KR20010040379A - 식물의 이차 대사 화합물 함량의 변화 방법 및 그를 위한조성물 - Google Patents

식물의 이차 대사 화합물 함량의 변화 방법 및 그를 위한조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이차 대사 경로의 산물 중 하나 이상의 함량이 변화된, 유전자적으로 형질전환된 식물을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 형질전환 가능하고 전체 식물로 재생 가능한 식물세포에 DNA 발현 카세트를 도입하는 단계를 포함한다. 상기 발현 카세트는 식물 세포에서 형질전환 및 선별에 필요한 DNA 서열을 포함한다. 또한 상기 발현 카세트는 식물세포에서 활성을 나타내는 프로모터의 조절하에 이차 대사 경로의 기질의 이용도를 변화시킬 수 있는 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 상기 기질은 포도당, 아미노산, 통상의 지방산 및 뉴클레오티드로부터 선택된 일차 대사 산물이 아니다. 종자를 포함하는 식물 또는 식물 조직은 이후에 이차 대사 경로의 산물 중 하나 이상의 함량이 변화된 상태로 회수될 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 수득된 식물 및 종자로부터 유래한 사료 제품을 제공한다.

Description

식물의 이차 대사 화합물 함량의 변화 방법 및 그를 위한 조성물 {Methods and Compositions for Modifying Levels of Secondary Metabolic Compounds in Plants}
본 출원은 부분적으로 미국 특허 제09/012,453호에 연계되어 있고, 가출원 60/072,156호를 우선권으로 주장한다.
식물은 이차 대사에 의해 다양한 화합물을 생성한다. 식물의 물질대사에 필수적인 것으로 생각되지는 않지만, 이차 대사 경로는 종종 독특한 생화학적 물질을 생성하는데, 이 중 어떤 것은 영양에 유해하거나, 또는 독성이 있는 것도 있다. 상기 경로에 의해 생성된 이차 대사 경로 및 화합물은 각각의 종 또는 속에 특이적이다. 따라서, 이차 대사 경로의 조작은 신규 생화학 물질을 생성하거나, 또는 이차 대사 산물의 함량이 변화된 식물 조직을 생성할 수 있다. 특히, 영양에 유해하거나 독성이 있는 이차 대사 화합물의 변화를 목적으로한 이차 대사의 조작은 사실상 식품 및 사료 분야에서 독특하게 적용할 수 있다.
식물 세포의 생장 및 생존에 필수적이라고 생각되는 생화학적 과정을 방해하지 않고 이차 대사를 조작하는 것이 바람직하다. 식물 세포의 생장 및 생존에 필수적인 전체 생화학적 과정 및 화합물을 일차 대사 경로 및 그 생성물로 생각한다. 통상, 일차 대사는 일차 당(예: 포도당), 아미노산, 통상의 지방산, 뉴클레오티드 및 이들로부터 유래한 중합체(전분, 단백질, 지질, RNA 및 DNA 등과 같은 다당류)의 생성을 유도하는 생화학적 과정을 포함한다(Yeoman and Yeoman, Tansley Review No. 90, Manipulating Secondary Metabolism in Cultured Plant Cells, New Phytologist, 134:553-569, 1996).
따라서, 모든 식물 세포의 생존 및 생장에 필수적인 물질대사 과정을 일차 대사라고 정의하는 반면, 모든 식물 세포에 필수적이지는 않은 생화학적 과정을 이차 대사라로 정의할 수 있다. 예를 들면, 이차 대사 경로는 식물의 색깔, 맛, 형태 등과 같은 특징을 결정한다. 또한, 이차 대사는 곤충에 의해 인지되거나 병원체 반응에 관련된 다양한 화합물을 생성한다. 상기 화합물 중 어떤 것은 야생 조건하에서 특정 식물 종에 유익할 수 있지만, 배양 조건하에서는 수확된 식물의 질에 해롭거나 작물을 특정 용도로 사용하는 것을 제한할 수 있다. 어떤 이차 대사 산물은 종 내에서 특정 생화학적 경로의 결과로 진화해 온 독특한 화합물이다. 이차 대사는 생화학적 기작에서 통상의 일차 대사에서 나타나는 중복성(redundancy)의 특성이 없기 때문에, 식물에서 이차 대사 산물은 여러 경로에서 생성되지 않는다. 통상, 이차 대사 산물은 일차 대사와 같이 어디에서나 나타나는 생화학적 물질보다 더 식물-특이적이다.
일차 대사 경로를 조작하려는 다양한 시도 결과, 전분 또는 오일(지질) 함량이 변화된 식물 세포를 창출하였다. 그러나, 일차 대사 기작의 총체적인 조작은 유해한 효과를 초래할 것으로 예상된다. 예를 들면, 지질의 조성은 변화시킬 수 있지만, 지질의 제거는 명백하게 세포 생존에 유해할 것이다. 중복적 생화학적 기작으로 인해 이를 조작하려는 시도를 극복할 수 있기 때문에, 일차 대사의 조작은 항상 성공적이지는 않다. 따라서, 식물에서 일차 대사 경로는 예상가능하게 배양 조건하에서 유용하고 실체적인 결과를 제공하도록 조작하기 어렵다.
예를 들면, 특정한 물질의 감소 또는 제거보다 그 조성을 변화시킨 신규 형질을 생성하는데 있어서 일차 대사를 성공적으로 변화시켰다. 통상 상기 조작은 식물 유전자의 외부(ectopic) 발현에 의해 성취되어 왔는데, 그 예로는 특정 조직에서의 과다-발현, 조절 방식보다는 구성적 방식의 과다-발현, 또는 안티센스 RNA, 리보자임(ribozyme) 또는 상호-억제(co-suppression)에 의한 특이적 유전자 활성의 억제가 있다. 그러나, 사전에 그러한 조작의 결과를 예측하는 것은 어렵다.
식물 효소의 발현은 다양한 수준에서 변형시킬 수 있다. 이는 유전자 발현 수준, 번역, 단백질 프로세싱(processing) 및 단백질 기능의 알로스테릭 (allosteric)한 제어를 포함한다. 따라서, 일차 대사에 관련된 식물 유전자의 외부 발현은 일차 대사의 조절에서의 복잡한 생화학적 제어 기작을 극복하지 못할 수 있다. 추가로, 일차 대사 경로는 식물 생장 및 생존에 필수적이기 때문에, 일차 대사의 중복성은 상기 조작에서 극복해야 할 어려운 장애물이다. 따라서, 일차 대사를 변화시키려는 시도는 종종 의도한 형질을 제공하는데 실패하여 왔다. 게다가, 야생 수준에서 또는 다양한 환경적 곤경하에서 상기 변형된 식물을 평가한 결과, 예상된 효과가 관찰되지 않거나 식물의 형질이 다른 기작에 의해 대체되어 나타남을 알았다. 따라서, 일차 대사의 변형은 특정한 형질을 얻기 위해 상기 일차 대사를 세심하게 고려하거나 분별있는 조치를 필요로 한다.
이차 대사 경로의 조작은 이와 관련된 생화학적 이해의 부족, 이차 대사 경로에서 발현되는 유전자에 대한 정보 부족 및 생화학적 경로 사이의 복잡한 상관관계로 인하여 이해하기 어려웠다.
그러나, 이차 대사를 변화시키는 방법은 이차 대사 화합물의 함량 변화(예를 들면, 영양에 유해한 것으로 생각되는 화합물)를 포함한 신규 형질을 제공하는 가치있는 수단을 제공할 수 있다. 따라서, 이차 대사 경로는 식물의 유전자적 조작에 대한 중요한 표적이다.
식물에서 이차 대사 경로로 생각되는 두 가지 생화학적 경로가 최종 생성물의 함량을 변화시킬 목적으로 연구되어 왔다. 상기 경로를 조작하기 위해 사용된 방법은 원하는 결과를 산출하지 못했다. 예를 들면, 페닐프로파노이드 경로는 리그닌 생성에 관련된 이차 대사 경로이다. 리그닌의 생합성 경로는 중합되어 리그닌 및 다른 페놀계 화합물을 생성하는 세 가지 이상의 일차 페놀 전구체인 쿠마르산, 페룰산 및 시나프산을 생성하는 일반적인 페닐프로파노이드 생합성 경로의 일부이다(도 2 참조).
이차 대사 경로인 페닐프로파노이드 경로를 변화시키기 위한 시도에서, 리그닌 단량체의 생성에 관련된 많은 효소의 유전자가 안티센스 또는 상호-억제 기술을 통한 리그닌 감소의 표적으로 현재 알려져 있다(예를 들면, US 5,451,514호, US 5,633,439호, WO 93/05160호 및 WO 94/08036호). 상기 표적 유전자는 신나밀 알코올 탈수소효소, 카페산 O-메틸-전이효소 및 페닐알라닌 암모니아 용해효소의 유전자를 포함한다. 상기 기술은 리그닌 함량의 감소에 관한 것이고, 이는 식물의 프로세싱 또는 분해성에 유익한 효과가 있다고 추측된다.
그러나, 페닐프로파노이드 경로 중의 한 유전자를 표적으로하는 안티센스 또는 상호-억제 기술에 의한 리그닌의 감소는 많은 부작용이 나타날 수 있다. 상기 부작용은 질병에 대한 감수성 증가, 생장 속도의 변화 또는 식물 섬유의 물리적 강도 감소에 따른 농경상의 특성 감소를 포함한다. 페닐알라닌 암모니아 용해효소의 억제는 다양한 유해 형질을 초래한다(Elkind et al., Abnormal Plant Development and Down-Regulation of Heterologous Phenylalanine Ammonia Lyase Gene, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9057-9061, 1990). 페닐알라닌 암모니아 용해효소는 일차 대사 산물인 페닐알라닌이라는 아미노산에 작용한다. 상기 실험의 결과로, 특정 이차 대사 경로에 관련된 일차 대사 산물 중 하나의 변화를 통한 이차 대사의 변화가 예기치 않은 유해한 형질을 생성할 수 있다는 사실을 알았다. 따라서, 이차 대사 경로에서 생화학적 단계의 선택은, 표현형상으로는 정상이지만 특정 이차 대사 산물이 감소된 식물을 생성하는데 결정적인 요소이다. 게다가, 안티센스 RNA 또는 상호-억제 전략은 이차 대사 감소의 상업적으로 허용되는 양 또는 특이성을 제공하지 못할 수 있다. 또한, 키(key) 효소를 코딩하는 유전자의 활성은 관련된 유전자의 발현에 영향을 받을 수 있다. 따라서, 영양에 유해한 것으로 생각되는 페놀계 화합물의 감소, 또는 안티센스 RNA 또는 상호-억제에 의한 부작용 없는 리그닌 함량의 감소에 대한 진전은 거의 없었다.
원하는 결과를 산출하지 못했던 물질대사 경로를 변화시키려는 두 번째 노력의 예는 카놀라(canola)에서 글루코시놀레이트 생합성의 변형이다. 클루코시놀레이트 경로를 조작하여 카놀라 사료의 글루코시놀레이트 함량을 변화시키려는 시도가 보고되었다. 글루코시놀레이트의 생합성을 변화시키려는 것으로 보고된 한 가지 방법은, 글루코시놀레이트의 생성에 사용된 황과 경쟁하거나, 또는 글루코시놀레이트의 생성에서 트립토판을 트립타민으로 전환시키는데 사용되는 트립토판의 함량을 감소시키는 새로운 경로를 창조하는 것이었다("Engineering Altered Glucosinolate Biosynthesis by Two Alternative Strategies", Ibrahim, Chavadej ＆ De Luca 공저, Genetic engineering of plant secondary metabolism, 1994, Plenum Publishing Corporation 출판, 미국 뉴욕).
그러나, 상기 방법은 종자 사료의 글루코시놀레이트 함량을 감소시키는데 성공하지 못하였다. 상기 방법은 카놀라 사료에서 영양에 유해한 글루코시놀레이트의 함량 감소에 실패하였다. 글루코시놀레이트는 식물의 잎에서 생성된 후 종자로 이동한다. 따라서, 상기 방법은 글루코시놀레이트의 생산에 사용되는 일차 대사 산물(황, 트립토판이라는 아미노산) 중 하나의 이용도를 단순히 변화시켜 글루코시놀레이트의 생성을 감소시킬 것이라는 믿음에 기초하였다. 그러나, 종자의 일차 글루코시놀레이트는 아미노산(트립토판)을 잔기 생성에 사용하지 않는 지방족 글루코시놀레이트이다. 게다가, 상기 실험의 결과(예를 들면, Chavadej et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 91:2166-2170)에서 일차 아미노산인 트립토판을 변화시킬수 있는 효소를 지닌 유전자 이식 식물의 종자에서 글루코시놀레이트가 감소되지 않았고, 종자의 지방족 글루코시놀레이트 함량은 유전자가 이식되지 않은 식물과 같거나 심지어 더 많았다. 따라서, 중요하지 않은 성분(인돌 글루코시놀레이트)은 감소된 것 같았지만, 종자에서 전체 글루코시놀레이트 생성은 변화되지 않았다. 유전자적 연구에서, 글루코시놀레이트 함량이 낮은 식물을 종래의 교배로부터 수득할 수 있고, 상기 글루코시놀레이트의 함량을 낮게 조절하는 무수한 유전자 위치가 십자화과 식물(crucifer)에 존재한다는 사실은 명백하다. 글루코시놀레이트 생합성 중에 일어나는 많은 생화학적 형질전환이 존재하고 있고, 전체 글루코시놀레이트의 함량을 감소시키는 방법이 필요하다면 모든 또는 대부분의 글루코시놀레이트 합성 단계를 표적화해야 한다. 따라서, 일반적으로 유용한 방법을 고안하려면, 십자화과 식물에서 글루코시놀레이트 생성을 변화시키는 일반적인 방법에서는 글루코시놀레이트 생합성에서 상이한 효소 및 기질을 고려해야 한다.
그러나, 상기 변화를 얻기 위해 사용된 효소는 또한 일차 대사 산물(아미노산인 트립토판 및 광물질인 황)에도 작용하기 때문에, 식물 세포에서 상기 화합물의 어떠한 변화라도 유해한 효과를 나타낼 것이다. 따라서, 상기 제안된 방법은 이차 대사 경로를 특이적 표적으로 하는데 실패하였다. 실제로, 트립토판의 변화는 많은 유해 효과를 초래할 것으로 기대할 수 있다. 따라서, 일차 대사 산물의 변화는 글루코시놀레이트의 함량이 낮은 카놀라 사료라는 의도한 효과를 산출하지 못하였고, 일차 대사 변화의 어려움을 알 수 있었다.
따라서, 이차 대사를 변화시키는 일반적인 방법은 식물 조직의 생화학적 조성을 변화시키는데 가치가 있을 것이다. 예를 들면, 이는 영양에 유해한 화합물의 감소, 이차 대사의 프로필 변화, 프로세싱 특성이 변화된 식물 조직의 제공, 산업상 유용하거나 제약상 유용한 화합물의 함량 변화, 변화된 맛, 구조 또는 외양, 이차 대사 산물의 영향을 받는 곤충 유혹, 질병 내성 또는 다른 생물학적 과정과 관련된 상기 이차 대사 산물이 변화된 식물의 생성, 또는 이차 대사 산물의 변화에 의한 긍정적인 생장 특성을 갖는 식물을 포함한다.
〈발명의 요약〉
본 발명은 이차 대사 산물의 생성을 표적으로하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 이차 대사 경로에 필수적이고 최종 이차 대사 산물의 생성(특히, 최종 생성물 생성으로부터 하나 내지 다섯 가지 생화학적 단계의 화합물의 생성)에 필수적인 기질 이용도의 변화를 포함한다. 최종 산물 생성 근처의 단계에서 기질을 표적으로하는 것은 일차 대사 경로에도 관련된 물질의 변화와 관련된 문제를 피하게 되는데, 이는 상기 단계가 일차 대사 경로로 기질이 도입되는 시점를 지나서 나타나기 때문이다. 따라서, 상기 방법은 일차 대사 경로에 포함되지 않고 이차 대사 경로에만 사용되는 전구체와 관련하여 이차 대사 산물의 감소 또는 변화를 특이적 표적으로하는 신규 수단을 제공한다.
또한 상기 방법은, 특정한 조직(예를 들면, 종자 조직)만 변화되는 것과 같은 조직 특이적인 방식에서 기질의 이용도를 변화시키는 것을 포함한다.
따라서, 상기 방법은 일차 대사 화합물을 포함하지 않고 이차 대사 경로에 사용되는 전구체와 관련하여 이차 대사 산물의 감소 또는 변화를 특이적 표적으로하는 신규 수단을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
A) 식물세포에서 형질전환 및 선별에 필요한 DNA 서열 이외에, 포도당, 아미노산, 통상의 지방산 및 핵산으로부터 선택된 일차 대사 기질이 아니라는 조건하에 이차 대사 경로에서 상기 기질의 이용도를 변화시킬 수 있는 단백질을 식물에서 활성이 있는 프로모터의 조절하에 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 발현 카세트를, 형질전환이 가능하고 전체 식물로 재생될 수 있는 식물 세포에 도입하는 단계, 및
B) 이차 대사 경로의 산물 중 하나 이상의 함량이 변화된 식물을 회수하는 단계
를 포함하는, 유전자적으로 형질전환된 식물의 제조 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 종자가 생성되는 조건하에서 상기 A 및 B 단계의 방법에 따라 수득된 식물을 배양하는 것을 포함하는, 유전자적으로 형질전환된 종자의 제조 방법을 제공한다.
재조합 DNA는 이후의 세대에 전달되도록 번식력이 있는 식물 게놈의 염색체에 도입시켰다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 식물 형질전환용 벡터, 상기 기재된 방법에 따라 형질전환된 식물 및 종자, 및 그로부터 유래한 종자 또는 사료를 포함하는 식량 생성물을 제공한다.
본 발명은 식물의 이차 대사 경로에 의해 생성되는 화합물을 변화시키는 방법 및 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 이차 대사 산물의 함량이 변화된 식물 세포 및 이차 대사 산물의 함량이 변화된 식물의 종자를 제공한다. 한 가지 실시양태에서, 영양에 유해한 이차 대사 산물이 본 발명에 따라 식물, 식물 세포 및 식물 종자에서 변화되었다. 다른 실시양태에서, 페닐프로파노이드 및 당 알코올 이차 대사 경로에 나타나는 생성물이 본 발명에 따라 식물, 식물 세포 및 식물 종자에서 변화되었다. 추가로, 본 발명은 식물 세포 및 종자에서 이차 대사 산물의 함량을 변화시키는데 유용한 유전자 구조물 및 벡터를 제공한다. 추가로, 본 발명은 종자 사료 및 상기 종자 사료를 함유하는 동물 사료, 특히, 이차 대사 산물의 함량이 감소 또는 변화된 종자 사료에 관한 것이다.
도 1은 임의의 이차 대사 경로 변화 방법의 일반적인 개요를 나타내는 도면이다.
도 2는 일반적인 페닐프로파노이드 대사 및 시나핀 생성을 도시하는 것이다.
도 3은 발생중인 종자에서 시나핀 합성의 징후 및 경과를 브라시카 나푸스 씨브이 웨스타(Brassica napus cv Westar) 종자의 박층 크로마토그래피로 나타낸 것이다.
도 4는 HPLC를 이용하여 발생중인 종자에서 시나핀의 축적을 정량분석한 것이다.
도 5는 발생중인 종자의 절개된 장각과를 통해 방사성 콜린을 공급하여 시나핀을 합성하는 능력을 측정한 것으로, 수분후 7 내지 43일 동안 반사능이 시나핀으로 혼입됨을 도시한 것이다.
도 6은 단리된 종자에 방사성 콜린-함유 용액을 스며들게 하여 발생중인 종자의 시나핀 합성 능력을 측정한 것으로, 수분후 43 내지 64일 동안 반사능이 시나핀으로 혼입됨을 도시한 것이다.
도 7은 새로 합성된 시나핀이 발생중인 종자의 떡잎, 배축 및 종피 분획에 축적되는 것을 종자 전체에 표지된 시나핀에 대한 비율로 나타낸 것이다.
도 8은 단위 질량의 조직 시료 당 발생중인 종자의 떡잎 및 배축 성분의 시나핀 함량을 나타낸 것이다.
도 9는 종자를 기준으로(즉, 축 또는 떡잎 쌍을 기준으로) 발생중인 종자의 떡잎 및 배축 성분의 시나핀 함량을 측정한 것이다.
도 10A 및 10B는 콜린 산화효소 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열(서열 3)이다.
도 11은 콜린 산화효소 오픈 리딩 프레임의 추론된 아미노산 서열(서열 4)이다.
도 12는 조직 선택적 프로모터의 조절을 받는 COX 유전자을 포함하는, 식물 형질전환용 벡터 pHS 731의 모식도이다.
도 13은 브라시카 에스피(Brassica sp.)에서 COX 유전자의 발현에 의해 종자의 시나핀 함량이 감소함을 나타낸다.
도 14는 조직 선택적 프로모터의 조절하에 BADH 유전자을 포함하는, 식물 형질전환용 벡터 pHS 981의 모식도이다.
도 15는 브라시카 에스피(Brassica sp.)에서 COX 및 BADH 유전자의 발현에 의해 종자의 시나핀 함량이 감소함을 나타내는 표이다.
도 16은 브라시카 에스피(Brassica sp.)에서 COX 및 BADH 유전자의 발현에 의해 종자의 페놀계 화합물 함량이 감소함을 나타내는 표이다.
도 17은 식물 세포에서 발현되도록 최적화된, 합성된 비 푸물리스(B. pumulis)의 페룰산 탈카르복실화효소 유전자의 핵산 서열(서열 1)이다.
도 18은 합성된 비 푸물리스(B. pumulis)의 페룰산 탈카르복실화효소 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩되는 추정 아미노산 서열(서열 2)이다.
도 19는 구성적 35S 프로모터의 조절하에 페룰산 탈카르복실화효소 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 벡터의 제한효소 지도이다.
도 20은 종자 선택적 나핀 프로모터의 조절하에 페룰산 탈카르복실화효소 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 벡터의 제한효소 지도이다.
도 21은 종자의 발생중에 피트산이 축적됨을 나타내는 그래프이다.
도 22는 발생중인 종자에서 피트산 퇴적의 조직 특이성을 나타내는 그래프이다.
도 23은 피트산, 지질, TFA-가용성 세포벽 및 세포 잔해 분획에 발견되는, 물질대사에 의해 표지된 미오-이노시톨(myo-inositol)의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 24는 미오-이노시톨 O-메틸 전이효소 유전자의 증폭된 DNA 단편의 서열(서열 5)이다.
도 25는 pRD400 5에 35S 프로모터-IMT-GUS-Nos 종결자 카세트를 포함하는 pSIMT 벡터의 제한효소 지도이다.
도 26은 pRD400에 종자-선택적 프로모터-IMT-GUS-Nos 종결자를 포함하는 pNIMT 벡터의 제한효소 지도이다.
도 27은 IMT 유전자를 포함하는 유전자 이식 식물의 PCR 분석 결과이다.
도 28은 IMT 유전자를 발현하는 식물의 노던 블랏(nothern blot) 분석 결과이다.
도 29는 유전자 이식 식물에서 관찰되는 피트산의 감소를 도시하는 막대 그래프이다.
도 30은 pSIMT 벡터를 포함하고, 야생에서 자란 F1, F2 및 F3 종자에서 피트산의 감소를 도시하는 표이다.
도 31은 pNIMT 벡터를 포함하고, 야생에서 자란 F1 및 F2 종자에서 피트산의 감소를 도시하는 표이다.
본 발명은 일차 대사 산물과 구별되는 이차 대사 산물의 특이적인 감소 또는 변화에 관한 것이다. 상기와 같은 방법에서, 유사한 결과를 얻기 위해 일차 대사 경로를 변화시키는 잠재적 유해 효과는 피해야 한다. 따라서, 본 발명은 일차 대사 산물로 생각되는 화합물의 조작을 피하고 있다.
바람직한 실시양태에서, 식물 세포에 이종(heterologous)이고, 기질에 작용할 수 있으며, 기질을 제거하거나 기질의 풀(pool)에서 그 이용도를 변화시킬 수 있는 효소를 사용하여 상기 기질의 이용도를 변화시켰다. 일차 및 이차 대사의 방법 및 상호관계에 대한 일반화된 관점은 도 1에 도시되어 있다. 이차 대사에서 생성물의 흐름을 바꾸기 위해 이종 효소의 활성을 이용하는 것은 이차 대사 산물의 원하는 표적의 변화를 초래한다. 이는 이차 대사 경로에서 생성물 흐름을 바꿔 원하는 표적의 이차 대사 산물을 변화시킨다. 그렇게 하면, 이차 대사 경로 내의 특정 효소 단계의 최종-산물의 양은 줄어드는 반면, 반대로 상기 경로의 다른 단계에서는 높은 농도로 산물이 축적되어 상기 산물을 생성하는 효소를 억제하게 된다. 상기 피드백(feedback) 억제는 전체 이차 대사 경로로부터 생성되는 최종-산물에 영향을 끼치게 된다. 따라서, 특정 이차 대사 경로 및 이와 관련된 경로의 산물 함량 변화는 신규 효소 활성의 도입에 의해 성취되며, 상기 효소 활성은 상기 경로를 통해 생화학적 조성물(예를 들면, 기질 및 그의 생성물)의 흐름을 변화시킨다. 이종 효소는 대사 경로의 전구체가 식물 세포에 유해한 효과를 주지 않는 물질로 축적되는 물질대사적 전환을 초래하며 식물 조직에서 발현되어 왔다.
몇몇 실시양태에서, 가치있는 산물 또는 식물 세포에 유익한 효과가 있는 산물은 상기 방법의 결과로 생성되었다.
한 실시양태에서, 신규 효소 활성을 가하여 표적 전구체를 변화시켰다. 본 발명의 한 바람직한 면은 식물 세포에서 발현되면서 이종의 활성이 있는 효소의 선택을 숙고하게 한다. 예를 들면, 상기 효소는 식물 세포에서 이차 대사 경로와 정상적으로 관련되지 않은 것이다. 사용된 효소는 식물, 동물 또는 미생물에서 유래할 수 있고, 식물 세포에서 적합한 발현을 위해 변형될 수 있다. 발현되는 세포에 이종인 효소 활성을 이용하여, 정상적인 생화학적 조절 기작을 우회하고 이차 대사를 예측가능한 방식으로 변화시킬 수 있다. 본 발명의 범위 내에서 특히 흥미로운 것은 당 알코올 및 페닐프로파노이드 이차 대사 경로와 관련된 이차 대사 경로 산물의 변형이다.
본 발명의 방법을 이용하는 추가의 예는 갈락토오스와 같은 변형된 당 화합물 및 스타키오스나 라피노오스와 같은 영양에 유해한 수크로실 글리코시드의 함량 변화이다. 갈락토오스는 상기 영양에 유해한 수크로실 글리코시드의 생성에 대한 전구체 중 하나인 갈락티놀로 전환된다. 갈락토오스의 전구체 형태는 소위 UDP-갈락토오스라는 접합된 형태이다. 본 발명의 방법에서 고려되는 바와 같이, UDP-갈락토오스의 생성 및 축적(및 이후의 갈락티놀로 전환)은 UDP-갈락토오스의 함량을 변화시킬 수 있는, 식물 세포에 이종인 효소 활성의 이용으로 억제된다. UDP-갈락토오스 4-에피머라아제(galE)는 생물체에서 갈락토오스 대사의 주요 단계 중 하나와 관련되어 있다. 상기 효소는 UDP-갈락토오스를 UDP-포도당으로 전환하는 것을 촉매한다. 상기 효소의 유전자는 인간, 효모 및 박테리아에서 입수 가능하다. 본 발명에서는 박테이라에서 코딩되는 효소를 사용하였다.
식물 세포에서 상기 이종 효소의 발현 결과로, UDP-갈락토오스는 감소하고 이로운 화합물인 UDP-포도당이 생성될 것이다. UDP-갈락토오스 4-에피머라아제 효소의 발현은 영양에 유해한 수크로오스 글리코시드의 전구체 중 하나인 갈락티놀의 생합성을 감소시킬 것이라고 믿어진다. 원하지 않는 수크로오스 글리코시드의 축적 비율을 감소시키는 것 이외에, 새로 도입된 효소의 활성은 UDP-포도당의 이용도를 증가시켜 이후의 수크로오스 생성을 증가시킨다. 후자는 식물의 생산성(예를 들면, 단백질, 지질, 총체적인 수확 등)을 증가시키기 위한 탄소원 또는 직접 축적된 수크로오스로서 수크로오스가 필요한 다른 대사 경로에 참여하고 그 활성을 증가시킬 것이다.
상기 방법의 또 다른 적용을 본 발명에서 고려할 수 있다. 포스포글루코뮤타아제(phosphoglucomutase, pgm)를 이용하여 포도당-1-인산 및 포도당-6-인산과 같은 다양한 당 유도체의 함량을 변화시키는 것도 가능하다. 상기 효소는 수크로오스의 합성 및 축적시 포도당-1-인산 및 포도당-6-인산(G-1-P 및 G-6-P)의 상호전환을 촉매한다. 상기 효소는 수크로오스, 전분 및 글리코겐의 합성 및 사용에서 중추적인 역할을 하고, 모든 유기체에 존재한다. 상기 효소에 대한 유전자는 박테리아(예를 들면, 아그로박테리움(Argrbacterium)) 뿐만 아니라 진핵생물에서도 입수 가능하다.
G-6-P는 다양한 당 상호전환의 주요 출발 물질이고, 상기 상호전환 중 하나가 미오-이노시톨-1-P의 합성이다. 후자는 피트산 합성 및 영양에 유해한 수크로실 글리코시드에서 각각 주요 기질 및 보조인자로 작용한다. 상기 효소의 발현으로 낮아진 G-6-P의 함량에 의해 상기 언급한 영양에 유해한 인자의 번역량 감소를 예상할 수 있다. 따라서, 다양한 대사적 변화는 본 발명의 범위 내에서 고려될 수 있다.
상기 방법은 어떤 특별한 이차 대사 경로에 제한되지 않는다. 또한, 상기 방법은 어떤 특별한 식물 종에 제한되지도 않는다. 오히려, 상기 방법은 외떡잎 및 쌍떡잎 식물을 포함하는, 상업적으로 가치있는 많은 농작물 종에 흔히 나타나는 이차 대사 경로 또는 이차 대사 산물이 특정 농작물에 특별히 중요한 이차 대사 경로를 변화시키기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 대한 생화학적 기초는 기질의 이용도에 의한 효소의 조절이라는 개념에서 알 수 있다. 통상, 효소의 반응 속도는 기질의 이용도에 의해 영향을 받는다. 다시 말하면, 효소는 이용 가능한 기질의 양에 비례하는 속도로 생성물을 생산할 것이다. 기질의 감소는 생성물의 감소를 초래한다. 게다가, 많은 효소는 최종 산물을 억제하는 특성이 있는데, 그 의미는 최종 산물이 과량으로 존재하면 효소의 반응 속도가 감소한다는 것이다. 따라서, 이용 가능한 기질 또는 효소 생성물의 양을 변화시켜, 생화학적 경로에 의해 생성되는 화합물의 전체 생산량을 변화시킬 수 있다.
본 발명에 의해 변화시킬 수 있는 이차 대사 경로의 예는 이소프레노이드 생합성, 알칼로이드 생합성, 테르페노이드 생합성, 페놀 생합성, 당 알코올 생합성, 또는 영양에 유해한 또는 상업적으로 가치있는 화합물을 생성하는 임의의 다른 이차 대사 경로를 포함한다. 본 발명에 의해 조절될 수 있는 특정 이차 대사 산물은 영양에 유해한 페놀계 화합물(시나핀 또는 십자화과 식물의 글로코시놀레이트), 당 알코올 생성물(피트산 또는 스타키오스와 라피노오스), 목화의 고시폴, 니코틴, 클로로겐산, 응축 탄닌 또는 임의의 다른 영양에 유해한 이차 대사 산물을 포함한다. 클로로겐산 화합물은 콩, 목화 및 해바라기에 흔히 나타나고, 카페산으로부터 유도되었으며, 페닐프로파노이드 경로에서 생성되는 화합물이다. 또 다른 영양에 유해한 화합물은 사포닌, 및 알팔파를 포함하는 많은 식물에서 발견되는 영양에 유해한 화합물을 포함한다. 사포닌은 고분자량의 글리코시드로, 트리테르펜 또는 스테로이드 애글리콘에 결합된 당 잔기로 구성되어 있다. 사포닌은 세 가지(트리테르펜 글리코시드, 스테로이드 글리코시드 및 스테로이드 알칼로이드 글리코시드) 이상의 부류가 공지되어 있다. 식물에서 사포닌의 생합성은 출발 물질 스쿠알렌과 관련되어 있다. 또한, 피토스테롤, 카르데놀리드, 쿠쿠르비타신, 쿠아시노이드 및 리모니드와 같은 다른 중요한 이차 대사 산물의 부류도 스쿠알렌으로부터 유래한 것이다. 동물 음식물에서 과량의 스쿠알렌은 포만감으로 공지된 증상과 관련되어 있다.
언급되지 않은 다양한 이차 대사 경로에서 상기 방법의 유용성에 의해 본 발명은 예시된다. 그러나, 임의의 식물에서 이차 대사 경로를 변형시키는 방법의 유용성은 숙련자들에게 명백할 것이고, 본 발명을 수행하는 일반적인 방법도 제공될 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 식물에서 시나핀 함량 및 관련된 페놀계 화합물을 변화시키는 방법 및 DNA 조성물을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 페놀 화합물 함량이 변화된 식물 세포 및 페놀 화합물 함량이 감소된 식물 종자(특히, 시나핀 함량이 감소된 십자화과 식물)를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 식물 세포에서 당 알코올 이차 대사 경로의 산물인 피트산 함량을 변화시키는 방법 및 DNA 조성물을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 피트산 함량이 변화된 식물 세포 및 피트산이 감소된 식물 종자를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 사료로 사용하기 적합한, 피트산 함량이 감소된 식물 종자를 제공하고, 변형된 사료 제조에 적합한 감소된 피트산 함량을 갖는 식물 종자를 제공하며, 당 알코올(이노시톨) 대사가 변형된 식물 세포를 제공한다.
식물에서 각각의 이차 대사 경로는 독특하거나 독특한 방식으로 사용되는 제한된 수의 효소와 관련되어 있다. 이차 대사 경로는 식물 전체에 사용되거나 존재하는 다양한 화합물을 생성할 수 있다. 따라서, 이차 대사를 변화시키는 수단으로서의 독특한 효소 활성은 특정 경로를 통한 화합물의 흐름을 특별하게 변화시키는데 사용된다. 상기 방법의 유용성을 예시하기 위해, 본 발명의 방법에 따라 두 가지 구별되는 이차 대사 경로를 변형하였다. 상기 방법의 특성을 완전히 이해하도록 돕는 상기 경로에 대한 정보를 하기에 제공한다.
(A) 페닐프로파노이드 대사를 위한 이차 대사 경로
식물은 이차 대사 경로인 페닐프로파노이드 경로를 통해 다양한 페놀계 화합물을 생성한다. 페닐프로파노이드 대사는 질병 내성, UV광 보호 및 식물 생장 조절을 포함하는, 식물의 많은 생리학적 과정에 포함되어 왔다. 상기 경로의 산물은 식물 조직의 성분으로 식물 섬유의 생성에 관련되고, 종자 또는 종자 사료에서 대사에 의해 생성되는 탄수화물과 관련된 코르크질(suberin) 및 리그닌 생합성을 필요로 한다. 리그닌은 불용성 섬유의 생성에 관련되어 있다고 믿어지고, 따라서 종자 또는 사료에서 높은 농도의 리그닌은 사료 또는 종자(특히, 위가 하나인(monogastric) 동물에서)의 비효율적인 이용도와 상호관계가 있다. 따라서 식물의 페놀, 특히 리그닌의 페놀성 전구체는 동물 사료에 대한 영양에 유해한 인자로 생각될 수 있고, 식물 페놀의 감소 또는 적합한 변화(특히, 리그닌 생성에 사용되는 페놀)는 고급 사료를 제공할 수 있다.
또한, 식물 페놀은 다양한 다른 화합물의 생성에 관련되어 있는데, 그들 중 일부도 영양에 유해하다는 특성이 있다.
본 발명은 식물 세포나 사료용 종자 또는 사료에서 영양에 유해한 것으로 생각되는 특정 페놀 화합물을 감소시키는 수단을 제공한다. 특히, 본 발명은 시나핀을 생성하는 식물 세포에서, 상기 쓴맛의 영양에 유해한 화합물인 시나핀(또는 시나포일 콜린)을 감소시키는 것을 고려하고 있다. 또한, 시나핀은 사료 내에서 단백질과 복합체를 생성하여 동물체 내에서 단백질의 소화 및 이용도를 감소시킨다고 생각된다. 또한, 쓴맛은 사료의 수준에 영향을 끼칠 수 있다. 추가로, 껍질이 갈색인 달걀을 낳는 어떤 암탉 계통에 시나핀을 먹였을 때, 달걀에서 물고기 냄새같은 악취가 유발되었다. 이 경우에 시나핀-함유 사료의 비율은 약 10% 미만을 필요로 하고, 이는 음식의 조성에서 시나핀을 함유하는 사료의 사용을 제한한다. 따라서, 십자화과 식물의 종자 또는 종자 사료에서 시나핀의 감소는 상업적 목적으로 중요하다.
시나핀의 생성은 페닐프로파노이드 경로가 확장되어 발생한다. 본 발명의 범위 내에서 정의된 경로는, 리그닌 단량체 및 페닐프로파노이드 경로의 산물로부터 유래한 다른 생화학적 조성물의 생성을 유발하는 분지 경로와 같은 다양한 단계로부터 분지된 생화학적 경로 뿐만 아니라 시나프산의 생성을 유발하는 생화학적 단계를 포함한다.
페닐프로파노이드 경로에서, 방향족 아미노산인 L-페닐알라닌은 페닐알라닌 암모니아 용해효소(PAL)의 기질이다. PAL의 효소 활성은 신나메이트-4-히드록실라아제(C4H)의 기질인 신남산의 생성을 유발한다. C4H의 산물은 많은 플라보노이드 화합물의 전구체인 p-쿠마르산으로, 이들 중 어떤 것은 티로신 암모니아 용해효소 (TAL)의 작용에 의해 L-티로신으로부터 생성될 수 있다. 또한, 쿠마르산은 리그닌 생합성의 전구체로 작용할 수도 있다. p-쿠마레이트-3-히드록실라아제(C3H) 효소는 p-쿠마르산에 작용하여 카페산을 생성한다. 카페산은 카페에이트 및 5-히드록시페룰레이트-O-메틸 전이효소(OMT)에 의한 대사로 페룰산을 생성한다. 페룰산은 리그닌 생합성에 사용되는 공지된 세 가지 일차 페놀 단량체 중 하나이다. 또한, 페룰산은 5-히드록시페룰산을 생성하는 페룰레이트-5-히드록실레이트 (F5H)의 기질이고, 이는 OMT 효소에 의해 추가로 변형되어 시나프산을 생성한다. 또한, 시나프산은 UDP-포도당 시나포일전이효소(SGT)의 작용에 의해 시나포일 포도당을 생성할 수 있다. 시나포일 포도당은 시나포일 포도당-콜린 시나포일 전이효소(SCT)의 기질로 작용하여 시나포일 콜린 또는 시나핀의 생성을 유발한다. 나중 두 단계는 십자화과 식물 및 브라시카(Brassicas)에서 널리 사용되는 단계이고, 종자에 시나핀이 축적되는 것은 성숙한 종자에서 발견되는 주요 비-중합체 페놀계 화합물의 축적을 의미한다. 페닐프로파노이드 대사의 일반화된 경로는 도 2에 도시되어 있다. 추가의 효소 활성이 특정 식물 종에서는 페닐프로파노이드 경로의 일부일 수 있음을 알아야 한다.
시나핀 또는 시나포일 콜린은 십자화과 식물의 종자에서 가장 풍부한 페놀계 화합물이고, 비 나푸스(B. napus)에서 상기 화합물은 사료의 4%나 차지한다(Blair 및 Reichert, 1984, J. Sci. Food Agric. 35:29). 시나핀 합성은 외양이 연한 녹색인 미성숙 종자에서 발생하고, 종자가 성숙하는 동안 순 분해가 없는 것 같다(Vogt et al., 1993, Arch. Biochem. Biophys. 300:622).
발생중인 실생(즉, 발아중인 종자)은 에스테르화 효소 반응에 의해 시나핀을 분해하여 시나프산 및 콜린을 생성한다. 증명되지는 않았지만, 시나핀의 분해가 종자의 발아시 인지질 합성에 콜린을 제공할 것이라고 가정하였다(Strack et al., 1981, Z. Naturforsch. 36c:215). 그러나, 십자화과 식물을 제외한 대부분의 식물 종자에 시나핀이 없기 때문에, 시나핀이 종자의 발생 또는 발아에 통상적으로 중요한 성분이라고는 생각하지 않는다.
페닐프로파노이드 경로에 결함이 있는 돌연변이체를 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)에서 단리하였다(Chapple et al., 1992, The Plant Cell 4: 1413-1424). 상기 돌연변이체가 생리학적, 생화학적 및 유전학적 연구에 훌륭한 골격을 제공하기는 하지만, 식물 전체에 나타나는 돌연변이 징후로 인한 UV광에 대한 과민증을 포함하는, 돌연변이의 부정적인 결과로 인해 농경법상 가치가 없다. SIN1이라 불리우는 상기 돌연변이체(시나포일 말레이트 생합성 돌연변이체, SINapoyl malate biosysthesis mutants)는 시나프산 에스테르의 합성을 억제하고, 시나핀(시나포일-콜린 에스테르)의 함량을 감소시키며, 추가로 식물에서 리그닌 단량체 조성물을 변화시킨다. 리그닌 함량의 변화는 식물에서 리그닌을 진기한 조성물이 되게 하여 식물 섬유를 변화시킨다.
채플(Chapple) 등은 리그닌 함량을 감소시키거나, 또는 카놀라 종자와 같은 중요한 십자화과 식물의 종자에서 리그닌 함량을 변화시키는데 SIN1과 같은 돌연변이 사용의 가능성에 대해 추가로 토론하고 있지만, 어떻게 해야 하는지 방향을 제시하지 못하고 있다. 카놀라 종자에서 시나핀을 감소시키는 것이 중요한 목적이라는 사실을 추가로 고려해야 하지만, SIN1 돌연변이를 이용하여 어떻게 해야 하는지 방향성이 없다. SIN1 돌연변이체의 UV 감수성이 명백하다면, 상기 돌연변이는 농업 조건하에서 거의 가치가 없다. 비록 종자에서 시나핀 함량을 감소시키는 방법이 당업계에 기재되기는 했지만, SIN1 돌연변이는 시나핀이 식물의 생장 및 발생에 필수적이지 않고 시나핀이 감소된 종자도 생장하고 발생할 수 있다는 중요한 과학적 증거를 제공한다. 그러나, SIN1 돌연변이는 상업적으로 생성된 십자화과 식물의 종자에서 유해한 UV 과민성과 무관하게 시나핀의 함량을 감소시키는 방법을 제공하지는 못한다.
시나핀과 같은 영양에 유해한 페놀계 화합물 이외에, 페닐프로파노이드 경로의 많은 산물은 리그닌의 생성에 관련되어 있다. 리그닌의 생합성은 세 가지(쿠마르산, 페룰산 및 시나프산) 이상의 일차 페놀 전구체를 생성하는 일반적인 페닐프로파노이드 생합성 경로의 일부이고, 상기 화합물이 중합되어 리그닌 및 다른 페놀계 화합물을 생성한다.
상기 전구체로부터 리그닌이 생성되는 생화학적 기작은 복잡하고 카페산/5-히드록시페룰산-O-메틸 전이효소(COMT), 카페오일-CoA-환원효소(CCoAOMT), 신나밀 알코올 탈수소효소(CAD), 신나모일-CoA-환원효소(CCR), 퍼산화효소, 4-쿠마레이트:CoA 리가아제 (4CL) 및 코니페린-특이적 베타-글루쿠로니다아제(CBG)와 같은 무수한 효소가 관련되어 있다. 다른 효소들이 관련될 수도 있으며, 리그닌 생성에 대한 완전한 생화학적 기작이 이직 이해되지는 못하고 있다.
리그닌은 복잡한 중합체로서 주로 단량체 페놀 화합물의 유니트가 다양한 비율로 상호결합된 상태로 이루어지며, 세포의 유형이 다르거나 종이 다르면 상이한 유형으로 결합된다. 조직이 기계적 강도를 필요로하거나 수분 전도와 관련된 식물의 세포벽에 필수적인 성분이 리그닌이다. 추가로, 리그닌은 병원균에 저항성을 나타내는 기작과 관련되어 있다고 믿어진다. 쌍떡잎 식물에서 흔히 나타나는 리그닌은 페룰산-유도 과이아실 유니트 및 시나프산-유도 시린길 잔기로 구성되는 과이아실-시린길 리그닌이다. 따라서, 시나프산 및 페룰산은 모두 야생형 리그닌의 생성에 필요하다. 예를 들면 펄프화시키는 동안, 목재의 분해가능성 및 진행도는 특이적인 리그닌 단량체의 이용도에 일차적으로 기초한 리그닌 단량체의 조성에 매우 의존적일 것으로 생각된다. 시나포일-유도 시린길 리그닌에 5-O-메틸기가 존재하면 가교되는 정도를 감소시켜, 페룰산으로부터 유도된 과이아실 유니트로 구성된 리그닌보다 주로 시린길 유니트로 구성된 리그닌을 더 가공하기 쉽게 만든다고 믿어진다. 따라서, 시린길 리그닌 함량을 증가시키는 방법은 리그닌의 가교가 감소되어 소화가 잘되는 사료를 만들게 할 것이다.
가축 사료용 농작물의 소화성은 섬유의 함량에 의해 영향을 받는데, 그 이유는 가교된 리그닌은 잘 분해되지 않고 세포벽 성분과 물리적으로 결합되어 작용하기 때문이다.
시나핀을 제거하거나 그의 함량을 낮추고 일반적인 페놀 화합물의 함량을 변화시켜 종자 사료를 개선시키려는 임의의 시도는 발생중인 종자를 표적으로 해야한다는 사실은 명백하다. 시나핀을 합성하는 생화학적 경로가 종자에서 특이적으로 변화되기 위해서는, 낮은 농도의 시나핀을 제공하는 형질의 생식질이 자연상태에 없기 때문에 분자 유전학적으로 접근하는 것이 가장 적합하다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종자에서 페놀계 화합물의 함량을 변화시키는 방법에 대해 기술하고 있고, 나아가 시나프산 및 관련 페놀계 화합물을 변화시키는 방법을 기술하고 있다. 상기 방법은 페닐프로파노이드 경로에서 효소에 대한 전구체 및 기질로 사용되는 화합물의 이용도에 영향을 주는 신규 효소 활성을 도입하는 것과 관련되어 있다. 풍부한 상기 화합물이 고갈 또는 변화되면, 정상적인 경로에 생화학적 이동이 유발되고 다양한 페닐프로파노이드 생성물의 함량이 변할 것이다.
상기 방법의 한 예로서, 콜린 산화효소(COX)라는 신규 효소 활성을 사용하여 식물세포, 특히 식물 종자에서 콜린 풀(pool)을 감소시켰다. 다른 것보다 콜린은 시나포일 포도당으로부터 시나핀을 생성하는데 사용된다. 콜린 풀의 감소는 시나핀 전구체(콜린 및 시나포일-포도당)의 함량 변화를 초래하여, 페닐프로파노이드 경로의 초기 효소 단계에서 생성된 전구체 조성물(시나프산을 포함함)을 변화시킬 것이다. 그 결과는 시나핀 함량이 매우 감소되고 페놀 화합물 함량이 변화된 종자이다. 콜린 산화효소에 의한 콜린의 산화는 과산화수소를 생성한다고 공지되어 있다. 식물 세포에서 과산화수소의 생성은 유익하기 때문에, 식물에서 콜린 산화효소를 발현시키는 것은 추가의 이점이 존재할 것이다. 상기 방법의 추가적인 면에 예시된 바와 같이, 베타인 알데히드 탈수소효소(BADH)의 두 번째 효소 활성이 콜린 산화효소 산물인 베타인 알데히드의 글리신베타인(스트레스 보호제의 기능을 함)으로의 전환을 증가시키기 위해 사용된다. 베타인 화합물은 식품 업계에서 다양하게 적용할 수 있고 식물 생장을 증가시키는 첨가제로서 가치있는 화합물이다.
따라서, 식물 세포에서 페놀계 화합물의 함량을 변화시키고 시나핀을 감소시키는 유익한 효과는 페닐프로파노이드 경로에서 단일 전구체의 감소에 의해 나타난다. 페닐프로파노이드 경로에서 다른 효소를 사용하여 다양한 다른 최종 산물을 변화시키는 방법이 당업계 숙련자에게는 상기 방법의 범위 내에서 명백하다.
본 발명의 범위 내에서 사용할 수 있는 신규 효소 활성의 다른 예는 페닐프로파노이드 경로에서 생성되는 페룰산을 분해하는 것이다. 세 가지 주요 리그닌 단량체에서, 페룰산은 세포벽을 견고하게 하고 효소적으로 분해되지 않도록 만드는 펜토오스 사슬, 아라비녹실란(arabinoxylans) 및 헤미셀룰로오스를 가교시켜, 구조적 견고함 및 세포벽 구성의 강도를 부여하는 것으로 믿어진다. 따라서, 리그닌의 성분으로서 페룰산은 식물 조직의 기계적 강도를 유지하는데 중요한 역할을 한다. 특정 방법으로 페룰산의 함량을 변화시키는 것은 많은 유익한 효과를 나타낼 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 페룰산은 일반적인 페닐프로파노이드 경로에서 합성되고, 경로의 다양한 산물에 대한 전구체 역할을 한다(JPN Rosazza et al., Journal of Industrial Microbiology 15: 457-471, 1995, R Whetten 및 R Sederoff, Plant Cell 7: 1001-1013, 1995 및 RA Dixon and NL Paiva, 1995, Plant Cell 7: 1085-1097, 1995에서 논평함).
본 발명의 방법은 페룰산의 함량을 변화시켜 페닐프로파노이드 경로의 다양한 다른 화합물(특히, 시나핀)의 생성을 변화시키는 수단을 제공한다. 본 발명의 한 가지 면은 식물 세포에서 페룰산의 함량을 변화시키는 방법에 대해 기술한다. 상기 방법은 페룰산을 합성하는 이종 효소 활성에 의존한다. 상기 효소 중 일부는 상업적으로 유용한 화합물을 생성할 수도 있다. 예를 들면 페룰산 탈카르복실화효소는, 산업적 공급 원료로 사용될 수 있고 식물 세포에 축적되어도 유해한 효과가 없는 비닐과이아콜 화합물을 생성하는데 사용될 수 있다. 페룰산이 고갈되거나 양이 변화되면 페닐프로파노이드 경로에서 생화학적 이동이 발생하여 다양한 페닐프로파노이드 산물의 함량이 변화하게 된다.
본 발명에 따른 방법은 페닐프로파노이드 경로에 제한되지는 않는다. 본 발명의 유용성에 대한 예로서, 당 알코올을 생성하는 이차 대사 경로의 변형을 예시한다.
(B) 당 알코올 대사를 위한 이차 대사 경로
또한, 본 발명은 식물 세포에서 당 알코올을 변화시키는 방법 및 DNA 조성물을 제공한다. 본 발명의 방법을 적용한 결과, 피트산, 스타키오스, 라피노오스, 수크로실 글리코시드, 우로나이드 및 펜토오스, 포스포이노시타이드 및 글리코포스포세라마이드와 같은 당 알코올로부터 유래한 화합물이 변형된 상태의 식물 세포를 제공하였다. 그 결과, 본 발명의 몇몇 실시양태에서 피트산이 감소된 식물 종자를 수득할 수 있었다. 또한, 본 발명은 사료로 적합한 정도로 피트산 함량이 감소된 식물 종자, 변화된 사료의 제조에 적합한 정도로 피트산 함량이 감소된 식물 종자, 및 이노시톨 대사가 변화된 식물 세포를 제공한다. 스타키오스 및 라피노오스와 같은 영양에 유해한 당 알코올을 포함하는, 당 알코올 대사에서 유래한 다른 화합물도 또한 본 발명에 의해 변화될 수 있다. 특히, 피테이트 함량이 변화된 식물 종자가 사료로 사용하기에 적절하다.
피테이트는 많은 종자에서 통상 종자 질량의 2 내지 4%를 차지하며, 어떤 종에서는 그 함량이 10%에 달하는 중요한 성분이다. 사료에 높은 농도의 피테이트가 존재하는 것은 식욕 상실, 한 배에서 출산되는 태아(litter)의 수 감소 및 다른 부정적 특성 인자와 관련된다. 상기 효과는 피테이트에 아연이 결합할 수 있는 능력 때문인 것 같다. 다른 종자 성분과 피트산의 복합체는 통상 피틴(phytin)이라 불리운다. 피틴이 많으면 부정적 효과가 나타난다.
종자의 특성에 방해되는 효과 이외에, 사료 조성물에 피트산이 존재하는 것은 환경적으로 바람직하지 못한 결과를 초래한다. 위가 하나인 동물에서, 피트산과 결합된 포스페이트는 통상 사용되지 않고, 따라서 음식물에 포스페이트를 가해야 하는데 이는 비용이 소요된다. 피트산과 관련된 포스페이트는 위가 하나인 동물에서 배설되고, 피트산에 포함된 포스페이트는 환경에 방출되어 미생물에 의해 분해된다. 종자 사료에 피트산이 많으면 배설되는 포스페이트의 양이 많아지게 된다. 계속적으로 증가하는 가축 생산은 종종 공급되는 물의 부영양화 및 포스페이트 오염에 관련된 다른 환경 문제를 유발하였다. 상기 문제는 증가할 것이고, 미래에 가축 생산의 주요 제한 요인이 될 것이라 예상된다. 따라서, 배설된 피트산의 양을 감소시키는 방법은 상기 환경 문제를 개선하는데 상당히 유익할 것이다.
조성물에 포스페이트를 가하는 것과 관련된 비용이 사료 비용의 상당한 부분을 차지하는 것은 아니지만, 배설된 포스페이트의 환경적 영향력은 피테이트 함량이 낮은 사료의 제조를 통해 피할 수 있다.
반추 동물에서, 반추위에 미생물상이 존재하면 피트산에 함유된 포스페이트가 유리될 수 있어서 포스페이트의 이용도가 높아진다. 그 결과로, 반추위 음식물에 가해진 포스페이트의 함량은 위가 하나인 동물에 비해 매우 적다. 그러나, 대부분의 식물 종자에 존재하는 피트산의 함량은 실제로 필요한 양보다 많아서, 반추 동물에서도 포스페이트 오염이 문제가 된다.
현재까지 피테이트를 감소시키기 위해 고려해온 주된 방법은 사료에 포함된 피타아제(phytase) 효소의 작용에 의한 피테이트의 분해을 이용하는 것이었다. 비록 상기 방법이 포스페이트의 이용도를 높여주기는 하지만, 피트산 함량이 감소된 종자 또는 사료를 생산하지는 못하고 피트산에 포함된 포스페이트의 이용도가 증가된 사료를 생산할 뿐이다. 따라서, 피타아제 효소의 사용은 단지 피트산의 포스페이트를 이용 가능하게 만드는데 유용할 뿐이다.
피타아제 활성은 곰팡이(아스퍼길리스(Aspergillis)), 박테리아(바실러스 (Bacillus), 슈도모나스(Pseudomonas)) 및 효모(사카로마이세스(Saccharomyces))와 같은 미생물에서 흔히 나타난다. 미생물 피타아제를 포함하는 효소 혼합물로 식물을 처리하여 피트산을 제거하는 방법은 미국 특허 제5,554,399호에 기재되어 있다. 대부분의 미생물은, 추가로 피트산을 분해하는 다양한 포스파타아제 뿐만 아니라 피타아제 활성 그 자체를 포함하는 많은 피타아제 활성 효소를 합성한다. 이용 가능한 포스페이트를 피트산으로부터 완전히 유리하는 것은 독특한 효소 활성의 수에 의존적일 것이다.
미생물의 피타아제를 생성하도록 식물을 형질전환시키는 다른 접근 방법도 또한 기재되어 있다. 미국 특허 제5,593,963호는 구성적인 발현 또는 단계나 조직에 특이적인 방식의 발현을 유도할 수 있는 서열을 포함하는 조절 서열의 제어를 받는 유전자 이식 식물에서 피타아제를 발현하는 것에 대해 기재하고 있다. 식물 세포, 좀 더 구체적으로 식물의 종자 세포는 피트산에 포함된 포스페이트의 일부분을 방출하는 피타아제 활성을 포함하도록 제조될 수 있다.
그러나, 피트산으로부터 포스페이트의 단순한 유리는 포스페이트 폐기물의 감소 문제 및 피트산의 잠재적 영양에 유해한 효과를 완전히 해결하지는 못한다. 더 중요한 것은 복합체 피트산 또는 피테이트의 존재가 감소되지 않는다는 것이다. 공개된 기술은 피트산으로부터 포스페이트를 유리시키는 수단을 제공하지만, 생성되는 피트산의 함량을 조절하는 수단을 제공하지는 못한다.
피트산의 함량을 편리하게 조작할 수 있는 임의의 수단은 식물을 사료로 사용하는데 매우 유용할 것이다. 예를 들면, 피트산 함량이 감소된 식물 종자는 피틴이 감소된 종자 사료를 제공할 것이고, 따라서 피트산 복합체의 감소로 인해 자양분이 많고 소화가 잘될 수 있다.
영양이 개선된 사료 이외에, 피트산이 감소된 사료는 환경에 방출하는 포스페이트를 감소시켜 오염을 줄일 것이다. 비록 피트산으로부터 포스페이트를 유리시키는 수단이 사료에 가하고 배설되는 포스페이트의 양을 감소시키기는 하지만, 피트산의 실제적인 양 및 그에 따른 포스페이트의 잠재적 이용도는 대부분의 동물에 필요한 포스페이트의 영양을 제공하기에 충분하다.
따라서, 피트산의 함량을 조작하는 방법은 모든 사료 업계에 매우 유용할 것이고, 추가로 새롭고 가치있는 사료 및 사료 조성물을 제공할 것이다.
상기 관점에서, 종자의 발생중에 피테이트의 생산을 조절하는 수단은 매우 유용하고 포스페이트 오염 및 피트산의 영양에 유해한 효과라는 문제에 대한 해결책을 제공할 것이라는 사실은 명백하다. 추가로, 다양한 식물 종에 유용한 유전자적 기작은 특히 가치가 있을 것이다. 본 발명은 그러한 해결책을 제공한다.
본 발명의 범위를 이해하기 위해서는 피트산이 생성되는 생화학적 기작에 대한 올바른 인식이 요구된다. 비록 피트산의 생합성이 완전히 이해되지는 않았지만, 해결의 키(key)가 되는 많은 단계가 공지되어 있다. 피트산은 미오-이노시톨의 6인산 유도체이고, 피트산을 합성하는 생화학적 경로는 미오-이노시톨 및 당 알코올을 초기 기질로 이용한다. 또한, 상기 화합물(미오-이노시톨, 흔히 이노시톨이라고도 불리움)은 다른 미오-이노시톨 유도체 및 에피머의 생성에 중추적인 역할을 한다. 수크로실 글리코시드와 같은 상기 유도체 중 일부는 영양에 유해한 화합물이고, 따라서 상기 화합물의 감소가 요구된다.
미오-이노시톨은 식물 세포 어디에나 있는 당 알코올이다. 그러나, 임의의 미오-이노시톨 히드록실기의 단순한 보호는 상기 화합물을 통한 피트산의 생합성 및 다른 경로를 부적절하게 만든다. 미오-이노시톨의 보호는 생체내에서 다양한 메틸 전이효소에 의해 특정 위치를 메틸화시켜 수행한다. 예를 들면, 미오-이노시톨은 위치 6에서 일메틸화를 통해 오노니톨(ononitol)로 전환된다. 위치 5에서의 메틸화는 피니톨(pinitol)로 에피머화되는 세쿠오이톨(sequoyitol)을 생성한다. 피니톨은 피트산 생합성에 사용될 수 없다. 미오-이노시톨의 메틸화된 유도체는 식물에 스트레스에 대한 내성과 같은 유익한 특성을 부여하고, 상기 화합물은 용질 수송 및 막단백질의 안정화에 관련된 것으로 공지되어 있다. 따라서, 정상적으로 당 알코올 대사와 관련되지 않은 이종 효소 활성을 이용한 이노시톨의 변형은 본 발명의 범위 내에서 고려된다.
피트산 생성에 대한 생화학적 기작이 잘 이해되지는 않았지만, 두 가지 잠재적 경로가 공지되어 있고, 피트산 생합성에 다양한 효소 활성이 관련된 것으로 보인다. 피테이트는 대부분의 식물 조직에서 발견되지만, 특히 포스페이트 저장 기능을 하는 것으로 생각되는 종자 및 화분(pollen)에서 우세하게 발견된다. 따라서, 종래의 수단에 의해 피테이트 생합성을 변화시키는 수단을 고안하는 것은, 특히 그 생성에 대한 생화학적 기작이 잘 이해되지 않았기 때문에 어렵다고 판명되었다.
피트산의 생성을 최소화하기 위해, 본 발명은 피트산 생합성에서 미오-이노시톨을 변형시키고 미오-이노시톨의 이용도를 방해하는 효소를 코딩하는 DNA 조성물 및 그 방법에 대해 기재하고 있다. 본 발명은 종자, 특히 피트산 생합성이 일어나는 종자내 조직에서 미오-이노시톨을 특이적으로 메틸화시키는 이종 메틸 전이효소 유전자를 고려하고 있다. 이종(heterologous)이란 상기 식물 세포의 피테이트 생합성과 정상적으로는 관련되지 않은 효소를 의미한다. 본 발명은 호염성 식물로부터 수득된 이종 효소 활성을 이용하는데, 상기 효소는 옥수수, 콩, 목화, 알팔파, 밀, 보리, 호밀, 사탕수수, 해바라기, 브라시카(Brassica) 지방 종자, 및 다른 재래적으로 경작되는 농작물과 같은 종래의 농작물에서는 발견되지 않는다.
또한, 미오-이노시톨로부터 메틸 이노시톨을 생성하는 것은 식물 세포에 해가 없는 무독성 화합물의 생성이라는 추가의 이점을 제공한다. 따라서, 이용 가능한 미오-이노시톨의 풀을 감소시켜 피트산의 생성이 감소된다.
피테이트는 종자 사료에서 주요 영양에 유해한 인자 중 하나이다. 피트산의 영양에 유해한 효과는 무기질 결합, 단백질과의 복합체 생성 및 다른 부정적 효과를 포함하고, 특히 과량의 포스페이트를 피트산의 형태(환경에서 대사로 포스페이트 오염을 생기게 함)로 배설하는 것과 관련된 효과를 포함한다. 따라서, 식물 세포에서 피트산을 감소시키는 방법은 사료 업계에서 유용하다. 수경 재배에서, 식물에서 유래한 단백질을 청어의 대체 먹이로 사용하는 것은 피트산의 농도가 너무 높다는 커다란 문제가 있다. 따라서, 식물 세포, 특히 동물의 사료로 사용되는 식물 조직의 세포에서 피트산 함량을 감소시키는 방법은 가치있고 매우 유익하다. 동물의 사료로 사용되는 다양한 식물 종에 걸쳐 피트산의 함량을 감소시키는 방법은 사료 산업에서 특히 가치있다.
미오-이노시톨-O-메틸 전이효소(IMT)를 코딩하는 식물 유전자는 메셈브리안테뭄 크리스탈리눔(Mesembryanthemum crystallinum, 채송화)으로부터 단리하였고, 상기 효소는 이종 유전자 이식 식물에서 미오-이노시톨을 피니톨로 전환하였다 (미국 특허 제5,563,324호). 상기 식물 유전자는 미오-이노시톨의 메틸화 유도체인 오노니톨(이후에 피니톨로 에피머화될 수 있음)의 과다발현에 의해 식물의 스트레스에 대한 내성을 증가시킬 목적으로 구성적인 프로모터의 조절을 받는다. 본 발명에서, 종자의 이노시톨 대사를 변형시키기 위해 식물 유전자는 종자 선택적 프로모터의 조절을 받는다.
미국 특허 제5,563,324호에 기재된 피니톨의 제조는 유전자 이식 담배 식물 전체에 걸쳐 구성적으로 발현되었을 때, 염에 대한 내성을 부여하였다. 유사하게, 박테리아의 만니톨 1-P 탈수소효소는 식물 세포에서 구성적으로 발현되었을 때, 만니톨, 당 알코올 또는 폴리올의 생성을 촉매하고 식물 세포가 염 스트레스에 내성을 갖도록 한다. 그러므로 미국 특허 제5,563,324호는 식물세포에 염 내성을 부여하기 위한 수단으로서 식물 세포 고유의 당으로부터 당 알코올을 제조할 수 있는 효소를 사용하는 당 알코올의 제조에 대해 기재하고 있다.
그러나, 미국 특허 제5,563,324호는 고유의 유도체를 포함하는 다른 화합물에 대한 전구체로서 미오-이노시톨의 사용을 방지하기 위해 미오-이노시톨을 변화하게 할 수 있는 유전자 사용에 대한 어떤 방향성도 제시하지 않았다. 그러나, 미국 특허 제5,563,324호는 미오-이노시톨의 변형이 식물에 어떠한 부정적인 효과도 초래하지 않는다고 명확한 증거를 제시하고 있으므로, 미오-이노시톨의 함량을 조작하더라도 유해한 효과는 나타나지 않을 것이다.
따라서, 메틸 전이효소 유전자에 의한 미오-이노시톨의 변화 가능성은 식물 세포에 유해하지 않을 것으로 예측되고, 상기 효소 반응으로 메틸화된 산물은 식물 세포에 무해한 것으로 공지되어 있다.
그러나, 미오-이노시톨은 식물 생장 및 발생의 다양한 면에 기초가 된다. 피트산 생합성에 대한 전구체로서의 작용 이외에, 미오-이노시톨은 우로나이드 및 펜토오스 생합성에도 사용되고, 글리코포스포세라마이드를 포함하는 복잡한 식물 지질 뿐만 아니라 식물 세포막의 포스포이노시타이드에도 나타난다. 게다가, 상기 화합물은 자연적으로 발생하는 이노시톨 이성질체의 전구체이고, 미오-이노시톨 뿐만 아니라 많은 이성질체가 식물계 전체에 걸쳐 종 특이적 패턴의 메틸 에테르로서 작용한다.
통상, 식물 대사에서 미오-이노시톨의 역할은 크고, 상기 미오-이노시톨 풀의 변화는 특히 농경 재배 조건하에서 예측하지 못한 결과를 초래할 수 있다. 비록 미국 특허 제5,563,324호에서 메틸 전이효소 유전자의 구성적인 발현에 대해 기재하고 있지만, 그 결과로 생성된 식물이 유용하다는 어떤 증거도 제시하지 못하고 있다. 미국 특허 제5,563,324호에서는 "비록 새로이 삽입된 유전자로 인해 식물이 농경 조건에서 더 좋은 효과를 만들어내지 못하더라도, 상기 유전자를 가지고 있는 유전자 이식 식물은, 식물 내부 과정(예를 들면, 삼투압 조절)의 변화가 식물의 야생 행태에 어떤 영향을 주는지 연구하는데 유용하다"(컬럼 2의 60-65행)고 진술하고 있다. 따라서, US 5,563,324호에서는 피트산의 감소를 위해 미오-이노시톨의 함량을 조절하는 것을 예측하지 못하거나, 또는 그 문헌에 포함된 기술로부터 창출될 수 있는 농경법상 유용한 특징 및 유용성이 있는 식물을 기대하지 못하였다. 따라서, 미국 특허 제5,563,324호는 스트레스에 대한 내성 또는 추가의 과학적 연구 목적으로 미오-이노시톨-변형 유전자를 식물 전체에서 발현하였다.
따라서, 피트산의 감소에 대한 신규 접근 방법을 본 발명에서 배우게 된다는 사실은 명백하다. 메틸-전이효소 유전자의 사용은 피트산의 감소에 특이적이다. 본 발명은 종자 및(또는) 종자 사료에서 과량의 피트산으로 인한 문제를 해결하지 못하는 피타아제 효소의 발현과 같이, 당업계에서 이미 사용하던 방법에 의존적이지 않다. 본 발명에 수행된 작업의 과정에서, 피트산 생합성에 사용되는 미오-이노시톨의 함량을 변화시켜 피트산의 함량을 조절할 수 있음을 발견하였다. 종자 조직에서 메틸 전이효소 유전자의 발현은 식물의 다른 특성을 변화시키지 않고 피트산의 감소를 유발한다는 것을 알았다. 피테이트를 생합성하는 종자의 조직에서 메틸 전이효소 유전자를 발현시키면, 배양 환경이 극단적이더라도 성숙한 종자에서 추가적인 효과 없이 피트산을 감소시켰다. 조직-선택적인 프로모터를 사용하면, 다른 조직에서 나타나는 미오-이노시톨 대사는 그대로 두고 종자 조직에서만 대사의 효소 활성을 억제하는 것을 포함하여 당업계에 많은 장점을 제공한다.
본 발명의 목적은 식물에 무해한 화합물로 바꾸어 주는 대사 풀로 전환시켜, 미오-이노시톨을 피트산 생합성의 출발 물질로 전환시키는 것이다. 상기 방법은 피트산의 생성에 사용된 미오-이노시톨의 풀을 고갈 또는 변화시키는 메틸-전이효소 유전자를 포함하는, 신규 효소 활성의 도입과 관련되어 있다. 상기 전구체의 고갈 또는 변화는 정상적인 피트산 생합성의 생화학적 이동을 유발하여 생성된 피트산의 함량을 감소시키게 된다.
본 발명은 기질의 이용도에 의한 효소 활성을 조절이라는 개념에 생화학적 기초를 두고 있다. 통상, 효소의 반응 속도는 기질의 이용도에 의해 조절된다. 효소는 이용 가능한 기질의 양에 비례하는 속도로 생성물을 생산할 것이다. 기질의 감소는 최종 산물의 감소를 초래한다.
따라서, 본 발명은 피트산의 생성에 기질로 사용되는 이노시톨의 이용도를 고갈시키는 메틸 전이효소의 신규 활성을 이용하는 상기 접근 방법을 활용한다. 식물 종자에서 미오-이노시톨의 풀에 작용할 수 있는 임의의 효소를 본 발명의 범위 내에서 사용할 수 있다. 상기 방법은 피트산 생합성에 사용되는 미오-이노시톨의 풀을 다양한 방식으로 변화시키는 효소 활성의 도입에 관한 것이다.
미국 특허 제5,563,324호와 비교하여, 본 발명은 미오-이노시톨을 변형시켜 피트산을 생성하지 못하게 할 수 있는 유전자를 종자-선택적인 방식으로 발현하여 피트산의 생성을 변화시키려고 한다. 놀랍게도, 미오-이노시톨 변형 유전자가 구성적으로 발현되더라도 종자에서 피트산의 함량이 감소된다. 그러나, 본 발명의 가장 바람직한 실시양태는, 종자-선택적인 프로모터를 이용하여 식물의 농경상의 실행을 보장받고, 상기 프로모터가 손상되지 않으며, 결과로 생성된 식물이 종자에서 감소된 피테이트의 함량 이외에 모든 것이 정상인 것이다. 따라서, US 5,563,324호와 비교하여 본 발명은, 스트레스에 내성을 갖는 식물의 제조를 예견하지 않고, 또한 연구 목적으로 이해하지도 않는다.
상기 기재된 방법은 피타아제 효소의 발현에 의해 피트산을 감소시키는 것과 관련해서 당업계에 많은 장점을 제공한다. 이는 특정 조직에서 피트산의 함량이 변화된 식물, 종자에 피트산의 함량이 감소된 식물 및 피트산이 감소된 종자 사료를 포함한다. 상기 식물, 종자 및 사료는 더 좋은 먹이의 이용 및 사료의 특성이라는 이점을 포함하고, 포스페이트의 함량이 감소된 먹이 및 사료의 제조를 통해 환경에 기여하며, 예전에는 사료 또는 먹이의 영양에 유해한 피트산의 함량에 의해 사용이 제한되었던 식품 산업에 상기 사료를 사용할 수 있는 이점을 포함한다.
상기 기재한 방법은 다양한 식물 종에 유용하다. 상기 식물 종에는 외떡잎 및 쌍떡잎 식물 뿐만 아니라, 곡물 및 지방 종자 농작물을 포함한다. 상기 방법은 지방 종자 식물 및 십자화과 식물에 특히 유용하다.
상기 유전자적 변형의 결과는 변형된 당 알코올 경로, 특히 이노시톨 경로가 변화된 식물 세포 및 피트산 함량이 감소된 식물 세포, 특히 피테이트 함량이 감소된 식물 종자이다. 따라서, 본 발명의 방법 당 알코올과 관련된 이차 대사를 변화시키는 가치있는 수단을 제공한다.
비록 피트산 함량이 감소된 식물 세포와 같은 당 알코올 대사의 변화와 관련된 본 발명의 실시양태를 카놀라 식물 세포에서 주장하기는 했지만, 옥수수 식물도 피트산의 농도가 높아서 옥수수 세포에서 피트산 함량을 감소시키는 것도 유사하게 수행할 수 있다.
본 발명은 식물 세포 및 종자에서 피테이트의 함량을 변화시키는데 유용한, 특히 식물 세포에서 피테이트를 감소시키는데 유용한 방법, 유전자 구조물 및 벡터를 제공한다. 추가로, 본 발명은 식물 종자에서 피테이트를 감소시키는데 유용한 방법 및 DNA 조성물을 제공한다. 추가로, 본 발명은 변형된 종자 사료 및 상기 종자 사료를 포함하는 동물 사료, 특히 피테이트 함량이 감소된 종자 사료에 관한 것이다.
피트산의 감소는 새로이 기재된 방법 및 DNA 조성물에 의해 수행된다. 상기 방법은 피트산 생합성 경로에서 전구체를, 새로이 도입되고 피트산의 생성을 감소시키는 "끝이 막힌 경로(dead end pathway)"로 변환시킬 수 있는 "대사 경로 우회(metabolic shunt)" 또는 새로운 생화학적 경로의 개발을 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태의 결과로 생성된 "말단 소멸 경로"의 산물은 상기 식물 세포에 무해한 것으로 공지된 화합물이다. 따라서, 전구체 미오-이노시톨 화합물을 상기 화합물로 전환시키는 것은 어떤 식으로든 식물의 특성을 손상시키지 않을 것이다.
본 발명의 다른 면에 따라, 벡터 및 재조합 DNA 구조물은 피트산 함량이 변화된 식물 종자, 특히 피트산 함량이 감소된 식물 종자를 생성하게 한다. 추가로, 본 발명의 다른 면은 피트산 함량이 감소된 종자 사료의 제조에 유용하다. 상기 사료는 피테이트의 함량이 감소되었고, 따라서 동물 사료, 특히 피트산이 환경 오염과 관련되어 있거나 영양에 유해한 인자로 확인된 경우에 유용하다. 또한, 본 발명은 가금, 돼지, 소 및 물고기를 포함하는 다양한 동물의 먹이로 사용될 수 있는, 유전자적으로 변화된 종자로부터 유래한 변화된 사료를 제공한다.
본 발명은 종자에서 미오-이노시톨의 함량을 변화시킬 수 있고 직접 모든 종 및 다양한 식물에 사용될 수 있는 신규 효소 활성을 가하는 것을 포함한다. 임의의 식물 종에서 동일한 방식으로 미오-이노시톨의 변화가 발생하기 때문에, 식물 종이 다르더라도 동일한 유전자를 사용할 수 있다. 상기 방법은 유전자 억제 기술의 사용에 의존하지 않는데, 그 이유는 상기 기술이 DNA 서열에 의존적이므로 각각의 특이적 유전자 또는 작물 종에 알맞은 특정 유전자가 필요하기 때문이다. 미생물, 식물 또는 동물에서 유래한 많은 적합한 효소를 본 발명 방법의 범위 내에서 사용할 수 있다. 다양한 다른 식물 중에서 동일한 유전자 구조물을 사용할 수 있다.
본 발명의 광범위한 면에 따라서, 식물 형질전환용 벡터(미오-이노시톨의 대사를 통해 피트산의 생성에 적합하지 않게 해주는 효소를 생성함) 구조물 뿐만 아니라 형질전환된 식물 세포를 확인하는 선별 마커를 포함하는, 식물 종자에서 피테이트 함량을 감소시키는 방법을 제공하였다.
본 발명의 상황에서, 이노시톨의 대사에 의한 변화는 히드록실화, 이성질화, 메틸화, 절단, 또는 임의의 다른 생화학적 변형(정상 상태에서 미오-이노시톨에 작용하여 피트산을 생성하는 이후의 효소 활성을 무력화시킴)을 포함한다. 따라서, 대사에 의한 변화는 피트산 생합성에 대한 이용 가능한 기질의 풀로부터 효과적으로 미오-이노시톨의 이용도를 감소시키는 임의의 변형을 포함한다.
본 발명의 예를 들면, 미오-이노시톨 메틸-전이효소를 코딩하는 유전자가 본 발명의 한 가지 면을 예시하기 위해 사용된다. 식물 종자 세포에서 선택적인 발현을 위한 프로모터의 조절을 받는 상기 효소는, 식물 종자에서 피테이트의 제조에 이용 가능한 미오-이노시톨의 풀을 고갈시킬 수 있다. 본 발명의 다른 면에 따라서, 상기 메틸 전이효소는 미오-이노시톨을 무해한 물질로 전환시킬 수 있다.
본 발명에 따라 상기 방법에 의해 생성된 식물 세포는 일차 대사가 변화되지 않았고, 특정 이차 대사 경로 산물의 변화를 제외하고는 변화되지 않은 식물과 구별할 수 없는 형질을 나타내었다.
일차 대사가 영향받지 않았다는 것을 보장하기 위해, 이차 대사 경로에 특이적이고 경로의 최종 산물 생성에 필수적인 기질(특히, 최종 산물 생성 단계로부터 1 내지 5단계 안에 존재함)의 이용도 변화에 의한 이차 대사 산물의 생성을 조직 특이적 표적으로하는 방법을 기재하였다. 상기 방식으로, 이차 대사 경로의 산물에 특이적인 감소를 달성하였다.
본 발명의 상황에서, 페닐프로파노이드 이차 대사 경로의 산물에 대한 전구체로 사용된 화합물은 신남산, p-쿠마르산, 카페산, 페룰산, 5-히드록시페룰산, 시나프산, 콜린, 다양한 시나포일 화합물(시나포일-포도당 및 시나포일-말레이트를 포함하지만 이에 제한되지는 않음) 및 시나포일 콜린을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 범위 내에서, 페닐프로파노이드 경로의 산물은 플라보노이드, 리그닌, 다양한 단량체 및 중합체 페놀 화합물 및 시나핀을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 특이적인 효소의 선택에 의해 페닐프로파노이드 경로 내에서 임의의 산물의 함량을 변화시킬 수 있다. 전구체 화합물을 변형시키거나 표적으로하기 위해 사용되는 효소는 미생물, 동물 또는 식물에서 기원할 수 있다. 상기 효소는 자연 발생적인 것이거나, 또는 기질에 대한 특이성을 변화시켜 신규 효소 활성을 창출하기 위해 공지된 효소의 돌연변이에 의해 유래될 수 있다.
본 발명의 범위 내에서 사용된 효소는 이성질화, 접합, 인산화, 히드록실화, 산화, 탈수소화, 메틸화 또는 다른 유사한 생화학적 활성(결합 또는 격리를 포함)에 의해 전구체로 사용되는 화합물을 페닐프로파노이드 경로에서 발견되는 산물로 변형시키는 효소이거나, 가수분해 효소, 탈카르복실화효소, 산화효소, 에스테르화 효소, 또는 L-페닐알라닌, 신남산, p-쿠마르산, 카페산, 페룰산, 5-히드록시페룰산, 시나프산, 시나포일-포도당, 시나포일-말레이트 또는 콜린(시나포일-포도당으로부터 시나핀을 생성하기 위해 사용됨)과 같이 페닐프로파노이드 경로에서 전구체로 사용되는 화합물을 파괴할 수 있는 효소를 포함할 수 있다. 상기 방법의 한 가지 면에서, 효소는 페닐프로파노이드 경로에서 정상적으로 생성되는 산물에 대한 전구체로서 사용되는 화합물로부터 스트레스 보호 물질을 생성하는데 사용된다. 유사하게, 페닐프로파노이드 경로의 일부로서 생성되지 않고 페닐프로파노이드 경로의 산물 생성에 요구되는 추가적인 기질의 특이적 환원에 대한 효소 활성을 상기 산물의 양을 감소시키는데 사용할 수 있다. 따라서, 페닐프로파노이드 경로의 전구체로 사용되는 화합물 및 페닐프로파노이드 경로에서 산물의 생성을 위해 요구되는 임의의 다른 화합물 모두가 상기 방법의 범위 내에서 표적이 될 수 있다.
본 발명의 상황에서, 당 알코올 이차 대사 경로의 산물에 대한 전구체로 사용된 화합물은 미오-이노시톨, 갈락티놀 및 당의 UDP-유도체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 당 알코올 대사의 산물은 피트산, 스타키오스, 라피노오스, 수크로실 글리코시드, 우로나이드 및 펜토오스, 포스포이노시타이드 및 글리코포스포세라마이드를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 상황에서, 당 알코올 대사 화합물을 변화시키기 위해 사용된 효소 활성은, 정상일 경우 상기 당 알코올에 작용하는 효소 활성을 무력화시키는 히드록실화, 이성질화, 메틸화, 절단 또는 임의의 다른 생화학적 변형(결합 또는 격리)의 능력이 있는 효소 활성을 포함한다. 당 알코올 이차 대사에 한정된 본 발명의 예시에서, 피트산의 전구체인 이노시톨의 메틸화는 피트산 생합성에 대한 이노시톨의 이용도를 감소시키는 것으로 나타났다.
따라서, 이차 대사 최종 산물에 대한 전구체는 이차 대사 산물의 생성에 직접 사용되는 생화학적 물질이거나, 또는 생화학 반응에서 특이적인 이차 대사 산물의 생성을 유도하며 일차 대사 산물이 아닌 생화학적 물질이다.
이차 대사 경로에서 생성물의 전구체로 기능하는 화합물에 작용하거나 이를 표적으로 하는데 사용되는 효소는, 식물 세포에 무해하여 식물 세포의 특성을 변화시키지 않고 많은 양으로 축적될 수 있는 물질을 상기 화합물로부터 생성한다. 또한, 상기 효소는 식물 세포에 유익한 효과를 제공하는 물질을 생성할 수 있다. 이차 대사 경로 산물의 전구체로 사용되는 상기 화합물로부터 스트레스 보호제의 생성을 예로 들 수 있다. 또한, 상기에 사용된 효소는 산업 화합물, 제약 물질 또는 영양 물질과 같은 유용한 물질을 생성할 수 있다. 하나 이상의 효소가 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있고, 이차 대사 경로의 산물에 대한 전구체로 사용되는 특정 화합물의 함량을 감소시키기 위해 한 가지가 넘은 효소의 활성을 사용할 수 있다.
본 발명에 사용된 효소는 다양한 원천에서 다양한 방법으로 수득할 수 있다. 예를 들면, 당업계 숙련자는 본 발명의 범위 내에서 표적이 되는 이차 대사 경로의 전구체로 사용되는 화합물을 찾아낼 수 있다. 상기 화합물의 화학적 구조는 공지되어 있거나 확인할 수 있기 때문에, 화학적으로 유사한 물질에 대한 공지된 효소 활성을 확인하기 위해 상기 효소의 특성을 분석할 수 있다. 따라서, 적합한 효소를 찾아낼 수 있고, 해당 유전자를 단리하여 본 발명의 범위 내에서 사용할 수 있다. 추가로, 바람직한 활성을 갖으며 인공적으로 제조된 단백질을 찾아내는 조합 화학 또는 유사한 계획을 사용하여 합성 유전자를 수득할 수 있다. 본 발명의 범위 내에서 사용된 효소는 당업계에 흔히 공지된 방법을 사용하여 변형시킬 수 있다.
효소 변형의 한 가지 예를 들면, 이차 대사 경로에서 전구체로 사용되는 화학적으로 관련된 화합물에 작용하는 효소를 코딩하는 유전자는 위치-지정 변형, 돌연변이 및 이종 시스템(박테리아 또는 곰팡이 세포)에서 변화된 특이성의 선별과 같은 기술의 사용에 의해 활성이 증가되도록 변형 및(또는) 선택할 수 있다. 상기 화합물의 대사가 불가능한 박테리아에서 상기 변화된 효소를 코딩하는 유전자의 발현, 상기 효소를 발현하고 상기 화합물을 양분 또는 탄소원으로 이용하여 생장할 수 있는 박테리아의 선별, 및 이차 대사 경로에서 전구체로 사용되는 특정 화합물에 작용할 수 있는 효소 활성의 회수가 이에 포함될 수 있다. 상기 방식으로 특정 이차 대사에서 전구체로 사용되는 특정 화합물에 특이적인 효소를 생성할 수 있다. 다른 방법으로, 박테리아는 이차 대사에서 전구체로 사용되는 다양한 화합물을 이용하여 생장하는지 여부로 선별할 수 있다. 당업계 숙련자는 돌연변이 박테리아를 쉽게 알아볼 수 있고, 이차 대사 경로에서 전구체로 사용되는 특정 화합물을 포함하는 다른 세포는 상기 화합물을 무해한 물질로 전환시키는 특정 효소 활성을 확인하는 수단을 제공할 수 있다. 상기 접근 방법은 특정 효소 활성이 있는 세포를 직접 선별하거나, 원하는 효소 활성을 단계적으로 변화 및 선별할 수 있다.
유사하게, 펄프화 공정에서 리그닌을 분해할 수 있는 트리코더마 (Trichoderma) 곰팡이 추출물을 이용한 효소의 제조와 같이 현재 상업적으로 사용되는 공지된 효소 활성을 이용하는 것은, 예를 들면, 페놀계 화합물의 분해와 관련된 효소를 단리하는데 적합한 효소 활성의 원천을 제공할 수 있다. 펄프 산업에서 리그닌 공정에 사용되는 효소를 코딩하는 유전자가 직접 또는 변형되어, 본 발명의 범위 내에서 페닐프로파노이드 경로의 전구체로 사용되는 화합물에 특이적으로 작용하도록 사용될 수 있다는 것은 당업계 숙련자들에게 명백하다. 따라서, 다양한 효소 활성이 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있다는 것을 고려해야 한다. 그러므로, 상기 방법은 원천 또는 사용된 효소의 특이성에 제한되지 않는다.
예를 들면, 상기 방법의 한 가지 면에서, 식물 세포에서 발현되는 효소는 페닐프로파노이드 경로에서 전구체 또는 기질로 사용되는 화합물에 작용하여, 정상적으로는 페닐프로파노이드 경로에서 전구체로서 상기 화합물을 이용하는 효소를 무력화시키는 물질을 생성한다. 따라서, 페닐프로파노이드 경로의 특정 화합물의 함량은 상기 산물의 생성에 필요한 전구체의 감소를 통해 줄어든다. 결과로 생성된 식물 세포는 직접 사용되거나, 또는 상기 세포를 페닐프로파노이드 경로 산물의 함량이 변화된 전체 식물을 재생하도록 유도할 수 있으며, 상기 식물은 사료 가공, 펄프화 가공 또는 신규 페놀 화합물 조성(페닐프로파노이드 경로의 특정 산물의 과다 생산을 포함)을 갖는 식물의 생산을 포함한 많은 산업 공정에 유용하다. 페닐프로파노이드 산물의 함량이 변화된 나무는 펄프 및 종이 산업에 유용할 것이다. 페닐프로파노이드 산물의 함량이 변화된 식물은 사료 산업에 유용할 것이다.
또한, 상기 방법은 특성이 변화된 식물 세포 또는 조직, 특히 사료 가공 또는 다른 산업 공정에 사용되는 식물 조직의 회수 및 이용에 관한 것이다. 본 발명의 범위 내에서 고려되는 페닐프로파노이드 경로의 변화는 상기 방법으로부터 유래된 식물의 농경 수행, 특히 추가된 효소 활성에서 기인한 스트레스 보호제의 생성이라는 본 발명의 면에서 긍정적인 변화를 가져올 것이다. 질병 및 UV 내성, 기계적 강도 등과 같은 것도 다른 유익한 효과로 포함될 수 있다.
본 발명의 추가의 실시양태에서, 상기 방법은 식물 세포를 배양하여 페닐프로파노이드 경로의 산물이 변화된 식물을 회수하는 단계를 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 유용한 화합물, 동물 사료 제조 또는 펄프 제품의 생산과 같은 산업 공정에 상기 식물을 이용하는 것을 포함한다.
페닐프로파노이드 경로의 산물에 대한 전구체로서 사용되는 화합물에 작용할 수 있는 효소를 코딩하는 유전자는 자연상태에서 수득하거나 합성할 수도 있고, 또는 이들의 배합물일 수도 있다. 숙련된 종사자는 상기 유전자의 코딩 서열이 식물세포에서 높은 수준으로 발현되도록 변형될 수 있음을 쉽게 알 것이다. 이는 유전자가 발현될 식물세포에서 정상적으로 발견되는 코돈 이용도(codon usage)에 더 근접하게 상기 서열의 코돈을 변화시켜 수행할 수 있다. 게다가, 상기 코딩 서열의 편리한 조작을 위해 특이적 제한효소 부위를설계할 수 있음은 명백하다. 또한, 번역 인핸서(enhancer), 인트론 등과 같은 다양한 서열을 부가하면 코딩 서열의 적절한 발현이 보장됨을 고려해야 한다. 또한, 기질 결합 부위의 변화 또는 효소 활성을 증가시키는 일차 아미노산 서열의 변형에 의해 효소가 변형될 수도 있다. 상기의 모든 조작은 당업계에 통상적인 것이고, 숙련된 종사자는 쉽게 알 것이다.
본 발명의 다른 면에서, 효소는 조직 선택적 프로모터, 특히 종자-선택적 프로모터의 조절을 받는다. 종자-선택적 프로모터는 배타적 또는 우선적으로 그의 조절을 받는 서열을 식물 종자 조직에 한정되게 발현시킨다. 따라서, 페닐프로파노이드 경로의 특정 산물의 함량은 조직 선택적인 방식으로 변화되고, 다른 조직에서 상기 산물의 양은 정상적으로 유지된다. 상기 효소가 선택적으로 발현되는 조직은 사료 또는 임의의 다른 산업 공정상의 제조에 사용된다.
본 발명의 범위 내에서 임의의 수의 조직-선택적 프로모터가 사용될 수 있다는 사실은 숙련된 종사자에게 명백하다. 특히 종자-선택적 프로모터는, 종자 또는 종자 사료가 사료로 사용되는 농작물에서 페닐프로파노이드 경로의 산물을 변화시키는데 사용된다. 다른 농작물에서, 페놀 화합물의 함량을 변화시키고자 하는 식물의 부위에 따라 다양한 조직-선택적 프로모터를 사용할 수 있다. 예를 들면, 뿌리 또는 괴경-선택적 프로모터는 감자, 순무, 카사바 등과 같은 뿌리 또는 괴경 농작물의 페놀 화합물 또는 리그닌 함량을 변화시키는데 사용될 수 있다. 다른 조직-선택적 프로모터가 펄프용으로 수확되는 나무와 같은 식물에 사용될 수 있다. 따라서, 나무의 목재에 대한 효소 활성을 억제하는 프로모터는 본 발명 방법의 범위 내에서 유용하다.
본 발명의 특이적인 한 가지 면에서, 식물 세포에서 콜린-대사 효소의 코딩 서열을 발현시키는 것을 고려할 수 있다. 콜린의 대사 효소의 발현은 시나포일-포도당으로부터 시나핀을 생성하는데 이용 가능한 콜린의 풀을 고갈시킨다. 십자화(Cruciferae)과(family)의 종과 같은 어떤 식물 종은 시나핀이라 불리우는 영양에 유해한 화합물을 생성한다. 시나핀은 시나포일 포도당(sin-glu)의 포도당 잔기를 콜린으로 치환하여 합성된다고 믿어진다. 상기 영양에 유해한 화합물인 시나핀의 감소는 종자 및 그로부터 유래한 사료의 가치를 높여준다. 콜린 산화효소와 같이 콜린을 변형시키는 효소의 사용은 본 발명에 유용하다.
밀, 시금치, 사탕무 및 보리와 같은 식품용 식물에서 콜린이 베타인으로 산화된다(Rhodes 및 Hanson, 1993, Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 44:357-384)고 공지되어 있다. 상기 산화 경로는 두 가지 효소에 의해 촉매(일반적인 용어인 "콜린 산화 시스템"으로 공지됨)되고, 상기 경로의 산물은 하기에 나타나는 바와 같다.
콜린 → 베타인 알데히드 → 글리신베타인 (베타인)
첫 번째 단계는 박테리아 및 동물에서 콜린 탈수소효소(CDH) 또는 콜린 산화효소(COX)에 의해 촉매(Rozwadowski, Khachatourians 및 Selvaraj, 1991, Journal of Bacteriology, 173:472-478)되고, 식물에서는 콜린 일산화효소(CMO)에 의해 촉매(Rhodes 및 Hanson, 1993)된다. 두 번째 단계는 베타인 알데히드 탈수소효소 (BDAH)에 의해 촉매(Rhodes 및 Hanson, 1993)된다. 따라서, 콜린 대사 효소의 사용은 통상적인 또는 특이적인 방식으로 구성적, 유도적 또는 조직-특이적 프로모터에 의해 이용 가능한 콜린의 풀을 고갈시킨다. 콜린의 이용도를 감소시키는 것은 시나핀의 생성을 감소시킨다. 추가로, 시나핀의 감소는 페닐프로파노이드 경로의 다른 산물의 함량을 변화시켜, 식물 조직에서 변화된 페놀 화합물 함량을 유발할 수 있다.
본 발명의 다른 특이적인 실시양태에서, 미생물의 콜린 산화효소(COX) 유전자(Rozwadowski, Khachatourians 및 Selvaraj, 1991, Journal of Bacteriology, 173:472-478)는 종자 선택적인 프로모터의 조절을 받는다. 종자에서 콜린 산화효소의 발현은, COX 효소의 활성에 의해 콜린(카놀라 종자에서 시나핀 생합성의 전구체 중 하나임)을 무해한 물질인 베타인으로 전환한다. 상기 재조합 DNA를 포함하는 종자는 시나핀의 함량이 감소된 상태였고, 페닐프로파노이드 경로의 다른 산물의 함량이 변화된 상태였다. 상기 종자로부터 유래된 사료는 사료 가공에 유용하다.
본 발명의 다른 특이적 실시양태에서, 종자 선택적인 프로모터 및 이차 효소(BADH)의 조절하에 이용된 COX 유전자는 베타인 알데히드로부터 베타인의 생성을 증가시키기 위해 사용되었다. 상기 실시양태에서, BADH(Boyd, L.A., L. Adam, L.E. Pelcher, A. McHuhgen, R. Hirji 및 G. Selvaraj, 1990, Gene 103:45-52)는 종자-선택적 프로모터의 조절을 받아 발현되었다.
베타인은 많은 식품 및 사료 식물에서 먹을 수 있는 부분으로 발견되고, 어떤 경우에는 음식물 및 사료 첨가제로 사용된다. 또한, 베타인은 스트레스 보호제 기능을 제공한다.
본 발명의 다른 특이적 실시양태에서, 십자화과 식물 세포(Brassica sp.)에서 종자 선택적인 프로모터 및 이차 효소 BADH의 조절하에 사용되는 COX 유전자는 베타인 알데히드로부터 베타인의 생성을 보장하기 위해 사용된다.
십자화과 식물의 종자에서 콜린의 변화는 시나핀 함량을 감소시키고, 추가로 페닐프로파노이드 경로에서 다양한 산물의 함량을 변화시킨다. 종자에서 콜린 함량의 변화로 인해 시나포일 포도당 또는 다른 시나포일 화합물(예를 들면, 리그닌의 전구체인 시나프산의 함량을 변화시키는 시나포일 말레이트)의 함량이 증가된다고 믿어진다. 따라서, 통상 최종 산물 억제(end-product inhibition)라 불리우는 생화학적 조절 기작은 페닐프로파노이드 경로에서 다양한 산물의 함량을 변화시키게 된다. 따라서, 시나핀 생성의 억제는 페닐프로파노이드 경로에서 시나핀이 생성되는 마지막 단계 이전에 생성되는 다양한 산물의 양을 변화시킨다.
또한, 이차 대사인 페닐프로파노이드 경로에서는, 식물 세포에서 발현되며 페룰산에 작용하는 효소를 표적으로 할 수 있다. 페룰산은 페닐프로파노이드 경로의 다른 전구체이다. 따라서, 페룰산의 함량이 감소된다. 페룰산의 이용도를 감소시키면, 십자화과 식물에서 시나핀의 감소를 포함하는 페놀계 화합물의 감소를 유발한다. 숙련된 종사자는 유전자의 코딩 서열이 변형되어 식물 세포에서 높은 수준으로 발현될 수 있음을 쉽게 알 것이다.
본 발명의 다른 면에 따라서, 페룰산에 작용할 수 있는 효소를 코딩하는 유전자는 조직 선택적인 프로모터의 조절을 받는다. 따라서, 페룰산의 함량은 조직 선택적인 방식으로 변화되며, 다른 식물 조직은 정상 수준의 페룰산을 유지한다. 효소가 선택적으로 발현되는 조직은 사료, 식품 제조 또는 임의의 다른 산업 공정에 사용된다.
상기 실시양태에서 사용이 고려되는 효소는 페룰산을 변화시킬 수 있는 효소 및 특히, 페룰산으로부터 다양한 화합물을 생성하는 것으로 공지된 효소를 포함한다. 당업계 숙련자들에게는 다른 효소가 본 발명 방법의 범위 내에서 페룰산의 대사에 사용될 수 있음이 명백하다. 페룰산의 대사 활성이 있는 것으로 공지된 미생물에는 에어로박터 에스피(Aerobacter sp.), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 비 서프틸리스(B. subtilis), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 엔테로박터 에스피(Enterobacter sp.), 슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.), 스트렙토마이세스 에스피(Streptomyces sp.), 아스퍼길리스 에스피(Aspergillis sp.), 캔디다 에스피(Candida sp.), 푸사리움 에스피(Fusarium sp.), 한세눌라 에스피(Hansenula sp.), 페니실룸 에스피(Penicillum sp.), 로도토룰라(Rhodotorula sp.) 및 사카로마이세스 에스피(Saccharomyces sp.)를 포함한다. 상기 목록이 완벽하지는 않지만, 당업계에서 발견되는 페룰레이트 대사 효소의 많은 원천을 예시한다. 따라서 상기 방법은 페룰산의 대사에 사용되는 효소의 원천에 제한되지 않는다. 본 발명의 범위 내에서, 식물 세포에서 최적의 발현을 보장하기 위해 미생물의 코딩 유전자를 변형시키는 것을 고려해야 한다. 상기 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다.
상기 효소의 예로서, 비 푸물리스(B. pumulis)의 페룰산 탈카르복실화효소를 사용하였다. 상기 효소의 유전자를 단리하여 서열 분석을 수행 하였다(Zago et al., Applied and Environmental Microbiology 61:4484-4486, 1995). 추정되는 아미노산 서열은 그대로 유지시키면서, 상기 유전자 서열을 식물 유전자와 더 유사하게 변형할 수 있다. 상기 효소는 탈카르복실화에 의해 페룰산으로부터 비닐과이아콜을 생성할 수 있다. 따라서 상기 방법의 한 가지 예에서, 가치있는 화합물(비닐과이아콜, VG)은 페룰산에 작용할 수 있는 도입 유전자의 활성에 의해 제조되었다. 상기 효소는 추가의 보조 인자를 필요로하지 않고, 분자량이 약 22kda으로 적당했다.
본 발명의 다른 특이적 실시양태에서, 페룰레이트 탈카르복실화효소는 조직 특이적인 프로모터의 조절하에, 페룰산 대사가 조직특이적으로 변화된 식물을 생성하였다.
페룰산의 변화는 페룰산의 감소를 제공하였고, 추가로 페닐프로파노이드 경로의 다양한 산물의 양을 변화시켰다.
또한, 본 발명은 식물 조직, 특히 사료 또는 식품 가공에 유용한 식물 종자의 생성을 고려해야 한다. 종자를 직접 먹이는 것 및 가공된 종자로부터 변형된 사료를 사용하는 것 모두가 본 발명의 범위 내에 있다. 식물 종자에서 페놀 화합물 함량의 감소는 사료 가공에 바람직하고, 페놀 화합물 함량이 변화된 유전자적으로 변형된 종자, 특히 영양에 유해한 페놀 화합물 함량이 감소된 종자는 사료 산업에 매우 유용하다.
전체 또는 부분적으로 조작된 종자를 직접 먹이는 것 이외에, 종자 사료를 생산하는 많은 방법이 사용된다. 십자화과 식물의 종자에서 특히 중요한 것은, 십자화과 식물의 지방 종자에서 오일을 추출하는 동안 사료를 제조하는 것이다. 통상, 오일은 용매 또는 비-용매 공정을 통해 지방 종자로부터 추출한다. 상기 방법에 의해 생성된 케이크(cake) 또는 추출되고 남은 고형물은 사료의 제조용으로 사용될 수 있고, 통상 이는 십자화과 식물 종자의 페놀 화합물 함량의 대부분을 포함한다. 페놀 화합물의 함량이 낮은 사료의 제조 방법은 십자화과 식물의 종자로부터 유도된, 지금까지 알려지지 않은 신규 조성물을 제공한다.
본 발명은 페놀 화합물 함량이 변화된 사료 생성물을 수득하기 위해 상기 방법에 따라 제조된, 유전자적으로 변형된 종자의 사용을 고려하고 있다.
상기 기재된 방법은 식물의 형질을 변화시키는 많은 장점을 제공한다. 추가로, 상기 방법은 산업적으로 유용한 것으로 공지된 다양한 화합물을 제조하게 한다. 상기 기재된 방법은 임의의 식물 종 또는 식물 조직에서 유용하다.
상기 기재된 방법은 페닐프로파노이드 경로의 조작에 관련되고 공개된 기술에 많은 장점을 제공한다. 상기 방법은 식물 전체에서 효과가 나타나고 UV에 대한 감수성과 관련된 SIN1 돌연변이와 같은 방법에 의존하지 않는다. 상기 방법은 페닐프로파노이드 경로로부터 식물 유전자의 클로닝을 필요로하는 안티센스 RNA 또는 상호-억제와 같이, 유전자 발현을 방해하는 유전자적 기작을 사용하지 않는다. 상기 방법은 식물체 고유의 유전자는 어떤 것이라도 특이적으로 변형시키지 않는다. 따라서, 플라보노이드의 생성, UV 보호제의 생성, 질병 반응 관련성 및 다른 생화학적 기능과 같은 상기 경로의 다양한 기능은 유해하게 변화시키지 않는다. 조직 선택적인 프로모터의 사용에 의해, 페놀 화합물의 함량은 임의의 조직에서 변화될 수 있지만, 다른 식물 조직에서는 변화되지 않고 남아있다.
상기 기술된 방법은 많은 식물 종에서 유용하지만, 십자화과 식물에서 특히 유용하다. 상기 방법의 결과로서, 스트레스 보호제의 생성이나 도입된 효소 활성에 의한 가치있는 산업 화합물의 생성과 같은 부가의 장점이 제공된다. 페닐프로파노이드 경로에서 임의의 수의 단계가 상기 방법에 의해 표적이 될 수 있고, 다른 생화학적 경로가 유사한 방법으로 변형될 수 있음은 명백하다.
또한, 본 발명은 다른 이차 대사 경로의 변형에도 유용하다. 예를 들면, 본 발명의 한 실시양태에서는 당 알코올 대사가 변화된, 특히 종자 세포에서 피테이트 함량이 변화된 식물을 생성하기 위한 방법 및 DNA 조성물이 제공된다. 페테이트는 스타키오스, 라피노오스, 수크로실 글리코시드, 우로나이드 및 펜토오스, 포스포이노시타이드 및 글리코포스포세라마이드를 포함하는 다른 화합물의 생성에 전구체 또는 중간체로 기능하는 당 알코올인 미오-이노시톨로부터 유래한다. 추가로, 본 발명은 십자화과 식물의 종자에서 피테이트의 함량을 감소시키는 방법 및 DNA 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 사료 가공에 적합하도록 피트산 함량이 감소된 식물 종자, 변형된 사료의 제조에 적합하도록 피트산 함량이 감소된 식물 종자 및 이노시톨 대사가 변형된 식물 세포를 제공한다.
본 발명은 종자 세포에서 피테이트의 함량이 변화된 식물을 생성하기 위한 방법 및 DNA 조성물을 제공한다. 추가로, 본 발명은 외떡잎 식물, 쌍떡잎 식물, 지방 종자 및 십자화과 식물의 종자에서 피테이트를 감소시키기 위한 방법 및 DNA 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 사료 가공에 적합하도록 피트산 함량이 감소된 식물 종자, 변형된 사료의 제조에 적합하도록 피트산 함량이 감소된 식물 종자 및 이노시톨 대사가 변형된 식물 세포를 제공한다.
본 발명은 피트산 생합성에 대한 당 알코올 전구체인 미오-이노시톨에 작용하며, 상기 전구체가 대사적으로 전환되어 "말단 소멸" 대사가 되게 하거나 대사가 원활하게 일어나지 않아서 식물 세포에 무해하게 축적될 수 있게하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 고려하고 있다. 상기 방식으로 피트산 생합성을 감소시켰다. 다른 당 알코올도 본 발명에 기재된 방법에 의해 표적이 될 수 있다. 미오-이노시톨을 표적으로하는 효소는 미생물, 동물 또는 식물에서 기원할 수 있다. 상기 효소는 자연발생적일 수도 있고, 또는 기질 특이성을 변화시켜 신규 효소 활성을 갖도록 공지된 효소의 돌연변이에 의해 유래될 수 있다.
바람직하게, 미오-이노시톨에 작용하도록 사용된 효소는 식물 세포에 무해한 화합물을 생성하기 때문에, 많은 양이 축적되더라도 식물 세포에 유해한 효과를 나타내지 않는다. 하나 이상의 효소가 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있고, 미오-이노시톨의 함량을 감소시키기 위해 한 가지가넘는 독특한 효소 활성이 사용될 수 있다.
본 발명의 범위 내에서 사용된 효소는 이성질화, 접합, 인산화, 히드록실화, 메틸화 또는 임의의 다른 유사한 생화학적 활성에 의해 미오-이노시톨을 변형시킬 수 있거나, 또는 미오-이노시톨 또는 다른 당 알코올을 제거할 수 있는 효소를 포함할 수 있다.
본 발명의 범위 내에서 사용된 효소는 무수한 원천 또는 다양한 방법에 의해 유래될 수 있다. 예를 들면, 당업계 숙련자는 화학적으로 유사한 기질에 대한 공지된 활성을 갖는 효소를 확인할 수 있다. 따라서, 상기 효소를 동정하고 유전자를 단리하여 본 발명의 범위 내에서 사용할 수 있다. 본 발명의 범위 내에서 사용되는 효소는 당업계에 흔히 공지된 방법을 이용하여 변형시킬 수 있다.
추가로, 상기 방법은 상기 효소를 코딩하는 유전자를 식물 세포에 도입하는 형질전환을 사용한다. 식물 세포에 형질전환시키는 것은 다양한 수단에 의해 수행된다. 통상적으로 유용한 방법은 에이 투미파시엔스(A. tumifaciens) 및 에이 리조게네스(A. rhyzogenes)의 플라스미드가 이원체 또는 함께 삽입된 형태의 아그로박테리움(Agrobacterium) 기재 시스템(예를 들면, US 4,940,838호 및 US 5,464,763호), 바이오리스틱(biolistic) 접근법(예를 들면, US 4,945,050호, US 5,015,580호 및 US 5,149,655호), 미세주입(예를 들면, US 4,743,548호), 프로토플라스트(protoplast)에 의한 DNA의 직접 주입(예를 들면, US 5,231,019호 및 US 5,453,367호) 또는 바늘형 휘스커(whisker)(예를 들면, US 5,302,523호)를 이용한 형질전환을 포함한다. 유전자적으로 식물 세포를 형질전환시키는 임의의 방법이 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있다.
또한, 상기 방법은 특성이 변화된 식물 세포 또는 조직, 특히 사료용 식물 종자 조직의 회수 및 용도에 관한 것이다.
따라서, 당 알코올 대사가 변화된 식물 세포를 수득할 수 있다. 무수한 화합물이 당 알코올로부터 유래하지만, 일차적으로 중요한 것은 피트산 또는 피테이트이다. 특정 식물 세포에서 피테이트를 감소시키는 방법은 사료 가공에 매우 유용하다.
미오-이노시톨에 작용할 수 있는 효소를 코딩하는 유전자는 자연상태에서 수득하거나 합성할 수도 있고, 또는 이들의 배합물일 수도 있다. 숙련된 종사자는 상기 유전자의 코딩 서열이 식물세포에서 높은 수준으로 발현되도록 변형될 수 있음을 쉽게 알 것이다. 이는 유전자가 발현될 식물세포에서 정상적으로 발견되는 코돈 이용도(codon usage)에 더 근접하게 상기 서열의 코돈을 변화시켜 수행할 수 있다. 게다가, 상기 코딩 서열의 편리한 조작을 위해 특이적 제한효소 부위를설계할 수 있음은 명백하다. 또한, 번역 인핸서(enhancer), 인트론 등과 같은 다양한 서열을 부가하면 코딩 서열의 적절한 발현이 보장됨을 고려해야 한다. 상기의 모든 조작은 당업계에 통상적인 것이고, 숙련된 종사자는 이를 쉽게 알 것이다.
또한, 피트산이 만들어지는 종자 조직과 같은 특정한 조직에서만 미오-이노시톨이 변형되게 할 수 있도록 효소의 발현을 제한하기 위해 조직-선택적 프로모터를 사용할 수 있음은 명백하다. 적합한 종자 선택적 프로모터는 브라시카 나푸스 (Brassica napus)에서 유래한 나핀 프로모터, 파세올리스(Phaseolis)에서 유래한 파세올린 프로모터, 또는 종자-선택적인 임의의 다른 프로모터를 포함한다.
특히, 메셈브리안테뭄 크리스탈리눔(Mesembryanthemum crystallinum)으로부터 입수가능한 미오-이노시톨 O-메틸 전이효소를 사용하는 것이 본 발명의 범위 내에서 고려된다.
본 발명은 미오-이노시톨에 작용할 수 있는 효소의 발현으로부터 생성된, 유전자적으로 변형된 종자의 사용을 고려하고 있는데, 이 때 상기 효소는 종자 선택적 프로모터의 조절을 받는다. 따라서, 피트산의 함량이 감소된다. 종자의 조작 과정에서, 사료 생성물은 피트산 함량이 감소된 상태로 제공된다. 따라서, 상기 방법의 결과로 피트산 함량이 감소된 사료를 수득할 수 있다.
본 발명은 피트산 함량이 감소된 십자화과 식물 종자의 제조 방법을 제공한다. 특히, 메셈브리안테뭄 크리스탈리눔(Mesembryanthemum crystallinum)에서 유래한 미오-이노시톨 O-메틸 전이효소를 사용하는 것이 본 발명의 범위 내에서 고려된다. 당업계 숙련자는 본 발명의 결과로서 십자화과 식물의 종자로부터 피트산 함량이 감소된 사료를 제조할 수 있음을 알 것이다.
피트산이 존재하는 종자 사료는 수생 양식하는 물고기에게 유해하다는 것이 공지되어 있다. 그러나, 카놀라 종자 사료와 같은 어떤 종자 사료는 물고기의 영양에 적합한 단백질 조성을 갖는다. 고농도의 피트산은 물고기 사료로 사용될 수 있는 카놀라 사료의 양을 제한한다. 따라서, 십자화과 식물의 종자로부터 제조된, 피트산 함량이 낮은 사료는 수생 양식에 매우 유용하다.
따라서, 본 발명은 피트산 함량이 변화된 종자 및 피트산 함량이 감소된 종자 사료의 제조에 유용하다. 변형된 종자 및 사료는 가금, 돼지, 수생 양식 동물, 반추 및 비-반추 동물을 포함하는 다양한 동물의 사료 가공에 매우 유용하다. 추가로, 본 발명의 범위 내에서 미오-이노시톨의 변형을 위해 임의의 수의 다른 효소를 사용할 수 있음은 명백하다. 또한, 종자-선택적인 프로모터를 사용하는 상기 효소들의 다양한 조합이 피트산를 감소시키기 위해 사용될 수 있음은 명백하다.
당 알코올 이차 대사에 본 발명을 사용하는 것은 예시된 식물 종에 제한되지 않는다. 실제로, 피트산을 생성하는 임의의 식물 종이 본 발명의 방법에 의해 변형될 수 있다. 상기 방법은, 이에 사용되는 O-메틸 전이효소가 상업적으로 중요한 모든 주요 농작물에 이종이기 때문에 임의의 농작물 종에서 유용하다. 따라서, 동물 사료로 사용되거나 종자의 일부 또는 전체가 동물 사료로 사용되는 임의의 농작물 종은 본 발명의 방법에 의해 피트산 함량이 감소된 식물로 변형될 수 있다. 따라서, 상기 방법은 외떡잎 식물(예를 들면, 옥수수, 벼, 밀, 보리 및 호밀) 및 쌍떡잎 식물(예를 들면, 콩, 목화, 알팔파, 브라시카(Brassica), 아마 및 해바라기 등)을 포함하는 임의의 농작물에 적용될 수 있다.
페닐프로파노이드 및 당 알코올 대사의 변형은, 특정 대사 화합물(특히, 영양에 유해한 화합물)을 감소시키는 방법을 예시하는 본 발명의 방법에 의해 성취될 수 있고, 본 발명의 방법에 따른 믿을 수 있고 예측가능한 방식으로 성취될 수 있다.
임의의 이차 대사 경로가 본 발명의 범위 내에서 변화될 수 있다는 사실은 당업계 숙련자들에게 명백하다. 본 발명은 서로 무관한 두 가지 대사 경로에서 설명되었으며, 예측가능하고 명백한 결과를 제공하였다. 본 발명의 주요 교시사항하에서, 예를 들면, 카놀라 식물 세포, 옥수수 식물 세포, 벼 식물 세포 및 목화 식물 세포에서 영양에 유해한 물질을 감소시켰다.
숙련된 종사자는 특정 이차 대사 산물의 생성을 본 발명 방법의 일부분으로서 평가하게 된다. 따라서, 당업계 숙련자는 산물이 생성되는 발생학적 시간 골격 뿐만 아니라, 이차 대사 산물 또는 그의 전구체로 사용되는 화합물이 합성되는 조직에 대한 기본적인 이해가 필요함을 알 것이다. 상기 정보를 이용하여 이차 대사 산물 또는 그의 전구체에 작용하는 효소의 발현을 조절하기 위한 프로모터를 선택할 수 있다. 상기 방식에서, 조직이 생성되는 발생학적 시간 동안에, 이차 대사 산물이 만들어지는 조직에서 상기 이차 대사 산물에 대한 전구체에 작용할 수 있는 효소가 이차 대사 산물을 표적으로 하는데 필요함을 당업계 숙련자는 쉽게 알 것이다. 따라서, 상기 이차 대사 산물에 대한 전구체에 작용하는 효소는 상기 전구체가 합성되는 바로 그 시간 또는 그 부근의 시간에 발현되어야 한다.
추가로, 숙련된 종사자는 본 발명이 실행되는 조직에 대한 생화학적 분석을 하게된다. 상기 분석은 발생시 조직 내의 다양한 화합물의 함량 측정, 생합성의 구획화 또는 세포내 위치 지정, 발생시 상기 화합물이 처음으로 합성되거나 더 이상 합성되는 않는 기간의 측정, 및 임의의 다른 생화학적 정보 분석을 포함할 수 있다. 상기 분석을 통하여, 당업계 숙련자는 식물 조직에서 이차 대사 산물의 함량이 원하는 정도로 변화되도록 적당하게 발현시켜 줄 프로모터를 선택할 수 있게된다. 심지어는 전구체로 사용되는 화합물이 적은 함량 변화하더라도 원하는 효과를 제공할 수 있음을 알아야 한다.
예를 들면 본 발명의 피트산 실시양태의 일부분으로서, 피트산이 생성되는 발생학적 시간 골격 뿐만 아니라, 피트산이 합성되는 조직에 대한 기본적인 이해를 통해 미오-이노시톨에 작용하는 효소의 발현을 조절하기 위한 프로모터를 선택한다는 것을 당업계 숙련자는 쉽게 알 것이다. 상기 방식에서, 피트산이 생성되는 발생학적 시간 동안에, 피트산이 만들어지는 조직에서 미오-이노시톨에 작용할 수 있는 효소가 미오-이노시톨을 표적으로 하는데 필요함을 당업계 숙련자는 쉽게 알 것이다. 따라서, 미오-이노시톨에 작용하는 효소는 피트산이 합성되는 바로 그 시간 또는 그 부근의 시간에 발현되어야 한다. 상기 효소의 발현량은 특정 수준의 피트산 감소를 위해 변화될 수 있다. 상기 감소량은 미세한 비율의 변화에서부터 거의 모든 피트산이 감소되는 양일 수 있다. 피트산 함량이 더 낮은 농작물 종에서 피트산을 감소시키는 것보다는 피트산 함량이 높은 농작물 종에서 피트산의 함량을 감소시키는 경우에, 미오-이노시톨을 변형시키는 유전자가 더 높은 수준으로 발현되어야 함을 당업계 숙련자는 쉽게 알 것이다. 다양한 수단에 의한 발현량의 조작은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 번역을 증가시키는 DNA 서열의 부가, 전사 수준을 높여주는 강력한 프로모터의 사용, 또는 세포 간질 부착 영역 또는 골격 부착 영역과 같은 DNA 서열(이식된 유전자의 전사를 높여줌)의 부가를 포함한다.
또한, 본 발명의 실시양태는 식물 조직, 특히 사료 가공에 유용한 식물 종자의 생산을 고려하고 있다. 종자를 직접 먹이는 것 및 가공된 종자로부터 변형된 사료를 사용하는 것 모두가 본 발명의 범위 내에 있다. 식물 종자에서 피트산 함량의 감소는 사료 가공에 바람직하고, 피트산 함량이 변화된 유전자적 변형 종자는 사료 산업에 매우 유용하다.
어떤 적용 방법에서는, 곡물 전체가 동물을 먹이는데 사용되거나 곡물을 최소한 가공하여 분류하지 않고 사용될 수 있다. 예를 들면, 옥수수 곡물은 최소한으로 가공하여 사료로 사용될 수 있다. 그러나, 어떤 옥수수 곡물은 옥수수 글루텐과 같은 가공물로 가공하여 동물 사료로 사용한다. 상기 두 가지 모두의 옥수수 사료는 동물에서 배설된 과량의 포스페이트에 의한 환경 파괴와 관련된 피트산의 함량을 감소시키기 때문에 매우 유용하다. 밀, 보리 및 귀리와 같은 다른 사료용 곡물은 본 발명의 방법에 의해 유용해진다. 따라서, 본 발명은 경제적으로 중요한 다양한 농작물 종에 유용하다. 미오-이노시톨의 함량을 변화시키기 위해 본 발명에서 사용된 유전자는, 모든 농작물 종에서 미오-이노시톨이 발견되고 상기 미오-이노시톨이 피트산 생합성의 유일한 전구체이기 때문에 임의의 농작물 종에서 사용할 수 있다. 따라서, 미오-이노시톨의 변화를 위해 사용된 메틸-전이효소 유전자의 이용은 명백히 주장되어 왔다. 코딩 영역의 코딩 서열, 또는 프로모터 또는 번역되지 않는 리더 서열, 종결자 등의 특이적 DNA 서열은 특정 식물 종의 세포에서 최적의 발현을 위해 변형될 수 있다. 이는 모두 당업계의 기술 범위 내에 있다. 따라서, 곡물이 직접 사료 가공에 사용되거나 곡물이 조작된 후 사료 가공에 사용되는 식물 종을 포함하는, 유전자적으로 형질전환 가능한 임의의 식물 종에서 본 발명을 수행할 수 있다.
따라서, 피트산 함량이 감소된 종자 전체를 이용한 사료 제조는 상기 방법의 결과로 수득할 수 있다.
전체적 또는 부분적으로 파쇄된 종자를 직접 사료로 사용하는 것 이외에, 종자 사료의 제조에 사용되는 많은 방법이 있다. 옥수수의 습식 밀링(milling) 공정은 다른 것보다 옥수수 글루텐 사료의 제조에 사용된다. 가공된 옥수수 사료 뿐만 아니라 피트산 함량이 감소된 전체 옥수수 곡물도 본 발명의 방법에 따라 제조할 수 있다.
옥수수와 같은 주요 사료 농작물 이외에, 지방 종자 농작물도 사료로 사용되는 많은 양의 식물 사료를 제공한다. 지방 종자에서 특히 중요한 것은 오일을 추출하는 동안 사료를 제조하는 것이다. 통상, 오일은 용매 또는 비-용매 공정을 통해 지방 종자로부터 추출한다. 상기 방법에 의해 생성된 케이크(cake) 또는 추출되고 남은 고형물은 사료의 제조용으로 사용될 수 있고, 통상 이는 종자 피트산 함량의 대부분을 포함한다.
지방 종자를 가공하는 가장 흔한 방법은 오일 추출 및 이후에 케이크나 종자의 잔여 성분을 회수하는 것과 관련되어 있다. 본 발명은 상기 공정에 유용하고, 결과로 생성된 사료는 피트산 함량이 낮아졌기 때문에 종래에 제조된 사료보다 더 가치있다.
따라서, 피트산 함량이 낮은 사료를 제조하는 방법은 지방 종자로부터 유래한 사료에서 현재까지 알려지지 않은 신규 조성물을 제공한다. 본 발명에 의해 유익하게 될 주요 지방 종자 농작물은 브라시카 나푸스(Brassica napus), 브라시카 라파(Brassica rapa), 브라시카 준세아(Brassica juncea), 브라시카 니그라(Brassica nigra), 시나피스 알바(Sinapis alba), 크람베(Crambe), 에루카 사티바(Eruca sativa), 및 상업적으로 유용하고 사료 제조에 사용될 수 있는 다른 십자화과 식물의 지방 종자와 같은 십자화과 식물의 지방 종자 농작물을 포함한다. 콩, 목화, 옥수수, 홍화, 해바라기 및 땅콩을 포함하는, 십자화과 식물이 아닌 지방 종자도 종종 사료 가공에 사용한다.
본 발명은 종자 선택적 프로모터의 조절하에 미오-이노시톨에 작용할 수 있는 효소의 발현으로부터 생성된, 유전자적으로 변형된 지방 종자의 사용을 고려한다. 따라서, 피트산의 함량은 감소한다. 지방 종자의 조작에서, 사료 생성물은 피트산 함량이 감소한다.
하기의 실시예는 본 발명의 방법을 예시하는 것이고, 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
〈실시예 1〉 페닐 프로파노이드 경로의 산물을 확인하기 위해 통상적으로 사용하는 방법: 십자화과 식물의 종자에서 시나핀 함량 측정 및 페닐프로파노이드 경로의 최종 산물의 판단
당업계 숙련자는 분석 화학에 공개된 무수한 문헌을 참고로 페닐프로파노이드 경로의 산물을 측정하기 위한 상기 예시된 모든 방법을 적용할 수 있다. 예시된 첫 번째 방법에서, 식물 조직(즉, 십자화과 식물의 종자 조직)에서 공개된 방법(Chapple, C.C.S., T. Vogt, B.E. Ellis 및 C.R. Somerville, 1992, Plant Cell 4:1413-1424)을 통해 시나핀을 확인하기 위한 단순한 분석을 수행하였다. 페닐프로파노이드 경로의 산물인 시나핀을 측정하기 위해 박층 크로마토그래피 (thin layer chromatography, TLC) 프로토콜을 표준화시켰다. 상기 방법을 식물 추출액의 분리를 위해 사용하였고, 정해진 양의 시나핀을 실리카 플레이트(예를 들면, Whatman 60A silicaG)에 스팟(spot)으로 찍었다. 시나핀은 공개된 방법(D. Strack, 1977, Z. Pflanzenphysiol. 84: 139-145)에 의해 정제할 수 있다. 시작점으로부터 약 10cm 떨어진 곳에서 n-부탄올, 아세트산 및 물이 각각 10 대 2 대 3으로 섞인 용매 혼합물의 이동에 의해 분리하였다. 종자 추출물은 미리 중량이 측정된 시료를, 100 내지 500㎕의 메탄올 용액(98% 메탄올 및 2% 아세트산)이 들어있고 뚜껑이 꽉 닫혀있는 튜브에 밤새 담그고, 상기에 가한 부피와 동량의 메탄올을 가한 후 분쇄하여 제조하였다. 약 12,000 x g로 원심분리한 후 상층액을 수집하였다. 상층액을 클로로포름 400㎕ 및 물 100㎕의 혼합물(CW)로 추출하고, 상기와 같은 방식으로 원심분리하여 지질상을 제거하고, 수상을 공기중에서 건조 후 진공에서 건조시켰다. 시료를 물에 용해시킨 후 TLC 플레이트에 스팟으로 찍었다. 상승 용매에 노출시키기 전에, 경험상 측정된 정해진 양의 시료를 TLC 플레이트에 스팟으로 찍었다. 건량 측정치는 건조 후에 알려진 양의 신선한 시료의 무게를 측정하여 수득하였다.
상기 TLC 플레이트를 UV광하에서 관찰하면 시나핀은 밝은 스팟으로 가시화된다. 앞서 정제한 시나핀 시료를 단독으로, 또는 인공적으로 종자 추출물과 혼합된 형태로 사용하여, 종자 추출물에 시나핀 성분이 존재하면 추출물 내의 시나핀과 정제된 시나핀의 이동 정도가 일치하기 때문에 이를 표준으로 이용하였다. 방사성 표지된 시나핀을 모니터할 때는, TLC 플레이트를 방사능의 방출을 양적인 이미지로 만드는 앰비스4000(Ambis4000, 스캔 분석기) 스캐너로 스캐닝하였다.
이어서, 고압 액체 크로마토그래피(high pressure liquid chroamtography, HPLC)를 사용하여 시나핀의 함량을 측정하였다. 상기와 같이 추출하여 클로로포름과 물로 추출하지 않은 식물의 메탄올 추출물을 뉴클레오실(Nucleosil) C18AB 컬럼에 맞는 가변 HPLC 장치로 분석하였다. 통상 주입 부피는 10㎕이었고, 이동상은 용매 A(물 중의 2% 아세트산) 및 용매 B(아세토니트릴 중의 2% 아세트산)의 혼합물이었다. 통상의 가동 조건은 이동상과 관련되는데, 본 실시예에서는 17분 동안 용매 A를 90%에서 80%로 변화시킨 후, 1분 동안 추가로 10% 떨어뜨렸다. 컬럼은 10%의 용매 A에서 4분 동안 유지하고 나서, 상기 용매를 제거하고 90%의 용매 A로 평형화시켰다. 용출되는 기질을 더 잘 분리하기 위해서 상기 조건을 변화시킬 수 있다. 예를 들면, 90%의 용매 A 대신에, 처음에는 80%로 15분 동안 처리하고 70%로 15분 동안 처리한 후 10%로 2분 동안 처리 및 10%로 추가의 2분 동안 처리하고 나서 90%로 평형화시킬 수 있다. UV의 흡광도를 모니터하기 위해 다이오드 정렬 검출기(diode array detector)를 사용하였다. 시료 분석을 위해 330nm로 지정된 UV 흡광도를 사용하였다. 정제된 시나핀을 사용하여 표준 곡선을 작성하였고, 식물 추출물에서 시나핀을 정량화하는데 이를 사용하였다. HPLC 조건(예를 들면, 용매의 비율 및 구배, 상이한 유형의 용매)이 변화될 수 있음은 당업계 숙련자들에게 명백하다. 측정 장비 및 해당 시료의 복잡성을 기초로 적합한 조건을 결정하는 것이 바람직하다. 공개된 문헌에 의하면, 시나핀을 포함한 페놀계 화합물을 분석하기 위한 HPLC 방법은 다양하다.
방사성 추적자 연구(radioactive tracer study)를 사용하여 더 정밀한 시나핀 합성의 징후 및 종자의 다양한 부분에서 새로이 합성된 시나핀의 비율을 측정하였다. 또한, 방사성 추적자 방법은 외부에서 제공되는 콜린으로부터 시나핀을 합성하는 개개의 종자 성분(예를 들면, 떡잎, 배 및 종피)의 능력을 측정하는데 사용할 수 있다. 방사능 표지된 산물은 TLC 분석에 이은 앰비스400 스캐닝과 같은 방법에 의해 시나핀 분석에 사용할 수 있다.
종자 및 종자 성분 중의 전체 시나핀 함량을 정량분석하기 위해 HPLC를 사용하였다. 종자의 다양한 발생 단계에서 시나핀 함량의 정량분석을 위해 TLC를 사용하였고, 방사성 추적자 분석을 TLC 분석과 병행하고 방사성 스팟을 계수하여 종자 및 종자 조직(떡잎, 축 및 종피)에서 시나핀의 분포 및 시나핀 합성의 징후를 측정하였다.
가능한 생체내 조건을 대표하는 상태로 실험하기 위해 전체 꼬투리(장각과), 오히려 단리된 종자를 사용하여, 콜린으로부터 시나핀의 새로운(de nove) 합성을 확증하는 방사성 추적자 방법을 수행하였다. 제어된 조건(통상, 낮의 온도가 20℃이고, 밤의 온도가 15℃이며, 낮 16시간과 밤 8시간이 주기임)하에서 배양하던 식물로부터 다양한 발생 단계의 장각과를 수득하였다. 장각과의 꽃자루 부분을 뉴 잉글랜드 뉴클리어(New England Nuclear)사로부터 구입한14C로 표지된 콜린(원액의 활성도는 2.0GBq/mmol이고, 농도는 0.2mCi/ml과 동일한 7.4MBq/ml이며, 콜린은 3.7μmol/ml임)이 포함된 용액에 담궜다. 꽃자루가 있는 장각과를 1.8ml의 수성 배지(예를 들면, 절반-강도의 무라시게-스쿠그(Murashige-Skoog) 배지)가 들어있는 튜브에 담그고, 1mM의 비-방사성 콜린 및 1.8 내지 9㎕의 방사성 콜린 원액을 20℃에서 24 내지 72시간 동안 낮 16시간과 밤 8시간의 주기로 자라는 식물의 배양 용기에서 인큐베이션하였다. 광 조건은 초당 51마이크로아인슈타인/sq.m이었고, 종자를 꼬투리로부터 분리하여 TLC로 분석하였다. 상기 시료를 메탄올 용액에서 ㅊ출하고 나서, 클로로포름 및 물(CW)로 상기에 기재된 바와 같이 추출하였다.
오래된 종자를 분석할 때는, 상기 방법 이외에 장각과에서 분리된 종자를 침윤시켰다. 약 23℃의 상온에서 15분 동안 가벼운 진공하에서, 20개의 종자를 상기 기재된 방사성 콜린 배지 500㎕로 침윤시켰다. 이어서, 방사성 배지를14C-콜린이 적은 상기 조성의 비-방사성 배지 500㎕로 교체하고, 23℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이어서, 종자를 상기와 같이 추출하였다.
또한 식물은 클로로포름, 메탄올 및 포름산이 각각 5 대 12 대 3의 비율로 섞인 혼합물(CMF)로 추출할 수 있다. 통상 시료 1mg 당 CMF 1㎕를 가하고, 상기 시료를 분쇄하여 상온(21 내지 23℃)에서 밤새(16시간) 방치한 후, 약 12,000 x g로 5분 동안 원심분리한다. 상층액은 수집하고, 펠릿은 상기와 동일한 부피의 CMF를 가하여 20분 동안 방치한 후, 상기와 같이 원심분리 한다. 상층액을 수집하고, 상기 기재된 바와 같이 클로로포름 및 물(CW)로 추출한 후, 수성 분획을 상기와 같이 분석하였다.
〈실시예 2〉 특정 조직에서 페닐프로파노이드 경로의 산물이 합성되는 위치 확인
본 실시예에서는, 페닐프로파노이드 경로의 산물이 합성되는 발생 시기를 결정하였다. 상기 특별한 실시예는 시나핀 합성 및 십자화과 식물의 종자 조직에의 축적을 예시한다. 본 실시예에서는, 브라시카 나푸스(Brassica napus)의 발생중인 종자를 사용하였다. 손으로 수분시킨 꽃으로부터 수득한 장각과 추출물의 TLC 분석하여 시나핀 축적의 징후가 나타나는 시간을 측정하였다. 수분후 경과된 날짜(DAP)가 7, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 및 34일인 시료와 성숙한 종자 시료를 채취하였다. 종자 추출물은 실시예 1에 기재된 방법에 따라 제조하였고, 시나핀 함량은 TLC 분석에 의해 가시화하였다. 18 DAP부터 성숙한 종자까지 시나핀의 존재를 확인하였고, 성숙한 종자가 가장 많은 시나핀을 함유하고 있었는데, 이는 발생중인 종자에 순 축적이 있음을 의미한다.
종자가 제거된 꼬투리 벽 분획은 시나핀을 함유하지 않았고, 수분후 경과한 날짜가 7,14 및 16일인 시료와 같은 어린 종자에서는 시나핀이 존재하지 않았다. 만약 존재한다면 아주 적은 양이라도 검출할 수 있는 상기 방법은 UV 형광 검출법을 사용하기 때문에, 어린 종자에서 전혀 검출되는 않는 결과를 보이는 상기 분석은 수분후 경과된 날짜가 약 18일인 종자에서 시나핀의 축적이 나타남을 의미한다. 도 3은 28 DAP까지의 시료에 대한 TLC 분석의 예를 보여주고, 두 번째 플레이트는 성숙한 종자까지의 시료에 대한 TLC 분석의 예를 보여준다. 상기 분석 결과가 정량화되지 않았기 때문에, 실시예 1에 기재된 메탄올 용액으로 수득한 전체 종자 추출물에 대한 HPLC 분석을 수행하였다. 도 4에 나타난 상기 결과는, 시나핀 합성의 징후가 20 DAP부터 빠르게 증가하여 종자가 성숙할 때까지 계속됨을 확인해준다. 성숙한 종자의 시나핀 함량은 종자 건량을 기준으로 약 0.8%이었고, 오일이 종자의 약 45%를 차지하기 때문에, 이는 약 1.5%의 탈지 종자 사료로 변형될 것이다.
〈실시예 3〉 페닐프로파노이드 경로로의 산물이 합성되는 시간적 및 공간적 국면의 결정 - 종자 발생에 관련된 시나핀 합성
실시예 2에서 수득한 정보를 기초로, 시나핀이 발생중인 종자에서 합성됨을 추가로 확인하였다. 또한, 시나핀의 분해는 종자의 발생시 최소임은 분명하다. 상기 분석을 확인하기 위해, 식물의 페닐프로파노이드 경로에서 마지막 단계에 시나포일-포도당으로부터 시나핀을 합성하는데 사용되는 전구체인14C-콜린과 함께 발생중인 종자를 인큐베이션하였다. 방사성 전구체의 존재는 방사능으로 표지된 시나핀의 생성을 초래하였다. 따라서, 상기 방법에 의한 시나핀의 생합성을 정량화할 수 있다. 도 5에 도시된 바와 같이, 시나핀의 합성(시나핀으로14C-콜린의 혼입)은 10 DAP에서 검출할 수 없었고, 처음으로 14 DAP에서 나타났다. 따라서, 시나핀 합성(즉, 전구체인 시나포일-포도당 및 콜린으로부터 최종 산물인 시나핀의 생성)은 14 DAP부터 거의 성숙한 종자에서 발생한다. 그러므로, 종자에서 시나핀 축적의 징후는 14 DAP 이후에 나타나고, 발생중인 종자는 시나핀을 계속 합성하여 성숙할 때까지 축적한다.
비록 비-방사성 분석에서는 18 DAP의 종자에서 시나핀의 축적이 가시화되는 시기로 나타나지만, 방사성 분석은 감응성이 좋아서 생합성의 양이 매우 적더라도 검출가능하다. 따라서, 방사성 분석에 나타난 바와 같이, 시나핀 합성은 약 14 DAP의 종자에서 처음으로 시작한다. 침윤 연구 결과, 오래되고 거의 성숙한 종자에서 시나핀을 합성하는 역량이 존재함을 알았다(도 6).
페닐프로파노이드 경로의 산물이 축적되는 발생학상의 시기를 결정하는 것 이외에, 당업계 숙련자는 추가로 페닐프로파노이드 경로의 산물을 생합성하는 조직 특이성을 결정할 수 있다. 본 실시예의 상기 부분에서, 떡잎, 축 및 종피에서의 시나핀 축적을 측정하였다. 18 내지 24 DAP의 장각과 종자를 사용하여 방사성 추적자 분석을 수행하였다. 절개된 장각과의 꽃자루를14C-콜린이 함유된 용액에 24 내지 72시간 동안 담그고, 종자의 세 가지 성분을 절개하여 시나핀 분석을 수행하였다. 도 7에 요약된 상기 분석의 결과, 떡잎이 시나핀을 최대로 함유(종자 당)하고 있으며 그 다음에 축 및 종피의 순으로 함유함을 알았다. 25 DAP로부터 성숙한 종자의 떡잎 및 축으로부터 수득한 시나핀 추출물을 건량 기준으로 분석한 결과, 축은 떡잎이 함유한 시나핀의 약 50%를 함유함을 알았다(도 8). 그러나, 축에 비해 떡잎은 상대적으로 질량이 크기 때문에(성숙한 종자의 경우 축 중량의 약 6배), 종자의 떡잎에서 발견되는 시나핀은 전체 시나핀의 최대 90%를 차지할 수 있다(도 9).
〈실시예 4〉 페닐프로파노이드 경로의 전구체에 작용할 수 있는 효소를 코딩하는 유전자로의 식물의 유전자적 형질전환
본 실시예는, 시나핀 합성에 사용되는 전구체에 작용하는 콜린 산화효소 (COX)라는 효소를 식물세포에서 발현시켰다. 종자-선택적 프로모터의 조절하에 식물 형질전환용 벡터에 콜린 산화효소를 삽입하였다. 콜린은 시나포일-포도당으로부터 시나핀을 생성하는 전구체이므로, 콜린 풀의 감소는 시나핀 생성의 감소를 유발한다.
십자화과 식물 종의 하나인 브라시카 나푸스(Brassica napus)에 종자 선택적인 콜린 산화효소(COX) 구조물을 형질전환하였다. 콜린 산화효소 유전자의 DNA 서열은 도 10에 기재하였고, 추정되는 아미노산 서열은 도 11에 기재하였다. 종자 특이적 발현을 증명하기 위해 나핀 프로모터 서열(Kohno-Murase, J., M. Murase, H. Ichikawa 및 J. Imamura, 1994, Plant Molecular Biology, 26:115-1124)을 사용하였다. 지침서(Maniatis, T., Frittsch, E.F. 및 Sambrook, J., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York)에 기재된 바와 같은 표준 프로토콜에 따른 일련의 클로닝 및 서브클로닝에 의해 최종 플라스미드 pHS731을 구성하였다. 골격을 이루는 벡터는 RD400(Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., Panchuk, B., Pelcher, L.E. 및 Keller, W., 1992, Gene 211:383-384)으로부터 수득하였는데, 이는 RD400의 NosP-NptII 식물 선별 마커 대신에 gus 및 npt(Gus::npt)의 융합 유전자를 포함하도록 변형하였다. Gus-npt는 이전에 기재된 바 있다(Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., Pelcher, L.E., Crosby, W.L. 및 G. Selvaraj, 1991, Gene 101: 239-246). 상기 유전자는 npt 서열의 끝부분에 Nos 종결자(폴리 A 신호)를 포함하는 2.6kb 단편으로서 pGKK14(Datla et al, 1991)로부터 중간체 플라스미드(RD400의 전체 T-DNA를 잃어버림)로 클로닝되었다. pBI525(Datla, R.S.S., F. Bekkaoui, J.K. Hammerlindl, G. Pilate, D.I. Dunstan 및 W.L. Crosby, 1993, Plant Science 94:139-149)로부터 알팔파 모자이크 바이러스의 리더 서열을 따라 특별히 이중으로 삽입된 CaMV35S 프로모터를 HindⅢ-BamHⅠ 단편으로 Gus::npt 서열의 끝부분에 클로닝하였다. 중합효소 Ⅰ의 클레나우 (Klenow) 단편으로 말단을 채워서 HindⅢ, BamHⅠ 및 주변의 XbaⅠ 부위를 제거하여 pHS722를 만들었다. pTZ19R(Mead, D.A., E. Szczesna-Skorupa 및 B. Kemper, 1986, Protein Engineering 1:67-74)의 다중 클로닝 부위를 포함하는 기능성 lac-알파 영역은 중합효소 연쇄 반응에 의해 0.26kb 단편으로 수득하였다. 상기 단편을 MunⅠ 및 EcoRⅠ으로 절단하여 PHS722의 EcoRⅠ 부위에 삽입하여 pHS723를 수득하였다. 벡터 T-DNA 부분의 상기 뉴클레오티드 서열을 결정하였고, 제한효소 분석에 의해 다중 클로닝 부위에서 유일한 부위를 확인하였다. pHS725는 pHS723에서 기원하고, pKR11(Rozwadowski et al., 1991 참조) 기원의 콜린 산화효소 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 일련의 중간체 벡터를 통해 클로닝에 편리한 부위를 제공하거나, 또는 꽃양배추 모자이크 바이러스의 폴리 A 신호와 같은 특징을 제공하는 유도체이다. pHS725 벡터는 pHS723 골격으로 3' 말단에 CaMV의 폴리 A 신호를 포함하는 COX 오픈 리딩 프레임을 제공한다. CaMV35S 프로모터를 포함하는 오픈 리딩 프레임의 5' 부분을 중간체 플라스미드에서 유래한 나핀 프로모터로 대체하여 pHS731을 수득하였다. 중간체 벡터는 1.1kb의 나핀 프로모터를 HindⅢ-나핀 P-BamHⅠ 가세트로 함유하는 pUC19 유도체를 포함하는데, 상기 카세트는 제이 코노-무라세(J. Kohno-Murase)(Kohno-Murase et al., 1994)로부터 수득하여 HindⅢ-BamHⅠ이 절단된 RD400(Datla et al., 1992) 플라스미드에 HindⅢ-BamHⅠ 삽입체의 형태로 라이게이션하였다. 그 결과로 생성된 플라스미드가 pHS974이다. pRKJ6A(pRKJ6A는 문헌(R.K. Jain, 1995, Genetic Engineering of Osmolyte Biosynthesis in Plants: Manipulation of Betaine Aldehyde Dehydrogenase Gene Expression Tobacco, Ph.D. Thesis, University of Saskatchewan, Saskatoon, Canada)에 상세히 기재되어 있음)로부터 BamHⅠ-BADH 오픈 리딩 프레임-폴리 A-KpnⅠ 카세트를 2.1kb 단편으로 단리하고, BamHⅠ-KpnⅠ이 절단된 pHS974에 라이게이션하여 pHS981을 수득하였다. pHS981은 pHS731을 만드는데 사용하였다. 도 12는 결과로 생성된, 오른쪽 및 왼쪽 경계에 나핀 프로모터-Cox 오픈 리딩 프레임-CaMV 폴리 A 신호를 포함하는 pHS731을 도시하고 있다. 나핀 프로모터-Cox 오픈 리딩 프레임-CaMV 폴리 A 신호 단편의 뉴클레오티드 서열을 상기 성분으로부터 결정하였다. 또한, pHS723를 만들어낸 벡터가 왼쪽과 오른쪽 경계 및 상기 벡터 바깥쪽 영역을 포함하는 pBIN19(Bevan, M., 1984, Nucleic Acids Research 12: 8711-8721) 전체를 포함하기 때문에, 부가의 서열을 확인하는 것도 가능하다. pBIN19의 완전한 뉴클레오티드 서열은 공개되어 있다. 따라서, 상기에 기재된 COX 유전자 구조물을 쉽게 회수하여 다른 벡터에 클로닝 할 수 있다. 대장균(E. coli) DH5에 포함된 플라스미드 벡터 pHS731은 미국 메릴랜드주 로크빌 파크론 드라이브 12301 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 수탁번호 ATCC 98300호로 1997년 1월 22일에 기탁되었다.
공개된 정보(DeLisle, A.J. 및 Crouch, M.L., 1989, Plant Physiology 91:617-623 및 Hoglund, A.-S., T. Rodin, E. Larsson 및 L. Rask, 1992, Plant Physiology, 98:509-515) 및 나핀 프로모터를 이용한 실험 결과를 기초로, 나핀 유전자의 발현이 비 나푸스(B. napus) 종자 발생의 시간상 중간 부분에 이루어질 것으로 기대하였다.
pHS731 벡터를 아그로박테리움(Agrobacterium) 균주 MP90에 표준 삼중부모 (triparental) 교배하고 나서, 아그로박테리움-매개의 형질전환을 통해 브라시카 (Brassica)에 도입하였다. 형질전환은 문헌(Moloney et al., 1989, Plant Cell Reports 8:238-242)에 기재된 바와 같이 수행하였다.
이원 벡터 pHS731을 포함하는 아그로박테리움 투미파시엔스(Argrbacterium tumifaciens) 균주 GV3101/pMP90(Koncz C. 및 Schell, J., 1986, Mol. Gen. Genet. 204:383-396)을 형질전환 연구에 사용하였다. LB 배지(100ml)(Difco, 미국)에서 배양한 정지기(stationary phase)의 박테리아 배양물을 원심분리에 의해 수획하고, 저온 보호제로서 1% DMSO(디메틸 설폭사이드, Sigma, 미국)를 함유하는 신선한 LB 배지 10ml에 재현탁하였다. 형질전환용으로 사용할 때까지 200㎕ 분획을 -20℃에 보관하다가, 박테리아 분획에 2% 수크로오스, 50μM 아세토시린곤(pH 5.6)을 포함하는 2ml의 브레인 하트 인퓨젼 배지(Brain Heart Infusion Broth, Difco, 미국)를 가하고 밤새 28℃에서 배양하였다. 박테리아 세포의 밀도는 약 1×109세포/ml이었다.
문헌(Moloney et al, 1989, Plant Cell Rep. 8:238-242)에 기재된 방법에 따라, 식물 형질전환용 벡터를 포함하는 아그로박테리움(Agrobacterium)에 떡잎 외식편을 노출시켰다. 외식편 잎꼭지의 단면을 박테리아 배양물에 잠깐 담궜다. 외식편을 공-배양 배지에 넣어, 상기 단면이 배지와 접촉하게 하였다. 10개의 외식편을 100×15mm 샤알레에 각각 넣었다. 공-배양 샤알레를 스트레친 실(등록상표) (Strentch'n SealTM) 플라스틱 랩으로 밀봉하였다. 종자 발아 단계에 관해 상기 기재한 온도 및 광주기 조건하의 배양 캐비넷에서 상기 샤알레를 3일 동안 배양하였다. 이어서, 외식편을 선별 배지로 옮겼다.
3 내지 4주 후에, 선별 배지에서 재생되는 녹색 발아(형질전환체로 추정)를 절개하여 신선한 선택 배지로 옮겨 계속 배양하였다. 상기 발아의 길이가 1.5 내지 2.0cm가 되었을 때, 이를 뿌리 생성 배지에 옮겼다. 추정의 유전자 이식 발아에서 문헌(Jefferson, R. A., 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405)에 기재된 방법으로 gus 유전자의 발현 여부를 스크린하였다.
형질전환의 확인은 NPTII 및 PAT 분석, 서던 블랏(Southern blots), PCR(중합효소 연쇄 반응, Polymerse Chain Reaction) 및 자손 분석을 통해 수행하였다. 202622라 불리우는 pHS731 벡터를 포함하는 브라시카 나푸스, 씨브이 웨스타 (Brassica napus, cv. Westar)의 유전자 이식 종자는 미국 메릴랜드주 로크빌 파크론 드라이브 12301 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 수탁번호 ATCC 97854호로 1997년 1월 22일에 기탁되었다.
이어서, 브라시카 나푸스 (Brassica napus) 종자에서 콜린 산화효소의 발현을 측정하였다. 몇 가지 독립적인 유전자 이식 계통을 재생시켰다. COX 활성은 결합 효소 반응(coupled enzymatic reaction)에 의해 측정하였다. COX는 콜린으로부터 베타인 알데히드를 생성하고, 상기 베타인 알데히드는 BADH에 의한 그의 NAD-의존성 산화에 의해 분석할 수 있다. NAD 환원은 340nm에서의 흡광도 변화로 모니터할 수 있다. 분석 방법을 표준화하기 위해, 상업적으로 입수가능한 다양한 양의 COX(예를 들면, Sigma) 및 일정한 양의 대장균(E. coli) BADH(50유니트, 1유니트는 단백질 1mg이 분당 1nmol의 NAD를 환원시키는 단위임) 제조물(BADH를 과다발현하는 박테리아 균주로부터 제조)를 사용하여 반응 조건을 표준화하고, BADH가 아닌 COX가 제한되는 표준 곡선을 작성하였다. 이어서, 유전자 이식 계통 및 대조군으로부터 추출한 식물을 사용하여 상기 분석을 수행하였다. BADH는 공지된 방법 (Falkenberg, P. 및 Strom, A.R., 1990, Biochemica Biophysica Acta 1034:253-259)에 의해 충분히 제공되거나 정제될 수 있다.
식물 추출물은 하기와 같이 수득하였다. 약 100mg의 식물 잎을 액체 질소로 냉동시키고, 시료 중량 두 배 부피의 빙냉 추출 완충액에서 분쇄하였다. 상기 시료를 약 10,000 x g로 원심분리하고, 상층액을 다시 원심분리하였다. 입자성 물질이 보이지 않을 때까지 계속 원심분리하였다. 종자의 경우에는, 시료당 약 20개의 종자를 최초로 원심분리한 후, 활성화된 숯 20mg을 가하고 하기와 같이 남은 과정을 수행하였다. KOH로 pH를 8.0으로 조정한 추출 완충액은 1.92g의 HEPES, 0.2ml의 0.5M EDTA, 10ml의 글리세롤 및 탈이온수를 포함하여 전체 부피를 100ml로 맞추었다. 분석 전에, 1M 원액의 DTT를 최종 농도 25mM로 가하고, HEPES 완충액 중의 10X 원액 완전 단백질분해 억제제 칵테일(Boehringer-Manheim, 카탈로그 번호 1697-498)을 가하였다. 상기 효소 분석 완충액(BADH 완충액)은 50mM HEPES-KOH(pH 8.0), 1mM EDTA 및 새로 가해진 최종 농도 1mM의 DTT를 포함한다. 50㎕의 BADH 완충액, 50㎕의 10mM 원액 NAD, 50㎕의 식물 시료, 30㎕ 또는 50U 상당의 BADH 및 탈이온수를 포함하여 전체 부피가 450㎕인 반응으로 결합(coupled) 분석을 수행하였다. 20분 동안 모니터한 후에 반응 혼합물을 혼합하였다. 340nm에서의 흡광도의 배경 변화 때문에, 50㎕의 염화콜린을 가하고 10 내지 20분 동안 분광계를 읽었다. 식물 시료를 빼고 다양한 양의 정제된 COX를 가하여 표준 곡선을 작성하였다. 프로그램화된 베크만(Beckman) DU65 유형의 기록 분광계를 사용하여 유니트를 계산하였다. 당업계 숙련자는 NAD에 대한 계수를 소멸시키기 위해 문헌상 유용한 생화학적 데이타를 이용하여 상기 프로토콜을 장비에 적합하게 변형시킬 수 있다. NAD 환원 그 자체는 탈수소효소에 대해 수행하는 표준 분석이다.
〈실시예 5〉 페놀 화합물 함량이 감소된 유전자 이식 종자의 분석
본 실시예에서는, 종자를 분석하여 시나핀 함량을 측정하였다. 실시예 4에서 회수된 유전자 이식 식물로부터 수득한 종자를 배양하여 자가 수분된 자손을 수득하고, 상기 자손에 대해 베타 글루쿠로니다아제(GUS) 활성을 코딩하는 이식 유전자의 분리 또는 분리의 결여를 분석하였다. 상기 유전자(Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., Pelcher, L.E., Crosby, W.L. 및 G. Selvaraj, 1991, Gene 101: 239-246 참조)는 pHS731 벡터 T-DNA의 오른쪽과 왼쪽 경계 내에 존재하고, 따라서 유전자 분리라는 유전자적 분석에 편리한 마커로 사용할 수 있다. 유전자적 분리의 결여는 자손의 기원이 된 식물이 호모접합성(homozygous) 식물임을 의미한다. 분리가 나타나는 식물 계통은 헤미접합성(hemizygous)임을 의미하고, GUS 활성이 결여된 분리체는 COX 유전자를 포함하지 않는 대조군 유전자를 보유하고 있다. 따라서, COX를 포함하는 호모 접합성 계통의 풀이 존재하고, 그 상대편은 이식 유전자를 포함하지 않는다. HPLC 프로토콜을 사용하여 상기 계통에 대해 시나핀 함량을 분석하였다. 도 13에 기재된 상기 실험의 결과는 유전자 이식 분리체에서는 시나핀의 함량이 현저하게 감소하고, 유전자 이식이 되지 않은 상대편은 그 반대임을 나타낸다. 유전자 이식이 되지 않은 분리체는 매우 훌륭한 대조군인데, 그 이유는 이들이 동일한 일차 유전자 이식 식물로부터 유래했기 때문이다. 상기 결과는 기재된 방법이 유용함을 주장한다. 유전자 발현의 양, 시기 및 장소를 변화시켜 다양한 양의 시나핀 감소를 성취할 수 있고, 또한 개개의 유전자 이식 계통에서 위치 효과 및 카피수(copy number)를 포함한 다양한 이유로 원하는 결과를 나타내는 유익한 변형체를 찾을 수 있음은 당업계 숙련자에게 명백하다.
〈실시예 6〉 폴리프로파노이드 경로의 전구체 전환에 의한 스트레스 보호제 산물의 제조
본 실시예에서는, 종자-선택적인 프로모터 조절하의 COX 및 BADH의 혼합된 활성에 의해 스트레스 보호제인 베타인을 제조하였다. 실시예의 첫 번째 부분에서는, 종자 선택적인 프로모터 조절하의 BADH 유전자를 갖는 유전자 이식 브라시카 나푸스(Brassica napus)를 생성하였다. 상기 식물의 BADH 발현에 대한 분석을 수행하였다.
브라시카 나푸스(Brassica napus) 종자에서 베타인 알데히드 탈수소효소 유전자를 발현시켰다. 대장균(E. coli)의 BADH 유전자(betB)를 단리하여 비 나푸스(B. napus)의 나핀 프로모터(Boyd et al., Gene 103:45-52 (1990))에 연결시켜 종자-특이적으로 발현되도록 조작하였다. RD400 플라스미드(Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., Panchuk, B., Pelcher, L.E. 및 Keller, W., 1992, Gene 211:383-384)를 사용하여, 나핀 프로모터 및 꽃양배추 모자이크 바이러스의 폴리 A 신호의 발현 조절하에 있고, 오른쪽과 왼쪽 T-DNA 경계 내에 betB의 오픈 리딩 프레임의 ATG 위치 이하를 포함하는 최종 유도체 pHS974를 수득하였다. 나핀-betB-폴리 A 카세트(약 3.3kbp)는 HindⅢ 부위, 나핀 프로모터, BahHⅠ 부위, betB ORF, EcoRⅠ 부위-꽃양배추 모자이크 바이러스 DNA의 폴리 A 신호, KpnⅠ 부위 및 EcoRⅠ 부위를 순차적으로 포함한다. 나핀 프로모터는 코노-무라세(Kohno-Murase) 등의 문헌(Plant Molecular Biology, 26:115-1124, 1994)으로부터 수득하였고, 폴리 A 신호는 그 기원인 pHIT117(Guerineau, F., Woolston, S., Brooks, L. 및 Mullineaux, 1988, Nucleic Acids Research 16:11380) 플라스미드로부터 수득하였다. 최종 플라스미드 pHS981은 약 15kbp의 길이이고, 도 14에 도시된다. 상기 벡터를 아그로박테리움 투미파시엔스(Argrbacterium tumifaciens) 균주 GV3101[pMP90](Koncz C. 및 Schell, J., 1986, Mol. Gen. Genet. 204:383-396)에 도입하고, 그 결과로 생긴 균주를 브라시카 나푸스 (Brassica napus)의 유전자적 형질전환에 사용하였다.
몇 가지 유전자 이식 계통을 수득하였고, 다양한 발생 단계의 종자에 대해 BADH 활성을 분석하였다. BADH 활성은 약 35 DAP의 종자에서 최대로 나타났고, 성숙한 종자는 잉여의 활성을 보유하였다. 발생 단계상의 기능으로서 특이적인 활성은 BADH 활성이 시나핀 합성과 동시에 일어나는 징후임을 의미한다.
BADH 유전자를 발현하는 상기 식물 계통을 실시예 4에 기재된 COX 유전자를 갖는 식물 계통과 교배하였다. COX 유전자를 포함하는 식물 및 BADH 및 COX 유전자를 모두 포함하는 식물에 대해 시나핀 함량 및 전체 페놀 화합물 함량을 분석하였다. 상기 결과는 도 15(시나핀 함량) 및 도 16(전체 페놀 화합물 함량)에 도시하였다. 분석이 끝난 종자를 식물로부터 수확하여 야생(field) 조건에서 1999년 여름에 배양하였다. 도 15에 나타난 바와 같이, COX 및 BADH의 혼합 활성으로 인해 COX 단독의 활성보다 시나핀 축적이 추가로 감소하였다. 도 16에 나타난 바와 같이, 유전자 이식 식물의 전체 페놀 화합물 함량을 대조군과 비교하였다.
〈실시예 7〉 합성된 페룰산 탈카르복실화효소 유전자의 뉴클레오티드 서열
본 실시예에서는, 바실러스 푸밀루스(Bacillus pumilus)(Zago et al., Applied and Environmental Microbiology 61:4484-4486, 1995)의 페룰산 탈카르복실화효소를 사용하여 식물 세포에서 최적으로 발현되는 유전자를 구성하였다. 페룰산 탈카르복실화효소의 오픈 리딩 프레임은 공개된 서열을 기초로 합성 올리고뉴클레오티드의 라이게이션에 의해 합성하였다. 상기 올리고뉴클레오티드는 주로 브라시카 나푸스(Brassica napus)에서 고도로 발현되는 우세한 코돈에 기초하여 합성하였다.
합성 올리고뉴클레오티드의 길이는 약 60 뉴클레오티드였다. 이중 올리고뉴클레오티드는 5' 말단에 BamHⅠ-점착성 말단(5' GATC-)를 포함하고 3' 말단에 EcoRⅠ-점착성 말단(3'-TTAA-5')을 포함하도록 고안하였다. 개개의 이중 올리고뉴클레오티드를 어닐링시켜 5' BamHⅠ 및 3' EcoRⅠ 부위를 갖는 전장 오픈 리딩 프레임을 생성하였다. 라이게이션 반응은 표준 프로토콜을 다라서 수행하였다. 라이게이션 생성물은 클로닝 벡터에 라이게이션시켰다.
상기 합성 유전자를 BamHⅠ-EcoRⅠ 절단된 pBluescript SK-(Stratagene)에 라이게이션하고, 대장균(E. coli) 클론으로부터 플라스미드 DNA를 소량 제조로 스크린하여 0.5kb 삽입체를 갖는 클론을 동정하였다. 잠재적 후보를 스크린하고, 두 클론에 대한 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 각각의 클론에서 점 돌연변이를 발견하였고, 상기의 두 가지 점 돌연변이는 선택된 두 클론에서 일정한 간격을 유지하였다. 상기 돌연변이의 간격으로 인해 상기 두 유전자의 두 가지 비-돌연변이 부위의 결합으로부터 원래 유전자의 재구성이 가능하였다. 상기 클론을 pGS97b1이라 명명하였다. 상기 합성 뉴클레오티드 서열을 도 17에 기재하였다. 예상 아미노산 서열을 도 18에 기재하였다.
상기 합성 유전자의 기능은 단순한 시험으로 확인하였다. 페룰산 탈카르복실화효소는 페룰산을 4-비닐과이아콜(4-VG)로 전환시킨다. 4-VG는 독특한 정향나무 냄새가 나고, 정향나무의 천연향을 부여하는 가장 중요하고 유일한 화합물로 믿어진다. pGS97b1이 형질전환된 대장균(Escherichia coli) 균주를 1mM의 페룰산을 포함하는 배지에서 배양하면 독특한 정향나무 냄새가 나는 반면, 페룰산이 없는 배지에서 배양하면 상기 냄새가 나지 않는다. 페룰산이 제공된 배양물의 HPLC 분석으로 페룰산의 소멸을 확인할 수 있다. 상기 결과에 기초하여, 기능성 유전자가 pGS97b1에 클로닝됨을 결론내렸다.
〈실시예 8〉 식물에 구성적 프로모터의 조절하에 페룰산 탈카르복실화효소를 코딩하는 유전자의 유전자적 형질전환
본 실시예에서는, pGS97b1에 클로닝된 페룰산 탈카르복실화효소를 RD400의 NosP-NptII 식물 선별 마커 대신에 gus 및 npt(Gus::npt)의 융합 유전자를 포함하도록 변형된 식물 형질전환용 벡터인 RD400(Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., Panchuk, B., Pelcher, L.E. 및 Keller, W., 1992, Gene 211:383-384)에 삽입하였다. Gus-npt는 이전에 기재된 바 있다(Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., Pelcher, L.E., Crosby, W.L. 및 G. Selvaraj, 1991, Gene 101: 239-246). 페룰산 탈카르복실화효소 유전자는 35S 프로모터의 조절하에 놓여 있고, 상기 플라스미드를 표준 프로토콜에 따라 담배 식물에 형질전환하기 위해 사용하였다.
상기 벡터의 제한효소 지도는 도 19에 도시하였다. 도 19에 도시된 pGS97b3 벡터는 하기 사항을 제외하고는 pHS731과 유사하다. pHS731과 동일한 벡터 골격에서, HindⅢ-나핀 P-BamHⅠ 카세트를 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터-알팔파 모자이크 바이러스 리더 카세트(문헌(R.S.S. Datla, F. Bekkaoui, J. K. Hammerlindl, G. Pilate, D.I. Dunstan 및 W.L. Crosby. Improved high-level constitutive foreign gene expression in plants using an AMV RNA4 untranslated leader sequence, Plant Science 94: 139-149, 1993)에 기재됨)로 대체하였다. 프로모터 부분은 도 19에서 35S라는 약자로 표기하였다. 35S 뒤쪽에 pHS731의 COX 오픈 리딩 프레임 대신 페룰레이트 탈카르복실화효소가 있는데, 상기 효소의 유전자는 5' 말단에 BamHⅠ 및 3' 말단에 EcoRⅠ 부위가 결합되어 있다.
페룰산 탈카르복실화효소 유전자를 발현하는 유전자 이식 식물을 회수하였다. 상기 식물에 대해 페놀 화합물 함량 및 비닐과이아콜 생성을 분석하였다.
페룰산 탈카르복실화효소 유전자를 갖는, 담배의 독립적인 유전자 이식 식물은 웨스턴 블랏(western blot) 분석 결과 예상 크기의 면역 반응성 폴리펩티드를 함유하고 있었는데, 상기 웨스턴 블랏 분석은 페룰산 탈카르복실화효소에 대해 생성된 폴리클론 항체를 사용하였다. 형질전환되지 않은 식물에는 면역 반응성 펩티드가 나타나지 않았다. 이는 상기 유전자 이식 식물에서 페룰산 탈카르복실화효소 단백질의 이식 유전자 발현에 대한 증거를 제공한다.
〈실시예 9〉 식물에 조직 선택적인 프로모터 조절하의 페룰산 탈카르복실화효소를 코딩하는 유전자의 유전자적 형질전환
본 실시예에서는, pGS97b1에 클로닝된 페룰산 탈카르복실화효소를 식물 형질전환용 벡터인 RD400에 삽입하였다. 페룰산 탈카르복실화효소 유전자를 비 나푸스 (B. napus)의 종자 특이적 나핀 프로모터의 조절을 받게 하였다. 상기 벡터의 제한효소 지도는 도 20에 도시하였다. 도 20에 도시된 pGS97b2 벡터는, 동일한 벡터 골격에서 HindⅢ-35S-BamHⅠ 카세트를 도 12의 pHS731에 나타나는 HindⅢ-나핀 프로모터-BamHⅠ 카세트로 대체한 것을 제외하고는 pGS97b3과 유사하다. 페룰산 탈카르복실화효소 유전자를 발현하는 유전자 이식 식물을 회수하였다. 식물 종자를 대상으로 페놀 화합물 함량 및 비닐과이아콜 생성을 분석하였다.
〈실시예 10〉 십자화과 식물인 브라시카 나푸스(Brassica napus)의 발생중인 종자에서 피트산의 조직 특이성 및 발생 패턴의 측정
본 실시예에서는, 피느산의 생합성 경로에 관련된 정보를 브라시카 나푸스(Brassica napus)에서 측정하였다. 피트산은 미오-이노시톨의 6인산 유도체이기 때문에(피트산을 IP6이라고도 칭함), 전체 인산화 이노시톨 유도체에 대한 미오-이노시톨 성분 개개의 인산화 유도체(예를 들면, IP1,IP2, IP3,IP4및 IP5)의 비율을 측정하였다. 다양한 인산화 유도체의 생성을 위해 고압 증기 멸균 (autoclaving)에 의해 부분적으로 분해된 순수한 피트산을, 베르논(Vernon) 및 보너트(bohnert)의 문헌(1992. The EMBO Journal 11:2077-2085) 및 베르논 디엠(Vernon DM), 타르친스키 엠씨(Tarczynski MC), 젠센 알지(Jensen RG) 및 보너트 에이치제이(Bohnert HJ)의 문헌(1993. The Plant Journal 4: 199-205)에 따라 수행하는 HPLC 분석의 표준으로 사용하였다.
다양한 형태의 인산화 이노시톨(예를 들면, IP1,IP2, IP3,IP4및 IP5) 및 피트산은 상기 분석에 의해 쉽게 구별할 수 있다. 브라시카(Brassica)의 발생중인 종자로부터 추출한 이노시톨 인산 시료를 분석했을 때, IP6(즉, 피트산)에 상응하는 하나의 피크만이 나타났다. 상기 결과는 발생중인 종자에서 IP6가 이노시톨 인산의 우세한 형태이고, 다른 인산화 이노시톨 중간체 형태는 상기 방법에 의한 HPLC 분석으로 검출할 수 없음을 주장한다. 따라서, 미오-이노시톨로부터 피트산의 생합성은 빠르고 정량적인 방식으로 일어난다고 믿어진다.
피트산의 발생학적 생합성
상기 실시예의 본 부분에서는, 피트산이 축적되는 발생학적 시기를 측정하였다. 종자의 피트산 함량을 측정하기 위한 방법은 하기와 같다. 액체 질소가 존재하는 모르타르에서 종자를 분쇄하고, 0.5M HCl이 들어있는 5ml 멸균 튜브에 상기 분말을 옮겼다. 헥산 추출로 지질을 제거한 후에, 남아있는 상(수상 및 조직 잔여물)을 울트라소닉 리퀴드 프로세서(ultrasonic liquid precessor, Model XL2020, Heat Systems, Inc., 미국 뉴욕주 파밍데일)를 사용하여 단계 3의 강도로 90초 동안 초음파 처리하였다. 원심분리한 후, 액체를 새 튜브에 옮기고 HPLC로 피트산을 분석하였다. 다양한 발생학적 단계의 종자에 상기 방법을 사용하였다.
종자의 발생 도중 피트산의 축적은 도 21에 도시된다. 비록, 매우 초기 단계의 종자(즉, 수분후 경과된 날짜가 12일인 종자)에서 처음으로 피트산이 검출되기는 하지만, 그 함량은 수분후 경과된 날짜가 22일이 될 때까지 현저하게 증가하지 않는다. 처음으로 나타난지 10일의 기간동안, 피트산의 함량은 종자당 최대 240㎍이었다. 건량을 기준으로 표현하면, 피트산의 함량은 약 3.2%이었다. 상기 결과는, 피트산 생합성을 방해하여 피트산 함량을 감소시키는 것은 약 12 DAP로부터 거의 성숙된 종자가 될 때까지 유전자를 발현시킬 수 있는 프로모터를 필요로 함을 의미한다.
추가의 분석은 피트산이 종피보다는 주로 배 조직에 축적됨을 나타낸다(도 22). 종자에 존재하는 피트산 중 거의 90%가 떡잎에 있고, 10%는 배축에 존재한다. 상기 발견은 다양한 배 조직이, 피트산 생합성을 유전자적으로 변형시켜 피트산 함량을 감소시키는데 가장 바람직한 표적 조직임을 추가로 제시한다.
〈실시예 11〉 발생중인 종자 조직에서 미오-이노시톨 대사의 측정
본 실시예는 피트산 생합성에 사용되는 미오-이노시톨 풀의 일부분을 예시한다. 비록 미오-이노시톨은 식물에서 피트산 생합성에 대한 전구체이지만, 상기 화합물은 또한 다른 혐기성 경로에 사용되어 포스파티딜이노시톨 및 세포벽 성분을 생성하기도 한다. 본 실시예는 발생중인 종자에서 피트산 생합성에 사용되는 전체 미오-이노시톨 풀의 일부분을 예시한다.3H-미오-이노시톨을 이용하여 생체내에서 표지된 브라시카(Brassica) 종자를 사용하여 상이한 용매로 추출된 다른 분획에서의 이노시톨 분포를 조사하였다. 발생중인 종자를3H-미오-이노시톨로 생체내 펄스(pulse) 표지하는데 사용된 기술은 하기와 같다. 상이한 발생 단계의 장각과를 분리하고 말단을 즉시 절단하여 5μCi의3H-미오-이노시톨을 포함하는 10ml의 멸균 배양액이 들어있는 50ml 튜브에 넣고 표준 배양 조건(광조건에서 20℃로 16시간 배양, 암조건에서 15℃로 8시간 배양)에서 2일 동안 배양하였다. 종자를 수확하여 지질, 피트산, 트리플루오로아세트산(TFA)-가용성 세포벽 조성물 및 세포벽 잔해를 추출하였다. 각 분획의 방사능은 액체 섬광 계수기로 측정하였다.
펄스-표지된 종자로부터 추출된 네 가지 유형의 추출물을 수용성 세포 성분(피트산 분석용), 헥산-가용성(지질 분석용) 성분, 트리플루오로아세트산(TFA)-가용성 세포벽 조성물 및 세포 잔해로 분리하였다. 도 23은 상이한 발생 단계의 종자 각각의 분획에 대한 평균 방사능을 목록화한 것이다. 상기 데이타는 전체 표지된 종자에서 20% 이상이 수분후 경과된 날짜(DAP)가 25 내지 30일인 지질 분획에서 발견됨을 의미한다. 세포벽 분획에서의 방사능(TFA-가용성 세포벽 및 세포 잔해)은 종자 발생 과정에서 혼입된 전체 표지의 약 5%를 차지하였다. 수용성 분획의 방사능은 피트산 비율을 확인하기 위해 추가로 HPLC 분석하였다. 수용성 추출물에서 표지된 약 10%가 피트산 피크에서 회수되었고, 표지의 약 30%가 시료 주입시 피크(미오-이노시톨과 무관함)로 나타났다. 수용성 추출물에 존재하는 다른 표지된 물질(미확인 화합물)을 피트산 피크가 나타나기 이전 또는 이후에 회수하였다.
피트산, 지질, TFA-가용성 세포벽 및 세포 잔해 분획에서 나타나는, 대사에 의해 표지된 비율은 도 3에 나타내었다.3H-미오-이노시톨로부터 표지된 물질의 약 30%가 20 내지 30 DAP의 종자에서 발견되었다. 동시에, 표지된 물질의 약 60%가 지질(이노시톨-함유 인지질)에서 발견되었고, 10% 미만이 세포벽 분획에서 발견되었다.
따라서, 피트산 생합성에 사용되는 전체 미오-이노시톨 풀의 부분은 피트산 생합성이 최대로 나타나는 종자 발생 시기에 약 30%이었다.
〈실시예 12〉 미오-이노시톨에 작용할 수 있는 효소를 코딩하는 유전자의 클로닝
본 실시예에서는, 미오-이노시톨에 작용할 수 있는 유전자를 단리하였다. 상기 유전자는 채송화에서 유래한 이노시톨 O-메틸-전이효소 유전자였다. 상기 유전자를 단리하기 위해 하기에 기재된 바와 같이 역전사 클로닝을 사용하였다. 문헌(Maniatis et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)에 따라서, 표준 DNA 조작법을 사용하였다.
500mM의 NaCl이 처리된 채송화의 잎으로부터 전체 RNA를 단리하고, 폴리 (A)+ RNA를 추가로 정제하였다. 상기 mRNA를 하기와 같은 반응의 조건으로 슈퍼스크립트(Superscript) Ⅱ 역전사 효소(Promega, 위스콘신주 매디슨)를 이용한 역전사 반응에 사용하였다. 20㎕의 물에 용해된 3㎍의 mRNA를 주형으로 사용하였다. 상기 RNA를 65℃에서 5분 동안 가열하여 변성시키고 나서, 얼음상에서 냉각시켰다. 상기 혼합물에 3㎕의 올리고-dT(500㎍/ml), 8㎕의 5X 역전사 효소 완충액 및 4㎕의 0.1M DTT, 2㎕의 10mM dNTP를 가하였다. 상기 혼합물을 42℃로 가온하고 나서 3㎕(60 유니트)의 슈퍼스크립트 Ⅱ 역전사 효소를 가하였다. 이를 42℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어서, 1㎕의 RNase H(1.5 유니트/㎕)를 가하고, 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 결과로 생성된 cDNA를 주형으로 사용하고 벤트(Vent) 중합효소를 이용하여 하기와 같은 조건에서 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 100㎕ 부피에서, 94℃ 1분, 55℃ 1분 및 72℃ 1분의 주기(각 주기에 2초가 연장됨)로 30주기 동안 수행하였다. 상기 반응에 사용된 프라이머는 공개된 IMT DNA 서열(진뱅크 제M87340호)를 기초로 고안하였다. 사용된 순방향 프라이머는 5' 말단에 BamHⅠ 부위(밑줄)를 포함하는 하기 서열 6이었다.
5' TTTTTGGATCCATGACTACTTACA CAATGGCAACTACA 3'
사용된 역방향 프라이머는 5' 말단에 NotⅠ 부위(밑줄)를 포함하는 하기 서열 7이었다.
5' TTTTTTTTGCGGCCGCATAAAGGCAAATCATACACTG 3'
증폭된 DNA 단편을 BamHⅠ 및 NotⅠ으로 절단하고 나서, pSPORT1(BRL, 메릴랜드주 베테스다)에 서브클로닝하였다. BamHⅠ 및 NotⅠ으로 절단된 단편을 pSPORT 벡터의 상응하는 부위에 클로닝하여 pSportIMT를 생성하였다. 도 24(서열 5)는 3' 비번역 부위에 상이한 두 염기를 제외하고는 공개된 IMT DNA 서열과 일치하는, 증폭된 DNA 단편을 나타내고 있다. 예상 단백질 서열은 진뱅크에서 입수가능한 공개된 정보와 일치한다.
〈실시예 13〉 미오-이노시톨에 작용할 수 있는 효소를 코딩하는 식물 형질전환용 벡터의 구성: 채성화 미오-이노시톨 O-메틸 전이효소 유전자의 사용
본 실시예는 식물 세포에서 활성이 있는 프로모터의 조절하에 미오-이노시톨에 작용할 수 있는 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 벡터를 예시하고 있다. 예시된 식물 형질진환용 벡터는 종자 세포에서 활성이 있는 35S 프로모터의 조절하에 미오-이노시톨 O-메틸 전이효소 유전자를 포함한다.
벡터의 구성은 하기와 같이 수행하였다. pSportIMT를 BamHⅠ 및 EcoRⅠ으로 절단하여 IMT 유전자를 방출시켰다. 상기 IMT 유전자 단편을 pBluescript SK(-)(Stratagene, 캘리포니아주 라졸라)의 상응하는 부위에 클로닝하고, 결과로 생성된 플라스미드를 pBlueIMT라 명명하였다. pBlueIMT를 SpeⅠ으로 절단하고, XbaⅠ으로 미리 절단된 pBI221(CloneTech) 벡터에 클로닝하였다. pBI221에서 35S 프로모터에 대해 IMT 유전자를 올바른 방향으로 포함하는 플라스미드를 HindⅢ 및 EcoRⅠ으로 절단하였다. 35S-IMT-Nos 종결자 단편을 pRD400에 클로닝하여 p35SIMT라는 식물 형질전환용 벡터를 제조하였다.
결과로 생성된, pRD400에 35S 프로모터-IMT-GUS-Nos 종결자 카세트를 포함하는 p35SIMT 벡터 구조물을 도 25에 도시하였다.
〈실시예 14〉 종자-선택적 프로모터의 조절하에 미오-이노시톨에 작용할 수 있는 효소를 코딩하는 식물 형질전환용 벡터의 구성
본 실시예에서는, 종자-선택적 프로모터의 조절하에 미오-이노시톨에 작용할 수 있는 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 벡터를 제조하였다. 사용된 유전자는 미오-이노시톨 O-메틸 전이효소였고, 그 프로모터는 종자 선택적인 나핀 프로포터였다. 상기 벡터를 pNIMT라 명명하였다.
pNIMT 벡터는 하기와 같이 구성하였다. SpeⅠ-절단 IMT DNA 단편(실시예 4)을 pDH1의 XbaⅠ 부위에 라이게이션하여, 나핀 프로모터-IMT-Nos 종결자 카세트를 수득하였다. 상기 발현 카세트를 추가로 pRD400에 클로닝하였다. 결과로 생성된 벡터를 도 26에 도시하였다.
〈실시예 15〉 p35SIMT로 브라시카 나푸스(Brassica napus)(Westar)의 형질전환
p35SIMT 벡터를 아그로박테리움(Agrobacterium) 균주 MP90에 표준 삼중부모 (triparental) 교배하고 나서, 아그로박테리움-매개의 형질전환을 통해 브라시카 (Brassica)에 도입하였다. 형질전환은 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. p35SIMT가 형질전환된 식물을 수득하고, 피테이트 함량을 분석하였다.
〈실시예 16〉 유전자 이식 식물의 분자적 분석
CaMV 35S-IMT 발현 카세트를 포함하는 F0유전자 이식 식물을 IMT 효수 분석 뿐만 아니라 PCR, 서던 및 노던 블랏으로 분석하였다. 예비 PCR 분석으로 모든 유전자 이식 식물이 IMT 유전자를 포함하고 있다는 사실을 알 수 있었다(도 27). 서던 혼성화 결과, IMT 유전자는 브라시카(Brassica)의 게놈에 다양한 카피수(copy number)로 삽입되었음을 알았다. 도 28에 도시되는 노던 혼성화 분석용의 전체 RNA를 발생중인 종자로부터 추출하였다.
〈실시예 17〉 유전자 이식 식물에서 피트산 분석
F0유전자 이식 식물로부터 수확한 성숙 종잘에서 피트산 함량으르 분석하였다. 종자의 추출은 실시예 10에 기재된 바와 같이 수행하였다. 수집된 데이타는 유전자 이식 식물에서 평균 15% 이상의 피트산이 감소되었음을 나타낸다. 도 29 및 30은 상기 데이타를 요약한 것이다. 수집된 데이타는 pSIMT 벡터로 생성된 유전자 이식 식물에서 평균 15%를 넘는 피트산이 감소되었음을 나타낸다. F1유전자 이식 식물은 유전자 분리로 인해 유전자 이식 식물과 비-유전자 이식 식물이 섞여있고, 따라서 형질전환된 종자를 기준으로 하면 피트산의 실제 감소량은 더 높다. F2및 F3종자는 pSIMT 벡터를 포함하는 호모접합성 계통이다. 야생 조건에서 pSIMT 벡터를 갖는 호모접합성 계통의 종자에 나타나는 피트산 감소 정도는 평균 30%이다. 피트산 분석 이외에, 삽입된 유전자의 카피수를 측정하기 위해 서던 블랏 분석을 수행하였다. 심지어 한 카피수의 유전자만 포함된 식물에서도, 피트산의 감소(34%)는 현저하게 나타났다(예를 들면, 식물 번호 TP #11). 따라서, 피트산 생합성이 일어나는 조직에서 미오-이노시톨을 변형시킬 수 있는 효소의 발현은 종자에서 피트산의 감소를 유발함은 명백하다. 또한, 피트산 함량이 낮은 형질은 유전성이 있기 때문에, 상기 형질은 성적으로 전달 가능함이 명백하다. 따라서, 사용 방법은 일단 낮은 피트산 함량의 형질이 얻어지면 종래의 교배 기술에 의해 상기 형질을 전달하는 것을 포함한다.
〈실시예 18〉 pNIMT로 브라시카 나푸스(Brassica napus)의 형질전환
p35SIMT 벡터를 아그로박테리움(Agrobacterium) 균주 MP90에 표준 삼중부모 (triparental) 교배하고 나서, 아그로박테리움-매개의 형질전환을 통해 브라시카 (Brassica)에 도입하였다. 형질전환은 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다.
p35SIMT 벡터로 형질전환된 식물을 수득하고 실시예 17에서와 같은 피트산 함량의 감소 여부를 분석하였다. 도 31은 pNIMT 벡터를 포함하고 야생 조건에서 배양된 F1 및 F2 유전자 이식 종자로부터 수집한 데이타 표를 나타낸다. F1 식물에서, pNIMT 삽입체가 분리되었기 때문에 분석된 종자는 유전자 이식 및 비-유전자 이식 분리체의 혼합물이었다. F2 세대에서, 대부분의 계통은 호모접합성 또는 거의 호모접합성 개체군이었다. F2의 분석에서, 야생 조건에서 배양된 식물로부터 40%에 가까운 피트산 함량의 감소를 관찰하였다. 따라서, 종자 선택적인 조건에서 피트산 생합성에 이용 가능한 미오-이노시톨을 감소시킬 수 있는 효소의 발현은 피트산의 함량을 현저히 감소시킨다.
〈실시예 19〉 UDP-포도당의 생성 및 축적은 식물 세포에 이종인 효소 활성을 이용하여 억제한다.
UDP-갈락토오스 4-에피머라아제(galE)라는 효소는 생물체에서 갈락토오스 대사의 주요한 단계 중 하나와 관련되어 있다. 상기 효소는 UDP-칼락토오스를 UDP-포도당으로 전환시키는 단계를 촉매한다. 상기 효소의 유전자는 인간, 효모 및 박테리아에서 입수 가능하다.
본 실시예의 목적은 상기 효소를 표적 식물의 특정 조직에서 과다발현시켜 UDP-갈락토오스를 소모하고 UDP-포도당의 풀을 증가시키는 것이다. 예상된 결과는 영양에 유해한 수크로오스 글리코시드(라피노오스 및 스타키오스 등과 같은 RFO 글리코시드)인 갈락티놀 생합성의 감소이다. 필요한 RFO 글리코시드의 축적 비율을 감소시키는 것 이외에, 상기 목적을 수행하는 것은 UDP-포도당 및 수크로오스의 이용도를 동시에 증가시킬 것이다. 수크로오스는, 식물에 필수적인 다른 대사 산물의 생성 또는 식물의 생산성(예를 들면, 단백질, 지질 및 전체 생산물 등) 증가를 위한 탄소원으로서 필요한 대사에 참여하여 이를 증가시킬 것으로 기대된다.
본 실시예는 고등식물에 박테리아 효소가 유용성이 있어서 어떤 필수 물질을 다른 것으로 전환시키는 물질대사적 전환이 가능하고, 결과로 생긴 새로운 물질은 다양한 주요 대사적 상호전환에 쉽게 사용될 수 있음을 예시하기 위한 것이다.
〈실시예 20〉 포스포글루코뮤타아제(pgm) 효소를 이용한 당 유도체 함량의 변화
포스포글루코뮤타아제(pgm)는 수크로오스의 합성 및 소비시 포도당(Glc)-1-인산 및 Glc-6-인산의 상호전환을 촉매한다. 상기 효소는 수크로오스, 전분 및 글리코겐의 합성 및 사용에서 중추적인 역할을 하고, 모든 유기체에 존재한다. 상기 효소에 대한 유전자는 박테리아(예를 들면, 아그로박테리움(Argrbacterium)) 뿐만 아니라 다양한 진핵생물에서도 입수 가능하다.
G-1-P 및 G-6-P는 모든 생명체에의 일차 탄수화물 대사 경로에서 필수적인 물질이다. 구체적으로, G-1-P는 수크로스 생합성에 주요 물질인 UDP-포도당의 생성을 위한 일차적인 물질이다. 반면, G-6-P는 다양한 당 상호전환의 주요 출발 물질이고, 이 중 하나가 미오-이노시톨-1-P의 합성이다. 후자는 피트산 및 RFO의 합성에 있어서 각각 주요 물질 및 보조인자이다.
본 실시예의 목적은, 표적 식물에서 박테리아의 PGM 유전자를 과다발현시켜 G-1-P 및 G-6-P의 상대적인 비율을 필요에 따라 조작(조직에 따라)할 수 있게 하는 것이다. 예를 들면, 발생중인 종자(싱크 조직)에 상기 활성을 올바르게 표적으로하면, UDP- 또는 ADP-포도당, 및 이후의 수크로오스 및 다른 저장 물질(단백질, 지질 또는 전분)의 생성에 필요한 G-1-P는 증가하게 될 것이다. 반면, G-6-P의 함량을 감소시키는 효과로 인해 상기 기재한 영양에 유해한 인자의 함량은 감소할 것이다.
〈실시예 21〉 유전자 이식 옥수수 세포의 생성 및 재생
Hi-Ⅱ 유전자형의 미성숙 접합체 배로부터 유형 Ⅱ의 캘러스(callus) 배양을 개시하였다(Armstrong et al, (1991) Maize Genet. Coop. Newslett., 65: 92-93). 수분후 약 14일에, Hi-Ⅱ 부모 A와 Hi-Ⅱ 부모 B를 교배시킨 식물, 또는 자가- 또는 근친-수분시킨 Hi-Ⅱ 식물에서 유래한 F2 배의 온실-재배 이삭으로부터 미성숙 배를 단리하였다. 미성숙 배(1.5 내지 3.5mm)를 N6 염 및 비타민(Chu et al, (1978) The N6 medium and its application to anther culture of cereal crops. Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Peking Press, 43-56), 1.0mg/L의 2,4-D, 25mM의 L-프롤린, 100mg/L의 카제인 가수분해물, 10mg/L의 AgNO3, 2.5g/L의 GELRITE (Schweizerhall, 뉴저지주 사우쓰 플레인필드) 및 20g/L 수크로오스로 구성된 초기 배지(pH 5.8)에서 배양하였다. 6주 후에, 캘러스를 유지 배지(AgNO3가 빠지고 L-프롤린이 6mM로 감소된 초기 배지)에서 배양하였다. 유형 Ⅱ의 캘러스를 약 12 내지 16주 동안 선별하였다.
블라스팅(blasting), 또는 외부 DNA의 식물 세포에 도입(미세입자 충격(bombardment)을 통한 형질전환)을 위해, 74㎕의 2.5M CaCl2, 물 및 30㎕의 0.1M 스퍼미딘(유리 염기)를 DNA 및 물 300㎕에 가하여, 140㎍의 플라스미드 DNA(예를 들면, 35S-PAT-옥수수 글로불린 프로모터-IMT)를 알코올로 세척된 구형 금 입자(1.5 내지 3.0㎛ 직경, Aldrich Chemical Co., Inc., 위스콘신주 밀워키) 60mg에 침전시켰다. 상기 용액을 즉시 볼텍스하고, DNA로 코팅된 금 입자를 가라앉게 하였다. 결과로 생성된 투명한 상층액을 제거하고, 금 입자를 1ml의 순수 에탄올에 재현탁하였다. 상기 현탁액을 순수 에탄올로 희석하여 ml당 15mg의 DNA-코팅 금이 존재하는 현탁액을 수득하였다.
바람직하게, 플라스미드 DNA는 bar 또는 pat 유전자(포스포이노트리신 또는 제초제 글루포시네이트 암모니아에 내성 부여)와 같은 선별 마커를 포함하고, 적합한 종자 선택적 프로모터(옥수수 글로불린 1 프로모터 또는 옥수수 제인 프로모터)의 조절하에 도 24에 기재된 IMT 유전자의 코딩 영역 또는 도 17에 기재된 페룰산 탈카르복실화효소 유전자의 코딩영역과 같은 이차 대사를 변화시킬 수 있는 유전자 구조물을 포함한다. 다른 방법으로, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터 또는 벼의 액틴 프로모터와 같은 구성적 프로모터가 IMT 또는 페룰산 탈카르복실화효소의 발현에 사용될 수 있다.
약 600mg의 배 캘러스 조직을, 카제인 가수분해물 및 L-프롤린이 결여되고 0.2M 소르비톨 및 0.2M 만니톨이 삼투압 유지를 위해 제공되는 유형 Ⅱ 캘러스 유지 배지의 표면에 도포하였다. 캘러스를 전처리 상태로 4시간 동안 유지하고 나서, 블라스팅 배지(7g/L의 GELRITE 대신에 20g/L의 TC 아가로 고형화된 삼투성 배지, PhytoTechnology Laboratories, LLC, Shawnee Mission, KS)를 포함하는 배양 접시에 옮겼다. 헬륨 기체(블라스팅)를 사용하여 현탁된 DNA-코팅 금 입자를 가속화시켜 표적 조적에 도입하였다. 상기 사용된 장치는 미국 특허 제5,141,131호에 기재되어 있고, 이는 참고문헌으로 본 명세서에 포함된다. 조직을 스테인리스 강철 스크린(104㎛ 개구)으로 덮고 장치의 용기 내에 부분적 진공(2.5인치의 수은)하에 놓아두었다. 블라스팅 이전에 상기 DNA-코팅 금 입자를 순수 에탄올로 1 대 1로 추가로 희석하고, 1500psi의 헬륨 압력을 사용하여 캘러스 표적에 20㎕의 DNA 및 금 현탁액을 4회 가속화하였다. 블라스팅 직후에, 조직을 삼투성 배지에 옮겨 16 내지 24시간 세포를 회복시켰다. 이어서, 조직을 작은 조각으로 나누고 선별 배지(카제인 가수분해물 및 L-프롤린이 결여되고, 30mg/L의 BASTA(AgrEvo, 독일 베를린)를 포함하는 유지 배지)에 옮겼다. 매 4주마다 조직 조각을 비선택적으로 신선한 선별 배지에 옮기는 과정을 3개월 동안 수행하였다. 7주 후 및 최대 22주 후에, 생장-억제 조직에 대항하여 증식하는 캘러스 영역을 분리 및 단리하였다. 결과로 생성된 BASTA-내성 조직을 2주에 1회씩 신선한 선별 배지를 제공하며 배양하였다. 적합한 분석 후에, 양성 유전자 이식 계통을 동정하고 재생 배지로 옮겨 배양하였다.
이하 MS 염이라 불리우는 무라시게(Murashige) 및 스쿠그(Skoog) 염 및 비타민(Murashige and Skoog, (1962) Physiol. Plant. 15: 473-497), 30g/L의 수크로오스, 100mg/L의 미오-이노시톨, 30g/L의 만니톨, 5mg/L의 6-벤질아미노푸린(이하 BAP), 0.025mg/L의 2,4-D, 30mg/L의 BASTE 및 2.5g/L의 GELRITE를 포함하는 싸이토키닌-기재의 유도 배지(pH 5.7)에 옮겨 캘러스 조직의 재생을 개시하였다. 일주일 동안은 낮은 조명(125ft-촉광)하에서 배양하였고, 이후의 일주일 동안은 높은 조명(325ft-촉광)하에서 배양하였다. 2주간의 유도 기간 후에, 조직을 비선택적으로 호르몬-결여 재생 배지(2,4-D 및 BAP가 없는 것과 높은 조명하에 배양하는 것 외에 유도 배지와 동일함)에 옮겼다. 작은(1.5 내지 3cm) 묘목을 분리하여 SH 배지(Schenk 및 Hildebrandt, (1972) Can. J. Bot. 50:199-204), 10g/L의 수크로오스, 100mg/L의 미오-이노시톨, 5 mL/L의 FeEDTA 및 2.5g/L의 GELRITE, pH 5.8)가 들어있는 150×25mm 배양 튜브에 넣었다.
큰 묘목은, 생장 및 충분한 뿌리 시스템의 발생이 빨리 나타나도록 온실에서 약 0.25kg의 메트로믹스(METRO-MIX) 360(The Scotts Co., 오하이오주 메리스빌)이 들어있는 12cm의 화분에 옮겼다. 고압 나트륨 및 금속 할라이드 램프의 배합에 의해 제공되는 16시간의 광주기로 묘목을 배양하면서, 세 가지 독립적인 피터스 엑셀(Peters Excel) 비료 제제(Grace-Sierra Horticultural Products Company, 캘리포니아주 밀피타스)의 배합물과 혼합하여 필요한 때에 물을 주었다. 6 내지 8의 잎 단계에, 약 4kg의 METRO-MIX가 들어 있는 5갤런 화분에 식물을 옮기고, 번식력이 있는 유전자 이식 옥수수로 성숙할 때까지 배양하였다. 상기 식물에서 모은 종자는 미성숙 배에 삽입된 유전자를 포함하고 있고, 식물로 자랐을 때 상기 삽입된 DNA에 의해 코딩되는 단백질을 발현할 것이다.
〈실시예 22〉 유전자 이식 벼의 제조
배 생성 캘러스의 제조를 위해, 성숙한 자포니카 쿨티바(Japonica cultiva) (Taipei 309) 종자의 껍질을 벗기고, 70% 에탄올에서 2 내지 5분 동안 처리하고 나서 '리퀴녹스(Liquinox)' 비누가 몇 방울 포함된 50%의 상업적인 표백제(2.6% 하이포염화나트륨)에서 30 내지 45분 동안 처리하여 표면을 멸균하였다. 이어서, 종자를 멸균 증류수로 3회 세척하고, '캘러스 유도' 배지(즉, NB)로 옮기기 전에 여과지 위에 올려놓았다. NB 배지는 pH가 5.8로 조절된 N6 대형 요소(Chu, 1978, The N6 medium and its application to anther culture of cereal crops. Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Peking Press, p43-56) 배지, B5 대형 요소 배지 및 비타민(Gamborg et al., 1968, Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50: 151-158), 300mg/L의 카제인 가수분해물, 500mg/L의 L-프롤린, 500mg/L의 L-글루타민, 30g/L의 수크로오스, 2mg/L의 2,4-디클로로-페녹시아세트산(2,4-D) 및 2.5g/L의 젤라이트(Schweizerhall, NJ)로 구성된다. 캘러스 '유도' 배지에서 배양된 성숙한 종자를 28℃의 어두운 곳에서 배양하였다. 배양 3주 후, 성숙한 배의 소순판 영역으로부터 유도되어 일차로 생성된 캘러스를 신선한 NB 배지에서 추가로 배양하였다.
식물 조직의 바이오리스틱(biolistic) 형질전환을 사용하여 외부 DNA를 도입하였다. 실시예 21에 기재된 바와 같이, 약 140㎍의 플라스미드 DNA를 60mg의 1.0㎛(Bio-Rad) 금 입자에 침전시켰다. hpt(하이그로마이신 포스포전이효소)를 발현시키는 옥수수 유비퀴틴 프로모터, 및 IMT 유전자를 발현시키는 옥수수 유비퀴틴 1, 옥수수 글로불린 1 또는 제인 프로모터를 포함하는 플라스미드를 사용하였다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 약 140㎍의 플라스미드 DNA를 60mg의 1.0㎛(Bio-Rad) 금 입자에 침전시켰다.
헬륨 블라스팅을 위해, 활성적으로 자라는 2 내지 4mm 크기의 캘러스 배양물에 높은 삼투압을 처리하였다. 상기 처리는 헬륨 블라스팅 전에 캘러스를 0.2M 만니톨 및 0.2M 소르미톨을 포함하는 NB 배지(Vain et al., 1993, Osmoticum treatment enhances particle bombardmentmediated transient and stable transformation of maize. Plant Cell Rep. 12: 84-88)에서 4시간 동안 배양하는 것을 포함한다. 삼투압 처리 후에, 캘러스 배양물을 '블라스팅' 배지(NB + 2% 아가)에 옮기고 스테인리스 강철 스크린(230㎛)로 덮었다. 각 표적당 2,000psi의 헬륨 압력으로 캘러스 배양물을 2회 블라스팅하였다. 블라스팅 후, NB 배지와 30mg/L로 구성된 선별 배지로 옮기기 전에 높은 삼투압 배지에서 밤새 배양하였다. 2주 후에, 배양물을 높은 농도의 선별 물질을 포함하는 신선한 선별 배지, 즉 NB + 50mg/L 하이그로마이신(Li et al., 1993, An improved rice transformation system using the biolistic method. Plant Cell Rep. 12: 250-255)으로 옮겼다.
NB + 50mg/L에서 회복된, 촘촘한 백황색의 배 생성 캘러스 배양물을 '전-재생'(PR) 배지 + 50mg/L 하이그로마이신에 옮겨 재생시켰다. PR 배지는 2mg/L의 멘질 아미노푸린(BAP), 1mg/L의 나프탈렌 아세트산(NAA) 및 5mg/L의 아브시스산(ABA)을 포함하는 NB 배지로 구성되어 있다. 어두운 곳에서 2주 동안 배양한 후, 캘러스를 '재생'(RN) 배지로 옮겼다. RN 배지의 조성은 3mg/L의 BAP 및 0.5mg/L의 NAA를 포함하는 NB 배지이다. RN 배지에서의 캘러스 배양물을 높은 형광(325ft-촉광)하의 28℃에서 2주 동안 배양하였다. 묘목이 생성된 후에, 2cm의 발아를 포함하는 묘목을 1/2 B5 비타민, 10g/L의 수크로오스, 0.05mg/L의 NAA, 50mg/L의 하이그로마이신 및 2.5g/L의 젤라이트가 들어있고 pH가 5.8로 조정된 1/2 MS 배지(Murashige 및 Skoog, 1962, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant.15:473-497)를 포함하는 자홍색 상자에 옮겼다. 뿌리 시스템이 잘 발달된, 8 내지 15cm의 큰 식물을 토양(메트로믹스:상층 토양=1:1)에 옮기고 온실에서 배양(29℃의 낮 및 24℃의 밤 주기, 50 내지 60% 습도, 12시간 광주기)하였다. 상기 식물에서 모은 종자는 벼의 캘러스에 삽입된 유전자를 포함하고 있고, 식물로 자랐을 때 상기 삽입된 DNA에 의해 코딩되는 단백질을 발현할 것이다.
SEQUENCE LISTING
〈110〉 GEORGES, FAWZY
DONG, JIN-ZHUO
KELLER, WILF
HUSSAIN, ATTA A. K.
SELVARAJ, GOPALAN
DATLA, RAJU
〈120〉 METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING LEVELS OF SECONDARY
METABOLIC COMPOUNDS IN PLANTS
〈130〉 pct
〈140〉
〈141〉
〈150〉 US 60/072156
〈151〉 1998-01-22
〈150〉 US 09/012453
〈151〉 1998-01-23
〈160〉 7
〈170〉 PatentIn Ver. 2.0
〈210〉 1
〈211〉 483
〈212〉 DNA
〈213〉 Arthrobacter pascens
〈400〉 1
atggaccaat tcgtgggtct ccacatgatc tacacatacg agaacggttg ggagtacgaa 60
atctacatca agaacgacca cacaatcgac taccgtatcc acagtggtat ggtgggtggt 120
aggtgggtga gggaccaaga ggtgaacatc gtgaagctca caaagggtgt gtacaaggtg 180
agctggacag agccaacagg tacagacgtg agcctcaact tcatgccaga ggagaagagg 240
atgcacggtg tgatcttctt cccaaagtgg gtgcacgaga ggccagacat cacagtgtgc 300
taccaaaacg actacatcga cctcatgaag gagagcaggg agaagtacga gacataccca 360
aagtacgtgg tgccagagtt cgctgacatc acatacatcc accacgctgg agtgaacgac 420
gagacaatca tcgctgaggc tccatacgag ggtatgacag acgagatcag ggctggtagg 480
aag 483
〈210〉 2
〈211〉 161
〈212〉 PRT
〈213〉 Bacillus pumilus
〈400〉 2
Met Asp Gln Phe Val Gly Leu His Met Ile Tyr Thr Tyr Glu Asn Gly
1 5 10 15
Trp Glu Tyr Glu Ile Tyr Ile Lys Asn Asp His Thr Ile Asp Tyr Arg
20 25 30
Ile His Ser Gly Met Val Gly Gly Arg Trp Val Arg Asp Gln Glu Val
35 40 45
Asn Ile Val Lys Leu Thr Lys Gly Val Tyr Lys Val Ser Trp Thr Glu
50 55 60
Pro Thr Gly Thr Asp Val Ser Leu Asn Phe Met Pro Glu Glu Lys Arg
65 70 75 80
Met His Gly Val Ile Phe Phe Pro Lys Trp Val His Glu Arg Pro Asp
85 90 95
Ile Thr Val Cys Tyr Gln Asn Asp Tyr Ile Asp Leu Met Lys Glu Ser
100 105 110
Arg Glu Lys Tyr Glu Thr Tyr Pro Lys Tyr Val Val Pro Glu Phe Ala
115 120 125
Asp Ile Thr Tyr Ile His His Ala Gly Val Asn Asp Glu Thr Ile Ile
130 135 140
Ala Glu Ala Pro Tyr Glu Gly Met Thr Asp Glu Ile Arg Ala Gly Arg
145 150 155 160
Lys
〈210〉 3
〈211〉 546
〈212〉 PRT
〈213〉 Arthrobacter pascens
〈400〉 3
Met His Ile Asp Asn Val Glu Asn Leu Asn Asp Arg Glu Phe Asp Tyr
1 5 10 15
Ile Ile Ile Gly Gly Gly Ser Ala Gly Ala Ala Val Ala Ala Arg Leu
20 25 30
Ser Glu Glu Pro Thr Val Ser Val Ala Leu Val Glu Ala Gly Pro Asp
35 40 45
Asp Arg Gly Val Pro Glu Val Leu Gln Leu Asp Arg Trp Met Glu Leu
50 55 60
Leu Glu Ser Gly Tyr Asp Trp Asp Tyr Pro Ile Glu Pro Gln Glu Asn
65 70 75 80
Gly Asn Ser Phe Met Arg His Ala Arg Ala Lys Ile Met Gly Gly Cys
85 90 95
Ser Ser His Asn Ser Cys Ile Ala Phe Trp Ala Pro Arg Glu Asp Leu
100 105 110
Asp Glu Trp Glu Ser Lys Tyr Gly Ala Thr Gly Trp Asn Ala Glu Ser
115 120 125
Ala Trp Pro Leu Tyr Gln Arg Leu Glu Thr Asn Glu Asp Ala Gly Pro
130 135 140
Asp Ala Pro His His Gly Asp Ser Gly Pro Val His Leu Met Asn Val
145 150 155 160
Pro Pro Ala Asp Pro Ala Gly Val Ala Leu Leu Asp Ala Cys Glu Gln
165 170 175
Ala Gly Ile Pro Arg Ala Lys Phe Asn Thr Gly Thr Thr Val Ile Asn
180 185 190
Gly Ala Asn Phe Phe Gln Ile Thr Arg Arg Ala Asp Gly Thr Arg Ser
195 200 205
Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Pro Ile Ile Glu Arg Gly Asn Phe
210 215 220
Thr Leu Leu Thr Gly Leu Arg Ala Arg Gln Leu Val Phe Asp Ala Asp
225 230 235 240
Lys Arg Cys Thr Gly Val Asp Val Val Asp Ser Ala Phe Gly Arg Thr
245 250 255
His Arg Leu Ser Ala Arg Cys Glu Val Ile Leu Ser Thr Gly Ala Ile
260 265 270
Asp Ser Pro Lys Leu Leu Met Leu Ser Gly Ile Gly Pro Ala Ala His
275 280 285
Leu Ala Glu His Gly Val Glu Val Leu Val Asp Ser Pro Gly Val Gly
290 295 300
Glu His Leu Gln Asp His Pro Glu Gly Val Val Gln Phe Glu Ala Lys
305 310 315 320
Gln Gln Met Val Gln Thr Ser Thr Gln Trp Trp Glu Ile Gly Ile Phe
325 330 335
Thr Pro Thr Glu Asn Gly Leu Asp Arg Pro Asp Leu Met Met His Tyr
340 345 350
Gly Ser Val Pro Phe Asp Met Asn Thr Leu Arg Tyr Gly Tyr Pro Thr
355 360 365
Thr Glu Asn Gly Phe Ser Leu Thr Pro Asn Val Thr His Ala Arg Ser
370 375 380
Arg Gly Thr Val Arg Leu Arg Ser Arg Asp Phe Arg Asp Lys Pro Ala
385 390 395 400
Val Asp Pro Arg Tyr Phe Thr Asp Pro Glu Gly His Asp Met Arg Val
405 410 415
Met Val Ala Gly Ile Arg Lys Ala Arg Glu Ile Ala Ala Gln Pro Ala
420 425 430
Met Ala Glu Trp Thr Gly Arg Glu Leu Ser Pro Gly Thr Glu Ala Gln
435 440 445
Thr Asp Glu Glu Leu Gln Asp Tyr Ile Arg Lys Thr His Asn Thr Val
450 455 460
Tyr His Pro Val Gly Thr Val Arg Met Gly Pro Ala Asp Asp Asp Met
465 470 475 480
Ser Pro Leu Asp Pro Glu Leu Arg Val Lys Gly Val Thr Gly Leu Arg
485 490 495
Val Ala Asp Ala Ser Val Met Pro Glu His Val Thr Val Asn Pro Asn
500 505 510
Ile Thr Val Met Met Ile Gly Glu Arg Cys Ala Asp Leu Ile Arg Ala
515 520 525
Ser Arg Thr Gly Glu Thr Thr Thr Ala Glu Ala Glu Leu Ser Ala Ser
530 535 540
Leu Ala
545
〈210〉 4
〈211〉 1641
〈212〉 DNA
〈213〉 Arthrobacter pascens
〈400〉 4
atgcacatcg acaacgtcga aaacctcaac gaccgcgagt tcgactacat catcatcggc 60
ggcggttccg ccggagcggc agtcgccgcc cgcctgagcg aggagcccac cgtgtccgtg 120
gcgctggtgg aggccggccc ggacgaccgc ggcgttcccg aggtactgca gctcgaccgc 180
tggatggagc tgctggaatc cggctacgac tgggactacc cgatcgaacc gcaggagaac 240
ggcaactcct tcatgcgcca cgcccgcgcg aagatcatgg gtggctgctc cagccacaac 300
tcctgcatcg ccttctgggc cccgcgcgaa gacctggacg agtgggagtc caagtacggc 360
gccaccggct ggaacgctga gtccgcctgg ccgctgtacc agcggctgga gaccaacgag 420
gacgccggcc cggacgcgcc gcaccacggc gactcaggcc cggtgcacct gatgaacgtg 480
cccccggcgg accccgccgg cgtcgcactc ctggacgcct gcgaacaggc aggcattccg 540
cgcgcgaagt tcaacaccgg caccaccgtg atcaatggcg ccaacttttt ccagatcaca 600
cgccgcgcgg acggcacccg ttcctccagc tcggtctcct acatccaccc gatcatcgag 660
cgcgggaact tcaccctgct gaccgggttg cgcgcccggc aactggtgtt cgacgcggac 720
aagcgctgca ccggcgtcga cgttgtggac tcggcgttcg gccggactca ccggctctcc 780
gcgcgttgcg aggtcatcct gtccaccggc gccattgact cgcctaagct gctcatgctc 840
tccggcatcg gccccgccgc gcacctcgcc gagcacggcg tcgaggtcct ggtcgactcc 900
cccggtgtcg gcgagcacct gcaggaccac cccgaaggcg tcgtccagtt cgaggccaag 960
cagcagatgg tgcagacttc gacgcagtgg tgggagatcg gcatcttcac ccccaccgag 1020
aacggcctgg accgcccgga cctgatgatg cactacggct ccgtcccgtt cgacatgaac 1080
accctgcggt acggctaccc caccacggag aacggcttca gcctcacgcc gaacgtcacg 1140
cacgcccgct cccgcggcac cgtccggctg cgcagccgcg acttccgcga caagcccgcc 1200
gtcgacccgc ggtacttcac tgatccggag ggccacgaca tgcgcgtcat ggtggccggc 1260
atccgcaagg cccgtgaaat cgccgcccag cctgccatgg ccgaatggac cggccgcgag 1320
ctctcgcccg gcaccgaggc gcagaccgac gaggaactgc aggactacat ccgcaagacg 1380
cacaacaccg tttaccaccc cgtcggcacc gtccgcatgg gaccagccga cgacgacatg 1440
tcgccgctcg accccgagct gcgggtgaag ggcgtgaccg gcctgcgcgt cgccgatgcc 1500
tctgtcatgc ctgaacacgt cacggtcaat cccaacatca ccgtcatgat gatcggcgaa 1560
cgctgcgccg acctcatccg cgccagccgg accggcgaaa caacgacggc ggaggcggag 1620
ctcagcgcgt ccctcgcctg a 1641
〈210〉 5
〈211〉 1494
〈212〉 DNA
〈213〉 Mesembryanthemum crystallinum
〈400〉 5
aaaaaaaaaa ttttacttct ctgttttacc aaaaagagaa aaaaaaatga ctacttacac 60
caatggcaac tacacacaac caaaaaccct agacaaagat gaacaattag ctggtttggc 120
agtgacatta gcaaatgcag ctgcttttcc aatgatcctg aaatcagcct ttgagctaaa 180
aatccttgac atattctcaa aagcagggga aggcgtgttt gtatcgactt ctgagatcgc 240
tagccaaatc ggggcaaaga accctaatgc cccggtgttg ttggaccgga tgctccggct 300
cctggctagc cactctgtgt taacatgcaa gctccaaaag ggtgagggtg gttctcaaag 360
ggtgtatggt ccagctcccc tttgcaacta tcttgctagt aatgatggtc aaggctctct 420
tggccctttg cttgttttgc atcatgacaa ggtcatgatg gagagttggt ttcacttgaa 480
tgattacata ctagaaggag gtgttccatt caagcgcgct catgggatga tccaattcga 540
ctacactggg actgatgaaa ggttcaatca tgtgttcaac caagggatgg cacaccacac 600
tatcctggtc atgaagaagc tccttgacaa ctacaatggg tttaatgatg tcaaggtcct 660
agttgatgtg ggtggtaaca ttggtgtcaa tgtgagcatg atcgtcgcta agcatactca 720
cattaagggc atcaactatg acttgcctca tgtcattgct gatgctcctt cttaccccgg 780
tgtggagcat gttggtggta acatgtttga gagcatacca caagcagatg ccattttcat 840
gaagtgggtg ttgcatgatt ggagcgacga gcattgcgtg aagatactca acaagtgcta 900
tgagagcctg gcaaagggag ggaagatcat ccttgtggaa tcgcttatac cagtaatccc 960
agaagacaac ctcgaatcac acatggtgtt tagccttgat tgccacactt tggtgcacaa 1020
ccaaggtgga aaagagagat caaaggagga ttttgaagcc ttagcttcca agactggctt 1080
ctctacagtt gatgtcattt gctgtgccta tgacacttgg gtcatggagc tctacaagaa 1140
gtgattcaag ctctaaatgc tgtgttgttg tcattgttgc tagcccaagt agctagctag 1200
ctggttaaaa tttctcctac ctagcatttg ttttatggct aagttgagga gattcatgta 1260
ttgtaaatgt tgtgtttggg tttgggtttg tatttgtatt tgtgttttgt tgttgtgtct 1320
ttgtagctaa gttgatatcc tgctcatcta ggctggctgc attttttttg tggctgcctg 1380
acaatgtagc atttgtggtt ttctttcaat aaagcatcta ttgtacctct gttatcagtg 1440
tatgatttgc ctttattttt aataacttaa tttttttttt cttgtttata tcca 1494
〈210〉 6
〈211〉 38
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence: Primer
〈400〉 6
tttttggatc catgactact tacacaatgg caactaca 38
〈210〉 7
〈211〉 37
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence: Primer
〈400〉 7
ttttttttgc ggccgcataa aggcaaatca tacactg 37

Claims (32)

  1. A) 식물 세포에서 형질전환 및 선별에 필요한 DNA 서열 이외에, 포도당, 아미노산, 통상의 지방산 및 뉴클레오티드로부터 선택되는 일차 대사 산물이 아니라는 조건하에 이차 대사 경로에서 상기 산물인 기질의 이용성을 변화시킬 수 있는 단백질을 식물 세포에서 활성을 나타내는 프로모터의 조절하에 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 발현 카세트를, 형질전환 가능하고 전체 식물로 재생 가능한 식물세포에 도입하는 단계, 및
    B) 이차 대사 경로의 산물 중 하나 이상의 함량이 변화된 식물을 회수하는 단계
    를 포함하는, 유전자적으로 형질전환된 식물의 제조 방법.
  2. 종자가 생성되는 조건하에서 제1항의 방법의 단계 A 및 B에 따라 수득된 식물을 배양하는 것을 포함하는, 유전자적으로 형질전환된 종자의 제조 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 프로모터가 조직 선택적인 것인 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 프로모터가 종자 선택적인 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 종자 선택적인 프로모터가 파세올린 프로모터 및 나핀 프로모터로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 이차 대사 경로의 산물이 영양에 유해한 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 이종(heterologous) 효소인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩 단백질이 페닐프로파노이드 경로의 기질 중 하나 이상을 변화시켜 상기 경로의 산물 하나 이상을 변화시킬 수 있는 효소인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 코딩 단백질이 콜린에 작용하여 페닐프로파노이드 경로중의 다른 효소에 의한 콜린의 이용을 변화시킬 수 있는 콜린 대사 효소인 방법.
  10. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 콜린 대사 효소가 콜린 산화효소이며, 상기 콜린 산화효소를 코딩하는 DNA 서열이 식물 세포에서 활성이 있는 종자-선택적 프로모터의 조절을 받는 것인 방법.
  11. 제8항에 있어서, 코딩 단백질이 베타인 알데히드에 작용하여 이를 베타인으로 변환시킬 수 있는 베타인 알데히드 탈수소효소이며, 상기 베타인 알데히드 탈수소효소를 코딩하는 DNA 서열이 식물 세포에서 활성이 있는 종자-선택적 프로모터의 조절을 받는 것인 방법.
  12. 제7항에 있어서, 코딩 단백질이 페룰산 탈카르복실화효소인 방법.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩 단백질이 당 알코올에 작용할 수 있는 효소인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 코딩 단백질이 미오-이노시톨에 작용할 수 있는 효소인 방법.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조되고 시나핀 함량이 감소된, 유전자적으로 변형된 식물 종자.
  16. 제13항의 방법에 따라 제조되고 페놀 함량이 변화된, 유전자적으로 변형된 식물 종자.
  17. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조되고 리그닌 함량이 변화된, 유전자적으로 변형된 식물 종자.
  18. 제13항의 방법에 따라 제조되고 당 알코올 함량이 변화된, 유전자적으로 변형된 식물 종자.
  19. 제13항의 방법에 따라 제조되고 피트산 함량이 감소된, 유전자적으로 변형된 식물 종자.
  20. DNA 벡터 pHS 731.
  21. DNA 벡터 pHS 981.
  22. DNA 벡터 pGS 97b1.
  23. DNA 벡터 pSIMT.
  24. DNA 벡터 pNIMT.
  25. 파세올린 프로모터의 조절하에, COX 유전자, BADH 유전자, IMT 유전자 및 페룰산 탈카르복실화효소 유전자로부터 선택되는 유전자를 포함하는 DNA 벡터.
  26. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되고, 디코틸레도네아 (Dicotyledoneae) 및 모노코틸레도네아(Monocotyledoneae)로부터 선택되는 식물.
  27. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되고, 말바세아 (Malvaceae), 리나세아(Linaceae), 콤포지타(Compositae), 파바세아(Fabaceae), 유포르비아세아(Euphorbiaceae) 및 올레아세아(Oleaceae)과로부터 선택되는 식물.
  28. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되고, 브라시카세아 (Brassicaceae)(=크루시페라(Cruciferae))과인 식물.
  29. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되고, 리눔(Linum), 고시피움(Gossypium), 글리시네(glycine), 아라키스(Arachis), 카르타무스 (Carthamus), 헬리안투스(Helianthus), 메디카고(Medicago), 시나피스(Sinapis), 라파누스(Raphanus), 리시누스(Ricinus), 올레아(Olea), 제아(Zea), 호르디움 (Hordium), 트리티칼레(Triticale) 및 오리자(Oryza)속으로부터 선택되는 식물.
  30. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되고, 브라시카 (Brassica)속인 식물.
  31. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되고, 브라시카 나푸스 (Brassica napus) 또는 브라시카 라파(Brassica rapa)인 식물.
  32. 제2항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 종자 또는 상기 종자에서 유래한 사료를 포함하는 사료 제품.
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