CZ290830B6

CZ290830B6 - Nukleová kyselina, vektor, mikroorganismus, rostlinný DNA genom, buňka a rostlina, způsob jejího získávání a způsob výroby trehalózy z ní

Info

Publication number: CZ290830B6
Application number: CZ19953449A
Authority: CZ
Inventors: Andreas Hoekema; Jan Pen; Mirjam Petronella Does; Den Elzen Petrus Josephus Maria Van
Original assignee: Syngenta Mogen B.V.
Priority date: 1993-06-30
Filing date: 1994-06-30
Publication date: 2002-10-16
Also published as: CZ344995A3; CN1131315C; ATE284446T1; RO115650B1; KR960703436A; HU221124B1; HUP9503723D0; CN1129015A; NO955354D0; WO1995001446A1; NO955354L; UA39958C2; HUT74666A; AU7384694A; ES2229222T3; DE69434173D1; FI956317A0; FI956317A; SK166095A3; JP3645260B2

Abstract

Nukleov kyseliny, kter p°i expresi v rostlin nebo rostlinn bu ce zvy uje obsah trehal zy v t to rostlin nebo rostlinn bu ce, p°i em tato nukleov kyselina v d le uveden m po°ad obsahuje a) oblast iniciace transkripce, kter je funk n v dan rostlin nebo rostlinn bu ce, b) DNA sekvenci k duj c trehal zafosf t synt zu z E. coli a pop° pad , c) oblast terminace transkripce, kter je funk n v dan rostlin nebo rostlinn bu ce. Bin rn klonovac vektor obsahuj c tuto nukleovou kyselinu, mikroorganismus rodu Agrobacterium obsahuj c tento vektor. Zp sob z sk v n rostliny se zv² enou schopnost produkce trehal zy, kter² zahrnuje stupe 1) zav d n do recipientn bu ky rostliny a) nukleov kyseliny podle kter hokoliv z n rok 1 a 4 nebo klonovac ho vektoru podle n roku 5 nebo mikroorganismu podle n roku 6, b) DNA sekvence k duj c selektovateln² markerov² gen, kter² je funk n v dan m rostlinn m hostiteli a pop° pad sekvenci terminace transkripce, je je funk n v dan rostlin a 2) vytvo°en rostliny z transformovan bu ky za podm nek umo uj c ch selekci na p° tomnost selektovateln ho markerov ho genu. DNA genom obsahuj c v² e uvedenou nukleovou kyselinu, bu ky a rostliny s t mto genomem a zp sob v²roby trehal zy z t chto rostlin.\

Description

Vynález se týká modifikace metabolismu rostlinných uhlohydrátů za použití rekombinantních DNA technik, rekombinantní DNA pro toto použití, jakož i rostlin a jejich částí, které byly geneticky modifikovány. Těchto rostlin se může použít pro extrakci specifických uhlohydrátových sloučenin, nebo je lze alternativně zpracovávat na potravu, krmivá nebo krmivové přísady se zlepšenými vlastnostmi díky přítomnosti těchto uhlohydrátových sloučenin, například se zlepšenými zpracovatelskými vlastnostmi. Vynález zejména zahrnuje tyto aspekty: nukleovou kyselinu, která při expresi v rostlině nebo rostlinné buňce zvyšuje obsah trehalózy v této rostlině nebo rostlinné buňce, binární klonovací vektor obsahující tuto nukleovou kyselinu, mikroorganismus obsahující tento vektor, způsob získávání rostliny se zvýšenou schopností produkce trehalózy, DNA genom obsahující výše uvedenou nukleovou kyselinu, buňky a rostliny s tímto genomem a způsob výroby trehalózy z těchto rostlin.

Dosavadní stav techniky

Trehalóza je obecný název, kterým se označují D-glukosyl-D-glukosidy obsahující disacharidy založené na dvou α-, α, β- a β,β-připojených molekulách glukózy. Trehalóza zejména atrehalóza, tj. l-(o-a-D-glukopyranosyl)-l'-o-a-D-glukopyranóza je disacharid, který je velmi rozšířen v přírodě.

Chemická syntéza trehalózy je obtížná (je zapotřebí používat chránících skupin) a neefektivní. Z přírodních zdrojů trehalózy, které jsou v současné době k dispozici, je možno uvést vyšší houby a kvasinky Saccharomyces cerevisiae, které mohou akumulovat nad 10 % sušiny trehalózy. Produkci trehalózy vadí její vysoká reaktivita, jejímž důsledkem je její rychlá metabolizace. Přehled výskytu a metabolismu disacharidu trehalózy, zvláště pak α,α-trehalózy, v živých organismech je uveden v publikaci Elbein A. D. (1974) Adv. Carbohydrate Chem. and Biochem. 30, 227 až 256. Pokud se týče rostlin, byla přítomnost trehalózy oznámena u některých druhů nižších rostlin a u řady druhů vyšších rostlin, které patří do spermatophyta; Echinops persicus, Carex brunescens a Fagus silvaticus. Tyto výsledky však nikdy nebyly nezvratně potvrzeny jinými autory (například Kendall et al., 1990, Phytochemistry 29, č. 8, 2525 až 2528). Tak například Kendall et al. uvádějí ve výše citované publikaci, že z spermatophytes byla přítomnost trehalózy nezvratně zjištěna pouze v semenech kmínu (Carům carvi). Zprávu o přítomnosti trehalózy v slunečnici (Cegla et al., 1977, J.Am. Oil Chem. Soc. 54, 150 a dále) podle Kendalla et al. (viz výše uvedená citace z roku 1990) zpochybnili Kandler et al. (The Biochemistry of Plants, sv. 3, Carbohydrates: Structure and Function; Preiss, J. ed. str. 228. Academie Press). Zprávy o výskytu trehalózy v buku (Fagus sylvaticus) a brukvi nemohly být potvrzeny jinými autory (Kendall et al., výše uvedená citace z roku 1990 a odkazy v ní obsažené).

Přestože se trehalóza ve vyšších rostlinách vyskytuje zřejmě zřídka, přítomnost degradační aktivity trehalózy byla oznámena u celé řady zkoumaných čeledí rostlin. Stabilní vysoká aktivita trehalózy byla zjištěna u tří linií pšenice, borovice (jack pine) a Selaginella lepidophyla. Stabilní nízká aktivita trehalózy byla zjištěna u vojtěšky, „black Mexičan sweet com“ a smrku (white spruce). Labilní slabé aktivity byly zjištěny ve dvou různých suspenzích canola, ale tyto aktivity pravděpodobně nelze vysvětlit specifickou aktivitou trehalózy. Bylo též oznámeno, že ječmen, sveřep, sója a smrk (black spurce) neobsahuje vůbec žádnou aktivitu trehalózy (Kendall, 1990, viz výše).

V organismech, které jsou schopny produkovat trehalózu, se trehalóza pravděpodobně biosyntetizuje ve formě 6-fostátu, zatímco zásobní formou je volný cukr. Proto se předpokládá, že organismy produkující a/nebo ukládající trehalózu budou obsahovat fosfatázu schopnou rozštěpit trehalóza-6-fosfát (Elbein, 1974, výše uvedená citace). O přítomnosti specifických trehalózafosfát fosfatas ve vyšších rostlinách je známo jen málo.

V mezinárodní patentové přihlášce WO 93/17093 Al publikované 2. září 1993 je popsána produkce trehalózy v kvasinkách, které jsou transgenní, pokud se týče genů kódujících trehalózafosfát syntázu. Byl učiněn předpoklad, že byl trehalóza mohla být produkována také ve vyšších rostlinách za použití těchto kvasinkových genů, ale dosud nebyly publikovány žádné zprávy o produkci trehalózy v rostlinách. Přihláška WO 93/17 093 Al byla publikována před datem podání předložené přihlášky, ale po datu její priority.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je nukleová kyselina, která při expresi v rostlině nebo rostlinné buňce zvyšuje obsah trehalózy v této rostlině nebo rostlinné buňce, přičemž tato nukleová kyselina v dále uvedeném pořadí obsahuje

a) oblast iniciace transkripce, která je funkční v dané rostlinně nebo rostlinné buňce,

b) DNA sekvenci kódující trehalózafosfát syntázu z E. coli a popřípadě,

c) oblast terminace transkripce, která je funkční v dané rostlině nebo rostlinné buňce.

Ve výhodném provedení této nukleové kyseliny DNA sekvence kóduje trehalózafosfát syntázu z E. coli o složení odpovídajícím aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO: 3.

V jiném výhodném provedení této nukleové kyseliny DNA sekvence kóduje trehalózafosfát syntázu zE. coli zahrnující otevřený čtecí rámec genu otsA zE. coli, jak je přítomen v pMOG799 uloženém ve sbírce Centraal Bureau voor Schimmelcultures, pod přírůstkovým číslem 430.93.

Místo iniciace transkripce v této nukleové kyselině s výhodou obsahuje promotorovou oblast DNA kódující 35S RNA viru mozaiky květáku a terminátorovou oblast transkripce nopalin syntázového genu z Agrobacterium tumefaciens.

Předmětem vynálezu je také klonovací vektor obsahující nukleovou kyselinu popsanou výše, přičemž tento klonovací vektor je binární vektor.

Dále je předmětem vynálezu také mikroorganismus obsahující výše uvedený vektor, přičemž tento mikroorganismus patří do rodu Agrobacterium.

Předmětem vynálezu je rovněž způsob získávání rostliny se zvýšenou schopností produkce trehalózy, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje stupeň

1) zavádění do recipientní buňky rostliny a) nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 nebo klonovacího vektoru podle nároku 5 nebo mikroorganismu podle nároku 6, b) DNA sekvence kódující selektovatelný markerový gen, který je funkční v daném rostlinném hostiteli a popřípadě sekvenci terminace transkripce, jež je funkční v dané rostlině a

2) vytvoření rostliny z transformované buňky za podmínek umožňujících selekci na přítomnost selektovatelného markerového genu.

Dále je předmětem vynálezu také rekombinantní rostlinný DNA genom obsahující výše uvedenou nukleovou kyselinu podle vynálezu.

-2CZ 290830 B6

Předmětem vynálezu je i rostlinná buňka obsahující rekombinantní rostlinný DNA genom uvedený výše, jakož i kultura těchto rostlinných buněk a rostlina obsahující tyto buňky. Rostliny podle vynálezu produkující trehalózu vykazují zvýšenou odolnost proti suchu. Pod pojmem „rostliny podle vynálezu“ se rozumějí také části rostlin podle vynálezu, jako jsou buňky nebo protoplasty nebo jejich kultury, květy, plody, listy, pyl, kořeny (včetně kultur kořenového vlášení), semena, lodyhy, hlízy (včetně tzv. mikrohlíz) apod.

Konečně je předmětem vynálezu i způsob výroby trehalózy, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje stupeň

1) pěstování rostliny podle nároku 11 za podmínek umožňujících produkci trehalózy,

2) sklizně této rostliny nebo části rostliny a

3) izolace trehalózy z této rostliny nebo části rostliny.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 jsou znázorněny části biosyntetických drah pro sacharózu a škrob v zásobních tkáních rostliny. Tento obrázek ukazuje, že uhlohydrát produkovaný v listech fotosyntézou se transportuje floemovou tkání ve formě sacharózy. Po vstupu do zásobní tkáně se působením aktivity invertázy vázané k membráně převede na monosacharidy, glukózu a fruktózu. Působením řady enzymatických stupňů se tyto monosacharidy převedou na škrob a/nebo sacharózu, jak je zhruba znázorněno na tomto obrázku. Předpokládá se, že glukózové metabolity G65 a UDPG slouží jako substráty pro TPS-enzym zavedený do rostliny prostřednictvím genu otsA exprimovatelného v rostlině. Tento obrázek ukazuje, jak se množství UDPG a G65, které jsou k dispozici jako substráty, zvyšuje snížením hladiny enzymů SPS a AGPázy. Jejich inhibice je označena křížkem.

Na obr. 2 je znázorněna mapa EMBL4 klonu 7F11 od Kohary et al. (1987), obsahujícího otsBA operon z E. coli. 18,8kb inzert je tmavě označen. Jsou zde označena restrikční místa pro enzymy EcoRV a HindlII použitá pro klonování genu otsA, jakož i jejich vzdálenost v kb vzhledem k místu na levé straně inzertu. Také je zde označen gen otsA a B, přičemž směs transkripce ukazují šipky (viz obr. 8, na němž je znázorněna rozšířená mapa).

Na obr. 3 je znázorněna sekvence klonované bramborové SPS cDNA. Podtrženy jsou kukuřičné SPS cDNA sekvence použité jako oligonukleotidy při amplifikační reakci PCR.

Na obr. 4 je schematicky znázorněn binární vektor pMOG664.

Na obr. 5 je znázorněna restrikční mapa části pTiBó ukazující dva fragmenty klonované do pMOG579.

Na obr. 6 je schematicky znázorněn pMOG579 použitý pro sestrojení pomocného plazmidu bez T-oblasti v Agrobacterium kmene MOG101.

Na obr. 7 je schematicky znázorněn expresní vektor pMOG180.

Na obr. 8 je znázorněna rozšířená mapa EMBL4klonu 7F11 od Kohaiy et al. (1987) obsahující operon otsBA z E. coli. Je zde znázorněno umístění otevřeného čtecího rámce (ORF) TPS (*: místa HindlII, která nejsou přítomna v Koharově mapě (viz dále)).

Na obr. 9 je schematicky znázorněn binární vektor pMOG799.

Na obr. 10 je schematicky znázorněn binární vektor pMOG801.

-3CZ 290830 B6

Na obr. 11 je schematicky znázorněn binární vektor pMOG802.

Následuje podrobný popis tohoto vynálezu.

V přednostním provedení zahrnuje vynález rostlinu bramboru, která je schopna produkovat trehalózu v hlízách díky přítomnosti genu exprimovatelného v rostlině, který v dále uvedeném pořadí zahrnuje

a) oblast iniciace transkripce pocházející z 35S RNA CaMV, která je lemována ze strany proti směru exprese genu dvojitým zesilovačem transkripce genu,

b) sekvenci DNA kódující trehalózafosfát syntázu, jež představuje kódující oblast genu otsA umístěného v operonu otsBA operonu E. coli a

c) sekvenci terminace transkripce pocházející z genu nopalin syntázy (nos) z Agrobacterium.

Trehalóza je produkována v hlízách transgenních rostlin obsahujících gen TPS exprimovatelný v rostlině, zatímco kontrolní rostliny, které neobsahují tento gen, trehalózu neprodukují. Trehalózafosfát, který jde produkován v hlízách transgenních rostlin, se zřejmě převádí na trehalózu. Zjevně není nutno zajistit přítomnost aktivity trehalózafosfát fosfatázy, poněvadž tato aktivita se zdá být v bramboru inherentně přítomna.

Na obr. 1 je také ilustrován přístup vedoucí ke zlepšení dostupnosti substrátu pro TPS. K tomuto účelu byly klonovány dva geny ovlivňující dostupnost glukóza-6-fosfátu (G6P) a UDPG s pozitivním SPS genem a pozitivní AGPázou pod kontrolou promotoru CaMV 35S pro expresi v hostitelských rostlinách. Při zavedení do rostlinného hostitele obsahujícího v rostlině exprimovatelný gen TPS podle tohoto vynálezu dojde přitom ke zvýšení dostupnosti substrátu pro TPS a tedy k syntéze trehalózy. Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že pro blokování syntézy sacharózy nebo škrobu za účelem zlepšení dostupnosti substrátu je možno použít také jiných pozitivních genů.

Přestože je vynález podrobně popsán na případu rostliny bramboru, která exprimuje v rostlině exprimovatelný gen trehalózafosfát syntázy zE.coli pod kontrolou promotoruCaMV 35S, jakožto oblasti iniciace transkripce, odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že pro produkci trehalózy se stejně dobře hodí i jiní spermatofytičtí rostlinní hostitelé. Přednostními rostlinnými hostiteli spadajícími do spermatophyta jsou Angiospermae, zejména Dicotyledoneae, které zahrnují mj. Solanaceae, jakožto reprezentativní čeleď a dále též Monocotyledoneae, které zahrnují mj. Gramineae, jakožto reprezentativní čeleď. Vhodní rostlinní hostitelé podle tohoto vynálezu zahrnují rostliny (jakož i jejich části a buňky), které byly geneticky modifikovány za použití techniky rekombinace DNA za účelem vyvolání nebo zvýšení produkce trehalózy v požadované rostlině nebo orgánu rostliny ajejich potomstvo. Těchto rostlin se může použít přímo (například u druhů produkujících jedlé části) nebo po purifikaci trehalózy z použitého hostitele (ať již zjedlého nebo nejedlého rostlinného hostitele). Plodiny sjedlými částmi podle vynálezu zahrnují květové plodiny, jako je květák (Brassica oleracea), artyčok (Cynara scolymus), ovocné plodiny (jako jsou jabloně Malus, například Malus domesticus), banánovníky (Musa, například Musa acuminata), bobuloviny (jako je například rybíz, Ribes, například Ribes rubrum), třešně (jako je například třešeň Prunus, například Prunus avium), okurky (Cucumis, například Cucumis sativus), vinnou révu (Vitis, například Vitis vinifera), citroníky (Citrus limon), melouny (Cucumis melo), ořechoviny (jako je například ořech vlašský, Juglans, například Juglans regia; podzemnice olejná, Arachis hypogeae), pomerančovníky (Citrus, například Citrus maxima), broskvoně (Prunus, například Prunus persica), hrušně (Pyra, například Pyra commulis), papriky (Solanum, například Solanum capsicum), švestky (Prunus, například Prunus domestica), jahodník (Fragaria, například Fragaria moschata), rajče (Lycopersicon, například Lycopersicon aesculentum), listové plodiny, jako je vojtěška (Medicago sativa), brukev

-4CZ 290830 B6 (například Brassica oleracea), endívie (Cichoreum, například Cichoreum endivia), česnek (Allium porrum), hlávkový salát (Lactuta sativa), špenát (Spinacia oleraceae), tabák (Nicotiana tabacum), kořenové plodiny, jako je Marantha arundinacea, řepa (Beta vulgaris), mrkev (Daucus carota), kasava (Manihot esculenta) tuřín (Brassica rapa), ředkev (Raphanus sativus), yam (Dioscorea esculenta), sladké brambory (Ipomoea batatas) a plodiny pěstované na semeno, jako je fazol (Phaseolus vulgaris), hrách (Pisum sativum), sója (Glycine max), pšenice (Triticum aestivum), ječmen (Hordeum vulgare), kukuřice (Zea mays), rýže (Oryza sativa), plodiny, u nichž se sklízejí hlízy, jako jsou kedlubny (Brassica oleraceae), brambor (Solanum tuberosum) apod. Jedlé části je možno konzervovat sušením v přítomnosti zvýšené hladiny trehalózy v nich produkované díky tomu, že tyto rostliny obsahují v rostlině exprimovatelný gen trehalózafosfát syntázy. Může být výhodné produkovat zvýšenou hladinu trehalózy tak, že se DNA kódující aktivitu TPS umístí pod kontrolu promotoru specifického pro určitý orgán nebo tkáň rostliny, přičemž volbu takového promotoru může snadno provést odborník v tomto oboru.

Může se použít jakéhokoliv genu pro trehalózafosfát syntázu, který je pod kontrolou regulačních prvků potřebných pro expresi DNA v rostlinných buňkách, a to buď specificky nebo konstitutivně, pokud je schopen produkovat aktivitu trehalózafosfát syntázy. Sekvenci nukleových kyselin znázorněnou v SEQ ID NO: 2 a ve skutečnosti jakýkoliv otevřený čtecí rámec kódující aktivitu trehalózafosfát syntázy podle tohoto vynálezu je možno měnit, aniž by bylo nutno měnit aminokyselinovou sekvenci proteinu jím kódovaného. Tato skutečnost je způsobena degenerací genetického kódu. Otevřený čtecí rámec kódující aktivitu trehalózafosfát syntázy je možno přizpůsobit použití v kodonu zvolené hostitelské rostliny.

Izolované sekvence nukleových kyselin SEQ ID NO:2 se také může použít pro identifikaci aktivity trehalózafosfát syntázy v jiných organismech a její následnou izolaci hybridizací DNA z jiného zdroje s DNA- nebo RNA-fragmentem, který lze získat z genu E. coli. Přednostně se takové sekvence DNA podrobí screeningu hybridizací za stringentních podmínek (jako je například teplota a iontová síla hybridizační směsi). Okolnost, zda podmínky jsou stringentní, nebo ne, závisí také na druhu hybridizace, tj. na poměru DNA : DNA, DNA : RNA, RNA : RNA, jakož i na délce nejkratšího hybridizačního fragmentu. Odborníci v tomto oboru jsou schopni zajistit stringentní režim hybridizace.

Zdroje pro izolaci aktivity trehalózafosfát syntázy zahrnují mikroorganismy (například bakterie, kvasinky a houby), rostliny, zvířata apod. Podobně se může při způsobu výroby trehalózy podle tohoto vynálezu použít i izolovaných sekvencí DNA kódujících aktivitu trehalózafosfát syntázy, které pocházejí z jiných zdrojů.

Do rozsahu vynálezu spadají také sekvence nukleových kyselin, které byly získány modifikací sekvence nukleových kyselin znázorněné v SEQ ID NO:2 mutací jednoho nebo více kodonů tak, aby došlo v kódovaném proteinu ke změnám aminokyselin, za předpokladu, že taková mutace aminokyselinové sekvence úplné nezruší aktivitu trehalózafosfát syntázy.

V zásadě se pro vynález hodí jakýkoliv rostlinný hostitel v kombinaci s jakýmkoliv v rostlině exprimovatelným genem trehalózafosfát syntázy. Pro získání takové kombinace v rostlině exprimovatelného genu s rostlinným hostitelem trehalózafosfát syntázy se podobně může použít i genů trehalózy z jiných zdrojů, když se stanou dostupnými.

Inhibice endogenních genů za účelem zvýšení dostupnosti substrátu pro trehalózafosfát syntázu, která je zde ozřejměna na příkladu inhibice endogenního sacharózafosfát syntázového genu a ADP-glukosa pyrrofosforylázového genu, se může provést řadou alternativních způsobů, jejich volba není pro vynález kritická. Přednostně se inhibice provádí tzv. pozitivním způsobem („antisense approach“). Přitom se exprimuje sekvence DNA produkující RNA, jež je alespoň zčásti komplementární s RNA kódující enzymatickou aktivitu, která má být blokována (například AGPázu nebo SPS v příkladech). Přednostně se používá homologických pozitivních genů, poněvadž ty jsou účinnější než heterologické geny. Izolace pozitivního SPS genu z bramboru za

- 5 CZ 290830 B6 použití sekvence kukuřičného SPS genu, jakožto próby, může ilustrovat proveditelnost této strategie. Neznamená to však, že pro provádění vynálezu je nutno použít homologických pozitivních fragmentů. Alternativní metoda blokování syntézy nežádoucích enzymatických aktivit spočívá v zavedení přídavné kopie endogenního genu přítomného v rostlinném hostiteli do genomu rostlinného hostitele. Často je pozorováno, že taková přídavná kopie genu utlumí endogenní gen. Tento účinek je v literatuře označován názvem „ko-subpresivní účinek“ nebo „ko-suprese“.

Pro modifikaci spočívající v zavedení v rostlině exprimovatelného genu podle tohoto vynálezu do recipientní buňky a pro pěstování nové rostliny nesoucí a exprimující tento v rostlině exprimovatelný gen lze v zásadě použít jak dvojděložných, tak jednoděložných rostlin, které jsou přístupné pro transformaci. Přednostními rostlinami podle tohoto vynálezu jsou rostliny, které jsou schopny konvertovat trehalóza fosfát na trehalózu a které neobsahují žádnou nebo obsahují jen nízkou aktivitu degradující trehalózu. Do rozsahu tohoto vynálezu však spadají i rostliny postrádající schopnost konvertovat trehalózafosfát na trehalózu. Takové rostliny je možno dále modifikovat zavedením přídavných genů kódujících fosfatázy, které jsou schopny převádět trehalózafosfát na trehalózu. V principu přicházejí v úvahu také rostliny obsahující trehalózy, poněvadž takové rostliny je možno přizpůsobit pro produkci trehalózy inhibici aktivity takových enzymů, například inhibici exprese genů kódujících takové enzymy za použití „pozitivního způsobu“.

Metoda, jakou se v rostlině exprimovatelný gen trehalózafosfát syntázy zavádí do recipientní rostlinné buňky, není rozhodující, za předpokladu, že je tento gen stabilně zabudován do genomu příslušné rostlinné buňky. Kromě použití kmenu rodu Agrobacterium jsou pro zavádění DNA do rostlinných buněk k dispozici i různé jiné techniky, jako je transformace protoplastů za použití metody s vápníkem a polyethylenglykolem, elektroporace a mikroinjekce nebo bombardování (potaženými) částicemi (Potrykus, 1990, Bio/Technol. 8, 535 až 542).

Kromě tzv. přímých metod transformace DNA jsou v širokém rozsahu dostupné také transformační systémy zahrnující vektory, jako jsou virové vektory (například z viru mozaiky květáku (CaMV) a bakteriální vektory, například z genu Agrobacterium) (Potrycus, 1990, Bio/Technol. 8, 535 až 542). Po selekci a/nebo screeningu se z protoplastů, buněk nebo částí rostlin mohou regenerovat celé rostliny za použití způsobů, které jsou dobře známy v tomto oboru (Horsch et al., 1985, Science 225, 1229 až 1241).

Již by lo ukázáno, že jednoděložné rostliny jsou vhodné pro transformaci a že fertilní transgenní rostliny je možno regenerovat z transformovaných buněk. Takovou transformaci umožnil vývoj reprodukovatelných systémů tkáňových kultur pro tyto plodiny, spolu s účinnými metodami zavádění genetického materiálu do rostlinných buněk. Jako přednostní způsoby transformace jednoděložných rostlin lze v současné době uvést bombardování explantátů nebo suspenzí buněk mikroprojektily a přímé zavádění DNA či elektroporaci (Shimamoto et al., 1989, Nátuře 338, 274 až 276). Transgenní rostliny kukuřice byly získány zaváděním bar-genu z Streptomyces hygroscopicus kódujícího fosfinothricin acetyltransferázu (což je enzym inaktivující herbicid fosfinothricin) do embryogenních buněk kukuřičné suspenzní kultury bombardováním mikroprojektily (Gordon-Kamm, 1990, Plant Cell 2, 603 až 618). Bylo též oznámeno zavádění genetického materiálu do aleuronových protoplastů jiných jednoděložných plodin, jako je pšenice a ječmen (Lee 1989, Plant Mol. Biol. 13, 21 až 30). Rostliny pšenice byly regenerovány zembryogenní suspenzní kultury selekcí pouze stárnutého kompaktu a tkání modulárního embryogenního kaliu pro přípravu embryogenních suspenzních kultur (Vasil, 1990, Bio/Technol. 8, 429 až 434). Kombinace s transformačními systémy pro tyto plodiny umožňuje aplikovat způsob podle vynálezu na jednoděložné rostliny. Těchto metod je také možno použít pro transformaci a regeneraci dvojděložných rostlin.

Jednoděložné rostliny, včetně z obchodného hlediska důležitých plodin, jako je kukuřice, jsou použitelné pro přenos DNA prostřednictvím kmenů Agrobacterium (EP 159 418 Bl, Gould J.,

-6CZ 290830 B6

Michael D., Hasegawa O., Ulian E. C., Peterson G., Smith R. H. (1991) Plant Physiol. 95, 426 až 434).

Pokud se týče volby hostitelské rostliny, dává se přednost rostlinným druhům, které nevykazují žádnou nebo vykazují jen nízkou degradační aktivitu pro trehalózu. Rostliny vykazující trehalózovou aktivitu nejsou však vyloučeniny z vhodných hostitelských rostlin pro produkci trehalózy, přestože může být nutné zajistit inhibici trehalózové aktivity, pokud tato aktivita vůbec brání akumulaci trehalózy. Takové inhibice je možno dosáhnout za použití pozitivního způsobu, který je dobře znám v tomto oboru a který je ilustrován pro účely tohoto popisu.

Také je třeba chápat, že vynález se neomezuje na použití promotoru CaMV 35S, jakožto oblasti iniciace transkripce. Vhodné sekvence DNA pro řízení exprese genů exprimovatelných v rostlině, včetně markerových genů, jako jsou oblasti iniciace transkripce, zesilovače transkripce, nepřepisované vedoucí sekvence apod. mohou být odvozeny zjakéhokoliv genu, který je exprimován v rostlinné buňce, jako jsou endogenní rostlinné geny, geny přirozeně exprimované v rostlinných buňkách, jako jsou geny obsažené v T-DNA divokého typu Agrobacterium, geny rostlinných virů, jakož i jiné eukaryontní geny obsahující oblast iniciace transkripce vyhovující pozitivní sekvenci pro iniciaci eukaryontní transkripce. Také sem spadají hybridní promotory, v nichž jsou kombinovány funkční části různých promotorů nebo jejich syntetických ekvivalentů. Kromě konstitutivních promotorů se také může pro řízení exprese genů exprimovatelných v rostlině podle tohoto vynálezu používat i indukovatelných promotorů nebo promotorů jinak regulovaných při expresi, například promotorů regulovaných specifickým stadiem vývoje nebo typem buňky, za předpokladu, že jsou exprimovány v částech rostliny obsahujících substrát pro TPS.

Aby bylo možno provádět selekci nebo screening transformovaných buněk, přednostně se do rostlinné buňky zavádí také markerový gen připojený k v rostlinně exprimovatelnému genu podle vynálezu. Volba vhodného markerového genu při transformaci rostliny leží v rozsahu zkušeností odborníků v tomto oboru. Jako několik příkladů rutinně používaných markerových genů je možno uvést gen neomycinfosfotranferázy, udělující odolnost vůči kanamycinu (EP-B 131 623), glutathion-S-transferázový gen z krysích jater, udělující odolnost vůči herbicidům glutathionové řady (EP-A 256 223), glutamin syntetázový gen, který při nadexpresi uděluje rezistenci vůči inhibitorům glutamin syntetázy, jako je fosfinothricin (WO 87/05327), acetyltransferázový gen z Streptomyces viridochromogenes, udělující resistenci vůči selekčnímu činidlu fosfinothricinu (EP-A 275 957), gen kódující 5-enolshikimate-3-fosfát syntézu (EPSPS), který uděluje toleranci vůči N-fosfonomethylglycinu, gen bar udělující rezistenci vůči Bialaphos (viz například WO 91/02 071) apod. Skutečný výběr markéru nemá rozhodující význam, pokud je zvolený markér funkční (tj. selektivní) v kombinaci se zvolenými rostlinnými buňkami.

Markerový gen nemusí být spojen s genem, který je předmětem zájmu, poněvadž kotransformace nespojených genů (US 4 399 216) představuje také účinný postup transformace rostlin.

Přednostním rostlinným materiálem pro transformaci, zejména v případě dvojděložných rostlin, jsou listové kotoučky, které lze snadno transformovat a vykazují dobrou schopnost regenerace (Horsch R.B.etal., 1985, Science, 227, 1229 až 1231).

Přestože lze trehalózu produkovat za použití v rostlině exprimovatelného genu trehalózafosfát syntázy, jakožto jediného genu modifikujícího uhlohydráty, vynález je dále ilustrován na příkladech zahrnujících přídavné v rostlině exprimovatelné pozitivní geny, které jsou schopny zvýšit dostupnost substrátu pro trehalózafosfát syntázu. Jako specifické příklady takových genů je možno uvést v rostlině exprimovatelné pozitivní geny pro SPS z kukuřice a bramboru a AGPázu z bramboru. Potlačovací regulace enzymů modifikujících uhlohydráty za použití pozitivního způsobu není omezena konkrétními příklady. Tak například se pro inhibici exprese cílového genu může použít zčásti komplementárních v rostlině exprimovatelných pozitivních genů, za předpokladu, že v rostlině exprimovatelné pozitivní geny produkují transkript, který je

-7CZ 290830 B6 dostatečně komplementární s transkriptem cílového genu a který je dostatečně dlouhý, aby inhibovat expresi tohoto cílového genu.

Pro vynález je zcela nerozhodující, jak je přítomnost dvou nebo více genů v téže rostlině zajištěna. Přitom je možno mj. použít některé z následujících metod:

a) transformace rostlinné linie vícegenovým konstruktem obsahujícím více než jeden zaváděný gen,

b) simultánní kotransformace téže rostlinné linie různými konstrukty,

c) několik cyklů transformace stejné rostliny zaváděnými geny,

d) křížením dvou rostlin, z nichž každá obsahuje odlišný gen zavedený do stejné rostliny.

Vynález je možno aplikovat v zemědělství a v zahradnictví, což například vyplývá ze zlepšených vlastností modifikovaných rostlin jako takových, nebo z požadavků kteréhokoliv odvětví průmyslu, v němž má být trehalózy použito. Trehalózafosfátu a trehalózy se může používat jako takových, například v purifikované formě nebo ve formě přísad nebo ve formě zásobního produktu v částech rostlin. Částí rostlin obsahujících trehalózafosfát nebo trehalózu (nebo zvýšené množství těchto látek) se může používat jako takových nebo po zpracování bez potřeby přidávat trehalózu.

Trehalózu je možno purifikovat z rostlin nebo částí rostlin, v nichž je produkována a potom sejí může používat při různých průmyslových postupech. V potravinářském průmyslu se může trehalózy používat jako přísady k potravinám před sušením. Sušení potravin je důležitý průmyslový způsob konzervace. Trehalóza je užitečná zejména při konzervaci potravinářských výrobků konvenčním sušením na vzduchu a umožňuje rychlou rekonstituci přídavkem vody za vzniku vysoce kvalitního produktu (Roser et al., července 1991, Trends in Food Science and Technology, str. 166 až 169). Přitom se s výhodou zachovají přirozené příchutě a vůně a nutriční hodnota (proteiny a vitaminy) čerstvého produktu. Zjistilo se, že trehalóza je schopna stabilizovat proteiny a membrány a vytvářet chemicky inertní stabilní sklo. Nízká vodná aktivita takových důkladně vysušených potravinářských produktů zabraňuje průběhu chemických reakcí, které jsou příčinou degradačních procesů.

Jako přírodního zdroje pro masovou produkci uhlohydrátů (škrobů a sacharózy) se odedávna používá polních plodin, jako je kukuřice, kasava, brambory, řepa cukrová a cukrová třtina. Produkci trehalózy v takových plodinách lze zajistit metodami genového inženýrství, kterými se do těchto rostlinných druhů zavede biosyntetická dráha vedoucí ktrehalóze. To by umožnilo využít takto transformovaných plodin pro výrobu trehalózy.

Úroveň dosavadního stavu techniky je doložena citacemi uvedenými v tomto popisu. Všechny tyto citace, ať již se jedná o patenty nebo jiné publikace, jsou zde uvedeny náhradou za přenesení jejich celého obsahu jednotlivě do popisu tohoto vynálezu.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

Příklady provedení vynálezu

DNA manipulace

Všechny postupy s DNA (izolace DNA z E. coli, restrikce, ligace, transformace atd.) se provádějí podle standardních protokolů (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,

2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, USA)

-8CZ 290830 B6

Kmeny

Ve všech příkladech se pro klonování používá E. coli K-12 kmene DH5a. Jako kmene Agrobacterium tumefaciens, pro pokusy s transformací rostlin se používá kmene MOG101, což je neonkogenní pomocný kmen oktopinového typu získaný z kmene LBA1010 (Koekman et al., 1982 Plazmid 7, 119) substitucí T-DNA markérem rezistence vůči spektinomycinu.

Konstrukce kmene Agrobacterium MOG101

Pro přenesení genových konstruktů do rostliny bramboru a tabáku se použije binárního vektorového systému (Hoekema A., Hirsch, P. R., Hooykaas P. J. J. a Schilperoort, R. A., 1983, Nátuře 303, 179. Pomocný plazmid dodávající Agrobacterium tumefaciens virulentní funkce se získá z oktopinového Ti-plazmidu pTiB6. MOG101 je kmen Agrobacterium tumefaciens nesoucí neonkogenní Ti-plazmid (Koekman et al., 1982, výše uvedená citace), z něhož se vypustí celá Toblast a nahradí se bakteriálním markérem rezistence vůči spektinomycinu z transpozonu Tni831 (Hooykaas et al., 1980, Plazmid 4, 64 až 75).

Ti-plazmid pTiB6 obsahuje dvě sousední T-oblasti, tj. TL (T-levá) a TR (T-pravá). Pro získání derivátu neobsahujícího TL- a TR-oblast se zkonstruuje intermediámí faktor pMOG579. Plazmid pMOG579 je derivátem pBR322, který obsahuje dva Ti-plazmidové fragmenty, které jsou homologické s fragmenty umístěnými na levé a pravé straně mimo T-oblasti pTiB6 (na obr. 5 a 6 označeny tmavě). Tyto dva fragmenty jsou vpMOG579 odděleny 2,5kb fragmentem BamHI-Hind3 ztransposonu Tni831 (Hooykaas et al., 1980, Plazmid 4, 64 až 75) nesoucího markér resistence vůči spektinomycinu (viz obr. 6). Tento plazmid se zavede do kmene Agrobacterium tumefaciens LBA1010 [C58-C9 pTiB6) = upravený (cured) kmen C58, do něhož byl zaveden pTiB6 (Koekman et al. (1982), výše uvedená citace)] triparentální kopulací z E. coli za použití HB101 8pRK2013, jako pomocného prostředku. Provede se selekce transkonjugantů na resistenci vůči rifampicinu (20 mg/litr) a spektinomycinu (250 mg/litr). Dvojnásobná rekombinace mezi pMOG579 a pTiB6 má za následek ztrátu resistence vůči karbenicilinu (markér pBR322) a deleci celé T-oblasti. V 5 000 spektinomycin-resistentních transkonjugantech replikovaných na karbenicilin (100 mg/litr) se zjistí 2 senzitivní transkonjuganty. Analýza Southern (není znázorněna) ukazuje, že dvojnásobné křížení má za následek vypuštění celé Toblasti. Výsledný kmen se označí názvem MOG101. Tento kmen a jeho konstrukce jsou analogické kmenu GV2260 (Deblaere et al., 1985, Nucl. Acid Res. 13, 4777 až 4788).

Alternativním pomocným kmenem pro MOG101 je například LBA4404. Tohoto kmene lze také účelně použít pro zavedení binárního plazmidu, jako je pMOG799 a následující transformaci rostliny. Snadno dostupné jsou i jiné vhodné pomocné kmeny.

Konstrukce expresního vektoru pMOG180

Expresní vektor pMOG180 je derivátem pMOG180 (EP 0 479 359 Al, příklad 2B), z něhož se odstraní gen kódující GUS a do něhož se mohou vložit jiné geny mezi vedoucí sekvenci A1MV RNA4 a 3'nos terminační sekvenci, jako fragment BamHI.

K tomuto účelu se syntetizuje fragment EcoRI/NcoI zpMOG18 obsahujícího promotor 35S a vedoucí sekvenci A1MV RNA4 za použití PCR technologie a primerů.

5' GTTTCTACAGGACGGAGGATCCTGGAAGTATTTGAAAGA 3' a

5’ CAGCTATGACCATGATTACG 3 *, čímž dojde k mutaci místa Ncol na místo BamHI. Potom se vektor pMOG18 rozštěpí EcoRI a BamHI a nově syntetizovaný fragment EcoRI/BamHI se může ligovat mezi tato dvě restrikční místa. Aby nedošlo k PCR-indukovaným nepravidelným mutacím v sekvencích promotoru,

-9CZ 290830 B6 nahradí se fragment EcoRI/EcoRV ve fragmentu EcoRI/BamHI syntetizovaném PCR sekvencemi divokého typu zpMOG18. Krátký fragment EcoRV/BamHI se zkontroluje na mutace sekvenováním. Výsledným expresním vektorem je plazmid pMOG180 (obr. 7).

Triparentální kopulace

Binární vektory se mobilizují při triparentálních kopulacích s kmenem E. coli HB101 obsahujícím plazmid pRK2013 (Ditta, G., Stanfield S., Corbin D. a Helinski D. R. et al., (1980) Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 77, 7347) do kmene Agrobacterium tumefaciens MOG101 a použije se jich pro transformaci.

Transformace tabáku (Nicotiana tabacum SRÍ)

Tabák se transformuje kokultivací rostlinné tkáně s kmenem Agrobacterium tumefaciens MOG101 (Hoekema et al., 1983, Nátuře 303, 179 až 180) obsahujícím popsaný binární vektor, který je předmětem zájmu. Transformace se provádí kokultivací listových kotoučků tabáku (Nicotiana tabacum, odrůda Petit Havana SRÍ) způsobem popsaným vHorsch et al., 1985, Science 227, 1229 až 1231). Transgenní rostliny se regenerují z kořenů rostoucích na selekčním médiu obsahujícím buď kanamycin nebo hygromycin, podle toho, jaký gen rezistence je obsažen v binárním plazmidu. Po vytvoření kořenů se rostliny přenesou do půdy.

Transformace bramboru

Brambor (Solanum tuberosum odrůda Désiree) se transformuje kmenem Agrobacterium tumefaciens MOG101, který obsahuje binární vektor, který je předmětem zájmu (Hoekema A, Huisman M. J., Molendijk, L., Van den Elsen P. J. M. a Comelissen B. J. C. (1989), Bio/technology 7, 273). Jako základního kultivačního média se použije MS30R30, které se skládá z média MS (Murashige T. a Skoog F. (1962) Physiol. Pian 14, 473) doplněného sacharosou (30 g/litr), vitaminy R3 (Ooms G., Burrell Μ. M., Karp A., Bevan M. a Hille J. (1987) Theor. Appl. Genet. 73, 744), zeatinribosidem (ZR) (5μΜ) a indoloctovou kyselinou (IAA) (0,3μΜ). Pokud je to zapotřebí, nechá se médium ztuhnout za použití agaru Daichin při koncentraci 0,7 g/litr.

Hlízy Solanum tuberosum odrůdy Désiree se oloupají a povrchově sterilizují 20minutovým působením 0,6% roztoku chlornanu s obsahem 0,1 % smáčedla Tween-20. Brambory se důkladně perou za použití velkého objemu sterilní vody po dobu přinejmenším 2 hodin. Z válečků bramborové tkáně vyříznutých korkovrtem se nařežou kotoučky o tloušťce asi 2 mm a tyto kotoučky se inkubují 20 minut v suspenzi skládající se z média MS30R3 bez ZR a IAA s obsahem 10⁶ až 10⁷ bakterií/ml Agrobacterium MOG101, který obsahuje binární vektor. Kotoučky se potom za sucha blotují na sterilní filtrační papír a přenesou na tuhé médium MS30R3 sZR a IAA. Po dvou dnech se kotoučky přenesou na čerstvé médium s lOOmg/litr cefotaximu a 50 mg/litr vangomycinu. Za další týden se kotoučky znovu přenesou do stejného média, které však tentokrát obsahuje kanamycin (100 mg/litr) a účelem selekce na transgenní výhony. Po 4 až 8 týdnech se výhonky odříznou od kotoučků a umístí do kořenového média (médium MS30R3 bez ZR a IAA, ale s cefotaximem (100 mg/litr) a kanamycinem (100 mg/litr)). Výhody se propagují axenicky pomocí meristémových řízků a po vývoji kořenů se přenesou do půdy. Pokud je to vhodné, použije se pro selekci místo kanamycinu (100 mg/litr) hygromycinu (10 mg/litr).

Transformace bramboru odrůdy Kardal se provede v podstatě stejným způsobem jako v příkladě odrůdy Désiree, s tím rozdílem, že se použije následujících modifikací: v základním kultivačním médiu jsou přítomny jako fytohormony zeatinribosid (3 mg/litr) a IAA (kyselina indoloctová) (0,03 mg/litr). Suspenze Agrobacterium použitá pro transformaci obsahuje 10⁵ až 10⁶ bakterií v 1 ml. Koncentrace kanamycinu v kořenovém médiu je 50 mg/litr.

-10CZ 290830 B6

Stanovení trehalózy

Trehalóza se stanovuje v podstatě způsobem popsaným v publikaci Hottiger et al. (1987) J. Bact. 169, 5518. Tkáň bramborových hlíz se zmrazí v kapalném dusíku, rozmělní na prášek v třecí misce a potom 60 minut extrahuje při teplotě místnosti za použití přibližně tří objemů 500mM kyseliny trichloroctové. Po centrifugaci se peleta ještě jednou stejným způsobem extrahuje. Spojené supematanty z těchto dvou extrakcí se zkoušejí na anthron-pozitivní látku (Spiro R. G., (1966) Meth. Enzymol. 8, 3). Trehalóza se stanoví kvalitativně pomocí chromatografie na tenké vrstvě. Extrakty se deionizují (ionex V, Měrek) a nanesou na desky se silikagelem 60 (Měrek). Po chromatografii se vyvíjení desek provede směsí n-butanolu, pyridinu a vody v objemovém poměru 15 : 3 : 2. Skvrny se vizualizují postříkáním roztokem vanilinu (5 mg/ml) v koncentrované kyselině sírové a zahřátím na 130 °C. Jako standardu se použije obchodně dostupné trehalózy (Sigma).

Alternativně se trehalóza stanovuje kvantitativně chromatografií na anexu za použití pulzní amperometrické detekce. Extrakty se připraví přídavkem 1 ml vroucí vody k 1 g zmrazené látky a následujícím 15minutovým zahříváním na 100 °C. Vzorky (25 μΐ) se analyzují v kapalinovém chromatografií (Dionex DX-300), který je vybaven kolonou 4 x 250 mm Dionex 35391 carbopac PA-1 a předkolonou 4 x 50 mm Dionex 43096 carbopac PA-1. Eluce se provádí lOOmM hydroxidem sodným rychlostí 1 ml/min. Cukry se detekují pomocí pulzního amperometrického detektoru (Dionex, PAD-2). Jako standardu se použije obchodně dostupné trehalózy (Sigma).

Stanovení enzymů

Při všech stanoveních se pro kontrolu používá materiálu z hlíz netransgenních hlíz nebo netransgenního tabáku. Obsah proteinu ve všech vzorcích se stanoví podle Bradforda (Bradford (1976) Anal. Biochem. 72, 248). V případě stanovení v extraktech hlíz se zmrazené kotoučky hlízy bramboru o hmotnosti přibližně 100 mg homogenizují ve 100 μΐ 20mM pufru HEPES o pH 7,4 a provede se centrifugace (Eppendorf, 5 minut při nastavení na nejvyšší rychlost). Supematantu se použije pro zkoušky aktivity.

Aktivita SPS

Aktivita SPS se stanoví v podstatě způsobem popsaným vAmirJ. a Preiss J. (1982) Plant Physiol. 63, 1027 až 1030. Změnami složení reakční směsi se mohou stanovit dvě různé formy aktivity SPS; V_max a V_sei. Reakční směs V_max obsahuje 3,2mM UDP-glukózu, 81μΜ [¹⁴C]-UDPglukózu, 3,2mM fruktóza-6-fosfát, 16mM glukóza-6-fosfát, lOOmM HEPES o pH 7,4, 20mM chlorid horečnatý a 5mM kyselinu ethylendiamintetraoctovou (EDTA) v celkovém objemu 50 μΐ. V reakční směsi V_sei je koncentrace fruktóza-6-fosfátu a glukóza-6-fosfátu poloviční a navíc je přidán anorganický fosfát (5mM). Pro kontrolu se aktivita SPS měří v reakční směsi V_max bez fruktóza-6-fosfátu a glukóza-6-fosfátu. Reakce se provádí při teplotě místnosti po dobu 30 minut a zastaví se zahřátím směsi (5 minut na 95 °C). Produkty reakce se zpracují alkalickou fosfatázou a vzniklá [¹⁴C]-sacharóza se ze substrátů oddělí ionexovou chromatografií. Množství radioizotopem značené sacharózy vzniklé při reakci se změří v scintilačním počítači.

Aktivita TPS

Aktivita TPS se měří podobným způsobem, jako aktivita SPS. Po chromatografii na ionexu obsahují vzorky defosforylovanou sacharózu a trehalózu. Pro stanovení podílu trehalózy ve vzniklých produktech se vzorky podrobí chromatografii na tenké vrstvě charakterizované v tomto popisu. Extrakty se deionizují (ionex V, Měrek) a nanesou na silikagelové desky (Silica Gel 60, Měrek). Po chromatografii se skvrny obsahující [¹⁴C]-sacharózu a [¹⁴C]-trehalózu seškrábnou a jejich radioaktivita se změří ve scintilačním počítači.

-11CZ 290830 B6

Aktivita AGPázy

Aktivita AGPázy se stanoví způsobem popsaným v publikaci Miiller- Róber B., Sonnewald U. a Willmitzer L. (1992) EMBO J. 11, 1229. Produkce glukóza-1-fosfátu z ADP-glukózy se stanoví v systému s NAD-připojenou glukóza-6-fosfát dehydrogenázou. Reakční směs pro stanovení obsahuje 80mM HEPES o pH 7,4, lOmM chlorid hořečnatý, lmM ADP-glukózu, 0,6mM NAD, 10μΜ glukóza-l,6-difosfát, 3mM DTT, 0,02% hovězí sérový albumin, 1 m.j. fosfoglukomutázy z králičího svalu (Sigma), 2,5 m.j. NAD-vázané glukóza-6-fosfát dehydrogenázy z Leuconostoc mesenteroides a hlízový extrakt. Reakce se iniciuje přídavkem difosforečnanu sodného do konečné koncentrace 2mM. Redukce NAD se měří spektrofotometricky při 340 nm a 30 °C. Jednotka aktivity AGPázy je definována jako nmol glukóza-1-fosfátu vytvořeného za minutu při 30 °C.

Příklad I

Klonování plné délky E. coli otsA genu

V E. coli je trehalózafosfát syntáza (TPS) kódována genem otsA umístěným v operonu otsBA. Umístění a směs transkripce tohoto operonu v chromozomu E. coli jsou známy (Kaasen I., Falkenberg P., Styrvold O. B. a Strom A. R. (1992), J. Bact. 174, 889). Gen otsA je umístěn v poloze 42' a podle Kaasena et al. představuje 18,8kb fragment přítomný v genomovém klonu EMBL4 označeném šifrou 7F11 na mapě podle Kohary et al. (Kohara Y., Akiyama K. a Isono K. (1987), Cell 50, 495). DNA se připraví z lyzátu lambda klonu 7F11 a štěpí HindlII. Izolovaný 2,9kb HindlII fragment (pravostranné místo HindlII v inzertu (14,3kb) zKoharovy mapy vypadne, jak si již všimli Kaasen et al.) se klonuje do pUC18 linearizovaného HindlII. 2,9kb HindlII inzert z výsledného plazmidu označeného pMOG674 se sekvenuje. Zjistí se, že sekvence obsahuje část genu araH arabinózového transportního operonu (Scripture J. B., Voelker C., Miller S., O'Donnell R. T., Polgar L., Radě J., Horazdovsky B. F. a Hogg R. W. (1987) J. Mol. Biol. 197, 37), gen otsB kódující TPP lokalizovaný Kaasenem et al. a část genu otsA kódujícího TPS. Zjistí se, že gen otsA není omezen na 2,9kb fragment HindlII, jak to popsali Kaasen et al. Pro doplnění sekvence se izoluje překrývající fragment BamHI/EcoRl a provede se jeho částečná sekvenace. Úplná sekvence kódující TPS genu otsA je znázorněna v SEQ ID NO: 1. Polohy genu otsA v klonu 7F11 s použitými restrikčními enzymy jsou znázorněny na obr. 8. Přídavné místo HindlII, které není přítomno v mapě publikované Koharou et al., se nachází na levostranném místě 2,9kb HindlII fragmentu.

Místo HindlII v pMOG180 se nahradí místě Sstl klonováním oligonukleotidového duplexu

Sstl

5’ AGCTCACGAGCTCTCAGG 3’

3' GTGCTCGAGAGTCCTCGA (SEQIDNO: 8)

5’ (SEQIDNO: 9) do pMOG180 rozštěpeného HindlII. Výsledný vektor se označí názvem pMOG746. Oligonukleotidový duplex se strukturou

BamHI

Sphl HindlII

Smál |

BamHI

5'

GATCCCCCGGGGCATGCAAGCTTG 3' (SEQIDNO: 10)

3'

GGGGCCCCGTACGTTCGAACCTAG 5' (SEQIDNO: 11)

-12CZ 290830 B6 se klonuje do vektoru pMOG746 linearizovaného BamHI. Vektor s oligonukleotidovým duplexem v požadované orientaci (což se zkontroluje štěpením restrikčním enzymem) se označí zkratkou pMOG747. 2,9kb HindlII fragment plazmidu pMOG674 se klonuje do pMOG747 linearizovaného HindlII, čímž se získá vektor pMOG748. Izoluje se asi 2,4kb fragment EcoRV/Sstl a asi 3,5kb fragment Sstl/Smal pMOG748. Tyto fragmenty se ligují a transformují do E. coli, přičemž dojde k deleci 3' konce 2,9kb fragmentu HindlII. Vzniklý plazmid se označí zkratkou pMOG749. 5' konec genu otsA se syntetizuje pomocí PCR za použití syntetických oligonukleotidů TPS1 a TPS2 a pMOG749, jako templátu.

TPS1

5^r GAGAAAATACCCGGGGTGATGAC 3' (SEQIDNO: 12)

TPS2

5' GATAATCGTGGATCCAGATAATGTC 3' (SEQIDNO: 13)

Sekvenováním se potvrdí, že 0,4 kb PCR fragment má správnou sekvenci, lkb fragment BamHI/HindlII z pMOG749 se klonuje spolu s 0,4kb PCR fragmentem Xmal/BamHl do pMOG747 linearizovaného Xmal a HindlII. Do výsledného plazmidu rozštěpeného HindlII a Sstl se klonuje syntetický oligonukleotidový duplex TPS6/7, který kóduje tři C-terminální aminokyseliny TPS.

LysLeuAlaStop

TPS 6/7:

5' AGCTGGCGTGAGGAGCGGTTAATAAGCTTGAGCT

3'

3' CCGCACTCCTCGCCAATTATTCGAAC 5'

Do výsledného plazmidu rozštěpeného HindlII a Sstl se klonuje 0,25kb fragment HindlII/Sstl z plazmidu pMOG749, který obsahuje terminátor z genu NOS (Agrobacterium tumefaciens nopalin syntázový gen) za vzniku plazmidu pMOG798. Tento plazmid obsahuje gen otsA z E. coli ve správné orientaci pod kontrolou promotoru 35S z viru mozaiky květáku (CaMV) s dvojnásobným zesilovačem transkripce (Guilley. et al. (1982) Cell 30, 763), vedoucí sekvenci RNA4 z viru mozaiky vojtěšky (AMV) (Brederode et al. (1980) Nucl. Acids Res. 8, 2213) a terminátorovou sekvenci transkripce nopalin syntázy z Agrobacterium tumefaciens. Celá expresní kazeta se klonuje jako 2,5kb fragment EcoRI/Sstl do binárního vektoru pMOG23 linearizovaného EcoRI a Sstl. Výsledného binárního vektoru pMOG799 (obr. 9) se použije pro transformaci bramboru a tabáku (kmen E. coli nesoucí pMOG799 byl uložen ve sbírce kultur Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Phabagen, collections, Padualaan 8, Utrech, Holandsko,

23. srpna 1993 pod přírůstkovým čidlem CBS 430.93; pMOG23 byl uložen ve sbírce CBS 29. června 1990 pod přírůstkovým číslem CBS 102.90).

Příklad II

Produkce trehalózy v tabáku transformovaném pMOG6799

Listové kotoučky tabáku se transformují binárním vektorem pMOG799 za použití Agrobacterium tumefaciens. Na aktivitu trehalóza fosfát syntázy (TPS) se analyzuje 20 nezávislých transgenních výhonů. Zjistí se, že některé tabákové rostliny pěstované in vitro mají extrémně tlusté kořeny ve srovnání s netransformovanými rostlinami. Při analýze kořenů těchto transgenních tabákových rostlin se zjistí zvýšená hladina trehalózy ve srovnání s netransgenními kontrolními rostlinami.

-13CZ 290830 B6

Příklad III

Produkce trehalózy v bramborech transformovaných pMOG799

Kotoučky z bramborových hlíz se transformují binárním vektorem pMOG 799 za použití Agrobacterium tumefaciens. Transgenní výhony se selektují na kanamycin. Na aktivitu trehalózafosfát syntázy (TPS) se analyzuje celkem 20 nezávislých transgenních výhonů. Výhony, u nichž se zjistí enzym, se pěstují až do stadia zralých rostlin. Analýzou zralých hlíz těchto transgenních rostlin bramboru se zjistí zvýšená hladina trehalózy ve srovnání s netransgenními 10 kontrolními rostlinami. Transgenní rostlinná linie MOG799.1 se propaguje pro další výzkumy.

Příklad IV

Konstrukce pMOG664

Syntetizují se dva oligonukleotidy odpovídající sekvenci cDNA malé podjednotky ADP-glukóza pyrofsorylázy (AGPasaB) z hlízy bramboru odrůdy Désiree (Miiller - Rober B., Kossmann J., Hannah L. C., Willmitzer L. a Sonnewald U. (1990) Mol. Gen. Genet 224, 136 až 146)

5' TCCCCATGGAATCAAAGCATCC 3' (SEQIDNO; 4)

5' GATTGGATCCAGGGCACGGCTG 3' (SEQIDNO: 5)

Tyto oligonukleotidy se zkonstruují tak, aby obsahovaly vhodná restrikční místa (BamHI a Ncol-tato místa jsou podtržena) na svých koncích, aby je bylo možno sestavit do expresní 25 kazety v pozitivní orientaci, po rozštěpení těmito enzymy. Fragment o délce přibližně 1 kb se amplifikuje pomocí PCR s těmito oligonukleotidy za použití DNA izolované z knihovny cDNA bramboru odrůdy Désiree z dva měsíce staré listové tkáně (Clontech), jako templátu. Sekvenováním se potvrdí, že tento fragment je identický s AGPáza B sekvencí z bramboru odrůdy Désiree (Miiller-Rober B., Kossmann J., Hannah L. C., Willmitzer L. a Sonnewald U. 30 (1990) Mol. Gen. Genet 224, 136 až 146). Po vyštěpení pomocí BamHI a Ncol se vzniklý fragment klonuje do pMOG18 linearizovaného BamHI a Ncol. 1,85kb EcoRI/BamHI fragment (obsahující promotor CaMV 35S, vedoucí sekvenci AMV RNA4 a fragment AGPázy v pozitivní orientaci), jakož i fragment BamHI/HindlII obsahující terminátor znopalin syntázového (NOS) genu Agrobacterium tumefaciens z výsledného plazmidu se klonuje třícestnou ligací do binárního 35 vektoru pMOG22 linearizovaného EcoRI a HindlII. Binární vektor pMOG22 obsahuje v rostlině exprimovatelný gen HPTII pro selekci na hygromycin v transgenních rostlinách (pMOG22 byl uložen ve sbírce kultur Centraal Bureau voor Schimmelcultures, 29. ledna 1990 přírůstkovým čidlem 101.90). Výsledného binárního vektoru pMOG664 (obr. 4) se použije pro transformaci bramboru.

Příklad V

Konstrukce pMOG801

Syntetizuje se soubor oligonukleotidů, které jsou komplementární k sekvenci cDNA kukuřičné sacharózafosfát syntázy (SPS) (Worrell, A. C., Bruneau, J-M., Summerfalt, K., Boersig, M., a Voelker, T. A. (1991) Plant Cell 3, 1121). Tyto oligonukleotidy mají následující sekvence:

5' CTAGGTCGTGATTCTGATACAGGTGGCCAGGTG 3' (SEQIDNO: 6)

5^r CAGCATCGGCATAGTGCCCATGTATCACGTAAGGC 3' (SEQIDNO: 7)

-14CZ 290830 B6

Výše popsaných oligonukleotidů se použije na PCR amplifikaci fragmentu DNA (370 bp) za použití DNA izolované z cDNA knihovny bramboru odrůdy Désiree pocházející z tkáně dva měsíce starých listů (Clontech). jako templátu. Sekvenováním tohoto fragmentu se zjistí, že je tento fragment homologický vůči SPS sekvenci kukuřice (viz obr. 3 a Worrell et al. (1991)).

Fragmentu PCR se použije pro screening lambda gtl 0 cDNA knihovny bramboru odrůdy Désiree pocházející z tkáně dva měsíce starých listů (Clontech). Inzert jednoho pozitivně hybridizujícího se klonu se sekvenuje. Sekvence 654bp fragmentu DNA je ze 65 % totožná s odpovídající částí sekvence SPS kukuřice (počínaje nukleotidem č. 349 na obr. 11 podle výše uvedené citace Worrell et al. z roku 1991). EcoRI inzert tohoto klonu se klonuje do pMOG180 rozštěpeného io BamHI třícestnou ligací za použití následujícího syntetického oligonukleotidového duplexu:

5' GATCGTCAGATCTAGC 3' (SEQIDNO: 14)

3' CAGTCTAGATCGTTAA 5' (SEQIDNO: 15)

Plazmid obsahující SPS fragment v pozitivní orientaci vzhledem k promotoru CaMV 35S se 15 označí názvem pMOG787. Fragment EcoRI/HindlII plazmidu pMOG787 se klonuje třícestnou ligací za použití syntetického linkeru

5' AGCTTCCCCCCCG 3' (SEQIDNO: 16)

3' AGGGGGGGCTTAA 5' (SEQIDNO: 17) do binárního vektoru pMOG22 linearizovaného EcoRI. Binární vektor pMOG22 obsahuje v rostlině exprimovatelný gen HPTII pro hygromycinovou selekci v transgenních rostlinách. (pMOG22 byl uložen ve sbírce kultur Centraal Bureau voor Schimmelcultures, 29. ledna 1990 přírůstkovým číslem 101.90). Výsledného binárního vektoru pMOG801 (obr. 10) se použije pro transformaci bramboru.

Příklad VI

Konstrukce pMOG802

EcoRi fragment plazmidu pMOG801 obsahujícího pozitivní SPS expresní kazetu se klonuje do binárního vektoru pMOG664 (obsahujícího pozitivní AGPázovou kazetu) linearizovaného EcoRi. Výsledný binární vektor se označí zkratkou pMOG802 (obr. 11).

Příklad VII

Produkce trehalózy v bramboru transformovaném pMOG799 a pMOG664

Kotoučky z bramborové hlízy pocházející z rostlinné linie MOG799.1, která je rezistentní vůči kanamycinu, exprimující TPS (příklad IX) se transformují binárním vektorem pMOG664 obsahujícím pozitivní AGPázovou expresní kazetu. Transgenní výhony získané selekcí na hygromycinu (10 mg/litr) se analyzují na přítomnost sekvence TPS a pozitivní AGPázy pomocí PCR. Transgenní rostliny obsahující obě tyto sekvence se analyzují na aktivitu TPS a AGPázy.

Analýza transgenních hlíz na aktivitu AGPázy ukazuje, že u jednotlivých transgenních linií dochází ve srovnání s netransgenními kontrolními rostlinami ke snížení hladiny aktivity. Analýza Nothem blot ukazuje, že hladina mRNA pro AGPázu je v transgenních rostlinách nižší ve srovnání s netransgenními kontrolními rostlinami. Hladina trahalózy v hlízách transgenních rostlin bramboru, u nichž byla zjištěna aktivita TPS a snížená hladina AGPázy, je vyšší ve srovnání s hladinou trehalózy zjištěnou v hlízách transgenní rostlinné linie MOG799.1.

-15CZ 290830 B6

Příklad Vlil

Produkce trehalózy' v bramboru transformovaném pMOG799 a pMOG801

Kotoučky z bramborové hlízy pocházející z rostlinné linie MOG799.1, která je rezistentní vůči kanamycinu, exprimující TPS (příklad IX) se transformují binárním vektorem pMOG801 obsahujícím pozitivní SPS expresní kazetu. Transgenní výhony získané selekcí na hygromycinu (10 mg/litr) se analyzují na přítomnost sekvence TPS a pozitivní SPS pomocí PCR. Transgenní rostliny obsahující obě tyto sekvence se analyzují na aktivitu TPS a SPS.

Analýza transgenních hlíz na aktivitu SPS ukazuje, že u jednotlivých transgenních linií dochází ve srovnání s netransgenními kontrolními rostlinami ke snížení hladiny aktivity. Analýza Nothem blot ukazuje, že hladina mRNA pro SPS je v transgenních rostlinách nižší ve srovnání s netransgenními kontrolními rostlinami. Hladina trahalózy v hlízách transgenních rostlin bramboru, u nichž byla zjištěna aktivita TPS a snížená hladina SPS, je vyšší ve srovnání s hladinou trehalózy' zjištěnou v hlízách transgenní rostlinné linie MOG799.1.

Příklad IX

Produkce trehalózy v bramboru transformovaném pMOG799 a pMOG802

Kotoučky z bramborové hlízy pocházející z rostlinné linie MOG799.1, která je rezistentní vůči kanamycinu, exprimující TPS (příklad IX) se transformují binárním vektorem pMOG802 obsahujícím pozitivní SPS expresní kazetu a AGPázovou expresní kazetu. Transgenní výhony získané selekcí na hygromycinu (10 mg/litr) se analyzují na přítomnost sekvence TPS, pozitivní AGPázy a pozitivní SPS pomocí PCR. Transgenní rostliny obsahující všechny tři tyto konstrukty se analyzují na aktivitu TPS, AGPázy a SPS.

Analýza transgenních hlíz na aktivitu AGPázy a SPS ukazuje, že u jednotlivých transgenních linií dochází ve srovnání s netransgenními kontrolními rostlinami ke snížení hladiny aktivity. Analýza Nothem blot ukazuje, že hladina mRNA pro AGPázu a SPS je v transgenních rostlinách nižší ve srovnání s netransgenními kontrolními rostlinami. Hladina trahalózy v hlízách transgenních rostlin bramboru, u nichž byla zjištěna aktivita TPS a snížená hladina SPS, je vyšší ve srovnání s hladinou trehalózy zjištěnou v hlízách transgenní rostlinné linie MOG 799.1.

Uložené kmeny pMOG22 přírůstkové číslo CBS 101.90 (strana 23, řádek 18 až 21; strana 24, řádek 21 až 23) pMOG23 přírůstkové číslo CBS 102.90 (strana 22, řádek 10) pMOG799 přírůstkové číslo CBS 430.93 (strana 22, řádek 6)

Seznam sekvencí (1) Obecné informace (i) Přihlašovatel:

(A) Jméno: MOGEN International N. V.

(B) Ulice: Einsteinweg 97 (C) Město: LEIDEN (D) Stát: Zuid-Holland (E) Země: Nizozemsko (F) Poštovní směrovací číslo (ZIP): NL-2333 CB (B) Telefon: (31).(71).258282 (H) Telefax: (31).(71).221471

-16CZ 290830 B6 (ii) Název vynálezu: PRODUCTION OF TREHALÓZE IN PLANTS (Výroba trehalózy v rostlinách) (iii) Počet sekvencí: 17 (iv) strojně čitelná forma:

(A) střední typ: diskety (B) počítač: IBM PC kompatibilní (C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) softwqare: Patentln Release č. 1.0, verze 1,25 (EPO) (v) Údaje o současné přihlášce:

ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: WO PCT/EP93/02290 (2) Informace o SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka 370 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovost: dvouřetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA - mRNA (iii) Hypotetická: ne (vi) Původní zdroj:

(A) Organismus: Solanum tuberosum (B) Kmen: Desiree (F) Typ tkáně: list (xi) Popis sekvence: SEQ IDNO:1

CTAGGTCGTG ATTCTGATAC AGGTGGCCAG GTGAAGTATG TAGIAGAGCT TGCTCGAGCA 60 CTTGCAAACA TGAAAGGAGT TCACCGAGTT GATCTCTTGA CTCGGCAGAT CACATCCCCA 120 GAGGTTGATT CTAGCTATGG TGAGCCAATT GAGATGCTCT CATGCCCATC TGATGCTTTG 180 GCTGCTGTGG TGCCTACTAT TCGGATCCCT GCGGACCAGG TGACAAGATA TTCCAAAAGA 240 ATTTACATAC CAGAATTTGT TGATGGAGCA TTAAGCCACA TTGTGAATAT GGCAAGGGCT 300 ATAGGGGAGC AAGTCAATGC TGGAAAAGCA GTGTGGCCTT ACGTGATACA TGGGCACTAT 360

GCCGATGCTG

370 (2) Informace o SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka 1446 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovost: dvouřetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: ne (vi) Původní zdroj:

(A) Organismus: Escherichia coli (vii) Bezprostřední zdroj:

(B) Klon: 7F11 (viii) Poloha v genomu:

-17CZ 290830 B6 (B) Poloha na mapě: 41—42' (ix) Charakteristický znak:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 19..1446 (D) Jiné informace: produkt = „Trehalóza fosfát syntáza; gen = „otsA“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:2

GAGAAAATAA CAGGAGTG

ATG ACT ATG AGT CGT TTA GTC GTA GTA TCT AAC

51

Met Thr Met Ser Arg Leu

Val Val Val Ser 10

Asn

1

5

CGG

ATT

GCA

CCA

GAC

GAG

CAC

GCC

AGT

GCC

GGT

GGC

CTT

GCC

99

Arg

Ile

Ala

Pro

Asp

Glu

His

Ala

Ser

Ala

Gly Gly

Leu

Ala

15

20

25

GTT

GGC

ATA

CTG

GGG

GCA

CTG

AAA

GCC

GCA

GGC

GGA

CTG

TGG

TTT

GGC

147

Val

Gly

Ile

Leu

Gly

Ala

Leu

Lys

Ala

Gly

Leu

Trp

Phe

Gly

35 40

-18CZ 290830 B6

TGG

AGT

GGT

GAA

ACA

GGG

AAT

GAG

GAT

CAG

CCG

CTA

AAA

AAG

GTG

AAA

195

Trp

Ser

Gly

Glu

Thr

Gly

Asn

Glu

Asp

Gin

Pro

Leu

Lys

Val

Lys

45

50

55

AAA GGT AAC ATT

ACG TGG GCC TCT TTT AAC CTC AGC

GAA CAG GAC CTT

243

Lys 60

Gly

Asn

Ile

Thr

Trp Ala 65

Ser

Phe

Asn Leu 70

Ser

Glu Gin Asp

Leu 75

GAC

GAA

TAC

AAC

CAA

TTC

TCC

AAT

GCC

GTT

CTC

TGG

CCC

GCT

TTT

291

Asp

Glu

Tyr

Asn

Gin

Phe

Ser

Asn

Ala

Val

Leu

Trp

Pro

Ala

Phe

80

85

90

CAT

TAT

CGG

CTC

GAT

CTG

GTG

CAA

TTT

CAG

CGT

CCT

GCC

TGG

GAC

GGC

339

His

Tyr

Arg

Leu

Asp

Leu

Val

Gin

Phe

Gin

Arg

Pro

Ala

Trp

Asp

Gly

95

100

105

TAT

CTA

CGC

GTA

AAT

GCG

TTG

CTG

GCA

GAT

AAA

TTA

CTG

CCG

CTG

TTG

387

Tyr

Leu

Arg

Val

Asn

Ala

Leu

Ala

Asp

Lys

Leu

Pro

Leu

110

115

120

CAA

GAC

GAT

GAC

ATT

ATC

TGG

ATC

CAC

GAT

TAT

CAC

CTG

TTG

CCA

TTT

435

Gin

Asp

Ile

Trp

Ile

His

Asp

Tyr

His

Leu

Pro

Phe

125

130

135

GCG

CAT

GAA

TTA

CGC

AAA

CGG

GGA

GTG

AAT

CGC

ATT

GGT

TTC

TTT

483

Ala

His

Glu

Leu

Arg

Lys

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ile

Gly

Phe

140

145

150

155

CTG

CAT

ΛΤΤ

CCT

TTC

CCG

ACA

CCG

GAA

ATC

TTC

AAC

C-CG

CTG

CCG

ACA

531

Leu

His

Ile

Pro

Phe

Pro

Thr

Pro

Glu

Ile

Phe

Asn

Ala

Leu

Pro

Thr

160

165

170

TAT

GAC

ACC

TTG

CTT

GAA

CAG

CTT

TGT

GAT

TAT

GAT

TTG

CTG

GGT

TTC

579

Tyr

Asp

Thr

Leu

Glu

Gin

Leu

Cys

Asp

Tyr

Asp

Leu

Gly

Phe

175

180

185

CAG

ACA

GAA

AAC

GAT

CGT

CTG

GCG

TTC

CTG

GAT

TGT

CTT

TCT

AAC

CTG

627

Gin

Thr

Glu

Asn

Asp

Arg

Leu

Ala

Phe

Leu

Asp

Cys

Leu

Ser

Asn

Leu

190

195

200

ACC

CGC

GTC

ACG

ACA

CGT

AGC

GCA

AAA

AGC

CAT

ACA

GCC

TGG

GGC

AAA

675

Thr

Arg

Val

Thr

Arg

Ser

Ala

Lys

Ser

His

Thr

Ala

Trp

Gly

Lys

205

210

215

GCA

TTT

CGA

ACA

GAA

GTC

TAC

CCG

ATC

GGC

ATT

GAA

CCG

AAA

GAA

ATA

723

Ala

Phe

Arg

Thr

Glu

Val

Tyr

Pro

Ile

Gly

Ile

Glu

Pro

Lys

Glu

Ile

220

225

230

235

GCC

AAA

CAG

GCT

GCC

GGG

CCA

CTG

CCG

CCA

AAA

CTG

GCG

CAA

CTT

AAA

771

Ala

Lys

Gin

Ala

Gly

Pro

Leu

Pro

Lys

Leu

Ala

Gin

Leu

Lys

240 245 250

-19CZ 290830 B6

GCG GAA CTG

AAA AAC

GTA CAA AAT ATC TTT TCT GTC GAA CGG CTG GAT

819

Ala Glu

Leu

Lys 255

Asn

Val Gin

Asn

lle 260

Phe Ser

Val Glu

Arg Leu Asp 265

TAT

TCC

AAA

GGT

TTG

CCA

GAG

CGT

TTT

CTC

GCC

TAT

GAA

GCG

TTG

CTG

8 67

Tyr

Ser

Lys

Gly

Leu

Pro

Glu

Arg

Phe

Leu

Ala

Tyr

Glu

Ala

Leu

270

275

280

GAA

AAA

TAT

CCG

CAG

CAT

GGT

AAA

ATT

CGT

TAT

ACC

CAG

ATT

GCA

915

Glu

Lys

Tyr

Pro

Gin

His

Gly

Lys

lle

Arg

Tyr

Thr

Gin

lle

Ala

285

290

295

CCA

ACG

TCG

CGT

GGT

GAT

GTG

CAA

GCC

TAT

CAG

GAT

ATT

CGT

CAT

CAG

963

Pro

Thr

Ser

Arg

Gly

Asp

Val

Gin

Ala

Tyr

Gin

Asp

Tle

Arg

His

Gin

300

305

310

315

CTC

GAA

AAT

GAA

GCT

GGA

CGA

ATT

AAT

GGT

AAA

TAC

GGG

CAA

TTA

GGC

1011

Leu

Glu

Asn

Glu

Ala

Gly

Arg

Tle

Asn

Gly

Lys

Tyr

Gly

Gin

Leu

Gly

320

325

330

TGG

ACG

CCG

CTT

TAT

TTG

AAT

CAG

CAT

TTT

GAC

CGT

AAA

TTA

CTG

1059

Trp

Thr

Pro

Leu

Tyr

Leu

Asn

Gin

His

Phe

Asp

Arg

Lys

Leu

335

340

345

ATG

AAA

ATA

TTC

CGC

TAC

TCT

GAC

GTG

GGC

TTA

GTG

ACG

CCA

CTG

CGT

1107

Met

Lys

lle

Phe

Arg

Tyr

Ser

Asp

Val

Gly

Leu

Val

Thr

Pro

Leu

Arg

350

355

360

GAC

GGG

ATG

AAC

CTG

GTA

GCA

AAA

GAG

TAT

GTT

GCT

CAG

GAC

CCA

1155

Asp

Gly

Met

Asn

Leu

Val

Ala

Lys

Glu

Tyr

Val

Ala

Gin

Asp

Pro

365

370

375

GCC

AAT

CCG

GGC

GTT

CTT

GTT

CTT

TCG

CAA

TTT

GCG

GGA

GCG

GCA

AAC

1203

Ala

Asn

Pro

Giy

Val

Leu

Val

Leu

Ser

Gin

Phe

Ala

Gly

Ala

Asn

380

385

390

395

GAG

TTA

ACG

TCG

GCG

TTA

ATT

GTT

AAC

CCC

TAC

GAT

CGT

GAC

GAA

GTT

1251

Glu

Leu

Thr

Ser

Ala

Leu

lle

Val

Asn

Pro

Tyr

Asp

Arg Asp

Glu

Val

400

405

410

GCA

GCT

GCG

CTG

GAT

CGT

GCA

TTG

ACT

ATG

TCG

CTG

GCG

GAA

CGT

ATT

1299

Ala

Leu

Asp

Arg

Ala

Leu

Thr

Met

Ser

Leu

Ala

Glu

Arg

lle

415

420

425

TCC

CGT

CAT

GCA

GAA

ATG

CTG

GAC

GTT

ATC

GTG

AAA

AAC

GAT

ATT

AAC

1347

Ser

Arg

His

Ala

Glu

Met

Leu

Asp

Val

lle

Val

Lys

Asn

Asp

lle

Asn

430

435

440

CAC

TGG

CAG

GAG

TGC

TTC

ATT

AGC

GAC

CTA

AAG

CAG

ATA

GTT

CCG

CGA

1395

His

Trp

Gin

Glu

Cys

Phe

lle

Ser

Asp

Leu

Lys

Gin

lle

Val

Pro

Arg

445 450 455

AGC GCG GAA AGC CAG CAG Ser Ala Glu Ser Gin Gin 460 465

CGC GAT AAA GTT GCT ACC Arg Asp Lys Val Ala Thr

470

TTT CCA AAG CTT

Phe Pro Lys Leu

475

1443

GCG 1446

Ala

-20CZ 290830 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 3:

5	(i)	Charakteristika sekvence: (A) Délka 476 párů bází (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární
10	(ii) (xi)	Typ molekuly: protein Popis sekvence: SEQ IDNO:3

Met Thr 1

Met

Ser Arg Leu Val Val Val Ser Asn Arg

Ile

Ala

Pro Pro 15

5

10

Asp

Glu

His

Ala

Ser

Ala

Gly

Leu

Ala

Val

Gly

Ile

Leu

Gly

20

25

30

Ala

Leu

Lys

Ala

Gly

Leu

Trp

Phe

Gly

Trp

Ser

Gly

Glu

Thr

35

40

45

Gly

Asn

Glu

Asp

Gin

l’ro

Leu

Lys

Val

Lys

Gly

Ά3Π

Ile

Thr

50

55

60

Trp

Ala

Ser

Phe

Asn

Leu

Ser

Glu

Gin

Asp

Leu

Asp

Glu

Tyr

Asn

65

70

75

80

Gin

Phe

Ser

Asn

Ala

Val

Leu

Trp

Pro

Ala

Phe

His

Tyr

Arg

Leu

Asp

85

90

95

Leu

Val

Gin

Phe

Gin

Arg

Pro

Ala

Trp

Asp

Gly

Tyr

Leu

Arg

Val

Asn

100

105

110

Ala

Leu

Ala

Asp

Lys

Leu

Pro

Leu

Gin

Asp

Ile

115

120

125

Ile

Trp

Ile

His

Asp

Tyr

His

Leu

Pro

Phe

Ala

His

Glu

Leu

Arg

130

135

140

Lys

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ile

Gly

Phe

Leu

His

Ile

Pro

Phe

145

150

155

160

Pro

Thr

Pro

Glu

Ile

Phe

Asn

Ala

Leu

Pro

Thr

Tyr

Asp

Thr

Leu

165

170

175

-21CZ 290830 B6

Glu

Gin

Leu

Cys

Asp

Tyr

Asp

Leu

Gly Phe

Gin

Thr

Glu

Asn

Asp

180

185

190

Arg

Leu

Ala

Phe

Leu

Asp

Cys

Leu

Ser

Asn

Leu

Thr

Arg

Val

Thr

195

200

205

Arg

Ser

Ala

Lys

Ser

His

Thr

Ala

Trp

Gly Lys

Ala

Phe

Arg

Thr

Glu

210

215

220

Val

Tyr

Pro

Ile

Gly

Ile

Glu

Pro

Lys

Glu

Ile

Ala

Lys

Gin

Ala

225

230

235

240

Gly

Pro

Leu

Pro

Lys

Leu

Ala

Gin

Leu

Lys

Ala

Glu

Leu

Lys

Asn

245

250

255

Val

Gin

Asn

Ile

Phe

Ser

Val

Glu

Arg

Leu

Asp

Tyr

Ser

Lys

Gly

Leu

260

265

270

Pro

Glu

Arg

Phe

Leu

Ala

Tyr

Glu

Ala

Leu

Glu

Lys

Tyr

Pro

Gin

275

280

285

His

Gly

Lys

Ile

Arg

Tyr

Thr

Gin

Ile

Ala

Pro

Thr

Ser

Arg

Gly

290

295

300

Asp

Val

Gin

Ala

Tyr

Gin

Asp

ile

Arg

His

Gin

Leu

Glu

Asn

Glu

Ala

305

310

315

320

Gly

Arg

Ile

Asn

Gly

Lys

Tyr

Gly

Gin

Leu

Gly

Trp

Thr

Pro

Leu

Tyr

325

330

335

Tyr

Leu

Asn

Gin

His

Phe

Asp

Arg

Lys

Leu

Met

Lys

Ile

Phe

Arg

340

345

350

Tyr

Ser

Asp

Val

Gly

Leu

Val

Thr

Pro

Leu

Arg

Asp

Gly

Met

Asn

Leu

355

360

365

Val

Ala

Lys

Glu

Tyr

Val

Ala

Gin

Asp

Pro

Ala

Asn

Pro

Gly

Val

370

375

380

Leu

Val

Leu

Ser

Gin

Phe

Ala

Gly

Ala

Asn

Glu

Leu

Thr

Ser

Ala

385

390

395

400

Leu

Ile

Val

Asn

Pro

Tyr

Asp

Arg Asp

Glu

Val

Ala

Leu

Asp

405

410

415

Arg

Ala

Leu

Thr

Met

Ser

Leu

Ala

Glu

Arg

Ile

Ser

Arg

His

Ala

Glu

420

425

430

Met

Leu

Asp

Val

Ile

Val

Lys

Asn

ASp

Ile

Asn

His

Trp

Gin

Glu

Cys

435 440 445

Phe Ile Ser Asp Leu

Lys Gin

455

Ile Val Pro Arg Ser Ala Glu Ser Gin

460

Gin Arg Asp Lys Val Ala Thr Phe Pro Lys Leu Ala 465 470 475

450

-22CZ 290830 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka 22 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Retězcovost: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: Ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:4:

TCCCCATGGA ATCAAAGCAT CC22 (2) Informace o SEQ ID NO: 5:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka 22 párů bázíi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Retězcovost: jednořetězcováj (D) Topologie: lineárníj j

(ii) Typ molekuly: cDNAΐ (iii) Hypotetická: Anoj (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:5:

GATTGGATCC AGGGCACGGC TG22 (2) Informace o SEQ ID NO: 6:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka 33 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Retězcovost: jednořetězcováj (D) Topologie: lineární1 í i (ii) Typ molekuly: cDNAj (iii) Hypotetická: Ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:6:

CTAGGTCGTG ATTCTGATAC AGGTGGCCAG GTG33 (2) Informace o SEQ ID NO: 7:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka 35 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Retězcovost: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: Ano

-23CZ 290830 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ IDNO:7:

CAGCATCGGC ATAGTGCCCA TGTATCACGT AAGGC 3 5 (2) Informace o SEQ ID NO: 8:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka 18 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovost: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: Ano (xi) Popis sekvence: SEQ IDNO:8:

AGCTCACGAG CTCTCAGG 18 (2) Informace o SEQ ID NO: 9:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka 18 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovost: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: Ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:9:

GTGCTCGAGA GTCCTCGA 18 (2) Informace o SEQ ID NO: 10:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka 24 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovost: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: Ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

GATCCCCCGG GGCATGCAAG CTTG 24 (2) Informace o SEQ ID NO: 11:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka 24 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina

-24CZ 290830 B6 (C) Řetězcovost: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: Ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

GGGGCCCCGT ACGTTCGAAC CTAG 24 (2) Informace o SEQ ID NO: 12:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka 23 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovost: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: Ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

GAGAAAATAC CCGGGGTGAT GAC 23 (2) Informace o SEQ ID NO: 13:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka 25 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovost: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: Ano (xi) Popis sekvence: SEQIDNO:13:

GATAATCGTG GATCCAGATA ATGTC 25 (2) Informace o SEQ ID NO: 14:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka 16 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovost: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: Ano (xi) Popis sekvence: SEQIDNO:14:

GATCGTCAGA TCT AGC 16

-25CZ 290830 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 15:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka 16 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Retězcovost: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: Ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:

CAGTCTAGAT CGTTAA 16 (2) Informace o SEQ ID NO: 16:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka 13 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Retězcovost: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: Ano (xi) Popis sekvence: SEQ IDNO:16:

AGCTTCCCCC CCG 13 (2) Informace o SEQ ID NO: 17:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka 13 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Retězcovost: dvouřetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: Ano (xi) Popis sekvence: SEQIDNO:17:

AGGGGGGGCTTAA 13

-26CZ 290830 B6

Claims

1. Nukleová kyselina, která při expresi v rostlině nebo rostlinné buňce zvyšuje obsah trehalózy v této rostlině nebo rostlinné buňce, přičemž tato nukleová kyselina v dále uvedeném pořadí obsahuje

a) oblast iniciace transkripce, která je funkční v dané rostlině nebo rostlinné buňce,

2. Nukleová kyselina podle nároku 1, v níž DNA sekvence kóduje trehalózafosfát syntázu z E. coli o složení odpovídajícím aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO: 3.

3. Nukleová kyselina podle nároku 1, v níž DNA sekvence kóduje trehalózafosfát syntázu z E. coli zahrnující otevřený čtecí rámec genu otsA z E. coli, jak je přítomen vpMOG799 uloženém ve sbírce Centraal Bureau voor Schimmelcultures, pod přírůstkovým číslem CBS 430.93.

4. Nukleová kyselina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, v níž místo iniciace transkripce obsahuje promotorovou oblast DNA kódující 35S RNA viru mozaiky květáku a terminátorovou oblast transkripce nopalin syntázového genu z Agrobacterium tumefaciens.

5. Klonovací vektor obsahující nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, přičemž tento klonovací vektor je binární vektor.

6. Mikroorganismus obsahující vektor podle nároku 5, přičemž tento mikroorganismus patří do rodu Agrobacterium.

7. Způsob získávání rostliny se zvýšenou schopností produkce trehalózy, vyznačující se t í m , že zahrnuje stupeň

8. Rekombinantní rostlinný DNA genom obsahující nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4.

9. Rostlinná buňka obsahující rekombinantní rostlinný DNA genom podle nároku 8.

10. Kultura rostlinných buněk obsahující rostlinné buňky podle nároku 9.

11. Rostlina obsahující buňky podle nároku 9 nebo kulturu podle nároku 10.

-27CZ 290830 B6

12. Způsob výroby trehalózy, vyznačující se tím, že zahrnuje stupeň

1) pěstování rostliny podle nároku 11 za podmínek umožňujících produkci trehalózy, ) sklizně této rostliny nebo části rostliny a ) izolace trehalózy z této rostliny nebo části rostliny.