SK166095A3 - Production of trehalose in plants - Google Patents

Description

Spôsob produkcie trehalózy v rastlinách

Oblasť techniky

Vynález sa týka modifikácie metabolizmu rastlinných uhľohydrátov použitím rekombinantných DNA techník, rekombinantnej DNA pre toto použitie, ako aj rastlín a ich častí, ktoré boli geneticky modifikované. Tieto rastliny sa môžu používať na extrakciu špecifických uhlohydrátových zlúčenín, alebo sa dajú alternatívne spracúvať na potravu, krmivá alebo krmivové prísady so zlepšenými vlastnosťami vďaka prítomnosti týchto uhlohydrátových zlúčenín, napríklad so zlepšenými spracovateľskými vlastnosťami.

Doterajší stav techniky

Trehalóza je všeobecný názov, ktorým sa označujú D-glukozyl-D-glukozidy obsahujúce disacharidy založené na dvoch ,&,β- a β,β-pripojených molekulách glukózy. Trehalóza, najmä &-trehalóza, tj. l-(o-&-D-glukopyranozyl)-l’-o-&-D-glukopyranóza je disacharid, ktorý je velmi rozšírený v prírode.

Chemická syntéza trehalózy je ťažká (je potrebné používať chrániace skupiny) a neefektívna. Z prírodných zdrojov trehalózy, ktoré sú v súčasnosti k dispozícii, je možné uviesť vyššie huby a kvasinky Saccharomyces cerevisiae, ktoré môžu akumulovať nad 10 % sušiny trehalózy. Prekážkou produkcie trehalózy je jej vysoká reaktivita, ktorej dôsledkom je jej rýchla metabolizácia. Prehľad výskytu a metabolizmu disacharidu trehalózy, najmä &-trehalózy, v živých organizmoch je uvedený v publikácii Elbein A. D. (1974) Adv. Carbohydrate Chem. and Biochem. 30, 227 až 256. Pokiaľ ide o rastliny, bola prítomnosť trehalózy oznámená v niektorých druhoch nižších rastlín a množstva druhov vyšších rastlín, ktoré patria medzi spermatophyty: Echinops persicus, Carex brunescens a Fagus silvaticus. Tieto výsledky však nikdy neboli nevyvrátitelne potvrdené inými autormi (napríklad Kendall et al., 1990, Phytochemistry 29, č. 8, 2525 až 2528). Tak napríklad Kendall et al., uvádzajú vo vyššie citovanej publikácii, že zo spermatophytes bola prítomnosť trehalózy nevyvrátitelne potvrdená len v semenách rasce (Carum carvi). Správu o prítomnosti trehalózy v slnečnici (Cegla et al., 1977, 1. Am.

54, 150 a ďalej) podlá Kendalla et al. (pozri citácia z roku 1990) spochybnili Kandler zv. 3, Carbohydrates:

str. 228. Academic Press). Správy o výskyte trehalózy v buku (Fagus sylvaticus) a kapuste nemohli byť potvrdené inými autormi (Kendall et al.. vyššie uvedená citácia z roku 1990 a odkazy v nej obsiahnuté).

Oil Chem. Soc. vyššie uvedená et al. (The Structure and

Biochemistry of Plants, Function, Preiss, J. ed.

Napriek tomu, že sa trehalóza vo vyšších rastlinách vyskytuje zrejme zriedkavo, prítomnosť degradačnej aktivity trehalózy bola oznámená v množstve skúmaných čeladí rastlín. Stabilná vysoká aktivita trehalózy bola zistená v troch líniách pšenice, borovice (jack pine) a Selaginelly lepidophyly. Stabilná nízka aktivita trehalózy bola zistená u lucerny, black Mexičan sweet corn a smreku (white spruce). Labilné slabé aktivity boli zistené v dvoch rôznych suspenziách canola, ale tieto aktivity sa pravdepodobne nedajú vysvetliť špecifickou aktivitou trehalózy. Bolo tiež oznámené, že jačmeň, stoklas, sója a smrek (black spruce) neobsahujú vôbec žiadnu aktivitu trehalózy (Kendall, 1990, pozri vyššie).

V organizmoch, ktoré sú schopné produkovať trehalózu, sa trehalóza pravdepodobne biosyntetizuje vo forme 6-fosfátu, zatial čo zásobnou formou je volný cukor. Preto sa predpokladá, že organizmy produkujúce a/alebo ukladajúce trehalózu budú obsahovať xfosfatázu schopnú rozštiepiť trehalóza-6-fosfát (Elbein, 1974. vyššie uvedená citácia). 0 prítomnosti špecifických trehalózafosfátfosfatáz vo vyšších rastlinách je málo známe.

V medzinárodnej patentovej prihláške WO 93/17093 Al publikovanej 2. septembra 1993 je popísaná produkcia trehalózy v kvasinkách, ktoré sú transgénne, pokial ide o gény kódujúce trehalózafosfátsyntázu. Predpokladá sa, že by trehalóza mohla byť produkovaná tiež vo vyšších rastlinách týchto kvasinkových génov, ale doteraz neboli publikované žiadne správy o produkcii trehalózy v rastlinách. Prihláška 93/17093 Al bola publikovaná pred dátumom podania predloženej prihlášky, ale po dátume jej priority.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je spôsob produkcie trehalózy v rastlinnom hostiteloví vďaka prítomnosti génu, ktorý je v tomto rastlinnom hostiteľovi exprimovaný a ktorý v ďalej uvedenom poradí zahrnuje

a) oblasť iniciácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostitelovi,

b) sekvenciu DNA kódujúcu aktivitu trehalózafosfátsyntázy a poprípade

c) sekvenciu terminácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostitelovi.

Predmetom vynálezu je ďalej tiež spôsob produkcie trehalózy v rastlinnom hostitelovi vďaka prítomnosti génu, ktorý je v tomto hostitelovi exprimovaný a ktorý v ďalej uvedenom poradí zahrnuje

d) oblasť iniciácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostitelovi,

e) sekvenciu DNA kódujúcu aktivitu trehalózafosfátsyntázy a poprípade

f) sekvenciu terminácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostitelovi a vďaka prítomnosti génu, ktorý je v tomto rastlinnom hostitelovi exprimovatelný a ktorý v ďalej uvedenom poradí zahrnuje

a) oblasť iniciácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostiteľovi,

b) sekvenciu DNA kódujúcu sekvenciu RNA, ktorá je aspoň čiastočne komplementárna so sekvenciou RNA kódujúcou enzým sacharózafosfátsyntázu (SPS) prirodzene sa vyskytujúci v tomto rastlinnom hostiteľovi a poprípade

c) sekvenciu terminácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostiteľovi a

Predmetom vynálezu je dalej tiež spôsob produkcie trehalózy v rastlinnom hostiteľovi vďaka prítomnosti génu, ktorý je v tomto rastlinnom hostiteľovi exprimovateľný a ktorý v ďalej uvedenom poradí zahrnuje

d) oblasť iniciácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostiteľovi,

e) sekvenciu DNA kódujúcu aktivitu trehalózafosfátsyntázy a poprípade

f) sekvenciu terminácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostiteľovi a vďaka prítomnosti génu, ktorý je v tomto rastlinnom hostiteľovi exprimovateľný a ktorý v ďalej uvedenom poradí zahrnuje

a) oblasť iniciácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostiteľovi,

b) sekvenciu DNA kódujúcu sekvenciu RNA, ktorá je aspoň čiastočne komplementárna so sekvenciou RNA kódujúcou enzým ADP-glukózopyrofosforylázu prirodzene sa vyskytujúci v tomto rastlinnom hostiteľovi a poprípade

c) sekvenciu terminácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostiteľovi.

Predmetom vynálezu je dalej tiež spôsob produkcie trehalózy v rastlinnom hostiteľovi vďaka prítomnosti génu, ktorý je v tomto rastlinnom hostiteľovi exprimovateľný a ktorý v ďalej uvedenom poradí zahrnuje

a) oblasť iniciácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostiteľovi,

b) sekvenciu DNA kódujúcu aktivitu trehalózafosfátsyntázy a poprípade

c) sekvenciu terminácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostiteľovi a vďaka prítomnosti génu, ktorý je v tomto rastlinnom hostiteľovi exprimovateľný a ktorý v ďalej uvedenom poradí zahrnuje

d) oblasť iniciácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostiteľovi,

e) sekvenciu DNA kódujúcu sekvenciu RNA, ktorá je aspoň čiastočne komplementárna so sekvenciou RNA kódujúcou enzým sacharózafosfátsyntázu prirodzene sa vyskytujúci v tomto rastlinnom hostiteľovi a poprípade

f) sekvenciu terminácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostiteľovi a •vďaka prítomnosti génu, ktorý je v tomto rastlinnom hostiteľovi exprimovateľný a ktorý v ďalej uvedenom poradí zahrnuje

g) oblasť iniciácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostiteľovi,

h) sekvenciu DNA kódujúcu sekvenciu RNA, ktorá je aspoň čiastočne komplementárna so sekvenciou RNA kódujúcou enzým

ADP-glukózopyrofosforylázu prirodzene sa vyskytujúci v tomto rastlinnom hostiteľovi a poprípade

i) sekvenciu terminácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostiteľovi.

Do rozsahu vynálezu tiež patria gény exprimovateľné v rastline, ktoré sa používajú pri spôsobe výroby trehalózy, ako aj ich kombinácie a ďalej tiež klonovacie plazmidy, transformačné vektory, mikroorganizmy a jednotlivé rastlinné bunky nesúce gény exprimovateľné v rastline podľa vynálezu.

Predmetom vynálezu je ďalej tiež rekombinantný rastlinný DNA genóm obsahujúci gén trehalózafosfátsyntázy exprimovatelný v rastline, pričom tento gén v genóme nie je prirodzene prítomný. Predmetom vynálezu je tiež ďalej rekombinantý rastlinný DNA genóm obsahujúci gén trehalózafosfátsyntázy exprimovatelný v rastline, pričom tento gén v genóme nie je prirodzene prítomný a okrem toho gén schopný inhibovat biosyntézu aktivity SPS exprimovatelný v rastline a/alebo gén schopný inhibovat biosyntézu aktivity AGPázy exprimovatelný v rastline.

Predmetom vynálezu je ďalej tiež spôsob získavania rastliny schopnej produkovať trehalózu, ktorého podstata spočíva v tom, že zahrnuje stupeň

1) zavádzania génu exprimovatelného v rastline do bunky rastlinného príjemca, pričom tento gén v ďalej uvedenom poradí zahrnuj e

a) oblasť iniciácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostiteľovi,

b) sekvenciu DNA kódujúcu aktivitu trehalózafosfátsyntázy a poprípade

c) sekvenciu terminácie transkripcie, ktorá je funkčná v ľ'TJ'MXXkMU W * äj Rľ ct'.

danom rastlinnom hostiteľovi a génu exprimovateľného v rastline, pričom tento gén v ďalej uvedenom poradí zahrnuje

d) oblasť iniciácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostiteľovi,

e) sekvenciu DNA kódujúcu selektovatelný markerový gén, ktorý je funkčný v danom rastlinnom hostiteľovi a poprípade

f) sekvenciu terminácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostiteľovi a

2) vytvorenie rastliny z transformovanej bunky pri podmienkach umožňujúcich selekciu na prítomnosť selektovateľného markerového génu.

Predmetom vynálezu sú dalej tiež rastliny produkujúce trehalózu (alebo zvýšenú hladinu trehalózy) v dôsledku genetickej modifikácie.

Predmetom vynálezu sú dalej tiež rastliny obsahujúce rekombinantný DNA genóm zahrnujúci gén exprimovateľný v rastline podľa vynálezu.

Predmetom vynálezu sú dalej tiež rastliny obsahujúce rekombinantný DNA genóm zahrnujúci gén exprimovateľný v rastline podľa vynálezu, pričom rastliny produkujú trehalózu.

\

Predmetom vynálezu sú dalej tiež rastliny obsahujúce rekombinantný DNA genóm podía vynálezu, ktoré vykazujú zvýšenú odolnosť proti suchu.

Do rozsahu vynálezu patria tiež časti rastlín podľa vynálezu, ako sú napríklad bunky alebo protoplazmy alebo ich kultúry, kvety, plody, listy, peľ, korene (vrátane kultúr byle, hluzy (vrátane tzv.

koreňového vlásenia), semená, mikrohlúz) a pod.

Ďalším predmetom vynálezu je spôsob konzervácie rastlín alebo častí rastlín za prítomnosti trehalózy, ktorého podstata spočíva v tom, že zahrnuje stupeň

1) pestovania rastliny podlá vynálezu produkujúcej trehalózu,

2) zber tejto rastliny alebo jej častí obsahujúcich trehalózu,

3) sušenie týchto rastlín alebo ich častí na vzduchu alebo alternatívne

4) lyofilizáciu týchto rastlín alebo ich častí.

Do rozsahu vynálezu patria tiež rastliny a ich časti, ktoré boli konzervované pomocou spôsobu podlá tohto vynálezu.

Ďalším predmetom vynálezu je spôsob výroby trehalózy, ktorého podstata spočíva v tom, že zahrnuje stupeň

1) pestovania rastliny, ktorá je vďaka rekombinantnému rastlinnému DNA genómu schopná produkovať trehalózu (jej zvýšenú hladinu),

2) zber tejto rastliny alebo jej častí a

3) izoláciu trehalózy z tejto rastliny alebo jej častí.

Ďalším predmetom vynálezu je spôsob výroby trehalózy, ktorého podstata spočíva v tom, že zahrnuje stupeň

1) pestovanie rastlinných buniek v kultúre, ktoré sú vďaka rekombinantnému rastlinnému DNA genómu schopné produkovať trehalózu (jej zvýšenú hladinu) a

2) izoláciu trehalózy z tejto kultúry rastlinných buniek.

Ďalším predmetom vynálezu je izolovaná sekvencia nukleových kyselín kódujúcich aktivitu trehalózafosfátsyntázy. Prednostná izolovaná sekvencia nukleových kyselín je sekvencia získaná z E. coli, pričom takáto izolovaná sekvencia nukleových kyselín s výhodou zodpovedá zloženiu uvedenému v SEQ ID NO:2. Ďalšia prednostná realizácia zahrnuje sekvenciu nukleových kyselín kódujúcich aminokyselinovú sékvenciu, ako to je uvedené v SEQ ID NO:3. j

I i

Prehľad obr. na výkresoch í

Na obr. 1 sú znázornené časti biosyntetických dráh pre sacharózu a škrob v zásobných tkanivách rastliny. Tento obrázok ukazuje, že uhľohydrát produkovaný v listoch fotosyntézou sa transportuje floemovým tkanivom vo forme sacharózy. Po vstupe do zásobného tkaniva sa pôsobením aktivity invertázy viazanej k membráne prevedie na monosacharidy, glukózu a fruktózu. Pôsobením množstva enzymatických stupňov sa tieto monosacharidy prevedú na škrob a/alebo sacharózu, ako to je približne znázornené na tomto obrázku. Predpokladá sa, že glukózové metabolity G65 a UDPG slúžia ako substráty pre TPS-enzým zavedený do rastliny prostredníctvom génu otsA exprimovateľného v rastline. Tento obrázok ukazuje, ako sa množstvo UDPG a G65, ktoré sú k dispozícii ako substráty, zvyšuje znížením hladiny enzýmu SPS a AGPázy. Ich inhibícia je označená krížikom.

Na obr. 2 je znázornená mapa EMBL4klonu 7F11 od Kohary et al. (1987) obsahujúceho otsBA operón z E. coli. 18,8kb insert je označený tmavo. Sú tu označené reštrikčné miesta pre enzým EcoRV a HindlII použité na klonovanie génu otsA, ako aj ich vzdialenosť v kb od miesta na ľavej strane insertu. Tiež je tu označený gén otsA a B, pričom smer transkripcie ukazujú šípky (pozri obr. 8, na ktorom je znázornená rozšírená mapa).

Na obr. 3 je znázornená sekvencia klonovanej zemiakovej SPS cDNA. Podtrhnuté sú kukuričné SPS cDNA sekvencie použité ako oligonukleotidy pri amplifikačnej reakcii PCR.

Na obr. 4 je schematicky znázornený binárny vektor pMOG664.

Na obr. 5 je znázornená reštrikčná mapa časti pTiB6 ukazujúca dva fragmenty klonované do pMOG579.

Na obr. 6 je schematicky znázornený pMOG579 použitý na zostrojenie pomocného plazmidu bez T-oblasti v Agrobacterium kmeňa MOG101.

Na obr. 7 je schematicky znázornený expresný vektor pMOGISO.

Na obr. 8 je schematicky znázornená rozšírená mapa EMBL4klonu 7F11 od Kohary et al. (1987) obsahujúca operón otsBA z E. coli. Je tu znázornené umiestenie otvoreného čítacieho rámca (ORF) TPS (*: miesta HindlII, ktoré nie sú prítomné v Koharovej mape (pozri ďalej)).

Na obr. 9 je schematicky znázornený binárny vektor pMOG799.

Na obr. 10 je schematicky znázornený binárny vektor pMOGSOl.

Na obr. 11 je schematicky znázornený binárny vektor pMOG8Ó2.

Nasleduje podrobný popis tohto vynálezu.

V prednostnej realizácii zahrnuje vynález rastlinu zemiaku, ktorá je schopná produkovať trehalózu v hluzách vďaka prítomnosti génu exprimovatelného v rastline, ktorý v ďalej uvedenom poradí zahrnuje

a) oblasť iniciácie transkripcie pochádzajúcu z 35S RNA CaMV, ktorá je lemovaná zo strany proti smeru expresie génu dvojitým zosilňovačom transkripcie génu,

b) sekvenciu DNA kódujúcu trehalózafosfátsyntázu, ktorá predstavuje kódujúcu oblasť génu otsA umiesteného v operóne otsBA operónu E. coli a

c) sekvenciu terminácie transkripcie pochádzajúcu z génu nopalínsyntázy (nos) z Agrobacterium.

Trehalóza je produkovaná v hľuzách transgénnych rastlín obsahujúcich gén TPS exprimovatelný v rastline, zatial čo kontrolné rastliny, ktoré neobsahujú tento gén, trehalózu neprodukujú. Trehalózafosfát, ktorý je produkovaný v hluzách transgénnych rastlín, sa zrejme prevádza na trehalózu. Zrejme nie je nutné zaistiť prítomnosť aktivity trehalózafosfátfosfatázy, keďže táto aktivita sa zdá byť v zemiaku inherentne prítomná.

Na obr. 1 je tiež ilustrovaná prístup vedúci k zlepšeniu dostupnosti substrátu pre TPS. Na tento cieí boli klonované dva gény ovplyvňujúce dostupnosť glukóza-6-fosfátu (G6P) a UDPG s pozitívnym SPS génom a pozitívnou AGPázou pod kontrolou promotora CaMV 35S pre expresiu v hostiteľských rastlinách. Pri zavedení do rastlinného hostitela obsahujúceho exprimovatelný gén TPS podlá tohto vynálezu dôjde pritom k zvýšeniu dostupnosti substrátu pre TPS a teda k syntéze trehalózy. Odborníkom v tomto obore je zrejmé, že na blokovanie syntézy sacharózy alebo škrobu s cielom zlepšenia dostupnosti substrátu je možné použiť tiež iné pozitívne gény.

Napriek tomu, že je vynález podrobne popísaný na prípade rastliny zemiaku, ktorá exprimuje v rastline exprimovatelný gén trehalózafosfátsyntázy z E. coli pod kontrolou promotora CaMV 35S, ako aj oblasti iniciácie transkripcie, odborníkom v tomto obore je zrejmé, že na produkciu trehalózy sa rovnako dobre hodia aj iné spermatofytickí rastlinní hostitelia. Prednostní rastlinní hostitelia patriaci medzi spermatophyty sú Angiospermae, najmä Dicotyledoneae, ktoré zahrnujú mj. Solanacae, ako reprezentatívna čelaď a ďalej tiež Monocotyledoneáe, ktoré zahrnujú okrem iného Gramineae, ako reprezentatívnu čelaď. Vhodní rastlinní hostitelia podlá tohto vynálezu zahrnujú rastliny (ako aj ich časti a bunky), ktoré boli geneticky modifikované použitím techniky rekombinácie DNA s cielom vyvolania alebo zvýšenia produkcie trehalózy v požadovanej rastline alebo orgáne rastliny a ich potomstvo. Tieto rastliny sa môžu použiť priamo (napríklad ak ide o druhy produkujúce jedlé časti) alebo po purifikácii trehalózy z použitého hostitela (či už z jedlého alebo nejedlého rastlinného hostitela). Plodiny s jedlými časťami podlá vynálezu zahrnujú kvetové plodiny, ako je napríklad karfiol (Brassica oleracea, artičoka (Cynara scolymus), ovocné plodiny (ako sú napríklad jablone (Malus, napríklad Malus domesticus), banánovníky (Musa, napríklad Musa acuminata), bobuloviny (ako je napríklad ríbezle, Ribes, napríklad Ribes rubrum), čerešne (ako. je napríklad čerešňa Prunus, napríklad Prunus avium), uhorky (Cucumis, napríklad Cucumis sativus), hrozno (Vitis, napríklad Vitis vinifera), citrón (Citrus limon), dyňu (Cucumis melo), orechy (ako je napríklad vlašský orech, Juglans, napríklad Juglans regia, arašida, Arachis hypogeae), pomaranče (Citrus, napríklad Citrus maxima), marhule (Prunus, napríklad Prunus persica), hrušky (Pyra, napríklad Pyra commulis), papriky (Solanum, napríklad Solanum capsicum), slivky (Prunus, napríklad Prunus fomestica), jahody (Fragaria, napríkld Fragaria moschata), rajčiny (Lycopersicon, napríklad Lycopersicon aesculentum), listové plodiny, ako je napríklad lucerna (Medicago sativa), kapusty (napríklad Brassica oleracea), endívia (Cichoreum, napríklad Cichoreum endivia), cesnak (Allium porrum), hlávkový šalát (Lactuca sativa), špenát (Spínacia oleracea), tabak .(Nicotiana tabacum), koreňové plodiny, ako je napríklad arovrút (Marantha arundinacae, repa (Beta vulgaris), mrkva (Daucus carota), kasave (Manihot esculenta), kvaka (Brassica rapa), reďkev (Raphanus sativus), yam (Dioscorea esculenta), sladké zemiaky (Ipomoea batatas) a plodiny pestované na semeno, ako je napríklad fazula (Phaseolus vulgaris), hrach (Pisum sativum), sója (Glycine max), pšenica (Triticum aestivum), jačmeň (Hordeum vulgare), kukurica (Zea mays), ryža (Oryza sativa), plodiny, z ktorých sa zberajú hľuzy, ako je napríklad kaleráb (Brassica oleraceae), zemiaky (Solanum tuberosum) a pod. Jedlé časti je možné konzervovať sušením J v prítomnosti zvýšenej hladiny

I trehalózy v nich produkovanej vďaka tomu, že tieto rastliny í , obsahujú v rastline exprimoýatelný gén trehalozafosfátsyntázy.

i

Môže byť vhodné produkovať zvýšenú hladinu trehalózy tak, že sa DNA kódujúca aktivitu TPsJ umiesti pod kontrolu promotora špecifického pre určitý orgán alebo tkanivo rastliny, pričom volbu takéhoto promotora môže lahko uskutočniť odborník v tomto obore.

Môže sa použiť akýkolvek gén pre trehalózafosfátsyntázu, ktorý je pod kontrolou regulačných prvkov potrebných pre expresiu DNA v rastlinných bunkách, a to buď špecificky alebo konštitutívne, ak je schopný produkovať aktivitu trehalózafosfátsyntázy. Sekvenciu nukleových kyselín znázornená v SEQ ID NO: 2 a v skutočnosti akýkolvek otvorený čítací rámec kódujúci aktivitu trehalozafosfátsyntázy podlá tohto vynálezu, je možné meniť, bez toho aby bolo nutné meniť aminokyselinovú sekvenciu proteínu ním kódovaného. Táto skutočnosť je Spôsobená degeneráciou genetického kódu, Otvorený čítací rámec kódujúci aktivitu trehalózafosfátsyntázy je možné prispôsobiť použitiu v kodóne zvolenej hostiteľskej rastliny.

Izolované sekvencie nukleových kyselín SEQ ID NO: 2 sa tiež môžu použiť na identifikáciu aktivity trehalozafosfátsyntázy v iných organizmoch s následnou izoláciou hybridizáciou DNA z iného zdroja s DNA- alebo RNA-fragmentom, ktorý sa dá získať z génu E. coli. Prednostne sa takéto sekvencie DNA podrobia screeningu hybridizáciou pri stringentnýčh podmienkach (ako je napríklad teplota a iónová sila hybridizačnej zmesi). Okolnosť, či podmienky sú stringentné, alebo nie, závisí tiež od druhu hybridizácie, tj. od pomeru DNA:DNA, DNA:RNA, RNA:RNA, ako aj od dĺžky najkratšieho hybridizačného fragmentu. Odborníci v tomto obore sú schopný zaistiť stringentný režim hybridizácie.

Zdroje pre izoláciu aktivity trehalozafosfátsyntázy zahrnujú mikroorganizmy (napríklad baktérie, kvasinky a huby), rastliny, zvieratá a pod. Podobne sa môžu pri spôsobe výroby podlá tohto vynálezu použiť aj izolované sekvencie DNA kódujúce aktivitu trehalózafosfátsyntázy, ktoré pochádzajú z iných zdrojov.

Do rozsahu vynálezu patria tiež sekvencie nukleových kyselín, ktoré boli získané modifikáciou sekvencie nukleových kyselín znázornenej v SEQ ID NO: 2 mutáciou jedného alebo viacerých kodónov tak, aby došlo v kódovanom proteíne k zmenám aminokyselín, pri predpoklade, že takáto mutácia aminokyselinovej sekvencie úplne nezruší aktivitu trehalózafosfátsyntázy.

V zásade sa pre vynález hodí akýkolvek rastlinný hostite! v kombinácii s akýmkolvek v rastline exprimovatelným génom * I trehalózafosfátsyntázy. Na získanie takejto kombinácie v rastline exprimovatelného génu s rastlinným hostitelom trehalózafosfátsyntázy sa podobne môžu použiť aj gény trehalózy z iných zdrojov, ak sa stanú dostupnými. í

Inhibícia endogénnych génov s cielom zvýšenia dostupnosti substrátu pre trehalózafosfátsyntázu, ktorá je tu ozrejmená na príklade inhibície endogénneho sacharózafosfátsyntázového génu a ADP-glukózapyrofosforylázového génu, sa môže uskutočniť pomocou množstva alternatívnych spôsobov, ktorých volba nie je pre vynález kritická. Prednostne sa inhibícia uskutočňuje tzv. pozitívnym spôsobom (antisense approach). Pritom sa exprimuje sekvencia DNA produkujúca RNA, ktorá je aspoň čiastočne komplementárna s RNA kódujúcou enzymatickú aktivitu, ktorá má byť blokovaná (napríklad AGPázu alebo SPS v príkladoch). Prednostne sa používajú homologické pozitívne gény, keďže tie sú účinnejšie ako heterologické gény. Izolácia pozitívneho SPS génu zo zemiaku použitím sekvencie kukuričného SPS génu ako sondy ilustruje uskutočniteľnosť tejto stratégie. Neznamená to však, že na uskutočnenie vynálezu je nutné použiť homologické pozitívne fragmenty. Alternatívna metóda blokovania syntézy nežiadúcich enzymatických aktivít spočíva v zavedení prídavnej kópie endogénneho génu prítomného v rastlinnom hostiteľovi do genómu rastlinného hostiteľa. Často je pozorované, že takáto prídavná kópia génu utlmí endogénny gén. Tento účinok je v literatúre označovaný názvom kosupresívny účinok alebo kosupresia.

i í

Na modifikáciu spočívajúcu v zavedení r rastline exprimovateľného génu podľa tohto vynálezu do recipientnej bunky a na pestovanie novej rastliny nesúcej a exprimujúcej tento v rastline exprimovateľný gén sa dajú zásade použiť ako dvojklíčnolistové, tak aj jednoklíčnolistové rastliny, ktoré sú prístupné pre transformáciu. Prednostné rastliny podľa tohto vynálezu sú rastliny, ktoré sú schopné konvertovať fosfát na trehalózu a ktoré neobsahujú žiadnu alebo obsahujú len nízku aktivitu degradujúcu trehalózu. Do rozsahu tohto vynálezu však patria aj rastliny, ktorým chýba schopnosť konvertovať trehalózafosfát na trehalózu. Takéto rastliny .je možné dalej modifikovať zavedením prídavných génov kódujúcich fosfatázy, ktoré sú schopné prevádzať trehalózafosfát na trehalózu. V princípe prichádzajú do úvahy tiež rastliny obsahujúce trehalázy, keďže takéto rastliny je možné prispôsobiť pre produkciu trehalózy inhibíciou aktivity takýchto enzýmov, napríklad inhibíciou expresie génov kódujúcich takéto enzýmy použitím pozitívneho spôsobu. ¹

Metóda, akou sa v rastline exprimovateľný gén trehalózafosfátsyntázy zavádza do recipientnej rastlinnej bunky, nie je rozhodujúca, pri predpoklade, že je tento gén stabilne zabudovaný do genómu príslušnej rastlinnej bunky. Okrem toho použitie kmeňov rodu Agrobacterium sú na zavádzanie DNA do rastlinných buniek k dispozícii aj rôzne iné techniky, ako je transformácia protoplastov použitím metódy s vápnikom a polyetylénglykolom, elektroporácia a mikroinjekcia alebo bombardovanie (potiahnutými) časticami (Potrykus, 1990, Bio/Technol. 8, 535 až 542).

Okrem tzv. priamych metód transformácie DNA sú v širokom rozsahu dostupné tiež transformačné systémy zahrnujúce vektory, ako sú vírusové vektory (napríklad z vírusu mozaiky karfiolu (CaMV) a bakteriálne vektory, napríklad z génu Agrobacterium) (Potrycus, 1990, Bio/Technol. 8, 535 až 542). Po selekcii a/alebo sereeningu sa z protoplastov,[buniek alebo častí rastlín môžu regenerovať celé rastliny použitím spôsobov, ktoré sú dobre známe v tomto obore (Horsch et al., 1985, Science 225, 1229 až 1241).

Už bolo ukázané, že jednokličnolistové rastliny sú vhodné na transformáciu a že fertilné transgénne rastliny je možné buniek. Takúto transformáciu systémov tkanivových kultúr pre metódami zavádzania genetického prednostné spôsoby sa dá v súčasnosti suspenzií buniek či elektroporácia 274 až 276). zavádzaním bargénu regenerovať z transformovaných umožnil vývoj reprodukovatelných tieto plodiny, spolu s účinnými materiálu do rastlinných buniek. Ako transformácie jednoklíčnolistových rastlín uviesť bombardovanie explantátov alebo mikorprojektilmi a priame zavádzanie DNA (Shimamoto et al., 1989, Náture 338,

Transgénne rastliny kukurice boli získané z Streptomyces hygroseopieus kódujúceho fosfinotricínacetyltransferázu (čo je enzým inaktivujúci herbicíd fosfinotricín) do embryogénnych buniek kukuričnej suspenznej kultúry bombardovaním mikroprojektilmi (Gordon-Kamm, 1990, Plánt Celí 2, 603 až 618).

Bolo tiež oznámené zavádzanie genetického materiálu do aleurónových protoplastov iných jednoklíčnolistových plodín, ako je pšenice a jačmeň (Lee 1989, Plánt Mol. Biol. 13, 21 až 30).

Rastliny pšenice boli regenerované z embryogénnej suspenznej kultúry selekciou len zrelého kompaktu a tkanív nodulárneho embryogénneho závalu na prípravu embryogénnych suspenzných kultúr (Vasil, 1990, Bio/technol. 8, 429 až 434). Kombinácia s transformačnými systémami pre tieto plodiny umožňuje aplikovať spôsob podlá vynálezu na jednokličnolistové rastliny. Tieto metódy je možné tiež použiť na transformáciu a regeneráciu dvojklíčnolistových rastlín.

Jednoklíčnoslistové rastliny, vrátane z obchodného hľadiska dôležitých plodín, ako je kukurica, sú použiteľné na prenos DNA prostredníctvom kmeňov Agrobacterium (EP 159 418 , BI, Gould j., Michael D. , Hasegawa 0., Ulian E. C., Peterson G., Smith R.H. (1991) Plánt Physiol, 95, 426 až 434).

Pokial ide o volbu hostiteľskej rastliny, dáva sa prednosť rastlinným druhom, ktoré nevykazujú žiadnu alebo vykazujú len nízku degradačnú aktivitu pre trehalózu. Rastliny vykazujúce trehalázovú aktivitu nie sú však vylúčené z vhodných hostiteľských rastlín na redukciu trehalózy, napriek tomu, že môže byť nutné zaistiť inhibíciu trehalázovej aktivity, ak sa táto aktivita vôbec bráni akumulácii trehalózy. Takúto inhibíciu je možné dosiahnuť použitím pozitívneho spôsobu, ktorý je dobre známy v tomto obore a ktorý je ilustrovaný pre ciele tohto vynálezu.

Tiež je potrebné chápať, použitie promotora CaMV 35S ako že vynález sa neobmedzuje na oblasti iniciácie transkripcie.

Vhodné sekvencie DNA na riadenia expresie génov exprimovateľných v rastline, vrátane markerových génov, ako sú oblasti iniciácie transkripcie, zosilňovače transkripcie, neprepisované vedúce sekvencie a pod, môžu byť odvodené od ktoréhokoľvek génu, ktorý je exprimovaný v rastlinnej bunke, ako sú endogénne gény, prirodzene exprimované v rastlinných bunkách, ako sú gény obsiahnuté v T-DNA divokého typu Agrobacterium, gény rastlinných vírusov, ako aj iné eukaryontné gény obsahujúce oblasť iniciácie transkripcie vyhovujúce pozitívnej sekvencii na iniciáciu eukaryontnej transkripcie. Tiež sem patria hybridné promotory, v ktorých sú kombinované funkčné časti rôznych promotorov alebo ich syntetických ekvivalentov. Okrem konštitutívnych promotorov sa tiež môžu na riadenie expresie génov exprimovateľných v rastline podlá tohto vynálezu používať aj indukovatelné promotory alebo promotory inak regulovateľné pri expresii, napríklad promotory regulované špecifickým štádiom vývoja alebo typom bunky, pri predpoklade, že sú exprimované v častiach rastliny obsahujúcich substrát pre TPS.

Aby bolo možné uskutočňovať selekciu alebo screening transformovaných buniek, prednostne sa do rastlinnej bunky zavádza tiež markerový gén pripojený k v rastline exprimovateľnému génu podlá vynálezu. Volba vhodného markerového

I génu pri transformácii rastliny leží v rozsahu skúseností odborníkov v tomto obore, j Ako niekoľko príkladov rutinne používaných markerových génov je možné uviesť gén neomycínfosfotransferázy udávajúci odolnosť voči kanamycínu (EP-B 131 623), glutatión-S-transferázový gén z potkanej pečene udávajúci odolnosť voči herbicídom glutatiónového radu (EP-A 256 223), glutamínsyntetázový gén, ktorý pri nadexpresii udáva rezistenciu voči inhibítorom fosfinotricín (WO 87/05327), Streptomyces viridochromogenes glutamínsyntetázy, ako je acetyltransferázový gén zo udávajúci rezistenciu voči selekčnému činidlu fosfinotricínu (EP-A 275 957), gén kódujúci 5-enolshikimate-3-fosfátsyntázu (EPSPS), ktorý udáva toleranciu voči N-fosfonometylglycínu, gén bar udávajúci rezistenciu voči Bialaphos (pozri napríklad WO 91/02071). Skutočný výber markeru nemá rozhodujúci význam, ak je zvolený marker funkčný (tj. selektívny) v kombinácii so zvolenými rastlinnými bunkami.

Markerový gén nemusí byť spojený s génom, ktorý je predmetom záujmu, kečfže kotransformácia nespojených génov (US 4 399 216) predstavuje tiež účinný postup transformácie rastlín.

í

Prednostný rastlinný materiáli, pre transformáciu, najmä v i

prípade dvojklíčnolistových rastlín, sú listové kotúčky , ktoré i ' sa dajú ľahko transformovať a vykazujú dobrú schopnosť regenerácie (Horsch R. B. et al., 1985, Science, 227, 1229 až 1231).

Napriek tomu, že sa dá trehalóza produkovať použitím v rastline exprimovateľného génu trehalózafosfátsyntázy, ako jediného génu modifikujúceho uhľohydráty, vynález je dalej ilustrovaný na príkladoch zahrnujúcich prídavné v rastline exprimovateľné gény, ktoré sú schopné zvýšiť dostupnosť substrátu pre trehalózafosfátsyntázu. Ako špecifické príklady takýchto génov je možné uviesť v rastline exprimovateľné pozitívne gény pre SPS z kukurice a zemiaku a AGPázu zo zemiaku. Potláčacia regulácia enzýmov modfikujúcich uhľohydráty použitím pozitívneho spôsobu nie je obmedzená konkrétnymi príkladmi. Tak napríklad sa na inhibíciu expresie cieľového génu môžu použiť čiastočne komplementárne v rastline exprimovateľné pozitívne gény, pri predpoklade, že v rastline exprimovateľné pozitívne gény produkujú transkript, ktorý je dostatočne komplementárny s transkriptom cieľového génu a ktorý je dostatočne dlhý, aby inhiboval expresiu tohto cieľového génu.

Pre vynález je úplne nerozhodujúce, ako je prítomnosť dvoch alebo viacerých génov v tej istej rastline zaistená. Pritom je možné okrem iného použiť niektoré z nasledujúcich metód:

a) transformáciu rastlinnej línie viacgénovým konštruktom obsahujúcim viac ako jeden zavádzaný gén,

b) simultánnu kotransformáciu tej istej rastlinnej línie rôznymi konštruktmi,

c) niekoľko cyklov transformácie rovnakej rastliny zavádzanými génmi,

d) kríženie dvoch rastlín, z ktorých každá obsahuje odlišný gén zavádzaný do rovnakej rastliny.

Vynález je možné aplikovať v poľnohospodárstve a v záhradníctve, čo napríklad vyplýva zo zlepšených vlastností modifikovaných rastlín ako takých, alebo z požiadaviek ktoréhokoľvek odvetvia priemyslu, v ktorom má byť trehalóza použitá. Trehalózafosfát a trehalóza sa môže používať ako také, napríklad v purifikovanej forme alebo vo forme prísad alebo vo forme zásobného produktu v častiach rastlín. Časti rastlín obsahujúcich trehalózafosfát alebo trehalózu (ich zvýšené množstvo) sa môžu používať ako také, alebo na spracovanie bez potreby pridávať trehalózu.

í

Trehalózu je možné purifikovat z rastlín alebo častí rastlín, v ktorých je produkovaná a potom sa môže používať pri rôznych priemyselných postupoch. V potravinárskom priemysle sa [

môže trehalóza používať ako prísada k potravinám pred sušením. Sušenie potravín je dôležitý priemyselný spôsob konzervácie. Trehalóza je užitočná najmä pri konzervácii potravinárskych výrobkov konvenčným sušením na vzduchu a umožňuje rýchlu rekonštitúciu prídavkom vody za vzniku vysokokvalitného produktu (Roser et al., júl 1991, Trends in Food Science and Technology, str. 166 až 169). Pritom sa s výhodou zachovajú prirodzené nutričná hodnota (proteíny a vitamíny) Zistilo sa, že trehalóza je schopná stabilizovať proteíny a membrány a vytvárať chemicky inertné stabilné sklo. Nízka vodná aktivita takýchto vysušených potravinárskych produktov zabraňuje, aby prebiehali chemické reakcie, ktoré sú príčinou degradačných procesov.

príchute a vône a čerstvého produktu.

Ako prírodné zdroje pre masovú produkciu uhlohydrátov (škrobov a sacharózy) sa odjakživa používajú polné plodiny, ako je kukurica, kasave, zemiaky, cukrová repa a cukrová trstina. Produkcia trehalózy v takýchto plodinách sa dá zaistiť pomocou metód génového inžinierstva, pomocou ktorých sa do týchto rastlinných druhov zavedie biosyntetická dráha vedúca k trehalóze. To by umožnilo využil takto transformované plodiny na výrobu trehalózy.

Úroveň doterajšieho stavu techniky je doložená citáciami uvedenými v tomto popise. Všetky tieto citácie, či už ide o patenty alebo iné publikácie, sú tu uvedené náhradou za prenesenie ich celého obsahu jednotlivo do popisu tohto vynálezu.

Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcich príkladoch realizácie. Tieto príklady majú výlučne ilustratívny charakter a rozsah vynálezu v žiadnom ohlade neobmedzujú.

Príklady realizácie vynálezu

DNA manipulácia

Všetky postupy s DNA (izolácia DNA z E. coli, reštrikcia,

ligácia, transformácia atď.) sa uskutočňujú podlá štandardných protokolov (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, USA)

Kmene

Vo všetkých sa na klonovanie používa E. coli K-12 kmeň DH5&. Ako kmeň Agrobacterium tumefáciens, na pokusy s transformáciou rastlín sa používa kmeň MOG101, čo je neonkogénny pomocný kmeň oktopínového typu získaný z kmeňa LBA1010 (Koekman et al., 1982, Plazmid 7, 119) substitúciou T-DNA markerom resistencie voči spektinomycínu.

Konštrukcia kmeňa Agrobacterium MOG101

Na prenesenie génových konštruktov do rastliny zemiaku a tabaku sa použije binárny vektorový systém (Hoekema A., Hirsch, P. R., Hooykaas P. J. J. a Schilperoot, R. A., 1983, Náture 303, 179). Pomocný plazmid dodávajúci Agrobacterium tumefáciens virulentné funkcie sa získa z oktopínového Ti-plazmidu pľiB6.

kmeň Agrobacterium tumefáciens nesúci neonkogénny (Koekman et al., 1982, vyššie uvedená citácia), z ktorého sa vypustí celá T-oblasť a nahradí sa bakteriálnym markerom resistencie voči spektinomycínu z transpozónu Tnl831 (Hooykaas et al., 1980, Plazmid 4, 64 až 75).

MOG101 je Ti-plazmid

Ti-plazmid pTiB6 obsahuje dve susedné T-oblasti, tj. TL (T-lavá) a TR (T-pravá). Aby sa získal derivát neobsahujúci TL- a TR-oblasť sa skonštruuje intermediárny faktor pMOG579. Plazmid pMOG579 je derivátom pBR322, ktorý obsahuje dva Ti-plazmidové fragmenty, ktoré sú homologické s fragmentmi umiestenými na lávej a pravej strane mimo T-oblasti pTiB6 (na obr. 5a 6 označené tmavo). Tieto dva fragmenty sú v pMOG579 oddelené 2,5 kb fragmentom BamHI-Hind3 z transpozónu Tnl831 (Hooykaas et al., 1980, Plazmid 4, 64 až 75) nesúceho marker resistencie voči spektinomycínu (pozri obr. 6). Tento plazmid sa zavedie do kmeňa

Agrobacterium tumefaciens LBA1010 [C58-C9 (pTiB6) = upravený (cured) kmeň C58, do ktorého bol zavedený pTiB6 (Koekman et al., 1982, vyššie uvedená citácia)] triparentálnou kopuláciou z E. coli použitím HB101 8pRK2013 ako pomocného prostriedku.

Uskutoční sa selekcia transkonjugantov na rezistenciu voči rifampicínu (20 mg/liter) a spektinomycínu (250 mg/liter). Dvojnásobná rekombinácia medzi pMOG579 a pTiB6 má za následok stratu rezistencie voči karbenicilínu (marker pBR322) a deléciu celej T-oblasti. V 5 000 spektinomycín-rezistentných transkonjugantoch replikovaných na karbenicilín (100 mg/liter) sa zistia 2 senzitívne transkonjuganty. Analýza Southern (nie je znázornená) ukazuje, že dvojnásobné kríženie má za následok vypustenie celej T- oblasti. Výsledný kmeň sa označí názvom M0G101. Tento kmeň a jeho konštrukcie sú analogické kmeňu GV2260 (Deblaere et al., 1985, Nucl. Acid Res. 13, 477 až.4788).

Alternatívny pomocný kmeň pre MOG101 je napríklad LBA4404. Tento kmeň sa dá tiež účelne použiť na zavedenie binárneho plazmidu, ako je napríklad pMOG799 a následne na transformáciu rastliny. Ľahko dostupné sú aj iné vhodné pomocné kmene.

Konštrukcia expresného vektora pMOGISO

Expresný vektor pMOG180 je derivátom pMOG18 (EP 0 479 359

Al, príklad 2B), z ktorého sa odstráni gén kódujúci GUS a do ktorého sa môžu vložiť iné gény medzi vedúcu sekvenciu A1MV RNA4 a 3'nos terminačnú sekvenciu, ako fragment BamHI.

Pre tento ciel sa syntetizuje fragment EcoRI/Ncol z pM0G18 obsahujúceho promotor 35S a vedúcu sekvenciu A1MV RNA4 použitím PCR technológie a primérov

5' GTTTCTACAGGACGGAGGATCCTGGAAGTATTTGAAAGA 3 ' a

5' CAGCTATGACCATGATTACG 3’, t

čím dôjde k mutácii miesta Ncol na miesto BamHI. Potom sa vektor

pM0G18 rozštiepi EcoRI a BamHI a novo syntetizovaný fragment EcoRI/BamHI sa môže ligovať medzi tieto dve reštrikčné miesta. Aby nedošlo k PCR-indukovaným nepravidelným mutáciám v sekvenciách promotora, nahradí sa fragment EcoRI/EcoRV vo fragmente EcoRI/BamHI syntetizovanom PCR sekvenciami divokého typu z pMOG18. Krátky fragment EcoRV/BamHI sa skontroluje na mutácie sekvenovaním. Výsledný expresný vektor je plazmid pMOG180 (obr. 7).

Triparentálne kopulácie

Binárne vektory sa mobilizujú pri triparentálnych kopuláciách s kmeňom E. coli HB101 obsahujúcim plazmid pRK2013 (Ditta, G., Stanfield S., Corbin D. a Helinski D. R. et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7347) do kmeňa Agrobacterium tumefaciens MOG101 a použijú sa na transformáciu.

Transformácia tabaku (Nicotiana tabacum SR1)

Tabak sa transformuje kokultiváciou rastlinného tkaniva kmeňom Agrobacterium tumefaciens MOG101 (Hoeakema et al., 1983, Náture 303, 179 až 180) obsahujúcim popísaný binárny vektor, ktorý je predmetom záujmu. Transformácia sa uskutočňuje kokultiváciou listových kotúčkov tabaku (Nicotiana tabacum, odroda Petit Havana SR1) spôsobom popísaným v Horsch et al. , 19985, Science 227, 1229 až ¹ 1231). Transgénne rastliny sa regenerujú z koreňov rastúcich na selekčnom médiu obsahujúcom kanamycín alebo hygromycín, podľa toho, aký gén rezistencie je obsiahnutý v binárnom plazmide. Po vytvorení koreňov sa rastliny prenesú do pôdy.

I

Transformácia zemiaku íZemiak (Solanum tuberosum ‘ odroda Désiree) sa transformuje kmeňom Agrobacterium tumefaciens MOG101, ktorý obsahuje binárny vektor, ktorý je predmetom záujmu (Hoekema A, Hiusman M. J. , Molendijk L·., Van den Elsen P,. J. M. a Cornelissen B. J. C.

(1989), Bio/technology 7, 273). Ako Základné kultivačné médium sa použije MS30R30, ktoré sa skladá z média (Murashige T. a Skoog F. (1962) Physiol. Plaň 14, 473) doplneného sacharózou (30 g/liter), vitamínmi R3 (Ooms G., Burrell M. M., Karp A., Bevan M a Hille J (1987) Thoer. Appl. Genet. 73, 744), zeatinribozidom (ZR) (5μΜ) a indoloctovou kyselinou (IAA) (0,3μΜ). Ak to je potrebné, nechá sa médium stuhnúť použitím agaru Daichin pri koncentrácii 0,7 g/liter.

Hľuzy Solanum tuberosum odrody Désiree sa olúpu a povrchovo sterilizujú 20-minútovým pôsobením 0,6% roztoku chlornanu s obsahom 0,1 % namáčadla Tween-20. Zemiaky sa dôkladne perú použitím veíkého objemu sterilnej vody počas prinajmenšom 2 hodín. Z valčekov zemiakového tkaniva vyrezaných korkovrtom sa narežú na kotúčky s hrúbkou asi 2 mm a tieto kotúčky sa inkubujú 20 minút v suspenzii zloženej z média MS30R30 bez ZR a IAA s obsahom 10⁶ až 10⁷ baktérií/ml Agrobacterium MOG101 so obsahom binárneho vektora. Kotúčky sa potom vysušia do sucha na sterilnom filtračnom papieri a prenesú na tuhé médium MS30R30 s ZR a IAA. Po dvoch dňoch sa kotúčky prenesú na čerstvé médium so 100 mg/liter cefotaximu a 50 mg/liter vangomycínu. 0 ďalší týždeň sa kotúčky opäť prenesú do rovnakého média, ktoré však obsahuje kanamycín (100 mg/liter) s cielom selekcie na transgénne výhony. Po 4 až 8 týždňoch sa výhonky odrežú od kotúčkov a umiestia do koreňového média (médium MS30R30 bez ZR a IAA, ale s cefotaxímom (100 mg/liter) a kanamycínom (100 mg/liter)). Výhony sa propagujú axénicky pomocou meristémových rezkov a po vývoji koreňov sa prenesú do pôdy. Ak je to vhodné, použije sa na selekciu namiesto kanamycínu (100 mg/liter hygromycín (10 mg/liter).

Transformácia zemiaku odrody Kardal sa uskutoční v podstate rovnakým spôsobom ako v príklade odrody Désiree, s tým rozdielom, že sa použijú tieto modifikácie: v základnom kultivačnom médiu sú prítomné ako fytohormóny zeatinribozid (3 mg/liter) a IAA (kyselina indoloctová) (0,03 mg/liter). Suspenzia použitá na transformáciu obsahuje 10⁵ až 10⁶ baktérií v 1 ml. Koncentrácia

kanamycínu v koreňovom systéme je 50 mg/liter.

Stanovenie trehalózy

Trehalóza sa stanovuje v podstate pomocou spôsobu popísaného v publikácii Hottiger et al. (1987) J. Bact. 169. Tkanivo zemiakových hľúz sa zmrazí v kvapalnom dusíku, rozdrobí na prášok v trecej miske a potom 60 minút extrahuje pri teplote miestnosti použitím približne troch objemov 500mM kyseliny trichlóroctovej. Po centrifugácii sa peleta ešte raz pomocou rovnakého spôsobu extrahuje. Spojené supernatanty z týchto dvoch extrakcií sa skúšajú na antrónpozitívnu látku (Spiro R. G., (1966) Meth. Enzymol. 8, 3). Trehalóza sa stanoví kvalitatívne pomocou chromatografie na tenkej vrstve. Extrakty sa deionizujú (ionex V, Merck) a nanesú na dosky so silikagélom.60 (Merck). Po chromatografii sa vyvíjanie dosiek uskutoční zmesou n-butanolu, pyridínu a vody v objemovom pomere 15:3:2. Škvrny sa vizualizujú postriekaním roztokom vanilínu ( mg/ml) v koncentrovanej kyseline sírovej a zahriatím na 130 °C. Akom štandard sa použije obchodne dostupná trehalóza (Sigma).

Alternatívne sa trehalóza stanovuje kvantitatívne chromatografiou na anexe použitím pulznej amperometrickej detekcie. Extrakty sa pripravia prídavkom 1 ml vriacej vody k 1 g zmrazenej látky a následným 15 minútovým zahrievaním na 100 °C. Vzorky (25 μΐ) sa analyzujú v kvapalinovom chromatografe (Dionex DX-300), ktorý je vybavený kolónou 4 x 250 mm Dionex 35391 carbopac PA-1 a predkolónou 4 x 50 mm Dionex 43096 carbopac PA-1. Elúcia sa uskutočňuje lOOmM hydroxidom sodným rýchlosťou 1 -ml/min. Cukry sa detegujú pomocou pulzného amperometrického detektoru (Dionex, PAD-2). Ako štandard sa použije obchodne dostupná trehalóza (Sigma).

Stanovenie enzýmov

Pri všetkých stanoveniach sa na kontrolu používa materiál h hlúz netransgénnych hlúz alebo netransgénneho tabaku. Obsah vo

všetkých vzorkách sa stanoví podía Bradforda (Bradford (1976) Anál. Biochem. 72, 248). V prípade stanovenia v extraktoch hlúz sa zmrazené kotúčky hluzy zemiaku s hmotnosťou približne 100 mg homogenizujú v 100 μΐ 20mM pufra HEPES s pH 7,4 a uskutoční centrifugácia (Eppendorf, 5 minút pri nastavení na najvyššiu rýchlosť). Supernatant sa použije na skúšky aktivity.

Aktivita SPS

Aktivita SPS sa stanoví v podstate pomocou spôsobu popísaného v Amir J. a Preiss J. (1982) Plánt Physiol. 63, 1027 až 1030. Zmenami zloženia reakčnej zmesi sa môžu stanoviť dve rôzne formy aktivity SPS: V_max a V_sel. Reakčná zmes V_max obsahuje 3,2mM UDP-glukózu, 81μΜ [¹⁴C]-UDP-glukózu, 3,2mM fruktóza-6-fosfát, 16mM glukóza-6-fosfát, lOOmM HEPES s pH 7,4, 20mM chlorid horečnatý a 5mM kyselinu etyléndiamíntetraoctovú (EDTA) v celkovom objeme 50 μΐ. V reakčnej zmesi V_ge^ je koncentrácia fruktóza-6-fosfátu a glukóza-6-fosfátu polovičná a navyše je pridaný anorganický fosfát (5mM). Pre kontrolu sa aktivita SPS meria v reakčnej zmesi V_max bez fruktóza-6-fosfátu a glukóza-6-fosfátu. Reakcia sa uskutočňuje pri teplote miestnosti počas 30 minút a zastaví sa zahriatím zmesi (5 minút na 95 °C). Produkty reakcie sa spracujú alkalickou fosfatázou a vzniknutá [¹⁴C]-sacharóza sa zo substrátov oddelí chromatografiou na ionexe. Množstvo rádioizotopom označenej sacharózy vzniknutej pri reakcii sa zmeria v scintilačnom počítači.

Aktivita TPS

Aktivita TPS sa meria podobným spôsobom akó aktivita SPS. Po chromatografii na ionexe obsahujú vzorky defosforylovanú sacharózu a trehalózu. Na stanovenie podielu trehalózy vo vzniknutých produktoch sa vzorky podrobia chromatografii na tenkej vrstve charakterizovanej v tomto popise. Extrakty sa deionizujú (ionex V, Merck) a nanesú na silikagélové dosky (Silica Gel 60, Merck). Po chromatografii sa škvrny obsahujúce [ ¹⁴C]-sacharózu a [¹⁴C]-trehalózu zoškrabú a ich rádioaktivita sa

zmeria v scintilačnom počítači.

Aktivita AGPázy

Aktivita AGPázy sa stanoví spôsobom popísaným v publikácii Muller - Rôber B., Sonnewald U. a Willmitzer L. (1992) EMBO J. 11, 1229. Produkcia glukóza-l-fosfátu z ADP-glukózy sa stanoví v systéme s NAD-pripojenou glukóza-6-fosfátdehydrogenázou. Reakčná zmes pre stanovenie obsahuje 80mM HEPES s pH 7,4, lOmM chlorid horečnatý, lmM ADP-glukózu, 0,6mM NAD, ΙΟμΜ glukóza-1,6-difosfát, 3mM DTT, 0,02% hovädzí sérový albumín, 1 m.j. fosfoglukomutázy z králičieho svalu (Sigma), 2,5 m.j. NAD-viazanej glukóza-6-fosfátdehydrogenázy z Leuconostoc mesenteroides a híuzový extrakt. Reakcia sa iniciuje prídavkom difosforečnanu sodného do konečnej koncentrácie 2mM. Redukcia NAD sa meria spektrofotometricky pri 340 nm a 30 °C. Jednotka aktivity AGPázy je definovaná ako nmol glukóza-l-fosfátu vytvoreného za minútu pri 30 °C.

Príklad 1

Klonovanie plnej dĺžky E.

coli otsA génu

V E. coli je trehalózafosfátšyntáza (TPS) kódovaná génom otsA umiesteným v operóne otsBA. Umiestenie a smer transkripcie tohto operónu v chromozóme E. jcoli je známy (Kaasen I., i

Falkenberg P., Styrvold O. B. a Strom A. R. (1992), J. Bact. 174, 889). Gén otsA je umiestený v polohe 42’ a podía Kaasena et al. predstavuje 18,8kb fragment prítomný v klone EMBL4 označenom šifrou 7F11 na mape podía Kohary et al. (Kohará Y., Akyiama K. a Isono K. (1987). Celí 50, 495). DŇA sa pripraví z lyzátu lambda klonu 7F11 a štiepi HindlII. Izolovaný 2,9kb HindlII fragment (pravostranné miesto HindlII v inserťe (14,3kb) z Koharovej mapy vypadne, ako si už všimli Kaasen e^t al.) sa klonuje do pUC18 linearizovaného HindlII. 2,9kb HindlII insert z výsledného plazmidu označeného pMOG674 sa sekvehuje. Zistí sa, že sekveneia obsahuje časť génu araH arabinozového transportného operónu (Scripture J. B., Voelker C., Miller S., O'Donnell R. T., Polgar L., Rade J., Horazdovsky B. F. a Hogg R. W. (1987) J. Biol. 197, 37), gén otsB kódujúci TPP lokalizovaný Kaasanom et al. a časť génu otsA kódujúceho TPS. Zistí sa, že gén otsA nie je obmedzený na 2,9kb fragment HindlII, ako to popísali Kaasen et al. Kvôli doplneniu sekvencie sa izoluje prekrývajúci fragment BamHI/EcoRI a uskutoční sa jeho čiastočná sekvenácia. Úplná sekvenácia kódujúca TPS génu otsA jé znázornená v SEQ ID NO:1. Poloha génu otsA v klone 7F11 s použitými reštrikčnými enzýmami je znázornená na obr. 8. Prídavné miesto HindlII, ;ktoré nie je prítomné v mape publikovanej Koharom et al. sa nachádza na ľavostrannom mieste i 1

2,9kb HindlII fragmentu. i í

t

Miesto HindlII v pMOG180 sa nahradí miestom SstI klonovaním oligonukleotidového duplexu i ^! i ’

SstI · · , '

5’ AGCTCACGAGCTCTCAGG 3’ (SEQIDNO: 8)

3’ GTGCTCGAGAGTCCTCGA 5' (SEQIDNO': 9)

I :

I ! i do pMOGISO rozštiepeného HindlII. Výsledný vektor sa označí názvom pMOG746. Oligonukleotidový dupléx so štruktúrou ' i1

BamHI Sphl HindlII | Smal | | BamHI

I I I I I J.

5' GATCCCCCGGGGCATGCAAGCTTG 3' (SEQIDNO: 10)

3' GGGGCCCCGTACGTTCGAACCTAG 5' (SEQIDNO: 11) sa klonuje do vektora pMOG746 lineärizovanéhó BamHI. Vektor s oligonukleotidovým duplexom v požadovanej orientácii (čo sa skontroluje štiepením reštrikčným enzýmom) sa označí skratkou pMOG747. 2,9kb HindlII fragment plazmidu pMOG674 sa klonuje do pMOG747 linearizovaného HindlII, čím;sa získa vektor pMOG748. Izoluje sa asi 2,4kb fragment EcoRV/Sstl a* asi 3,5kb fragment Sstl/SamI pMOG748. Tieto fragmenty sa ligujú a transformujú do E. coli, pričom dôjde k delécii 3' konca 2,9kb fragmentu HindlII.

Vzniknutý plazmid sa označí skratkou sa syntetizuje pomocou PRC použitím TPS1 a TPS2 a pMOG749 ako templátu.

pMOG749. 5' koniec génu otsA syntetických oligonukleotidov

TPSl 5' GAGAAAATACCCGGGGTGATGAC 3' j(SEQIDNO: 12) TPS2 5' GATAATCGTGGATCCAGATAATGTC 3 ' ’(SEQIDNO: 13)

Sekvenovaním sa potvrdí, že 0,4kb PCR fragment má správnu sekvenciu. lkb fragment BamHI/HindlII z pMOG749 sa klonuje spolu s 0,4kb PCR fragmentom Xmal/BamHI do ;pMOG747 linearizovaného Xmal a HindlII. Do výsledného plazmidu rozštiepeného HindlII a SstI sa klonuje syntetický oligonukleotidový ’duplex TPS6/7, ktorý kóduje tri C-terminálne aminokyseliny TPS.

'9

LysLeuAlaStop j

TPS 6/7: 5' AGCTGGCGTGAGGAGCGGTTAATAAGCTTGAGCT 3'

1í .

3' CCGCACTCCTCGCCAATTATTCGAAC 5'

')

Do výsledného plazmidu rozštiepeného HindlII a SstI sa klonuje

0,25kb fragment HindlII/SstI z plazmidu pMOG749, ktorý obsahuje i

terminátor z génu NOS (Agrobacterium tumefaciens nopalínsyntázový gén) za vzniku plazmidu pM0G798. Tento plazmid obsahuje gén otsA z E. coli v správnej orientácii pod kontrolou promotora 35S z vírusu mozaiky karfiolu (CaMV) s dvojnásobným zosilňovačom transkripcie (Guilley et al. (1982) Celí 30, 763), vedúcu sekvenciu RNA4 z vírusu mozaiky lucerny (AMV) (Brederode et al. (1980) Nucl. Acids Res. 8, 2213); a terminátorovu sekvenciu transkripcie nopalínsyntázy z Agrobacterium tumefaciens. Celá íl expresná kazeta sa klonuje ako 2,5kb fragment EcoRI/SstI do binárneho vektora pMOG23 lineraizováného EcoRl' a SstI. Výsledný binárny vektor pM0G799 (obr. 9) sa použije na transformáciu

Ί.

zemiaku a tabaku (kmeň E. coli nesúci pMOG799 bol uložený v zbierke kultúr Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Phabagen collections, Padualaan 8, Ultrecht, jHolandsko, 23. augusta 1993 pod prírastkovým číslom CBS 430.93, pMOG23 bol uložený v zbierke CBS 29. júna 1990 pod prírastkovým číslom CBS 102.90).

Príklad II

Produkcia trehalózy v tabaku transformovanom pMOG6799

Listové kotúčky tabaku sa transformujú binárnym vektorom pMOG799 použitím Agrobacterium tumefaciens. Na aktivitu trehalózafosfátsyntázy (TPS) sa analyzuje 20 nezávislých transgénnych výhonov. Zistí sa, že niektoré tabakové rastliny pestované in vitro majú extrémne hrubé korene v porovnaní s netransformovanými rastlinami. Pri analýze koreňov týchto transgénnych tabakových rastlín sa zistí zvýšená hladina trehalózy v porovnaní s netransgénnymi kontrolnými rastlinami.

I

Príklad III

Produkcia trehalózy v zemiakoch transformovaných pMOG799

Kotúčky zo zemiakových hlúz sa transformujú binárnym vektorom pMOG799 použitím Agrobacterium tumefaciens. Transgénne výhony sa selektujú na kanamycín. Na aktivitu trehalózafosfátsyntázy (TPS) sa analyzuje celkovo 20 nezávislých transgénnych výhonov. Výhony, u ktorých sa zistí enzým, sa pestujú až do štádia zrelých rastlín. Analýzou zrelých hlúz týchto transgénnych rastlín zemiaku sa zistí zvýšená hladina trehalózy v porovnaní s netransgénnymi kontrolnými rastlinami. Transgénna rastlinná línia MOG799.1 sa propaguje na ďalšie výskumy.

Príklad

Konštrukcia pMOG664

Syntetizujú sa dva oligonukleotidy zodpovedajúce sekvencii f | cDNA malej podjednotky ADP-glukozapyrofosforylázy (AGPázaB) z híuzy zemiaku odroda Désiree (Muller - Róber B., Kossman j.,

Hannah L. C., Willmitzer L. a Sonnewald U. (1990) Mol. Gen. Genet í

224, 136 až 146) i

5' TCCCCATGGAATCAAAGCATCC 3' (SEQIDNO: 4)

5' GATTGGATCCAGGGCACGGCTG 3' (SEQIDNO: 5)

Tieto oligonukleotidy sa skonštruujú tak, aby obsahovali vhodné reštrikčné miesta (BamHI a Ncol - tieto miesta sú podtrhnuté) na svojich koncoch, aby sa dali zostaviť do expresnej kazety v pozitívnej orientácii, po rozštiepení týmito enzýmami. Fragment s dĺžkou približne 1 kb sa amplifikuje pomocou PCR s týmito oligonukleotidmi použitím DNA izolovanej z knižnice cDNA zemiaku odrody Désiree z dva mesiace starého listového tkaniva (Clontech) ako templátu. Sekvenovaním sa potvrdí, že tento fragment je identický so sekvenciou AGPázy B zo zemiaku odrody Désiree ((Muller - Rôber B., Kossman J., Hannah L. C., Willmitzer L. a Sonnewald U. (1990) Mol. Gen. Genet 224, 136 až 146). Po vyštiepení pomocou BamHI a Ncol sa vzniknutý fragment klonuje do í

pMOG18 linearizovaného BamHI a Ncol.il,85kb EcoRI/BamHI fragment (obsahujúci promotor CaMV 35S, veäúcu sekvenciu AMV RNA4 a fragment AGPázy v pozitívnej orientácii), ako aj fragment BamHI/HindlII obsahujúci terminátor | z nopalínsyntázového (NOS) génu Agrobacterium tumefaciens z výsledného plazmidu sa klonuje trojcestnou ligáciou do binárneho vektora pMOG22 linearizovaného EcoRI a HindlII. Binárny vektor pMOG22 obsahuje v rastline exprimovateíný gén HPTII pre selekciu na hygromycín v transgénnych rastlinách (pMOG22 boí uložený v zbierke kultúr Centraal Bureau voor Schimmelcultures, 29. januára 1990 pod prírastkovým číslom 101.90). Výsledný binárny vektor pMOG664 (obr. 4) sa použije na transformáciu zemiaku.

PríkladV

Konštrukcia pMOGSOl

Syntetizuje sa súbor oligonukleotidov, ktoré sú komplementárne k sekvencii cDNA kukuričnej sacharózafosfátsyntázy (SPS) (Worrell, A. C., Bruneau, J-M., Summerfalt, K., Boersig, M. a Voelker, T. A. (1991) Plánt Celí 3, 1121). Tieto oligonukleotidy ľ/l-Ptllľl-- N LU. 1. i m _____ majú tieto sekvencie:

5' CTAGGTCGTGATTČTGATACAGGTGGCCAGGTG' 3'

5' CAGCATCGGCATAGTGCCCATGTATCACGTAAGGC ' 3' (SEQIDNO: 6) (SEQIDNO: 7)

Vyššie popísané oligonukleotidy sa použijú na PCR amplifikáciu fragmentu DNA (370bp) použitím DNA izolovanej z cDNA knižnice zemiaku odrody Désiree pochádzajúcej z tkaniva dva mesiace starých listov (Clontech) ako templátu. Sekvenovaním tohto fragmentu sa zistí, že je tento fragment homologický voči SPS sekvencií kukurice (pozri obr. 3,a Worrell et al. (1991)). Fragment PCR sa použije pre screening lambda gtlO cDNA knižnice zemiaku odrody Désiree pochádzajúcej z tkaniva dva mesiace starých listov (Clontech). InSert jedného pozitívne hybridižujúceho sa klonu sa sekvenuje. Sekvencia 654bp fragmentu DNA je z 65 % totožná so zodpovedajúcou časťou sekvencie SPS kukurice (začínajúc nukleotidom č. 349 na obr. 11 podlá vyššie uvedenej citácie Worell et al. z roku 1991). EcoRI insert tohto klonu sa klonuje do pMOG180 rozštiepeného BamHI trojcestnou ligáciou použitím tohto syntetického oligonukleotidového duplexu:

5' GATCGTCAGATCTAGC 3' (SEQIDNO: 14) j

3' CAGTCTAGATCGTTAA 5' (SEQIDNO: 15) 1 •í

Plazmid obsahujúci SPS fragment v pozitívnej orientácii vzhladom na promotor CaMV 35S sa označí názvom pMOG787. Fragment : I

EcoRI/HidnIII plazmidu pM0G787 sa klonuje trojcestnou ligáciou použitím syntetického linkeru: í i i ' I ¹ : ^;

5' AGCTTCCCCCCCG 3' (SEQIDNO: 16) '

3' AGGGGGGGCTTAA 5' (SEQIDNO: 17) '1 . J do binárneho vektora pMOG22 lineraizovaného EcoRI. Binárny vektor pMOG22 obsahuje v rastline exprimovatelný gén HPTII pre hygromycínovú selekciu v transgénnyčh rastlinách. (pMOG22 bol uložený v zbierke kultúr Central Bureau voor Schimmelcultures, 29. januára 1990 pod prírastkovým číslom 101.90). Výsledný vektor

pMOGSOl (obr. 10) sa použije na transformáciu zemiaku.

Príklad VI

Konštrukcia pMOG802

EcoRI fragment plazmidu pMOG801 obsahujúceho pozitívnu SPS expresnú kazetu sa klonuje do binárneho vektora pMOG664 (obsahujúceho pozitívnu AGPázovú kazetu) lineraizovaného EcoRI. Výsledný binárny vektor sa označí skratkou pMOG802 (obr. 11).

Príklad

VII

Produkcia trehalózy v zemiaku transformovanom pMOG799 a pMOG664

Kotúčky zo zemiakovej hluzy pochádzajúce, z rastlinnej línie MOG799.1, ktorá je rezistentná voči kanamycínu, exprimujúce TPS (príklad IX) sa transformujú binárnym vektorom pMOG664 obsahujúcim pozitívnu AGPázovú expresnú kazetu. Transgénne výhony získané selekciou na hygromycíne (10 mg/liter) sa analyzujú na prítomnosť sekvencie TPS a pozitívnej AGPázy pomocou PCR. Transgénne rastliny obsahujúce obidve tieto sekvencie sa analyzujú na aktivitu TPS a AGPázy.

Analýza transgénnych hlúz na aktivitu AGPázy ukazuje, že v jednotlivých transgénnych líniách dochádza v porovnaní s netransgénnymi kontrolnými rastlinami k zníženiu hladiny [

aktivity. Analýza Nothern blot ukazuje, že hladina mRNA pre AGPázu je v transgénnych rastlinách netransgénnymi kontrolnými rastlinami hluzách transgénnych rastlín zemiaku, aktivita TPS a znížená hladina AGPázy, je vyššia v porovnaní s hladinou trehalózy zistenou v hluzách transgénnej rastlinnej línie MOG799.1.

nižšia v porovnaní s Hladina trehalózy v v ktorých bola zistená

Príklad VIII

Produkcia trehalózy v zemiaku transformovanom pMOG799 a pMOG801

Kotúčky zo zemiakovej hluzy pochádzajúce z rastlinnej línie MOG799.1, ktorá je rezistentná voči kanamycínu, exprimujúce TPS (príklad IX) sa transformujú binárnym vektorom pMOGSOl obsahujúcim pozitívnu SPS expresnú kazetu. Transgénne výhony získané selekciou na hygromycíne (10 mg/liter) sa analyzujú na prítomnosť sekvencíe TPS a pozitívnej SPS pomocou PCR. Transgénne rastliny obsahujúce obidve tieto sekvencíe sa analyzujú na aktivitu TPS a SPS.

Analýza transgénnych hlúz na aktivitu SPS ukazuje, že v jednotlivých transgénnych líniách dochádza. v porovnaní s netransgénnymi kontrolnými rastlinami k zníženiu hladiny aktivity. Analýza Nothern blot ukazuje, že hladina mRNA pre SPS je v transgénnych rastlinách nižšia v porovnaní s netransgénnymi kontrolnými rastlinami. Hladina trehalózy v hluzách transgénnych rastlín zemiaku, v ktorých bola zistená aktivita TPS a znížená hladina SPS, je vyššia v porovnaní s hladinou trehalózy zistenou v hluzách transgénnej rastlinnej línie MOG799.1.

Príklad IX

Produkcia trehalózy v zemiaku transformovanom pMOG799 a PMOG802

Kotúčky zo zemiakovej hluzy pochádzajúce z rastlinnej línie MOG799.1, ktorá je rezistentná voči kanamycínu, exprimujúce TPS (príklad IX) sa transformujú binárnym vektorom pMOG802 obsahujúcim pozitívnu SPS expresnú kazetu a AGPázovú expresnú kazetu. Transgénne výhony získané selekciou na hygromycíne (10 mg/liter) sa analyzujú na prítomnosť sekvencíe TPS, pozitívnej AGPázy a pozitívnej SPS pomocou PCR. Transgénne rastliny obsahujúce všetky tri tieto sekvencíe sa analyzujú na aktivitu TPS, AGPázy a SPS.

Analýza transgénnych hľúz na aktivitu AGPázy a SPS ukazuje, že v jednotlivých transgénnych líniách dochádza v porovnaní s netransgénnymi kontrolnými rastlinami k zníženiu hladiny aktivity. Analýza Nothern blot ukazuje, že hladina mRNA pre AGPázu a SPS je v transgénnych rastlinách nižšia v porovnaní s netransgénnymi kontrolnými rastlinami. Hladina trehalózy v hľuzách transgénnych rastlín zemiaku, v ktorých bola zistená aktivita TPS a znížená hladina SPS, je vyššia v porovnaní s hladinou trehalózy zistenou v hľuzách transgénnej rastlinnej línie MOG799.1.

Uložené kmene pMOG22 prírastkové číslo CBS 101.90 (strana 23, riadok 18 až

21, strana 24, riadok 21 až 23) pMOG23 prírastkové číslo CBS 102.90 (strana 22, riadok 10) pMOG799 prírastkové číslo CBS 430.93 (strana 22, riadok 6)

Zoznam sekvencii (1) Všeobecné informácie (i) (A) (B) (C) (D) (E) (F) (G) (H) (ii) (iii) (iv) (v)

Prihlasovateľ: ^!

Meno: MOGEN International N.V

Ulica: Einsteinwég 97

Mesto: LEIDEN [

Štát: Zuid-Holl[and

Krajina: Holandsko,

Poštovné smerovacie číslo (ZIP): NL-2333 CB Telefón: (31).(71);.258282

Fax: (31).(71),.221471

Názov vynálezu: PRODUCTION OF TREHALOSE

IN PLANTS (Výroba trehalózy v rastlinách)

Počet sekvencii: 17 ^! strojovo čitateľná forma:

(A) stredný typ: diskety (B) počítač: IBM PC kompatibilný (C) operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Paťentln Release č. 1.0, verzia 1,25 (EPO)

Údaje o súčasnej prihláške:

ČÍSLO PRIHLÁŠKY: WO PCT/EP93/02290 (2) Informácie o SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka 370 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazcovitosť: dvojreťazcová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA - mRNA (iii) Hypotetická: nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Solanum tuberosum (B) Kmeň: Desiree ¹ (C) Typ tkaniva: SEQ ID NO: 1

CTAGGTCGTG ATTCTGÄTAC AGGTGGCCAG GTGAAGTATG TAGTAGAGCT TGCTCGAGCA

CTTGCAAACA TC-AAAGGAGT TCACCGAGTT GATCTCTTGA CTCGGCAGAT CACATCCCCA

120

GAGGTTGATT CTAC-CTATGG TGAGCCAATT GAGA7GC7CT CATGCCCATC 7GA7GC777G

180

GCTGCTGTGG	TGCCTACTAT TCGGATCCCT GCGGACCAGG TGACAAGATA TTCCAAAAGA	240
ATTTACATAC	CAGAATTTGT TGATGGAGCA TTAAGCCACA TTGTGAATAT GGCAAGGGCT	300
ATAGGGGAGC	AAGTCAATGC TGGAÄAÄGCA GTGTGGCCTT ACGTGATACA TGGGCACTAT	360
GCCGATGCTG		370

(2) Informácie o SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristika sekveneie:

(A) Dĺžka 1446 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazcovitosť: dvojreťazcová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (genómová) (iii) Hypotetická: nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Escherichia coli (vii) Bezprostredný zdroj:

(B) Kloň: 7F11 (viii) Poloha v genóme:

(B) Poloha na mape: 41-42' (ix) Charakteristický znak:

(A) Meno/kíúč: CDS (B) Umiestenie: 19..1446 (D) Iné informácie: produkt =

Trehalózafosfátsyntáza, gén = otsA (xi) Popis sekveneie: SEQ ID NO:2

GAGAAAATAA CAGGAGTG ATG Het	ACT T h Z	ATG AGT CGT TTA	GTC Val	GTA Val	GTA Val	TCT Ser 10	AAC Asn
Ket	Ser Arg Leu 5
	1
CGG	ATT GCA CCA CCA GAC	C-AG	CAC	GCC GCC AGT	GCC	C-GT	GGC	CTT	GCC
Arg	íle Ala Pro Pro Asp	Glu	Kis	Ala Ala Ser	Ala	Gly	Gly	Leu	Ala
	15			20		-	25
GTT	GGC ATA CTG GGG GCA	CTG	AAA	GCC GCA C-C-C	GGA	CTG	TGG	TTT	GGC
Val	Gly íle Leu Gly Ala	Leu	Lyô	Ala Ala Gly	Gly	Leu	Trp	Phe	Gly
	30		35			40

TGG

AGT

GGT

GAA

ACA

GGG

AAT

GAG

GAT

CAG

CCG

CTA

AAA

AAG

GTG

AAA

195

Trp

Ser

Gly

Glu

Thr

Gly

Asn

Glu

Asp

Gin

Pro

Leu

Lys

Lys

Val

Ly3

45

50

55

AAA

GGT

AAC

ATT

ACG

TGG

GCC

TCT

TTT

AAC

CTC

AGC

GAA

CAG

GAC

CTT

243

Lys

Gly

Asn

íle

Thr

Trp

Ala

Ser

Phe

Asn

Leu

Ser

Glu

Gin

Asp

Leu

60

65

70

75

GAC

GAA

TAC

TAC

AAC

CAA

TTC

TCC

AAT

GCC

GTT

CTC

TGG

CCC

GCT

TTT

291

Asp

Glu

Tyr

Tyr

Asn

Gin

Phe

Ser

Asn

Ala

Val

Leu

Trp

Pro

Ala

Phe

Θ0

85

90

CAT

TAT

CGG

CTC

GAT

CTG

GTG

ČKÁ

TTT

CAG

CGT

CCT

GCC

TGG

GAC

GGC

339

His

Tyr

Arg

Leu

Asp

Leu

Val

Gin

Phe

Gin

Arg

Pro

AJ.a

Trp

Asp

Gly

95

100

105

TAT

CTA

CGC

GTA

AAT

GCG

TTG

CTG

GCA

GAT

AAA

TTA

CTG

CCG

CTG

TTG

• 387

Tyr

Leu

Arg

Val

Asn

Ala

Leu

Leu

Ala

Asp

Lys

Leu

Leu

Pro

Leú

Leu

110

115

120

CAA

GAC

GAT

GAC

ATT

ATC

TGG

ATC

CAC

GAT

TAT

CAC

CTG

TTG

CCA

TTT

435

Gin

Asp

Asp

Asp

íle

íle

Trp

íle

His

A.sp

Tyr

His

Leu

Leu

Pro

Phe

125

130

135

GCG

CAT

GAA

TTA

CGC

AAA

CC-G

GGA

GTG

AAT

AAT

CGC

ATT

GGT

TTC

TTT

483

Ala

HÍ3

Glu

Leu

Arg

Ly3

Arg

Gly

Val

Asn

Asn

Arg

íle'

Gly

Phe

Phe

140

145

150

155

CTG

CAT

ATT

CCT

TTC

CCG

ACA

CCG

GAA

ATC

TTC

AAC

GCG

CTG

CCG

ACA

531

Leu

His

íle

Pro

Phe

Pro

Thr

Pro

Glu

íle

Phe

Asn

AJLa

Leu

Pro

Thr

160

165

170

TAT

GAC

ACC

TTG

CTT

GAA

CAG

CTT

TGT

GAT

TAT

GAT

TTG

CTG

GGT

TTC

579

Tyr

Asp

Thr

Leu

Leu

Glu

Gin

Leu

Cy3

Asp

Tyr

Asp

Leu

Leu

Gly

Phe

175

180

185

CAG

ACA

GAA

AA.C

GAT

CGT

CTG

C-CG

TTC

CTG

GAT

TGT

CTT

TCT

AAC

CTG

627

Gin

Thr

Glu

Asn

Asp

Arg

Leu

Ala

Phe

Ireu

Asp

Cys

Leu

Ser.

Avsn

Leu

190

195

200

ACC

CGC

GTC

ACG

ACA

CGT

AGC

GCA

AAA

AGC

CAT

ACA

C-CC

TGG

GGC

AAA

675

Thr

Arg

Val

Thr

Thr

Arg

Ser

Ala

Lys

Ser

His

Thr

AJ. a

Trp

Gly

Lys

205

210

215

GCA

TTT

CGA

ACA

GAA

GTC

TA.C

CCG

ATC

GGC

ATT

GAA

CCG

AAA

GAA

ATA

723

Ala

Phe

Arg

Thr

Glu

Val

Tyr

Pro

íle

Gly

íle

Glu

Pró

Lys

Glu

íle

220

225

230

235

GCC

AAA

CAG

GCT

GCC

GGG

CCA

CTG

CCG

CCA

AAA

CTG

GCG

CAA

CTT

AAA

771

Ala

Lys

Gin

Ala

Ala

Gly

Pro

Leu

Pro

Pro

Lys

Leu

Ala

Gin

Leu

Lys

240 245 250

GCG

GAA

CTG

AAA

AAC

GTA CAA

AAT

ATC

TTT

TCT

GTC

GAA

CGG

CTG

GAT

819

. Ala

Glu

Leu

Ly3

Asn

Val Gin

Asn

íle

Phe

Ser

Val

Glu

Arg

Leu

Asp

•

255

260

265

TAT

TCC

AAA

GGT

TTG

CCA G.AG

CGT

TTT

CTC

GCC

TAT

GAA

GCG

TTG

CTG

867

Tyr

Ser

Lys

Gly

Leu

Pro Glu

Arg

Phe

Leu

Ala

Tyr

Glu

Al a

Leu

Leu

270

.275

280

GAA

AAA

TAT

CCG

CAG

CAT CAT

GGT

AAA

ATT

CGT

TAT

ACC

CAG

ATT

GCA

915

Glu

Lys

Tyr

Pro

Gin

His His

Gly

Lys

íle

Arg

Tyr

Thr

Gin

íle

Ala

285

290

295

CCA

ACG

TCG

CGT

GGT

GAT GTG

CAA

GCC

TAT

CAG

GAT

ATT

CGT

CAT

CAG

963

Pro

Thr

Ser

Arg

Gly

Asp Val

Gin

Ala

Tyr

Gin

Asp

íle

Arg

His

Gin ·

300

305

310

315

CTC

GAA

AAT

GAA

GCT

GGA CGA

ATT

AAT

GGT

A1A

TAC

GGG

CAA

TTA

GGC

• 1011

Leu

Glu

Asn

Glu

Ala

Gly Arg

íle

Asn

Gly

Lys

Tyr

Gly

Gin

Leu'

Gly

320

325

330

TGG

ACG

CCG

CTT

TAT

TAT TTG

AAT

CAG

CAT

TTT

GAC

CGT

AAA

TTA

CTG

1059

Trp

Thr

Pro

Leu

Tyr

Tyr Leu

Asn

Gin

His

Phe

Asp

Arg

Lys

Leu

Leu

335

340

345

ATG

AAA

ATA

TTC

CGC

T.AC TCT

GAC

GTG

GGC

TTA

GTG

ACG

CCA

CTG

CGT

1107

Het

Ly3

íle

Phe

Arg

Tyr Ser

A3p

Val

Gly

Leu

Val

Thr

Pro

Leu

Arg

350

3S5

360

GAC

GGG

ATG

AAC

CTG

GTA GCA

AAA

GAG

TAT

GTT

GCT

GCT

CAG

GAC

CCA

1155

Asp

Gly

Het

Asn

Leu

Val Ala

Ly3

Glu

Tyr

Val

Ala

Ala

Gin

Asp

Pro

365

370

375

GCC

AAT

CCG

GGC

GTT

CTT GTT

CTT

TCG

CAA

TTT

GCG

GGA

GCG

GCA

AAC

1203

Ala

Asn

Pro

Gly

Val

Leu Val

Leu

Ser

Gin

Phe

Ala

Gly

Ala

Ala

Asn

380

385

390

395

GAG

TTA

ACG

TCG

GCG

TTA ATT

GTT

AAC

CCC

TAC

GAT

CGT

GAC

GAA

GTT

1251

Glu

Leu

Thr

Ser

Ala

Leu íle

Val

Asn

Pro

Tyr

Asp

Arg

Asp;

.Glu

Val

400

405

410

GCA

GCT

GCG

CTG

GAT

CGT C-CA

TTG

ACT

A.TG

TCG

CTG

GCG

G.AA

CGT

ATT

1299

Ala

Ala

Ala

Leu

Asp

Arg Ala

Leu

Thr

Het

Ser

Leu

Ala

Glu

Arg

íle

415

420

425

TCC

CGT

CAT

GCA

GAA

ATG CTG

GAC

GTT

ATC

GTG

AAA

AAC

GAT

ATT

AAC

1347

Ser

Arg

HÍ3

Ala

Glu

Het Leu

Asp

Val

íle

Val

Ly3

Asn

A3P

íle

Asn

430

435

440

CAC

TGG

CAG

GAG

TGC

TTC ATT

AGC

GAC

CTA

AAG

CAG

ATA

GTT

CCG

CGA

1395

HÍ3

Trp

Gin

Glu

Cys

Phe íle

Ser

Asp

Leu

Lys

Gin

íle

Val

Pro

Arg

445 450 455

AGC GCG GAA AGC CAG CAG CGC GAT ΑΛΑ GTT GCT ACC 7TT CCA ZxAG CTT

Ser Ala Glu Ser Gin Gin Arg Asp Lys Val Ala Thr Phe Pro Lys Leu

460 465 470 . 475

GCG

Ala

1443

1446 (2) Informácie o SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka 476 párov báz (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteln

	(Xi)	Popis	sekvencie:	SEQ	ID	NO: 3
Het Thr Het 1	Ser Arg 5	Leu Val	Val Val Ser 10	A_sn	Arg	íle Ala Pro Pro 15
Asp Glu His	Ala Ala 20	Ser AJ a	Gly Gly Leu 25	Ala	Val	Gly íle Leu Gly 30
Ala Leu Lys 35	Ala Ala	Gly Gly	Leu Trp Phe 40	Gly	Trp	Ser Gly Glu Thr 45
Gly A.τη Gin 50	Asp Gin	Pro Lee 55	Lys Lys Val	LV3	Lys 60	Gly Asn íle Thr
Trp Ala Ser 65	Phe Asn	Leu Ser 70	Glu Gin A.sp	Leu 75	Asp	Glu Tyr Tyr Asn 80
Gin Phe Ser	Asn Ala 85	Val Leu	Trp Pro AJa 90	Phe	His	Tyr Arg Leu Asp 95
Leu Val Gin	Phe Gin 100	Arg Pro	AJa Trp Asp 105	Gly	Tyr	Leu Arg Val A^sn 1.1.0
Ala Leu Leu 115	AJ. a Asp	Lys Leu	Leu Pro Leu 120	Leu	Gin	Asp A.sp Asp íle 125
íle Trp íle 130	KÍ 3 Asp	Tyr His 135	Leu Leu Pro	Phe	Ala 140	His Glu Leu Arg
Lys Arg Gly 145	Val Asn	A. s n Arg 150	íle Gly Phe	Phe 155	Leu	His íle Pro Phe 160

Pro Thr Pro Glu íle Phe A-s.n Ala Leu Pro Thr Tyr Asp Thr Leu Leu 165 170 175

Glu

Gin

Leu

Cys Asp Tyr Asp

Leu

Leu

Gly

Phe

Gin

Thr

Glu

Α3Π

Asp

180

185

190

Arg

Leu

Ala

Phe Leu Asp Cys

Leu

Ser

Asn

Leu

Thr

Arg

Val

Thr

Thr

195

200

205

Arg

Ser

Ala

Lys Ser His Thr

Ala

Trp

Gly

Lys

Ala

Phe

Arg

Thr

Glu

210

215

220

Val

Tyr

Pro

íle Gly íle Glu

Pro

Lys

Glu

íle

Ala

Lys

Gin

Ala

Ala

225

230

235

240

Gly

Pro

Leu

Pro Pro Lys Leu

Ala

Gin

Leu

L y 3

Ala

Glu

Leu

Lys

Asn

245

250

255

Val

Gin

Asn

íle Phe Ser Val

Glu

Arg

Leu

Asp

Tyr

Ser

Lys

Gly.

Leu

260

265

270

Pro

Glu

Arg

Phe Leu Ala Tyr

Glu

Ala

Leu

Leu

Glu

Lys

Tyr

Pro

Gin

275

280

285

His

His

Gly

Ly3 íle Arg Tyr

Thr

Gin

íle

Ala

Pro

Thr

Ser

Arg

Gly

290

295

300

Asp

Val

Gin

Ala Tyr Gin Asp

íle

Arg

HÍ3

Gin

Leu

Glu

Asn

Glu

Ala

305

310

315

320

Gly

Arg

íle

Asn Gly Lys Tyr

Gly

Gin

Leu

Gly

Trp

Thr

Pro

Leu

Tyr

325

330

335

Tyr

Leu

Asn

Gin His Phe Asp

Arg

Lys

Leu

Leu

Het

Lys

íle

Phe

Arg

340

345

350

Tyr

Ser

Asp

Val Gly Leu Val

Thr

Pro

Leu

Arg

A3p

Gly

Het

Asn

Leu

355

360

365

Val

Ala

Ly3

Glu Tyr Val Ala

Ala

Gin

Asp

Pro

Ala

Asn

Pro

Gly

Val

370

375

380

Leu

Val

Leu

Ser Gin Phe Ala

Gly

Ala

Ala

Asn

Glu

Leu

Thr

Ser

Ala

385

390

395

400

Leu

íle

Val

Asn Pro Tyr Asp

Arg

Asp

Glu

Val

Ala

Ala

Ala

Leu

Asp

405

410

415

Arg

Ala

Leu

Thr Het Ser Leu

Ala

Glu

Arg

íle

Ser

Ärg

His

Ala

Glu

420 425 430

Het Leu Asp Val íle Val Lys Asn Asp íle Asn His Trp Gin Glu Cys 435 440 445

Phe	íle 450	Ser Asp	Leu	Lys	Gin íle Val Pro Arg Ser Ala Glu Ser Gin
455	4 60 ’·
Gin	Arg	Asp Ly3	Val	Ala	Thr	Phe Pro Ly3 Leu Ala ' ·
465				470		475

(2) Informácie o SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka 22 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazcovitosť: jednoreťazcová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: Áno (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO:4:

TCCCCATGGA ATCAAAGCAT CC 22 (2) Informácie o SEQ ID NO: 5:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka 22 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazcovitosť: jednoreťazcová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: Áno (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO;5:

GATTGGATCC AGGGCACGGC TG 22 (2) Informácie o SEQ ID NO: 6:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka 33 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazcovitosť: jednoreťazcová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: Áno (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO:6:

CTAGGTCGTG ATTCTGATAC AGGTGGCCAG GTG (2) Informácie o SEQ ID NO: 7:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka 35 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazcovitosť: jednoreťazcová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (genómová) (iii) Hypotetická: Áno (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO:7:

CAGCATCGGC ATAGTGCCCA TGTATCACGT AAGGC 35 (2) Informácie o SEQ ID NO: 8:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka 18 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazcovitosť: jednoreťazcová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: Áno (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO:8:

AGCTCACGAG CTCTCAGG (2) Informácie o SEQ ID NO: 9:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka 18 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazcovitosť: jednoreťazcová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: Áno (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO:9:

GTGCTCGAGA GTCCTCGA .18 (2) Informácie o SEQ ID NO: 10:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka 24 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazcovitosť: jednoreťazcová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: Áno (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO:10:

GATCCCCCGG GGCATGCAAG CTTG 24 (2) Informácie o SEQ ID NO: 11:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka 24 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazcovitosť: jednoreťazcová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: Áno (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO:11:

GGGGCCCCGT ACGTTCGAAC CTAG (2) Informácie o SEQ ID NO: 12:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka 23 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazcovitosť: jednoreťazcová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: Áno (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO:12:

CAGAAAATAC CCGGGGTGAT GAC (2) Informácie (i) (ii) (iii) (xi) o SEQ ID NO: 13:

Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka 25 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazcovitosť: jednoreťazcová (D) Topológia: lineárna Typ molekuly: cDNA Hypotetická: Áno

Popis sekvencie: SEQ ID NO:13:

GATAATCGTG GATCCAGATA ATGTC 25 (2) Informácie (i) (ii) (iii) (xi)

O SEQ ID NO: 14:

Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka 16 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazcovitosť: jednoreťazcová (D) Topológia: lineárna Typ molekuly: cDNA Hypotetická: Áno

Popis sekvencie: SEQ ID NO:14:

GATCGTCAGA TCTAGC (2) Informácie (i) (ii) (iii) (Xi) o SEQ ID NO: 15:

Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka 16 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazcovitosť: jednoreťazcová (D) Topológia: lineárna Typ molekuly: cDNA Hypotetická: Áno

Popis sekvencie: SEQ ID NO:15:

CAGTCTAGAT CGTTAA (2)

Informácie o SEQ ID NO:

16:

(i) Charakteristika sekvencíe:

(A) Dĺžka 13 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazcovitosť: jednoreťazcová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: Áno (xi) Popis sekvencíe: SEQ ID NO:16:

AGCTTCCCCC CCG (2) Informácie o SEQ ID NO: 17:

(i) Charakteristika sekvencíe:

(A) Dĺžka 13 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazcovitosť: dvojreťazcová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: Áno (xi) Popis sekvencíe: SEQ ID NO:17:

AGGGGGGGCT TAA

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Gén exprimovateľný v rastline, ktorý pri expresii v rastline alebo rastlinnej bunke zvyšuje obsah trehalózy v tejto rastline alebo rastlinnej bunke.

   2. Gén exprimovateľný v rastline podľa nároku 1, ktorý v číalej uvedenom poradí obsahuje:

   a) oblasť iniciácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostiteľovi,

   b) sekvenciu DNA kódujúcu aktivitu trehalózafosfátsyntázy a poprípade

   c) sekvenciu terminácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostiteľovi.

   3. Gén exprimovateľný v rastline podľa nároku 2, v ktorom sekvencia DNA kódujúca aktivitu trehalózafosfátsyntázy má zloženie zodpovedajúce aminokyselinovej sekvencii SEQ ID NO: 2.

   4. Gén exprimovateľný v rastline podľa nároku 2, v ktorom sekvencia DNA kódujúca aktivitu trehalózafosfátsyntázy zahrnuje otvorený čítací rámec génu otsA z E. coli.

   5. Gén exprimovateľný v rastline podľa nároku 2 až 4, v ktorom miesto iniciácie transkripcie obsahuje promotorovú oblasť DNA kódujúcu 35S RNA vírusu mozaiky karfiolu a terminátorovú oblasť transkripcie nopalínsyntázového génu z Agrobacterium tumefaciens.

   6. Gén exprimovateľný v rastline podľa nároku 2, ako je prítomný v pMOG799, ktorý bol uložený v zbierke kultúr Centraal

   Bureau Schimelcultures pod prírastkovým číslom 430.93.

   7. Sekvencia ..DNA obsahujúca gén exprimovatelný v rastline, ktorý v ďalej uvedenom poradí zahrnuje

   a) oblasť iniciácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostitelovi,

   b) sekvenciu DNA kódujúcu aktivitu trehalózafosfátsyntázy a poprípade

   c) sekvenciu terminácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostitelovi, a gén exprimovatelný v rastline, ktorý v ďalej uvedenom poradí zahrnuj e

   d) oblasť iniciácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostitelovi,

   e) sekvenciu DNA kódujúcu sekvenciu RNA, ktorá je aspoň čiastočne komplementárna so sekvenciou RNA kódujúcou enzým sacharózafosfátsyntázu (SPS) prirodzene sa vyskytujúci v tomto rastlinnom hostitelovi a poprípade

   f) sekvenciu terminácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostitelovi.

   8. Sekvencia DNA obsahujúca gén exprimovatelný v rastline, ktorý v ďalej uvedenom poradí zahrnuje

   a) oblasť iniciácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostitelovi,

   b) sekvenciu DNA kódujúcu aktivitu trehalózafosfátsyntázy a poprípade ₍ c) sekvenciu terminácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostitelovi, a gén exprimovatelný v rastline, ktorý v ďalej uvedenom poradí zahrnuje

   d) oblasť iniciácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostitelovi,

   e) sekvenciu DNA kódujúcu sekvenciu RNA, ktorá je aspoň čiastočne komplementárna so sekvenciou RNA kódujúcou enzým ADP-glukózapyrofosforylázu prirodzene sa vyskytujúci v tomto rastlinnom hostitelovi a poprípade

   f) sekvenciu terminácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostitelovi.

   9. Sekvencia DNA obsahujúca gén exprimovatelný v rastline, ktorý v ďalej uvedenom poradí zahrnuje

   a) oblasť iniciácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostitelovi,

   b) sekvenciu DNA kódujúcu aktivitu trehalózafosfátsyntázy a poprípade

   c) sekvenciu terminácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostitelovi, a gén exprimovatelný v rastline, ktorý v ďalej uvedenom poradí zahrnuje

   a) oblasť iniciácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostitelovi,

   b) sekvenciu DNA kódujúcu sekvenciu RNA, ktorá jé aspoň čiastočne komplementárna so sekvenciou RNA kódujúcou enzým sacharózafosfátsyntázu prirodzene sa vyskytujúci v tomto rastlinnom hostitelovi a a gén exprimovatelný v rastline, ktorý v ďalej uvedenom poradí zahrnuj e

   a) oblasť iniciácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostitelovi,

   b) sekvenciu DNA kódujúcu sekvenciu RNA, ktorá je aspoň čiastočne komplementárna so sekvenciou RNA kódujúcou enzým ADP-glukózapyrofosforylázu prirodzene sa vyskytujúci v tomto rastlinnom hostitelovi a poprípade

   c) sekvenciu terminácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostitelovi.

   10. Klonovací vektor obsahujúci gén exprimovatelný v rastline podlá niektorého z nárokov 1 až 6.

   11. Klonovací vektor obsahujúci sekvenciu DNA podlá niektorého z nárokov 7 až 9.

   12. Binárny vektor obsahujúci gén exprimovatelný v rastline podlá niektorého z nárokov 1 až 6.

   13. Binárny vektor obsahujúci sekvenciu DNA podlá niektorého z nárokov 7 až 9.

   14. Mikroorganizmus obsahujúci vektor podlá niektorého z nárokov 1 až 13.

   15. Mikroorganizmus podlá nároku 12 alebo 13, ktorý je z rodu Agrobacterium.

   16. Spôsob získavania rastliny so zvýšenou schopnosťou produkcie trehalózy, vyznačujúcisatým, že zahrnuje stupeň

   1) zavádzania génu exprimovateľného v rastline do recipientnej bunky rastliny, pričom tento gén pri expresii v rastline alebo rastlinnej bunke zvyšuje obsah trehalózy v tejto rastline alebo rastlinnej bunke a génu exprimovateľného v rastline, ktorý v ďalej uvedenom poradí zahrnuje

   a) oblast iniciácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostiteľovi,

   b) sekvenciu. DNA kódujúcu selektovateľný markerový gén, ktorý je funkčný v danom rastlinnom hostiteľovi a poprípade

   c) sekvenciu terminácie transkripcie, ktorá je funkčná v danom rastlinnom hostiteľovi a
2. 2) vytvorenie rastliny z transformovanej bunky pri podmienkach umožňujúcich selekciu na prítomnosť selektovateľného markérového génu.

   17. Rekombinantý rastlinný DNA genóm obsahujúci gén trehalózafosfátsyntázy exprimovateľný v rastline, pričom tento gén v genóme nie je prirodzene prítomný.

   18. Rekombinantý rastlinný DNA genóm obsahujúci

   a) gén kódujúci trehalózafosfátsyntázu exprimovateľný v rastline a

   b) gén schopný inhibovat biosyntézu aktivity sacharózafosfátsyntázy exprimovateľný v rastline.

   19. Rekombinantý rastlinný DNA genóm obsahujúci

   a) gén kódujúci trehalózafosfátsyntázu exprimovateľný v rastline a

   b) gén schopný inhibovať biosyntézu aktivity ADP-glukózapyrofosforylázy exprimovateíný v rastline.

   20. Rekombinantý rastlinný DNA génom obsahujúci

   a) gén kódujúci trehalózafosfátsyntázu exprimovateíný v rastline a

   b) gén schopný inhibovať biosyntézu aktivity

   ADP-glukózapyrofosforylázy exprimovateíný v rastline a

   c) gén schopný inhibovať biosyntézu aktivity sacharózafosfátsyntázy exprimovateíný v rastline.

   21. Rastlinná bunka obsahujúca rekombinantý' rastlinný DNA genóm podía niektorého z nárokov 17 až 20.

   22. Kultúra rastlinných buniek obsahujúca rastlinné bunky podía nároku 21.

   23. Rastlina obsahujúca bunku podía nároku 21.

   24. Rastlina obsahujúca prevažne bunky podía nároku 21.

   25. Rastlina schopná produkovať zvýšenú hladinu trehalózy v dôsledku genetickej modifikácie.

   26. Rastlina podía nároku 25 obsahujúca zvýšenú hladinu trehalózy.

   27. Rastlina podía nároku 25 patriaca do súboru Angiospermae.

   28. Rastlina podía nároku 27 patriaca do čeíade Solanaceae.

   29. Rastlina podía nároku 28, ktorou je Solanum tuberosum.

   30. Časť rastliny podlá niektorého z nárokov 25 až 29.

   31. Časť rastliny podlá nároku, ktorá obsahuje zvýšenú hladinu trehalózy.

   32. Časť podía niektorého z nárokov 30 alebo 32, zvolená zo súboru zahrnujúceho cibule, kvety, plody, koreňové vlásenie, listy, mikrohluzy, pel, korene, semená, byle a hluzy.

   33. Spôsob konzervácie rastlín alebo častí rastlín pri prítomnosti trehalózy, vyz nač u jú cis atý m, že zahrnuje stupeň

   1) pestovanie rastliny podlá niektorého z nárokov 25 až 26 alebo pestovanie časti rastliny podlá niektorého z nárokov 29 až 30,

   2) zber tejto rastliny alebo jej častí obsahujúcich trehalózu,
3. 3) sušenie tejto rastliny alebo jej častí na vzduchu alebo alternatívne
4. 4) lyofilizáciu tejto rastliny alebo jej častí.

   34. Sušená rastlina alebo čast rastliny pripravítelná spôsobom podlá nároku 31.

   35. Spôsob výroby trehalózy, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje stupeň

   1) pestovanie rastliny podlá nároku 25 pri podmienkach umožňujúcich produkciu trehalózy

   2) zber tejto rastliny alebo jej častí a

   3) izoláciu trehalózy z tejto rastliny alebo časti rastliny.

   36. Izolovaná sekvencia DNA kódujúca plnú dĺžku aktivity trehalózafosfátsyntázy.

   37. Izolovaná sekvencia DNA podlá nároku 36 pripravitelná z E. coli.

   38. Izolovaná sekvencia DNA podlá nároku 35 so zložením zodpovedajúcim SEQ ID NO: 2.

   39. Izolovaná sekvencia nukleovej kyseliny kódujúca aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 3.