동일한 영역을 나타내는 클론 8의 서열을 서열 번호 42 (PCR 프라이머 조합 1/5)에 나타내었고 클론 43의 서열을 서열 번호 44에 나타내었다 (PCR 프라이머 조합 2/5).
주형으로서 에이치. 애누스의 게놈 DNA를 사용하는 PCR 증폭에서 프라이머 조합 TPSdeg 2/5를 사용하여 헬리안투스 애누스 (해바라기)로부터 하나의 TPS 유전자 단편을 단리시켰다. 서열결정 및 서던 블롯 분석으로 이. 콜리, 효모 및 셀라기넬라의 TPS 유전자와의 상동성을 확인하였다. 다양한 유기체의 EST 서열 (expressed sequence tag, 발현 서열 표시물)과 상기 서열을 비교해 보면 (표 6b 및 서열 번호 45 내지 53과 41을 참조) 벼 및 아라비돕시스에서 매우 상동성인 유전자가 존재한다는 것이 나타났는데, 이는 대부분의 식물이 TPS 상동 유전자를 포함한다는 본 발명을 지지하는 것이다 (도 3).
dbEST ID 젠뱅크 접근 번호 생물체 기능
35567 D22143 오리자 사티바(Oryza sativa) TPS
58199 D35348 카에노르합디티스 엘레강스(Caenorhabditis elegans) TPS
60020 D36432 카에노르합디티스 엘레강스 TPS
87366 T36750 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) TPS
35991 D22344 오리자 사티바 (Oryza sativa) TPS
57576 D34725 카에노르합디티스 엘레강스 TPS
298273 H37578 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) TPS
298289 H37594 아라비돕시스 탈리아나 TPS
315344 T76390 아라비돕시스 탈리아나 TPS
315675 T76758 아라비돕시스 탈리아나 TPS
317475 R65023 아라비돕시스 탈리아나 TPS
71710 D40048 오리자 사티바 TPS
401677 D67869 카에노르합디티스 엘레강스 TPS
322639 T43451 아라비돕시스 탈리아나 TPS
76027 D41954 오리자 사티바 TPP
296689 H35994 아라비돕시스 탈리아나 TPP
297478 H36783 아라비돕시스 탈리아나 TPP
300237 T21695 아라비돕시스 탈리아나 TPP
372119 U37923 오리자 사티바 TPP
680701 AA054930 브루기아 말라이 (Brugia malayl) 트레할라제
693476 C12818 카에노르합디티스 엘레강스 트레할라제
311652 T21173 아라비돕시스 탈리아나 TPP
914068 AA273090 브루기아 말라이 트레할라제
43328 T17578 사카로마이세스 세레비지애 TPP
267495 H07615 브라시카 나푸스 (Brassica napus) 트레할라제
37331 R64855 아라비돕시스 탈리아나 TPP
1008 T00368 카에노르합디티스 엘레강스 트레할라제
36717 D23329 오리자 사티바 TPP
71650 D39988 오리자 사티바 TPP
147057 D49134 오리자 사티바 TPP
401537 D67729 카에노르합디티스 엘레강스 트레할라제
680728 AA054884 브루기아 말라이 트레할라제
694414 C13756 카에노르합디티스 엘레강스 트레할라제
871371 AA231986 브루기아 말라이 트레할라제
894468 AA253544 브루기아 말라이 트레할라제
86985 T36369 사카로마이세스 세레비지애 TPP
<실시예 4>
식물 TPS 및 니코티아나 타바쿰 (Nicotiana tabacum)의 TPP 유전자의 단리
식물 TPS- 및 TPP-코딩 cDNA의 단편을 담배 잎의 전체 RNA 제조물로부터 유래된 cDNA 상에서의 PCR을 사용하여 단리하였다. 표 7의 "네스티드 (nested)" 칼럼은 상응하는 DNA 단편을 수득하기 위하여 프라이머 세트 3 및 4를 사용하여 제2 라운드의 PCR 증폭이 필요할 경우를 나타낸다. 프라이머는 서열 목록에 포함시켰다 (표 7). 상기 프라이머 세트를 사용하여 수득된 DNA 단편의 서브클로닝 및 그 이후의 서열 결정 분석에서 공지된 TPS 유전자에 대한 상당한 상동성이 나타났다 (도 4 및 5).
식물 유래의 TPS 및 TPP cDNA의 증폭
TPS-cDNA 프라이머 1 프라이머 2 네스티드 프라이머 3 프라이머 4
"825" bp (서열 번호 22 및 23) Tre-TPS-14 (서열 번호 30) Deg 1(서열 번호 7) 아니오
"840" bp (서열 번호 18 및 19) Tre-TPS-14 (서열 번호 30) Tre-TPS-12 (서열 번호 31) 예 Tre-TPS-13 (서열 번호 32) Deg 5(서열 번호 9)
"840" bp (서열 번호 18 및 19) Tre-TPS-14 (서열 번호 30) Tre-TPS-12 (서열 번호 31) 예 Deg 2(서열 번호 8) Deg 5(서열 번호 9)
TPP-cDNA 프라이머 1 프라이머 2 네스티드
"723" bp (서열 번호 16 및 17) Tre-TPP-5 (서열 번호 35) Tre-TPP-16 (서열 번호 38) 아니오
"543" bp(서열 번호 14) Tre-TPP-7 (서열 번호 36) Tre-TPP-16 (서열 번호 38) 아니오
"447" bp(서열 번호 12) Tre-TPP-11 (서열 번호 37) Tre-TPP-16 (서열 번호 38) 아니오
<실시예 5>
해바라기 (헬리안투스 애누스)로부터의 TPS 유전자 단편의 서열 정보를 사용하여 완전한 길이의 해바라기 TPS 클론을 RACE-PCR 기술을 사용하여 수득하였다.
상기 완전한 길이의 클론의 서열 분석 및 효모의 TPS2 (도 6)와 TPS 및 TPP 코딩 서열과의 정렬에서 단리된 클론이 TPS/TPP의 두 부분으로 된 효소 (서열 번호 24, 26 및 28)를 코딩한다는 것이 나타났다. 단리된 두 부분 클론 (pMOG1192)은 1997년 4월 21일에 수탁 번호 CBS692.97로 부다페스트 조약의 규칙 하에 Central Bureau for Strain collections에 기탁하였다. 그 후 본 발명자들은 다른 식물 종도 또한 TPS/TPP 두 부분 클론을 포함하는지를 조사하였다. 두 부분 TPS/TPP cDNA는 담배로부터 증폭시켰다. 프라이머인 TPS deg1/TRE-TPP-16를 사용한 PCR 및 TPS deg2/TRE-TPP-15 (서열 번호 33)을 사용한 네스티드 후 기대되는 크기 (즉 1.5 kb)의 DNA 생성물을 검출하였다. TPS deg1/TRE-TPP-6 (서열 번호 34)를 사용한 PCR 및 TPS deg2/TRE-TPP-15를 사용한 네스티드에서 동일한 밴드가 나타났다. 후자의 단편은 서턴 블롯 실험에서 해바라기의 두 부분 cDNA와 혼성화하는 것으로 나타났다. 또한 컴퓨터 데이터베이스 검색을 사용하여 아라비돕시스의 두 부분 클론을 동정하였다 (서열 번호 39).
<실시예 6>
식물에서의 식물 유래의 TPS 유전자의 발현
해바라기 및 셀라기넬라 레피도필라의 TPS 유전자의 기능에 대한 다른 증거는 그의 상응하는 완전한 길이의 cDNA 클론을 단리시키고 그 이후 식물에서 35S CaMV 프로모터의 조절 하에 상기 클론을 발현시킴으로써 얻어졌다. 셀리가넬라 효소의 발현에 의한 트레할로스의 축적은 젠텔라 (Zentella) 및 이투리아가 (Iturriaga)에 의해 보고되었다 ([Plant Physiol. 111, Abstract 88 (1996)] 참조).
<실시예 7>
단자엽 종의 TPS 및 TPP를 코딩하는 유전자
젠뱅크 (Genbank) 서열에서의 컴퓨터 검색에서 서열 목록 (서열 번호 41, 51, 52 및 53)에 포함되어 있는 효모의 TPS1 및 TPS2에 상동성인 벼의 여러 EST-서열의 존재가 나타났다 (도 7).
<실시예 8>
사람 TPS 유전자의 단리
사람 cDNA로부터 TPS 유전자를 단리하였다. PCR 반응은 퇴화 TPS 프라이머인 deg2 및 deg5를 사용하여 사람 cDNA 상에서 수행하였다. 상기에 의해 0.6 kb의 기대되는 TPS 단편을 수득하였다. 서열 분석 (서열 번호 10) 및 TPS효모서열과의 분석에서 단리된 서열이 상동성의 TPS 단백질을 코딩한다는 것이 나타났다 (도 8).
<실시예 9>
안티센스 억제에 의한 내생 TPS 발현의 억제
내생 TPS 유전자의 발현은 억제를 원하는 세포 또는 조직에서 안티센스 TPS 유전자의 발현을 작동시키는 프로모터 서열의 조절 하에 상동성 TPS 유전자의 상기 안티센스 발현에 의해 억제시킬 수 있다. 상기 접근법에 있어서 안티센스 발현 벡터에서 전체 코딩 영역이 발현될 필요는 없다 해도 억제시켜야 하는 TPS 유전자에 완전히 동일한 서열을 사용하는 것이 바람직하다. 상기와 같은 코딩 영역의 단편은 또한 유전자 발현의 안티센스 억제에 있어서 기능을 나타내었다. 별법으로 이종성의 유전자는 이것이 내생 유전자에 충분히 상동성일 경우 안티센스 접근법에서 사용할 수 있다.
pMOG845 및 pMOG1010에 유사한 2원 벡터는 억제시키기 위한 도입 유전자의 코딩 영역이 역 배향으로 도입되는 것을 확실하게 하기 위하여 사용될 수 있다. 표적 조직에서의 유전자의 발현을 작동시키는 데 적당한 모든 프로모터는 또한 유전자의 안티센스 발현에도 적당하다.
<실시예 10>
안티센스 억제제 의한 내생 TPP 발현의 억제
세포 및 조직에서의 tps의 안티센스 발현을 작동시키는 데 사용될 수 있는 벡터의 구축과 유사하게 (실시예 9) TPP 유전자의 안티센스 발현을 작동시키는 벡터를 구축할 수 있다.
<실시예 11>
발리다마이신 A 상에서 재배한 야생형 담배 및 감자 식물에서의 트레할로스 축적
담배에서 트레할로스 생합성 경로가 존재한다는 것에 대한 증거는 트레할라제 억제제인 발리다마이신 A 10-3M의 존재 하에 야생형 식물을 재배함으로써 수득되었다. 처리 식물에서는 매우 소량인 0.0021% (fw) 이하의 트레할로스가 축적되었다. 트레할로스 축적은 억제제 없이 재배된 대조 식물에서는 전혀 검출되지 않았다. 발리다마이신 A의 존재 하에 배양된 야생형 미세괴경에서 유사한 데이터가 얻어졌다. 17개의 주 중 10개의 주에서 평균 0.001%의 트레할로스 (fw)가 축적되었다 (표 4). 발리다마이신 A가 없는 배지 상에서 유도된 미세괴경에서는 트레할로스가 전혀 관찰되지 않았다.
<실시예 12>
as-트레할라제로 형질전환된 감자 식물에서의 트레할로스의 축적
내생 트레할로스 생합성 유전자의 존재에 대한 다른 증거는 35S CaMV 안티센스 트레할라제 구축물 (서열 번호 54 및 55, pMOG1027; 국제 특허 출원 공개 제WO 96/21030호에 기술되어 있음)로 야생형 감자 식물을 형질전환시킴으로써 수득되었다. pMOG1027로 형질전환된 감자 새순에서는 습윤 중량을 기준으로 0.008% 이하의 트레할로스가 축적되는 것으로 나타났다. 관찰된 트레할로스 피크의 본질은 트레할라제 효소로 축적 트레할로스를 명확하게 분해시킴으로써 확인되었다. 몇몇 pMOG1027 형질전환 주의 괴경에서 소량의 트레할로스가 축적되는 것으로 나타났다 (도 9).
<실시예 13>
트레할로스-6-포스페이트에 의한 식물 헥소키나제 활성의 억제
헥소키나제 활성에 대한 트레할로스-6-포스페이트의 조절 효과를 증명하기 위하여, 식물 추출물을 제조하여 트레할로스-6-포스페이트의 부재 하 및 존재 하에서의 헥소키나제 활성에 대하여 시험하였다.
·기질로서 과당 (도 10, 도 11) 및 글루코스 (도 11)를 사용하여 감자 괴경 추출물을 분석하였다. 기질로서 1 mM의 T-6-P 및 과당을 사용하여 간세도 (Gancedo) 등의 문헌 [J. Biol. Chem. 252, 4443 (1997)]에 따라 감자 괴경 분석을 수행하였다. 담배, 벼 및 옥수수에 대한 하기 분석은 이 단락의 실험법에 기술되어 있는 분석법에 따라 수행하였다.
·기질로서 과당 (도 12) 및 글루코스 (도 12, 도 13)를 사용하여 담배 잎 추출물을 분석하였다.
·기질로서 과당 및 글루코스 (도 14)을 사용하여 벼 잎 추출물을 분석하였다.
·기질로서 과당 및 글루코스 (도 15)를 사용하여 옥수수 잎 추출물을 분석하였다.
<실시예 14>
동물 세포 배양물에서의 트레할로스-6-포스페이트에 의한 헥소키나제 활성의 억제
동물 세포에서의 헥소키나제 활성의 조절을 증명하기 위하여 생쥐 하이브리도마 세포 배양물로부터 전체 세포 추출물을 제조하였다. 헥소키나제 분석은 간세도 등에 의해 기술된 바와 같은 조건 (상기 참조) 하에서 기질로서 글루코스 또는 과당을 사용하여 수행하였다. 생쥐 하이브리도마 세포는 20% 수크로스에 세포 펠렛을 노출시키고 이어서 증류수로 삼투 충격 (osmotic shock)을 가하였다. 상기 조 단백질 추출물을 헥소키나제 분석에 사용하였다 (약 200 μg의 단백질에 상응하는 50 μl의 추출물).
T-6-P에 의한 동물 헥소키나제 활성의 억제
기질 농도(mM) T6P(mM) V0(ODU/분) V0(ODU/분) 억제율(%)
글루코스 2 0.83 0.0204 0.0133 35
글루코스 20 0.83 0.0214 0.0141 35
글루코스 100 0.83 0.0188 0.0125 34
과당 20 0.23 0.0207 0.0205 1
과당 20 0.43 0.0267 0.0197 26
과당 20 0.83 0.0234 0.0151 35
과당 20 1.67 0.0246 0.0133 46
수득된 데이터는 생쥐 세포 추출물에서의 헥소키나제 활성이 트레할로스-6-포스페이트에 의해 억제된다는 것을 명확하게 보여주었다. 상기 효과가 나타나는 T-6-P의 농도 범위는 조 식물 추출물에서 관찰되었던 것에 필적하였다. 이 효소에 대한 기질로서 글루코스 또는 과당을 사용한 트레할로스-6-포스페이트에 의한 헥소키나제 억제의 효율에서는 차이가 나타나지 않았다.
<실시예 15>
TPS 및 TPP 발현 담배 식물의 광합성 및 호흡
35S-TPP (1010-5), PC-TPS (1318-10 및 1318-37)로 형질전환된 담배 식물 및 야생형 삼순 엔엔 식물을 사용하여 상기 유전자들의 발현의 광합성 및 호흡에 대한 효과를 잎에서 측정하였다.
측정은 기체 교환 실험 장치에서 수행되었다. 기체 교환의 속도는 적외선 기체 분석 장치를 사용하여 들어오는 공기와 나가는 공기 사이의 농도 차이를 기준으로 계산하였다. 광합성 및 호흡을 동일 잎으로부터 측정하였다. 각각의 형질전환 식물로부터 가장 어리고 성숙한 잎 (상부 잎) 및 하부에 3 내지 4개의 잎을 포함하는 잎 (하부 잎)을 사용하였다.
광합성은 350 vpm 및 950 vpm의 CO2농도에서의 4배인 0 내지 975 μmol.m-2.s-1(200 와트 m-2)의 광합성 활성 광 강도 (PAR)의 함수로서 측정하였다.
호흡은 두 가지의 상이한 시간 간격을 사용하여 측정하였다. 광합성 실험 후의 짧은 암주기 동안 수행된 측정은 표 9에서 RD로 암호화되어 있다. 상기 수치는 순간의 활성을 반영하는 데 이는 호흡이 암주기 동안 실질적으로 변화하기 때문이다. 따라서 전체 밤 주기 동안의 수치가 표 10에 나타낸 바와 같이 또한 요약되어 있다 (단지 350 vpm의 CO2에서만 측정).
광합성 및 호흡 속도 (STD는 표준 편차임)
상부 잎 350 ppm 950 ppm
마이크로몰/m2/s STD 마이크로몰/m2/s STD
야생형 RD 0.0826 0.048 1.016 0.142
EFF 0.060 0.004 0.087 0.004
AMAX 11.596 0.588 19.215 0.942
1010-5 RD 0.873 0.060 1.014 0.134
EFF 0.059 0.002 0.090 0.007
AMAX 12.083 1.546 18.651 1.941
1318-10 RD 0.974 0.076 1.078 0.108
EFF 0.064 0.003 0.088 0.008
AMAX 16.261 2.538 24.154 1.854
1318-37 RD 1.067 0.140 1.204 0.116
EFF 0.061 0.002 0.084 0.011
AMAX 16.818 2.368 25.174 2.093
하부 잎
야생형 RD 0.0438 0.078 0.526 0.112
EFF 0.068 0.002 0.085 0.004
AMAX 6.529 1.271 11.489 1.841
1010-5 RD 0.455 0.068 0.562 0.118
EFF 0.064 0.002 0.085 0.006
AMAX 8.527 0.770 13.181 1.038
1318-10 RD 0.690 0.057 0.828 0.086
EFF 0.064 0.008 0.085 0.005
AMAX 11.562 1.778 20.031 1.826
1318-37 RD 0.767 0.033 0.918 0.099
EFF 0.073 0.006 0.103 0.004
AMAX 13.467 1.818 19.587 1.681
12시간의 암주기 동안의 호흡 (CO2의 mmol, STD는 표준 편차임)
상부 잎 STD 하부 잎 STD
야생형 25.17 0.82 13.19 1.98
1010-5 30.29 5.09 13.08 1.52
1318-10 28.37 4.50 20.47 0.87
1318-37 32.53 2.01 17.7 1.03
상부 잎에서의 호흡과는 반대로 하부 잎에서는 TPS 형질전환 식물의 호흡이 야생형 및 TPP 식물보다 현저하게 더 높았는데 (표 10) 이는 더 높은 신진대사 활성을 나타내는 것이다. 잎의 노화 동안의 호흡의 하락은 TPS 형질전환 식물이 현저하게 적었다.
또한 광합성 특성이 한편으로는 TPS 형질전환 식물과 다른 한편으로는 TPP 형질전환 및 야생형 대조 식물 사이에서 현저하게 달랐다. AMAX 수치 (광 포화에서의 광합성 최대치), 광합성의 효율 (EFF) 및 광합성 측정 후의 짧은 암기간 동안의 호흡 속도 (RD)를 표 9에 나타내었다. 평균적으로 상부 TPS 잎의 AMAX 수치는 TPP 및 야생형 잎과 비교하여 35%가 더 높았다. 하부 잎에서는 광합성 속도가 훨씬 더 증가하였다 (88%).
광 흡수에서의 차이가 상이한 광합성 속도를 야기하는 것을 제외시키기 위하여 흡수치는 SPAD-502 (Minolta)로 측정하였다. 흡수에서의 현저한 차이는 측정되지 않았다 (표 11a).
형질전환 주의 흡수치
흡수율 (%) 상부 잎 하부 잎
야생형 삼손 엔엔 84 83
1010-5 84 82
1318-10 85 86
1318-37 86 86
<실시예 16>
TPS 및 TPP 발현 담배 식물의 클로로필-형광
35S-TPP (1010-5), PC-TPS (1318-10 및 1318-37)로 형질전환된 담배 식물 및 야생형 삼순 엔엔 식물을 사용하여 상기 유전자의 발현 효과를 잎 재료의 클로로필 형광에 대하여 측정하였다. 1) 전자 수송 속도 및 환원력의 생성에 대한 측정으로서 ETE (전자 수송 효율, electron transport efficiency), 및 2) 동화물질의 축적에 의해 야기되는 에너지-소실에 대한 측정으로서 비광화학적 켄칭 (quenching)의 형광의 두 특징을 측정하였다.
100 μmol.m-2.s-1의 추가의 광 하에서 온실에서 식물을 재배하였다 (04:00 - 20:00 시간). 낮/밤의 온도는 21℃/18℃였고 상대 습도는 ±75%였다. 측정 전의 밤시간 동안 (16시간의 지속 시간) 각 유전자형의 두 식물을 암실로 옮겼고 두 식물을 광 하로 옮겼다 (±430 μmol m-2.s-1, 20℃, 70%의 상대 습도). 가장 어리고 완전히 성숙한 잎을 측정하였다. PSII (포토시스템 II)의 광화학적 효율 및 "비광화학적 켄칭" 매개변수를 광 강도 증가의 함수로서 측정하였다. 각각의 광 강도에서 300초의 안정화 시간이 걸렸다. 측정은 분 당 3회의 광-플래쉬의 빈도, 350 ppm의 CO2및 20%의 O2로 5, 38, 236, 422 및 784 μmol m-2.s-1의 PAR에서 수행하였다. 실험은 암에서 광으로, 그리고 그 반대로 예비처리를 역으로 행하여 동일 식물을 사용하여 반복하였다. 형광 특성이 도 16에 예시되어 있다.
전자 수송 효율 (ETE)에서의 감소는 TPP 및 야생형 식물에서 유사하였다. TPS 식물은 광 강도의 증가에 명확하게 덜 응답하였다. 상기 차이는 광 예비처리에서 가장 명확하였다. 상기 결과는 "비광화학적" 켄칭 데이터와 일치한다. TPS 식물은 TPP 및 야생형 식물과 비교하여 광에 의한 추가의 동화산물 공급에 명확하게 덜 응답하였다. TPS 식물의 경우 동화산물 축적의 광합성에 대한 네가티브 조절이 현저하게 감소되었다.
<실시예 17>
TPS 및 RPP 발현 담배 식물에서의 동화산물의 배출 및 배급
35S-TPP (1010-5) 및 PC-TPS (1318-37)로 형질전환시킨 담배 식물을 사용하여,
1) 완전히 자란 잎으로부터의 탄소 동화산물의 배출 ("상대적 공급원 활성"을 나타냄, 코흐 (Koch)의 문헌 [Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol. 47, 509 (1996)]) 및
2) 광 및 암기 동안의 싱크에서의 광 동화산물의 네트 축적 ("상대적 싱크 활성)을 측정하였다.
식물의 발생 단계는 꽃눈이 막 보이는 단계였다. 매우 풍부한, 광합성 산물의 정상상태 13C 표지의 표지 기술을 사용하였다 (드 비서 (De Visser) 등의 문헌 [Plant Cell Environ 20, 37 (1997)] 참조). 두 유전자형 모두의 8개의 식물은 완전히 자란 잎을 사용하여 이후에 적당한 암기 (14시간)이 있을 경우 명기(10시간) 동안 5.1 원자%의13CO2로 표지하였다. 표지 후 식물을 1) 새순-말단, 2) 어리고 성장하는 잎, 3) 완전히 발생된 어린 잎 (표지할 잎의 위), 4) 어린 줄기 (표지할 잎의 위), 5) 표지된 잎, 6) 표지된 잎의 잎꼭지 및 기저부, 7) 오래된 노화 잎, 8) 표지 잎 보다 아래의 가장 오래된 다른 잎, 9) 표지 잎보다 아래의 줄기, 10) 뿌리 말단으로 나누었다. 수, 습윤 중량 및 건중량과 탄소의13C 퍼센트 (13C의 원자%)를 측정하였다. 생물량, 건조 물질 및 잎의 수와 같은 일반적인 매개변수에 이어 1) 표지 잎으로부터의 C의 배출; 2) 식물 부분에서 들어온 C의 상대적 분포; 3) 식물 부분에서의 들어온 C의 절대량; 4) 명기 및 완전한 광 및 암기 동안 들어온 C의 상대적 분포를 계산하였다.
TPP 형질전환체의 토양 위 생물량은 TPS 형질전환체와 비교하여 27% 더 컸으며 (P<0.001); TPP 형질전환체의 뿌리 시스템도 또한 더 우수하게 발생하였다. TPP 식물은 TPS 식물과 비교하여 +39%의 잎 및 +10%의 줄기 생물량의 현저하게 변화된 건조 물질 분포를 나타내었다. TPS 식물은 더 큰 갯수의 잎을 갖지만, 잎 당 잎 면적은 더 작았다. TPS 식물 당 전체 잎 면적은 야생형과 유사하였다 (0.4 m2식물-1).
- 완전히 발생된 잎의 상대적 공급원 활성
표지된 잎으로부터의 광합성 산물의 네트 배출 비율은 척도로서 식물 (표지된 잎 없음)에서의 "새로운 C"의 양을 사용하여 밤 동안의 "새로운 C"의 %의 상대적 감소 (TPP의 경우 39%이고 TPS의 경우 56%임) 및 식물에 존재하는 전체 고정 양으로 측정하였다. 명기 후에 TPP 잎은 TPS 잎의 51%와 비교하여 37%를 배출하였다 (표 11b). 그 후의 암기에서 상기 퍼센트는 각각 52% 및 81%로 증가하였다. 두 방법 모두 TPS 식물의 광합성 산물 배출 비율이 TPP 형질전환 식물과 비교하여 현저하게 증가한다는 결론을 지지한다.
- 식물 부분에서의 "새로운 C"의 절대량
TPS 형질전환체에 의한 배출량은 TPP 형질전환체와 비교하여7 현저하게 높았다. 자라고 있는 어린 TPS 잎은 자라고 있는 어린 TPP 잎과 비교하여 C를 더 강하게 들여온다.
- 식물 부분에서의 "새로운 C"의 상대적인 증가: 싱크- 강도
관련된 식물 부분으로의 "새로운 C"의 상대적인 배포는 도 17에 예시되어 있다. 상기 퍼센트는 싱크-강도의 척도이다. TPS 형질전환체에서, 특히 새순-말단, 표지 잎의 위 및 아래의 줄기 및 표지 잎의 잎꼭지에서 현저하게 더 큰 싱크-강도가 존재하였다.
완전히 자란 표지된 잎의 공급원 활성: C-축적 및 C-배출 (명기 (낮) 동안의 정상 상태의13C-표지 후 표지된 잎 및 전체 식물 (토양 위)에서의 C-동화산물의 매일의 네트 축적율 및 배출율. N=4: LSD 수치는 P<0.05에 대하여 가장 작은 현저한 차이를 나타냄).
시간 (최종) 형질전환 자란 잎의 공급원 활성
공급원 잎의 새로운 C (잎의 전체 C의 %) 밤 동안의 네트 C 배출율 ("낮"의 %) 공급원 잎의 새로운 C (식물에서의 새로운 C의 %) 식물로의 네트 C 배출율 (전체 새로운 C의 %)
낮 TPS 17.8 - 48.7 51
TPP 22.6 - 63.0 37
낮+밤 TPS 7.8 56 16.6 81
TPP 13.8 39 48.4 52
LSD 0.05 2.4 6.1
- 식물 부분 사이의 "새로운 C"의 식물 내의 상대적 분포: 싱크의 비교 강도
식물 기관 사이의 고정 탄소의 분포 (도 18)에 의해 상기 결론이 확인되었다. TPS 형질전환 식물은 줄기 말단, 자라는 어린 잎(낮) 및 심지어 가장 노화된 잎 (보조 분열조직이 없음), 및 어린 줄기와 노화 줄기에 동화산물을 비교적 많이 배출시킴이 나타났다.
<실시예 18> 상추
PC-TPS 및 PC-TPP로 형질전환된 상추 식물의 능력
상추 형질전환 실험에 사용된 구축물은 PC-TPS 및 PC-TPP였다. PC-TPS 형질전환체는 60 g/ℓ의 수크로스 상에서 외식편을 배양함으로써 재생 동안 레스큐 (rescue)시켰다. TPS 및 TPP 형질전환 식물 모두의 표현형은 야생형 대조군과 명확하게 구분할 수 있었는데, 야생형 식물과 비교시 TPS 형질전환 식물의 잎은 두껍고 암녹색이었으며 TPP 형질전환 식물의 잎은 잎 말단이 더 매끈한 밝은 녹색이었다.
잎의 형태, 가장 현저하게는 잎의 말단은 TPS 및 TPP의 발현에 의해 명확하게 영향을 받았다. PC-TPS로 형질전환된 잎은 더 매끄럽고 둥근 형태의 PC-TPP 형질전환 잎보다 훨씬 더 톱니모양 (notched)이었다 (도 19). 형질전환 상추 주의 잎 추출물을 당 및 전분에 대하여 분석하였다 (도 20).
<실시예 19> 사탕무
PC-TPS 및 PC-TPP로 형질전환된 사탕무 식물의 능력
사탕무 형질전환 실험에 사용된 구축물은 PC-TPS 및 PC-TPP였다. TPS 및 TPP 구축물 둘 모두를 사용하여 얻어진 형질전환 빈도는 대조군과 유사하였다. TPS 및 TPP 형질전환 식물 모두의 표현형은 야생형 대조군과 명확하게 구분할 수 있었는데, 야생형 식물과 비교시 TPS 형질전환 식물의 잎은 두껍고 암녹색이었으며 TPP 형질전환 식물의 잎은 밝은 녹색이었고 잎꼭지는 약간 더 컸다 (도 21). 주근의 직경은 모든 식물에 있어서 온실에서 약 8주 동안 재배한 후 측정하였다. 대조군 식물과 유사한 잎 크기를 갖는 몇몇 PC-TPS 형질전환 주의 주근의 직경이 현저하게 더 컸다 (도 22). PC-TPP 형질전환 주는 비형질전환 대조군과 비교하여 더 작은 주근을 형성하였다. 형질전환 사탕무 주의 잎 추출물을 당 및 전분에 대하여 분석하였다 (도 20).
<실시예 20> 아라비돕시스
PC-TPS 및 PC-TPP로 형질전환된 아라비돕시스 식물의 능력
아라비돕시스 형질전환 실험에 사용된 구축물은 PC-TPS 및 PC-TPP였다. TPS 및 TPP 형질전환 식물 모두의 표현형은 야생형 대조군과 명확하게 구분할 수 있었는데, 야생형 식물과 비교시 TPS 형질전환 식물의 잎은 두껍고 암녹색이었으며 TPP 형질전환 식물의 잎은 더 크고 표백되어 있었다. TPP 발현 수준이 높은 식물은 종자를 맺지 않았다.
<실시예 21> 감자
TPS 및 TPP 구축물로 형질전환된 솔라눔 투베로숨 식물의 능력
구축물: 35S-TPS pMOG799
pMOG799로 형질전환시킨 식물을 온실에서 재배하였으며 괴경 생산량을 측정하였다 (도 23). 대다수의 형질전환 식물은 야생형 대조군과 비교시 더 작은 잎 크기를 나타내었다. 더 작은 잎 크기를 갖는 식물에서는 대조 주와 비교하여 더 작은 괴경 매스가 수득되었다 (도 25).
구축물: 35S-TPP pMOG1010 및 PC-TPP pMOG1124
pMOG1010 및 pMOG1124로 형질전환시킨 식물을 온실에서 재배하여 괴경 생산량을 측정하였다. 괴경 생산량 (도 24)은 야생형 대조 주(도 25)와 유사하거나 또는 더 적었다.
구축물: PC-TPS pMOG1093
pMOG1093으로 형질전환시킨 식물을 온실에서 재배하여 괴경 생산량을 측정하였다. 색상이 약간 더 암녹색인, 크기가 야생형과 유사한 잎 (B-C)을 갖는 다수의 형질전환 주에서 야생형 식물과 비교하여 더 많은 괴경 매스가 수득되었다 (도 26). 대조 식물보다 잎의 크기가 더 작은 (D-G) 식물에서는 더 적은 괴경 매스가 수득되었다.
구축물: Pat-TPP pMOG1128
pat-tpp 형질전환 식물의 외식편 상에서 시험관 내에서 미세괴경을 유도하였다. 형성된 미세괴경의 평균 습윤 중량 생물량은 실질적으로 대조 주와 비교하여 더 적었다.
구축물: Pat-TPS pMOG845
pMOG845로 형질전환시킨 식물을 온실에서 재배하여 괴경 생산량을 측정하였다. 3개의 Pat-TPS 주가 대조 주와 비교하여 더 많은 괴경 매스를 생성하였다 (도 27).
구축물: PC TPS Pat TPS; pMOG1129 (845-11/22/28)
PC TPS 및 Pat-TPS를 동시에 발현하는 식물은 Pat-TPS 주 (카나마이신에 대하여 내성)를 PC TPS 구축물 및 히그로마이신 내성 마커 유전자를 포함하는 pMOG1129 구축물로 재형질전환시킴으로써 만들어 유전형이 pMOG1129 (845-11), pMOG1129 (845-22) 및 pMOG1129 (845-28)이 되게 하였다. 괴경 매스 생산량은 거의 생산량이 없는 것에서부터 대조 식물과 유사하거나 또는 더 높은 생산량을 갖는 것까지 다양하였다 (도 28).
<실시예 22> 담배
TPS 및 TPP 구축물로 형질전환시킨 엔. 타바쿰 식물의 능력
뿌리 시스템
35S TPP (pMOG1010) 또는 35S TPS (pMOG799)로 형질전환시킨 담배 식물을 온실에서 재배하였다. 뿌리의 크기는 개화 직전에 측정하였다. pMOG1010으로 형질전환시킨 주는 pMOG799 및 비형질전환 야생형 담배 식물과 비교하여 뿌리의 크기가 현저하게 더 작거나/컸다.
개화에 대한 TPS 및(또는) TPP 발현의 영향
35S-TPS, PC-TPS, 35S-TPP 또는 PC-TPP로 형질전환시킨 담배 식물을 온실에서 재배하였다. 높은 수준의 TPS 유전자를 발현시키는 식물은 야생형 식물과 비교하여 현저하게 더 느린 성장 속도를 나타내었다. 개화 및 하부 잎의 노화는 상기 식물에서 지연되어 정상적으로 노화하는 잎이 여전히 녹색 (stay-green)의 표현형을 나타내었다. 고수준의 TPP 유전자를 발현하는 식물은 어떤 꽃도 만들지 않거나 또는 발육이 이상하였고 꽃눈을 완전히 발생시키지 않아 중성을 나타내었다.
결실에 대한 TPS 및(또는) TPP 발현의 영향
35S-TPS, PC-TPS, 35S-TPP 또는 PC-TPP로 형질전환시킨 담배 식물을 온실에서 재배하였다. 고수준의 TPP 유전자를 발현하는 식물은 꽃의 발생이 열악하거나 또는 꽃이 발생하지 않았으며 결실이 없었다.
종자 발아에 대한 TPS 및(또는) TPP 발현의 영향
35S-TPP (pMOG1010) 또는 PC-TPP로 형질전환시킨 담배 식물을 온실에서 재배하였다. 저수준으로 형질전환 유전자를 발현하는 몇몇 형질전환 주는 개화하였고 결실하였다. S1 종자의 발아시 야생형 식물로부터 유래된 S1 종자와 비교하여 현저하게 감소된 발아 빈도가 관찰되었다 (또는 발아되지 않음) (표 12).
35S-TPP 형질전환 종자의 발아
종자 번호 표백 상대적 [TPPmRNA] 발아
1010-2 + 15.8 지연됨
1010-3 - 5.3 지연됨
1010-4 + 4.2 지연됨
1010-5 + 5.2 지연됨
1010-6 + 3.9 지연됨
1010-7 - 2.8 지연됨
1010-8 + 6.5 지연됨
1010-9 + 4.6 지연됨
1010-10 - 1.9 정상
1010-11 - 5.7 정상
1010-12 + 1.4 정상
1010-14 - 0.1 정상
1010-15 - 0.3 정상
1010-18 + 5.6 지연됨
1010-20 + 6.4 지연됨
1010-21 + 9.5 지연됨
1010-22 + 8.8 없음
1010-23 - 4.5 정상
1010-24 - 10.2 지연됨
1010-25 - 4.7 덜 지연됨
1010-27 - 4.8 정상
1010-28 + 22.1 지연됨
1010-31 + 9.4 덜 지연됨
1010-32 - 0.3 덜 지연됨
1010-33 + 14.7 지연됨
종자 생산량에 대한 TPS 및(또는) TPP 발현의 영향
종자 생산량은 pMOG1010-5로 형질전환시킨 S1 식물에서 측정되었다. 평균적으로 pMOG1010-5는 야생형 식물의 경우 7.8 g의 종자/식물 (n=8)과 비교하여 4.9 g의 종자/식물 (n=8)을 생성하였다. "1000개의 낟알 (1000-grain)"의 중량은 야생형인 삼순 엔엔의 0.08 g과 비교하여 pMOG1010-5 주의 경우 0.06 g이었다. 상기 데이터는 공급원 잎으로부터 탄수화물의 방출이 감소되어 종자 "싱크" 조직의 발생이 열악하였다는 것에 의해 설명될 수 있다.
잎 형태에 대한 TPS 및 TPP 발현의 영향
온실에서 재배된 PC-TPS 형질전환, PC-TPP 형질전환 및 비형질전환 대조 담배 잎의 단편들을 플라스틱에 함침시켜 고정시켰고 쿠페를 제조하여 광학현미경을 사용하여 세포 구조를 연구하였다. PC-TPP 형질전환 식물의 횡단면의 세포 구조 및 형태는 대조 식물에서 관찰된 것과 유사하였다. PC-TPS 형질전환체의 횡단면은 스폰지 유조직 세포층이 야생형 및 TPP 형질전환 식물의 3층과 비교하여 7층의 세포층으로 구성된다는 것을 나타내었다 (도 29). 상기 발견은 스폰지 TPS 형질전환 식물 주가 TPP 및 대조 식물과 비교하여 더 두껍고 더 딱딱한 잎을 형성한다는 본 발명자들의 관찰 결과와 일치한다.
<실시예 23>
트레할로스 포스페이트 신타제의 발현에 의한 저온-감미 (cold-sweetening)의 억제
감자 괴경에 특이적인 파타틴 프로모터의 조절 하의 TPS 유전자를 포함하는 (pMOG845; 실시예 1) 형질전환 감자 식물 (솔라눔 투베로숨 씨브이. Kardl)을 제조하였다. 형질전환 식물 및 야생형 대조 식물을 온실에서 재배하였고 괴경을 수확하였다. 괴경 재료의 샘풀을 취하여 수확 직후, 그리고 4℃에서 저장한 지 6개월 후 당 분석을 실시하였다. HPLC-PED 분석 결과를 도 30에 예시한다.
TPS이. 콜리로 형질전환된 감자 식물에서는 수확 직후 괴경에 축적된 전체 당 (글루코스, 과당 및 수크로스)의 양이 더 적다는 것이 명확하게 나타났다. 4℃에서 6개월 동안 저장한 후 용해성 당의 증가는 야생형 대조 주와 비교하여 형질전환 주에서 현저하게 덜하였다.
<실시예 24>
결핍 스트레스 하에서의 35S TPP (pMOG851) 형질전환 담배 식물의 향상된 능력
35S CaMV 프로모터의 조절 하에 이. 콜리로부터의 TPS 및 TPP 유전자 모두를 포함하는 형질전환 담배 식물을 조작하였다. TPS 및 TPP 유전자의 발현은 노던 블롯 및 효소 활성 측정을 사용하여 수득된 주에서 증명하였다. pMOG851-2는 0.008 mg의 트레할로스.g-1fw를 축적하고 pMOG851-5는 0.09 mg의 트레할로스.g-1fw를 축적하는 것으로 나타났다. 두 유전자 모두의 발현은 결핍 스트레스 하에서 식물 형태 및 성장 능력에 뚜렷한 효과를 미쳤다. 물 공급을 제한함으로써 부과되는 결핍 스트레스 하에서 재배할 경우 시험된 두 형질전환 담배 주인 pMOG851-2 및 pMOG851-5는 야생형 담배보다 28% (P<0.01) 및 39% (P<0.001) 더 큰 전체 건중량을 나타내었다. 상기 건중량에서의 증가는 잎 생성량이 증가한 데에 주로 기인하는 것이었으며 잎의 건중량은 pMOG851-5 형질전환 식물의 경우 85%까지 더 높았다. 우수하게 물이 공급된 조건 하에서는 현저한 차이점은 관찰되지 않았다.
결핍 스트레스 실험
일차 형질전환체인 pMOG851-2 및 pMOG851-5 (Goddijn 등의 문헌 [Plant Physiol. 113, 181 (1997)] 참조)의 자가 수정으로부터 수득된 F1 종자를 상기 연구에 사용하였다. 종자를 20%의 가정용 표백제에서 10분 동안 살균시켰고 멸균수로 5회 헹구었으며 10 g.L-1의 수크로스 및 100 mg.L-1의 카나마이신을 포함하는 절반 농도의 무라시게 및 스쿡 배지에 뿌렸다. 야생형 SR1 종자를 카나마이신이 없는 플레이트에 뿌렸다. 2주 후에 모든 주로부터의 묘목을 토양 (모래 양토)으로 옮겼고 22℃에서 약 100 μE.m-2의 광 강도 (14시간.d-1)에서 성장 챔버에서 재배하였다. 모든 식물을 3.8리터의 화분에서 동일 양의 토양에서 재배하였다. 식물에는 절반 농도의 호아글랜드 (Hoagland) 영양 용액으로 매일 물을 주었다. pMOG851-2 및 pMOG851-5의 묘목은 야생형 묘목보다 약간 더 느리게 성장하였다. 본 발명자들은 동일한 발생 상태에서 실험을 시작하는 것이 가장 중요하다고 생각하였기 때문에, 본 발명자들은 묘목이 동일한 길이 (10 cm), 동일한 발생 상태 (4잎), 및 동일한 건중량 (각 주의 2개의 추가의 식물로부터 측정)일 때 각각의 주의 결핍 스트레스 처리를 시작하였다. 이것은 pMOG851-2의 처리 착수는 야생형보다 2일 늦고, pMOG851-5의 처리 착수는 야생형보다 7일 더 늦다는 것을 의미한다. 각각의 주로부터 6개의 식물에 결핍 스트레스를 주었고, 반면 4개의 식물은 대조군으로서 물을 잘 주는 조건 하에 두었다. 야생형 담배 식물은 이들을 시드는 지점 근처에서 유지시킴으로써 결핍상태가 되게 하였고; 잎의 하부의 절반이 시들 때, 식물에 많은 영양 용액을 줌으로써 식물이 일시적으로 팽압을 회복하도록 하였다. 실제적으로 이것은 매 3일마다 영양 용액 50 ml을 공급한다는 것을 의미하며; 대조 식물에는 매일 물을 주어 농포 용수량에서 이들이 유지되도록 하였다. 이어서 pMOG851-2 및 pMOG851-5 식물에는 야생형과 정확하게 동일한 방식으로 물을 주었다 (즉 야생형과 같이 동일한 양의 영양 용액을 동일한 시간 간격 후에 공급함). 줄기 길이는 전체 연구 기간 동안 규칙적으로 측정하였다. 모든 식물은 동일한 날에 수확하였는 데 (야생형 식물의 경우 처리 착수 32일 후) 이는 형질전환 식물을 더 늦은 단계에서 수확하면 식물 주의 비교가 복잡하게 될 것이기 때문이다. 수확 시에 전체 잎 면적은 Delta-T Devices 잎 면적 미터 (미국 캘리포니다주 소재의 산타 클라라 (Santa Clara)사)를 사용하여 측정하였다. 또한 잎, 줄기 및 뿌리의 습윤 중량 및 건중량을 측정하였다.
두 번째 실험을 본질적으로 동일한 방식으로 행하여 식물의 삼투 포텐셜을 분석하였다. 결핍 스트레스 35일 후에 가장 어린 성숙한 잎으로부터의 샘플을 명기의 초기에 취하였다 (n=3).
떼어낸 잎의 공기 건조
공기건조시킨 떼어낸 잎의 물 손실은 물을 잘 준 4주령의 pMOG851-2, pMOG851-5 및 야생형 식물로부터 측정하였다. 식물 주 당 5개의 식물을 사용하였고, 각각의 식물로부터 가장 어린 2개의 성숙한 잎을 떼어내어 25%의 상대 습도에서 공기건조시켰다. 각각의 잎의 습윤 중량은 32시간에 걸쳐 측정하였다. 실험시에 샘플은 삼투 포텐셜 측정 및 용해성 당 함량의 측정을 위하여 유사한, 물을 잘 준 잎으로부터 취하였다.
삼투 포텐셜 측정
삼투 포텐셜 분석을 위한 잎 샘플을 1 ml의 뚜껑이 닫힌 주사기에 즉시 저장하였고 드라이 아이스에서 냉동시켰다. 분석 직전에 잎 샘플을 작은 바이알에 압착시켜 넣었고 혼합시켰으며 이것을 사용하여 종이 디스크를 포화시켰다. 이어서 Wescor HR-33T 이슬 포인트 마이크로볼트 미터를 사용하여 Wescor C52 챔버에서 삼투 포텐셜을 측정하였다.
클로로필 형광
야생형, pMOG851-2 및 pMOG851-5 식물의 클로로필 형광은 플스 조절 (PAM) 형광계 (독일 에펠트리흐 소재의 왈츠 (Walz)사)를 사용하여 결핍 처리 20일 후 각각의 식물 주에 대하여 측정하였다. 측정 전에 식물을 암 상태에서 2시간, 이어서 암기에서 1시간 동안 두었다. 그 후 가장 어린 성숙한 잎을 20분 동안 암 상태에 적응시켰다. 각각의 측정의 처음에 작은 (1.6 KHz에서 조정된 0.05μmol m-2s-1) 광 빔을 켰고 최소 형광 수준 (FO)을 측정하였다. 이어서 4000 μmol m-2s-1의 포화 광 펄스를 지속 기간 800 ms로 적용함으로써 최대 형광 수준 (Fm)을 측정하였다. 추가의 20초 후에 시그날이 FO근처까지 줄여졌을 때 화학선 광의 짧은 포화 펄스 (길이: 800ms, 4000 μmol m-2s-1)를 2초간의 암 간격으로 30초 동안 반복적으로 주었다. 광화학적 (qQ) 및 비광화학적 (qE) 켄칭 성분을 볼러-노르덴캄프 (Bolhar-Nordenkampf) 및 오키스트 (Oquist) (1993)에 따른 형광/시간 곡선으로부터 측정하였다. 측정 순간에 문제의 잎은 육안으로 시들지 않았다. 통계학적 데이터는 Number Cruncher Statistical System 프로그램 (미국 84037 유타주 케이스빌 노쓰 400 이스트 865 소재의 힌츠 박사 (Dr. J.L. Hintz))을 사용하여 평방편차의 일방 분석법으로 얻어졌다.
결핍-스트레스 식물의 클로로필 형광 분석에서 pMOG851-5에서 더 높은 광화헉적 켄칭 (qQ) 및 최대 형광에 대한 가변성 형광의 더 높은 비율 (Fv/Fm)이 나타났는데, 이는 더 효과적인 작업의 광합성 기관을 나타내는 것이다 (표 13).
야생형 (wt) 및 트레할로스 축적 (pMOG851-2, pMOG851-5) 형질전환 담배 식물의 클로로필 형광 매개 변수. 물을 잘 주거나 (대조) 또는 건조 상태 하에서 재배한 식물들 사이에서 식물 주 당 차이, 및 물을 잘 주거나 또는 건조 상태하에 재배한 각각의 형질전환 주 및 야생형 사이의 차이를 분석하는 ANOVA 시험으로부터 P (확률) 수치를 얻음. Fm: 최대 형광; Fv: 가변성 형광 (Fm-Fv); qQ: 광화학적 켄칭; qE: 비광화학적 켄칭. Fm, Fv는 임의의 유닛으로 표현됨 (차트 mm).
WT pMOG851-1 pMOG851-5 8-51-2/WT 815-5
Fm 대조 174.4 180.4 175.6 ns ns
건조 151.5 155.7 167.8 ns 0.0068
P (대조 건조) 0.0004 0.000 ns
Fv 대조 134.6 143.3 142.8 ns ns
건조 118.4 122.1 135.6 ns 0.0011
P (대조 건조) 0.006 0.000 ns
Fv/Fm 대조 0.771 0.794 0.813 0.059 0.0052
건조 0.782 0.784 0.809 ns 0.0016
P (대조 건조) ns ns ns
qE 대조 15.2 23.8 29.9 0.259 0.0085
건조 25.4 21.6 23.5 ns ns
P (대조 건조) 0.048 ns ns
qQ 대조 91.3 92.4 90.4 ns ns
건조 73.68 78.5 92.75 ns 0.0005
P (대조 건조) 0.005 0.006 ns
탄수화물 분석
수확시에 스트레스 및 비스트레스 모두의 조건 하에서 pMOG851-5 식물은 건중량이 0.2 mg.g-1인 트레할로스를 포함하는 반면, pMOG851-2 및 야생형에서는 트레할로스의 수준이 검출 한계 미만이었다. pMOG851-5 식물의 트레할로스 함량은 스트레스 및 비스트레스 식물에서 유사하였다 (각각 0.19 및 0.20 mg.g-1의 건조 중량). 물을 잘 준 조건 하에서 글루코스 및 과당의 수준은 야생형보다 pMOG851-5 식물에서 2배 더 높았다. 스트레스를 받은 pMOG851-5 식물의 잎은 스트레스를 받은 야생형 식물의 잎보다 약 3배 더 높은 4종의 비구조적 탄수화물인 전분, 수크로스, 글루코스 및 과당 각각을 포함하였다. pMOG851-2 잎에서 탄수화물 수준은 클로로필 형광 수치와 마찬가지로 야생형에서의 탄수화물 수준과 현저하게 다르지 않았다. 스트레스를 받은 식물의 모든 주는 비스트레스 식물과 비교하여 증가된 수준의 글루코스 및 과당을 포함하였다.
결핍 스트레스 및 대조 식물의 삼투 포텐셜
두 번째의 온실 조건 하에서의 유사한 실험 동안 형질전환 식물은 상기한 바와 같은 동일한 표현형을 나타내었고, 다시 pMOG851-5는 결핍 스트레스 하에서 pMOG851-2 및 야생형 식물보다 성장이 훨씬 감소됨이 나타났다. 결핍 pMOG851-5 식물의 잎에서의 삼투 포텐셜 (-1.77 ± 0.39 Mpa)는 야생형 잎 (-1.00 ± 0.08 Mpa)보다 현저하게 낮았으며 (P=0.017); pMOG851-2는 중간치를 나타내었다 (-1.12 ± 0.05 Mpa). 유사하게, 물을 잘 준 조건 하에서 pMOG851-5 식물의 삼투 포텐셜 (-0.79 ± 0.05 Mpa)는 야생형 잎 (-0.62 ± 0.03 Mpa)보다 현저하게 낮았으며 pMOG851-2는 중간치를 나타내었다 (-0.70 ± 0.01 Mpa).
떼어낸 잎의 공기 건조
pMOG851-2, pMOG851-5 및 야생형의 잎을 떼어내어 그들의 습윤 중량을 32시간의 공기건조에 걸쳐 측정하였다. pMOG851-2 및 pMOG851-5 식물의 잎은 야생형 잎보다 물을 현저하게 덜 잃어버렸으며 (P<0.05); 32시간 후에 pMOG851-5 및 pMOG851-2의 잎에서는 야생형의 경우 30%의 습윤 중량과 비하여 각각 그들의 습윤 중량의 44% 및 41%가 남아있었다. 실험시에 샘플은 삼투 포텐셜 측정 및 트레할로스, 수크로스, 글루코스 및 과당의 분석을 위하여 유사한, 물을 잘 준 잎으로부터 취하였다. 두 형질전환 주의 삼투압 포텐셜은 야생형보다 더 낮았으며 (P<0.05), pMOG851-5가 가장 낮은 물 포텐셜 (-0.63 ± 0.03 Mpa), 야생형이 가장 높은 포텐셜 (-0.51 ± 0.02 Mpa) 및 pMOG851-2가 중간치의 포텐셜 (-0.57 ± 0.04 Mpa)를 가졌다. 시험된 모든 당의 수준은 야생형 잎보다 pMOG851-5 식물의 잎에서 현저하게 더 높아 4종의 당을 합한 것의 3배 더 높은 수준을 나타내었다 (P=0.002). pMOG851-2 식물은 4종의 당을 합한 것의 2배 더 높은 수준을 포함하였다 (P=0.09). 트레할로스 수준은 pMOG851-5 식물에서 0.24 ± 0.02 mg.g-1DW이었고, pMOG851-2 및 야생형에서는 검출치 미만치었다.
<실시예 25>
결핍 스트레스 하의 TPS 및 TPP 형질전환 상추 식물 주의 능력
TPS 및 TPP 일차 형질전환체 및 야생형 대조 식물을 결핍 스트레스 하에 두었다. TPP 형질전환 주가 먼저 그의 시드는 지점에 도달하였고, 이어서 대조 식물, 이어서 TPS 형질전환 식물이 그의 시드는 지점에 도달하였는데, 이는 다른 식물 종에서 관찰되는 바와 같이 TPS 형질전환 주가 결핍 스트레스 동안 TPP 및 야생형 식물보다 명확하게 잇점을 갖는다는 것을 나타낸다.
<실시예 26>
PC-TPS 또는 PC-TPP 형질전환 식물에서 상추 식물의 추대에 대한 영향
상추의 추대는 PC-TPP 형질전환 식물에서 감소되었다 (표 14). PC-TPS 형질전환 식물 주에서는 야생형 상추 식물과 비교하여 추대가 증가되었음이 나타났다.
상추 식물의 추대
PC-TPP 주 식물의 전체 # 1. 정상 추대 2. 감소된 추대 3. 육안으로 관찰가능한 개화 4. 가능한 대화 현상 5. 완전한 무성
1A 4 4
2A 3 1 2
3A 2 2
4A 5 1 1 1 2
5A 5 1 1 3
7A 1 1
8A 5 4 1
9A 5 5
10A 3 1 2
11A 4 2 3
12A 4 4
대조 5 5 `
<실시예 27>
TPS 및 TPP로 형질전환된 토마토 식물의 능력
토마토 형질전환 실험에 사용된 구축물은 35S-TPP, PC-TPS, PC-TPS as-트레할라제, PC-TPP, E8-TPS, E8-TPP, E8 TPS E8 as-트레할라스였다. 플라스토시아닌 프로모터 및 35S 프로모터에 의해 작동되는 TPP 유전자로 형질전환된 식물은 다른 식물에서 관찰되는, 즉 잎의 표백, 꽃의 형성 감소 또는 꽃 형성이 없어 작은 열매를 맺거나 또는 열매가 없는 표현형과 유사한 표현형을 나타내었다. 소수의 35S-TPP 형질전환 주는 극도로 큰 열매를 생성시켰다. 상기 열매에서는 과피의 빨리자람 (outgrow)이 증강되었음이 나타났다. 플라스토시아닌 프로모터 및 35S 프로모터로 작동되는 TPS 유전자로 형질전환된 식물은 작은 란셋 형상의 잎을 형성하지 않았다. 몇몇의 심각하게 발육이 저지된 식물은 작은 암녹색 잎을 형성하였다. PC-TPS 및 PC-as-트레할라제로 형질전환된 식물은 대조 식물과 비교하여 더 작고 더 암녹색인 잎을 형성하였다.
35S 또는 PC 작동 TPS 및 TPP 형질전환 식물의 색상 및 잎 말단은 다른 작물에서 관찰되는 것과 유사하게 명확하게 구분할 수 있었다.
열매 특이 E8 프로모터의 조절 하의 TPS 및 TPP 유전자를 포함하는 식물은 야생형 열매와 비교하여 표현형상의 차이를 전혀 나타내지 않았다. E8 TPS 및 E8-as-트레할라제로 형질전환된 식물은 황색 과피 및 불완전한 성숙의 발육 이상인 열매를 생성하였다.
<실시예 28>
as-트레할라제 및(또는) TPS로 형질전환된 감자 식물의 능력
구축물: 35S as-트레할라제 (pMOG1027) 및 35S as-트레할라제 Pat TPS (pMOG1027(845-11/22/28).
35S as-트레할라제 및 pat-TPS를 동시에 발현하는 식물은 35S as-트레할라제 구축물 및 히그로마이신 내성 마커 유전자를 포함하여 유전자형이 pMOG1027 (845-11), pMOG1027(845-22) 및 pMOG1027 (845-28)인 구축물 pMOG1027로 pat-TPS 주 (카나마이신에 대하여 내성)를 재형질전환시킴으로써 만들어졌다. 미세괴경을 시험관내에서 유도하여 미세괴경의 습윤 중량을 측정하였다. 평균 습윤 중량 양은 pMOG1027 (pMOG845-11/22/28)을 포함하는 형질전환 주에 있어서 증가되었다. pMOG1027에 의해서만 형질전환된 주로부터 얻어진 미세괴경의 습윤 중량 생물량은 야생형 대조 식물보다 약간 더 높았다. 생성된 식물을 온실에서 재배하여 괴경 생성량을 측정하였다 (도 33). 35S s-트레할라제 또는 35S as-트레할라제 및 pat-TPS의 조합물로 형질전환시킨 주는 대조 주와 비교하여 현저하게 더 많은 괴경 매스를 생성하였다. 전분 측정에서는 더 큰 생성량을 갖는 식물 주에 의해 생성된 괴경의 전분 함량에 있어서 어떠한 차이도 나타나지 않았다 (도 34). 다수의 1027(845-11/22/28) 주는 잎의 보조 싹으로부터 토양 위의 괴경을 생성하였는 데, 이는 식물 발생에 대한 사용된 구축물의 심오한 영향을 나타내는 것이다. 35S as-트레할라제 단독으로 형질전환시킨 식물 주는 토양 위의 괴경을 형성하지 않았다.
구축물: Pat as-트레할라제 (pMOG1028) 및 Pat as-트레할라제 Pat TPS(pMOG1028(845-11/22/28))
Pat as-트레할라제 및 Pat-TPS를 동시에 발현하는 식물은 Pat as-트레할라제 구축물 및 히그로마이신 내성 마커 유전자를 포함하여 유전자형이 pMOG1028 (845-11), pMOG1028(845-22) 및 pMOG1028 (845-28)인 구축물 pMOG1028로 Pat-TPS 주 (카나마이신에 대하여 내성)를 재형질전환시킴으로써 만들어졌다. 식물을 온실에서 재배하여 미세괴경의 습윤 중량을 측정하였다 (도 35). 다수의 pMOG1028 형질전환 주는 대조 주와 비교하여 현저하게 더 많은 괴경 매스를 생성하였다. Pat-TPS 및 Pat as-트레할라제 모두로 형질전환시킨 개개의 식물은 괴경 생성량이 거의 생성량이 없는 것에서부터 대조 주와 비교하여 유사하거나 또는 더 큰 생성량을 갖는 것까지 다양하였다 (도 35).
구축물: PC as-트레할라제 (pMOG1092)
pMOG1092로 형질전환된 식물을 온실에서 재배하여 괴경 생성량을 측정하였다. 여러 주는 대조군과 비교하여 더 암녹색의 잎을 생성하였다. 괴경 생성량은 비형질전환 식물과 비교하여 현저하게 증가하였다 (도 36).
구축물: PC as-트레할라제 PC-TPS(pMOG1130)
pMOG1130으로 형질전환된 식물을 온실에서 재배하여 괴경 생성량을 측정하였다. 여러 형질전환 주는 작은 암녹색 잎을 발생시켰고 현저하게 발육저지된 성장을 나타내었는데 이는 식물을 TPS로 형질전환시킬 때 관찰되는 표현형 효과가 as-트레할라제 유전자가 동시에 발현될 때 더 심하다는 것을 나타낸다 (실시예 21 참조). 괴경 매스 생성량은 거의 생성량이 없는 것에서부터 대조 식물과 비교하여 현저하게 더 큰 생성량을 갖는 것까지 다양하였다 (도 37).
<실시예 29>
엔. 타바쿰에서의 감자 트레할라제 cDNA의 과다발현
구축물: de35S CaMV 트레할라제 (pMOG1078)
pMOG1078로 형질전환된 일차 담배 형질전환체는 야생형 담배와는 다른 표현형을 나타내었고, 몇몇 형질전환체의 잎은 색상이 암녹색이었고 더 두꺼웠는데 (잎의 형태는 란셋 형태가 아님) 이는 식물 대사작용에 대한 트레할라제 유전자 발현의 영향을 나타내는 것이다. 자가수분 일차 형질전환체의 종자를 뿌려 카나마이신 상에서 선발하였다. 표현형은 S1 세대에서 멘델 방식으로 분리되는 것으로 나타났다.
기탁
부다페스트 조약하에 하기 기탁을 하였다. 하기 클론을 1997년 4월 21일 네덜란드의 3740 아게 바른 피.오. 박스 273 오스테르스트라트 1에 소재하는 센트랄 뷰로 푸어 심멜쿨투레스에 기탁하고, 하기 번호를 부여받았다.
에스케리키아 콜리 (Escherichia coli)
DH5alpha/pMOG1192 CBS 692.97
DH5alpha/pMOG1240 CBS 693.97
DH5alpha/pMOG1241 CBS 694.97
DH5alpha/pMOG1242 CBS 695.97
DH5alpha/pMOG1243 CBS 696.97
DH5alpha/pMOG1244 CBS 697.97
DH5alpha/pMOG1245 CBS 698.97
기탁된 클론
pMOG1192: 다카피 벡터 pGEM-T에 삽입된 헬리안터스 애누스 TPS/TPP 이성분 (bipartite) cDNA를 함유 (프로메가)
pMOG1240: pCRscript에 삽입된 담배 TPS "825" bp cDNA 단편 함유 (스트라타겐)
pMOG1241: pGEM-T에 삽입된 담배 TPS "840" bp cDNA 단편 함유 (프로메가)
pMOG1242: pGEM-T에 삽입된 담배 TPS "630" bp cDNA 단편 함유 (프로메가)
pMOG1243: pGEM-T에 삽입된 담배 TPP "543" bp cDNA 단편 함유 (프로메가)
pMOG1244: pUC18 플라스미드에 삽입된 담배 TPP "723" bp cDNA 단편 함유
pMOG1245: pGEM-T에 삽입된 담배 TPP "447" bp 단편 함유 (프로메가)
관련 pMOG### 및 pVDH### 클론 목록
1. 바이너리 벡터
pMOG23: NPTII 선택 마커를 함유하는 바이너리 벡터 (약 10 Kb)
pMOG22: NPTII-유전자가 하이그로마이신 내성을 부여하는 HPT-유전자로 대체된 pMOG23의 유도체
pVDH 275: 플라스토시아닌 프로모터- 노스 터미네이터 발현 카셋트를 함유하는 pMOG23으로부터 유래된 바이너리 벡터.
pMOG402: 폴리링커에 KpnI 제한 부위가 없으며, NPTII 유전자에서의 포인트 돌연변이가 복구된 pMOG23의 유도체
pMOG800: 폴리링커에서의 복구된 KpnI 부위를 갖는 pMOG402의 유도체
2. TPS/TPP 발현 구축물
pMOG799 35S-TPS-3'nos1
Hyg 마커를 갖는 pMOG810와 동일
pMOG845 Pat-TPS-3'PotPiII
Hyg 마커를 갖는 pMOG925와 동일
pMOG851 35S-TPS-3'nos 35S-TPP(atg)2
pMOG1010 de35S CaMV amv 리더 TPP(gtg) PotPiII
Hyg 마커를 갖는 pMOG 1142와 동일
pMOG1093 플라스토시아닌-TPS-3'nos
Hyg 마커를 갖는 pMOG 1129와 동일
pMOG1177 플라스토시아닌-TPS-3'PotPiII 3'nos
pVDH318 pMOG1177과 동일
pMOG1093과 기능적으로 동일
pMOG1124 플라스토시아닌-TPP(gtg) 3'PotPiII 3'nos
pVDH321 pMOG1124와 동일
pMOG1128 파타틴 TPP(gtg) 3'PotPiII
pMOG1140 E8-TPS-3'nos
pMOG1141 E8-TPP(gtg)-3'PotPiII
3. 트레할라제 구축물
pMOG1028 파타틴 as-트레할라제 3'-POTPiII, 하이그로마이신 내성 마커
pMOG1078 de35S CaMV amv 리더 트레할라제 3'nos
pMOG1090 de35S CaMV amv 리더 as 트레할라제 3'nos
Hyg 마커를 갖는 pMOG1027과 동일
pMOG1092 플라스토시아닌-as 트레할라제-3'nos
pMOG1130 플라스토시아닌-as 트레할라제-3'nos 플라스토시아닌-TPS-3'nos
pMOG1153 E8-TPS-3'nos E8-as 트레할라제-3'PotPiII
1: 모든 구축물은 다른 지시가 없는 한 NPTII 선택 마커를 함유한다.
2: 두 형태의 TPP 구축물은 문헌 (Goddijn et al. (1997) Plant Physiol. 113, 181)에 설명된 것처럼 사용된다.
〈서열표〉
(1) 일반적 정보 :
(i) 출원인:
(A) 이름: 모겐 인터내셔널 엔브이
(B) 거리: 아인쉬타인베크 97
(C) 도시: 라이덴
(D) 국가: 네덜란드
(F) 우편번호: 2333 CB
(G) 전화: (0)71-5258282
(H) 팩스: (0) 71-5221471
(ii) 발명의 명칭: 트레할로스-6-포스페이트 수준의 변경에 의한 대사 조절
(iii) 서열수: 57
(iv) 컴퓨터 판독 형태
(A) 매체 유형: 플로피 디스켓
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형
(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: 패턴트인 릴리스 #1.0, 버전 #1.25 (EPO)
(vi) 우선권 출원 데이터:
(A) 출원 번호: EP 96.201.225.8
(B) 출원일: 1996년 5월 3일
(vi) 우선권 출원 데이터:
(A) 출원 번호: EP 96.202.128.3
(B) 출원일: 1996년 7월 26일
(vi) 우선권 출원 데이터:
(A) 출원 번호: EP 96.202.395.8
(B) 출원일: 1996년 8월 29일
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 1450 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(iii) 가설: 없음
(ix) 특징:
(A) 이름/키: CDS
(B) 위치: 21..1450
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 2에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 476 아미노산
(B) 유형: 아미노산
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(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 3에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 835 염기쌍
(B) 유형: 핵산
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(iii) 가설: 없음
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(A) 이름/키: CDS
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(xi) 서열 설명:
(2) 서열 4에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 272 아미노산
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(2) 서열 5에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 유형: 핵산
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(ii) 분자 형태: cDNA
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(xi) 서열 설명:
(2) 서열 6에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
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(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없음
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 7에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 26 염기쌍
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(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 인티센스: 없음
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 8에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 28 염기쌍
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(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 9에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 22 염기쌍
(B) 유형: 핵산
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(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 10에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 743 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 인간
(ix) 특징:
(A) 이름/키: CDS
(B) 위치: 1..743
(D) 다른 정보: /부분
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 11에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 247 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 12에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 395 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 니코티아나 타바쿰
(B) 주: 삼선 엔엔 (Samsun NN)
(C) 조직형: 잎
(ix) 특징:
(A) 이름/키: CDS
(B) 위치: 1..395
(D) 다른 정보: /부분
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 13에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 131 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 14에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 491 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 니코티아나 타바쿰
(B) 주: 삼선 엔엔 (Samsun NN)
(C) 조직형: 잎
(ix) 특징:
(A) 이름/키: CDS
(B) 위치: 1..491
(D) 다른 정보: /부분
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 15에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 163 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 16에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 361 염기쌍
(B) 유형: 핵산
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(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 니코티아나 타바쿰
(B) 주: 삼선 엔엔 (Samsun NN)
(C) 조직형: 잎
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 17에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 118 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 니코티아나 타바쿰
(B) 주: 삼선 엔엔 (Samsun NN)
(C) 조직형: 잎
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 18에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 417 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 니코티아나 타바쿰
(B) 주: 삼선 엔엔 (Samsun NN)
(C) 조직형: 잎
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 19에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 411 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 니코티아나 타바쿰
(B) 주: 삼선 엔엔 (Samsun NN)
(C) 조직형: 잎
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 20에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 405 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 니코티아나 타바쿰
(B) 주: 삼선 엔엔 (Samsun NN)
(C) 조직형: 잎
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 21에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 427 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 니코티아나 타바쿰
(B) 주: 삼선 엔엔 (Samsun NN)
(C) 조직형: 잎
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 22에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 315 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 니코티아나 타바쿰
(B) 주: 삼선 엔엔 (Samsun NN)
(C) 조직형: 잎
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 23에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 352 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 니코티아나 타바쿰
(B) 주: 삼선 엔엔 (Samsun NN)
(C) 조직형: 잎
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 24에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 2640 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 헬리안터스 애누스 (Helianthus annuus)
(F) 조직형: 잎
(ix) 특징:
(A) 이름/키: CDS
(B) 위치: 171..2508
(ix) 특징:
(A) 이름/키: 확실하지 않음
(B) 위치: 대체 (2141..2151, "ccatnnntta")
(ix) 특징:
(A) 이름/키: 확실하지 않음
(B) 위치: 대체 (2237..2243, "actnaaa")
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 25에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 779 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 26에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 2130 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 헬리안터스 애누스
(ix) 특징:
(A) 이름/키: CDS
(B) 위치: 171..2130
(C) 다른 정보: /부분
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 27에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 653 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 28에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 390 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 헬리안터스 애누스
(ix) 특징:
(A) 이름/키: CDS
(B) 위치: 3..258
(C) 다른 정보: /부분
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 29에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 85 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 30에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 31에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 23 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 32에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 33에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 34에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 35에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 36에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 37에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 38에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 39에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 2982 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)
(ix) 특징:
(A) 이름/키: CDS
(B) 위치: 64..2982
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 40에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 973 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 41에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 300 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 오리자 사티바 (Oryza sativa)
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 42에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 627 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 셀라기넬라 레피도필라 (Selaginella lepidophylla)
(ix) 특징:
(A) 이름/키: CDS
(B) 위치: 4..627
(C) 다른 정보: /부분
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 43에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 208 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 44에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 645 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 셀라기넬라 레피도필라
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 45에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 498 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 아라비돕시스 탈리아나
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 46에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 463 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 아라비돕시스 탈리아나
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 47에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 394 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 아라비돕시스 탈리아나
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 48에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 428 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 아라비돕시스 탈리아나
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 49에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 481 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 아라비돕시스 탈리아나
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 50에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 395 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 아라비돕시스 탈리아나
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 51에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 431 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 오리자 사티바
(ix) 특징:
(A) 이름/키: misc_feature
(B) 위치: 1
(C) 다른 정보: /standard_name= "GENBANK ID: D22143"
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 52에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 496 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 오리자 사티바
(ix) 특징:
(A) 이름/키: misc_feature
(B) 위치: 1
(C) 다른 정보: /standard_name= "GENBANK ID: D40048"
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 53에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 288 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 오리자 사티바
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 54에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 2207 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 기원
(A) 생물체: 솔라늄 튜버로섬 (Solanum Tuberosum)
(B) 주: Kardal
(ix) 특징:
(A) 이름/키: CDS
(B) 위치: 161..1906
(C) 다른 정보: /function= "putative glycosylationsite"
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 55에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 581 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 56에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 18 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없음
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 57에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 18 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없음
(xi) 서열 설명:

Claims (107)

  1. 트레할로스-6-포스페이트의 대사 이용성의 변화를 유도함으로써 생체내 세포, 조직 또는 기관의 발생 및(또는) 조성의 변형 방법.
  2. 트레할로스-6-포스페이트의 세포내 이용성을 감소시킴으로써 세포의 해당작용 방향에서의 탄소 흐름을 촉진하는 방법.
  3. 트레할로스-6-포스페이트의 세포내 이용성을 증가시킴으로써 세포의 해당작용 방향에서의 탄소 흐름을 억제하는 방법.
  4. 트레할로스-6-포스페이트의 세포내 이용성을 감소시킴으로써 세포의 광합성을 억제하는 방법.
  5. 트레할로스-6-포스페이트의 세포내 이용성을 증가시킴으로써 세포의 광합성을 촉진하는 방법.
  6. 트레할로스-6-포스페이트의 세포내 이용성을 증가시킴으로써 싱크-관련 활성을 촉진하는 방법.
  7. 트레할로스-6-포스페이트의 세포내 이용성을 감소시킴으로써 세포 또는 조직의 성장을 촉진하는 방법.
  8. 트레할로스-6-포스페이트의 세포내 이용성을 증가시킴으로써 세포 또는 조직의 성장을 억제하는 방법.
  9. 트레할로스-6-포스페이트의 세포내 이용성을 감소시킴으로써 세포의 물질대사를 증가시키는 방법.
  10. 제2항, 제4항, 제7항 또는 제9항에 있어서, 상기 트레할로스-6-포스페이트의 세포내 농도의 감소는 트레할로스 포스페이트 포스파타제 (TPP) 활성의 증가에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, TPP 활성의 증가는 효소 TPP를 발현할 수 있는 벡터로 상기 세포를 형질전환시켜 달성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 세포가 TPP를 코딩하는 이종 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되는 방법.
  13. 제2항, 제4항, 제7항 또는 제9항에 있어서, 상기 트레할로스-6-포스페이트의 세포내 농도의 감소는 트레할로스 포스페이트 신타제 (TPS) 활성의 감소에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 TPS 활성의 감소는 TPS를 억제하는 분자를 발현할 수 있는 벡터로 상기 세포를 형질전환시켜 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 벡터는 TPS의 안티센스 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제10항에 있어서, 상기 감소는 내생 TPP 효소의 돌연변이에 기인하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제10항에 있어서, 트레할로스-6-포스페이트의 감소가 포스포-알파-(1,1)-글루코시다제의 상대적인 과다발현에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제3항, 제5항, 제6항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 트레할로스-6-포스페이트의 세포내 농도의 증가가 TPS 활성의 증가에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 TPS 활성의 증가는 효소 TPS를 발현할 수 있는 벡터로 상기 세포를 형질전환시켜 달성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 세포는 TPS를 코딩하는 이종 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제3항, 제5항, 제6항 또는 제8항에 있어서, 트레할로스-6-포스페이트의 세포내 농도의 증가는 TPP 활성의 감소에 의하여 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 TPP 활성의 감소는 TPP를 억제하는 분자를 발현할 수 있는 벡터로 상기 세포를 형질전환함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 벡터가 TPS의 안티센스 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제18항에 있어서, 상기 증가가 내생 TPS 효소의 돌연변이에 기인하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 또는 세포들이 식물체에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 식물체가 트랜스제닉 식물체인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 트랜스제닉 식물체가 아그로박테리움 튜머페신즈를 사용하여 형질전환시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 또는 세포들이 동물, 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 인간에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 미생물, 바람직하게는 세균, 병원균, 효모, 진균류, 세포배양물, 난모세포, 정자세포, 하이브리도마, 원생생물 및 조직배양체로 이루어지는 군으로부터 선택된 미생물인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. TPP를 코딩하는 유전자를 포함하는 클로닝 벡터.
  31. 제30항에 있어서, 서열 3, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 17로 나타낸 뉴클레오타이드 서열 및 서열 24, 서열 28, 서열 39, 서열 42 및 서열 44에 의하여 코딩되는 이성분 효소로부터의 TPP를 코딩하는 부분으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 클로닝 벡터.
  32. 발현시 내생 TPS 유전자의 기능 활성을 방지할 수 있는 TPS의 안티센스 유전자를 포함하는 클로닝 벡터.
  33. 서열 1, 서열 10, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 26, 서열 39, 서열 41, 서열 42, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 서열 48, 서열 49, 서열 50, 서열 51, 서열 52 및 서열 53으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 TPS 코딩 유전자를 포함하는 클로닝 벡터.
  34. 발현시 내생 TPP 유전자의 기능 활성을 방지할 수 있는 TPP의 안티센스 유전자를 포함하는 클로닝 벡터.
  35. 자신 또는 그의 조상이 TPP를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 식물체.
  36. 자신 또는 그의 조상이 TPP의 안티센스 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 식물체.
  37. 자신 또는 그의 조상이 TPS의 안티센스 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 식물체.
  38. 세포내 탄수화물 분배에 영향을 주기 위한 트레할로스-6-포스페이트의 용도.
  39. 바이오매스를 증가시키기 위한 트레할로스-6-포스페이트의 용도.
  40. 헥소키나제 활성에 영향을 주기 위한 트레할로스-6-포스페이트의 용도.
  41. 헥소키나제 시그날링 활성에 영향을 주기 위한 트레할로스-6-포스페이트의 용도.
  42. 세포벽 합성에 영향을 주기 위한 트레할로스-6-포스페이트의 용도.
  43. 바이오매스를 증가시키기 위한 트레할로스-6-포스페이트의 세포내 이용성에 영향을 미치는 화합물의 용도.
  44. 헥소키나제 활성에 영향을 끼치기 위한 트레할로스-6-포스페이트의 세포내 이용성에 영향을 미치는 화합물의 용도.
  45. 광합성에 영향을 끼치기 위한 트레할로스-6-포스페이트의 세포내 이용성에 영향을 미치는 화합물의 용도.
  46. 해당작용 경로에서 탄소 흐름에 영향을 끼치기 위한 트레할로스-6-포스페이트의 세포내 이용성에 영향을 미치는 화합물의 용도.
  47. 트레할로스-6-포스페이트의 세포내 이용성을 증가시킴으로써 저온 감미의 방지 방법.
  48. 트레할로스-6-포스페이트의 세포내 이용성 증가에 의한 수확 후 사탕무에서의 인버타제 억제 방법.
  49. 저온 감미 또는 인버타제 억제에 영향을 끼치기 위한 트레할로스-6-포스페이트의 세포내 이용성에 영향을 미치는 화합물의 용도.
  50. 제47항 또는 제48항에 있어서, T-6-P의 세포내 이용성의 증가는 트레할로스 포스페이트 신타제 활성의 증가로부터 기인하는 것인 방법.
  51. 제47항에 있어서, T-6-P 이용성의 조절은 특이적으로 감자 괴경에서 변경되는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 트레할로스 포스페이트 신타제를 코딩하는 유전자가 특이적으로 괴경에서 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 유전자가 에스케리키아 콜리 기원의 TPS 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제48항에 있어서, 상기 T-6-P 이용성의 조절은 특이적으로 사탕무 주근에서 변경되는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 트레할로스 포스페이트 신타제를 코딩하는 유전자가 특이적으로 주근에서 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 이성분 TPS-TPP 효소를 코딩하는 DNA 서열로 생물체를 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 트레할로스의 축적 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 유전자가 아라비돕시스 탈리아나 기원의 이성분 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제56항에 있어서, 상기 유전자가 셀라기넬라 레피도필라 기원의 이성분 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제56항에 있어서, 상기 유전자가 인간 이성분 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제56항에 있어서, 상기 유전자가 헬리안터스 애누스 기원의 이성분 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 이성분 TPS-TPP 효소를 코딩하는 DNA 서열의 발현에 의하여 트레할로스 제조동안 대사 진행을 방지하는 방법.
  62. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, TPP 또는 TPS의 발현이 특정 조직으로 제한되는 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, TPP 또는 TPS의 발현이 유도성 프로모터의 조절하에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 트레할로스의 대사 이용성의 변경을 유도하여 생체내 세포, 조직 또는 기관의 발생 및(또는) 조성의 변형 방법.
  65. 세포내 트레할라제 이용성의 증가에 의하여 세포내 해당작용 방향에서의 탄소 흐름을 촉진하는 방법.
  66. 세포내 트레할라제 이용성의 증가에 의한 세포내 해당작용 방향에서의 탄소 흐름의 억제 방법.
  67. 세포내 트레할라제 이용성의 감소에 의한 싱크 관련 활성의 촉진 방법.
  68. 세포내 트레할라제 이용성의 증가에 의한 세포 또는 조직의 성장 촉진 방법.
  69. 세포내 트레할라제 이용성의 감소에 의한 세포 또는 조직의 성장 억제 방법.
  70. 세포내 트레할라제 이용성의 증가에 의한 세포 대사의 증가 방법.
  71. 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제의 발현에 의하여 세포의 해당작용 방향에서의 탄소 흐름을 촉진하는 방법.
  72. 트레할로스-6-포스페이트 신타제의 발현에 의하여 세포의 해당작용 방향에서의 탄소 흐름을 억제하는 방법.
  73. 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제의 발현에 의한 세포내에서의 광합성의 억제 방법.
  74. 트레할로스-6-포스페이트 신타제의 발현에 의한 세포내에서의 광합성의 촉진 방법.
  75. 트레할로스-6-포스페이트 신타제의 발현에 의한 싱크 관련 활성의 촉진 방법.
  76. 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제의 발현에 의한 세포 또는 조직 성장의 촉진 방법.
  77. 트레할로스-6-포스페이트 신타제의 발현에 의한 세포 또는 조직 성장의 억제 방법.
  78. 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제의 발현에 의한 세포 대사의 증가 방법.
  79. 트레할로스-6-포스페이트 신타제의 발현에 의한 저온 감미의 방지 방법.
  80. 세포내 트레할라제의 이용성의 감소에 의한 저온 감미의 방지 방법.
  81. 트레할로스-6-포스페이트의 세포내 이용성의 감소에 의한 추대 (bolting) 방지 방법.
  82. 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제의 발현에 의한 추대 방지 방법.
  83. 트레할로스-6-포스페이트의 세포내 이용성의 증가에 의한 추대 유도 방법.
  84. 트레할로스-6-포스페이트 신타제의 발현에 의한 추대 유도 방법.
  85. 트레할라제의 세포내 이용성의 감소에 의한 추대 유도 방법.
  86. 식물체를 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제를 코딩하기 위한 효소로 형질전환시킴으로써 식물체의 수율을 증가시키는 방법.
  87. 트레할로스-6-포스페이트의 세포내 이용성을 증가시킴으로써 식물체의 수율을 증가시키는 방법.
  88. 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제를 코딩하는 부분에서 돌연변이를 갖는 이성분 효소인 것을 특징으로 하는 트레할로스-6-포스페이트 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  89. 트레할로스-6-포스페이트 신타제를 코딩하는 부분에서 돌연변이를 갖는 이성분 효소인 것을 특징으로 하는 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  90. 제88항 또는 제89항에 있어서, 이성분 유전자가 인간 TPS/TPP인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
  91. 제90항에 있어서, 상기 인간 TPS/TPP가 서열 11에 따른 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
  92. 제91항에 있어서, 서열 10의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
  93. 제88항 또는 제89항에 있어서, 이성분 유전자가 아라비돕시스 탈리아나 TPS/TPP인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
  94. 제93항에 있어서, 인간 TPS/TPP가 서열 40에 따른 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
  95. 제94항에 있어서, 서열 39의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
  96. 제88항 또는 제89항에 있어서, 이성분 유전자가 셀라기넬라 레피도필라 TPS/TPP인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
  97. 제96항에 있어서, 인간 TPS/TPP가 서열 43에 따른 아미노산 서열 또는 그의 돌연변이 단백질을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  98. 제97항에 있어서, 서열 42 또는 서열 44의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
  99. 제88항 또는 제89항에 있어서, 이성분 유전자가 헬리안터스 애누스 TPS/TPP인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
  100. 제99항에 있어서, 인간 TPS/TPP가 서열 25에 따른 아미노산 서열 또는 그의 돌연변이 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
  101. 제100항에 있어서, 서열 24 또는 서열 26 또는 서열 28의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
  102. 제88항 내지 제101항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터.
  103. 제102항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 생물체.
  104. 제103항에 있어서, 아그로박테리움 튜머페신즈인 것을 특징으로 하는 숙주 생물체.
  105. 제103항 또는 제104항에 따른 숙주 생물체에 의하여 형질전환된 세포.
  106. 제105항에 있어서, 식물 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  107. 제106항에 따른 식물 세포로부터 재현된 식물체 또는 식물체 부분.
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