ES2379461T3

ES2379461T3 - Terpeno sintasa/ciclasa y olefina sintasa y sus utilizaciones

Info

Publication number: ES2379461T3
Application number: ES02700889T
Authority: ES
Inventors: Asaph Aharoni; Maarten Anthonie Jongsma; Henricus Adrianus Verhoeven; Hendrik Jan Bouwmeester
Original assignee: Enza Zaden Beheer BV; Monsanto Invest BV
Current assignee: Enza Zaden Beheer BV; Monsanto Invest BV
Priority date: 2001-02-12
Filing date: 2002-02-12
Publication date: 2012-04-26
Anticipated expiration: 2022-02-12
Also published as: EP1379663B1; WO2002064764A3; US20100144893A1; WO2002064764A2; US8338663B2; ATE537260T1; EP1379663A2; EP1231273A1; WO2002064764A8; US20040161819A1; BR0207164A; US7453024B2

Abstract

Acido nucleico, o fragmento funcional del mismo, que codifica una molecula de naturaleza proteica, en el que dicha molecula de naturaleza proteica es capaz de sintetizar, como minimo, un alcohol monoterpenico linalol cuando se pone en contacto con geranil difosfato (GPP) y, como minimo, un alcohol sesquiterpenico nerolidol cuando se pone en contacto con farnesil difosfato (FPP) en condiciones apropiadas, en el que dicho acido nucleico codifica una molecula de naturaleza proteica, que comprende una secuencia de aminoacidos o fragmento funcional de la misma que es, como minimo, el 50% identica a la secuencia H64MUT, tal como se muestra en la figura 2, o un fragmento funcional de la misma, preferentemente el 70% identica, mas preferentemente el 80% identica, mas preferentemente el 90% identica, mas preferentemente el 95% identica, y de la forma mas preferente el 99% identica.

Description

Terpeno sintasa/ciclasa y olefina sintasa y sus utilizaciones La presente invencion se refiere al sector de la manipulacion genetica del desarrollo de un sabor, fragancia o agente de control biologico. Mas especificamente, la presente invencion se refiere a un proceso para la produccion de compuestos isoprenoides bioactivos mediante el control o la modulacion de uno o mas genes implicados en ese proceso. Los isoprenoides son el grupo mas grande y mas diverso de compuestos secundarios vegetales. Como minimo, se han descrito 20.000 isoprenoides y, sin duda, much os mas se descubriran en el futuro. Por definicion, los isoprenoides estan compuestos por las llamadas unidades de isopreno (C5). Esto se puede reconocer en el numero de atomos de C presente en los isoprenoides, que habitualmente pueden dividirse entre cinco (C5, C10, C15, C20, C25, C30 y C40), aunque tambien se han descrito isoprenoides y politerpenos irregulares. Son miembros importantes de los isoprenoides, entre otros, los carotenoides, giberelinas, acido abscisico, algunas citoquinas, esteroles y los terpenoides, que comprenden, entre otros, monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos, triterpenos, tetraterpenos y politerpenos (gomas), etc. La mayoria de estos compuestos se producen en forma libre, pero tambien pueden estar modificados, o derivatizados como esteres y glucosidos, o unidos a proteinas. Entre los isoprenoides hay muchos compuestos con actividad biologica, por ejemplo, como r eguladores del crecimiento vegetal (giberelinas, acido abscisico, citoquinas), y en la interaccion entre plantas y otros organismos (por ejemplo como anti-microbianos, infoquimicos y los isoprenoides estimuladores de la germinacion que son exudados por las raices de algunas especies vegetales e inducen la germinacion de semillas de malas hierbas parasitas). Los monoterpenos y sesquiterpenos, la rama de C10 y C15 de la familia de los isoprenoides, fueron investigados por su valor economicamente interesante como compuestos generadores de sabor y fragancia en alimentos y cosmeticos y sus propiedades anti-carcinogenas y antimicrobianas. Los monoterpenos y sesquiterpenos tambien han mostrado tener importancia ecologica, por ejemplo, en la interaccion entre plantas, plantas e insectos/aranuelas (acaros d e la familia Tetranychidae) y p lantas y microorganismos. Por lo tanto, las pl antas que producen monoterpenos y sesquiterpenos han sido investigadas por muchos autores y esto ha dado como resultado una mejor comprension de las rutas bioquimicas que conducen a la formacion de estos compuestos y sus derivados. El linalol es un alcohol monoterpenico aciclico que tiene un peculiar sabor dulce floral y cremoso. En Clarkia breweri (Onagraceae) el linalol, entre otros compuestos, es responsable de la atraccion de polillas polinizadoras. El linalol es uno de los compuestos volatiles liberados como semioquimicos despues del ataque de un herbivoro en algunas plantas y, como tal, puede atraer a depredadores de los herbivoros. El sabor dulce del linalol le hace adecuado para mejorar el sabor a arandanos de productos alimentarios, especialmente de bebidas (patente de Estados Unidos N° 4041185). Ademas, se sabe que el linalol tiene una actividad antimicrobiana de amplio espectro. Se ha descrito por Pattnaik y otros (Microbios 89: 39-46, 1997), que muestra actividad antibacteriana contra bacterias Gram positivas y Gram negativas, asi como actividad antifungica contra hongos similares a levadura y filamentosos. El nerolidol, el analogo sesquiterpenico del monoterpenoide linalol, es un componente de muchos aceites esenciales y camaras volatiles florales (Bauer y otros, Common Fragrance and Flavor Materials. Preparations, Properties and Uses [Materi ales ha bituales de fraga ncia y s abor. Preparacio nes, propie dades y util izaciones], VCH Verlaggesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990; Knudsen y otros, Phytochemistry [Fitoquimica] 33: 253-280, 1993). Se ha descrito que el nerolidol tiene actividad antimicrobiana. El documento EP 0420630A2 describe la utilizacion de nerolidol en una composicion oral antiplaca. Bouwmeester y otros (Plant Physiol. 121: 173-180, 1999) para pepino y judia de Lima y Degenhardt y Gershenzon (Planta 210: 815-822, 2000) para maiz, demostraron que la biosintesis de nerolidol es inducida, respectivamente, despues de la alimentacion por parte d e aranuelas o Spodoptera. La enzima resp onsable de l a formacion de nerolidol cataliza la etapa reguladora en la formacion de la importante molecula de senalizacion 4,8-dimetil-1,3(E),7nonatrieno. Tanto el n erolidol como el 4,8-dimetil-1,3(E),7-nonatrieno son importantes constituyentes de la mezcla volatil producida en el maiz, despues de la alimentacion de larvas de gardama (Turlings y otros, Science 250: 1251-1253, 1990; Degenhardt y Gershenzon, 2000) y en gerbera en respuesta a la alimentacion por parte de aranuelas (Krips y otros, J. Chem Ecol 1999). Tambien en la camara volatil de varias flores, el nerolidol es un importante constituyente a menudo junto con 4,8-dimetil-1,3(E),7-nonatrieno (Kaiser, en: Perfumes: Art, Science and Technology [Perfumes: arte, ciencia y tecnologia], Elsevier Science Publishers, Essex, Reino Unido, pags. 213-250, 1991; Knudsen y otros, 1993). Tambien se ha descrito el nerolidol como constituyente de mezclas de feromonas en una serie de insectos y aranuelas (Aldrich-JR; Lusby-WR; Kochansky-JP, Experientia. 1986, 42: 5, 58 3-585; Regev-S; Cone-WW. Environmental-Entomology [Entomologia medioambiental] 1976, 5: 1, 133-138) y se ha descrito como acaricida si se formula en un sustrato de liberacion controlada (patente de Estados Unidos N° 4775534). Ademas, se ha descrito que el nerolidol es un repelente de mosquitos extremadamente eficaz.

A partir de una serie de plantas, se han aislado varios ADNc que codifican enzimas implicadas en la biosintesis de monoterpenoides, tales como S-linalol y R-linalol sintasas (Cseke y otros, Mol. Biol. Evol. 15: 1491-1498, 1998; Jia y otros, Arch Biochem Biophys 372: 143-149, 1999), (-)-4S limoneno sintasa (Colby y otros, J Biol Chem 268: 2301623024, 1993; Bohlmann y otros, J Biol Chem 272: 21784-21792, 1997).

El documento WO 9715584 describe la utilizacion de S-linalol sintasa, una monoterpeno aciclico sintasa, en la manipulacion genetica de la produccion de aroma. La utilizacion de la limoneno (monoterpeno) ciclasa en el control del gusano de la raiz del maiz, insertand o una secuencia de nucleotidos que codifica limoneno ciclasa en las plantas, se describe en el documento WO 9637102. En el documento WO 0022150, se describe la utilizacion de una limoneno sintasa, linalol sintasa y combinacion de limoneno y carveol sintasa (denominada en realidad limoneno hidroxilasa) p ara el c ontrol de ins ectos. Sin emb argo, los prod uctos terpen oides se formaron solame nte e n combinacion con una GPP sintasa.

Las enzimas implicadas en la produccion de precursores para la sintesis de los esqueletos de monoterpeno primario estan todas activas en los plastos, dado que todos los genes clonados de esta ruta hasta ahora tienen senales de direccion a los plastos. Recientemente, para una enzima, (4S)-limoneno sintasa, la localizacion en los leucoplastos de l as ce lulas secretoras e n Mentha spicata se ha demostrado c on inmu nomarcado co n or o. L as sen ales de direccion a los plastos indican que los precursores de isoprenoide para el metabolismo del monoterpeno se forman en los plastos, aunque se ha demostrado que se produce cierta division de estos precursores entre los diferentes compartimentos celulares de las plantas. A diferencia de otras monoterpeno (yditerpeno) ciclasas, que portan peptidos trans itorios esci ndibles de 50-70 aminoacidos, el ADNc de S-linalol s intasa aisl ado por Pichersk y y colaboradores, codific a una protein a co n un peptido escindible evi dente de, com o ma ximo, so lamente oc ho aminoacidos de largo. Sin embargo, se descubrieron caracteristicas de senal de direccion al plasto tipicas en los primeros 60 a minoacidos de l ADNc, lo que ap oya q ue l a enzim a li nalol sintas a, co mo se esp eraba p ara u na monoterpeno sintasa, es dirigida, de hecho, a los plastos.

Dos clones de ADNc independientes que codifican 5-epi-aristoloqueno sintasa (EAS) de tabaco han sido aislados y caracterizados por Facchini yChappell (Proc Natl Acad. Sci. Estados Unidos, 89: 11088-11092, 1992). Back y Chappell describieron la clonacion y la expresion bacteriana de vetispiradieno sintasa descubierta en Hyoscyamus muticus (J. Biol. Chem., 270(13): 7375-7381, 1995). El ADNc que codifica amorfa-4,11-dieno sintasa, un intermedio en la biosintesis del antimalarico artemisinina, fue aislado y caracterizado por Mercke y otros (Arch. Biochem. Biophys., 381(1): 173-180, 2000). La biosintesis de sesquiterpeno esta compartimentalizada en el citosol, y ninguna de las sesquiterpeno sintasas aisladas hasta el momento porta senal de direccion alguna. El farnesil difosfato (FPP) esta presente en cada organismo vivo y es el precursor de un gran numero de metabolitos primarios y secundarios. Se ha establecido que el FPP es el precursor de todos los sesquiterpenoides. Hay varios miles de compuestos sesquiterpenoides diferentes identificados en muchos organismos vivos. Son ejemplos, las amargas sesquiterpeno lactonas, tales como soncusida A y C, y cicorilida A en achicoria (De Kraker y otros, Plant Physiol 117: 1381-1392, 1998). La primera etapa comprometida en la biosintesis de estos compuestos es catalizada por una germacreno A sintasa que se clono a partir de achicoria (PCT/EP 0002130). Otros ejemplos son la clonacion de tres sesquiterpeno sintasas ((E)-a-bisaboleno, 5-selineno, y y-humuleno sintasa) de abeto gigante (WO 99/37139; Bohlmann y otros, proc Natl Acad Sci, Estados Unidos, 95: 6756-6761), y una germacreno C sintasa de tomate (Colby y otros, Proc Natl Acad Sci, Estados Unidos, 95: 2216-2221). La utilizacion de la amorfa-4,11-dieno sintasa en la manipulacion de la biosint esis de artemisi nina se describ e en el docu mento EP 0 982 4 04 A1. Sin embar go, la supuest a sesquiterpeno sintasa, responsable de la formacion del biologicamente importante nerolidol, nunca ha sido clonada.

La utilizacion de tecnologia de ADN recombinante, para introducir resistencia en base a metabolitos secundarios en plantas, solamente ha tenido un exito limitado. Por ejemplo, Hain y otros (Nature 361, 153-156, 1993) consiguieron introducir resistencia a hongos en una serie de especies vegetales mediante la introduccion del ADNc de resveratrol sintasa, qu e a islaron de l a uva. Au nque existen i nformes sobre l os efectos antimi crobianos e insecticidas de terpenoides especificos, la resistencia contra hongos, como resultado de la expresion de una terpeno sintasa en plantas, no se ha descrito hasta la fecha.

La presente invencion da a conocer un acido nucleico, o fragmento funcional del mismo, que codifica una molecula de naturaleza proteica, en el que dicha molecula de naturaleza proteica es capaz de sintetizar, como minimo, un alcohol monoterpenico linalol cuando se pone en contacto con geranil difosfato (GPP) y, como minimo, un alcohol sesquiterpenico nerolidol cuando se pone en contacto con farnesil difosfato (FPP) en condiciones apropiadas, en el que d icho acido nuc leico c odifica una m olecula d e na turaleza protei ca que c omprende un a se cuencia d e aminoacidos o fragmento funcional de la misma, que es, como minimo, el 50% identica a la secuencia H64MUT, tal como se muestra en la figura 2, o un fra gmento funcional de la misma, preferentemente el 70% identica, mas preferentemente el 80% identica, mas preferentemente el 90% identica, mas preferentemente el 95% identica, y de la forma mas preferente el 99% identica.

Preferentemente, dicho acido nucleico codifica una molecula de naturaleza proteica que comprende una secuencia de aminoacidos o fragmento funcional de la misma que es identica a la secuencia H64MUT, tal como se muestra en

la figura 2, o la secuencia H64NORS, tal c omo se m uestra en la figura 2, o la secuencia H64VES, tal como s e muestra en la figura 2, o un fragmento funcional de la secuencia H64MUT, H64NORS o H64VES.

Actualmente, la principal manera de producir compuestos que generan sabores vegetales (para facilitar la referencia con sabor tambien se indican, en general, fragancias) es mediante la via sintetica. Los productos quimicos organicos sinteticos constituyen mas del 80-90% (en peso y en valor) de las materias primas utilizadas en formulaciones de sabor y de fragancia. Sin embargo, a menudo existen problemas relativos a la produccion. La extraccion a partir de plantas intacta s y la fermen tacion co nvencional estan d ando a conoc er actualme nte vi as alterna tivas para la produccion comercial de productos quimicos generadores de sabor/aroma. Sin embargo, la demanda de sabores naturales por parte del consumidor ha estado aumentando de forma constante, y la demanda a menudo sobrepasa el suministro. En muchos c asos, los codiciados compuestos generadores de sabor no pueden aislarse facilmente. Una comprension de los precursores y la caracterizacion de genes que codifican enzimas implicadas en diversas rutas, que conducen a la formacion de sabores, son esenciales para la produccion de sabores naturales. Los acidos nucleicos y sus moleculas de naturaleza proteica codificadas de la pres ente invencion estan implicados en la ruta biosintetica para la prod uccion de terp enoides y, como t ales, dan a co nocer nuevos medios y metodos para la produccion biotecnologica in vivo e in vitro de biosabores, productos quimicos generadores de sabor naturales y compuestos de control biologico.

Ademas, los acidos nucl eicos y sus moleculas de naturaleza prote ica codific adas de la pr esente invenc ion y productos sintetizados son capaces esencialmente de actuar como potentes agentes de control biologico, solos o en combinacion.

Los hongos y las bacterias se han convertido en una amenaza creciente para los seres humanos. Las infecciones microbianas oportunistas han aumentado de manera espectacular en las dos ultimas decadas y se han convertido en una causa significativa de morbilidad y mortalidad. En los ultimos anos, la frecuencia de infecciones fungicas potencialmente letales ha a umentado de manera espectacular, haciendo a las infecci ones fungicas responsables actualmente de casi el 40% de todas las muertes, a causa de infecciones adquiridas en el hospital. El mayor numero de pacientes con un sistema inmunitario alterado (tales como debido al envejecimiento, quemaduras graves, SIDA, quimioterapia contra el c ancer, o ter apia i nmunosupresora p ara tra nsplantes de org anos), j unto c on una list a creciente de hongos y bacte rias potenciales patogenas, son reconocidos como factores que contribuyen a este creciente peligro para la s alud publica. Solamente hay un limitado conjunto de compuestos de control biologico disponibles, y la resistencia a los farmacos de control biologico existentes se esta convirtiendo en un problema de importancia cr eciente. Adem as, los a ntimicoticos uti lizados clin icamente pu eden mostrar efecto s secun darios perjudiciales.

Los hongos son responsables de sustanciales perdidas economicas debido al deterioro de alimentos, causado por toxinas altamente peligrosas (micotoxinas). Ademas de este problema, los aditivos alimentarios para impedir la contaminacion fung ica tam bien pueden se r pote ncialmente carc inogenos. Ad icionalmente, l os mi croorganismos patogenos de vegetales causan enormes perdidas de cultivos y esto ha promovido la amplia utilizacion de pesticidas en todo el mundo. Algunos pesticidas tienen efectos perjudiciales sobre organismos diferentes de las plagas que se pretende controlar, sobre la calidad del agua, y sobre el medio ambiente, en general. Los actuales antimicrobianos a menudo no son lo suficientemente especificos, y varias especies microbianas muestran una resistencia en aumento a estos pesticidas. Existe una necesidad de desarrollar nuevos y mas avanzados agentes de control biologico con nuevos mod os de acci on y amplios esp ectros, dirigi dos contra p atogenos d e pl antas y a nimales. Los aci dos nucleicos y sus moleculas de naturaleza proteica, codificadas de la presente invencion, implicados en la biosintesis de terpenoides, como tales, dan a conocer un nuevo metodo para la produccion biotecnologica in vivo e in vitro de agentes antimicrobianos o de control biologico naturales y mas especificos, por ejemplo antifungicos.

El aci do nuc leico, tal como se uti liza en el presente documento, se refiere a un o ligonucleotido, nuc leotido o polinucleotido, y fragmentos o partes de los mismos, y a ADN o ARN de origen genomico o sintetico, que puede ser de cadena sencilla o de cadena doble, y representa la cadena sentido o antisentido. Una moleculade naturaleza proteica, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molecula que comprende un peptido o proteina. La sintesis de sabor natural, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a compuestos generadores de sabor y de fragancia sintetizados que son identicos a sus contrapartidas naturales. Contrapartida natural, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a pr oductos que se obtienen directamente de fuentes vegetales y, algunas veces, animales, mediante procedimientos fisicos. Sabores sinteticos se refiere a compuestos identicos a los naturales que se producen de forma sintetica pero son quimicamente identicos a su contrapartida natural. Los compuestos identicos a los naturales son, con pocas excepciones, los unicos compuestos sinteticos utilizados en sabores ademas de los productos naturales. La sintesis de sabor artifici al se refiere a compuestos g eneradores de sabor q ue n o han s ido identificados e n product os ve getales o a nimales p ara e l consumo humano. Los acidos nucleicos de la presente invencion sientan las bases para la produccion de sabores artificiales util izando tecnic as conoc idas en l a tecnic a tales com o, por e jemplo, biosintes is c ombinatoria, manipulacion de rutas metabolicas, transposiciones geneticas, evolucion dirigida de proteinas, etc. La sintesis de control b iologico, tal como se utiliz a en el pres ente d ocumento, se refiere a com puestos d e co ntrol bi ologico sintetizados que pueden actuar como un agente de control biologico. Un agente de control biologico, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un compuesto, que puede suprimir o inhibir o restringir, como minimo

en parte, el crecimiento de un organismo patogeno (por ejemplo, hongos, bacterias, etc.), que es un compuesto que tiene actividad anti-patogenos.

La definicion "fragmento funcional" significa que una secuencia de un sujeto especifico puede variar respecto a la secuencia de referencia en una o mas sustituciones, deleciones o adiciones, cuyo efecto neto no da como resultado una disimilitud funcional adversa entre la secuencia de referencia y la secuencia del sujeto. Puede ser ventajoso producir un acido nucleico, segun la presente invencion, o derivados del mismo que posea una utilizacion de codones sustancialmente diferente. Los expertos en la materia saben que, como resultado de la degeneracion del codigo genetico, puede producirse una multitud de secuencias genicas, algunas que portan una homologia minima con las secuencias de nucleotidos de genes cualesquiera conocidos y cualesquiera de origen natural. La presente invencion incl uye la pos ible variacio n de la secue ncia de acid o nucl eico qu e po dria realizars e selecci onando combinaciones en base a posibles elecciones de codones. Ademas, puede realizarse la sustitucion de aminoacidos deliberada en base a similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia y/o la naturaleza anfipatica de los residuos, siempre que se conserve la actividad biologica del polipeptido.

Dicho acido nucleico codifica una terpeno ciclasa que tiene una capacidad de sintetizar nerolidol y linalol combinada. El nerolidol es un sesquiterpeno analogo del monoterpenoide linalol. Las enzimas implicadas en la produccion de precursores para l a sintes is de los esq ueletos de m onoterpenos primarios ha n demostrado ser activas en los plastos. La capacidad de dicha terpeno ciclasa de sintetizar linalol parece estar influida por la pres encia de una secuencia de senal d e d ireccion al pl asto, qu e es rica en r esiduos hidroxilados y basicos. La biosintesis d e sesquiterpeno esta compartimentalizada en el citosol, y ninguna de las sesquiterpeno sintasas aisladas hasta la fecha porta senal de direccion alguna. Sin embargo, la presente invencion muestra que los monoterpenos tambien pueden producirse mediante monoterpeno sintasas citosolicas. Aparentemente, el sustrato GPP esta presente en el citosol. La presente invencion muestra que la produccion de sesquiterpenos en el citosol es dificultada por una falta de sustrato. La co-expresion de una FPP sintasa citosolica o la transformacion con una construccion de fusion de sesquiterpeno sintasa y F PP sintas a s e d a a co nocer actualmente p ara su perar est e pr oblema. Una s olucion adicional es l a direcci on d e la bi osintesis de sesqu iterpenos a otro s compartime ntos celu lares anad iendo o cambiando una senal de direccion a/de la sesquiterpeno sintasa y/o la co-transformacion de una FPP sintasa con la misma direccion o transformacion con una construccion de fusion dirigida de sesquiterpeno sintasa y FPP sintasa. Ademas de la FPP sintasa, otras enzimas que catalizan etapas comprometidas en la biosintesis de GPP yFPP a traves de la ruta de mevalonato yno de mevalonato pueden acoplarse a, o co-expresarse con, monoterpeno y sesquiterpeno sintasas para aumentar los niveles de monoterpenos y/o sesquiterpenos producidos. Estas enzimas pueden dirigirse (anadiendo, cambiando y eliminando senales de direccion) a diferentes compartimentos (es decir, mitocondrias, cloroplastos, cromoplastos, leucoplastos, peroxisomas (vease tambien el ejemplo 7);

La presente invencion da a conocer, por lo tanto, un acido nucleico, segun la presente invencion, que codifica una molecula de naturaleza proteica provista de una senal de direccion, tal como una senal de direccion al plasto o una senal de direccion a mitocondrias, o una senal de direccion a cualquier otro organulo o un acido nucleico, segun la presente invencion, que codifica una molecula de naturaleza proteica sin dicha senal, dependiendo de donde se requiera la sintesis. La presente invencion da a conocer, por lo tanto, un acido nucleico, segun la presente invencion, que codifica una molecula de naturaleza proteica esencialmente capaz de la sintesis de un compuesto isoprenoide bio-activo en el citosol en una celula, cuando esta provisto de un sustrato adecuado en condiciones de reaccion apropiadas. Analogamente, la presente invencion da a conocer un acido nucleico, segun la presente invencion, que codifica una molecula de naturaleza proteica esencialmente capaz de sintesis de un compuesto isoprenoide bioactivo en un plasto en una celula o en una mitocondria, en una celula, cuando esta provista de un sustrato adecuado en condiciones de reaccion apropiadas.

En una realizacion preferente, dicho acido nucleico, tal como se da a conocer en el presente documento, esta provisto de u n aci do n ucleico q ue co difica un a sen al de d ireccion y/o rest os d e un a sen al de d ireccion. Preferentemente, dicha senal de direccion es una senal de direccion a plastos. Dicha senal de direccion a plastos esta ubicada, preferentemente, en el extremo N (peptido de transito N-terminal) y puede tener una gran abundancia de residuos de serina y/o treonina y/o un bajo numero de residuos de acidos y/o ser rica en residuos hidroxilados y basicos. En una realizacion preferente, dicha senal de direccion tiene un motivo F (Phe), K (Lys), V (Val), F (Phe), N (Asn) y/o un motivo D (asp) S (Ser), L (Leu), L (Leu), Xaa, S (Ser), S (Ser), donde Xaa es preferentemente, P (pro) o S (Ser). En otra realizacion, la senal de direccion RRxxxxxxxxW es preferente. En particular la presente invencion da a conocer un acido nucleico que codifica un fragmento de sesquiterpeno sintasa esencialmente bioactivo, dicho acido nucleico provisto de una senal de direccion para dar a conocer el producto genico codificado con actividad de monoterpeno sintasa, o u n acido nucleico que c odifica un fragme nto de mon oterpeno si ntasa e sencialmente bioactivo, dicho acido nucleico desprovisto de una senal de direccion, esencialmente, a plastos, para dar a conocer el producto genico codificado con actividad de sesquiterpeno sintasa y, por lo tanto, da a co nocer la diversas enzimas con una actividad diferente, tal como se esperaria.

Se entiende que, a traves d e evolucion convergente o divergente, pueden crearse, mediante esta ruta, nuevas proteinas con funciones alteradas. Las mutaciones que conducen a divergencia son, en su mayoria, sustituciones de base un ica q ue gen eran sustitucio nes d e amino acidos indivi duales, aun que otros sucesos que conduce n a deleciones o inserciones tambien se producen. Las mutaciones pueden estar en un acido nucleico que comprende el

peptido de transito y/o el marco de lectura abierta (ORF). La nueva proteina contiene habitualmente muchos de los elementos pr e-existentes. L a funcion biologica or iginal puede restaur arse invirti endo mutaciones (p or ejem plo, sustituciones de base unica) utilizando tecnicas conocidas en la tecnica (por ejemplo, mutagenesis dirigida).

En una realizacion preferente, a traves de una sustitucion de base unica en una secuencia predecesora de dicha secuencia de acido nuc leico (por ejemplo H64NORL), el peptido de transito N-terminal es restaurado. El termino restaurado/a, tal como se utiliza en el presente documento, significa que un codon de terminacion en la senal diana se elimina, por ejemplo a traves de una sustitucion de base unica, de modo que la traduccion comienza en el primer ATG (Met), cade na arri ba de la se nal diana/secuencia de transito o resto de la senal diana. La secu encia predecesora de dicha secuencia nucleica es una secuencia (secuencia de ancestro comun) que tiene un codon de terminacion en la senal diana o el resto de senal diana, de modo que la traduccion dela proteina comienza en un segundo ATG (Met) truncando la senal diana o el resto de la senal diana. Se conjetura que la presencia de la senal diana restaurada o el resto de la senal diana influyen en la sintesis de linalol y/o nerolidol.

La ionizacion de FPP al cation farnesilo es la primera etapa en la biosintesis de un gran numero de sesquiterpenos. Los productos de muchas de las sesquiterpenoide sintasas/ciclasas que catalizan la formacion de un esqueleto terpenoide a partir de los respectivos sustratos de difosfato (FPP), en su mayoria, hidrocarburos ciclicos, con unas pocas excepciones, ta les c omo, por ej emplo, e l a lcohol s esquiterpenico aciclic o nero lidol. N inguna de las sesquiterpeno sintasas aisladas hasta la fecha porta senal de direccion alguna.

La presente invencion da aconocer, por lo tanto, un acido nucleico segun la presente invencion, en el que dicho acido nucleico codifica una molecu la de n aturaleza proteica que comprende una secuencia de a minoacidos o fragmento funcional de la misma que es, como minimo, el 50% identica a la secuencia H64MUT, mas preferente el 53 o el 60% homologa, y aun mas preferente el 70, 80, 90, 95 o 99% homologa a la secuencia, tal como se muestra en la figura 2 o fragmento funcional de la misma. La homologia es generalmente respecto a la longitud completa de la secuencia relevante mostrada en el presente documento. Tal como es bi en sabido, la homologia, a nivel de aminoacidos, es generalmente en terminos de similitud o identidad de aminoacidos. La similitud permite la "variacion conservativa", es decir sustitucion de un residuo hidrofobo, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, o la sustitucion de un residuo polar por otro, tal como arginina por lisina, acido glutamico por acido aspartico, o glutamina por asparagina. La sustitucion deliberada de a minoacidos puede realizarse en bas e a si militud de la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobia y/o la naturaleza anfipatica de los restos, siempre que se conserve la actividad biologica del polipeptido. En una realizacion preferente, todas las homologias de porcentaje mencionadas en el presente documento se refieren al porcentaje de identidad de secuencia, por ejemplo el porcentaje (%) de identidad de la secuencia de aminoacidos con respecto a una secuencia de referencia particular puede ser el porcentaje de resid uos de amin oacidos en una sec uencia c andidata, qu e so n ide nticos a los resi duos d e aminoacidos en la secuencia de referencia, despues de alinear las secuencias e introducir los huecos, si fuera necesario, para conseguir el maximo porcentaje de identidad de secuencia, sin considerar a sustitucion conservativa alguna como parte de la identidad de secuencia. La similitud o identidad de aminoacidos puede determinarse mediante programas geneticos conocidos en la tecnica.

La presente invencion comprende, ademas, un acido nucleico que codifica una molecula de naturaleza proteica segun la presente invencion que puede obtenerse de un eucariota. Un eucariota, tal como se utiliza en el presente documento, comprende una celula u organismo con un nucleo estructuralmente discreto limitado por una membrana y otros c ompartimentos su bcelulares bie n desarr ollados. Los eucar iotas, tal com o se util iza e n el pr esente documento, in cluyen todos los org anismos exc epto v irus, bacteri as y ci anobacterias (alg as ver de-azuladas). Preferentemente, dicho acido nucleico puede obtenerse de fresa y/o maiz y/o te y/o pepino y/o judiade lima y/o algodon y/o e species de ti mo y/o es pecies de citricos y/o es pecies de euc alipto y/o p omelo y/o hon gos y/o levaduras.

La presente invencion comprende, ademas, un acido nucleico que codifica una molecula de naturaleza proteica, segun la presente invencion, que puede obtenerse de un procariota. Un procariota, tal como se utiliza en el presente documento, comprende una celula u organismo que carece de un nucleo estructuralmente discreto limitado por una membrana y otros compartimentos subcelulares, por ejemplo bacterias, incluyendo arqueobacterias y cianobacterias (algas verde-azuladas).

La presente invencion comprende ademas un acido nucleico que codifica una molecula de naturaleza proteica segun la presente invencion, que puede obtenerse a partir de animales invertebrados. Un artropodo es un miembro de un phylum d e an imales i nvertebrados que i ncluye ins ectos, aracnidos (aranas y acaros por ejemp lo aranu elas (Tetranychus urticae), afidos (por ejem plo Aphis gossypii, Myzus persicae), y trips ( Frankliniella occidentalis) y crustaceos (cangrejos, langostas, cochinillas, camarones, etc.).

En una realizacion preferente, dicho acido nucleico que codifica una molecula denaturaleza proteica segun la presente invencion puede obtenerse de fresa. La pr esente invencion da a co nocer, ademas, un a cido nucleico, segun la presente invencion, en el que la expresion de dicho acido nucleico se representa mediante auxina durante la maduracion del fruto. El acido indol-3-acetico o auxina es una hormona vegetal que desempena papeles clave en la regulacion de la division, la extension y la diferenciacion celular.

La presente invencion da a conocer una molecula de naturaleza proteica codificada por un acido nucleico, segun la presente invencion. La presente invencion da a conocer ademas un vector que comprende un acido nucleico, segun la presente invencion. Preferentemente, dicho vector es un vector de expresion recombinante que comprende una secuencia codificante que esta unida de forma operativa a una secuencia promotora, capaz de dirigir la expresion de dicha s ecuencia cod ificante en un a cel ula huesp ed p ara dich o vector , y un a secu encia d e termi nacion de la transcripcion, en la que la secuencia codificante es un acido nucleico segun la presente invencion. Preferentemente, a dicho acido nucleico se le ha provisto de medios para la direccion y/o la integracion nuclear en el genoma de un huesped.

Pueden utilizarse metodos que se conocen bien en la tecnica para construir vectores de expresion que contienen el acido nucleico de la presente invencion, y controles transcripcionales y traduccionales apropiados. Estos metodos incluyen tecnicas recombinantes in vitro. Pueden utilizarse elementos transcripcionales exogenos y codones de iniciacion y tambien pueden ser de diversos origenes, tanto naturales como sinteticos. La eficacia de la expresion puede mejorar mediante la inclusion de mejoradores apropiados para el sistema celular que se esta utilizando. En el caso de vectores de expresion en plantas, la expresion de un acido nucleico de la presente invencion puede estar impulsada por una serie de promotores definidos anteriormente y aun por definir, incluyendo promotores inducibles y regulados desde el punto de vista del des arrollo. La presente invencion contempla, ademas, la utilizacion de los promotores individuales del acido nucleico de la presenteinvencion para este fin. En particul ar, pueden utilizarse promotores cualesquiera particularmente sensibles a sucesos de maduracion, promotores inducibles por heridas o inducibles especificos (por ejemplo promotores inducibles por aranuelas, insectos etc., que pueden aislarse de plantas de las que se alimentaron, por ejemplo, aranuelas o insectos), para impulsar la expresion especifica de tejido de dicho acido nucleico. Ademas, los promotores virales tales como los promotores 35S y19S de CaMV pueden utilizarse solos o en combinacion con la secuencia lider omega de TMV. Pueden utilizarse promotores o mejoradores obtenidos de los genomas de celulas vegetales, promotores especificos de tejidos, es decir promotores especificos de frutos, Fbp7 (Columbo y otros 1997; Plant Cell [Celula vegetal] 9; 703-715), promotor 2A11 (Pear y otros, 1989, Plant Molecular Biology [Bilogia molecular vegetal], 13: 639-651), la subunidad pequena de la enzima Rubisco (Corruzzi y otros, 1984; EMBO J 3: 16 ; Broglie y otros, 1984 Science 224: 838-843) o promotores especificos de temporizacion, tales como promotores especificos de maduracion (el promotor E8, Diekman y Fisher, 1988, EMBO J,

7: 3315-3320). Las secuencias terminadoras adecuadas incluyen la del gen de nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (Nos extremo 3'), la region de terminacion de la subunidad pequena de ribulosa bisfosfato carboxilasa de tabaco; y otras regiones 3' conocidas en la tecnica. Pueden utilizarse metodos conocidos en la tecnica para construir v ectores recom binantes q ue expresaran u n ac ido n ucleico "s entido" o "anti sentido". T ambien p ueden utilizarse tecnicas antisentido o sentido parcial u otras para reducir la expresion de dicho acido nucleico que conduce a la produccion de un sabor, fragancia y/o compuesto de control biologico. Pueden utilizarse tecnicas sentido de longitud completa para aumentar o reducir la expresion de dicho acido nucleico que conduce a la produccion de un sabor y compuesto de control biologico.

La presente invencion da a conocer, ademas, un vector de clonacion replicativo que comprende un acido nucleico, segun la presente invencion, y un replicon operativo en una celula huesped para dicho vector. La presente invencion contempla la utilizacion de sistemas de expresion de base biologica y no biologica, aun no descritos, ynuevos sistemas huespedes que pueden utilizarse para contener y expresar el acido nucleico de la presente invencion. La definicion de celula huesped, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una celula en la que se ejecuta un proceso extranomediante interaccion biologica, independientemente de que la celulapertenezca a un organismo unicelular, pluricelular, organismo diferenciado o a una celula artificial, cultivo celular o protoplasto.

La presente invencion da a conocer, ademas, un huesped que comprende un acido nucleico, segun la presente invencion, o un v ector, se gun la pr esente i nvencion. Pu eden uti lizarse diversos sistemas de e xpresion de vector/huesped p ara c ontener y expresar el aci do nucleico de l a presente i nvencion. Est os inc luyen microorganismos, tales como bacterias (por ejemplo E. coli, B. subtilis, Streptomyces, Pseudomonas) transformadas con sistemas de expresion de ADN de bacteriofagos, plasmidos o cosmidos recombinantes, levaduras (por ejemplo,

S. cerevisiae, Kluyveroromyces lactis, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Schizosacch. Pombe, Yarrowia) transformadas con vectores de expresion de levadura; hongos filamentosos (Aspergillus nidulans, Aspergillus orizae, Aspergillus niger) transformados con vectores de expresion de hongos filamentosos, sistemas de celulas de insecto transfectadas con vectores de expresion de virus (por ejemplo, baculovirus, adenovirus, virus de herpes o vaccinia); sistemas de celulas vegetales transfectadas con vectores de expresion de virus (por ejemplo virus del mosaico de la coliflor, CaMV, virus del m osaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresion bacterianos (por ejemplo, Ti o plasmido Pbr322); o sistemas de celulas de mamifero (ovario de hamster chino (CHO), rinon de cria de hamster (BHK), hibridomas, incluyendo lineas celulares de raton, de mono, de ser humano y similares. Una cepa huesped puede seleccionarse por su capacidad para modularla expresion del acidonucleico o para procesar la molecula de naturaleza proteica expresada de la forma deseada. Dichas modificaciones de dicha molecula de naturaleza proteica inc luyen acilac ion, carboxilacion, gl ucosilacion, fos forilacion y l ipidacion. El pr ocesamiento posterior a la traduccion que escinde una forma "prepro" de dicha molecula de naturaleza proteica, tambien puede ser importante para la correcta insercion, plegamiento y/o funcion. Pueden seleccionarse diferentes celulas huesped que tienen la correcta maquinaria celular y mecanismos caracteristicos para dichas actividades postraduccionales para asegurar la correcta modificacion y procesamiento de la molecula de naturaleza proteica extrana introducida.

La presente invencion da a conocer, ademas, un huesped que comprende un acido nucleico, segun la presente invencion o un vector, segun la presente invencion, en el que dicho huespedcomprende una celula procariota. La presente inve ncion da a co nocer, adem as, un huesp ed que compr ende un acid o nu cleico, seg un la prese nte invencion, o un vector segun la presente invencion, en el que dicho huesped comprende una celula eucariota.

La presente invencion da a conocer, ademas, un huesped que comprende un acido nucleico, segun la presente invencion, o un vector segun la presente invencion, en el que dicho huesped comprende una planta y material de propagacion de la misma. La presente invencion es particularmente util para permitir que las plantas produzcan linalol, nerolidol o una combinacion de los dos. Esto permite el cultivo de plantas con un sabor/fragancia mejorados como se describe para el linalol solo en el documento WO 9715584, o resistencia mejorada contra microorganismos

o insectos, tal como se describe en los ejemplos 8, 9, 12, 13 y14y el documento WO 0022150 para linalol que, sin embargo, tenia que co-expresarse con una GPP sintasa.

Las enfermedades bacterianas para las que se da a conocer resistencia en el presente documento incluyen, aunque no constituyen limitacion:

Erwinia spp. (por ej emplo E. amylovora (f uego bacteri ano) y E. carotovora), Clavibacter spp. (por ejempl o C. michiganense pv. Sepedonicum (podredumbre anular bacteriana de la patata), Corynebacterium spp., Pseudomonas spp. (por ejemplo P. syringae pv. tomato), Xanthomonas spp. (X. campestris y X. vesicatoria), y Agrobacterium spp.

Las enfermedades fungicas para las que se da a conocer resistencia en el presente documento incluyen, aunque no constituyen limitacion:

Hongos del mildiu pulverulento (Sphaerotheca spp. (por ejemplo S. pannosa var. rosa. (rosa), S. humuli (lupulo), S. fuliginea (cucurbitaceas)), Podosphaera leucotricha (manzana), Uncinula necator (uva), Erysiphe spp. (por ejemplo

E. cichoracearum (cuc urbitaceas, tomate), E. polygoni (remolac ha)), Leveillula taurica (tomate), Microsphaera euonymi (calabacin)), Botrytis spp. (por ejemplo B. cinerea (podredumbre gris)), Cladosporium spp. (por ejemplo C. fulvum (en tomate)), Sphaeropsis spp. (por ejemplo Sphaeropsis sapinea (muerte apical del pino), Cercospora spp.

(C. beticola en remolacha, C. zeae-maydis en maiz, C. sorghi en sorgo), Fusarium spp. (por ejemplo F. oxysporum f. niveum (marchitez en sandia) F. graminearum y F. moniliforme (costra en trigo) F. moniliforme, F. oxysporum, F. subglutinans, F. proliferatum), enfermedades de antracnosis (Apiognomonia veneta (en sicomoro, fresno, roble, arce y nogal), Colletotrichum trifolii (antracnosis de la alfalfa), Colletotrichum coccodes (puntos negros en la patata)), enfermedades de roya (por ejemplo Puccinia recondita (roya de las hojas de trigo) y Uromyces appendiculatus (roya en las judias)), Phytophtora spp. (P. infestans (tizon tardio de l a patata), P. sojae (tizon en semilla de so ja), P. megasperma f. sp. medicaginis (podredumbre de la raiz en alfalfa)), hongos que causan el deterioro (Gibberella spp., Diplodia spp., Penicillium, Aspergillus spp. Penicillium spp., Peacilomyces spp.), Verticillium spp. (p or ejemplo V. albo-atrum (podredumbre negra de la raiz en fresa), Septoria spp. (por ejemplo S. tritici y S. avenae f. sp. triticea (Septoriosis en trigo), S. lycopersici (Septoriosis de la hoja del tomate)), Sclerotinia spp. (por ejemplo S. sclerotiorum (moho blanco de las judias), Aphanomyces spp. (por ejemplo A. cochlioides (podredumbre de la raiz en remolacha azucarera), Alternaria spp. (por ejemplo A. solani (tizon temprano en tomate), Magnaporthe spp. (por ejemplo M. grisea (quemazon del arroz))

Insectos

Los insectos para los que se da a conocer resistencia en el presente documento incluyen, aunque no constituyen limitacion, Lepidoptera, Orthoptera, Homoptera, Hemiptera, especialmente insectos de la calabaza (Anasa tristis); chinche verde hediondo (Acrosternum hilare); Riptortus clavatus; Coleoptera, especialmente, escarabajo de la patata (Leptinotarsa decemlineata); escara bajo de la pat ata d e tripl e lin ea (Lema trilineata); escara bajo esparr aguero (Crioceris asparagi); escarabajo del frijol mexicano (Epilachna varivestis); escarabajo castano de la harina (Tribolium castaneum); escarabajo confuso de la harina (Tribolium confusum); escarabajos pulga (Chaetocnema spp., Haltica spp. y Epitrix spp.); gusan o de la raiz del maiz ( Diabrotica Sp p.); escarab ajo d e la al ubia ( Callosobruchus maculatus); picudo del algodonero (Anthonomus grandis); gorgojo del arroz (Sitophilus oryza); gorgojo del maiz (Sitophilus zeamais); calandra granaria (Sitophilus granarius); gorgojo egipcio de la alfalfa (Hypera postica); gorgojo del frijol (Acanthoscelides obtectus); gorgojo de los granos almacenados (Rhyzopertha dominica); gusano de la harina (Tenebrio molitor); Thysanoptera, especialmente, trips de las flores occidentales (Frankliniella occidentalis); Diptera, especialmente, minador de las hojas spp. (Liriomyza trifolii); nematodos parasitos de plantas especialmente los nem atodos formadores de quistes de l a patata ( Globodera sp p.), el nem atodo formador de q uistes de la remolacha (Heterodera schachtii) y los nematodos agalladores de la raiz (Meloidogyne spp.).

La resistenc ia pued e deter minarse re alizando la pru eba apropiada con el orga nismo partic ular, pero pue de predecirse tambien determinando el contenido de terpeno, tal como se demuestra en la figura 30 y el ejemplo 13 en el presente documento. Planta, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a organismos eucariotas autotrofos. Se caracterizan por la utilizacion directa de la energia solar para su metabolismo primario, su pared celular permanente y, en el caso de individuos pluricelulares, su crecimiento abierto ilimitado. En el caso de plantas heterotrofas, los organismos estan en un contexto evolutivo derivado esencialmente de plantas autotrofas en su estructura y metabolismo. La presente invencion da a conocer una planta o una parte, tal com o un tallo, hoja, tuberculo, raiz, fruto o semilla o material reproductivo de la misma transformado con el vector de expresion segun la presente invencion.

La presente invencion da a conocer, ademas, una planta o parte de la misma que contiene, dentro de su genoma, un vector segun la presente invencion.

La presente invencion da a conocer un huesped que comprende un acido nucleico, segun la presente invencion o un vector segun la presente invencion, en el que dicho huesped comprende una celula vegetal. "Celula vegetal", tal como se utiliza en el presente documento, es cualquier celula que seauto-propague, limitada por una membrana semipermeable y que conti ene un o o m as pl astos. D icha c elula r equiere una p ared cel ular s i se r equiere propagacion adicional. Celula vegetal, tal como se utiliza en el presente documento, puede formar parte de una planta completa o puede ser una celula aislada o parte de un tejido que puede regenerarse en una planta completa e incluye, por ejemplo, semil las, cultivos en susp ension, embrio nes, r egiones m eristematicas, teji dos ca llosos, protoplastos, hojas, raices, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas. Las construcciones vectoriales, segun la presente invencion, pueden introducirse en celulas vegetales mediante transformacion directa del ADN, o transfeccion mediada por patogenos. El procedimiento o metodo para preparar un transformante puede realizarse segun la tecnica convencional utilizada en los sectores de biologia molecular, biotecnologia e ingenieria genetica. La manipulacion de acido nucleico en celulas vegetales puede llevarse a cabo utilizando el sistema de recombinacion especifica de sitio Cre/l ox, tal como s e in dico e n la s olicitud de patente W O9109957. La pl anta diana p uede seleccionarse entre cualquier especie vegetal monocotiledonea o dic otiledonea. Las p lantas ejemplares incluyen patata, tomate , petuni a, maiz, sorgo, al godon, sem illa de so ja, ju dias, co lza, alfa lfa, esparr agos, bon iato y crisantemo. Sin embargo, esto no debe considerarse limitante, en la medida en que microbios e insectos pueden infestar muchos otros cultivos. Por lo tanto, los metodos de la presente invencion son facilmente aplicables a numerosas especies vegetales, si se descubre que son susceptibles a las especies de microbios o insectos que se han en umerado a nteriormente e n e l pr esente d ocumento inc luyendo, sin co nstituir l imitacion, es pecies de los generos Medicago, Trifolium, Vigna, Citrus, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Capsicum, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Helianthus, Bromus, Asparagus, Panicum, Pennisetum, Cucumis, Glycine, Lolium, Triticum y Zea.

La presente invencion da a conocer, ademas, un huesped que comprende un acido nucleico, segun la presente invencion, o un vector segun la presente invencion, en el que dicho huesped comprende una celula de insecto. Las celulas de insecto, tales como celulas de gusano de seda o las propias larvas, pueden utilizarse como huespedes. Por ejemplo, en un sistema tal, se utiliza el virus de polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar el acido nucleico extrano en celulas de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. El acido nucleico de la presente invencion puede clonarse en la region no esencial del virus, tal como el gen de la polihedrina, y ponerse bajo el control de un promotor de polihedrina. La insercion con exito del acido nucleico inactivara al gen de la polihedrina y producira un virus recombinante que carece de recubrimiento proteico. Los virus recombinantes se utilizan a continuacion, para infectar celulas de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que se expresa el acido nucleico [Smith y otros (1993) J Virol 46: 584; Engelhard y otros (1994) Proc. Natl acad Sci, 91: 3224-7].

La presente invencion da a conocer, ademas, un huesped en el que dicho vector, segun la presente invencion y dicho huesped expresa una proteina o polipeptido de nerolidol sintasa/ciclasa. Preferentemente, dicho huesped muestra una actividad glucosiltransferasa adecuada, con lo cual el linalol y nerolidol producidos se convierten y se acumulan o almacenan e n dich o h uesped c omo sus resp ectivos lin aloilglucosido y nerolidilglucosido. Preferentemente, dicho huesped contiene la enzima glucosidasa apropiada (inducible), adecuada para la liberacion de los respectivos linalol y nerolidol. Como alternativa, dicho huesped esta provisto de un acido nucleico que codifica una enzima glucosidasa adecuada (inducible). El huesped que contiene un acido nucleico que codifica una molecula de naturaleza proteica segun la presente invencion, puede identificarse mediante diversos procedimientos conocidos en la tecnica. Estos procedimientos incluyen, aunque no constituyen limitacion hibridacion ADN-ADN, ADN-ARN, amplificacion utilizando so ndas ( partes o fragme ntos de dich o aci do nucl eico), tecnicas de bioensayo o inmunoensayo de proteinas que incluyen tecnologias basadas en membrana, solucion o chip, para l a deteccion y/o cuantificacion de dicho acido nucleico y la molecula de naturaleza proteica codificada.

La presente invencion da a conocer, ademas, un huesped en el que dicho vector, segun la presente invencion y dicho huesped expresan una proteina o polipeptido monoterpeno sintasa/ciclasa.

La presente invencion da a conocer un metodo para producir un sabor, fragancia y/o compuesto de control biologico que comprende, a) transformar o transfe ctar un huesped adecuado con, como minimo, un ac ido nucleico que codifica una molecula de naturaleza proteica segun la presente invencion, b) expresar dicho acido nucleico en presencia de un sustrato adecuado, c) opcionalmente aislar el producto formado. En una realizacion preferente, dicho acido nucleico incluye una secuencia diana restaurada o un resto de la senal diana, es decir, en aquellos casos en los que se requiera la dir eccion al plasto. En una realizacion preferente de la presente invencion, hay un metodo para producir nerolidol y/o linalol y/o a-pineno y/o 1-pineno (hidrocarburos terpenicos biciclicos) y/o sabineno y/o 1-mirceno (monoterpeno aciclico) y/o a-felandreno y/o 1-felandreno y/o a-terpinoleno y/o a-terpineol y /o y

terpineno o mezclas de los mismos, a) transforman do/transfectando un huesped adecuado, b) expresando, como minimo, u n ac ido nuc leico de l a pr esente invencion e n presencia de un s ustrato adecuado, y c) aisl ando los productos formados. En una realizacion preferente, dicho huesped muestra actividad glucosiltransferasa adecuada, con lo cual el linalol y/o nerolidol producido se convierte y se acumula o almacena en dicho huesped, como sus respectivos linaloilglucosido y nerolidilglucosido. Esto es lo mas facil cuando dicho huesped ya contiene la enzima glucosidasa apropiada (inducible), adecuada para la l iberacion de los respectivos linalol y nerolidol. Sin embargo, esto no se requiere, la expresion sin dicha actividad glucosiltransferasa y/o glucosidasa es perfectamente adecuada para la mayoria de los fines y, como alternativa, dicho huesped puede estar provisto incluso de un acido nucleico que c odifica u na e nzima glucosidasa a decuada, cuan do se consi dere neces ario. P ara la actividad de co ntrol biologico, se da a conocer incluso la expresion de los compuestos, segun la presente invencion, sin dicha actividad glucosiltransferasa y/o glucosidasa, y dejar que la actividad de control biologico dependa parcialmente de dicha actividad en elorganismo diana, por ejemplo, despues de la captacion por parte de un insecto en la saliva del insecto, o de la induccion de dicha actividad despues de la infeccion por herbivoros o fungica.

Se da a con ocer un meto do para pr oducir un comp uesto, segun la prese nte in vencion, que comprende: a) transformar o transfectar un huesped adecuado con, como minimo, un acido nucleico que codifica una molecula de naturaleza proteica segun la presente invencion, b) expresar dicho acido nucleico en presencia de un sustrato adecuado y c) opcio nalmente aislar el producto formado, en el que dicho huesped comprende un microorganismo, celula vegetal o planta. Microorganismo, tal como se ut iliza en el presente documento, se refiere a organismos microscopicos tales como Archaea, Bacterias, Cianobacterias, Microalgas, Hongos, Levaduras, Virus, Protozoos, Rotiferos, Nematodos, Micro-crustaceos, Micro-moluscos, Micro-mariscos, Micro-insectos, etc.

La presente invencion da a conocer un metodo para producir un sabor, fragancia y/o compuesto de control biologico en un sistema de expresion de lisado sin celulas que comprende expresar, como minimo, un acido nucleico que codifica una molecula de naturaleza proteica, segun la presente invencion, en presencia de un sustrato adecuado y opcionalmente aislar el producto formado, en el que dicho sistema de lisado libre contiene todos los componentes necesarios para la expresion y el procesamiento. El sistema de expresion de lisado sin celulas, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a sistemas de traduccion/translocacion sin celulas conocidos en la tecnica, tal como, por ejemplo, sistema de traduccion de lisado de reticulocitos de conejo.

La d escripcion da a co nocer, ademas, un compuesto g enerador d e sa bor y/o de c ontrol b iologico que pu ede obtenerse me diante un met odo, se gun l a presente invencion. Prefer entemente, d icho sabor y/o c ompuesto d e control biologico compr ende, como minim o, un nerolidol y/o li nalol y/o a-pineno y /o 1-pineno ( hidrocarburos terpenicos biciclicos) y/o sabineno y/o 1-mirceno (monoterpeno aciclico) y/o a-felandreno y/o 1-felandreno y/o aterpinoleno y/o a-terpineol y/o y-terpineno o mezclas de los mismos.

La descripcion da a conocer, ademas, la utilizacion de un compuesto generador de sabor, segun la descripcion, en la industria de los alimentos procesados como aditivo. Preferentemente, como aditivo alimentario para mejorar el sabor de jarabes, helados, granizados, postres helados, yogures, pasteles, salsas, dulces, productos de confiteria, articulos horneados etc., y productossimilares, por ejemplo, la mejora del sabor a arandanos (patente de Estados Unidos N° 4041185). La fresa es una fruta popular para ingredientes de sabor natural debido a su sabor, fragancia, aroma y perfume. La descripcion da a conocer la utilizacion del acido nucleico, segun la presente invencion, para la produccion industrial de sabores a "fruta" que son naturales para coincidir con la fidelidad al olor de la fruta natural. La descripcion da a conocer la produccion de nuevos sabores, fragancias y/o agentes de control biologico mediante la utilizacion del acido nucleico, segun la presente invencion, solo o en combinacion, para dar a conocer nuevas vias para la produccion. Por ejemplo, el nerolidol natural o estereoquimicamente puro puede utilizarse como sustrato, para la semi-sintesis de compuestos generadores de sabor y fragancia o repelentes de insectos, tal como se describe en la patente de Estados Unidos N° 005196200A). Los compuestos de la presente descripcion pueden utilizarse para sustituir a ad itivos alimentarios sinteticos potencialmente carcinogenos utilizados actualmente. La descripcion da a conocer la utilizacion de un compuesto generador de sabor y/o de control biologico, segun la descripcion, como aditivo desinfectante, por ejemplo, para obtener formulaciones y composiciones naturales, tales como composiciones orales antiplaca tal como se describe en el documento EP 0420630). La descripcion da a conocer, ademas, la utilizacion de un compuesto generador de sabor y/o de control biologico segun la descripcion como disolvente desengrasante y/o plastificante y/o portador de colorante.

La descripcion da a conocer, ademas, la utilizacion de un compuesto generador de sabor y/o de control biologico, segun la descripcion, como agente saborizante y/o de control biologico para medicamentos y vitaminas orales. La descripcion da a conocer, ademas, la utilizacion de un compuesto generador de sabor, segun la descripcion, para proporcionar sabor/aroma adicional en bebidas, incluyendo bebidas alcoholicas y no alcoholicas.

La descripcion da a conocer, ademas, la utilizacion de un compuesto generador de sabor segun la descripcion para mejorar o reducir el sabor/aroma/fragancia/perfume de una planta.

La descripcion da a conocer, ademas, la utilizacion de un compuesto generador de sabor, segun la descripcion, para mejorar el sabor/aroma de productos naturales y/o productos sinteticos y/o productos artificiales. La descripcion da a conocer ademas la utilizacion de un compuesto generador de sabor segun la descripcion para la sintesis industrial de sustancias de sabor/aroma identicas a las naturales. En una realizacion preferente, dicho compuesto generador de sabor de la presente descripcion se utiliza para la produccion de nuevas combinaciones de sustancias de sabor artificial.

La descripcion da a conocer la utilizacion de un compuesto generador de sabor y/o de control biologico, segun la descripcion, como agente de control de plagas. Plaga, tal como se utiliza en el presente documento, es un termino general para organismos (ratas, insectos, acaros, microorganismos, etc.) que pueden causar enfermedades o danos

o consumir cultivos alimentarios y otros materiales importantes para seres humanos/animales. El acido nucleico de la presente invencion sienta las bases, mediante el cultivo de plantas, para producir cultivos, como minimo, mas capaces de controlar, o incluso eliminar, las infestaciones por plagas perjudiciales permitiendoles producir mas terpenoides volatiles (aleloquimicos volatiles vegetales) para repeler a la plaga causante del ataque y/o para atraer a enemigos nat urales de la plag a hasta el cultivo. Pref erentemente, dichos t erpenoideos vo latiles compren den nerolidol y/o linalol. Los compuestos generadores de sabor y/o de control biologico de la pres ente descripcion pueden util izarse como ins ecticidas, r epelentes de insectos, feromon as de ins ecto, acaric idas, escarabicidas, agentes antimicrobianos, anti-fungicos, agentes anti-alimentacion por herbivoros etc. Por ejemplo, se ha descrito que el nerolidol es un repelente de mosquitos extremadamente eficaz. Las formulaciones quecontienennerolidol natural, producidas segun la presente descripcion, pueden utilizarse, por lo tanto, en el control de mosquitos.

En una realizacion preferente, dicho compuesto, segun la descripcion, se utiliza para el control de la a) interaccion entre plantas e insectos, b) interaccion entre plantas y microorganismos, c) interaccion entre una planta y otra.

La descripcion da a conocer la utilizacion de un compuesto generador de sabor y/o de control biologico segun la descripcion como agente antimicrobiano. Agente antimicrobiano, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un compuesto que puede, como minimo, suprimir o inhibir o restringir en parte el crecimiento de un organismo patogeno (por ejemplo hongos, bacterias, levaduras etc.).

Preferentemente, dicho compuesto puede utilizarse junto con, como minimo , otro compuesto que tiene actividad antimicrobiana para aume ntar o supleme ntar dicha activ idad antimicrobiana (por ejemplo dicho compuesto puede actuar de forma sinergica con, como minimo, otro compuesto antimicrobiano). La utilizacion de combinaciones sinergicas de agentes antimicrobianos tiene muchas ventajas. Una de dichas ventajas es que m inimiza el riesgo conocido asociado con la utilizacion de agentes antimicrobianos potencialmente perjudiciales que pueden utilizarse en dosificaciones menores para conseguir el mismo efecto. Tambien rebaja los riesgos asociados con la utilizacion de agentes antimicrobianos no especificos/no selectivos, por ejemplo, como aditivos en productos alimentarios y no alimentarios. Preferentemente, dicho compuesto puede utilizarse para programas de tratamiento de cultivos para reducir o eliminar la utilizacion de pesticidas/biocidas perjudiciales [por ejemplo tratamientos por pulverizacion]. Puede incorporarse en productos como agente de control biologico [por ejemplo materiales domesticos, detergentes, productos alimentarios, etc.] o aplicarse a productos [por ejemplo como recubrimiento externo a productos de cuero, etc.] para reducir el riesgo de deterioro o contaminacion.

La descripcion da a conocer, ademas, la utilizacion de un compuesto generador de sabor, segun la descripcion, para proporcionar s abor/aroma en cosmeticos (i ncluyendo p erfumes d e j abon, esp ecialidades y bases de perfume), cremas, productos de proteccion solar, acondicionadores para el cabello, productos de limpieza, productos para el cuidado p ersonal, prod uctos de asistenci a sanitaria (i ncluyendo todos los productos de asistenci a sanitaria a mamiferos). La descripcion da a con ocer, ademas, la utilizacion de un compuesto generador de sabor, segun la descripcion, como agente de prolongacion y fijador en perfumes o como un auxiliar de suspension para sales de aluminio en productos farmaceuticos anti-transpiracion (por ejemplo desodorantes).

La descri pcion da a conoc er la utilizac ion de un ac ido n ucleico, segu n la prese nte i nvencion, com o marcad or molecular o herramienta de diagnostico. Preferentemente, como marcador molecular para la formacion de sabor [por ejemplo, pr oduccion d e n erolidol y/o li nalol y/o a-pineno y /o 1-pineno (hi drocarburos terpe nicos biciclicos) y/o sabineno y/o 1-mirceno (monoterpeno aciclico) y /o a-felandreno y/o 1-felandreno y/o a-terpinoleno y/o a-terpineol y/o y-terpineno] en el cultivo de plantas. Aun mas preferente, como marcador molecular para la maduracion de frutos (por ejem plo, madurac ion d e frutos de fresa y pomelo). El acido nuc leico se gun la presente i nvencion puede utilizarse com o marcad ores para l a selec cion d e esp ecies de c ultivo, tales como p or ejem plo m aiz, algo don, manzana y pepino, y cualesquieraotros cultivos que emplean un mecanismo de defensa de liberacion de volatiles, con produccion mejorada de terpenoides volatiles (por ejemplo un compuesto generador de sabor que atrae a un depredador (terpenoide), segun la descripcion) en respuesta a plagas que se alimentan de ellos.

La descripcion da a conocer, ademas, la utilizacion de un compuesto generador de sabor y/o de control biologico, segun la descripcion, en la preparacion de una composicion. Las bases adecuadas para composiciones se conocen en la tecnica. Preferentemente, dicha composicion comprende, como minimo, nerolidol y/o linalol y/o a-pineno y/o 1pineno y/o sabineno y/o 1-mirceno y/o a-felandreno y/o 1-felandreno y/o a-terpinoleno y/o a-terpineol y/o y-terpineno,

o mezclas de los mismos.

La descripcion da a conocer, ademas, una composicion que comprende un compuesto generador de sabor y/o de control biologico, segu n l a descripcion. Preferentem ente, dichas comp osiciones s on antifun gicas, acarici das o pesticidas. Po r ejemp lo, u na comp osicion acar icida es util p ara c ontrolar las poblaciones d e aran uelas. Preferentemente, dichas composiciones comprenden formulaciones de liberacion lenta que pueden emplearse con fines de fumigado. Por ejemplo, fumigado en agricultura para la proteccion de cultivos contra microorganismos y plagas, por ejemplo, insectos, acaros, etc. Preferentemente, dicha composicion se encuentra en una forma que puede administrarse a una planta, animal (incluyendo ser humano), producto alimentario o no alimentario, producto industrial, etc.

La descripcion da a conocer una composicion que comprende un compuesto generador de sabor y/o de control biologico, seg un la d escripcion, qu e es un pro ducto farmaceutico. Se conoc en c omposiciones farmaceutic as adecuadas, y estas pu eden estar e n f ormas d e do sificacion, tale s como com primidos, pild oras, po lvos, suspensiones, capsulas, supositorios, preparaciones para inyeccion, pomadas, colirios, etc. La descripcio n da a conocer una composicion que comprende un compuesto generador de sabor y/o de control biologico, segun la descripcion, que es un producto nutraceutico.

La descripcion da a conocer la utilizacion de una composicion que comprende un compuesto generador de sabor y/o de control biologico, segun la descripcion, para aumentar o mejorar el aroma y/o sabor de productos alimentarios o no alimentarios y/o la proteccion de productos alimentarios o no alimentarios contra contaminacion fungica y/o infestacion p or pla gas. Por ejem plo, ch icles, pro ductos medici nales, deterg entes, cosmeticos, productos de confiteria, etc. Preferentemente, dicha composicion mejorara la vida util/conservacion de productos alimentarios y no alimentarios (incluyendo productos industriales).

La descripcion da a conocer la utilizacion de una composicion que comprende un compuesto generador de sabor y/o de contro l bio logico, se gun l a descripc ion, para el contr ol biologico d e plag as. Por ejempl o, adm inistrar dic ha composicion a una planta. Los mo dos d e admin istracion pueden d eterminarse facil mente me diante protoco los convencionales y puede asumir la forma de pulverizaciones, granulos disolubles, etc.

La descripcion da a conocer la utilizacion de una composicion que comprende un compuesto generador de sabor y/o de control biologico, segun la descripcion, para la prot eccion de productos almacenados. Por ejemplo, para la proteccion de productos almacenados contra microorganismos, insectos y otras plagas. Por ejemplo la proteccion de patatas, bulbos florales, cebollas, etc., contra Phytophtora spp, Phoma spp, Fusarium, Botrytis spp y otros patogenos de productos almacenados.

La descripcion da a conocer la utilizacion de una composicion que comprende un compuesto generador de sabor y/o de control biologico, segun la descripcion, para la prevencion o el tratamiento de una enfermedad. Por ejemplo, para el tratamie nto de cari es d ental y/o placa dent al y/o trastornos cut aneos (formul aciones d ermatologicas) y/o tratamiento inmunosupresor, anti-leucemia y anti-retroviral. Una realizacion preferente es que dicha composicion es adecuada para el consumo humano o aplicacion externa.

La d escripcion da a con ocer un meto do de tratami ento de u na enfermedad qu e c omprende administrar u na composicion, segun la descripcion, con un vehiculo a un receptor adecuado. Preferentemente, dicho vehiculo es un vehiculo farmaceuticamente aceptable (por ejemplo sistema vehiculode farmacos) o vehiculo inerte, tal como un glucosido.

Breve descripcion de los dibujos:

Figura 1: An alisis de l a c amara vo latil utiliza ndo GC-MS de fres a silvestre (A ) y cultiv ada (B). Los cromatogramas son de m/z 93 (obtenidos en modo SCAN [barrido]). Picos: 1, a-pineno; 2, 1-mirceno; 3, 1felandreno; 4, y-terpineno (provisional); 5, a-terpinoleno (provisional); 6, a-terpineol; 7, carvilacetato; 8, linalol; 9, trans-nerolidol.

Figura 2: Alineamiento de secuencia de proteinas H64, H64NORS, H64MUT, H64VES. La secuenc ia de acido nucleico H64MUT despues del codon de terminacion en H64NORL (ubicacion marcada) se cambio a un residuo de Leucina. El fondo negro corresponde a residuos identicos en las tres secuencias y el fondo gris corresponde a identidad entre dos de las tres secuencias.

Figura 3: senales de direccion en los diferentes genes de H64.

A. Alineamiento de secuencia de proteinas de los diferentes fragmentos de H64 obtenidos mediante PCR en ADN genomico y las mismas regiones en ADNc aislados. Las flechas indican cuales de las secuencias no tienen un co don de termi nacion e n esta region. El motivo RR es co mun en s enales de dir eccion d e monoterpeno sintasas. El fondo negro corresponde a residuos identicos en las siete secuencias, y el fondo gris corresponde a identidad entre, como minimo, tres de las siete secuencias.

B. Mutagenesis dirigida y construccion de H64MUT a partir de H64NORL. La region 5' de H64NORL y H64MUT se aline a entre los dos cod ones AT G y l a po sicion de l a mutage nesis dirigida esta m arcada mediante el fondo gris. El codon de terminacion T(U)GA en H64NORL se convirtio en un codon que codifica un residuo de leucina (CTA).

Figura 4: Expresion de genes de H64 analizada mediantetransferenciasde ARN en gel y ADNc de H64NORL como sonda.

A. Expresion en tejidos vegetativos (hojas) y reproductivos (4 fases del desarrollo del fruto).

B. Expresion en fruto maduro de dos cultivares silvestres (1, Plant Research International, linea H1 y 2 Plant Research International, linea 92189) y dos cultivares cultivados (1, cultivar Calypso y 2, cultivar Gorrella.

C. Expresion en frutos tratados con o sin la auxina sintetica NAA. Frutos de fresa (cultivar Elsanta) en la fase blanca del desarrollo se trataron con pasta de lanolina que contenia NAA 100 mM. Se trataron bayas tratadas y de control (pasta sin NAA), se dejaron en la planta durante 7 dias y, a continuacion, se recogieron y se utilizaron para el aislamiento del ARN.

Figura 5: El vector de expresion pRSET B utilizado para la clonacion y la expresion de H64MUT/, SOSA y SOSV en celulas de E. coli.

Figura 6: alineamiento de secuencia de acido nucleico de los dos ADNc de SOSA cultivada clonados (MA y WS) y su hom ologo de la fresa silvestre (SOSV). El f ondo negro corres ponde a resi duos identicos e n las tres secuencias y el fondo gris corresponde a identidad entre dos de las tres secuencias. Se representa la ubicacion de la insercion de CC que causa el desplazamiento de marco y el codon de terminacion que le sigue. El codon de terminacion en el 3' es el extremo del ORF.

Figura 7: Alineamiento de la secuencia de proteinas de los diferentes ADNc de SOS aislados. El fondo negro corresponde a residuos identicos en las cinco secuencias y el fondo gris corresponde a identidad entre, como minimo, tres de las cinc o secuencias. La insercion de CC en la SEC11B(SOSA/MA) y la SEC10B(SOSA/WS) forma un r esiduo de pr olina y un c odon de termin acion, a co ntinuacion. E n la SEC11C(SOSA/MA) y l a SEC10C(SOSA/WS), se eliminaron los dos nucleotidos de citosina y se permitio la traduccion adicional de la proteina.

Figura 8: Alineamiento de secuencia de acido nucleico de los diferentes fragmentos de SOS obtenidos mediante PCR en ADN genomico y las mismas regiones en ADNc aislados de fresa silvestre y cultivada. La fuente del fragmento esta marcada en el lado iz quierdo del nombre de cada secuencia. El fondo negro corresponde a residuos identicos en las quince secuencias, y el fondo gris corresponde a identidad entre, como minimo, doce de las quince secuencias.

Figura 9: Expresion de genes de SOS analizada mediante transferencias de ARN en gel y ADNc de SOSV como sonda

Expresion en fruto maduro de dos cultivares silvestres (1, Plant Research International, linea H1 y2 Plant Research International, linea 92189) y dos cultivares cultivados (1, cultivar Calypso y 2, cultivar Gorrella.

Figura 10: Analisis por radio-GLC de productos radiomarcados formados a partir de [ 3M-geranil difosfato en ensayos con proteinas recombinantes. A, senal FID que muestra autenticos patrones no marcados de 1, 1mirceno; 2, trans-ocimeno; 3, lin alol; 4, a-terpineol; 5, nerol; 6, geraniol. B, C, se nales de rad iacion qu e muestran productos enzimaticos de proteinas recombinantes SOSV (B) y H64MUT (C).

Figura 11: Analisis por radio-GLC de productos radiomarcados formados a partir de [3H]-farnesil difosfato en ensayos con proteina recombinante. A, senal FID que muestra autenticos patrones no marcados de 7, cisnerolidol; 8, trans-nerolidol; 9, trans-trans-farnesol. B, senal de radiacion que muestra productos enzimaticos de proteina recombinante H64MUT.

Figura 12: Analisis por GC-MS en una columna HP5-MS de productos formados a partir de geranil difosfato en ensayos con proteina recombinante SOSV. Picos: 1, a-pineno; 2, 1-pineno; 3, sabineno; 4, 1-mirceno; 5, afelandreno; 6 , 1-felandreno; 7, dih idromircenol (prov isional); 8, a-terpinoleno (pr ovisional); 9, a-terpineol (provisional).

Figura 13: Analisis por GC-MS en una columna HP5-MS del producto formado a partir de geranil difosfato en un ensayo con proteina rec ombinante H6 4MUT. A, cromatograma m/z 93. B, espectro de masa del pico d el producto principal (linalol).

Figura 14: Analisis por GC-MS en una columna HP5-MS del producto formado a partir de farnesil difosfato en un ensayo con proteina rec ombinante H6 4MUT. A, cromatograma m/z 93. B, espectro de masa del pico d el producto principal (nerolidol).

Figura 1 5: Expresio n con G FP transitor ia de protei nas de fusio n en protoplastos d e tabaco. g, GFP; ca, autofluorescencia de c lorofila; mt, Mito Tracker (tincio n mitocondrial); ol, sup erposicion d e ima gen de a utofluorescencia de clorofila en imagen de GFP; ol-mt, superposicion de imagen de autofluorescencia de clorofila, imagen de GFP e imagen de Mitotracker. Se realizaron 10 construcciones diferentes (C1-C10) para estudiar fragmentos obtenidos de H64NORL (C1, C2), H64TAR4 (C3, C4, C5) yH64VES (C7, C8, C9). Vease la figura 16, para una representacion esquematica de las diferentes construcciones realizadas y utilizadas para los estudios de localizacion. C6 muestra la localizacion de la fusion de un extremo 5' de limoneno sintasa de citricos con GFP. C10 es una fusion de la region H64VES entre los dos residuos metionina y la region cadena abajo de la segunda metionina a partir de H64NORL. pOL65 es el vector original, que contiene solamente GFP y se utilizo para insertar todos los fragmentos para la fusion con la GFP. Rpo-ol es un control positivo para una senal de d ireccion a plastos. Los cloroplastos ti enen d e promedio 5 micr ometros de ta mano m ientras que la s mitocondrias tienen 1 micrometro de tamano. pOL65, C1, C2, C4, C5, C8 y C9 muestran, todos, la localizacion citosolica. C3 muestra la localizacion doble plastidica y mitocondrial. C6, C7, C10 y Rpo-ol muestra localizacion sub-celular plastidica.

Figura 16: Representacion esquematica de las diferentes construcciones utilizadas para ensayos de expresion transitoria con GFP en protoplastos de tabaco. Los fragmentos obtenidos del extremo 5' de los ADNc descritos en la presente invencion se utilizaron para una fusion traduccional con el gen de GFP. El motivo MID esta presente en la mayor parte de los genes de sesquiterpeno sintasa descritos hasta la fecha. SC, codon de terminacion. M1 yM2 son los dos residuos metionina en los extremos N de las div ersas proteinas (vease tambien la figura 3A).

Figura 17: Comparacion de los efectos de farnesol y linalol presentes en el medio de cultivo sobre el crecimiento del micelio de Phytophthora infestans.

Figura 18: Datos de respuesta a la dosis de los efectos de linalol presente en el medio de cultivo o la fase de vapor sobre el crecimiento del micelio de Phytophthora infestans.

Figura 19: Datos de respuesta a la dosis de los efectos de nerolidol presente en el medio de cultivo o la fase de vapor sobre el crecimiento del micelio de Phytophthora infestans.

Figura 20: Datos de respuesta a la dosis de los efectos de linalol ynerolidol presentes en el medio de cultivo solos y en combinacion sobre el crecimiento del micelio de Phytophthora infestans.

Figura 21: Datos de respuesta a la dosis de los efectos de linalol ynerolidol presentes en el medio de cultivo solos y en combinacion sobre el crecimiento del micelio de Phytophthora infestans.

Figura 22 Datos de respuesta a la dosis de los efectos de linalol y nerolidol presentes en el medio de cultivo sobre el crecimiento del micelio de Fusarium spp., el dia 7.

Figura 23 Datos de respuesta a la dosis de los efectos de linalol y nerolidol presentes en el medio de cultivo sobre el crecimiento del micelio de Botrytis spp., el dia 7.

Figura 24 Datos de respuesta a la dosis de los efectos de nerolidol (A) y linalol (B) presentes en el medio de cultivo sobre la germinacion de esporas de aislados de Fusarium verticillioides el dia 3.

Figura 25 Analisis de la camara volatil de Arabidopsis transgenica que expresa la H64NORS con la senal de direccion de H64VES (H64TAR) ADNc, que muestra un gran pico de linalol (1), y un pico mas pequeno de nerolidol (2). Ambos compuestos estan ausentes en Arabidopsis de tipo silvestre de control (vease el inserto).

Figura 26 Analisis de la camara volatil de volatiles producidos mediante transformantes individuales de patata de control y transgenicos, que expresan H64TAR (3 transformantes individuales TM 9, TM 13, TM 29). El lin alol esta virtualmente ausente en patata de control, y aumentado fuertemente en las lineas transgenicas. Ademas el 8hidroxilinalol esta aumentado en las lineas transgenicas.

Figura 27 Analisis quiral del l inalol li bre e n p atata de c ontrol y t ransgenica, q ue m uestra la pres encia d e amb os enantiomeros en patata de control (aproximadamente 80:20). En las lineas transgenicas H64TAR la relacion se ha desplazado de forma espectacular hacia el enantiomero S, que es producido por la enzima introducida.

Figura 28A Identificacion de linalil-1-D-glucopiranosido en tejido de Petunia utilizando HPLC-MS/MS. Senal io nica m/z 375 de A: el (R,S)-linalil-1-D-glucopiranosido sintetizado, B: el tejido de hoja de Petunia transgenica y C: el tejido de hoja de Petunia de control.

Figura 28B Espectro ionico del producto de A: E l (R,S)-linalil-1-D-glucopiranosido sintetizado y B: El compuesto aislado a partir del tejido de Petunia transgenica. El tiempo de retencion y el espectro ionico del producto del (R,S)-linalil1-D-glucopiranosido sintetizado encajan con el compuesto detectado en el tejido de Petunia transgenica.

Figura 29 Determinacion de la distribucion enantiomerica de S-linalol y R-linalol despues de la hidrolisis enzimatica de la fraccion de glucosido obtenida de tejido de la hoja utilizando analisis por MDGC-MS de fase quiral, A: Tejido de control y B: el tejid o trans genico. La pl anta transg enica acumul a S-linalil-1-D-glucopiranosido a ltamente enriquecido.

Figura 30 La figura 30 combina los datos de las tablas 1 y 4. Las figuras 30A, B y C dan a conocer la correlacion en el tamano de la lesion, velocidad de crecimiento de la lesion y esporulacion, respectivamente, del aisladode Phytophthora infestans IPO 428-2 representados graficamente frente al contenido de linalol, 8-hidroxilinalol, linaloltriol, linalilglucosido, 8-hidroxilinalilglucosido y contenido de linaliltriolglucosido de las lineas transgenicas de patata T o TM-9, -13, -29 y una linea de control. Los datos de control de la tabla 4 sobre el crecimiento yla esporulacion fungicos se tomaron como valores promedio de las plantas H64NOR con niveles con aumentos despreciables de linalol, nerolidol o derivados. Los datos de linalol (derivado) dados a conocer en la tabla 1 son mucho mas fi ables y c uantitativos qu e lo s datos d e S PME sobre l inalol en l a tab la 4, lo que justifica su utilizacion. La figura 30D da aconocer los datos in vitro sobre la sensibilidad del aislado de Phytophthora infestans IPO428-2 que se utilizo para los experimentos in planta paralinalol puro en el medio, tal como se describe en el ejemplo 9.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustracion.

Ejemplo 1. Análisis de terpenos en fresa silvestre y cultivada

Biosintesis de terpenoides en fresas silvestres y cultivadas

La variedad cultivada (Elsanta), utilizada por los inventores para los e xperimentos mencionados, produce tanto el monoterpeno linalol como el sesquiterpeno nerolidol. Por otro lado, el cultivar silvestre utilizado (linea PRI 92189) produce niveles bajos de linalol pero no muestra ningun vestigio de nerolidol. Tanto los informes bibliograficos como los datos de GC-MS de los inventores muestran patrones similaresde produccion de linalol y nerolidol en varias variedades mas de fresa cultivadas y silvestres. Los datosde secuenciacion de los inventores y experimentos que utilizan las enzimas recombinantes producidas en E. coli muestran que la capacidad de la variedad cultivada para formar nerolidol se adquirio eliminando (mediante deleciones y terminacion de la traduccion) la senal de direccion al plasto [donde el sustrato para la biosintesis de monoterpeno esta disponible (GPP)] y dirigiendo el inicio de la traduccion al codon AUG, c adena abajo. Sin em bargo, el l inalol e n l as vari edades cultiva das ta mbien p uede formarse mediante enzimas codificadas por genes similares a H64TAR2, H64TAR4 y H64TAR6 que contienen una senal de direccion apropiada sin terminacion y, por lo tanto, sus productos proteicos son dirigidos al plasto para formar linalol. Si el GPP esta presente en el citosol, entonces el linalol tambien podria ser producido alli por una enzima codificada por un ADNc expresado a nivel citosolico. No podemos excluir que la traduccion en H64TAR2, H64TAR4 yH64TAR6 tambien pueda comenzar a partir del codon AUG cadena abajo (el que se encuentra cadena abajo del motivo RR y no el codon AUG adicional presente justo antes del motivo RR) y esto dara como resultado la formacion de nerolidol tambien. Sin embargo, dado que las variedades cultivadas como las utilizadas en este estudio son, en su mayoria, octaploides es probable que procesos evolutivos, tales como poliploidia permitan a la planta formar un gen (mutado) adicional a partir de un gen existente y producir un compuesto beneficioso adicional, tal como nerolidol, para sabor y defensa. Williams y otros, (Biochemistry 1998, 37, 12213-12220) describieron un papel para el tandem de argininas presentes en el extremo N de monoterpeno sintasas en la unica etapa de migracion de bifosfato que acompana a la formacion del intermedio 3-s-linalil difosfato y que precede a la reaccion de ciclacion final catalizada por las monoterpeno sintasas. Este motivo RR, esta presente en H64TAR2, H64TAR6 y H64VES y esto p odria explicar la form acion d e li nalol p or est os g enes que co difican e nzimas. Sin embargo, la proteina recombinante H64MUT no contiene el motivo RR, pero cataliza la formacion tanto de nerolidol como de linalol. Esto podria implicar a otros residuos entre la ubicacion del motivo RR yel AUG cadena abajo que funcionan para determinar si se formara monoterpeno. Este motivo contiene 12 aminoacidos: extremos N, DSLLPSSITIKP. La secuencia de ADN genomico corta obtenida (H64W149) contiene un motivo RW en lugar de un motivo RR y esto podria ser importante para la formacion del monoterpeno linalol. En los cultivares silvestres (diploides) solamente podia identificarse una variante que codifica una proteina con una senal de direccion (ambas mediante PCR en ADN y ARN) que puede catalizar solamente la formacion de los bajos niveles de linalol detectados.

Análisis de la cámara volátil. Muestras de frutos maduros o en maduracion se encerraron en frascos de vidrio de 1 l que se cerraron con una tapa forrada de t eflon equipada con una entr ada y una salida, y colocada en una sal a climatizada a 25°C y 210 !mol.m-2.s-1 provista de luces HPI-T de 400 W (Philips, Eindhoven, Paises Bajos). Se utilizo una bomba de vacio para extraer el aire a traves de los frascos de vidrio a, aproximadamente, 100 ml min-1, con en aire entrante siendo purificado a traves de un cartucho de vidrio (140 x 4 mm) que contenia 150 mg de Tenax TA (malla 20/35, Alltech, Breda, Paises Bajos). En la salida, los volatiles emitidos por los frutos fueron atrapados en un cartucho con Tenax similar. Los volatiles se muestrearon durante 24 h. Los cartuchos se eluyeron utilizando 3 x 1 ml de eter pentanodietilico redestilado (4:1). De las muestras (no concentradas), 2 !l se analizaron mediante GC-MS utilizando un cromatografo de gases HP 5890 de la serie II equipado con una columna HP-5MS (30 m x 0,25 mm de diametro interno, 0,25 !m diametro de la pelicula) y un detector selectivo de masas HP 5972A. El GC (cromatografo de gases) se programo a una temperatura inicial de 45°C durante 1 minuto, con un aumento gradual de 10° min-1 hasta 280°C y un tiempo final de 5 minutos. Las temperaturas del orificio de inyeccion (modo sin division), interfaz y la fuente de MS eran de 250, 290 y 180°C, respectivamente, y la presion de la entrada de He se controlo mediante control de la presion electronica para conseguir un flujo de columna constante de 1,0 ml min -1. El potencial de ionizacion se fijo a 70 eV, y el barrido se realizo desde 48-250 amu.

El analisis de los perfiles de la camara volatil se centro en terpenoides mostrando solamente el cromatograma 93 ionico (aunque las muestras se anal izaron utilizando el modo SCAN). De esa manera, pueden verse diferencias notables entre fresa cultivada y silvestre: el perfil de la camara volatil de la fresa silvestre contiene carvilacetato y una serie de monoterpenos olefinicos, tales como a-pineno, mirceno, a-felandreno y a-terpinoleno, a-terpineol y yterpineno (los tres ultimos identificados de forma provisional) (figura 1A), mientras que la cultivada esta dominada por dos picos principales solamente: linalol y trans-nerolidol (figura 1B).

Ejemplo 2. Técnicas moleculares generales

Se aislo ADN de hojas de fresa jovenes tal como fue descrito por Marty y otros, [Theor. Appl. Genet. (2000) 10 0: 1129-1136].

Se realizaron experimentos de transferencia en gel de ARN, tal como fue descrito por Aharoni y otros, [The Plant Cell (La celula vegetal), (2000) 12, 647-661].

La clonacion de ADNc de l ongitud completa se realizo utilizando el kit de amp lificacion de ADNc S MART RACE cDNA Ampl ification Kit (C lontech), seg un las instrucc iones d el fabr icante, con ligeras modific aciones en l as temperaturas de hibridacion (normalmente reducidas en de 5 a 10°C en comparacion con la recomendada) o la cantidad de ciclos (hasta 35 ciclos).

Se re alizaron PCR, di gestion p or restricc ion, a islamiento de ADN pla smidico y el ectroforesis en gel utilizando protocolos estandar. T odos los fragm entos se p urificaron a partir del gel utiliz ando el kit de purifi cacion GFX (Amersham). La clonacion de los fragmentos de PCR se realizo a los vectores PCR SCRIPT (Stratagene) o pCR 4Blunt-TOPO (Invitrogen) (para productos con extremo romo, generados cuando se utilizaba pfu polimerasa) o al vector pGEM-T Easy (Promega) (cuando se generaban productos de PCR con cola A mediante la utilizacion de taq polimerasa). En todo el texto se utilizaron los siguientes nombres de construccion/ADNc (vease tambien el listado de secuencias):

-: H64VES: ADNc de longitud completa de fresa silvestre (con senal de direccion)

-: H64NORL: ADNc de fresa cultivada original partiendo de Met 1, incluyendo el codon de terminacion entre Met 1 y Met 2 (senal de direccion no funcional)

-: H64NORS: obtenido de H64NORL partiendo de Met 2 (sin senal de direccion)

-: H64MUT: obtenido de H64NORL; codon de terminacion reparado

-: H64TAR: utilizado para la transformacion de plantas: compuesto por la region de Met 1 a Met 2 deH64VES y H64NORS (con senal de direccion)

-: H64NOR: utilizado para transformacion de plantas: H64NORS incluyendo el intron

Ejemplo 3. Construcción de una biblioteca de ADNc de fase de fruto rojo de fresa, escisión de masas y secuenciación aleatoria

Aislamiento de ARN mensajero y construcción de la biblioteca de ADNc

El ARN total se aislo de la fase de desarrollo de fruto rojo de fresa utilizando el metodo descrito por Manning K. [Analytical Biochemistry (Bioquimica analitica) (1991) 195, 45-50]. El cultivar utilizado era Fragaria X ananassa Duch.

cv. Elsanta. La biblioteca de ADNc fue pr oducida como un servicio personalizado por (Stratagene) en el vector lambda zap. El ARN mensajero se aislo del ARN total utilizando el kit de aislamiento polyA+ (Pharmacia).

Escisión de masas y secuenciación aleatoria

El sistema ExAssistT/SOLRT (Stratagene) se utilizo para la escision de masas del fagemido pBluescript SK(-). La escision se realizo segun las instrucciones del fabricante, utilizando 20 x 103 pfu de la biblioteca no amplificada para cada escision. Se extrajo ADN plasmidico de alta calidad a partir de co lonias tomadas aleatoriamente utilizando el robot QIAGEN BioROBOT 9600. Las colonias se cultivaron durante una noche en 3 ml de medio Caldo Luria (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl) suplementado con 100 mg/l de ampicilina, se centrifugaron a 3000 RPM durante 10 minutos y el sedimento se utilizodirectamente para el a islamiento del ADN plasmidico mediante el robot. Cada ronda de aislamiento de ADN comprendia 96 cultivos.

El tamano del inserto se estimo mediante electroforesis en gel de agarosa despues de la digestion con enzima de restriccion del vector pBlueScript (SK-) con EcoRI y XhoI. Se utilizaron insertos deuna longitud por encima de 500 pb para la secuenciacion. Los ADN plasmidicos de las muestras seleccionadas se utilizaron para reacciones de secuenciacion por reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando el kit ABI PRISMT Dye Terminator Cycle Sequencing R eady Reacti on Kit y el termociclador MJ Rese arch PT C-200 DNA E ngineT. Se utilizaron l os cebadores universales T3 yT7 para secuenciacion desde los extremos 5' y 3', respectivamente. El programa de PCR era, segun el protocolo del fabricante, del Dye Terminator (ABI PRISM). Se utilizaron los secuenciadores ABI 373, 370A y 310 (Applied Bio-systems). Las secuencias se editaron de forma manual para eliminar secuencias del vector y no fiables y se sometieron a la busqueda de homologia mediante BLAST (Altschul y otros J. Mol. Biol. 215, 403 - 410, 1990), proporcionada por el National Center for Biotechnological Information (Centro Nacional para Informacion Biotecnologica) en la pagina Web (info@ncbi.nlm.nih.gov). La busqueda se realizo contra todas las bases de datos no redundantes disponibles mediante el programa.

Ejemplo 4. Clonación y caracterización de genes H64 de fresa silvestre y cultivada

Clonación del ADNc de H64 a partir de fresa cultivada (H64NORL) y su homólogo a partir de la fresa silvestre (H64VES)

Los inventores identificaron ante todo el ADNc de H64 de sus clones seleccionados aleatoriamente originados de la biblioteca de ADNc del cultivar de fresa cultivada Elsanta (fruto rojo maduro). Los resultados de la busqueda de homologia utilizando el programa BLAST indicaban que el ADNc podria codificar una proteina terpeno sintasa. Toda la biblioteca de ADNc de H64 tiene 1874 pb de largo [(denominada H64 de Normal Larga (H64NORL)] y contiene un marco de lectura abierta (ORF) que codifica una proteina de 519 aminoacidos (aa) de longitud [los inventores denominaron a la parte del ADNc que forma el ORF de 519 aa como H64 Normal Corta (H64NORS), vease la figura 2].

La clonacion del homologo de fresa silvestre del ADNc de H64 cultivado se consiguio mediante la utilizacion del kit SMART RACE (Clontech) utilizando ARN de la coleccion de Plant Research International de fresas silvestres (linea 92189). Los oligonucleotidos utilizados principalmente parasecuenciar el ADNc H64NORL se utilizaron para la amplificacion RACE 3' (AAP291 - 5'- CTTCATGAGGTTGCACTTCG- 3' yel oligonucleotido anidado AAP 293 - 5'- AATGGTGGAAGGAGCTTGGATTGG- 3'). El ADNc de fresa silvestre de longitud completa [H64 Vesca (H64VES)] se obtuvo disenando un oligonucleotido en la region no traducida 3' (UTR) en base al fragmento de 1000 pb obtenido en la RACE 3' y utilizandolo para RACE para el lado 5' (5' GTTCAACTCCACTTCCAGCAGTC 3'). El ADNc H64VES tiene 1894 pb de largo y contiene un marco de lectura abierta que codifica una proteina de 580 aminoacidos (aa) de longitud. Sesenta y un aminoacidos cadena abajo del primer residuo de metionina de la proteina de 580 aa, los inventores pudieron identificar un residuo de metionina adicional. Estos 61 aminoacidos se parecen a la senal de direccion plastidica caracteristica de monoterpeno sintasas, dado que contiene el motivo con dos argininas y un gran numero de residuos de serina [Williams y otros (Biochemistry, 37 12213-12220, 1998); vease la figura 3A). Los ADNc H64NORL y H64VES comparten el 96% de identidad a nivel del acido nucleico y, si el codon de terminacion se elimina y el resto de la secuencia se traduce, 92,4% a nivel de los aminoacidos (a partir del ATG situado en el nucleotido 145 hasta el final de la region codificante). H64VES y H64NORS comparten el 97,2% de identidad a nivel del acido nucleico y el 94,2% a nivel de los aminoacidos (cuando la parte que comienza a partir del comienzo de H64NORS a H64NORVES se utiliza para el alineamiento hasta el final de la region codificante).

Análisis de la expresión de H64 durante el desarrollo, en cultivares cultivados y silvestres y en respuesta al tratamiento con auxina

El a nalisis de transfere ncia en g el de A RN uti lizando H64NORL c omo so nda rev elo qu e esta esta re gulada positivamente durante la maduracion del fruto de fresa cultivada (figura 4). No se pudo detectar expresion en los tejidos de la hoja y del fruto verde. La expresion de H64 aumentaba desde la fase de blanca, a roja, del desarrollo del fruto. El analisis de la expresion de H64 en frutos maduros de dos cultivares silvestres y dos cultivados mostraba que H64 se expresa fuertemente en los cultivares cultivados, y apenaspodia detectarse expresion alguna en los cultivares silvestres (se detecto una ligera senal en los cultivares silvestres despues de una larga exposicion de la pelicula, no se muestran los datos). Otra transferencia engel de ARN mostraba que H64 es reprimido por auxina. Esto se correlaciona con el hecho de que tambien otros genes regulados positivamente, por la maduracion de la fresa son reprimidos por auxina.

Mutagénesis dirigida de H64NORL

Un analisis mas minucioso del ADNc de H64 (denominado H64NORL) revelo que este podria contener un codon de inicio ATG adicional, 99 pb cadena arriba del ATG original que identificaron los inventores (que se propuso como el comienzo del ORF que codifica la proteina H64NORS de 519 aa). Los dos codones ATG estaban ubicados en marco pero no se pudo formar ningun peptido entre ellos dado que un codon de terminacion situado 39 pb antes del ATG cadena abajo era evidente. Los inventores sospechan que la parte entre los dos ATG es realmente parte de la proteina y, por alguna razon, podria mutar, de modo que podria formarse una proteina mas corta partiendo del ATG cadena abajo. Un apoyo adicional a esta idea era la gran abundancia de residuos de serina identificados en la zona traducida entre los dos ATG. Se parecia a los extremos N de otras monoterpenoide sintasas que contienen una abundancia relativamente alta de residuos de serina. Los inventores emplearon, por lo tanto, mutagenesis dirigida para mo dificar el cod on d e terminaci on y co nstruir u na protein a H6 4NORL n o trunca da [de nominada H6 4 Mutagenizada (H64MUT)]. Al cambiar el codon de terminacion (TGA) en un residuo de leucina (CTA) el ADNc H64MUT tiene 1659 pb de longitud que contiene una proteina de 552 aa de lo ngitud (vease la figura 3B). L a mutagenesis dirigida se re alizo utilizando el kit QuikCha nge segun lo descrito por e l fabricante (Stratagene). El oligonucleotido utilizado para el intercambio era, 5'- GGGAAGCAAGCTATCTAGAAAGTAGCAG-GCAATT-3'.

PCR en ADN genómico de fresa cultivada

Para verificar que la secuencia que obtuvieron los inventores para H64NORL no era un artefacto de PCR y el codon de terminacion entre los dos ATGs existe, los inventores realizaron PCR en el ADN genomico de fresa cultivada. Los inventores disenaron dos oligonucleotidos, uno cadena arriba del primer ATG (5'-CTCCCACAGCTTCTTAGTTGC-3') y otro cadena abajo del segundo ATG (el comienzo de H64NORS) (5'-CTAGCTCTGCTACATTCCTCAAGAC-3'). Se esperaba que la amplificacion con estos dos oligonucleotidos amplificara un fragmento de aproximadamente 200 pb. Se obtuvieron dos fragmentos evidentes de 300 pb y 400 pb cada uno. La secuenciacion de cuatro clones de los fragmentos de 300 pb de longitud revelo que estos eran similares al ADNc H64NORL original. La secuenciacion y el alineamiento de 20 d e l os clones m as g randes id entificaron var ias i soformas q ue eran d iferentes del A DNc H64NORL cultivado original. Todos los fragmentos (incluyendo los cortos) contenian un intron de aproximadamente 100 pb. Se ide ntificaron cuatro clo nes u nicos di ferentes de los 2 0 s ecuenciados. Dos de el los [SEC6C(H64NORU1/W151) y SEC7C(H64NORU2/UP3)] tenian 20 aa adicionales (en comparacion con H64MUT) pero seguian conteniendo un codon de terminacion situado inmediatamente al comienzo del peptido que formaron. Otros dos fragmentos [SEC 8C(H64NORU3/UP16) y SE C9C(H64NORU4/UP1)] no contenian nin gun co don d e terminacion y eran los mas similares a la secuencia H64VES. Estos fragmentos anadian 26 aa a la secuencia H64MUT y ambos contenian los dos residuos de arginina, como en H64VES, que se encuentran mas a menudo en la senal de direccion plastidica de monoterpeno sintasas (vease la figura 3A).

Clonación de H64MUT/H64NORS para expresión en E. coli

El vector de expresion en E. coli pRSETB (Invitrogen) se utilizo para la expresion heterologa de terpeno sintasas de fresa (ver la f igura 5). El v ector p RSETB conti ene el promotor T 7 q ue puede ser in ducido por isopropil-1-Dtiogalactopiranosido (IPTG) y, por lo tanto, insertando el gen deseado cadena debajo de este promotor, el gen puede expresarse en E. coli. Ademas, se colocaron insertos de ADN cadena abajo y en marco con una secuencia que codifica un peptido de fusion N-terminal. Esta secuencia incluye (en orden de 5' a 3' desde el extremo N al extremo C), un codon de inicio de la traduccion ATG, una serie de seis residuos de histidina que funcionan como un dominio de union a metales en la proteina traducida, el epitopo Anti-Xpress, y la secuencia de reconocimiento de escision de enteroquinasa.

El pRSETB original se utilizo principalmente para la insercion del gen que codifica la Proteina Verde Fluorescente (GFP). El gen de GFP se fusiono con el vector pRSETB utilizando los sitios de restriccion BamHI y HindIII situados en el sitio de clonacion multiple (MCS), tal como puede verse en la figura 5. Esta construccion, para la expresion de GFP, servia como control para los experimentos junto con el vector pRSETB vacio.

La clonacion del gen de GFP en el vector p RSETB insertaba un sitio d e restriccion SalI adicional en 3' del gen d e GFP y, junto con el sitio BamHI, ubicado en 5' del gen de GFP servian como sitios para clonar H64MUT. Los sitios BamHI y SalI se introdujeron en 5' y 3' respectivamente de la secuencia codificante de H64MUT mediante la utilizacion de PCR. El marco de lectura abierta de 552 aminoacidos del clon de H64MUT se amplifico con la pfu ADN polimerasa (Stratagene) y oligonucleotidos (que contienen los sitios BamHI y SalI) AAP339 (5'-CGGATCCGGCATC-GTCTTCTCGGGC-3') y AAP334 (5'-CGTCGACCAACTCCACTTCCGGTAGTC-3') segun las instrucciones de los fabricantes. El producto de PCR se clono en el vector PCR-script (Stratagene), se corto con BamHI y SalI y se inserto adicionalmente (como una fusion de traduccion) en los sitios de restriccion correspondientes en el vector pRSETB. El H64NORS se clono de manera similar.

Expresión bacteriana y purificación parcial utilizando las columnas His tag.

El vector pRSETB que aloja los H64MUT o H64NORS se utilizo para transformar la cepa de E. coli BL21 Gold DE3 pLysE (Stratagene), segun lo descrito por el fabricante. Para la expresion bacteriana, tipicamente 1 ml de cultivo liquido durante una noche, cultivado a 37°C en medio Caldo Luria (LB) (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl) suplementado con 100 mg/l de ampicilina, se diluyo 50 veces en el mismo medio y se cultivo hasta que la DO600 alcanzo 0,4 (a 37°C). En esta fase, se ana dio IPTG a una concentracion final de 1 mM para inducir la expresion. Despues del cultivo durante una noche a 16°C, las celulas se recogieron mediante centrifugado a 4000 x g durante 15 minutos. El sedimento y una muestra del sobrenadante se mantuvieron para analisis en gel SDS. Las celulas se procesaron adicionalmente, segun lo descrito por los fabricantes de las columnas Ni-NTA Spin Columns (QIAGEN), para la purificacion de proteinas en condiciones nativas. El primer eluato de la columna (200 !l) se utilizo adicionalmente para ensayos de actividad enzimatica.

Ejemplo 5. Clonación y caracterización de genes SOS de fresa silvestre y cultivada

Clonación del ADNc de SOS de fresa cultivada (SOSA) y su homólogo de la fresa silvestre (SOSV)

Para clonar el ADNc de SOSA(MA) del CV de fresa silvestre Elsanta, se diseno un oligonucleotido en una secuencia publicada de una sesquiterpeno ciclasa de la fresa silvestre (Nam y otros Plant Mol. Biol. 39: 629-636, 1999). El oligonucleotido (AAP 272, 5'-GATGATATGTATGATGCATTCGG-3') se utilizo par a realizar una reaccion RACE 3' utilizando el kit RACE (Clontech) y se clono un fragmento de 991 pb. Para clonar el ADNc de longitud completa, se realizo un a re accion RA CE 5' utilizan do un olig onucleotido dise nado en e l UTR 3' del ADN c (AAP283, 5'-GAAAGGATAGGCTCATCAGTACGTG-3'). Todo el AD Nc SOSA(MA) clona do tien e 260 5 pb d e longit ud. Los inventores no pudieron, sin embargo, identificar un ORF que codifique una proteina mas larga de 255 aa, lo que es menos de la mitad de una terpeno sintasa tipica. Por lo tanto, se realizo un segundo intento de clonar un ADNc con un ORF mas largo. Utilizando oligonucleotidos basados en la secuencia de SOSA(MA), uno situado al comienzo del ORF (AAP325, 5'-CGGAT CCGCCTGTCCATGCTACTCC-3') y el otro en el UT R (AAP341, 5'-CGTCGACTGAGTTCAGAGTGGCACTGG-3'), se aislo un segundo ADNc de SOSA de longitud completa por medio de PCR en el ADNc de la fresa cultivada [denominado SOSA(WS)]. La secuenciacion de SOSA(WS) revelo que, en cuanto a SOSA(MA), este contiene un ORF truncado. Los inventores decidieron clonar el homologo SOS de longitud completa de la fresa silvestre para identificar la causa de dicho truncamiento en el ORF de los genes cultivados. La clonacion del homologo SOS silvestre se re alizo mediante reaccion RACE 3' utilizando un oligonucleotido disenado en el ORF de SOSA(MA) (AAP325, ver anterior). El homologo SOS de longitud completa de la fresa silvestre (SOSV) tiene 197 3 pb de l ongitud y co ntiene u n ORF que co difica u na protein a d e 556 aa d e long itud. El alineamiento de las secuencias de acido nucleico SOSA(MA), SOSA(WS) y SOSV revelo cambios menores en el ORF (ver la figura 6). Sin embargo, los inventores pudieron identificar la base del truncamiento en los genes de SOS cultivados que era una insercion de dos nucleotidos de citosina que causaba un desplazamiento del marco seguido por un codon de terminacion (ver la figura 6). La eliminacion de la insercion de CCdelos genes de SOSA(WS) y SOSA(MA) da como resultado la formacion de ORF que codifican 554 y 555 aa, respectivamente (figura 7).

PCR en ARN genómico de fresa cultivada y silvestre

Para confirmar la presencia del desplazamiento de marco de CC, que causa un truncamiento en los genes SOS de fresa cultivada, se analizo la existencia de la insercion a nivel del ADN. Se realizo PCR en el ADN genomico de fresa tanto silvestre como cultivada utilizando dos oligonucleotidos situadosdesde ambos lados del lugarde insercion (AAP345, 5' -AGAGGTTAGGTGCTCGGCGTTAC-3') y el oligonucleotido inverso, AAP346, 5'-GAACAACTCCACGATCCTATCTC-3'). El fragmento d e ADN amplificado esperado tenia 200 pb. Se obtuvieron productos d e PCR d el tam ano de 30 0 p b de amb as r eacciones util izando e l ADN s ilvestre y c ultivado. S e secuenciaron 20 y 15 fragmentos de las reacciones de fresa cultivada y silvestre, respectivamente. Todos los fragmentos contenian un intron de aproximadamente 100 pb. El alineamiento de secuencia de todos los fragmentos revelo 7 secuencias diferentes de la cultivada y5 de la silvestre. La figura 8 muestra un alineamiento de todos los fragmentos de los genes SOS de la fresa tanto silvestre como cultivada obtenidos de ARN (los diferentes ADNc) o de AD N. Entr e los fr agmentos cultiva dos pud ieron i dentificarse 2 fr agmentos q ue mostraba n l a inserc ion CC mientras que los otros 5 no la contenian. Por otro lado, no se pudo detectar ningun fragmento en la fresa silvestre que contuviera la mutacion de desplazamiento de marco.

Análisis de la expresión de SOS en fruto maduro de fresa cultivada y silvestre

Utilizando el ADNc SOSV como son da, se an alizo la expresion genica de SOS e n dos c ultivares, silvestre y cultivado, diferentes (figura 9). El ADNc SOSV podia utiliz arse para hibridacion con transferencias que contenian ARN de cultivares tanto silvestre como cultivado, dado que los genes SOSA y SOSV comparten casi el 99% de identidad a nivel del acido nucleico (en la region del ORF). Apenas podia detectarse expresion alguna en los cultivares cultivados mientras que una expresion fuerte podia detectarse en los cultivares silvestres. La sonda SOSA tambien se ut ilizo par a hibridar tra nsferencias co n A RN e xtraido de diferentes fas es d e d esarrollo de frutos cultivados (Elsanta), pero solamente podia detectarse una senal debil despues de una exposicion larga. Nam y otros, (1999) tampoco fueron capaces de detectar la expresion del ADNc parcial homologo de SOS con ARN obtenido de diferentes fases del desarrollo del fruto de lafresa cultivada. La expresion en diferentes tejidos de la planta de fresa silvestre estaba restringida al fruto, especificamente a la fase madura roja.

Clonación y expresión de SOSV y SOSA en E. coli

Ambas regiones codificantes de SOSA y SOSV se utilizaron para la formacion de una proteina recombinante en celulas de E. coli. Todo el ORF de ADNc SOSA, aunque truncado, se expreso para servir como control negativo para los ensayos enzimaticos. De forma similar a la clonacion de H64MUT, los sitios de restriccion BamHI y SalI en 5' y 3' del gen de GFP sirvieron, respectivamente, como sitios para la clonacion de ORF de SOSA y SOSV en el vector de expresion pRSETB. Los sitios BamHI y SalI se introdujeron en 5' y 3' respectivamente de la secuencia codificante de los genes SOS silvestres y cultivados mediante la utilizacion de PCR. Los sitios de restriccion se anadieron a los oligonucleotido utiliza dos para la re accion de P CR (AA P325, 5'-CGG ATCCGCCTGTCCATGCTACTCC-3' y el cebador inverso AAP341, 5'-CGTCGACTGAGTTCAGAGTGGCACTGG-3'). El pro ducto de PCR se clono en el vector PCR-script (Stratagene), se corto con BamHI y SalI y se inserto adicionalmente (como fusion de traduccion) en los sitios de restriccion co rrespondientes en el vector pRSETB. La expr esion de S OSA y SOSV en E. coli se realizo en paralelo a la expresion de H64MUT y en condiciones experimentales identicas.

Ejemplo 6. Análisis de enzimas recombinantes de SOSA, SOSV, H64MUT y H64NORS

Para la determinacion de la identidad de terpeno sintasa, las enzimas purificadas mediante His-tag (preparadas tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 4.6) se diluyeron 10 veces con tampon A que contenia MOPSO 15 mM (pH 7,0), glicerol al 10%, MgCl2 10 mM, ascorbato sodico 1 mM y DTT 2 mM. A 1 ml de es ta preparacion enzimatica, se le anadieron 40 !M de [3H]-geranil difosfato (GPP) o [ 3H]-farnesil difosfato (FPP). Los ensayos con GPP como sustrato tambie n se supl ementaron co n MnCl 2 1 mM. Despu es de l a adici on d e una ca pa d e recubrimiento de 1 ml de pentano redestilado, los tubos se mezclaron cuidadosamente y se incubaron durante 1 h a 30°C. Despues del ensayo, los tubos se agitaron en vortice, la capa de pentano se elimino y se paso por una corta columna de oxido de aluminio revestida de Na2SO4 anhidro. El ensayo se re-extrajo con 1 ml de eter dietilico, que se paso tambien por la columna de oxido de aluminio, y la columna se lavo con 1,5 ml de eter dietilico. Se retiraron 100 !l del extractoorganico para recuento por centelleo liquido en 4,5 ml de coctel de centelleo (Ultima Gold, Packard Bioscience, Paises Bajos). Los productos radiomarcados estaban presentes en los extractos organicos de:

H64MUT H64NORS SOSV SOSA [3H]-GPP + + + -[3H]-FPP + + --

Posteriormente, los extractos se concentraron cuidadosamente en un chorro de N2 antes del analisis utilizando radio-GLC y GC-MS. La radio-GLC se realizo en un cromatografo de gases Carlo-Erba de la serie 4160 equipado con un detector de radiactividad RAGA-90 (Raytest, Straubenhardt, Alemania). Los componentes de la muestra, que se eluian de la columna, se redujeron cuantitativamente antes de la medicion de la radiactividad mediante el paso a traves de un reactor de conversion lleno de virutas de platino a 800°C. Se inyectaron muestras de 1 !l en el modo de columna en frio. La col umna era un ca pilar de silice fu ndido (30 m x 0,32 mm de di ametro interno) recubierto con una pelicula de 0,25 !m de polietilenglicol (EconoCap EC-WAX, Alltech Associates) y accionado con un flujo de He de 1,2 ml min-1. La temperatura del horno se programo a 70°C durante 1 minuto, seguido de un aumento gradual de 5° min-1 hasta 210°C y un periodo final de 10 minutos. Aproximadamente el 20% del efluente de la columna se dividio con un divisor ajustable a un FID (Detector de Ionizacion de Llama) (temperatura 270°C). El resto se dirigio al reactor de conversion y radio-detector. Se anadio H2 antes del reactor a 3 ml min-1,y CH4 como gas inactivador antes del detector de radiactividad (5 ml contando el tubo) para dar un flujo total de 36 ml min-1. El analisis de radio-GLC dio los siguientes resultados:

-: las proteinas recombinantes SOSV y H 64MUT y H6 4NCRS catalizaban la formacion de pro ductos radiomarcados a p artir de [ 3H]-GPP (figura 1 0). Para la pr oducto SOSV, una seri e de picos de pr oductos radiomarcados eran visibles en la zona del tiempo de retencion de monoterpenos olefinicos (figura 10B). El principal producto radio-marcado no se co-eluyo con ninguno de los compuestos de referencia no marcados anadidos, pero uno de los picos radio-marcados menores parecia co-eluirse con el 1-mirceno de refer encia. Para la enzima recombinante H64MUT, el unico producto radio-marcado co-eluia con linalol (figura 10C).

-: con [3H]-FPP como sustrato, el recuento de centelleo mostraba que ni la proteina recombinante SOSA ni la SOSV catalizaban la formacion de ningun producto radio-marcado. La proteina H64MUT catalizaba la formacion de un producto radio-marcado que el analisis por radio-GC mostraba que era un unico producto que co-eluia con trans-nerolidol (figura 11).

Las muestras tambien se analizaron mediante GC-MS, utilizando un cromatografo de gases HP 5890 de la serie II equipado con una columna HP5-MS (30 m x 0,25 mm diametro interno, 0,25 !m diametro de la pelicula) y un detector HP 5972A Mass Selective Detector (Hewlett-Packard). El horno se programo a una temperatura inicial de 45°C durante 1 minuto, con un aumento gradual de 10°C min-1hasta 280°C y un periodo final de 5 minutos. Las temperaturas del orificio de inyeccion (modo sin division), la interfaz y la fuente de MS eran de 250, 290 y 180°C, respectivamente, y la presion de entrada de He estaba controlada mediante el control de presion electronico para conseguir un flujo de columna constante de 1,0 ml min-1. El potencial de ionizacion se ajusto a 70 eV, y el barrido se realizo de 48-250 amu. El cromatograma m/z 93 de productos catalizados de la proteina recombinante SCSV de [3H]-GPP muestra de nuevo varios picos (figura 12), como tambien se observo en el cromatograma de radio-GC (figura 10B). Los compuestos se identificaron como a-pineno (compuesto principal), 1-pineno, sabineno, 1-mirceno, a-felandreno, 1-felandreno, dihidromircenol (provisional), a-terpinoleno (provisional) y a-terpineol (provisional). Esto muestra que SOSV no es una sesquiterpeno sintasa como se reivindica para un fragmento de acido nucleico aislado por Nam y ot ros (Plant Mol Biol, 39: 19 99-2002, 19 99) y Mart y (B ase de d atos EMBL, Numero de Entrad a AJ001452), sino una monoterpeno sintasa, es decir, u na a-pineno sintasa. Nam y otros yMarty habian aislado solamente un fragmento del ADNc y, por ejemplo, se dejaron el lado 5'. Por lo tanto, los autor es fueron tambien incapaces de expresar funcionalmente la proteina y la identificaron erroneamente como una sesquiterpeno sintasa. Los cromatogramas de GC-MS de las inc ubaciones de la proteina H64MUT con [3H]-GPP o [3H]-FPP muestran la presencia de un producto de terpeno para cada sustrato y la comparacion de los tiempos de retencion y los espectros de masas con autenticos patrones confirmo que, a partir de [3H]-GPP, se produjo linalol(figura 13) y, a partir de [ 3H]-FPP, trans-nerolidol (figura 14). El analisis utilizando columnas enantioselectivas mostro que, tant o linalol como nerolidol eran de la configuracion S, es decir, (3S)-(E)-nerolidol y S-linalol. Caracterización. La proteina H64NCRS codificada y purificada mediante his-tag demostro tener un pH optimo de aproximadamente 7 tanto para GPP como para FPP. Para ambos sustratos, no habia preferencia por Mn2+ (a 1 mM) o Mg2+(a 10 mM) y, por lo tanto, se utilizo de forma rutinaria una combinacion de los dos. La afinidad de la enzima por los dos sustratos diferia fuertemente. La Km para FPP era de 3,2 !M que esta en el intervalo esperado para sesquiterpeno sintasas. Sin embargo, para GPP la Km era >50 !M, lo que es altamente inusual. Sin embargo, la Vmax aparente para GPP era mucho mayor que para FPP.

Ejemplo 7. Análisis de la dirección

Se utilizaron ensayos de expresion transitoria utilizando la Proteina Verde Fluorescente (GFP) para identificar la localizacion sub-celular de las proteinas codificadas por los diferentes fragmentos de acido nucleico descritos en la presente invencion (figura 15). En prim er lugar, se c onstruyeron 13 construcciones diferentes que fusionaron en marco las partes del extremo 5' de los diferentes genes (H64NCRL, H64NCRS, H64TAR4, H64VES, SOSV) al gen de GFP (figura 16). Se utilizaron diferentes regiones de los extremos 5', parte de las cuales incluian una parte de la propia proteina (hasta el motivo MID). La expresion en plantas fue impulsada por el promotor del virus del mosaico de la coliflor 35S. Se utilizo el ADN plasmidico de construcciones para transformar protoplastos de tabaco. Despues de transformacion, los protoplastos se incubaron durante 24 horas a 28°C en l a oscuridad yseguidamente se utilizaron para el analisis de la expresion transitoria de GFP y la localizacion subcelular utilizando microscopia de barrido con laser confocal. Los resultados demostraron que los extremos 5', tanto de H64TAR4 como de H64VES codifican una senal de direccion (figura 15). La proteina codificada por H64TAR4 es dirigida a los plastos (por ejemplo, cloroplastos) y las mitocondrias, mientras que la proteina H64VES es dirigida a los plastos (por ejemplo, cloroplastos). H64NCRL y H64NORS, que son las mas activas en la fresa cultivada madura, son dirigidas al citosol. SOSV tambien es dirigida al citosol, al contrario que todas las monoterpeno sintasas descritas hasta la fecha que estan localizadas en los plastos. Por lo tanto, segun este experimento, para monoterpeno sintasas el citosol y no solamente los plastosson una posible ubicacion, y en el citosol hay altos niveles de GPP para sintetizar los monoterpenos. Para sesquiterpeno sintasas, que normalmente se describe, que estan localizadas en el citosol, otra localizacion sub-celular puede ser posible, tal como en l as mitocondriasy cloroplastosy pueden utilizar FPP en estos compartimentos yproducir altos niveles del sesquiterpeno. Los inventores tambien demostraron, mediante el mismo metod o, que l as d iferentes s enales de d ireccion de l as terp eno si ntasas podian camb iarse facilm ente mediante la utilizacion de mutagenesis dirigida. Por ejemplo, la senal de direccion plastidica codificada por la parte N-terminal de H64VES podia modificarse para una direccion doble a mitocondrias y cloroplastos mediante un cambio en 2 residuos de aminoacidos (Triptofano-W6 cambiado a Arginina-R6 y delecion de lsoleucina-I16).

Ejemplo 8. Efectos de nerolidol sobre Agrobacterium tumefaciens

El FPP, el precursor para la biosintesis de sesquiterpeno es un metab olito de lo mas comun y existe en todo organismo vivo. Por lo tanto, la expr esion de una proteina que codifica una nerolidol sintasa dara como resultado la conversion de FPP endogeno en nerolidol en la mayoria de los organismos vivos. Los inventores construyeron un vector binario (plasmido utilizado para la transformacion de celulas vegetales, que carece de los genes virulentos presentes en el plasmido Ti de la cepa virulenta de Agrobacterium tumefaciens) que contiene el gen de H64NORS flanqueado por un promotor de CaMV 35S (extremo 5') y un terminador de nopalina sintasa (NOS) (extremo 3') y lo utilizaron p ara transformar 2 cepas dif erentes de Agrobacterium. En ambos cas os, no se obtuv ieron co lonias despues de sembrar la reaccion de transformacion en medio Caldo Luria (LB) que contenia 50 mg/l de kanamicina y Rifampicina. Por lo tanto, el gen de H64NORS se expreso en Agrobacterium y laproteina codificada por este convertia al FPP bacteriano endogeno en nerolidol, que es altamente toxico para las celulas de Agrobacterium y, por lo tanto, no se obtuvieron transformantes. Por lo tanto, las plantas transgenicas que expresan una nerolidol sintasa tendran un efecto antimicrobiano y podrian utilizarse para la proteccion contra enfermedad de agallas de corona causada por Agrobacterium. Para poder introducir un plasmido que contiene dicha terpeno sintasa que tiene efectos toxicos sobre las bacterias, pueden introducirse uno o mas intronesen la secuencia codificante del gen. Estos intrones pueden no ser cortados por las bacterias y, por lo tanto, ninguna proteina funcional es formada por el microorganismo. En la planta, el proc eso de corte eucariota norma l cond ucira a una pr oteina f uncional. L a introduccion de promotores adecuados, especificos de organos y/o inducibles en la construccion apropiada permitira la expresion dirigida de linalol y/o nerolidol en el sitio apropiado para controlar la enfermedad de agallas de corona en plantas, tales como frutos, rosa, etc. Ademas, formul aciones de liberacion lenta u otras composiciones que contienen linalol y/o nerolidol pueden ser utiles para controlar la enfermedad de agallas de corona.

Ejemplo 9. Efectos de linalol y nerolidol sobre la germinación de esporas, el crecimiento de lesiones y la esporulación de Phytophthora infestans, Fusariurn spp., y Botrytis spp.

Comparación de los efectos de farnesol y linalol sobre el crecimiento del micelio de Phytophthora infestans en medio de cultivo

Se ensayaron farnesol y linalol a dos concentraciones (2% y 0,2% (v/v)) mediante la adicion a medio Plich en placas de 6 pocillos (3 ml por pocillo). Se utilizo una placa de 6 pocillos por compuesto con dos concentraciones diferentes por triplic ado. Todos los p ocillos se in ocularon con u n taquito d e miceli o de Phytophthora infestans (ais lado VK98014, 1 mes de edad) y se incubaron a 20°C. El dia 3, 5 y 7 se midio el crecimiento radial del micelio. En la figura 17 se proporciona una vision general de los resultados. El crecimiento del micelio de Phytophthora infestans se inhibia completamente 3, 5 y 7 dias despues del experimento mediante las concentraciones alta y baja de linalol. El farnesol daba como resultado una inhibicion parcial del crecimiento del micelio, tanto a la concentracion alta como a la baja. El experimento demuestra que el linalol es mas eficaz que el farnesol para la inhibicion del crecimiento del micelio de Phytophthora infestans.

Comparación de los efectos de linalol y nerolidol sobre el crecimiento del micelio de Phytophthora infestans solo y en combinación con medio de cultivo

Se ensayaron linalol y nerolidol en tres concentraciones (0,2%, 0,02% y 0,002% (v/v)) mediante la adicion a medio Plich e n plac as de 6 poc illos (3 ml por pocil lo). Se ut ilizo u na p laca de 6 poc illos por compu esto con do s concentraciones diferentes por triplicado. Para estudiar si los compuestos actuaban directamente o mediante la fase de vapor en una placa, los micelios se cultivaron en medio de control con los compuestos (0,2%) anadidos al medio en los pocillos adyacentes. De esta manera el intercambio libre de los compuestos a traves de la fase de vapor era posible. A todos los pocillos se les inoculo con un taquito de micelio de Phytophthora infestans (aislado VK98014, 1 semana de edad) y se incubaron a 20°C. El dia 3 y 5, se midio el crecimiento radial del micelio. Los resultados se muestran en las figuras 18-21.

La fi gura 18 muestra que el l inalol es activo inc luso a la co ncentracion mas baja d el 0,002% (= 20 p pm). Notablemente, los efectos de linalol son igualmente eficaces a traves de la fase de vapor que a traves del medio. Aparentemente, este monoterpeno es tan volatil que las concentraciones activas en la fase de vapor y del medio son similares. Esta alta actividad, en la fase d e vapor, hace del linalol un compuesto atractivo para la proteccion de productos alm acenados cont ra microor ganismos, por ej emplo, la proteccion d e p aratas frente a Phytophthora, Phoma y Fusarium.

La figura 19 muestra que el nerolidol es ligeramente mas eficaz que el linalol (comparese la figura 18) en la inhibicion del crecimiento del micelio de Phytophthora infestans y que es un inhibidor potente del crecimiento del micelio incluso a la concentracion mas baja de 20 ppm. Al contrario que el linalol, los efectos a traves de la fase de vapor son despreciables. Esto puede explicarse por el hecho de que el sesquiterpeno nerolidol es mucho menos volatil que el monoterpeno linalol.

Las figuras 20 y 21 muestran que la accion de linalol y nerolidol es mas potente en combinacion que cuando se toman solos. Esto sugiere que la produccion simultanea de estos compuestos en plantas podria dar como resultado un control fungico mas eficaz, en comparacion con una situacion cuando solamente uno de los dos compuestos esta presente.

El efecto de nerolidol infiltrado en hojas de patata sobre la germinación de esporas de Phytophthora infestans, formación de lesiones y esporulación.

Hojas del cultivar de patata Bintje se infiltraron al vacio con una solucion al 0,05% (v/v) de nerolidol. Esto se realizo colocando 6 hojitas de una vez en un tapon bluecap de 50 ml con la solucion de nerolidol o un control de agua. Los tubos se colocaron durante 15-30 minutos al vacio que, a continuacion, se libero subitamente. Una buena infiltracion fue visible mediante el color verde oscuro de las hojas. Las hojas habian ganado aproximadamente el 25% en peso de esta manera, de modo q ue la concentracion real en las hojas estaba en el i ntervalo de aproximadamente el 0,0125%. Lashojas se colocaron en agar-agua (1,5%) y se inocularon con 250-500 esporas de los 4 aislados diferentes de Phytophthora infestans (raza-0, IPO-c, 428-2, VK98014). Las hojas se incubaron durante una noche en la oscuridad a 15°C y,a continuacion, se pasaron a condiciones de iluminacion normal (15°C, 16 h de luz, 8 h de oscuridad). Despues de 7 dias, las h ojas se va loraron para l a form acion d e l esiones y la esporulacion. Los resultados demuestran que, tambien cuando se infiltraba en hojas de patata, el nerolidol inhibe fuertemente el crecimiento del micelio, la formacion de lesiones y la esporulacion a una baja concentracion. Los efectos parecen no ser especificos de raza sino afectar igualmente a los cuatro aislados diferentes, mostrando que tambien el nerolidol proporciona una amplia resistencia contra este hongo.

Efectos de Linalol y nerolidol sobre el crecimiento del micelio de Fusarium y Botrytis

Fusarium. Se ensayaron nerolidol y linalol en un intervalo de concentraciones (10-5000 ppm) solos y en combinacion mediante la adicion a medio Plich en placas de 6 pocillos (3 ml por pocillo). En el caso de la comparacion de la aplicacion de nerolidol y linalol solos con la combinacion de los dos compuestos, 100 ppm del compuesto individual se comparo, por ejemplo, con 50 + 50 ppm de los dos compuestos juntos. Una placa de 6 pocillos por compuesto se utilizo con dos concentraciones diferentes, por triplicado. Todos los pocillos se inocularon con un taquito de micelio de Fusarium graminearum, Fusarium culmorum o la cepa de F. verticillioides MRC826 y se incubaron a 20°C. Cada dia se midio el crecimiento radial del micelio. Los resultados deldia 7 se dan en la figura 22. Elcrecimiento del micelio d e to das l as es pecies d e Fusarium se inhibia a co ncentraciones por en cima d e 1 0 p pm. A baj as concentraciones, el nerolidol era ligeramente mas eficaz que el linalol en el caso de F. graminearum y MRC826. A concentraciones muy altas, el linalol era mas eficaz. La utilizacion combinada de nerolidol y linalol es, como minimo, tan eficaz como cualquier compuesto individual yparece proporcionar una inhibicion mas robusta contra todas las especies de Fusarium.

Botrytis. Se ensayaron nerolidol y linalol en unintervalo de concentraciones (10-5000 ppm) solos y en combinacion mediante la adicion a medio Plich en placas de 6 pocillos (3 ml por pocillo). En el caso de la comparacion de la aplicacion de nerolidol y linalol solos con la combinacion de los dos compuestos, 100 ppm del compuesto individual se compararon, por ejemplo, con 50 + 50 ppm de los dos compuestos juntos. Una placa de 6 pocillos por compuesto se utilizo con dos concentraciones diferentes por triplicado. Todos los pocillos se inocularon con un taquito de micelio de Botrytis cinerea aislado de uva y fresa e incubado a 20°C. Cada dia se midio el crecimiento radial del micelio. Los resultados del dia 7 se dan en la figura 23. El crecimiento del micelio de todos los aislados de Botrytis se inhibia a concentraciones por encima de 10 ppm. A bajas concentraciones, el nerolidol era mas eficaz que el linalol. A concentraciones muy altas, el linalol o la combinacion de linaloly nerolidol era la mas eficaz. La utilizacion combinada de nerol idol y l inalol es, com o minimo, tan eficaz como cualquier com puesto i ndividual y parece proporcionar la inhibicion mas robusta contra todos los aislados de Botrytis.

Efectos de linalol y nerolidol sobre la germinación de esporas de Fusarium.

Se utilizo un ensa yo esp ectrofotometrico para monitorizar el in icio de la germi nacion de es poras de Fusarium verticillioides (aislados: 1TEM2282, MRC3235, MRC826, MRC826-2) en solucion. Las esporas se diluyeron a una concentracion de 10 5 esporas/ml en medio Czapek Dox y se mezclaron con 8-4000 ppm de linalol o nerolidol. El linalol no afectaba a la germinacion de las esporas en absoluto (figura 24B). El nerolidol, sin embargo, mostraba una fuerte inhibicion de la germinacion a concentraciones por encima de 250 ppm (figura 24A). Esto sugiere que el nerolidol proporciona un modo de control adicional de Fusarium verticillioides a nivel de la germinacion de esporas en comparacion con linalol y que, para el control mas eficaz en todas las fases del desarrollo del hongo, de Fusarium spp, una utilizacion combinada de nerolidol y linalol es la mas apropiada.

Ejemplo 10. Transformación y caracterización de Arabidopsis, patata, tomate y petunia

Preparación de construcciones para la transformación de plantas.

Se preparan construccionescon los ADNc de H64 para la transformacion de plantas para producir plantas que produciran linalol y/o nerolidol en diversos compartimentos:

Los ADNc se colocan bajo el control del promotor 35S o del promotor Rubisco, tanto por separado como en combinacion para obtener plantas que producen linalol o nerolidol solos o en combinacion. Tambien se contempla que, para algunos fines, se requiere la glucosilacion o la deglucosilacion del terpeno-alcohol para el modo de accion contra hongos o insectos. Por esta razon, tambien se realizan construcciones que contienen glucosil-transferasas o

glucosidasas, junto con los ADNc de linalol y/o nerolidol sintasa.

Construcción de vectores binarios.

Las secuencias apropiadas se ligaron en un vector pFIap10. El producto de ligamiento se transformo en celulas competentes DH5a de E. coli, y las colonias transformadas se cultivaron durante una noche a 37°C y 250 rpm. La casete de expresion se elimino del vector resultante utilizando enzimas de restriccion PacI y AscI (NEB, Inglaterra) y se ligo en el vector binario pBINPLUS, que contenia un marcador de seleccion de resistencia a kanamicina (nptII), despues de la digestion con PacI y AscI. Las colonias se comprobaron despues de la transformacion mediante transformacion inversa a celulas competentes DH5a de E. coli.

Transformación de Arabidopsis

Se utilizo el metodo de transformacion de inmersion floral "floral-dip" para transformar plantas de Arabidopsis de ecotipo Columbia segun Marsh-Martinez y otros (2002). Despues de recoger las semillas, se dejaron secar durante varios dias y a continuacion se sembraron en medio MS que contenia 50 mg/I de kanamicina y 400 mg/l de cefotaxima. Brotes verdes, de 1 cm de tamano, se transfirieron al invernadero y se cultivaron hasta la madurez.

Transformación de patata

El dia 1 un cultivo de Agrobacterium tumefaciens de AGL0 que contenia un vector binario obtenido de BINPLUS se inicio en 50 ml de medio LB que contenia 50 mg/l de kanamicina y se agito durante 2 dias a 28°C. El dia 2 internodulos de un cultivo in vitro del cultivar de patata Desiree se cortaron en trozos de 0,5-1 cm yse colocaron en medio R3B (30 g/l sacarosa, 4,7 g/l de sales de Murashige y Skoog, pH 5,8 (KOH), 8 g/l de agar purificado, 2 mg/l de NAA y 1 mg/l de BAP) que se cubrio con 2 papeles de filtro esteriles que se habia empapado previamente en 2 ml de medio PACM (30 g/l s acarosa, 4,7 g/l de sales de Murashige y Skoog, 2 g/l de hidrolizado de caseina, pH 6,5 (KOH), 1 mg/ml de 2,4-D y 0,5 mg/l de cinetina). Las placas se cubrieron con parafilmy se incubaron durante una noche a 24°C en un regimen de 16 h de luz. El dia 3, el cultivo de A. tumefaciens se vertio en una placa de Petri esteril que contenia los explantes. Despues de 5-10 minutos, los explantes se eliminan del cultivo, se colocan en una papel de filtro esteril para eliminar el exceso deagrobacterias y se volvieron a colocar en las placasque contienen medio R3B despues de eliminar en primer lugar el papel de filtro superior (dejando uno debajo). Las placas con los explantes se incubaron adicionalmente a 24°C y 16 h de luz hasta el dia 5, cuando los explantes se transfirieron a placas que contenian medio ZCVK (20 g/l de sacarosa, 4,7 g/l de sales de Murashige y Skoog, pH 5,8 (KOH), 8 g/l de agar purificado, 1 mg/l d e zeatina, 200 mg/l de vancomicina, 100 mg/l de kanamicina, 200 mg/l de claforan). El dia 1 9 y, po steriormente, cada 3-4 semanas los explantes s e tran sfirieron a nuevo me dio Z CVK. Cua ndo aparecieron brotes, los brotes se transfirieron a medio de Murashige y Skoog que contenia sacarosa al 20% (MS20). Despues de enraizar, las plantas se transfirieron al invernadero.

Transformación de petunia.

Se transformaron cortes de hojas de Petunia W115 con la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens utilizando un protocolo de transformacion de plantas estandar (Lucker y otros, The Plant Journal [Diario de las plantas] 27: 315-324, 2001). Como control, tambien se transformaron cortes de hojas con LBA4404 que contenia el vector pBINPLUS. A demas, algunos cortes de hojas n o tran sformados se hici eron p asar a trav es del pr oceso d e regeneracion. Las plantas enraizadas, que surgieron de la transformacion con Agrobacterium se ensayaron con PCR en busca de la presencia de la construccion genica respectiva. Las plantas que dieron positivo se tr ansfirieron al invernadero. Todas las plantas transgenicas eran fenotipicamente normales y mostraban un desarrollo normal en comparacion con plantas de control no transformadas, que se habian sometido al mismo proceso de regeneracion.

Transformación de tomate.

Se utiliz o el cultivar d e tomate "Micro-T om" ( Lycopersicon flavour) (Scott y H arbaugh, 19 89). L as pla ntas s e cultivaron a partir de semillas suministradas por una compania de semillas (Beekenkamp seed, Holanda). En primer lugar, las semillas de Micro-Tom se esterilizaron. Un aclarado en etanol al 70% seguido por un blanqueamiento de dos horas en HCIO4 al 1,5%. Despues del blanqueamiento, las semillas se aclararon rapidamente en agua dos veces y,a continuacion, se lavaron en agua durante diez ysesenta minutos. Despues de la esterilizacion, las semillas se sembraron en macetas, que contenian 80 ml de vermic ulita y70 ml de medio de germinacion que contenia 4,4 g/l de sales de MS con vitaminas y sacarosa al 0,5% (pH 5,8). Despues de 7 dias de crecimiento en una sala de cultivo (25°C), tapadas con 2 pliegues de papel de filtro, los cotiledones se cortaron bajo el agua cerca del peciolo y la punta con una accion giratoria del escalpelo, para minimizar el dano. Los explantes se colocaron sobre sus anversos en papel de filtro en capas alimentadoras para incubar durante una noche en la sala de cultivo (25°C), cubiertos con 4 pliegues de papel de filtro, en condiciones de iluminacion baja. Despues de la incubacion, los explantes se s umergieron en la susp ension de Agrobacterium durante 20 minutos. Despues de la inmersion, los explantes se volvieron a colocar en capas alimentadoras para co-cultivo, despues de un aclarado en una solucion que contenia 400 mg/l de carbenicilinay 100 mg/l de tricarcilina. Los explantes se colocaron en medio inductor de callos (4,4 g/l de sales MS con vitaminas de Nitsch, sacarosa al 3%, agar purificado al 0,8% (Oxoid), pH 6,0, 2 mg/I

de zeatina, 400 mg/I de carbenicilina, 100 mg/I de tricarcilina, 100 mg/I de kanamicina). Las placas se taparon con 2 pliegues de papel de filtro yse dejaron crecer en una sala de cultivo (25°C) en condiciones de iluminacion baja durante 3 semanas. El callo formado se transfirio a medio inductor de brotes (como el medio inductor de callos, pero con 1 mg/l de zeatina, 200 mg/l de carbenicilina, 50 mg/l de tricarcilina).

Estas placas se dejaron crecer en las mismas condiciones que las placas de induccion de callos. Los brotes formados se transfirieron a medio de enraizado en macetas (4,4 g/l de sales MS con vitaminas de Nitsch, sacarosa al 3%, gel de agar al 0,5% (Sigma), pH 6,0, 0,25 mg/l de IBA, 50 mg/l de kanamicina, 400 mg/l de carbenicilina. Las condiciones de cultiv o s eguian s iendo l as mismas. Las plantas t otalmente d esarrolladas se transfirier on posteriormente al invernadero.

Análisis de las plantas transgénicas con cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) por capilaridad.

Los tejidos a analizar se recogieron en el invernadero y se congelaron en nitrogeno liquido. En general, 200 mg de material congelado se homogeneizaron y se transfirieron a un mortero que contenia 1,5 ml de CaCI2 5 M y una pequena cantidad de arena de mar purificada. Estos tejidos se mezclaron con 0,75 ml de CaCI2 5 M. El material se trituro rap ida y mi nuciosamente c on un mazo, in hibiendo l as re acciones e nzimaticas. 0,75 m l d el mater ial se introdujeron en un frasco de GC de 1,8 ml que contenia un pequeno agitador magnetico. El frasco se cerro a continuacion con un tapon de aluminio con un tabique de PTFE/goma de butilo. Posteriormente, el frasco se coloco en un bano de agua a 50°C y se precalento durante 20 minutos mientras se agitaba. La camara volatil se muestreo durante 30 minutos con una fibra PDMS SPME de 100 ! (Supelco, Belfonte PA Estados Unidos).

El analisis de GC-MS se realizo utilizando un cromatografo de gases Fisons 8060 directamente acoplado a un espectrofotometro de masas MD 800 (lnterscience, Breda, Paises Bajos). Se utilizo una columna HP-5 (50 m x 0,32 mm, grosor de la pelicula 1,05 !m) con He (37 kPa) como gas portador. La temperatura del horno de GC se programo de la siguiente manera: 2 minutos a 80°C, aumento gradual hasta 250°C a 8�min-1y 5 minutos a 250°C. Los esp ectros de masas e n el modo d e impacto de electrones se gener aron a 70 eV. Los compu estos se identificaron mediante comparacion de tiempos de retencion y espectros de masas de GC con l os de autenticos compuestos de referencia. La inyeccion se realizo mediante desorcion termica de la fibra SPME en el inyector a 250°C durante 1 minuto utilizando el modo de inyeccion, sin division con la valvula de division abriendose despues de 60 s egundos. Com o a lternativa, los v olatiles se atra paron e n c artuchos qu e c ontienen T enax, se e luyeron utilizando pentano/eter y se analizaron utilizando GC-MS esencialmente, tal como fue descrito por Bouwmeester y otros (1998). Las plantas transgenicas de Arabidopsis que expresaban H64TAR, por ejemplo, produjeron grandes cantidades de linalol y cantidades mas pequenas de nerolidol (figura 25). Las lineas transgenicas de patata tambien producian cantidades sustanciales de linalol, pero tambien el derivado de hidroxi 8-hidroxilinalol (figura 26). De forma interesante, el linalol nativo de patata, que tambien puede detectarse, tenia una estequiometria diferente al linalol transgenico (figura 26), lo que permitia una clara distincion entre producto nativo y transgenico. Dado que se sospechaba que, en algunas de las especies vegetales, estos compuestos estaban presentes en una forma unida, el material de la hoja de Petunia (muestras transgenicas y de control) se recogio y se congelo en nitrogeno liquido, y se trituro a un polvo fino en un mortero con mazo enfriados. En total, 60 mg del materi al de las hojas en polvo se transfirieron a 0,5 ml de tampon citrato a pH 4,5, a los que se anadieron 140 i.u. de 1-glucosidasa. El frasco se tapo y se incubo durante 12 h a 25°C. Posteriormente, la camara volatil del frasco se muestreo durante 30 minutos con el dispositivo de microextraccion en fase solida PDMS de 100 micrometros y se analizaron utilizando GC-MS tal como se ha descrito anteriormente. Ni linalol ni nerolidol eran detectables en muestras de las plantas de control no transformadas, mientras que en las plantas transgenicas se detectaron tanto linalol como nerolidol. La muestra de material de las hojas transgenicas sin beta-glucosidasa presente durante la incubacion no mostraba ningun linalol o nerolidol detectable, indicando que todo el linalol y nerolidol se almacena en las hojas de petuniaen forma de su glucosido, en lugar de la emision continua tal como se describio para linalol en las flores de Clarkia breweri.

Identificación de glucósidos en plantas transgénicas

Se re alizo u n an alisis d e cromatografia de liqu idos de alta r esolucion-ionizacion p or e lectropulverizacionespectrometria de masas en tandem (HPLC-ESI-MS-MS) de extractos de metanol en un sistema TSQ 7000 LC-MS-MS cuadrupolo de fase triple con una interfaz de ionizacion por electropulverizacion (ESI) (Finnigan MAT, Bremen, Alemania). La temperatura del capilar calentado era de 240°C. El voltaje del capilar de ESI se ajusto a 3,5 kV, dando como resultado una corriente de 3,4 !A. El nitrogeno servia tanto como funda (70 psi) como como gas auxiliar (10 l/minutos). La adquisicion y al evaluacion de los d atos se llevaron a cabo en una estacion Personal DECstation 5000/33 (Digital Equipment, Unterbhring, Alemania) y el software ICIS 8.1 (Finnigan MAT). La separacion por HPLC se llevo a cabo en una columna Eurospher 100 C-18 (100 x 2 mm, 5 !m, Knauer, Berlin, Alemania) utilizando un gradiente lineal con un caudal de 200 !l mm-1. El disolvente A era acetato de amonio 5 mM en agua, y el disolvente B era acetato de amonio 5 mM en metanol. El programa del gradiente era el siguiente: 0-30 minutos del 5 al 100% de B. Los esp ectros de masas se adquirieron en el modo negativo. Los espectros ionicos del producto estaban disponibles mediante disociacion inducida por colision (CID) (1,5 mTorr de Argon; -20 eV).

Para la preparacion de extractos, se homogeneizaron hojas de plantas (de 3 a 7 g) en 50 ml de metan ol al 80% y se

centrifugaron (2000 g durante 5 minutos). El residuo se lavo con 50 ml de metanol al 80% y los sobrenadantes se combinaron. El metanol se elimino al vacio y la solucion acuosa restante extrajo con 2 x 20 ml de eter dietilico. El extracto se sometio a extraccion en fase solida XAD-2 (20 cm, 1 cm de diametro interno). La columna se lavo sucesivamentecon 50 ml de agua y 50 mlde eter dietilico. Los glucosidos se eluyeron con 80 ml de metanol. El extracto se concentro al vacio.

El residuo se disolvio en 1 ml de metanol al 50% en agua y se analizo mediante HPLC-ESI-MS-MS.

Se sintetiz o R,S-Linalil 1-D-glucopiranosido a p artir d e R,S-linalol y bromur o de 2,3,4,6-tetra-O-acetil-beta-Dglucopiranosilo segun una sintesis de Ko enigs-Knorr modificada. Para la hidrolisis enzimatica, una alicuota del extracto de metanol se disolvio en 2 ml de tampon fosfato 0,2 M (pH 5,5), y 200 !l de Rohapect D5L (R�hm, Darmstadt, Alemania), se a nadio una pre paracion de e nzima pectinolitica que m uestra activid ad glucosidasa. Despues de un periodo de incubacion de 24 h a 37°C, las agliconas liberadas se extrajeron dos veces mediante 1 ml de eter dietilico cada una. Las capas organicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron. Se realizaron analisis de cromatografia de gases-espectrometria de masas multidim ensionales (MDGC-MS) con Fison 8160 GC en tandem conectado a un Fison 8130 GC un espectrometro de masas cuadrupolo Fisons MD 800 equipado con el software Fisons MassLab (Version 1.3). El primer GC estaba equipado con un inyeccion de division (1:10, a 230°C) y un detector de ionizacion de llama (a 250°C). El primer GC empleaba una columna capilar de silice fundido de 25 m x 0,25 mm de diametro interno recubierta con una pelicula de 0,25 !m de DB-Wax 20 M (J � W Scientific) para la pre-separacion de la molecula diana. La separacion de enantiomeros se consiguio con el segundo GC que utilizaba una columna capilar de silice fundido de 25 m x 0,25 mm de diametro interno recubierta con una pelicula de 0,15 !m de 2,3-di-O-etil-6-O-tert. butil dimetilsilil-1-ciclodextrina/PS086. La columna en el GC1 estaba conectada mediante un sistema de conmutacion de multiples columnas (Fisons) a la columna en el GC2. El tiempo de retencion del compuesto de interes se determino mediante separacion por GC mientras la columna en el GC1 estaba conectada al FID. La separacion de los enantiomeros se consiguio en el segundo GC, despues de la transferencia del compuesto de interes desde la columna capilar en el GC1 a la columna en el GC2 mediante el dispositivo de conmutacion. La columna capilar de silice fundido en el GC1 se mantuvo a 60°C ya continuacion se programo a 240°C a 10°C min-1 con el flujo de gas de He a 3 ml min-1. La columna capilar de silice fundido en el GC2 se mantuvo a 60°C (15 minutos) y, a continuacion, se programo a 200°C a 2°C min-1 con el flujo de gas de He a 3 ml min-1. El c ompuesto d e i nteres se tra nsfirio d el GC 1 a l GC2 d e 9,8 minutos a 10,3 min utos. L os par ametros operativos de MS eran voltaje de ionizacion, 70 eV (ionizacion por impacto de electrones); temperatura de la fuente de iones y de la interfaz, 230°C y 240°C, respectivamente. Se sintetizo linalil-1-D-glucopiranosido para verificar la identidad del glucosido presente en el tejido de Petunia transgenica transformado con S-linalol sintasa. El analisis por HPLC-MS/MS en tejido de petunia de control y transgenico, tal como se muestra en la figura 28, revelo que la senal ionica m/z 375 (figura 27A) del compuesto detectado en el tejido de Petunia transgenica tenia el mismo tiempo de retencion que uno de los dos diastereomeros de ( R,S)-linalil 1-D-glucosido que se resuelven ligeramente en la senal ionica A. Ademas el espectro ionico del producto del compuesto de referencia sintetizado encaja con el espectro del pico detectado en el tejido de Petunia transgenica bastante bien (figura 28B). La senal ionica m/z 375 del tejido de Petunia de control mostraba solamente una ligera elevacion por encima del nivel de fondo en el tiempo de retencion del linalil 1-D-glucosido, lo que indicaba que tambien existe un nivel basal de linalil-1-D-glucosido presente en la planta antes de la transformacion (figura 28A). A continuacion, el analisis por cromatografia de gases multidimensional de fase q uiral-espectrometria de masas (MD GC-MS), despues de la hidrolisis enzimatica de la fraccion de gl ucosido del te jido d e l a h oja, revel o que la hoja tra nsgenica de P etunia co ntiene (S)-linalil-1-Dglucosido altamente enriquecido. La planta de control contiene, sin embargo, (R)-linalil-1-D-glucosido ligeramente enriquecido. Dado que no utilizo ningun promotor especifico de tejido para la expresion, la enzima puede formarse en todos los organos vegetales, ydara un producto en todas las celulas donde GPP este presente. Mediante la accion de una glucosiltransferasa endogena, altamente activa, de Petunia que es capaz de unirse eficazmente al Slinalol pr oducido por la planta tra nsgenica, como ( S)-linalil-1-D-glucosido, se evita el d ano ce lular. Dicha glucosiltransferasa, altame nte activa, tambie n se des cribio e n fruto de Ki wi tra nsgenico q ue expr esaba estilbenosintasa, que acumulaba piceido (resveratrol-glucosido) en lugar de resveratrol. La volatilizacion de linalol a gran escala de las plantas transgenicas podia excluirse, dado que solamente eran detectables vestigios de linalol cuando se analizaba la camara volatil de las plantas transformadas. La volatilizacion solamente se producia a partir de las flores y no de las hojas. Esto contrasta con Arabidopsis donde grandes cantidades de linalol fueron emitidas desde las hojas (figura 25). Por lo tanto, los inventores concluyen que la mayoria del linalol en Petunia esta unido directamente en forma de 1-D-glucosido.

El analisis adicional de extractos de hoja de patata tambien mostro la presencia de glucosidos, no solamente del propio linalol sino tambien de 8-hidroxilinalol. Ademas, se descubrieron mas derivados de linalol, tales como linaloltriol, incluyendo el glucosido correspondiente (Tabla 1).

En concl usion, las plantas transgen icas que e xpresan los transg enes ins ertados demuestra n produc ir los compuestos terpenoides esperados. Sus cantidades, liberacion, oxidacion a polioles y derivatizacion a glucosidos varian de especie a especie y pueden estar influidas por la co-expresion de otras secuencias (ver el ejemplo 11). Cuando estos compuestos no se almacenan en intermedios unidos algunos, tales como glucosidos, las plantas tienen caracteristicas olfatorias alteradas.

Tabla 1

control: TM9 T M13 T M29

peso de la muestra (g): 3,5 3,5 4,1 3,0

linalol (!g/g de peso fresco) mediante GC-MS: 0,3 6,6 4,0 10,5

8-hidroxilinalol (!g/g de peso fresco) mediante GC-MS: 0,1 3,7 2,1 4,7

linaloltriol (!g/g de peso fresco) mediante GC-MS: � 0,1 � 0,1 � 0,1 0,3

linalol unido glucosídicamente (!g/g de peso fresco) mediante GC-MS: 0,4 3,3 0,6 1,0

8-hidroxilinalol unido glucosídicamente (!g/g de peso fresco) mediante GC-MS: 1,6 18,7 8,9 27,2

linaloltriol unido glucosídicamente (!g/g de peso fresco) mediante GC-MS: � 0,1 3,3 1,4 5,8

linalilglucósido (!g/g de peso fresco) mediante GC-MS: 17 83 55 90

8-hidroxilinalilglucósido de forma provisional (!g/g de peso fresco) mediante LC-MS: 12 101 51 126

linaliltriolglucósido de forma provisional (!g/g de peso fresco) mediante LC-MS: � 1 39 24 38

linalol relacion enantiomerica (R:S) mediante MDGC-MS: 74:26 5:9 5 5:95 1:99

linalol unido glucosídicamente relacion enantiomerica mediante MDGC-MS: 96:4 1:99 2:98 1:99

5 Ejemplo 11. Efectos de los cambios en la dirección de terpenoides y GPP y FPP sintasas

El ejemplo 10 muestra que los inventores fueron capaces de producir grandes cantidades de monoterpenos en una gama de diferentes especies, y que no es necesario introducir una GPP sintasa, a diferencia de lo reivindicado en el documento WO 0022150. Sin embargo, la produccion de sesquiterpenos en plantas transgenicas demostro ser

10 dificil, tal como ha sido descrito por varios autores mas(Wallaart y otros, Planta 212: 460-465, 2001; Hohn y Ohlrogge, Plant Physiol 97: 460-462, 1991).

Por lo tanto, el efecto de introducir un gen adicional que codifica una FPP sintasa en plantas de tipo silvestre o plantas q ue ya sobr e-expresan u na s esquiterpeno sint asa so bre la produccion d e sesqu iterpeno se e xamino 15 utilizando plantas de Arabidopsis thaliana (ecotipo Columbia). Se introdujeron dos genes de dos maneras, mediante co-transformacion de d os v ectores b inarios qu e alojan l os difer entes g enes o retran sformando una p lanta ya transformada con un unico gen, y seleccionando en un nuevo marcador seleccionable (higromicina en lugar de kanamicina que se utilizo en la transformacion del primer gen). Los genes individuales incluian una FPP sintasa de fresa que codifica una proteina citosolica (FPPS), FPP sintasa con una senal de direccion al plasto (TARFPPS) y un

20 gen de germacreno A sintasa (GERA, sesquiterpeno sintasa) que se aislo de achicoria (PCT/EP 0002130). La cotransformacion se realizo con las siguientes combinaciones de genes:

1.: FPPS y un H64NORS localizado en el plasto (H64TAR)

2.: TARFPPS y H64TAR

3.: FPPS y H64NORS (citosolico)

4.: FPPS y GERA.

Para evitar problemas con la introduccion del plasmido que contiene H64NORS en Agrobacterium (vease el ejemplo 8) se introdujo un intron en el gen H64NORS que no puede ser procesado por las bacterias pero puede ser procesado por la planta. La combinacion de FPP sintasa citosolica y una sesquiterpeno sintasa plastidica se realizo para comprobar si la reserva de FPP en los plastos puede aumentar mediante transporte desde el citosol a los plastos. Una serie de lineas de progenie autoalimentadas de una linea que produce gran cantidad de linalol y nerolidol debido a la introduccion de un H64NORS (H64TAR) plastidico tambien se co-transformaron con los genes FPPS y TARFPPS. El analisis por GC-MS de las plantas transgenicas resultantes mostro que la co-expresion de una FPP sintasa citosolica y sesquiterpeno sintasa citosolica mejora enormemente la produccion de los sesquiterpenos nerolidol (combinacion 3) y germacr eno A (combinacion 4). Adem as, la so bre-expresion de una FPP sintas a citosolica mejoro la produccion de nerolidol en el caso del H64NORS dirigido al plasto (combinacion 1). La coexpresion de una FPP sintasa yH64NCRS en los plastos (combinacion 2) dio como resultado niveles apreciables tanto de l inalol como d e n erolidol. Esto muestra qu e es posi ble incrementar l a bi osintesis de s esquiterpeno (transgenico) en el citosol, mejora ndo la disp onibilidad del sustrato y que es posible dirigir la biosintes is de sesquiterpeno a otros compartimentos diferentes del citosol.

Ejemplo 12. Plantas transgénicas con control biológico de plagas mejorado

Se ha descrito que el linalol y el nerolidol, y su derivado 4,8-dimetil-1,3(E),7-nonatrieno desempenan un importante papel en la atraccion de depredadores de una variedad de plagas de insectos y aranuelas por un gran numero de cultivos. Las secuencias descritas en la presente invencion pueden utilizarse como marcadores para la seleccion de especies cultivadas, tales como maiz, algodon, manzana y pepino, y cualesquiera otros cultivos que emplean este mecanismo de defensa indirecto, con produccion mejorada de compuestos volatiles, que atraen a depredadoresen respuesta a plagas que se alimentan de ellos. Ademas, la presente invencion puede utilizarse para fabricar plantas transgenicas con una capacidad de senalizacion mejorada. Aqui, las secuencias de ADN se colocan bajo el control de un promotor inducible, tal como promotores inducibles por heridas o inducibles especificos. Este ultimo tipo de promotores se aislan de plantas de las que se alimentaban por ejemplo aranuelas o insectos. Los promotores inducibles por aranuelas pueden aislarse, por ejemplo, de pepino o judia de lima. Estas especies vegetales han demostrado reaccionar fuertemente a la alimentacion por parte de aranuelas con la produccion de compuestos de senalizacion v olatiles (Bo uwmeester y otr os, 199 9). Se preparan bibliotecas s ustractivas (reg uladas pos itiva y negativamente) a partir de material vegetal no infestado (control) e infestado utilizando el kit de sustraccion de ADNc PCRSelectTM (Clontech), y la expresion de los ADNc en estas bibliotecas sustractivas se comprueba utilizando tecnologia de micro-matriz de ADNc (vease por ejemplo Aharoni y otros, 2000) utilizado ARNm de materiales vegetales infestados por aranuelas de control y tratados con JA (acido jasmonico) como sondas para la hibridacion. Los ADNc regulados se secuenciaran, y se someteran al programa BLAST para deducir su identidad. Los ADNc de longitud completa de genes interesantes, fuertemente regulados, se obtienen utilizando la tecnologia de PCR RACE,

o cribando una biblioteca de ADNc. Los ADNc de longitud completa interesantes se caracterizan por su perfil de expresion por utiliz ar e xpresion heterologa o tra nsformacion d e p lantas modelos. Los pr omotores de genes fuertemente regulados (positivamente) se aislan utilizando el kit Genome WalkerTM (Clontech).

Tal como se ha mencionado anteriormente, las secuencias de ADN de la presente invencion se colocan bajo el control d e pr omotores i nducibles por h eridas o l os promotores a islados a decuados especific os (de teji do) (inducibles), y se utilizan para la transformacion de cultivos, en los q ue el control biologico es permitido por la produccion de comp uestos de s enalizacion vo latiles i nducibles, tal es como pepino, maiz y al godon, utiliz ando protocolos publicados. La transformacion de pepino se lleva a cabo utilizando un protocolo para la transferencia de genes y la regeneracion de pepino, tal como lo ha desarrollado una compania de semillas holandesa.

La respuesta alterada de las plantas transgenicas se determina utilizando plantas transgenicas y de control tratadas con acido jasmonico e i nfestadas con aranuelas o gardama. La produccion de volatiles se determina utilizando atrapamiento de la cam ara volatil y analisis por GC -MS (Bou wmeester y otros, 19 99). La resp uesta de los respectivos depredadores se determina utilizando estudios comportamentales utilizando un olfatometro de tubo en � (por ejemplo, Takabayashi y otros, J. Chem. Ecol. 20(2), 373-385, 1994). La Arabidopsis transgenica del ejemplo 10 demostro producir grandes cantidades de linalol y cantidades menores de nerolidol. En un experimento en un tubo en �, ac aros depredadores hambrientos (Phytoseiulus persimilis) demostraron preferir marcadamente las plantas que producen linalol/nerolidol:

El 70% de los acaros depredadores ensayados preferia la Arabidopsis transgenica por encima del tipo silvestre.

Ejemplo 13. Efectos de la expresión de linalol y nerolidol sobre la resistencia a microorganismos

Varias especies vegetales que expresan el gen de H64NORS y que producen niveles elevados de linalol y nerolidol

5 se ana lizaron para resist encia a inf ecciones micro biana por mil diu pulv erulento y Phytophthora infestans. Se observaron efectos claros en hojas y frutos que muestran que los datos in vitro presentados en el ejemplo 7 son predictivos de los datos in vivo en plantas transgenicas.

Petunia y mildiu pulverulento

10 Se cultivaron plantas de tomate transformadas (control (vector vacio) y homocigotica transgenica para el rasgo) a partir de semillas en un pequeno invernadero en condiciones controladas identicas (n=30). A las pl antas se les inoculo con e sporas de mildiu pulv erulento (Elysiphe cichoracearum). Desp ues de 4 sema nas, l as pla ntas se valoraron para la infeccion. Los resultados indican que la presencia de linalol protegiaa las plantas de la infeccion

15 por mildiu (Tabla 2).

Tabla 2. Infección de plantas de Petunia que producen linalol de tipo silvestre y transgénicas con mildiú pulverulento

Severam: ente infectadas Moderadamente infectadas (hojas mas bajas, mas viejas) Limpias

Vector vacio de control: 75% - 25%

Homocigotica para linalol: - 10% 90%

20 Tomate y Phytophthora infestans

Se recogieron frutos verdes de diversas lineas de tomateMicrotom transgenicas homocigoticas. Anteriormente, estas lineas se habian caracterizado para el contenido de linalol mediante destilacion con vapor y GC-MS. A diez bayas diferentes de cada linea transgenica se les inoculo pinchando la parte superior del fruto con un palillo 25 sumergido en una suspension de 10.000 esporangios/ml de Phytophthora infestans 1P0428-2. Despues de 7 dias, los frutos se valoraron para el niv el de i nfeccion (T abla 3). Cas i tod os los frutos afectados s e habian vu elto completamente grises/ negros justo d ebajo de l a pi el. L os frutos se v aloraron c omo limpi os si n o prese ntaban infeccion en absoluto. Se observo una fuerte correlacion entre un alto nivel de expresion de linalol y un bajo porcentaje de bayas afectadas. Los frutos transgenicos con altos niveles de linalol permanecieron en gran medida

30 libres de infeccion

Tabla 3. Relación entre la producción de linalol y la infección por Phytophthora infestans de frutos verdes para diferentes líneas transgénicas.

Linea de tomate: % de bayas afectadas Cantidad de linalol (unidades arbitrarias)

control 60: 465

1A 70: 2.000

1C 50: 3.778

1B 30: 22.989

1BA 10: 18.125

35 Patata y Phytophthora infestans

Se analizaron lineas transgenicas de patata que expresan el gen de H64NORS en dos construcciones diferentes (H64NOR y H64TAR), para la produccion de linalol y nerolidol en la camara volatil utilizando una fibra SPME y GC

40 MS. La construccion H64NOR no produjo produccion de nerolidol o linalol por encima del trasfondo presente en la patata, mientras que la construccion H64TAR dio niveles muy altos de linalol y niveles bajos de nerolidol en la camara volatil. Ambos conjuntos de plantas se ensayaron para la resistencia a Phytophthora infestans inoculando a 5 hojas desprendidas en 2 replicados con suspensiones de esporas y valorando el area de la lesion, el crecimiento de la lesion yla esporulacion (Tabla 4). Se observo una correlacion muy fuerte entre altos niveles de expresion de

45 linalol y un crecimiento de la lesion y una esporulacion fuertemente reprimidos o ausentes.

Tabla 4. Efecto de diferentes construcciones sobre la produccion de linalol y el crecimiento de lesiones y la esporulacion de Phytophthora infestans

Construccion Lin: transgenica del genotipo de patata ea 1�rea de la lesion (mm2) 1Tasa de crecimiento de la lesion (LGR: mm/dia) t5-7 dpi 1Esporulacion (7 dpi) Linalol (x102 unidades arb.) (5 min/medicion)

H64NOR I5: 271 4,2 1,4 625

I12 506: 7.7 2,8 1125

I20 294: 5,2 2 1275

I23 456: 8,0 2,6 1150

I27 574: 8,5 3,4 3750

I30 458: 7,0 2,3 1675

H64TAR T: 1 0 0 0 163000

T9 79: 1,6 0,8 390000

T13 123: 3,7 0,8 152000

T24 143: 2,3 0,8 390000

T29 0: 0 0 157000

T31 0: 0 0 229000

1 Cinco hoj as por ge notipo fueron inoculadas, cada una, con 1 gota de u n inoculo de 10 microlitros p or hoja (IPO428-2, 50000 esporangios/ml) y fueron valoradas para el ar ea de la lesi on, el c recimiento y la esporulacion (valor visual en una escala de 0-4) en los dias post-infeccion (dpi) indicados

La figura 30 combina los datos de la tabla 1 y 4. Las figuras 30A, B y C dan a conocer la correlacion en el tamano de

5 la lesi on, la t asa de crec imiento d e la le sion y la es porulacion, resp ectivamente, del aisl ado de Phytophthora infestans IPO 428-2 re presentado co ntra el c ontenido de linalol, 8-hidroxilinalol, l inaloltriol, linalilglucosido, 8hidroxilinalilglucosido ylinaliltriolglucosido de las lineas transgenicas de patata T o TM-9, T-13, T-29 y una linea de control. Los datos de control de la tabla 4 sobre el crecimiento fungico y la esporulacion se tomaron como los valores promedio de las plantas H64NOR (lineas I) con niveles aumentados despreciables de linalol, nerolidol o derivados.

10 En la tecnica, se sabe que los datos de linalol (derivado) dados a conocer en la tabla 1 son mucho mas fiables y cuantitativos que los datos de SPME sobre linalol en la tabla 4, lo que justifica su utilizacion preferente. La figura 30 demuestra una fuerte correlacion de dosis-efecto de los niveles de linalol (derivados) producido en patata con los niveles de resistencia. Con altos niveles de expresion de terpeno, se obtuvo claramente una completa resistencia a infeccion por Phytophthora infestans. Ademas, la figura 30D da a conocer los datos in vitro sobre la sensibilidad del

15 aislado de Phytophthora infestans 1P0428-2, que se utili zo para los e xperimentos in planta, a lina lol puro en e l medio, tal como se describe en el ejemplo 9. A partir de la comparacion de los datos in vitro con los datos in planta de la figura 30, queda claro que las cantidades producidas in planta estan en el mismo intervalo que las cantidades requeridas in vitro para afectar al crecimiento del micelio. No queda claro, sin embargo, si el alcohol y glucosido formados de forma natural derivados de linalol son activos de forma similar para inhibir el crecimiento fungico que las

20 formas de linalol libres no derivadas y pueden contribuir al efecto de linalol libre de manera fundamental.

Ejemplo 14. Efecto de la expresión de linalol y nerolidol sobre la resistencia a insectos

Arabidopsis thaliana y Myzus persicae

25 Una linea de Arabidopsis thaliana transformada con la construccion H64TAR se caracterizo para tener una unica insercion genica mediante transferencia de Southern, altos niveles en la camara volatil de linalol y bajos niveles en la camara volatil de nerolidol (ejemplo 10). Esta linea se selecciono y se autoalimento. Las semillas autoalimentadas se sembraron y se analizaron plantas jovenes, no en floracion en busca de los niveles de linalol en la camara volatil

30 utilizando analisis SPME GC-MS (ej emplo 1 0). Se uti lizaron pl antas homocigoticas y h eterocigoticas co n altos niveles de linalol en un bioensayo con adultos hembra de Myzus persicae para observar efectos repelentes o disuasorios de la expresion de linalol (Tabla 5). Para cada experimento, se tomaron doshojas de la planta, una de un control yuna de una planta con linalol y se sumergieron una cerca de la otra en agar-agua gelificante de una pequena placa de Petri. Se colocaron diez hembras adultas en el interior de la tapa de la placa de Petri. Despues de

35 tiempos preseleccionados, el numero de adultos en cada una de las hojas, se registro. Un efecto disuasorio era visible con el tiempo. Inicialmente, los afidos no mostraban preferencia alguna, pero despues de 2 dias se observo una distribucion muy significativa en la cualel 62% estaban enplantas decontrol y el 38% estaban en plantas de linalol. Esto indica que linalol y/o nerolidol son potenciales disuasorios o repelentes de insectos en plantas que pueden expresar altos niveles de estos compuestos.

Tabla 5. Efecto de la producción de linalol en Arabidopsis transgénica sobre la elección de áfidos.

Tiempo despues de la inoculacion (horas): �fidos en A. thaliana de control (%) �fidos en linea de A. thaliana que expresa linalol (%) Significacion (valor P, test t)

0,25 50: 50 0,47

1 52: 47 0,31

4 58: 41 0,05

20 56: 43 0,09

24 57: 42 0,2

26 59: 40 0,11

45 62: 37 0,003

Secuencias

5 Nota: Secuencia de aci do nucleico (A); Traduccion de l a secuencia de acido nucleico de A (B) o si la secuenc ia contiene un intron: (A) Secuencia de acido nucleico que incluye un intron; (B) Secuencia de acido nucleico de (A) que excluye un intron; (C) Traduccion de acido nucleico de (B).

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 1A (H64NORL)

10 CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 1874 TIPO: ADNc TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal

15 OTRA INFORMACIÓN: LINALOL/NEROLIDOL SINTASA DE FRESA CULTIVADA DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 1A

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 1B (H64NORL)

CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:

5 LONGITUD: 519

TIPO: Péptido

TIPO DE CADENA: Sencilla

TOPOLOG�?A: Lineal

OTRA INFORMACIÓN: LINALOL/NEROLIDOL SINTASA DE FRESA CULTIVADA10 DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 1B

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 2A (H64NORS) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 1631

15 TIPO: ADNc TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: LINALOL/NEROLIDOL SINTASA DE FRESA CULTIVADA

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 2B (H64NORS)

5 CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 519 TIPO: Péptido TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal

10 OTRA INFORMACIÓN: LINALOL/NEROLIDOL SINTASA DE FRESA CULTIVADA

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 2B

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 3A (H64MUT)

CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:

5 LONGITUD: 1874

TIPO: ADNc

TIPO DE CADENA: Sencilla

TOPOLOG�?A: Lineal

OTRA INFORMACIÓN: LINALOL/NEROLIDOL SINTASA DE FRESA CULTIVADA10 ESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 3A

5 INFORMACIÓN PARA EL Nº: 3B (H64MUT) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 552 TIPO: Péptido TIPO DE CADENA: Sencilla

10 TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: LINALOL/NEROLIDOL SINTASA DE FRESA CULTIVADADESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 3B

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 4A (H64VES)

15 CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 1894 TIPO: ADNc TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: LINALOL/NEROLIDOL SINTASA DE FRESA SILVESTRE DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 4A

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 4B (H64VES) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 580

5 TIPO: Péptido TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: LINALOL/NEROLIDOL SINTASA DE FRESA SILVESTRE DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 4B

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 5A (H64NORD1/W155) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 333 TIPO: ADN genómico

15 TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: fragmento de PCR del 5’ de H64 de fresa cultivada. Incluye codón de terminación y un intrón.DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 5A

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 5B (H64NORD1/W155) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 240 TIPO: ADN genómico

25 TIPO DE CADENA: Sencilla

TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: fragmento de PCR del 5’ de H64 de fresa cultivada. Codón de terminación modificado e intrón eliminado. DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 5B

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 5C (H64NORD1/W155) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 68 TIPO: Péptido

10 TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: fragmento de PCR del 5’ de H64 de fresa cultivada. Codón de terminación modificado e intrón eliminado y fragmento traducido.DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 5C

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 6A (H64NORU1/W151) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 392 TIPO: ADN genómico

20 TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: fragmento de PCR del 5’ de H64 de fresa cultivada. Incluye codón de terminación y un intrón.DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 6A

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 6B (H64NORU1/W151) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 300 TIPO: ADN genómico

30 TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: fragmento de PCR del 5’ de H64 de fresa cultivada. Codón de terminación modificado e intrón eliminado. DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 6B

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 6C (H64NORU1/W151) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 88

5 TIPO: Péptido TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: fragmento de PCR del 5’ de H64 de fresa cultivada. Codón de terminación modificado e intrón eliminado y fragmento traducido

10 DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 6C

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 7A (H64NORU2/UP3) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 350

15 TIPO: ADN genómico TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: fragmento de PCR del 5’ de H64 de fresa cultivada. Incluye codón de terminación y un intrón.

20 DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 7A

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 7B (H64NORU2/UP3) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 258

25 TIPO: ADN genómico TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: fragmento de PCR del 5’ de H64 de fresa cultivada. Codón de terminación modificado e intrón eliminado.

30 DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 7B

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 7C (H64NORU2/UP3)

CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:

5 LONGITUD: 74

TIPO: Péptido

TIPO DE CADENA: Sencilla

TOPOLOG�?A: Lineal

OTRA INFORMACIÓN: fragmento de PCR del 5’ de H64 de fresa cultivada. 10 Codón de terminación modificado e intrón eliminado y fragmento traducido

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 7C

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 8A (H64NORU3/UP16)

CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: 15 LONGITUD: 367

TIPO: ADN genómico

TIPO DE CADENA: Sencilla

TOPOLOG�?A: Lineal

OTRA INFORMACIÓN: fragmento de PCR del 5’ de H64 de fresa cultivada. 20 Incluye un intrón.

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 8A

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 8B (H64NORU3/UP16) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:

25 LONGITUD: 277 TIPO: ADN genómico TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: fragmento de PCR del 5’ de H64 de fresa cultivada.

30 Intrón eliminado. DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 8B

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 8C (H64NORU3/UP16)CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:

LONGITUD: 80 TIPO: Péptido TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: fragmento de PCR del 5’ de H64 de fresa cultivada. Intrón eliminado y fragmento traducidoDESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 8C

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 9A (H64NORU4/UP1)

10 CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 357 TIPO: ADN genómico TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal

15 OTRA INFORMACIÓN: fragmento de PCR del 5’ de H64 de fresa cultivada. Incluye un intrón.DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 9A

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 9B (H64NORU4/UP1)

20 CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 267 TIPO: ADN genómico TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal

25 OTRA INFORMACIÓN: fragmento de PCR del 5’ de H64 de fresa cultivada. Intrón eliminado. DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 9B

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 9C (H64NORU4/UP1)

30 CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 77 TIPO: Péptido TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal

35 OTRA INFORMACIÓN: fragmento de PCR del 5’ de H64 de fresa cultivada. Intrón eliminado y fragmento traducidoDESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 9C

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 10A (SOSA/WS) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 1672

5 TIPO: ADNc TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: OLEFINA SINTASA DE FRESA CULTIVADA. INCLUYE UN CODÓN DE TERMINACIÓN.

10 DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 10A

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 10B (SOSA/WS)

CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:

5 LONGITUD: 254

TIPO: Péptido

TIPO DE CADENA: Sencilla

TOPOLOG�?A: Lineal

OTRA INFORMACIÓN: OLEFINA SINTASA DE FRESA CULTIVADA. 10 DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 10B

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 10C (SOSA/WS) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 554

15 TIPO: Péptido TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: OLEFINA SINTASA DE FRESA CULTIVADA. Deleción de la inserción CC

20 DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 10C

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 11A (SOSA/MA) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 2605

25 TIPO: ADNc TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: OLEFINA SINTASA DE FRESA CULTIVADA. INCLUYE UN CODÓN DE TERMINACIÓN. DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 11A

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 11B (SOSA/MA)

5 CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 255 TIPO: Péptido TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal

10 OTRA INFORMACIÓN: OLEFINA SINTASA DE FRESA CULTIVADA. DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 11B

INFORMACIÓN PARA EL Nº:11C (SOSA/MA) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:

15 LONGITUD: 555 TIPO: Péptido TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: OLEFINA SINTASA DE FRESA CULTIVADA.

20 Deleción de la inserción CC. DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 11C

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 12A (SOSV)CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 1973 TIPO: ADNc TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: OLEFINA SINTASA DE FRESA SILVESTRE DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 12A

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 12B (SOSV) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 556 TIPO: Péptido TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: OLEFINA SINTASA DE FRESA SILVESTRE DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 12B

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 13A (SOSV1/W76) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 289 TIPO: ADN genómico

TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: Fragmento de PCR en ADN genómico de fresa silvestre. Incluyendo un intrón. DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 13A

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 13B (SOSV1/W76) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 204 TIPO: ADN genómico

10 TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: Fragmento de PCR en ADN genómico de fresa silvestre. No incluyendo un intrón. DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 13B

15 INFORMACIÓN PARA EL Nº: 13C (SOSV1/W76) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 67 TIPO: Péptido TIPO DE CADENA: Sencilla

20 TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: Traducción de un fragmento de PCR en ADN genómico de fresa silvestre.DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 13C

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 14A (SOSV2/W93)

25 CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 289 TIPO: ADN genómico TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal

30 OTRA INFORMACIÓN: Fragmento de PCR en ADN genómico de fresa silvestre. Incluyendo un intrón. DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 14A

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 14B (SOSV2/W93)

CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:

5 LONGITUD: 204

TIPO: ADN genómico

TIPO DE CADENA: Sencilla

TOPOLOG�?A: Lineal

OTRA INFORMACIÓN: Fragmento de PCR en ADN genómico de fresa silvestre. No incluyendo un intrón. 10 DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 14B INFORMACIÓN PARA EL Nº: 14C (SOSV2/W93) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 67

15 TIPO: Péptido TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: Traducción de un fragmento de PCR en ADN genómico de fresa silvestre

20 DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 14C INFORMACIÓN PARA EL Nº: 15A (SOSV3/W9O) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 300

25 TIPO: ADN genómico TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: Fragmento de PCR en ADN genómico de fresa silvestre. Incluyendo un intrón. DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 15A

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 15B (SOSV3/W9O) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 204 TIPO: ADN genómico

35 TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: Fragmento de PCR en ADN genómico de fresa silvestre. No incluyendo un intrón. DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 15B

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 15C (SOSV3/W90) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 67

5 TIPO: Péptido TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: Traducción de un fragmento de PCR en ADN genómico de fresa silvestre

10 DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 15C

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 16A (SOSV4/W79) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 289

15 TIPO: TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: Fragmento de PCR en ADN genómico de fresa silvestre. Incluyendo un intrón. DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 16A

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 16B (SOSV4/W79) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 204 TIPO: ADN genómico

25 TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: Fragmento de PCR en ADN genómico de fresa silvestre. No incluyendo un intrón.DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 16B

30 INFORMACIÓN PARA EL Nº: 16C (SOSV4/W79) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 67 TIPO: Péptido TIPO DE CADENA: Sencilla

35 TOPOLOG�?A: Lineal

OTRA INFORMACIÓN: Traducción de un fragmento de PCR en ADN genómico de fresa silvestre DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 16C

5 INFORMACIÓN PARA EL Nº: 17A (SOSV5/W84) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 300 TIPO: ADN genómico TIPO DE CADENA: Sencilla

10 TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: Fragmento de PCR en ADN genómico de fresa silvestre. Incluyendo un intrón. DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 17A

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 17B (SOSV5/W84)

15 CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 204 TIPO: ADN genómico TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal

20 OTRA INFORMACIÓN: Fragmento de PCR en ADN genómico de fresa silvestre. No incluyendo un intrón. DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 17B

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 17C (SOSV5/W84) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA:

25 LONGITUD: 67 TIPO: Péptido TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: Traducción de un fragmento de PCR en

30 ADN genómico de fresa silvestre DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 17C

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 18A (SOSA1/W66)

CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: 35 LONGITUD: 291

TIPO: ADN genómico

TIPO DE CADENA: Sencilla

TOPOLOG�?A: Lineal

OTRA INFORMACIÓN: Fragmento de PCR en ADN genómico de fresa cultivada. Incluyendo un intrón y una

inserción CC. DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 18A

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 18B (SOSA1/W66)

5 CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 206 TIPO: ADN genómico TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal

10 OTRA INFORMACIÓN: Fragmento de PCR en ADN genómico de fresa cultivada. No incluyendo un intrón. Incluyendo una inserción CC. DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 18B

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 18C (SOSA1/W66)

15 CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 67 TIPO: Péptido TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal

20 OTRA INFORMACIÓN: Traducción de un fragmento de PCR en ADN genómico de fresa cultivada. Inserción CC delecionada DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 18C

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 19A (SOSA2/W68)

25 CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 296 TIPO: ADN genómico TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal

30 OTRA INFORMACIÓN: Fragmento de PCR en ADN genómico de fresa cultivada. Incluyendo un intrón. DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 19A

INFORMACIÓN PARA EL Nº: 19B (SOSA2/W68)

CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 204 TIPO: ADN genómico TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�?A: Lineal OTRA INFORMACIÓN: Fragmento de PCR en ADN genómico de fresa cultivada. No incluyendo un intrón. DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA PARA EL Nº: 19B

INFORMACI�N PARA EL N°: 19C (SOSA2/W68)

10 CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 67 TIPO: Peptido TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�A: Lineal

15 OTRA INFORMACI�N: Traduccion de fragmento de PCR en ADN genomico de fresa cultivada. DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA PARA EL N°: 19C

INFORMACI�N PARA EL N°: 20A (SOSA3/W46)

CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: 20 LONGITUD: 298

TIPO: ADN genomico

TIPO DE CADENA: Sencilla

TOPOLOG�A: Lineal

OTRA INF ORMACI�N: F ragmento de P CR e n ADN gen omico d e fresa c ultivada. Incl uyendo u n i ntron. 25 DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA PARA EL N°: 20A

INFORMACI�N PARA EL N°: 20B (SOSA3/W46) CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 204

30 TIPO: ADN genomico TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�A: Lineal OTRA INFORMACI�N: Fragmento de PCR en ADN genomico de fresa cultivada. No incluyendo un intron. DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA PARA EL N°: 20B

INFORMACI�N PARA EL N°: 20C (SOSA3/W46) CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 67 TIPO: Peptido TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�A: Lineal OTRA INFORMACI�N: Traduccion de fragmento de PCR en ADN genomico de fresa cultivada. DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA PARA EL N°: 20C

10 INFORMACI�N PARA EL N°: 21A (SOSA4/W59) CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 296 TIPO: ADN genomico TIPO DE CADENA: Sencilla

15 TOPOLOG�A: Lineal OTRA INF ORMACI�N: F ragmento de P CR e n ADN gen omico d e fresa c ultivada. Incl uyendo u n i ntron. DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA PARA EL N°: 21A

INFORMACI�N PARA EL N°: 21B (SOSA4/W59)

20 CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 204 TIPO: ADN genomico TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�A: Lineal

25 OTRA INFORMACI�N: Fragmento de PCR en ADN genomico de fresa cultivada. No incluyendo un intron. DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA PARA EL N°: 21B

INFORMACI�N PARA EL N°: 21C (SOSA4/W59)

CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: 30 LONGITUD: 67

TIPO: Peptido

TIPO DE CADENA: Sencilla

TOPOLOG�A: Lineal

OTRA INFORMACI�N: Traduccion de fragmento de PCR en ADN genomico de fresa cultivada. 35 DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA PARA EL N°: 21C

INFORMACI�N PARA EL N°: 22A (SOSA5/W74) CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 296

40 TIPO: ADN genomico TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�A: Lineal OTRA INF ORMACI�N: F ragmento de P CR e n ADN gen omico d e fresa c ultivada. Incl uyendo u n i ntron. DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA PARA EL N°: 22A

INFORMACI�N PARA EL N°: 22B (SOSA5/W74) CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 204 TIPO: ADN genomico

10 TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�A: Lineal OTRA INF ORMACI�N: F ragmento de P CR en A DN genomico de fresa cultiv ada. No incl uyendo u n intro n. DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA PARA EL N°: 22B

15 INFORMACI�N PARA EL N°: 22C (SOSA5/W74) CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 67 TIPO: Peptido TIPO DE CADENA: Sencilla

20 TOPOLOG�A: Lineal OTRA INFORMACI�N: Traduccion de fragmento de PCR en ADN genomico de fresa cultivada. DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA PARA EL N°: 22C

INFORMACI�N PARA EL N°: 23A (SOSA6/W56)

25 CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 302 TIPO: ADN genomico TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�A: Lineal

30 OTRA INF ORMACI�N: F ragmento de P CR e n ADN gen omico d e fresa c ultivada. Incl uyendo u n i ntron. DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA PARA EL N°: 23A

INFORMACI�N PARA EL N°: 23B (SOSA6/W56)

CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

5 LONGITUD: 204

TIPO: ADN genomico

TIPO DE CADENA: Sencilla

TOPOLOG�A: Lineal

OTRA INFORMACI�N: Fragmento de PCR en ADN genomico de fresa cultivada. No incluyendo un intron. 10 DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA PARA EL N°: 23B

INFORMACI�N PARA EL N°: 23C (SOSA6/W56) CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 67

15 TIPO: Peptido TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�A: Lineal OTRA INFORMACI�N: Traduccion de fragmento de PCR en ADN genomico de fresa cultivada. No incluyendo un intron.

20 DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA PARA EL N°: 23C

INFORMACI�N PARA EL N°: 24A (SOSA7/W61) CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 302

25 TIPO: ADN genomico TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�A: Lineal OTRA INFORMACI�N: Fragmento de PCR en ADN genomico de fresa cultivada. Incluyendo un intron. DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA PARA EL N°: 24A

INFORMACI�N PARA EL N°: 24B (SOSA7/W61) CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 204 TIPO: ADN genomico

35 TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�A: Lineal OTRA INFORMACI�N: Fragmento de PCR en ADN genomico de fresa cultivada. No incluyendo un intron. DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA PARA EL N°: 24B

INFORMACI�N PARA EL N°: 24C (SOSA7/W61)

5 CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 67 TIPO: Peptido TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�A: Lineal

10 OTRA INFORMACI�N: Traduccion de fragmento de PCR en ADN genomico de fresa cultivada. DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA PARA EL N°: 24C

INFORMACI�N PARA EL N°: 25A (H64TAR2)

CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: 15 LONGITUD: 1665

TIPO: ADNc

TIPO DE CADENA: Sencilla

TOPOLOG�A: Lineal

OTRA INFORMACI�N: LINALOL/NEROLIDOL SINTASA DE FRESA CULTIVADA CON SE�AL DIANA 20 DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA PARA EL N°: 25A

INFORMACI�N PARA EL N°: 25B (H64TAR2)

CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

5 LONGITUD: 554

TIPO: Peptido

TIPO DE CADENA: Sencilla

TOPOLOG�A: Lineal

OTRA INFORMACI�N: LINALOL/NEROLIDOL SINTASA DE FRESA CULTIVADA CON SE�AL DIANA 10 DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA PARA EL N°: 25B

INFORMACI�N PARA EL N°: 26A (H64TAR6) CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 1665

15 TIPO: ADNc TIPO DE CADENA: Sencilla

TOPOLOG�A: Lineal OTRA INFORMACI�N: LINALOL/NEROLIDOL SINTASA DE FRESA CULTIVADA CON SE�AL DIANA DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA PARA EL N°: 26A

INFORMACI�N PARA EL N°: 26B (H64TAR6) CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 554 TIPO: Peptido TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�A: Lineal OTRA INFORMACI�N: LINALOL/NEROLIDOL SINTASA DE FRESA CULTIVADA CON SE�AL DIANA DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA PARA EL N°: 26B

INFORMACI�N PARA 27A (H64TAR4)

CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: 10 LONGITUD: 1865 bases

TIPO: ADNc

TIPO DE CADENA: Sencilla

TOPOLOG�A: Lineal

OTRA INFORMACI�N: LINALOL/NEROLIDOL SINTASA DE FRESA CULTIVADA CON SE�AL DIANA 15 DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA PARA: 27A

INFORMACI�N PARA 27B (H64TAR4)

CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

5 LONGITUD: 578 aminoacidos

TIPO: Peptido

TIPO DE CADENA: Sencilla

TOPOLOG�A: Lineal

CTHER INFORMATION: LINALCCL/NEROLIDOL SINTASA DE FRESA CULTIVADA CON SE�AL DIANA 10 DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA PARA: 27B

INFORMACI�N PARA: 28A (H64NORL)

CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

5: LONGITUD: 2277 bases

TIPO: ADN genomico

TIPO DE CADENA: Sencilla

TOPOLOG�A: Lineal

OTRA INFOR MACI�N: FRAGMENTO DE ADN GEN�MICO: DE LINALCOL/NEROLIDOL SINT ASA DE FRESA

10: CULTIVADA

DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA PARA: 28A

INFORMACI�N PARA 29 (El) CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 227 bases TIPO: ADN genomico TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�A: Lineal CTHER INFORMATION: Fragmento de PCR en ADN genomico de ambos lados de los residuos de metionina DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA PARA: 29A

INFORMACI�N PARA: 29B (E1) CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 64 aminoacidos TIPO: Peptido

15 TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�A: Lineal CTHER INFORMATION: Fragmento de PCR en ADN genomico de ambos lados de los residuos de metionina DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA PARA: 29B

20 INFORMACI�N PARA: 30A (E2) CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 201 bases

TIPO: ADN genomico TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�A: Lineal OTRA INF ORMACI�N: F ragmento d e PCR en ADN genomico d e ambos l ados de los resi duos de metion ina DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA PARA 30A

INFORMACI�N PARA: 31A (E3) CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 141 bases TIPO: ADN genomico

10 TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOG�A: Lineal OTRA INFORMACI�N: Fragmento de PCR en ADN genomico de ambos lados de los residuos de metionina DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA PARA: 31A

Claims

REIVINDICACIONES

1.

�cido nucleico, o fragmento funcional del mismo, que codifica una molecula de naturaleza proteica, en el que dicha molecula de naturaleza proteica es capaz de sintetizar, como minimo, un alcohol monoterpenico linalol cuando se pone en contacto con geranil difosfato (GPP) y, como minimo, un alcohol sesquiterpenico nerolidol cuando se pone en contacto con farnesil difosfato (FPP) en condiciones apropiadas, en el que dicho acido nucleico codifica una molecula de naturaleza proteica, que comprende una secuencia de aminoacidos o fragmento funcional de la misma que es, como minimo, el 50% identica a la secuencia H64MUT, tal como se muestra en la figura 2, o un fragmento funcional de la misma, preferentemente el 70% identica, mas preferentemente el 80% identica, mas preferentemente el 90% identica, mas preferentemente el 95% identica, y de la forma mas preferente el 99% identica.
2.

�cido nucleico, segun la reivindicacion 1, en el que dicho acido nucleico codifica una molecula de naturaleza proteica que comprende una secuencia de aminoacidos o fragmento funcional de la misma que es identica a la secuencia H64MUT, tal como se muestra en la figura 2, o la secuencia H64NORS, tal como se muestra en la figura 2, o la secuencia H64VES, tal como se muestra en la figura 2, o un fragmento funcional de la secuencia H64MUT, H64NORS o H64VES.
3.

Secuencia de acido nucleico, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que puede obtenerse de un eucariota, preferentemente una planta, mas preferentemente fresa.
4.

Secuencia de acido nucleico, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-3, provista de un aci do nucleico que codifica una senal de direccion a plastos o un acido nucleico que codifica una senal de direccion a mitocondrias.
5.

�cido nucleico, segun cualquiera de las r eivindicaciones 1-4, que codif ica una molecula de naturaleza proteica capaz de la sintesis de un compuesto bioactivo isoprenoide en el citosol, plasto o mitocondria en una celula, cuando se le suministra un sustrato adecuado en condiciones de reaccion apropiadas.
6.

Vector que comprende un acido nucleico, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
7.

Huesped transgenico que comprende un acido nucleico, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o un vector, segun la reivindicacion 6.
8.

Huesped transgenico, segun la reivindicacion 7, en el que dicho huesped expresa una nerolidol sintasa/ciclasa o una monoterpeno sintasa/ciclasa.
9.

Huesped transgenico, segun la reivindicacion 7 u 8, en el que dicho huesped es una planta o material de propagacion obtenido de la misma.
10.

Metodo para producir un sabor, fragancia y/o agente de control biologico que comprende, a) transformar o transfectar un huesped adecuado con, como minimo, un acido nucleico, segun cualquiera de las reivindicaciones 15, o un vector, segun la reivindicacion 6; b) expresar dicho acido nucleico en presencia de un sustrato adecuado.
11.

Metodo, segun la reivindicacion 10, que comprende, ademas, la etapa c) de aislar el producto formado.
12.

Metodo para proporcionar resistencia a patogenos en una planta, transformando o transfectando una planta con, como minimo, un acido nucleico, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o un vector, segun la reivindicacion 6, y expresar dicho acido nucleico en presencia de un sustrato adecuado.
13.

Metodo, segun la reivindicacion 12, en el que se proporciona resistencia contra hongos y/o insectos.