SK148498A3 - Regulating metabolism by modifying the level of trehalose-6-phosphate - Google Patents

Description

Glykolýza bola jedným z prvých biochemických metabolických procesov, popísaných detailne v literatúre. Aj keď všeobecne je tok cukrov v organizme známy a aj keď sú objasnené všetky enzýmy glykolytických ciest, signál, ktorý spôsobuje indukciu metabolizmu stimuláciou glykolýzy nebol zalial rozlúštený. Bolo navrhnutých niekoľko hypotéz, založených na základe znalosti kvasiniek, ale žiadna z nich nebola dokázaná bez všetkých pochybností.

Vplyv na riadenie rozdeľovania cukrov neovplyvňuje priamo 3.en glykolytické bunkové procesy a skladovanie cukrov, ale môže byt použitý na ovplyvnenie sekundárnycľi či odvodených procesov, ako je bunkové delenie, vytváranie biomasy a akumulácia zásobných látok, čo znamená ovplyvnenie rastu a produktivity.

Najmä v prípade rastlín sú vlastnosti, pletív priamo ovplyvnené prítomnosťou cukrov a riadenie rozdeľovania cukrov môže p r · i. n i e s ť o b r o v sk é r o z d i. e 1 y .

Rast, vývoj a výnos rastlín závisí od energie, ktorú môžu takéto rastliny získať z fixácie CO^ počas procesu fotosyntézy.

Fotosyntéza prebieha predovšetkým v listoch a menšej miere v stonke. Ostatné rastlinné orgány, ako sú korene, semená alebo hľuzy, podstatne neprispievajú k fotoasimilačnému procesu. Tieto pletivá sú vo svojom raste a výžive kompletne závislé od fotosynteticky aktívnych orgánov. To potom znamená, že existuje tok produktov odvodených od fotosyntézy (nazývaných všeobecne fotosyntáty) do fotosynteticky inaktívnych častí rastliny. 1 o t o s y n t e t i c:: k y ak t í v n e š a s t i. s ú n a z ý v a n é z d r o j m 1 ( s o u r ses) a s ú popisované ako čistí vývozcovia fotosyntátov.

Predpokladá sa, že ako výkonnosť fotosyntézy, tak aj rozdelení.e cukrov v rastlinách sú pre rastlinu nevyhnutné. Novo sa vyvíjajúce pletivá, ako napr. mladé listy alebo iné častí rastliny, ako sú korene a semená, sú kompletne závislé od f o t o s y n t e t i c; k ý c h z d r o j o v. ľl o ž. n o s ť o v p 1 y v n e n i a d i s t r i b ú c i e e u k r o v by mala obrovský vplyv oa fenotyp rastliny - napríklad na jej výšku, vzdialenosť internodií, velkosť a tvar listov a veľkosť a štruktúru koreňového systému.

Okrem toho má distribúcia fotoasimilačných produktov veľkú dôležitosť pre výnos rastlinnej biomasy a plodov. Príkladom je vývoj pšenice počas posledných storočí. lej lotosyntetieká kapacita sa nezmenila nijako výrazne, ale výnos pšeničných zŕn narástol podstatne. Zvýšil sa pomer zberovej biomasy k celkovej biomase (zberový index). Dôvodom v pozadí je skutočnosť, že sa pôsobením klasí okého š ľachtenia zmenil pomer sínk-source, to znamená pomer zdrojov a pletív využívajúcich tieto zdroje. Napr.

časĽ rastliny, ktorá sa dá zbierať ..... teda semená sa zvýšila.

Mechanizmus, ktorý riadi distribúciu a slnil lačných produktov a potom tvorbu stokov a zdrojov je však neznámy. Predpokladá sa, že je tento mechanizmus lokalizovaný niekde v metabolických cestách cukrov a ich regulácii. Z posledných výskumov vyplýva, že hexokinázy môžu hrať hlavnú úlohu v metabolickej signalizácii a kontrole metabolických tokov. Postulovalo sa množstvo mechanizmov regulujúcich aktivitu hexokináz C Graham et al. (1994), The Plánt G e 11 6 s 761; J a n g and Sheen (1.994), The Plánt Celí 6 s 1665; Rose et al. (1991) Eur. J. Biochem. 199:511.....518; Blazquez et al.

(1999), FCBS 329s51; Koch (1996), Annu. Rev. Plánt Physiol- Plánt Mol. Biol. 47:509; Jaríg e t al. (1997) The Plánt Celí 9:5). Jedna z týchto teórií. hexokinázovej regulácie postulovaných v kvasinkách sa zmieňuje o trehalóze a s ňou súvisiacich monosacharIdoch CΊhevelein and Hohmann (1995), ΊIBS 20:3). Je však ťažké si predstaviť, že by toto bol univerzálny mechanizmus, pretože sa predpokladá, že syntéza trehalózy je obmedzená len na určité druhy.

Zostáva teda stále potreba objasnenia signálu, ktorý môže riadiť modifikáciu vývoja a/alebo zloženia buniek, pletív a •i o r g á n o v i n v :i. v o.

Doterajší stav techniky

Vynález vychádza z možnosti modifikácie metabolizmu in vivo hladinou T -D--P. Pokles intracelulárnej koncentrácie T-6-P stimuluje glykolytickú aktivitu a naopak zvýšenie koncentrácie Ί-6-Ρ inhibuje glykolytickú aktivitu a stimuluje glykolytickú fotosyntézu.

Tieto modifikácie spôsobené zmenami. Ί-6--Ρ sú n a j p r a v d e p o d o b n e j δ i e d ô s 1 e d k om s i g n á 1. n e j f u n k e i. e h e x o k i. n á z, ktorých aktivita, ako bolo ukázané, je pomocou Γ--6-Ρ regulovaná. Zvýšený tok prostredníctvom hexokináz, to znamená zvýšeným množstvom glukózy, z ktorej vzniká glukóza-6-fosfát, inhibuje fotosyntetickú aktivitu v rastlinách. Navyše zvýšený tok cez hexoklnázy nesti.mul.uje len glykolýzu, ale tiež intenzitu delenia buniek.

ľ e ó r i a r e g u 1 á e i e m e t a b o 1. i. zrnu u h 1 í k a t r e h a 1 ó z a - 6 - f o s f á t om

V normálnej rastlinnej bunke prebieha tvorba cukrov počas fotosyntézy, pri. ktorej je C.O3. viazaný a redukovaný na fosforylovarié hexózy so sacharózou ako konečným produktom. Normálne je táto sacharóza transportovaná vonku z buniek do buniek alebo pletív, v ktorých vďaka tomuto prísunu sacharózy môžu využívať cukry ako stavebný materiál, pre ich metabolizmus alebo sú schopné tieto cukry ukladať ako napr. škrob. Z tohoto hľadiska sú rastlinné bunky produkujúce cukry považované za zdroje, zatiaľ čo bunky, na ktorých sa cukry spotrebúvajú, sú nazývané slnkom.

V živočíšnych bunkách a vo väčšine mikrobiálnych buniek fotosyntéza neprebieha a cukry sú získavané z externých zdrojov, buď priamym využitím sacharidov (napr. kvasinky a ďalšie mikroorganizmy) alebo štiepením cukrov (zvieratá). Cukry sú väčšinou transportované vo forme glukózy, ktorá je aktívne transpnrtovaná cez bunkovú membránu.

K prvým krokom metabolickej dráhy glukózy po vstupe do bunky je ...jej fosforylácia na glukóza.....6-fosfát katalyzovaná enzýmom hexokinázou. Už predtým bolo dokázané, že cukry fosforylované hexokinázami CHXK) v rastlinách riadia expresiu génov zúčastňujúcich sa pri fotosyntéze <Jang a Sheen C1994), The Plánt Celí 6, 166b) . Preto sa predpokladá, že IIXK môžu mat dvojitú funkciu a môžu pôsobiť, ako klúčový senzor a prenášač signálu regulácie génovej expresie riadenej cukrami. Táto regulácia najskôr normálne signalizuje bunke, či je dostupný začiatočný P r o d u l< t, t o z r i a m e n á g 1 u k ó z a . P o d o b n ý ú č 1 n o k m ô ž e b y t p o z o r o v a n ý pri zavedení TPS alebo 1 PP, ktoré ovplyvňujú hladinu T—6—P. Navyše bolo ukázané, že hladina T-6-P ovplyvňuje aktivitu hexokináz in i/itro. Zvyšovaním hladiny T.....6 P buka dostane signál, že je nedostatočný príšun cukrov. Λ naopak, znižovanie hladiny Ί-6--Ρ predstavuje signál. nadbytku glukózy vedúci k zníženiu fotosyntézy: signalizuje, že substrát pre glykolýzu a následný prísun energie potrebnej pre rast a delenie buniek je dostupný v dostatočnej miere. Predpokladá sa, že táto signalizácia je spúšťaná zvýšeným tokom cez hexokinázy (J.J. Van Oosten, pr ednáška na Pi jkstJniver sltei t Utrecht, 19.4.1996).

Podľa teórie založenej na možnosti signalizácie v prípade rastlín hladinou v š e 11< y r a s 11 ::L n y v y ž a d o v a 1 i P r í t om n o s ť schop ného vytvárať. a rozkladať r e g u 1 á c; 1 e h e x o k i n á z o v e j t r e ťi a 1 ó z a - 6 - f o s f á t u, la y enzymatického systému í:; i g n á 1 o u m o 1 e l< u 1. u trehalóza -6· fosfátu. Napriek tomu, že je trehalóza prítomná v mnohých druhoch húb, baktérií, kvasiniek, rias a niektorých bezstavovcov, len v prípade veľmi obmedzeného okruhu cievnatých r a s 11. í n l::> o 1. a s y n t é z a t o h o t o c u k r u d o k á z a n á C E1 b e i o ¢1974), A d v . Carboh. Chem. Biochem. 30, 227). Stále: zostáva nejasné, prečo aj napriek zrejmému nedostatku enzýmov syntetizujúcich trehalózu obsahujú všetky rastliny trehalázy, to znamená enzýmy schopné štiepiť trehalózu na dve molekuly glukózy.

Nepriamy dôkaz prítomnosti metabolickej dráhy pre trehalózu e x p e r 1 m e n t o c: h bc:íl získaný o ýalldamycín A, inhibítormi trehalázy, ako je alebo pri transformácii anti-sense trehalázou prezentovaných o tomto dokumente.

Tvorba trehalózy by mohla byt brzdená, ak by Jej medzlprodukt T-6·-P mohol príliš ovplyvniť, metabolická aktivitu. Aby sa mohla trebalóža akumulovať vo vysokých koncentráciách, bez toho, aby bolo ovplyvnené rozdelenie a lokalizácia metabolitov pôsobením trehalóza-6-fosfátu, mal by byť vo veľkej miere exprimovaný dvojdielny enzým TPS/TPP. Takýto enzým by bol svojou genetickou stavbou podobný génu kvasiniek, kde produkt génu TPS'ž obsahuje TPS a ľPP oblasť homológnu s génmi otsA a otsB E. coli (Kaasen et al. (1994), Gene 145, 9). Pri použití takéhoto enzýmu nebude trehalóza6.....fosfát voľne dostupný pre iné bunkové komponenty. Iný príklad takéhoto tripartitného enzýmu uvádza Z e n t e 1 i a a 11 u r r i a g a (Plaň t P h y s i o1. (1.996) , 111 a t) s t r a k t 88), ktorí izolovali zo Selaginella lopidophylla cIJNA s veľkosťou 3, 2 k t) kódu j úcu možnú trehalóza -6 - f os f átsyntázu/f osf atázu . Je možné tiež predpokladať, že konštrukcia skráteného produktu génu TPS-TPP, ktorým by bola zaistená aktivita len TPS, by bola pre syntézu T-6.....F’ rovnako účinná ako otsA gén z E- coli. pr i použití v homológnom systéme.

Podľa našich údajov na molekulovej úrovni sú syntézu trehalózy okrem Selaginella prítomné tiež v Arabidopsis, tabaku, ryži a slnečnici,. Pomocou degenerovaných primárov z a 1 o ž e n ý e h n a k o n z e r v o v a n ý c ti s e k v e n c i á c f i medzi T P S _Ε. «= _o i x a TPSkvaemrx sme boli schopní Identifikovať gény kódujúce možné enzýmy produkujúce trehalóza-6 -fosfát v prípade slnečnice; a tabaku. Pri porovnaní sekvencií bola zistená významná homológia medzi týmito sekvenclami: TPS gény z kvasiniek a E. coli a ESI (expressed sequence tags) sekvenclami z Arabidopsis a ryže (pozri tiež Tab. 8b, v ktorej sú uvedené ESI čísla zistených homológnych EST) .

Nedávno Y08568, popis bol určený gén z Arabidopsis (. GENBANK Acc. No. v SEC) ID NOs 39), ktorý je možné na základe .jeho β

homológie považovať za bipartitný enzým.

Podľa týchto údajov obsahuje väčšina rastlín, v rozpore oo súčasnými názormi, gény kódujúce?: trehalóza-fosfát syntázy, ktoré um o ž ň u j ei s y n t e?: t i z o v a ť T - 6 - í³ . A l< o b o 1 o d o k á z a n é v p r :í. p a d e r a s 11í n exprlmu j úci ch T PS a akumulujúc::! oh trehalózu, rastliny obsahujú špecifické aj nešpecifické fosfatázy schopné defosforylovať T-6-P na trehalózu. Prítomnosť trehalázy vo všetkých rastlinách by mohla zvýšiť účinnosť premeny trehalózy.

Ďalej dráhy cukr C zobrazený f'oli a hexokináz v sme tiež získali údaje t?) úlohe??: 1-6.....P pri regulácii ov v ľudských tkanivách. Určili sme ludský TPS gén v SEO ID IMO·. 10) hoinológny k ÍPS génu z kvasiniek, rastlín. Ďalej sme uviedli údaje o vplyve na aktivitu u d s k ý c: Hi (my š a c:: í1:: h ) t k a n 1. v ej c Hi.

Vy ť vár ani. c: takéhoto s::i.gnálu znižovaním vnútrobunkovej k o n c: e n t r ác i e trehalóza- 6 f o s f á t u p r o s t r e dol c t v om e x p r e s i e e n z ým u TPP (alebo inhibíciou enzýmu IPS) bude signalizovať všetkým bunkovým systémom zvýšenie;: toku uhlíka cez glykolýzu a inhibíciu fotosyntézy. To je názorne ukázané v experimentálnej časti, kde napr·. v Príklade 2 sú popísané transgénne rastliny tabaku s expresiou enzýmu TPP, ktoré majú väčšie listy, viac sa vetvia a majú znížený obsah chlorofylu. Ak Je: však teňte?) silný signál vytváraný pri nedostatočnom množstve;: glukózy, je;: zásoba cukrov r ý c Hi 1 o s p o t r e?: la o v a n á .

V prípade, že tento umelo vytvorený nadbytočný signál pretrváva, bude nakoniec:: zníženie obsahu cukrov limitujúce: pre rast a bunkové delenie, to znamená bunky spotrebujú všetky svoje: zásobné: cukry a budú hladovať. preto sa listy vytvárajú s nízkym obsahom zásobných cukrov. Oproti tomu majú rastliny exprimujúce konštrukt s génom pre: TPS, ktorý zvyšuje: vnútrobunkovej koncentráciu T-6-P, redukovanú veľkosť listov, zatiaľ čo listy seá tmavšie: zelené a obsahu jiá viac: chlorofylu.

ý prípade kvasiniek je: hlavným cieľom glukózou indukovanej

Ί s i g n a 1 i z á c i e p r e p ιί u t i e ni e t a b o 1 i zrnu z ne o g e n e t i c: k é h o / r e s p i r a č n é Ιί o spôsobu na fermentativny spôsob. Tohto Javu sa zúčastňuje niekolko signálnych dr áh (Thevelein a 11ohmann, (1995) TIBS 20» 3). Zistilo sa» že okrem možnej úlohy hexoklnázovej signálnej dráhy je glukózou aktivovaná tiež. dráha RAS -cyk liek ej -AľlP (c AľlP). Aktivácia ras-cAľlP dráhy glukózou vyžaduje fosforyláciu glukózy» ale: nie: jej ďalší metabolizmus. Zalial bolo dokázané, že táto dráha aktivuje trehalázu a 6-los f or f ruk to-2-kinázu (čim stimuluje: g I y k o I. ý z u ), z a 11 a I č o j e 1 r u k t á z a -1, 0 - b 1 s f o s f a t á z a in h i b o v a n á e A M F¹ - d e p e n d e n t n o u f o s f o r y 1 á c i o u p r o t e í n o v (č im h r á n 1 glukoneogenéze). Táto dráha signálnej transdukcie a metabolické zmeny, ktoré môže: vyvolával, môže byt považovaná za jednu z drábi pôsobiacich paralelne s hexokinázovou signálnou dráhou, ktorá, ako bolo ukázané, je ovplyvnená hladinou trehalóza-6.....fosfátu.

Ako je popi s íi n é v našom vynáleze, transgénne rastliny exprimujúce as.....trehalázu sa prejavujú podobne ako rastliny exprimujúce '1 PS gén, majú tmavozelené listy a vyšší výnos. Zdá' sa tiež, že expresia as.....trehalázy v dvojitých konštruktoch zvyšuje:

účinky vyvolané expresiou TPS. Aktivita trehalázy bola dokázaná napr. v prípade rastlín, hmyzu, zvieral, húb a baktérií, ale len v prípade obmedzeného počtu druhov je trehalóza akumulovaná.

Napriek tomu, že je trehaláza prítomná vo väčšine rastlinných druhov, nie je jej úloha v rastlinách doteraz známa. Predpokladá sa, že sa má účastí pri interakcii medzi patogénom a rastlinou a pri obrannej reakcii rastliny. Zo zemiaku sme izolovali gén pre trehalázu a ukázali sme, že inhibícia aktivity trehalázy v pletivách listov a hiúz zemiaku vedie k zvýšeniu výnosu zemiakov. Expresia as-trehalázy špecifickej pre plody v kombinácii s expresiou TPS zmenila podstatne vývoj plodov rajčiaku.

Pódia vynálezu dochádza k akumulácii T-6--P v tých bunkách kde bol obsah vznikajúceho T-6-P vyvolaný vnesením e x p r i m o v a t eIného k onštr uk t u génu k óduj ú eeho trehalóza-fosf át - -syntázu (TPS). Môže byt použitý každý gén pre trehalóza-fosfáty

-syntázu riadený regulačnými prvkami nevyhnutnými pre expresiu DMA v bunkách, buď špecificky alebo konštitutívne, ak je schopný produkovať trehalózafosfát-syntázu a tým T-6-P v uvedených bunkách. V súlade s vynálezom je príklad jedného otvoreného čítacieho rámca kódujúceho TPS-enzým popísaného v SEQ ID NO: 2. Ďalšími príkladmi sú otvorené čítacie rámce prezentované pod

označením	SEO	ľ D	NO: 10, 1.8-23,	41 a 45-53. Je známou
skutočnos	tou.	ako	i ZL u s t r u j ú v y š š i e	; uvedené sekvencie,	že
identický	enzým	môže	b y t k ó d o v a n ý v i a c	ako jednou sekvenciou	DNA,

čo je spôsobené degeneráciou genetického kódu. Otvorený Čítací r ám e c k ó d u j ú c í t r e h a 1 é z a - f o s f á t · s y n t á z u m ô ž e by f p r i s p ô s o b e n ý použitiu kodónu u zvoleného hostiteľa, ale nie je to podmienkou.

I z o 1 o v a n á s e k v e n c i a n u k 1 e o v e j k y s e 1 í n y r e p r e z e n t o v a n á napríklad SEQ ID MO: 2 môže byt použitá aj na identifikáciu génov pre trehalóza f osf át-syntázu v iných organizmoch či ich následnú izoláciu a klonovanie pomocou POP techník a hybridizáciu DNA z iných zdrojov s fragmentom DNA alebo PNA získaným z génu E. coli. Prednostne je takáto sekvencia DNA hybr-idizovariá pri viac alebo menej presných podmienkach (ovplyvnených takými faktormi, ako je teplota, iónová sila hybridizačnéj zmesi). Ci sú presné podmienky pre hybridizáciu potrebné, závisí od povahy hybridizácie, to znamená DNA:DNA, DNA:PNA, PNA:PNA, rovnako ako aj od dĺžky najkratšieho hybr idizujúeeho fragmentu. Odborníci pracujúci v tomto odbore ľahko dokážu stanoviť vhodné podmienky režimu hybridizácie t a k, a by vylúčila možnosť neš e x p r i m o v a t e ľ n é h o g é n u použiť aj ďalšie, v s :i. n ý c:; h z d r o j o v, k t o r é boli izolované TPS gény a súčasne sa P e e i f i c k e j h y br i. d i z á c i e . Na získa n i e pre trehalóza-fosfát-syntázu je možné účasnosťi dostupné, gény pochádzajúce z sa zúčastňujú syntézy trehalózy a to je to popísané v tomto vynáleze. Viac v experimentálnej časti.

podobným spôsobom, ako podrobnosti j e uvedených

Zdroje pre izoláciu tretí a 1 ó z a - f o s f á t - s y n t á z o v e j aktivity zahrnujú rastliny, vynálezu mikroorganizmy (napr. baktérie, kvasinky, huby), zvieratá a podobne. Pre produkciu T-6-P môžu byť podľa využité podobným spôsobom aj izolované sekvencie DNA kódujúce trehalóza-fosfát-syntázovú aktivitu z iných zdrojov. Ako pri klad môžu slúžiť, gény na produkciu T-6--P z kvasiniek, ktoré boli. objavené vo WO 93/17093.

Vynález tiež obsahuje sekvencie nukleových kyselín, ktoré boli získané modifikáciou sekvencie nukleovej kyseliny prezentovanej v SEQ 10 MO: 1 mutáciou jedného alebo viacerých kodónov tak, aby výsledkom boli. zmeny aminokyselín u kodónovaného proteínu. ľlutácia sekvencie aminokyselín bola uskutočňovaná tak dlho, až došlo k úplnému odstráneniu aktivity trehalóza-fosfátsyntázy.

Podlá d'alčej časti vynálezu môže byt treba lóža-6-f osf á t v bunke premenený na trehalózu pomocou génov pre trehalóza-fosfát -fosfatázu riadenými regulačnými prvkami nevyhnutnými pre expresiu DMA v bunkách. Preferovaným otvoreným čítacím rámcom je podlá vynálezu rámec kódujúci enzým TPP prezentovaný v SEQ 10 MO: 4 (Kaasen et al. C1994) Gene, 14b, 9). Je dobre známa skutočnosť, že identický enzým kóduje viac ako .jedna sekvericia ONA, čo je spôsobené degeneráciou genetického kódu. Otvorený čítací rámec k ó d u j ú c i t r e h a 1 ó z a - f o s f á t - f n s f a t á z u m ô že b y ť p r i. s p ô s o b e n ý použitiu kodónu u zvoleného hostiteľa, ale nie je to podmienkou.

Izolovaná sekvenci a nukleove j kyseliny repr ezentovaná v SEQ

i. d e n t i f i k á e i u gén o v p r e mikroorganizmoch ti ich

NO: 3 môže byt použitá na t r e h a 1 ó z a.....f o s f á t -· f n s f a t á z u v 1. n ý c h následnú izoláciu a klonovanie pomocnú PCR techník a hybridizáciu ONA z iných zdrojov s fragmentom DNA alebo RNA získaným z génu coli. Prednostne je takáto sekvenčia ONA hybridizovaná pri viac alebo menej presných podmienkach (ovplyvnených takými faktormi, ako je teplota, iónová sila hybridizačnej zmesi). Ci sú presné podmienky pre hybridizáciu potrebné, závisí. od povahy hybridizácie, to znamená DNA:DNA, ONA:RNA, RNA·.RNA, rovnako ako aj od dĺžky najkratšieho hybridizujúceho fragmentu. Podmienky režimu hybridizácie musia byt dostatočne striktné, aby boli Izolované TPS gény čí súčasne sa vylúčila možnosť nešpecifickej hybridizácie. Ma získanie exprimovatelného génu pre

ΙΌ trehalóza-fosfátfosfatázu môžu byť použité aj ďalšie dostupné gény, ktoré sa zúčastňujú syntézy trehalózy, ktoré pochádzajú z iných zdrojov a to podobným spôsobom ako v tomto vynáleze. Viac p o d r o b n o s t í j e u v e (d e n ý c h v ex p e r~ im e: n t ?! 1 n e j é a s t i .

Zdroje zahrnujú rastliny, sekvencie pre izoláciu m i. k r o o r g a n 1 zmy t r e li a 1 ó z a - f o s f á t -( n a p r . b a k t é r i e z iných zdrojov.

zvieratá a podobne. Použiť je DNA kódujúc e t r e h a 1. é z a - f o s f á t f o s f a t á z o v e... , kvasinky, tiež možné fosfatázovú aktivity huby), izolované aktivitu

Vynález tiež obsahuje sekvencie nukleových kyselín, ktoré boli získané modifikáciou sekvencie nukleovej kyseliny prezentovanej v SEQ ID NO; 3 mutáciou jedného alebo viacerých kodónov tak, aby výsledkom boli zmeny aminokyselín u kodónovaného proteínu. Mutácia sekvencie aminokyselín bola uskutočňovaná tak dlho, až došlo k úplnému odstráneniu aktivity trehalóza-f osf át-~ fosfatázy.

Ďalšími enzýmami s TRS a '1PP aktivitou sú tzv. bipartltné enzýmy. Je možné predpokladať, že časť sekvencie, ktorá špecificky kóduje len jednu z týchto dvoch aktivít, môže byt separovaná z časti bipartitného enzýmu kódujúceho aj druhú časť. Jedným zo spôsobov separácie aktivít je vloženie mutácie do s e k v e n c 1 e k ó d u j ú c e.. i ak t i v 11 u, ktorá n:i.e je mutáciou je potom zasiahnutý exprimovaný proteín poškodený alebo nie je aktívny a plní sa zvyšná funkcia. To ...je možné uskutočniť v p r í p a d e s e k v e n e i 1 k ó d u ...j ú e i e h a k o T P S, t a k a ...j T P P a k t i v i t u . T a k t o získané kódujúce: sekvencie môžu byť použité pre tvorbu nového chimerického otvoreného čítacieho rámca schopného exprimovať enzýmy s TPS alebo TPP aktivitou.

Podlá ďalšej časti vynálezu môžu byť rastliny geneticky pozmenené tak, aby produkovali a akumulovali vyššie: uvedené enzýmy v určitých častiach rastliny. Preferovaná ...je táto expresia enzýmov v listoch a zásobných orgánoch rastlín. Za mimoriadne: vhodné časti rastlín sú považované zemiakové hluzy. Promótor, pomocou ktorého je selektívne dosiahnutá expresia enzýmu TPS v mikrohľúzkaeh a hľuzách zemiaku, je možné získal z oblasti proti smeru transkripcie (upstream) otvoreného čítacieho rámca patati.nového génu zo zemiaku.

Ďalším vhodným promótorom pre špecifická expresiu je plastocyanínový promótor, ktorý je špecifický pre fotoasimilujúcu časť. rastlín. Predpokladá sa tiež, že špecifická expresia v jednotlivých častiach rastlín môže pozitívne pôsobiť na rast rastlín a reprodukciu alebo ekonomické využitie týchto rastlín. Z tohoto hľadiska sú užitočné nasledujúce promótory: promótor E8 CEP 0 409 629) a promótor 2A11 C vari Haaren a Houck C1993), Plánt 1*1 o 1. B i o1. 221, 625 ), k t o r é s ú š p e c i f i c k é p r e p 1 o d y ; kruciferínový promótor, napínový promótor a ACP promótor, ktoré sú špecifické pre semená; PAL promótor špecifický pre kvety;

P r o m ó tor; cha1k ón -1zomerázový

SSI.J promótor promótor, ktoré sú špeeifické pre

..istý;

a feredoxínový T o h P h 7 promótor špecifický pre kor e ne. Rol C promótor špeci fický pre floém a 111402 promótor C En ju to e t al. <1999), Plánt Celí 7, 517) a PCNA promótor z ryže (Kosugi et al. C1995) Plánt 1. 7, 977), ktoré sú špeeifické pre meristémové pletivá. Ďalšou možnosťou pri využití tohoto vynálezu je aplikácia indukovatelných promótorov. Sú známe promótory indukované patogénni!, stresom, chemickými. alebo svetelnými C svetlo/tma) podnetmi. Je možné predpokladať, že pre indukciu špecifických prejavov, napr. pučaní, vybiehaní, tvorbe semien, ukladaní do zásobných pletív, je výhodné použiť na Indukciu aktivity génov, ktoré sú predmetom vynálezu, vonkajšie podnety. Tento prístup umožňuje normálny vývoj rastlín a výhodnú riadenú indukciu požadovaného javu. Promótory, ktoré pre použitie v takomto systéme, patogénmi popísané v DE 4446342 CPRP-l indukovaný hubami a auxínom), WO 96/28561 CPRP-l indukovaný hubami), EP 0 586 612 C indukovaný nematódami), EP 0 712 273 C indukovaný nematódami), WO 96/12814 C Indukovaný chladom), EP 0 494 724 C indukovaný su určené sú promótory indukovateľné tetracyklínom), E P 0 619 844 C indukovaný etylénom), E P 0 337 532 C Indukovaný kyselinou salicylovou), WO 95/24491 C indukovaný tiamínom) a WO 92/19724 C indukovaný svetlom). Ďalšie chemicky índukovateľné promótory sú popísané v EP Cl 674 608, EP 687 338, EP 455 667 a v US 5,364, 780. Podľa ďalšej realizácie tohoto vynálezu, sú bunky transformované konštruktmi, ktoré inhibujú endogénne exprimované TPS alebo TPP. Inhibícia nežiadúcej endogénnej enzýmovej aktivity môže byt dosiahnutá niekoľkými spôsobmi, ktorých výber nie je pre vynález rozhodujúci. Jednou z met ó d í n ti i b í c: i e g é n o v e j e x p r e s i. e .j e t z v . '' a n t i s e ose s t r a t é g i a . Pri tejto metóde je exprimovaná sekvencia DNA, ktorá produkuje RNA, ktorá je aspoň čiastočne komplementárna s RNA kódujúcou enzýmevú aktivitu, ktorá má byt inhihovaná. Prednostne sú používané homológne anti-sense gény, pretože sú účinnejšie ako gény heterolégne. Ďalšou alternatívnou metódou blokovania syntézy nežiadúcej enzýmovej aktivity je vnesenie ďalšej kópie endogénneho génu prítomného v hostiteľskej rastline do jej genómu. Často je pozorované, že takáto ďalšia kópia génu zoslabuje endogénny gén: tento efekt býva v literatúre označovaný ako kosupresný efekt alebo kosupresia. Podrobnosti o postupe zvyšovania dostupnosti substrátu sú uvedené v Príkladoch WO 36/81446 zahrnutom tu citáciou. Hostiteľskými bunkami môžu byt akékoľvek bunky, kde: je možné modifikovať. signalizáciu hexokinázaml. prostredníctvom zmien hladiny T-6.....P. Podľa tejto teórie sú teda všetky eukaryotieké bunky predmetom tohoto vynálezu. Z ekonomického hľadiska sú pre vynález najvhodnejšie bunky, ktoré sú dohre využiteľné pre produkciu metabolických látok. Medzi tieto organizmy okrem iného patria rastliny, zvieratá, kvasinky, huby. Možná je; však tiež expresia v špecializovaných bunkách C pankreatické het a--bunky a tukové bunky). K preferovaným hostiteľským rastlinám zo Spermatophytae patri Angioppermap, predovšetkým Dicotyldenoeae, ktorá zahrnuje okrem ďalších Solanaceae ako reprezentatívnu čeľaď, a ďalej Moriocotyledorusat?, ktorá zahrnuje okrem ďalších reprezentatívnu čeľaď Gramineats. Ako je definované v tomto vynáleze, vhodné hostiteľské rastliny (rovnako tak, ako ich časti a bunky) a ich potomstvo, obsahujú modifikovanú hladinu T-6-P, vyvolanú napr. aplikáciou rekombinantných DNA techník vedúcich k zvýšenej produkcii TPS a TPP v požadovaných rastlinách či ich orgánoch. K rastlinám podľa vynálezu patria rastliny s kvetmi, ako je karfiol (Brassiea oleracea), ar tičoka (Cynara scolymus), rezané kvety, ako je karafiát (Diankhus caryophyllus!, ruža (/?<zsa .spp.),

Cbrysanklícnum, petunia, Alstramerla, Gerbera, Gladiolus, ľalia (Ĺllíum spp.!, chmeľ (Humulus lupulus!, brokolica; črepníkové rastliny ako je Rhododendron, A^alia, Dahlia, Bcgionia, Fuchsia, Geranium atď.; ovocie, ako je jabloň (.Galov, napr. domesticus), banánovník (Gusa, napr. Acuminaka!, marhuľa (Prunus armeniacal oliva (Oliva sakiva!, ananás C Ananas comosus'), kokosová palma (Cocos riucifcra!, mango (Oangibera indica!, kiwi, avokádo CPersea amerlcana), bobuloviny (ako napr. ríbezle, Ribes, napr. rubrum).

uhorka (Cucumis, napr. v i n i Per a ), c: í t r ó n o v n í k horčica (Sínapis alba a čerešňa C ako napr. Prunus, napr. avium!, sativus!, vinič hroznorodý (Vi tis, napr (Cistrus l.imon!, melón (Cucumis melo!, nigra), or echy C ako je vlašský orech, Juplans, napr. podzemnica ole jná, Arachís hypoqeae!, pomaranšovník (Citrus, napr. maxima!, broskyňa (Prunus, napr. persíca!, hruška (Pyra, napr. Communis!, paprika (Solanum, napr. Capsicuní!, slivka (Prunus, napr. domcskica!, jahoda (Praparia, napr. moschata!, cscuicnkum! ; listové plodiny, ako je kapusta (ako Brassiea oleracea).

Brassiea rcpia;

r a j š i. a k (L. ycopersi con, n a p r lucerna endívia

C Gedicapo sa kiva! , (Cicboreum, napr. endívia), pór (Allium porrum), šalát (Lactuca sakiva!, špenát (Spínacia oleracea!.

t a b a k C Nicok iana tabacurn!, trávy, ako je Festuca, Poa, lúčne trávy (ako Lolium mulikiforum a Arrenatherum spp.!, okrasné trávniky, trsnaté trávy, chaluhy, čakanka (Cichorium íntybus!, čajovník (Thea sinensis!, zeler, petržel ďa1š1e k or enie; k o r - eňové ar u nd inacca !, r epa (Bck a ( Pe kr ose 1 i num cr ispum!, p a ž í t; k ti

Hodiny, ako je vulparis!, mrkva

Ganibok esculcnka, žeň-šeň (Panax gínseng), maranta C Daucus kvak a ci (Garanka caroka!, (Brassuca r apa!, reďkvička (Rapbanus sativus!, Oioscorca esculcnka, sladké zemiaky (Ipomoea batakas!, taro; semenné plodiny, ako je fazuľa (Pbascolus vulgaris), hrach (Pisum sakivum!, sója (Glycin max!, pšenica (Triticum acstivum!, jačmeň C Hordeum vulgare!, kukurica (Zca rnays!, ryža (Gry^a sakiva!, bôb (Vicia raba!, bavlník (Gossypium spp.!, kávovník (Coffea arabica a C. cancpbora!·, hluznaté rastliny, ako je kaleráb (Brassiea olcracead, zemiaky (Solanum kuberosum! ; cibuloviriy, ako je cibuľa (Allium cepa!.

cibula šarlotka, tulipán (Tulipa spp.), narcis (Narcissus spp.), cesnak (Alliuni sativuní); stonkové plodiny, ako je korkový dub, cukrová trstina (.Saccharum spp.), sisal (Sisal spp.), ľan (Linum vulgare), juta; stromy, ako je kaučukovník, dub (Ouercus spp.), breza (Betula spp.), jelša (Alnus spp.), javor (Acer spp.), brest (Ulmus spp.), palmy, paprade, brečtan a podobne.

Transformácia kvasiniek, húb alebo živočíšnych buniek sa uskutočňu je pomocou bežných trans formačných techník pri použití, všeobecne známych vektorových systémov ako napríklad pBluescript, pUC a vírusových vektorových systémov, ako sú RSV a SV40.

Spôsob vnesenia expresie schopných génov trchalóžafosfát.....

s y n t á z y, t r e ha 1 ó z a f o s f á t f o s f a t á z y a 1 e b o aký c f i k o 1 v e k d' a 1 š í c f t s e n s e alebo antisense génov do buniek transformovane,i rastliny nie je rdzhodujúci., ak sú gény exprimované v uvedených rastlinných bunkách.

Aj keď niektoré konkrétne formy vynálezu nemôžu byt uskutočniteľné v súčasnosti, napr. pretože niektoré rastlinné druhy vzdorujú genetickým transformáciám, je prax vynálezu v prípade takýchto rastlinných druhov len otázkou času a nie o t á z k o u p r i. n c í p u, p r e t o ž e p o d d a j n o s ť g e n e t i c k ý m t r a n s f o r m á e i á m ako sú tieto nie je dôležitá vo vzťahu k zásadným konkrétnym formám vynálezu.

Transformácia rastlinných druhov je dnes bežná pre veľké m n o ž s t v o r a s 11 i. n n ý c h d r u h o v za h r n u j ú c i. c t ί a k o j e d n o k ľ í č n o 1 i s t é, tak aj dvojklíčnolisté rastliny. V zásade môže byť použitý akýkoľvek spôsob transformácie na vnesenie chimerickej DNA podľa vynálezu do vhodne.j bunky predka. Spôsob môže byť vybraný z metód používajúcich vápnik a polyetylénglykol pre protoplasty (Krens et al.., 1982, Náture 296, 72; Negrutiu et al., 1987, Plánt Mol.

B i. o1. 8, 363 ) , e 1 e k t r o p or ácie p r o t o p 1 a s t o v C S h i. 11 i t o e t a 1.,

1985, Bio/Technol. 3, 1099), inikroin jekcie do rastlinného materiálu (Crossuay et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202), bombardovania rôznych rastlinných pletív časticami potiahnutými

DNA alebo DMA C par ticle bombardment) (Klein et al., 1987, Náture 527, 70), infekcie neintegrujúcimi sa vírusmi, prenos génov sprostredkovaný Agrobacteríum tumefaciens infiltráciou dospelých rastlín alebo transformáciou zrelého pelu či tnikrospór (EP 0 301 316) a pod. Uprednostňovaná metóda podľa vynálezu zahrnuje prenos DNA pomocou Agrobacterium. Predovšetkým sa preferuje použitie takzvanej technológie binárneho vektora (binary vector teehnology), ako je popísaná v EP A 120 516 a U.S. Patent

4, 940, 838.

Aj keď sú jednoklíčnolisté rastliny pokladané za n e p o d d a j n e j š i e g e n e t i c k ým t r a o s f o r m á c i á m, s ú p r í s t u p n é transformáciám a plodné transgénne rastliny môžu byt generované z transformovaných buniek alebo embryí alebo inej rastlinnej hmoty. V súčasnosti je v prípade jednoklíčnoli.stých rastlín uprednostňovaná metóda mlk ropr oj ek tllového bonibar dovaril a embryí, explantátov alebo suspenzií buniek a priame vnesenie DNA (direct DNA uptake) alebo elektroporáeia do pletiva (Sbimamoto et al.,

1989, Náture 338, 274-276). Transgénne rastliny kukurice boli získané vnesením Streptcmyces hygroscopicus bar génu, ktorý k óduje fosfinotricínacetyltransferázy (enzým, k torý inak tivuje herbicíd f osf inotrieíri) do embryogénnych buniek suspenzne j kultúry kukurice mikroprojektilovým bombar dovaním (Gordon-Kamm,

1990, Plánt Celí 2, 603) . Boli. popísané vnesenia genetického materiálu do aleurónovýeh protoplastov ďalších jednoklíčnolistýct i plodín, ako je pšenica a jačmeň (Lee, 1989, Plánt ľloľl.. Biol. 13, 21). Rastliny pšenice sa regenerovali z embryogénnej suspenznej kultúry výberom embryogénnych kalusov pre založenie embryogénnych suspenzných kultúr (Vasil, 1990, Bio/Technol. 8, 429). Kombinácia s transformačnými systémami pre tieto plodiny umožňuje aplikáciu P r e d kla d a n é h o vy n á 1 e z u n a j e d n o k 1. í. č n o 11 s t é r a s 11 i. n y.

Jednoklíčnolisté· rastliny vrátane komerčne .dôležitých plodín, ako je ryža a· kukurica, sú tiež prístupné prenosu DNA pomocou kmeňov Agrobacteríum (vide W0 94/00977; EP 0 159 4-18 B1+_; Gould et al.1991, Plánt Physlol. 95, 426-434).

Pre získanie transgénnych rastlín schopných konštitutívnej expresie viac ako jedného chimér iokého génu je dostupných mnoho a 11 e r n a t í v, v r á t a n e ·.

A. Použitia DNA napr. T-DNA na binárnom plazmide s množstvom modifikovaných génov fyzicky spojených s druhým selektovatelným značkovacím génom (selectable merker gen). Výhodou tejto metódy je tá skutočnosť, že sú chimerické gény fyzicky spojené a teda migrujú ako jeden Nendelovský lokus.

B. C u d z o o p e J- e n i e t r a n s g é n n y c h r a s 11 í. n, z k t o r ý e h k a 2 d á b o 1 a schopná expresie jedného alebo viacerých chimerických génov prednostne spojených so selektovatelným markerovým génom pelom z transgénnych rastlín, ktoré obsahovali jeden alebo viac chimerických génov spojených s iným selektovatelným markerom. Potom je možné selektovať semená, získané týmto krížením, na základe prítomnosti týchto dvoch selektovatelných markerov alebo na základe prítomnosti samotných) chimerických génov. Rastliny získané z vyselektovaných semien môžu byt potom použité pre ďalšie kríženie. Chimerické gény nie sú zvyčajne na jedinom lokuse a gény sa môžu z tohoto dôvodu segregovat ako nezávislé jednotky.

C- Použitia mnohých rôznych chimerických molekúl. DMA, napr. plazmidov, ktorých každý obsahuje jeden alebo viac chimerických génov a selektovatelný marker. Ak je kotransformácia vysoká, je selekcia len na základe jedného z markerov dostatočná. V ostatných prípadoch je preferovaná selekcia na základe viac ako j e d n é h o m a r k e r - a .

D. Následnej transformácie transgénnych rastlín už obsahujúcich prvý, druhý atď. chimerické gény s novou chimerickou DNA, ktorú môže obsahovať selektovatelný markerový gén. Tak ako v prípade metódy B nie sú chimerické gény v zásade na jedinom lokuse a môžu sa teda segregovat ako nezávislé entity.

E . Kom b i n á c i e vy š δ i. e u v e d e n ý c h s t r a t é g i í .

Konkrétna stratégia môže závisieť od niekoľkých predpokladov, ktoré môžu byt Jednoducho stanovené, ako súi cieľ rodičovských línií (prianie pestovanie, použitie v Šľachtiteľskom programe, použitie pre ciele produkcie hybridov), nie sú však kritické z hladiska popísaného vynálezu.

Je známe, že prakticky všetky rastliny môžu byť regenerované z bunkových suspenzií alebo tkanív. Spôsoby regenerácie sa líšia pre .jednotlivé rastliny. Všeobecne, najprv sú pripravené suspenzie transformovaných protoplastov alebo Petriho misky obsahujúce transformovaného explantáty. Výhonky môžu byť indukované priamo alebo nepriamo od kalusu cez orgaoogenézu alebo embryogenézu a následne môžu zakoreniť. llkrem selektovateľnébo mar kôr a budú všeobecne r asti toné bunky obsahovať rôzne aminokyseliny a rastlinné hormóny, ako sú auxín a cytoxíny. J o tiež výhodné pridať do média glutámovú kyseline a prnl.ín, na J má l< t a kým r a s 11. i nám, ako Je k u k u r 1 c a a I u e e r n a . U e i o o o s ť r e g e n e r á c i e bude závisieť od média, genotypu a histórie kultúry, ôk sú tieto tri premenné pod kontrolou, in regenerácia obvykle r e p r o d u k o vate 1 n á a o p a k o v a t e 1 n á . ľ o r; t a b i i n om v o e s e 11í s e k v e n c 1 o tr ansfOrmujúceho génu do transgénnej rastli ny môžu byť takto z í s k a o č v L. a s t o o s k i p r e o e s e o é d o ď a I š í c h r a s L i í n s e x u á 1. o y m krížením. V závislosti od rastlinného d r u hu, ktorý sa bude kríži ť, môže byť použitá akákoľvek metóda z množstva metód P o u ž í v a n ý c b v č ť a n d a r d n o m č ľ a c: h1 1 ť e 1 s t v e .

Vhodné sekvencie DNÔ, ktoré kontr olu.jú expresiu r astlinných expr imovateIných génov (vrátane mar ker ových génov), ako sú t r a n s k r i p č n é i n i o i a č o é o b 1 a s t i e o h a o c e r y (z o s 11 ň o v a č e), n e t r a n s k r i b o v a n é v e d ú c: e s e k v e o c i e (1. e a d e r ) a p o d ., môžu t) y ť získané z ktoréhokoívek génu, ktorý sa exprimuje v rastlinnej bunke. Je možné použiť tiež hybridné pr omótor y kombinujúce funkčné časti rôznych promótorov alebo od nich odvodené syntetické ekvivalenty. Okrem konštitutívnych promótorov môžu byť na kontrolu expresie expresie schopných génov podlá vynálezu P o u ž i t é i r i d u k o v a t e 1 n é p r o m ó t o r y a 1. e b o p r o m ó t o r y, k t o r ý e h e x p r e s 1 a je d .nak regulovaná (napr. vývojovo alebo v závislosti od typu buniek špecificky) . ľr 1 selekcii alebo hľadaní hr ansformovaných buniek sa dáva prednesť zahrnul i u mar ker ovýcb g dnou spojených s rastlinným expr :i movale ľným génom podľa vynálezu Lak, aby bol prenesený do rastlinnej bunky. Výber vhodného mar kerového génu pri transformácii rastlín nie je problémom pre bežne erudovaní j m pracovníka, bežne používané mar ker ové gény sú napríklad gény pre n e nm y c í n f o s 1 o t r a n s f e r á z u s p Ô s o b u ...j ú c:: e n d o 1. n o s ť v o é i k a n am y e í n u <1.1’ · 13 131 b 23), gény pre glu Latín.....S- transfer ázu z potkanej pečene spôsobujúce odolnosť voči herbicídom odvodených od glutatiónu ( E; ľ - A 25b 223), g é n y p r e g 1 u t a m í n s y nt ázu s p ô s o b u j ú e e p r i overexpresli odolnosť voči Inlilbí Lor om gluLamínsynl.ázy, ako je n a p r . f o s f i. 11 o t r 1. c í. n C W L.) 3 7 / ll5327), g é 11 p r e a e e t y 11 r a n s f e r á z u z o

Str&ptomyc&s ι/iridochromogenes udeľujúce odolnosť voči látke fnsfInotricínu (lľ A 27b 9b7), gén kódujúci b.....i :no l.š i Ici.ma L 3

.....fnof á tsyn Lázu (t ľS ľ S) u d e ľu júe1 to I er a nc1 u voč1 N.....f osf o nome ty J.....

glycínu gén h/iľ spôsobujúci odolnosť voči látke 8 i a Iapbns (napr.

Wl I 91/1121171) a pod.. Konkrétny výber mar kera nie je kritický, ka je funkčný (pripadne selektívny) v komblnác i.1 s vybr aným i r a s L I i n n ý m i I.. u n k a m 1..

ľlarkerový gén a sledovaný gén nemusia b y ľ. spojené,

P r e L n že k o t r a n s f^: o r m á e i a ne s p o.. j e n ý c:: h g é n o v ( l.l. S. Pate n t Ί, 399, 21. b ) je tiež účinný proces v rastlinnej transformácii.

llprednos Lčovaným materiá l om pre Lr ansf ormái ; i.u ( predovšetkým dvi i jl< I fčno I i stýeln pl.od í.n) sú l istové disky, ktoré sa môžu lahko tr ansfor movať a ma jú dobré regeneratívne schopnosti (I lorsob et al., 1985, Science 227, 1229).

Špecifické použitie vynálezu sa predpokladá v nasledujúcich oblastiach: ako je možné vidieť na príkladoch, vplyv expresie 1 PP (čo spôsobí zníženie vnútrobunkovej koncentrácie T--6--P) sa prejavuje zvýšenou veľkosťou listov, zvýšeným vetvením vedúcim l< zväčšeniu počtu listov, zvýšením celkovej biomasy listov, vybielením zrelých listov, vznikom viacerých malých kvetov a sterilitou. tieto efekty sú predovšetkým použiteľné v nasi.edu iúei rli prípadoch: zväčšenie li stove j plochy (a zvýšení e poštu listov) je ekonomicky dôleži té v prípade listových rasti ín, ako sú napr . špenát, šalát, lucerna, pór, silážna kukurica, ďalej v prípade tr ávnikov a záhr adných rastlín pr i. kontrolovanom pokrytí a regulácii. buriny, ďalej v prípade plodín, kde sú listy používané ako produkt, ako je napr. tabak, šaj, konope a ruže <parfumy!), ďalej na zakrytie plodín podobných kelu (napr. karf iol.) .

Ďalšou výhodnou skutočnosťou, že sú tieto listy stimulované vo svojej metabolickej aktivite, je 1ch tendencia použil' všetky svo je vnú tr obunkové zdroje, čo znamená, že majú nízky obsah škrobu, ý prípade rasti In, ktor é sú pestované pre konzumáciu, je v s v e 11 e d o e š n ý c: h t r e n d o v u p r e d n o s t ň u j ú c; i.. t:; h n í z k o k a 1 o r i e: k é potraviny, zníženie obsahu škrobu výhodou. Takéto zníženie obsahu škrobu má tiež vplyv na citu t a štruktúru listov. Zvýšenie; r ovnováhy medzi pr o telnmi a cukr ami v prospech proteínov C aké môže by t dosiahnu té nxpr oslou 11 ’l ’) je velmi. dôležité v prípade;

I i s t n a t ý c 11 p 1 o d í n, a k o i e s; i.. 1. á ž n a k u k u r i. e a .

Zvýšenie vetvenia, ktoré je spr evádzartš tendenciou mat ctonku s väčším priemerom, môže by t výhodné v prIpade plodín, kde je stonka zodpovedná za vznik ekonomicky atraktívneho produktu.

I’r l.k.l adotn v te jto kategórii sú všetky stromy na zvýšenú produkciu dreva, š o je základným materiálom pri: výrobu papieru, ďalej je to napr. konope, ďalej plodiny, ako je bambus alebo cukrová trstina, kaušukovník, korkový dub, ďale j na pr evenciu po l'ahúvani.a plodín alebo časti, plodín, ako je obilie, kukurica, strukoviny a jahody.

Zníženie lotosyn tetiek ej aktivity ··- ľlene j farebné listy sú preférováné v prípade plodín, ako je čakana a asparágus. Tiež v prípade rezaných kvetov môže byt bledoutie korunných lístkov žiadané, napr. v prípade Alstrom&ria.

Globálnym efektom je zvýšenie biotnasy vyplývajúce; zo zvýšenej metabolickej aktivity. To znamená, že je folomasa zložená z tne tabollzovanýoh látok, ako sú proteíny a tuky. Preto je: teda zvýšená rovnováha proteínov voči sacharidom v zrelých listoch, čo je výhodné v prípade takých plodín, ako je silážna kukurica alebo všetko krmivo, ktoré sa silážuje. Podobné zvýšeni e rovnováhy proteínov a sacharidov môže byt navodené v prípade ovocia, blúz a o s t a t n ý c I ί j e d 1 ý c h č a s t í r a s 11 í n.

Okrem rastlinnej ríše môže byt zvýšený metabolizmus užitočný pre produkciu proteínov v kultúrach mikroorganizmov alebo eukaryotických buniek. Produkcia ako endogénnych, tak aj heterológnych proteínov bude zvýšená, čo znamená, že produkcia heterológnych proteínov v kultúrach kvasiniek alebo iných ...jednobunkových organizmov môže byt týmto spôsobom zvýšená. 0 prípade kvasinky by to viedlo k účinnejšej f er menláei i, výsledkom čotm by bol vyšší výťažok a lkoholu, čo je samozrejme pr eferované v pivovarníctve, výrobe liehu a pod.

V prípade zvierat alebo ľudí s<i predpokladá, že choroby spôsobené defektným metabolizmom môžu byľ. prekonané stabilnou expresiou IPP alebo 1 PS v zaši ohnutých tkanivách, ú prípade ľudských buniek je zvýšená glukózy spotreba v pr ípade mnohých tumornvých buniek závislé do veľkej miery nd overexpresle hexoklnázy (Pempel e t al., .11)()(.i, I I .US Let t. 38b, 233). Predpokladá sa, že tok glukózy do metabolizmu nádorových buniek môže byť ovplyvnený expr esi ou enzýmov syntetizujúcich trehalózu.....6-fosfát. Ukázalo sa tiež, že aktivácia hexoklnázy je zoši Iňovaná eôľlľ/PKÔ (dráhou pr oteínkinázy ô). Preto môže 1. n a k t i v á c i a t e j t o s i g n á 1 n e j d r á h y m a t v p 1. y v na d o s 1 a H n u t e 1 n o s t glukózy a tým na proliferáciu neopláziou. Enzýmové aktivity v cicavčích bunkách schopné syntetizovať trehalózu-6-fosfát a tretia lóžu a degradovať trehalózu boli už dokázané napr. v prípade buniek obličkovej kôry králikov (Saoker, 1368, Proc. Natl. Aead. S o. L. I.JÔS 60, 1007).

Ďalší príklad môže byť nájdený v prípade defektov v sekréeil. inzulínu pankreatickými beta bunkami, v ktorých ...je produkcia g 1 u k ó y. a - 6 -- f o í; f á t u k a t a 1. y z o v a n á h e x o k í n á z o u r · o z h o d u j ú e o u r e a k e i. o u, ktorá spája zvýšenie hladiny extracelulárnej glukózy so sekréciou

I.

i nzulínu Cllfrat e t al., I'.lf)d, ľ I BS 19, 995). Zvýšenie hexoklnázovej aktivily spôsobené znížením vnúl.r obunkove j ľ-G.....P bude stimulovať, produkciu inzulínu v prípade buniek, ktoré sú n e d n s t a t n š n é v s e k r é (ľ: . i.. i. J n z u 1. í n u .

I lež v prípade transgéririych zvierat by zvýšená rovno v á ba proteínov voši sacharidom mohla byt výhodná. Obidve vlastnosti.......

zvýšený metabolizmus a zvýšená produkcia proteínov - sú veľmi dôležité v poľnohospodár štve, v prírastok mäsa šo najrýchlejší, zvierat produku júcich mäso, ako oviec, moriek, kôz, rýb dobytka, slimákov a pod. budú mat' mäso ktorom u zvierat musí byt Transformácia enzýmu TPP do n a p r . d o kure n i ec, r o ž n é h o I ί oni á r o v, k r a b o v, g a r n á t o v „ , povedie k zvieratám, ktoré porastú rýchlejšie a s väčším obsahom bielkovín.

Rovnakým spôsobum povedie tento zvýšený metabolizmus k zvýšenému spaľovaniu sacharidov a teda k prevencii obezity.

Zníženie koncentrácie 3.....b.....P má za následok, pre rastliny špecifickejšie, zvýšenie počtu kvetov (aj keď tento proces zrejme nevedie k vzniku semien). Zvýšený počet kvetov je však žiaduci v prípade rezaných kvetov a črepníkových kvitnúcich rasLlín a tiež v prípade rastlín vhodných pre záhradníctvo.

Ďa l ším vý:; I edki mi tohoto fenoménu kvi.tnutia je sterilita, pretože rastliny neprodukujú semená. Sterilné rastliny sú výhodné P r i. š ľa c 111 e n í I ί y b r 1 d o v .

iným ekonomicky dôležitým aspektom je obmedzenie predčasného dozrievania kultúrnych plodín, ako je hlávkový šalát, eridívla a a k o r e k r e a č n á, t a k a j k ŕ m n a t r á v a . T á t o pretože dovoľuje plodinám rást bez m e t a b o 11 c k ú p r á o u P r í p a d e p 1. o d í n, n a k v i. t n u 11 e a p r o d u k c i. u ako je hlávkový šalát.

komerčné produkty C či. komerčné použitie) nezrelé.

vlastnosť, je výhodná, n u t n o s t i. vy n a k 1 a d a ť s em i. e n. tik r em t o h o v eridívla a tráva, sú

S p e o i f i. c k á ex p r e s i. a

TPP v určitých častiach rastliny (slnku), môže mať ďalšie užitočné následky. Predpokladá sa, že expresla i PP pomocou pr omótor a, ktor ý je ak t ívny v r anom štádiu tvorby napr·. semien, dovolí zvýšený rast vyvíja júcicb sa semien. Podobný efekt by mala expresla 1 PP pod promótorom špecifickým pre kvety. Vyjadrené skrátene: nadmerný rast určitých časti rastlín je možné, ak TPP je expr l inovaná v závislosti od v b o d n ó b o pr omótora. Expresla špecifická pre plody by moli l a vi esť k zvýšenému rastu šupky v pomere k dužine. To by dovolilo zlepšenie ľl úpanl.a ovocia, čo by mohlo b y ľ. vhodné pre automatické P r i em y s 1 o v ú 1 u p a n i. e .

Expresla TPP počas procesu klíčenia semien obsahujúcich ole.....

je obmedzuje jeho degradáciu. Pri procese klíčenia je glyoxaľláto vý cyklus velmi.. aktívny. lá to metabolická dráha premieňa acetyľlCoA cez malá t na sacharózu, ktorá môže byť traosportovaoá a použitá ako zdroj energie počas rastu k..l ľčnycli rastl ín. Kľúčové enzýmy v tomto pr ocese sú malátsyntáza a i zočil.r átlyáza . Expresla obidvoch enzýmov je, ako sa predpokladá, regulovaná I n:xi iki oázovou signalizáciou. Jednou zo známok pre túto reguláciu je to, že ako

2.....deoxy glukóza, tak aj manóza sú f os I or yľl ované hcxuk i oázou a sú schopné previesť svoj signál - zníženie expresie malátsyntázy a lzoci.tr á t ľlyázy - bez toho, aby tmil ďalej metabol izované. Ex prešla TPP v semenách, teda zníženie i ohiblcie hexvkinázy, teda 1. nl i i b 1 e 1. a ma 1 á t s y n t á z y a : i z o c 1.1 r á 11 y á z y, u d r / 1 a v a sl< ľl. a d o v a n i c olejov do semien a zamedzuje klíčeniu.

v y s o k e j e x f» r e s 1 i f a r ti u s p ô s o b en ú

V porovnaní s efektmi. TPP pôsobí zvýšenie T b P spôsobené expresiou 1 PS Iné efekty, ako j c ilustrovaná v Príkladoch realizácie vynálezu. Z týchto príkladov vyplýva, že zvýšenie T -6 -P spôsobuje zakrpatenie alebo zakrpatený rast (najmä pri.

I PS), tvor bu viac zalomených listov, tmavšiu.! zvýšeným obsahom chlorofylu a zvýšený obsah škrobu. Ako je uvedené vyššie, vnesenie trehalázovýcb anti-sense konštruktov tiež stimuluje podobné efekty ako vnesenie T PS. Preto budú aplikácie ukázané alebo naznačené pre TPS rovnakou mierou platné pre anti-sense-tr ehalázu. Navyše, použitie dvojitého konštr u k t u TRS a anti-sense-trehaľLázy zosilňuje účinky j e cl n o 11 i v ý c h k o n š t r u k t o v .

Zakrpatenost je úkaz., ktorý i e záhradných rastlín, medzi ktorými príslovečným príkladom.

vyžadovaný v prípade sú j a po n sk é h o os ale rastlín ako sú

Vytvorenie minikvetov u ruže, amarylis, hortenzia, breza a palma bude mat ekonomické šance. Okrem rastlinnej ríše je zakrpatenost tiež požadovaná u zvierat.

Je tiež možné indukovať predčasne dozrievanie v prípade kultúrnych plodín ako je (dávkový šalát. Io je výhodné, pretože dovoľuje rýchlu produkciu semien. Ideálno by expresia TPS pre tento efekt ma la byt pod kontrolou i. ndukova teľného pr orné L or a.

Redukcia rastu je ďalej vyžadovaná pre priemysel vegetariánskych občerstvení, kde je prodpokI..udaná konzumácia zeleniny vo turmi: malých dávok . Per oščevé rajčiaky

C chór r y tomu to) sú pr ík l adom zeleni ny so zmenšenou veľkostnú úspešné na trhu. Je možné predpokladať, že by tiež ďalšia zelenina, ako ie hlávková kapusta, karfioJ, mrkva, repa a sladké zemiaky a ovocie, ako sú jablká, broskyňa, hrušky, melóny a niektoré tropické ovocie, ako je mango a banány, bo i i úspešné v miniatúrnej veľkosti, na trhu.

Zníženie rastu je požadované v prípade všetkých buniek, ktoré sú škodlivé pre organizmus. Príkladom sú patogény a nádoroví': bunky. Z tohoto posledného hľadiska môže byt videná r e g u. I á c i. a r a s L u zm e n o u h I.. a d i n y ľ.....b.....P . Z v ý š e o i e h I. a d i. n y T - b I ’ zníži rast a metabolizmus nádorového tkaniva. Jedným zo spôsobov ako zvýši, t vnutr obunkovú hladinu I- ž-P je vyradiť gén TPP týchto buniek vnesením špecifickéj rekombinantnej udalosti C event), ktorá spôsobí vnesenie mutácie do endogénneho génu pre ΊPP. Jedným zo spôsobov, ako je možné toto uskutočniť, je vnesenie sekvenci.e: DNA schopnej vniesť mutáciu do endogénneho génu pomocou pre nádorové bunky špecifických internaližujúcich protilátok. Iným spôsobom je cielené bombardovanie mikročasticami s uvedenou DMA. Po tretie-; môžu byt použité pre: nádorové bunky špecifické v í r us 11 v é vek L o r y o b s a 11 u j ú c: e u v e < I e n ú D M A .

I enomén tmavšieho zeleného zafarbenia pozor ovaného v súvislosti so zvýšenou koncentráciou i-b-P je vlastnosť, ktorá je požadovaná pre črepníkové kvitnúce rastliny a, všeobecne povedané, pre druhy v zahradili o t va a pre rekreačné trávy.

Zvýšenie hladiny T-6.....P spôsobí tiež zvýšenie zásobných sacharidov, ako sú škrob a sacharóza, pletivo, v ktorom sú sacharidy skladované,

To potom znamená, že je schopné skladovať viac materiálov. To môže byt ilustrované na Príklade, kde je v rastlinách tvorí zvýšená b!omasa zásobných hľuzy a zhruhnuté korene (ako v prípade repy u k ázané, or g á no v, že sa ako sú zásoba saeharózy) .

Plodiny, kde hy tuto bolo volmi. užitočné, sú zemiaky, cukrové repa, mrkva, čakanka a cukrová trstina.

Ďalším ekonomicky dôležitým efektom v prípade zemiakov je l.( i, že po tr ans formácii, s DNA kódu júcou gén pre TPS (vytvára zvýšenie ľ.....b P) sa zistilo, že zníži I o, dokonca aj p u zbere množstvo rozpustných cukrov sa a s l< I a cl o v a n í i ď ú z p r i n í z k y e i ί teplotách (4 b). Na prevenciu klíčenia by bežne bolo dokonca potrebné skladovanie pri. ešte nižších teplotách, ale vo vedie k extenzívnemu sladnutiu zemiakov. Zníženie množstva redukujúcici i cukrov je otázkou zásadnej dôležitosti pre potravinársky |ir i emysc I, pretože sladké zemiakové hľuzy nie sú vhodné pre ·,. prace vanie z dôvodu vzniku l^vlal 1 I ar dove j reakcie, pri ktorej reagujú vzájomne redukujúce cukry a aminokyseliny, čo vedie k bnednutiu.

Rovnakým spôsobom môže byť dosiahnutá tiež inhibícia aktivity invertázy, transormáciou cukrovej repy polynukleotidmi kódujúcimi. enzým TPS. Inhibícia aktivity invertázy v cukrovej repe po zbere je ekonomicky veimi dôležitá.

Tiež v ovocí a semenách môže byť ukladanie pozmenené.

Výsledkom nie je ].en zvýšená kapacita ukladania, ale aj zmena v zložení ukladaných látok . Plodí ny, kde je zvýšenie výnosu semien mimoriadne dôležité, sú kukurica, ryža, obilie, hrach, repka olejka, slnečnica, sójové bôby a strukoviny. Okrem toho sú zmeny v zložení a množstve ukladaných sacharidov dôležité pre všetky rastliny poskytujúce ovocie. Predovšetkým v prípade ovocia sa zmeny v ukladaných látkach prejaví a v zmenách objemnosti a tuhosti, čo je mimoriadne dôležité v prípade mäkkého ovocia, ako sú rajčiaky, banány, jahody, broskyne a hrozno.

Opačný k vplyvu pozorovanému pri expresii TPP je vplyv expresie TPS, ktorá znižuje v listoch pomer proteínov k sacharidom. Tento efekt je dôležitý pre listové plodiny, ako sú kŕmne trávy a lucerna. Listy majú tiež zníženú biomasu, čo môže byt dôležité v prípade tráv pestovaných na trávnikoch (nie je nutné J ch tak často kosit). Dôležitejšie však je, že majú tiež relatívne zvýšený obsah energie. Táto vlastriost je mimoriadne dôležitá pre plodiny ako je cibuľa, pór a si lážna kukurica.

Ha le j potom môže byt hladinou vnútrobunkovej T- 6.....P o v p I y v n i: 11 á ž 1 v o t. a s c?. h o p n o s t s em i e n .

Kombináciou expresie IPP v jednej časti rastliny a TPS v inej časti rastliny sa vyššie popísané vplyvy môžu synergizovat a zvyšovať. Je tiež možné pomocou špecifických promótorov exprlmovat gény sekvenčne počas vývoja. Napokon je tiež možné indukovať expresiu ktoréhokoľvek génu z vyššie uvedených génov tak, že ho umiestime pod kontrolu indukovateľného promótora. Predpokladá sa, že kombinácia popísaných spôsobov aplikácie bude zrejmá pre osoby skúsené v odbore.

Vynález je ďalej ilustrovaný na príkladoch. Zdôrazňuje sa, že príklady ukazujú špeciálnu realizáciu vynálezu, že je však zrejmé, že alternatívy týchto príkladov a použitie iných rastlín alebo expresných systémov je chránené týmto vynálezom.

P o d r; t a 1 a v v n á lez u

Spôsob modifikácie vývoja a/alebo zloženia buniek, tkanív a orgánov in vivo inak ako udelením sul mpnostl syntetizoval trvha'lúzu, indukciou zmieri metabolickej dostupnosti trehaléza-El -fosfátu.

Zistilo sa, 2e zmena vývoja a/alebo obsahu buniek, tkanív a orgánov in vivo je možná zavedením enzýmu trehalóza-6 • - f o s f á t s y n t á z y ( T P S ) a / a 1 e h o tým indukciou zmien v tri: 11 a I ú z a 6 f o s t á t u ( T - 6 - P ) ukladania zásobí. Vnesenie k o r i u en t r á u i e í 6 P . i o L o t r e h a 1 ó z a - 6.....f o s f á t f o s f a t á z y C T P P ) a m e t a b o 1 :L c: k ý e h e e s t á c h s a c:: h a r i d u Tieto zmeny vedú k zvýšeniu vnú tr obunkove j dostupnosti ľ 6 P. Vneseni e I PS induku je zvýšeni e vnútrobunkovej koncentrácie 1-6P a l.o spôsobu ju inhibielu toku uhlíku v q Iykn l ytiokom smere, stimuláciu f otosyntézy, iohibíeiu rastu, sti muláciu akti vít vzťahujúcich sa na sinok a zvýšeni e I PP i ndulcu ju zníženie vnútrobunkove j znížení e spôsobu je sti muláciu smer u gľykolýzy, zvýšenie Liinmau.y a zníženie tΌLosyntetlukej aktivity.

hladiny 1-6P môžu byt ovplyvnené genetickým inžinierstvom organizmov génovými konštr úle tmi schopnými, ovplyvniť hladinu T.....6 P alebo môžu by t ovplyvnené exogénne dodávaním látok sehopnýeli ovplyvni t Ľúto I íladiou .

Genetické konštruk ty, k tur é môžu byt použité v tomto vynáleze, sú konštrukty nesúce gén pre trehalézuiosfátsyntázu C TPS), enzým, ktorý je schopný katalyzovat reakciu, pri. ktore j vzniká T 6-P z glukózy-6-fosfátu a UDP glukózy. Na druhej strane konštrukt kódu júci enzým trahalózafosfátfosfatázu C TPP), ktorý katalyžuje reakciu, pri ktorej vzniká trehaléza z ΐ-6-Ρ, spôsobí, v závislosti od expresie, zníženie množstvo T-6-P.

A1.t e r o a t í v o e m 0 ž u La y t g é n o v é k o o š t r u k t y n e s ú c: e a n t i - s e n s e TPS C L TPP použité na reguláciu vnútrobunkovej dostupnosti T-6-P.

Ďalej holo nedávno oznámené, že vnútrobunková f (ι:*; I 11 a I I a - C I, ľI ) · g 1 u k d z i d á z a, I r e Λ, z i/u: // Z υ·. .·:υίι t ol t c b < 11 a schopná liydr olyzovaĽ Ί -6--P na glukózu a glukóza.....6fosfát (Soliook o L al., tone, 177, 77--88, 1886). Podobný enzým bol už popísaný v prípade Z,. coli. CRlmmele and Boos ¢1888), J. Bact. 176 ¢18),

5654 )- Pre overexpreslu museli byt použité homológne alebo heterolú g ne génové konštrukty. Je prijímané, že vznik endogénneho I -6-P a/alebo degradujúcich enzýmov je pod alosteriekou reguláciou a reguláciou cez kovalentnú modifikáciu. Táto r eguláci a môže by t obídená použitím hetero.I égnych génov.

Na zrušenie regulácie môžu byt alternatívne použité mutácie heter olégnych alebo homolégnych génov.

Vynález tiež dáva schopnosť meniť vzťah zdrojov a stokov a tiež rozdelenie zdrojov v rastline. Systém využívania uhlíka v celej rastline, vrátane produkcie as im ilá Lov v zdrojových tkanivách a ich zúži Lícovania v zdro jovýelt tkanivách, môže byt modifikovaný, čo môže viest k zvýšeniu výnosu hiomasy zberových pr edulc Lov . P r i použití Idnu. prístupu môže byt realizované ako zvýšenie výnesovélm potenciálu, tak indexu a zlepšenie kvality produktu, tkanivách môžu viesť k zmenám v zvýšením exportu foLosyntetiokých produktov, ô naopak, zmeny v sĺnk tkanivách môžu viest k zmenám v zdrojových tkanivách.

a j zlepšenie zber ovélm

I i. e t o z m c; n y v z d r o j o v ý c 11 ; i 11 k tk anivá e 1t, r t apr í k1 a d

Špecifická expresia v bunkových organelách, iných častiach organizmu dovoľuje vyššie uvedený smerovať do špecifických lokálnych aplikácií. expresia môže byt zistená vnesením alebo anti. -sense génov pr e 1 PS š p e c i f i c k ým i. p r om ó t o r m i..

t k a n i v á c h a 1 e b o všeobecný e f elc t I á t o š e c 1 f 1. c k á júcich ÍPS, ľPP l< on t r olovaných génov kódu alebo IPP

Špecifická expresia tiež dovoľuje simultánnu expresiu obidvoch ¢11^8 a TPP) enzýmov v rozdielnych tkanivách a preto lokálne zvýšenie hladiny T-6-P a zníženie T--6-P.

Použitím špecifických promótorov je tiež možné vytvoriť

B dočasné rozdiely. Na tieto ciele môžu byt použité pr omótor y, ktoré sú špecificky aktívne počas určitého obdobia organogenézy rastlinných častí. Týmto spôsobom je možné najskôr ovplyvnil' množstvo orgánov, ktoré sa vyvinú a potom umožnil’, týmto orgánom, aby sa naplnili zásobným materiálom, ako je škrob, olej č;:i proteíny.

Alternatívne je tiež možné použít indueíbilné promótory na selektívne zapínanie a vypínanie expresie génov vynálezu. Indukcia môže byt dosiahnutá napríklad patogénni:!, stresom, chemi káli am i alebo s ti mul.úci.ou svet.l om/tniou . liexokinázová aktivita je enzymaLieká akt!vi ta nachádza júca sa v hunkáeh, ktoré kata lyžujú reakciu liexózy na I lexóza B f os I á L . I lexózy zahrnú j ú glukózu, fruktózu, ga laktózu alelao akýkoľvek i ný Ch cukor. Uznáva sa, že exi stu je mnoho i zozýmov, ktoré všetky môžu hr ať. úlohu vo vyššie uvedenýclt hl ochem.i ckýcli reakciách. Ka ta I y/ι ivaním tejto reakcie hexokinázy tvor i a kľúčový enzým v hexóznvej C glukózeve j) s:.i gnall.záel i..

I lexózová si gnal izácia je regulačný meehan i zmus, k torým bunky vnímajú dostupnosť hexóz (glukóz).

Glykolýza je sekvencia reakcií, ktoré premieňajú glukózu na syrová L so spr i evodným vznikom A11’.

Chladové s ladnú L i e je akumulácia rozpustných cukrov v zemiakových Hľuzách po zbere, ak sú tieto skladované pri. nízke j teplote.

Uk l.adan.i.e zdr ojových látok je proces, pri ktorom sa primárny produkt glukóza metabolizuje na molekulové formy, ktoré sú vhodné pre skladovanie v bunke alebo v špecializovaných tkanivách. Tieto formy môžu byt rôzne. V rastlinnej ríši majú zásoby formu polykarbonáLov ako sú škrob, fruktán alebo celulóza alebo formu jednoduchších mono a disacharidov, ako sú fruktóza, sacharóza a maltóza. Ďalej sa vyskytujú vo forme olejov, ako je arašidový alebo olejový olej, a vo forme proteínov, ako sú kruciferín.

nupín a zásobný proteín semien repky. V živočíšnych liunkó.;:·· tiež v z i i i k a j ú p n I. y k a r b o n á t y, a k o j e g 1 y l< o g é n .

ýeikč množstvo energeticky bohatých látok je ale tiež prenesených d o tuku a 1 i. p i d o v .

Biomasa je celková hmotnosť biologického materiálu.

Pr e h1a d ebr á zk ov na výk r esoch

Obr. 1: Schematické znázornenie plazmidu pVDH275 nesúceho neomycľni osiotr ansfer ázový gén C ΝΡΊii ) ktorý je obklopený 35S promótorom vír usu tabakove j mozai ky Cp35S) a térmi náborom CI35S) akn seleklabilný mar ker. Expresná kazeta obsahuje

p.l astocyanínový promótor z hrachu CpPCpea) a nopai ínsyn tázový terminátor (Inos). Pravú (PH) a ľavú CLP) I ONA hraničnej sekvencie a I >al< ter i á 111y gén pre kanamycínovú rezistenciu (KanR) aku mar ker ový gén.

Obr . 2: Nothern hlot analýza tr ansgór iných tabakových rastlín. Panel A znázorňuje expresiu o t.r A ml 44 A v listoch jednotlivých pľlOG799 tr ansgónoych tabakov. Kontrolná línia C obsahu je celkovú RNA z netransf or muvai iých ras tlín /'/. tabaci/m.

Obr . 3: Porovnanie 1 PS kódujúeej sekvencie odvodenej od rastliny s kvasinkovou TPS sekvenciou pri využití Wisconsin GGG segueoee anaiysis package C Hever eux et aí. (1934) A compr ehensi ve set of segueoee anaiysis program s o f the VAX. Nuel. A e i. d Res., 12, 387). TPSatal 3/56 a 142 TPSr i.ee3 C SEO 10 Nfh 53) a Ri.ee TPS kódujú TPS enzýmy Arabidopsis a ryže odvodene od databázových sekvenci.í ESI. Ί PSsuolO, I PSsel43, C SEO 10 N0= 44) a TPSselS C SEO 10 NO: 42) kódujú TPS enzýmy slnečnice a Selapinella odvodené od sekvencií izolovaných technikou PCR C pozri príklad 3).

Obr. 4: Vyrovnanie tabakových TPS cDNA fragmentov získaných amplifikáciou PCR nesúcich TPS kódujúci kvasinkový Ί PSI gén. Or á m o v a n é μ > o 1. í č k a i. n d i k u j ú i d e n 1i t u m e d z i a m i n o k y s e 1. i. n am i.

v š e: L k ý c 1i š L y r o c 1i u v e cl oný c 1i s e k v e n c .i.. i .

Obr. 5: Vyrovnanie tabakových TPS ellNA fragmentov získaných ani p 11 flkáciou PCR nesúcich TPS k ódu „j ú c i kvaslnkový TPS2 gén. Orámované políčka Indikujú Identitu medzi aminokyselinami v š e t k ý c: h č t y r o e h u v e d e n ý c h s e k v e n e i í .

Obr. 6: Vyrovnanie fragmentu PCR amplifikovanej slnečnicovej TPS/TPP dvojdielnej eONA (SEO 10 MO: 24) s TPP kódujúcim kvasinkovým TPS2 génom. Orámované políčka indikujú identitu medzi aminokyselinami obidvoch sekvencií.

Obr . 7: Vyrovnanie fragmentu I PSI Arabi ch i.·: a ESI kľlonov ryže s génom I PSi kódu júcim kvasinkovú TPS. Orámované políčka i nd i ku jú identitu medzi, aminokyselinami všetkých troch sekvencií.

1	r . 0 : Vy r ovnanle	fr agmen tu	ľudskej cONA 1 Pľ	i am p 1 i. f i k o v a nej
pomoci	u PCR (SEO 10 NO	: 10) S	génom 1 PS.I kódu	j ú c i in k v a s i. n k o v ú
TPS .	(Ir á m o v a n é p o 1 f č k a	Ind i ku jú	i denl.i tu medz i	am i nokysc.O inam i
o bi d vi	ich sekvencií .

Obr. 0: Akumulácia trehalózy v tr ansgóm lyeh r astlinách /tuniakov ρΙΊΟΟ I 027 ( 35S as trehalase).

Obr . 10: I lexokInázová aktivita extr ak tu z hľúz divokého typu zemiakov (.S7iJ<n tum tuberosum ev . Kar dal) s prídavkom trehalóza.....Gf t>: O átu a bez n e ti o.

Ohr . 11: Hexokinázová ak tivi ta extr ak tu z hiúz divokého typu zemiakov (.Solanum tuberosum cv- Kar dal) s pr ídavkom tr ehalóza-G - fosfátu a bez neho. Ako substr á t na stanovenie je použitá f r u k t. ó z a a 1. e b o g 1 u k ó z íi .

Obr. 12: Hexokinázová aktivita extraktu z listov divokého typu tabaku (Nicotiana tabacum cv. SRD s prídavkom trehalóza-G -fosfátu a bez neho. Ako substrát na stanovenie je použitá fruktóz a a 1 e b o g I. u k ó z a .

Obr. 13: Graf merania aktivity hexulc i oázy

Sér l a	dát	1. :	Extrakt z	rastlín	tabaku
Séria	dát	2:	Extrakt z	rastlín	tabaku -i	1. m 1*1	t r e h a 1 c j z a.....G—f o s f á t
Séria	dát	'3 :	Komerčný	h e x o k i r t á z o v ý e x t r a k t	z kvasiniek (1/8
			jednotky).

Obr. 14: l lexolci názová aktivita extraktu z listov divokého typu ryže (.Oryza .satli/a) s prídavkom trehalóza-6--fosfátu a bez noho. Extrakt bol uskutočňovaný dvojmo pri použití rôzneho množstva extraktu. Ako substrát na stanovenie je použitá fruktóza alebo glukóza.

Obr. J b: llexoki názová aktivita extraktu z listov divokétio typu kukurice noho. Extrakt (//?<? nioys') s prídavkom trehalóza h fosfátu a bez bol uskutočňovaný dvojmo pri použi t Γ r ôznoiio množutva extraktu. Ako : substrát na stanovenie je použitá fruktóz,! alebo glukóza.

Obr . 16: Fluorescenčné charakteristiky tabakových listov divokého typu ( f r n juhol niky), PG I PS (štvorčeky) a 35S I PP (krížiky). II orné dva panely ukazujú efektivitu transportu elektrónov (III) pri indikovaných Intenzitách svetla (PAP). Rasti iny boli. merané po temnej perióde (horný ľavý panel) a po svetelnej perióde (horný pravý panel). Spodné panely ukazujú r e d u k c i. u f ^:: 1 u o r e s c: e n c i. e s p ô s o b e n ú a k u m u 1 á c 1 o u a s i. m 1.1. á t o v (nefotoehemieké zhášanie). Ľavý a pravý panel sa Ušla rovnako ako vo vyššie uvedenom popise.

Obr. 17: Relatívna aktivita sinku jednotlivých častí rastlín t r a n s g é n n y eh t a b a k o v P G 1' F⁵ S ( F a m i tie)

35S-TPP (Feast).

Indikovaná je hrubá akumulácia G vyjadrená ako percentá celkového obsahu C pre rôzne časti po svetelnej perióde (D) alebo po svetle i tma ( II i N) .

Obr. 18« Aktuálna distribúcia uhlíka v jednotlivých častiach r' <λ ; 1.1. f f t tr ansgénnyel i tabakov PO· 1 PS (I am i ne) a 3bSS I PP Cl easl.). Indikovaná .je hr ubá akumulácia C vy jadr ená ako per centá celkove j dennej akumulácie nového C pre rôzne časti r ast 1.1 n po svetelnej perióde CD) alebo po svetle ·'· tme CD·N).

Obr. 19: Znížené a zvýšené predčasné dozrievanie v prípade transgénrlyeh línií hlávkového šal átu expri.mu júeeho PĽ-I PS alebo PCľ P P v porovnaní s rastliny divokého typu. Spodný panel ukazuje moríelégiu a farbu lislov.

Obr. 20: Profil rozpustných cukrov C Obr. 20/1) v extrakte t r ansgénnych línií hlávkového šalátu C hor n ý panel) a t r ansgénnych línií repy C spodný panel). V prípade horného panelu sú kontroly GOS transgénnej línie, ktoré sú por ovnávané s líniam i pr e PO· IPS a PO I PP. V pr ijiade spodnéfm panel, u sú vše L k y transgénne rastliny PO I PS. Pref i I škrobu ie znázornený na nbr. 20/2.

Obr . 21 : Mor f olég.i u rastlín a lis Lov tr ansgénnych línií cukrovej repy, ktorá expri.mu je PO TPS C IPS) alebo PO I PP CTI’P) v porovnaní s divokým typom rastlín COontrol). Atyp IPS má listy, k tur é sú porovnateľné s d i vokým typom, zatiaľ čo D typ TPS má jasne menšie listy. Listy tr ansgénnych línií 1 PP majú svetlejšiu zelenú farbu, väčšie listové stopky a väčšiu veľkosť v porovnaní s kontrolou.

Obr. 22: Priemer hlavného koreňa transgénnych línií cukrovej repy C PO IPS). Na hornom panele indikujú Λ, II, 0 a D znižovanie velknsLl Lislov v porovnaní s kontrolou CA). Na spodnom panele sú ukázané jednotlivé kloň y kont. rol y a línie PO.....IPS 280-2.

Obr. 23: Výnos hľúz transgénnych zemiak ových línií pMOG'799 C35S TPS).

Obr. 24: Výnos hľúz transgénnych zemiakových línií pMOGlOlO

C 3bS TPP) a pMOGll.24 CP0-1PP).

Obr. 25:

V ý n o s hľúz 22 n e z á v i sI ýe h kIonov divok ého typu S.

tubornsum.

Obr. 26: Výnos hľúz transgénnych zemiakových línií pl*10G1993 (I .....TPS) v porovnaní s divokým typom. 6, C, D, I , I a G indikuje znižu júcu sa veľkosť listov v porovnaní s divokým typom (13/C).

Obr. 27: Výnos hľúz transgénnych zemiakových línií pl*10G845 (Pat-TPS) (Obr. 27-1) v porovnaní s divokým typom (Obr. 27-2). B, G označujú veľkosť listov.

Obr . 28: Výnos hľúz transgénnych zemiakových línii pľ1OGl 1 29 (8Ί6.....I 1/22/23) .

panel) t zväčšená

29: Priečny ransgénnycb veľkosť bun i i rez listmi TPP (spodný panel) a rastlín tabaku. Ďalšia vrstva l< sú viditeľnú na priečnom reze

I PS (horný buniek a

T PS.

Obr. 39: Analýza pred a po skladovaní n c ť r a n s g é n n e k o n t r o 1 n č

I-IPI 9.....PI I) tr ansgénnych hľúz na pr i. 4 °C. Kar dal. C, F, 8,

T. í n i. e .

TPS,..._<::<:>1 , G a I I sú

Obr . 31: ľi o r f o i. ú g i. a listu, farba a veľkosť t r ansgčnnej Fíni e tabaku. 3bS TPS (horný list), divoký typ (prostredný list) a 3bS TPP (spodný list).

L a I: > a k o v ý c: h i. í. n i. í : typu (IaIT), PC- TPS a ii i n y t r e h a 1 ú z y, oh) a chlorofylu

Obr. 32: Metabolické profily transgénnych 35S i PS (pl^vIOG799), 35S TPP ( pMOOlO I 9) , divokého (pMOGl.1.77) a PG TPP (pM0G1124) . Ukázané sú hl rozpusti iýc:l i cukrov (Obr. 32-1), škrobu (star (Chlórophyll) (Obr. 32-2).

b r ·. 3 3 : F’ o r o v n a n i e v ý n o s u h T ú z t r a n s g é n n y c h 1 í n 1 í. zem 1 a k o v PM0G1027 (35S as tr ehalase) a pM0G1027( 845-1.1/22/28) (35S as-trehalase pat TPS) s výnosom línií zemiakov divokého typu.

Obr. 34: Porovnanie obsahu škrobu transgénnych línií zemiakov pl*!0G1027 (35S as-trehalase) a pM9G1.927( 845-1.1/22/28) (35S as tr H lalase pat IPS) s Píniami zemiakov divokého typu. Sokvenoia všetkých znázornených línií je identická o Obr. 33.

Obr. 35: Porovnanie výnosu transgénnych línii zemiakov

PI40G1027 (35S as-trehalase) a pl*I0G1027( 845-11/22/28) ( 35S as-trehalase pat IPS) s výnosom zemiakov divokého typu.

Obr. 38: Porovnanie výnosu tr ansgénnyi :l i línií zemiakov pľlOG 1092 (PO as -trehalase) s výnosom Hnil zemiakov divokého typu ako v prípade obr. 35.

Obr. 37: Porovnanie výnosu transgénnych línií zemiakov pNUGI130 (PC as.....trebaJase PC I PS) s výnosom línií zemiakov divokého typu ako v prípade obr. 35.

P r í. k I a d y r e: a I i z á c:: J e vy n á I e z u

ONA man i puIáci a :

V š e t k y 0 N A p o s t u p y I i > g á e i a, t r a n s í o r m á e i a, š L a n d a r d 11 ý e 11 p r o l. o k o I. o v C I oniring: a Laboratory laboratory Press, CSII, Ne (Izolácia a teľ.) (Sambr ook manuaľl, 2. ui York) .

DNA z / . coli, r eštrikcia, Id o j : i u s k u t o č Γi o v a 1i é p o d 1 a e t al . (1989) 14 o leču Jar vydanie:, Cold Spring Harbor

Kmene ·.

Pre k lono vanie E. coli K 12 je vo všetkých príkladoch použitý kmeň Dl 15(/. Pre trans ior iná o i u rastlín sú použité kmene ΕΙΙΛ 105 a I40G 101 Agrobacteríum tumefaciens (Hood et al. (1993) Trans

Research 2, 208) .

Konštrukcia kmeňa I40G101 Agrobacteríum tumef aciens;

Konštrukcia kmeňa I40G101 Agrobacteríum tumefaciens je popísanej vo W0 96/21030.

Klonovanie génu otsA f . cn! i. a konštrukcia pl^vIOG799 :

V E . col i j e L r c: 11 a 1 ó z a f o e. I á t s y n L á z a C í PS) k ó < :l o v a n á g é n oni otsA lokalizovaným na oper ľni:: otsBA. Klonovanie a sekvencovanie génu otsA „je podr obrie popísané v Pr íklade I vo 14095/01446 uvedenom tu citáciou. S cieloin zvýšenia expr esie v rastlinných bunkách hol. otvorený čítací rámec spojený s r egulačným prvkom transkr ipcie promótora DaNV 35S PNA, zosil ňovačom transláele 1 eader a A IN V a transkr i pčným terminátorom n o s génu, ako bolo podr obne,.jš::i e popísané v Pr íklade 1. vo 14095/0 144 0, ktorého výsl edkom bol pľlOG799. Vzorka kmeňa E. colí obsahujúca pl*IOG799 bola uložená na základe Budapeštianskej dohody v Ocnbraal Bureau voor SehimmelculGures, Oostershraah 1, P.0. Box 273, 374 0 Ali

Baarn, Tlie Metherlands, pondelok 23. augusta 1993: evidenčné číslo pridelené Tnter natlonal Oepnsi bary Inštitút i on je CBS 430.93.

Izolácia promótora pal.aL ínu a konštr ukc i a |.>l^vll H.·!·>40 .Gasľ. pr iimiitnr a pabábinu je izolovaná z cl ir omozómovej ONA SíiEuium Ι.ι,ιΙχ:r /)<;uin i:v . Blot je piimnci.iu pol ymer áz<>ve j r etazcove j r e a k e i e . Je s y n t e 11 z o v a n á s ú p r a v a o I i g on u k 1 e o t ::i. d o v k:. i n i p 1 em e n L á r n y e 11 k μ > r o l. i sme r n e j o I«1 a s I., i p a t a t ľ n o v é Im g é n u Iambdapat21 zložene.j z týchto sekvencií:

h’ AAG	01 ľ ATG	1 1 G	GGA 1 A ľ	AGA	G 1 A	G 3 ’ P a b B 3 3 .	2 (StO 10	NO: !ť	:.)
5' G1A	GT ľ GGG	ATG	GÍG GAA	Al G	IGG	3' Pal.AlG.	2 (SEO 10	NO: Ι-	i)
ľ l e to	Pr iméry	sú	použ i bé	P r e	POP	amrd 1 f: i kác i u	f ragmentu	ΟΝ A	r,

veľkosťou 1123 bp, ako temp!át slúži ehr omozómová DMA izolovaná zo zemiakov cv. B'i.nt je. Ampl lf ikovaný fr agment vykazuje vysoký stupeň μm d obnos Li s pababínovou sekvenciou l.ambdapab 21 a ..je klonovaný pomocou EcoPT I :i.nkér a do vektora plJC'18, výsledkom čoho je plazmld pl^YIOG546.

Konštrukcia pl^vIOG845:

Konštrukcia pN0G845 je popísaná vo 140 90/21,030.

Η

Κι π iš tr úkol a pVDI 1310, pla, Locyan ír iI PS :

Plazmi d pľlOG798 (popísaný vo 14085/1)14 46) je štiepený pomocou 11 i r ud l I I a spo jený s oi.igot lukleoLldovým duple xoín 111VI I a IGV12 (pozri, konštrukcia pľlOG845) . Výsledný vektor je štiepený pomocou PstI a ll.indll..l a po následnej Inzercii, terminátora PotPi.lI vzniká pTCVi lG. Šti epením plazmidu p IGVI I 8 pomocou Srna I a HindlII je získaná šast DMA obsahujúca Ί PS kódujúcu ohlast a PotPi.IT ter minátor . Ďa l e j boli pr i dané BGLII li.nkéry a takto vytvorený f r agmen t bol vnesený do r asti.i nnšho nxpr esného vek tor a pVDI 1275 (Obr . 1) r ozštiepený Hanil II za vzni ku pVDH318. pVDI 1275 je odvodený od pľll IG33 (Si jmons et al. (1988), Bio/leehnol. 8. 3 17), kde obsahuje se.lekeoý mar ker MPľl'l riadený promótorom 35S CaľlV a expresnú kazetu obsahujúcu piastoeyanlnnvý (PG) promótor z hrachu a nos térmi našriú sekvenciu. PI as tocyarilnový |»r omótor obsiahnutý v pVDI 127b bol popísaný Puioo a Cray (1993) Planí J. 3, 437. lonl.o

P r o m ó L o r la o 1 p r e n e s e 1i ý d o la i n á r n e h o v e k t o r a P G P a m p j i f 1. k á c i. o u ; i pr i mór m i i alasahu júni m i vhodní': kl.onuvanó miesta.

Klooovariio ol.sB génu /. . čuli a konštrukcia pl^vH H i 11) 1 í) ( 35S Gal^vIV I PP) :

Súpr ava ol i gonukl eoti dov I PP I (b' GTGAGAI G IGGGGACAAA 3') (Sl O ID Ml): 56) a 1 PP ľl (b' G I GC 1 CG113 GGAGG1 GC 9') (SI IJ ID Ml):

97) t:o í i la o I a s y o t e t i. z o v a n á (Sl IJ ID Ml): 3) sok vnor: i i génu TPP / .

pr e PGP a m p I i f i l< á c i u f r a gin e n t u k o m p. 11 an e n t á r n e k iieto pri móry boli použité DNA s 3 7 lala p, ktorá nesie 3’ šast kódujúcej oblasti. TPP génu E. cc/lĹ, vnesené bolo PstI miesto ID lap v smere do stôp kodónu pri použi tí pľlOG748 (140 95/81.446) ako l.emplátu. Tento PGP ( fragment bol r ozštiepený pomocou Bgl.l.l a Pst! a klonovaný do pl^¥10G445 a 1 i n e a r . i. z o v an ý p cm o c o u H g Ί I ľ štiepený PstI a HindlII a bol.

(EP G 449 376 A3 príklad 7a) a P s t ľ. Vý s I e dný vek tor bo1 v I o ž e n ý t e r m i. n á t o r F’ o t P i. 11 ( p o z r 1.

konštrukcia pl^vIOG845) . Vyššie popísaný vektor bol štiepený BglII a HindlII a výsledný fragment s 1.325 lap bol izolovaný a klonovaný 5' 1 PP PGP fr agmentom šti epeným Sma.l a Bgll 1 v pílili 8 spoločne s i o e a r i. z o v a o ý linal

HindlII.

V ý s I. e d n ý vek t o r la o I n a z v a n ý

V>Ί (:V I >^Ζ1 . T ento vek tor bol 1 Jnear1xovaný pomocou EcoRl a Snia 1 a použitý pre vloženie promótora 35S Caľlý (850 bp I eoP.I -’ NeoT ' (miesto pre štiepenie NmT bolo znecitlivené nukleázou z bôbov) f r agment izolovaný pľlOG 18 obsahujúc i 35S GaľlV dvojnásobne zosilňujúci, promótor). Tento vektor boi. nazvaný p I CO I27. Z tohoto vektora bol izolovaný 2.8 kb EeoRl.....11 ind11 I fragment obsahujúci úplnú 353 ľľľ expresnú kazetu a klonovaný v binárnom vektore PI40G8GG za vzniku vektora pNOGlOTO.

Konštr ukci a pýf)IT321, plastocyanin (PC) T PP :

a m 111 m i e s t o ľ> I a z m i d u |: > T G 0.1 2 4 In o I. o o d s t r á n e o é š t i e p e n í m, zaplnením a následnou r ell.gáei nu. Následným štiepením hol získaný fragment obsahujúci, oblasť kódujúcu T PP a PotPi.l I terminátor. Po pridaní Baml II T i likérov boI výsledný fragment vložený do rastlinného binárneho expresného vektora pý|)ll275 (rozštiepeného I f a m III) z a vznik u p 00113 21.

Konštrukcia patatínového 1PP expresného vektora:

Podobne ako pri konštrukcii patatľnového TPS expresného vektora (pozri konštrukcia pl4OG845) hol patatíoový 1 PP expresný vektor konštr uovaný za vzniku binárneho vektora (pTIUGI 128), ktorý f > o t r a 11 s f o r m á <.: 1 i zvýš o v a 1 š p e ci f 1 c k y v hl u z á r:: 11 ú e i n n e s; t e x p r e s i e 1 P P.

Konštr uke i a cľal š f eh expr esných vek tor ov :

Podobne ako pri konštrukcii vyššie uvedeného vektora, môžu byt génové konštrukty vytvorené pri použití rôznych promótorov v kombinácii s TPS, 1 PP alebo trehalázou pomocou binárnych vektorov s NPTXI génom alebo génom rezistencie k hygromyeínu ako selekčné mar ker y. Popis binárneho vektora p 140822 obsahujúceho selek š ný marker H T P je uvedený v G od d i. j n e t al. (1933) Plánt J. 4, 863.

T r o j n á s o b n é v e k t o r y :

Η

P iiiárne vektory sú mobil i zovai ič v br n. jr oeti.eovsknin zmiešaní s kmeňom E. coli. IIP llll obsahujúcom plazmid pRK2HI3 (D iiba e t al .. (1988) Pr oo . Mati. Aoad . Se:i USA 77, 7347) do /E/robac tórium tuasfaciens kmeň MOG'J.Ol alebo EUA1.85 a toto je použité pr e t r a osf or tnáeie .

Ί r ansíor mái: i o tabaku Uiioii.ioio tabacom cv.SR 1. alebo ev. Sansuo N N) :

ľ a I::j a k b oI t r a n s 1 o r m o v a o ý s p o J o š n o u k u. I.. t: i. v á v i o u r a s 11 i. o o ý e: h pletív s fígrobacterium tumefaciens kmeňom MOGIOI obsahujúcim príslušný binárny vektor ako bolo popísaný vyššie, ľransformácia bola uškutočoeoá spoločnou kultiváciou listových diskov tabaku tak, ako to popísa l I lor sch e t al. (188b) Science 227, 1229.

ľ r ansgéi nie rastliny tmi i. regenerovali é z výhonkov rastúcich na sclokčoom médiu obsahujúcom kanamycín, zakorenené a prevedené do pôdy.

I r <n is f or máe i a zemi aku

Zem i ak QSolaoom toberooum cv. Kar da l ) tmi tr ans f or niovaný kinoňom 11 IA 185 /E/robactor ium obsahujúcim príslušný binárny vek tur . Ako základné mód i um bolo použi té I4S38R3 médium obsahujúce ľlS sol i (ľlurasblgc u Skoog (1982) Pbysi o I . Plánt. I 4, 473), R3 v i tamíny (tloms ol. a l . (1987) ii ioor . Appl. t.icoot. 73, 744), 30 g/1 sacharózy, 8,5 g/1 141 S, pil 5,8 (upravené Kllll) a prípadne spevnené 8 g/1 agarom Oa i.cl ii n. Hľuzy Solaoom toborosom cv. Kar dal bol i olúpané a povrchovo sterilizované v 96% etanole počas 5 sekúnd. P Iamene boli uhasené ponorením hľuzy do ober U ne j vody a z hľúz boli. nakrájané rezy s hrúbkou približne 2 mm. Disky vy k rá jané kor kovr tom z vaksolárnych ple tív boli inkubované počas 2D min v

I4S30R3 médiu obsahu júnom 1 5 x ID¹’ baktérií/ml figrobacterium EHA

185 nesúceho binárny vektor. Disky z hľúz boli opláchnuté médiom I4S30R3 a prenesené na spevnené kultivačné médium (Pľl postculture médium). PI4 médium sa skladalo z MS30R3 média obsahujúceho 3, 5 mg/1. zeatín r i b o zídu a 8, 83 mg/1 indol octovej kyseliny (1AA). Po dvoch dňoch boli disky prenesené o a čerstvé Pľl médium obsahujúce 200 mg/1 eefotaxímu a 100 mg/1 vanomycínu. Po ďalSíob trueli dňoch Ι:π 11 i di sky z h ľúz prenesené na méd i om Indukujúce tvorbu výhonkov (SI14), ktoré sa skladalo z P 1*1 média obsahujúceho 250 mg/1 cer herci.el i tou a 1.00 mg/1 kanamynínu. Po 40 týždňoch boli. výhonky regener u J úce z diskov oddelené a prenesené oa koreniace médium (I4S30P3 médium so 100 mg/1 eeľotaxímu, 50 mg/1. vanomyoínu a 50 mg/1 kanamycínu) . Výhonky boli r ozmnožované rnerisLámovými, r ezkami..

ľ r a o s f o r m á e i. a Sa 1. á L u

I r a 11 s f o r m ú r:: 1. a š a 1. ú t u, /, < z i. t w.:<> ;<) 1i v a c. v . I . v o la, b o 1 a uskutočnená podľa Our J. i.s e t al . (1994) J. Exp. Oot. 45, 1441.

I r a n s I o r m á o i a c: u k r o v e j r e r > y

Tr aos for máo i a cukrovej ropy, //./,<? i/z.z./g/<zz- /.·.- (udržiavaniu populácia), bola uskutočnená podľa I ry e t al . (1991) 1 bi r (.1 I n i, c: r o a t i o o a I 0 o n g r o:; s o ľ i SI ’ 14 H, ľ u s o on, IIS ô, a I ί :. t r a o L. č . 304, a I 11 k i inídľa Krvos nL al . (1990), Plánt Sni. i 10, 07.

I r ar is t or már 9 a L yt :t tpt :rsicun f a.o c:u In n i. u m

Pajčiak bol transformovaný podlá Vao Poekel oL al. (1993) l’laot Od I Pop. 12, 044.

ľ r a o s f o r m á o i a Λ r a l:.i 1 d o r > s i r;

Transformácia Arabidopsits thaliana bola uskutočnená buď podľa metódy popísanej Čiarke e t al. (1.992) Plánt 14 o 1 . 01 ol . Pep. 10, 170 alebo metódou popísanou Val. vek e os e t a L. (1900) Proo.

Mati. Acad. Sol. USA, 05, 5536.

n d u k c 1. a m i k r o I ί 1 ú z o l<

Stánkové rezky rastlín zemiaku pestovaných in vitro obsahujúce vedľajší merlstém boli prenesené na médium na indukciu n

m i kr ul > ľúzok . ľlód i um na Indukciu mikróbľúzok obsahoval u lx ľlS soli doplnené doplnené H3 vitamínmi, ľ), b g/1 ľlES (konečné pil b, 8 bôle upravení': KOI I) a spevnené 8 g/1 agarom Haictiln a ďalej obsahovalo a g /1. s a c h a rd z y a 2,5 m g /1. k i ne: t í. n u . ľl i k r o h 1 úzky s a v y t v o r 1.1.1. p o 3 až 5 týždňoch rastu v tme pri 24 °Cizolácia ťali dámycínu A

Zistilo sa, že validainycín A je vysoko špecifickým inh 1bi tor om trehaláz z rôznych zdrojov v rozsahu, ( 10.,,_o) 10 ľl až 10 ^{, o} ľl (Asano et al. (1987) J . Antl.blot. 40. 520; Kameda et al. (1987) J. A n t i blot. 40, 503). 9 výnimkou trehalázy neboli významne inlilbované akti vi ty žiadne j ct alebn o g 1 yknhydrolázy. Validainycín A bol izolovaný zo So lacní u, komerčného poldioľiospodár skebo prípravku (ľakeda tliem. tndust., Tokyo), podľa postupu pv| > ľsanél m KendalI el a.. (1990) I j iy tochem i s Ir y 29, 2525.

PosL.up zahrnoval innexovú cbr ornatogr a flu (LJAI Se|>badex A 2b (Pharmacia), bed vol . 10 ml, ekvillbračný pufer 0,2 mľl Na ľ.i, pil

7) z 3 / poľnotaospodár skebo prípravku Sulaeol. Na kolónu bol nanášaný 1 ml So la sedu a eluevaoý vodou v '7 frakciách, v podstal.e všetok Val idamycín bol obsiahnutý vo frakcii. 4. Na základe 1.00 / vý ľažin e; Li pr i lornto postupe bola v testoch akumulácie Lrehalózy upr avená koncentrácia Val!damyeínu A v ľlS médi u na I . 10 ľl.

Validainycín A a 8 môžu byľ tiež purifikovaný priamo zo S t.r t :/:>Lt uttyt :t 7 iy<jľ t !.·:< :t i/:> i i var. 7 í:íhih;:ih: | >od ľa metódy |:>opísane j v Iwasa e t al . (197 1) J . Aritl bl.nl.. 24 , 119, ktorého obsah je tu zahrň u L ý c: i L á e: i o u .

A n a 1 ý z a g 1 y c J.. d o v (Jbsah glycidov bol kvantitatívne stanovený pomocou ionexovej chromátografie pulznou elek tr ool ieml okou detekciou . Extrakty bol i. pripravené extrakciou zmrazeného zhomogenizovaného materiálu 80 X EtOH. F’o 15-minútove ..j extrakcii pri izbovej teplote bola rozpustná frakcia odparená a rozpustená v destilovanej vode. Vzorky (2b ul) boli analyzované na kvapalinovom chromatografe Dionex DX--300 s 4 x 250 mm Dionex 95391 carbopac F’A-l kolónou a 4 x 50 min ľ) i nncx -131195 earbopae PA -I pr edkolónou. Pre e Lúči u bol použitý 199 mľl NaOH ( I ml/min) a potom MaAc gradient. Cukry bol i delegované pulzoým elektrochemickým detek tor om (llionex, Pi l.)) . Ako štandard boli. použité komerčne dostupné glycidy (Sigma).

Analýza škrobu

Škrob bol analyzovaný tak, ako to popísal Aman et al. (1994) Methods in 9ar bnbydr ate Cl n :m i :; tr y, Volume X (eds. Peli I.ller et al.), pp. 111 - 115.

A n a 1. ý z a ex p r e s i e

Expres!a génov vnesenýcb do rôznych rastlinných druhov bol a bodrie Loná pomnr :ou Norl.her n bi n tu .

Stai íoveni e Ír ehalóza b fosfát fosfatázy

I PP bola s t a no vená mcranOii p r odukeic I '^'9 1 trehalózy z

I ¹ 'Ίΐϊ L r ehal óza.....C.....fosfátu r-r i 97 “C ( I. nndesbur ougľi a Vuor i o ( 1.99 1 )

J. of Cen. 1*1 i.crobiol. 197, 929). Hrubý extrakt bol pr j pr avený v 2b ιιιΙΊ I r i s, HCl pil 7,-1, obsahujúcom 5, b mľl ligUb... Vzorky boli zriedené na koncentráciu prolclnov I mg/ml ex trakčným pufrom obsahujúcim 1 mg/ml PSA. Štandardná reakčná zmes (konečný objem bil n I ) obsahovala 27, 5 ml*l ľ r.i s, HCl 7, 4, b, b ml*l l*lgC b.., 1 mg/ml

PSA a U, bb mľl ľ b P (špecif i cká ak tivi ta 954 cpm/nmol). Pealcci a bola začatá pridaním b nl enzýmu a zastavená zahriatím vo vriacej vode počas 5 minút. Po pridaní ACI X 9 (formáte) lonexu (P i. or ad) a 20-minútovej elcvi l l.bráoi.1. pri. izbovej teplote boli reakčné zmesi e e 111 r i f u g o v a n ó . P á d i. o a k t i. v i t a v o v z o r e o e b s u p e r n a t a n t u ( 4 00 u 1. ) bola meraná scintilačným počítačom.

Príprava rastlinných extraktov pre stanovenie bexoklnáz:

Zmrazený rastlinný materiál bol rozdrvený v kvapalnom dusíku a 30s homogenizovaný v extr akčnom pufri (IIP: 190 mľl HEPES pH 7,9 (KIJH), 1% (hm/obj) PVP, 5 ml*l l*lg01-,>, Imb ml*l I IIIIA, 0,1. % obj/obj

2

p. ľlel II I) olasal iu júraim Pr iatej riase I r ib i la i tur o Complete C Ooehringer I4ar mbelm) . Po centr 1 fugácl.l. laoPi. pr otčiny v super na taňte pr ee i p i tované 88 % síranom amónnym, r ozpustené v 1 ris -11(.:.1 pi l 7, 4 a extrakt di.alyzovaný eez noc proti 3.00 mľl Tris-HCl pH 7,4. Cast v z o r k y la o 1 a p o u ž:i. t á n a s t a o o m e n i e I a e x o k i n á z..

S t a n o v e n i. e l a e x o k i n á z

Ak t i v i L,i Hexokináz lania meraná pr i 25 '‘C hodnotením zmeny alasor laane.i o Ctili) pri 341) nm u zmesi obsahujúcej Ctí ľl Hepes-KOli pi l 7, 0, 4 mľl ľlgtlh.., 5 mľl A l P, t), 2 mľl MAI1P 'j 10 Ll/mJ kr eatí n f os I átki. názy C rozpus tene j v 50 % glycerolu, 0,1 % OSA, 50 mľl Hepes pH 7,0), 3,5 mľl kreatínfosfátu, 7 fl/ml glukóza-5.....fosfát dehydrogenázy a 2 mľl glukózy.

Ak bola pri stanovení aktivi ty hexokináz namiesto glukózy ako sulastr át použitá 2 mľl fruktóza, bolo pr i danýoh 3, 8 U/mI fosfogI ukózaiziamer ázy . I lexoki názy boli. takis to s tanovené me tódou podľa Oaneedo e L a I . C 1077) J. II i o I.. tliem., 252, 4443.

Pr i k I ad I

I xpres ia génu ntsA C I PS) z E. f:olí v tabaku a zemi aku:

ľransgénne rasti i ny tabaku lan I i vytvorené vnesením o t s A génu r ladeného pr oinótor om de35SCaľlV C pľll 10700) alebo pi astoeyanínový pr omótorom (pýlll 18 18) .

ľransgénne rastliny zemiaku boli vytvorené vnesením otsA génu riadeného patatínovým promótorom špecifickým pre hľuzy Cpľl00845) .

Listové disky tabaku boli. transformované binárnym vektorom pľl00709 pri použití Agrobacteríum tumefacíens. Transgénne výhonky boli s e1ek t ované na k anamyc íne.

Listy niektorých rastlín pestovaných v pôde sa nevyvinuli

3 úplne v laterálnom smere, čo viedlo k vytvoreniu ich kopi.jovl.Le j morfológie (br. 31). Dalej li.ež potlačená apl.káloa dominaoel.a viedla k zakrpatenému rastu rastlín a vytváraniu axilár ny cla výhonkov. 7 z 32 rastlín vykazovalo silon obmedzený rast s výškou rastlín 4.....30 em v dobe kvitnutia (la b. 1).

Tabuľka 1

Akumulácia trehalózy vo vzorcoch listov ots(\ transgénriych rastlín tabaku a leh výška v dobe kvitnutia rastlina - línia trehalóža výška mg . g.....^:l čer stve j váhy em

kon Lr cla	II, (10	bil 71
700 1	II, 04	NO
799 3	0, 02	10
799-5	0, 00	4
799 1 b	0, 055	30
799-24	0, 02	J 2
799 2b	II, 05	25
799 -32	0, 055	30
799 4 0	0, 11	25

Nl): nebij.l o hodnotené

Kontrolné rastliny dosiahli v dobe kvitnutia výšku 50.....70 em.

Transgénne línie so zakrpateným fenotypom vytvárali. menšie množstvo semien. Analýzy pomocou Northern blotu potvrdila, že rastliny so zakrpateným fenotypom exprlmujú gén otsA z E. coli (Obr. 2). V kontrolných rastlinách neboli, transkri.pty zistené, funkčnosť. vneseného génu bola potvrdená analýzou glycidov v listovom materiáli., z 32 tr ansgénnych rastlín tabaku pestovaných v skleníku, pri. ktorej bolo zistené 0,112 až 0,12 m g. g^-1 čerstvej váhy trehalézy v rastlinách s obmedzeným rastom (Tab. 1), čo naznaču je, že produkt reakcie ka talyzovanej TPS je delot; f cir y I ovaný los ľa tázam i rastliny. Ďalší dokaz akumulácie trelialózy v rastlinách tabaku bol. získaný po ošetrení surových extraktov prasačou trehalázou. Výsledkom predĺženej inkubácie extraktov z listov tabaku s trehalázou holá úplná degradácia trelialézy (výsledky nie sú uvedené). Prítomnosť trehalézy nebola dokázaná v kontrolných rastlináclt a rástlinách tabaku, ktoré sa o e v y z n a é o v a 1. i. a h e r a n t n ý m f e n o t y p o m .

Tabulka Ta: Primárne transformanty tabaku PG-TPS ( clL ^: d i vr iký typ)

Rastlina - línia	List č. hm. (g)	Plôch a listu (cm2)	Poee í, o cl vetvení.	Výška rast- lín ( ern)	bar ba listu	Axi- lárne výho- nky	Č.hm./ plochu (g/cm2)	Sušín a (%)	Sušina/ plochu (g/cm2)
kontr. 1	8, 18	349, 3	1		dt		0,023	7,21	0,0017
kontr. 2	10,5	418,8	1		dt		0, 025	9, 52	0,0024
kontr. 3	9, 99	373,8	1		dt		0,027	12,91	0,0035
kontr. 4	9, 91	362,9	1		dt		0, 027	9, 59	0,0026
kontr. 5	9, 82	393, 8	1		dt		0, 025	11, 51	0,0029
priemer							0,0254	10, 14	0,0026
2	8,39	290	2	105	dt		0, 029	12,16	0,0035
3	9, 34	296	1	123	dt		0,032	12,21	0,0039
4	8,36	254	2	130	dt	mnohé	0, 033	10, 05	0,0033
6	2,28	106	5	90	dt		0, 022	11,40	0,0025
8	5,21	133	4	100	tmavá	m o obié	0, 039	7,49	0,0029
10	8,08	258	2	165	tmavá	mnohé	0,031	12,25	0,0038
11	2, 61	64	12 .........	95	tmavá -------	mnohé	0, 041	9, 20	0,0038
13 '	2			'tírO'·'·'—
16 ...	5,86	209'	3	13Ό ‘	tmavá 5S.-UUL ΕΞ£	junokná.
;ι *.·.Λ .·*··.	rnfettaaĽTO·
17	5,15	224	2	155	dt		0,023 '	Íl,65^
18	17,2	547	1	133	dt		0, 031	10,35	0,0033
19	2,13	63	4	80	tmavá	mnohé	0, 034	11, 74	0,0040
20	3, 44	113	4	90	dt+tm	mnohé	0, 030	8,14	0,0025
21	9, 88	246	1	105	tmavá	mnohé	0, 040	8,50	0,0034
22	13, 1	409	1	135	dt		0,032	10, 68	0,0034
23	2,50	73	6	55	tmavá	mnohé	0,034	8,80	0,0030
24	8,76	286	2	130	dt		0,031	15,07	0,0046
27	7,91	219	1	124	dt		0, 036	14, 41	0,0052
28	10, 0	269	2	117	tmavá	mnohé	0, 038	8,62	0,0032
29	4,17	142	1	85	tmavá	mnohé	0, 029	10, 07	0,0030
30	10, 2	343	1	160	dt		0, 030	9,56	0,0029
32	1,95	61	3	75	tmavá	mnohé	0, 032	8,21	0,0026
33	2,85	96	5	95	dt+tm	mool) é	0,030	11,23	0,0033
34	8,38	244	1	123	dt		0, 034	13, 60	0,0047
35	5,59	173	3	126	dt		0, 032	14,49	0,0047
36	3,28	84	3	100	tmavá	mnohé	0, 039	11, 28	0,0044
37	7,80	222	1	125	dt+tm	mnohé	0,035	11, 28	0,0040
39	3,70	131	2	123	dt		0,028	17,84	0,0050
40	2,40	68,5	3	108	tmavá	in n oh é	0, 035	9,58	0,0034
priemer·							0, 032	11, 00	0,0035

^ζ|6

Pastľl ii ι v tr ansgénnehí > tabaku pbl)l 131 3 sa vyznačoval i zakrpateným vzrastom a tvorbou malých lis Lov, ktoré bo I i tmavš i e a brodia silnejšie ako l isty kontroly, fenotypom sa podobali, Lransyér iným rastlinám pľl06799 (Tab. la). Pri. ďalšej analýze týcbto listov boľl zistený vyšší obsah čerstvej váhy a sušiny na ilstovú plochu v porovnaní s kontrolou (Tab. la a 2). Tmavšia farbil listov indikuje vyšší obsah chlorofylu v listoch transgénnych rastlín (ľah. 1b) . b transformantoeh pl^vIO6799 (35STPS) a μ>Ι^¥Ι06 I I 77 (PCTPS) bol analyzovaný obsah glycidov, chlorofylu, trehai.ézy a škrobu (Obr. 32). pljOGJJ 77 je funkčne identický s pblľ)H3J 3.

Tabulka T b

Obsah chlorofylu v 'listoch transgénnych rastlín PC I PS M. tabaoum (To) b z o r k a C h T o r o t y i (m o / g I i s t. u )

kor	i tr 111	a 1.	0, 59
PC	1 PS	II) 1	n, 7’..
PC	1 PS	íli.....2	0, 39
PC	1 PS	T T	0, 69
PC	TPS	í 3	lľ), 9 T
PC	TPS	1.6	9, 99
PC	TPS	•J 9	0, f PI
PC	1 PS	37	0, 96

Poznámka: svetelné podmienky počas rastu významne ovplyvňujú stanovený obsah chlór o tylu. Preto môže byt obsah chlorofylu porovnávaný len v prípade rastlín zozbieraných a analyzovaných v rámci, jedného pokusu!

labu ľka 2

Čerstvá váha a obsah sušiny <DW) listového materiálu transgénnych rastlín s génom pre plaslocyanín.....16::..,,,1,

PO-fPS transgénny M.	Laba c um, c v .	Sainsun NM
	ľransgéľi	Kontrola
Čerstvá váha	0, 8 S	0, 78
Sušina C g)	0, 072	0, 079
% sušiny	8, 70 %	10, 10 %
Č . 111*1. /ploefia	30 <130 %)	28 <100
DW/plocha	3, 40 < 1.21. ;	Z) 2,87 <100
Γ) 1 n e f i a < j o d n o 11 e k )	208	275

Vypočítaný pomor medzi dĺžkou a čír kou vyvíjajúcich sa listov indikuje,, že I isl.y transgénnych rastlín lll IPS sú viac k opi j n vi t é Clab. d).

D i sky z hľúz zem i aku bi/bit/i.ii/i Luberosuiii ev. Kar dal. bel i Lr ans f or movanč /Vyr c/bacLer íwn Ι.ιιιιι,;! m: b://<; 111/11 Db obsahujúci m binárny vek Lor pl*ILIb8^zlb. f ransgény oll získané s lr ans formačnou frekvenciou porovnateľnou s knnlrnlnu obsahujúcou len prázdny vektor. 7 hľadiska fenotypu boli všetky získané rastliny ner oxuznatelnč nd divokého typu rasti ín, čn indikuje, že použití r: piet ivuvn špecifického promótora bán.' vzniku fenotypov pozorovaných v prípade rastl ín, kde je I PS gén riadený km išli tutívnym promótorom. ľllkr obľúzky boli Indukované na s t o n k o v ý c f t r e z k o e h b r a ns g é n n y c b a ne t r a n s f o r m o v a n ý c: 11 r a s 11 t 1i P e s t o v a n ý c h na m é d i u i n d u k u j ú e n m t v o r b u m 1 k r o h ľ ú z n k n b s a h u ...j ú c om

1.0.....^::S N Validamyeín A. Ako kontr ola bola použitá indukcia m! kr ofiľúzok na médiu bez Validamycínu A. 1*11 krohľúzky indukované na médiu obsahujúcom Validamycín A vykazovali zvýšenú hladinu trehalózy v porovnaní s mikrof fľúzkami vypestovanými na médiu bez Valí damycínu A Clab. 4). Prítomnosť malého množstva trehalózy v n e t r a n s f o r m o v a n ý c h r a s 111. n á c: h i. n d i k u j e p r í t om n o s ť f u n k č n e j d r á h y ti :i . n s y n tézy t r e ha 1. ó z y .

Tabulka 3 s Transgénne rastliny tabaku (cv. Samsun s génom pre pVD 11318

Transformant	Dĺžka (cm)	Šírka (cm)	Pomer
kontrola 1	12	8	1,50
kontrola 2	13	8,5	1, 53
kontrola 3	12	7,5	1,60
kontrola 4	15	9	1, 67
kontrola 5	25	16	1,56
kontrola 6	24	16, 5	1, 45
kontrola 7	28	20	1,40
kontrola 8	25	16	1,56
kontrola 9	26	19	1,37
kontrola 10	21	15	1, 40
1318-28	16	8,5	1,88*
1318-29	11	6, 5	1, 69
1318-30	19	14	1,36
1318-35	19	12	1,58
1318-39	21	16,5	1,27
1318-40 .. ...............	14 .	7	2,00* .....
1-318-3471 íľľ:- ;
1318-36 ..	13 5 - - - 2iUs&ssíí iV.'l fsesasyr
1318-37	17	9 “ ~	1,89*.
1318-4	20,5	12	1,71
1318-23	14	4,5	3,78*
1318-22	27	18’	1,50
1318-19	9	4	2,25*
1318-2	27	19	1, 42
1318-15	11	5	2,20*
1318-10	20	13	1,54
1318-3	25	18	1,39
1318-21	17	8,5	2,00*
1318-16	20	10	2,00*
1318-6	19	10,5	1,81
1318-20	13	5	2,60
1318-33	12	5	2,40
1318-27	23	20	1,15
1318-11	12	5	2,40*
1318-8	18,5	6, 5	2,85*
1318-24	27	17	1,59
1318-13	15	7	2,14*
1318-17	24	16	1,50
1318-18	23	16,5	1,39

j 8 ” ..... typický 1 PS fiatu typ

Pi mier d I žka/š Ír ka v prípade kontrol je 1,50.

Tabulka 1

Tretia Téza (.% čerstvej váhy) i Mali. dámy cín Λ

Val i. dámy cín Λ

845 2	0, 01 f i
845.....4
81 5.....8	0, 051
815.....II	0, 015
845 1 3	0, 011
815-22	0, 1 12
81 5-21.1	0, 002
815 28	0, 1 08
d i voký typ	0, 001
Kar da l.

Pr íklad 2

Expresia génu ntsB (ll’P) z / . coli v tabaku:

Poli vytvorené transgénne rastliny vneseným génom otsll riadeným dvojnásobným 35SCal^vIV promótor om (pIlOOlOLO) a plastocyan í m ivýtti pr omótor om ( pVD11321) .

Rastliny tabaku ( c v. Samsun) transformované pMOGlOlf) vytvár al i, v skleníku výrazne veľké li sty C plocha listu dosahovala v priemer 1.40 %), na ktorých sa začali. v dobe plného rozvoja vytvárať, chlór ézy C Obr. 31). Tieto rastliny mali tiež v porovnaní s kontrolnými silnejšie stonky, čo v prípade niektorých viedlo až k ich praskaniu. V niektorých pr ípadoch vyr astali, z bázy r astliny ďalšie stonky (ľah. 5). ý listových vzorkách z rastlín vy tvár a júr: i ch veľké listy bola zistená 5- I (Ix vyššia ak ti vi ta tr ehaľl .éza—5 - fns f á t los f a tázy v porovnaní s koo tr ol nu, čo dôkazu je l ui íkčnos t vneseného génu. Suchá a čer stvá váha/cnr' abnormálne veľkých listov bola porovnateľná s kontrolou, takže zvýšená veľkosť listu je spôsobená zvýšeným obsahom sušiny a nie vody. Expresia TOP ovplyvnila tiež kvetenstvo rastlín. Rastliny so z a k r p a t e n ý m f e n o t y p om, p r a v d e p o d o b n e s p ô s o b e n ý m k o n š t i t u t í v n o u expresi.ou TPP génu vo všetkých časti ach rastliny, vytváral i množstvo drobných kvetov, ktoré a úplne nevyvinuli a odpadával i, alebo nekroti. zo val 1. Vývoj kvetov a tvorba semien bola menej o a r u š e o á v p r í p a d e r a s 11 í o menej z a k r |: > a t e n ý e h .

b!

Tabuľka 5=

Transgénne rastliny tabaku s génom γ>ΝΙ H.i I í Π t ), CaliV T ľ’P cle 35S

Tabulka 6. Primárne transformanty tabaku PC-TPP

Iľtist.l.j.t k ľ- línia	List č. hm. (g)	Plocha listu (cm2)	Počet odve- tvení.	Výška rast- 1 in (cm)	Farba listu	Biednu t. i e	Č.hm./ plocha	Sušina	Sušina/ plocha
Kontr. 1	8,1θ	349,37					0,023	7,213
Kontr. 2	10,5	418,89					0,025	9,524
Kontr. 3	9, 99	373,87					0,027	12,913
Kontr. 4	9, 91	362,92					0, 027	9,586
Kontr. 5	9, 82	393,84					0, 025	11,507
						priemer	0,0255	10,149	0,0026
11	11,5	338	3	114	dt		0,0340	6,43	0,0022
12	20,1	742			svetl	bledn.	0,0272	9,82	0,0027
14	9,61	345	1	150	dt		0,0279	11,65	0,0032
16	5,99	234	5	54	svetl	bledn·.	0,0256	12,85	0,0033
17	9,10	314	3	105	dt		0,0290	8,79	0,0025
18	3,78	158	3	75	svetl		0,0239	7,67	0,0018
19	2,98	130	1	70	svetl		0,0229	10,74	0,0025
20	8,33_	296	3	70.. .	svetl	bledn.	0,0281	7,56	0,0021
22.-i	11, '5^í-			-rrrät						ft·
		'iď,^62^	vi t
24.. ;	9,42^	^69· r		AŠU·		52äk£ľsb«
25	15, 9	565	1	170	dt		ύ,0Σ8~2...	9,.51...		4
26	8,07	343	2	155	dt		0,0235	15,37	0,0036
28	11, 7	411	2	65	svetl	bledn.	0,0286	6,90	0,0020
29	11,6	420	1	117	svetl	bledn.	0,0277	3,53	0,0010
31	8,21	307	2	153	dt		0,0267	12,79	0,0034
32	4,03	175	1	70	svetl		0,0230	18,86	0,0043
34	4,81	203	1	107	svetl		0,0237	20,58	0,0049
35	7,86	307	3	130	svetl		0,0256	11, 45	0,0029
36	4,90	206	2	95	svetl		0,0238	22,65	0,0054
37	13, 9	475	1	135	dt		0,0293	4,82	0,0014
38	16, 6	614	1	90	svetl	bledn.	0,0271	3,31	0,0009
39	14, 9	560	1	112	dt	bledn.	0,0267	6,08	0,0016
40	24,5	843					0,0292	9,80	0,0029
41	8,86	343	1	115	dt		0, 0258	2, 93	0,0008
42	6, 93	289	1		dt		0,0240	3,32	0,0008
43	11,3	433	136	135	dt		0,0261	6,73	0,0018
44	10,0	341	2	135	dt		0,0294	6,49	0,0019
45	9, 40	327	2	135	dt		0,0287	8,51	0,0024
46	9,18	284	2	115	dt		0, 0323	15,69	0,0051
						priemer 0,027	9,60	0,0025

dt- divoký typ b3 tabaku (cv.

Samsun NM)

V ý v o .. j p V DI I3 2 ľl t r a n s f o r m a n t n v v skleníku boľl. porovná teľný s tr ansgénnymi. rastlinami p 14031.0111 (ľah. 6).

V transgénnyeh rastlinách pl40G1.010 C 353-133) a pl4031124 (Ρ3--ΊΡΡ) bol analyzovaný nbsab glycidov, eblornfylu, tr ehalézy a škrobu (Obr. 32). Obsab eblorotylu je uvedený v tabuľke ES a.

Tabuľka 6 a

Obsab eh I or ofyl.u v listoch tr ansgénnyeh rastlín PI: IPP N. tabaeum do)

Vzor ka

0111 or o f y I ( m g/g lis tu)

I eno typ l i stu

Kontrol a	1 1,53		divoký typ
Kontr ol a	2 1, 4(1		divoký typ
Kontr o1 a	i i, 4 e;		divoký typ
Kontr t d.a	1 1,53		d i voký typ
Kontrola	..: i, 9 e:		divoký typ
PO IPP 1.2	II, 79		l.i 1ednuti e
PC IPP 22	El, 73		biednu tie
PC TPP 25	ľl, 33		divoký typ
PP IPP 37	E), 33		divoký typ
PP IPP 33	Ľl, 74-		biednutie
......-............—............	---................................................................-........................	..................................	........................................................-................-
Poznámka:	svetelné p o d m i. e n k y	rastu	môžu významne	ovplyvni t
	zistený obsal i ebl or	of ylu.	1 o d n o t y c:: h i o r o f y 1. u	môžu byt
	preto porovnávané 1 e	n pokl.a	ľ ide o rastliny	zozbierané
	a analyzované počas	jedného	pokusu!

l’r fl< lad 3

Izolácia čaeLÍ génu kódujúcich treDalóza.....h f 1ie lá Lsyntázy ze

Sel aginella Ί ep i dopi íyl I a a lleliantbus annuus:

Pri. porovnaní sekvencií TPS pr-oteínu z E. coli a 5\ cer e\/ isiae holá z i stená pr í tomnos Ľ 11 i ekolkýcl i konzer vovanýoti oblasti. Tieto oblasti b o 1.1 použité p r e konštrukciu degenerovaných pr iniérov, ktoré beli. testované p r e PCP ainpl i. f.ikáciu. Ako temp lát bola použitá genómová DNA z. E. coli a kvasiniek. Na uľahčenie anneal i ngu degenerovaných primérov bol použitý POP program s postupne sa meniacou Lepí.o tou medzi annealingom a e!nngačným krokom.

Ir n PI ľ P am p I :i f 1 k á c i. u b o 1 i p o u ž 1 t é s c: L y pr i m é r n v ľ P S d e g 1 /5 a PSdeg 2/5 a cliNA zn Sela^iinel 1 a lepidophylla ako l.emplát.

Použi tú degener ované pr imér y	(kód	11 113) :
1PSdeg1 : 0ΛΥ 11	ľ Al1 100 Pil	0ΛΥ	ΟΛΥ IAY	0A	(SI U	ID MU:	7)
ľPSdeg2: 110 01	1 KÍ 1 IYY 111:	ΑΥΛ	Y o: 01 Í	Ί ΥΟ 0	(SI 0	ID MU:	8)
IPSdegb: OYI Ali	ľ ARP 110 All	OOP	oo o		( Sľ O	10 MU:	0)
POP f r agmenty	s p r e d p o k 1. a d a 11 o u	ve ľl<	:;:li:u	hm 1 i	k1ormvané
sekvencované.	Veľké množ	s L vo	L a l< h. o	zis	kanýel i	hnirmlógny

sekvencií hmle poLnm analyzovaných pomocou Southern blel.u hybridizáciou s genómovou DNA zn Selaginella. Pol i Izolované dva kleny: kloň 3, k l.ordl m sekvenei a je uvedená v 010 10 NO: 42 (kombinácia POP primérov 1/5) a kloň 43, ktorého sekvencie sú uvedené v SI 0 10 MO: 44 (kombinácia POP primérov 2/5), ktoré obsahova l i. oblasti s vysokým percentom podobnosti s gét mm TPS z E. coli a kvasiniek na úrovni aminokyselín.

Jeden fragment TPS génu bol. izolovaný P C P ampI i f ikáclou z Helianthus annuus (slnečnica) pomocou kombinácie primérov TPSdeg 2/5 a genómovej DNA z H. annuus ako templátu. Sekvenčná analýza a Southern blot potvrdila homológiu medzi 1 PS génom z E. coli.

kvasinkami a Selagi nel1 a. s e k v e n c: i a m i E S T (ex p r e s s e d pnzr j ľah. bb a SEQ 10 NOS = hnmn.l égnyeh génov v ryži <1 že v ä e š x n a r a s 11 1 n o t) s a h u. j e / porovnania l.ýehLo sekvencii so seguence tags) z rôznych organizmov, 45-53 a 41, vyplýva pri tom o os Ľ vysoko Arabi clopsis, čo p o d p o r u j e náč objav, gény bomolégne k TES (Obr. 3),

Tabuľka 6b.

dbEST ID.	Genbank	Organizmus	F-Linke i a
35567	D22143	Oryza sativa	TPS
58199	D35348	Caenorhabditis elegans	TPS
60020	D36432	Caenorhabditis elegans	TPS
87366	T36750	Saccharomyces	TPS
35991	D22344	Oryza sativa	TPS
57576	D34725	Caenorhabditis elegans	TPS
298273	H37578	Arabidopsis thaliana	TPS
298289	H37594	Arabidopsis thaliana	TPS
315344	T76390	Arabidopsis thaliana	TPS
315675	T76758	Arabidopsis thaliana	TPS
317475	R65023	Arabidopsis thaliana	TPS
71710	D40048	Oryza sativa	TPS
401677	D67869	Caenorhabditis elegans	TPS
322639	T43451	Arabidopsis thaliana	TPS
76027	D41954	Oryza sativa	TPP
296689	H35994	Arabidopsis thaliana	TPP
ľ2ľ)7478	ÍÍ36783^5? ix
300237	T21695
372119	U37923	Oryza sativa ' '' '	TPP'·' -- —
680701	AA054930	Brugia malayi	trehaláza
693476	C12818	Caenorhabditis elegans	tretia! á za
311652	T21173	Arabidopsis thaliana	TPP
914068	AA273090	Brugia malayi	trehaláza
43328	T17578	Saccharomyces	TPP
267495	H07615	Brassica napus	trebaláza
317331	R64855	Arabidopsis thaliana	TPP
15008	T00368	Caenorhabditis elegans	trebaláza
36717	D23329	Oryza sativa	TPP
71650	D39988	Oryza sativa	TPP
147057	D49134	Oryza sativa	TPP
401537	D67729	Caenorhabditis elegans	trehaláza
680728	AA054884	Brugia malayi	trehaláza
694414	C13756	Caenorhabditis elegans	trehaláza
871371	AA231986	Brugia malayi	trehaláza
894468	AA253544	Brugia malayi	trehaláza
86985	T36369	Saccharomyces	TPP

Príklad 4

Izoláci a rastľlinných génov TPS a TPP z Mi.co Li ana tabacurn:

Časti cDNA k é doj ú o o TPS a Ί P P boľl i. izolované pomocou PCR z c D N A o d v o d e n e j z c e 1 k o v e j R M A z 1 i s t o v . t a b a k u . S11 p e c o z n a C e n ý spojenie v tabulke 7 udáva, é i. bol pre získanie príslušného fragmentu DNA nutný druhý cyklus PCR am p 11 f lká c i. e so súpravou primérov 3 a 4. Priméry sú zahrnuté v zozname sekvencii (Tab. 7). Subklonovanie a následná sekvenčná analýza DNA fragmentov získaných pomocou uvedených súpr av primér ov vykazovali, značnú homológiu so známymi. TPS génmi. (Obr. 4 a 5).

Tabulka 7

Ampľl. i f i.káei a rastlinných TPS a TPP cDNA

nie—

..Iii

825 bp SEQ ID. NO 22 & 23

840 bp SEQ ID NO 18 & 19

630 bp SEQ ID NO 20 & 21

Tre-TPS-14 SEQ ID NO 30

Tre-TPS-14 SEQ ID NO 30

Tre-TPS-14

SEQ ID NO 30

Deg 1 - SEQ ID NO 7

Tre-TPS-12

SEQ ID NO

Tre-TPS-12

SEQ ID NO 31 ano ano

Tre-TPS-13

SEQ ID NO

Deg 5 SEQ ID NO 9

Deg 2

SEQ ID NO 8

Deg 5 SEQ ID NO

TPP“ cDNA	primér 1	primér 2	spojenie
723” bp	Tre-TPP-5	Tre-TPP-16	nie
SEQ ID NO 16 & 17	SEQ ID NO 35	SEQ ID NO 38
543 bp	Tre-TPP-7	Tre-TPP-16	nie
SEQ ID NO 14	SEQ ID NO 36	SEQ ID NO 38
447 bp	Tre-TPP-11	Tre-TPP-16	nie
SEQ ID NO 12	SEQ ID NO 37	SEQ ID NO 38

Príklad 5

Izolácia . jl vo j dielneho. .. .gélltf ,JPS/CfPP

cr/r /^srní-.í

Gel.á dĺžka 1 'PS klonu slnečnice (.H&líanthus annuus) bola získaná pomocou RADE.....PCR technológ i.e na základe údajov o s e k v e n c 1. 1. f r a g m e r 11 u t o h o t o g ŕ; o u .

Sekvenčná analýza celej dĺžky tohoto klonu a vyrovnanie s TPS2 z kvasiniek CObr s 6) a sekvencie kódujúce TPS a TPP ukazujú, že izolovaný kino kóduje bipartitný enzým TPS/TPP ( SEC'J 1D NO: 24, 25 a 28). Izolovaný bipartitný kino CpM0G1192) bol uložený 21. apríla 1997 v Central Bureau for strairi collections podlá pravidiel Budapeštianskej zmluvy pod číslom CBS692.97.

Ilalej sme zisťovali, či aj iné rastlinné druhy obsahujú hlpartitoé klony TPS/TPP. Dvojdielna TPS/ΊPP cDNA bola ampli. fikovaná z tabaku. Po PCR amplif lká e 11. s priinérmi TPS degl/TRE-TPP-18 a spojení s TPS deg2/TRE-lPP-15 CSEO 1D NO: 39) bol delegovaný DNA produkt s predpokladanou veľkosťou (to znamená

1,5 kb) . Rovnaký bánd sa ob javi l po PCR s IPS deg I /ÍRE-Ii ’P.....6 (Sll.)

11) NO: 34) a spojení s TPS deg2/TRE -1 PP - 1.5. Tento dr uhý fragment hybridlzoval s bipar ti. tnou cDNA zo slnečnice v Sou ther n holbe. Dalej bol tiež Identifikovaný b i par ti tný kloň C SI 0 11) NO: 39) z ňrabidopsis v počítačovej databáze.

Príklad 6

Expresia rastlinného génu TPS v rastlinách:

Ďalší dôkaz funkcie TPS génov zo slnečnice a Sej aqit telia el.pl dopitý ll.a bol získaný pri. izolácii zodpovedajúci oh klonov cDNA s plnou dĺžkou a následnej expresii týchto klonov riadenej 35S CaNý promótorom v rastlinách. Akumulácia trehalózy pr i expresii enzýmu zo Seiaptriella popisujú Zentel la a T tur r i aga (I99G) (Plánt Pliysinl . 111, Absbr ak t 88) .

P r íklad 7

Gény kódujúce 1 PS a TPP j jedni >kl í enc I i s tých druluiv:

D počítačovej databáze sekvenei í Gcnebank bulu zistených niekolko ES ľ -sekvenci í z ryže hnmológnych s I PS a IPS2 z kvasiniek (Gl.it . 7), ktoré sú uvedené v zozname sekvenclí (SI ll '10 MG: 41, 51, 52 a 59).

Príklad 8

Izolácia ľudského 1 PS génu :

I PS gén bol z ľudskej cDNA, na k tore j bol.a uskutočnená PGR reakcia pri použití degenerovaný cti TPS pr im ér o v deg2 a deg5 a získaný TPS fragment s predpokladanou dĺžkou 0,6 kb. Sekvenčná analýza a porovnanie s TPS sekvenci ou z kvasiniek naznačuje, že izolovaná sekvencia kóduje homológny TPS proteín (Obr. 8).

Príklad 9

Inhibícia endogénnej expresie TPS aoť i -sense :i nhibíni.ou:

Expr-esia endogénnych génov ÍPS môže 1nhlbovaná anti-sense expr es i ou Immol ógnolio TPS génu riadeného takým i sekvenciami promótora, ktoré opúšťajú expresiu anti-sense 1PS génu v bunkách alebo pletivách, v kťorýob je inhibícia požadovaná. Pre tento ciel sa dáva prednosť sekvencii úplne identickej s potláčaným TPS génom, aj keď nie je nutné exprlmovať celú kódujúcu oblasť v anti-sense expresnom vektore. Zistilo sa, že fragmenty Lej tu kódu jún :o j oblasti. sú tiež funkčné pr i anti.....sense i nhihiel i expresie génu. Ilalčou možnosťou pri anti- sense stratégii je využ i t ie i n: tor ol ógnych génov, ak sú dosťaťočnt: homológne s endogénnym génom.

M a o v e r e 111 e o p · a č 11<; j o r 1 en t á o 1 o k ó d u j ú e 11:: 11 o 1::> I a s t ľ pol.láčanýob vnesených génov je možné použi ť podobné binárni· vektory, ako sú p >140(114 h a pl4l 111 111111. Vše Iky promóťory použiteľné 11 a r 1 a d eni e exp r e sie géoov v e1 e1ových p»I e t i v á t: h sú vbod né a j p r i: aoť i -sense exprosi u génov.

Pr íkl ad I ll f obi bicia endogénnej expr esie 1 PP anti.....seosi.: 1nhlbielou;

Podnboo ako sú konštruované vektory, ktoré môžu byť použiťó oa riadenie anti-sense expresie tps v bunkách a pletivách C P r :í k 1 a d 9 ) , m ô ž u t) y ť k o n š t r u i :> v a o é 11 e ž vek t o r y r 1. a d i a c e a n t i. - s e r i s e exp r e s 1 u g é o o v T P P .

Príklad II

Akumulácia tr oba l úzy v tabakoch divokého typu a rastlinách zemiaku pestovaných na Valldamyeine ft:

Dôkaz prítomnosti, dr áhy biosyritézy trehalózy v tabaku bol získaný pr i li il i i 111 l.iii'.i

P > c s L o vaní i :l i v n k é 11 α í. y p u r a s l. I I n

I. r e 11 u 1 á x y ý a I .i .d a m y s 1 n u za pr ľ ti iinni is L i 111’ ľlšcl.r nií: r ástli ny akumulovali volmi malé množstvo C do 0,1)112 1 % š. dm.) trehalézy.

Akumulácia rastlinách získané v prítomnosti, ak umu l.ovalo lr i j ia I ézy pestovaných nebola nikdy

P> r i p> a d e m i k r o I ί ľ ti z o k z i s í. e n á v k o n L r o 1 n ý c 1, bez Inhibítora. Podobné výsledky boli divokého typu pestovaných v Desať Hnil zo sedemnástich (č.hm.) trehalézy (ľab. 4). ý médiu bez ťal i damyoínu A nebol

A.

Vali.damycínu v pr:i emer e ľ), 00 1% mlk r nh ľúzkacl i indukovaných na zistený žiadny oh sali trehalézy.

P r ikľl ad 12

Akumulácia trehalézy v Lr ansgénnyet i rastlinách zemiaku s génom p r o a- L r o 11 a I.. á z u :

Da l š í dôkaz pr ILomnos l. i endogénnych génov pr e blosyntézu trehalézy bo i získaný tr ans f or máci ou zemiaku divokého typu 35S haliť anti. trehaľl.óza konštr uk tu ( SI tJ ľl T) MO: 54 a bb), pIlOO l.l 127 popísaný vo Wl i 00/21030). ťo výhonkoch Lr aosgénnel u > zemiaku pil) 10 I 027 laoľla z i s. ton.j akumulácia trehalézy do 0,003 7- čerstvej hmotností. Identita piku Lr ehaľlézy bola potvrdená špecifickým štiepením akumulovanej trelialézy enzýme,n Lrebaiázou. ť hľuzách niektorých bransgénnych línii pľilj01.027 bola zist.cná akumulácia malých množstiev trelialézy C (llar . 0).

Príklad 13 ľlľ n 11 i b í e i a a k t i v i t y r a s 11 in n ý c h h e x o k i, i á z t r - e la a 1. é z a - 0 - f o s f á t om :

Regulačné pôsobenie tr etaaléza --6- los fátu i ta hexoklnázovú aktivitu boľlo študované v rastlinných extraktoch meraním hexokinázovej aktivity za prítomnosti či neprítomnosti treba lóža 6 -- fosfátu - Pri analýze extraktov z h lúz zemiaku slúžila fruktóza (Obr. 10, Obr. 11) a glukóza (Obr. 11) ako substrát. Analýza v hľuzách bola uskutočnená podlá Gancedo et al. (1997) J. Biol. Chem. 252, 4443, pri. použití línii 1-0.....P a fruktózy ako substrátu. Na sleduj ú r: e postupy v prípade tabaku, ryže a kukurice boli uskutočnené podľa metódy popísanej v experi.mentá I ne j časti.

ako substrát . 13) .

ako substrát e bola ako

Pri. analýze extraktov z listov tabaku bola fruk tóza C Obr . 12.) a glukóza C Obr·. 12 s Obr

Pri analýze extraktov z listov ryže bola f r u k t ó z a a g Ί. u k ó za C Ob r. 1. 4 ) .

Pri analýze extraktov z listov kuk u r i. c použitá fruktóza a glukóza CObr. 15).

použitá použitá ubstrát

Príklad l/l

Inhibícia aktivity hexnkináz v živočíšnych bunkových kultúrach t r' e 11 a 1 ó z a - 6 -- f n s f á t o m =

Na demonštráciu regulácie hexnk i náz< ive j aktivity v ž i v n č Γ š n y c 1i f) u n k á c h I: > o I i p r i p r a v e n é e x t r u k l. y z m y š a c í r: 1i I iybr i domových bui ikovýcl i kultúr. Aktivita hexnkináz bula stanovená ktoré pripísali liatu :i-:dn e t al . C μ I tybr i dóitu ivýt :h bunkách hol vyvolaný h u 11 k 11 v e j p c Ί. e t y d 11 2 11 % sn c m r é z y desti lovanou vodou. Tento hrubý exl.ral· s t a 1111 v e 11 í 11 e x o ki n á z (5 f I 111 extrakt pr n ti: í nov) .

substrátu pr i |	Odtii i enkacl i.
izr i vyšš í e) .	V myšacích
osmotický šok	umiestením
s i lás 1 i :di lým	( ip.l á( :hl )U L í m
. proteínov Iml	použitý pr i
.t zodpovedalo	asi 266 ug

I a6u ľ ka 8 n I1 i.. 6 ľ c i a ž i. v < j č (š 1t e...i b e x o k i n á z o v e „j ak L i. v i L y í b I ’

S u 1; is t r á t K o n c e 11	.....	1-0 P	Vo		0;,.	Inhibícia
l.r á c .i .a		C m 14)	C ODľJ/min)	(ODO/min)	(%)
C m M)
Glukóza 2		0, 83	0, 0204		0, 01.33	35
Glukóza 2G		0, 83	ti 02 1.4		ľt 0141	35
Glukóza 100		G, 83	ľt 0188		0, 0125	34
ľrukl.óza 20		U, 23	0, 0207		ľt 0205	1
ľrukl.óza 20		0, 43	0, 0287		ľt 0 1 07	25
ľrukl.óza 20		ľ.f 83	0, 0234		0, 0151	35
1 rukl.óza 20		1„ G7	0, 0240		ľt 0 1 33	4 G
11 v i: d enó v ýs1 e dk y	j asi K :	ukazu.	j ú, že	ak l. i vi ta 1 u:xi il< i e	iáz v myšací.
11 u n k 11 v ý c h e x t r a k t o c 11	je i ul	i i l.ii ivai lá	l.r i	;ha 1 óza- G h >s	t á Lom. Pnzs.
ki mci u i l.r ái: i í 1 G	ľt	1 :>r i kLorých	k	i nl i i In c i i	d od ládza.
pi ir ovi ía t.i: ľt lý s	r t )Z:	;al u nu	z i stoným	v hrubých	i r astl.l nnýi

ex l.r ak l.i n :G. I lč i t u iosľ i r il i i I > ľ i: i i: I icxi il< i i táz l.r t 'ba I óza ľt f i isf á l.i nu nezávisí:! a nd l.iilm, či bu l a použitá g l ukóza alebo fruktóza ako !3ubs L r á k .

Fotosyntéza a respirácia u rastlín tabaku expr :.i mu jút: i oh gén pre TPS _a TPP:

Účinok expresie týchto génov na fotosyntézu a respiráciu hni hodnotený v listoch L ransgénny ch rastlín tabaku 35S-TPP C1G1G-5),

PC.....1 PS (. 1310-10 a 1318-37) a tabaku divokého typu Samsun NN .

Meranie bolo uskutočňované v zariadení na meranie výmeny plynov. Rýchlosť výmeny plynov bola vypočítaná na základe rozdielov koncentrácií medzi vstupujúcim a vystupujúcim vzduchom pomocou g η infračerveného annly/áfnra plynov. Fotosyntéza a respirácia hni i merané v rovnakom liete. Pre každú tr ansgénnu rastlinu hni na stanovenie použitý jednak najmladší úplne vyvinutý list (vrchný list) a ďalej .lis.f n 3-4 poseliodle nižšie (spodný list).

Fotosyntéza bola meraná ako funkcia Iolosyntetioky aktívne j svetelnej intenzity (PAR) od f).....975 j mini . m '. s '¹ (900 kláti m“^) štyrikrát pr i (ílkoneeotr áei.áeh 950 vpír a 050 vpili.

Respirácia hni.a meraná punuoiu dvoch rôznych časových meradiel. Merania uskutočňované počas krátkeho obdobia tmy v experimentoch, v ktorých bola meraná fotosyntéza sú v tabulke 9

Vzh ľadom označené RD /načne mení na to, že sa počas obdobia tmy respirácia vyjadrujú tieto hodnoty okamžitú aktivitu. 7. tohoto dôvodu bo l i hodnoty za so b': obdob i e tmy tiež sčí tané, ako ukazuje tabu ľka III (meraní': len pr i 350 vpili lif.).

labuľka

Rýchlosť fotosyntézy a respirácie, STD označuje δ t a n cl a r d r i ú o d c b ý 1 k u

vrel iný	list	350 ppm	950 ppm
μτηοΐ .m'2. s'1	STD	μιηοΐ .m2. s'1	STD
divoký typ	RD	0,0826	0, 048	1,016	0, 142
		EFF	0, 060	0,004	0,087	0, 004
		AMAX	11,596	0, 588	19,215	0, 942
1010-5		RD	0,873	0,060	1,014	0, 134
		EFF	0, 059	0,002	0, 090	0, 007
		AMAX	12,083	1,546	18,651	1, 941
1318-10		RD	0, 974	0,076	1,078	0, 108
		EFF	0, 064	0, 003	0, 088	0,008 j
		AMAX	16,261	2,538	24,154	1,854
1318-37		RD	1,067	0,140	1,204	0, 116
		EFF	0, 061	0,002	0, 084	0, 011
		AMAX	16, 818 ..	2,368	25,174	2,093
			J JJ
' aspodný	iJÉBfet f ’ Ž»*			-------- -
divoký type				0,526
		EFF	0,068	0, 002	0,085	0,004
		AMAX	6, 529	1,271	11,489	1,841
1010-5		RD	0, 455	0,068	0,562	0, 118
		EFF	0,064	0,002	0,085	0, 006
		AMAX	8,527	0,770	13,181	1,038
1318-10		RD	0, 690	0, 057	0, 828	0,086
		EFF	0,064	0, 008	0, 085	0,005
		AMAX	11,562	1,778	20,031	1, 826
1318-37		RD	0,767	0,033	0,918	0, 099
		EFF	0, 073	0,006	0,103	0,004
		AMAX	13,467	1,818	19,587	1,681

bb tabuľka 11)

Respl.r ác: označujc	i a počas 1 .-•hodi nového š tandar dnú odcl iýl k u	obdobi a	tmy (mmol	Hlt,), S
	v rol iný list	SI D	spodný list	STD

di voký typ	25, 1.7	H, 82	J 3, 19	1, 98
101.0-5	38, 29	5, 89	J 3, 88	i, 52
131.8-10	28, 37	4, 58	28, 47	8, 87
131.8.....37	32, 53	2, OJ.	17, 7	1, 83

8 porovi laní s di vokým typom	rast	í í n a rast]	i nam i TPP, je v
pr í páde tr ai isgéi mycí i rastlín	1 PS	r esp i r ác i a :	;pndi lýol i li.s f ov
významne vyššia ako traospiráe	: i a 1 i :	;tnv vrclmýcl	i ( 1 a b . 1.0), čo
11 a z 11 a č u j e i. e h v y š š i. u m e t a la o 1	i okú	aktivitu. Pi	ak 1 c; r espi ráč i c
p o č a s s t a r 11 u f i a 1 i. s f o v j e |. > o d ;	• tablu:	menši v p r í |'k	i d r: i. r a 11 s g é n n y e h
rasti. í o I PS.
1 a k. i s to f - o f 11 s y 111 e f i e k é μ > u r	ainefr i	sa významní	: od 1 išujú medzi
f r ansgéni lym i r as f 1 i nam i 1 PS	na ji	.di ie. j s tr ane	<i i.r ai isgéi iným i

r ast I i i lam í i PP a divokým typom kontrolných rasi.l.in na strane druhé j. Hodnoty AľlAX (maximum fotosyntézy pri nasýtení svetlom), úči unosf fotosyntézy ( EI I ) a rýelilost r espi r áei e počas krátkeho obdobia tmy po meraní fotosyntézy (RD) sú obsiahnuté v tabuľke H. ý pr i.eiuer e sú hodnoty AľlAX v horných 1 i s f oel i tr ansgénnych rastlín 1 PS o 35 % vyššie v porovnaní s tr ansgéiioymi. rastl i nami. TPP alebo divokým typom rastlín. Spodné listy vykazujú dokonca väčšie zvýšenie rýchlosti fotosyntézy (83%).

Aby sa vylúčilo možné ovplyvnenie rýchlosti fotosyntézy rozdielmi. v absorpcii. svetla, bola absorpcia meraná pomocou SPAD-5(12 (Minolta). Žiadne významné rozdiely v absorpcii, neboli zistené (Tab. 11).

Tabu ľka 11

Iliidnuty absorpcie v prípade Lľ ansgénnycl i línií absorpcia vrchný T iel.

spodný list

divoký typ Samsun MN	34	83
1010.....5	34	82
T 3.1 3.....10	85	86
131337	86	86

Príklad 16

Fluorescencia chlorofylu v rastlinách tabaku exprimujúclch gény TPS a TPP:

b T i sto v oni mater i á I i (1010-5), P P -TPS (ISIS 1(1 Sainsun MM bol hodnotený fluorescenciu chl or 1i f y'l u . f l.u or esc ende :

Lr ansgénnych r asLl ľn tabaku 35S.....TPP a 1318-37) a tabaku divokélm typu účinok expr esi e týchto génov i ta Poli mer ané dve ct iarak tér i.st i ky

1) FTP (účinnosť. transportu elektrónov), ako miera rýchlosti transportu elektrónov a tvorby redukčného ekvivalentu

2) nefiítnehemi.eké zhášanie ako miera disipácie energie spôsobené j a k u m u T á c i o u a s im1. T. á t u.

Rastliny boli pestované v skleníku a pr-j.svetlované 103 limol.m '‘'.s'¹ ( 0400 - 2.0:00 h). Deň/noc T -· 21 l'./ltt °C; R. H. i

%. Počas nočnej periódy predchádzajúcej meranie (trvanie 15 Ii), boli dve rastliny od každého genotypu prenesené do tmy a dve rastliny na svetlo (± 430 umol.irr^.s^-1. 2.0 °C, R.H. 70 SO. Ma meranie bol použitý najmladší úplne vyvinutý list na rastline. Ukazovatele fotochemickej účinnosti fotosystéinu 11 (PSII) a nefotochemického zhášania boli stanovené ako funkcia zvyšujúcej h 9 sa svetelnej Intenzity. Pri každej intenzite svetla hnil rastliny stabilizované počas 300 s. Merania holi uskutočňované pri 5, 30,

230, 422 a 704 jiiih> 1.m .....¹ za miiiúlu, 350 ppm 13)._; a 20 / O.·-,. Pri opakovaní experimentu hol i. použilé tie isté r asLl iny a umiesten i e rastlín v tme pred vlastným meraním bolo zamerané oa umiestenie na svetle a naopak. Ukazovatele fluorescencie znázorňuje Obr. 10. Pokles účinnosti. elektrónového transportu (IľTE) hol porovnateloé v prípade rastlín Ί PP a divokého typu. Rastliny TPS reagovali na zvyšujúcu sa svetelnú intenzitu zretelne menej. Tento rozdiel hol najnápadnejší pri. predchádzajúeom vystavení rastlín svetlu. lietu pozorovania sú v zhode s výsledkami neiotoohemiokého zhášania. V por ovnaní s tr ansgénnynri rastlinami 1PP a rastlinami divokého typu, reagovali rastliny TPS jasne menej na dodatočný prísun asi mllátov v dôsledku ožiarenia. V pr ľ páde rastlín IPS bulu významne znížená negatívnu regulácia fotosyntézy akumulujúcimi sa asl.ini i.átml .

Príklad 17 x p o r t a r e x m 1 e s t en i e a e im i ľl á t o v v r a -s 11 i. n á c ľ i t a la a k u expr i mujúei eh gény TPS a TPP:

V transgénnyeh rastl inách tabaku 35S ΓΡΡ ( .1 3 I 0 · 3 7 ) bol. ;; t a nov e n ý ·.

(IIIID S) a

1)

2) export u h ľl í k a t ý c: h a s i. m i. I á t o v z ú p 1. o e (vyjadrujúceho r elatívou aktivitu zdroja, Rev. Plánt Physi o I . Plánt Mol. liiel . 47, 509 čistá akumulácia f otoasl.mi l átov v pletivách aktivita sinku) počas periódy svetla a tmy.

vy v i n u t. é ho ľl. 1 s t u Koeh (1996) Annu.

sinku (relatívou

Vývojové štádium rastlín: kvetné puky práve viditeľné. Použitá technika značenia-, značenie produktov fotosyntézy uhlíkom ^l3C pri ustálenom stave v prítomnosti prebytku uhlíka ¹³C (De Visser et al. (1997) Plánt Peli Environ. 20, 37). V prípade obidvoch genotypov boli. na značenie použité úplne vyvinuté listy ôsmich rastlín počas svetelnej periódy (10 hodín) nasledovanej periódou tmy C J 4 Hodín). Na značenie sa pnužiln 5, I atórn % ' ’C( t.. la značení. boli. rastl iny rozdelené de niekoľkých skúpim ľ) rastový vrchol, 2) mladý rastúc i list, 3) mladý úplne vyvinutý l ist C nad značeným listom), 4) mladá stonka C nad značeným listom), 4) mladá stonka C nad značeným listom), 5) značený list, (>) listová stopka a báza značeného listu, 7) starnúci list, 8) ostatné a staršie listy nižšie položené ako značený list, 9) stonka pod značeným listom 1(1) koreňové špičky. Bola stanovená čerstvá váha, obsah sušiny a percentný obsah uhlíka ' ’C C atóm % ^{1 :i}C) . Okrem základných par ametr ov, ako je b.ioinasa a obsah sušiny, sa vypočítalo: 1) export C zo značeného listu; 2) relatívny prísun importovaného t do jednôt I ivýeli častí rastliny; 3) absolútne množstvo importovaného t do jednotlivých častí rastliny; 4) relatívna distribúcia importovaného t. počas svetelnej |:>er i ódy a cele j totopor i údy.

Hmotnosť nadzemnej časti f r ansgéi myol i rastlín ľl’P bola vyššia o 27 % v por nvnanľ s. tr ansgénmi IPS CP< 9,0(11); tiež koreňový systém l.ýelito rast I í n bol lepšie vyvinutý. V prípade tr ansgénnycl i rasl.l ίο I PP lania zistená významne zmenená distribúcia sušiny v rastline, 39% v liste a ' 11)% v koreni v porovnaní s rastlinami IPS. Rastliny IÍIS mali väčší počet listov, ale menšiu listovú plochu. Celková p toeba listu na rastlinu IPS bola porovnateľná s divokým typom rastliny CH, 4 m’ rastlina¹).

Relatívna aktivita zdroja v prípade úplne vyvinutých listov:

Celková exportná rýchlosť f ntoasim i.látov zo značeného listu je ur čená r elatívnym poklesom % nového C počas noci C v prípade TPP 39 % a v prípade TPS 56 %) a celkovým množstvom viazaného nového C rastline C bez značeného listu). Po svetelnej perióde exportovali listy rastlín TPP 37 % o porovnaní s 51 % prípade rastlín TPS (Tab. 11). V nasledujúcej perióde tmy narástli, tieto hodnoty oa 52 % a 81 %. 0bidve metódy potvrdili, že transgénne r a s ti. i. n y TPS majú v porovnaní s transgénnym i. rastlinami TPP významne zvýšenú rýchlosť transportu produktov fotosyntézy.

Alusolútno množstvo nového t) v šasi. i ad) rastliny:

Export v prípade transgénov TPS bol. významne vyšší v porovnaní s transgénmi TPP. Mladé rastúce listy rastlín TPS Importovali C silnejšie ako mladé listy rastlin TPP.

Relatívne zvýšenie nového C v častiach rastlín: sila sinku:

Relatívny prísun nového t do jednotlivých častí rastlín je znázornený na Obr. 17. Percentná hodnota vyjadruje silu sinku. Významne vyššia sila slnku bola zlstená v prípade transgénov TPS a l.i) najmä v rastových vrcholoch, stonke nad a pod značeným listom a v listovej stopke značeného listu.

ľahu ľka II

Zdrojová aktivita úplne vyvinutého zoačenélio 1. is. tu: akumulácia ( a jiliii export. triková denná akumulácia a export uhlíkatých asi mi lá Lov v značenom listí?: a celej rastline (nadzemná čast) pi > steady state ISO 1aheI ing počas periédy svetla (deň). M 4: hodnoty ISO udávajú významný rozdiel pre P< 11, Oh

Oas	ľ r ai ísgén	Aktivita zdroja v	pr Tpacle rastúceho lis tu
(koni i :c)		nový 0 v zdr o jiivoni lis t e (% eel..... k ovčí m C v liste)	nový b expor tovaný v noci ( % cez deň)	nový b v zdr o jovom liste ( % no vé; li o C v rastline)	eel k o vý ex p! Iľ t b do rast l i i iy (% ee 1kové ho no vého b
Deň	TPS	17, 0	-	48, 7	51.
	TPS	22, b	-	03, 0	37
Deň i- noc	TPS	7, 8	b b	16, b	81
	TPS	13, 8	30	48, 4	52

2, 4 6, 1

LSD 0, 05

Pelal. ívna d j sir ibúe.ia nového C dri „jedni 111 i výi 11 časti rastliny: relatívna sila slnku

I) i sLr i.búc i a viazaného uhlíka medzi. ...jednotlivými. časťam i, r astliny potvr di la vyššie uvedené záver y . V pr ipáde transgénov í PS bol zistený r elatívne väčší expor t aslmilátov do r astového vrcholu, mladých rastúcich listov (cez deň) a dokonca do najstarších listov (bez axilárnych meristémov) a tiež do mladého aj starej stonky.

Príklad 18:

a lát

Pre javy r astlín ša l átu transf ormovaných PP I PS a PP.....I PP ·.

Pre tr ans tiirmái: i u rastlín šalátu boli innužité konštrukty

PP I PS a PP.....1PP. 1 ransgény PP.....I PS bo l i regenernvané na 99 g/1 sacbarúzy. I t a κι typ i ib i d vi nl i Lr ans gén u v I PS a I PP I:h íl i labke nd J fš i teľné od n.lr ans turmi ivane j kontroly; transgény 1 PS mali s.i Ine jšie, Lmavozcl.ené lisLy a trans íorman ty I PP svetlozelené lisLy s hladším okrajom v porovnaní s 1 Istín! knn tr n 1 nýi.i i rastlín.

I xpresla I PS a I PP zreťeľin: nvpl y vni l a mor f i > I óg 1 u l is Lov a na.jvýr azi n: jš1 r: okraje listov. I istý tr ansgénnyel i rasLlín PP- I PS lani i pi n;lsLa Li n; viac zvrásnené ako listy Lrai isgéni iv PP 1 PP, ktorých 'listy boli hladšie a zaobilené (Obr. 19). V listových extraktoch transgénnych línií šalátu lani analyzovaný obsah cukrov škrobu (I Ibr .

29) .

P r í k 1 a d .1 9 : c u k r u v á r e p a

Pr ejav tr ansgénnych rastlín cukr ovej repy PP.....TPS a PC-TPP·.

Pre transformáciu rastlín cukrovej repy boli použité k o n š L r u k t y P P - T P S a P C --1 P F’. F r e k v e n c 1 a t r a n s f o r m á o i. b o 1 a v prípade obidvoch konštruktov TPA s TPP porovnateľná s kontrolami. Fenotyp obidvoch transformantov TPS A TPP bol jasne odlíšiteľný od netransformovaných kontrol; transgény TPS mali. v porovnaní s kontrolou divokého typu Hrubšiu tmavozelené listy a tr ansgény TPP svetlozelené listy s dlhšími. listovými stopkami (Obr . 21). V prípade všetkých rastlín pestovaných v skleníku bol. vo veku asi 8 týždňov meraný priemer guľového koreňa. Niektoré transgénne línie PC 1 PS, k tor ých veľkosť. listov bola porovnateľnú s kontrolou, vykazovali významne väčší priemer guľového koreňa (Obr. 22).

Transgénne línie PC TPP vytvárali v porovnaní s kontrolou divokého typu menší guľový koreň. V listových extraktoch transgénnyeh línií cukrovky bol analyzovaný obsah cukrov a škrobu (Obr. 20).

Príklad 20

Arabi dopsl

Pre jav transgénnyeh r astl ín Arabidopsis PC.....TPS a PC IPP:

Pr e transínrmáeiu r astlín Arabi dopsi s boli. použité kiuišl.rukty PC.....1 PS a PP IPP. Fenotyp obi.dvoeh tr ans f or man tov 1 PS a

I PP bo l jasne od 1 í ši. teľný nd kontr o l d i vokého typu; t.r ansgény 1 PS mali v porovnaní s knnLrnlnu divokého tyi'U hrubšie Lmavozelené listy a Lr ansgény IPP väčšie b i e I e listy.

Pást I iny s vyššou Hladinou expresie IPP nevyLvárali semená.

Príklad 21.

Zemiak:

Prejav transgénnyeh rastlín Solanum tuberosum nesúcich konštrukt pre TPS a TPP:

Konštrukt: 35S TPS pľ10G799

Transgénne rastliny pl*IOG799 boli pestované v skleníku a bol. stanovený ich výnos hľúz (Obr. 23). Väčšina transgénnyeh rastlín mala v porovnaní s kontrolou divokého typu menšie listy. Hmotnosť hľúz zozbieraných z rastlín s menšími lietmi bola v porovnaní s kontrolou divokého typu nižšia (Obr. 25).

Konštrukt: 3bS-ľPP pl4OG 1.010 a PC TPP pl40G 11 24

Transgénne rastliny s pl40G1010 a pl40G1124 boli pestované v skleníku a bol stanovených ich výnos;; hľúz. Výnos; hľúz (Obr. 24) bol porovnateľný a.l.e b n nižší ako v prípade kontroly divokého typu (Obr. 25).

Konštr uk t ·. PC.....I PS pl40G1 093

	1 r ansgéi me	r a s; ti iny	s p14031lť	13 bo:	1.1 p e	:stt ivané	v	skleníku a
l.x j.I	stanovený i. c	b výnos; hl	ľúz. Hmotnosť. 1	ď ú z	bol a vyš	ši ,·	i v prípade
nie	1<(i ľkýcb tr an	sgénnyi :h	1 í ni í.	k t or ýeb	v e ľkoe.Ľ	11	s to v b n l,i
P or	uvnateľná s	l< on br i d nu	d i v oké 1 io	t y r-u	((1 f	:) a týe	b.	ktoré mal i
l.r ucl ia tmavšie	1 i e;ty ( Obr . 23) .	V	pr Ír	>ade rast	1 Íl	t s; menšími
1 i s	.tmi akn knnl.r	nla (113)	bol zisti	;ný n	i. ŽŠÍ	výnos; ITT	ú z .

Knnštr uk t . Pa t I PP ρΙ4Ο3 I120

V exp.l an tá t ovej kultúre tr ansgénnyeh rastlín pat IPP boli v in v i t.ľ 11 indukované m i kruh ľúzky. Pr i emer ná čerstvú hmotnosť, vytvorených mikruhľúzok bola v porovnaní s kontrolnými líniami ľ > n d s t a t n e n i ž š i a .

Knnštr uk t

Pat.....1 PS pl4OGO45

Transgénne rastliny pl4OG845 boli pestované v skleníku a bol stanovený ich výnos; hľúz. Zistenú hmotnosť, hľúz bola v prípade troch tr ansgénnyeh línií vyššia v porovnaní s; kontrolnými líniami (Obr. 27).

Konštrukt: PC TPS Pat TPS; pl40G1129 (045-11/22/20)

Rastliny exprimujúce súčasne PC TPS si Pat-TPS boli vytvorené retrans;formáciou Pat 1 PS línií (rezistentných voči kanamyeínu) knnčtr uk Ι.ηιιι μ1*11 II t .1.121 ·), kl.nrý i absalaoval konštrukt. PG TPS a markerový gén |:>r <: r ex i stenči u k hygrnniyc ľnu, za vzniku genotypov pl40G11.29 (841, i. 1), μ,141.)81.J 29 (845 22) a pl4l )G 1.1 29 (845 28). Výnos hľúz sa pohyboval, od ni::i n:.i.niáli id ,o až po výnos porovnateľný alebo vyšších ako výnos kontrolných rastlín.

Príklad 22

Tabak:

Pr e jav Lr ansgér iných rastlín M. tabaeum nesúci cl, konštrukty TPS a 1 P P :

kt ir t :Elt tvý sys tŕíia ľransgénne rastliny 959 ( μ, 141 IG 799 ) b o I i μ > e s t n v a n é v stanovená tesne prcd začiatkom kvitnutia línie 141)1)11)18 bola zistená

IPP (pľlOGÍGI D) alebo 959 T PS skleníku. Velkosľ. koreňov bola V prípade Lransgénnej väčší a/irieošia veľko;;Ľ.

významne kor ooov ako v pr ír>ade transformantu pl40G799 a kontroly divokého typu.

l/p/yp nxpr / i t: /ES a ΓΕΕ na kv i i. t tu L· i c:

ľransgénne rastliny t a la a l< u 95S ľ PS, P G.....1 PS, 91 ,S IPP a PG-TPP boli r>cstnvané v skleníku. Rastliny s vysokým stupňom expresie I PS génu rástli významne poma lšie v por ovnan í s kontrol ou divokého typu. Výsledkom oneskoreného kvitnutia a senescenolo spodných listov týchto rastlín bol fenotyp stále zelených inak ba žne starnúcie b I istia v. Pästi i ny s vysokou hladinou expresie TPP génu nevytvárali, žiadne kvety, alebo tvorili aberantné nedokonale vyvinuté kvetné puky, v dôsledku čoho boli sterilné.

Vplyv expresie 7~PS a 777-’ na Lvurbu. semien

Transgénne rastliny t a k, a k u 35S-TPS, PC-TPS, 35S-TPP a PG-TPP boli. pestované v skleníku. Rastliny s vysokou hladinou expresie

TPP génu vytvárali. kvety málu alebo vnhee žiadne a netvorí I1 semená.

Vplyv expresie TPS a TPP _na kPíčenie semien

Transgénne r astliny Tabaku 35S TPP ( pľlOb.ltllb) alebo PC 1PP boli pestované v skleníku. Niektoré transgénne línie s nízkou hladinou expresie transgénu vytvárali kvety a semená. Počas klíčenia semien SI generácie bola významne znížená frekvencia klíčenia (alebo bolo klíčenie inhibované) v porovnaní so semenami Sľl. v prípade kontroly divokého typu Clab. 12).

Tabuľka 12

Kl.íCenie semien transgénnych rastlín 35S-TPP

Variant	zbelení, e	Rel. (TPP mRNA)	Klíčenie
1010-2	h	15. 8	oneskorené
1010-3	....	5, 3	oneskorené
101.0-4	·+·	4, 2	oneskorené
I 01.0-5	“1	6, 2	o neskoro ié
1010.....6	·+	3, 9	oneskor ei lé
1 01.0 7		2, 8	oneskor oné
I010.....H	-1	6, 5	oneskorené
1010-9	·+·	4, 6	oneskor ei ič
'1.0 1 0- 10	....	1, 9	normálne
-.11)10 - .1.1	...	5, 7	i mriná I ne
1(111)1 2	-1	1, 4	m iriná 111<:
HI HI 14	...	11, 1	normál t ie
11)1.1) 1 5	....	0, 3	i mr má 1 ne
III Hl-18	1	tu b	oi leskor i :i ié
101.0 20	..|.	6, 4	oi ie: iknrei ié
1111 11-21	I-	9, 5	oi mskor e i lé
1010-22	1	8, 8	nie
1.1)1(1-23	-	4, 5	normálne
I 01.0 - 24	....	::i..o, 2	oneskorené
1010-25	....	4, 7	o n e s k o r e 11 é ( m e n e j)
HIHI.....27	-	4, 8	normálne
1(.)10-29		22, .1	oneskorené
1.010-31		9, 4	oneskorené (menej)
1.010-32	...	0, 3	o n e s k o r e n é (men e j)
1010.....33	-1-	14, 7	oneskorené

Vplyv oxprecíe TPS resp. TPP na výrtos semieti

Pre transgénne rastliny pľlIJG Tlllll-b v generácii Si. bol stanovený výnos semien. Priemerný výnos semien transgénnycl i rasti.in pľlOGlOlO5 bol. 4, ‘3 g na rastlinu <n-8), zatiaľ čo v prípade kontroly divokého typu 7,8 g na rastlinu (n^S). Zistená hmotnosť tisíc semien v prípade línie pl*IOG1.01ĽI--5 bola 0, 06 g a 0,08 g v prípade kontroly Samsun NN. Príčinou týchto výsledkov môže byť. znížený export cukrov zo zdrojových listov vedúcich k slabému rozvoju pletív sinku..

y a	mor f olég i a
1 PC	TPP boli
h rast	1 Íri PC.....TPS
ichýmu.	k torý t n > 1
.i i:dm.j.e	h vrstiev
IPP a	kontr ol y
to Z1 S	Lenia sú v
kde	tr ansgéi u:

rastlinami TPP a

Vplyv expresia TPS a 7PP na mor ľolťr^i.u listu

Segmenty tr ansgénr rych rastlín tabaku PC-IPS, PC-TPP a kontroly divokého typu pestovaných v skleníku bol i ľi.xovani:, zaliate dn živice a na rezoch bnl..j pomncnu svetelnej mi . kr oskopj e študované bunkové štruktúry. Punkové štruktúry a morfológia pozor ovanú na r ezoch transgéinlych rastl ín por« ivi inteľi ιό s kontrnlou. Na rczncli Lransgén bol i pozorované zmeny v morfológii hubového par enehýmu, ktorý bol v pr ľ páde týchto trans formantov zložený zo sjednij.ch vrstiev buniek, zatiaľ čo v prípade transf ormantov TPP a kontroly divokého typu len z troch vrstiev C Obr. 23).

súlade s našimi predchádzajúcim pozorovaní línie rastlín TI ’S vytvárali. v porovnaní k o r 11 r o 1 o u h r u b δ 1 e a Ľ u h š i e 1 i s; t y .

Príklad 23

Juh :i.b í c i a r: h 1 a d o v é h o s 1. a d nu t i a e x p r e s i o u t r e h a 1 é z a f os f á t s y n t á z o u :

ľransgénne rastliny zemiaku (Solanum tiherosum cv. Kardal) boli vytvorené vnesením TPS génu riadeného patatínovým promótorom špecifickým pre hľuzy CpľlOG845; Príklad 1). Transgénne rastliny a kontroly divokého typu boli pestované v skleníku a ich hľuzy zozbierané. Vzorky hľúz pre analýzu cukrov boli odobrané jednak bezprostredne po zbere a potom po ich šesťmesačnom skladovaní pri

Η ^c’(.‘. Výsledky HPLC--PEI.) analýzy sú zobrazené na (Jbr . 30. Výsledky jasne ukazu jú, že transgénne rastliny zemiaku s génom TPS_E. _co j. majú nižší celkový obsah cukrov (glukózy, fruktózy a sacharózy) v hľuzách bezprostredne po zbere. Po šiestich mesiacoch skladovania pri. 4 ‘’C bolo zvýšenie obsahu rozpustných cukrov významne nižšie v prípade transgénnych línií v porovnaní s kontrolnými., líniami., divokého typu.

Príklad 24

Zlepšenie prejavov transgénnych rastlín tabaku 35S TPS a 35S TPP (pl*IOG851) v podmienkach s tresu vyvolanom suchom s

Transgénne rastliny boli vytvorené vnesením obidvoch génov f PS a TPP z /ľ. coli ovládaných promótorom 35S ľľaľlV. Expresia génov TPS a ΓΡΡ v takto získaných líniách boJ a potvrdená pomocou Northern blufu a meraním aktivity enzýmov. V prípade pl*IOG851- 2 0,1)110 mg . g ¹ ľn 11 a akumu I ár: i a é . I im tr cl ia I ózy pľll )00h I h tmia akumulácia 0,09 mg. g' š . I im . ľ xpr es i a génov mala zrejmý vplyv na v podmienkach stresu suchom. Keď v stresových podmienkach vyvolaných sušiny ho l v prípade otri dvoch prípade obi.dvocl i a r as L mor ŕológiu rastlín hmli rastliny pestované i íedos ta f kom vody, ohsal i tr ansgénnyeh 1 í.ni í vyšší v prípade pľlUGRb J.-2 o 20 % ( p< (1,111.) a v pr ípade pl*IOG851-h o 39 % (P< 11,1)01) ako v |:>r í páde kontrolných rastlín tabaku divokého typu. Zvýšený obsah sušiny hol spôsobený predovšetkým zvýšenou produkciou listov: obsah sušiny v listoch v prípade pľlUľi851.-5 bol vyšší až o RS %. Žiadne významné rozdiely neboli zistené pri. dostatočnom zásobení rastlín vodou.

Stres vyvolaný suchom - experimentálna čast'

V experimentoch bolí P r im á r n y e h t r a n s f o r m a n t o v (1.997) F’lant Physlol. 1.1.3, .1.0 min v 20% komerčnom použité Fl. semená získané samoopelením pl*IOG851.-2 a pľlOG851.-5 (Goddijn et al. 1.81) . Semená boli sterilizované počas b í e 1 i d 1 e, o p 1 á c hn u t é p ä Ľ l< r á t s t e r 11. n o u vodou a vysiate na médium s polovičnou koncentráciou podľa

Murasfri ge-Skooga obsahujúce U) g. I......¹ sacharózy a :1 Of.) mg.I' ¹ kanamyc Triu. Semená SRJ. divokého typu lani i i. vysiate na platne bez kanainyi :íi iu. Po dvoch týždňoch boli. rastliny všetkých línií presadené do pôdy (piesočnaté zeminy) a pestované v kultivačnej miestnosti pri. 22 ^,::’O, intenzite svetla pr ibližne 1.00 uE .m^-“ a J 4 h dňa. Všetky rastliny boli pestované v rovnakom množstve pôdy v črepníkoch s objemom 3,8 1. Rastliny boli denne polievané živným roztokom podľa Hoaglanda s polovičnou koncentráciou. Semenáčiky pMOGOSl-2 a pM0G851-5 rástli, o niečo pomalšie ako semenáčiky tabaku divokého typu. Vzhľadom na to, že siiir považovali za dôležité začať experimenty v rovnakej vývojovej fáze rastlín, vyvolali sme vo všetkých líniách stres suchom pr i rovnakej výške semenáčikov (JU cm), v rovnakej vývojovej fáze rastlín (4 listy) a rovnakej sušine (stanovené v dvoch ďalších rastlinách pre každú líniu). 1U znamená, že stres suchom l:ml v prípade rastlín pMOGBbl--2 začatý o dva dni neskôr a pMlfGBl > I h n sedem dní neskôr ako v prípade kontroly divokého typu. V každej línií bolo suchu vystavených šesť rastlín a štyri ras l.l i ny lani i pestované pr i dostatočnom zásobení vodou ako kontroly.

lahaky di.vnkého typu l:m'l i vystavené suchu Lak dlho, dokiaľ i mdo:; i.al il i hodu vädí iu l. i a : keď zvädnutí':, rastliny boli zaliate spodné polovine listov bol i takým množstvom živného roztoku, až npäĽ získali Ľurgur. V praxi to znamenalo zaliatie rastlín bil ml živného roztoku každé tri dni, kontroly holi. polievané denne, aby mali dostatočnú zásobu vlahy. Rastliny pMíJGBbl. -2 a pl*IOG851h holi. potom zalievané presne rovnakým spôsobom ako rastliny divokého typu, to znamená boli zalievané rovnakým množstvom živného roztoku a v rovnakých Intervaloch ako rastliny divokého t y p u. P u č ac: e 1 é 11 o s 1 e d o v a n é h o o ti d o ti i a ti o 1 a p r a v i d e 1 n e m e r a n á výška stonky. Všetky rastliny holi zozbierané rovnaký deň (32. deň po začatí ošetrenia v prípade rastlín divokého typu), pretože by zber transgénnych rastlín p o r o v n á v a n i e .j e <::l n o 11 i v ý c h Γ.Ι í n i í m e r a n á c e 1. k o v á 1is tovej p1ochy v neskoršom štádiu komplikovalo rastlín. Pri tomto odbere bola zariadenia na meranie Ďalej bola stanovená i s t o v á p 1. o c h a p o m o c o u Delta-T (Santa 01ara, OA) čerstvá hmotnosť a obsah sušiny v listoch, stonkách a koreňoch.

Hli

Aby sa stanovil osmotický potenciál rastlín, bol uskutočnený druhý experiment v podstate rovnakým spôsobom. Po 35 dňoch stresu suchom boli na začiatku svetelnej periódy odobrané vzorky z najmladších úplne vylnutých listov <n~3).

Vysychanie oddelených listov na vzduchu

Vo veku štyroch týždňov bola u rastlín pl*IOG851-2, pl*10G85X---5 ci rastlín divokého typu dobre zásobených vodou meraná strata vody z vysychajúcich oddelených listov. V prípade každej línie rastlín bolo meranie uskutočnené na piatich rastlinách. 7. každej rastliny bolí odohrané dva najmladšie úplne vyvinuté listy a sušené pri 2b % relatívne j vlhkosti vzduchu. Po 32 hodinách bola pre každý list stanovená čerstvá hmotne isť. V dobe experimentu boli odobrané vzorky z porovnateľných listov dobre zásobených vodou, aby mohlo byľ. uskutočnené meranie: usmot i ckéhi i potenciálu a stanovený obsah r i izpustnýcl i oukr ov .

Mcr aule osím/t i.e:k'F:ht > puteru : i Λ! u

Vzorky lisLnv pre stanovenie e: mu it i okého potenciálu tmi i ihneď po odobraní zmrazené na suchom ľade v uzatvorených Injekčných striekačkách s objemom I ml. Tesne pred analýzou bola šľ.ava z listov vytlačená do malej skúmavky, pr etrepaná a použitá pre nasiaknutie papierového ter číka. l isrnot i oký potenciál bol potom stanovený v komôrke Wesoor C52 s pomocou Ulescor HR-33 mi krovoltmetra na stanoveni e rosného bodu.

Fluorescencia chlorofylu

Fluorescencia chlorofylu v prípade rastlín divokého typu, pl*IUG851-2 a pl*IOG851-5 bola v prípade každej línie meraná po 211 dňncli sucha pomocou pulzného modulačného fluorometra (ΡΑΙΊ) CWalz, Ef ľeltrich, Nemecko) . Pred vlastným meraním boli. rastliny ponechané v tme počas dvoch hodín, potom jednu hodinu na svetle: a potom jednu hodinu na svetle: a potom bol najmladší úplne vyvinutý list adaptovaný v tme 20 minút. Na začiatku každého merania hol zapnu tý slabý mer ací sve telný lúč ¢(1,(15 umní . nr. s ¹ modulovaný pri 1,5 Kllz) a bola meraná minimálna hladina fluorescencia CF_O). Maximálna hladina fluorescencie (F_m) bola potom meraná pri aplikácii, saturačného svetelného pulzu s 4880 umní . m''^;?. s”¹ počas 888 ms. Po ďalších 2.0 s, keď signál, poklesol takmer na I j>, krátke sa tur ačné pulzy ak ti.nl okého svetla (trvajúce 888 ms, 4880 jimol. m . s ') boli opakovane aplikované počas 80 d v o . j s. e l< u n d o v ý m i in t e r v a I m 1.. Z1 o ž k y f o t celiem i r:: k é h o a ne f o tocheml ckéhei 0¼.) zhášania boli odšltané z v y j a i J r u j ú e e j p r i e b eh f 1 u or e s c: en e i e

S S (dol krivky podľa čase ľíi 11 liar Mor denkamp f a Oguist (1883). V dobe merania listy neboli viditeľne zvädnuté. S ta ti s ti oké výsledky boli. získané pomocnú jednoeestnej anal ýzy vari and e a pr ogr amu Mumber Hruncher Štatistioal System (Dr. 1.1 . Ilintze, 885 Pasl. 488 Nor ti i, Kaysville, III 84(137, USA).

Pr i ana l ýze í I unre; ;cend e chlorofylu rastlín s tr esovaných l:n11 n z i stenč I >r ornou I i vo j í ;i.K i n im pi mier (I _v/l ,n) vyššie fotochemické zhášanie (g_o) a vyšší fluor escencie k maximálne j f I uor eseenc i i pr í pude rastlín 1141158515, oo svedčí n vyšše j efektivite I otosynteti okého apar á tu (ľab. 13).

Tabuľka 13

Parametre f f uoreseet id c i Id orol y Iu v rastlinách divokého typu (dt) a tr ansgénnyi :l i rasti ináoh tabaku akumulu júc i eh trehalúzu (|.>I4118851. 2., p14118851. 5). Hodnoty P (pravdepodobnosti) boli. získané bosínm ANÓDA analyzujúcim rozdiely medzi. líniami. rastlín a v podmienkach sucha f r a n s g é 11 ny m i. 1 í ri i. a m i p r 1 d o s t a t k u vody pestovanými. v dostatku vody (kontrola) a ďalej rozdiely medzi. jednotlivými a divokým typom rastlín pestovanými a v podmienkach sucha. F„, t maximálna fluorescencia, F_v premenlivá íl unr eseeneia (I,., ..... F'_ol = g_o: fotoehemleké zhášanie, g,:_S::

ne fotochemické zhášanie. F_rn a F_v vyjadrené v bezr ozmernej jednotke (mm záznamu).

			DT	pMOG851-l	pMOG851-5	8-51-2/DT	815-5
Fm	kontrola	174,4	180,4	175, 6	ns	ns
sucho	151, 5	155,7	167,8	ns	0,0068
P (kontr. sucho)	0,0004	0,0000	ns
	Fv	kontrola	134, 6	143,3	142,8	ns	ns
sucho	118, 4	122,1	135,6	ns	0,0011
P (kontr. sucho)	0, 006	0,0000	ns
u-
•	Fv /Fm	kontrola	0,771	0,794	0, 813	0, 059	0,0052
sucho	0,782	0, 784	0, 809	ns	0,0016
P (kontr. sucho)	ns	ns	ns
Qe ľ\i *·· *?· -	kontrola	15,2	23, 8	29,9	0,259	0,0085
sucho	25, 4	21, 6	23, 5	ns	ns
P (korrtr. š ú ~			7£._·
Λ-—f
		kontrola	91,3	92,4	90,4	ns	ns
qo	sucho	73,69	78,5	92,75	ns	0,0005
		P (kontr. sucho)	0,005	0,006	ns

Analýza cukrov

V dobe odberu obsahovali rastliny pl*IOG851-5 0,2 mg.g^-1 č.hm. trehalózy, zatiaľ, čo v pl*IOG851~2 a rastlinách divokého typu bola hladina trehalózy pod detekčným limitom ako v stresujócich, tak aj v nes t r esu j čiel ch podmienkach. Obsah trehalózy v rastlinách pľlOG851-5 bol v stresovaných nestresovaných rastlinách porovnateľný <0,1.9 a 0,20 m g. g^-1 sušiny). Pri dostatku vody hladiny glukózy a fruktózy boli v rastlinách pl*IOG851-5 dvojnásobné oproti, divokému typu. b listoch stresovaných rastlín phť)G851-5 bola zistená trojnásobná hladina všetkých štyroch neštrukturálnych cukrov škrobu, sacharózy, glukózy a fruktózy oproti listom stresovaných rastlín divokého typu. b listoch rastlín p 1*106851-2 sa hladina cukrov, rovnako tak, ako aj hodnôt fluorescencie, významne nelíšila od hodnôt zistených v divokom type. b stresovaných rastlinách všetkých línií bol nameraný zvýšený obsah glukózy a fruktózy v porovnaní s nestresovanýml rastlinami.

Osmotícký potenciál rastlín stresovaných suchom a kontrolných rastlín:

Počas druhého podobného e x p e r im e n t u v s k 1. e n í k o v ý o h podmienkach vykazovali, transgénne rastliny rovnaký fenotyp, ako už bolo popísané vyššie, a opäť. v prípade rastlín pl*IOG851-5 bola redukcia rastu pri strese suchom ovela menšia ako v prípade PP10G851.-2 a rastlín divokého typu. Osmotícký potenciál v listoch r.a s 11 í n pjj 06 8.51 -5,^g.t r es o yjjjýgb sugU&ia _ Wiíti

-významne

í-1, 00 ±0^ 08 Pípali v

TÍScľhoťy Wi -Mpa). J áÄsSBES'' óódy bol osmotícký potenciál rastlín pl*IOG851-5 (-0,79 ±0,05 ťlpa) významne nižší (P=0, 038) ako v listoch rastlín divokého typu (-0,62 ±0,03 Pípa) a listoch rastlín pťlOG851-2, kde dosahoval stredné hodnoty (-0,70 ±0,01. hpa) .

Usychanie oddelených listov

Listy rastlín p1*106851-2, pPI06851-5 a divokého typu boli oddelené a po 32 hodinovom vysychaní, bola meraná ich čerstvá hmotnost. Listy rastlín pl*IOG851~2 a pl*IOG851-5 strácali významne menej vody (P< 0,05) ako listy rastlín divokého typu j po 32 hodinách pP106851-5 a pP10G851-2 mali. 44 % a 41 % percent ich východiskovej čerstvej hmotnosti v porovnaní s 30 % v prípade divokého typu. b dobe experimentu boli tiež odoberané vzorky z porovnateľných listov dostatočne zásobených vodou s cieloin stanovenia osmotického potenciálu a analýzy trehalózy, sacharózy, glukózy a fruktózy.

Obidve transgénne línie mali nižší osmotický potenciál, ako rastliny divokého typu <P< 0,05); najnižší, vodný potenciál (-0,63 ±0,03 Mpa) bol zistený v prípade pM0G851-5, najvyšší (-0,51 ±0,02 Mpa) v prípade rastlín divokého typu a stredné hodnoty (-0,57 ±0,04 Mpa) dosiahol v prípade pMCG851-2. Obsah všetkých sledovaných cukrov bol. významne vyšší v listoch pl*10G851-5, kde dosahoval, v porovnaní s listmi divokého typu, trojnásobné hodnoty v prípade všetkých štyroch cukrov (P=0, 002). Rastliny pM0G851-2 obsahovali dvakrát vyššiu hladinu všetkých štyroch cukrov (P-Q, 09). Obsah trehalózy v rastlinách pMOG851-5 bol 0, 24±0, 02 mg.g^-3 sušiny, v rastlinách pľlOG851-2 a rastlinách d i v o kého typu p o d d e t e k č n ým 1. im i t oni .

Príklad 25

Prejav SÍÍCbhni :

’PrTmärne tra_r)šTormänt.y““dPS ä IPP' a kontroly diVôkéliótvpil b o 1i s t res o vané su c hom. N aj prv dos i a h1i bo du v ä d nu t i a tr ansgé nne línie TPP, potom kontrolné rastliny a napokon transgénne rastliny TPS. Ma základe tohoto výsledku je možné usudzovať, že transgénne línie TPS, rovnako ako bolo pozorované v prípade iných rastlinných druhov, sú v podmienkach stresu vyvolaného suchom jasne vo výhode oproti rastlinám TPP a rastlinám divokého typu.

Príklad 26

Ovplyvnenie vybiehania rastlín transgénnych línií šalátu PC--TPS a PC-TPP =

Vybiehanie šalátu bolo v prípade transgénnych rastlín PC-TPP znížené (Tab. 14). Transgénne línie PC-TPS vybiehali v porovnaní, s kontrolami divokého typu viac.

Tabulka 14

Vybiehanie rastlín šalátu
PC-TPP	Celkový	1.	2.	3. 4 .	5.
línia	počet	Nor-	Zní-	Vidí- Nožná	Úplne
	rastlín	málne	žené	telné fas-	vegetatívne
		vy -	vy-	kvit- clá-
		bie-	bie-	nutie cla
		b a nie	b a n i. e
1A	4				4
2A	3			1	2
3A	2	2
4A	5	1	1	1 2
5A	5		1	1	3
7A	1		1

12Ä kontrola 5

Príklad 27

Prejav transformácie rastlín rajčiaku TPS a TPP:

Pre transformáciu rajčiaku boli použité nasledujúce konštrukty: 35S TPP, PC-TPP, PC-TPS as-trehaláza, PC-TPP, E8-TPS, E8-TPP, E8 TPS E8 as-trehaláza. Transgénne rastliny nesúce TPP gén riadený plastocyanínovým promótorom a 35S promótorom mail podobný fenotyp, ako bol pozorovaný u iných rastlín: zbelenie listov, redukovaná tvorba kvetu alebo ich absencia vedúca k p r o d u k c 11. m a 1 ý c h p 1 o d o v a 1 e ti o k i c ti a b s e n c 1 i , M i e k o 1 k o transgénnyeh línií 35S-TPP vytváralo extrémne veľké plody. Tieto plody mali značne zväčšený perlkarp. Transgénne rastliny nesúce TPS gén riadený plastocyanínovým promótorom a promótorom 35S nevytvárali malé kopljovité listy. Niektoré silne zakrpatené rastliny tvorili, tmavozelené listy. Transgénne rastliny PC-TPS a PC-as-trehaláza tvorili menšie a tmavšie listy ako kontrolné rastliny.

Farba a okraje listov rastlín TPS a TPP, kde sú riadené promótormi 35S alebo PC, boli. jasne rozpoznateľné rovnako ako u o s t a t o ý o b p 1 o d í n .

Rastliny nesúce TPS a TPP gény riadené promótorom E8, ktorý je špecifický pre plod, nevykazovali, žiadne odchýlky fenotypu v porovnaní, s plodmi rastlín divokého typu.

Transgénne rastliny E8 TPS E8 as-trehaláza tvorili, aberantné plody so žltou šupkou, ktoré nedozrievali.

liii—dW:

alebo TPS =

Konštrukty: 35S as-trehaláza (pľlOG1027) a 35S as-trehaláza Pat

TPS C PN0G1027C845-11/22/28))

Rastliny exprimujúce súčasne 5S as-trehalázu a pat-TPS boli vytvorené retransformáciou pat-TPS líni í C rezistentných ku kanamycínu) konštruktom pľl0G1027 obsahujúcim konštrukt 35S as-trehaláza a markerový gén pre rezistenciu k bygromyeínu, za vzniku genotypov pľl0G1027 (845-11), pľl01027 (845-22) a

014081827 (845-28). ľlikrohľúzky holi. indukované in vitro a bola stanovená ich čerstvá hmotnosť. Priemerný výnos mikrohľúzok vyjadrený ich čerstvou hmôtnostou bol vyšší v prípade t r a n s g é n n y c (ί 1 í n i. í o b s a h u j ú e i. c h p 1*1 OG1G 27 ( p ľl OG845-11/22/28) .

Čerstvá hmotnosť mikrohľúzok získaných z transgénnyeh línií pľl0G1027 bola oproti kontrole divokého typu len slabo zvýšená. Takto získané rastliny holi vypestované v skleníku a bol stanovený výnos hľúz (Obr. 33). Transgénne línie 35S as-trehaláza alebo v kombinácii 35S as-trehaláza a pat-TPS tvorili významne viac hmoty hlúz v porovnaní, s kontrolnými líniami. Pri analýze škrobu nebol zistený žiadny rozdiel v obsahu škrobu v prípade línií s vyššími výnosmi (Obr. 34). Veľký počet línií 1.027( 845-1.1/22/28) tvoril hľuzy z axilárnych pukov nad povrchom pôdy, čo svedčí o silnom vplyve použitých konštruktov na vývoj rastlín. Línie transgénnyeh rastlín len s 35S as-trehaláza nevytvárali hľuzy nad povrchom pôdy.

Konštruk ty: Pat as-trehaláza (pl*10G1028) a Pat as-trehaláza Pat TPS (pľlOG1028(845-11/22/28))

Rastliny exprimujúce súčasne Pat as-trehaláza a Pat-TPS boli vytvorené retrarisf orináciou pat-TPS línií (rezistentných ku kanamycínu) konštruktom pM0G1.028 obsahujúcim konštrukt Pat ^trehalto

Q§45-28) .

vynos FľTúz (Obr.' 35) ľNiekoľko Iransgénnych „Línii pTTUG'lOz*tí tvorilo významne viac hmoty hlúz v porovnaní s kontrolnými líniami. Výnos hlúz jednotlivých transgénnyeh rastlín Pat TPS a Pat as-trehaláza bol rôzny a pohyboval, sa od takmer nulového výnosu až po výnos porovnateľný alebo vyšší, ako bol zistený v prípade línií kontroly divokého typu (Obr. 35).

Ko n š t r u k t: P G a s -1 r e h a ľl. á z a ( p ľl 0G1092 )

Transgénne rastliny pľlOG1092 holi pestované v skleníku a bol. stanovený výnos hlúz. Niekolko línií, tvorilo tmavšie zelené listy ako kontrola. Výnos hlúz bol v porovnaní s kontrolou divokého typu významne vyšší (Obr. 36).

Konštrukt: PG as-trehaláza PC-TPS (pl*IOG1130)

Tr ansgénne rastliny pľlOG113D boli pestované v skleníku a bol stanovený výnos hľúz. Niekoľko Hnil tvorilo malé tmavozelené listy a malo silne zakrpatený vzrast, éo svedčí o silnejδem účinku súčasnej expresie génov TPS a as-trehaláza oa fenotyp rastlín (pozri Príklad 21). Výnos hľúz sa pohyboval od takmer nulového výnosu až po výnos významne vyšší ako výnos kontrolných rastlín (Obr. 37).

Príklad 29

Overexpresia cDNA trehalázy zo zemiaku v prípade N-tabacum:

Konštrukt: de35S CaľlV trehaláza CpľlOG1078)

Fenotyp primárnych transformantov pt*l0G1078 bol odlišný od fenotypu tabaku divokého typu. Niektoré traosgény mali tmavozelené a hrubšie listy (morfológia listov nebola kopijovitá), čo ukazuje na vplyv expresie génu pre trehalázu na metabolizmus., r as UXn._; n l- _e r.*gn4'n_?

Bendelovýgfc zákon^ŕ_; - ní ‘a-⁵

Uloženie

Na základe budapeštianskej dohody boli kTony uložené 21. apríla 1997 v Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, P.O. Box 273, 3748 AG Baarn, The Netherlands a boli označené nasl.edujúcim spôsobom ·.

LsdTeri ch i a col

DH5alpha/pl*IOG1192	G B S	692.97
D H S a 1 p h a / p ľl C 3G 12 4 0	CBS	693.97
DHSalpha/pľlOG1241	CBS	694.97
DHSalpha/pl*IOG1242	CBS	695.97
DHSalpha/pľlOG'1243	CBS	696.97
DHSalpha/pľlOG1244	CBS	697.97
DH5alpha/pľlOG1245	CBS	698.97

y

U1 o ž e n é k 1. ony:

PM0G1192	obsahujúci vloženú v	TPS/TPP bipartitnú cDNA z Helianthus annuus
multi-copy	vektore:	pGEM-T (Promega).
PM0G1240	obsahujúci	TPS 825	h p	cDNA	fragment	z tabaku	vložený
	v pCRscri.pt	C S t r a t a g e: n e ) .
PM0G1241	obsahujúci	TPS ”840	tip	cDNA	fragment	z tabaku	vložený
	v pGEM-T (Promega).
PM0G1242	obsahujúci	TPS 630	bp	cDNA	fragment	z tabaku	vložený
	v pGLM-T CPromega).
PM0G1243	obsahujúci	TPP 543	b p	cDNA	fragment	z tabaku	vložený
	v p G t. M - T C P r om e: g a ) .
PM0G1244	obsahujúci	TPP 723	tip	cDNA	fragment	z tabaku	vložený
	v a plJCl.8 plazmid.
PM0G1245	obsahujúci	TPP 447	1 b	P f r;	a gm e: n t z	tabaku	vložený

v pGEM-T C Pr omega).

Zoznam prstelušigýclv^OfKÍtt^^^DHS^^l^gv

1. Binárne vektorye

PMOG23

PM0G22 pVDH 275

PM0G402

PMOG800

Binárny v e k t or C c a . 1.0 K b ) o b s a h u j ú c: i s e 1 e k č n ý m a r k e r MPTII

Derivát pM0G23, kde: NPTII-gén bol nahradený génom HPT pre rezistenciu k bygromycínu

Binárny vektor odvodený od pM0G23, obsahujúci plaštocy ani nový promótor- nos terminátor v expresnej kazete: Derivát pMOG23, bodová mutácia MPTII génu bola opravená, v polylinkéri nie je reštrikčné miesto KpnI Derivát pMOG4D2 s opraveným miestom KpnI v polylinkéri

2. Expresné konštrukty TPS/TPP

pMOG	799	35S-TPS-3’nos1
pMOG	810	ten istý s l-l y g markerom
pMOG	845	Pat-TPS-3’PotPlIT

pľlOG	925
pľlOG	851
PľlOG	1010
PľlOG	1142
pľlOG	1093
PľlOG	1129
pľlOG	1177
pVDH	318
pľlOG	1124
pVDH	321
pľlOG	1128
PľlOG	1140
pľlOG	1141
3. Trehal
PľlOG	1028

ten Istý s Hyg markerom

35S-TPS-3'nos 35S-TPPCatg)^a de35S CaľlV amv leader TPPCgtg) PotPilI ten istý s llyg mar k e r oni

Plastocyanin- TPS-3’nos ten Istý s Hyg markerom

F³1 a s t o c y a n in - T P S - 3' P o t P i TI 3' n o s identický s pľlOG1177 funkčne identický s pľ!0G1093

PI. a s t o e y a n in - T P P C g t g ) 3' F³1 o P i II 3' n o s identický s pľlOG'11.24

Patatin IPP(gtg) 3'PotPilI

E8-TPS-3’nos

E8-TPPÍgtg)-3’PotPilI hy g r omy uxrju

pW’wr ’ten istý s F-íyg markerom pľlOG 1092 Plastocyanin— as trehalase—3’nos

P ľl OG 113 0 P1 a s t o c y a n i n - a s t r e h a 1. a s e - 3 ’ n o s F³1. a s t o c y a n 1 n - T P S - 3' n o s pľlOG 1153 E8-TPS-3'nos E8-as trehalase-3’PotPilI ¹ Všetky konštr ul< ty obsahujú selekčný mar ker NPTII, ak nie .je uvedené niečo iné

Dva typy TPP konštruktov boli použité tak, ako to popísal Goddijn et al. (1997) Plánt Physlol. 113, 181.

Zoznam sekvencií

Cl) Všeobecné informácie:

C i) Žiadateľ.:

( A ) l^vl e n o : 14 OG E M 1 n t e r n a t i o n a 1 n o (B) Ulica: Einsteinueg 97

CC) 14 e s t o : L e i d e n

CD) Kra j i na: Holandk sk o C E) PSČ CZIP): 2333 CB

C F) Telefón: 071-5258282 CC) Telefax: 071-5221471 (11) Názov vynálezu: Regulácia metabolizmu zmenou hladiny t r e h a 1 ó z y - 6 - f o s f á t u ( i i 1) P o ó e t s ekv e n c i í ·. 5 7 (iv) Forma vhodná pre počítačové spracovanie:

(A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: ΪΒΙ4 PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-D0S/I4S-D0S ( D ) S o f t ui a r e: Pat e n 11 n R e 1 e a s e # 1. 0 „ V e r s i o n # 1.2 5 C EPO) (vi) P r e d c hádzajóce ú daj e o žiadost it (A) Číslo žiadosti: EP 96.201.255.8 ( B ) Dát um r e g 1. s t r á c i e : 3.5.199 6 (vi) P r e d c íi á d za. j ó c e ú d a „j e o ž i ra d o s t i :

--------- 2^ A>

... — < λ . —t'™-. ... ľ . '-c4Ši-<A5.....číslo' žjmčjosTr......LP ~ (B) Dátum registrácie: 29.8.1996 (2) Informácie o SEQ ID NO: 1:

( i ) C h a r a k t e r i s t i k a s e k v e n c i e :

(A) Dĺžka: 1450 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: dva ( D ) T o p o 1 ó g i a: 1 i n e á r - n a (ii) Typ m o1ek u1y: DNA (genómov á) (ii i) Hypotetický: Nie ( 1. x ) VI a s t n o s t i:

(A) l4eno/KTúč: CBS (B) Umiestenie: 21..1450 (xl.) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 1:

’atäaaactct ccccgggacc atg act atg agt cgt tta gtc gta gta tct

Met Thr Met Ser Arg Leu Val Val Val Ser

10

AAC CGG ATT GCA

CCA CCA GAC GAG CAC GCC GCC AGT GCC GGT GGC CTT

Asn

Arg íle Ala

Pro 15

Pro Asp

Glu His

Ala 20

Ala Ser Ala

Gly Gly 25

Leu

GCC

GTT

GGC

ATA

CTG

GGG

GCA

CTG

AAA

GCC

GCA

GGC

GGA

CTG

TGG

TTT

Ala

Val

Gly

íle

Leu

Gly

Ala

Leu

Lys

Ala

Ala

Gly

Gly

Leu

Trp

Phe

30

35

40

GGC

TGG

AGT

GGT

GAA

ACA

GGG

AAT

GAG

GAT

CAG

CCG

CTA

AAA

AAG

GTG

Gly

Trp

Ser

Gly

Glu

Thr

Gly

Asn

Glu

Asp

Gin

Pro

Leu

Lys

Lys

Val

45

50

55

AAA

AAA

GGT

AAC

ATT

ACG

TGG

GCC

TCT

TTT

AAC

CTC

AGC

GAA

CAG

GAC

Lys

Lys

Gly

Asn

íle

Thr

Trp

Ala

Ser

Phe

Asn

Leu

Ser

Glu

Gin

Asp

• .

CTT

60 GAC

GAA

TAC

TAC

AAC

65 CAA

TTC

TCC

AAT

GCC

70 GTT

CTC

TGG

CCC

GCT

Leu

Asp

Glu

Tyr

Tyr

Asn

Gin

Phe

Ser

Asn

Ala

Val

Leu

Trp

Pro

Ala

75

80

85

90

TTT

CAT

TAT

CGG

CTC

GAT

CTG

GTG

CAA

TTT

CAG

CGT

CCT

GCC

TGG

GAC

----------

Phe.

JíjsíTyr

^Arg. ,Leu - Asp .Leu -Val

egAsitt

.. .

bftaSäH

Áh·

146

194

242

290

338

·., ciy ť^ Leú^Kŕg^Íľ.ÄŽn.ľAlLh^rT^atľ-Su XTaSŽn Mffe r.dau..T.;fli,ij.BňfíŕÄflUi 110 115 120

TTG CAA GAC

GAT GAC Asp Asp

ATT íle

ATC íle

TGG Trp 130

ATC CAC GAT íle His Asp

TAT CAC CTG TTG

CCA Pro

434

Leu

Gin

Asp 125

Tyr

His 135

Leu

Leu

TTT

GCG

CAT

GAA TTA

CGC

AAA

CGG

GGA GTG AAT

AAT

CGC

ATT

GGT

TTC

482

Phe

Ala 140

His

Glu Leu

Arg

Lys 145

Arg

Gly Val Asn

Asn 150

Arg

íle

Gly

Phe

TTT

CTG

CAT

ATT CCT

TTC

CCG

ACA

CCG GAA ATC

TTC

AAC

GCG

CTG

CCG

’ 530

Phe 155

Leu

His

íle Pro

Phe 160

Pro

Thr

Pro Glu íle 165

Phe

Asn

Ala

Leu

Pro 170

ACA

TAT

GAC

ACC TTG

CTT

GAA

CAG

CTT TGT GAT

TAT

GAT

TTG

CTG

GGT

578

Thr

Tvr

Asp

Thr Leu 175

Leu

Glu

Gin

Leu Cys Asp 180

Tyr

Asp

Leu

Leu 185

Gly

TTC

CAG

ACA

GAA AAC

GAT

CGT

CTG

GCG 'TTC CTG

GAT

TGT

CTT

TCT

AAC

626

Phe

Gin

Thr

Glu Asn 190

Asp

Arg

Leu

Ala Phe Leu 195

Asp

Cys

Leu 200

Ser

Asn

CTG

ACC

CGC

GTC ACG

ACA

CGT

AGC

GCA AAA AGC

CAT

ACA

GCC

TGG

GGC

674

Leu

Thr

Arg

Val Thr

Thr

Arg

Ser

Ala Lys Ser

His

Thr

Ala

Trp

Gly

205 210 215

AAA GCA TTT CGA ACA

GAA GTC TAC CCG ATC GGC ATT GAA CCG AAA GAA. '

722

Lys Ala 220

Phe Arg

Thr

Glu

Val 225

Tyr

Pro

íle

Gly íle 230

Glu

Pro

Lys Glu

ATA GCC

AAA CAG

GCT

GCC

GGG

CCA

CTG

CCG

CCA AAA

CTG

GCG

CAA CTT

770

íle Ala

Lys Gin

Ala

Ala

Gly

Pro

Leu

Pro

Pro Lys

Leu

Ala

Gin Leu

235

240

245

250

AAA GCG

GAA CTG

AAA

AAC

GTA

CAA

AAT

ATC

TTT TCT

GTC

GAA

CGG CTG

818

Lys Ala

Glu Leu

Lys

Asn

Val

Gin

Asn

íle

Phe Ser

Val

Glu

Arg Leu

255

260

265

GAT TAT

TCC AAA

GGT

TTG

CCA

GAG

CGT

TTT

CTC GCC

TAT

GAA

GCG TTG

866

Asp Tyr

Ser Lys

Gly

Leu

Pro

Glu

Arg

Phe

Leu Ala

Tyr

Glu

Ala Leu

270

275

280

CTG GAA

AAA TAT

CCG

CAG

CAT

CAT

GGT

AAA

ATT CGT

TAT

ACC

CAG ATT

914

Leu Glu

Lys Tyr

Pro

Gin

His

His

Gly

Lys

íle Arg

Tyr

Thr

Gin íle

285

290

295

GCA CCA

ACG TCG

CGT

GGT

GAT

GTG

CAA

GCC

TAT CAG

GAT

ATT

CGT CAT

962

Ala Pro

Thr Ser

Arg

Gly

Asp

Val

Gin

Ala

Tyr Gin

Asp

íle

Arg His

300

305

310

CAG CTC

GAA AAT

GAA

GCT

GGA

CGA

ATT

AAT

GGT AAA

TAC

GGG

CAA TTA

1010

g^'VGGC •yse ACG — Giy -**p ^urhr^»pgpt?wyyy--Tyr^,,Eťia^Fgg?ťT.in Hl s ťňu jtsp’MTgr 'Lyg~cw

335 340 345

CTG ATG

AAA Lys

ATA TTC CGC TAC TCT GAC GTG GGC TTA GTG

ACG Thr 360

CCA CTG

1106

Leu

Met

íle Phe 350

Arg Tyr

Ser

Asp 355

Val

Gly

Leu

Val

Pro

Leu

CGT

GAC

GGG

ATG

AAC

CTG

GTA

GCA

AAA

GAG

TAT

GTT

GCT

GCT

CAG

GAC

1154

Arg

Asp

Gly

Met

Asn

Leu

Val

Ala

Lys

Glu

Tyr

Val

Ala

Ala

Gin

Asp

365

370

375

-

CCA

GCC

AAT

CCG

GGC

GTT

CTT

GTT

CTT

TCG

CAA

TTT

GCG

GGA

GCG

GCA '

1202

Pro

Ala

Asn

Pro

Gly

Val

Leu

Val

Leu

Ser

Gin

Phe

Ala

Gly

Ala

Ala

380

385

390

AAC

GAG

TTA

ACG

TCG

GCG

TTA

ATT

GTT

AAC

CCC

TAC

GAT

CGT

GAC

GAA

1250

Asn

Glu

Leu

Thr

Ser

Ala

Leu

íle

Val

Asn

Pro

Tyr

Asp

Arg

Asp

Glu

395

400

405

410

GTT

GCA

GCT

GCG

CTG

GAT

CGT

GCA

TTG

ACT

ATG

TCG

CTG

GCG

GAA

CGT

1298

Val

Ala

Ala

Ala

Leu

Asp

Arg

Ala

Leu

Thr

Met

Ser

Leu

Ala

Glu

Arg

415

420

425

ATT

TCC

CGT

CAT

GCA

GAA

ATG

CTG

GAC

GTT

ATC

GTG

AAA

AAC

GAT

ATT

1346

íle

Ser

Arg

His

Ala

Glu

Met

Leu

Asp

Val

íle

Val

Lys

Asn

Asp

íle

430

435

440

ÁAČ CAC TGG CAG GAG

TGC TTC ATT AGC GAC CTA AAG

CAG ATA GTT Čcď

’ 1394

Asn

His

Trp Gin 445

Glu

Cys

Phe

íle 450

Ser

Asp

Leu

Lys

Gin íle Val 455

Pro

CGA

AGC

GCG

GAA

AGC

CAG

CAG

CGC

GAT

AAA

GTT

GCT

ACC

TTT

CCA

AAG

1442

Arg

Ser

Ala

Glu

Ser

Gin

Gin

Arg

Asp

Lys

Val

Ala

Thr

Phe

Pro

Lys

460 465 470

CTC TGC AG 1450

Leu Cys

475

C 2) Informácie o SEQ ID NO:

2:

<i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 476 aminokyselín C B) Typ: aminokyselina <D) Topológia: lineárna

Cii) Typ molekuly: proteín (xi) Popis sekvencie: SEO ID NO: 2:

---- j

Asp žílu _HisAla ¥»! Ofrr'IIl tiuu'Oln 20 25 30

Ala

Leu Lys 35

Ala

Ala Gly Gly

Leu Trp Phe Gly Trp Ser Gly Glu Thr

40

45

Gly

Asn

Glu

Asp

Gin

Pro

Leu

Lys

Lys

Val

Lys

Lys

Gly

Asn

íle

Thr

50

55

60

Trp

Ala

Ser

Phe

Asn

Leu

Ser

Glu

Gin

Asp

Leu

Asp

Glu

Tyr

Tyr

Asn

65

70

75

80

Gin

Phe

Ser

Asn

Ala

Val

Leu

Trp

Pro

Ala

Phe

His

Tyr

Arg

Leu

Asp

85

90

95

Leu

Val

Gin

Phe

Gin

Arg

Pro

Ala

Trp

Asp

Gly

Tyr

Leu

Arg

Val

Asn

100

105

110

Ala

Leu

Leu

Ala

Asp

Lys

Leu

Leu

Pro

Leu

Leu

Gin

Asp

Asp

Asp

íle

115

120

125

íle

Trp

íle

His

Asp

Tyr

His

Leu

Leu

Pro

Phe

Ala

His

Glu

Leu

Arg

130

135

140

Lys

Arg

Gly

Val

Asn

Asn

Arg

íle

Gly

Phe

Phe

Leu

His

íle

Pro

Phe

145

150

155

160

Pro

Thr

Pro

Glu

íle

Phe

Asn

Ala

Leu

Pro

Thr

Tyr

Asp

Thr

Leu

Leu

165

170

175

Glu

Gin

Leu

Cys

Asp

Tyr

Asp

Leu

Leu

Gly

Phe

Gin

Thr

Glu

Asn

Asp

180

185

190

Arg

Leu

Ala

Phe

Leu

Asp

Cys

Leu

Ser

Asn

Leu

Thr

Arg

Val

Thr

Thr

195

200

205

Arg

Ser

Ala

Lys

Ser

His

Thr

Ala

Trp

Gly

Lys

Ala

Phe

Arg

Thr

Glu

210

215

220

Val

Tyr

Pro

íle

Gly

íle

Glu

Pro

Lys

Glu

íle

Ala

Lys

Gin

Ala

Ala

225

230

235

240

Gly

Pro

Leu

Pro

Pro

Lys

Leu

Ala

Gin

Leu

Lys

Ala

Glu

Leu

Lys

Asn

245

250

255

Val

Gin

Asn

íle

Phe

Ser

Val

Glu

Arg

Leu

Asp

Tyr

Ser

Lys

Gly

Leu

260

265

270

Pro

Glu

Arg

Phe

Leu

Ala

Tyr

Glu

Ala

Leu

Leu

Glu

Lys

Tyr

Pro

Gin

275

280

285

His

His

Gly

Lys

íle

Arg

Tyr

Thr

Gin

íle

Ala

Pro

Thr

Ser

Arg

Gly

290

295

300

Asp

Val

Gin

Ala

Tyr

Gin

Asp

íle

Arg

His

Gin

Leu

Glu

Asn

Glu

Ala

305

--..

T.-~-

310

-'Λ

315

320

-Gly ^jA»g>«Ile--Asw*©iy-tys-T^e^^^^^ JWP^cnenviigL

	T Tľ't	As»'	GlnMtós-^PhetiAsp·* 340			-------
•Tyx-			345			By s·	350		Äľy 1
Tyr	Ser	Asp	Val Gly Leu Val	Thr	Pro	Leu	Arg Asp	Gly	Met	Asn	Leu
		355		360				365
Val	Ala	Lys	Glu Tyr Val Ala	Ala	Gin	Asp	Pro Ala	Asn	Pro	Gly	Val
	370		375				380
Leu	Val	Leu	Ser Gin Phe Ala	Gly	Ala	Ala	Asn Glu	Leu	Thr	Ser	Ala -
385			390				395				400
Leu	íle	Val	Asn Pro Tyr Asp	Arg	Asp	Glu	Val Ala	Ala	Ala	Leu	Asp
			405			410				415
Arg	Ala	Leu	Thr Met Ser Leu	Ala	Glu	Arg	íle Ser	Arg	His	Ala	Glu
			420		425				430
Met	Leu	Asp	Val íle Val Lys	Asn	Asp	íle	Asn His	Trp	Gin	Glu	Cys
		435		440				445
Phe	íle	Ser	Asp Leu Lys Gin	íle	Val	Pro	Arg Ser	Ala	Glu	Ser	Gin
	450		455				460

Gin Arg Asp Lys Val Ala Thr Phe Pro Lys Leu Cys 465 470 475

9B

C2) Informácie o SEO ID NO: 3:

C i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 835 párov báz C B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: dva (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (genómová) (iii) Hypotetický: Nie (ix) Vlastnosti:

(A) ľleno/Kľúč: CDS (B) Umiestenie: 18..818 (xi) Popis sekvencie: SEO ID NO: 3:

ATAAAACTCT

ATG ACA GAA CCG TTA ACC GAA ACC CCT GAA CTA j 50

Met Thr Glu Pro Leu Thr Glu Thr Pro Glu Leu f

10

TCC GCG AAA TAT Ser Al© Lys Tyr

.........15

CAT

-=*—íle Lys^rtr-His ---------3T5----

40

GGA CTA Gly Leu

CAG Gin

CTA CTG GCA ACC GCA AGT GAT GGT

GCA TTG GCA

TTG Leu

ATA íle

194

Leu Leu

Ala

Thr Ala 50

Ser

Asp

Gly

Ala 55

Leu

Ala

45

TCA

GGG

CGC

TCA

ATG’ GTG

GAG

CTT

GAC

GCA

CTG

GCA

AAA

CCT

TAT

CGC

242

Ser

Gly

Arg

Ser

Met

Val

Glu

Leu

Asp

Ala

Leu

Ala

Lys

Pro

Tyr

Arg

60

65

70

75

TTC

CCG

TTA

GCG

GGC

GTG

CAT

GGG

GCG

GAG

CGC

CGT

GAC

ATC

AAT

GGT

. 290

Phe

Pro

Leu

Ala

Gly

Val

His

Gly

Ala

Glu

Arg

Arg

Asp

íle

Asn

Gly

80

85

90

AAA

ACA

CAT

ATC

GTT

CAT

CTG

CCG

GAT

GCG

ATT

GCG

CGT

GAT

ATT

AGC

338

Lys

Thr

His

íle

Val

His

Leu

Pro

Asp

Ala

íle

Ala

Arg

Asp

íle

Ser

95

100

105

GTG

CAA

CTG

CAT

ACA

GTC

ATC

GCT

CAG

TAT

CCC

GGC

GCG

GAG

CTG

GAG

386

Val

Gin

Leu

His

Thr

Val

íle

Ala

Gin

Tyr

Pro

Gly

Ala

Glu

Leu

Glu

110

115

120

GCG

AAA

GGG

ATG

GCT

TTT

GCG

CTG

CAT

TAT

CGT

CAG

GCT

CCG

CAG

CAT

434

Ala

Lys

Gly

Met

Ala

Phe

Ala

Leu

His

Tyr

Arg

Gin

Ala

Pro

Gin

His

125

130

135

482

GAA GAC GCA TTA ATG ACA TTA GCG CAA CGT ATT ACT CAG ATC TGG ČČA

Glu

Asp

Ala

Leu

Met

Thr

Leu

Ala

Gin

Arg

íle

Thr

Gin

íle

Trp

Pro

140

145

150

155

CAA

ATG

GCG

TTA

CAG

CAG

GGA

AAG

TGT

GTT

GTC

GAG

ATC

AAA

CCG

AGA

Gin

Met

Ala

Leu

Gin

Gin

Gly

Lys

Cys

Val

Val

Glu

lle

Lys

Pro

Arg

160

165

170

GGT

ACC

AGT

AAA

GGT

GAG

GCA

ATT

GCA

GCT

TTT

ATG

CAG

GAA

GCT

CCC

Gly

Thr

Ser

Lys

Gly

Glu

Ala

íle

Ala

Ala

Phe

Met

Gin

Glu

Ala

Pro

175

180

185

TTT

ATC

GGG

CGA

ACG

CCC

GTA

TTT

CTG

GGC

GAT

GAT

TTA

ACC

GAT

GAA

Phe

íle

Gly

Arg

Thr

Pro

Val

Phe

Leu

Gly

Asp

Asp

Leu

Thr

Asp

Glu

190

195

200

TCT

GGC

TTC

GCA

GTC

GTT

AAC

CGA

CTG

GGC

GGA

ATG

TCA

GTA

AAA

ATT

Ser

Gly

Phe

Ala

Val

Val

Asn

Arg

Leu

Gly

Gly

Met

Ser

Val

Lys

íle

205

210

215

GGC

ACA

GGT

GCA

ACT

CAG

GCA

TCA

TGG

CGA

CTG

GCG

GGT

GTG

CCG

GAT

Gly

Thr

Gly

Ala

Thr

Gin

Ala

Ser

Trp

Arg

Leu

Ala

Gly

Val

Pro

Asp

220

225

230

235

GTC

TGG

AGC

TGG

CTT

GAA

ATG

ATA

ACC

ACC

GCA

TTA

CAA

CAA

AAA

AGA

Val

Trp

Ser

Trp

Leu

Glu

Met

íle

Thr

Thr

Ala

Leu

Gin

Gin

Lys

Arg

240

.jjo

530

578

626

674

722

770

-GAA Glu Asn Asn

CCGGATTGCA CCTGCAG 835

270 (2) Informácie o SEČI ID NO: 4:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 272 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna

Cii) Typ molekuly: proteín (xi) Popis sekvencie: SEČI ID NO: 4:

Met 1

Thr

Glu

Pro

Leu 5

Thr

Glu Thr

Pro

Glu 10

Leu

Ser

Ala

Lys

Tyr 15

Ala

Trp

Phe

Phe

Asp 20

Leu

Asp

Gly Thr

Leu 25

Ala

Glu

íle

Lys

Pro 30

His

Pro

Äsp

Gin

Val 35

Val

Val

Pro

Asp

Asn 40

íle

Leu

Gin

Gly

Leu 45

Gin

Leu

Leu

Ala

Thr 50

Ala

Ser

Asp

Gly

Ala 55

Leu

Ala

Leu

íle

Ser 60

Gly

Arg

Ser

Met

Val 65

Glu

Leu

Asp

Ala

Leu 70

Ala

Lys

Pro

Tyr

Arg 75

Phe

Pro

Leu

Ala

Gly 80

Val

His

Gly

Ala

Glu 85

Arg

Arg

Asp

íle

Asn 90

Gly

Lys

Thr

His

íle 95

Val

His

Leu

Pro

Asp 100

Ala

íle

Ala

Arg

Asp 105

íle

Ser

Val

Gin

Leu 110

His

Thr

Val

íle

Ala 115

Gin

Tyr

Pro

Gly

Ala 120

Glu

Leu

Glu

Ala

Lys 125

Gly

Met

Ala

Phe

Ala 130

Leu

His

Tyr

Arg

Gin 135

Ala

Pro

Gin

His

Glu 140

Asp

Ala

Leu

Met

Thr 145

Leu

Ala

Gin

Arg

íle 150

Thr

Gin

íle

Trp

Pro 155

Gin

Met

Ala

Leu

Gin 160

Gin

Gly

Lys

Cys

Val

Val

Glu

íle

Lys

Pro

Arg

Gly

Thr

Ser

Lys

Gly

165 170 175

T3ô

205

Val

A.sn 210

Arg

Leu

dy

Gly

Met 215

Ser

Val

Lys

íle

Gly 220

Thr

Gly

Ala

Thr

Gin 225

Ala

Ser

Trp

Arg

Leu 230

Ala

Gly

Val

Pro

Asp 235

Val

Trp

Ser

Trp

Leu 240

Glu

Met

íle

Thr

Thr 245

Ala

Leu

Gin

Gin

Lys 250

Arg

Glu

Asn

Asn

Arg 255

Ser

Asp

Asp

Tyr

Glu

Ser

Phe

Ser

Arg

Ser

íle

*

260 265

C2) Informácie o SEQ ID NO: 5:

C i) Charakteristika sekvencie: C A) Dĺžka: 27 párov báz C B) Typ: nukleová kyselina CC.) PoCet reťazcovjeden CD) Topolúgia: lineárna

Cii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: Nie (xi) Popis sekvencie: SEČI ID NO: 5:

AAGCTTATGT TGCCATATAG AGTAGAT 27 (2) Informácie o SEO ID NO: 6:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 29 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: .jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: Nie (xi) Popis sekvencie: SEO ID NO: 6:

GTAGTTGCCA TGGTGCAAAT GTTCATATG (2) Informácie o SEO ID NO: 7:

(i) __Charakteristika

.....- -

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: Nie (iii) Antisence: Nie (xi) Popis sekvencie: SLO ID NO: 7:

GAYITIATIT GGRTICAYGA YTAYCA (2) Informácie o SLO ID NO: 8:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 2Q párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: Nie (iii) Antisence: Nie (xi) Popis sekvencie: SEO ID NO: 8:

TIGGITKITT YYTICAYAYI CCITTYCC

100 (2) Informácie o SEQ ID NO: 9:

C i) Charakteristika sekvencie:

C A) Dĺžka: 22 párov báz (B) Typ-, nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: jeden

CD) Topolúgia: lineárna

Cii) Typ molekuly: cDNA

Ciii) Hypotetický: Nie C iii) Aritisence: Nie

Cxi) Popis sekvencie-. SEQ ID NO·. 9-.

GYIACIARRT TCATICCRTC IC

C2) Informácie o SEO ID NO: 10:

C i) Charakteristika sekvencie:

CA) Dĺžka: 743 párov báz C B) Typ: nukleová kyselina CC) Počet reťazcov: dva ____ __. C P) ToPľ>lÓ9ia.:... r .Ί t -gT'HajpaLe^^rTŕλ ľ¹ 'fijSBBjžBBjjSSjjÍBBiBBBMiBBIBBBBMBBBBBHMBSjSSreS>X··-1 -t t

—......c vi >«šipevochf

CA) Organizmus: Homo sapiens

Cix) Vlastnosti:

C A) ľleno/KIúč: CDS

	Cxi)	CB) Umiestenie: 1..743 CD) Ďalšie informácie:	/čiastočná NO: 10:
Popis sekvencie:	SEO	ID
GAC	GTG ATG	TGG ATG CAC GAC TAC	CAT	TTG	ATG GTG TTG CCT ACG TTC 48
Asp 1	Val Met	Trp Met His Asp Tyr 5	His	Leu 10	Met Val Leu Pro Thr Phe 15
TTG	AGG AGG	CGG TTC AAT CGT TTG	AGA	ATG	GGG TTT TTC CTT CAC AGT 96
Leu	Arg Arg	Arg Phe Asn Arg Leu 20	Arg 25	Met	Gly Phe Phe Leu His Ser 30
CCA	TTT CCC	TCA TCT GAG ATT TAC	AGG	ACA	CTT CCT GTT AGA GAG GAA 144
Pro	Phe Pro 35	Ser Ser Glu íle Tyr 40	Arg	Thr	Leu Pro Val Arg Glu Glu 45

101

ΑΤΑ CTC AAG GCT TTG CTC TGT GCT GAC ATT GTT GGA TTC CAC ACT TTT ’ 192 íle Leu Lys Ala Leu Leu Cys Ala Asp íle Val Gly Phe His Thr Phe

55 60

GAC TAC GCG AGA CAC TTC CTC TCT TGT TGC AGT CGG ATG TTG GGT TTA 240

Asp Tyr Ala Arg His Phe Leu Ser Cys Cys Ser Arg Met Leu Gly Leu

70 75 80

GAG TAT CAG Glu Tyr Gin

TCT AAA AGA GGT TAT ATA GGG TTA GAA TAC Ser Lys Arg Gly Tyr íle Gly Leu Glu Tyr

90

ACA GTA GGC ATC AAG ATT ATG CCC GTC Thr Val Gly íle Lys íle Met Pro Val

100 105

GGG ATA Gly íle

TAT GGA CGG Tyr Gly Arg

288

CAT ATG GGT CAT ATT His Met Gly His íle 110

GAG TCC ATG AAG AAA CTT GCA GCG AAA GAG TTG ATG CTT AAG Glu Ser Met Lys Lys Leu Ala Ala Lys Glu Leu Met Leu Lys

115 120 125

AAG CAG CAA TTT GAA GGG AAA ACT GTG TTG CTT Lys Gin Gin Phe Glu Gly Lys Thr Val Leu Leu

130 135

336

GCG

Ala

CTA

Leu

384

GGT GCC GAT GAC CTG Gly Ala Asp Asp Leu 140

GAT ATT TTC AAA GGT ATA AAC TTA AAG CTT CTA GCT ATG GAA CAG ATG ^AsPJi^{le p}he Lys .GIy _x.I_le J

432

480

GCA Ala

AAT Asn

CCT ACG AGG

GGT Gly

AAA GGA GTA GAT TTT

GAG GAA ATA CAG GCT

576

Pro

Thr Arg 180

Lys Gly Val 185

Asp

Phe

Glu Glu

íle 190

Gin Ala

GAG

ATA

TCG

GAA

AGC

TGT

AAG

AGA

ATC

AAT

AAG

CAA

TTC

GGC

AAG

CCT

624

Glu

íle

Ser

Glu

Ser

Cys

Lys

Arg

íle

Asn

Lys

Gin

Phe

Gly

Lys

Pro

195

200

205

GGA

TAT

GAG

CCT

ATA

GTT

TAT

ATT

GAT

AGG

CCC

GTG

TCA

AGC

AGT

GAA

672

Gly

Tyr

Glu

Pro

íle

Val

Tyr

íle

Asp

Arg

Pro

Val

Ser

Ser

Ser

Glu

210

215

220

CGC

ATG

GCA

TAT

TAC

AGT

ATT

GCA

GAA

TGT

GTT

GTT

GTC

ACG

GCT

GTG

720

Arg

Met

Ala

Tyr

Tyr

Ser

íle

Ala

Glu

Cys

Val

Val

Val

Thr

Ala

Val

225

230

235

240

743

AGC GAC GGC ATG AAC TTC GTC TC Ser Asp Gly Met Asn Phe Val

245

102 ζ2) Informácie ο SEQ ID NO: 11:

C i) Charakteristika sekvencie·.

C A) Dĺžka: 247 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina <D) Topológia: lineárna

Cii) Typ molekuly: proteín

Cxi) Popis sekvencie·. SEQ ID NO: 11:

Asp Val Met Trp Met His Asp Tyr His Leu Met Val Leu Pro Thr Phe 15 10 15

Leu Arg Arg Arg Phe Asn Arg Leu Arg Met Gly Phe Phe Leu His Ser 20 25 30

Pro Phe Pro Ser Ser Glu íle Tyr Arg Thr Leu Pro Val Arg Glu Glu 35 40 45 íle Leu Lys Ala Leu Leu Cys Ala Asp íle Val Gly Phe His Thr Phe 50 55 60

Thr

Val

Gly

íle 100

Lys

íle

Met

Pro

Val 105

Gly

íle

His

Met

Gly 110

His

íle

Glu

Ser

Met 115

Lys

Lys

Leu

Ala

Ala 120

Lys

Glu

Leu

Met

Leu 125

Lys

Ala

Leu

Lys

Gin 130

Gin

Phe

Glu

Gly

Lys 135

Thr

Val

Leu

Leu

Gly 140

Ala

Asp

Asp

Leu

Asp 145

íle

Phe

Lys

Gly

íle 150

Asn

Leu

Lys

Leu

Leu 155

Ala

Met

Glu

Gin

Met 160

Leu

Lys

Gin

His

Pro 165

Lys

Trp

Gin

Gly

Gin 170

Ala

Val

Leu

Val

Gin 175

íle

Ala

Asn

Pro

Thr 180

Arg

Gly

Lys

Gly

Val 185

Asp

Phe

Glu

Glu

íle 190

Gin

Ala

Glu

íle

Ser 195

Glu

Ser

Cys

Lys

Arg 200

íle

Asn

Lys

Gin

Phe 205

Gly

Lys

Pro

Gly

Tyr 210

Glu

Pro

íle

Val

Tyr 215

Íle

Asp

Arg

Pro

Val 220

Ser

Ser

Ser

Glu

Arg 225

Met

Ala

Tyr

Tyr

Ser 230

íle

Ala

Glu

Cys

Val 235

Val

Val

Thr

Ala

Val 240

103

Ser Asp Gly Met Asn Phe Val 245 (2) Informácie o SEQ ID NOs 12:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka·. 395 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcovdva (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Nie (iii) Aritisence: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Nicotiana tabaeum (B) Druh: Samsun NN (F) Typ pletiva: List (ix) Vlastnosti:

(C) Meno/KIúč: CDS (D) Umiestenie: 1..395 (D) Ďalšie informácie: /čiastočná (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 12:

- . GCG AAA ece-^>'ČTC^,^^,Í^^ŽS^CTT_CT.gAe--AGe--GMÍ’awr'XgT-gAťTGGA TCA TAT —’~AlaLýš Pro Val Met Lys Leu Tyr Arg Glu Ala Thr Asp Gly Ser Tyr

5 10 15

ATA GAA

ACT Thr

AAA GAG AGT GCA TTA GTG TGG CAC CAT CAT GÄT GCA

GAC Asp

96

íle

Glu

Lys 20

Glu

Ser

Ala Leu

Val 25

Trp

His

His His

Asp 30

Ala

CCT

GAC

TTT

GGC

TCC

TGC

CAG

GCA

AAG

GAA

TTG

TTG

GAT

CAT

TTG

GAA

144

Pro

Asp

Phe

Gly

Ser

Cys

Gin

Ala

Lys

Glu

Leu

Leu

Asp

His

Leu

Glu

35

40

45

AGC

GTA

CTT

GCA

AAT

GAA

CCT

GCA

GTT

GTT

AAG

AGG

GGC

CAA

CAT

ATT

192

Ser

Val

Leu

Ala

Asn

Glu

Pro

Ala

Val

Val

Lys

Arg

Gly

Gin

His

íle

50

55

60

GTT

GAA

GTC

AAG

CCA

CAA

GGT

GTG

ACC

AAA

GGA

TTA

GTT

TCA

GAG

AAG

240

Val

Glu

Val

Lys

Pro

Gin

Gly

Val

Thr

Lys

Gly

Leu

Val

Ser

Glu

Lys

65

70

75

80

GTT

CTC

TCG

ATG

ATG

GTT

GAT

AGT

GGG

AAA

CCG

CCC

GAT

TTT

GTT

ATG

288

Val

Leu

Ser

Met

Met

Val

Asp

Ser

Gly

Lys

Pro

Pro

Asp

Phe

Val

Met

85

90

95

TGC

ATT

GGA

GAT

GAT

AGG

TCA

GAC

GAA

GAC

ATG

TTT

GAG

AGC

ATA

TTA

336

Cys

Íle

Gly

Asp

Asp

Arg

Ser

Asp

Glu

Asp

Met

Phe

GlU

Ser

íle

Leu

100

105

110

104

AGC Ser

ACC Thr

GTA Val 115

TCC Ser

AGT Ser

CTG Leu

TCA Ser

GTC Val 120

ACT Thr

GCT Ala

GCC Ala

CCT Pro

GAT Asp 125

GTC Val

TTT GCC Phe Ala

384

TGC

ACC

GTC

GG

395

Cys

Thr

Val

130

C2) Informácie o SEQ ID NO: 13:

C i) Charakteristika sekvencie:

C A) DÍžka: 131 aminokyselín C B) Typ: aminokyselina CD) Topológia: lineárna

Cii) Typ molekuly: proteín

Cxi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 13:

Ala Lys Pro Val Met Lys Leu Tyr Arg Glu Ala Thr Asp Gly Ser Tyr ¹⁵ 10 15 íle Glu Thr Lys Glu Ser Ala Leu Val Trp His His His Asp Ala Asp ²⁰ 25 30

..............—50 ’-·

Val 65

Glu

Val

Lys

Pro

Gin 70

Gly

Val

Thr

Lys

Gly 75

Leu

Val

Ser

Glu

Lys 80

Val

Leu

Ser

Met

Met 85

Val

Asp

Ser

Gly

Lys 90

Pro

Pro

Asp

Phe

Val 95

Met

Cys

íle

Gly

Asp 100

Asp

Arg

Ser

Asp

Glu 105

Asp

Met

Phe

Glu

Ser 110

íle

Leu

Ser

Thr

Val 115

Ser

Ser

Leu

Ser

Val 120

Thr

Ala

Ala

Pro

Asp 125

Val

Phe

Ala

Cys Thr Val 130

C2) Informácie o SEQ ID NO: 14:

C i) Charakteristika sekvencie: C A) DÍžka: 491 párov báz

CB) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: dva

CD) Topológia: lineárna Cii) Typ molekuly: cDNA k mRNA

105 (iii) Hypotetický: Nie (iii) Antiserice: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Nicotiana tabacum (B) Druh: Samsun NN (F) Typ pletiva: List < ix) Vlastnosti:

(A) Meno/KIúč* CDS (B) Umiestenie: 1..491 (D) Ďalšie informácie: /čiastočná (xi) Popis sekvencie: SEO ID NO: 14:

GGG CTG TCG GCG GAA CAC GGC TAT TTC TTG AGG ACG AGT CAA GAT GAA 48

Gly Leu Ser Ala Glu His Gly Tyr Phe Leu Arg Thr Ser Gin Asp Glu

10 15 «

GAA TGG GAA ACA TGT GTA CCA CCA GTG GAA TGT TGT TGG AAA GAA ATA 96

Glu Trp Glu Thr Cys Val Pro Pro Val Glu Cys Cys Trp Lys Glu íle

25 30

GCT GAG CCT GTT ATG.CAACTT TAC ACT GAG ACT ACT GAT GGA TCA GTT 144

•íle· Glu Asp- Lys'Gltr Thr Ser MefVäl Trp SeF^Tyŕ Glu Ašp Ala Asp

50

55

60

CCT

GAT

TTT

GGA

TCA

TGT

CAG

GCT

AAG

GAA

CTT

CTT

GAT

CAC

CTA

GAA

240

Pro

Asp

Phe

Gly

Ser

Cys

Gin

Ala

Lys

Glu

Leu

Leu

Asp

His

Leu

Glu

65

70

75

80

AGT

GTA

CTA

GCT

AAT

GAA

CCG

GTC

ACT

GTC

AGG

AGT

GGA

CAG

AAT

ATA

288

Ser

Val

Leu

Ala

Asn

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Arg

Ser

Gly

Gin

Asn

íle

85

90

95

f

GTG

GAA

GTT

AAG

CCC

CAG

GGT

GTA

TCC

AAA

GGG

CTT

GTT

GCC

AAG

CGC

336

Val

Glu

Val

Lys

Pro

Gin

Gly

Val

Ser

Lys

Gly

Leu

Val

Ala

Lys

Arg

100

105

110

CTG

CTT

TCC

GCA

ATG

CAA

GAG

AAA

GGA

ATG

TCA

CCA

GAT

TTT

GTC

CTT

384

Leu

Leu

Ser

Ala

Met

Gin

Glu

Lys

Gly

Met

Ser

Pro

Asp

Phe

Val

Leu

115

120

125

TGC

ATA

GGA

GAT

GAC

CGA

TCG

GAT

GAA

GAC

ATG

TTC

GAG

GTG

ATC

ATG

432

Cys

íle

Gly

Asp

Asp

Arg

Ser

Asp

Glu

Asp

Met

Phe

Glu

Val

íle

Met

130

135

140

AGC

TCG

ATG

TCT

GGC

CCG

TCC

ATG

GCT

CCA

ACA

GCT

GAA

GTC

TTT

GCC

480

Ser

Ser

Met

Ser

Gly

Pro

Ser

Met

Ala

Pro

Thr

Ala

Glu

Val

Phe

Ala

145

150

155

160

106

TGC ACC GTC GG .491

Cys Thr Val (2) Informácie o StO ID NO* 15:

C i) Charakteristika sekvencie:

C A) DÍžka: 163 aminokyselín C B) Typ: aminokyselina CD) Topológia: lineárna

Cii) Typ molekuly: proteín

Cxi) Popis sekvencie: SEO ID NO: 15:

Gly

Leu

Ser

Ala

Glu

His

Gly

Tyr

Phe

Leu

Arg

Thr

Ser

Gin

Asp

1

5

10

15

Glu

Trp

Glu

Thr

Cys

Val

Pro

Pro

Val

Glu

Cys

Cys

Trp

Lys

Glu

20

25

30

Ala

Glu

Pro

Val

Met

Gin

Leu

Tyr

Thr

Glu

Thr

Thr

Asp

Gly

Ser

35

40

45

íle

Glu

Asp

Lys

Glu

Thr

Ser

Met

Val

Trp

Ser

Tyr

Glu

Asp

Ala

50

PÍií >-

55,

^-í

.60

se?»*

Š3ŠS3

'GlýdSer^ Cys G1h«A1k Xys 70

- - ·

.«w .

- --S».-

.......

Ser

Val

Leu

Ala

Asn

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Arg

Ser

Gly

Gin

Asn

íle

85-

90

95

Val

Glu

Val

Lys

Pro

Gin

Gly

Val

Ser

Lys

Gly

Leu

Val

Ala

Lys

Arg

100

105

110

Leu

Leu

Ser

Ala

Met

Gin

Glu

Lys

Gly

Met

Ser

Pro

Asp

Phe

Val

Leu

115

120

125

Cys

íle

Gly

Asp

Asp

Arg

Ser

Asp

Glu

Asp

Met

Phe

Glu

Val

íle

Met

130

135

140

Ser

Ser

Met

Ser

Gly

Pro

Ser

Met

Ala

Pro

Thr

Ala

Glu

Val

Phe

Ala

145

150

155

160

Cys Thr Val

C2) Informácie o SEO ID NO: 16:

C i) Charakteristika sekvencie: C A) DÍžka: 361 párov báz C B) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: dva

CD) Topológia: lineárna

107 (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Nie (iii) Antisence: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus· Nicotiana tabacum (B) Druh: Samsun NN (F) Typ pletiva: List (xi) Popis sekvencie: SEO ID NO: 16:

TTTGATTATG ATGGGACGCT GCTGTCGGAG GAGAGTGTGG ACAAAACCCC GAGTGAAGAT 60

GACATCTCAA TTCTGAATGG TTTATGCAGT GATCCAAAGA ACGTAGTCTT TATCGTGAGT 120

GGCAGAGGAA AGGATACACT TAGCAAGTGG TTCTCTCCGT GTCCGAGACT CGGCCTATCA 180

GCAGAACATG GATATTTCAC TAGGTGGAGT AAGGATTCCG AGTGGGAATC TCGTCCATAG' 240

CTGCAGACCT TGACTGGAAA AAAATAGTGT TGCCTATTAT GGAGCGCTAC ACAGAGCACA 300

GATGGTTCGT CGATAGAACA GAAGGAAACC TCGTGTTGGC TCATCAAATG CTGGCCCCGA 360

A 361

(A) DÍžka: 118 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina CC) Počet reťazcov: dva (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Nie (iii) Antisence: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Nicotiana tabacum (B) Druh: Samsun NN (F) Typ pletiva: List (xi) Popis sekvencie: SEO ID NO: 17:

GGAAACCCAC AGGATGTAAG CAAAGTTTTA GTTTTTGAGA TCTCTTGGCA TCAAGCAAAG 60 TAGAGGGAAG TCACCCGATT CGTGCTGTGC GTAGGGATGA CAGATCGGAC GACTTAGA 118

108 (2) Informácie o SEQ ID NO: 18:

C i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 417 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: dva CD) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA

Ciii) Hypotetický: Nie (iii) Antisences Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Nicotiana tabacurn (B) Druh: Samsun NN (F) Typ pletiva: List (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 18:

TTGTGGCCGA TGTTCCACTA CATGTTGCCG TTCTCACCTG ACCATGGAGG CCGCTTTGAT 60

CGCTCTATGT GGGAAGCATA TGTTTCTGCC AACAAGTTGT TTTCACAAAA AGTAGTTGAG 120

GTTCTTAATC CTGAGGATGA CTTTGTCTGG ATTCATGATT ATCATTI

GTGCTGACAT TGTTGGATTC CACACTTTTG ACTACGCGAG ACACTTCCTC TCTTGTTGCA 360

GTCGATTTTG GGTAGAGTAC AGTCTAAAAA AAGTTATATT GGGTTAAAAT ACTATGG 417 (2) Informácie o SEQ ID NO: 19·.

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 417 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: dva (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Nie (iii) Antisence: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Nicotiana tabacurn (B) Druh: Samsun NN (F) Typ pletiva·. List (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 19:

109

GGGTCATATT GATCCATGAA GAAATTGCAG CGAAAGAGTG ATGCTTTAAT GCGTAAAGCA 60

GCAATTTGAA GGGAAAACTG TGTTGTTAGG TGCCGATGAC CTGGATATTT TCAAAGGTAT 120

GAACTTAAAG CTTCTAGCTA TGGAACAGAT GCTCAAACAT CACCCCAAGT GGCAAGGGCA 180

GGCTGTGTTG GTCCAAGATT GCAAATCCTA CGAGGGGTAA AGGAGTAGAT TTTGACGAAA 240

TACGGCTGAG ACATCGGAAA GCTGTAAGAG AATCAATAAG CAATTCGGCA AGCCTGGATA 300

TGAGCCTATA GTTTATATTG ATAGGCCCGT GTCAAGCAGT GAACGCATGG CATATTACAG 360

TATTGCAGGA TGTGTTGTGG TCACGCTGTG AGCGATGGCA TGAATCTGTT C 411 (2) Informácie o SEO 10 NO: 20s (i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 405 párov báz (B) Typ s nukleová kyselina (C) Počet retazcov: dva CD? Topológias lineárna (ii? Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii? Hypotetický: Nie »MjiwaWÍ

atxaria—x;

Cl·? Typ pletiva: List -

(xi? Popis sekvencie: SEC'J ID NO: 20:

TGGGGTGGTT	CCTGCATACG	CCGTTTCCTT	CTTCTGAGAT	ATATAAAACT	TTGCCTATTC	60
GCGAAAGATC	TTACAGCTCT	CTTGAATTCA	ATTTGATTGG	GTTCCACACT	TTTGACTATg	•120
CAGGCACTTC	CTCTCGTGTT	GCAGTCGGAT	GTTAGGTATT	TCTTATGATC	AAAAAGGGGT	180
TACATAGGCC	TCGATATTAT	GGCAGGACTG	TAATATAAAA	ATTCTGCCAG	CGGGTATTCA	240
TATGGGGCAG	CTTCAGCAAG	TCTTGAGTCT	TCCTGAAACG	GAGGCAAAAT	CTCGGAACTC	300
GTGCAGCATT	TAATCATCAG	GGGGAGGACA	TTGTTGCTGG	GATTGATGAC	TGGACATATT	360

TAAAGGCTCA TTTGAATTTA TTACCATGGA ACAACTCTAT TGCAC

405

110 (2) Informácie o SEQ ID NO; 21*

C i) Charakteristika sekvencie;

(A) Dĺžka; 427 párov báz (B) Typ; nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: dva CD) Topológia: lineárna

Cii) Typ molekuly: cDNA k mRNA Ciii) Hypotetický: Nie Ciii) Antisence: Nie C vi) Pôvodný zdroj:

C A) Organizmus; Nicotiana tabaeum C B) Druh: Samsun NN C F) Typ pletiva: List

Cxi) Popis sekvencie: SEC) ID NO: 21:

-GATGTCÄÄAG.TÄAGTGCÄBGA

ATCATATGGG GCAGCTTCAG CAATCTTGAT CTTCCTGAAA CGGAGGCAAA AGTCTTCGGA 60

ACTCGGCAGC AGTTTAATCA TCAGGGGAGG ACATTGTTGC TGGGAGTTGA TGACATGGAC 120

ATATTTAAAG GCATCAGTTT GAAGTTATTA GCAATGGAAC AACTTCTATT GCAGCACCCG 180 • ~ ,,,Λ » · -- ~ * 'í*

GAAGACCTGG GTACGAACCA GTTATCTTGA TTGATAAGCC ACTAAAGTTT TATGAAAGGA 360

TTGCTTATTA TGTTGTTGCA GAGTGTTGCC TAGTCACTGC TGTCAGCGAT GGCATGAACC 420

TCGTCTC 427

C2) Informácie o StO ID NO: 22:

C i) Charakteristika sekvencie:

C A) DÍžka: 315 párov báz C B) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: dva

CD) Topológia: lineárna

Cii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Nie

C iii) Antisence: Nie C vi) Pôvodný zdroj:

C A) Organizmus; Nicotiana tabaeum C B) Druh: Samsun NN C F) Typ pletiva: List

Cxi) Popis sekvencie: SEO ID NO: 22:

111

GATGTGGATG	CATGACTACC	AATCCAAGAG	GGGGTATATT	GGTCTTGACT	ATTATGGTAA	60
ACTGTGACCA	TTAAAATCCT	TCCAGTTGGT	ATTCACATGG	GACAACTCCA	AAATGTTATG	120
TCACTACAGA	CACGGGAAAG	AAAGCAAAGG	AGTTGAAAGA	AAAATATGAG	GGGAAAATTG	180
TGATGTTAGG	TATTGATGAT	ATGGACATGT	TTAAAGGAAT	TGGTCTAAAG	TTTCTGGCAA	240
TGGGGAGGCT	TCTAGATGAA	AACCCTGTCT	TGAGGGGTAA	AGTGGTATTG	GTTCAATCAC	300
CAGGCCTGGA	AATTA					315

C2) Informácie o SEQ ID NO: 23:

C i) Charakteristika sekvencie: C A) DÍžka= 352 párov báz C B) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: dva

CD) Topolúgia: lineárna

Cii) Typ molekuly·. cDNA k mRNA Ciii) Hypotetický-. Nie

Ciii) Antisence: Nie

C vi) Pôvodný zdroj:

rýp¹ V

Cxi) Popis sekvencie: SED ID NO:

23:

AGAAGTAAAG GGAGTGAGTC CCCGAGGŤTC AAAAAGAGGT CAACAGAATT GCAGTGAAAT 60

TAATAAAAAA TATGGCAAAC CGGGGTACAA GCCGATTGTT TGTATCAATG GTCCAGTTTC 120 e

GACACAAGAC AAGATTGCAC ATTATGCGGT CTTGAGTGTG TTGTTGTTAA TGCTGTTAGA 180

GATGGGATGA ACTTGGTGCC TTATGAGTAT ACGGTCTTTA GGCAGGGCAG CGATAATTTG 240

GATAAGGCCT TGCAGCTAGA TGGTCCTACT GCTTCCAGAA AGAGTGTGAT TATTGTCTTG 300

AATTCGTTGG GTGCTCGCCA TCTTTAGTGG CGCCATCCGC GTCAACCCCT GG 352

C2) Informácie o SEQ ID NO: 24:

C i) Charakteristika sekvencie: C A) DÍžka: 2640 párov báz C B) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: dva

CD) Topolúgia: lineárna

Cii) Typ molekuly: cDNA k mRNA

112

Ciii) Hypotetický: Nie (iii) Antiserice: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Helianthus annuus (F) Typ pletiva: List (ix) Vlastnosti:

(A) ľleno/Kľúč: CDS (B) Umiestenie: 171..2508 (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/KlúC: neisté (B) Umiestenie: nahradené (2141..2151, (ix) Vlastnosti:

(A) ľleno/KIúč: neisté (B) Umiestenie: nahradené (2237..2243, ccatrinntta ) actriaaa ) (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 24:

GGATCCTGCG GTTTCATCAC ACAATATGAT ACTGTTACAT CTGATGCCCC TTCAGATGTC 60

CCAAATAGGT TGATTGTCGT ATCGAATCAG TTACCCATAA TCGCTAGGCT AAGACTAACG 120

ATC íle

AAA GAT Lys Asp 5

GCA TTA CCC Ala Leu Pro

GCA Ala

GCC Ala 10

GTT GAG GTT TTC TAT GTT

GGC Gly

GCA Ala

224

Val Glu

Val

Phe Tyr 15

Val

CTA

AGG

GCT

GAC

GTT

GGC

CCT

ACC

GAA

CAA

GAT

GAC

GTG

TCA

AAG

ACA

272

Leu

Arg

Ala

Asp

Val

Gly

Pro

Thr

Glu

Gin

Asp

Asp

Val

Ser

Lys

Thr

20

25

30

TTG

CTC

GAT

AGG

TTT

AAT

TGC

GTT

GCG

GTT

TTT

GTC

CCT

ACT

TCA

AAA '

320

Leu

Leu

Asp

Arg

Phe

Asn

Cys

Val

Ala

Val

Phe

Val

Pro

Thr

Ser

Lys

35

40

45

50

TGG

GAC

CAA

TAT

TAT

CAC

TGC

TTT

TGT

AAG

CAG

TAT

TTG

TGG

CCG

ATA

368

Trp

Asp

Gin

Tyr

Tyr

His

Cys

Phe

Cys

Lys

Gin

Tyr

Leu

Trp

Pro

íle

55

60

65

TTT

CAT

TAC

AAG

GTT

CCC

GCT

TCT

GAC

GTC

AAG

AGT

GTC

CCG

AAT

AGT

416

Phe

His

Tyr

Lys

Val

Pro

Ala

Ser

Asp

Val

Lys

Ser

Val

Pro

Asn

Ser

70

75

80

CGG

GAT

TCA

TGG

AAC

GCT

TAT

GTT

CAC

GTG

AAC

AAA

GAG

TTT

TCC

CAG

464

Arg

Asp

Ser

Trp

Asn

Ala

Tyr

Val

His

Val

Asn

Lys

Glu

Phe

Ser

Gin

85

90

95

113

AAG GTG ATG GAG GCA

GTA ACC AAT GCT AGC AAT TAT GTA TGG ATA

CAT His

' 512

Lys Val 100

Met Glu

Ala

Val

Thr 105

Asn

Ala

Ser

Asn Tyr 110

Val

Trp

íle

GAC

TAC

CAT

TTA

ATG

ACG.

CTA

CCG

ACT

TTC

TTG

AGG

CGG

GAT

TTT

TGT

560

Asp

Tyr

His

Leu

Met

Thr

Leu

Pro

Thr

Phe

Leu

Arg

Arg

Asp

Phe

Cys

115

120

125

130

CGT

TTT

AAA

ATC

GGT

TTT

TTT

CTG

CAT

AGC

CCG

TTT

CCT

TCC

TCG

GAG

608

Arg

Phe

Lys

Íle

Gly

Phe

Phe

Leu

His

Ser

Pro

Phe

Pro

Ser

Ser

Glu

135

140

145

GTT

TAC

AAG

ACC

CTA

CCA

ATG

AGA

AAC

GAG

CTC

TTG

AAG

GGT

CTG

TTA

656

Val

Tyr

Lys

Thr

Leu

Pro

Met

Arg

Asn

Glu

Leu

Leu

Lys

Gly

Leu

Leu

150

155

160

AAT

GCT

GAT

CTT

ATC

GGG

TTC

CAT

ACA

TAC

GAT

TAT

GCC

CGT

CAT

TTT

704

Asn

Ala

Asp

Leu

íle

Gly

Phe

His

Thr

Tyr

Asp

Tyr

Ala

Arg

His

Phe

165

170

175

1

CTA

ACG

TGT

TGT

AGT

CGA

ATG

TTT

GGT

TTG

GAT

CAT

CAG

TTG

AAA

AGG

752

Leu

Thr

Cys

Cys

Ser

Arg

Met

Phe

Gly

Leu

Asp

His

Gin

Leu

Lys

Arg

180

185

190

GGG

TAC

ATT

TTC

TTG

GAA

TAT

AAT

GGA

AGG

AGC

ATT

GAG

ATC

AAG

ATA

800

215 220 225

CCC GAT ACA AGA TTA CAA GTT

CAA GAA CTA AAA AAA CGT TTC GAA

GGG Gly

896

Pro Asp Thr Arg

Leu Gin

Val

Gin

Glu Leu 235

Lys Lys

Arg

Phe 240

Glu

230

AAA

ATC

GTG

CTA

CTT

GGA

GTT

GAT

GAT

TTG

GAT

ATA

TTC

AAA

GGT

GTG

944

Lys

íle

Val

Leu

Leu

Gly

Val

Asp

Asp

Leu

Asp

íle

Phe

Lys

Gly

Val

245

250

255

AAC

TTC

AAG

GTT

TTA

GCG

TTG

GAG

AAG

TTA

CTT

AAA

TCA

CAC

CCG

AGT

992

Asn

Phe

Lys

Val

Leu

Ala

Leu

Glu

Lys

Leu

Leu

Lys

Ser

His

Pro

Ser

260

265

270

TGG

CAA

GGG

CGT

GTG

GTT

TTG

GTG

CAA

ATC

TTG

AAT

CCC

GCT

CGC

GCG

1040

Trp

Gin

Gly

Arg

Val

Val

Leu

Val

Gin

íle

Leu

Asn

Pro

Ala

Arg

Ala

275

280

285

290

CGT

TGC

CAA

GAC

GTC

GAT

GAG

ATC

AAT

GCC

GAG

ATA

AGA

ACA

GTC

TGT

1088

Arg

Cys

Gin

Asp

Val

Asp

Glu

íle

Asn

Ala

Glu

íle

Arg

Thr

Val

Cys

295

300

305

GAA

AGA

ATC

AAT

AAC

GAA

CTG

GGA

AGC

CCG

GGA

TAC

CAG

CCC

GTT

GTG

1136

Glu

Arg

íle

Asn

Asn

Glu

Leu

Gly

Ser

Pro

Gly

Tyr

Gin

Pro

Val

Val

310 315 320

114

TTA ATT GAT

GGG Gly

CCC Pro

GTT TCG TTA AGT GAA AAA GCT GCT TAT TAT GCT

1184

Leu

íle

Asp 325

Val

Ser

Leu 330

Ser

Glu

Lys

Ala

Ala 335

Tyr Tyr

Ala

ATC

GCC

GAT

ATG

GCA

ATT

GTT

ACA

CCG

TTA

CGT

GAC

GGC

ATG AAT

CTT

1232

íle

Ala 340

Asp

Met

Ala

íle

Val 345

Thr

Pro

Leu

Arg

Asp 350

Gly

Met Asn

Leu

ATC

CCG

TAC

GAG

TAC

GTC

GTT

TCC

CGA

CAA

AGT

GTT

AAT

GAC CCA

AAT

1280

íle 355

Pro

Tyr

Glu

Tyr

Val 360

Val

Ser

Arg

Gin

Ser 365

Val

Asn

Asp Pro

Asn 370

CCC

AAT

ACT

CCA

AAA

AAG

AGC

ATG

CTA

GTG

GTC

TCC

GAG

TTC ATC

GGG

1328

Pro

Asn

Thr

Pro

Lys 375

Lys

Ser

Met

Leu

Val 380

Val

Ser

Glu

Phe íle 385

Gly

TGT

TCA

CTA

TCT

TTA

ACC

GGG

GCC

ATA

CGG

GTC

AAC

CCA

TGG GAT

GAG

1376

Cys

Ser

Leu

Ser 390

Leu

Thr

Gly

Ala

íle 395

Arg

Val

Asn

Pro

Trp Asp 400

Glu

TTG

GAG

ACA

GCA

GAA

GCA

TTA

TAC

GAC

GCA

CTC

ATG

GCT

CCT GAT

GAC

1424

Leu

Glu

Thr 405

Ala

Glu

Ala

Leu

Tyr 410

Asp

Ala

Leu

Met

Ala 415

Pro Asp

Asp

1472

CAT AAA His Lys

GAA ACC GCC CAC ATG AAA CAG TAT CAA TAC ATT ATC TCC CAT Glu Thr Ala His Met Lvs Gin. Tvr .Gin Tvr.Ile II e. .Sex „His.

440

450

GAT

Asp VSä~Ale - “

435

445

TGC ATC GAT CAT TCT CGT AAA CGA

TGC Cys

ATG AAT TTA GGA TTT GGG TTA

1568

Cys

íle

Asp His

Ser 455

Arg Lys

Arg

Met 460

Asn Leu

Gly

Phe

Gly 465

Leu

GAT

ACT

AGA

GTC

GTT

CTT

TTT

GAT

GAG

AAG

TTT

AGC

AAG

TTG

GAT

ATA

1616

Asp

Thr

Arg

Val

Val

Leu

Phe

Asp

Glu

Lys

Phe

Ser

Lys

Leu

Asp

íle

470

475

480

t

GAT

GTC

TTG

GAG

AAT

GCT

TAT

TCC

ATG

GCT

CAA

AAT

CGG

GCC

ATA

CTT

1664

Asp

Val

Leu

Glu

Asn

Ala

Tyr

Ser

Met

Ala

Gin

Asn

Arg

Ala

íle

Leu

485

490

495

TTG

GAC

TAT

GAC

GGC

ACT

GTT

ACT

CCA

TCT

ATC

AGT

AAA

TCT

CCA

ACT

1712

Leu

Asp

Tyr

Asp

Gly

Thr

Val

Thr

Pro

Ser

íle

Ser

Lys

Ser

Pro

Thr

500

505

510

GAA

GCT

GTT

ATC

TCC

ATG

ATC

AAC

AAA

CTG

TGC

AAT

GAT

CCA

AAG

AAC

1760

Glu

Ala

Val

íle

Ser

Met

íle

Asn

Lys

Leu

Cys

Asn

Asp

Pro

Lys

Asn

515

520

525

530

ATG

GTG

TTC

ATC

GTT

AGT

GGA

CGC

AGT

AGA

GAA

AAT

CTT

GGC

AGT

TGG

1808

Met

Val

Phe

íle

Val

Ser

Gly

Arg

Ser

Arg

Glu

Asn

Leu

Gly

Ser

Trp

535

540

545

115

TTC GGC GCG TGT

GAG AAA Glu Lys

CCC GCC ATT GCA GCT GAG CAC GGA TAC TTT

1856

Phe Gly Ala

Cys 550

Pro Ala íle 555

Ala

Ala Glu

His

Gly 560

Tyr 1*

Phe

ATA

AGG

TGG

GCG

GGT

GAT

CAA

GAA

TGG

GAA

ACG

TGC

GCA

CGT

GAG

AAT

1904

íle

Arg

Trp

Ala

Gly

Asp

Gin

Glu

Trp

Glu

Thr

Cys

Ala

Arg

Glu

Asn

565

570

575

AAT

GTC

GGG

TGG

ATG

GAA

ATG

GCT

GAG

CCG

GTT

ATG

AAT

CTT

TAT

ACA

1952

Asn

Val

Gly

Trp

Met

Glu

Met

Ala

Glu

Pro

Val

Met

Asn

Leu

Tyr

Thr

580

585

590

GAA

ACT

ACT

GAC

GGT

TCG

TAT

ATT

GAA

AAG

AAA

GAA

ACT

GCA

ATG

GTT

2000

Glu

Thr

Thr

Asp

Gly

Ser

Tyr

íle

Glu

Lys

Lys

Glu

Thr

Ala

Met

Val

595

600

605

610

TGG

CAC

TAT

GAA

GAT

GCT

GAT

AAA

GAT

CTT

GGG

TTG

GAG

CAG

GCT

AAG

2048

Trp

His

Tyr

Glu

Asp

Ala

Asp

Lys

Asp

Leu

Gly

Leu

Glu

Gin

Ala

Lys

615

620

625

1

GAA

CTG

TTG

GAC

CAT

CTT

GAA

AAC

GTG

CTC

GCT

AAT

GAG

CCC

GTT

GAA

2096

Glu

Leu

Leu

Asp

His

Leu

Glu

Asn

Val

Leu

Ala

Asn

Glu

Pro

Val

Glu

630

635

640

GTG

AAA

CGA

GGT

CAA

TAC

ATT

GTA

GAA

GTT

AAA

CCA

CAG

GTA

CCC

CAT

2144

..^Val. Lys„Arg .Gly_Gln Ivrlle v^,ä>e(«íei^45-*w>^®³-'^{3C=ä,=;;iss=}'---'^!ľ5’^ee=®^as——

. -^ľ~--ľ,GGG..g!B^ggP ' Gly Lea«Pro'*Sér 660

TTT AAC Phe Asn 675

TTA Leu

AAT TTC

TTT AAA TAT GAA TGC AAT TAT AGG GGG TCA CTG

2240

Asn

Phe

Phe 680

Lys Tyr

Glu Cys

Asn 685

Tyr

Arg Gly

Ser

Leu 690

AAA

GGT

ATA

GTT

GCA

GAG

AAG

ATT

TTT

GCG

TTC

ATG

GCT

GAA

AAG

GGA

2288

Lys

Gly

íle

Val

Ala

Glu

Lys

íle

Phe

Ala

Phe

Met

Ala

Glu

Lys

Gly

695

700

705

f

AAA

CAG

GCT

GAT

TTC

GTG

TTG

AGC

GTT

GGA

GAT

GAT

AGA

AGT

GAT

GAA

2336

Lys

Gin

Ala

Asp

Phe

Val

Leu

Ser

Val

Gly

Asp

Asp

Arg

Ser

Asp

Glu

710

715

720

GAC

ATG

TTT

GTG

GCC

ATT

GGG

GAT

GGA

ATA

AAA

AAG

GGT

CGG

ATA

ACT

2384

Asp

Met

Phe

Val

Ala

íle

Gly

Asp

Gly

íle

Lys

Lys

Gly

Arg

íle

Thr

•

725

730

735

AAC

AAC

AAT

TCA

GTG

TTT

ACA

TGC

GTA

GTG

GGA

GAG

AAA

CCG

AGT

GCA

2432

Asn

Asn

Asn

Ser

Val

Phe

Thr

Cys

Val

Val

Gly

Glu

Lys

Pro

Ser

Ala

740

745

750

GCT

GAG

TAC

TTT

TTA

GAC

GAG

ACG

AAA

GAT

GTT

TCA

ATG

ATG

CTC

GAG

2480

Ala

Glu

Tyr

Phe

Leu

Asp

Glu

Thr

Lys

Asp

Val

Ser

Met

Met

Leu

Glu

755

760

765

770

116

AAG CTC GGG TGT CTC AGC AAC CAA GGA T GATGATCCGG AAGCTTCTCG 2528

Lys Leu Gly Cys Leu Ser Asn Gin Gly

775

TGATCTTTAT GAGTTAAAAG TTTTCGACTT TTTCTTCATC AAGATTCATG GGAAAGTTGT 2588 TCAATATGAA CTTGTGTTTC TTGGTTCTGG ATTTTAGGGA GTCTATGGAT CC 2640 (2) Informácie o SEQ ID NO: 25:

C i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 779 aminokyselín C B) Typs aminokyselina CD) Topológia: lineárna

Cii) Typ molekuly: proteín

Cxi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 25:

Met His íle Lys Asp Ala Leu Pro Ala Ala Val Glu Val Phe Tyr Val 15 10 15

Lys*^-Thr .Leu Lre*Asp Arg^BPítt*’ftsn 35 40

Ser

Lys

Trp

Asp

Gin

Tyr

Tyr

His

Cys

Phe

Cys

Lys

Gin

Tyr

Leu

Trp

50

55

60

Pro

íle

Phe

His

Tyr

Lys

Val

Pro

Ala

Ser

Asp

Val

Lys

Ser

Val

Pro

65

70

75

80

Asn

Ser

Arg

Asp

Ser

Trp

Asn

Ala

Tyr

Val

His

Val

Asn

Lys

Glu

Phe

85

90

95

Ser

Gin

Lys

Val

Met

Glu

Ala

Val

Thr

Asn

Ala

Ser

Asn

Tyr

Val

Trp

100

105

110

íle

His

Asp

Tyr

His

Leu

Met

Thr

Leu

Pro

Thr

Phe

Leu

Arg

Arg

Asp

115

120

125

Phe

Cys

Arg

Phe

Lys

íle

Gly

Phe

Phe

Leu

His

Ser

Pro

Phe

Pro

Ser

130

135

140

Ser

Glu

Val

Tyr

Lys

Thr

Leu

Pro

Met

Arg

Asn

Glu

Leu

Leu

Lys

Gly

145

150

155

160

Leu

Leu

Asn

Ala

Asp

Leu

íle

Gly

Phe

His

Thr

Tyr

Asp

Tyr

Ala

Arg

165

170

175

His

Phe

Leu

Thr

Cys

Cys

Ser

Arg

Met

Phe

Gly

Leu

Asp

His

Gin

Leu

180

185

190

117

Lys Arg Gly Tyr íle Phe Leu Glu Tyr Asn Gly Arg Ser íle Glu íle 195 200 205

Lys íle Lys Ala Ser Gly íle His Val Gly Arg Met Glu Ser Tyr Leu 210 215 220

Ser Gin Pro Asp Thr Arg Leu Gin Val Gin Glu Leu Lys Lys Arg Phe

225 230 235 240

Glu Gly Lys íle Val Leu Leu Gly Val Asp Asp Leu Asp íle Phe Lys

245 250 255

Gly Val Asn Phe Lys Val Leu Ala Leu Glu Lys Leu Leu Lys Ser His 260 265 270

Pro Ser Trp Gin Gly Arg Val Val Leu Val Gin íle Leu Asn Pro Ala 275 280 285

Arg Ala Arg Cys Gin Asp Val Asp Glu íle Asn Ala Glu íle Arg Thr 290 295 300

Val Cys Glu Arg íle Asn Asn Glu Leu Gly Ser Pro Gly Tyr Gin Pro 305 310 315 320

Val Val Leu íle Asp Gly Pro Val Ser Leu Ser Glu Lys Ala Ala Tyr

..'Ľ dfc.VBfr¹ -

Asn

Leu

íle 355

Pro

Tyr

Glu

Tyr

Val 360

Val

Ser

Arg

Gin

Ser 365

Val

Asn

Asp

Pro

Asn 370

Pro

Asn

Thr

Pro

Lys 375

Lys

Ser

Met

Leu

Val 380

Val

Ser

Glu

Phe

íle 385

Gly

Cys

Ser

Leu

Ser 390

Leu

Thr

Gly

Ala

íle 395

Arg

Val

Asn

Pro

Trp 400

Asp

Glu

Leu

Glu

Thr 405

Ala

Glu

Ala

Leu

Tyr 410

Asp

Ala

Leu

Met

Ala 415

Pro

Asp

Asp

His

Lys 420

Glu

Thr

Ala

His

Met 425

Lys

Gin

Tyr

Gin

Tyr 430

íle

íle

Ser

His

Asp 435

Val

Ala

Asn

Trp

Ala 440

Arg

Ser

Phe

Phe

Gin 445

Asp

Leu

Glu

Gin

Ala 450

Cys

íle

Asp

His

Ser 455

Arg

Lys

Arg

Cys

Met 460

Asn

Leu

Gly

Phe

Gly 465

Leu

Asp

Thr

Arg

Val 470

Val

Leu

Phe

Asp

Glu 475

Lys

Phe

Ser

Lys

Leu 480

Asp

íle

Asp

Val

Leu

Glu

Asn

Ala

Tyr

Ser

Met

Ala

Gin

Asn

Arg

Ala

485 490 495

118

íle

Leu

Leu

Asp 500

Tyr

Asp

Gly

Thr

Val 505

Thr

Pro

Ser

íle

Ser 510

Lys

Ser

Pro

Thr

Glu 515

Ala

Val

íle

Ser

Met 520

íle

Asn

Lys

Leu

Cys 525

Asn

Asp

Pro

Lys

Asn 530

Met

Val

Phe

íle

Val 535

Ser

Gly

Arg

Ser

Arg 540

Glu

Asn

Leu

Gly

Ser 545

Trp

Phe

Gly

Ala

Cys 550

Glu

Lys

Pro

Ala

íle 555

Ala

Ala

Glu

His

Gly 560

Tyr

Phe

íle

Arg

Trp 565

Ala

Gly

Asp

Gin

Glu 570

Trp

Glu

Thr

Cys

Ala 575

Arg

Glu

Asn

Asn

Val 580

Gly

Trp

Met

Glu

Met 585

Ala

Glu

Pro

Val

Met 590

Asn

Leu

Tyr

Thr

Glu 595

Thr

Thr

Asp

Gly

Ser 600

Tyr

íle

Glu

Lys

Lys 605

Glu

Thr

Ala

Met

Val 610

Trp

His

Tyr

Glu

Asp 615

Ala

Asp

Lys

Asp

Leu 620

Gly

Leu

Glu

Gin

Ala

Lys

Glu

Leu

Leu

Asp

His

Leu

Glu

Asn

Val

Leu

Ala

Asn

Glu

Pro

Pro

His

Gly

Leu 660

Pro

Ser

Cys

Tyr

Asp 665

íle

His

Arg

His

Arg 670

Phe

Val

Glu

Ser

Phe 675

Asn

Leu

Asn

Phe

Phe 680

Lys

Tyr

Glu

Cys

Asn 685

Tyr

Arg

Gly

Ser

Leu 690

Lys

Gly

íle

Val

Ala 695

Glu

Lys

íle

Phe

Ala 700

Phe

Met

Ala

Glu

Lys 705

Gly

Lys

Gin

Ala

Asp 710

Phe

Val

Leu

Ser

Val 715

Gly

Asp

Asp

Arg

Ser 720

Asp

Glu

Asp

Met

Phe 725

Val

Ala

íle

Gly

Asp 730

Gly

íle

Lys

Lys

Gly 735

Arg

íle

Thr

Asn

Asn 740

Asn

Ser

Val

Phe

Thr 745

Cys

Val

Val

Gly

Glu 750

Lys

Pro

Ser

Ala

Ala 755

Glu

Tyr

Phe

Leu

Asp 760

Glu

Thr

Lys

Asp

Val 765

Ser

Met

Met

Leu Glu Lys Leu Gly Cys Leu Ser Asn Gin Gly 770 775

119 (2) Informácie o SEQ ID NO: 26:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 2130 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: dva

CD) Topológia: lineárna Cii) Typ molekuly: cDNA k mRNA Ciii) Hypotetický: Nie

Ciii) Antisence: Nie C vi) Pôvodný zdroj:

C A) Organizmus: Helianthus annuus Cix) Vlastnosti:

CA) Meno/Kľúč: CDS

C B) Umiestenie: 171..2130

CD) Ďalšie informácie: /čiastočná (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 26:

GGATCCTGCG GTTTCATCAC ACAATATGAT ACTGTTACAT CTGATGCCCC TTCAGATGTC 60 •CCAAATAGGT.

<«£*C0 ^u

ATC AAA GAT

GCA TTA CCC

GCA GCC

GTT GAG GTT TTC TAT GTT GGC GCA

224

íle

Lys

Asp 5

Ala

Leu

Pro

Ala

Ala 10

Val

Glu

Val

Phe

Tyr 15

Val

Gly

Ala

CTA

AGG

GCT

GAC

GTT

GGC

CCT

ACC

GAA

CAA

GAT

GAC

GTG

TCA

AAG

ACA

272

Leu

Arg 20

Ala

Asp

Val

Gly

Pro 25

Thr

Glu

Gin

Asp

Asp 30

Val

Ser

Lys

Thr

TTG

CTC

GAT

AGG

TTT

AAT

TGC

GTT

GCG

GTT

TTT

GTC

CCT

ACT

TCA

AAA

320

Leu 35

Leu

Asp

Arg

Phe

Asn 40

Cys

Val

Ala

Val

Phe 45

Val

Pro

Thr

Ser

Lys 50

TGG

GAC

CAA

TAT

TAT

CAC

TGC

TTT

TGT

AAG

CAG

TAT

TTG

TGG

CCG

ATA

368

Trp

Asp

Gin

Tyr

Tyr 55

His

Cys

Phe

Cys

Lys 60

Gin

Tyr

Leu

Trp

Pro 65

íle

TTT

CAT

TAC

AAG

GTT

CCC

GCT

TCT

GAC

GTC

AAG

AGT

GTC

CCG

AAT

AGT

416

Phe

His

Tyr

Lys 70

Val

Pro

Ala

Ser

Asp 75

Val

Lys

Ser

Val

Pro 80

Asn

Ser

CGG

GAT

TCA

TGG

AAC

GCT

TAT

GTT

CAC

GTG

AAC

AAA

GAG

TTT

TCC

CAG

464

Arg

Asp

Ser 85

Trp

Asn

Ala

Tyr

Val 90

His

Val

Asn

Lys

Glu 95

Phe

Ser

Gin

120

AAG GTG ATG GAG GCA

GTA Val

ACC AAT Thr Asn 105

GCT AGC AAT TAT GTA TGG ATA CAT '

512

Lys Val Met 100

Glu

Ala

Ala

Ser

Asn

Tyr 110

Val Trp íle

His

GAC

TAC

CAT

TTA

ATG

ACG

CTA

CCG

ACT

TTC

TTG

AGG

CGG

GAT

TTT

TGT

560

Asp

Tyr

His

Leu

Met

Thr

Leu

Pro

Thr

Phe

Leu

Arg

Arg

Asp

Phe

Cys

115

120

125

130

CGT

TTT

AAA

ATC

GGT

TTT

TTT

CTG

CAT

AGC

CCG

TTT

CCT

TCC

TCG

GAG

608

Arg

Phe

Lys

íle

Gly

Phe

Phe

Leu

His

Ser

Pro

Phe

Pro

Ser

Ser

Glu

135

140

145

GTT

TAC

AAG

ACC

CTA

CCA

ATG

AGA

AAC

GAG

CTC

TTG

AAG

GGT

CTG

TTA

656

Val

Tyr

Lys

Thr

Leu

Pro

Met

Arg

Asn

Glu

Leu

Leu

Lys

Gly

Leu

Leu

150

155

160

AAT

GCT

GAT

CTT

ATC

GGG

TTC

CAT

ACA

TAC

GAT

TAT

GCC

CGT

CAT

TTT

704

Asn

Ala

Asp

Leu

íle

Gly

Phe

His

Thr

Tyr

Asp

Tyr

Ala

Arg

His

Phe

165

170

175

•

CTA

ACG

TGT

TGT

AGT

CGA

ATG

TTT

GGT

TTG

GAT

CAT

CAG

TTG

AAA

AGG

752

Leu

Thr

Cys

Cys

Ser

Arg

Met

Phe

Gly

Leu

Asp

His

Gin

Leu

Lys

Arg

180

185

190

800

GGG TAC ATT Gly Tyr íle •195.........

GAA TAT Glu Tyr 200

AAT GGA AGG AGC ATT GAG ATC Asn Gly Arg Ser Ile„Glu íle.

AAG ATA Lvs IIe

áag gBg^gcLggg^tt CAŤ ®raŕŠ3J3T33^ . Lys Ala *SerGly - tie - His -VeŠ^giyťR;“

215 220

225

CCC GAT ACA AGA TTA CAA GTT

CAA GAA CTA AAA AAA CGT TTC GAA GGG

896

Pro Asp Thr Arg

Leu Gin

Val

Gin

Glu Leu 235

Lys Lys Arg

Phe 240

Glu Gly

230

AAA

ATC

GTG

CTA

CTT

GGA

GTT

GAT

GAT

TTG

GAT

ATA

TTC

AAA

GGT

GTG

944

Lys

íle

Val

Leu

Leu

Gly

Val

Asp

Asp

Leu

Asp

íle

Phe

Lys

Gly

Val

245

250

255

-·

AAC

TTC

AAG

GTT

TTA

GCG

TTG

GAG

AAG

TTA

CTT

AAA

TCA

CAC

CCG

AGT

992

Asn

Phe

Lys

Val

Leu

Ala

Leu

Glu

Lys

Leu

Leu

Lys

Ser

His

Pro

Ser

260

265

270

TGG

CAA

GGG

CGT

GTG

GTT

TTG

GTG

CAA

ATC

TTG

AAT

CCC

GCT

CGC

GCG

1040

Trp

Gin

Gly

Arg

Val

Val

Leu

Val

Gin

íle

Leu

Asn

Pro

Ala

Arg

Ala

275

280

285

290

CGT

TGC

CAA

GAC

GTC

GAT

GAG

ATC

AAT

GCC

GAG

ATA

AGA

ACA

GTC

TGT

1088

Arg

Cys

Gin

Asp

Val

Asp

Glu

íle

Asn

Ala

Glu

íle

Arg

Thr

Val

Cys

295

300

305

GAA

AGA

ATC

AAT

AAC

GAA

CTG

GGA

AGC

CCG

GGA

TAC

CAG

CCC

GTT

GTG

1136

Glu

Arg

Xle

Asn

Asn

Glu

Leu

Gly

Ser

Pro

Gly

Tyr

Gin

Pro

Val

Val

310 315 320

121

TTA ATT

GAT GGG CCC GTT TCG TTA AGT GAA AAA GCT

GCT Ala 335

TAT TAT

GCT Ala

1184

Leu

íle

Asp 325

Gly

Pro

Val

Ser Leu 330

Ser

Glu

Lys

Ala

Tyr

Tyr

ATC

GCC

GAT

ATG

GCA

ATT

GTT

ACA

CCG

TTA

CGT

GAC

GGC

ATG

AAT

CTT

1232

íle

Ala

Asp

Met

Ala

íle

Val

Thr

Pro

Leu

Arg

Asp

Gly

Met

Asn

Leu

340

345

350

ATC

CCG

TAC

GAG

TAC

GTC

GTT

TCC

CGA

CAA

AGT

GTT

AAT

GAC

CCA

AAT

1280

íle

Pro

Tyr

Glu

Tyr

Val

Val

Ser

Arg

Gin

Ser

Val

Asn

Asp

Pro

Asn

355

360

365

370

CCC

AAT

ACT

CCA

AAA

AAG

AGC

ATG

CTA

GTG

GTC

TCC

GAG

TTC

ATC

GGG

1328

Pro

Asn

Thr

Pro

Lys

Lys

Ser

Met

Leu

Val

Val

Ser

Glu

Phe

íle

Gly

375

380

385

TGT

TCA

CTA

TCT

TTA

ACC

GGG

GCC

ATA

CGG

GTC

AAC

CCA

TGG

GAT

GAG

1376

Cys

Ser

Leu

Ser

Leu

Thr

Gly

Ala

íle

Arg

Val

Asn

Pro

Trp

Asp

Glu

390

395

400

1

1

TTG

GAG

ACA

GCA

GAA

GCA

TTA

TAC

GAC

GCA

CTC

ATG

GCT

CCT

GAT

GAC

1424

Leu

Glu

Thr

Ala

Glu

Ala

Leu

Tyr

Asp

Ala

Leu

Met

Ala

Pro

Asp

Asp

405

410

415

CAT

AAA

GAA

ACC

GCC

CAC

ATG

AAA

CAG

TAT

CAA

TAC

ATT

ATC

TCC

CAT

1472

His Lys Glu Thr Ala His -Mg.t-.Xys-.ClB------mi.; Ímnsasšďi^jBMMaMaEEBj

---- - - - 35^^Γ-^-^(·ββββ8«βί6ΐβ····(··Ι

GATGTA GCT AAC-TOG'GCT!

- _-__βχ-.-ΐ. -i

Asp 435

Vaľ Ala

Ašn

Trp

Áía 440

Arg Sér

Phe

Phe

Gin Asp 445

Leu

Glu

Glň

Ala 450

TGC

ATC

GAT

CAT

TCT

CGT

AAA

CGA

TGC

ATG

AAT

TTA

GGA

TTT

GGG

TTA

1568

Cys

íle

Asp

His

Ser 455

Arg

Lys

Arg

Cys

Met 460

Asn

Leu

Gly

Phe

Gly 465

Leu

GAT

ACT

AGA

GTC

GTT

CTT

TTT

GAT

GAG

AAG

TTT

AGC

AAG

TTG

GAT

ATA

1616

Asp

Thr

Arg

Val 470

Val

Leu

Phe

Asp

Glu 475

Lys

Phe

Ser

Lys

Leu 480

Asp

íle

ŕ

GAT

GTC

TTG

GAG

AAT

GCT

TAT

TCC

ATG

GCT

CAA

AAT

CGG

GCC

ATA

CTT

1664

Asp

Val

Leu 485

Glu

Asn

Ala

Tyr

Ser 490

Met

Ala

Gin

Asn

Arg 495

Ala

íle

Leu

TTG

GAC

TAT

GAC

GGC

ACT

GTT

ACT

CCA

TCT

ATC

AGT

AAA

TCT

CCA

ACT

1712

Leu

Asp 500

Tyr

Asp

Gly

Thr

Val 505

Thr

Pro

Ser

íle

Ser 510

Lys

Ser

Pro

Thr

GAA

GCT

GTT

ATC

TCC

ATG

ATC

AAC

AAA

CTG

TGC

AAT

GAT

CCA

AAG

AAC

1760

Glu 515

Ala

Val

íle

Ser

Met 520

íle

Asn

Lys

Leu

Cys 525

Asn

Asp

Pro

Lys

Asn 530

ATG

GTG

TTC

ATC

GTT

AGT

GGA

CGC

AGT

AGA

GAA

AAT

CTT

GGC

AGT

TGG

1808

Met

Val

Phe

íle

Val 535

Ser

Gly

Arg

Ser

Arg 540

Glu

Asn

Leu

Gly

Ser 545

Trp

122

TTC GGC

GCG TGT GAG

AAA Lys

CCC GCC ATT GCA GCT GAG CAC GGA TAC TTT

1856

Phe

Gly

Ala

Cys Glu 550

Pro Ala

íle 555

Ala Ala

Glu His

Gly 560

Tyr

Phe

ATA

AGG

TGG

GCG

GGT

GAT

CAA

GAA

TGG

GAA

ACG

TGC

GCA

CGT

GAG

AAT

1904

íle

Arg

Trp

Ala

Gly

Asp

Gin

Glu

Trp

Glu

Thr

Cys

Ala

Arg

Glu

Asn

565

570

575

AAT

GTC

GGG

TGG

ATG

GAA

ATG

GCT

GAG

CCG

GTT

ATG

AAT

CTT

TAT

ACA

1952

Asn

Val

Gly

Trp

Met

Glu

Met

Ala

Glu

Pro

Val

Met

Asn

Leu

Tyr

Thr

580

585

590

GAA

ACT

ACT

GAC

GGT

TCG

TAT

ATT

GAA

AAG

AAA

GAA

ACT

GCA

ATG

GTT

2000

Glu

Thr

Thr

Asp

Gly

Ser

Tyr

íle

Glu

Lys

Lys

Glu

Thr

Ala

Met

Val

595

600

605

610

TGG

CAC

TAT

GAA

GAT

GCT

GAT

AAA

GAT

CTT

GGG

TTG

GAG

CAG

GCT

AAG

2048

Trp

His

Tyr

Glu

Asp

Ala

Asp

Lys

Asp

Leu

Gly

Leu

Glu

Gin

Ala

Lys

615

620

625

GAA

CTG

TTG

GAC

CAT

CTT

GAA

AAC

GTG

CTC

GCT

AAT

GAG

CCC

GTT

GAA

2096

Glu

Leu

Leu

Asp

His

Leu

Glu

Asn

Val

Leu

Ala

Asn

Glu

Pro

Val

Glu

630

635

640

GTG

AAA

CGA

GGT

CAA

TAC

ATT

GTA

GAA

GTT

AAA

C

2130

Val

Lys

Arg

Gly

Gin

Tyr

íle

Val

Glu

Val

Lys

(A) Dĺžka: 653 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 27:

Met 1

His

íle

Lys

Asp 5

Ala

Leu

Pro

Ala

Ala 10

Val

Glu

Val

Phe

Tyr 15

Val

Gly

Ala

Leu

Arg 20

Ala

Asp

Val

Gly

Pro 25

Thr

Glu

Gin

Asp

Asp 30

Val

Ser

Lys

Thr

Leu 35

Leu

Asp

Arg

Phe

Asn 40

Cys

Val

Ala

Val

Phe 45

Val

Pro

Thr

Ser

Lys 50

Trp

Asp

Gin

Tyr

Tyr 55

His

Cys

Phe

Cys

Lys 60

Gin

Tyr

Leu

Trp

Pro 65

íle

Phe

His

Tyr

Lys 70

Val

Pro

Ala

Ser

Asp 75

Val

Lys

Ser

Val

Pro 80

Asn

Ser

Arg

Asp

Ser

Trp

Asn

Ala

Tyr

Val

His

Val

Asn

Lys

Glu

Phe

90 95

123

Ser

Gin

Lys

Val

Met

Glu

Ala

Val

Thr

Asn

Ala

Ser

Asn

Tyr

Val

Trp

100

105

110

íle

His

Asp

Tyr

His

Leu

Met

Thr

Leu

Pro

Thr

Phe

Leu

Arg

Arg

Asp

115

120

125

Phe

Cys

Arg

Phe

Lys

íle

Gly

Phe

Phe

Leu

His

Ser

Pro

Phe

Pro

Ser

130

135

140

Ser

Glu

Val

Tyr

Lys

Thr

Leu

Pro

Met

Arg

Asn

Glu

Leu

Leu

Lys

Gly

145

150

155

160

Leu

Leu

Asn

Ala

Asp

Leu

íle

Gly

Phe

His

Thr

Tyr

Asp

Tyr

Ala

Arg

165

170

175

His

Phe

Leu

Thr

Cys

Cys

Ser

Arg

Met

Phe

Gly

Leu

Asp

His

Gin

Leu

180

185

190

Lys

Arg

Gly

Tyr

íle

Phe

Leu

Glu

Tyr

Asn

Gly

Arg

Ser

íle

Glu

íle

195

200

205

Lys

íle

Lys

Ala

Ser

Gly

íle

His

Val

Gly Arg

Met

Glu

Ser

Tyr

Leu

210

215

220

Ser

Gin

Pro

Asp

Thr

Arg

Leu

Gin

Val

Gin

Glu

Leu

Lys

Lys

Arg

Phe

225

.. ......

-.230.

-—α-ι

1

’Glrr’Oíy’tysi's

Gly Val Asn Phe Lys Val Leu Ala Leu Glu Lys Leu Leu Lys Ser His 260 265 270

Pro

Ser

Trp

Gin

Gly

Arg

Val

Val

Leu

Val

Gin

íle

Leu

Asn

Pro

Ala

275

280

285

Arg

Ala

Arg

Cys

Gin

Asp

Val

Asp

Glu

íle

Asn

Ala

Glu

íle

Arg

Thr

290

295

300

Val

Cys

Glu

Arg

íle

Asn

Asn

Glu

Leu

Gly

Ser

Pro

Gly

Tyr

Gin

Pro

305

310

315

320

Val

Val

Leu

íle

Asp

Gly

Pro

Val

Ser

Leu

Ser

Glu

Lys

Ala

Ala

Tyr

325

330

335

Tyr

Ala

íle

Ala

Asp

Met

Ala

íle

Val

Thr

Pro

Leu

Arg

Asp

Gly

Met

340

345

350

Asn

Leu

íle

Pro

Tyr

Glu

Tyr

Val

Val

Ser

Arg

Gin

Ser

Val

Asn

Asp

355

360

365

Pro

Asn

Pro

Asn

Thr

Pro

Lys

Lys

Ser

Met

Leu

Val

Val

Ser

Glu

Phe

370

375

380

íle

Gly

Cys

Ser

Leu

Ser

Leu

Thr

Gly

Ala

íle

Arg

Val

Asn

Pro

Trp

385

390

395

400 ·.

124

Asp

Glu

Leu

Glu

Thr 405

Ala

Glu

Ala

Leu

Tyr 410

Asp

Ala

Leu

Met

Ala 415

Pro

Asp

Asp

His

Lys 420

Glu

Thr

Ala

His

Met 425

Lys

Gin

Tyr

Gin

Tyr 430

íle

íle

Ser

His

Asp 435

Val

Ala

Asn

Trp

Ala 440

Arg

Ser

Phe

Phe

Gin 445

Asp

Leu

Glu

Gin

Ala 450

Cys

íle

Asp

His

Ser 455

Arg

Lys

Arg

Cys

Met 460

Asn

Leu

Gly

Phe

Gly 465

Leu

Asp

Thr

Arg

Val 470

Val

Leu

Phe

Asp

Glu 475

Lys

Phe

Ser

Lys

Leu 480

Asp

íle

Asp

Val

Leu 485

Glu

Asn

Ala

Tyr

Ser 490

Met

Ala

Gin

Asn

Arg 495

Ala

íle

Leu

Leu

Asp 500

Tyr

Asp

Gly

Thr

Val 505

Thr

Pro

Ser

íle

Ser 510

Lys

Ser

Pro

Thr

Glu 515

Ala

Val

íle

Ser

Met 520

íle

Asn

Lys

Leu

Cys 525

Asn

Asp

Pro

Lys

Asn 530

Met

Val

Phe

íle

Val 535

Ser

Gly

Arg

Ser

Arg 540

Glu

Asn

Leu

Gly

5-gy

565 570 575

Tyr ^he ilé

C2)

Glu

Asn

Asn

Val

Gly

Trp

Met

Glu

Met

Ala

Glu

Pro

Val

Met

Asn

Leu

580

585

590

Tyr

Thr

Glu

Thr

Thr

Asp

Gly

Ser

Tyr

íle

Glu

Lys

Lys

Glu

Thr

Ala

595

600

605

Met

Val

Trp

His

Tyr

Glu

Asp

Ala

Asp

Lys

Asp

Leu

Gly

Leu

Glu

Gin

610

615

620

Ala

Lys

Glu

Leu

Leu

Asp

His

Leu

Glu

Asn

Val

Leu

Ala

Asn

Glu

Pro

625

630

635

640

Val

Glu

Val

Lys

Arg

Gly

Gin

Tyr

íle

Val

Glu

Val

Lys

645

650

Informácie

o

SEQ

ID

NO s

28:

C i) Charakteristika sekvencie: C A) DÍžka: 390 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: dva

CD) Topológia: lineárna

125

Cii) Typ molekuly: cDNA k mRNA Ciii) Hypotetický: Nie Ciii) Antisence: Nie C vi) Pôvodný zdroj:

C A) Organizmus: Helianthus annuus Cix) Vlastnosti:

C A) Meno/KľúC* CDS

C B) Umiestenie: 3..258

CD) Ďalšie informácie: /čiastočná

Cxi) Popis sekvencie: SEO ID NO: 28:

TT GCA GAG AAG ATT TTT GCG TTC ATG GCT GAA AAG GGA AAA CAG GCT 47

Ala Glu Lys íle Phe Ala Phe Met Ala Glu Lys Gly Lys Gin Ala

5 10 15 .

GAT TTC GTG TTG AGC GTT GGA GAT GAT AGA AGT GAT GAA GAC ATG TTT 95

Asp Phe Val Leu Ser Val Gly Asp Asp Arg Ser Asp Glu Asp Met Phe

25 30

GTG GCC ATT GGG GAT GGA ATA AAA AAG GGT CGG ATA ACT AAC AAC AAT 143

Val Ala íle Gly Asp Gly íle Lys Lys Gly Arg íle Thr Asn Asn Asn

TTT TTA Phe Leu 65	GAC Asp	GAG ACG AAA GAT GTT TCA ATG ATG CTC GAG AAG CTC GGG	239
Glu	Thr	Lys	Asp 70	Val	Ser Met Met Leu 75	Glu Lys	Leu Gly
TGT CTC	AGC	AAC	CAA	GGA	T GATGATCCGG AAGCTTCTCG	TGATCTTTAT	288
Cys Leu	Ser	Asn	Gin	Gly
80				85

GAGTTAAAAG TTTTCGACTT TTTCTTCATC AAGATTCATG GGAAAGTTGT TCAATATGAA 348

CTTGTGTTTC TTGGTTCTGG ATTTTAGGGA GTCTATGGAT CC 390

C2) Informácie o SEO ID NO: 29:

C i) Charakteristika sekvencie:

CA) DÍžka: 85 aminokyselín C B) Typ: aminokyselina CD) Topológia: lineárna

Cii) Typ molekuly: proteín

Cxi) Popis sekvencie: SEO ID NO: 29·.

126

Ala

Glu

Lys

íle

Phe

Ala

Phe

Met

Ala

Glu

Lys

Gly

Lys

Gin

Ala

Asp

1

5

10

15

Phe

Val

Leu

Ser

Val

Gly

Asp

Asp

Arg

Ser

Asp

Glu

Asp

Met

Phe

Val

20

25

30

Ala

íle

Gly

Asp

Gly

íle

Lys

Lys

Gly

Arg

íle

Thr

Asn

Asn

Asn

Ser

35

40

45

Val

Phe

Thr

Cys

Val

Val

Gly

Glu

Lys

Pro

Ser

Ala

Ala

Glu

Tyr

Phe

50

55

60

Leu

Asp

Glu

Thr

Lys

Asp

Val

Ser

Met

Met

Leu

Glu

Lys

Leu

Gly

Cys

65

70

75

80

Leu Ser Asn Gin Gly 85

C 2) Informácie o SEO ID NO: 30:

(i) Charakteristika sekvencie: (A) Dĺžka: 24 párov báz C B) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: jeden

CD) Topológia: lineárna

Cxi) Popis sekvencie: SEO ID NO: 301

CCAIGGRTTI ACXCKDATIG CICC

C2) Informácie o SEO ID NO: 31:

C i) Charakteristika sekvencie·.

C A) DÍžka: 23 párov báz C B) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: jeden

CD) Topológia: lineárna

Cii) Typ molekuly: cDNA

Ciii) Hypotetický: Nie Ciii) Antisence: Nie

Cxi) Popis sekvencie: SEO ID NO: 31:

ATHGTIGTIW SIAAYMRIYT ICC

127 (2) Informácie o SEO ID NO: 32:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 20 párov báz

C B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: Nie (iii) Antisence: Nie (xi) Popis sekvencie: SEO ID NO: 32:

YTITGGCCIA TITTYCAYTA (2) Informácie o SEO ID NO: 33:

(i)

Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 20 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: jeden (D) Topológia: lineárna Typ molekuly: cDNA Hypotetický: Nie

TGRTCIARIA RYTCYTTIGC

Z20 (2) Informácie o SEO ID NO: 34:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 20 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: Nie (iii) Antisence: Nie (xi) Popis sekvencie: SEO ID NO: 34:

TCRTCIGTRA ARTCRTCICC

128 (2) Informácie ο SEQ ID ΝΟχ 35:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 20 párov báz

C B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: Nie (iii) Aritiserice: Nie (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 35:

TTYGAYTAYG AYGGIACIYT (2) Informácie o SEQ ID NO: 36:

(i)

Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 20 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: jeden (D) Topológia: lineárna Typ molekuly: cDNA (ii)

(2) Informácie o SEQ ID NO: 37:

(i) (ii) (iii) (iii)

Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 20 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: jeden (D) Topológia: lineárna Typ molekuly: cDNA Hypotetický: Nie Antisence: Nie (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 37

ATIGCIAARC CIGTIATGAA

129 (2) Informácie o SEQ ID NO: 38:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 20 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: Nie (iii) Aritisence: Nie (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 38:

CCIACIGTRC AIGCRAAIAC (2) Informácie o SEQ ID NO: 39:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 2982 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: dva (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Nie

(iii) Antisence: Nie

Γ Íl · JL JL IiMMIBg

(B) Umiestenie: 64..2982 (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 39:

ATAAACTTCC TCGCGGCCGC CAGTGTGAGT AATTTAGTTT TGGTTCTGTT TTGGTGTGAG 60

CGT

ATG Met 1

CCT Pro

GGA AAT

AAG TAC AAC TGC AGT TCT TCT CAT ATC

CCA CTC Pro Leu 15

108

Gly

Asn

Lys Tyr 5

Asn

Cys

Ser

Ser 10

Ser

His

íle

TCT

CGA

ACA

GAA

CGC

CTC

TTG

AGA

GAT

AGA

GAG

CTT

AGA

GAG

AAG

AGG

156

Ser

Arg

Thr

Glu

Arg

Leu

Leu

Arg

Asp

Arg

Glu

Leu

Arg

Glu

Lys

Arg

20

25

30

AAG

AGC

AAC

CGA

GCT

CGT

AAT

CCT

AAT

GAC

GTT

GCT

GGC

AGT

TCC

GAG

204

Lys

Ser

Asn

Arg

Ala

Arg

Asn

Pro

Asn

Asp

Val

Ala

Gly

Ser

Ser

Glu

40 45

130

AAC TCT

GAG AAT Glu Asn 50

GAC TTG CGT TTA GAA

GGT GAC AGT TCA AGG CAG

TAT Tyr

252

Asn

Ser

Asp Leu

Arg

Leu Glu 55

Gly

Asp Ser

Ser 60

Arg

Gin

GTT

GAA

CAG

TAC

TTG

GAA

GGG

GCT

GCT

GCT

GCA

ATG

GCG

CAC

GAT

GAT

300

Val

Glu

Gin

Tyr

Leu

Glu

Gly

Ala

Ala

Ala

Ala

Met

Ala

His

Asp

Asp

65

70

75

GCG

TGT

GAG

AGG

CAA

GAA

GTT

AGG

CCT

TAT

AAT

AGG

CAA

CGA

CTA

CTT

348

Ala

Cys

Glu

Arg

Gin

Glu

Val

Arg

Pro

Tyr

Asn

Arg

Gin

Arg

Leu

Leu

80

85

90

95

GTA

GTG

GCT

AAC

AGG

CTC

CCA

GTT

TCT

CCC

GTG

AGA

AGA

GGT

GAA

GAT

396

Val

Val

Ala

Asn

Arg

Leu

Pro

Val

Ser

Pro

Val

Arg

Arg

Gly

Glu

Asp

100

105

110

TCA

TGG

TCT

CTT

GAG

ATC

AGT

GCT

GGT

GGT

CTA

GTC

AGT

GCT

CTC

TTA

444

Ser

Trp

Ser

Leu

Glu

íle

Ser

Ala

Gly

Gly

Leu

Val

Ser

Ala

Leu

Leu

115

120

125

GGT

GTA

AAG

GAA

TTT

GAG

GCC

AGA

TGG

ATA

GGA

TGG

GCT

GGA

GTT

AAT

492

Gly

Val

Lys

Glu

Phe

Glu

Ala

Arg

Trp

íle

Gly

Trp

Ala

Gly

Val

Asn

130

135

140

GTG

CCT

GAT

GAG

GTT

GGA

CAG

AAG

GCA

CTT

AGC

AAA

GCT

TTG

GCT

GAG

540

Val

Pro

Asp

Glu

Val

Gly

Gin

Lys

Ala

Leu

Ser

Lys

Ala

Leu

Ala

Glu

145

150

155

TAT AAT Tyr Asn

GGT TAC TGC

AAC AAT Asn Asn

ATT CTG TGG CCT CTG TTT CAC TAC CTT

636

Gly

Tyr

Cys 180

íle Leu

Trp 185

Pro

Leu

Phe

His

Tyr 190

Leu

GGA

CTT

CCG

CAA

GAA

GAT

CGG

CTT

GCC

ACA

ACC

AGA

AGC

TTT

CAG

TCC

684

Gly

Leu

Pro

Gin

Glu

Asp

Arg

Leu

Ala

Thr

Thr

Arg

Ser

Phe

Gin

Ser

195

200

205

CAA

TTT

GCT

GCA

TAC

AAG

AAG

GCA

AAC

CAA

ATG

TTC

GCT

GAT

GTT

GTA

732

Gin

Phe

Ala

Ala

Tyr

Lys

Lys

Ala

Asn

Gin

Met

Phe

Ala

Asp

Val

Val

210

215

220

AAT

GAG

CAC

TAT

GAA

GAG

GGA

GAT

GTC

GTC

TGG

TGC

CAT

GAC

TAT

CAT

780

Asn

Glu

His

Tyr

Glu

Glu

Gly

Asp

Val

Val

Trp

Cys

His

Asp

Tyr

His

225

230

235

CTT

ATG

TTC

CTT

CCT

AAA

TGC

CTT

AAG

GAG

TAC

AAC

AGT

AAG

ATG

AAA

828

Leu

Met

Phe

Leu

Pro

Lys

Cys

Leu

Lys

Glu

Tyr

Asn

Ser

Lys

Met

Lys

240

245

250

255

GTT

GGA

TGG

TTT

CTC

CAT

ACA

CCA

TTC

CCT

TCG

TCT

GAG

ATA

CAC

AGG

876

Val

Gly

Trp

Phe

Leu

His

Thr

Pro

Phe

Pro

Ser

Ser

Glu

íle

His

Arg

260

265

270

131

ACA

CTT

CCA

TCA

CGA

TCA

GAG

CTC

CTT

CGG

TCA

GTT

CTT

GCT

GCT

GAT

924

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Ser

Glu

Leu

Leu

Arg

Ser

Val

Leu

Ala

Ala

Asp

275

280

285

' TTA

GTT

GGC

TTC

CAT

ACA

TAT

GAC

TAT

GCA

AGG

CAC

TTT

GTG

AGT

GCG

972

Leu

Val

Gly

Phe

His

Thr

Tyr

Asp

Tyr

Ala

Arg

His

Phe

Val

Ser

Ala

290

295

300

TGC

ACT

CGT

ATT

CTT

GGA

CTT

GAA

GGA

ACA

CCT

GAG

GGA

GTT

GAG

GAT

1020

Cys

Thr

Arg

íle

Leu

Gly

Leu

Glu

Gly

Thr

Pro

Glu

Gly

Val

Glu

Asp

305

310

315

CAA

GGC

AGG

CTC

ACT

CGT

GTA

GCT

GCT

TTT

CCA

ATT

GGC

ATA

GAT

TCT

1068

Gin

Gly

Arg

Leu

Thr

Arg

Val

Ala

Ala

Phe

Pro

íle

Gly

íle

Asp

Ser

320

325

330

335

GAT

CGG

TTT

ATA

CGA

GCA

CTT

GAG

GTC

CCC

GAA

GTC

AAA

CAA

CAC

ATG

1116

Asp

Arg

Phe

íle

Arg

Ala

Leu

Glu

Val

Pro

Glu

Val

Lys

Gin

His

Met

340

345

350

AAG

GAA

TTG

AAA

GAA

AGA

TTT

ACT

GAC

AGA

AAG

GTG

ATG

TTA

GGT

GTT

1164

Lys

Glu

Leu

Lys

Glu

Arg

Phe

Thr

Asp

Arg

Lys

Val

Met

Leu

Gly

Val

355

360

365

GAT

CGT

CTT

GAC

ATG

ATC

AAA

GGG

ATT

CCA

CAA

AAG

ATT

CTG

GCA

TTC

1212

Asp

Arg Leu

Asp

Met

íle

Lys Gly

íle

Pro

Gin

Lys

íle -aftA.

Leu Ala

Phe

k-WÄ»- í 1

_ r??*·—

GAA. AAAľľTyr -CTg^SAS^GAA *λ*Φ6Α-M&? '

385

390

395

TTG

AAA

ATT

GCG

GTG

CCA

ACA

AGA

CCT

GAC

GTT

CCT

GAG

TAT

CAA

ACA

1308

Leu

Lys

íle

Ala

Val

Pro

Thr

Arg

Pro

Asp

Val

Pro

Glu

Tyr

Gin

Thr

400

405

410

415

CTC

ACA

AGC

CAA

GTT

CAT

GAA

ATT

GTT

GGC

CGC

ATT

ATT

GGT

CGT

CTC

1356

Leu

Thr

Ser

Gin

Val

His

Glu

íle

Val

Gly

Arg

íle

íle

Gly

Arg

Leu

420

425

430

GGG

ACA

CTG

ACT

GCA

GTT

CCA

ATA

CAT

CAT

CTG

GAT

CGG

TCT

CTG

GAC

1404

Gly

Thr

Leu

Thr

Ala

Val

Pro

íle

His

His

Leu

Asp

Arg

Ser

Leu

Asp

435

440

445

TTT

CAT

GCT

TTA

TGT

GCA

CTT

TAT

GCC

GTC

ACA

GAT

GTT

GCG

CTT

GTA

1452

Phe

His

Ala

Leu

Cys

Ala

Leu

Tyr

Ala

Val

Thr

Asp

Val

Ala

Leu

Val

450

455

460

ACA

TCT

TTG

AGA

GAT

GGG

ATG

AAT

CTT

GTC

AGT

TAT

GAG

TTT

GTT

GCT

1500

Thr

Ser

Leu

Arg

Asp

Gly

Met

Asn

Leu

Val

Ser

Tyr

Glu

Phe

Val

Ala

465

470

475

TGC

CAA

GAG

GCC

AAA

AAG

GGC

GTC

CTC

ATT

CTC

AGT

GAA

TTT

GCA

GGT

1548

Cys

Gin

Glu

Ala

Lys

Lys

Gly

Val

Leu

íle

Leu

Ser

Glu

Phe

Ala

Gly

480

485

490

495

132

GCT GCA CAG TCT CTG GGT GCT GGA GCT ATT CTT GTG AAT CCT TGG AAC 1596

Ala Ala Gin Ser Leu Gly Ala Gly Ala íle Leu Val Asn Pro Trp Asn

500 505 510

ATC ACA GAA GTT GCT GCC TCC ATT GGA CAA GCC CTA.AAC ATG ACA GCT 1644 íle Thr Glu Val Ala Ala Ser íle Gly Gin Ala Leu Asn Met Thr Ala

515 520 525

GAA GAA AGA GAG AAA AGA CAT CGC CAT AAT TTT CAT CAT GTC AAA ACT 1692

Glu Glu Arg Glu Lys Arg His Arg His Asn Phe His His Val Lys Thr

530 535 540

CAC

His

ACT GCT CAA GAA TGG GCT Thr Ala Gin Glu Trp Ala 545 550

GAA ACT TTT GTC AGT GAA Glu Thr Phe Val Ser Glu

555

CTA AAT GAC Leu Asn Asp

1740

ACT GTA ATT GAG GCG CAA CTA CGA ATT AGT AAA GTC CCA CCA GAG CTT Thr Val íle Glu Ala Gin Leu Arg íle Ser Lys Val Pro Pro Glu Leu 560 565 570 575

1788

GAT	GCA	ATT	CAA	CGG	TAT	TCA
Asp	Ala	íle	Gin	Arg	Tyr	Ser
	580					585
GGT	TTC	AAT	GCA	ACA	TTG	ACT
Gly	Phe	Asn	Ala	Thr	Leu	Thr
ľ595	es»“* -			ľ6QQ-	-

590

1836

1884

610 615 620

GAG CTT AAA

GGG Gly

CCC TTA AAG GCA TTA TGC

AGT GAT

CCA AGT ACA ACC

1980

Glu Leu

Lys

Pro

Leu

Lys Ala 630

Leu

Cys

Ser

Asp 635

Pro

Ser

Thr Thr

625

ATA

GTT

GTT

CTG

AGC

GGA

AGC

AGC

AGA

AGT

GTT

TTG

GAC

AAA

AAC

TTT

2028

íle

Val

Val

Leu

Ser

Gly

Ser

Ser

Arg

Ser

Val

Leu

Asp

Lys

Asn

Phe

640

645

650

655

k

GGA

GAG

TAT

GAC

ATG

TGG

CTG

GCA

GCA

GAA

AAT

GGG

ATG

TTC

CTA

AGG

2076

Gly

Glu

Tyr

Asp

Met

Trp

Leu

Ala

Ala

Glu

Asn

Gly

Met

Phe

Leu

Arg

660

665

670

CTT

ACG

AAT

GGA

GAG

TGG

ATG

ACT

ACA

ATG

CCA

GAA

CAC

TTG

AAC

ATG

2124

Leu

Thr

Asn

Gly

Glu

Trp

Met

Thr

Thr

Met

Pro

Glu

His

Leu

Asn

Met

675

680

685

GAA

TGG

GTT

GAT

AGC

GTA

AAG

CAT

GTT

TTC

AAG

TAC

TTC

ACT

GAG

AGA

2172

Glu

Trp

Val

Asp

Ser

Val

Lys

His

Val

Phe

Lys

Tyr

Phe

Thr

Glu

Arg

690

695

700

ACT

CCC

AGG

TCA

CAC

TTT

GAA

ACT

CGC

GAT

ACT

TCG

CTT

ATT

TGG

AAC

2220

Thr

Pro

Arg

Ser

His

Phe

Glu

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Leu

íle

Trp

Asn

705

710

715

133

TAC AAA TAT

GCA GAT

ATC GAA íle Glu 725

TTC GGG

AGA Arg

CTT CAA GCA AGA GAT TTG

2268

Tyr 720

Lys

Tyr

Ala

Asp

Phe

Gly

Leu 730

Gin

Ala

Arg

Asp

Leu 735

TTA

CAA

CAC

TTA

TGG

ACA

GGT

CCA

ATC

TCT

AAT

GCA

TCA

GTT

GAT

GTT

2316

Leu

Gin

His

Leu

Trp

Thr

Gly

Pro

íle

Ser

Asn

Ala

Ser

Val

Asp

Val

740

745

750

GTC

CAA

GGA

AGC

CGC

TCT

GTG

GAA

GTC

CGT

GCA

GTT

GGT

GTC

ACA

AAG

2364

Val

Gin

Gly

Ser

Arg

Ser

Val

Glu

Val

Arg

Ala

Val

Gly

Val

Thr

Lys

755

760

765

GGA

GCT

GCA

ATT

GAT

CGT

ATT

CTA

GGA

GAG

ATA

GTG

CAT

AGC

AAG

TCG

2412

Gly

Ala

Ala

íle

Asp

Arg

íle

Leu

Gly

Glu

íle

Val

His

Ser

Lys

Ser

770

775

780

ATG

ACT

ACA

CCA

ATC

GAT

TAC

GTC

TTG

TGC

ATT

GGT

CAT

TTC

TTG

GGG

2460

Met

Thr

Thr

Pro

Íle

Asp

Tyr

Val

Leu

Cys

íle

Gly

His

Phe

Leu

Gly

785

790

795

AAG

GAC

GAA

GAT

GTT

TAC

ACT

TTC

TTC

GAA

CCA

GAA

CTT

CCA

TCC

GAC

2508

Lys

Asp

Glu

Asp

Val

Tyr

Thr

Phe

Phe

Glu

Pro

Glu

Leu

Pro

Ser

Asp

800

805

810

815

ATG CCA GCC ATT GCA CGA TCC AGA CCA TCA TCT GAC AGT GGA GCC AAG Met Pro Ala Ile..Ala.Arg Ser-Ara. Pr a---Ser_vSer_;

-----2556

TCA TCATCA GGAXag^CSAl

Ser

Seŕ

Ser

Gly 835

Asp

Arg

Arg

Pro

Pro 840

Ser

Lys

Ser

Thr

His 845

Asn

Asn

AAC

AAA

AGT

GGA

TCA

AAA

TCC

TCA

TCA

TCC

TCT

AAC

TCT

AAC

AAC

AAC

2652

Asn

Lys

Ser 850

Gly

Ser

Lys

Ser

Ser 855

Ser

Ser

Ser

Asn

Ser 860

Asn

Asn

Asn

AAC

AAG

TCC

TCA

CAG

AGA

TCT

CTT

CAG

TCA

GAG

AGA

AAA

AGT

GGA

TCC

2700

Asn

Lys 865

Ser

Ser

Gin

Arg

Ser 870

Leu

Gin

Ser

Glu

Arg 875

Lys

Ser

Gly

Ser .

AAC

CAT

AGC

TTA

GGA

AAC

TCA

AGA

CGT

CCT

TCA

CCA

GAG

AAG

ATC

TCA

2748

Asn 880

His

Ser

Leu

Gly

Asn 885

Ser

Arg

Arg

Pro

Ser 890

Pro

Glu

Lys

íle

Ser 895

TGG

AAT

GTG

CTT

GAC

CTC

AAA

GGA

GAG

AAC

TAC

TTC

TCT

TGC

GCT

GTG

2796

Trp

Asn

Val

Leu

Asp 900

Leu

Lys

Gly

Glu

Asn 905

Tyr

Phe

Ser

Cys

Ala 910

Val

GGT

CGT

ACT

CGC

ACC

AAT

GCT

AGA

TAT

CTC

CTT

GGC

TCA

CCT

GAC

GAC

.844

Gly

Arg

Thr

Arg 915

Thr

Asn

Ala

Arg

Tyr 920

Leu

Leu

Gly

Ser

Pro 925

Asp

Asp

GTC

GTT

TGC

TTC

CTT

GAG

AAG

CTC

GCT

GAC

ACC

ACT

TCC

TCA

CCT

TAA

2892

Val

Val

Cys

Phe

Leu

Glu

Lys

Leu

Ala

Asp

Thr

Thr

Ser

Ser

Pro

*

930 935 940

134

TAT CCC GAG ACA GTG TCA AGT GAG TTC ATG TAA CCC AAT AAA AAC TAT 2940

Tyr Pro Glu Thr Val Ser Ser Glu Phe Met * Pro Asn Lys Asn Tyr

945 950 955

TGT TTT GTA ACA AAA AGC AGC CAT TAC CAG ACT CTT TAG TGG 2982

Cys Phe Val Thr Lys Ser Ser His Tyr Gin Thr Leu * Trp

960 965 970

C2) Informácie o SEO ID NOs 40:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 973 aminokyselín C B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín

Cxi) Popis sekvencie: SEO ID NO: 40:

Met Pro Gly Asn Lys Tyr Asn Cys Ser Ser Ser His íle Pro Leu Ser 15 10 15

ArsrThr ^Glu ^S..^Le4. tfeU--:Arq

s§£^sn·-;

Ser Glu

35

40

Ser 60

45 Arg

Gin

Tyr

Val

Asn

Asp Leu

Arg Leu Glu 55

Gly

Asp

Ser

50

Glu

Gin

Tyr

Leu

Glu

Gly

Ala

Ala

Ala

Ala

Met

Ala

His

Asp

Asp

Ala

65

70

75

80

Cys

Glu

Arg

Gin

Glu

Val

Arg

Pro

Tyr

Asn

Arg

Gin

Arg

Leu

Leu

Val

90 95

Val

Ala

Asn

Arg 100

Leu

Pro

Val

Ser

Pro 105

Val

Arg

Arg

Gly

Glu 110

Asp

Ser

Trp

Ser

Leu 115

Glu

íle

Ser

Ala

Gly 120

Gly

Leu

Val

Ser

Ala 125

Leu

Leu

Gly

Val

Lys 130

Glu

Phe

Glu

Ala

Arg 135

Trp

íle

Gly

Trp

Ala 140

Gly

Val

Asn

Val

Pro 145

Asp

Glu

Val

Gly

Gin 150

Lys

Ala

Leu

Ser

Lys 155

Ala

Leu

Ala

Glu

Lys 160

Arg

Cys

íle

Pro

Val 165

Phe

Leu

Asp

Glu

Glu 170

íle

Val

His

Gin

Tyr 175

Tyr

Asn Gly Tyr Cys Asn Asn íle Leu Trp Pro Leu Phe His Tyr Leu Gly 180 185 190

135

Leu

Pro

Gin

Glu

Asp

Arg

Leu

Ala

Thr

Thr

Arg

Ser

Phe

Gin

Ser

Gin

195

200

205

Phe

Ala

Ala

Tyr

Lys

Lys

Ala

Asn

Gin

Met

Phe

Ala

Asp

Val

Val

Asn

210

215

220

Glu

His

Tyr

Glu

Glu

Gly

Asp

Val

Val

Trp

Cys

His

Asp

Tyr

His

Leu

225

230

235

240

Met

Phe

Leu

Pro

Lys

Cys

Leu

Lys

Glu

Tyr

Asn

Ser

Lys

Met

Lys

Val

245

250

255

Gly

Trp

Phe

Leu

His

Thr

Pro

Phe

Pro

Ser

Ser

Glu

íle

His

Arg

Thr

260

265

270

Leu

Pro

Ser

Arg

Ser

Glu

Leu

Leu

Arg

Ser

Val

Leu

Ala

Ala

Asp

Leu

275

280

285

Val

Gly

Phe

His

Thr

Tyr

Asp

Tyr

Ala

Arg

His

Phe

Val

Ser

Ala

Cys

290

295

300

Thr

Arg

íle.

Leu

Gly

Leu

Glu

Gly

Thr

Pro

Glu

Gly

Val

Glu

Asp

Gin

305

310

315

320

Gly

Arg

Leu

Thr

Arg

Val

Ala

Ala

Phe

Pro

íle

Gly

íle

Asp

Ser

Asp

335

325

Arg fhe.Žle.Arg^MÄ>Leu

330

Glu

Leu

Lys

Glu

Arg

Phe

Thr

Asp

Arg

Lys

Val

Met

Leu

Gly

Val

Asp

355

360

365

Arg

Leu

Asp

Met

íle

Lys

Gly

íle

Pro

Gin

Lys

íle

Leu

Ala

Phe

Glu

370

375

380

Lys

Phe

Leu

Glu

Glu

Asn

Ala

Asn

Trp

Arg

Asp

Lys

Val

Val

Leu

Leu

385

390

395

400

Lys

íle

Ala

Val

Pro

Thr

Arg

Pro

Asp

Val

Pro

Glu

Tyr

Gin

Thr

Leu

405

410

415

Thr

Ser

Gin

Val

His

Glu

íle

Val

Gly

Arg

íle

íle

Gly

Arg

Leu

Gly

420

425

430

Thr

Leu

Thr

Ala

Val

Pro

íle

His

His

Leu

Asp

Arg

Ser

Leu

Asp

Phe

•

435

440

445

His

Ala

Leu

Cys

Ala

Leu

Tyr

Ala

Val

Thr

Asp

Val

Ala

Leu

Val

Thr

450

455

460

Ser

Leu

Arg

Asp

Gly

Met

Asn

Leu

Val

Ser

Tyr

Glu

Phe

Val

Ala

Cys

465

470

475

480

Gin Glu Ala Lys Lys Gly Val Leu íle Leu Ser Glu Phe Ala Gly Ala 485 490 495

136

Ala Gin Ser Leu Gly Ala Gly Ala íle Leu Val Asn Pro Trp Asn íle 500 505 510

Thr Glu Val Ala Ala Ser íle Gly Gin Ala Leu Asn Met Thr Ala Glu 515 520 525

Glu Arg Glu Lys Arg His Arg His Asn Phe His His Val Lys Thr His 530 535 540

Thr Ala Gin Glu Trp Ala Glu Thr Phe Val Ser Glu Leu Asn Asp Thr

545 550 555 560

Val íle Glu Ala Gin Leu Arg íle Ser Lys Val Pro Pro Glu Leu Pro

565 570 575

Gin His Asp Ala íle Gin Arg Tyr Ser Lys Ser Asn Asn Arg Leu Leu 580 585 590 íle Leu Gly Phe Asn Ala Thr Leu Thr Glu Pro Val Asp Asn Gin Gly 595 600 605

Arg Arg Gly Asp Gin íle Lys Glu Met Asp Leu Asn Leu His Pro Glu 610 615 620

Leu Lys Gly Pro Leu Lys Ala Leu Cys Ser Asp Pro Ser Thr Thr íle

Glu

Tyr

Asp

Met 660

Trp

Leu

Ala

Ala

Glu 665

Asn

Gly

Met

Phe

Leu 670

Arg

Leu

Thr

Asn

Gly 675

Glu

Trp

Met

Thr

Thr 680

Met

Pro

Glu

His

Leu 685

Asn

Met

Glu

Trp

Val 690

Asp

Ser

Val

Lys

His 695

Val

Phe

Lys

Tyr

Phe 700

Thr

Glu

Arg

Thr

Pro 705

Arg

Ser

His

Phe

Glu 710

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser 715

Leu

íle

Trp

Asn

Tyr 720

Lys

Tyr

Ala

Asp

íle 725

Glu

Phe

Gly

Arg

Leu 730

Gin

Ala

Arg

Asp

Leu 735

Leu

Gin

His

Leu

Trp 740

Thr

Gly

Pro

íle

Ser 745

Asn

Ala

Ser

Val

Asp 750

Val

Val

Gin

Gly

Ser 755

Arg

Ser

Val

Glu

Val 760

Arg

Ala

Val

Gly

Val 765

Thr

Lys

Gly

Ala

Ala 770

íle

Asp

Arg

íle

Leu 775

Gly

Glu

íle

Val

His 780

Ser

Lys

Ser

Met

Thr

Thr

Pro

íle

Asp

Tyr

Val

Leu

Cys

íle

Gly

His

Phe

Leu

Gly

Lys

785 790 795 800

137

Asp

Glu

Asp

Val

Tyr 805

Thr

Phe

Phe

Glu

Pro 810

Glu

Leu

Pro

Ser

Asp 815

Met

Pro

Ala

Íle

Ala 820

Arg

Ser

Arg

Pro

Ser 825

Ser

Asp

Ser

Gly

Ala 830

Lys

Ser

Ser

Ser

Gly 835

Asp

Arg

Arg

Pro

Pro 840

Ser

Lys

Ser

Thr

His 845

Asn

Asn

Asn

Lys

Ser 850

Gly

Ser

Lys

Ser

Ser 855

Ser

Ser

Ser

Asn

Ser 860

Asn

Asn

Asn

Asn

Lys 865

Ser

Ser

Gin

Arg

Ser 870

Leu

Gin

Ser

Glu

Arg 875

Lys

Ser

Gly

Ser

Asn 880

His

Ser

Leu

Gly

Asn 885

Ser

Arg

Arg

Pro

Ser 890

Pro

Glu

Lys

íle

Ser 895

Trp

Asn

Val

Leu

Asp 900

Leu

Lys

Gly

Glu

Asn 905

Tyr

Phe

Ser

Cys

Ala 910

Val

Gly

Arg

Thr

Arg 915

Thr

Asn

Ala

Arg

Tyr 920

Leu

Leu

Gly

Ser

Pro 925

Asp

Asp

Val

Val

Cys

Phe

Leu

Glu

Lys

Leu

Ala

Asp

Thr

Thr

Ser

Ser

Pro

*

Tyr

930 935 940

965 970

C 2) Informácie o SEO ID NO: 41 =

C i) Charakteristika sekvencie:

C A) DÍžka: 300 párov báz íB) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: dva

CD) Topolúgia: lineárna

Cii) Typ molekuly·. cDNA k mRNA Ciii) Hypotetický: Nie

Ciii) Antisence: Nie Cvi) Pôvodný zdroj:

C A) Organizmus: Oryza sativa

Cxi) Popis sekvencie: SEO ID NO: 41:

ATAAACTTCC TCGGACCAAA GAAGAGCATG TTGGTTGTGT CGGAGTTTAT TGGTTGCTCA 60

CCTTCACTGA GTGGAGCCAT TCGTGTTAAC CCGTGGAATA TCGAGGCAAC TGCAGAGGCA 120

138

CTGAATGAGG

GTTATGTCAG

GGGCTTGCAA

CCATCTCAAT

CACCCATGAT

GGATCACTTT

GTCAGAGCGT

GTTGCATATT

AGGAAACCAT — I

AAAAGCAGCT GAGGCACGAA AAACATTACC

GGTCTAAGAG CTTTGTACAG GACCTGGAGA

GCTGGGGCAT TGGATTGGAT TTCGCTCAGG

180

240

300 <2) Informácie o SEO ID NO: 42:

<i)

C ii) Ciii) C iii) C vi)

Cix)

Charakteristika sekvencie:

C A) DÍžka: 627 párov báz

C B) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: dva

CD) Topológia: lineárna

Typ molekuly: cDNA k mRNA

Hypotetický: Nie

Antisence: Nie

Pôvodný zdroj:

C A) Organizmus: Selaginella lepidophylla Vlastnosti:

C A) ľleno/KIúč: CDS

C B) Umiestenie: 4..627

CD) Ďalšie informácie: /čiastočná

Cxi)

Popis sekveopie:— SEfcF-IQ—

ATT ATG TGG GTG CAT GAT

TAC CAC CTC TGT CTG GTC CCT CAG ATG

ATC íle 15

48

Met 1

Trp Val

His

Asp 5

Tyr His Leu Cys

Leu 10

Val

Pro

Gin Met

CGC

CAA

AAG

CTG

CCA

GAT

GTG

CAG

ATT

GGC

TTC

TTC

CTC

CAC

ACC

GCT

96

Arg

Gin

Lys

Leu

Pro

Asp

Val

Gin

íle

Gly

Phe

Phe

Leu

His

Thr

Ala

20

25

30

TTT

CCC

TCG

TCA

GAG

GTC

TTC

CGC

TGC

TTG

GCC

GCA

CGA

AAG

GAG

CTG

- 144

Phe

Pro

Ser

Ser

Glu

Val

Phe

Arg

Cys

Leu

Ala

Ala

Arg

Lys

Glu

Leu

35

40

45

CTG

GAC

GGC

ATG

CTT

GGT

GCC

AAC

TTG

GTT

GCT

TTC

CAG

ACG

CCA

GAG

192

Leu

Asp

Gly

Met

Leu

Gly

Ala

Asn

Leu

Val

Ala

Phe

Gin

Thr

Pro

Glu

50

55

60

TAT

GCA

CAC

CAC

TTC

CTC

CAG

ACG

TGC

AGT

CGC

ATT

TCT

CTG

CTG

AAG

240

Tyr

Ala

His

His

Phe

Leu

Gin

Thr

Cys

Ser

Arg

íle

Ser

Leu

Leu

Lys

65

70

75

CAA

CCG

AGG

AAG

GCG

TTC

AGC

TCG

TTT

CGT

CAA

TGT

CTG

GTC

ATA

ATG

288

Gin

Pro

Arg

Lys

Ala

Phe

Ser

Ser

Phe

Arg

Gin

Cys

Leu

Val

íle

Met

80

85

90

95

139

CAA Gin

GAA GCG

CTA Leu

CGA GGG

TCA Ser

AGA AGG TCA TCG

TTG Leu

CGC GTG Arg Val

ACA Thr 110

AGC ' Ser

336

Glu

Ala

Arg 100

Gly

Arg

Arg

Ser 105

Ser

TGA

CAA

CAT

CGC

GTG

TAC

GCG

AGA

AGC

TTC

TGT

CGT

ACG

AGC

TGT

TCT

384

*

Gin

His

Arg

Val

Tyr

Ala

Arg

Ser

Phe

Cys

Arg

Thr

Ser

Cys

Ser

115

120

125

TGA

ACA

AGA

ACC

CAC

AGT

GGA

GGG

ACA

AGG

TCG

TTC

TCA

TTC

AGG

TTG

432

★

Thr

Arg

Thr

His

Ser

Gly

Gly

Thr

Arg

Ser

Phe

Ser

Phe

Arg

Leu

130

135

140

CGA

CCT

CCA

CGA

CTG

AGG

ATT

CTG

AGC

TTG

CTG

CGA

CCG

TAT

CCG

AAA

480

Arg

Pro

Pro

Arg

Leu

Arg

íle

Leu

Ser

Leu

Leu

Arg

Pro

Tyr

Pro

Lys

145

150

155

TTG

TTA

CAC

GTA

TTG

ACG

CTG

TGC

ACT

CGA

CGC

TCA

CAC

ACA

CCC

ACT

528

Leu

Leu

His

Val

Leu

Thr

Leu

Cys

Thr

Arg

Arg

Ser

His

Thr

Pro

Thr

160

165

170

175

CGT

CTT

CCT

CAG

GCA

AGA

CAT

TGC

GTT

CTC

GCA

GTA

CCT

CGC

ACT

TCT

576

Arg

Leu

Pro

Gin

Ala

Arg

His

Cys

Val

Leu

Ala

Val

Pro

Arg

Thr

Ser

180

185

190

CTC

GAT

CGC

CGA

TGC

TCT

TGC

AAT

CAA

CTG

TTC

GAT

GGC

ATG

AAC

CTC

624

Leu

Asp

Arg

Arg

Cys

Ser

Cys

Asn

Gin

Leu

Phe

Asp

Gly

Met

Asn

Leu

195

200

205

C 2) Informácie o SEQ ID NO: 43:

C i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 208 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina
	CD)	Topológia: lineárna
Cii)	Typ	molekuly: proteín
Cxi)	Popis	; sekvencie: SEQ ID NC): 43:

Met 1

Trp

Val

His

Asp 5

Tyr

His

Leu

Cys

Leu 10

Val

Pro

Gin

Met

íle 15

Arg

Gin

Lys

Leu

Pro

Asp

Val

Gin

íle

Gly

Phe

Phe

Leu

His

Thr

Ala

Phe

20

25

30

Pro

Ser

Ser

Glu

Val

Phe

Arg

Cys

Leu

Ala

Ala

Arg

Lys

Glu

Leu

Leu

Asp Gly Met Leu Gly Ala Asn Leu Val Ala Phe Gin Thr Pro Glu Tyr 50 55 60

140

Ala 65

His

His

Phe Leu Gin 70

Thr Cys Ser

Arg

íle 75

Ser

Leu

Leu

Lys

Gin 80

Pro

Arg

Lys

Ala

Phe

Ser

Ser

Phe

Arg

Gin

Cys

Leu

Val

íle

Met

Gin

85

90

95

Glu

Ala

Leu

Arg

Gly

Ser

Arg

Arg

Ser

Ser

Leu

Arg

Val

Thr

Ser

*

100

105

110

Gin

His

Arg

Val

Tyr

Ala

Arg

Ser

Phe

Cys

Arg

Thr

Ser

Cys

Ser

*

115

120

125

Thr

Arg

Thr

His

Ser

Gly

Gly

Thr

Arg

Ser

Phe

Ser

Phe

Arg

Leu

Arg

130

135

140

Pro

Pro

Arg

Leu

Arg

íle

Leu

Ser

Leu

Leu

Arg

Pro

Tyr

Pro

Lys

Leu

145

150

155

160

Leu

His

Val

Leu

Thr

Leu

Cys

Thr

Arg

Arg

Ser

His

Thr

Pro

Thr

Arg

165

170

175

Leu

Pro

Gin

Ala

Arg

His

Cys

Val

Leu

Ala

Val

Pro

Arg

Thr

Ser

Leu

180

185

190

Asp

Arg

Arg

Cys

Ser

Cys

Asn

Gin

Leu

Phe

Asp

Gly

Met

Asn

Leu

Val

195

200

205 (2)

(1) Charakteristika sekvencie:

C A) DÍžka: Ei45 párov báz C B) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: dva

CD) Topológia-. lineárna

Cii) Typ molekuly: cDNA k mRNA

Ciii) Hypotetický: Nie

Ciii) Antisence: Nie

C vi) Pôvodný zdroj:

C A) Organizmus: Selaginella lepidophylla

Cxi) Popis sekvencie: SEO ID NO: 44:

GGGTGGTTCT TGCACACGCC GTTTCCCTCG TCTGAGATTT ACAGAACGCT GCCGCTGCGG 60

GCCGAGCTGC TCCAAGGCGT CTTAGGCGCG GACTTAGTGG GGTTCCACAC ATACGACTAT 120

GCAAGGCACT TTGTTAGCGC GATGCACACG GATACTCGGG CTGGAAGGCA CTCCCAGGGT 180

GTCGAGGATC AAGGGAAGAT CACGCGAGTG GCTGCCTTCC CCGTGGATCG ATTCGGAGCG 240

ATTTATCGAC GCGTAGAGAC CGATGCGGTC AAGAAACACA TGCAAGAGCT GAGCCAGGTT 300

141

TTGCTGTCGT AAGGTTATGT TGGGGTGGAT AGGCTTGACA TGATTAAAGG AATTCCACAG	• 360
AAGCTGCTAG CCTTTGAAAA ATTCCTCGAG GAGAACTCCG AGTGGCGTGA TAAGGTCGTC	420
CTGGTGCAAA TCGCGGTGCC GACTAGAACG GACGTCCTCG AGTACCAAAA GCTTACGAGC	480
CAGGTTCACG AGATTGTTGG TCGCATAAAT GGACGTTTCG GCTCCTTGAC GGCTGTTCCT	540
ATCCATCACC TCGATCGGTC CATGAAATTT CCGGAGCTTT GTGCGTTATA TGCAATCACT	600
GATGTCCTGC TCGTGACATC CCTGCGCGAC GGCATGAACT TCGTC	645
C 2) Informácie o SEO ID NO: 45:

Ci) Charakteristika sekvencie:

C A) Dĺžka: 498 párov báz C B) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: dva

CD) Topológia: lineárna

Cii) Typ molekuly: cDNA k mRNA

Ciii) Hypotetický: Nie

Ciii) Antisence: Nie

C vi) Pôvodný zdroj:

C A) Organizmus: Arabidopsis thaliana

GCCGTTGTGG	ATTCATCGCC	TCGCACAAGC	ACTCTTGTCG	TGTCTGAGTT	TATTGGATGC	60
TCACCTTCTT	TGAGTGGTGC	CATTAGGGTG	AATCCATGGG	ATGTGGATGC	TGTTGCTGAA	120
GCGGTAAACT	CGGCTCTTAA	AATAGTGAGA	CTGAGAAGCA	ACTACGGCAT	GAGAAACATT	180
ATCATTATAT	TAGCACTCAT	GATGTTGGTT	ATTGGGCAAA	GAGCTTTATG	CAGGATCTTG	240
AGAGAGCGTG	CCGAGATCAT	TATAGTAAAC	GTTGTTGGGG	GATTGGTTTT	GGCTTGGGGT	'300
TCAGAGTTTT	GTCACTCTCT	CCAAGTTTTA	GGAAGCTATC	TGTGGACACA	TTTGTTCCAG	360
TTTATAGGAA	AACCACAGAG	AGGGCTAATA	TTCTTTTATA	ATGGTACTCT	TTGTTCCGAA	42.0
AGCTCATTGT	TCAAGATCCA	GCAACGGGTT	CCTTGTCCTA	AGCCCCTTAA	GGCCCCATAA	480
CCGGTGTTTT	TTAGTGAG					498

C2) Informácie o SEO ID NO: 46:

C i) Charakteristika sekvencie; C A) Dĺžka·. 469 párov báz C B) Typ·, nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: dva

CD) Topológia: lineárna

142 (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Nie (iii) Antisence.: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Arabidopsis thaliana (xi) Popis sekvencie: SEO ID NO: 46:

GCCGTTGTGG	ATTCATCGCC	TCGCACAAGC	ACTCTTGTCG	TGTCTGAGTT	TATTGGATGC	60
TCACCTTCTT	TGAGTGGTGC	CATTGGGTGA	ATCCATGGGA	TGTGGATGCT	GTTGCTGAAG	120
CGGTAAACTC	GGCTCTTAAA	ATGAGTGAGA	CTGAGAAGCA	ACTACGGCAT	GAGAAACATT	180
ATCATTATAT	TAGCACTCAT	GATGTTGGTT	ATTGGGCAAA	GAGCTTTATG	CAGGATCTTG	240
AGAGAGCGTG	CCGAGATCAT	TATAGTAAAC	GTTGTTGGGG	GATTGGTTTT	GGTTTGGGGT	300
TCAGAGTTTT	TGTCACTCTC	TCCAAGTTTA	GGAAGCTATC	TTGGGACAAT	TGTTCCAGTT	360
TTTAGGGAAA	ACACAGGGAA	GGTTATTTCC	TTGATTATAA	TGGACCTTGT	CCAAGCCCCA	420
TTTTTAAGGC	CCAGGAACCG	GGTTTTTTTT	TCTTAAAGCC	CCT		463

(A) Dĺžka: 394 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: dva (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Nie (iii) Antisence: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Arabidopsis thaliana (xi) Popis sekvencie: SEO IĽ) NO·. 47:

GGTATTGATG	TAGAGGAAAT	ACGTGGTGAA	ATCGAAGAAA	GCTGCAGGAG	GATCAATGGA	60
GAGTTTGGGA	AACCGGATAT	CAACCTATCA	TATATATTGA	TACCCGGTTT	CGATTAATGA	120
AATAAATGCT	TATACCATAT	TGCTGAGTGC	GTGGTCGTTA	CAGCTGTTAG	AGATGGTATG	180
AACCTTACTC	CCTACGAATA	TATCGTTTGT	AGACAAGGTT	TACTTGGGTC	TGAATCAGAC	240
TTTAGTGGCC	CAAAGAAGAG	CATGTTGGTT	GCATCAAGTT	TATTTGGATG	TCCCCTTTCG	300

143 (2) Informácie o SEQ IC) MC)s 48:

(i) Charakteristika sekvencie;

(A) DÍžka: 428 párov báz

C B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: dva (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Nie (iii) Antisence: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Arabidopsis thaliana (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 48:

AAGTCCGTTG TGGATTCACG CCTCGCACAA GCACTCTTGT CGTGTCTAGT TTATTGGATG 60

CTCACCTTCT TTAGTGGTGC CATTAGGGTG AATCCATGGA TGTGGATGCT GTTGCTGAAG 120

GAGCGTGCCG	AGATCATTAT	AGTAAACGTT	GTTGGGGGAT	TGGTTTTGGT	TTGGGGTTCA	300
AGTTTTGTCA	CTCTCTCCAA	GTTTTAGGAA	GCTATCTTGT	GGACACATTG	TTCCAGTTTA	360
TAGAAACACA	GGGAAGGGGC	TATATTCTTG	TTTAAATGGG	ACCCCTTGTC	CCTAAAAGTC	420
CCATTTGT						428

(2) Informácie o SEQ ID NO: 49:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 481 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: dva (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Nie (iii) Antisence: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Arabidopsis thaliana (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 49:

144 (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:49:

CAAACGAAGA GCTTCGTGGG AAAGTGGTTC

CAGGTAAGGA TGTTCAAGAT GTAGAGAAAC

TAAATTTGGG AGACCTGGTG GTTATAAGCC

TGGATAAAGT TGCTTATTAC GCGATCTCGG

GATGAATTTG GTGCCTTATA AGTACACAGT

AGCTTTGGTT TTGGGGAGGA TGATGTTAGG

CCGGTTGTCC TCCATCTCTA GTGGTGCGAT

TTACGCCATG AGCTTCAAAT CCGGTTTCCG

A

C 2) Informácie o SEQ ID NO: 50:

TCGTGCAGAT	TACTAATCCT	GCTCGTAGTT	60
AGATAAATTT	ATTGCTGATG	AGATCAATTC	120
TATTGTTTTG	TAATGGACCT	GTTAGTACTT	180
AGTGTGTTGT	CGTGAATCTG	TGAGAGATGG	240
GACTCGGCAA	GGGAGCCCTG	CTTTGGATGC	300
AAGAGTGTGA	TTATTGTTTC	TGAGGTTCAA	360
CCCTTTTAAT	CCGTGGACAT	CGATCAGCAC	420
CAAAGGGAAA	ATTGCCCCGA	GCTTAAGGCC	480
			481

<i) Charakteristika sekvencie: C A) DÍžka: 395 párov báz (B) Typ·- nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: dva

CD) Topológias lineárna

Cii) tTvp molekúl ví

C A) Organizmus: Arabidopsis thaliana

Cxi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: bO:

AGACCTGGTG	GTTATAAGCC	TATTGTGTTT	GTCAATGGAC	CTGTTAGTAC	TTTGGATAAA	60
TTGCTTATTA	CGCGATCTCG	GAGTGTGTTG	TCGTGAATCT	GTGAGAGATG	GGATGAATTT	120
GGTGCCTTAT	AAGTACACAG	TGACTCGGCA	AGGGAGCCCT	GCTTTGGATG	CAGCTTTAGG	180
TTTTGGGGAG	GATGATGTTA	GGAAGAGTGT	GATTATTGTT	TCTAGTTCAT	CGGTTGTCTC	240
CATCTCTGAG	TGGTGCGATC	CGTTAATCCG	TGGAACATCG	TGCAGTCACT	AAACGCCATG	300
AGCCTGCAAT	ACGATGTCGC	AAAGGGAAAA	TCTTTGCCAC	CAGAAGCATC	ATAAGTACAT	360

AAAGCCTCAC AATTGCCTAT TTGGGCCGGG GTTTT

395

145 (2) Informácie o SEO ID NO: 51:

(i) Charakteristika sekvencie:

C A) Dĺžka: 431 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov; dva (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Nie (iii) Antisence: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Oryza sativa ( ix) Vlastnosti:

C A) ľleno/KIúč: misc_feature (B) Umiestenie: 1 (D) Ďalšie Informácie: /standard_name=GENBANK ID:D22143” (xi) Popis sekvencie: SEO ID NO: 51:

GGGAATGGAG GGTCTCCGAG CTGCAGCAGC AATTTGAGGG GAAGACTGTG TTGCTCGGTG 60

-TGGATGACAT

-JTGAGGACACA TCCCAAGTGCdgAGGGGC

GTGGAAAGGG	TAAGGATCTT	GAAGCCATCC	AGGCTGAGAT	TCATGAGAGC	TGCAAGAGGA	240
TTAATGGAGA	GTTTGGCCAG	TCAGGATACA	GCCCTGTTGT	CTTCATTGAC	CGTGATGTGT	300
CAAGTGTGGA	GGAAGATTGC	CTACTACACA	ATAGCAGAAT	GTGTGGTGGT	GACTGCTGTT	360
AGGGATGGGA	TTGACTTGAC	ACCATATGGA	TATATTGTCT	GTAGGGCAGG	GGTCTTACTC	420
ACATCAGAGG	T					431

(2) Informácie o SEO ID NO: 52:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka·. 496 párov báz (B) Typ: nukleovú kyselina (C) Počet reťazcov: dva (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Nie (iii) Antisence: Nie

146 (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Oryza sativa (ix) Vlastnosti:

(A) ľleno/Klúč: misc_feature (B) Umiestenie; 1 (D) Ďalšie informácie: /standard_name=GENBANK ID:040048 (x±) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 52:

CTACCGTTCC CTCCCTGTTC GCGACGAGAT CCTCAAATCA CTGCTAAACT GCGATCTGAT 60

TGGGTTCCAC ACCTTTGATT ACGCGCGGCA TTTCCTGTCC TGCTGCAGCC GGATGCTGGG 120

GATCGAGTAC CAGTCGAAGA GGGGATATAT CGGTCTCGAT TACTTTGGCC GCACTGTTGG 180

GATAAAGATC ATGCCTGTTG GGATTAACAT GACGCAGCTG CAGACGCAGA TCCGGCTGCC 240

TGATCTTGAG TGGCGTGTCG CGAACTCCGG AAGCAGTTTG ATGGGAAGAC TGTCATGCTC 300

GGTGTGGATG ATATGGACAT ATTTAAGGGG ATTAATCTGA AAGTTCTTGC GTTTTGAGCA 360

GATGCTGAGG ACACACCCAA AATGGCAGCC AAGGCAGTTT TGGTGCAGAT TCAAACCAAG 420

GGTGGTTGTT GGGAGGACTT AGGTACAGCT AGATATGAGT TCAGGGGTAA TGACATTTCA 480

(2) Informácie o SEQ ID NO: 53:

(i.) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 288 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: dva (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetický: Nie (iii) Antisence: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Oryza sativa (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 53:

GGACCAAAGA	AGAGCATGTT	GGTTGTGTCG	GAGTTTATTG	GTTGCTCACC	TTCACTGAGT	60
GGAGCCATTC	GTGTTAACCC	GTGGAATATC	GAGGCAACTG	CAGAGGCACT	GAATGAGGCC	120
ATCTCAATGT	CAGAGCGTAA	AAGCAGCTGA	GGCACGAAAA	ACATTACCGT	TATGTCAGCA	180
CCCATGATGT	TGCATATTGG	TCTAAGAGCT	TTGTACAGGA	CCTGGAGAGG	GCTTGCAAGG	240

ATCACTTTAG GAAACCATGC TGGGGCATTG GATTGGATTT CGCTCAGG

288

147

C 2) Informácie o SEQ ID NO: 54:

C i) Charakteristika sekvencie:

C A) DÍžka: 2207 párov báz C B) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: dva

CD) Topológia: lineárna Cii) Typ molekuly: cDNA k mRNA Ciii) Hypotetický: Nie

Ciii) Antisence: Nie

C vi) Pôvodný zdroj:

C A) Organizmus: Solanum tuberosum

C B).Druh: Kardal Cix) Vlastnosti:

C A) Meno/KTúč: CDS

C B) Umiestenie: 161..1906

CD) Ďalšie informácie: /čiastočná Cix) Vlastnosti:

C A) Meno/Klúč ·. CDS

C B) Umiestenie: 842..850

CD) Ďalšie informácie:/function= putatative glycosylationsite C funkcia= pravdepodobné miesto glykozylácie)

Cxi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 54:

CTTTTCTGAG

CCCATTGCCG

TTATGGCATC

TAATAACATA

GCATTCTCTG

AGTATTGAAC

GGCATTGATT

TTCTTACAAA

CCTTTAACTT

TTTTTTCAAT

AAAAAACATT

GTTATACAAT

TAATAACACC TGCAAACATT

TTTTTGTTCA CATAAATTAG

ATG GGT AAA GCT ATA Met Gly Lys Ala Xle

5

120

175

ATT TTT

ATG Met

ATT íle

TTT Phe 10

ACT Thr

ATG Met

TCT ATG

AAT Asn 15

ATG Met

ATT AAA

GCT Ala

GAA Glu 20

ACT Thr

223

íle

Phe

Ser

Met

íle

Lys

TGC

AAA

TCC

ATT

GAT

AAG

GGT

CCT

GTA

ATC

CCA

ACA

ACC

CCT

TTA

GTG

271

Cys

Lys

Ser

íle

Asp

Lys

Gly

Pro

Val

íle

Pro

Thr

Thr

Pro

Leu

Val

25

30

35

ATT

TTT

CTT

GAA

AAA

GTT

CAA

GAA

GCT

GCT

CTT

CAA

ACT

TAT

GGC

CAT

319

íle

Phe

Leu

Glu

Lys

Val

Gin

Glu

Ala

Ala

Leu

Gin

Thr

Tyr

Gly

His

40

45

50

AAA

GGG

TTT

GAT

GCT

AAA

CTG

TTT

GTT

GAT

ATG

TCA

CTG

AGA

GAG

AGT

367

Lys

Gly

Phe

Asp

Ala

Lys

Leu

Phe

Val

Asp

Met

Ser

Leu

Arg

Glu

Ser

55

60

65

148

415

CTT

TCA

GAA

ACA

GTT

GAA

GCT

TTT

AAT

AAG

CTT

CCA

AGA

GTT

GTG

AAT

Leu

Ser

Glu

Thr

Val

Glu

Ala

Phe

Asn

Lys

Leu

Pro

Arg

Val

Val

Asn

70

75

80

85

GGT

TCA

ATA

TCA

AAA

AGT

GAT

TTG

GAT

GGT

TTT

ATA

GGT

AGT

TAC

TTG

Gly

Ser

íle

Ser

Lys

Ser

Asp

Leu

Asp

Gly

Phe

íle

Gly

Ser

Tyr

Leu

90

95

100

AGT

AGT

CCT

GAT

AAG

GAT

TTG

GTT

TAT

GTT

GAG

CCT

ATG

GAT

TTT

GTG

Ser

Ser

Pro

Asp

Lys

Asp

Leu

Val

Tyr

Val

Glu

Pro

Met

Asp

Phe

Val

105

110

115

GCT

GAG

CCT

GAA

GGC

TTT

TTG

CCA

AAG

GTG

AAG

AAT

TCT

GAG

GTG

AGG

Ala

Glu

Pro

Glu

Gly

Phe

Leu

Pro

Lys

Val

Lys

Asn

Ser

Glu

Val

Arg

120

125

130

GCA

TGG

GCA

TTG

GAG

GTG

CAT

TCA

CTT

TGG

AAG

AAT

TTA

AGT

AGG

AAA

Ala

Trp

Ala

Leu

Glu

Val

His

Ser

Leu

Trp

Lys

Asn

Leu

Ser

Arg

Lys

135

140

145

GTG

GCT

GAT

CAT

GTA

TTG

GAA

AAA

CCA

GAG

TTG

TAT

ACT

TTG

CTT

CCA

Val

Ala

Asp

His

Val

Leu

Glu

Lys

Pro

Glu

Leu

Tyr

Thr

Leu

Leu

Pro

150

155

160

165

TTG

AAA

AAT

CCA

GTT

ATT

ATA

CCG

GGA

TCG

CGT

TTT

AAG

GAG

GTT

TAT

Leu

Lys

Asn

Pro

Val,

íle

.Jle^Pro Gly S?i;,.Äxg_Phe

ŕ»

463

511

559

607

655

703

JTAT .TGG GAT .TCT ^TATtTPGG-GT^

Tyr Trp Ás’p Šer Tyŕ“Ťrp Val íle Árg’GÍy Leu Leu Ala Ser Lys Met 185 190 195

TAT GAA Tyr Glu

ACT Thr 200

GCA Ala

AAA Lys

GGG Gly

ATT GTG

ACT AAT CTG GTT

TCT CTG

ATA íle

GAT Asp

799

íle

Val 205

Thr

Asn

Leu

Val

Ser 210

Leu

CAA

TTT

GGT

TAT

GTT

CTT

AAC

GGT

GCA

AGA

GCA

TAC

TAC

AGT

AAC

AGA

847

Gin

Phe

Gly

Tyr

Val

Leu

Asn

Gly

Ala

Arg

Ala

Tyr

Tyr

Ser

Asn

Arg

215

220

225

AGT

CAG

CCT

CCT

GTC

CTG

GCC

ACG

ATG

ATT

GTT

GAC

ATA

TTC

AAT

CAG

895

Ser

Gin

Pro

Pro

Val

Leu

Ala

Thr

Met

íle

Val

Asp

íle

Phe

Asn

Gin

230

235

240

245

ACA

GGT

GAT

TTA

AAT

TTG

GTT

AGA

AGA

TCC

CTT

CCT

GCT

TTG

CTC

AAG

943

Thr

Gly

Asp

Leu

Asn

Leu

Val

Arg

Arg

Ser

Leu

Pro

Ala

Leu

Leu

Lys

250

255

260

GAG

AAT

CAT

TTT

TGG

AAT

TCA

GGA

ATA

CAT

AAG

GTG

ACT

ATT

CAA

GAT

991

Glu

Asn

His

Phe

Trp

Asn

Ser

Gly

íle

His

Lys

Val

Thr

íle

Gin

Asp

265

270

275

GCT

CAG

GGA

TCA

AAC

CAC

AGC

TTG

AGT

CGG

TAC

TAT

GCT

ATG

TGG

AAT

1039

Ala

Gin

Gly

Ser

Asn

His

Ser

Leu

Ser

Arg

Tyr

Tyr

Ala

Met

Trp

Asn

280 285 290

149

AAG	CCC	CGT	CCA	GAA	TCG	TCA	ACT	ATA
Lys	Pro 295	Arg	Pro	Glu	Ser	Ser 300	Thr	íle
CTC	CCA	AAT	ATA	TGT	GAA	AAA	AGA	GAA
Leu 310	Pro	Asn	íle	Cys	Glu 315	Lys	Arg	Glu
GCT	GCT	GAA	AGT	GGA	TGG	GAT	TTC	AGT
Ala	Ala	Glu	Ser	Gly 330	Trp	Asp	Phe	Ser
TCT	GAT	CTG	ACA	ACA	ACT	AGT	ACA	ACA
Ser	Asp	Leu	Thr 345	Thr	Thr	Ser	Thr	Thr 350
AAT	GCA	TTC	CTT	CTG	AAG	ATG	GAA	CTT
Asn	Ala	Phe 360	Leu	Leu	Lys	Met	Glu 365	Leu
CTT	GTT	GGA	GAA	AGT	AGC	ACG	GCT	TCA
Leu	Val 375	Gly	Glu	Ser	Ser	Thr 380	Ala	Ser
AAT	AGA	CAG	AAG	GCT	ATA	AAC	TGT	ATC

GAC AGT GAA ACA GCT TCC GTA 1087

Asp Ser Glu Thr Ala Ser Val

305

TTA TAC CGT GAA CTG GCA TCA 1135 Leu Tyr Arg Glu Leu Ala Ser

320 325

TCA AGA TGG ATG AGC AAC GGA 1183 Ser Arg Trp Met Ser Asn Gly 335 340

TCA ATT CTA CCA GTT GAT TTG 1231 Ser íle Leu Pro Val Asp Leu

355

GAC ATT GCC TTT CTA GCA AAT 1279 Asp íle Ala Phe Leu Ala Asn

370

CAT TTT ACA GAA GCT GCT CAA 1327 His Phe Thr Glu Ala Ala Gin

385

TTT TGG AAC GCA GAG ATG GGG 1375

Asn. A^g pln Lys.Ála.. Ile.A5^5y.s.ale ,_!gSg^a)Zž;

390 .. j;-- ' j .. .ľ'

CAA TGG . CTT GAT -TAC TGG CTT^ÄCC AAC-i

Gin Trp

Leu

Asp

Tyr 410

Trp

Leu

Thr

Asn

Ser 415

Asp

Thr

Ser

Glu

Asp 420

íle

TAT

AAA

TGG

GAA

GAT

TTG

CAC

CAG

AAC

AAG

AAG

TCA

TTT

GCC

TCT

AAT

1471

Tyr

Lys

Trp

Glu

Asp

Leu

His

Gin

Asn

Lys

Lys

Ser

Phe

Ala

Ser

Asn

425

430

435

TTT

GTT

CCG

CTG

TGG

ACT

GAA

ATT

TCT

TGT

TCA

GAT

AAT

AAT

ATC

ACA

1519

Phe

Val

Pro

Leu

Trp

Thr

Glu

íle

Ser

Cys

Ser

Asp

Asn

Asn

íle

Thr

440

445

450

ACT

CAG

AAA

GTA

GTT

CAA

AGT

CTC

ATG

AGC

TCG

GGC

TTG

CTT

CAG

CCT

1567

Thr

Gin

Lys

Val

Val

Gin

Ser

Leu

Met

Ser

Ser

Gly

Leu

Leu

Gin

Pro

455

460

465

GCA

GGG

ATT

GCA

ATG

ACC

TTG

TCT

AAT

ACT

GGA

CAG

CAA

TGG

GAT

TTT

1615

Ala

Gly

íle

Ala

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Thr

Gly

Gin

Gin

Trp

Asp

Phe

470

475

480

485

CCG

AAT

GGT

TGG

CCC

CCC

CTT

CAA

CAC

ATA

ATC

ATT

GAA

GGT

CTC

TTA

1663

Pro

Asn

Gly

Trp

Pro

Pro

Leu

Gin

His

íle

íle

íle

Glu

Gly

Leu

Leu

490

495

500

AGG

TCT

GGA

CTA

GAA

GAG

GCA

AGA

ACC

TTA

GCA

AAA

GAC

ATT

GCT

ATT

1711

Arg

Ser

Gly

Leu

Glu

Glu

Ala

Arg

Thr

Leu

Ala

Lys

Asp

íle

Ala

íle

505 510 515

150

Thr

Glu

Ala

Ala

Gin

Asn

Arg

Gin

Lys

Ala

íle

Asn

Cys

íle

Phe

Trp

385

390

395

400

Asn

Ala

Glu

Met

Gly

Gin

Trp

Leu

Asp

Tyr

Trp

Leu

Thr

Asn

Ser

Asp

405

410

415

Thr

Ser

Glu

Asp

íle

Tyr

Lys

Trp

Glu

Asp

Leu

His

Gin

Asn

Lys

Lys

420

425

430

Ser

Phe

Ala

Ser

Asn

Phe

Val

Pro

Leu

Trp

Thr

Glu

íle

Ser

Cys

Ser

435

440

-4

445

Asp

Asn

Asn

íle

Thr

Thr

Gin

Lys

Val

Val

Gin

Ser

Leu

Met

Ser

Ser

450

455

460

Gly

Leu

Leu

Gin

Pro

Ala

Gly

íle

Ala

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Thr

Gly

465

470

475

480

Gin

Gin

Trp

Asp

Phe

Pro

Asn

Gly

Trp

Pro

Pro

Leu

Gin

His

íle

íle

485

490

495

íle

Glu

Gly

Leu

Leu

Arg

Ser

Gly

Leu

Glu

Glu

Ala

Arg

Thr

Leu

Ala

500

505

510

Lys

Asp

íle

Ala

íle

Arg

Trp

Leu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Val

Thr

Tyr

Lys

515

520

525

Lys Thr Gly Ala Met Tyr Glu Lys Tyr Asp Val Thr Lys Cys Gly -A^A. 530 . rr:'535.......... - —

.Tyr Gly GÍy ~Gly^J731ý “GÍuŕ TTyr RgtjSér jGljťŕ;

545 ^7- ' ^J5^:50 '

Asn Gly Val Val Leu Ala Leu Leu Glu Glu Phe Gly Trp Pro Glu Asp

565

Leu Lys íle Asp Cys

570

575

580

C 2) Informácie: o

SEO ID NO: 56:

C i) Charakteristika sekvencie:

C A) DÍžka: 18 párov báz C B) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: jeden

CD) Topolúgia: lineárna

Cii) Typ molekuly: cDNA

Čili) Hypotetický: Nie

Cxi) Popis sekvencie: SEO ID NO: 56:

CTCAGATCTG GCCACAAA

151

Pro Arg Val Val Asn Gly Ser íle Ser Lys Ser Asp Leu Asp Gly Phe 85 90 95 íle Gly Ser Tyr Leu Ser Ser Pro Asp Lys Asp Leu Val Tyr Val Glu 100 105 110

Pro Met Asp Phe Val Ala Glu Pro Glu Gly Phe Leu Pro Lys Val Lys 115 120 125

Asn Ser Glu Val Arg Ala Trp Ala Leu Glu Val His Ser Leu Trp Lys 130 135 140

Asn Leu Ser Arg Lys Val Ala Asp His Val Leu Glu Lys Pro Glu Leu

145 150 155 160

Tyr Thr Leu Leu Pro Leu Lys Asn Pro Val íle íle Pro Gly Ser Arg

165 170 175

Phe Lys Glu Val Tyr Tyr Trp Asp Ser Tyr Trp Val íle Arg Gly Leu 180 185 190

Leu Ala Ser Lys Met Tyr Glu Thr Ala Lys Gly íle Val Thr Asn Leu 195 200 205

Val Ser Leu íle Asp Gin Phe Gly Tyr Val Leu Asn Gly Ala Arg Ala

Asp íle Phe Asn Gin Thr Gly Asp Leu Asn Leu Val Arg Arg Ser Leu 245 250 255

Pro Ala Leu Leu Lys Glu Asn His Phe Trp Asn Ser Gly íle His Lys 260 265 2*5

Val Thr íle Gin Asp Ala Gin Gly Ser Asn His Ser Leu Ser Arg Tyr 275 280 285

Tyr Ala Met Trp Asn Lys Pro Arg Pro Glu Ser Ser Thr íle Asp Ser 290 295 300

Glu Thr Ala Ser Val Leu Pro Asn íle Cys Glu Lys Arg Glu Leu Tyr

305 310 315 320

Arg Glu Leu Ala Ser Ala Ala Glu Ser Gly Trp Asp Phe Ser Ser Arg

325 330 335

Trp Met Ser Asn Gly Ser Asp Leu Thr Thr Thr Ser Thr Thr Ser íle 340 345 350

Leu Pro Val Asp Leu Asn Ala Phe Leu Leu Lys Met Glu Leu Asp íle 355 360 365

Ala Phe Leu Ala Asn Leu Val Gly Glu Ser Ser Thr Ala Ser His Phe 370 375 380

152

C 2) Informácie o SEQ ID NO: 57:

C i) Charakteristika sekvencie:

C A) DÍžka: 18 párov báz C B) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: jeden

CD) Topológia: lineárna

Cii) Typ molekuly: cDNA Čili) Hypotetický: Nie

Cxi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 57:

GTGCTCGTCT GCAGGTGC

Claims (32)

1. Spôsob modifikácie vývoja a/alebo zloženia buniek, tkanív a orgánov in vivo inak ako udelením schopnosti syntetizovať trehalázu, indukciou zmien metabolickej dostupnosti trehalúza-6-fosfátu.

2. Spôsob stimulácie toku uhlíka v bunkách v glykolytickom smere znížením vnútrobunkovej dostupnosti trehalóza-6-fosfátu.

3. Spôsob inhibície toku uhlíka v bunkách v glykolytickom smere zvýšením vnútrobunkovej dostupnosti trehalóza-6-fosfátu.

4. Spôsob inhibície fotosyntézy v bunkách znížením vnútrobunkovej dostupnosti trehalóza-6~fosfátu.

5. Spôsob stimulácie fotosyntézy v bunkách_ zvýšením__________ vnútrobunkovej ·do^upnosti—’tetpet' . Mi -.-Ĺ...

6. Spôsob stimulácie: aktivít spojených so ~ spotrebotr (sink-related activity) zvýšením vnútrobunkovej dostupnosti trehalóza—6-fosfátu

7. Spôsob stimulácie rastu buniek alebo tkanív znížením v n ú t rob u n kov e .j d o s t u p n o s t i t r e: h a 1 ó z a - 6 - f o s f átu.

8. Spôsob získania zakrpatených organizmov zvýšením vnútrobunkovej dostupnosti trehaIóza-6-fosfátu.

9. Spôsob zvýšenia metabolizmu buniek znížením v n ú t r o b u n k o v e j d o s t u p n osti t r e: h a 1 é z a - 6 - f o s f á t u .

10. Spôsob podlá nárokov 2, 4, 7 alebo 9 charakterizovaný tak, že sa uvedené zníženie vnútrobunkovej koncentrácie trehalóza-6-fosfátu uskutoční zvýšením aktivity trehalóza154 fosfátfosfatázy (TPP).

11. Spôsob podlá nároku 10, charakterizovaný tak, že sa zvýšenie aktivity TP dosiahne transformáciou uvedených buniek vektorom schopným expresie enzýmu TPP.

12. Spôsob podlá nároku 11, charakterizovaný tak, že sa uvedená bunky transformujú vektorom obsahujúcim heterológny gén kódujúci TPP.

13. Spôsob padla nároku 2, 4, 7 alebo 9 charakterizovaný tak, že sa uvedené zníženie vnútrobunkovej koncentrácie trehalóza-6-fosfátu uskutoční znížením aktivity trehalózafosfátsyntázy (TPS).

14. Spôsob podlá nároku 13, charakterizovaný tak, že sa zníženie aktivity TPS uskutoční transformáciou uvedených buniek vektorom schopným expresie molekuly, ktorá inhibuje TPS.

.. .. -------- -z vektor obsahu je uvedené

Spôsob podlá nároku 10, charakterizovaný zníženie dosiahne mutáciou endogénneho enzýmu tak,

TPP.

že sa

17.

uvedené overexpre

Spôsob podlá nároku 10, charakterizovaný zníženie trehalóza-6-fosfátu uskutočni iou fosfα-alfa-C1, 1)-glukozidázy.

tak, že sa relatívnou

18. Spôsob podlá nároku 3, 5, E5 alebo 8, charakterizovaný tak, že sa uvedené zvýšenie vnútrobunkovej koncentrácie trehalóza-6-fosfátu uskutočni zvýšením aktivity TPS.

19. Spôsob podlá nároku 18, charakterizovaný tak, že sa uvedené zvýšenie aktivity TPS dosiahne transformáciou uvedených buniek vektorom schopným expresie enzýmu TPS.

155

20. Spôsob podlá nároku 19, charakterizovaný tak, že sa uvedené bunky transformujú vektorom obsahujúcim heterológny gén kódujúci TPS.

21. Spôsob podlá nároku 3, 5, 6 alebo S, charakterizovaný tak, že sa uvedené zvýšenie vnútrobunkovej koncentrácie trehalóza-6-fosfátu uskutočni znížením aktivity TPP.

22. Spôsob podlá nároku 21, charakterizovaný tak, že sa uvedené zníženie aktivity TPP uskutoční, transformáciou uvedených buniek vektorom schopným expresie: molekuly, ktorá inhibuje TPP.

23. Spôsob podlá nároku 22, charakterizovaný tak, že uvedený vektor obsahuje anti-sense gén TPS.

24. Spôsob podlá nároku 16, charak terizovaný tak, že: sa uvedené zvýšenie: dosiahne mutáciou endogénneho enzýmu TPS.

____ 25. Spôsob podlá ktoréhokolvek nároku 1—24, charakterizovaný

charakterizovaný tak, že -•r.?·.··-' SÚ 26. Spôsob podlá nároku 25, uvedené rastliny transgénne:. 27. Spôsob podlá nároku 26, charakterizovaný tak, že sú uvedené transgénne: rastliny produkované transformáciou

Agrobactéri um t umefaciens.

28. Spôsob podľa ktoréhokolvek nároku 1-24, charakterizovaný tak, že: je: uvedená bunka, alebo bunky, lokalizovaná v živočíchovi, prednostne: v cicavcovi, e: š t e: prednostnej šie v 1 u d s k e .j by t o stí.

29. Spôsob podľa ktoréhokolvek nároku 1-24, charakterizovaný tak, že uvedené bunky sú mikroorganizmy, prednostne mikroorganizmy vybrané zo skupiny obsahujúcej baktérie, mikróby, kvasinky, plíesne, bunkové kultúry, oocyty, spermatické bunky,

156 hybridómy, Protista a kalusy.

30. Klonovací. vektor, ktorý obsahuje gén kódujúci TPP, uvedený gén nie je kvasinkovým TPP génom.

31. Klonovací vektor padla nároku 30, charakterizovaný tak, že obsahuje nukleotidové sekvencie vybrané zo skupiny nukleotidových sekvencii zobrazených v SEQ ID NO: 3, SEQ ID N0-. 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 a časti kódujúcich TPP v dvojdielnych enzýmoch, ako sú kódované v SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO·. 42, SEQ ID NO:

44.

32. Klonovací vektor, ktorý obsahuje anti-sense gén kódujúci TPS, ktorý je po expresii schopný zamedziť funkčnú aktivitu endogénneho génu pre TPS.

33. Klonovací. vektor, ktorý obsahuje gén TPP, charakterizovaný tak, že aep-jsiPWt--..-xíix·; ϊ,.',χ~λ .ÄU ID.

ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44.

34. Klonovací vektor, ktorý obsahuje anti-sense gén kódujúci TPP, ktorý je po expresii schopný zamedziť funkčnú aktivitu endogénneho génu pre TPP.

35. Rastlina charakterizovaná tak, že ona alebo jej predchodcovia sú transformovaní vektorom obsahujúcim nukleotidovú sekvenciu kódujúcu TPP, pričom uvedený gén nie je kvasinkový gén pre TPP, ale uvedená rastlina stále obsahuje uvedenú nukleotidovú sekvenciu.

36. R a s 11ina eharak terizovaná tak, že ona aIebo jej predchodcovia sú transformovaní vektorom obsahujúcim nukleotidovú sekvenciu kódujúcu anti-sense gén TPP a uvedená rastlina stále obsahuje uvedenú nukleotidovú sekvenciu.

157

37. Rastlina charakterizovaná tak, že ona alebo ...jej predchodcovia sú transformovaní vektorom obsahujúcim nukleotidovú sekvenciu kódujúcu anti-sense gén TPP a uvedená rastlina stále obsahuje uvedenú nukleotidovú sekvenciu.

38. Použitie trehalóza-6-fosfátu na ovplyvnenie rozdelenia k a r ti o h y d r á t o v v hu n k á c h.

Použitie trehalóza-6-fosfátu na zvýšenie biomasy.

40. Použitie t r e h a 1 ó z a - 6 - f o s f á t u na ovplyvnenie aktivity hexokinázy ' in vivo . 41. Použitie t r e h a 1 ó z a - 6 - f o s f á t u na ovplyvnenie funkcie hexokinázovej signalizácie in vivo. 42. Použitie tr e haló z a-6-fosfá tu na ovplyvnenie syntézy

bunkovéj^steny ^iE.· ,37.43-^ ...........

trehalóza-6-fosfátu na zvýšenie biomasy.

44. Použitie látok ovplyvňujúcich vriútrobunkovú dostupnosť trehalóza—6-fosfátu na ovplyvnenie aktivity hexokinázy.

45. Použitie látok ovplyvňujúcich vriútrobunkovú dostupnosť tr eh a1óza—6—fosfá t u na ovplyvnenie fotosyntézy.

46. Použitie látok ovplyvňujúcich vriútrobunkovú dostupnosť trehalóza-6-fosfátu na ovplyvnenie toku uhlíka v glykolytickej ceste.

47. Spôsob prevencie chladového sladnutia zvýšením vnútrobunkovej dostupnosti trehalóza-6-fosfátu.

48. Spôsob inhibície invertázy v repe po zbere zvýšením

158 vnútrobunkovéj dostupnosti trehalóza-6-fosfátu.

49. Použitie látok ovplyvňujúcich vnútrobunkovú dostupnosť trehaláza-6-fosfátu na ovplyvnenie chladového sladnutla alebo inhibíciu invertázy.

50. Spôsob podlá nároku 47 alebo 48, charakterizovaný tak, že zvýšenie vnútrobunkovéj dostupnosti trehalóza-6—fosfátu je výsledkom zvýšenia aktivity trehalózafosfátsyntázy.

51. Spôsob podľa nároku 47, charakterizovaný tak, že: je: regulácia dostupnosti trehalóza-6-fosfátu špecificky zvýšená v zemiakových hľuzách.

52. Spôsob podľa nároku 51 charakterizovaný tak, že je gén kódujúci trehalózafosfátsyntázu špecificky exprImovaný v hľuzách.

53. Spôsob podľa nároku b2, charakterizovaný tak, že: uvedený cD j^e 9^n pre TPS regulácia dostupnosti trehalóza-6-fosfátu špecificky zvýšená v hlavnom reťazci repy.

55. Spôsob podľa nároku 54, charakterizovaný tak, že je gén kódujúci trehalózafosfátsyntázu Špecificky exprimovaný v hlavnom koreni.

5(5. Spôsob akumulácie: trehalózy, charakterizovaný tak, že sa organizmus transformuje sekvenciou DNA kódujúcou dvojdielny enzým TPS-TPP.

57. Spôsob podľa nároku 56, charakter izovaný tak, že: uvedený gén je: dvojdielny gén z Arabidopsis thaliana.

58. S p ô s o b p o d ľ a n á r oku 5 6, c: h ar ak ter izovaný tak, že: uvedený gén je: dvo jdielny gén z Selaginella lepidophylla.

159

59. Spôsob podlá nároku 56, charakterizovaný tak, že uvedený gén je ľudský dvojdielny gén.

60. Spôsob podía nároku 56, charakterizovaný tak, že uvedený gén je dvojdielny gén z Helianthus annuus.

61. Spôsob zamedzenia metabolického riadenia počas produkcie trehalózy expresiou sekvencie DNA kódujúcej dvojdielny enzým

TPS-TPP. 62. Spôsob podľa nároku '1- 24, charakterizovaný tak, že2 je expresla TPP alebo TPS obmedzená na špecifické tkanivo. 63. Spôsob podľa nároku 1-24, charakterizovaný tak, že expresia TPP alebo TPS je pod kontrolou indukovaleIného

promótora.

---- 65. Spôsob inhibície toku uhlíka v bunkách v glykolyťickom smere expresiou trehalóza-6-fosfátsyntázy.

66. Spôsob inhibíeie fotosyntézy v bunk ách expresiou trehalóza-6-fosfátfosfatázy.

67. Spôsob stimulácie fotosyntézy v bunkách expresiou trehalóza-6-fosfátsyntázy.

68. Spôsob stimulácie aktivít spojených so spotrebou (sink-related activitý) expresiou trehalóza-6-fosfátsyntázy.

69. Spôsob stimulácie:-: rastu buniek trehaIóza-6-fosfátfosfatázy.

70. Spôsob získania organizmov alebo tkanív expresiou r e d u k o v a n o u v e I k o s t o u

160 expresiou trehalúza-6-fosfátsyntázy.

71. Spôsob zvýšenia trehalóza-6-fosfátfosfatázy. metabolizmu buniek expresiou 72. Spôsob zamedzenia trehalóza-6-fosfátsyntázy. chladového sladnútia expresiou 73. Spôsob zamedzenia predčasného d o z. r i e v a n i a znížením

vnútr oburikove j dostupnosti tr ehalóza-6-fosfátu.

74. Spôsob zamedzenia trehalóza-6-fosfátfosfatázy. predčasného dozrievania expresiou 7 5. S p ô s o b i n d u k c i e predčasného dozrievania zvýšením

vnútrobunkovej dostupnosti trehalóza-6-fosfátu.

76. Spôsob Indukcie predčasného dozrievania _t r e h a 1 ú z a -rj6- f o sfá tsyntázy _ľ-,_;- - -.

λ.,.; 77 . Spôsob,, enzýmom kódujúcim trehalóza-6-fosfátfosfatázu.

78. Spôsob zvýšenia výnosu rastlín zvýšením vnútrobunkovej dostupností trehalóza-6-fosfátu.

79. Polynukleotid kódujúci trehalóza-6-fosfátsyntázu, charakterizovaný tak, že to je dvojdielny enzým majúci mutáciu v časti kódujúcej trehalóza-6-fosfátfosfatázu.

86. Polynukleotid kódujúci trehalóza-6-fosfátfosfatázu, charakterizovaný tak, že to je dvojdielny enzým majúci mutáciu v časti kódujúcej trehalóza-6-fosfátsyntázu.

81. Polynukleotid podľa nároku 79 alebo 80, charakterizovaný tak, že dvojdielny gén je ľudský TPS/TPP.

161

82. Polynukleotid podľa nároku 81, charakterizovaný tak, že ľudský TPS/TPP obsahuje aminokyselinovú sekvenciu podľa SEQ ID MCI: 11.

83. Polynukleotid podľa nároku 82, charakterizovaný tak, že obsahuje polynukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO: 10.

84. Polynukleotid podľa nároku 79 alebo 80, charakterizovaný tak, že dvojdielny gén je TPS/TPP gén Arabídopsis tbaliana.

86. Polynukleotid podľa nároku 84, charakterizovaný tak, že ľudský TPS/TPP obsahuje aminokyselinovú sekvenciu podľa SEQ ID NO: 40.

86. Polynukleotid podľa nároku 86, charakterizovaný tak, že obsahuje polynukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO: 39.

87. Polynukleotid podľa nároku 79 alebo 80, charakterizovaný ľudský TPS/TPP obsahuje aminokyselinovú sekvenciu podľa SEQ IĎ NO-. 43 alebo odtiaľ pochádzajúci muteín.

89. Polynukleotid podľa nároku 88, charakterizovaný tak, že obsahuje polynukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO: 42 alebo SEQ ID NO: 44.

90. Polynukleotid podlá nároku 79 alebo 80, charakterizovaný tak, že dvojdielny gén je TPS/TPP gén Helianthus annuus.

91. Polynukleotid podľa nároku 90, charakterizovaný tak, že ľudský TPS/TPP obsahuje aminokyselinovú sekvenciu podľa SEQ ID NO: 25 alebo odtiaľ pochádzajúci muteín.

92. Polynukleotid podľa nároku 91, charakterizovaný tak, že obsahuje polynukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO: 24 alebo SEQ ID

162

NC): 26 alebo SEO ID NO: 28.

93. Vektor prechovávajúci polynukleotid podľa ktoréhokoľvek nároku 79-92.

94. Hostiteľský organizmus obsahujúci vektor podľa nároku

93.

95. Hostiteľský organizmus podľa nároku 94, charakterizovaný tak, že to je Agrobacteríum tumefacíens.

96. nároku 94 Bunka alebo t r a n s f o r m o v a n á 95. hostiteľským organizmom podľa 97. Bunka podľa nároku 96, charakterizovaná tak, že to je rastlinná bunka

98. Rastlina alebo časť rastliny, regenerovaná z rastlinnej _;bunky podľa-, nároky_Ľ>i37-. -<.