RO122151B1

RO122151B1 - Procedeu de modificare a nivelurilor concentraţiilor de compuşi metabolici secundari, din plante

Info

Publication number: RO122151B1
Application number: ROA200000733A
Authority: RO
Inventors: Wilfred A. Keller; S. Datla Raju S.; Jin-Zhuo Dong; Fawzy Georges; K. Hussain Atta A.; Gopalan Selvaraj
Original assignee: National Research Council Of Canada
Priority date: 1998-01-22
Filing date: 1999-01-22
Publication date: 2009-01-30
Also published as: JP2002502587A; CA2318887C; EP1049785A2; CN1292822A; AU2146199A; BR9907223A; RU2260050C2; PL194895B1; WO1999037786A2; KR100816113B1; CN1246461C; HUP0100315A3; CA2318887A1; KR20010040379A; WO1999037786A3; PL342736A1; AU763969B2; HUP0100315A2; TR200002166T2; US6703539B1

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu de modificarea nivelurilor concentraţiilor de compuşi metabolici secundari, din plante. Procedeul conform invenţiei constă în introducerea unei casete de expresie, care cuprinde o secvenţă ADN, într-o celulă vegetală care poate fi transformată şi regenerată într-o plantă întreagă. Secvenţa ADNmenţionată codifică, sub controlul unui promotor, o proteină capabilă să modifice utilizareaunui substrat din calea metabolică secundară. Substratul nu este un metabolit primar din grupul ales dintre: glucoză, aminoacizi, acizi graşi uzuali şi nucleotide. O plantă sau un ţesut vegetal incluzând seminţele pot fi regenerate avândun conţinut modificat cel puţin al unui produs din calea metabolică secundară. Invenţia se maireferă şi la utilizarea unei plante modificate prin procedeul conform invenţiei, la prepararea de hrană pentru animale.

Description

Invenția se referă la un procedeu de modificare a nivelurilor concentrațiilor compușilor care se obțin în plante pe căi metabolice secundare. Invenția se mai referă la celule vegetale cu conținut modificat de metaboliți secundari, precum și la semințe cu conținut alterat de metaboliți secundari. într-o variantă de realizare a invenției, conținutul de produși metabolici secundari anti-nutritivi este alterat, conform invenției, în plante, celule vegetale și semințe, într-o altă variantă de aplicare a invenției, produși întâlniți în căile metabolice secundare fenilpropanoidice și ale polialcoolilor glucidici sunt alterați, conform invenției, în plante, celule vegetale și semințe. Invenția se mai referă la construcți genetici și vectori utili pentru modificarea conținutului de metaboliți secundari al celulelor vegetale și al semințelor. De asemenea, invenția se referă la făina de semințe (șrotul) modificate și la nutrețul conținând șrotul modificat, în particular, la făina de semințe în care conținutul de metaboliți secundari este redus sau alterat.

Plantele produc o varietate de compuși pe calea metabolismului secundar. Cu toate că nu sunt considerate esențiale pentru metabolismul plantei, căile metabolice secundare produc adesea produși biochimici unici, dintre care unii sunt considerați anti-nutritivi sau chiar toxici. Căile metabolice secundare și compușii produși pe aceste căi sunt adesea specifici pentru o anumită specie sau un anumit gen. Astfel, manipularea căilor metabolice secundare poate conduce la obținerea de compoziții noi de produși biochimici sau țesuturi vegetale cu conținut alterat de metaboliți secundari. în particular, manipularea metabolismului secundar în scopul alterării compușilor metabolici secundari care sunt anti-nutritivi sau toxici în natură poate furniza aplicații unice în domeniul alimentar sau al nutrețurilor.

Este de dorit manipularea metabolismului secundar fără perturbarea proceselor biochimice considerate esențiale pentru creșterea și supraviețuirea celulei vegetale. Colecția de procese biochimice și de compuși implicați care sunt esențiali pentru creșterea și supraviețuirea plantei sunt considerate căi metabolice primare împreună cu produșii lor. în general, metabolismul primar este considerat a îngloba acele procese biochimice care conduc la formarea de zaharuri primare (cum ar fi glucoza), aminoacizi, acizi grași uzuali, nucleotide și polimeri derivați din acestea (polizaharide cum ar fi amidonul, proteine, lipide, ARN și ADN, etc), Yeoman and Yeoman, Tansley Review Nr. 90, Manipulating Secondary Metabolism in Cultured Plant Cells, New Phytologist, 134: 553 -569,1996.

Astfel, domeniul admite faptul că metabolismul primar poate fi definit ca acele procese metabolice esențiale pentru creșterea și supraviețuirea tuturor celulelor vegetale, în timp ce metabolismul secundar poate fi definit ca acele procese biochimice care nu sunt esențiale pentru toate celulele vegetale. Spre exemplu, căile metabolice secundare determină caracteristici ale plantei cum ar fi: culoarea, gustul, morfologia, etc. De asemenea, metabolismul secundar produce diverși compuși care sunt recunoscuți de către insecte sau sunt implicați în răspunsul patogen. Unii dintre acești compuși pot asigura un beneficiu anumitor specii de plante în condiții sălbatice, dar în condiții de cultivare, acești compuși pot dăuna calității produsului recoltat, sau pot limita utilitatea recoltei pentru anumite aplicații. Unii dintre metaboliții secundari sunt compuși unici care s-au dezvoltat la o anumită specie, ca rezultat al căilor biochimice specializate. Metabolismul secundar nu este caracterizat prin redundanța mecanismelor biochimice, care este tipică metabolismului primar, așadar, în mod caracteristic, produșii metabolismului secundar nu sunt produși în plante pe căi multiple. Metaboliții secundari sunt, în mod tipic, mai specifici plantei decât compușii biochimici ubicuitari care sunt implicați în căile primare.

Numeroase încercări de manipulare a căilor metabolice primare au avut ca rezultat în celulele vegetale un conținut alterat de amidon sau ulei (lipide). Cu toate acestea, este de așteptat ca o manipulare brutală a metabolismului primar să conducă la efecte nocive. Spre exemplu, compoziția în lipide poate fi schimbată, dar eliminarea lipidelor ar fi, în mod evident,

RO 122151 Β1 nocivă pentru supraviețuirea celulei. Manipularea metabolismului primar nu are întotdeauna 1 succes deplin deoarece mecanismele biochimice redundante pot înfrânge unele tentative de manipulare. Așadar, căile metabolice primare din plante sunt adesea dificil de manipulat 3 într-o manieră care să fie predictibilă și să ofere rezultate utile și tangibile în condiții de cultivare. 5 în anumite împrejurări, metabolismul primar a fost alterat cu succes pentru producerea unui nou fenotip care reprezintă mai degrabă o modificare compozițională, decât o 7 reducere sau eliminare a unei substanțe specifice. în mod caracteristic, aceste manipulări au fost realizate prin exprimarea ectopică a unei gene vegetale, cum ar fi supra-exprimarea 9 unei gene în anumite țesuturi sau, mai degrabă într-o manieră constitutivă decât într-o manieră reglată, sau prin inhibarea activității unei gene specifice de către ARN antisens, ribo- 11 zime sau prin co-supresie. Cu toate acestea, a fost dificil de prevăzut a priori rezultatele unor asemenea manipulări. 13

Exprimarea unei enzime vegetale poate fi modificată la multe niveluri. Aceasta include controlul la nivelul exprimării genei, al traducerii, prelucrării proteinei și controlul 15 alosteric al funcției proteice. Astfel, exprimarea ectopică a unei gene vegetale implicate în metabolismul primar nu poate învinge complexele controale biochimice asupra reglării meta- 17 holismului primar. Mai mult, redundanța din metabolismul primar ridică, de asemenea, o barieră dificil de trecut în aceste manipulări, deoarece căile metabolice primare sunt 19 esențiale pentru creșterea și supraviețuirea plantei. în consecință, tentativele de alterare a metabolismului primar au eșuat adesea în ceea ce privește furnizarea fenotipului prevăzut. 21 Mai mult decât atât, evaluarea acestor plante modificate la nivelul câmpului, sau sub o varietate de condiții extreme de mediu, a relevat adesea că nu se observă efectul prevăzut 23 sau că perfomanța plantei este compromisă. Așadar, modificarea metabolismului primar necesită luarea atentă în considerare a căii metabolice primare sau a etapei discrete dintr-o 25 cale, în scopul obținerii unui fenotip specific.

Manipularea căilor metabolice secundare a devenit complicată datorită cunoașterii 27 insuficiente a biochimiei implicate, datorită informațiilor puține referitoare la genele exprimate în căile metabolice secundare și datorită interrelațiilor complexe dintre căile biochimice, în 29 general. Cu toate acestea, metodele de alterare a metabolismului secundar pot furniza o modalitate valoroasă de producere de noi fenotipuri, inclusiv a celor cu niveluri alterate ale 31 compușilor metabolici secundari, spre exemplu, a celor considerate anti-nutritive în natură. Așadar, căile metabolice secundare reprezintă o țintă importantă pentru manipularea 33 genetică a plantelor.

S-au făcut eforturi pentru transferul căii de biosinteză a betainei în plante incapabile 35 de a sintetiza betaina osmoprotectoare. Holmstrom, K.O. și colab., Production of the Escherichia coli betaine-aldehyde dehydrogenase, an enzyme required for the synthesis of 37 the osmoprotectant glycine betaine, in transgenic plants, The Plant Journal, (1994) 6 (5):

749-58 descrie utilizarea unei gene care codifică betain-aldehid dehidrogenaza pentru 39 sintetizarea metabolitului osmoprotector glicin-betaină.

Rezumatul Derwent AN 96-512578, Toyota Jidosha KK, October 15, 1996 descrie 41 utilizarea genei pentru colin dehidrogenaza și a genei pentru betain-aldehid dehidrogenază pentru producerea betainei osmoprotectoare. 43

Două căi biochimice din plante care sunt considerate căi metabolice secundare au constituit subiectul studiilor care vizau alterarea nivelurilor de concentrații de produși finali. 45 Metodele utilizate pentru manipularea acestor căi nu au condus la rezultatele dorite. Spre exemplu, calea fenilpropanoid este implicată în formarea ligninei și este considerată o cale 47 metabolică secundară. Biosinteză ligninei este parte din calea biosintetică generală fenilpropanoidică care produce cel puțin trei precursori fenolici primari: acizii cumaric, ferulic 49

RO 122151 Β1 și sinapic, ai căror produși se polimerizează în lignină și în alți compuși fenolici (a se vedea fig. 2). în încercările de a altera calea metabolică secundară fenilpropanoidică, genele pentru multe dintre enzimele implicate în formarea monomerilor ligninei sunt identificate în mod curent ca ținte pentru reducerea ligninei via tehnologiile antisens sau de co-supresie (ex. US5451514, US5633439, WO9305160, W09408036). Aceste gene țintă includ pe cele care codifică cinamil alcool dehidrogenaza, acid cafeic O-metil-transferaza și fenilalanin amoniu liaza. Aceste tehnici sunt îndreptate spre reducerea conținutului de lignină, deoarece se presupune că aceasta ar avea un efect benefic general asupra prelucrării sau digestibilității plantelor.

Cu toate acestea, reducerea ligninei cu ajutorul tehnologiilor antisens sau de cosupresie, prin țintirea uneia dintre genele din calea fenilpropanoid poate avea un număr de efecte nedorite. Acestea pot include: susceptibilitatea crescută față de boli, viteze alterate de creștere sau reducerea forței fizice a fibrei vegetale și, de aici, o reducere a performanței agronomice. S-a arătat că inhibarea enzimei fenilalanin amoniu liaza conduce la numeroase fenotipuri dăunătoare (Elkind și colab., Abnormal Plant Development and Down-Regulation of Phenylpropanoid Biosynthesis in Transgenic Tobacco Containing a Heterologous Phenylalanine Ammonia Lyase Gene, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9057 - 9061, 1990). Enzimă fenilalanin amoniu liaza acționează asupra metabolitului primar, fenilalanina, un aminoacid. Rezultatele acestor experimente demonstrează că alterarea metabolismului secundar prin modificarea unuia dintre metaboliții primari implicați într-o anumită cale metabolică secundară poate produce fenotipuri neprevăzute și dăunătoare. în consecință, alegerea unei (unor) etape biochimice dintr-o cale metabolică secundară este crucială pentru producerea de plante care sunt normale din punct de vedere fenotipic, dar care prezintă o reducere a unui metabolit secundar specific. Mai mult, utilizarea de ARN antisens sau a strategiilor de co-supresie pot să nu asigure nivelul sau specificitatea reducerii metabolitului secundar care să fie acceptabile din punct de vedere comercial. în plus, inhibarea genelor care codifică activități enzimatice cheie poate afecta exprimarea genelor înrudite. Astfel, a fost realizat un mic progres în ceea ce privește reducerea compușilor fenolici considerați anti-nutritivi, sau reducerea conținutului de lignină cu ajutorul ARN antisens sau al cosupresiei, fără însoțirea de efecte secundare nocive.

Un al doilea exemplu în ceea ce privește eforturile de alterare a unei căi metabolice care au eșuat în producerea rezultatelor dorite este modificarea biosintezei glucozinolatului la rapiță. Au fost raportate tentativele de modificare a conținutului de glucozinolat în șrotul de rapiță prin manipularea căii glucozinolatului. O metodă care a fost propusă pentru alterarea biosintezei glucozinolaților a fost aceea de creare a unei noi căi care să competiționeze pentru sulful utilizat în formarea glucozinolaților, sau de reducere a nivelurilor concentrațiilor de triptofan utilizate în formarea glucozinolaților prin conversia triptofanului în triptamină (EngineeringAltered Glucosinolate Biosynthesis by Two Alternative Strategies, by Ibrahim, Chavadej & De Luca, published in: Genetic engineering of plant secondary metabolism 1994, Plenum Publishing Corporation, New York; USA).

Cu toate acestea, metoda nu a avut succes în reducerea conținutului de glucozinolat al șrotului de rapiță. Metoda nu a reușit în ceea ce privește reducerea conținutului anti-nutritiv de glucozinolați din făina de rapiță. Glucozinolații sunt produși în frunzele plantei și, apoi, transportați în sămânță. Astfel, metoda s-a bazat pe premisa că simpla alterare a disponibilității unuia dintre metaboliții primari (sulf, aminoacidul triptofan) utilizați în formarea glucozinolaților ar reduce producerea de glucozinolați. Cu toate acestea, glucozinolații primari din semințe sunt glucozinolați alifatici care nu utilizează aminoacidul triptofan pentru producerea catenelor laterale. Mai mult, rezultatele acestor experimente (ex. Chavadej și colab., Proc.

RO 122151 Β1

Natl. Acad. Sci. USA, 91: 2166 - 2170, 1994) au demonstrat că plantele transgenice care 1 poartă o enzimă capabilă să altereze aminoacidul primar triptofan nu au avut conținut redus de glucozinolați în sămânță, conținutul glucozinolaților alifatici din sămânță fiind egal sau, 3 poate, chiar mai mare față de plantele netransgenice. Astfel, producția de glucozinolați totali din sămânță nu a fost redusă, deși un component minor (indol glucozinolați) s-a dovedit a 5 fi redus. Din studiile genetice reiese clar faptul că plante cu conținut scăzut de glucozinolați pot fi obținute prin ameliorare convențională și că există un număr de loci care controlează 7 conținutul redus de glucozinolați la crucifere. Există numeroase transformări biochimice care au loc în cadrul biosintezei glucozinolaților, iar acele etape în comun cu toată sau cu cea mai 9 mare parte a sintezei glucozinolaților sunt etapele care trebuie să fie avute în vedere în cazul în care este necesară o metodă de reducere a glucozinolaților totali. Astfel, dacă se 11 urmărește o metodă de utilitate generală, atunci, o metodă generală de alterare a producerii glucozinolatului la crucifere trebuie să ia în considerare diferitele enzime și substraturi utili- 13 zate în biosinteza glucozinolatului.

Cu toate acestea, se pare că enzimele utilizate pentru obținerea acestei modificări 15 au acționat, de asemenea, și asupra metaboliților primari (aminoacidul triptofan și mineralul sulf), astfel încât orice alterare semnificativă a acestor compuși din celula vegetală poate 17 avea un efect nociv. în consecință, metoda propusă nu a reușit să țintească în mod specific calea metabolică secundară. într-adevăr, este de așteptat ca alterarea triptofanului să con- 19 ducă la multe efecte nocive. Așadar, alterarea nivelurilor concentrațiilor unui metabolit primar nu produce efectul scontat al șrotului de răpită cu conținut redus de glucozinolați, subliniind 21 dificultatea modificării metabolismului primar.

WO9723599 Method for Regulation ofPlant Composition”, (E.l. DuPont și Purdue 23 Research Foundation, July 3, 1997) descrie utilizarea ferulat-5-hidroxilazei (F5H) derivate dintr-o plantă cruciferă, pentru reglarea compoziției în lignină a celulelor vegetale. Enzima 25 F5H descrisă în WO9723599 este o enzimă considerată în mod normal ca parte din calea fenilpropanoidică din celulele vegetale, spre exemplu, în planta cruciferă din care a fost 27 obținută. Enzima F5H descrisă în WO9723599 nu manifestă activitate în celula transformată care este heteroloagă activității enzimei F5H din celula din care s-a obținut. 29 în consecință, o metodă generală de alterare a metabolismului secundar va fi valoroasă pentru alterarea compoziției biochimice a țesuturilor vegetale. Aceasta poate include, 31 spre exemplu, reducerea compușilor anti-nutritivi, alterarea profilelor metabolice secundare, asigurarea țesuturilor vegetale cu caracteristici de prelucrare alterate, alterarea nivelurilor 33 concentrațiilor compușilor de utilitate industrială sau de interes farmaceutic, producerea de plante cu gust, textură sau aspect modificate, producerea de plante cu metaboliți secundari 35 alterați implicați în atracția insectelor, toleranța la boli sau la alte procese biologice care sunt influențate de către metaboliții secundari, sau de plante cu caracteristici de creștere modifi- 37 cate pozitiv prin alterarea metaboliților secundari.

Prezenta invenție se referă la un procedeu care țintește formarea unui metabolit 39 secundar. Procedeul constă în alterarea accesibilității unui substrat care este specific căii metabolice secundare și esențial pentru formarea produsului metabolic secundar final, în 41 mod particular, a acelor compuși din etapele biochimice 1-5 ale formării produsului final. Țintirea substratelor la etapele apropiate formării produsului final evită problemele legate de 43 alterarea metaboliților implicați de asemenea în căile primare, deoarece ea are loc după punctul de intrare al unui substrat în calea metabolică primară. Așadar, procedeul prevede 45 o nouă modalitate de țintire specifică a reducerii sau alterării metaboliților secundari prin identificarea precursorilor utilizați într-o cale metabolică secundară care nu conține substrate 47 pentru căile metabolice primare.

RO 122151 Β1 într-unul din aspecte, invenția se referă la un procedeu de îmbunătățire a profilului nutrițional al unei plante care cuprinde următoarele etape:

- furnizarea unei secvențe de acid nucleic care codifică o enzimă care modifică utilizarea unui substrat intermediar într-o cale metabolică secundară asociată cu un profil nutrițional al unei plante, enzima menționată având o activitate care nu apare în mod natural în calea metabolică secundară amintită;

- transformarea unei celule vegetale a plantei menționate cu o casetă de expresie care cuprinde secvența de acid nucleic amintită legată operațional la un promotor selectiv pentru sămânță; și

- recuperarea unei plante modificate genetic din celula vegetală menționată, planta modificată genetic amintită fiind caracterizată printr-un profil nutrițional îmbunătățit comparativ cu varianta sălbatică a plantei amintite.

în al doilea aspect, invenția se referă la o plantă modificată genetic, care cuprinde o moleculă de acid nucleic recombinant încorporată stabil în genomul plantei menționate, molecula de acid nucleic recombinant amintită cuprinzând:

a) un promotor selectiv pentru sămânță,

b) o secvență de acid nucleic legată operațional la promotorul selectiv pentru sămânță amintit, secvența de acid nucleic menționată codificând o enzimă care modifică utilizarea unui substrat intermediar într-o cale metabolică secundară asociată cu un profil nutrițional al unei plante, enzima menționată având o activitate care nu apare în mod natural în calea metabolică secundară amintită; planta modificată genetic amintită fiind caracterizată printr-un profil nutrițional îmbunătățit comparativ cu tipul nemodificat genetic al plantei menționate; sau la o celulă, sau la o sămânță sau la o componentă a plantei modificate genetic menționate, sau la un descendent al acesteia.

Invenția se mai referă la utilizarea plantei modificate genetic definite anterior, sau unui descendent al acesteia la prepararea de hranei animalelor.

- fig. 1: O reprezentare schematică a schemei generale a metodei de alterare a oricărei căi metabolice secundare.

-fig. 2:0 reprezentare schematică a metabolismului fenilpropanoidic general și a producerii sinapinei în plantele crucifere.

- fig. 3: începutul și evoluția sintezei sinapinei în semințele în curs de dezvoltare. Analiza prin cromatografie în strat subțire a semințelor de Brassica napus cv Westar.

-fig. 4: Analizarea cantitativă a acumulării sinapinei în semințele în curs de dezvoltare prin analiza HPLC.

- fig. 5: Determinarea competenței semințelor în curs de dezvoltare de a sintetiza sinapina, prin administrare de colină radioactivă via pediculul păstăilor tăiate, încorporarea markerului radioactiv în sinapină la 7 până la 43 de zile după polenizare.

- fig. 6: Determinarea competenței semințelor în curs de dezvoltare de a sintetiza sinapina cu ajutorul, și infiltrarea semințelor izolate, cu o soluție conținând colină radioactivă, încorporarea markerului în sinapina la 43 până la 64 de zile după polenizare.

- fig. 7: Acumularea sinapinei nou sintetizate în cotiledon, axele embrionare și fracția de înveliș a seminței ale semințelor în curs de dezvoltare ca o fracție a sinapinei totale marcate dintr-o sămânță.

- fig. 8: Conținutul de sinapina al cotiledonului și componentelor axelor embrionare ale semințelor în curs de dezvoltare per unitate de masă din proba de țesut.

- fig. 9: Determinarea conținutului de sinapina din cotiledon și din componentele axelor embrionare ale semințelor în curs de dezvoltare cu raportare per sămânță, adică, axa sau o pereche de cotiledoane.

RO 122151 Β1

- fig. 10A și 10B: Secvența de nucleotide a cadrului deschis de citire pentru colin 1 oxidază (ID SECV. Nr: 3).

- fig. 11: Secvența de aminoacizi dedusă din cadrul cu citire deschisă pentru colin 3 oxidază (ID SECV. NR: 4).

- fig. 12: Diagrama vectorului pHS 731 de transformare vegetală care conține gena 5 COX aflată sub controlul unui promotor selectiv de țesut.

- fig. 13: Reducerea conținutului de sinapină al semințelor de Brassica sp. prin 7 exprimarea genei COX.

- fig. 14: Diagrama vectorului pHS 981 de transformare vegetală care conține gena 9 BADH aflată sub controlul unui promotor selectiv de țesut.

- fig. 15: Reducerea conținutului de sinapină al semințelor de Brassica sp. prin 11 exprimarea genelor COX și BADH.

- fig. 16: Alterarea conținutului fenolic al semințelor de Brassica sp. prin exprimarea 13 genelor COX și BADH.

- fig. 17: Secvența de nucleotide a unei gene sintetice pentru decarboxilaza acidului 15 ferulic din B. pumulis, optimizată pentru exprimarea în celulele vegetale (ID SECV. NR: 1).

- fig. 18: Secvența de aminoacizi, dedusă, a proteinei codificate de către cadrul 17 deschis de citire sintetic al decarboxilazei acidului ferulic din B. pumulis (ID SECV. NR: 2).

- fig. 19: Harta de restricție a unui vector de transformare vegetală, hartă care conține 19 gena pentru decarboxilaza acidului ferulic aflată sub controlul promotorului constitutiv 35S.

- fig. 20: Harta de restricție a unui vector de transformare vegetală, hartă care conține 21 gena pentru decarboxilaza acidului ferulic aflată sub controlul promotorului din napină, selectiv pentru sămânță. 23

- fig. 21: Acumularea de acid fitic pe parcursul dezvoltării seminței.

- fig. 22: Specificitatea de țesut a depozitării acidului fitic în sămânța în curs de 25 dezvoltare.

- fig. 23: Procentul de mioinozitol, marcat, metabolizat găsit în: acidul fitic, lipide, 27 peretele celular solubil în TFA și fracțiile de debriuri (resturi) celulare.

- fig. 24: Secvența fragmentului de ADN amplificat din gena pentru mioinozitol O- 29 metil-transferază (ID SECV. NR: 5).

- fig. 25: Harta de restricție a vectorului pSIMT, hartă care conține caseta: promotor 31 35S-IMT-GUS-Nos terminator în pRD400 5.

- fig. 26: Harta de restricție pentru vectorul pNIMT, hartă care conține un promotor 33 selectiv de sămânță -IMT-Nos- terminator în pRD400.

- fig. 27: Analizarea prin tehnica PCR a plantelor transgenice care conțin gena IMT. 35

- fig. 28: Analizarea prin tehnica Northern blot a plantelor care exprimă gena IMT.

- fig. 29: O histogramă care ilustrează reducerea acidului fitic, observată în plantele 37 transgenice.

- fig. 30: Un tabel care ilustrează reducerea acidului fitic în plantele cultivate în 39 câmpurile F1, F2, și F3, plante conținând vectorul pSIMT.

- fig. 31: Un tabel care ilustrează reducerea acidului fitic în plantele cultivate în 41 câmpurile F1, F2, și F3, plante conținând vectorul pNIMT.

Prezenta invenție se bazează pe reducerea sau alterarea specifică a precursorilor 43 la produși ai metabolismului secundar care sunt diferiți de metaboliții primari. în acest fel sunt evitate posibilele efecte nocive ale alterării căilor metabolice primare, cu obținerea unui 45 rezultat similar. Astfel, prezenta invenție evită manipularea compușilor care ar putea fi considerați ca metaboliți primari. 47

RO 122151 Β1 într-o aplicație preferată a invenției, accesibilitatea substratului este alterată prin folosirea unei enzime, spre exemplu a uneia care este heteroloagă celule vegetale menționate, capabilă să acționeze asupra amintitului substrat și care îndepărtează substratul de la, sau modifică accesibilitatea substratului la rezerva disponibilă de substrate. O schemă generalizată a metodei, precum și relația dintre metabolismul primar și cel secundar sunt prezentate în fig. 1. Utilizarea unei activități enzimatice pentru a altera fluxul de produși în calea metabolică secundară conduce la o modificare a unui metabolit secundar dorit drept țintă. Aceasta alterează fluxul de produși din calea metabolică secundară, conducând la o modificare a unui metabolit secundar dorit drept țintă. Lucrând în acest fel, nivelul produsului final al anumitor etape enzimatice din calea metabolică secundară este redus, în timp ce, în contrast, pentru alte etape din cale, produsul se acumulează până la niveluri ridicate, inhibând enzimele responsabile de producerea menționatului produs. Această inhibiție prin feedback influențează, la rândul său, producerea produsului final din întreaga cale metabolică secundară. Astfel, schimbările nivelurilor concentrațiilor de produși ai unei căi metabolice secundare specifice și ai căilor asociate sunt realizate prin introducerea de noi activități enzimatice care alterează fluxul de produși biochimici (ex. substrate și produși ai acestora) prin cale. Au fost exprimate enzime heteroloage în țesuturi vegetale, determinând astfel, ramificația metabolică a precursorilor din aceste căi în substanțe care se acumulează fără efecte nocive în celula vegetală.

în unele aplicații ale invenției, ca rezultat al acestui procedeu se formează produși valoroși sau produși cu efecte benefice pentru celula vegetală.

într-una dintre aplicații, precursorul țintit este modificat apoi prin adăugarea unei noi activități enzimatice. Un aspect preferat al invenției vizează selecția unei enzime având activitate heteroloagă cu celula vegetală în care este exprimată. Spre exemplu, enzima este una care, în mod normal, nu este asociată cu calea metabolică secundară la eliberarea în celula vegetală. Enzima utilizată poate fi de origine vegetală, animală sau microbiană și poate fi modificată pentru exprimarea corespunzătoare în celulele vegetale. Enzima heteroloagă selecționată este capabilă să modifice precursorul pentru a-i altera disponibilitatea de a forma metabolitul secundar. Prin utilizarea unei activități enzimatice heteroloage cu celula vegetală în care este exprimată, mecanismele normale de control biochimic sunt ocolite, iar metabolismul secundar este alterat într-o manieră previzibilă. De un interes deosebit pentru scopul prezentei invenții este modificarea produșilor căii metabolice secundare legate de alcoolii glucidici și ai căii metabolice secundare fenilpropanoidice.

Exemple suplimentare referitoare la utilitatea prezentului procedeu se găsesc în alterarea nivelurilor concentrațiilor compușilor glucidici modificați cum ar fi galactoza și sucrozilglicozidele anti-nutritive cum ar fi stahioza și rafinoza. Galactoza este convertită la galactinol care este unul dintre precursorii pentru formarea acestor sucrozil-glicozide anti-nutritive. Forma precursoare a galactozei este forma conjugată cunoscută sub denumirea de UDPgalactoză. Ca o metodă studiată în prezenta invenție, formarea și acumularea de UDP-galactoză (și conversia ulterioară la galactinol) sunt protejate prin utilizarea unei activități enzimatice heteroloage cu celulele vegetale, enzima menționată fiind capabilă să altereze nivelurile concentrațiilor de UDP-galactoză. Enzima UDP-galactozo4-epimeraza (galE)este implicată în una dintre principalele etape ale metabolismului galactozei în sistemele vii. Ea catalizează conversia UDP-galactozei în UDP-glucoză. Gena pentru această enzimă este disponibilă de la om, drojdii și bacterii. în prezenta invenție s-a studiat utilizarea unei enzime codificate bacterian.

Ca o consecință a exprimării acestei enzime heteroloage într-o celulă vegetală, disponibilitatea UDP-galactozei ar fi redusă și s-ar produce un compus benefic, UDP-glucoza. Este general admis faptul că exprimarea enzimei UDP-galactozo 4-epimeraza ar conduce la o biosinteză redusă de galactinol, care este unul dintre precursorii sucrozo-glicozidelor anti-nutritive. în afară de reducerea vitezei de acumulare a sucrozo-glicozidelor nedorite,

RO 122151 Β1 activitatea enzimei nou introduse ar conduce la creșterea disponibilității UDP-glucozei și 1 ulterior, la formarea sucrozei. Este de presupus ca cea din urmă să participe în, și să crească activitatea altor căi metabolice în care sucroză este necesară fie ca sursă de carbon 3 pentru sporirea productivității plantei (ex. proteine, lipide, producție totală etc.), fie direct, ca sucroză acumulată. 5 în cadrul scopului prezentei invenții pot fi studiate și alte aplicații ale metodei. Este posibilă alterarea nivelurilor concentrațiilor diferiților derivați glucidici cum ar fi glucozo-1- 7 fosfat și glucozo-6-fosfat prin utilizarea enzimei fosfoglucomutaza (pgm). Această enzimă catalizează interconversia glucozo-1-și glucozo-6-fosfatului (G-1-P, G-6-P)în sinteza și con- 9 sumul sucrozei. Enzima joacă un rol de bază în sintetizarea și utilizarea sucrozei, amidonului și glicogenului și este prezentă în toate organismele. Gena pentru această enzimă este dis- 11 ponibilă de la o varietate de eucariote, precum și din surse bacteriene (ex. Agrobacterium).

G-6-P este un material principal de plecare pentru un număr de interconversii glucidice, una 13 dintre acestea fiind sinteza mioinozitol-1-Ρ. Acesta din urmă este un substrat și co-factor principal în sinteza acidului fitic și, respectiv a sucrozil-glicozidelor anti-nutritive. S-ar putea 15 ca exprimarea enzimei să scadă nivelul de G-6-P, ceea ce s-artraduce în niveluri de concentrații scăzute ale factorilor anti-nutritivi menționați mai sus. Astfel, în cadrul scopului prezentei 17 invenții pot fi studiate diverse alterări metabolice.

Metoda nu se limitează la o anumită cale metabolică secundară. De asemenea, 19 metoda nu se limitează la o anumită specie vegetală. Mai degrabă, metoda poate fi aplicată pentru alterarea căilor metabolice secundare comune multor specii cultivate valoroase, 21 incluzând monocotiledonatele și dicotiledonatele, sau pentru a ținti un metabolit secundar cu semnificație unică pentru o anumită cultură. 23

Baza biochimică pentru metoda din prezenta invenție se află pe conceptul de reglare a activității enzimatice prin accesibilitatea substratelor. în general, vitezele enzimatice sunt 25 influențate de accesibilitatea substratelor. Cu alte cuvinte, o enzimă va produce un produs cu o viteză proporțională cu cantitatea de substrat disponibil. Reducerea concentrației de 27 substrat conduce la niveluri de concentrații mai mici ale produsului. Mai mult, multe enzime sunt supuse inhibiției prin produsul final, ceea ce înseamnă că viteza enzimatică este redusă 29 în prezența unui mare exces al produsului final. Așadar, prin alterarea nivelurilor de concentrații ale substratelor disponibile sau ale produșilor enzimatici, producția globală de compuși 31 produși printr-o cale biochimică poate fi modificată.

Exemple de căi metabolice secundare care pot fi alterate cu ajutorul prezentei invenții 33 includ biosinteza izoprenoidelor, biosinteza alcaloizilor, biosinteza terpenoidelor, biosinteza fenolilor, biosinteza alcoolilor glucidici sau oricare altă cale metabolică secundară care pro- 35 duce compuși anti-nutritivi sau de natură comercială valoroasă. Metaboliți secundari specifici care pot fi modulați cu ajutorul prezentei invenții includ compuși fenolici anti-nutritivi cum ar 37 fi sinapina sau glucozinolații de la crucifere, produșii alcoolici glucidici cum ar fi acidul fitic sau stahioza și rafinoza, gosipolul din bumbac, nicotină, acidul clorogenic, taninurile conden- 39 sate sau oricare alt metabolit secundar anti-nutritiv. Compusul acid clorogenic este comun în soia, bumbac, floarea soarelui și este derivat din acid cafeic care este un compus produs 41 pe calea fenilpropanoidică. Alți compuși anti-nutritivi includ saponinele - compuși anti-nutritivi găsiți în multe plante, inclusiv în lucernă. Saponinele sunt glicozide cu masă moleculară 43 mare care conțin o parte glucidică legată de o triterpenă sau un aglicon steroidic. Există 3 clase de saponine cunoscute: glicozide triterpenice, glicozide steroidice și glicozide steroid 45 alcaloidice. Biosinteza saponinelorîn plante implică materialul de plecare squalen. Alte clase importante de metaboliți secundari cum ar fi fitosterolii, cardenolidele, cucurbitacinele, 47 quasinoidele și limonidele sunt, de asemenea, derivate de la squalen. Excesul de saponine din dieta animalelor este asociat cu starea cunoscută sub denumirea de meteorism 49 (balonare).

RO 122151 Β1

Prezenta invenție este exemplificată prin demonstrarea utilității metodei într-un număr de căi metabolice secundare neînrudite. Cu toate acestea, utilitatea metodei pentru modificarea oricărei căi metabolice secundare va fi evidentă pentru specialistul în domeniu și este asigurată o metodă generală pentru realizarea invenției. într-unul dintre exemple, prezenta invenție prevede metode și compoziții de ADN pentru alterarea conținutului de sinapină și de compuși fenolici înrudiți din plante. într-un alt exemplu, invenția prevede celule vegetale modificate în ceea ce privește conținutul fenolic, precum și semințe cu conținut fenolic redus, în particular plante crucifere cu conținut redus de sinapină. în altă aplicație, prezenta invenție prevede metode și compoziții de ADN pentru alterarea conținutului în acid fitic din celulele vegetale, un produs al căii metabolice secundare a alcoolilor glucidici. într-o altă aplicație, invenția prevede celule vegetale cu conținut modificat de acid fitic, precum și semințe cu conținut redus de acid fitic. într-o altă aplicație, invenția prevede semințe cu conținut redus de acid fitic adecvate aplicațiilor în câmp, semințe cu conținut redus de acid fitic adecvate preparării unei făini modificate, precum și celule vegetale cu un metabolism modificat al alcoolilor glucidici (inozitol).

Fiecare cale metabolică secundară din plante este asociată cu un număr limitat de enzime și substraturi pentru aceste enzime care sunt unice sau care sunt utilizate într-o manieră unică. Calea metabolică secundară poate produce diverși compuși care sunt utilizați sau sunt prezenți în plantă. în felul acesta, ca modalitate de a altera metabolismul secundar sunt utilizate activități enzimatice unice pentru alterarea specifică a fluxului de compuși prin calea specifică. în scopul asigurării unei ilustrări a utilității metodei au fost modificate două căi metabolice secundare diferite, conform metodei din prezenta invenție. Mai jos suntfurnizate informații asupra acestor căi care ajută la asigurarea unei înțelegeri depline a naturii metodei.

A. CALEA METABOLICA SECUNDARA PENTRU METABOLISMUL FENILPROPANOIDIC

Plantele produc o varietate de compuși fenolici prin intermediul căii fenilpropanoidice - o cale metabolică secundară. Metabolismul fenilpropanoidic este implicat în multe procese fiziologice din plante incluzând: rezistența la boli, protecția față de lumina UV și reglarea creșterii plantelor. Produșii acestei căi sunt necesari biosintezei suberinei și ligninei care sunt componente ale țesuturilor vegetale și sunt implicate în formarea fibrei vegetale, un termen general care se referă la carbohidrații sub-metabolizați din semințe sau din făina de semințe. Se presupune că lignina este implicată în formarea fibrei insolubile și, de aceea, nivelurile de concentrații ridicate de lignină din semințe sau șroturi sunt corelate cu utilizarea ineficientă a făinii sau a semințelor, în special în cazul animalelor monogastrice. în consecință, fenolii vegetali, în particular precursorii fenolici ai ligninei pot fi considerați ca factori antinutritivi pentru hrana animalelor, iar reducerea sau alterarea corespunzătoare a fenolilor vegetali, în special a fenolilor utilizați la formarea ligninei pot furniza o făină superioară.

Fenolii vegetali sunt implicați, de asemenea, în formarea diferiților alți compuși, dintre care unii sunt anti-nutritivi în natură.

Prezenta invenție prevede o modalitate de reducere a compușilor fenolici specifici care sunt considerați anti-nutritivi în celulele vegetale, semințe sau șroturi utilizate ca furaje, în particular, prezenta invenție studiază reducerea compusului anti-nutritiv cu gust amar sinapina (sau sinapoil-colina) din celulele vegetale care îl produc. Se presupune, de asemenea, că sinapina complexează cu proteinele din făină, reducând disponibilitatea proteinei pentru digestie și utilizare de către animal. Gustul amar poate afecta și gradul de furajare, în plus, când este administrată câtorva rase de găini care produc ouă cu coaja de culoare

RO 122151 Β1 maronie, sinapina cauzează un miros inacceptabil de pește în ouă. Procentul făinii conținând 1 sinapina în aceste cazuri trebuie să fie menținut sub circa 10%, iar aceasta limitează utilizarea făinii cu conținut de sinapina în aceste formulări de furaje. în consecință, reducerea șina- 3 pinei din semințe sau șroturi provenind de la crucifere constituie un obiectiv comercial important. 5

Producerea sinapinei are loc ca o extensie a căii fenilpropanoidice. Calea definită în scopul prezentei invenții include etapele biochimice care conduc la formarea acidului sinapic, 7 precum și căile biochimice care se ramifică din diferite etape, cum arfi căile ramificate care conduc la formarea monomerilor ligninei și ai altor produși biochimici derivați din produșii căii 9 fenilpropanoidice.

în calea fenilpropanoidică, L-fenilalanina care este un aminoacid aromatic, reprezintă 11 un substrat pentru enzima fenilalanin amoniu liaza (PAL). Activitatea enzimatică a PAL conduce la formarea acidului cinamic care este un substrat pentru cinamat-4-hidroxilază (C4H). 13

Produsul enzimei C4H este acidul p-cumaric care este un precursor pentru mulți compuși flavonoidici, dintre care unii pot fi formați și din L-tirozină, prin acțiunea enzimei tirozin 15 amoniu liaza (TAL). Acidul cumaric poate servi și drept precursor pentru biosinteza ligninei.

Enzima p-cumarat-3-hidroxilaza (C3H) acționează asupra acidului p-cumaric pentru a forma 17 acidul cafeic. Acidul cafeic este metabolizat de către cafeat / 5-hidroxiferulat-O-metiltransferaza (OMT) cu formarea acidului ferulic. Acidul ferulic este unul din cei trei monomeri feno- 19 lici primari cunoscuți, utilizați pentru biosinteza ligninei. De asemenea acidul ferulic poate fi substrat pentru enzima ferulat-5-hidroxilaza (F5H), formând acidul 5-hidroxiferulic care poate 21 fi modificat ulterior de către enzima OMT pentru formarea acidului sinapic. Acidul sinapic este celălalt monomer fenolic principal al ligninei. De asemenea, acidul sinapic poate fi 23 conjugat pentru a forma sinapoil-glucoza, prin acțiunea enzimei UDP-glucozo sinapoiltransferaza (SGT). Sinapoil-glucoza servește drept substrat pentru sinapoil-glucoza: colin șina- 25 poiltransferază (SCT), conducând la formarea sinapoil-colinei sau sinapinei. Aceste ultime două etape sunt prevalente la crucifere, iar la Brassicacee acumularea sinapinei în sămânță 27 reprezintă principalul component fenolic nepolimeric găsit în sămânța matură. O cale generalizată pentru metabolismul fenilpropanoidic este prezentată în fig. 2. Trebuie menționat 29 faptul că, la anumite specii de plante, din calea fenilpropanoidică pot face parte și activități enzimatice suplimentare. 31

Sinapina sau sinapoil-colina este cel mai abundent compus fenolic din semințele cruciferelor, iar în B. napus ea poate contribui cu aproximativ 4% din făină (Blair and 33

Reichert, 1984., J. Sci. Food Agric. 35: 29). Sinteza sinapinei are loc în semințele imature care au încă aspect verde deschis și se pare că nu există o degradare netă pe măsura matu- 35 rizării semințelor (Vogt și colab., 1993., Arch. Biochem. Biophys. 300:622). Plantuleleîn curs de dezvoltare (adică semințele în curs de germinare) degradează sinapina printr-o reacție 37 esterazică, cu producere de acid sinapic și colină. A fost postulat, dar nedovedit faptul că degradarea sinapinei ar putea furniza aportul de colină pentru sinteza fosfolipidelorîn cursul 39 germinării seminței (Strack și colab., 1981, Z Naturforsch. 36c: 215). Cu toate acestea, deoarece majoritatea plantelor care nu sunt crucifere nu au sinapina în semințele lor, este 41 improbabil ca sinapina să fie un compus esențial pentru dezvoltarea seminței sau pentru germinație, în general. 43

Mutante defective în calea generală fenilpropanoidică au fost izolate la Arabidopsis thaliana (Chapple și colab., 1992., The Plant Cell4: 1413-1424). în timp ce aceste mutante 45 furnizează un excelent cadru de lucru pentru studiile fiziologice, biochimice și genetice, ele nu prezintă nici o valoare agronomică datorită consecințelor negative ale mutației care 47 include hipersensibilitatea la lumina UV datorată manifestării fenotipului mutant în plantă, în

RO 122151 Β1 particularîn frunze. Aceste mutante, desemnate SIN1 (mutante în biosintezaSINapoil malatului), blochează sinteza esterilor acidului sinapic, reducând conținutul în sinapină (un ester al sinapoil-colinei) și, în continuare, alterând compoziția monomerică a ligninei din plantă. Alterarea conținutului de lignină poate conduce la plante cu lignină de compoziție unică și, în consecință, cu fibră vegetală alterată.

în continuare, Chapple și colab. discută posibilitatea de utilizare a mutantelor cum ar fi SIN 1 pentru reducerea conținutului de lignină sau alterarea acestuia în semințele cruciferelor importante, cum ar fi semințele de rapiță, dar nu există nici o instrucțiune referitoare la modul cum se poate realiza acest deziderat. în continuare, s-a considerat că reducerea sinapinei în semințele de rapiță este un obiectiv important, cu toate acestea, nu este asigurată nici o instrucțiune privitoare la modalitatea de realizare a acestui lucru prin utilizarea mutației SIN1. Dată fiind evidenta sensibilitate UV a mutantei SIN1, mutația are o valoare redusă pentru utilizare în condiții agricole. Deși în domeniu nu au fost descrise metode de reducere a conținutului de sinapină din semințe, mutația SIN1 asigură o dovadă științifică importantă că sinapina nu este un component esențial pentru creșterea și dezvoltarea plantei și că sămânța cu conținut redus de sinapină este capabilă de creștere și dezvoltare. Cu toate acestea, mutația SIN1 nu prevede o metodă de reducere a conținutului de sinapină din semințele de crucifere produse comercial, lipsite de sensibilitatea UV asociată, nocivă.

în formarea ligninei sunt implicați mulți produși ai căii fenilpropanoidice, în afara compușilor fenolici anti-nutritivi cum arfi sinapină. Biosinteza ligninei este parte a căii biosintetice fenilpropanoidice generale care produce cel puțin trei precursori fenolici primari: acizii cumaric, ferulic și sinapic, ai căror produși sunt polimerizați în lignină și alți compuși fenolici.

Biochimia formării ligninelor din acești precursori este complexă și există un număr de alte enzime implicate, cum ar fi: acid cafeic / acid 5-hidroxiferulic-O-metiltransferaza (COMT), cafeoil-CoA-reductaza (CCoAOMT), cinamil alcool dehidrogenaza (CAD), cinamoilCoA-reductaza (CCR), peroxidaza, 4-cumarat:CoA ligaza (4CL) și coniferin - befa-glucuronidaza specifică (CBG). Pot fi implicate și alte enzime, iar biochimia completă a formării ligninei nu este încă complet cunoscută.

Lignină este un polimer complex, alcătuit în principal din unități ale acestor fenoli monomerici interconectate în diferite proporții și cu diferite tipuri de legături în diferite tipuri de celule și în specii diferite. Ligninele sunt componente esențiale ale pereților celulelor vegetale în care țesuturile necesită forță mecanică, sau sunt implicate în conducerea apei. în afară de acestea, se presupune că ligninele sunt implicate în mecanismele de rezistență față de patogeni. Comună la dicotiledonate este guaiacil-siringil lignină, alcătuită atât din unități guaiacil derivate din acid ferulic, cât și resturi siringii derivate din acid sinapic. în consecință, atât acidul sinapic cât și acidul ferulic sunt necesari pentru formarea ligninei de tip sălbatic. Se presupune că degradabilitatea sau procesabilitatea lemnului, spre exemplu, în timpul decorticării sunt foarte dependente de compoziția în monomeri a ligninei, care se bazează în primul rând pe disponibilitatea monomerilor specifici ai ligninei. Se crede că prezența grupărilor 5-0-metil în ligninele siringii derivate din sinapoil ar reduce legarea încrucișată, făcând în felul acesta ca lignină alcătuită în principal din unități siringii să fie mai ușor de prelucrat decât lignină alcătuită esențialmente din unități guaiacil derivate din acidul ferulic. în consecință, metodele de creștere a conținutului de siringii lignină pot conduce la o făină care este mai digestibilă, datorită unei legări încrucișate reduse a ligninei.

Digestibilitatea culturilor furajere este influențată de cantitatea de fibră deoarece ligninele legate încrucișat sunt rezistente la degradare și acționează în sensul legării fizice a componentelor peretelui celular.

RO 122151 Β1

Este evident din precedentele că orice tentative de ameliorare a făinii de semințe prin 1 scăderea sau eliminarea sinapinei și alterarea conținutului fenolic general trebuie să fie îndreptate spre semințele în curs de dezvoltare. Pentru ca calea biochimică de sinteză a 3 sinapinei să fie alterată specific în semințe, o abordare genetică moleculară este cea mai adecvată, având în vedere lipsa germoplasmei care să asigure în mod natural un conținut 5 redus de sinapină.

într-una dintre aplicații, prezenta invenție expune o metodă care alterează nivelul 7 compușilorfenolici din semințe și, mai mult, alterează nivelul acidului sinapicși al compușilor fenolici înrudiți. Metoda se bazează pe introducerea de activități enzimatice noi care afec- 9 tează disponibilitatea compușilor utilizați ca precursori și substrate pentru enzimele din calea fenilpropanoidică. Epuizarea sau o schimbare în abundența acestor compuși conduce la o 11 deplasare biochimică în calea normală și la producerea de niveluri alterate ale diverșilor produși fenilpropanoidici. 13

Ca un exemplu de metodă, a fost întrebuințată o nouă activitate enzimatică, colin oxidaza (COX), pentru reducerea rezervelor de colină dintr-o celulă vegetală, în particular, 15 din sămânță. Colina este utilizată, printre altele, pentru producerea de sinapină din sinapoilglucoza. Reducerea rezervorului de colină cauzează alterarea nivelurilor rezervei de pre- 17 cursori ai sinapinei (colina și sinapoil-glucoza) și, de aici, modificările compoziției precursorilor formați în etapele enzimatice timpurii ale căii fenilpropanoidice, inclusiv acidul sinapic. 19 Rezultatul este sămânța cu conținut de sinapină mult diminuat și conținut fenolic alterat. Se știe că oxidarea colinei de către colin oxidază produce peroxid de hidrogen. Producerea per- 21 oxidului de hidrogen în celulele vegetale este considerată benefică și, în consecință, există un beneficiu suplimentar pentru exprimarea colin oxidazei în plante. Ca o ilustrare a unui 23 aspect suplimentar al metodei, o a doua activitate enzimatică, betain aldehid dehidrogenaza (BADH), este utilizată pentru amplificarea conversiei produsului colin oxidazei, betain 25 aldehida, în glicinbetaină, care funcționează ca un protector de stres. Compusul betaină este un compus valoros pentru diverse aplicații în industria alimentară și ca aditiv pentru amplifi- 27 carea creșterii vegetale.

în consecință, un efect benefic al modificării conținutului fenolic din celulele vegetale 29 și al reducerii specifice a sinapinei sunt evidențiate prin reducerea unui singur precursor din calea fenilpropanoidică. Pentru un specialist în domeniu este clar că și alte enzime pot fi utili- 31 zate în scopul metodei de alterare a diverșilor alți produși finali din calea fenilpropanoidică.

Un alt exemplu în scopul prezentei invenții este utilizarea de noi activități enzimatice 33 pentru degradarea acidului ferulic, format și el în calea fenilpropanoidică. Din cei trei monomeri principali ai ligninei, se presupune că acidul ferulic conferă rigiditatea structurală și forța 35 arhitecturii peretelui celular prin legarea încrucișată a catenelor pentozice, arabinoxilanilor și hemicelulozelor, făcând pereții celulari mai rigizi și mai puțin susceptibili la degradarea 37 enzimatică. Astfel, ca și componentă a ligninei, acidul ferulic joacă un rol important în forța mecanică a țesuturilor celulare. Alterarea nivelului de acid ferulic într-o manieră specifică 39 poate conduce la multe efecte benefice.

Acidul ferulic este sintetizat pe calea fenilpropanoidică generală, așa cum s-a descris 41 mai sus și servește drept precursor pentru diferiții produși ai căii (trecut în revistă în JPN Rosazza și colab., Journal of Industrial Microbiology 15: 457 - 471, 1995; R. Whetten and 43 R. Sederoff, Plant Cell 7: 1001 -1013, 1995; RA Dixon and NL Paiva, 1995, Plant Cell 7: 1085-1097,1995). 45

Prezenta metodă prevede o modalitate de modulare a nivelurilor de acid ferulic, prin aceasta alterând producerea diferiților alți compuși din calea fenilpropanoidică, în particular, 47 a sinapinei. Un aspect al prezentei invenții expune o metodă care alterează nivelul acidului ferulic din celulele vegetale. Metoda se bazează pe introducerea de activități enzimatice 49 heteroloage care metabolizează acidul ferulic. Unele dintre aceste enzime pot produce și

RO 122151 Β1 compuși de utilitate comercială. Spre exemplu, este utilizată enzima acid ferulic decarboxilaza, cu producerea compusului vinilguaiacol, un compus care poate fi utilizat drept furaj industrial și care se poate acumula în celulele vegetale fără efect nociv. Epuizarea sau o modificare în abundența acidului ferulic conduce la o deplasare biochimică în calea fenilpropanoidică normală și la producerea de niveluri alterate ale diferiților produși fenilpropanoidici.

Metoda conformă invenției nu se limitează la calea fenilpropanoidică. Ca un exemplu al utilității prezentei invenții, este exemplificată modificarea căii metabolice secundare care produce alcooli glucidici.

B. CALEA METABOLICĂ SECUNDARĂ PENTRU METABOLISMUL ALCOOLILOR GLUCIDICI

De asemenea, prezenta invenție prevede metode și compoziții de ADN pentru alterarea conținutului de alcooli glucidici din celulele vegetale. Ca rezultat al aplicării metodei din prezenta invenție sunt furnizate celule vegetale modificate în ceea ce privește compușii derivați din alcoolii glucidici, cum ar fi: acidul fitic, stahioza, rafinoza, sucrozil glicozidele, uronidele și pentozele, fosfoinozitidele și glicofosfoceramidele. Ca rezultat, în unele aplicații ale invenției sunt obținute semințe cu conținut redus de acid fitic. Invenția mai prevede, de asemenea, semințe cu conținut redus de acid fitic adecvate aplicațiilor furajere, semințe cu conținut redus de acid fitic adecvate preparării de șroturi modificate și celule vegetale cu metabolism modificat al inozitolului. Alți compuși derivați din metabolismul alcoolilor glucidici sunt, de asemenea, alterați cu ajutorul prezentei invenții, inclusiv compușii anti-nutritivi derivați din alcoolii glucidici, cum ar fi stahioza și rafinoza. De o relevanță specială pentru aplicațiile furajere sunt semințele cu conținut modificat de fitat.

Fitatul este o componentă semnificativă a multor semințe, reprezentând în mod tipic 2-4% din masa seminței, dar își poate ridica nivelurile la 10% în unele specii. Prezența unor niveluri ridicate ale fitatului în rațiile furajere a fost corelată cu pierderea apetitului, reducerea mărimii puilor, precum și cu alți factori de performanță negativă. Este probabil ca aceste efecte să fie datorate capacității fitatului de legare a zincului. în general, complexele acidului fitic cu celelalte componente ale seminței sunt cunoscute sub denumirea de fitină. în mod similar, nivelurile de concentrație ridicate ale fitinei sunt asociate cu efecte negative.

în afara efectelor distructive asupra performanței furajere, prezența acidului fitic în formulările de nutrețuri conduce, de asemenea, la un număr de consecințe nedorite asupra mediului înconjurător. în cazul animalelor monogastrice, fosforul asociat cu acidul fitic este, în general, inaccesibil, așadar, fosforul trebuie să fie adăugat dietei în care reprezintă un cost suplimentar. Fosforul asociat cu acidul fitic este excretat de către animalele monogastrice și, ulterior, degradarea fecalelor de către microbi conduce la eliberarea în mediul înconjurător a fosforului conținut în acidul fitic. Nivelurile de concentrație ridicate de acid fitic din multe șroturi au ca rezultat o cantitate semnificativă de fosfor excretat. Creșterea continuă a șeptelului a condus adesea la eutrofizarea surselor de apă și la alte probleme de mediu legate de poluarea cu fosfor. Este de așteptat ca aceste probleme să se amplifice și să poată deveni o limitare majoră pentru creșterea șeptelului în viitor. în felul acesta, metodele de reducere a nivelului de acid fitic excretat vor constitui un beneficiu semnificativ pentru ameliorarea acestor probleme de mediu înconjurător.

Deși costurile actuale asociate adăugării fosforului într-o formulare furajeră nu constituie o fracție semnificativă a costurilor furajului, consecințele asupra mediului ale fosforului excretat generează costuri asociate semnificative, care ar putea fi evitate prin producerea de șroturi din semințe cu conținut redus de fitat.

RO 122151 Β1 în cazul animalelor rumegătoare, prezența faunei microbiene din rumen poate cauza 1 eliberarea fosforului conținut în acidul fitic și, în consecință, fosforul devine mai accesibil. Ca rezultat, cantitatea de fosfor adăugată în rațiile rumegătoarelor este foarte redusă, în compa- 3 rație cu animalele monogastrice. Cu toate acestea, cantitatea de acid fitic din majoritatea semințelor o depășește pe cea necesară în mod real, așa încât chiar și la rumegătoare, 5 poluarea cu fosfor este un motiv major de îngrijorare.

Până în prezent, metodele predominante care au fost studiate pentru reducerea 7 fitatului au fost în mare parte direcționate spre degradarea fitatului prin acțiunea enzimelor fitazice conținute în făină. Deși această metodă are ca rezultat o mai mare disponibilitate a 9 fosforului, ea nu permite producerea de semințe sau șroturi cu conținut redus de acid fitic, ci doar de făini în care fosforul conținut în acidul fitic este, în general, mai disponibil. în felul 11 acesta, utilizarea enzimei fitaza își găsește utilitatea doarîn a face fosforul din acidul Fitic mai accesibil. 13

Activitatea fitazică se întâlnește în mod uzual în microorganisme cum arfi: ciupercile (Aspergillus), bacteriile (Bacillus, Pseudomonas) și drojdiile (Saccharomyces). îndepărtarea 15 fitatului prin tratarea materialelor vegetale cu amestecuri enzimatice conținând fitaza microbiană este descrisă, spre exemplu, în brevetul US 5554399. Majoritatea microbilor sinteti- 17 zează un număr de activități fitazice care pot include activitatea fitazică însăși, în afara unor fosfataze care degradează, în continuare, acidul fitic. Eliberarea completă a fosforului 19 accesibil din acidul fitic poate fi dependentă de un număr de activități enzimatice diferite.

De asemenea, a fost descrisă abordarea alternativă a transformării plantelor în 21 sensul producerii fitazei microbiene. Brevetul US 5593963 descrie exprimarea fitazei în plante transgenice sub controlul secvențelor reglatoare care le includ pe cele capabile să 23 conducă exprimarea fie în mod constitutiv, fie într-o manieră specifică de stadiu sau de țesut.

Pot fi produse celule vegetale sau, mai specific, celule de semințe vegetale care conțin o 25 activitate fitazică care poate elibera o parte din fosforul conținut în acidul fitic.

Cu toate acestea, simpla eliberare de fosfor din acidul fitic nu rezolvă în întregime 27 problema reducerii fosforului rezidual și posibilele efecte anti-nutritive ale acidului fitic. Mai important este faptul că prezența acidului fitic complexat sau a fitatului nu este redusă. 29 Lucrările publicate furnizează mijloacele de eliberare a fosforului din acidul fitic, dar nu prevăd o modalitate de control al nivelurilor de concentrații de acid fitic produs. 31

Orice modalitate prin care nivelurile de concentrații de acid fitic ar putea fi manipulate în mod convenabil și-ar găsi o utilitate mai mare în aplicațiile de furajare. Spre exemplu, 33 semințe cu niveluri reduse ale acidului fitic ar furniza o făină cu disponibilitate minerală mai mare. Semințele cu conținut redus de acid fitic ar furniza, de asemenea, o făină cu conținut 35 redus de fitină și, de aceea, potfi mai nutritive și mai digerabile datorită reducerii complexelor acidului fitic. 37 în afara șroturilor îmbunătățite din punct de vedere nutritiv, șroturile cu conținut redus de acid fitic ar avea ca rezultat o eliberare diminuată a fosforului în mediul înconjurător și o 39 poluare mai mică. Deși mijloacele de eliberare a fosforului din acidul fitic pot reduce nivelul de fosfor adăugat și excretat, nivelurile reale de acid fitic și, de aici, fosforul potențial dis- 41 ponibil sunt în exces față de necesitățile nutriției cu fosfor ale majorității animalelor. în consecință, metodele de manipulare a nivelurilor acidului fitic își vor găsi utilitate în toate aplica- 43 țiile de furajare și, mai mult decât atât, furnizează șroturi și compoziții furajere care sunt noi și valoroase. 45

Având în vedere aceste considerații, este evident că o modalitate prin care producerea fitatului în cursul dezvoltării seminței ar putea fi reglată ar putea fi utilă și ar furniza o 47 soluție pentru problemele legate de poluarea cu fosfor și de efectele anti-nutritive ale acidului fitic. în plus, arfi valoros, în mod special, un mecanism genetic care și-ar găsi utilitatea într-o 49 gamă largă de specii vegetale. Prezenta invenție prevede asemenea soluții.

RO 122151 Β1

Pentru înțelegerea anvergurii prezentei invenții este necesară aprecierea mecanismului biochimic responsabil de formarea acidului fitic. Deși biosinteză acidului fitic nu este complet cunoscută, există un număr de etape cheie care sunt cunoscute. Acidul fitic este derivatul hexafosfat al mioinozitolului; calea biochimică care sintetizează acidul fitic utilizează, exclusiv ca substrat inițial, mioinozitol, care este un alcool glucidic. De asemenea, acest compus (mioinozitol, cunoscut sub denumirea uzuală de inozitol) este important pentru producerea altor derivați și epimeri mioinozitolici. Unii dintre acești derivați, cum ar fi sucrozilglicozidele sunt, de asemenea, compuși anti-nutritivi și, de aceea, este de dorit reducerea acestor compuși.

Mioinozitolul este un alcool glucidic ubicuitarîn celulele vegetale. Cu toate acestea, simpla protecție a oricăreia dintre grupările hidroxil ale mioinozitolului îl face necorespunzător pentru biosinteză acidului fitic și a altor căi. Protecția mioinozitolului poate fi realizată in vivo prin metilarea la situsurile specifice cu ajutorul diverselor metil-transferaze. Spre exemplu, mioinozitolul este transformat în ononitol prin monometilare în poziția 6. Metilarea în poziția 5 produce sequoiitol, care este epimerizat la pinitol. Pinitolul nu poate fi utilizat pentru biosinteza acidului fitic. Se cunosc derivați metilați ai mioinozitolului care conferă proprietăți benefice plantei, cum ar fi toleranța la stres și care sunt implicați în transportul solutului și stabilizarea proteinelor membranare. Astfel, în cadrul scopului prezentei invenții a fost studiată modificarea inozitolului cu ajutorul activităților enzimatice heteroloage neasociate în mod normal cu metabolismul alcoolilor glucidici. Biochimia formării fitatului nu este bine cunoscută, cu toate acestea, sunt cunoscute cel puțin două căi de formare potențiale și este posibil să existe un număr de activități enzimatice diferite implicate în biosinteză acidului fitic. Fitatul se găsește în majoritatea țesuturilor vegetale, cu toate acestea, el predomină în special în semințe și polen care dețin un posibil rol în depozitarea fosforului. în felul acesta s-a dovedit dificilă inventarea unei modalități de modificare a biosintezei fitatului prin mijloace convenționale, în special datorită faptului că biochimia formării sale nu este bine cunoscută.

în scopul minimizării producerii de acid fitic, prezenta invenție descrie metode și compoziții de ADN care codifică una sau mai multe enzime care modifică mioinozitolul, prevenind utilizarea mioinozitolului în biosinteză acidului fitic. Prezenta invenție studiază utilizarea unei gene pentru metil-transferaza heteroloagă, pentru metilarea specifică a mioinozitolului în sămânță, în particular în țesuturile seminței responsabile de biosinteză acidului fitic (prin heterolog se înțelege o enzimă neasociată în mod normal cu biosinteză fitatului în menționata celulă vegetală). Invenția utilizează o activitate enzimatică heteroloagă obținută dintr-o plantă halofită, o activitate enzimatică negăsită în plantele de cultură convenționale cum ar fi: porumb, soia, bumbac, lucernă, grâu, orz, secară, sorg, floarea soarelui, semințe oleaginoase de Brassica și alte culturi cultivate în mod obișnuit.

Producerea metilinozitolului din mioinozitol asigură, de asemena, beneficiul suplimentar al producerii unui compus inofensiv, lipsit de orice efect nociv pentru celula vegetală. Astfel, prin reducerea rezervei de mioinozitol disponibil, producerea de acid fitic este redusă.

Fitatul este unul dintre factorii anti-nutritivi majori din făina de semințe. Efectele antinutritive ale acidului fitic includ: legarea mineralelor, formarea de complexe cu proteinele și alte efecte negative, în particular cele legate de excreția excesului de fosfor sub formă de acid fitic care este metabolizat în mediul înconjurător, determinând poluarea cu fosfor. în consecință, metodele de reducere a acidului fitic din celulele vegetale au utilitate în aplicațiile de hrănire. în acvacultura, nivelurile ridicate de acid fitic sunt, de asemenea, o problemă majoră pentru utilizarea proteinei derivate din plante ca substitut pentru făina pentru hering, în felul acesta, metodele de reducere a conținutului de acid fitic din celulele vegetale, în particular din celulele țesutului vegetal utilizat pentru furajarea animalelor, sunt valoroase și au

RO 122151 Β1 o mare utilitate. Metodele de reducere a conținutului de acid fitic din semințele de la o gamă 1 vastă de specii vegetale utilizate pentru furajarea animalelor sunt valoroase în mod special pentru industria de furaje. Gena vegetală care codifică mioinozitol-O-metil-transferaza (IMT) 3 a fost izolată din Mesembryanthemum crystallinum (planta de gheață) și s-a arătat că această enzimă transformă mioinozitolul în pinitol în plantele transgenice heteroloage (brevet 5

US 5563324). Această genă vegetală a fost plasată sub controlul unui promotor constitutiv cu scopul de a crește toleranța plantelor la stres prin supraproducerea derivatului metilat al 7 mioinozitolului, ononitolul, care poate fi ulterior epimerizat la pinitol. în prezenta invenție, gena vegetală este plasată sub controlul unui promotor selectiv de sămânță pentru a altera 9 metabolismul inozitolului în sămânță.

S-a arătat că producerea pinitolului descrisă în brevetul US 5563324 conferă tole- 11 ranță față de săruri atunci când este exprimată constitutiv în plante transgenice de tutun. în mod similar, exprimarea unei manitol 1-P dehidrogenaze bacteriene, când este exprimată 13 constitutiv într-o celulă vegetală catalizează producerea manitolului, un alcool glucidic sau poliol și determină celula vegetală să devină tolerantă la stresul salin. în consecință, brevetul 15 US 5563324 descrie producerea alcoolilor glucidici prin utilizarea unei enzime capabile să producă un alcool glucidic din glucidele native din celulele vegetale, ca modalitate de a 17 conferi celulelor vegetale toleranță față de săruri.

Cu toate acestea, brevetul US 5563324 nu furnizează nici o instrucțiune pentru utili- 19 zarea unei gene capabile să modifice mioinozitolul, pentru a preveni utilizarea mioinozitolului ca precursor pentru alți compuși care conțin derivați nativi. Brevetul US5563324 asigură, 21 totuși, dovada clară că modificarea mioinozitolului nu conduce la vreun efect negativ asupra plantei și, în consecință, nu ar fi de așteptat ca manipulările nivelurilor de mioinozitol să con- 23 ducă la efecte nocive. în consecință, posibilitatea modificării mioinozitolului cu o genă pentru metil-transferază nu se anticipează a fi nocivă pentru celulele vegetale, iar produsul metilat 25 al acestei reacții enzimatice este cunoscut a fi inofensiv pentru celulele vegetale.

Cu toate acestea, mioinozitolul este fundamental pentru multe aspecte diferite ale 27 creșterii și dezvoltării vegetale. în afara rolului său ca precursor pentru biosinteză acidului fitic, mioinozitolul este de asemenea utilizat în biosinteză uronidelor și a pentozelor, este 29 prezent și în fosfoinozitidele din membranele celulei vegetale, precum și în alte lipide vegetale complexe, incluzând glicofosfoceramidele. Mai mult decât atât, el este, de asemenea, 31 precursor al altor izomeri inozitolici existenți în mod natural, iar mulți dintre aceștia, precum și mioinozitolul sunt distribuiți ca eteri metilici într-o schemă specifică de specie din cadrul 33 regnului vegetal.

Rolul mioinozitolului în metabolismul vegetal general este larg, iar modificarea depo- 35 zitului de mioinozitol ar putea avea consecințe neprevăzute, în special în condiții de cultivare agronomice. Deși brevetul US 5563324 descrie exprimarea constitutivă a genei pentru metil- 37 transferază, el nu prevede nici o dovadă că plantele rezultante prezintă utilitate. în brevetul US 5563324 se menționează că: Chiar dacă genele nou inserate nu fac o plantă mai perfor- 39 mantă în condiții agricole, plantele transgenice purtătoare de asemenea gene sunt utile pentru scopuri de cercetare, în sensul investigării modului în care modificările din procesele 41 vegetale interne (ex., reglarea osmotică) afectează performanța din câmp a plantelor. (Coloana 2, liniile 60 - 65). Cu toate acestea, brevetul US 5563324 nu anticipează manipul- 43 rea nivelurilor de mioinozitol pentru reducerea acidului fitic și nu prevede total acele plante cu caracteristici agronomice utile și, în consecință, utilitatea va rezulta din sfaturile conținute 45 aici. în consecință, brevetul US 5563324 descrie exprimarea unei gene pentru modificarea mioinozitolului în întreaga plantă, în scopul toleranței la stres sau al studiului științific ulterior. 47

RO 122151 Β1 în consecință, prezenta invenție prezintă o abordare nouă în sensul reducerii acidului fitic. Utilizarea genei pentru metil-transferază este specifică reducerii acidului fitic. Prezenta invenție nu se bazează pe metode deja existente în domeniu, cum arfi exprimarea enzimelor fitazice care nu rezolvă problema excesului de acid fitic din semințe sau șroturi. în cursul studiilor desfășurate aici s-a dedus că nivelurile de acid fitic pot fi controlate prin alterarea nivelurilor de mioinozitol disponibile pentru biosinteză acidului fitic. S-a descoperit că exprimarea unei gene pentru metil-transferază în țesutul seminței conduce la reducerea acidului fitic din sămânță fără nici o modificare demonstrabilă în alte caracteristici ale plantei. Este evident că limitarea exprimării genei pentru metil-transferază în țesuturile seminței responsabile de biosinteză fitatului reduce semnificativ acidul fitic din semințele mature, fără vreun efect suplimentar asupra plantei, chiar dacă aceasta este cultivată în câmp, în condiții extreme de mediu. Utilizarea unui promotor selectiv de țesut oferă multe avantaje invenției, inclusiv restrângerea activității enzimatice la țesutul de sămânță, lăsând metabolismul mioinozitolului intact în celelalte țesuturi.

Obiectivul prezentei invenții este de a abate utilizarea mioinozitolului ca material de plecare în biosinteză acidului fitic, prin diversiune într-un rezervor (”ροοΓ) metabolic, unde este transformat în compuși care sunt inofensivi pentru plantă. Metoda se bazează pe introducerea de noi activități enzimatice care conțin, într-una din aplicații, o genă pentru metiltransferaza care epuizează sau alterează rezerva de mioinozitol utilizat pentru producerea acidului fitic. Epuizarea sau alterarea nivelurilor acestui precursor conduc la o deplasare metabolică în calea normală de biosinteză a acidului fitic și cauzează reducerea nivelului de acid fitic produs.

Baza biochimică a acestei invenții este conceptul de reglare a activității enzimatice prin disponibilitatea substratelor. în general, vitezele enzimatice sunt controlate prin disponibilitatea substratului. O enzimă va produce un produs cu o viteză care este, în general, proporțională cu cantitatea de substrat disponibilă. Reducerea concentrațiilor de substrat conduce la niveluri mai mici ale produșilor finali. în consecință, prezenta invenție prezintă avantajul acestei abordări prin utilizarea unei noi activități enzimatice, o metil-transferază care epuizează disponibilitatea substratului inozitol utilizat pentru formarea acidului fitic. Orice alte enzime capabile să acționeze asupra rezervorului de mioinozitol din semințe ar putea fi utilizate în scopul prezentei invenții. Metoda se bazează pe introducerea unei activități enzimatice care, în orice alte modalități diferite, alterează rezervorul de mioinozitol utilizat pentru biosinteză acidului fitic.

Spre deosebire de brevetul US 5563324, prezenta invenție caută să modifice producerea fitatului într-o manieră selectivă față de sămânță, prin exprimarea unei gene capabile să modifice mioinozitolul, conferindu-i astfel inaccesibilitate pentru producerea acidului fitic. în mod surprinzător, chiar exprimarea constitutivă a unei gene de modificare a mioinozitolului conduce la niveluri reduse de fitat în sămânță. Cu toate acestea, într-o aplicație preferată a prezentei invenții, este utilizat un promotor selectiv pentru sămânță, pentru asigurarea că performanța agronomică a plantei nu este compromisă, iar planta rezultantă este normală în orice modalitate, cu excepția nivelurilor reduse de fitat din sămânță. Prin urmare, spre deosebire de brevetul US 5563324, prezenta invenție nu anticipează producerea de plante tolerante la stres, nici nu le interpretează ca plante utile pentru scopuri de cercetare.

Metoda descrisă oferă multe avantaje față de stadiul cunoscut al tehnicii, legate de reducerea acidului fitic prin exprimarea de enzime fitazice. Acestea includ: plante cu niveluri alterate de acid fitic în țesuturi specifice, plante cu niveluri reduse de acid fitic și șroturi cu conținut redus de acid fitic. Beneficiile unor asemenea plante, semințe și șroturi includ: utilizarea mai bună în furajare și performanța făinii, șroturi și preparate furajere cu niveluri reduse de fosfor și, în consecință, atribute de mediu mai bune și capacitate de a utiliza șroturile menționate pentru aplicații în industria de furaje, utilizări limitate anterior de cantitatea de acid fitic anti-nutritiv din făină sau furaje.

RO 122151 Β1

Metoda descrisă își găsește utilitate în multe specii vegetale. Aceste specii vegetale 1 includ plante mono- și dicotiledonate, precum și culturi cerealiere și oleaginoase. Metoda își găsește utilitate, în mod particular, în plantele oleaginoase și în cele crucifere. Rezultatele 3 acestei modificări genetice sunt celulele vegetale cu metabolism modificat al alcoolilor glucidici, în particular, metabolismul inozitoluIui, și celulele vegetale cu conținut redus de acid 5 fitic, în particular, semințe cu conținut redus de fitat. Astfel, metoda din prezenta invenție prevede o modalitate valoroasă de a altera metabolismul secundar legat de alcoolii glucidici. 7

Deși aplicația acestei invenții implicând alterarea metabolismului alcoolilor glucidici, spre exemplu, celule vegetale cu conținut redus de acid fitic, a fost demonstrată în celule 9 vegetale de rapiță, plantele de porumb au, de asemenea, o concentrație ridicată de acid fitic, iar o reducere a conținutului de acid fitic din celulele de porumb poate fi realizată în mod 11 similar.

Prezenta invenție stipulează metode, construcți genetici și vectori utili pentru modifi- 13 carea conținutului de fitat al celulelor vegetale și semințelor, în particular, pentru reducerea nivelurilor de fitat din celulele vegetale. Invenția prevede, în continuare, metode și compoziții 15 de ADN utile pentru reducerea fitatului în semințele plantelor. în continuare, invenția face referire la făină modificată de semințe și la furaje pentru animale conținând făină modificată 17 de semințe, în particular, făină de semințe cu conținut redus de fitat.

Reducerea acidului fitic este realizată cu ajutorul metodelor și compozițiilor de ADN 19 nou descrise. Metoda constă în dezvoltarea unui șunt metabolic sau a unei noi căi biochimice, capabile să abată un precursor din calea biosintetică a acidului fitic spre o nouă și 21 nou introdusă cale a finalului mort care reduce producția de acid fitic. Ca rezultat al unei aplicații specifice a acestei metode, produsul(șii) căii finalului mort sunt compuși cunoscuți 23 ca fiind inofensivi pentru celula vegetală menționată. în consecință, este admis în totalitate faptul că șuntarea compușilor precursori ai mioinozitolului în acești compuși nu va compro- 25 mite performanța plantei în niciun fel.

în concordanță cu un alt aspect al invenției, pentru producerea de semințe cu conținut 27 alterat de acid fitic, în particular, de semințe cu conținut redus de acid fitic, au fost prevăzuți vectori și construcți ADN recombinanți. în plus, un alt aspect al invenției prevede semințe de 29 plante utile pentru producerea de șroturi cu conținut redus de fitat. Menționatul șrot are niveluri reduse de fitat și, ca urmare, este util pentru furajarea animalelor, în special pentru 31 acele aplicații în care acidul fitic este asociat cu poluarea mediului înconjurător sau a fost identificat ca factor anti-nutritiv. Invenția mai prevede, de asemenea, făini modificate, deri- 33 vate din semințe alterate genetic care pot fi utilizate în diferite diete animale, incluzându-le pe cele pentru pui, porci, vite și pești. 35

Metoda constă din adăugarea unei noi activități enzimatice care poate altera conținutul de mioinozitol din semințe și poate fi direct aplicată în toate speciile și varietățile 37 de plante. Aceeași genă poate fi utilizată în orice specie vegetală, deoarece alterarea mioinozitolului se va realiza în aceeași manieră în orice specie vegetală. Metoda nu se bazează pe 39 utilizarea tehnologiilor de supresie a genei care sunt dependente de secvența de ADN și, ca urmare, ar necesita gene specifice gata făcute pentru fiecare genă specifică sau specie de 41 plantă cultivată. Astfel, utilitatea prezentei invenții pentru toate culturile este evidentă. în scopul metodei pot fi întrebuințate numeroase enzime adecvate, provenind din surse micro- 43 biene, vegetale sau animale. Aceiași construcți genetici pot fi utilizați într-o varietate de specii vegetale diferite. 45

Așadar, în conformitate cu un aspect larg al prezentei invenții, este prevăzută o metodă de reducere a conținutului de fitat din semințele plantelor, metodă constând în cons- 47 truirea unui vector de transformare vegetală conținând, pe lângă un marker selectabil care permite identificarea celulelor vegetale transformate cu amintitul vector, o enzimă capabilă 49 să metabolizeze mioinozitolul, făcând mioinozitolul necorespunzător pentru producerea de acid fitic. 51

RO 122151 Β1 în contextul prezentei invenții, metabolizarea inozitolului include: hidroxilarea, izomerizarea, metilarea, clivarea, sau orice altă modificare biochimică care face mioinozitolul incapabil de a fi supus acțiunii activității enzimatice corespunzătoare, care acționează, în mod normal, asupra mioinozitolului, cu producerea de acid fitic. Ca urmare, metabolizarea include orice modificare care reduce eficient disponibilitatea mioinozitolului din rezervorul de substrate corespunzătoare pentru biosinteza acidului fitic.

Ca un exemplu al prezentei invenții, pentru a ilustra unul dintre aspectele invenției este utilizată o genă care codifică o metil-transferază a mioinozitolului. Enzima menționată, aflată sub controlul unui promotor selectiv pentru exprimarea în celulele semințelor de plante este capabilă să epuizeze rezervorul de mioinozitol disponibil pentru producerea fitatului în menționata sămânță de plantă. în conformitate cu un alt aspect al prezentei invenții, menționata metil-transferază este capabilă să transforme mioinozitolul într-o substanță inofensivă.

De aceea, în general, celulele vegetale produse prin metoda conformă prezentei invenții au un metabolism primar nealterat și au fenotipuri care nu se pot deosebi de plantele nemodificate, cu excepția alterării produsului sau produșilor dintr-o o cale metabolică secundară specifică.

Cu scopul de a asigura că metabolismul primar este neafectat, prezenta invenție descrie o metodă de țintire, într-o manieră specifică de țesut, a formării unui metabolit secundar prin alterarea disponibilității unui substrat care este specific căii metabolice secundare și esențial formării produsului final al căii, în particular a acelor substrate din prima până la a cincea etapă biochimică ale formării produsului final. în acest fel se obține o reducere a produșilor specifici ai căii metabolice secundare.

în contextul prezentei invenții, compușii utilizați ca precursori ai produselor căii metabolice secundare fenilpropanoidice includ, dar nu se limitează la: acid cinamic, acid pcumaric, acid cafeic, acid ferulic, acid 5-hidroxiferulic, acid sinapic, colină, diverși compuși sinapoilici care includ, dar nu se limitează la: sinapoil-glucoză, sinapoil-malat și sinapoilcolină. în contextul prezentei invenții, produșii căii fenilpropanoidice includ, dar nu se limitează la: flavonoide, lignine, diferiți compuși fenolici monomerici și polimerizați și sinapină. Prin selecția unei enzime specifice se poate realiza orice numărde alterări ale nivelurilor produșilor din calea fenilpropanoidică. Enzimele utilizate pentru modificarea sau țintirea compușilor utilizați ca precursori potfi de origine microbiană, animală sau vegetală. Enzimele pot avea răspândire naturală sau pot fi derivate prin mutația unei enzime cunoscute pentru alterarea specificității sale de substrat, producând în acest fel o nouă activitate enzimatică. Enzimele utilizate în scopul prezentei invenții pot fi cele capabile să modifice compușii utilizați ca precursori pentru produsele întâlnite în calea fenilpropanoidică prin: izomerizare, conjugare, fosforilare, hidroxilare, oxidare, dehidrogenare, metilare sau orice altă activitate biochimică (incluzând legarea sau sechestrarea) sau pot cuprinde enzimele capabile să distrugă compușii utilizați ca precursori în calea fenilpropanoidică cum ar fi: hidrolaze, decarboxilaze, oxidaze, esteraze sau orice alte enzime capabile să degradeze: acidul cinamic, acidul p-cumaric, acidul cafeic, acidul ferulic, acidul 5-hidroxi-ferulic, acidul sinapic, sinapoilglucoza, sinapoil-malatul sau colina (utilizată pentru producerea sinapinei din sinapoilglucoză). într-un aspect al metodei sunt utilizate enzimele care produc substanțe protectoare față de stres, din compuși utilizați ca precursori ai produșilor formați în mod normal în calea fenilpropanoidică. în mod similar, utilizarea unei activități enzimatice pentru reducerea unui substrat suplimentar, neprodus ca parte a căii fenilpropanoidice, dar necesar pentru formarea unui produs ai căii fenilpropanoidice poate fi utilizată pentru reducerea nivelului produsului amintit. în consecință, în scopul prezentei metode potfi țintiți ambii compuși utilizați ca precursori în calea fenilpropanoidică și oricare alt compus solicitat de calea fenilpropanoidică pentru obținerea produșilor.

RO 122151 Β1 în contextul prezentei invenții, compușii utilizați ca precursori pentru produșii căii 1 metabolice secundare a alcoolilor glucidici includ, dar nu se limitează la: mioinozitol, galactinol și UDP-derivați ai glucidelor. Produșii metabolismului alcoolilor glucidici includ, dar nu se 3 limitează la: acid fitic, stahioză, rafinoză, sucrozil-glicozide, uronide și pentoze, fosfoinozitide și glicofosfoceramide. în contextul prezentei invenții, activitatea enzimatică utilizată pentru 5 alterarea compușilor metabolismului alcoolilor glucidici o include pe cea capabilă de hidroxilare, izomerizare, metilare, clivare sau oricare altă modificare biochimică (cum ar fi legarea 7 sau sechestrarea) care face un alcool glucidic incapabil de a fi supus acțiunii activității enzimatice corespunzătoare care, în mod normal, acționează asupra amintitului alcool glucidic. 9 în ilustrarea prezentei invenții în calea metabolică secundară a alcoolilor glucidici, s-a constatat că metilarea inozitolului, care este precursorul acidului fitic, reduce disponibilitatea 11 inozitolului pentru biosinteză acidului fitic.

în consecință, este clar pentru specialiștii din domeniu că precursorii unui produs final 13 dintr-o cale metabolică secundară sunt acei compuși biochimici care sunt utilizați direct pentru formarea unui metabolit secundar, sau acei compuși biochimici care sunt utilizați într- 15 o reacție biochimică conducând la formarea unui metabolit secundar specific, amintiții compuși biochimici nefiind un metabolit primar. 17

Enzimele utilizate pentru punerea în aplicare sau țintirea compușilor care funcționează ca precursori ai produselor dintr-o cale metabolică secundară produc, de preferință, 19 din compușii menționați, substanțe care sunt inofensive pentru celula vegetală și, prin urmare, se pot acumula în cantități ridicate fără alterarea proprietăților celulei vegetale. 21 Enzimele pot produce, de asemenea, substanțe care conferă un efect benefic celulei vegetale, cum ar fi producerea de protectanți de stres din amintiții compuși utilizați ca precursori 23 ai produșilor căii metabolice secundare. Enzimele utilizate pot produce, de asemenea, substanțe de utilitate cum ar fi chimicale industriale, substanțe farmaceutice sau nutraceutice. 25 în scopul prezentei invenții pot fi întrebuințate una sau mai multe enzime, iar pentru reducerea nivelului compușilor specifici utilizați ca precursori pentru un produs al unei căi meta- 27 bolice secundare pot fi utilizate mai multe activități distincte.

Enzimele utilizate în contextul prezentei invenții pot proveni din mai multe surse sau 29 se pot obține printr-o varietate de metode. Spre exemplu, artizanul calificat poate identifica un compus utilizat drept precursor dintr-o cale metabolică secundară spre a fi țintit în scopul 31 prezentei metode. Structura chimică a acestor compuși este bine cunoscută sau poate fi identificată și deci pentru a identifica o enzimă cu activitate cunoscută asupra substratelor 33 similare din punct de vedere chimic se poate analiza literatura despre enzime. în consecință, o enzimă corespunzătoare poate fi identificată, iar gena izolată și utilizată în contextul 35 prezentei invenții. în plus, ca bază pentru obținerea unei gene sintetice se pot utiliza, de asemenea, chimia combinatorială sau scheme similare care caută proteine produse în mod 37 artificial pentru o activitate dezirabilă. Enzimele utilizate în scopul prezentei invenții pot fi modificate cu ajutorul metodelor cunoscute în mod curent în domeniu. 39

Ca exemplu de modificare enzimatică, gena care codifică o enzimă capabilă să acționeze asupra compușilor înrudiți chimic, utilizați ca precursori într-o cale metabolică 41 secundară, poate fi modificată și/sau selecționată în ceea ce privește o activitate sporită, prin întrebuințarea unor tehnici de tipul: modificare situs-specifică, mutație și selecție cu speci- 43 ficități alterate în sistemele heteroloage cum ar fi celulele bacteriene sau fungice. Aceasta poate include exprimarea genei care codifică enzimă menționată alterată din celulele 45 bacteriene, incapabilă de a metaboliza compușii menționați, selecția bacteriilor care exprimă enzimă și sunt capabile să crească pe compușii menționați ca unic nutrient sau unică sursă 47

RO 122151 Β1 de carbon și regenerarea unei activități enzimatice capabile să acționeze asupra unui compus specific utilizat ca precursor într-o cale metabolică secundară. în felul acesta, este posibilă producerea unei enzime cu specificitate pentru un compus specific utilizat ca precursor într-o cale metabolică secundară specifică. Alternativ, bacteriile pot fi selecționate pentru creștere pe diferiți compuși utilizați ca precursori într-o cale metabolică secundară. Artizanul calificat poate aprecia rapid dacă selecția bacteriilor mutaționate sau a altor celule pe compuși specifici utilizați ca precursori într-o cale metabolică secundară poate furniza un instrument de identificare a activităților enzimatice specifice, capabile să transforme compușii menționați în substanțe inofensive. Această abordare poate include selecția directă a activităților enzimatice specifice sau modificarea pas-cu-pas și selecția activităților enzimatice dorite.

în mod similar, utilizarea activităților enzimatice cunoscute, folosite în mod curent în scopuri comerciale, cum ar fi preparatele enzimatice pe bază de extracte fungice de Trichoderma, capabile să degradeze lignina în operațiile de decorticare, poate furniza o sursă de activitate enzimatică potrivită, spre exemplu, pentru izolarea enzimelor implicate în degradarea compușilor fenolici. Este evident pentru cei calificați în domeniu că genele care codifică enzimele utilizate în industria hârtiei pentru prelucrarea ligninei pot fi utilizate în scopul metodei fie direct, fie după modificare, pentru a acționa specific asupra unuia dintre compușii utilizați ca precursori în calea fenilpropanoidică. în consecință, s-a presupus că, în scopul prezentei metode pot fi întrebuințate diferite activități enzimatice. De aceea, metoda nu este limitată de sursa sau de specificitatea enzimei utilizate.

Spre exemplu, într-un aspect al metodei, o enzimă care este exprimată într-o celulă vegetală acționează asupra unui compus utilizat drept precursor sau substrat al unui produs din calea fenilpropanoidică în scopul producerii unei substanțe care nu este supusă acțiunii enzimei mai mult timp decât ar utiliza, în mod normal, compusul menționat ca precursor din calea fenilpropanoidică. în consecință, nivelurile produsului specific din calea fenilpropanoidică sunt diminuate prin reducerea precursorilor necesari pentru formarea produsului menționat. Celula vegetală rezultantă poate fi utilizată direct sau poate fi indusă să regenereze o plantă întreagă, cu niveluri alterate ale produșilor din calea fenilpropanoidică, plantă care are utilitate în nenumărate procese industriale, nelimitate la aplicațiile furajere, aplicațiile de decorticare sau de producere de plante cu compoziții noi ale compușilor fenolici, incluzând supraproducția anumitor produși din calea fenilpropanoidică. Copacii cu niveluri alterate ale produșilor fenilpropanoidici vor avea utilitate în industria de decorticare și a hârtiei. Plantele cu niveluri alterate ale produșilor fenilpropanoidici vor avea utilitate în industria de furaje. Metoda se bazează, de asemenea, pe regenerarea și utilizarea celulelor sau țesuturilor vegetale cu proprietăți alterate, în particular a țesutului vegetal utilizat pentru aplicațiile furajere sau alte procese industriale. Este posibil ca alterările căii fenilpropanoidice inventate în scopul prezentei invenții să poată conduce, de asemenea, la schimbări pozitive în performanța agronomică a plantelor derivate din metodele menționate, în particular din acele aspecte ale invenției în care producerea unui protectant de stres rezultă din activitatea enzimatică adăugată. Pot fi anticipate și alte efecte benefice care pot include rezistența mărită față de boli și lumina UV, forța mecanică, etc.

într-o aplicație ulterioară a invenției, metoda include etapa de cultivare a celulei vegetale menționate și de regenerare a plantei în care produșii căii fenilpropanoidice au fost alterați.

în continuare, într-o altă aplicație, invenția include utilizarea plantei menționate pentru un proces industrial, cum ar fi producerea de compuși utili, prepararea sau decorticarea furajelor.

RO 122151 Β1

Genele care codifică enzimele capabile să acționeze asupra compușilor utilizați drept 1 precursori ai produșilor căii fenilpropanoidice pot fi naturale, sintetice sau o combinație între acestea. Practicantul calificat va aprecia rapid că secvența de codificare a genei poate fi 3 modificată pentru a permite grade ridicate de exprimare în celulele vegetale. Aceasta se poate realiza prin alterarea secvențelor de codoni pentru o asemănare mai corectă a utilizării 5 codonului aflat în mod normal în celula vegetală în care va fi exprimată gena. Mai mult decât atât, este evident că situsurile specifice de restricție pot fi prelucrate în sensul asigurării unei 7 manipulări convenabile a secvenței codificatoare. De asemenea, s-a studiat dacă adăugarea diferitelor secvențe, cum ar fi amplificatorii translaționali, intronii etc. poate fi utilizată pentru 9 a asigura exprimarea adecvată a secvenței codificatoare. De asemenea, enzimele pot fi modificate prin alterarea situsurilor de legare a substratului sau altă modificare în secvența 11 primară a aminoacizilor care amplifică activitatea enzimatică. Toate aceste manipulări sunt obișnuite în domeniu și vor fi rapid apreciate de către lucrătorul calificat. 13 într-un alt aspect al prezentei invenții, enzima se află sub controlul unui promotor selectiv pentru țesut, în particular, al unui promotor selectiv pentru sămânță. Un promotor 15 selectiv pentru sămânță este un promotor care funcționează exclusiv sau preferențial pentru a determina ca exprimarea secvențelor de sub controlul său să fie limitată la țesutul unei 17 semințe. Ca urmare, nivelurile produsului specificai căii fenilpropanoidice sunt alterate într-o manieră selectivă de țesut, părăsind celelalte țesuturi ale plantei cu niveluri normale ale pro- 19 dușilor căii fenilpropanoidice. Țesutul în care enzima este exprimată selectiv este utilizat pentru prepararea furajelor sau în orice alt proces industrial. Este evident pentru specialistul 21 avizat că în scopul prezentei invenții pot fi utilizați orice promotori selectivi pentru țesut. în particular, un promotor selectiv pentru sămânță este utilizat pentru alterarea produșilor căii 23 fenilpropanoidice în plantele cultivate în care sămânța sau făina de semințe sunt folosite pentru furajare. La alte culturi pot fi utilizați diverși promotori selectivi pentru țesut, dependent 25 de porțiunea de plantă în care este dorită alterarea conținutului fenolic. Spre exemplu, un promotor selectiv pentru rădăcină sau tuberculi poate fi utilizat pentru alterarea conținutului 27 fenolic sau de lignină al culturilor rădăcinoase sau tuberculifere cum ar fi: cartof, nap turcesc, manioc, etc. în cazurile în care frunzele sau tulpinile sunt folosite drept furaj, un promotor 29 selectiv pentru frunză sau tulpină poate fi folosit pentru limitarea exprimării enzimelor capabile să acționeze asupra compușilor utilizați ca precursori în calea fenilpropanoidică. Alți 31 promotori selectivi pentru țesut pot fi utilizați în plante cum ar fi copacii care sunt recoltați pentru fabricarea hârtiei. Astfel, un promotor care limitează activitatea enzimei la lemnul 33 copacului își găsește utilitate în scopul prezentei metode.

într-un aspect specific al prezentei invenții a fost studiată exprimarea unei secvențe 35 codificatoare a enzimei care metabolizează colina din celulele vegetale. Exprimarea enzimei menționate care metabolizează colina epuizează rezervorul de colină disponibilă utilizată 37 pentru formarea sinapinei din sinapoil-glucoză. Unele specii vegetale, în special cele din familia Cruciferae produc un compus anti-nutritiv numit sinapină. Se presupune că sinapina 39 este sintetizată prin schimbarea părții de glucoza din sinapoil-glucoză (sin-glu) cu colina. Reducerea compusului anti-nutritiv sinapină sporește valoarea seminței și a făinii rezultate, 41 derivate din ea. Utilizarea unei enzime pentru modificarea colinei, cum ar fi colin oxidaza prezintă utilitate în prezenta invenție. 43

Este cunoscut faptul că colina este oxidată la betaină în plantele alimentare cum ar fi: grâu, spanac, sfeclă de zahăr și orz (Rhodes and Hanson, 1993, Annual Review ofPlant 45

Physiology and Plant Molecular Biology, 44: 357 - 384). Această cale oxidativă este catalizată de două enzime (cunoscute, în termeni generici, ca sistemul de oxidare a 47 colinei), iar produșii acestei căi sunt prezentați mai jos:

Colină - betain aldehidă - glicinbetaină (betaină)

RO 122151 Β1

Prima etapă este catalizată de o colin dehidrogenază (CDH) sau colin oxidază (COX) de la bacterii și animale (Roswadowski, Khachatourians and Selvaraj, 1991, Journal of Bacteriology, 173:472-478) și de o colin monooxigenază (CMO) din plante (Rhodes and Hanson, 1993). Cea de-a doua etapă este catalizată de o betain aldehid dehidrogenază (BADH) (Rhodes and Hanson, 1993). Ca urmare, utilizarea unei enzime de metabolizare a colinei poate epuiza rezervorul de colină disponibilă, într-o manieră generală sau specifică, prin utilizarea unor promotori constitutivi, inductibili sau specifici pentru țesut. Reducerea disponibilității colinei scade producerea de sinapină. în plus, reducerea sinapinei poate determina schimbări ale nivelurilor altor produși ai căii fenilpropanoidice, conducând la un țesut vegetal cu conținut fenolic alterat.

într-o altă aplicație specifică a prezentei invenții, o genă pentru colin oxidaza (COX) microbiană (Roswadowski, Khachatourians and Selvaraj, 1991, Journal of Bacteriology, 173:472-478) este plasată sub controlul unui promotor selectiv pentru sămânță. Exprimarea colin oxidazei în semințe deturnează colina, unul dintre precursorii biosintezei sinapinei din semințele de rapiță, spre o substanță inofensivă, betaina, prin formarea betain aldehidei care este transformată lent în betaină prin activitatea enzimei COX. Sămânța conținând ADN-ul recombinant are niveluri reduse de sinapină și niveluri modificate ale altor produși ai căii fenilpropanoidice. Făina obținută din sămânța menționată este utilă pentru aplicațiile de furajare.

într-o altă aplicație specifică a prezentei invenții, gena COX este utilizată sub controlul unui promotor selectiv pentru sămânță, iar o a doua enzimă, BADH, este utilizată pentru intensificarea formării de betaină din betain aldehidă. în această aplicație, BADH (Boyd, L.A., L. Adam, L.E. Pelcher, A. McHughen, R. Hirji and G. Selvaraj, 1990, Gene 103: 45-52) este exprimată sub controlul unui promotor selectiv pentru sămânță. Betaina este un compus existent în părțile comestibile ale multor plante alimentare sau furajere care este utilizat, de asemenea, ca aditiv alimentar sau furajer, în unele împrejurări. De asemenea, betaina manifestă și o funcție protectoare față de stres.

într-o altă aplicație specifică a prezentei invenții, gena COX este utilizată într-o celulă vegetală de crucifere (Brassica sp.) sub controlul unui promotor selectiv pentru sămânță, iar o a doua enzimă, BADH, exprimată, de asemenea, sub controlul unui promotor selectiv pentru sămânță, este utilizată pentru asigurarea formării betainei din betain aldehidă.

Alterarea colinei în sămânța de crucifere asigură o reducere a conținutului de sinapină și, ulterior, o alterare a diverșilor produși ai căii fenil-propanoidice. Este general acceptat faptul că alterarea nivelurilor de colină din sămânță conduce la niveluri mai mari ale sinapoilglucozei sau ale altor compuși sinapoilici cum ar fi sinapoil malatul care, la rândul său, alterează nivelurile de acid sinapic - un precursor al ligninei. în consecință, este invocat mecanismul biochimic reglator cunoscut, în mod obișnuit, sub denumirea de inhibiție prin produs final, care conduce la alterarea nivelului diverșilor produși ai căii fenil-propanoidice. Astfel, prevenirea formării sinapinei are ca rezultat modificările nivelurilor unui număr de produși formați în etapele din calea fenilpropanoidică anterior etapei terminale a formării sinapinei.

De asemenea, calea metabolică secundară fenilpropanoidică poate fi țintită, cu ajutorul enzimei care acționează asupra acidului ferulic, exprimată în celulele vegetale. Acidul ferulic este un alt precursor din calea fenilpropanoidică. în felul acesta sunt reduse nivelurile acidului ferulic. Reducerea disponibilității acidului ferulic conduce la alterări ale nivelurilor compușilor fenolici, incluzând reducerea sinapinei în plantele crucifere.

Genele care codifică enzimele capabile să acționeze asupra acidului ferulic pot fi naturale, sintetice sau o combinație între acestea. Practicianul specializat va aprecia rapid că secvența de codificare a genei poate fi modificată pentru a asigura grade ridicate de exprimare în celulele vegetale.

RO 122151 Β1 în conformitate cu un alt aspect al invenției, gena care codifică enzima capabilă să 1 acționeze asupra acidului ferulic este plasată sub controlul unui promotor (activator) selectiv pentru țesut. în consecință, nivelurile de acid ferulic sunt alterate într-o manieră selectivă 3 pentru țesut, părăsind celelalte țesuturi ale plantei cu niveluri normale de acid ferulic. Țesutul în care enzima este exprimată în mod selectiv este utilizat la prepararea unui furaj, preparat 5 alimentar sau în orice proces industrial.

Enzimele studiate în sensul folosirii în aceste aplicații ale prezentei invenții le includ 7 pe cele capabile să modifice acidul ferulic și, în particular, acele enzime cunoscute ca producătoare de compuși valoroși din acidul ferulic. Este evident pentru un specialist din domeniu 9 că în scopul metodei de metabolizare a acidului ferulic pot fi întrebuințate și alte enzime.

Surse cunoscute de activitate enzimatică care metabolizează acidul ferulic se găsesc în 11 următoarele microorganisme: Aerobacter sp., Bacillus megaterium, B. subtilis, Corynebacterium glutamicum, Enterobacter sp., Pseudomonas sp., Streptomyces sp., 13 Aspergillus sp., Candida sp., Fusariumsp., Hansenulasp., Penicilliumsp., Rhodo-torulasp., Saccharomyces sp. Această listă nu este exhaustivă, dar servește la ilustrarea numeroaselor 15 surse de enzime care metabolizează ferulatul, găsite în lucrările de specialitate. Astfel, metoda nu este limitată prin sursa de enzimă utilizată pentru a metaboliza acidul ferulic. în 17 scopul prezentei invenții, pentru a asigura exprimarea optimă în celulele vegetale, s-a studiat alterarea genei microbiene codificate. Metodele menționate sunt bine cunoscute în domeniu. 19

Ca exemplu de astfel de enzime s-a utilizat o acid ferulic decarboxilază din B. pumulis. Gena pentru această enzimă a fost izolată și secvențializată (Zago și colab., 21 Applied and Environmental Microbiology 61: 4484-4486, 1995). Secvența genică poate fi modificată pentru a se asemăna mai mult cu o genă vegetală, cu condiția păstrării secvenței 23 prevăzute de aminoacizi. Enzima este capabilă să producă vinilguaiacol din acidul ferulic, prin decarboxilare. în felul acesta, într-unul din exemplele metodei, un compus valoros (vinii- 25 guaiacol, VG) este produs prin activitatea unei gene introduse, capabile să acționeze asupra acidului ferulic. Enzima nu necesită co-factori suplimentari și are o masă moleculară 27 aparentă de aproximativ 22 Kda.

într-o altă aplicație specifică a prezentei invenții, enzima ferulat decarboxilaza este 29 plasată sub controlul unui promotor selectiv pentru țesut, conducând la o plantă cu țesuturi modificate specific în ceea ce privește metabolismul acidului ferulic. 31

Alterarea acidului ferulic asigură o reducere a conținutului de acid ferulic și, în continuare, o alterare a diverșilor produși ai căii fenilpropanoidice. 33

Prezenta invenție mai studiază și producerea de țesut vegetal, în particular sămânță, care prezintă utilitate pentru aplicațiile furajere sau alimentare. Atât furajarea directă cu 35 sămânță, cât și utilizarea făinii modificate din sămânța prelucrată fac parte din scopul prezentei invenții. Reducerea conținutului fenolic din semințele plantelor este de dorit în aplica- 37 țiile furajere, iar sămânța modificată genetic, cu conținut fenolic alterat, în particular cu conținut fenolic anti-nutritiv diminuat, prezintă utilitate în industria furajeră. 39 în afara furajării directe cu sămânța întreagă sau parțial spartă, există multe metode utilizate pentru producerea de șroturi. De importanță deosebită în cazul semințelor cruci- 41 ferelor este producerea de făină în timpul extracției uleiului din semințele lor oleaginoase. în general, uleiul este extras din semințele oleaginoase cu ajutorul, fie a unui proces cu sol- 43 venți, fie a unuia fără solvent. Turta sau solidele expulzate în urma acestui proces sunt folosite în formulările făinoase și conțin, de obicei, majoritatea conținutului fenolic al semințelor 45 de crucifere. O metodă de producere a făinii cu conținut fenolic scăzut prevede o compoziție nouă, care nu se întâlnește în mod curent în făina obținută din semințele cruciferelor. 47

Prezenta invenție are în vedere utilizarea semințelor modificate genetic, produse în conformitate cu metoda de obținere a unui produs făinos, cu conținut fenolic alterat. 49

RO 122151 Β1

Metoda descrisă oferă multe avantaje pentru alterarea unui fenotip vegetal. în plus, metoda permite producerea de diverși compuși cu utilitate industrială cunoscută. Metoda descrisă își găsește utilitate în orice specie vegetală sau țesut vegetal.

Metoda descrisă oferă multe avantaje lucrării publicate, în legătură cu manipularea căii fenilpropanoidice. Metoda nu se bazează pe mutații cum ar fi mutația SIN1 care se manifestă în plantă și este asociată cu sensibilitatea față de lumina UV. Metoda nu utilizează mecanismele genetice desemnate să blocheze exprimarea genei, cum ar fi ARN-ul antisens sau co-supresia, care necesită donarea genelor vegetale din calea fenilpropanoidică. Metoda nu modifică în mod specific vreo genă nativă din plantă. în felul acesta, diverse funcții ale căii, cum ar fi producerea de flavonoide, producerea de protectanți față de lumina UV, implicarea în răspunsul la boală și alte funcții biochimice ale căii nu sunt alterate în detrimentul plantei. Prin utilizarea promotorilor selectivi de țesut, conținutul fenolic poate fi alterat în orice țesut, în timp ce celelalte țesuturi ale plantei rămân nemodificate.

Metoda descrisă își găsește utilitate în multe specii de plante dar, în mod particular, în plantele crucifere. Ca rezultat al metodei, un beneficiu suplimentar este asigurat prin producerea unui proiectant față de stres sau a unui compus industrial valoros, ca rezultat al activității enzimatice introduse. Este evident că orice număr de etape din calea fenilpropanoidică pot fi țintite prin metodă și alte căi biochimice pot fi, de asemenea, modificate cu o abordare similară.

De asemenea, prezenta invenție își găsește utilitate și în modificarea altor căi metabolice secundare. Spre exemplu, într-o aplicație a prezentei invenții sunt prevăzute metode și construcți ADN pentru producerea de plante cu metabolismul alcoolilor glucidici alterat, în particular, alterarea conținutului de fitat din celulele semințelor. Fitatul este derivat din alcoolul glucidic mioinozitol care servește, de asemenea, ca precursor sau intermediar pentru formarea altor compuși incluzând: stahioză, rafinoză, sucrozil glicozide, uronide și pentoze, fosfoinozitide și glicofosfoceramide. Invenția prevede, în continuare, metode și compoziții ADN pentru reducerea conținutului de fitat din semințele cruciferelor. Invenția prevede, de asemenea, semințe cu conținut redus de acid fitic adecvate aplicațiilor furajere, semințe cu conținut redus de acid fitic adecvate pentru prepararea de făini modificate și celule vegetale cu metabolismul inozitolului modificat.

Prezenta invenție prevede metode și construcți ADN pentru producerea de plante cu conținut alterat de fitat în celulele seminței. Invenția prevede, în continuare, metode și compoziții ADN pentru reducerea conținutului de fitat din monocotiledonate, dicotiledonate, semințe oleaginoase și semințe de crucifere. De asemenea, invenția prevede, semințe de plante cu conținut redus de acid fitic adecvate pentru aplicațiile furajere, semințe cu conținut redus de acid fitic potrivite pentru prepararea de făini modificate și celule vegetale cu metabolismul inozitolului modificat.

Prezenta invenție intenționează exprimarea de gene care codifică enzime ce acționează asupra unui precursor al alcoolilor glucidici pentru biosinteză acidului fitic, mioinozitol, determinând abaterea metabolică a acestui precursor înspre compușii „cu final mort sau slab metabolizați care se pot acumula fără prejudicii în celula vegetală. în acest fel se obține o reducere a biosintezei acidului fitic. Metodele descrise în prezenta invenție pot avea drept țintă și alți alcooli glucidici. Enzimă utilizată pentru țintirea mioinozitolului poate fi de origine microbiană, animală sau vegetală. Enzimă poate fi întâlnită în mod natural sau poate fi derivată prin mutația unei enzime cunoscute pentru a-i altera specificitatea de substrat, în felul acesta producând o nouă activitate enzimatică.

Enzimă utilizată pentru a acționa asupra mioinozitolului produce preferențial compuși care sunt inofensivi pentru celula vegetală și, de aceea se pot acumula până la niveluri ridicate fără efecte nocive asupra celulei vegetale. în scopul prezentei invenții pot fi utilizate una sau mai multe enzime, iar pentru reducerea nivelului de mioinozitol se poate folosi mai mult de o singură activitate distinctă.

RO 122151 Β1

Enzimele utilizate în scopul prezentei invenții și cele capabile să modifice mioinozi- 1 toiul prin izomerizare, conjugare, fosforilare, hidroxilare, metilare sau orice altă activitate biochimică similară pot să conțină enzime capabile să elimine mioinozitolul sau alți alcooli 3 glucidici.

Enzimele utilizate în contextul prezentei invenții pot fi derivate dintr-un număr de 5 surse sau printr-o varietate de metode. Spre exemplu, artizanul calificat poate identifica o enzimă cu activitate cunoscută asupra unor substrate similare din punct de vedere chimic. 7 în acest fel, enzima poate fi identificată, gena izolată și utilizată în contextul prezentei invenții. Enzimele utilizate în scopul prezentei invenții pot fi modificate folosind metode 9 cunoscute în mod obișnuit în domeniu. Metoda se bazează, în continuare, pe utilizarea transformării pentru a introduce gena care codifică enzima în celulele vegetale. Transformarea 11 celulei vegetale poate fi realizată printr-o varietate de mijloace. Metodele care au utilitate generală includ sistemele pe bază de Agrobacterium utilizând, fie plasmide binare și co- 13 integrate de A. tumefaciens și de A. rhyzogenes (ex. brevet US 4940838, US 5464763), abordarea biolistică (ex. brevet US 4945050, US 5015580, US 5149655), microinjectarea 15 (ex. brevet US 4743548), preluarea directă de către protoplaști (ex. brevet US 5231019,

US 5453367), fie whiskers de tip ac (ex. brevet US 5302523). Orice metodă de transformare 17 genetică a unei celule vegetale poate fi utilizată în contextul prezentei invenții.

De asemenea, metoda se bazează pe regenerarea și utilizarea de celule sau țesuturi 19 vegetale cu proprietățile alterate, în particular, țesut de semințe utilizate pentru furajare.

în felul acesta sunt obținute celule vegetale cu metabolismul alcoolilor glucidici 21 alterat. Numeroși compuși derivă din alcooli glucidici, dar de importanță primară este acidul fitic sau fitatul. Metodele de reducere a fitatului în anumite celule vegetale își găsesc o mare 23 utilitate în aplicațiile pentru furajare.

Genele care codifică enzimele capabile să acționeze asupra mioinozitolului pot fi 25 naturale, sintetice, sau o combinație între acestea. Practicianul calificat va aprecia rapid faptul că secvența codificatoare a genei poate fi modificată în sensul asigurării de niveluri 27 ridicate de exprimare în celulele vegetale. Acest lucru poate fi înfăptuit prin alterarea secvențelor de codoni pentru o mai corectă asemănare a utilizării codonului aflat în mod normal în 29 celula vegetală în care va fi exprimată gena. Mai mult decât atât, este evident că situsurile de restricție specifice pot fi prelucrate în așa fel încât să permită manipularea convenabilă 31 a secvenței codificatoare. S-a presupus, de asemenea, că adăugarea diverselor secvențe, cum arfi: amplificatori translaționali, introni etc., poate fi utilizată pentru asigurarea exprimării 33 adecvate a secvenței codificatoare. Toate aceste manipulări sunt obișnuite în domeniu și vor fi apreciate rapid de către specialistul în domeniu. De asemenea, este evident că un pro- 35 motor selectiv de țesut poate fi utilizat pentru limitarea exprimării enzimei capabile de a modifica mioinozitolul din acele țesuturi în care este produs acidul fitic, cum ar fi țesutul 37 seminței. Promotori selectivi pentru sămânță, corespunzători, includ: promotorul din napină din Brassica napus, promotorul din faseolină din Phaseolis, sau orice alt promotor care este 39 selectiv pentru sămânță.

în particular, prezenta invenție intenționează utilizarea unei mioinozitol O-metil-trans- 41 feraze, cum ar fi cea disponibilă din Mesembryanthemum crystallinum.

Prezenta invenție are în vedere utilizarea seminței modificate genetic, produse prin 43 exprimarea unor enzime capabile să acționeze asupra mioinozitolului, enzima menționată fiind sub controlul unui promotor selectiv pentru sămânță. în consecință, nivelurile de acid 45 fitic sunt reduse. Prin prelucrarea seminței se obține un produs făinos cu conținut scăzut de acid fitic. Prin urmare, ca rezultat al metodei se obține, de asemenea, un preparat furajer cu 47 conținut redus de acid fitic.

RO 122151 Β1

Prezenta invenție prevede un mijloc de a produce semințe de crucifere cu conținut scăzut de acid fitic. în particular, utilizarea unei mioinozitol O-metil-transferaze cum ar fi cea din Mesembryanthemum crystallinum pentru a reduce nivelurile de acid fitic din culturile de crucifere, este avută în vedere în scopul prezentei invenții. Artizanul calificat va aprecia ușor că producerea de făină cu conținut redus de acid fitic din semințele de crucifere poate fi realizată ca rezultat al prezentei invenții.

Se știe că prezența acidului fitic în făina semințelor (șroturi) este păgubitoare pentru peștii crescuți în acvacultură. Cu toate acestea, unele faini de semințe, cum ar fi șrotul de rapiță, au o compoziție proteică care este corespunzătoare nutriției peștilor. Concentrația ridicată de acid fitic din șrotul de rapiță limitează cantitatea care poate fi utilizată într-o dietă pentru pești. De aceea, șroturile cu conținut redus de acid fitic, produse din semințe de crucifere, au o mare utilitate în acvacultura.

în consecință, prezenta invenție își găsește utilitate pentru producerea unei semințe cu conținut modificat de acid fitic și de șroturi cu conținut redus de acid fitic. Sămânța și făina modificate au utilitate într-un număr de aplicații de furajare incluzând: pui, porci, acvacultura, animale rumegătoare și nerumegătoare. în continuare, este evident din descrierea anterioară că orice număr de enzime diferite poate fi utilizat pentru modificarea mioinozitolului în scopul prezentei invenții. De asemenea, este evident că diferite combinații ale acestor enzime utilizând promotori selectivi pentru sămânță pot fi utilizate pentru realizarea unei reduceri specifice a acidului fitic.

Aplicarea invenției căii secundare a alcoolilor glucidici nu este limitată la speciile vegetale exemplificate. într-adevăr, orice specie vegetală care produce acid fitic poate fi modificată prin metoda prezentei invenții. Metoda prevede utilitatea la orice specie de plantă de cultură, deoarece enzima utilizată, O-metil-transferaza este heteroloagă tuturor speciilor de cultură principale, de importanță comercială. Astfel, orice specie de plantă de cultură care este utilizată pentru hrana animalelor sau produce sămânță care este utilizată, parțial sau în întregime pentru hrana animalelor, poate fi modificată prin prezenta metodă, în sensul producerii de plante cu conținut redus de fitat. în consecință, metoda poate fi aplicată oricărei plante de cultură, incluzând monocotiledonate (ex., porumb, orez, grâu, orz, secară) și dicotiledonate (ex. soia, bumbac, lucerna, Brassica, in, floarea soarelui etc).

Prin prezenta metodă se obține atât modificarea metabolismului fenilpropanoidic, cât și a metabolismului alcoolilor glucidici, fiind prevăzute exemple specifice, privind modul în care reducerea compușilor metabolici specifici, în particular, a compușilor anti-nutritivi, este realizată într-o manieră sigură și previzibilă, în conformitate cu metoda din prezenta invenție.

Este evident pentru cei specializați în domeniu că orice cale metabolică secundară poate fi alterată în scopul prezentei invenții. Invenția a fost demonstrată în două căi metabolice secundare neînrudite și furnizează rezultate previzibile și clare. Reducerea agenților anti-nutritivi din, spre exemplu, celule ale plantei de rapiță, celule ale plantei de porumb, celule ale plantei de orez și celule ale plantei de bumbac s-a realizat cu ajutorul vastelor cunoștințe furnizate de prezenta invenție. Din metoda furnizată de prezenta invenție face parte și instruirea profesionistului calificat în sensul evaluării producerii metabolitului secundar specific. Ca urmare, artizanul specializat va aprecia imediat că, pe lângă informațiile privind cadrul de timp în care are loc sinteza, are nevoie de niște cunoștințe de bază privitoare la țesuturile în care este sintetizat metabolitul secundar sau compusul utilizat drept precursorul acestuia. Asemenea informații vor asigura ghidul pentru selecția unui promotor pentru controlul exprimării enzimei care acționează asupra metabolitului secundar sau a precursorului acestuia. în felul acesta, cititorul avizat va aprecia imediat că țintirea unui metabolit

RO 122151 Β1 secundar va necesita o enzima capabilă să acționeze asupra unui precursor pentru meta- 1 bolitul secundar menționat, în țesutul în care metabolitul secundar menționat este produs, precum și în cadrul de timp în care este produs. Astfel, enzima care acționează asupra pre- 3 cursorului pentru metabolitul secundar menționat trebuie exprimată în, sau aproape de timpul de sinteză a menționatului precursor. 5

Lucrătorul specializat este instruit, în continuare, pentru a efectua o analiză biochimică a țesutului în care invenția trebuie aplicată. Analiza menționată poate include deter- 7 minarea nivelurilor diverșilor compuși din țesutul în curs de dezvoltare, orice compartimentare sau localizare subcelulară a biosintezei, perioada de timp a dezvoltării, în care compusul 9 este sintetizat mai întâi, sau nu mai este sintetizat și orice altă informație biochimică relevantă. Prin efectuarea acestei analize, artizanul specializat va fi capabil să selecționeze un 11 promotor care să furnizeze nivelurile corespunzătoare de exprimare, în scopul introducerii în țesutul vegetal a schimbării dorite în conținutul metabolitului secundar. S-a apreciat faptul 13 că, chiar și alterări mici ale nivelurilor de compuși utilizați drept precursori pot asigura efectul dorit. 15

Spre exemplu, ca parte din aplicația acidului fitic din prezenta invenție, profesionistul specializat va aprecia rapid că o cunoaștere fundamentală a țesutului în care acidul fitic este 17 sintetizat, în plus față de cadrul de timp de dezvoltare în care este produs acidul fitic, va furniza îndreptarul pentru selecția unui promotor pentru controlul exprimării enzimei care 19 acționează asupra mioinozitolului în această manieră, cititorul calificat va aprecia rapid că țintirea mioinozitolului va necesita enzima capabilă să acționeze asupra mioinozitolului în 21 țesutul în care acidul fitic este produs, precum și un cadru al timpului de dezvoltare în care este produs acidul fitic. Așadar, enzima care acționează asupra mioinozitolului trebuie să fie 23 exprimată în, sau aproximativ în timpul de sinteză a acidului fitic. Nivelul exprimării enzimei poate fi modificat pentru a atinge un nivel specific de reducere a acidului fitic. Acest nivel de 25 reducere poate fi cuprins între un mic procent până la aproape completa eliminare a acidului fitic. Artizanul specializat va observa rapid că reducerea acidului fitic, în special în anumite 27 specii de plante de cultură cu conținut ridicat de acid fitic, poate necesita niveluri superioare de exprimare ale genei care modifică mioinozitolul, comparativ cu acele specii de plante de 29 cultură în care acidul fitic este prezent în cantități mai mici. în domeniu este bine cunoscută manipularea exprimării cantităților prin diverse mijloace. Aceasta poate include adăugarea 31 de secvențe de ADN care amplifică traducerea, promotori puternici care asigură grade ridicate de transcriere, sau adăugarea de secvențe de ADN, cum ar fi atașarea la matrice 33 sau atașarea susținătoare de regiuni care par să asigure niveluri sigure de transcriere superioară a transgenelor. 35

Această aplicație a prezentei invenții are în vedere, de asemenea, producerea de țesut vegetal, în particular, sămânță care prezintă utilitate pentru aplicațiile furajere. Atât 37 furajarea directă cu sămânță, cât și utilizarea făinii modificate din sămânța prelucrată fac parte din prezenta invenție. Reducerea conținutului de acid fitic din semințele plantelor este 39 dorită în aplicațiile furajere, iar sămânța modificată genetic, cu conținut alterat de acid fitic are o mare utilitate în industria de nutrețuri. 41 în unele aplicații, bobul întreg poate fi dat în hrană animalelor, sau acesta este supus unei minime prelucrări, fără a fi fracționat. Spre exemplu, boabele de porumb sunt folosite 43 adesea pentru furajare, cu minimă prelucrare. Cu toate acestea, unele boabe de porumb sunt prelucrate, iar produșii rezultați prin prelucrare, cum arfi făina glutenică de porumb, sunt 45 administrați, de asemenea, în hrana animalelor. Ambele tipuri de furaje de porumb pot beneficia de niveluri reduse de acid fitic, în particular, pentru că acestea se leagă de degradarea 47 mediului înconjurător datorată excesului de fosfor excretat de animale. Alte boabe de cereale

RO 122151 Β1 utilizate pentru furajare, cum ar fi: grâu, orz și ovăz pot beneficia, de asemenea, de prezenta invenție. în felul acesta, prezenta invenție își găsește utilitate într-o gamă largă de specii de plante de cultură importante din punct de vedere economic. Gena demonstrată în prezenta invenție că alterează nivelurile de mioinozitol se va găsi în acțiune în orice specie de plantă de cultură, deoarece mioinozitolul se întâlnește în toate speciile de plante de cultură și este singurul precursor cunoscut pentru biosinteza acidului fitic. Așadar, a fost demonstrată în mod clar utilitatea genei pentru metil-transferază utilizată pentru alterarea mioinozitolului. Artizanul specializat poate aprecia rapid că secvența codificatoare din regiunea codificatoare, sau secvența specifică de ADN din promotorul sau din secvența lider (conducătoare) netradusă, terminator etc, pot fi modificate pentru a asigura exprimarea optimă în celula vegetală a anumitor specii de plante. Acestea sunt la îndemâna specialistului în domeniu. Astfel, se anticipează că prezenta invenție poate fi pusă în practică la orice specie vegetală capabilă de a fi transformată genetic, inclusiv la acele specii de plante la care bobul este utilizat direct pentru aplicarea ca furaj, sau la acele specii de plante la care bobul este prelucrat înainte de a fi utilizat pentru aplicațiile de furajare.

în consecință, ca rezultat al metodei s-a produs un preparat furajer pe bază de sămânță cu conținut redus de acid fitic.

» în afara furajării directe cu sămânța întreagă sau parțial spartă, există multe metode utilizate pentru producerea de șroturi. Măcinarea umedă a porumbului este utilizată pentru a produce, pe lângă alți produși, făina glutenică de porumb. Pe lângă produșii furajeri de porumb prelucrat se mai pot obține, în conformitate cu metoda din prezenta invenție, și boabe de porumb întregi cu conținut redus de acid fitic. Prezenta invenție își mai găsește utilitate și în producerea de făină glutenică de porumb cu conținut redus de acid fitic.

în afara culturilor furajere principale, cum este porumbul, culturile oleaginoase asigură o mare cantitate de făină vegetală utilizată pentru furajare. De o importanță deosebită la semințele oleaginoase este producerea făinii în timpul extracției uleiului. în general, uleiul este extras din semințele oleaginoase utilizând fie un proces pe bază de solvenți, fie unul fără solvenți. Turta sau solidele eliminate, produse în urma acestui proces este utilizată în formulările făinoase și cuprinde, de obicei, majoritatea conținutului de acid fitic din sămânță.

Cea mai uzuală prelucrare pentru semințele oleaginoase implică extracția uleiului și recuperarea turtei sau a componentelor reziduale ale seminței urmând extracției uleiului. Prezenta invenție își găsește utilitate în acest proces, iar produșii făinoși rezultanți potfi mai valoroși decât făina obținută în mod convențional, datorită conținutului redus de acid fitic.

în consecință, o metodă de producere a făinii cu conținut redus de acid fitic furnizează o compoziție nouă, neîntâlnită în mod curent în făina derivată din semințele oleaginoase. Majoritatea culturilor oleaginoase care vor beneficia de prezenta invenție includ culturile oleaginoase crucifere, cum ar fi: Brassica napus, Brassica rapa, Brassica juncea, Brassica nigra, Sinapis alba, Crambe, Eruca sativa și alte oleaginoase crucifere care pot fi importante din punct de vedere comercial și pot fi utilizate pentru făină. Semințele oleaginoase necrucifere care sunt adesea utilizate în aplicațiile furajere includ: soia, bumbacul, porumbul, șofrănașul, floarea soarelui și alunele.

Prezenta invenție are în vedere utilizarea seminței modificate genetic produse prin exprimarea enzimelor capabile să acționeze asupra mioinozitolului, enzima menționată aflându-se sub controlul unui promotor selectiv pentru sămânță. în consecință, nivelurile de acid fitic sunt reduse. Prin prelucrarea semințelor oleaginoase se obține un produs făinos, cu conținut redus de acid fitic.

Exemplele următoare servesc la ilustrarea metodei și, în nici un caz, nu limitează scopul invenției.

RO 122151 Β1

Exemplul 1. Metode generale utilizate pentru identificarea produșilor căii fenilpro- 1 panoid: Determinarea conținutului de sinapină. un produs terminal ai căii fenilpropanoid în semințele de crucifere 3

Este evident că specialistul cu experiență în domeniu poate adapta toate metodele ilustrate pentru determinarea produșilor căii fenilpropanoid cunoscând numeroasele publicații 5 de chimie analitică. în prima metodă exemplificată pentru identificarea sinapinei într-un țesut de plantă, și anume un țesut de sămânță din plante crucifere, a fost adaptat un simplu test, 7 după metode publicate (Chapple, C.C.S., T, Vogt, Β. E. Ellis și C.R. Sommerville, 1992, Plant Cell 4:1413-1424). Pentru estimarea produsului căii fenilpropanoid, sinapina, a fost standar- 9 dizat un protocol pentru cromatografia în strat subțire (TLC). Această metodă a utilizat separarea extractelor de plante și o cantitate cunoscută de sinapină depusă pe plăci cu silicagel 11 (de exemplu Whatman 60A SilicaG). Sinapina poate fi purificată în conformitate cu metode publicate (de exemplu D. Strack, 1977, Z. Pflanzenphysiol. 84:139-145). Separarea s-a efec- 13 tuat prin migrarea unui amestec de solvenți n-butanol, acid acetic și apă într-o proporție de respectiv 10:2:3, până la 10 cm de la origine. Extractele de semințe au fost preparate prin 15 înmuierea peste noapte a probelor precântărite într-un tub închis etanș conținând 100 - 500 microlitri soluție metanolică (98% metanol, 2% acid acetic), urmată de adăugarea unul volum 17 egal de metanol eu cel adăugat înainte și de măcinare. Supernatantul a fost obținut după centrifugare ca. 12.000 x g. Supernatantul a fost extras cu un amestec cloroform : apă (CW; 19 400 microlitri: 100 microlitri) și a fost centrifugat ca mai sus, faza lipidică a fost îndepărtată, iar faza apoasă a fost uscată cu aer sau uscată sub vid. Probele au fost dizolvate în apă și 21 depuse ca spot pe plăcile de TLC. O cantitate definită din probă determinată prin încercări empirice a fost depusă ca spot pe plăcile TLC înainte de introducerea în solvent. Măsură- 23 torile de greutate propie, acolo unde au fost utilizate, au fost efectuate prin uscarea și apoi cântărirea unei cantități cunoscute de probă proaspătă. 25

Placa TLC a fost apoi vizionată la lumină UV și sinapina a fost vizualizată ca un spot strălucitor. O probă de sinapină purificată anterior a fost utilizată ca standard, singură și, de 27 asemenea, ca un amestec artificial cu un extract de semințe, pentru a asigura faptul că sinapina purificată migrează cu sinapina din extractul de semințe atunci când este prezentă 29 în amestec cu componenții din extractul de semințe. Când sinapina marcată radioactiv a fost monitorizată, plăcile TLC au fost scanate într-un scanner Ambis4000 (Scanalytics) care pune 31 în evidență cantitativ emisiile radioactive.

Apoi, pentru a verifica conținutul de sinapină, a fost utilizată cromatografia lichidă de 33 înaltă presiune (HPLC). Extractele metanolice din materialul vegetal obținute ca mai sus, dar fără extracția în clororform - apă, au fost supuse analizei HPLC pe un instrument HPLC 35 Varian prevăzut cu o coloană Nucleosil C18AB. Volumul de injecție a fost în general 10 microlitri, iar faza mobilă a fost un amestec de Solvent A (2% acid acetic în apă) și Solvent 37 B (2% acid acetic în acetonitril). în general condițiile pentru un experiment vor implica în faza mobilă: Solventul A variat de la 90% la 80% timp de 17 minute, urmate de o scădere pană 39 la 10% într-un minut. Coloana a fost menținută la 10% solvent A timp de 4 minute și apoi spălată și echilibrată cu 90% Solvent A. Aceste condiții pot fi variate pentru a îmbunătăți 41 separarea substanțelor eluate. De exemplu Solventul A poate fi modificat de la 90% din momentul inițial până la 80% în 15 min, până la 70% în 15 min și apoi până la 10% în 2 min, 43 urmate de alte 2 min de până la 10% și echilibrare cu 90%. Un detector cu serie de diode a fost utilizat pentru a monitoriza absorbanța UV. Absorbanta UV la 330 nanometri a fost utili- 45 zată pentru analiza probei. A fost construită o curbă standard cu sinapina purificată și a fost utilizată pentru cuantificarea sinapinei în extractele de plante. Este evident pentru specialistul 47 cu experiență în domeniu că condițiile HPLC (de exemplu proporțiile și gradientul solvenților, diferitele tipuri de solvenți) pot fi variate. Este de dorit determinarea condițiilor care sunt 49 adecvate pentru aparatură și pentru complexitatea probei căreia îi sunt aplicate. Literatura prezintă o varietate de metode HPLC pentru analiza compușilorfenolici care includ sinapina. 51

RO 122151 Β1

Au fost utilizate studii cu markeri radioactivi pentru a obține o reprezentare mai corectă a începutului sintezei de sinapină și pentru determinarea proporției de sinapina nou sintetizată în diferite părți ale seminței. Metoda cu marker radioactiv poate de asemenea fi utilizată pentru a determina capacitatea componentelor individuale ale semințelor (de exemplu cotiledoane, embrion, înveliș ai seminței) de a sintetiza sinapina dintr-o provizie exogenă de colină. Produșii radiomarcați pot fi apoi analizați pentru sinapină, de exemplu prin protocolul TLC- urmat de scanarea cu Ambis4000.

Protocolul HPLC a fost utilizat pentru analiza cantitativă a conținutului total de sinapină în semințe și componenți ai semințelor, TLC a fost utilizată pentru analiza calitativă a conținutului de sinapină în diferite faze ale dezvoltării seminței, iar markerul radioactiv împreună cu TLC urmată de numărarea spoturilor radioactive au fost utilizate pentru determinarea apariției și distribuției de sinapină în semințe și țesut de sămânță precum cotiledoane, axe și înveliș al semințelor.

Metoda markerului radioactiv pentru stabilirea sintezei de novo a sinapinei din colină utilizează mai degrabă păstăi întregi, decât semințe izolate pentru a se asigura condiții experimentale cât mai reprezentative pentru condițiile in vivo. Păstăile în diferite stadii de dezvoltare au fost obținute din plante crescute în condiții controlate, în general la o temperatură de 20°C ziua și 15°C noaptea, într-un ciclu zi/noapte de 16/8 ore. Pediculul a fost imersat într-o soluție conținând colină marcată cu ¹⁴C achiziționată de la New England Nuclear (activitatea specifică Stock2,0 GBq/mmol; concentrație 7,4 MBq/ml care este identică cu 0,2 mCi/ml; colină 3,7 micromol/ml). Păstăile cu pediculul imersat într-un tub conținând 1,8 ml dintr-un mediu apos ca mediul Murashige-Skoog de tărie medie și colină neradioactivă 1 mM și 1,8 până la 9 microlitri din stocul de colină radioactivă au fost incubate într-o cameră de creștere a plantelor timp de 24 până la 72 ore cu un ciclu zi/noapte de 16 h lumină/8 h întuneric la o temperatură de 20’C. Condițiile de lumină au fost de 51 microEinstiens/metru pătrat per secundă, iar semințele îndepărtate din aceste păstăi au fost utilizate pentru analiza TLC. Aceste probe au fost extrase într-o soluție metanolică urmată de extracția cu cloroformapă (CW) așa cum a fost descris anterior.

La analiza semințelor mai vechi, pe lângă metoda de mai sus s-a efectuat și infiltrarea semințelor separate de păstăi. Douăzeci de semințe au fost infiltrate cu 500 microlitri mediu de colină radioactivă descris mai sus sub vid slab timp de 15 min la temperatura camerei de cca. 23’C. Mediul radioactiv a fost apoi îndepărtat și înlocuit cu 500 microlitri mediu neradioactiv din compoziția de mai sus, mai puțin ¹⁴C-colina și incubat la 23’C timp de 24 h. Semințele au fost apoi extrase ca mai sus.

Materialul vegetal poate fi de asemenea extras cu un amestec de cloroform : metanol: acid formic (CMF) într-o proporție de respectiv 5 : 12 : 3. în general se adaugă 2 microlitri de CMF per mg probă, proba este măcinată și lăsată la temperatura camerei (2123°C) peste noapte (16 h) urmată de centrifugarea la cca 12.000 x g timp de 5 min. Supernatantul este colectat și materialul concentrat obținut după centrifugare este amestecat bine cu un alt volum de CMF ca cel adăugat anterior, lăsat 20 min și centrifugat ca mai sus. Supernatanții sunt reuniți, se efectuează o extracție cu cloroform-apă (CW) așa cum a fost descris anterior, iar fracția apoasă se analizează conform celor prezentate anterior.

Exemplul 2. Identificarea locului sintezei unui produs din calea fenilpropanoid într-un anumit țesut în acest exemplu a fost determinat momentul sintezei unui produs din calea fenilpropanoid. Acest exemplu ilustrează sinteza sinapinei și acumularea în țesutul semințelor crucifere. în acest exemplu au fost utilizate semințe în dezvoltare de Brassica napus. A fost efectuată analiza TLC a extractelor de păstăi obținute de la flori polenizate manual pentru a stabili momentul începutului acumulării de sinapină. Au fost luate probe în zilele 7, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 și 34 după polenizare (DAP) și după maturizarea semințelor.

RO 122151 Β1

Extractele de semințe au fost preparate conform metodelor descrise în exemplul 1 și conți- 1 nutul de sinapină a fost vizualizat prin analiza TLC. Sinapina a fost pusă în evidență începând cu 18 DAP și până la maturitatea seminței și s-a arătat că semințele mature au cel mai 3 mare conținut de sinapină, sugerând faptul că a existat o acumulare netă în semințele în dezvoltare. 5

Peretele păstăii din care au fost îndepărtate semințele nu a conținut sinapină, iar sinapina a fost absentă din semințele mai tinere din probele din 7-14- și 16-DAP. Această 7 analiză a indicat că începutul acumulării de sinapină a fost la aproximativ 18 DAP; totuși, întrucât această metodă utilizează detecția prin fluorescență U V, prezența de cantități foarte 9 mici, dacă există, în semințele mai tinere nu va fi detectabilă. Fig. 3 prezintă un exemplu de analiză TLC a probelor până la 28 DAP și o doua placă prezintă un exemplu până la maturi- 11 tatea semințelor. întrucât rezultatele de mai sus nu sunt cantitative, s-a efectuat analiza HPLC a extractelor de semințe, obținute cu o soluție metanolică conform descrierii din 13 exemplul 1.

Rezultatele prezentate în fig. 4 confirmă începutul sintezei sinapinei de la 20 DAP 15 crescând rapid și continuu până la maturitate. Cantitatea de sinapină în semințele mature a fost de cca. 0,8% pe baza greutății uscate a semințelor, iar întrucât uleiul constituie 17 aproximativ 45% din sămânță, aceasta ar s-ar traduce în cca. 1,5% din sămânța degresată măcinată. 19

Exemplul 3. Determinarea aspectelor temporale și spațiale ale sintezei unui produs în calea fenilpropanoid - sinteza sinapinei față de dezvoltarea semințelor 21

Pornind de la informația obținută în Exemplul 2, s-a demonstrat faptul că sinapina este sintetizată de semințele aflate în evoluție. De asemenea, a devenit evident că degra- 23 darea sinapinei a fost minimă în timpul dezvoltării seminței. Pentru a confirma această analiză, semințe aflate în curs de dezvoltare au fost incubate cu ¹⁴C-colină, un precursor utili- 25 zat pentru sinteza sinapinei din sinapoil-glucoză, o etapă finală în metabolismul fenilpropanoid la plante. Prezența precursorului radioactiv a dus la producerea sinapinei marcate. 27 Astfel, prin această, metodă a devenit posibilă cuantificarea biosintezei sinapinei. După cum se arată în fig. 5, sinteza sinapinei (încorporarea de ¹⁴C-colină în sinapină) nu este detecta- 29 bilă la 10 DAP, și a apărut prima oară la 14 DAP. Astfel sinteza sinapinei (de exemplu producția de produs final sinapină de la precursorii sinapoil-glucoză și colină) are loc de la 14 31

DAP până aproape de maturitatea semințelor. în mod corespunzător începutul acumulării de sinapină în semințe are loc după 14 DAP și semințele în dezvoltare continuă să sinteti- 33 zeze și să acumuleze sinapină până la maturitate.

Deși 18 DAP pare a fi momentul la care acumularea de sinapină devine vizibilă în 35 analiza neradioactivă, testul radioactiv este mai sensibil și permite detecția biosintezei chiar în cantități mici. Deci, așa cum s-a arătat prin testul radioactiv, sinteza sinapinei începe cu 37 viteză mică la 14 DAP. Studii de infiltrare arată că capacitatea de a sintetiza sinapină este prezentă de asemenea în semințele mai vechi apropiate de maturitate (fig. 6). 39

Pe lângă determinarea schemei de dezvoltare în timp a acumulării produșilor căii fenilpropanoid, persoana cu experiență în domeniu trebuie să determine în continuare speci- 41 ficitatea țesutului pentru biosinteză produsului metabolismului fenilpropanoid. în această parte a exemplului a fost măsurată acumularea de sinapină în cotiledoane, axe și învelișuri 43 de semințe. Analiza markerilor radioactivi a fost efectuată cu păstăi întregi între 18 și 42 DAP. Pediculul păstăilor excizate a fost imersat într-o soluție conținând ¹⁴C-colină timp de 45 24 până la 72 h și cele trei componente ale seminței au fost disecate și analizate pentru sinapină. Rezultatele prezentate în fig. 7 au arătat că cotiledoaneie au conținut cantitatea 47 maximă de sinapină (raportat la o sămânță) urmate de axe și învelișul seminței. Extractele

RO 122151 Β1 de sinapină din cotiledoane și axe ale semințelor de la 25 DAP până la maturitate au arătat că, pe baza greutății uscate, axele au conținut aproximativ 50% din conținutul de sinapină al cotiledoanelor (fig. 8). Totuși întrucât cotiledoanele au o masă mai mare față de axe (cca. de 6 ori greutatea axelor la maturitate) conținutul lor în sinapină contribuie cu până la 90% din totalul de sinapină găsit în sămânță (fig. 9).

Exemplul 4. Transformarea genetică a unei plante cu o genă care codifică o enzimă capabilă de a acționa asupra unui precursor din calea fenilpropanoid în acest exemplu, o enzimă, colin oxidază (COX) care acționează asupra precursorului utilizat pentru sinteza sinapinei este exprimată într-o celulă a plantei. Enzimă colin oxidată este inserată într-un vector de transformare a plantei sub controlul unui promotor selectiv pentru semințe. Colina este un precursor pentru producerea de sinapină din sinapoilglucoză, deci reducerea lotului de colină reduce producția de sinapină.

Transformarea genetică a Brassica napus, o specie de plantă cruciferă, cu o construcție colin oxidază (COX)

Secvența ADN a genei colin oxidază este prezentată în fig. 10, în timp ce secvența de aminoacizi prevăzută este prezentată în fig. 11. Pentru a asigura exprimarea specifică pentru semințe a fost utilizată o secvență promotor din napină (Kohno-Murase, J., M. Murase, H. Ichikawa și J. Imamura, 1994, Plant Molecular Biology, 26 :115-1124). Această plasmidă finală pHS731 a fost construită printr-o serie de donări și subclonări conform protocoalelor standard descrise în manuale ca Maniatis, T., Frittsch, E.F. și Sambrook, J. (1982; Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor, New York). Scheletul vectorului este de la RD400 (Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., Panchuk, B., Pelcher, LE. și Keller, W., 1992, Gene 211: 383-384) care a fost modificat pentru a include, în locul markerului pentru selecția plantelor al RD400, NosP-Nptll, o genă de fuziune între gus și npt(Gus:: npt). Gena Gus-npt a fost descrisă anterior (Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., Pelcher, L.E., Crosby, W.L și Selvaraj, G., 1991, Gene 101: 239-246). A fost donată ca un fragment de 2,6 Kb, conținând terminatorul Nos (semnal polîA) la sfârșitul secvenței npt, de la pGKK14 (Datla și colab., 1991) într-o plasmidă intermediară carea pierdut întregul T-ADN din RD400. Un promotor CaMV353 parțial duplicat alături de leader-ul Virus Alfaalfa Mosaic din pBI525 (Datla, R.S.S., F. Bekkaoui, J.K, Hammerlindl, G. Pilate, D.l. Dunstan și W.L Crosby, 1993, Plant Science 94 :139-149) a fost donat ca un fragment HindiII -BamHI la capătul 5’ al secvenței Gus.npt. Site-urile pentru Hindlll, BamHI și site-urile adiacente Xbal au fost îndepărtate completând capetele cu fragmentul Klenow al Polimerazei I pentru a da pHS722.0 regiune funcțională lac-alfa conținând site-urile de donare multiple de la pTZ19R (Mead, DA, E, Szczesna -Skorupa și B. Kemper, 1986, Protein Engineering 1 : 67 - 74) a fost obținută ca un fragment de 0,26 Kb prin reacția în lanț a polimerazei. Acest fragment a fost digerat cu Munl și EcoRI și introdus într-un site EcoRI al pHS722 pentru a da pHS723. Secvența de nucleotide a unei porțiuni a T-ADN-ului vectorului a fost determinată și site-urile unice din site-urile de donare multiple au fost identificate prin analiza de restricție. pHS725 este un derivat provenit din pHS723 și care conține cadrul deschis al colin oxidazei inițial din pKR11 (vezi Rozwadowski și colab., 1991) printr-o serie de vectori intermediari care au furnizat siteuri adecvate sau astfel de caracteristici ca și semnalul de poliadenilare (polyA) din virusul mosaicului conopidei. Vectorul pHS725 furnizează în pHS723 cadrul deschis al COX cu un semnal PolyA al CaMV la capătul 3'. Porțiunea de la 5' a cadrului deschis conținând promotorul CaMV35S a fost înlocuită cu un promotor din napină de la o plasmidă intermediară pentru a da pHS731. Plasmida intermediară a conținut un derivat pUC19 conținând un promotor de napină de 1,1 Kb ca o casetă Hindlll-NapinP-BamHI, primită de la J. Kohno-Murase (Kohno-Murase și colab., 1994) care a fost legată ca o inserție Hindlll-BamHI în fereastra μΜί·4ΜΗΗΜΗΜ·-Μ»«Η·Μ

RO 122151 Β1

Hindlll-BamHI a plasmidei RD400 (Datla și colab., 1992). Plasmida rezultată a fost pHS974. 1

Caseta BamHI-BADH cadru deschis de citire-PolyA-Kpnl a fast izolată ca un fragment de 2,1 Kb din pRKJ6A (pRKJ6A este descrisă în detaliu în R.K. Jain, 1995, Genetic Engineering 3 ofOsmolyte Biosynthesis in Plants: Manipulation ofBetaineAldehyde Dehydrogenase Gene Expression Tobacco, Teză de doctorat, Universitatea Saskatchewan, Saskatoon, Canada) 5 și legată de fereastra BamHI-Kpn I a pHS974 rezultând pHS981. pHS981 a fost utilizat în derivarea pHS731. Figura 12 prezintă plasmida rezultantă pHS731 care conține cu delimitări 7 la dreapta și la stânga promotorul din napină - cadrul deschis de citire al Cox - semnal poliA din CaMV. Secvența de nucleotide a segmentului promotor din napină - cadru deschis de 9 citire al Cox - semnal poliA din CaMV a fost determinată din componenți. Confirmarea suplimentară a secvenței este de asemenea posibilă deoarece precursorii pHS723 includ integral 11 pBIN19 (Bevan, M., 1984, Nucleic Acids Research 12: 8711-8721). incluzând delimitările la dreapta și la stânga și toată regiunea din afară. Secvența completă de nucleotide a pBIN19 13 a fost publicată. Astfel constructul care conține gena COX descrisă mai sus poate fi cu ușurință recuperată pentru donarea în alți vectori. Vectorul plasmidă pHS731 în E. coli DH5 15 a fost depozitat în 22 ianuarie, 1997 la American Type Culture Colection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville MD, USA 20852, sub numărul ATCC Designation 98300. 17

Pe baza informațiilor publicate (DeLisle A.J. și Crouch M.L., 1989, Plant Physiology 98 : 617 - 623; Hoglund, A.-S., T. Rodin, E. Larsson și L. Rask, 1992, Plant Physiology 19 98 : 509 - 515) și a rezultatelor noastre obținute cu un promotor din napină, era de așteptat ca expresia genei din napină să extindă porțiunea medie a dezvoltării temporale a semințelor 21 de 6. napus.

Vectorul pHS731 a fost inserat în tulpina Agrobacterium MP90 prin încrucișare tripa- 23 rentală standard urmată de transformarea mediată de Agrobacterium a Brassica. Transformarea a fost în esență efectuată conform celor descrise de Moloney și colab.. 1989, Plant 25 Cell Reports 8 : 238 - 242.

Linia Agrobacterium tumifaciens GV3101/pMP90 (Koncz C. & Schell, J., 1986, Mol. 27 Gen. Genet. 204 : 383-396) care adăpostește vectorul binar pHS731 a fost utilizat pentru studii de transformare. O cultură bacteriană în fază staționară a fost recoltată prin centrifu- 29 gare în 100 ml de LB Broth (Difco, SUA) și resuspendată în 10 ml LB Broth proaspăt cu 1%

DMSO (dimetilsulfoxid) (Sigma, SUA) drept crioprotector. Părți alicote de 200 pl au fost con- 31 servate la -20°C până când au fost utilizate pentru etapa de transformare, în care o parte alicotă bacteriană a fost adăugată la 2 ml Brain Heart Infusion Broth (Difco, SUA) care 33 conține 2% sucroză, 50 μΜ acetosiringonă, are pH 5,6 și a fost incubată peste noapte la 28°C. Densitatea de celule bacteriene a fost de aproximativ 1 x10⁹ celule per ml. 35

Fragmente de cotiledoane au fost expuse la Agrobacterium conținând vectorul de transformare a plantei conform metodei Iul Moloney și colab., 1989, Plant Cell Rep. 8 :238 - 37

242. Suprafața tăiată a pețiolului fragmentelor de plantă a fost scurt imersată în cultura bacteriană. Fragmentele au fost introduse în mediul de co-cultivare astfel încât suprafața 39 tăiată să fie în contact cu mediul. Zece fragmente au fost plasate pe fiecare placă Petri de 100 x 15 mm. Plăcile de co-cultivare au fost sigilate cu foile de plastic Stretch'n Seal™. 41 Plăcile au fost incubate timp de 3 zile într-un dulap de creștere cu condiții de temperatură și fotoperioade, ca mai sus, în ceea ce privește etapa de germinare a semințelor. Fragmentele 43 au fost apoi transferate în mediul de selecție.

După 3 până la 4 săptămâni în mediul de selecție, vlăstarele regenerate (transfer- 45 manți potențiali) au fost excizate și transferate în mediu de selecție proaspăt pentru a-și continua creșterea. Când vlăstarele au atins o lungime de 1,5 - 2,0 cm ele au fost transferate 47 într-un mediu de prindere a rădăcinilor. Vlăstarele potențial transgenice au fost analizate pentru exprimarea genei gus, în principal conform descrierii lui Jefferson R. A., 1987, Plant 49 Mol. Biol. Rep. 5 : 387 - 405. Prezența petei albastre a fost privită ca o dovadă a transformării. 51

RO 122151 Β1

Confirmarea transformării a fost stabilită prin pe kanamicină, test Southern blots, analiză PCR (reacția în lanț a polimerazei) și analiza descendenței. Semințele transgenice de Brassica napus, cv. Westar conținând vectorul pHS731 cu referința 202622 au fost depozitate în 22 ianuarie 1997 la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville MD, SUA 20852, sub numărul de înregistrare ATCC Designation 97854.

A fost determinată apoi exprimarea unei gene colin oxidază în semințele de Brassica napus. Câteva linii transgenice independente au fost regenerate. Activitatea COX a fost demonstrată utilizând o reacție enzimatică cuplată. COX produce betain aldehidă din colină, iar betain aldehida poate fi cu ușurință testată prin oxidarea sa dependentă de NAD de către BADH. Reducerea NAD este monitorizată prin modificarea absorbanței la 340 nm. Pentru a standardiza testul au fost utilizate cantități variabile de COX disponibilă comercial (de ex. Sigma) și o cantitate constantă de BADH din E. Coli (50 unități; 1U = 1 nmol NAD redus per minut per mg proteină) preperat dintr-o linie bacteriană care supraexprimă BADH este utilizat pentru a standardiza condițiile de reacție și a stabili o curbă standard astfel încât COX să fie limitativă și nu BADH. Testul este apoi realizat cu extracte de plante pentru liniile transgenice și martori. BADH poate fi îmbogățit sau purificat prin metode publicate în literatură (de ex. Falkenberg, P. și Strom, A.R., 1990, Biochemica Biophysica Acta 1034 : 253 - 259).

Extractele de plante au fost obținute după cum urmează. Frunzele plantelor având aproximativ 100 mg sunt înghețate în azot lichid, amestecate cu două volume, față de greutatea probei, de tampon de extracție răcit cu gheață. Probele au fost centrifugate la cca 10.000 x g iar supernatantul a fost din nou centrifugat. Centrifugarea a fost repetată până când nu a mai fost vizibilă materie sub formă de particule. Cu semințele, cca. 20 per probă, după prima centrifugare s-au adăugat 20 mg cărbune de lemn și s-a urmat restul modului de lucru. Tamponul de extracție, ajustat la pH 8,0 cu KOH, conține în 100 ml, 1,92 g HEPES, 0,2 ml EDTA 0,5 M, 10 ml glicerol și apă deionizată pentru a completa până la 100 ml. înaintea efectuării testului, s-a adăugat DTT dintr-un stoc 1M până la o concentrație finală de 25 mM și a fost adăugat un cocteil de inhibitor complet de protează (BoehringerMannheim, Catalog : 1697-498) dintr-un stoc 10x în tampon HEPES. Tamponul de testare a enzimelor (tampon BADH) conține HEPES-KOH 50 mM, EDTA 1 mM de pH 8,0 și DTT proaspăt adăugat pentru o concentrație finală de 1 mM. Testul cuplat a fost efectuat într-o reacție conținând 50 microlitri tampon BADH, 50 microlitri stoc NAD de 10 mM, 50 microlitri probă de plantă, 30 microlitri sau echivalent pentru a da 50 U BADH și apă deionizată pentru a completa volumul la 450 microlitri. Absorbanța a fost monitorizată la 340 nm timp de 20 min apoi au fost adăugați 50 microlitri clorură de colină și citirea spectrofotometrică a fost continuată timp de 10 până la 20 min. Pentru o curbă standard, s-a omis proba de plantă și au fost adăugate în locul acesteia diferite cantități de COX purificat. Unitățile au fost calculate utilizând un spectrofotometru programabil, cu înregistrare de tipul Beckman DU65. O persoană cu experiență în domeniu poate modifica protocoalele, pentru a adapta echipamentul, utilizând datele biochimice disponibile în literatură pentru coeficientul de extincție pentru NAD. Reducerea NAD în sine este un test standard efectuat pentru dehidrogenaze.

Exemplul 5. Analiza semințelor transgenice pentru conținutul fenolic redus în acest exemplu semințele au fost analizate pentru conținutul de sinapină. Semințele de la plantele transgenice recuperate în Exemplul 4 au fost crescute pentru a obține auto descendenți, și aceste linii de descendenți au fost analizate pentru segregarea sau absența acesteia la o transgenă care codifică o activitate glucuronidazică (GUS). Această genă (vezi Datla, R.S.S., Hammerlindl, J. K., Pelcher, L. E., Crosby, W. L., și G. Selvaraj, 1991, Gene 101 :239-246) este prezentă între limitele dreaptă și stângă ale T-ADN al vectorului pHS731 și astfel servește ca un marker convenabil în analiza genetică a segregării. Absența segregării genetice a indicat natura homozigotică a plantei din care a provenit descendentul.

RO 122151 Β1

Acele linii care au prezentat segregare au fost hemizigotice și segreganții care nu prezintă 1 activitate GUS au fost reținuți ca martori care nu conțin gena COX. Astfel, au existat loturi de linii homozigote conținând COX și contrapărțile lor care nu conțin transgene. Aceste linii 3 au fost analizate pentru conținutul lor în sinapină prinfr-un protocol HPLC. Rezultatele prezentate în fig. 13 arată clar că segreganții transgenici au niveluri de sinapină semnificativ 5 reduse comparativ cu cei netransgenici. Segreganții netransgenici oferă cel mai bun control deoarece provin din aceeași plantă transgenică primară. Aceste rezultate demonstrează utili- 7 tatea metodei descrise. Este evident pentru o persoană cu experiență în domeniu că pot fi realizate diferite niveluri de reducere schimbând nivelurile, momentul și localizarea exprimării 9 genei și de asemenea căutând variante benefice printre liniile transgenice individuale care prezintă rezultate dorite datorită unei varietăți de motive care includ efectele de poziție și 11 numărul de ordine (copy number).

Exem p I u 16. Producerea unui produs de protecție împotriva stresului prin modificarea 13 unui precursor în metabolismul fenilpropanoid în acest exemplu protectorul împotriva stresului, betaina, a fost produs prin activitatea 15 combinată a COX și BADH, ambele sub controlul promotorului selectiv pentru semințe. Ca o primă parte a acestui exemplu au fost obținute Brassica napus transgenice purtând gena 17 BADH sub controlul unui promotor selectiv pentru semințe. A fost efectuată analiza acestor plante pentru exprimarea BADH. 19

Exprimarea unei gene betain aldehidă dehidrogenază în semințele Brassica napus

O genă BADH din E. coli (betB) este izolată și manipulată pentru exprimarea speci- 21 fică pentru semințe prin legarea de un promotor din napină din B. napus (Boyd și colab,

Gene 103:45-52 (1990)). Plasmida RD400 (Datla., R.S.S.. Hammerlindl, J.K., Panchuk, B., 23

Pelcher, L. E. și Keller, W., 1992., Gene 211:383-384) a fost utilizată ca vector din care a fost obținut derivatul final pHS974 conținând între limita din dreapta și cea din stânga a T-ADN 25 cadrul deschis de citire al betB din site-ul său ATG sub controlul de exprimare ai unul promotor din napină și a fost obținut un semnal PolyA din virusul mozaicului conopidei. Caseta 27 Napin-betB-PolyA (cca. 3,3 Kbp) a conținut în ordinea indicată: site-ul Hindlll, promotorul din napină, site-ul BamHI, betB ORF, site-ul EcoRI -semnal polyA al ADN-ulul virusului 29 mosaicului conopidei, site-ul Kpnl și site-ul EcoRI. Promotorul din napină a provenit de la Kohno-Murase și colab. (Plant Molecular Biology, 26:115-1124, 1994) iar semnalul PolyA a 31 fost originar din plasmida pJIT117 (Guerineau, F., Woolston, S., Brooks, L, și Mullineaux,

1988, Nucleic Acids Research 16:11380). Plasmida finală pHS981 de cca. 15 Kbp este pre- 33 zentată în fig. 14. Aceasta a fost introdusă în Agrobacterium tumefaciens GV3101 [pMP90] (Koncz, C. și Schell, J., 1986, Molecular and General Genetics 204 : 383-396) și tulpina 35 rezultată a fost utilizată pentru transformarea genetică a Brassica napus.

Mai multe linii transgenice au fost obținute și semințele aflate în diferite etape de 37 dezvoltare au fost testate pentru activitatea BADH. Activitatea BADH a fost maximă în jurul a 35 DAP și semințele mature au reținut activitatea reziduală. Activitatea specifică ca o 39 funcție de etapa de dezvoltare a demonstrat că începutul activității BADH este concomitent cu sinteza sinapinei. 41

Liniile care exprimă gena BADH au fost încrucișate cu liniile purtând gena COX descrisă în Exemplul 4. Plantele conținând gena COX și plantele conținând atât gena BADH 43 cât și COX au fost analizate pentru conținutul de sinapină și conținutul fenolic total. Aceste rezultate sunt prezentate în fig. 15 (conținut în sinapină) și fig. 16 (conținut fenolic total). 45

Semințele analizate au fost recoltate de la plante cultivate în condiții de câmp în vara anului 1999. După cum s-a arătat în fig. 15, activitatea combinată a COX și BADH conduce la o 47 reducere suplimentară a acumulării de sinapină față de activitatea doar a COX singură. Așa cum s-a arătat în fig. 16, există o reducere în conținutul fenolic total la plantele transgenice 49 față de martor.

RO 122151 Β1

Exemplul 7. Secvența de nucleotide a unei gene sintetice care codifică decarboxilaza acidului ferulic în acest exemplu secvența publicată a decarboxilazei acidului ferulic din Bacillus pumilus (Zago și colab., Applied and Environmental Microbiology, 61 : 4484 - 4486, 1995) a fost utilizată pentru construcția unei gene optimizate pentru exprimarea în celule de plante. Cadrul deschis de citire al decarboxilazei acidului ferulic a fost sintetizat legând oligonucleotide sintetice bazate pe secvența publicată. Oligonucteotidele au fost sintetizate în general pe baza preferinței codonului pentru genele exprimate puternic din Brassica napus.

Oilgonucleotidele sintetice au o lungime de aproximativ 60 nucleotide. Design-ul duplexurilor de oligonucleotide a inclus la capătul 5' un capăt BamHI-coeziv (5’ GATC-) și un terminus EcoRI coeziv (3'-TTAA-5') la capătul 3’ Duplexurile individuale au fost asamblate și a fost format un cadru deschis de citire cu lungime întreaga cu site-uri 5' BamHI și 3’ EcoRI. Reacțiile de legare sunt conforme protocoalelor standard. Produsele legărilor au fost la rândul lor legate de un vector de clonare.

La legarea genelor sintetice de mai sus în pBluescript SK- (Statagene) scindat la BamHI-EcoRI, au fost identificate clone cu o inserție de 0,5 kb prin analizarea plasmidului ADN-ului pregătitor din clonele E. coli. Candidații potențiali au fost analizați și a fost determinată secvența de nucleotide pentru două dintre clone, S-a găsit că fiecare dintre clone are un punct de mutație și aceste două puncte de mutație au fost izolate în cele două clone alese. Izolarea mutațiilor a permis reconstrucția unei gene intacte din combinarea a două porțiuni fără mutație- ale genei din aceste clone. Această clonă este cunoscută sub numele pGS97b1. Secvența de nucleotide a acestei gene sintetice este prezentată în fig. 17. Secvența de aminoacizi prevăzută este prezentată în fig. 18.

Funcționalitatea genei sintetice a fost confirmată printr-un test simplu. Decarboxilaza acid ferulic convertește acidul ferulic în 4-vinilguaiacol (4-VG). 4-VG are un miros distinct de cuișoare și 4-VG este considerat a fi cel mai important compus care dă aroma naturală a cuișoareior. Atunci când tulpina de Escherichia coli cu pGS97b1 este crescută în prezența a 1 mM acid ferulic în mediul de creștere, aceasta are un miros distinct de cuișoare, în timp ce cultura fără acid ferulic sau cultura unei tulpini doar cu vectorul, nu a produs mirosul de cuișoare. Analiza HPLC a culturilor alimentate cu acid ferulic a confirmat dispariția acidului ferulic. Pe baza rezultatelor de mai sus s-a concluzionat faptul că o gena funcțională este donată în pGS97b1.

Exemplul 8. Transformarea genetică a unei plante cu o genă care codifică decarboxilaza acidului ferulic sub controlul unui promotor constitutiv în acest exemplu, o enzimă, decarboxilaza acid ferulic donată în pGS97b1 a fost inserată într-un vector de transformare a plantei RD400 (Datla, R.S.S., Hammerlindl, J. K., Panchuk, B., Pelcher, LE. și Keller, W., 1992, Gene 211 : 383-384) care a fost modificat pentru a include în locul markerului de selecție a plantei NosP-Nptll al RD400 o genă de fuziune între gus și npt (Gus : npt). Gus-npt a fost descris anterior (Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., Pelcher, L. E., Crosby, W. L și G. Selvaraj, 1991, Gene 101 : 239-246). Gena care codifică decarboxilaza acidului ferulic a fost plasată sub controlul promotorului 35S, iar plasmida a fost utilizată pentru a transforma plantele de tutun conform protocoalelor standard.

Harta de restricție a vectorului este prezentată în fig. 19. Vectorul pGS97b3 după cum este prezentat în fig. 19 este similar cu pHS731 cu excepția celor ce urmează. Pe același schelet de vector ca și pHS731, caseta Hindlll-napină P-BamHI a fost înlocuită cu o casetă promotor 35S din virusul mozaicului conopidei - regiune lider din virusul mozaicului alfalfa (descrisă în R.S.S. Datla, F. Bekkaoui, J. K. Hammerlindl, G. Pilate, D. I. Dunstan și W. L.

RO 122151 Β1

Crosby. Improved high-level constitutive foreign gene expression in plants using an AMV 1 ARN4 unstranslatedleadersequence, Plant Science 94:139-149,1993). Această porțiune de promotor este abreviată ca 35S în fig. 19. După 35S urmează cadrul deschis de citire al 3 ferulat decarboxilazei legate de BamHI la capătul 5' și EcoRI la căpătui 3’ în locul cadrului deschis de citire al COX din pHS731. 5

Au fost recuperate plantele transgenice care exprimă gena care codifică decarboxilaza acidului ferulic. Plantele au fost analizate pentru conținutul fenolic și producția de 7 vinilguaiacol.

S-a descoperit că plantele de tutun transgenice independente care poartă gena care 9 codifică decarboxilaza acidului ferulic conțin o polipeptidă imunoreactivă de dimensiune previzibilă în analiza spoturi lor western (western blot analysis) cu anticorpi poilclonali crescuți 11 împotriva decarboxilazei acidului ferulic. Plantele netransformate nu au avut peptida imunoreactivă. Aceasta aduce dovada exprimării transgenice a proteinei decarboxilaza a acidului 13 ferulic în aceste plante transgenice.

Exemplul 9. Transformarea genetică a unei plante cu o genă care codifică decarbo- 15 xilaza acidului ferulic sub controlul unui promotor selectiv pentru țesuturi în acest exemplu o enzimă, decarboxilaza acidului ferulic, donată în pGS97b1 a fost 17 inserată într-un vector de transformare a plantei RD400. Gena care coifică decarboxilaza acidului ferulic a fost plasată sub controlul promotorului din napină de la B. napus specific 19 pentru semințe și plasmida a fost utilizată pentru a transforma plantele de tabac conform protocoalelor standard. Harta de restricție a vectorului este prezentată în fig. 20. Vectorul 21 pGS97b2 după cum se arată în fig.20 este similar lui pGS97b3, cu excepția faptului că pe același schelet de vector caseta Hindlll-35S-BamHI a fost înlocuită cu caseta Hindlll-pro- 23 motor din napină-BamHI prezentată în fig. 12 pentru pHS731. Au fost recuperate plante transgenice care exprimă gena care codifică decarboxilaza acidului ferulic. Semințele 25 plantelor au fost analizate pentru conținutul fenolic și producerea vinilguaiacolului.

Exemplul 10. Determinarea specificității pentru țesut și a modelului de dezvoltare a 27 acumulării de acid fitic în semințele în dezvoltare ale unei plante cruci fere de Brassica napus. Biosinteză acidului fitic 29 în acest exemplu au fost obținute informații privitoare la calea biosintetică a acidului fitic în sămânța de Brassica. întrucât acidul fitic este derivatul hexafosfat al mioinozitolului 31 1 (acidul fitic este cunoscut sub numele IP₆), au fost determinate proporțiile de derivați fosforilați individuali ai componenților de mioinozitol (de ex. IP,, IP₂,1P₃, IP₄ și IP₅) din totalul deri- 33 vaților fosforilați de inozitol. Acidul fitic pur, degradat parțial prin introducerea în autoclavă pentru a produce diferiții derivați fosforilați a fost utilizat ca standard pentru analiza HPLC 35 efectuată conform Vernon și Bohnert (1992, The EMBO Journal 11 :2077 - 2085) și Vernon DM, Tarczynski MC și Jensen RG și Bohnert HJ (1993, The Plant Journal, 4:199-205). 37

Diferitele forme de inozitol fosforilat (de ex. IP,, IP₂, IP₃, IP₄ și IP₅) și acidul fitic au fost ușor de identificat prin această analiză. Când au fost analizate probe de fosfat de inozitol 39 extrase din semințe în curs de dezvoltare de Brassica a fost identificat numai un pic, corespunzătoare lui IP₆ (adică acid fitic). Acest rezultat a demonstrat că IP₆ este forma de fosfat 41 de inozitol predominantă în semințele în dezvoltare, și că alte forme intermediare de inozitol fosforilat nu au putut fi detectabile prin HPLC prin metodele descrise. în consecință, biosin- 43 teza acidului fitic din mioinozitol se consideră a avea loc într-un mod rapid și în esență cantitativ. 45

Dezvoltarea biosintezei acidului fitic în această parte a exemplului a fost determinată evoluția în timp a acumulării de acid 47 fitic. Metodele pentru determinarea conținutului de acid fitic al semințelor sunt, după cum urmează: semințele sunt pisate în mojar în prezență de azot lichid și pudra este transferată 49 într-un tub steril de 15 ml conținând 5 ml HCI 0,5 M. După îndepărtarea lipidelor prin extracție

RO 122151 Β1 cu hexan, faza rămasă (faza apoasă cu reziduuri de țesuturi) este sonicată timp de 90 secunde la nivelul 3 cu un procesor ultrasonic lichid (Model XL2020, Heat Systems, Inc., Farmingdale, NY, USA). După centrifugare lichidul este transferat într-un tub proaspăt pentru analiza acidului fitic prin HPLC. Această metodă a fost aplicată semințelor aflate în diferite stadii de dezvoltare.

Acumularea de acid fitic în timpul dezvoltării semințelor este prezentată în fig. 21. Deși acidul fitic este detectabil la început în semințe foarte timpuriu (și anume la 12 zile după polenizare), conținutul nu a crescut semnificativ până la 22 zile după polenizare. în timpul unei perioade de 10 zile după prima sa apariție, acidul fitic atinge un nivel maxim de aproximativ 240 ug/sămânță. Conținutul de acid fitic exprimat față de greutatea uscată a sămânței mature este de aproximativ 3,2%. Aceste rezultate indică faptul că reducerea acidului fitic prin interferența cu biosinteza acidului fitic necesită un promotor care este capabil să se exprime de la aproximativ 12 DAP până aproape de maturitatea seminței.

Analiza mai aprofundată a arătat că acidul fitic este în principal depus mai degrabă în țesutul embrionar decât în învelișul seminței (fig. 22). Cotiledoanele conțin aproape 90% din acidul fitic al seminței și 10% este prezent în axa embrionului. Aceste date sugerează faptul că diferitele țesuturi ale embrionului sunt țesuturile țintă preferate pentru reducerea acidului fitic prin modificarea genetică a biosintezei acidului fitic.

Exemplul 11. Determinarea metabolismului mioinozitolului în țesutul seminței în dezvoltare

Acest exemplu ilustrează care este cantitatea de mioinozitol utilizată pentru biosinteza acidului fitic. Deși mioinozitolul este precursor în sinteza acidului fitic în plante, este de asemenea utilizat în alte căi anabolice pentru producerea de fosfatidiinozitol și de componente ale pereților celulari. Acest exemplu ilustrează cantitatea din totalul de mioinozitol care este utilizat pentru biosinteza acidului fitic în semințele în dezvoltare. Marcarea in vivo a semințelor Brassica utilizând ³H-mioinozitol a fost utilizată pentru a urmări distribuția de inozitol în diferite fracțiuni extrase cu diferiți solvenți. Tehnica utilizată pentru marcarea radioactivă in vivo a semințelor în dezvoltare cu ³H-mioinozitol este după cum urmează. Păstăi în diferite stadii de dezvoltare au fost îndepărtate și capătul tăiat a fost imediat plasat în 10 ml mediu de cultură steril conținând 5 uCi ³H-mioinozitol în tuburi de 50 ml și a fost cultivat în condiții de creștere standard (la 20°C timp de 16 h la lumină, la 15°C timp de 8 h fără lumină) timp de 2 zile. Semințele au fost recoltate pentru extracția lipidelor, acizilor fitici, componenților pereților celulelor solubili în acid trifluoroacetic (TFA) și a resturilor din pereții celulari. Radioactivitatea a fost determinată în fiecare fracțiune prin scintilație lichidă.

Au fost efectuate patru tipuri de extracții din semințele marcate radioactiv pentru a separa componentele solubile în apă ale celulelor (pentru analiza acidului fitic), solubile în hexan (pentru analiza lipidelor), componentele pereților celulari solubile în acid trifluoroacetic (TFA) și debriurile celulare. Fig. 23 listează radioactivitatea medie în fiecare fracțiune la diferite stadii de dezvoltare a seminței. Datele indică că mai mult de 20% din totalul marcajelor din semințe se găsesc în fracțiunea lipidică la 25-30 zile după polenizare (DAP). Radioactivitatea în fracțiunile din pereții celulelor (pereții celulelor solubili în TFA și debriurile celulare) corespunde la aproximativ 5% din marcajul încorporat în cursul dezvoltării semințelor. Radioactivitatea în fracțiunea solubilă în apă a fost analizată în continuare prin HPLC pentru identificarea cantității de acid fitic. S-a găsit că aproximativ 10% din marcaj în extractul solubil în apă este recuperat în picul de acid fitic și aproximativ 30% din marcaj este în picul de injecție al probei, care este mioinozitol liber. Celălalt material marcat prezent în extractul solubil în apă a fost recuperat în picurile pre- și post-acid fitic, reprezentând compuși neidentificați.

RO 122151 Β1

Procentul de marcaj metabolizat găsit în fracțiunile acid fitic, lipide, pereți ai celulelor 1 solubili în TFA, debriuri celulare este prezentat în fig. 3. Aproximativ 30% din marcajul din metaboliții derivați de la ³H-mioinozitol se regăsește în acidul fitic la 20 - 30 DAP. 3 Concomitent, aproximativ 60% din marcaj a fost prezent în lipide (fosfolipide conținând inozitol) și mai puțin de 10% în fracțiunea cu pereți celulari. 5

De aceea, cantitatea totală de mioinozitol care este utilizată pentru biosinteza acidului fitic este de aproximativ 30% la un moment al dezvoltării semințelor în care biosinteza 7 acidului fitic pare a fi la un maxim.

Exemplul 12. Clonarea unei gene care codifică o enzimă capabilă de a acționa 9 asupra mioinozitolului în acest exemplu, a fost izolată o genă capabilă să acționeze asupra mioinozitolului. 11 Gena este gena care să codifică inozitol O-metil transferaza din planta de gheață comună. Clonarea cu ajutorul revers-transcriptazei a fost utilizată pentru a izola gena după cum se 13 descrie în continuare. Manipularea standard a ADN a fost efectuată conform Maniatis și colab., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring 15

Harbor, NY. ARN total a fost extras din țesuturi de frunză de plantă de gheață tratate cu 500 mM NaCI, iar poli(A) + ARN au fost purificate suplimentar. Acest mARN a fost utilizat 17 pentru transcriere inversă de Superscript II revers-transcriptază (Promega, Madison, Wl.)în următoarele condiții: trei micrograme mARN dizolvate în 20 microlitri apă au fost utilizați ca 19 model. ARN-ul a fost denaturat prin încălzirea la 65°C timp de 5 minute apoi răcit pe gheață. Amestecului i-au fost adăugați 3 microlitri oligo-dT (500 micrograme/ml), 8 microlitri tampon 21 de 5X revers-transcriptază, 4 microlitri DTT 0,1 M, 2 microlitri dNTPs 10 mM. Amestecul a fost încălzit la 42°C apoi s-au adăugat 3 microlitri (60 unități) de Supertranscript II revers- 23 transcriptază. Reacția a fost efectuată timp de o oră la 42°C. După această perioadă de timp s-a adăugat 1 microlitru de RNA-ază H (1,5 unități/microlitri) și reacția a fost continuată timp 25 de 30 minute la 37°C. cADN rezultat a fost utilizat ca model pentru PCR de polimeraza Vent în următoarele condiții: reacția PCR a fost efectuată într-un volum de 100 microlitri cu cicluri 27 constând din 94°C timp de un minut, 55°C timp de un minut, 72°C timp de un minut cu o extensie de 2 secunde pentru fiecare ciclu cu un total de 30 cicluri. Primerii utilizați în 29 această reacție s-au bazat pe secvența ADN IMT publicată (GenBank număr de acces M87340). Primerul în sens direct a fost Secvența I.D. Nr. 6: 31 ⁵'TTTTTGGATCCATGACTACTTACA CAATGGCAACTACA³’ 33 care conține un site BamH I la capătul 5’ (subliniat). 35

Primerul în sens invers utilizat a fost Secvența cu I.D. Nr. 7:

⁵TTTTTTTTGCGGCCGCATAAAGGCAAATCATACACTG³ care conține un site Not I la capătul 5' (subliniat).

Fragmentul ADN amplificat a fost digerat cu BamH I și Not I, și apoi subclonat în pSPORT 41 1 (BRL, Bethesda, MD.). Fragmentul PCR digerat cu Bam HI, Not I a fost donat în site-urile corespunzătoare ale vectorului pSPORT pentru a deriva pSportIMT. Fig. 24 (Secvența cu 43 I.D. Nr. 5) prezintă secvența fragmentului ADN amplificat care este identic cu secvența ADN IMT publicată cu excepția unei diferențe de două baze în regiunea 3’ netranslatată. Secvența 45 de proteină prezisă este identică cu informația publicată disponibilă de la GeneBank.

RO 122151 Β1

Exemplul 13. Construcția vectorilor de transformare a plantelor cu o genă care codifică o enzimă capabilă să acționeze asupra mioinozitolului: Utilizarea genei mioinozitol O-metil transferază din planta de gheață

Acest exemplu ilustrează construcția unui vector de transformare a unei plante care conține o genă capabilă să acționeze asupra mioinozitolului sub controlul unul promotor activ în celulele vegetale. Vectorul de transformare a plantelor exemplificat conține gena mioinozitol O-metil transferază sub controlul unui promotor activ în celulele semințelor, promotorul 35S. Construcția vectorului s-a realizat după cum urmează: pSportIMT a fost digerată cu Bam HI și Eco RI pentru a elibera gena IMT. Fragmentul de genă IMT a fost donat în siteurile corespunzătoare ale pBluescript SK (-), (Stratagene, La Jolla, CA.) și plasmida rezultantă este cunoscută sub numele pBlueIMT. pBlueIMT a fost digerată cu Spe I și donată în vectorul pBI 221 (CloneTech) tăiat anterior cu Xba I. O plasmidă care a conținut gena IMT cu orientarea corectă față de promotorul 35S în pBI 221 a fost ales și digerat cu Hind III și Eco RI. Fragmentul terminator 35S-IMT-Nos a fost transferat în pRD400 rezultând vectorul de transformare a plantei p35SIMT.

Constructul rezultant, p35SIMT, conține o casetă promotor 35S-IMT-GUS-Nos terminator în pRD400 și este prezentat în Figura 25.

Exemplul 14. Construcția vectorilor de transformare a plantelor cu o genă care codifică o enzimă capabilă să acționeze asupra mioinozitolului sub controlul unui promotor selectiv pentru semințe în acest exemplu, o genă care codifică o enzimă capabilă să acționeze asupra mioinozitolului sub controlul unui promotor selectiv pentru semințe a fost construită într-un vector de transformare a plantelor. Gena utilizată a fost gena mioinozitol O-metil-transferază și promotorul a fost promotorul din napină selectiv pentru semințe. Vectorul este cunoscut sub numele pNIMT.

Vectorul pNIMT a fost construit după cum urmează: un fragment de ADN IMT digerat de Spe I (Exemplul 4) a fost legat în pDH1 (promotorul din napină conform descrierii lui Kohno-Murase și colab. 1994, Plant Molecular Biology, 26: 1115-1124) la un site Xba I, rezultând o casetă promotor din napină-IMT-Nos terminator. Această casetă de exprimare a fost apoi transferată în pRD400. Vectorul rezultant este prezentat în fig. 26.

Exemplul 15. Transformarea Brassica napus (Westar) cu P35SIMT

Vectorul p35SIMT a fost inserat în tulpina de Agrobacterium MP90 prin încrucișare triparentală standard urmată de transformarea Brassica mediată de Agrobacterium. Transformarea a fost efectuată conform descrierii din Exemplul 4. Plantele transformate cu p35SIMT au fost obținute și analizate pentru conținutul de fitat.

Exemplul 16. Analiza moleculară a plantelor transgenice

Plantele transgenice F_o conținând caseta de exprimare CaMV 35S-IMT au fost analizate prin PCR, testele spoturilor Southern și northern, precum și prin testul enzimei IMT. Analiza PCR preliminară a indicat faptul că toate plantele transgenice au conținut gena IMT (fig. 27). Hibridizarea Southern a arătat că gena IMT a fost integrată în genomul Brassica cu diferite numere de ordine. ARN-ul total a fost extras din semințe în dezvoltare pentru analiza de hibridizare northern după cum se arată în fig. 28.

Exemplul 17. Analiza acidului fitic în pianteie transgenice

Conținutul de acid fitic a fost analizat în semințele mature recoltate de la plantele transgenice F_o. Extracția semințelor a fost efectuată conform descrierii din Exemplul 10. Datele colectate au indicat faptul că în plantele transgenice s-a găsit o reducere în medie mai mare de 15% de acid fitic. Figurile 29 și 30 prezintă datele. Datele colectate indică faptul că în medie o reducere mai mare de 15% acid fitic se găsește în plantele transgenice obținute

RO 122151 Β1 cu vectorul pSIMT. Semințele F., sunt amestecuri de semințe transgenice și netransgenice 1 datorită segregării, deci de fapt reducerea acidului fitic este mai mare per sămânța transformată. Semințele F₂ și F₃ sunt linii homozigote conținând vectorul pSIMT. Este evident faptul 3 că în condiții de câmp liniile homozigote care poartă vectorul pSIMT prezintă și au în medie o reducere de 30% a nivelurilor de acid fitic în sămânță. în afară de analiza acidului fitic, ana- 5 liza Southern a spoturilor a fost efectuată pentru a determina numărul de ordine al genelor inserate. Chiar în plantele cu o singură copie de genă inserată, s-a observat o reducere 7 semnificativă (34%) a acidului fitic (de ex. Planta cu numărul TP #11). Astfel, exprimarea unei activități a enzimei capabile de a modifica mioinozitolul în țesuturile responsabile pentru 9 biosinteză acidului fitic conduce clar la o reducere a acidului fitic în sămânță. Este de asemenea clar faptul că caracteristica de acid fitic redus poate fi transferată pe cale sexuală, 11 întrucât aceasta s-a putut moșteni, astfel încât metoda utilizată poate de asemenea include transferul caracteristicii prin tehnici de creștere convenționale odată ce caracteristica de 13 concentrație scăzută în acid fitic este stabilită.

Exemplul 18. Transformarea Brassica napus cu pNIMT 15

Vectorul p35SNIMT a fost inserat în tulpina Agrobacterium MP90 prin încrucișare standard triparentală, urmată de transformarea mediată de Agrobacterium a Brassica. 17 Transformarea a fost efectuată conform descrierii din Exemplul 4. Plantele transformate cu p35NIMT su fost obținute și analizate pentru conținutul redus de acid fitic ca în Exemplul 17. 19

Figura 31 prezintă un tabel de date colectate de la semințele transgenice F, și F₂ purtând vectorul pNIMT crescutîn condiții de câmp. în plantele F, inserția pNIMT este segregatoare, 21 astfel, semințele analizate au fost un amestec de segreganți transgenici și netransgenici. în generația F₂, cele mai multe linii au fost populații homozigote sau aproape homozigote. în 23 analiza F₂ a fost observată o reducere de aproape 40% în conținutul de acid fitic al semințelor la plantele crescute în condiții de câmp. Astfel exprimarea unei enzime capabile de a 25 reduce disponibilitatea mioinozitolului pentru biosinteză acidului fitic într-o materie selectivă pentru semințe conduce la o reducere semnificativă a nivelurilor de acid fitic. 27

Exemplul 19. Formarea și acumularea de UDP-galactoză este prevenită utilizând activitatea unei enzime heteroloage celulelor de plante 29

Enzimă UDP-galactoză 4-epimerază (galE) este implicată în una din etapele majore ale metabolismului galactozei în sistemele vii. Ea catalizează conversia UDP-galactozei în 31

UDP-glucoză. Gena pentru enzimă este disponibilă de la oameni, drojdie și bacterii. Obiectivul acestui exemplu este de a supraexprima această enzimă în țesuturile specifice 33 ale plantei țintă, în vederea creșterii rezervei de UDP-glucoză pe seama celui de UDP-galactoză. Rezultatul prevăzut va fi biosinteză redusă a galactinolului, care este precursorul glico- 35 zidelor sucrozei anti-nutriționale (glicozide RFO (Familia Rafinoză a Oligozaharidelor), de exemplu rafinoză, stahioză etc). Atingerea acestui țel va conduce, pe lângă reducerea vitezei 37 de acumulare a glicozidelor RFO nedorite, la disponibilitatea mărită a UDP-glucozei și, concomitent, a sucrozei. Cea din urmă este de așteptat să participe și să favorizeze alte căi 39 metabolice în care sucroza este necesară fie pentru producerea de alți metaboliți care sunt esențiali pentru plantă sau ca sursă de carbon pentru productivitatea mărită a plantei (de ex. 41 proteine, lipide, randament global etc.).

Acesta este un exemplu pentru a ilustra utilitatea unei enzime bacteriene în plantele 43 superioare pentru a determina conversia metabolică a unui substrat esențial în altul, când substratul nou rezultat va fi imediat utilizat de plantă într-o varietate de interconversii 45 metabolice importante.

RO 122151 Β1

Exemplul 20. Alterarea nivelurilor de derivați de zaharuri utilizând enzima fosfoglucomutaza (pgm)

Enzima fosfoglucomutază (pgm) catalizează interconversia glucozei (Glc)-l-și Glc-6fosfatîn sinteza și consumarea sucrozei. Enzima joacă un rol de pivot în sinteza și utilizarea sucrozei, amidonului și glicogenului și este prezentă în toate organismele. Gena pentru această enzimă este disponibilă dintr-o varietate de surse eucariote și bacteriene (de exemplu Agrobacterium).

G-1 -P și G-6-P sunt substraturi esențiale într-un număr de căi metabolice primare ale carbohidrațilorîn toate sistemele vii. în mod specific, G-1 -P este substratul primar pentru producerea UDP-glucozei, care este substratul principal în biosinteza sucrozei. G-6-P, pe de altă parte, este materia primă principală pentru un număr de interconversii ale zaharurilor, unul din acestea fiind sinteza mioinozitolulul-1-Ρ. Acesta din urmă este un substrat principal și co-factor în sinteza acidului fitic și respectiv a RFO-urilor.

Obiectivul acestui exemplu este de a arăta că prin supraexprimarea genei PGM bacteriene într-o plantă țintă raportul relativ G-1-P la G-6-P poate fi manipulat în favoarea uneia sau alteia din cele două forme fosforilate ale glucozei (dependente de țesut). Prin orientarea corectă a acestei activități, și anume în dezvoltarea semințelor de exemplu ('sink tissues'), ar fi de așteptat o creștere a nivelului G-1 -P, care ar cere producerea de UDP- sau ADP-glucoză, și apoi sucroză și alte substanțe de stocare ca proteine, lipide sau amidon. Pe de altă parte, efectul micșorării nivelului de G-6-P va trece în niveluri mai joase de factori anti-nutriționali menționați mai sus.

Exemplul 21. Producerea și regenerarea celulelor transgenice de porumb

Culturile de calus de tip II sunt inițiate din embrioni zigotici imature din genotipul Hi-ll. (Armstrong și colab., (1991), Maize Genet. Coop. Newslett., 65 : 92-93). Embrionii imaturi sunt izolați aproximativ 14 zile după polenizare din spice crescute în seră din încrucișări între un părinte A Hi-ll și un părinte B Hi-ll sau între embrionii F2 derivați de la auto- sau sibpolenizarea unei plante Hi-ll. Embrioni imaturi (1,5 până la 3.5 mm) sunt cultivați pe un mediu de inițiere constând din săruri N6 și vitamine (Chu și colab., (1978), The N6 medium and its application to another culture of cereai crops, Proc. Symp, Plant Tissue Culture, Peking Press, 43-56), 1,0 mg/L 2,4-D, 25 mM L-prolină, 100 mg/L hidrolizat de cazeină, 10 mg/L AgNO₃,2,5 g/L GELRITE (Schweizerhall, South Plainfield, NJ) și 20 g/L sucroză cu un pH de 5,8. După patru până la șase săptămâni, calus-ul este subcultivat în mediul de menținere (mediul de inițiere în care este omis AgNO₃ și L-prolina este redusă la 8 mM). Selecția pentru calus-ul de tip II este efectuată timp de cca, 12-16 săptămâni.

Pentru bombardarea, sau introducerea de ADN străin în celulele plantelor (transformarea prin bombardare cu microparticule), 140 pg ADN plasmidic (de exemplu 35SPAT/promotor al globulinei de porumb/IMT) sunt precipitate peste 60 mg particule sferice de aur clătite cu alcool (diametru 1,5- 3,0 pm, Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, Wl) adăugând 74 pL de CaCI₂ H₂O 2,5 M, și 30 pL spermidină 0.1 M (bază liberă) peste 300 pL de ADN plasmidic și H₂O. Soluția este imediat agitată și particulele de aur îmbrăcate în ADN sunt lăsate să se depună. Supernatantul clar rezultat este îndepărtat și particulele de aur sunt resuspendate în 1 ml etanol absolut. Această suspensie este diluată cu etanol absolut pentru a obține 15 mg aur acoperit cu ADN/mL. ADN-ul plasmidic utilizat conține preferabil un marker selectabil, ca de exemplu gena bar sau pat, care conferă rezistență la fosfinotricină sau ierbicidul glufosinat de amoniu și o construcție genetică capabilă să modifice metabolismul secundar, ca regiunea de codificare a genei IMT descrisă în fig. 24 sau regiunea de codificare a genei care codifică decarboxilaza acidului ferulic descrisă în fig. 17, sub controlul unui promotor selectiv din semințe adecvat, ca promotorul din globulina 1 din porumb sau promotorul din zeina din porumb. în mod alternativ, un promotor constitutiv ca un promotor din ubiquitina din porumb sau un promotor din actina din orez poate fi utilizat pentru a exprima IMT sau decarboxilaza acid ferulic.

RO 122151 Β1

Aproximativ 600 mg țesut calus embrionic este răspândit pe suprafața mediului de 1 întreținere a calus tip II care nu conține hidrolizat de cazeină și L-prolină, dar este suplimentat cu 0,2 M sorbitol și 0,2 M manitol ca osmotic. Calus-ul este menținut timp de 4 ore 3 ca pre-tratament și apoi transferat în vase de cultură conținând mediu de bombardare (medii osmotice solidificate cu 20 g/L TC agar (PhytoTechnology Laboratories, LLC, Shawnee 5 Mission, KS) în loc de 7g/l GELRITE. Heliu gazos (bombardare) este utilizat pentru a accelera particulele suspendate de aur acoperite cu ADN spre și în țesuturile țintă preparate. 7 Dispozitivul utilizat este descris în brevetul US 5141131. Țesuturile sunt acoperite cu un ecran de oțel inoxidabil (deschideri de 104 pm) și plasat sub vid parțial de 25 inch de Hg în 9 camera dispozitivului. Particulele de aur acoperite cu ADN sunt în continuare diluate 1:1 cu etanol absolut înainte de bombardare și sunt accelerate spre calus-ul țintă de patru ori utili- 11 zând o presiune de heliu de 1500 psi, cu fiecare bombardare furnizând 20 pL de suspensie ADN/aur. Imediat după bombardare, țesutul este transferat în mediul osmotic pentru o peri- 13 oadă de redresare de 16-24 h. După aceea, țesutul este divizat în bucăți mici și transferat în mediul de selecție (mediul de menținere căruia îi lipsește hidrolizatul de cazeină și L- 15 prolină dar conținând 30 mg/L BASTA® (AgrEvo, Berlin, Germania). La fiecare patru săptămâni pentru 3 luni, bucățile de țesut sunt transferate în mod neselectiv într-un mediu de 17 selecție proaspăt. După 7 săptămâni și până la 22 săptămâni sunt îndepărtate și izolate sectoarele calus care proliferează pe fondul țesutului cu inhibiție de creștere. Țesutul rezis- 19 tent la BASTA® este subcultivat bisăptămânal în mediu de selecție proaspăt. Urmând o analiză adecvată, sunt identificate linii transgenice pozitive și sunt transferate în mediile de 21 regenerare.

Regenerarea este inițiată prin transferarea țesutului calus într-un mediu de inducție 23 bazat pe citokinină, care constă din săruri Murashige și Skoog, denumite în cele ce urmează MS, și vitamine (Murashige și Skoog, (1962) Physiol. Plant., 15 : 473-497) 30 g/l sucroză, 25 100 mg/l mioinozitol, 30 g/l manitol, 5 mg/l 6-benzilaminopurină, denumită în continuare BAP,

0,025 mg/l 2,4-D, 30 mg/l BASTA® și 2,5 g/l GELRITE la pH 5,7. Culturile sunt plasate în 27 lumină slabă (125 ft-candele) timp de o săptămână urmată de o săptămână de lumină intensă (325 ft- candele). Urmând o perioadă de inducție de două săptămâni, țesutul este 29 transferat în mod neselectiv într-un mediu de regenerare fără hormoni, care este identic cu mediul de inducție cu observația că îi lipsește 2,4-D și BAP, și este menținut în lumină 31 puternică. Plăntuțe mici (1,5-3 cm) sunt îndepărtate și plasate în tuburi de cultură de 150 x 25 mm conținând mediu SH (săruri SH și vitamine (Schenk și Hildebrandt, (1972) Can. J. 33 Bot. 50 :199-204), 10 g/l sucroză, 100 mg/l mioinozitol, 5 ml/l FeEDTA si 2.5 g/l GELRITE, pH 5,8). 35

Plăntuțele mai mari sunt transferate în vase de 12 cm conținând aproximativ 0,25 kg METRO-MIX 360 (The Scotts Co. Marysville, OH) în seră de îndată ce prezintă creștere și 37 dezvoltă un sistem suficient de rădăcini. Plăntuțele sunt crescute cu o fotoperioadă de 18 h suplimentată de o combinație de lămpi de sodiu la înaltă presiune și lămpi de halogenuri 39 metalice, și sunt udate după nevoie cu o combinație de trei formulări de fertilizare independente Peters Excel (Grace-Sierra Horticultural Products Company, Milpitas, CA). în etapa 41 cu 6-8 frunze, plantele sunt transplantate în vase de 5 galoane conținând aproximativ 4 kg METRO-MIX 360, și crescute la porumb transgenic fertil matur. Semințele furnizate de 43 aceste plante conțin genele inserate în embrioanele imature și când se vor dezvolta în plante vor exprima proteinele codificate prin ADN-ul inserat. 45

Exemplul 22. Producerea orezului transgenic

Pentru inițierea calus-ului embriogenic, semințe mature de Japonica cultivar, Taipei 47 309 sunt decorticate și sterilizate la suprafață în etanol 70% timp de 2-5 min. urmat de o înmuiere timp de 30-45 min în albitor comercial 50% (hipoclorit de sodiu 2,6%) cu câteva 49 picături de săpun Liquinox. Semințele sunt apoi clătite de 3 ori în apă distilată sterilă și plasate pe hârtie de filtru înainte de transferarea în mediul de inducție a călușului' (și anume 51

RO 122151 Β1

NB). Mediul NB constă din N6 macro elemente (Chu, 1978, Mediul NS și aplicația lui la o altă cultură de cereale, Proc, Symp. Plant Tissue Culture, Peking Press, p 43-56), microelemente B5 și vitamine (Gamborg și colab., 1968, Cerințe nutriționale ale culturilor în suspensie de celule de rădăcină de soia, Exp. Cell Res. 50 : 151-158), 300 mg/l hidrolizat de cazeină, 500 mg/i L-prolină, 500 mg/l L-glutamină, 30 g/l L-sucroză, 2 mg/l acid 2,4-diclorfenoxiacetic (2,4-D) și 2,5 g/l gelrită (Schweizerhall, NJ) cu pH-ul ajustat la 5,8. Semințele mature cultivate pe mediul de “inducție” a călușului sunt incubate la întuneric la 28°C. După 3 săptămâni de cultivare, călușul primar apărut, indus din regiunea scutelară a unui embrion matur, este transferat în mediul NB proaspăt pentru întreținere ulterioară.

Transformarea biolistică a țesutului de plantă este utilizată pentru a introduce ADN-ul străin. Aproximativ 140 pg ADN plasmidic este precipitat peste 60 mg particule de aur de 1,0μ (Bio-Rad) așa cum este descris în Exemplul 21. Este utilizată plasmidă conținând promotorul din ubiquitina din porumb care acționează hpt (higromicin fosfotransferaza) și ubiquitina 1 din porumb, globulina 1 din porumb și promotorul din zeină care acționează gena IMT. Aproximativ 140 pg ADN plasmidic este precipitat peste 60 mg particule de aur de 1,0 μ (BioRad) așa cum este descris aici.

Pentru insuflarea cu heliu, culturi de calus embriogen care cresc activ, de dimensiune 2-4 mm, sunt supuse unui tratament osmotic înalt. Acest tratament include plasarea călușului pe mediul NB cu manitol 0,2 M și sorbitol 0,2 M (Vain și colab., 1993, Tratamentul osmotic îmbunătățește transformarea tranzitorie și stabilă mediată de bombardarea cu particule a porumbului, Plant Cell Rep. 12:84-88) timp de 4 h înainte de insuflarea cu heliu. După tratamentul osmotic culturile de calus sunt transferate în mediul de bombardare (NB + 2% agar) și acoperite cu un ecran de inox (230μ). Culturile calus sunt insuflate la presiuni de heliu de 2.000 psi de două ori per țintă. După insuflare, calus-ul este transferat înapoi în mediu osmotic înalt peste noapte, înainte de plasarea pe mediul de selecție care constă din mediu NB cu 30 mg/l higromicină. După 2 săptămâni, culturile sunt transferate într-un mediu de selecție proaspăt cu o concentrație mai mare de agent de selecție, și anume NB+50 mg/l higromicină (Li și colab., 1993, Sistem îmbunătățit de transformare a orezului utilizând metoda biolistică, Plant Cell Rep. 12 : 250-255).

Culturi de calus embriogenic, compacte, alb-galbene, recuperate pe NB+50 mg/l higromicină sunt regenerate prin transferarea în mediul de pre-regenerare (PR) + 50 mg/l higromicină. Mediul PR care constă din mediu NB cu 2 mg/l benzii aminopurină (BAP), 1 mg/l acid naftalen acetic (NAA) și 5 mg/l acid abscisic (ABA). După 2 săptămâni de cultură în întuneric, calus-ul este transferat în mediul de regenerare (RN). Compoziția mediului RN este mediu NB cu 3 mg/l BAP și 0,5 mg/l NAA. Culturile de calus pe mediul RN sunt incubate timp de două săptămâni la 28°C sub lumină fluorescentă intensă (325 ft-candele). După ce plăntuțele încep să se formeze, plăntuțele cu tija de 2 cm sunt transferate în cutii cu fucsină conținând 1/2 mediu MS (Murashige și Skoog, 1962, Un mediu revăzut pentru creșterea rapidă și bioteste cu culturi de țesuturi de tabac, Physiol. Plant. 15 : 473-497) cu 1/2 vitamine B5,10 g/l sucroză, 0,05 mg/l NAA, 50 mg/l higromicină și 2,5 g/l gelrite ajustat la pH 5,8. Plante mari de 8-15 cm cu sisteme de rădăcini bine dezvoltate sunt transferate în sol (1 metromix : 1 top sol) și crescute în seră (29/24°C ciclu zi/noapte, 50-60% umiditate, 12 ore fotoperioadă). Plantele de orez se dezvoltă într-o recoltă de orez transgenic fertil. Sămânța produsă de aceste plante conține genele inserate în calusu de orez și atunci când devin plante ele vor exprima proteinele codificate de ADN-ul inserat.

RO 122151 Β1

LISTA DE SECVENȚE

I <110> GEORGES, FAWZY 3

DONG, JIN-ZHUO

KELLER, WILF 5

HUSSAIN, ATTA A. K.

SELVARAJ, GOPALAN 7

DATLA, RAJU <120> METODE Șl COMPOZIȚII PENTRU MODULAREA METABOLIȚOR

SECUNDARI Al PLANTELOR	11
<130> pct	13
<140	15
<141 >	17
<150 US 60/072156	19
<151 > 1998-01-22	21
<150> US 09/012453
<151 > 1998-01-23	23
<160 7	25
<170> Patentln Ver. 2,0	27

RO 122151 Β1 <210> 1 <211> 483 <212> DNA <213> Arthrobacter pascens <400> 1 atggaccaat tcgtgggtct ccacatgatc tacacatacg agaacggttgg gagtacgaa atctacatca agaacgacca cacaatcgac taccgtatcc acagtggtat ggtgggtggt aggtgggtga gggaccaaga ggtgaacatc gtgaagctca caaagggtgt gtacaaggtg agctggacag agccaacagg tacagacgtg agcctcaact tcatgccaga ggagaagagg atgcacggtg tgatcttctt cccaaagtgg gtgcacgaga ggccagacat cacagtgtgc taccaaaacg actacatcga cctcatgaag gagagcaggg agaagtacga gacataccca aagtacgtgg tgccagagtt cgctgacatc acatacatcc accacgctgg agtgaacgac gagacaatca tcgctgaggc tccatacgag ggtatgacag acgagatcag ggctggtagg aag <210> 2 <211> 161 <212 > PRT <213> Bacillus pumilus <400> 2

Met Asp Gin Phe Val Gly Leu His Met Ile Tyr Thr Tyr Glu Asn Gly

10 15

RO 122151 Β1

Trp Glu Tyr

Glu 20 Gly

Ile Met

Tyr Ile Lys Asn Asp His

Thr Arg

Ile Asp Tyr Arg

1 3 5 7

Val

Gly

25

Val

30

Val

Ile

His

Ser 35

Gly 40

Arg

Trp

Asp 45

Gin

Glu

Asn

Ile

Val

Lys

Leu

Thr

Lys

Gly

Val

Tyr

Lys

Val

Ser

Trp

Thr

Glu

9

50

55

60

11

13

Pro

Thr

Gly

Thr

Asp

Val

Ser

Leu

Asn

Phe

Met

Pro

Glu

Lys

Arg

65

70

75

80

15

17

Met

His

Gly

Val

Ile

Phe

Pro

Lys

Trp

Val

His

Glu

Arg

Pro

Asp

19

85

90

95

21

Ile

Thr

Val

Cys

Tyr

Gin

Asn

Asp

Tyr

Ile

Asp

Leu

Met

Lys

Glu

Ser

23

100

105

110

25

Arg

Glu

Lys

Tyr

Glu

Thr

Tyr

Pro

Lys

Tyr

Val

Pro

Glu

Phe

Ala

27

115

12 0

125

29

Asp

Ile

Thr

Tyr

Ile

His

Ala

Gly

Val

Asn

Asp

Glu

Thr

Ile

31

130

135

140

33

Ala

GlU

Ala

Pro

Tyr

Glu

Gly

Met

Thr

Asp

Glu

Ile

Arg

Ala

Gly

Arg

35

145

150

155

160

37

RO 122151 Β1

Lys <210=> 3 <211> 546 <212> PRT <213> Arthrobacter pascens

11

13

<400> 3

15

Met

His

Ile

Asp

Asn

Val

Glu

Asn

Leu

Asn

Asp

Arg

Glu

Phe

Asp

Tyr

1

5

10

15

17

19

Ile

Gly

Ser

Ala

Gly

Ala

Val

Ala

Arg

Leu

20

25

30

21

23

Ser

Glu

Pro

Thr

Val

Ser

Val

Ala

Leu

Val

Glu

Ala

Gly

Pro

Asp

25

35

40

45

27

Asp

Arg

Gly

Val

Pro

Glu

Val

Leu

Gin

Leu

Asp

Arg

Trp

Met

Glu

Leu

29

50

55

60

31

Leu

Glu

Ser

Gly

Tyr

Asp

Trp

Asp

Tyr

Pro

Ile

Glu

Pro

Gin

Glu

Asn

33

65

70

75

80

35

Gly

Asn

Ser

Phe

Met

Arg

His

Ala

Arg

Ala

Lys

Ile

Met

Gly

Cys

37

85

90

95

RO 122151 Β1

Ser Ser His Asn	Ser Cys	lle Ala Phe Trp Ala Pro Arg Glu Asp	Leu	1 3
	100	105	110
						5
Asp Glu Trp	Glu	Ser Lys	Tyr Gly Ala	Thr Gly Trp Asn Ala Glu	Ser
115			12 0	125		7
						9
Ala Trp Pro	Leu	Tyr Gin	Arg Leu Glu	Thr Asn Glu Asp Ala Gly	Pro
						11
13 0			13 5	140
						13
Asp Ala Pro	His	His Gly	Asp Ser Gly	Pro Val His Leu Met Asn	Val	15
145		150		155	160
						17
Pro Pro Ala	Asp	Pro Ala	Gly Val Ala	Leu Leu Asp Ala Cys Glu	Gin	19
		165		170 175
						21
Ala Gly lle	Pro	Arg Ala	Lys Phe Asn	Thr Gly Thr Thr Val lle	Asn	23
	180		185	190		25
Gly Ala Asn	Phe	Phe Gin	lle Thr Arg	Arg Ala Asp Gly Thr Arg	Ser	27
195			200	205		29
						31
Ser Ser Ser	Val	Ser Tyr	lle His Pro	lle lle Glu Arg Gly Asn	Phe
210			215	220		33

RO 122151 Β1

Thr Leu Leu Thr Gly Leu Arg Ala Arg Gin Leu Val Phe Asp Ala Asp

225 230 235 240

Lys Arg Cys Thr Gly Val Asp Val Val Asp Ser Ala Phe Gly Arg Thr

245 250 255

His Arg Leu Ser Ala Arg Cys Glu Val Ile Leu Ser Thr Gly Ala Ile 260 265 270

Asp Ser Pro Lys Leu Leu Met Leu Ser Gly Ile Gly Pro Ala Ala His 275 280 285

Leu Ala Glu His Gly Val Glu Val Leu Val Asp Ser Pro Gly Val Gly 290 295 300

Glu His Leu Gin Asp His Pro Glu Gly Val Val Gin Phe Glu Ala Lys

305 310 315 320

Gin Gin Met Val Gin Thr Ser Thr Gin Trp Trp Glu Ile Gly Ile Phe

325 330 335

Thr Pro Thr Glu Asn Gly Leu Asp Arg Pro Asp Leu Met Met His Tyr 340 345 350

Gly Ser Val Pro Phe Asp Met Asn Thr Leu Arg Tyr Gly Tyr Pro Thr 355 360 365

RO 122151 Β1

Thr

Glu Asn Gly 370

Phe

Ser Leu Thr Pro Asn Val Thr

His Ala Arg Ser

3

375

380

Arg

Gly

Thr

Val

Arg

Leu

Arg

Ser

Arg

Asp

Phe

Arg

Asp

Lys

Pro

Ala

5

385

390

395

400

7

9

Val

Asp

Pro

Arg

Tyr

Phe

Thr

Asp

Pro

Glu

Gly

His

Asp

Met

Arg

Val

11

405

410

415

13

Met

Val

Ala

Gly

Ile

Arg

Lys

Ala

Arg

Glu

Ile

Ala

Gin

Pro

Ala

15

420

425

430

17

Met

Ala

Glu

Trp

Thr

Gly

Arg

Glu

Leu

Ser

Pro

Gly

Thr

Glu

Ala

Gin

19

435

440

445

21

Thr

Asp

Glu

Leu

Gin

Asp

Tyr

Ile

Arg

Lys

Thr

His

Asn

Thr

Val

23

450

455

460

25

27

Tyr

His

Pro

Val

Gly

Thr

Val

Arg

Met

Gly

Pro

Ala

Asp

Met

29

465

470

475

480

31

Ser

Pro

Leu

Asp

Pro

Glu

Leu

Arg

Val

Lys

Gly

Val

Thr

Gly

Leu

Arg

33

485

490

495

35

Val

Ala

Asp

Ala

Ser

Val

Met

Pro

Glu

His

Val

Thr

Val

Asn

Pro

Asn

37

500

505

510

39

RO 122151 Β1

Ile Thr Val Met Met Ile Gly Glu Arg Cys Ala Asp Leu Ile Arg Ala 515 520 525

Ser Arg Thr Gly Glu Thr Thr Thr Ala Glu Ala Glu Leu Ser Ala Ser 530 535 540

Leu Ala

545 <210> 4 <211> 1641 <212 > DNA <213> Arthrohacter pascens <400> 4

atgcacatcg	acaacgtcga	aaacctcaac	gaccgcgagt	tcgactacat	catcatcggc	60
ggcggttccg	ccggagcggc	agtcgccgcc	cgcctgagcg	aggagcccac	cgtgtccgtg	120
gcgctggtgg	aggccggccc	ggacgaccgc	ggcgttcccg	aggtactgca	gctcgaccgc	130
tggatggagc	tgctggaatc	cggctacgac	tgggactacc	cgatcgaacc	gcaggagaac	240
ggcaactcct	tcatgcgcca	cgcccgcgcg	aagatcatgg	gtggctgctc	cagccacaac	300
tcctgcatcg	ccttcrgggc	cccgcgcgaa	gacctggacg	agtgggagtc	caagtacggc	360
accaccggct	ggaacgctga	gtccgcctgg	ccgctgtacc	agcggctgga	gaccaacgag	420
gacgccggcc	cggacgcgcc	gcaccacggc	gactcaggcc	cggtgcacct	gatgaacgtg	430

RO 122151 Β1

cccccggcgg	accccgccgg	cgtcgcactc	ctggacgcct	gcgaacaggc	aggcattccg	540
cgcgcgaagt	tcaacaccgg	caccaccgtg	atcaatggcg	ccaacttttt	ccagatcaca	600
cgccgcgcgg	acggcacccg	ttcctccagc	tcggtctcct	acatccaccc	gatcatcgag	660
cgcgggaact	tcaccctgct	gaccgggttg	cgcgcccggc	aactggtgtt	cgacgcggac	720
aagcgctgca	ccggcgtcga	cgttgtggac	tcggcgttcg	gccggactca	ccggctctcc	780
gcgcgttgcg	aggtcatcct	gtccaccggc	gccattgact	cgcctaagct	gctcatgctc	840
tccggcatcg	gccccgccgc	gcacctcgcc	gagcacggcg	tcgaggtcct	ggtcgacccc	900
cccggtgtcg	gcgagcacct	gcaggaccac	cccgaaggcg	tcgtccagtt	cgaggccaag	960
cagcagatgg	tgcagacttc	gacgcagtgg	tgggagatcg	gcatcttcac	ccccaccgag	1020
aacggcctgg	accgcccgga	cctgatgatg	cactacggct	ccgtcccgtt	cgacatgaac	1080
accctgcggt	acggctaccc	caccacggag	aacggcttca	gcctcacgcc	gaacgtcacg	1140
cacgcccgct	cccgcggcac	cgtccggctg	cgcagccgcg	acttccgcga	caagcccgcc	1200
gtcgacccgc	ggtacttcac	tgatccggag	ggccacgaca	tgcgcgtcat	ggtggccggc	1260
atccgcaagg	cccgtgaaat	cgccgcccag	cctgccatgg	ccgaatggac	cggccgcgag	1320
ctctcgcccg	gcaccgaggc	gcagaccgac	gaggaactgc	aggactacat	ccgcaagacg	1380
cacaacaccg	tttaccaccc	cgtcggcacc	gtccgcatgg	gaccagccga	cgacgacatg	1440
tcgccgctcg	accccgagct	gcgggtgaag	ggcgtgaccg	gcctgcgcgt	cgccgatgcc	1500
tctgtcatgc	ctgaacacgt	cacggtcaat	cccaacatca	ccgtcatgat	gatcggcgaa	1560
cgctgcgccg	acctcatccg	cgccagccgg	accggcgaaa	caacgacggc	ggaggcggag	1620
ctcagcgcgt	ccctcgcctg	a				1641

<210> 5 <211? 1494 <212> DNA <213> Mesembryanthemum crystallinum

RO 122151 Β1 <400> 5 aaaaaaaaaa caatggcaac agtgacatta aatccttgac tagccaaatc cctggctagc ggtgtatggt tggccctttg tgattacata ctacactggg tatcctggtc agttgatgtg cattaagggc tgtggagcat gaagtgggtg tgagagcctg agaagacaac ccaaggtgga ctctacagtt gtgattcaag ctggttaaaa ttgtaaatgt ttgtagctaa acaatgtagc tatgatttgc ttttacttct tacacacaac gcaaatgcag atattctcaa ggggcaaaga cactctgtgt ccagctcccc cttgttttgc ctagaaggag actgatgaaa atgaagaagc ggtggtaaca atcaactatg gttggtggta ttgcatgatt gcaaagggag ctcgaatcac aaagagagat gatgtcattt ctctaaatgc tttctcctac tgtgtttggg gttgatatcc atttgtggtt ctttattttt ctgttttacc caaaaaccct ctgcttttcc aagcagggga accctaatgc taacatgcaa tttgcaacta atcatgacaa gtgttccatt ggttcaatca tccttgacaa ttggtgtcaa acttgcctca acatgtttga ggagcgacga ggaagatcat acatggtgtt caaaggagga gctgtgccta tgtgttgttg ctagcatttg tttgggtttg tgctcatcta tcctttcaat aataacttaa aaaaagagaa agacaaagat aatgatcctg aggcgtgttt cccggtgttg gctccaaaag tcttgctagt ggtcatgatg caagcgcgct tgtgttcaac ctacaatggg tgtgagcatg tgtcattgct gagcatacca gcattgcgtg ccttgtggaa tagccttgat ttttgaagcc tgacacttgg tcattgttgc ttttatggct tatttgtatt ggctggctgc aaagcatcta tttttttttt aaaaaaatga gaacaattag aaatcagcct gtatcgactt ttggaccgga ggtgagggtg aatgatggtc gagagttggt catgggatga caagggatgg tttaatgatg atcgtcgcta gatgctcctt caagcagatg aagatactca tcgcttatac tgccacactt ttagcttcca gtcatggagc tagcccaagt aagttgagga tgtgttttgt attttttttg ttgtacctct cttgtttata ctacttacac ctggtttggc ctgagctaaa ctgagatcgc tgctccggct gttctcaaag aaggctctct ttcacttgaa tccaattcga cacaccacac tcaaggtcct agcatactca cttaccccgg ccattttcat acaagtgcta cagtaatccc tggtgcacaa agactggctt tctacaagaa agctagctag gattcatgta tgttgtgtct tggctgcctg gttatcagtg tcca

RO 122151 Β1 <210> 6 <211>38 3 <212> ADN <213> Secvență artificială ⁵ <220> ⁹ <223> Descrierea secvenței artificiale: Primer ₁₁ <400> 6 ¹³ tttfctggatc catgactact tacacaatgg caactaca 38 <210> 7 <211>37 <212>ADN 21 <213> Secvență artificială <220 25 <223> Descrierea secvenței artificiale: Primer <400> 7 ttttttttgc ggccgcataa aggcaaatca tacactg 37

Claims

1. Procedeu de îmbunătățire a profilului nutrițional al unei plante caracterizat prin aceea că, cuprinde următoarele etape: 35

-furnizarea unei secvențe de acid nucleic care codifică o enzimă capabilă să modifice utilizarea unui substrat intermediar într-o cale metabolică secundară, asociată cu un profil 37 nutrițional al unei plante, enzimă menționată având o activitate care nu apare în mod natural în calea metabolică secundară, amintită; 39

- transformarea unei celule vegetale a plantei menționate cu o casetă de expresie care cuprinde secvența de acid nucleic amintită legată operațional la un promotor selectiv 41 pentru sămânță; și

- recuperarea unei plante modificate genetic din celula vegetală menționată, planta 43 modificată genetic amintită fiind caracterizată printr-un profil nutrițional îmbunătățit comparativ cu varianta sălbatică a plantei amintite. 45

2. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, calea metabolică secundară este calea fenilpropanoidului. 47

3. Procedeu conform revendicării 2, caracterizat prin aceea că enzimă este o enzimă care metabolizează colina. 49

RO 122151 Β1

4. Procedeu conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că enzima care metabolizează colina este colin oxidaza.

5. Procedeu conform revendicării 4, caracterizat prin aceea că caseta de expresie conține suplimentaro secvență de acid nucleic care codifică o betainaldehid dehidrogenază care convertește betainaldehida la betaină.

6. Procedeu coform revendicării 2, caracterizat prin aceea că enzima acționează asupra acidului ferulic.

7. Procedeu coform revendicării 6, caracterizat prin aceea că enzima este decarboxilaza acidului ferulic.

8. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, calea metabolică secundară este calea metabolică secundară a alcoolilor glucidici.

9. Procedeu conform revendicării 8, caracterizat prin aceea că substratul intermediar al căii metabolice secundare este selectat din grupul constituit din mioinozitol, galactinol și derivați UDP ai zaharidelor.

10. Procedeu conform revendicării 8, caracterizat prin aceea că substratul intermediar al căii metabolice secundare este mioinozitol, și că enzima este o enzimă care acționează asupra mioinozitolului.

11. Procedeu conform revendicării 10, caracterizat prin aceea că enzima este m ioinozitol-O-meti l-tra nsferază.

12. Procedeu conform revendicării 11, caracterizat prin aceea că mioinozitol-Ometil-transferaza are secvența de aminoacizi a mioinozitol-O-metil-transferazei din Mesembryanthemum crystallinum.

13. Procedeu conform revendicării 8, caracterizat prin aceea că profilul nutrițional îmbunătățit cuprinde un conținut de acid fitic redus comparativ cu varianta sălbatică a plantei menționate.

14. Procedeu conform revendicării 2, caracterizat prin aceea că profilul nutrițional îmbunătățit cuprinde un conținut redus de sinapină comparativ cu varianta sălbatică a plantei menționate.

15. Procedeu conform revendicării 2, caracterizat prin aceea că profilul nutrițional îmbunătățit cuprinde un conținut modificat de lignină comparativ cu varianta sălbatică a plantei menționate.

16. Procedeu conform oricăreia dintre revendicările de la 1 la 15, caracterizat prin aceea că substratul intermediar al căii metabolice secundare nu este un metabolit primar al grupului ales dintre glucoză, aminoacizi, acizi grași uzuali și nucleotide.

17. Procedeu conform oricăreia dintre revendicările de la 1 la 15, caracterizat prin aceea că promotorul selectiv pentru sămânță este un promotor de faseolină sau un promotor de napină.

18. Procedeu conform oricăreia dintre revendicările de la 1 la 15, caracterizat prin aceea că cuprinde etapa suplimentară de creștere a plantei modificate genetic în condiții care permit formarea seminței și recuperarea seminței respective.

19. Procedeu conform oricăreia dintre revendicările de la 1 la 15, caracterizat prin aceea că planta este selectată dintre Dicotyledoneae și Monocotyledoneae.

20. Procedeu conform oricăreia dintre revendicările de la 1 la 15, caracterizat prin aceea că planta este un membru al familiei Brassicaceae, de preferință un membru al genului Brassica, de preferință Brassica rapa sau Brassica napus.

21. Procedeu conform oricăreia dintre revendicările de la 1 la 15, caracterizat prin aceea că planta este selectată din grupul constând din porumb, canola, grâu, orz, lucerna, boabe de soia și sorg.

RO 122151 Β1

22. Plantă modificată genetic, caracterizată prin aceea că cuprinde o moleculă de 1 acid nucleic recombinant, încorporată stabil în genomul plantei menționate, molecula de acid nucleic recombinant amintită cuprinzând: 3

a) un promotor selectiv pentru sămânță,

b) o secvență de acid nucleic legată operațional la promotorul selectiv pentru 5 sămânță amintit, secvența de acid nucleic menționată codificând o enzimă capabilă să modifice utilizarea unui substrat intermediar într-o cale metabolică secundară, asociată cu un 7 profil nutrițional al unei plante, enzimă menționată având o activitate care nu apare în mod natural în calea metabolică secundară amintită, planta modificată genetic amintită fiind carac- 9 terizată printr-un profil nutrițional îmbunătățit comparativ cu varianta sălbatică a plantei menționate, sau o celulă, sămânță sau o componentă a plantei modificate genetic menționate, 11 sau un descendent al acesteia.

23. Plantă modificată genetic sau descendent al acesteia, conform revendicării 22, 13 caracterizată prin aceea că, calea metabolică secundară este calea fenilpropanoidului.

24. Plantă modificată genetic sau descendent al acesteia, conform revendicării 23, 15 caracterizată prin aceea că enzimă este o enzimă care metabolizează colina.

25. Plantă modificată genetic sau descendent al acesteia, conform revendicării 24, 17 caracterizată prin aceea că enzimă care metabolizează colina este colin oxidaza.

26. Plantă modificată genetic sau descendent al acesteia, conform revendicării 25, 19 caracterizată prin aceea că cuprinde suplimentar o secvență de acid nucleic care codifică o betainaldehid dehidrogenază care convertește betainaldehida la betaină. 21

27. Plantă modificată genetic sau descendent al acesteia, conform revendicării 23, caracterizată prin aceea că enzimă acționează asupra acidului ferulic. 23

28. Plantă modificată genetic sau descendent al acesteia, conform revendicării 27, caracterizată prin aceea că enzimă este decarboxilaza acidului ferulic. 25

29. Plantă modificată genetic sau descendent al acesteia, conform revendicării 22, caracterizată prin aceea că calea metabolică secundară este calea metabolică secundară 27 a alcoolilor glucidici.

30. Plantă modificată genetic sau descendent al acesteia, conform revendicării 22, 29 caracterizată prin aceea că substratul intermediar al căii metabolice secundare este selectat din grupul constituit din mioinozitol, galactinol și derivați UDP ai zaharidelor. 31

31. Plantă modificată genetic sau descendent al acesteia, conform revendicării 22, caracterizată prin aceea că substratul intermediar al căii metabolice secundare este 33 mioinozitol, și că enzimă este o enzimă care acționează asupra mioinozitolului.

32. Plantă modificată genetic sau descendent al acesteia, conform revendicării 23, 35 caracterizată prin aceea că enzimă este mioinozitol-O-metil-transferază.

33. Plantă modificată genetic sau descendent al acesteia, conform revendicării 32, 37 caracterizată prin aceea că mioinozitol-O-metil-transferaza are secvența de aminoacizi a mioinozitol-O-metil-transferazei din Mesembryanthemum crystallinum. 39

34. Plantă modificată genetic sau descendent al acesteia conform oricăreia dintre revendicările 22-33, caracterizată prin aceea că substratul intermediar al căii metabolice 41 secundare nu este un metabolit primar al grupului ales dintre glucoză, aminoacizi, acizi grași uzuali și nucleotide. 43

35. Plantă modificată genetic sau descendent al acesteia, conform oricăreia dintre revendicările 22-33, caracterizată prin aceea că promotorul selectiv pentru sămânță este 45 un promotor de faseolină sau un promotor de napină.

36. Plantă modificată genetic sau descendent al acesteia, conform revendicării 22, 47 caracterizată prin aceea că profilul nutrițional îmbunătățit cuprinde un conținut de acid fitic redus comparativ cu varianta sălbatică a plantei menționate. 49

RO 122151 Β1

37. Plantă modificată genetic sau descendent al acesteia, conform revendicării 22, caracterizată prin aceea că profilul nutrițional îmbunătățit cuprinde un conținut redus de sinapină comparativ cu varianta sălbatică a plantei menționate.

38. Plantă modificată genetic sau descendent al acesteia, conform revendicării 22, caracterizată prin aceea că profilul nutrițional îmbunătățit cuprinde un conținut modificat de lignină comparativ cu varianta sălbatică a plantei menționate.

39. Plantă modificată genetic sau descendent al acesteia, conform oricăreia dintre revendicările 22-38, caracterizată prin aceea că planta este selectată dintre Dicotyledoneae și Monocotyledoneae.

40. Plantă modificată genetic sau descendent al acesteia conform oricăreia dintre revendicările 22-38, caracterizată prin aceea că planta este un membru al familiei Brassicaceae, de preferință un membru al genului Brassica, de preferință Brassica rapa sau Brassica napus.

41. Plantă modificată genetic sau descendent al acesteia, conform oricăreia dintre revendicările 22-38, caracterizată prin aceea că planta este selectată din grupul constând din porumb, canola, grâu, orz, lucernă, boabe de soia, sorg.

42. Utilizarea plantei modificate genetic sau a unui descendent al acesteia definiți în revendicările 22-41 sau a unei celule, semințe sau component ale acesteia la prepararea hranei pentru animale.