JP2002505875A - 植物中トレハロース生合成遺伝子の発現 - Google Patents

植物中トレハロース生合成遺伝子の発現

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、トレハロース生合成遺伝子を、例えば、誘導性プロモーターの制御下に発現する新規トランスジェニック植物を提供し、該植物は成長過程で正常である。本発明はまた当該植物のストレス耐性を改善する方法、食物品質を改善する方法、および本発明植物の他の作製・使用法を提供する。本発明はまた新規トレハロース生合成酵素をエンコードするヌクレオチド配列を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は植物におけるトレハロース生合成遺伝子の発現および干ばつ抵抗性に
関する。とりわけ、本発明は高等植物におけるトレハロースの蓄積と干ばつ抵抗
性の問題およびかかる特性を設計する新規方法を取扱うものである。また、本発
明は収獲した植物の貯蔵性の改良、果実および花卉の所蔵期間の改良、ならびに
形質転換植物で発現された外来タンパク質の安定化に必要な要件を取扱うもので
ある。好適な態様において、本発明は植物中でのトレハロース生合成遺伝子の、
好ましくは誘導性プロモーター制御下の発現につき記載するが、この遺伝子はト
レハロースの非制御蓄積と関連する有害な影響なしに干ばつに対する抵抗性獲得
を可能とする。
【０００２】 （背景技術） トレハロース（α−Ｄ−グルコピラノシル−［１，１］−α−Ｄ−グルコピラ
ノシド）は下等生物、例えば、細菌、真菌および昆虫などに共通して見出される
二糖であり、トレハロースはそれらの生物の休止期または安定期細胞および器官
に多くの場合集積する。トレハロースの生合成には２種の酵素活性が必要である
；トレハロース−６−リン酸シンターゼはＵＤＰ−グルコースとグルコース−６
−リン酸との縮合を触媒してトレハロース−６−リン酸とし、また、トレハロー
ス−６−リン酸ホスファターゼはトレハロース−６−リン酸をリン酸水解し、ト
レハロースとする。
【０００３】 トレハロースは還元型炭素に対し貯蔵型として作用するが、より有意義な役割
として、様々な非生物的ストレス、顕著なものとして熱および乾燥などの有害な
影響に対し防御物として働く。生体内および生体外両方において、トレハロース
の蓄積は生物高分子（特に、膜およびタンパク質）を乾燥、温度極限、および浸
透ストレスショックなどから保護することと相関する。醗酵生産されたトレハロ
ースは、酵素の保存用、および脱水と加工処理した食物の安定化用に市販使用さ
れている。
【０００４】 トレハロースが共生微生物の産物として植物に存在することはこれまでも認め
られてきたことではあるが、一般に脊椎動物および高等植物はトレハロースを合
成し得ないと考えられていた。高等植物ファミリーにおいて特異的にトレハロー
スを同化する酵素（トレハラーゼ）が略至るところに存在するということは生物
学的興味の対象であったが、これは主に共生または着生微生物および真菌起源か
ら植物細胞に入り込んだ外来トレハロースの存在に帰せられていた。注目すべき
例外は、異常に長期の乾燥期間にも生存し得る「復活植物」の範疇に大まかにグ
ループ分けされる下等植物と被子植物類である。これらの植物は種として、イワ
ヒバ（Ｓelaginella）およびミロタムヌス（Ｍyrothamnus）を包含し、干ばつの
始まりに続いて、乾燥重量で１０％ものトレハロースを蓄積することができる。
【０００５】 干ばつ抵抗性とトレハロースの関連性および微生物学的トレハロース醗酵の歴
史的に乏しい経済性の観点で、この二糖を蓄積する形質転換植物を設計する試み
もなされている。かかる植物は（細菌および酵母のトレハロース遺伝子を用い）
成功裏に入手されたが、植物サイトソル中での構成トレハロース産生は非常に有
害な影響を伴うことが明らかとなった。トレハロース産生遺伝子を推進する緑色
組織特異植物プロモーターの使用は、これらの影響をすべてではないが幾分改善
する、しかし、これらの表現型（矮小成長、異常葉、未発育根）はトレハロース
の発現が根の組織にまたは初期発生時に起こる場合に特に深刻である。
【０００６】 これらの事実を仮定すれば、トレハロース生合成遺伝子の誘導性発現系は、そ
れがトレハロース蓄積を可能とし、干ばつ抵抗性をもたらし、植物に対し有害な
影響を与えなければ、実用性が大きく、経済的に有益となる。
【０００７】 （発明の開示） 本発明はこのように植物におけるトレハロース生合成遺伝子の発現と干ばつ抵
抗性に関する。
【０００８】 好適な態様において、本発明は植物中でのトレハロース生合成遺伝子の発現、
好ましくは誘導性プロモーターの制御下の発現につき説明するが、この遺伝子は
トレハロースの非制御蓄積と関連する有害な影響なしに干ばつに対する抵抗性を
可能とする。好適なプロモーターは化学的に誘導可能なプロモーター、例えば、
タバコＰＲ−１ａプロモーターであり、化学的誘導物質の葉部塗付により活性化
することができる。
【０００９】 さらに、本発明は異なる細胞画分内で発現されるトレハロース生合成遺伝子の
発現につき記載する。第一の態様において、トレハロース生合成遺伝子は植物細
胞質内で発現される。さらなる態様において、トレハロース生合成遺伝子は植物
核ゲノムから発現され、そこからエンコードされたトレハロース生合成酵素は、
例えば、色素体移行ペプチドを用いることにより、色素体を標的とする。さらな
る態様において、トレハロース生合成遺伝子は植物色素体ゲノムから発現される
。好適な態様において、植物色素体においてトレハロース生合成遺伝子の発現を
指令し得るプロモーターに融合したトレハロース生合成遺伝子を含むベクターが
色素体ゲノムに形質転換される。好適な態様において、トレハロース生合成遺伝
子に融合したファージプロモーターを含むベクターが色素体ゲノムに形質転換さ
れる。得られる系統はファージＲＮＡポリメラーゼの核コーディング領域を含む
トランスジェニック系統に交雑されるが、この系統は色素体標的配列が補われて
おり、また、植物プロモーター、例えば、誘導性プロモーター、組織特異プロモ
ーターまたは構成的プロモーターなどに操作可能に連鎖されている。他の好適な
態様において、植物色素体にてトレハロース生合成遺伝子の発現を指令し得るプ
ロモーターは通常色素体に存在するＲＮＡポリメラーゼ、例えば、核エンコード
ポリメラーゼまたは色素体エンコードポリメラーゼなどにより転写されるプロモ
ーターである。かかるプロモーターは、clpＰプロモーター、１６Ｓｒ−ＲＮＡ 遺伝子プロモーター、ｐsbＡプロモーターまたはrbcＬプロモーターなどである が、これらに限定されるものではない。
【００１０】 本発明においては、大腸菌からのトレハロース生合成遺伝子が好適に使用され
るが、他の生物、例えば、これらに限定されるものではないが、酵母、他の下等
生物または高等生物からの遺伝子も使用することができる。例えば、大腸菌 Ｏt
sＡおよび／または大腸菌 ＯtsＢ遺伝子；酵母ＴＰＳ１、ＴＳＬ１またはＴＳＬ
２遺伝子（米国特許５，７９２，９２１）、アラビドプシス（Ａrabidopsis）ト
レハロースシンターゼ遺伝子（ＴＰＳ１、寄託番号Ｙ０８５６８、Ｂlazquezら 、Ｐlant Ｊ（１９９８）１３：６８５〜９）、アラビドプシス・トレハロース リン酸ホスファターゼ（Ｖogelら、Ｐlant Ｊ（１９９８）１３：６７３〜８３ ）または二官能性トレハロースリン酸シンターゼ／ホスファターゼをエンコード
するセラギネラ・レピドフィラ（Ｓelaginella lepidophylla）遺伝子（寄託番 号Ｕ９６７３６）。
【００１１】 好適な態様において、トレハロースリン酸シンターゼをエンコードするヌクレ
オチド配列およびトレハロースリン酸ホスファターゼをエンコードするヌクレオ
チド配列は両方とも植物中で発現される。他の好適な態様において、トレハロー
スリン酸シンターゼをエンコードするヌクレオチド配列は植物中で発現され、ま
たはトレハロースリン酸ホスファターゼをエンコードするヌクレオチド配列は植
物中で発現される。本発明はオペロン様ポリシストロン性遺伝子の単一プロモー
ターから転写された２種のトレハロース生合成遺伝子の色素体ゲノムからの発現
に関する。
【００１２】 本発明は経済的に重要な作物からの、特にトウモロコシ由来のトレハロース生
合成酵素をエンコードする新規なヌクレオチド配列をも開示する。かかるヌクレ
オチド配列を植物に形質転換し、そのトレハロース含量とその干ばつ抵抗性を増
大させる。本発明はまた常套の育種技法により、ストレスに対する抵抗性の増大
した系統産生のマーカーとしてこれらヌクレオチド配列を使用する方法を提供す
る。
【００１３】 このように本発明が提供するのは以下のとおりである： トレハロース生合成酵素をエンコードするヌクレオチド配列を発現する植物、
例えば、トレハロース６−リン酸シンターゼおよび／またはトレハロース６−リ
ン酸ホスファターゼをコードするヌクレオチド配列、例えば、大腸菌 ＯtsＡお よび／または大腸菌 ＯtsＢ遺伝子、を含んでなる植物。かかるヌクレオチド配 列は、例えば、その核または色素体ＤＮＡ中に、好ましくは誘導性プロモーター
、例えば、傷害により誘導可能なまたは化学的に誘導可能なプロモーターの制御
下に、あるいは植物色素体中でトレハロース生合成遺伝子の発現を指令し得るプ
ロモーター、例えば、トランス活性化因子調節プロモーターであって、対応する
トランス活性化因子が誘導性プロモーター、組織特異プロモーターまたは構成的
プロモーターの制御下にある場合のトランス活性化因子調節プロモーターの制御
下に、安定に取込まれている；また、かかる植物の子孫および種子をも包含し、
該種子は任意に処理（例えば、下塗りまたは被覆）および／または包装する、例
えば、使用指示書とともに袋に入れる。
【００１４】 本発明が特に提供するのは以下のとおりである： 植物のゲノム中に、トレハロース６−リン酸シンターゼをエンコードするヌク
レオチド配列を含んでなる第一異種発現カセットまたはその部分であって、誘導
性プロモーターの制御下、または当該植物の色素体中で該ヌクレオチド配列の発
現を指令し得るプロモーター、例えばトランス活性化因子調節プロモーターであ
って、対応するトランス活性化因子が好ましくは誘導性プロモーター、組織特異
プロモーターまたは構成的プロモーターの制御下にある場合のトランス活性化因
子調節プロモーターの制御下にある第一異種発現カセット、およびトレハロース
６−リン酸ホスファターゼをエンコードするヌクレオチド配列を含んでなる第二
異種発現カセットまたはその部分であって、誘導性プロモーターの制御下、また
は当該植物の色素体中で該ヌクレオチド配列の発現を指令し得るプロモーター、
例えば、トランス活性化因子調節プロモーターであって、対応するトランス活性
化因子が好ましくは誘導性プロモーター、組織特異プロモーターまたは構成的プ
ロモーターの制御下にある場合のトランス活性化因子調節プロモーターの制御下
にある第二発現カセットとを含んでなる本発明による植物；また、かかる植物の
子孫および種子をも包含し、該種子は任意に処理（例えば、下塗りまたは被覆）
および／または包装する、例えば、使用指示書とともに袋に入れる。
【００１５】 本発明がさらに提供するのは以下のとおりである： 好ましくは誘導性プロモーター、例えば、傷害により誘導可能なまたは化学的
に誘導可能なプロモーターの制御下にトレハロース６−リン酸シンターゼをエン
コードするヌクレオチド配列を含んでなる植物発現カセット； かかる植物発現可能なカセットを含んでなるベクター；および かかるベクターで形質転換した植物。
【００１６】 本発明がさらに提供するのは以下のとおりである： 好ましくは誘導性プロモーター、例えば、傷害により誘導可能なまたは化学的
に誘導可能なプロモーターの制御下にトレハロース６−リン酸ホスファターゼを
エンコードするヌクレオチド配列を含んでなる植物発現カセット； かかる植物発現可能なカセットを含んでなるベクター；および かかるベクターで形質転換した植物。
【００１７】 本発明がさらに提供するのは以下のとおりである： 好ましくは誘導性プロモーター、例えば、傷害により誘導可能なまたは化学的
に誘導可能なプロモーターの制御下にトレハロース６−リン酸シンターゼをエン
コードするヌクレオチド配列を含んでなり、そしてさらに、好ましくは誘導性プ
ロモーター、例えば、傷害により誘導可能なまたは化学的に誘導可能なプロモー
ターの制御下にトレハロース６−リン酸ホスファターゼをエンコードするヌクレ
オチド配列とを含んでなる植物発現カセット； かかる植物発現可能なカセットを含んでなるベクター；および かかるベクターで形質転換した植物。
【００１８】 さらなる態様において、本発明は、トランス活性化因子調節プロモーターの制
御下で色素体中、トレハロース生合成酵素をエンコードするヌクレオチド配列の
発現を包含し、トランス活性化因子の遺伝子は植物プロモーターの制御下、核Ｄ
ＮＡの中に存在する。例えば、色素体形質転換ベクターは一般にファージプロモ
ーター、例えば、ファージＴ７遺伝子１０プロモーターを用いて構築されるが、
このものの転写活性化はファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラ
ーゼに依存する。得られる系統はファージＲＮＡポリメラーゼの核コーディング
領域を含むトランスジェニック系統に交雑されるが、このラインは葉緑体標的配
列が補われており、また、植物プロモーター、好ましくは誘導性プロモーター、
組織特異プロモーターまたは構成的プロモーター、好ましくはタバコＰＲ−１ａ
プロモーターなどの化学的に誘導可能なプロモーターに操作可能に連鎖されてい
る。
【００１９】 本発明がこのようにさらに提供するのは以下のとおりである： 異種核発現カセットまたはその部分であって、好ましくは誘導性プロモーター
、組織特異プロモーターまたは構成的プロモーター、より好ましくは誘導性プロ
モーター、例えば、傷害により誘導可能なまたは化学的に誘導可能なプロモータ
ー、例えば、タバコＰＲ−１ａプロモーターを含んでなり、該プロモーターはト
ランス活性化因子（好ましくは、トランス活性化因子は植物中に天然に存在する
ものではなく、好ましくはＲＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡ結合タンパク質、例
えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ）をコードするＤＮＡ配列に操作可能に連鎖して
おり、当該トランス活性化因子は色素体標的配列、例えば、葉緑体標的配列（例
えば、上記の植物発現可能な発現カセット）に任意に融合されている異種核発現
カセットまたはその部分；および 異種色素体発現カセットまたはその部分であって、トランス活性化因子（例え
ば、トランス活性化因子がＴ７ＲＮＡポリメラーゼである場合はＴ７プロモータ
ー）により調節され、かつ、少なくとも１種のトレハロース生合成酵素、例えば
、トレハロース６−リン酸シンターゼなどをエンコードするヌクレオチド配列に
操作可能に連鎖しているトランス活性化因子介在プロモーターを含んでなる異種
色素体発現カセットまたはその部分； を含んでなる植物である；また、 かかる植物の子孫および種子をも包含し、該種子は任意に処理（例えば、下塗り
または被覆）および／または包装する、例えば、使用指示書とともに袋または他
の容器に入れる。
【００２０】 本発明がさらに提供するのは以下のとおりである： 異種核発現カセットまたはその部分であって、好ましくは誘導性プロモーター
、組織特異プロモーターまたは構成的プロモーター、より好ましくは誘導性プロ
モーター、例えば、傷害により誘導可能なまたは化学的に誘導可能なプロモータ
ー、例えば、タバコＰＲ−１ａプロモーターを含んでなり、該プロモーターはト
ランス活性化因子（好ましくは、トランス活性化因子は植物中に天然に存在する
ものではなく、好ましくはＲＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡ結合タンパク質、例
えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ）をエンコードするヌクレオチド配列に操作可能
に連鎖しており、当該トランス活性化因子は色素体標的配列、例えば、葉緑体標
的配列（例えば、上記の植物発現可能な発現カセット）に任意に融合されている
異種核発現カセットまたはその部分；および 異種色素体発現カセットまたはその部分であって、トランス活性化因子（例え
ば、トランス活性化因子がＴ７ＲＮＡポリメラーゼである場合はＴ７プロモータ
ー）により調節され、かつ、トレハロース６−リン酸ホスファターゼをエンコー
ドするヌクレオチド配列に操作可能に連鎖しているトランス活性化因子介在プロ
モーターを含んでなる異種色素体発現カセットまたはその部分； を含んでなる植物である；また、 かかる植物の子孫および種子をも包含し、該種子は任意に処理（例えば、下塗り
または被覆）および／または包装する、例えば、使用指示書とともに袋または他
の容器に入れる。
【００２１】 本発明がさらに提供するのは以下のとおりである： 異種核発現カセットまたはその部分であって、好ましくは誘導性プロモーター
、組織特異プロモーターまたは構成的プロモーター、より好ましくは誘導性プロ
モーター、例えば、傷害により誘導可能なまたは化学的に誘導可能なプロモータ
ー、例えば、タバコＰＲ−１ａプロモーターを含んでなり、該プロモーターはト
ランス活性化因子（好ましくは、トランス活性化因子は植物中に天然に存在する
ものではなく、好ましくはＲＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡ結合タンパク質、例
えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ）をコードするＤＮＡ配列に操作可能に連鎖して
おり、当該トランス活性化因子は色素体標的配列、例えば、葉緑体標的配列（例
えば、上記の植物発現可能な発現カセット）に任意に融合されている異種核発現
カセットまたはその部分；および 異種色素体発現カセットまたはその部分であって、トランス活性化因子（例え
ば、トランス活性化因子がＴ７ＲＮＡポリメラーゼである場合はＴ７プロモータ
ー）により調節され、かつ、トレハロース６−リン酸シンターゼをエンコードす
るヌクレオチド配列に操作可能に連鎖しているトランス活性化因子介在プロモー
ター、およびトランス活性化因子（例えば、トランス活性化因子がＴ７ＲＮＡポ
リメラーゼである場合はＴ７プロモーター）により調節され、かつ、トレハロー
ス６−リン酸ホスファターゼをエンコードするヌクレオチド配列に操作可能に連
鎖しているトランス活性化因子介在プロモーターとを含んでなる異種色素体発現
カセットまたはその部分； を含んでなる植物である；また、 かかる植物の子孫および種子をも包含し、該種子は任意に処理（例えば、下塗り
または被覆）および／または包装する、例えば、使用指示書とともに袋または他
の容器に入れる。
【００２２】 さらなる態様において、本発明は、通常色素体に存在するＲＮＡポリメラーゼ
、例えば、核エンコードポリメラーゼまたは色素体エンコードポリメラーゼなど
により転写されるプロモーターの制御下で、色素体中トレハロース生合成酵素を
エンコードするヌクレオチド配列の発現を包含する。かかるプロモーターは、例
えば、clpＰプロモーター、１６Ｓｒ−ＲＮＡ遺伝子プロモーター、psbＡプロモ
ーターまたはrbcＬプロモーターなどであるが、これらに限定されるものではな い。
【００２３】 本発明がこのようにさらに提供するのは以下のとおりである： 異種核発現カセットまたはその部分であって、好ましくは植物色素体において
トレハロース生合成酵素をエンコードするヌクレオチド配列を発現し得るプロモ
ーター、例えば、通常色素体に存在するＲＮＡポリメラーゼ、例えば、核エンコ
ードポリメラーゼまたは色素体エンコードポリメラーゼなどにより転写されるプ
ロモーターであり、少なくともトレハロース生合成酵素、例えば、トレハロース
６−リン酸シンターゼなどをエンコードするヌクレオチド配列に操作可能に連鎖
しているプロモーターを含んでなる異種核発現カセットまたはその部分； を含んでなる植物である；また、 かかる植物の子孫および種子をも包含し、該種子は任意に処理（例えば、下塗り
または被覆）および／または包装する、例えば、使用指示書とともに袋または他
の容器に入れる。
【００２４】 本発明がさらに提供するのは以下のとおりである： 異種核発現カセットまたはその部分であって、好ましくは植物色素体において
トレハロース生合成酵素をエンコードするヌクレオチド配列を発現し得るプロモ
ーター、例えば、通常色素体に存在するＲＮＡポリメラーゼ、例えば、核エンコ
ードポリメラーゼまたは色素体エンコードポリメラーゼなどにより転写されるプ
ロモーターであり、トレハロース６−リン酸ホスファターゼをエンコードするヌ
クレオチド配列に操作可能に連鎖しているプロモーターを含んでなる異種核発現
カセットまたはその部分； を含んでなる植物である；また、 かかる植物の子孫および種子をも包含し、該種子は任意に処理（例えば、下塗り
または被覆）および／または包装する、例えば、使用指示書とともに袋または他
の容器に入れる。
【００２５】 本発明がさらに提供するのは以下のとおりである： 異種核発現カセットまたはその部分であって、好ましくは植物色素体において
トレハロース生合成酵素をエンコードするヌクレオチド配列を発現し得るプロモ
ーター、例えば、通常色素体に存在するＲＮＡポリメラーゼ、例えば、核エンコ
ードポリメラーゼまたは色素体エンコードポリメラーゼなどにより転写されるプ
ロモーターであり、少なくともトレハロース生合成酵素、例えば、トレハロース
−６−リン酸シンターゼなどをエンコードするヌクレオチド配列に操作可能に連
鎖しているプロモーター、および通常色素体に存在するＲＮＡポリメラーゼ、例
えば、核エンコードポリメラーゼまたは色素体エンコードポリメラーゼなどによ
り転写されるプロモーターであり、トレハロース−６−リン酸ホスファターゼを
エンコードするヌクレオチド配列に操作可能に連鎖しているプロモーターとを含
んでなる異種核発現カセットまたはその部分； を含んでなる植物である；また、 かかる植物の子孫および種子をも包含し、該種子は任意に処理（例えば、下塗り
または被覆）および／または包装する、例えば、使用指示書とともに袋または他
の容器に入れる。
【００２６】 さらなる態様において、本発明はオペロン様ポリシストロン性遺伝子において
植物色素体の２種以上の遺伝子の単一プロモーターからの発現を包含する。好適
な態様において、オペロン様ポリシストロン性遺伝子は２種以上の遺伝子、例え
ば、トレハロース生合成酵素をエンコードするヌクレオチド配列を含んでなり、
色素体においてオペロン様ポリシストロン性遺伝子の発現を指令し得るプロモー
ターに操作可能に連鎖してなる遺伝子を含んでなり、色素体ゲノムに挿入される
。好適な態様において、オペロン様ポリシストロン性遺伝子は、オペロン様ポリ
シストロン性遺伝子における２種の遺伝子の間に介在ＤＮＡ配列、好ましくは色
素体ゲノムには存在しないＤＮＡ配列を含んでなる。他の好適な態様において、
該介在ＤＮＡ配列は非真核遺伝子の５'非翻訳領域（ＵＴＲ）、好ましくはウイ ルス５'ＵＴＲ，好ましくはＴ７、Ｔ３またはＳＰ６ファージなどの細菌ファー ジから由来の５'ＵＴＲから誘導される。好適な態様において、ＤＮＡ配列は修 飾して、介在ＤＮＡ配列の直ぐ下流に位置する遺伝子の翻訳を阻害または抑制す
る二次構造の形成を防止する。好適な態様においては、介在ＤＮＡ配列の直ぐ下
流に位置する遺伝子の発現、好ましくは翻訳が増大する。
【００２７】 本発明がこのようになおさらに提供するのは以下のとおりである： 異種核発現カセットまたはその部分であって、好ましくは誘導性プロモーター
、組織特異プロモーターまたは構成的プロモーター、より好ましくは誘導性プロ
モーター、例えば、傷害により誘導可能なまたは化学的に誘導可能なプロモータ
ー、例えば、タバコＰＲ−１ａプロモーターを含んでなり、該プロモーターはト
ランス活性化因子（好ましくは、トランス活性化因子は植物中に天然に存在する
ものではなく、好ましくはＲＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡ結合タンパク質、例
えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ）をエンコードするヌクレオチド配列に操作可能
に連鎖しており、当該トランス活性化因子は色素体標的配列、例えば、葉緑体標
的配列（例えば、上記の植物発現可能な発現カセット）に任意に融合されている
異種核発現カセットまたはその部分；および 異種色素体発現カセットまたはその部分であって、トランス活性化因子（例え
ば、トランス活性化因子がＴ７ＲＮＡポリメラーゼである場合はＴ７プロモータ
ー）により調節され、かつ、トレハロース生合成酵素をエンコードするヌクレオ
チド配列を含んでなる少なくとも１種の遺伝子を含んでなるオペロン様ポリシス
トロン性遺伝子に操作可能に連鎖しているトランス活性化因子介在プロモーター
を含んでなる異種色素体発現カセットまたはその部分； を含んでなる植物である。 好適な態様において、オペロン様ポリシストロン性遺伝子は、トレハロースリン
酸シンターゼをエンコードするヌクレオチド配列を含んでなる１遺伝子およびト
レハロースリン酸ホスファターゼをエンコードするヌクレオチド配列を含んでな
る１遺伝子とを含んでなる。好適な態様において、オペロン様ポリシストロン性
遺伝子は、オペロン様ポリシストロン性遺伝子における２種の遺伝子の間に介在
ＤＮＡ配列、好ましくは色素体ゲノムには存在しないＤＮＡ配列を含んでなる。
好適な態様において、該ＤＮＡ配列は非真核遺伝子の５'非翻訳領域（ＵＴＲ） 、好ましくはウイルス５'ＵＴＲ，好ましくはＴ７、Ｔ３またはＳＰ６ファージ などの細菌ファージから由来の５'ＵＴＲから誘導される。好適な態様において 、該ＤＮＡ配列は修飾して、介在ＤＮＡ配列の直ぐ下流に位置する遺伝子の翻訳
を阻害または抑制する二次構造の形成を防止する。好適な態様においては、介在
ＤＮＡ配列の直ぐ下流に位置する遺伝子の発現、好ましくは翻訳が増大する。ま
た、かかる植物の子孫および種子をも包含し、該種子は任意に処理（例えば、下
塗りまたは被覆）および／または包装する、例えば、使用指示書とともに袋また
は他の容器に入れる。
【００２８】 本発明がさらに提供するのは以下のとおりである： 異種核発現カセットまたはその部分であって、好ましくは植物色素体において
トレハロース生合成酵素をエンコードするヌクレオチド配列を発現し得るプロモ
ーター、例えば、通常色素体に存在するＲＮＡポリメラーゼ、例えば、核エンコ
ードポリメラーゼまたは色素体エンコードポリメラーゼなどにより転写されるプ
ロモーターであり、また、トレハロース生合成酵素をエンコードするヌクレオチ
ド配列を含んでなる少なくとも１種の遺伝子を含んでなるオペロン様ポリシスト
ロン性遺伝子に操作可能に連鎖しているプロモーターを含んでなる異種核発現カ
セットまたはその部分である。好適な態様において、オペロン様ポリシストロン
性遺伝子は、トレハロースリン酸シンターゼをエンコードするヌクレオチド配列
を含んでなる１遺伝子およびトレハロースリン酸ホスファターゼをエンコードす
るヌクレオチド配列を含んでなる１遺伝子とを含んでなる。好適な態様において
、オペロン様ポリシストロン性遺伝子は、オペロン様ポリシストロン性遺伝子に
おける２種の遺伝子の間に介在ＤＮＡ配列、好ましくは色素体ゲノムには存在し
ないＤＮＡ配列を含んでなる。好適な態様において、該ＤＮＡ配列は非真核遺伝
子の５'非翻訳領域（ＵＴＲ）、好ましくはウイルス５'ＵＴＲ，好ましくはＴ７
、Ｔ３またはＳＰ６ファージなどの細菌ファージから由来の５'ＵＴＲから誘導 される。好適な態様において、該ＤＮＡ配列は修飾して、介在ＤＮＡ配列の直ぐ
下流に位置する遺伝子の翻訳を阻害または抑制する二次構造の形成を防止する。
好適な態様においては、介在ＤＮＡ配列の直ぐ下流に位置する遺伝子の発現、好
ましくは翻訳が増大する。また、かかる植物の子孫および種子をも包含し、該種
子は任意に処理（例えば、下塗りまたは被覆）および／または包装する、例えば
、使用指示書とともに袋または他の容器に入れる。
【００２９】 本発明がさらに提供するのは以下のとおりである： 植物発現可能な発現カセットであって、 好ましくは誘導性プロモーター、例
えば、傷害により誘導可能なまたは化学的に誘導可能なプロモーター、例えば、
タバコＰＲ−１ａプロモーターを含んでなり、該プロモーターはトランス活性化
因子（好ましくは、トランス活性化因子は植物中に天然に存在するものではなく
、好ましくはＲＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡ結合タンパク質、例えば、Ｔ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼ）をエンコードするヌクレオチド配列に操作可能に連鎖してお
り、当該トランス活性化因子は色素体標的配列、例えば、葉緑体標的配列に融合
されている植物発現可能な発現カセット； かかる植物発現可能なカセットを含んでなるベクター；および かかるベクターで形質転換した植物またはそのゲノムがかかる植物発現可能な
発現カセットを含んでなる形質転換植物。
【００３０】 本発明がまた提供するのは以下のとおりである： 異種色素体発現カセットであって、トランス活性化因子により調節されるトラ
ンス活性化因子介在プロモーター（例えば、トランス活性化因子がＴ７ＲＮＡポ
リメラーゼである場合のＴ７プロモーター）を含んでなり、該プロモーターが、
例えば、トレハロース−６−リン酸シンターゼおよび／またはトレハロース−６
−リン酸ホスファターゼなどのトレハロース生合成酵素をエンコードするヌクレ
オチド配列に操作可能に連鎖する異種色素体発現カセット。
【００３１】 本発明がまた提供するのは以下のとおりである： 異種色素体発現カセットであって、核エンコードポリメラーゼまたは色素体エ
ンコードポリメラーゼなどの、通常色素体に存在するＲＮＡポリメラーゼにより
転写され、かつ、例えば、トレハロース−６−リン酸シンターゼおよび／または
トレハロース−６−リン酸ホスファターゼなどの少なくとも１種のトレハロース
生合成酵素をエンコードするヌクレオチド配列に操作可能に連鎖したプロモータ
ーを含んでなる異種色素体発現カセット。
【００３２】 本発明がまた提供するのは以下のとおりである： 異種色素体発現カセットであって、植物色素体においてトレハロース生合成酵
素を発現し得るプロモーター、例えば、核エンコードポリメラーゼまたは色素体
エンコードポリメラーゼなどの通常色素体に存在するＲＮＡポリメラーゼにより
転写されるプロモーター、あるいはトランス活性化因子により調節されるトラン
ス活性化因子介在プロモーター（例えば、トランス活性化因子がＴ７ＲＮＡポリ
メラーゼである場合のＴ７プロモーター）であって、両方のトレハロース生合成
酵素をエンコードするヌクレオチド配列を含んでなるオペロン様ポリシストロン
性遺伝子に操作可能に連鎖したプロモーターを含んでなる異種色素体発現カセッ
ト。好適な態様において、オペロン様ポリシストロン性遺伝子は、オペロン様ポ
リシストロン性遺伝子における２種の遺伝子の間に介在ＤＮＡ配列、好ましくは
色素体ゲノムには存在しないＤＮＡ配列を含んでなる。好適な態様において、該
ＤＮＡ配列は非真核遺伝子の５'非翻訳領域（ＵＴＲ）、好ましくはウイルス５'
ＵＴＲ，好ましくはＴ７、Ｔ３またはＳＰ６ファージなどの細菌ファージから由
来の５'ＵＴＲから誘導される。好適な態様において、該ＤＮＡ配列は修飾して 、介在ＤＮＡ配列の直ぐ下流に位置する遺伝子の翻訳を阻害または抑制する二次
構造の形成を防止する。好適な態様においては、介在ＤＮＡ配列の直ぐ下流に位
置する遺伝子の発現、好ましくは翻訳が増大する。
【００３３】 本発明がまた特徴とするのは以下のとおりである： 上記植物の生産方法であって、 調節され、対象のヌクレオチド配列に操作可能に連鎖したトランス活性化因子
、好ましくは、少なくとも1種のトレハロース生合成酵素、例えば、トレハロー ス−６−リン酸シンターゼおよび／またはトレハロース−６−リン酸ホスファタ
ーゼなどをエンコードするヌクレオチド配列を含んでなる異種色素体発現カセッ
トまたはその部分を含んでなる植物に、誘導性プロモーター、組織特異プロモー
ターまたは構成的プロモーター、より好ましくは誘導性プロモーターであって、
当該トランス活性化因子介在プロモーターを調節し得るトランス活性化因子をエ
ンコードするヌクレオチド配列に操作可能に連鎖したプロモーターを含んでなる
異種核発現カセットまたはその部分を含んでなる植物からの花粉を受粉させるこ
と； このように受粉した植物からの種子を回収すること；および 当該種子から上記のように植物を栽培すること； を特徴とする方法。
【００３４】 本発明がさらに提供するのは以下のとおりである： 植物中トレハロースの製造方法であって、当該植物中、上記プロモーターの１
種、例えば、誘導性プロモーター、例えば、傷害により誘導可能なまたは化学的
に誘導可能なプロモーターの制御下に当該植物の核ゲノムからの、または当該植
物の色素体においてまたは上記発現カセットの１つにおいて当該ヌクレオチド配
列を発現し得るプロモーターの制御下に当該植物の色素体ゲノムからのトレハロ
ース生合成酵素をエンコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列を発現する
ことにより製造する方法。
【００３５】 干ばつ、高塩度、浸透ストレスおよび温度極限に対し植物を保護する方法であ
って、当該植物中において、誘導性プロモーター、例えば、傷害により誘導可能
なまたは化学的に誘導可能なプロモーターの制御下に当該植物の核ゲノムからの
、または当該植物の色素体において当該ヌクレオチド配列を発現し得るプロモー
ターの制御下に当該植物の色素体ゲノムからのトレハロース生合成酵素をエンコ
ードする少なくとも１種のヌクレオチド配列を発現することにより保護する方法
。
【００３６】 収獲した植物の貯蔵性を高める方法であって、当該植物中において、誘導可能
なプロモーター、例えば、傷害により誘導可能なまたは化学的に誘導可能なプロ
モーターの制御下に当該植物の核ゲノムからの、または当該植物の色素体におい
て当該ヌクレオチド配列を発現し得るプロモーターの制御下に当該植物の色素体
ゲノムからのトレハロース生合成酵素をエンコードする少なくとも１種のヌクレ
オチド配列を発現することにより収獲した植物の貯蔵性を高める方法。
【００３７】 果実および野菜類の貯蔵期間を改善し、花卉を保存する方法であって、当該果
実、野菜類および花卉中において、誘導可能なプロモーター、例えば、傷害によ
り誘導可能なまたは化学的に誘導可能なプロモーターの制御下に当該植物の核ゲ
ノムからの、または当該植物の色素体において当該ヌクレオチド配列を発現し得
るプロモーターの制御下に当該植物の色素体ゲノムからのトレハロース生合成酵
素をエンコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列を発現することにより果
実および野菜類の貯蔵期間を改善し、花卉を保存する方法。
【００３８】 形質転換植物において発現したタンパク質を安定化する方法であって、当該植
物中において、誘導可能なプロモーター、例えば、傷害により誘導可能なまたは
化学的に誘導可能なプロモーターの制御下に当該植物の核ゲノムからの、または
当該植物の色素体において当該ヌクレオチド配列を発現し得るプロモーターの制
御下に当該植物の色素体ゲノムからのトレハロース生合成酵素をエンコードする
少なくとも１種のヌクレオチド配列を発現することにより、発現したタンパク質
を安定化する方法。
【００３９】 本発明がさらに提供するのは以下のとおりである： 植物の色素体中で単一プロモーターから２種以上の遺伝子を発現する方法であ
って、当該植物の色素体ゲノムにオペロン様ポリシストロン性遺伝子を導入する
ことを特徴とし、当該オペロン様ポリシストロン性遺伝子が当該植物の色素体に
おいて当該オペロン様ポリシストロン性遺伝子を発現し得るプロモーターに操作
可能に連鎖した２種以上の遺伝子を含んでなり、その場合当該オペロン様ポリシ
ストロン性遺伝子がさらに２つの遺伝子の間に介在ＤＮＡ配列を含んでなること
を特徴とする方法。好適な態様において、該ＤＮＡ配列は、非真核遺伝子の５' 非翻訳領域（ＵＴＲ）の一部、好ましくはウイルス５'ＵＴＲ，好ましくはＴ７ 、Ｔ３またはＳＰ６ファージなどの細菌ファージから由来の５'ＵＴＲの一部を 含んでなる。好適な態様において、該ＤＮＡ配列は修飾して、介在ＤＮＡ配列の
直ぐ下流に位置する遺伝子の翻訳を阻害または抑制する二次構造の形成を防止す
る。好適な態様においては、介在ＤＮＡ配列の直ぐ下流に位置する遺伝子の発現
、好ましくは翻訳が増大する。
【００４０】 好適な態様において、オペロン様ポリシストロン性遺伝子は、トレハロース生
合成遺伝子をエンコードするヌクレオチド配列を含んでなる少なくとも１種の遺
伝子を含んでなる。他の好適な態様において、オペロン様ポリシストロン性遺伝
子は、トレハロースリン酸シンターゼをエンコードするヌクレオチド配列を含ん
でなる遺伝子およびトレハロースリン酸ホスファターゼをエンコードするヌクレ
オチド配列を含んでなる遺伝子とを含んでなる。
【００４１】 本発明がさらに提供するのは以下のとおりである： 配列番号４５、４７、４９または５１に明示したヌクレオチド配列のいずれか
１つに一致するまたは実質的に同一のヌクレオチド配列を含んでなる単離したＤ
ＮＡ分子。好適な態様において、ヌクレオチド配列は配列番号４６、４８、５０
または５２に明示したアミノ酸配列のいずれか１つに一致するまたは実質的に同
一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをエンコードする。好適な態様において
、ＤＮＡ分子は配列番号４５、４７、４９または５１に明示したヌクレオチド配
列のいずれか１つに一致するまたは実質的に同一であるか、または配列番号４６
、４８、５０または５２に明示したアミノ酸配列のいずれか１つに一致するまた
は実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをエンコードする。好適な
態様において、ＤＮＡ分子は単子葉類から、好ましくはトウモロコシから由来す
る。好適な態様において、ヌクレオチド配列はトレハロース生合成遺伝子または
その一部、好ましくはトレハロース−６−リン酸シンターゼまたはトレハロース
−６−リン酸ホスファターゼをエンコードする。
【００４２】 本発明がさらに提供するのは以下のとおりである： 配列番号４５、４７、４９または５１に明示したヌクレオチド配列のいずれか
１つによりエンコードされるポリペプチドを含んでなるか、または配列番号４６
、４８、５０または５２に明示したアミノ酸配列のいずれか１つに一致するまた
は実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる単離したタン
パク質。好適な態様において、該タンパク質は配列番号４５、４７、４９または
５１に明示したヌクレオチド配列のいずれか１つによりエンコードされるか、ま
たは配列番号４６、４８、５０または５２に明示したアミノ酸配列のいずれか１
つによりエンコードされるポリペプチドに一致するかまたは実質的に同一である
。好適な態様において、該ポリペプチドは単子葉類から、好ましくはトウモロコ
シから由来する。好適な態様において、該ポリペプチドはトレハロース生合成酵
素またはその一部、好ましくはトレハロース−６−リン酸シンターゼまたはトレ
ハロース−６−リン酸ホスファターゼを含んでなる。
【００４３】 本発明がさらに提供するのは以下のとおりである： 配列番号４５、４７、４９または５１に明示したヌクレオチド配列のいずれか
１つ、またはその一部を含んでなる発現カセットを含んでなる植物であって、そ
の場合、当該ＤＮＡ分子は当該植物において発現可能である。好適な態様におい
て、当該発現カセットは当該植物のゲノムに安定に組込まれている。好適な態様
において、当該植物はストレス、好ましくは、干ばつ、浸透ストレスおよび温度
ストレスに抵抗性である。
【００４４】 本発明がさらに提供するのは以下のとおりである： ストレス抵抗性、好ましくは、干ばつ、浸透ストレス、および温度ストレスへ
の抵抗性が増大した植物を繁殖させる方法であって、 ａ）配列番号４５、４７、４９または５１に明示したヌクレオチド配列のいず
れか１つ、またはその一部を用い、異なる種類の植物種における分子多形を同定
すること、そして ｂ）当該多形を干ばつ、浸透ストレス、および温度ストレスへの抵抗性増大を
示す当該植物種の種類と相関させること、そして ｃ）当該多形を用いて、標準的繁殖技法により当該ストレスに対する抵抗性を
当該植物種の所望系統に導入すること、 からなる工程を含んでなる方法。
【００４５】 本発明がさらに提供するのは以下のとおりである： 上記方法のいずれか一つにより入手される植物であって、該植物がストレス抵
抗性、好ましくは、干ばつ、浸透ストレス、および温度ストレスに対し抵抗性で
あること。
【００４６】 （定 義） 明細書および請求項の明瞭で矛盾のない理解を確かなものとするために、以下
の定義を与える。
【００４７】 「干ばつ抵抗性」とは、長期間、植物が通常必要とする水分よりも少ない水分
しか受けず、または給水されずに生命を維持し、また、乾燥の他の特徴である葉
部のしおれを示さない生理的状態である。
【００４８】 本明細書にて使用する「遺伝子」とは、ヌクレオチド配列を含んでなり、その
ヌクレオチド配列に先行してまたはその後に続いてＤＮＡ配列が任意に操作可能
に連鎖しているものである。該ヌクレオチド配列は一般にＲＮＡ、例えば、ｍＲ
ＮＡ（センスＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ）、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはｓ
ｎＲＮＡなどに転写される。遺伝子内のヌクレオチド配列は任意にコーディング
配列を含んでなり、それがポリペプチドに翻訳され得る。ヌクレオチド配列に先
行するまたはその後に続くＤＮＡ配列の例は、５'および３'非翻訳配列、終結シ
グナルおよびリボソーム連結部位（ｒｂｓ）、またはその一部である。遺伝子内
に存在する可能性のある他の要素は、例えば、イントロンである。
【００４９】 本明細書にて使用する「発現カセット」とは、そこに挿入されたヌクレオチド
配列が適切な宿主細胞において転写され、そして随意翻訳され得るように設計さ
れたＤＮＡ構築物を意味する。発現カセットは一般に調節要素、例えば、該ヌク
レオチド配列に操作可能に連鎖したヌクレオチド配列の発現を指令し得るプロモ
ーターなどを含んでなり、それがそれ自体任意に操作可能に３'配列、例えば、 ３'調節配列または終結シグナルなどに連鎖している。発現カセットはまたヌク レオチド配列に含まれるコーディング配列の適切な翻訳に必要な配列を含んでな
る。ヌクレオチド配列は通常タンパク質のコーディング配列を含んでなるが、対
象の機能的ＲＮＡ、例えば、センスまたはアンチセンスの方向にあって、特定の
遺伝子、例えば、アンチセンスＲＮＡの発現を阻害するアンチセンスＲＮＡまた
は非翻訳ＲＮＡをもコードする。対象のヌクレオチド配列を含んでなる発現カセ
ットはキメラであることがあり、その場合少なくともその成分の一つが少なくと
もその他の成分の一つに関して異種であることを意味する。発現カセットはまた
天然産ではあるが、異種発現に有用な組換え型で得られている。しかし、一般に
発現カセットは宿主に関して異種である、すなわち、発現カセットの特定のＤＮ
Ａ配列は宿主細胞内に天然には存在せず、宿主細胞または宿主細胞の祖先に導入
しなければならなかった。発現カセット内のヌクレオチド配列発現は構成プロモ
ーターの、または誘導性プロモーターの制御下にあり、宿主細胞がある特定の外
部刺激に接触したときにのみ、それが転写を開始する。植物などの多細胞生物の
場合、プロモーターは特定の組織または器官または発生段階に特異的である。核
発現カセットは通常植物の核ゲノムに挿入され、当該植物の核ゲノムから特定ヌ
クレオチド配列の発現を指令することができる。色素体発現カセットは通常植物
の色素体ゲノムに挿入され、当該植物の色素体ゲノム、例えば、通常色素体に存
在するＲＮＡポリメラーゼにより転写されるプロモーター、例えば、核エンコー
ドポリメラーゼまたは色素体エンコードポリメラーゼなど、またはトランス活性
化因子介在プロモーターなどから特定ヌクレオチド配列の発現を指令することが
できる。本明細書に記載の色素体発現カセットはオペロン様ポリシストロン性遺
伝子を任意に含んでなる。
【００５０】 「調節要素」とはヌクレオチド配列の発現に関与するＤＮＡ配列をいう。調節
要素は対象のヌクレオチド配列に任意に連鎖したプロモーターを含んでなり、５
'および３'非翻訳領域（ＵＴＲ）または終結シグナルを含むこともある。それら
は一般にヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列、例えば、色素体における
発現の場合のリボソーム連鎖部位（rbs）などを包含する。
【００５１】 本明細書にて使用する「異種」とは、「異なる天然起源のもの」を意味するか
、または非自然状態を表す。例えば、もし宿主細胞が他の生物から、特に他の種
から由来するヌクレオチド配列により形質転換されるならば、そのヌクレオチド
配列はその宿主細胞に関して、また、その遺伝子を担持する宿主細胞の子孫に関
しても異種である。同様に、異種とは、同じ天然の当初細胞型から由来し挿入さ
れるヌクレオチド配列ではあるが、非天然状態、例えば、異なるコピー数にある
か、または異なる調節要素の制御下にあるヌクレオチド配列をいう。形質転換ヌ
クレオチド配列は異種コーディング配列または異種調節要素を含んでいてもよい
。あるいは、形質転換ヌクレオチド配列は完全に異種であってもよく、または異
種と内在性核酸配列との可能な組合わせからなっていてもよい。
【００５２】 「発現」とは、宿主生体、例えば、微生物または植物におけるヌクレオチド配
列、例えば、内在性遺伝子または異種遺伝子の転写および／または翻訳をいう。
アンチセンス構築物の場合、例えば、発現はアンチセンスＤＮＡの転写のみをい
う。
【００５３】 「オペロン様ポリシストロン性遺伝子」とは、植物色素体中かかるオペロン様
ポリシストロン性遺伝子の発現を指令し得る単一プロモーターの制御下にある２
種以上の対象遺伝子を含んでなる。オペロン様ポリシストロン性遺伝子内のすべ
ての遺伝子が、ヌクレオチド配列の５'末端に操作可能に連鎖したリボソーム部 位（rbs）を任意に含んでなる。好ましくは、オペロン様ポリシストロン性遺伝 子内の各rbsは異なる。また、オペロン様ポリシストロン性遺伝子は一般にオペ ロン様ポリシストロン性遺伝子内の第一遺伝子のrbsの５'末端に任意に連鎖した
５'ＵＴＲおよびオペロン様ポリシストロン性遺伝子内の最終遺伝子の３'末端に
任意に連鎖した３'ＵＴＲとを含んでなる。オペロン様ポリシストロン性遺伝子 内の２つの遺伝子はまた、２つの遺伝子間で重なり合う幾つかの核酸を含んでな
る。
【００５４】 「同種形成性」（Ｈomoplastidic）とは、色素体のすべてが遺伝的に同一であ
る場合の植物、植物組織または植物細胞をいう。これは色素体が形質転換されて
おらず、突然変異されておらず、または他にも遺伝的に変化がない場合の植物の
正常状態である。異なる組織または発生の段階においては、異なる形態、例えば
、葉緑体、プロプラスチド、エチオプラスト、アミロプラスト、有色体などを採
る可能性がある。
【００５５】 「マーカー遺伝子」：選択可能なまたはスクリーニング可能な形質をエンコー
ドする遺伝子。
【００５６】 「誘導性プロモーター」：「誘導性プロモーター」とは、植物がある特定の外
部刺激に接触したときにのみ転写を開始するプロモーターであり、構成的プロモ
ーターあるいは特定の組織もしくは器官または発生の段階に特異的なプロモータ
ーとは区別される。本発明にとって特に好ましいのは、化学的に誘導可能なプロ
モーターおよび傷害により誘導可能なプロモーターである。化学的に誘導可能な
プロモーターは植物由来のプロモーター、例えば、体組織獲得抵抗経路でのプロ
モーターなど、例えば、ＰＲプロモーター、例えば、ＰＲ−１、ＰＲ−２、ＰＲ
−３、ＰＲ−４およびＰＲ−５プロモーター、とりわけ、タバコＰＲ−１ａプロ
モーターおよびアラビドプシスＰＲ−１プロモーターなどであり、これらは植物
がＢＴＨおよび関連の化学物質に接触したときに転写を開始する。米国特許５，
６１４，３９５（参照により本明細書に取込む）およびＷＯ９８／０３５３６（
参照により本明細書に取込む）参照。化学的に誘導可能なプロモーターはまた、
レセプター介在系、例えば、ステロイド依存性遺伝子発現、銅依存性遺伝子発現
、テトラサイクリン依存性遺伝子発現など他の生物から由来する系、およびとり
わけ発現系として、ＥＰ−Ａ ０ ８５９ ８５１（参照により本明細書に取込む ）に記載された幼若成長ホルモンおよびそのアゴニストの介在するショウジョウ
バエからのＵＳＰレセプターを利用する系、並びに、例えば、ＥＰ−Ａ ０ ８１
３ ６０４（参照により本明細書に取込む）に記載されたレセプターの組合わせ を利用する系などを包含する。傷害により誘導可能なプロモーターは、プロティ
ナーゼインヒビターに対するプロモーター、例えば、バレイショからのプロティ
ナーゼインヒビターＩＩプロモーター、および他の傷害応答経路に関わる植物由
来プロモーター、例えば、ポリフェニルオキシダーゼ、ＬＡＰおよびＴＤに対す
るプロモーターなどを包含する。一般的文献として、Ｃ.Ｇatz「遺伝子発現の化
学的制御」、Ａnnu. Ｒev. Ｐlant Ｐhysiol. Ｐlant Ｍol. Ｂiol.（１９９７ ）４８：８９〜１０８（その内容を参照により本明細書に取込む）参照。
【００５７】 「に操作可能に連鎖した／と会合した」：例えば、調節要素を含んでなるＤＮ
Ａ配列は、もし２つの配列が、該ＤＮＡ配列がヌクレオチド配列の発現に影響す
るように位置づけられているならば、ヌクレオチド配列「に操作可能に連鎖した
」または「と会合した」と言う。
【００５８】 「表現型形質」：１つ以上の遺伝子発現の結果として生じる検出可能な性質。
【００５９】 「植物」：「植物」とは発生のいずれかの段階にあるいずれかの植物または植
物の部分をいう。本発明のある態様において、植物は発現を誘導するために致死
的に傷害するか、または致死レベルの所望タンパク質を発現するように誘導する
が、それゆえ本明細書にて使用する「植物」は、特に、重度に傷害したまたは死
に至らしめた植物および植物材料、並びに生存可能な植物、切片、細胞または組
織培養物、および種子を包含するものとする。好ましくは、本発明の植物はトレ
ハロース生合成遺伝子の誘導点に至るまでは発生的に正常であるということで区
別される。
【００６０】 「植物細胞」：プロトプラストと細胞壁を含んでなる植物の構造および生理単
位。植物細胞は単離した単一細胞または培養細胞の形状にあるか、またはより高
度に組織化された単位、例えば、植物組織、または植物器官としてあってもよい
。
【００６１】 「植物材料」：葉、茎、根、花または花の部分、果実、花粉、花粉管、胚珠、
胚嚢、卵細胞、接合体、胚、種子、色素体、ミトコンドリア、切片、細胞または
組織培養、または他の植物部分または産物をいう。
【００６２】 「プロモーター」：会合したＤＮＡ配列の転写を開始するＤＮＡ配列。プロモ
ーター領域は遺伝子発現の調節因子、例えば、活性化因子、エンハンサー、およ
び／またはリプレッサーとして作用する要素をも含む。
【００６３】 「プロトプラスト」：細胞壁が完全にまたは部分的に除かれた単離植物細胞。
【００６４】 「組換えＤＮＡ分子」：組換えＤＮＡ技法を用いともに連結されるＤＮＡ配列
の組合わせ物。
【００６５】 「組換えＤＮＡ技法」：例えば、サムブルーク（Ｓambrook）ら（１９８９、 コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ；コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー・プレス）の記載に従い、ＤＮＡ配列を連結するために使用する手法
。
【００６６】 「スクリーニング可能マーカー遺伝子」：遺伝子の発現が形質転換した細胞に
選択的優先性を与えるものではないが、その発現が形質転換した細胞を非形質転
換細胞から表現型として区別する遺伝子。
【００６７】 「選択可能マーカー遺伝子」：植物細胞中での遺伝子の発現が細胞に選択的優
先性を与える遺伝子。選択可能マーカー遺伝子で形質転換された細胞が保持する
選択的優先性は、非形質転換細胞の増殖に比べ、抗生物質または除草剤など負の
選択剤の存在下に増殖する能力によるものである。非形質転換細胞が保持する選
択的優先性は、非形質転換細胞に比べ、添加した化合物を栄養、増殖因子または
エネルギー源として利用する上昇したまたは新たな許容力によるものである。選
択可能マーカー遺伝子はまた、植物細胞中でのその発現が細胞に負および正の選
択的優先性両方を与える遺伝子または遺伝子の組合わせをいう。
【００６８】 その広い意味で、「実質的に同一」という用語は、本明細書でヌクレオチド配
列に関して使用する場合、ヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列に相当する
ことを意味し、その場合、相当する配列は参照ヌクレオチド配列によりエンコー
ドされるポリペプチドと実質的に同じ構造と機能をもつポリペプチドをエンコー
ドするが、例えば、ポリペプチドに影響しないアミノ酸の変化しか起こらない場
合である。望ましくは、実質的に同じヌクレオチド配列は参照ヌクレオチド配列
によりエンコードされるポリペプチドをエンコードする。実質的に同じヌクレオ
チド配列と参照ヌクレオチド配列間の同一性の率は、望ましくは少なくとも８０
％、より望ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ま
しくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％である。配列
比較はスミス−ウオーターマン配列アラインメントアルゴリズムを用い実施する
（例えば、Ｗaterman，Ｍ．Ｓ．計算生物学への導入：地図、配列およびゲノム 。Ｃhapman ＆ Ｈall．ロンドン：１９９５：ＩＳＢＮ ０−４１２−９９３９１
−０参照、またはhttp://www-hto.usc.edu/software/seqaln /indes.html）。ロ
ーカルＳプログラム、バージョン１．１６を以下のパラメータとともに使用する
：マッチ：１、ミスマッチペナルティ：０．３３、オープンギャップペナルティ
：２、拡張ギャップペナルティ：２。参照ヌクレオチド配列に「実質的に同一」
なヌクレオチド配列は以下の条件で参照ヌクレオチド配列にハイブリッド形成す
る；５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ−ＮａＰＯ4、 １ｍＭ−ＥＤＴＡ中、５０℃で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄；より望まし
くは、５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ−ＮａＰＯ4 、１ｍＭ−ＥＤＴＡ中、５０℃で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄；さらによ
り望ましくは、５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ−Ｎ
ａＰＯ4、１ｍＭ−ＥＤＴＡ中、５０℃で０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗 浄；好ましくは、５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ−
ＮａＰＯ4、１ｍＭ−ＥＤＴＡ中、５０℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで 洗浄；より好ましくは、５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．
５Ｍ−ＮａＰＯ4、１ｍＭ−ＥＤＴＡ中、６５℃で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ で洗浄。
【００６９】 「実質的に同一」という用語は、本明細書でタンパク質に関して使用する場合
、タンパク質が参照タンパク質に相当することを意味し、その場合、該タンパク
質は参照タンパク質と実質的に同じ構造と機能をもつが、例えば、その場合はポ
リペプチド機能に影響を与えないアミノ酸の変化のみが起こる。タンパク質また
はアミノ酸配列について用いる場合、実質的に同一と参照タンパク質またはアミ
ノ酸配列間の同一性の率は、望ましくは少なくとも８０％、より望ましくは少な
くとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％
、さらにより好ましくは少なくとも９９％である。
【００７０】 「トランス活性化因子」：「トランス活性化因子」とは、それ自体によりまた
は１種以上の他のタンパク質との組合わせにおいて、対応するトランス活性化因
子介在プロモーターの制御下にコーディング領域の転写を引起し得るタンパク質
である。トランス活性化因子系の例としては、ファージＴ７遺伝子１０プロモー
ターであり、その転写活性化はファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼなどの特異ＲＮ
Ａポリメラーゼに依存する。トランス活性化因子は一般にＲＮＡポリメラーゼま
たは転写を開始するための特定プロモーターと相互作用し得るＤＮＡ結合タンパ
ク質であり、転写開始はプロモーターを直接活性化することによるか、またはリ
プレッサー遺伝子を不活化すること、例えば、リプレッサータンパク質の発現ま
たは蓄積を抑制することによりなされる。ＤＮＡ結合タンパク質は適切な転写活
性化因子ドメインに連鎖した連鎖領域（例えば、ＧＡＬ４結合領域）を含んでな
るキメラタンパク質である。ある種のトランス活性化因子系は複数のトランス活
性化因子、例えば、ポリメラーゼのみならずプロモーター認識、ＤＮＡ結合、ま
たは転写活性化のための特異サブユニット（シグマ因子）を必要とするプロモー
ターを有する。トランス活性化因子は、好ましくは植物に関して異種である。
【００７１】 「形質転換」：ヌクレオチド配列を細胞内に導入すること。とりわけ、対象生
物体のゲノムにＤＮＡ分子を安定に組込むこと。
【００７２】 「トレハロース生合成酵素」はグルコースからのトレハロースの生合成に関与
するポリペプチドであり、例えば、本明細書に記載するように、特に、ＵＤＰ−
グルコースとグルコース−６−リン酸との縮合を触媒してトレハロース−６−リ
ン酸とするトレハロース−６−リン酸シンターゼ、またはトレハロース−６−リ
ン酸をトレハロースにリン酸水解するトレハロース−６−リン酸ホスファターゼ
である。トレハロース生合成酵素をエンコードするヌクレオチド配列はトレハロ
ース生合成遺伝子に含まれている。
【００７３】 「トレハロース」はＤ−グルコピラノシル−［１，１、］−Ｄ−グルコピラノ
シドである。本発明におけるトレハロースの好適な形状はα、α−トレハロース
（α−Ｄ−グルコピラノシル−［１，１、］−α−Ｄ−グルコピラノシド）であ
る。
【００７４】 本発明はまた本発明のＤＮＡ分子を含んでなる細胞を包含し、その場合のＤＮ
Ａ分子はその本来の細胞環境には存在しない。好適な態様において、かかる細胞
は植物細胞である。もう一つの好適な態様において、本発明のＤＮＡ分子はかか
る細胞内で発現し得るものであり、かかる細胞中でその発現を可能とする発現カ
セット内に構成される。好適な態様において、該発現カセットはかかる宿主細胞
のＤＮＡに安定に組込まれる。もう一つの好適な態様において、該発現カセット
はベクター内で構成され、それが細胞内での複製を可能とし、染色体外分子とし
て細胞内に存続する。
【００７５】 本発明はまた上記植物細胞を含んでなる植物をも包含する。さらなる態様にお
いて、本発明のＤＮＡ分子は該植物内で発現可能であり、トランスジェニック（
形質転換）植物において本発明ＤＮＡ分子のいずれか一つ、またはその機能的部
分または誘導体の発現がトレハロースを産生させ、干ばつ耐性、改善された食物
品質、工業的生産に有用な高レベルのトレハロース、その他本明細書に記載の特
性に導く。したがって、本発明は、本発明ＤＮＡ分子のいずれか一つ、またはそ
の機能的部分または誘導体の発現によりトレハロースを産生するトランスジェニ
ック植物をも包含する。
【００７６】 本発明に従い形質転換される植物は単子葉類または双子葉類が可能であり、こ
れらに限定されるものではないが、トウモロコシ、小麦、大麦、ライムギ、甘藷
、そら豆、えんどう豆、チコリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコ
リー、カブ、大根、ほうれん草、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、胡椒、セ
ロリ、唐茄子、かぼちゃ、麻、ズッキーニ、リンゴ、ナシ、花りん、メロン、プ
ラム、サクランボ、モモ、ネクタリン、アンズ、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、
ブラックベリー、パイナップル、アボガド、パパイヤ、マンゴー、バナナ、大豆
、トマト、モロコシ、サトウキビ、甜菜、ヒマワリ、ナタネ、クローバー、タバ
コ、ニンジン、綿、アルファルファ、米、バレイショ、ナス、キュウリ、しろい
ぬなずな（Ａrabidopsis thaliana）、および樹木植物、例えば、針葉樹および 落葉樹などを包含する。
【００７７】 好適なものは、トウモロコシ、小麦、大麦、ライムギ、モロコシ、および米か
らなる群より選択される単子葉植物である。
【００７８】 さらに好適なものは、チコリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコ
リー、胡椒、唐茄子、かぼちゃ、ズッキーニ、メロン、大豆、トマト、サトウキ
ビ、甜菜、ヒマワリ、ナタネ、綿、およびアルファルファからなる群より選択さ
れる双子葉植物である。
【００７９】 所望のヌクレオチド配列を特定の植物種に一旦形質転換した後、それをその種
内で増殖するか、あるいは伝統的な繁殖技法、例えば、戻し交雑のような循環選
択育種を用い、特に市販品種を含む同じ種の他の品種に移動する。この場合、所
望の導入遺伝子を遺伝子移入すべき反復親は、先ず、問題の導入遺伝子を担持す
る非反復親と交雑する。この交雑の子孫は次いで反復親に戻し交配し、次いで、
非反復親から移入すべき導入遺伝子を得られた子孫で選択する。導入遺伝子選択
した反復親との戻し交雑を３代、好ましくは４代、より好ましくは５代以上行っ
た後、その子孫は導入すべき導入遺伝子に対しヘテロ接合であるが、殆どの、ま
たは殆どすべての他の遺伝子については反復親と同様である。
【００８０】 トランスジェニック植物でのその発現のために、ＤＮＡ分子は、特にそのＤＮ
Ａ分子が原核細胞由来のものである場合、修飾することと最適化することを必要
とする。技術上既知であるが、すべての生物体はコドン使用のための特異的優先
性を有し、本発明のＤＮＡ分子内で構成されるヌクレオチド配列のコドンは、そ
れによってエンコードされるアミノ酸配列は維持しつつも、特異的植物優先性に
従って変化し得るものである。さらに、植物内での高発現は、少なくとも３５％
のＧＣ含有率、好ましくは４５％を超える含有率を有するコーディング配列から
達成するのが最善である。ＧＣ含有率の低いヌクレオチド配列では、メッセージ
を不安定化する可能性のあるＡＴＴＴＡモチーフおよび不適切なポリアデニル化
の原因となる可能性のあるＡＡＴＡＡＡモチーフの存在により発現が乏しいもの
となる。好適な遺伝子配列は単子葉類植物種および双子葉類植物種の両方におい
て適切に発現され得るが、これらの優先性は異なることが示されているので、配
列を修飾して単子葉類および双子葉類の特異的コドン優先性とＧＣ含有率とを占
めるようにすることができる（Ｍurrayら、Ｎucl．Ａcids Ｒes．１７：４７７ 〜４９８（１９８９））。さらに、ヌクレオチド配列はメッセージ切断の原因と
なる誤ったスプライス部位の存在につき選抜する。上記変化のようなヌクレオチ
ド配列内で実施する必要のあるすべての変化は、周知の技術、例えば、部位指向
突然変異誘発、ＰＣＲ、および合成遺伝子構築などを用いて遂行される；使用す
る方法は公開特許出願ＥＰ ０ ３８５ ９６２（モンサント）、ＥＰ ０ ３５９
４７２（ルブリゾール）、およびＷＯ９３／０７２７８（チバ−ガイギー）に記
載された方法である。
【００８１】 効率的な翻訳開始のためには、開始メチオニンに隣接する配列を修飾する必要
がある。例えば、植物に有効であることが知られている配列の封入によりそれら
を修飾することができる。ジョシ（Ｊoshi）は植物の適切な共通性（コンセンサ
ス）を示唆しており（ＮＡＲ １５：６６４３〜６６５３（１９８７））、また 、クロンテック（Ｃlontech）はさらに共通の翻訳開始因子を示唆している（１ ９９３／１９９４カタログ、２１０ページ）。これらの共通性は本発明のヌクレ
オチド配列での使用に適している。この配列は、ＡＴＧを含みＡＴＧまでの（未
修飾の二番目のアミノ酸は残す）、あるいは別法としてＡＴＧに続くＧＴＣ（導
入遺伝子の二番目のアミノ酸を修飾する可能性をもつ）を含みＧＴＣまでのヌク
レオチド配列を含んでなる構築物に組込まれる。
【００８２】 トランスジェニック植物においては、本発明のＤＮＡ分子、例えば、トレハロ
ース生合成遺伝子またはトランス活性化因子をエンコードする遺伝子は、植物内
で機能的であることが示されているプロモーターにより推進される。プロモータ
ーの選択は発現のための時間的空間的要件に依存して、また、目標とする種に依
存して変化する。双子葉類からの多くのプロモーターが単子葉類でも操作可能で
あり、その逆も可能であることが示されているが、理想的には、双子葉類プロモ
ーターは双子葉類での発現に選択され、単子葉類プロモーターは単子葉類での発
現に選択される。しかし、選択したプロモーターの起源に制限はなく、それらが
所望の細胞内でＤＮＡ分子の発現を推進するのに操作可能であれば充分である。
【００８３】 構成的に発現される好適なプロモーターとしては、ＣａＭＶ３５Ｓおよび１９
Ｓプロモーター、アクチンまたはユビキチンをエンコードする遺伝子からのプロ
モーター、およびアグロバクテリウム由来のプロモーター、例えば、ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ９４／１２９４６に記載された合成プロモーターなどを包含する。しかし、本
発明のＤＮＡ分子は、好ましくは、化学的に調節されるプロモーターの調節下に
発現される。これは、トレハロースが、作物植物を誘導性化学物質で処理したと
きにのみ合成されることを可能とし、それによって若い植物での発生異常を避け
得る。遺伝子発現の化学的誘導の好適な技法は、公開出願ＥＰ ０ ３３２ １０ ４（チバ−ガイギー）および米国特許５，６１４，３９５に詳述されている。化
学的誘導のための好適なプロモーターはタバコＰＲ−１ａプロモーターである。
【００８４】 誘導性プロモーターの第二の好適な範疇は、傷害により誘導可能なものであり
、トレハロース生合成酵素の発現は、植物が傷ついたとき、例えば、収獲時、ま
たはサイロに貯蔵する際または他のプロセシングの際に可能となる。多くのプロ
モーターが傷害部位に発現されていると記載されている。この種の好適なプロモ
ーターは以下の文献に記載されたものを包含する：Ｓtanfordら、Ｍol．Ｇen． Ｇenet．２１５：２００〜２０８（１９８９）；Ｘuら、Ｐlant Ｍolec．Ｂiol ．２２：５７３〜５８８（１９９３）；Ｌogemannら、Ｐlant Ｃell １：１５１
〜１５８（１９８９）；Ｒohrmeierおよび Ｌehle、Ｐlant Ｍolec．Ｂiol．２ ２：７８３〜７９２（１９９３）；Ｆirekら、Ｐlant Ｍolec．Ｂiol．２２：１
２９〜１４２（１９９３）；およびＷarnerら、Ｐlant Ｊ．３：１９１〜２０１
（１９９３）。
【００８５】 好適な組織特異発現パターンは緑色組織特異、根特異、茎特異、および花特異
発現パターンを包含する。緑色組織での発現に適したプロモーターは、光合成に
関与する遺伝子を調節する多くのものであり、これらの多くは単子葉類および双
子葉類の両方からクローン化されている。好適なプロモーターはホスホエノール
カルボキシラーゼ遺伝子からのトウモロコシＰＥＰＣプロモーターである（Ｈud
spethおよびＧrula、Ｐlant Ｍolec．Ｂiol．１２：５７９〜５８９（１９８９
））。根特異発現用の好適なプロモーターはドゥ・フラモン（ｄｅＦramond、Ｆ
ＥＢＳ２９０：２９０：１０３〜１０６（１９９１）；ＥＰ ０ ４５２ ２６９ 、チバ−ガイギー）により記載されたものであり、また、さらに好適な根特異プ
ロモーターは本発明により提供されるＴ−１遺伝子からのものである。好適な茎
特異プロモーターは、米国特許５，６２５，１３６（チバ−ガイギー）に記載さ
れたものであり、これはトウモロコシのtrpＡ遺伝子の発現を推進する。
【００８６】 適切なプロモーターの選択に加えて、植物中タンパク質発現の構築物は、異種
ヌクレオチド配列の下流に付着するための適切な転写ターミネーターを任意に必
要とする。数種のかかるターミネーターが入手可能であり、技術上既知である（
例えば、ＣａＭＶからのtm１、rbcＳからのＥ９）。植物中で機能する既知の入 手可能ターミネーターのいずれもが本発明の環境で使用可能である。多くの他の
配列が本発明ＤＮＡ分子の発現カセットに取込むことができる。これらはイント
ロン配列（例えば、Ａdh１およびブロンズ１）およびウイルス性リーダー配列（
例えば、ＴＭＶ、ＭＣＭＶおよびＡＭＶからの）などの発現を高めることが示さ
れている配列を包含する。
【００８７】 ＤＮＡ分子の発現は植物の異なる細胞の場所に目標を定めることが好ましい。
ある場合には、サイトソルでの局在化が望ましく、一方他の場合には、ある細胞
下細胞小器官（オルガネラ）での局在化が好ましい。導入遺伝子エンコード酵素
の細胞下局在化は技術上周知の技法により採り得る。一般に、既知細胞小器官標
的遺伝子産物からの標的ペプチドをエンコードするＤＮＡは巧みに操作して、ヌ
クレオチド配列の上流に融合する。多くのかかる標的配列は葉緑体について既知
であり、異種構築物でのその機能が示されている。好適な分類の標的配列は液胞
標的配列、例えば、植物キチナーゼおよびプロテアーゼ上に見出されるような配
列である。
【００８８】 植物形質転換に適したベクターは本明細書の別の個所に記載されている。アグ
ロバクテリウム介在形質転換には、バイナリーベクターまたは少なくとも１個の
Ｔ−ＤＮＡ境界配列を担持するベクターが適当であり、一方、直接の遺伝子移入
には、いずれのベクターも適当であるが、対象の構築物のみを含む直鎖状ＤＮＡ
が好適である。直接の遺伝子移入の場合には、単一ＤＮＡ種での形質転換または
同時形質転換が使用し得る（Ｓchocherら、Ｂiotechnology ４：１０９３〜１０
９６（１９８６））。直接の遺伝子移入およびアグロバクテリウム介在導入双方
においては、形質転換は通常（必ずしもではないが）抗生物質（カナマイシン、
ハイグロマイシン、またはメソトレキセート）または除草剤（バスタ）に抵抗性
を与える選択可能なマーカーとともに実施される。しかし、選択可能なマーカー
の選定は本発明に決定的なものではない。
【００８９】 もう一つの好適な態様において、本発明のＤＮＡ分子は直接プラスミドゲノム
に形質転換される。プラスミド形質転換技術は以下の文献に広範に記載されてい
る：米国特許５，４５１，５１３、５，５４５，８１７、５，５４５，８１８お
よび５，５７６，１９８；ＰＣＴ出願番号ＷＯ９７／３２９７７；ＭｃＢrideら
、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ ９１：７３０１〜７３０５（１９９４）
；これら文献のすべてを参照により本明細書に取込む。バイオリスティック（Ｂ
iolistics）経由色素体の形質転換は当初、単細胞緑藻類コナミドリムシ（Ｃhla
mydomonas reinhardtii）（Ｂoyntonら（１９８８）Ｓcience ２４０：１５３ ４〜１５３７；参照により本明細書に取込む）において達成されたが、シス−作
用抗生物質抵抗性座（スペクチノマイシン／ストレプトマイシン抵抗性）を選択
することによる、または非光合成突然変異表現型の相補性を用いるこの方法は、
間もなくタバコ（Ｎicotiana tabacum）にまで拡張された（Ｓvabら（１９９０ ）Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ ８７：８５２６〜８５３０；参照により
本明細書に取込む）。
【００９０】 タバコ色素体形質転換の基本技法は、葉またはカルス組織の粒子衝撃、または
選択し得る抗生物質抵抗性マーカーをフランキングするクローン化ＤＮＡの領域
とともに、プロトプラスト中にプラスミドＤＮＡをＰＥＧ−介在下に取込ませる
ことからなる。標的配列と名付けた１〜１．５ｋｂのフランキング領域は、色素
体ゲノムとの同族組換えを容易にし、その結果、１５６ｋｂのタバコ色素体ゲノ
ム特異領域の置換または修飾を可能とする。当初、スペクチノマイシンおよび／
またはストレプトマイシンに抵抗性を付与する色素体１６ＳｒＤＮＡおよびrps １２遺伝子における点突然変異が、形質転換用の選択可能マーカーとして利用さ
れた（Ｓvab、Ｚ．、Ｈajdukiewicz、Ｐ．、およびＭaliga、Ｐ．（１９９０） Ｐroc．Ｎatl．Ａcd．Ｓci．ＵＳＡ ８７、８５２６〜８５３０；Ｓtaub、Ｊ． Ｍ．およびＭaliga、Ｐ．（１９９２）Ｐlant Ｃell ４、３９〜４５；参照によ
り本明細書に取込む）。その結果は標的葉の１００衝撃あたりおおよそ１の頻度
で安定なホモプラズム形質転換体となった。これらマーカー間にクローニング部
位の存在することは、外来遺伝子導入用の色素体標的ベクターの形成を可能とす
る（Ｓtaub、Ｊ．Ｍ．およびＭaliga、Ｐ．、ＥＭＢＯ Ｊ．１２：６０１〜６０
６（１９９３）；参照により本明細書に取込む）。形質転換頻度の実質的増大は
、劣性のｒＲＮＡまたはｒ−タンパク質抗生物質抵抗性遺伝子を優性選択可能マ
ーカー、スペクチノマイシン−解毒酵素アミノグリコシド−３'−アデニルトラ ンスフェラーゼをエンコードする細菌ａａｄＡ遺伝子と置換することにより得ら
れた（Ｓvab、Ｚ．、およびＭaliga、Ｐ．（１９９３）Ｐroc．Ｎatl．Ａcd．Ｓ
ci．ＵＳＡ ９０、９１３〜９１７；参照により本明細書に取込む）。以前、こ のマーカーは緑藻類コナミドリムシ（Ｃhlamydomonas reinhardtii）色素体ゲノ
ムの高頻度形質転換に成功裏に使用されていた（Ｇoldschmidt−Ｃlermont、Ｍ ．（１９９１）Ｎucl．Ａcids Ｒes．１９、４０８３〜４０８９；参照により本
明細書に取込む）。最近、タバコとコケ（フィスコミトレラ・パテンズ（Ｐhysc
omitrella patens））由来プロトプラストの色素体形質転換が、ポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）介在下のＤＮＡ取込みにより達成された（Ｏ'Ｎeillら（１ ９９３）Ｐlant Ｊ．３：７２９〜７３８；Ｋoopら（１９９６）Ｐlanta １９９
：１９３〜２０１；両文献を参照により本明細書に取込む）。粒子衝撃とプロト
プラスト形質転換両方が本発明の状況に適している。
【００９１】 本発明のＤＮＡ分子は植物色素体内で該ＤＮＡ分子を発現し得るプロモーター
を含んでなる色素体発現カセットに挿入される。植物色素体内で発現し得る好適
なプロモーターは色素体遺伝子のコーディング領域上流の５'フランキング領域 から単離されるプロモーターであり、それは同一または異なる種からのものであ
ってもよく、非緑色組織に存在するものをも含む主たる色素体型に一般に見出さ
れるものの在来産物であってもよい。色素体での遺伝子発現は核遺伝子発現とは
異なり、原核細胞内での遺伝子発現に関連している（Ｓtemら（１９９７）植物 科学の傾向、２：３０８〜３１５に記載；参照により本明細書に取込む）。色素
体プロモーターは一般に原核プロモーターに典型的な−３５および−１０要素を
含み、ある種の色素体プロモーターは殆どの色素体ゲノムにエンコードされるＥ
coli様ＲＮＡポリメラーゼにより認識され、ＰＥＰ（色素体エンコードＲＮＡポ
リメラーゼ）プロモーターと呼ばれるが、一方、他の色素体プロモーターは核エ
ンコードＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＰプロモーター）により認識される。両方の
型の色素体プロモーターが本発明に適している。色素体プロモーターの例は、タ
バコclpＰ遺伝子プロモーター（ＷＯ９７／０６２５０；参照により本明細書に 取込む）およびアラビドプシスclpＰ遺伝子プロモーターなどのclpＰ遺伝子のプ
ロモーターである。
【００９２】 植物色素体においてＤＮＡ分子を発現し得るもう一つのプロモーターは、色素
体１６ＳリボソームＲＮＡオペロンの調節領域からのものである（Ｈarrisら、 Ｍicrobiol. Ｒev. ５８：７００〜７５４（１９９４）；Ｓhinozakiら、ＥＭＢ
Ｏ Ｊ．５：２０４３〜２０４９（１９８６）；両文献を参照により本明細書に 取込む）。植物色素体においてＤＮＡ分子を発現し得るプロモーターの他の例は
psbＡプロモーターまたはrbcＬプロモーターである。色素体発現カセットはまた
、好ましくはさらに、本発明のＤＮＡ分子に操作可能に連鎖した色素体遺伝子３
'非翻訳配列（３'ＵＴＲ）を含んでなる。非翻訳配列の役割は、好ましくは、転
写の終結よりもむしろ転写したＲＮＡの３'プロセシングを指令することである 。好ましくは、３'ＵＴＲは色素体rps１６遺伝子３'非翻訳配列またはアラビド プシス色素体psbＡ遺伝子３'非翻訳配列である。さらに好適な態様において、色
素体発現カセットは３'非翻訳配列の代りにポリ−Ｇ系を含んでなる。色素体発 現カセットはまた、好ましくはさらに、植物色素体内で機能し、本発明のＤＮＡ
分子に操作可能に連鎖した５'非翻訳配列（５'ＵＴＲ）を含んでなる。
【００９３】 色素体発現カセットは色素体形質転換ベクターにおいて構成され、好ましくは
さらに、同族組換えにより色素体に組込むためのフランキング領域を含んでなる
。色素体形質転換ベクターは少なくとも１個の複製の色素体起源を任意に含んで
いてもよい。本発明はまた、かかる色素体形質転換ベクターにより形質転換され
た植物色素体をも包含し、その場合、ＤＮＡ分子は植物色素体内で発現可能であ
る。本発明はまた、この植物色素体を含んでなる植物または植物細胞およびその
子孫を包含する。好適な態様において、該植物または植物細胞およびその子孫は
トランスジェニック色素体にとってホモプラズムである。
【００９４】 植物色素体内でＤＮＡ分子を発現し得る他のプロモーターは、トランス活性化
因子調節プロモーター、好ましくはその植物に関し、または発現が遂行される植
物細胞の細胞下細胞器官または構成要素に関し異種のプロモーターである。これ
らの場合において、トランス活性化因子をエンコードするＤＮＡ分子は、植物核
ＤＮＡに形質転換される適切な核発現カセットに挿入される。トランス活性化因
子は色素体移行ペプチドを用い、色素体を標的とする。トランス活性化因子およ
びトランス活性化因子推進ＤＮＡ分子は、選択した色素体形質転換系統に、色素
体標的配列を補足し核プロモーターに操作可能に連鎖したトランス活性化因子を
エンコードするＤＮＡ分子を含むトランスジェニック系統を交雑させることによ
り、または所望のＤＮＡ分子を含む色素体形質転換ベクターを、色素体標的配列
を補足し核プロモーターに操作可能に連鎖したトランス活性化因子をエンコード
するＤＮＡ分子を含むトランスジェニック系統に直接形質転換することにより会
合させる。もし核プロモーターが誘導性プロモーター、特に、化学的に誘導可能
なプロモーターであるならば、植物色素体におけるＤＮＡ分子の発現は、化学的
誘発物質の葉部塗付により活性化される。かかる誘導可能なトランス活性化因子
介在色素体発現系は、好ましくは厳格に調節可能であり、誘導前に検出し得る発
現がなく、誘導後にはタンパク質を非常に高く発現し、蓄積する。好適なトラン
ス活性化因子は、例えば、ウイルスＲＮＡポリメラーゼである。この型の好適な
プロモーターは単一サブユニットＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモー
ター、例えば、バクテリオファージＴ７ＤＮＡ−依存ＲＮＡポリメラーゼにより
認識されるＴ７遺伝子１０プロモーターである。Ｔ７ポリメラーゼをエンコード
する遺伝子は、好ましくは、核ゲノムに形質転換され、Ｔ７ポリメラーゼは色素
体移行ペプチドを用い、色素体に標的化される。遺伝子、例えば、Ｔ７ポリメラ
ーゼなどのウイルスＲＮＡポリメラーゼをエンコードする遺伝子の核発現に適し
たプロモーターは、上記または下記のとおりである。色素体におけるＤＮＡ分子
の発現は構成的であっても、誘導的であってもよい。色素体におけるＤＮＡ分子
の発現は、器官−または組織−特異的でもある。これらの異なる態様はＷＯ９８
／１１２３５（参照により本明細書に取込む）に広範に記載されている。このよ
うに、一側面において、本発明は、タバコの化学的に誘導し得るＰＲ−１aプロ モーター（ＵＳ５，６１４，３９５；参照により本明細書に取込む）の制御下に
ある葉緑体標的ファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼの核ゲノムにおける発現を、Ｔ
７遺伝子１０プロモーター／ターミネーター配列により調節される葉緑体レポー
ター導入遺伝子に結び付ける。例えば、母性的に遺伝性のトレハロース生合成遺
伝子に対しホモプラズムである色素体形質転換体を、核内でＴ７ポリメラーゼを
発現する系統により受粉させると、Ｆ１植物が、両方の導入遺伝子構築物を担持
はするが、それを発現しないものとして得られる。酵素的に活性なタンパク質の
大量合成は、ＰＲ−１ａ誘導因子化合物、ベンゾ（１，２，３）チアジアゾール
−７−カルボチオン酸Ｓ−メチルエステル（ＢＴＨ）を葉部塗付した後にのみ、
これら植物の色素体において開始される。
【００９５】 好適な態様において、２つ以上の遺伝子、例えば、トレハロース生合成遺伝子
がオペロン様ポリシストロン性遺伝子において単一プロモーターからの色素体ゲ
ノムから転写される。
【００９６】 好適な態様において、オペロン様ポリシストロン性遺伝子は、オペロン様ポリ
シストロン性遺伝子内の２つの遺伝子間に介在ＤＮＡ配列を含んでなる。好適な
態様において、ＤＮＡ配列は色素体配列との同族配列を避けるために、色素体ゲ
ノムには存在しない。今一つの好適な態様において、該ＤＮＡ配列は非真核遺伝
子の５'非翻訳領域（ＵＴＲ）から、好ましくはウイルス５'ＵＴＲ，好ましくは
Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６ファージなどの細菌ファージから由来の５'ＵＴＲから 誘導される。好適な態様において、該ＤＮＡ配列は修飾して、オペロン様ポリシ
ストロン性遺伝子のＲＮＡ転写において、例えば、ＤＮＡ配列と下流遺伝子のrb
sとの間にＲＮＡ二次構造の形成を防止する。かかる二次構造は下流遺伝子の発 現、特に、その翻訳開始を阻害または抑制する。かかるＲＮＡ二次構造は、コン
ピューターモデルとプログラム、例えば、「mfold」プログラム・バージョン３ （ＺukerおよびＴurner、ワシントン大学医学部、セントルイス、ＭＯ）、およ び他の当業者周知の方法により、融解温度を決めることにより予測される。かか
るＤＮＡ配列を下記に例示する。
【００９７】 オペロン様ポリシストロン性遺伝子内に介在ＤＮＡ配列の存在することは、下
流遺伝子rbsの接近可能性を高め、その結果、高率の発現を生じる。かかる戦略 はオペロン様キメラ遺伝子において単一プロモーターからの色素体ゲノムから転
写すべき２種以上の遺伝子に適用可能である。かかる遺伝子は代謝経路の一部と
なり得、または入出力特性をエンコードする遺伝子でもある。代謝経路の例は、
例えば、トレハロースまたはフラクタンなどの糖生合成経路である。
【００９８】 さらなる態様において、本発明のＤＮＡ分子は、生体外組換えまたはＤＮＡ混
合（シャフリング）として知られる技法で、ランダムな突然変異を取込むことに
より修飾される。この技法はステンマー（Ｓtemmer）ら、Ｎature ３７０：３８
９〜３９１（１９９４）および米国特許５，６０５，７９３（参照により本明細
書に取込む）に記載されている。百万ものヌクレオチド配列突然変異体コピーが
本明細書に記載の原初ヌクレオチド配列にもとづき産生され、活性の上昇したも
のまたは特異性の変化したものなど、性質の改善された変異体が回収される。該
方法は、本発明ヌクレオチド配列を含んでなる鋳型二本鎖ポリヌクレオチドから
の突然変異誘発した二本鎖ポリヌクレオチドの形成を包含し、その場合、鋳型二
本鎖ポリヌクレオチドは所望サイズの二本鎖ランダムフラグメントに切断される
。該方法は、得られた母集団の二本鎖ランダムフラグメントに１種以上の一本鎖
または二本鎖オリゴヌクレオチドを加える工程であるが、その場合、当該オリゴ
ヌクレオチドは二本鎖鋳型ポリヌクレオチドに対し相同の領域と非相同の領域を
含んでなる工程；二本鎖ランダムフラグメントとオリゴヌクレオチドの得られる
混合物を一本鎖フラグメントに変性する工程；得られた母集団の一本鎖フラグメ
ントを、当該一本鎖フラグメントが当該相同の領域でアニーリングするに至りア
ニールフラグメント対を形成する条件下でポリメラーゼと培養する工程であるが
、当該相同領域は一対の１メンバーが他のものの複製を開始するのに十分であり
、それによって突然変異誘発した二本鎖ポリヌクレオチドを形成する工程；そし
て第二および第三の工程を少なくともさらに２サイクル繰り返すが、その場合、
さらなるサイクルの第二工程において得られた混合物は前サイクルの第三工程か
らの突然変異誘発した二本鎖ポリヌクレオチドを含み、さらなるサイクルがさら
なる突然変異誘発した二本鎖ポリヌクレオチドを形成する工程；を含んでなる。
好適な態様において、二本鎖ランダムフラグメントの母集団中、単一種の二本鎖
ランダムフラグメント濃度は総ＤＮＡの１重量％より少ない。さらに好適な態様
において、鋳型二本鎖ポリヌクレオチドは少なくとも約１００種類のポリヌクレ
オチドを含んでなる。もう一つの態様において、二本鎖ランダムフラグメントの
サイズは約５ｂｐないし５ｋｂである。さらなる態様において、本方法第４工程
は第２工程および第３工程を少なくとも１０サイクル繰り返すことからなる。
【００９９】 多くの形質転換ベクターが植物の形質転換用として入手し得るが、本発明遺伝
子はかかるベクターとともに使用し得る。使用するベクターの選択は好適な形質
転換技法および形質転換の標的種に依存する。ある種標的種では、異なる抗生物
質または除草剤の選択マーカーが好適である。形質転換に常套的に使用される選
択マーカーは、カナマイシンおよび関連する抗生物質に抵抗性を付与するnptII 遺伝子（ＭessingおよびＶierra、Ｇene １９：２５９〜２６８（１９８２）； Ｂevanら、Ｎature ３０４：１８４〜１８７（１９８３））、除草剤ホスフィノ
スリシンに抵抗性を付与するbar遺伝子（Ｗhiteら、Ｎucl Ａcids Ｒes １８： １０６２（１９９０）；Ｓpencerら、Ｔheor Ａppl Ｇenet ７９：６２５〜６３
１（１９９０））、抗生物質ハイグロマイシンに抵抗性を付与するhpt遺伝子（ ＢlochingerおよびＤiggelmann、Ｍol Ｃell Ｂiol ４：２９２９〜２９３１） 、およびメソトレキセートに抵抗性を付与するdhfr遺伝子（Ｂourouisら、ＥＭ ＢＯ Ｊ．２（７）：１０９９〜１１０４（１９８３））を包含する。
【０１００】 多くのベクターがアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａgrobacterium t
umefaciens）を用いる形質転換用に入手し得る。これらは一般に少なくとも１つ
のＴ−ＤＮＡ境界配列を担持し、ｐＢＩＮ１９（Ｂevan、Ｎucl. Ａcids Ｒes.
（１９８４））およびｐＸＹＺなどのベクターを包含する。以下に２つの典型的
なベクターの構築につき記載する。
【０１０１】 ｐＣＩＢ２００およびｐＣＩＢ２００１の構築：バイナリーベクターｐＣＩＢ
２００およびｐＣＩＢ２００１をアグロバクテリウムで使用する組換えベクター
の構築に使用し、以下の方法で構築した。ｐＴＪＳ７５kanは、テトラサイクリ ン抵抗性遺伝子の切除を可能とするｐＴＪＳ７５のＮarＩ消化（Ｓchmidhauser およびＨelinski、Ｊ Ｂacteriol.１６４：４４６〜４５５（１９８５））、次 いでＮＰＴIIを担持するｐＵＣ４ＫからのＡcclフラグメント（Ｍessingおよび Ｖierra、Ｇene １９：２５９〜２６８（１９８２）；Ｂevanら、Ｎature ３０ ４：１８４〜１８７（１９８３）；ＭcＢrideら、Ｐlant Ｍolecular Ｂiology
１４：２６６〜２７６（１９９０））の挿入により創製した。ＸhoIリンカーは 左および右Ｔ−ＤＮＡ境界、植物選択可能nos／nptIIキメラ遺伝子とｐＵＣポリ
リンカー（Ｒothsteinら、Ｇene ５３：１５３〜１６１（１９８７））を含むｐ
ＣＩＢ７のＥcoＲＶフラグメントに連鎖し、ＸhoI−消化フラグメントはＳalＩ −消化ｐＴＪＳ７５kanにクローン化し、ｐＣＩＢ２００を創製した（ＥＰ ０ ３３２ １０４、実施例１９も参照）。ｐＣＩＢ２００は以下のユニークポリリ ンカー制限部位を含む：ＥcoＲＩ、ＳstＩ、ＫpnＩ、ＢglII、ＸbaＩおよびＳal
Ｉ。ｐＣＩＢ２００１は追加の制限部位を該ポリリンカーに挿入することにより
創製したｐＣＩＢ２００の誘導体である。ｐＣＩＢ２００１のポリリンカーにお
けるユニーク制限部位は、ＥcoＲＩ、ＳstＩ、ＫpnＩ、ＢglII、ＸbaＩ、ＳalＩ
、ＭluＩ、ＢclＩ、ＡvrII、ＡpaＩ、ＨpaＩおよびＳtuＩである。これらのユニ
ーク制限部位を含むことに加えて、ｐＣＩＢ２００１は、植物および細菌カナマ
イシン選択、アグロバクテリウム介在形質転換のための左および右Ｔ−ＤＮＡ境
界、大腸菌と他の宿主間の可動化用ＲＫ−２由来trfＡ機能、およびやはりＲＫ ２からのＯriＴおよびＯriＶ機能を有する。ｐＣＩＢ２００１ポリリンカーはそ
れ自体の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングに適している。
【０１０２】 ｐＣＩＢ１０およびそのハイグロマイシン選択誘導体：バイナリーベクターｐ
ＣＩＢ１０は植物中での選択用カナマイシン抵抗性をエンコードする遺伝子、Ｔ
−ＤＮＡ右および左境界配列を含み、大腸菌とアグロバクテリウムの双方で複製
することを可能とする広い宿主域のプラスミドｐＲＫ２５２から配列を取込む。
その構築はロースシュタイン（Ｒothstein）ら（Ｇene ５３：１５３〜１６１（
１９８７））により記載されている。種々のｐＣＩＢ１０誘導体が構築されてお
り、それはグリッツ（Ｇritz）ら（Ｇene ２５：１７９〜１８８（１９８３））
により記載されたハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼの遺伝子を取込
んでいる。これらの誘導体はハイグロマイシンのみ（ｐＣＩＢ７４３）またはハ
イグロマイシンとカナマイシン上でのトランスジェニック植物細胞の選択を可能
とする。
【０１０３】 アグロバクテリウム・テュメファシエンス（Ａgrobacterium tumefaciens）を
使用しない形質転換は、選定した形質転換ベクターにおいてＴ−ＤＮＡ配列の必
要性を巧みに回避し、その結果、これらの配列を欠くベクターが、Ｔ−ＤＮＡ配
列を含む上記ベクターなどのベクターに加え、利用可能である。アグロバクテリ
ウムに依存しない形質転換技法は、粒子衝撃、プロトプラスト取込み（例えば、
ＰＥＧおよびエレクトロポレーション）およびマイクロインジェクションによる
形質転換を包含する。ベクターの選定は形質転換する種に対しての好適な選択に
主に依存する。以下に幾つかの典型的なベクターの構築につき記載する。
【０１０４】 ｐＣＩＢ３０６４の構築：ｐＣＩＢ３０６４は除草剤バスタ（basta）（また はホスフィノスリシン（phosphinothricin））による選択との組合わせで、直接
遺伝子転移手技に適したｐＵＣ誘導ベクターである。プラスミドｐＣＩＢ２４６
はＥcoliＧＵＳ遺伝子とＣａＭＶ３５Ｓ転写ターミネーターに使用可能に融合し
ているＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含んでなり、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９３／０
７２７８に記載されている。このベクターの３５Ｓプロモーターは開始部位５' に２つのＡＴＧ配列を含んでいる。これらの部位は、ＡＴＧを除き、制限部位Ｓ
spＩとＰvuIIとを生成するような方法で標準的ＰＣＲ技法を用い突然変異させた
。新たな制限部位はユニークＳalＩ部位から９６および３７ｂｐ離れており、ま
た、実際の開始部位から１０１および４２ｂｐ離れていた。得られたｐＣＩＢ２
４６の誘導体はｐＣＩＢ３０２５と命名した。ＧＵＳ遺伝子は次いでＳalＩとＳ
acＩでの消化によりｐＣＩＢ３０２５から切除し、その末端を平滑として再連鎖
させ、プラスミドｐＣＩＢ３０６０を生成させた。プラスミドｐＪＩＴ８２はジ
ョン・インネス・センター（ノルウイッチ）から入手し、ストレプトマイセス・
ビリドクロモゲネス（Ｓtreptomyces viridochromogenes）からのbar遺伝子含有
４００ｂｐＳmaＩフラグメントを切除してｐＣＩＢ３０６０のＨpaＩ部位に挿入
した（Ｔhompsonら、ＥＭＢＯ Ｊ ６：２５１９〜２５２３（１９８７））。こ れによって、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターとターミネーターの制御下にある除草
剤選択用のbar遺伝子、アンピシリン抵抗用遺伝子（大腸菌での選択用）および ユニーク部位ＳphＩ、ＰstＩ、ＨindIII、とＢamＨＩをもつポリリンカーを含ん
でなるｐＣＩＢ３０６０を生成した。このベクターはそれ自体の調節シグナルを
含む植物発現カセットのクローニングに適している。
【０１０５】 ｐＳＯＧ１９およびｐＳＯＧ３５の構築：ｐＳＯＧ３５はメソトレキセートへ
の抵抗性を付与する選択可能マーカーとして大腸菌遺伝子ジヒドロ葉酸レダクタ
ーゼ（ＤＨＦＲ）を利用する形質転換ベクターである。ＰＣＲを用い、３５Ｓプ
ロモーター（〜８００ｂｐ）、トウモロコシＡdh１遺伝子からのイントロン６（
〜５５０ｂｐ）、およびｐＳＯＧ１０からの１８ｂｐのＧＵＳ非翻訳リーダー配
列を増幅する。大腸菌遺伝子ジヒドロ葉酸レダクターゼII型遺伝子をエンコード
する２５０ｂｐのフラグメントもまたＰＣＲにより増幅し、これら２つのＰＣＲ
フラグメントを、ｐＵＣ１９ベクターバックボーンとノパリンシンターゼターミ
ネーターとを含んでなるｐＢＩ２２１（クロンテック）からのＳacＩ−ＰstＩフ
ラグメントに組入れた。これらフラグメントを集合してｐＳＯＧ１９を生成させ
たが、このものはイントロン６配列、ＧＵＳリーダー、ＤＨＦＲ遺伝子およびノ
パリンシンターゼターミネーターと融合した３５Ｓプロモーターを含んでいる。
ｐＳＯＧ１９内のＧＵＳリーダーをトウモロコシ白化斑点ウイルス（ＭＣＭＶ；
Ｍaize Ｃhlorotic Ｍottle Ｖirus）からのリーダー配列と置換し、ベクターｐ
ＳＯＧ３５を生成させた。ｐＳＯＧ１９およびｐＳＯＧ３５はアンピシリン抵抗
用ｐＵＣ遺伝子を担持し、外来配列のクローニングに利用し得るＨindIII、Ｓph
Ｉ、ＰstＩおよびＥcoＲＩ部位を有する。
【０１０６】 トランスジェニック植物での発現を企図した遺伝子配列は、先ず、発現カセッ
ト中、適切なプロモーターの後ろと、適切な転写ターミネーターの上流に組込ま
れる。これらの発現カセットは次いで上記の植物形質転換ベクターに容易に移入
することができる。
【０１０７】 発現カセットに使用するプロモーターの選択がトランスジェニック植物での導
入遺伝子の空間的時間的発現パターンを決めることになる。選択されたプロモー
ターは特定の細胞型（葉表皮細胞、葉肉細胞、根皮層細胞など）または特定の組
織または器官（例えば、根、葉または花）内で導入遺伝子を発現し、この選択が
酵素生合成の所望の位置を反映する。あるいは、選択されたプロモーターが光誘
導または他の一過性調節プロモーター下に遺伝子の発現を推進する。さらなる（
および好適な）代替法は選択されたプロモーターが外的刺激、例えば、特異化学
誘導剤の塗付または傷害により誘導し得ることである。これが所望の場合のみに
トレハロース生合成遺伝子の転写を誘導する可能性を与える。
【０１０８】 様々な転写ターミネーターが発現カセットでの使用のために入手し得る。これ
らは導入遺伝子とその正しいポリアデニル化の範囲を越えて転写終結の責を果た
す。適切な転写ターミネーターおよび植物中で機能することの知られたターミネ
ーターは、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、tmlターミネーター、ノパリンシン ターゼターミネーター、ナシrbcＳ Ｅ９ターミネーターを包含する。これらは単
子葉類および双子葉類の両方で使用することができる。
【０１０９】 多くの配列が転写単位内からの遺伝子発現を高めることが見出されており、こ
れらの配列は本発明の遺伝子と組合わせてトランスジェニック植物でのその発現
を増大させるために使用することができる。
【０１１０】 種々のイントロン配列が特に単子葉類細胞において発現を高めることが示され
ている。例えば、トウモロコシＡdh１遺伝子のイントロンは、トウモロコシ細胞
に導入されたとき、その同族体プロモーターのもとで野生型遺伝子の発現を有意
に高めることが見出されている。イントロン１は特に効果的であることが見出さ
れ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子との融合構築物に
おいて発現を高めた（Ｃallisら、Ｇenes Ｄevelop １：１１８３〜１２００（ １９８７））。同じ実験系で、トウモロコシ・ブロンズ１遺伝子からのイントロ
ンは発現を高める上で同様の効果を示した。イントロン配列は植物形質転換ベク
ターに、一般には非翻訳リーダー内に常套的に組込まれている。
【０１１１】 ウイルス由来の多数の非翻訳リーダー配列もまた発現を高めることが知られて
おり、これらは特に双子葉類細胞において有効である。とりわけ、タバコモザイ
クウイルス（ＴＭＶ、“Ω−配列”）、トウモロコシ白化斑点ウイルス（ＭＣＭ
Ｖ）、およびアルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）からのリーダー配列が
発現の増強に有効なことが示されている（例えば、Ｇallieら、Ｎucl. Ａcids Ｒes. １５：８６９３〜８７１１（１９８７）；Ｓkuzeskiら、Ｐlant Ｍolec.
Ｂiol. １５：６５〜７９（１９９０））。
【０１１２】 遺伝子産物を標的とする種々のメカニズムの存在することが植物において知ら
れており、これらのメカニズム機能を制御する配列が一部詳細に特徴づけられて
いる。例えば、葉緑体に向けた遺伝子産物の標的化は、種々タンパク質のアミノ
末端に見出されるシグナル配列により制御されるが、それは葉緑体移入に際し切
断され、成熟タンパク質を生成する（例えば、Ｃomaiら、Ｊ.Ｂiol．Ｃhem. ２ ６３：１５１０４〜１５１０９（１９８８））。これらのシグナル配列は異種遺
伝子産物に融合可能であり、異種産物が葉緑体に移入するのに効果的である（Ｖ
an den Ｂroeckら、Ｎature ３１３：３５８〜３６３（１９８５））。適切なシ
グナル配列をエンコードするＤＮＡは、ＲＵＢＩＳＣＯタンパク質、ＣＡＢタン
パク質、ＥＰＳＰシンターゼ酵素、ＧＳ２タンパク質、およびその他葉緑体に局
在することの知られるタンパク質などをエンコードするｃＤＮＡの５'末端から 単離することができる。
【０１１３】 他の遺伝子産物はミトコンドリアなどの細胞小器官およびペルオキシソームな
どに局在化している（例えば、Ｕngerら、Ｐlant Ｍolec.Ｂiol. １３：４１１ 〜４１８（１９８９））。これらの産物をエンコードするｃＤＮＡは巧みに操作
し、異種遺伝子産物をこれらの細胞小器官に標的化することができる。かかる配
列の例は核エンコードＡＴＰアーゼおよびミトコンドリアへの特異アスパラギン
酸アミノトランスフェラーゼイソ型である。細胞タンパク顆粒を標的とすること
はロジャーズ（Ｒogers）ら（Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ ８２：６５ １２〜６５１６（１９８５））により記載されている。
【０１１４】 さらに、配列は他の細胞画分に遺伝子産物を標的とするように特性化されてい
る。アミノ末端配列は、ＥＲ、アポプラスト、およびアリューロン細胞からの細
胞外分泌を標的とすることに関わる（Ｋoehler およびＨo、Ｐlant Ｃell ２： ７６９〜７８３（１９９０）。さらに、カルボキシ末端配列と接合したアミノ末
端配列は遺伝子産物の液胞標的化に関わる（Ｓhinshiら、Ｐlant Ｍolec. Ｂiol
. １４：３５７〜３６８（１９９０））。
【０１１５】 上記の適切な標的配列を対象の導入遺伝子配列に融合することにより、どの細
胞小器官または細胞画分に対しても導入遺伝子産物を差し向けることが可能であ
る。葉緑体を標的とするには、例えば、ＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子、ＣＡＢ遺伝子、
ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子、またはＧＳ２遺伝子からの葉緑体シグナル配列を導
入遺伝子のアミノ末端ＡＴＧに枠内融合する。選択されたシグナル配列は既知の
切断部位を含むべきであり、構築される融合は切断が必要となる切断部位の後の
アミノ酸を考慮に入れるべきである。ある場合には、この要件が少数のアミノ酸
を切断部位と導入遺伝子ＡＴＧの間に加えるか、または代替法として導入遺伝子
配列内の数個のアミノ酸を置換えることにより満たされる。葉緑体移入のために
構築された融合は、生体外転写構築物の生体外翻訳による葉緑体取込みと、それ
に続く以下の文献に記載された技法による生体外葉緑体取込みの効率について試
験することができる（Ｂartlettら、Ｅdelmannら編纂、葉緑体の分子生物学にお
ける方法、エルスビアー、１０８１〜１０９１（１９８２）；Ｗasmannら、Ｍol
. Ｇen. Ｇenet. ２０５：４４６〜４５３（１９８６））。これらの構築技法は
技術上周知であり、ミトコンドリアおよびペルオキシソームにも同様に応用する
ことができる。トレハロース生合成遺伝子に必要とされる標的化の選定は、所定
の経路の出発点として要求される前駆体の細胞内局在化に依存する。これはある
場合にはミトコンドリア性またはペルオキシソーム性であるが、通常はサイトソ
ル性または葉緑体性である。
【０１１６】 細胞内標的化の上記メカニズムは、標的化シグナルが推進するプロモーターの
ものとは異なる発現パターンをもつプロモーターの転写調節下に特定細胞の標的
化ゴールに達するように、その同族体プロモーターとの接合だけでなく、異種プ
ロモーターとの接合でも利用され得る。
【０１１７】 本発明は、プロモーターの起源に関係なく、植物において発現し得るプロモー
ターの調節下にあるトレハロース生合成遺伝子の発現を包含する。
【０１１８】 さらに、本発明は、トレハロース生合成遺伝子の発現に要求されるまたは選択
されるさらなる配列と接合した植物発現可能プロモーターの使用を包含する。か
かる配列は、これらに限定されるものではないが、転写ターミネーター、発現を
増強する外来性配列（イントロン（例えば、Ａdhイントロン１）、ウイルス配列
（例えば、ＴＭＶ−Ω）など）、および特定の細胞器官または細胞画分を遺伝子
産物の標的とするための配列を包含する。
【０１１９】 適切な植物発現可能プロモーターは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、アクチン
プロモーターまたはユビキチンプロモーターなどの構成的に発現されるプロモー
ターである。
【０１２０】 「二重」３５Ｓプロモーターを含むプラスミドｐＣＧＮ１７６１の構築は、公
開特許出願ＥＰ ０ ３９２ ２２５（実施例２３）に記載されている。ｐＣＧＮ １７６１は「二重」３５Ｓプロモーターおよびプロモーターとターミネーターの
間にユニークＥcoＲＩ部位をもつtml転写ターミネーターを含み、ｐＵＣ型のバ ックボーンを有する。ｐＣＧＮ１７６１の誘導体は既存のＥcoＲＩ部位に加えて
ＮotＩとＸhoＩ部位を含む修飾ポリリンカーをもつように構築された。この誘導
体はｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸと命名された。ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸはトランス
ジェニック植物において３５Ｓプロモーターの制御下に発現する目的で、そのポ
リリンカー内でｃＤＮＡ配列または遺伝子配列（微生物ＯＲＦ配列を含む）をク
ローニングするのに有用である。かかる構築物の全３５Ｓプロモーター−遺伝子
配列−tmlターミネーターカセットは、上記のごとき形質転換ベクターに移入す るために、ＨindIII、ＳphＩ、ＳalＩおよびＸbaＩによりプロモーターに対して
５'部位で、また、ＸbaＩ、ＢamＨＩおよびＢglＩによりターミネーターに対し ３'部位で切断することができる。さらに、二重３５Ｓプロモーターフラグメン トは別のプロモーターと置換えるために、ＨindIII、ＳphＩ、ＳalＩ、ＸbaＩま
たはＰstＩでの５'切除により、また、ポリリンカー制限部位（ＥcoＲＩ、Ｎot ＩまたはＸhoＩ）での３'切除により除去することができる。
【０１２１】 この項に記載した構築物のいずれについても、クローニング部位周辺の修飾は
翻訳を高める配列の導入によりなされる。これは微生物由来の遺伝子を植物発現
カセットに導入すべきときに特に有用である；その理由はこれらの遺伝子が植物
での翻訳開始に適した配列をその開始メチオニンに隣接して含んでいないからで
ある。微生物由来の遺伝子がそのＡＴＧで植物発現カセットにクローン化される
べき場合には、その発現を最適化するためにその挿入部位を修飾するのが有用で
ある。翻訳開始部位の最適化によるｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸの修飾は、植物発現
に適した数種の最適化配列の一つを取込む実施例により説明する（例えば、上記
Ｊoshi）。本発明の範囲内で適宜使用し得るさらなる植物発現可能なプロモータ
ーは、以下に記載するような化学的に調節し得るプロモーターである。例えば、
この項はｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸ中の二重３５Ｓプロモーターをいずれかの選定
したプロモーターと置換することを説明する；例示としては、化学的に調節可能
なＰＲ−１ａプロモーター（米国特許５，６１４，３９５に記載されている；そ
の全文を参照により本明細書に取込む）および化学的に調節可能なアラビドプシ
スＰＲ−１プロモーターである。選定プロモーターは、好ましくは、その起源か
ら制限酵素により切除されるが、代替法として適切な末端制限部位をもつプライ
マーによりＰＣＲ増幅してもよい。ＰＣＲ増幅が採られるならば、その場合、プ
ロモーターは再配列し、標的ベクター中の増幅プロモーターのクローニング後、
増幅エラーをチェックすべきである。化学的に調節可能なタバコＰＲ−１ａプロ
モーターはプラスミドｐＣＩＢ１００４から切断され（構築についてはＥＰ ０
３３２ １０４の実施例２１参照）、プラスミドｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸに転移 される。ｐＣＩＢ１００４はＮcoＩで切断し、得られる直鎖化フラグメントの３
'オーバーハングをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼでの処理により平滑とする。該フラ
グメントは次いでＨindIIIで切断し、得られるフラグメント含有ＰＲ−１ａプロ
モーターをゲル精製し、二重３５Ｓプロモーターを除いてあるｐＣＧＮ１７６１
ＥＮＸにクローン化する。ここではＸhoＩでの切断およびＴ４ポリメラーゼでの
平滑化、引続くＨindIIIでの切断、およびｐＣＩＢ１００４プロモーターフラグ
メントをクローン化したフラグメント含有大型ベクター−ターミネーターの単離
によりなされる。これにより、ＰＲ−１ａプロモーターとtmlターミネーターを 有し、ユニークＥcoＲＩとＮotＩ部位含有介在ポリリンカーを有するｐＣＧＮ１
７６１ＥＮＸ誘導体を生成する。選択されたトレハロース生合成遺伝子をこのベ
クターに挿入し、次いで、融合産物（すなわち、プロモーター−遺伝子−ターミ
ネーター）を、本出願に記載されたベクターを含むいずれかの選択された形質転
換ベクターに転移することができる。種々の化学調節因子を採用し、本発明によ
り形質転換された植物において、トレハロース生合成コーディング配列の発現を
誘導することができる。本開示に関連して、「化学調節因子」は、植物において
ＰＲ−１ａプロモーターの誘導物質であることの知られている化学物質またはそ
の密接な誘導体を包含する。本発明の化学的に誘導し得るトレハロース生合成遺
伝子調節因子の好適な一群は、ベンゾ−１，２，３−チアジアゾール（ＢＴＨ）
構造に基づくものであり、これらに限定されるものではないが、以下のタイプの
化合物を包含する：ベンゾ−１，２，３−チアジアゾールカルボン酸、ベンゾ−
１，２，３−チアジアゾールチオカルボン酸、シアノベンゾ−１，２，３−チア
ジアゾール、ベンゾ−１，２，３−チアジアゾールカルボン酸アミド、ベンゾ−
１，２，３−チアジアゾールカルボン酸ヒドラジド、ベンゾ−１，２，３−チア
ジアゾール−７−カルボン酸、ベンゾ−１，２，３−チアジアゾール−７−チオ
カルボン酸、７−シアノベンゾ−１，２，３−チアジアゾール、ベンゾ−１，２
，３−チアジアゾール−７−カルボン酸アミド、ベンゾ−１，２，３−チアジア
ゾール−７−カルボン酸ヒドラジド、ベンゾ−１，２，３−チアジアゾールカル
ボン酸アルキルエステル（該アルキル基は１〜６個の炭素原子を含む）、ベンゾ
−１，２，３−チアジアゾール−７−カルボン酸メチルエステル、ベンゾ−１，
２，３−チアジアゾール−７−カルボン酸ｎ−プロピルエステル、ベンゾ−１，
２，３−チアジアゾール−７−カルボン酸ベンジルエステル、ベンゾ−１，２，
３−チアジアゾール−７−カルボン酸sec−ブチルヒドラジド、およびその適切 な誘導体。他の化学的誘導物質としては、例えば、安息香酸、サリチル酸（ＳＡ
）、ポリアクリル酸およびその置換誘導体；適切な置換基は低級アルキル、低級
アルコキシ、低級アルキルチオ、およびハロゲンを包含する。本発明の化学的に
誘導し得るＤＮＡ配列に対する調節因子のさらなる他の群は、ピリジンカルボン
酸構造、例えば、イソニコチン酸構造および好ましくはハロイソニコチン酸構造
に基づく。好適なものはジクロロイソニコチン酸およびその誘導体、例えば、低
級アルキルエステルである。このクラスの化合物の好適な調節因子は、例えば、
２，６−ジクロロイソニコチン酸（ＩＮＡ）、およびその低級アルキルエステル
、とりわけ、メチルエステルである。
【０１２２】 構成性発現はアクチンプロモーターによっても達成することができる。アクチ
ンの数種のイソ型が殆どの細胞型において発現されることが知られており、結果
としてアクチンプロモーターは構成的プロモーターとして良好な選択である。特
に、コメＡct１遺伝子からのプロモーターはクローン化され、特性化されている
（ＭｃＥlroyら、Ｐlant Ｃell ２：１６３〜１７１（１９９０））。プロモー ターの１．３ｋｂフラグメントはコメプロトプラストでの発現に必要とされる調
節要素のすべてを含んでいる。さらに、Ａct１プロモーターに基づく多くの発現
ベクターが単子葉類に使用するために特異的に構築されている（ＭｃＥlroyら、
Ｍol. Ｇenet．２３１：１５０〜１６０（１９９１））。これらはＡct１−イン
トロン１、Ａdh１５'フランキング配列とＡdh１−イントロン１（トウモロコシ ・アルコール・デヒドロゲナーゼ遺伝子）およびＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを
取込む。最高の発現を示すベクターは３５ＳとＡct１イントロンまたはＡct１５
'フランキング配列とＡct１イントロンとの融合であった。（ＧＵＳレポーター 遺伝子の）開始ＡＴＧ周辺配列の最適化もまた発現を高めた。マックエルロイ（
ＭｃＥlroy）らが記載するプロモーター発現カセット（Ｍol.Ｇen.Ｇenet．２３
１：１５０〜１６０（１９９１））はトレハロース生合成遺伝子の発現用に容易
に修飾可能であり、特に単子葉宿主で使用するのに適している。例えば、フラグ
メント含有プロモーターはマックエルロイ構築物から除去し、ｐＣＧＮ１７６１
ＥＮＸの二重３５Ｓプロモーターの置換えに使用し得るが、これは次いで挿入ま
たは特異遺伝子配列に利用し得る。このように構築された融合遺伝子は次いで適
切な形質転換ベクターに移入することができる。別の報告によると、第一イント
ロンをもつコメのＡct１プロモーターは、培養した大麦細胞内でも高い発現を指
令することが見出されている（Ｃhibbarら、Ｐlant Ｃell Ｒep. １２：５０６ 〜５０９（１９９３））。
【０１２３】 ユビキチンは多くの細胞型に蓄積することの知られたもう一つの遺伝子産物で
あり、そのプロモーターは構成的発現のためにトランスジェニック植物に使用す
る数種の種からクローン化されている（例えば、ヒマワリ−Ｂinetら、Ｐlant Ｓcience ７９：８７〜９４（１９９１）；トウモロコシ−Ｃhristensenら、Ｐl
ant Ｍolec．Ｂiol. １２：６１９〜６３２（１９８９））。トウモロコシ・ユ ビキチン・プロモーターをトランスジェニック単子葉系で発生させ、その配列と
単子葉形質転換のために構築されたベクターとが特許公報ＥＰ ０ ３４２ ９２ ６（ルブリゾール）に開示されている。さらに、テイラー（Ｔaylor）ら（Ｐlan
t Ｃell Ｒep. １２：４９１〜４９５（１９９３））は、トウモロコシユビキチ
ンプロモーターとそのイントロンを含んでなるベクター（ｐＡＨＣ２５）および
ミクロ投射衝撃により導入したときの多くの単子葉類細胞懸濁液でのその活性に
つき記載している。ユビキチンプロモーターはトランスジェニック植物、特に単
子葉類でのトレハロース生合成遺伝子の発現に適している。好適なベクターは、
適切なユビキチンプロモーターおよび／またはイントロン配列の導入により修飾
したｐＡＨＣ２５の誘導体または本願に記載したいずれかの形質転換ベクターで
ある。
【０１２４】 本発明の酵素に対するもう一つの発現パターンは根での発現である。適切な根
部プロモーターはドゥフラモンド（deＦramond、ＦＥＢＳ ２９０：１０３〜１ ０６（１９９１））により、また公開特許出願ＥＰ ０ ４５２ ２６９（チバ− ガイギー）に記載されたものである。このプロモーターは、トレハロース生合成
遺伝子の挿入と引続く全プロモーター−遺伝子−ターミネーターカセットの対象
形質転換ベクターへの転移のために、ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸなどの適切なベク
ターに転移する。
【０１２５】 傷害誘導性プロモーターもまたトレハロース生合成遺伝子の発現に適している
。多くのかかるプロモーターが記載されており（例えば、Ｘuら、Ｐlant Ｍolec
.Ｂiol. ２２：５７３〜５８８（１９９３）；Ｌogemannら、Ｐlant Ｃell １：
１５１〜１５８（１９８９）；ＲohrmeierおよびＬehle、Ｐlant Ｍolec.Ｂiol.
２２：７８３〜７９２（１９９３）；Ｆirekら、Ｐlant Ｍolec.Ｂiol. ２２：
１２９〜１４２（１９９３）；Ｗarnerら、Ｐlant Ｊ．３：１９１〜２０１（１
９９３））、すべてが本発明での使用に適している。ロゲマン（Ｌogemann）ら は双子葉類バレイショwuｎ１遺伝子の５'上流配列について記載している。ウー （Ｘu）らは双子葉類バレイショ（pin２）からの傷害誘導性プロモーターが単子
葉コメにおいて活性であることを示している。さらに、ローマイヤーおよびレー
ル（Ｒohrmeier ＆ Ｌehle）は、傷害により誘導され、かつ、標準技法により同
族プロモーターの単離に使用し得るトウモロコシＷip１ｃＤＮＡのクローニング
について記載している。同様に、フィレック（Ｆirek）らおよびＷarnerらは単 子葉アスパラガス（Ａsparagus officinalis）からの傷害誘導性遺伝子について
記載しているが、この遺伝子は局所傷害および病原侵入部位で発現される。技術
上周知のクローニング技法により、これらのプロモーターは適切なベクターに転
移し、本発明のトレハロース生合成遺伝子に融合して、これらの遺伝子を植物の
傷害部位で発現させるのに使用することができる。
【０１２６】 特許出願ＷＯ９３／０７２７８（チバ−ガイギー）は髄細胞内で優先的に発現
されるされるトウモロコシtrpＡ遺伝子の単離について記載している。該遺伝子 配列と転写の開始点から−１７２６まで伸長したプロモーターが提示されている
。標準的な分子生物学技法を用いて、このプロモーターまたはその部分がｐＣＧ
Ｎ１７６１などのベクターに転移され、そこでそれが３５Ｓプロモーターに置き
換わり、髄に好適の様式で外来遺伝子の発現を推進するのに使用される。事実、
髄に好適のプロモーターを含むフラグメントまたはその部分はいずれかのベクタ
ーに転移され、トランスジェニック植物での利用に向けて修飾される。
【０１２７】 ホスホエノールカルボキシダーゼ（ＰＥＰＣ）をエンコードするトウモロコシ
遺伝子はハドスペスおよびグルラ（Ｈudspeth ＆ Ｇrula、Ｐlant Ｍolec. Ｂio
l. １２：５７８〜５８９（１９８９））により記載されている。標準的な分子 生物学技法を用いて、この遺伝子に対するプロモーターを使用し、トランスジェ
ニック植物における葉部特異方式でいずれの遺伝子の発現も推進することができ
る。チェンおよびヤーゲンドルフ（Ｃhen ＆ Ｊagendorf、Ｊ．Ｂiol. Ｃhem. ２６８：２３６３〜２３７６（１９９３））は異種導入遺伝子移入のために葉緑
体移行ペプチドを使用し成功したと記載している。使用されたこのペプチドは、
ニコチアナ・プルンバギニフォリア（Ｎicotiana plumbaginifolia）のrbcＳ遺 伝子からの移行ペプチドである（Ｐoulsenら、Ｍol. Ｇen．Ｇenet. ２０５：１
９３〜２００（１９８６））。制限酵素ＤraＩおよびＳphＩ、またはＴsp５０９
IおよびＳphＩを用い、この移行ペプチドをエンコードするＤＮＡ配列をプラス ミドprbcＳ−８Ｂから切り出し、上記いずれかの構築物とともに使用するために
好適に処理することができる。ＤraＩ−ＳphＩフラグメントは、開始点rbcＳ Ａ
ＴＧに関し−５８から、移入切断部位直後の成熟ペプチドの最初のアミノ酸（メ
チオニンも）を含めてそのアミノ酸まで伸長しており、一方、Ｔsp５０９I−Ｓp
hＩは開始点rbcＳ ＡＴＧに関し−８から、成熟ペプチドの最初のアミノ酸を含 めてそのアミノ酸まで伸長している。このように、これらのフラグメントは、選
定したプロモーター（例えば、３５Ｓ、ＰＲ−１ａ、アクチン、ユビキチンなど
）の非翻訳リーダーに対する転写融合体を生成するカセットであって、一方でト
レハロース生合成遺伝子を移行ペプチド下流の正しい融合体に挿入することを可
能とするいずれかの選定した発現カセットのポリリンカーに適宜挿入することが
できる。この種の構築物は技術上型にはまったものである。例えば、ＤraＩ末端
はすでに平坦である一方、５'Ｔsp５０９Ｉ部位はＴ４ポリメラーゼ処理により 平滑としてもよいし、あるいは選定したプロモーターに対し融合を容易にするリ
ンカーまたはアダプター配列に結合してもよい。３'ＳphＩ部位はそのまま維持 してもよいし、あるいは選択したトレハロース生合成遺伝子の次工程挿入へ向け
た利用可能な適切な制限部位を設け得るような方法で、選定したベクターへのそ
の挿入を容易にするアダプターまたはリンカー配列に結合してもよい。理想的に
は、ＳphＩ部位のＡＴＧは維持し、選択したトレハロース生合成遺伝子の最初の
ＡＴＧを含ませる。チェンおよびヤーゲンドルフ（Ｃhen ＆ Ｊagendorf）は葉 緑体移入の理想的な切断のための共通配列を提供し、各事例において成熟タンパ
ク質の最初の位置はメチオニンが好適としている。その次の位置はより変化があ
って、アミノ酸にはそれ程の限定がない。いずれの場合にも、融合構築物は、バ
ートレットら（Ｂartlettら、Ｅdelmannら編纂、葉緑体の分子生物学における方
法、エルスビアー、１０８１〜１０９１（１９８２））およびワスマンら（Ｗas
mannら、Ｍol. Ｇen. Ｇenet. ２０５：４４６〜４５３（１９８６））の方法を
用い、生体外で移入の効率について評価することができる。一般に、最善の方法
は、アミノ末端を修飾せずに選択したトレハロース生合成遺伝子を用いて融合体
を生成させ、かかる融合体が高効率で移入された葉緑体でないことが明白な場合
には修飾を組入れるだけとし、その場合、修飾は確立された文献に従い実施する
のがよい（Ｃhen ＆ Ｊagendorf；Ｗasmanら；Ｋo ＆ Ｋo、J. Ｂiol．Ｃhem. ２６７：１３９１０〜１３９１６（１９９２））。
【０１２８】 好適なベクターは、prbcＳ−８ＢからのフラグメントをエンコードするＤraＩ
−ＳphＩ移行ペプチドをクローニングベクターｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸ／Ｓph- に移入することにより構築する。このプラスミドはＥcoＲＩで切断し、その末端
はＴ４ＤＮＡポリメラーゼでの処理により平滑とする。プラスミドprbcＳ−８Ｂ
をＳphＩで切断し、アニーリングした分子アダプターに結合する。得られる産物
はＴ４キナーゼ処理により５'−末端リン酸化する。次いでＤraＩで切断すると 、上記修飾ベクターの平滑末端ex−ＥcoＲＩ部位に結合したフラグメントをエン
コードする移行ペプチドを放出する。３５Ｓプロモーターの３'末端に隣接して 挿入体の５'末端をもつように配置したクローンを配列決定により同定する。こ れらのクローンは、rbcＳ ＡＴＧに関し−５８から成熟タンパク質のＡＴＧまで
伸長しており、またその位置にユニークＳphＩ部位と新たに創製したＥcoＲＩ部
位、並びにｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸの既存ＮotＩとＸhoＩ部位とを含んでいるrb
cＳ−８Ａプロモーター移行ペプチド配列に３５Ｓリーダー配列が融合したＤＮ Ａ融合体を担持する。この新たなベクターをｐＣＧＮ１７６１／ＣＴと命名する
。ＤＮＡ配列は、ＰＣＲ技法を用い増幅し、増幅したＡＴＧにＳphＩ、ＮＳphＩ
、またはＮlaIII部位を組込み、それを適切な酵素により制限酵素切断した後、 ＳphＩ−切断したｐＣＧＮ１７６１／ＣＴに結合することにによりｐＣＧＮ１７
６１／ＣＴに枠内移入する。構築を容易にするためには、クローン化遺伝子の二
番目のアミノ酸を変更することが必要となるが、殆どすべての場合に、標準的な
部位指向突然変異誘発とともにＰＣＲを使用することで、成熟タンパク質の切断
部位と最初のメチオニン周辺に所望の配列を構築することが可能となる。
【０１２９】 さらに好適なベクターはｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸの二重３５Ｓプロモーターを
prbcＳ−８ＡのＢamＨＩ−ＳphＩフラグメントに置換えることにより構築するが
、該フラグメントは（転写開始部位に関し）−１０３８から成熟タンパク質の最
初のメチオニンまでの完全長光調節rbcＳ−８Ａプロモーターを含む。破壊した ＳphＩ部位をもつ修飾ｐＣＧＮ１７６１はＰstＩとＥcoＲＩで切断し、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼで処理して末端平滑とする。prbcＳ−８ＡをＳphＩで切断し、上
記配列のアニール化分子アダプターに結合する。得られる産物はＴ４キナーゼで
の処理により５'末端リン酸化する。次いでＢamＨＩでの切断により、フラグメ ント含有プロモーター移行ペプチドを放出するが、このフラグメントをＴ４ＤＮ
Ａポリメラーゼで処理しＢamＨＩ末端平滑とする。このように生成したプロモー
ター移行ペプチドフラグメントを、調製したｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸベクターに
クローン化し、rbcＳ−８Ａプロモーターおよび異種遺伝子挿入用の切断部位に 位置するＳphＩ部位をもつ移行ペプチドとからなる構築物を生成する。さらに、
ＳphＩ部位の下流には、ＥcoＲＩ（再創製）、ＮotＩ、およびＸhoＩクローニン
グ部位が存在する。この構築物をｐＣＧＮ１７６１rbcＳ／ＣＴと命名する。
【０１３０】 同様の技巧手法が、他の起源（単子葉類および双子葉類）からのおよび他の遺
伝子からの他のＧＳ２葉緑体移行ペプチドエンコード配列を利用するために実施
し得る。さらに、同様の手法がミトコンドリアなど他の細胞下画分の標的化を達
成するために引続き実施し得る。
【０１３１】 双子葉類用の形質転換技法は技術上周知であり、アグロバクテリウム−ベース
の技法およびアグロバクテリウムを要しない技法を包含する。非−アグロバクテ
リウム技法はプロトプラストまたは細胞による直接の外来性遺伝物質取込みから
なる。この技法はＰＥＧもしくはエレクトロポレーション取込み、粒子衝撃介在
搬入、またはマイクロインジェクションなどにより実施することができる。これ
らの技法の例は以下の文献に記載されている：Ｐaszkowskiら、ＥＭＢＯ Ｊ ３ ：２７１７〜２７２２（１９８４）；Ｐotrykusら、Ｍol. Ｇen. Ｇenet.１９９
：１６９〜１７７（１９８５）；Ｒeichら、Ｂiotechnology ４：１００１〜１ ００４（１９８６）；およびＫleinら、Ｎature ３２７：７０〜７３（１９８７
）。それぞれの事例において、形質転換細胞は技術上既知の標準技法により全植
物に再生される。
【０１３２】 アグロバクテリウム介在形質転換は、多くの異なる種での形質転換の高効率性
と広い用途の故に、双子葉類の形質転換にとって好適な技法である。アグロバク
テリウムにより常套的に形質転換可能な多くの作物種は、タバコ、トマト、ヒマ
ワリ、綿、脂肪種子アブラナ、バレイショ、大豆、アルファルファおよびポプラ
などを包含する（ＥＰ ０ ３１７ ５１１（綿（１３１３））、ＥＰ ０ ２４９
４３２（トマト、カルジーン）、ＷＯ８７／０７２９９（アブラナ、カルジーン
）、ＵＳ４，７９５，８５５（ポプラ））。アグロバクテリウム形質転換は一般
に対象の外来ＤＮＡを担持するバイナリーベクター（例えば、ｐＣＩＢ２００ま
たはｐＣＩＢ２００１）を、共存するＴｉプラスミド上または染色体に宿主アグ
ロバクテリウム株が担持するvir遺伝子の補体に依存する適切なアグロバクテリ ウム株に転移することからなる（例えば、ｐＣＩＢ２００およびｐＣＩＢ２００
１用のＣＩＢ５４２株）。組換えバイナリーベクターのアグロバクテリウムへの
転移は、組換えバイナリーベクターを担持する大腸菌、ｐＲＫ２０１３などのプ
ラスミドを担持し、組換えバイナリーベクターを標的アグロバクテリウム株に可
動化し得るヘルパー大腸菌株を用い、三親交配手法により実施する。あるいは、
組換えバイナリーベクターはＤＮＡ形質転換によりアグロバクテリウムに転移す
ることができる（Ｈoefgen ＆ Ｗillmitzer、Ｎucl.Ａcids Ｒes. １６：９８７
７（１９８８））。
【０１３３】 組換えアグロバクテリウムによる標的植物種の形質転換は、通常、アグロバク
テリウムと植物からの外植片とを同時培養することからなり、技術上周知のプロ
トコールに従う。形質転換した組織は、バイナリープラスミドＴ−ＤＮＡ境界間
に存在する抗生物質または除草剤抵抗マーカーを含む選択可能培地上で再生され
る。
【０１３４】 殆どの単子葉種の形質転換が今や常套的になっている。好適な技法は、ＰＥＧ
またはエレクトロポレーション技法によりプロトプラストへ、また粒子衝撃によ
りカルス組織へ直接遺伝子を転移する。形質転換は単一のＤＮＡ種または複数の
ＤＮＡ種（すなわち、同時形質転換）について行われ、これら技法の両方が本発
明での使用に適している。同時形質転換は複雑なベクター構築を回避し、対象遺
伝子と選択可能マーカーの未連鎖座をもつトランスジェニック植物を生成するの
に利点を有するが、所望であれば、その選択可能マーカーを後代で除去すること
が可能である。しかし、同時形質転換使用の不利な点は、個々のＤＮＡ種のゲノ
ムに組込まれる頻度が１００％未満ということである（Ｓchocherら、Ｂio tech
nology ４：１０９３〜１０９６（１９８６））。
【０１３５】 特許出願ＥＰ ０ ２９２ ４３５（チバ−ガイギー）、ＥＰ ０ ３９２ ２２５
（チバ−ガイギー）およびＷＯ９３／０７２７８（チバ−ガイギー）はトウモロ
コシの基本同系繁殖系からのカルスとプロトプラストの調製技術、ＰＥＧまたは
エレクトロポレーションを用いるプロトプラストの形質転換、および形質転換し
たプロトプラストからのトウモロコシ植物の生成につき記載している。ゴードン
−カムら（Ｇordon-Ｋamら、Ｐlant Ｃell ２：６０３〜６１８（１９９０）） およびフロムら（Ｆrommら、Ｂiotchnology ８：８３３〜８３９（１９９０））
は、粒子衝撃を用いるＡ１８８−由来トウモロコシ系統の形質転換技法につき公
開している。さらに、ＷＯ９３／０７２７８（チバ−ガイギー）出願およびコジ
ールら（Ｋozielら、Ｂiotchnology １１：１９４〜２００（１９９３））は粒 子衝撃によるトウモロコシの基本同系繁殖系の形質転換技法につき記載している
。この技法は受粉後１４〜１５日目のトウモロコシの穂から切り出した１．５〜
２．５ｍｍ長の未成熟トウモロコシ胚と衝撃用ＰＤＳ−１０００Ｈｅバイオリス
ティックス装置を利用する。
【０１３６】 コメの形質転換もまたプロトプラストを利用する直接遺伝子転移技術または粒
子衝撃により実施することができる。プロトプラスト介在形質転換はジャポニカ
型およびインディカ型について記載されている（Ｚhangら、Ｐlant Ｃell Ｒep
７：３７９〜３８４（１９８８）；Ｓhimamotoら、Ｎature ３３８：２７４〜２
７７（１９８９）；Ｄattaら、Ｂiotechnology ８：７３６〜７４０（１９９０ ））。両型ともに粒子衝撃により常套的に形質転換し得る（Ｃhristouら、Ｂio
technology ９：９５７〜９６２（１９９１））。
【０１３７】 特許出願ＥＰ ０ ３３２ ５８１（チバ−ガイギー）はプーイデエ（Ｐooideae
）プロトプラストの生成、形質転換および再生のための技法につき記載している
。これらの技法はダクチリス（Ｄactylis）およびコムギの形質転換を可能とす る。さらにコムギの形質転換については、バシルら（Ｖasilら、Ｂiotechnology
１０：６６７〜６７４（１９９２））が、Ｃ型長期再生可能なカルスの細胞に 向けて粒子衝撃を用いること、また、バシルら（Ｖasilら、Ｂiotechnology １ １：１５５３〜１５５８（１９９３））およびウイークスら（Ｗeeksら、Ｐlant
Ｐhysiol. １０２：１０７７〜１０８４（１９９３））が未成熟胚と未成熟胚 誘導カルスの粒子衝撃を用いることについて記載した。しかし、コムギ形質転換
の好適な技法は未成熟胚の粒子衝撃によるコムギの形質転換からなり、遺伝子搬
入に先立つ高スクロースもしくは高マルトース工程のいずれかを含む。衝撃に先
立ち、いくつもの胚（０．７５〜１ｍｍ長）を、３％スクロースと暗所での進行
を可能とする体細胞胚誘導のための２，４−Ｄ３ｍｇ／Ｌを含むＭＳ培地（Ｍur
ashigeおよびＳkoog、Ｐhysiologia Ｐlantarum １５：４７３〜４９７（１９６
２））上に塗付する。選定した衝撃日に、誘導培地から胚を取出し、浸透培地（
すなわち、所望の濃度、一般には１５％濃度でスクロースまたはマルトースを添
加した誘導培地）上に置く。胚を２〜３時間原形質分離させ、次いで衝撃処理す
る。標的プレート当たり２０個の胚が典型的であるが、絶対的ではない。標準手
法を用い、適当な遺伝子担持プラスミド（例えば、ｐＣＩＢ３０６４またはｐＳ
Ｇ３５）をマイクロメーターサイズの金粒子上に沈着させる。デュポン・バイオ
リスティック（登録商標）ヘリウム装置により標準８０メッシュスクリーンを用
いる〜１０００psiのバースト圧で胚の各プレートをショットする。衝撃処理後 、胚を暗所に戻し、約２４時間（なお浸透培地上）回復させる。２４時間後、胚
を浸透培地から取出し、誘導培地上に戻し、再生させるまで、そこで約１ヵ月留
める。約１ヶ月後、胚形成途上カルスをもつ胚外植片を再生培地（ＭＳ＋１ｍｇ
／ＬのＮＡＡ，５ｍｇ／ＬのＧＡ；さらに適切な選択剤、ｐＣＩＢ３０６４の場
合は１０ｍｇ／Ｌのバスタ、また、ｐＳＯＧ３５の場合は２ｍｇ／Ｌのメソトレ
キセートを含む）に移す。約１ヵ月後、発生した苗条を「ＧＡ７ｓ」として知ら
れる大型の無菌容器に移すが、該容器は半濃度のＭＳ、２％スクロース、および
同じ濃度の選択剤を収容している。ＥＰ特許出願０ ６７４ ７１５はコムギの形
質転換法につき記載しているが、本出願を参照により本明細書に取込む。
【０１３８】 トウモロコシ由来の３種のヌクレオチド配列を記載する（実施例３２）。これ
らのヌクレオチド配列は、ブラスト（ＢＬＡＳＴ）サーチ（ＢＬＡＳＴＮ２．０
．７（Ｄec−２１−１９９８）Ａltschulら（１９９７）、Ｎucleic Ａcids Ｒe
s. ２５：３３８９〜３４０２）により比較した場合、高い共有度スコアとＤＮ Ａおよびタンパク質レベルで他のトレハロースリン酸シンターゼに有意な相同性
を示す。
【０１３９】 トウモロコシｃＤＮＡライブラリーを選抜するためのプローブとして使用され
たフラグメントＢｅ３は、例えば、酵母トレハロースリン酸シンターゼ（ＴＰＳ
１、寄託番号Ｑ００７６４）に対し、塩基５１９と１の間のアミノ酸レベルで相
同性６０％、塩基８３１と４６３の間で相同性５８％を示すが、いずれも酵母遺
伝子に対し逆の方向においてである。また、Ｂｅ３はアラビドプシス・トレハロ
ースシンターゼ（受託番号Ｙ０８５６８）に対し、塩基４７１と１の間のアミノ
酸レベルで相同性８９％、塩基８３０と４６２の間で相同性８４％を示すが、い
ずれもアラビドプシス遺伝子に対し逆の方向においてである。
【０１４０】 クローン４．１１は、クローン４．１１の塩基４と１２９（Ｂｅ３の塩基７０
６ないし８３１）間のヌクレオチドレベルでＢｅ３に殆ど一致する（４個のミス
マッチ）。クローン６はクローン６の塩基４と２１８（Ｂｅ３の塩基１０ないし
２２４）間のヌクレオチドレベルで、Ｂｅ３に比較した逆方向においてＢｅ３に
殆ど一致する（９個のミスマッチ）。クローン９はクローン９の塩基４と９５（
Ｂｅ３の塩基４４７ないし５６８）間のヌクレオチドレベルでＢｅ３に殆ど一致
する（１個のミスマッチ）。
【０１４１】 クローン４．１１は１６８６ｂｐの長さがあり、１４１３塩基対の予測された
部分コーディング配列を含んでなる。クローン６は１５５８ｂｐの長さがあり、
１０９２ｂｐの予測された完全長コーディング配列を含んでなる。クローン９は
７３５ｂｐの長さがあり、７３５ｂｐの予測された部分コーディング配列を含ん
でなる。
【０１４２】 クローン４．１１およびクローン６はヌクレオチドレベルで４４８と１６００
位置間（クローン４．１１）および３００と１４３９位置間（クローン６）で殆
ど一致する。
【０１４３】 クローン４．１１は、例えば、酵母ＴＰＳ１に対し５５％のアミノ酸同一性（
塩基４ないし２７９）、大腸菌ＯtsＡに対し４４％の同一性（塩基４ないし２８
２）、およびアラビドプシス・トレハロースリン酸シンターゼに対し７６％のア
ミノ酸同一性（塩基４ないし１０４７）と５９％のアミノ酸同一性（塩基１２４
０ないし１３７１）を有する。クローン６は、例えば、アスペルギルス・トレハ
ロースリン酸シンターゼに対し６３％のアミノ酸同一性（逆方向の塩基３ないし
３１１）、酵母ＴＰＳ１に対し４６％のアミノ酸同一性（逆方向の塩基２９３な
いし３）、およびアラビドプシス・トレハロースリン酸シンターゼに対し６７％
のアミノ酸同一性（塩基３００ないし９９８）と８６％のアミノ酸同一性（逆方
向の塩基３ないし３０２）を有する。クローン９は酵母ＴＰＳ１遺伝子に対し６
１％のアミノ酸同一性（塩基４ないし９６）およびアラビドプシス・トレハロー
スリン酸シンターゼに対し８０％のアミノ酸同一性（塩基４ないし９６）を有す
る。
【０１４４】 本発明をさらに以下の詳細な実施例に参照して説明する。これらの実施例は説
明のみの目的で提供されるものであって、特に特定しない限り、限定することを
意図するものではない。
【０１４５】 （実施例） Ａ．植物サイトソルにおけるトレハロース−６−リン酸シンターゼおよびトレハ
ロース−６−リン酸ホスファターゼ遺伝子の発現 実施例１：タバコＰＲ−１ａプロモーターに融合した大腸菌トレハロース−６−
リン酸シンターゼ遺伝子含有キメラ遺伝子の調製 二重３５Ｓプロモーターの制御下にあって、かつ、tml３'ポリアデニル化シグ
ナルに融合した大腸菌トレハロース−６−リン酸シンターゼ遺伝子（ＯtsＡ、Ｋ
aasenら（１９９４）Ｇene １４５（１）、９〜１５、ＥＭＢＬ／ジェンバンク 寄託番号Ｘ６９１６０）のコーディング配列を含むプラスミドｐＣＧＮ４４６７
（カルジーンから受領、デービス、ＣＡ）（ｐＣＧＮ４４６７はｐＣＧＮ１７６
１の誘導体である；ＥＰ０３９２２２５）をＰＣＲの鋳型として使用し、ともに
使用するプライマーは、左から右への「上部鎖」プライマーが、ＧＣＣコドンが
先行したＡＴＧと、また、その後に新たに加えられたＧＣＡコドンとを含み、そ
の結果としてＡＴＧにＮcoＩ制限部位を形成し、また、ＯtsＡ遺伝子の最初の２
４塩基からなり（プライマーＴＲＥＡ＋：ＧＴＣ ＡＧＣ ＣＡＴ ＧＧＣ ＡＡＧ
ＴＣＧ ＴＴＴ ＡＧＴ ＣＧＴ ＡＧＴ ＡＴＣ ＴＡＡ Ｃ；配列番号１）、右か
ら左への「下部鎖」プライマーは新たなＡＴＧの下流３９２ないし４１６位置に
相同である（プライマーＴＲＥＡ−：ＧＣＡ ＡＡＴ ＧＧＣ ＡＡＣ ＡＧＧ Ｔ ＧＡ ＴＡＡ ＴＣＧ；配列番号２）。このＰＣＲ反応はＡmpliＴaqＤＮＡポリメ
ラーゼにより製造業者の推奨（パーキン・エルマー／ロッシュ、ブランチバーグ
、ＮＪ）に従い、９４℃（３０秒）、４０℃（６０秒）および７２℃（３０秒）
で５サイクル、次いで９４℃（３０秒）、５５℃（６０秒）および７２℃（３０
秒）で２５サイクル実施し、これにより左末端にＮcoＩ部位を、また、右末端に
ＢamＨＩ部位を含む４２３ｂｐの産物を生成させた。このフラグメントを標準手
法によりゲル精製し、ＮcoＩおよびＢamＨＩで切断し（制限酵素はすべてプロメ
ガから購入する；マディソン、ＷＩ）、次いでｐＵＣ２１のＮcoＩおよびＢamＨ
Ｉの部位に結合し、ｐＵＣＯＴＳＡを得る；ｐＵＣ２１は以下の制限部位をもつ
ポリリンカー含有のｐＵＣ誘導体である：ＳpeＩ／ＳtuＩ／ＸhoＩ／ＢglII／Ｃ
laＩ／ＮsiＩ／ＳphＩ／ＮcoＩ／ＫpnＩ／ＸmaＩ／ＳmaＩ／ＳacＩ／ＥcoＲＩ／
ＢstＩＢＩ／ＨindIII/ＰstＩ／ＭluＩ／ＳalＩ／ＡatII／ＮdeＩ／ＢamＨＩ／ ＥcoＲＶ／ＮotＩ／ＥagＩ／ＸbaＩ／ＳpeＩ。
【０１４６】 ｐＵＣＯＴＳＡを次いでＳpeＩおよびＢamＨＩで消化し、ＯtsＡ遺伝子の５' 末端を含む４００ｂｐフラグメントをゲル精製し、次いで予めＸbaＩおよびＢam
ＨＩで消化したｐＣＧＮ４４６７と結合し、全ＯtsＡ遺伝子を含むｐＣＧＮＯＴ
ＳＡを得る。プラスミドｐＣＧＮＯＴＳＡをＮcoＩとＳacＩで消化し、ＯtsＡ遺
伝子を含む１．４ｋｂの長さのフラグメントをゲル精製し、９０３ｂｐの長さの
タバコＰＲ−１aプロモーターとnos遺伝子終止シグナルとの間でｐＪＧ２０３の
ＮcoＩとＳacＩ部位に結合する（Ｕknesら（１９９３）Ｔhe Ｐlant Ｃell ５：
１５９〜１６９）。プラスミドｐＪＧ２０３はＧＵＳ遺伝子に融合した９０３ｂ
ｐの長さのタバコＰＲ−１aプロモーターとnosポリアデニル化シグナルとを含ん
でなるｐＢＳＧus１．２（Ｕknesら（１９９３）Ｔhe Ｐlant Ｃell ５：１５９
〜１６９）の誘導体である。ｐＪＧ２０３において、nosポリアデニル化シグナ ル末端の第二ＳacＩ部位は、ＳacＩでの部分消化により除き、突出末端を充填し
て再結合する。タバコＰＲ−１aプロモーターに融合したＯtsＡ遺伝子を含むプ ラスミドｐＰＲ１ＯＴＳＡはこのようにして得られる。
【０１４７】 実施例２：タバコＰＲ−１aプロモーターに融合した大腸菌トレハロース−６− リン酸ホスファターゼ遺伝子を含むキメラ遺伝子の調製 二重３５Ｓプロモーターの制御下にあって、かつ、tml３'ポリアデニル化シグ
ナルに融合した大腸菌トレハロース−６−リン酸ホスファターゼ遺伝子（ＯtsＢ
、Ｋaasenら（１９９４）Ｇene １４５（１）、９〜１５、ＥＭＢＬ／ジェンバ ンク寄託番号Ｘ６９１６０）を含むプラスミドｐＣＧＮ４４５２（カルジーンか
ら受領、デービス、ＣＡ）をＰＣＲの鋳型として使用し、ともに使用するプライ
マーは、左から右への「上部鎖」プライマーが原ＧＴＧ開始コドンの前に新たに
創製したＡＴＧを含み、かつＧＣＣコドンが先行し、その結果としてＡＴＧにＮ
coＩ制限部位を形成し、さらにＯtsＡ遺伝子の最初の２３塩基を含み（プライマ
ーＴＲＥＡ＋：ＧＴＣ ＡＧＣ ＣＡＴ ＧＧＴ ＧＡＣ ＡＧＡ ＡＣＣ ＧＴＴ Ａ
ＡＣ ＣＧＡ ＡＡＣ；配列番号３）、右から左への「下部鎖」プライマーは新た
なＡＴＧの下流１８１ないし２０５位置に相同である（プライマーＴＲＥＡ−：
ＧＴＧ ＣＧＴ ＣＡＡ ＧＣＴ ＣＣＡ ＣＣＡ ＴＴＧ ＡＧＣ；配列番号４）。 このＰＣＲ反応はＡmpliＴaqＤＮＡポリメラーゼにより製造業者の推奨（パーキ
ン・エルマー／ロッシュ、ブランチバーグ、ＮＪ）に従い、９４℃（３０秒）、
４０℃（６０秒）および７２℃（３０秒）で５サイクル、次いで９４℃（３０秒
）、５５℃（６０秒）および７２℃（３０秒）で２５サイクル実施し、これによ
り左末端にＮcoＩ部位を、また、右末端にＥcoＲＶ部位を含む２１２ｂｐの産物
を生成させた。このフラグメントを標準手法によりゲル精製し、ＮcoＩおよびＥ
coＲＶで切断し、ｐＵＣ２１のＮcoＩとＥcoＲＶ部位に結合してｐＵＣＯＴＳＢ
を得る。
【０１４８】 プラスミドｐＵＣＯＴＳＢを次いでＳpeＩおよびＥcoＲＶで消化し、ＯtsＢ遺
伝子の５'末端を含む２１０ｂｐフラグメントをゲル精製し、次いで予めＸbaＩ およびＥcoＲＶで消化したｐＣＧＮ４４６７と結合し、全ＯtsＢ遺伝子を含むｐ
ＣＧＮＯＴＳＢを得る。プラスミドｐＣＧＮＯＴＳＢをＮcoＩとＳacＩで消化し
、ＯtsＢ遺伝子を含む０．８ｋｂの長さのフラグメントをゲル精製し、９０３ｂ
ｐの長さのタバコＰＲ−１aプロモーターとnos遺伝子終止シグナルとの間でｐＪ
Ｇ２０３のＮcoＩとＳacＩ部位に結合し、タバコＰＲ−１aプロモーターに融合 したＯtsＢ遺伝子を含むｐＰＲ１ＯＴＳＢを得る。
【０１４９】 実施例３：タバコＰＲ−１aプロモーターに融合したＯtsＡ遺伝子とタバコＰＲ −１aプロモーターに融合したＯtsＢ遺伝子を含むバイナリーベクターの調製 プラスミドｐＰＲ１ＯＴＳＡをＸhoＩで消化し、突出末端をクレノーＤＮＡポ
リメラーゼ（プロメガ、マディソン、ＷＩ）で充填し、さらにＳpeＩで消化する
。得られる２．６ｋｂの長さのフラグメントをゲル精製し、ｐＰＲ１ＯＴＳＢの
充填したＥcoＲＩ部位とＳpeＩ部位に結合し、タバコＰＲ−１aプロモーターに 融合したＯtsＡ遺伝子とタバコＰＲ−１aプロモーターに融合したＯtsＢ遺伝子 とを含むｐＰＲ１０ＴＳＡＢを得る。
【０１５０】 プラスミドｐＰＲ１ＯＴＳＡＢをＡpaＩとＸbaＩで消化し、タバコＰＲ−１a プロモーターに融合したＯtsＡ遺伝子とタバコＰＲ−１aプロモーターに融合し たＯtsＢ遺伝子とを含む４．６ｋｂの長さのフラグメントをゲル精製し、ｐＢＨ
ＹＧＭのＡpaＩとＸbaＩ部位に結合してバイナリーベクターｐＥＧＬ５０２を得
る（ｐＢＨＹＧＭは、ＢfrＩ／ＡpaＩ／ＣlaＩ／ＳmaＩ／ＢfrＩ／ＸbaＩ／Ｓal
Ｉ／ＰstＩ／ＳphＩ／ＨindIII制限部位を含むポリリンカーをｐＧＰＴＶ−Ｈyg
（Ｂeckerら（１９９２）Ｐlant Ｍol.Ｂiol.２０：１１９５〜１１９７）のＥc
oＲＩとＸbaＩ部位に挿入することにより調製した修飾ｐＧＰＴＶ−Ｈygベクタ ーである）。
【０１５１】 実施例４：タバコＰＲ−１aプロモーターに融合したＯtsＡ遺伝子を含むバイナ リーベクターの調製 プラスミドｐＰＲ１ＯＴＳＡをＡpaＩとＸbaＩで消化し、タバコＰＲ−１aプ ロモーターに融合したＯtsＡ遺伝子を含む２．６ｋｂの長さのフラグメントをゲ
ル精製し、ｐＢＨＹＧＭのＡpaＩとＸbaＩ部位に結合して、タバコＰＲ−１aプ ロモーターに融合したＯtsＡ遺伝子を含むバイナリーベクターを得る。
【０１５２】 実施例５：タバコＰＲ−１aプロモーターに融合したＯtsＢ遺伝子を含むバイナ リーベクターの調製 プラスミドｐＰＲ１ＯＴＳＢをＡpaＩとＸbaＩで消化し、タバコＰＲ−１aプ ロモーターに融合したＯtsＢ遺伝子を含む２．０ｋｂの長さのフラグメントをゲ
ル精製し、ｐＢＨＹＧＭのＡpaＩとＸbaＩ部位に結合して、タバコＰＲ−１aプ ロモーターに融合したＯtsＢ遺伝子を含むバイナリーベクターを得る。
【０１５３】 実施例６：アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．tumefaciens）による タバコ葉盤の形質転換 バイナリーベクター構築物をＡ．ツメファシエンス株ＧＶ３１０１（Ｂechtol
d、 Ｎ．ら（１９９３）ＣＲ Ａcad. Ｓci. Ｐaris、Ｓciences de la vie、３ １６：１１９４〜１１９９）にエレクトロポレーション（Ｄower，Ｗ．Ｊ．（１
９８７）Ｍol.Ｂiol.Ｒep.１：５）により形質転換する。タバコｃｖ‘Ｘanthi
nc’の葉盤およびサリチル酸ヒドロキシラーゼ遺伝子を過発現するトランスジェ
ニック「ＮahＧ」の葉盤（Ｇaffneyら（１９９３）Ｓcience ２６１：７５４〜 ７５６）を上記構築物含有のアグロバクテリウムクローン（Ｈorschら（１９８ ５）Ｓci ence ２２７：１２２９〜１２３１）と同時培養し、形質転換体をハイ
グロマイシンＢ５０ｍｇ／ｍｌに対する抵抗性により選択する。各構築物につき
約５０種の独立ハイグロマイシン系統（Ｔｏ系）が選択され、無ホルモン培地に
定着させる。
【０１５４】 実施例７：誘導可能トレハロース生合成遺伝子発現性を有するトランスジェニッ
ク系統の選択 各トランスジェニック系統について、約２〜３ｃｍ2の葉パンチを３ｍｌのベ ンゾ（１，２，３）チアジアゾール−７−カルボチオン酸Ｓ−メチルエステル（
ＢＴＨ、５．６ｍｇ／１０ｍｌ）中に約３００ｍｍｏｌ／ｍ-2ｓ-1の発光源下に
２日間培養する。葉材料を収獲し、さっと凍結し、液体窒素中で粉砕する。総Ｒ
ＮＡを抽出し（Ｖerwoerdら（１９８９）ＮＡＲ１７：２３６２）、ＯtsＡおよ びＯtsＢ遺伝子に特異的な放射標識プローブを用い記載（Ｗardら（１９９１） Ｔhe Ｐlant Ｃell ３：１０８５〜１０９４）どおりにノーザンブロット分析を
実施する。トランスジェニック系統の内、化学誘導剤の存在下にトレハロース生
合成遺伝子を高度に誘導発現性し得るものであって、化学誘導剤の不存在下では
バックグランド発現の低いものを選択する。特に、２種のトランスジェニック系
はＮ５とＮ６および自家受粉したものを選択し、それらの子孫をさらなる分析に
使用する。
【０１５５】 実施例８：トウモロコシの形質転換 トウモロコシの形質転換に使用した方法は、未成熟胚の細胞への粒子衝撃によ
るもので、コジールら（Ｋozielら、Ｂiotechnology１１：１９４〜２００（１ ９９３））が記載している。本明細書に記載した少なくとも１種のプラスミドに
よるトウモロコシの形質転換は、未成熟接合体胚または連続繁殖可能なＩ型胚形
成性カルスのミクロ投射衝撃により達成する。
【０１５６】 所有する遺伝子型ＣＧ００５２６およびＣＧ００７１４のＩ型胚形成性カルス
の培養（Ｇreenら、マイアミ冬期シンポジウム２０、１９８３）は、温室栽培材
料からの未成熟胚（長さ１．５〜２．５ｍｍ）から開始する。胚は受粉約１４日
後の表面滅菌した穂から無菌的に切り出す。ＣＧ００５２６の胚は２％スクロー
スと５ｍｇ／Ｌのクロランベン（chloramben）含有のＤカルス開始培地上に置き
（Ｄuncanら、Ｐlant １６５：３２２〜３３２（１９８５））、一方、ＣＧ００
７１４の胚は３％スクロースと０．７５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ含有のＫＭカルス
開始培地上に置く（ＫaoおよびＭichayluk、Ｐlant １２６：１０５〜１１０（ １９７５））。胚および胚形成性培養物は次いで暗所で培養する。約１４日後、
胚形成性応答物を外植片から除く。ＣＧ００５２６応答物は２％スクロースと０
．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ含有のＫＭカルス維持培地に置き、一方、ＣＧ００７
１４の応答物は２％スクロースと５ｍｇ／Ｌのディカンバ（Ｄicamba）含有のＫ
Ｍカルス維持培地に置く。新たな維持培地に対する週ごとの選択継代培養の３〜
８週間後、高品質の緊密な胚形成性培養物を確立する。活発に増殖する胚形成性
カルス片を遺伝子搬入用標的組織として選択する。遺伝子搬入の約４時間前に１
２％スクロース含有維持培地を含む標的プレート上にカルス片を塗付する。カル
ス片を標的プレートの中心から半径８および１０ｍｍの円形に並べる。
【０１５７】 デュポン・バイオリスティックス・マニュアル記載どおりに金ミクロキャリヤ
ー上にプラスミドＤＮＡを沈着させる。各プラスミド２〜３μｇを各６ショット
ミクロ担体調製品に使用する。ＰＤＳ−１０００Ｈｅバイオリスティックス装置
により遺伝子を標的組織細胞に搬入する。バイオリスティックス装置の設定は以
下のとおりである：破裂板とマクロキャリヤーの間８ｍｍ、マクロキャリヤーと
停止スクリーンの間１０ｍｍ、および停止スクリーンと標的の間７ｃｍ。各標的
プレートは６５０ｐｓｉの破裂板を用い、２回ショットする。２００×２００ス
テンレス網（マックマスター−カー、ニューブルンスイック、ＮＪ）を停止スク
リーンと標的組織の間に置く。
【０１５８】 遺伝子搬入７日後に、標的組織片を高浸透培地から高レベル選択培地に移す。
すべてのアミノ酸を選択培地から除く。これら高レベル選択培地上５〜８週間後
、ＣＧ００５２６から増殖するカルスを低レベルないし中レベルの培地に継代培
養する。
【０１５９】 原標的組織片からの選択に対し生存する組織を単一コロニーとして継代培養し
、独立形質転換事象と命名する。
【０１６０】 その時点で、選択培地上選択されたコロニーを３％スクロース含有修飾ＭＳ培
地（ＭＳ３Ｓ）（選択剤不含）（ＭurashigeおよびＳkoog、Ｐhysiologia Ｐlan
t arum １５：４７３〜４９７（１９６２））に移し、明所に置く。ＣＧ００５ ２６については、０．２５ｍｇ／Ｌのアンシミドール（ancymidol）と０．５ｍ ｇ／Ｌのキネチン（kinetin）とをこの培地に加え、胚発芽を誘導するが、一方 、ＣＧ００７１４については、２ｍｇ／Ｌのベンジルアデニンを添加する。
【０１６１】 ２週間後に、再生するコロニーをアンシミドールおよびキネチンまたはベンジ
ルアデニンを含まないＭＳ３S培地に移す。すべてのコロニーから根のあるまた はない再生苗条をＭＳ３Ｓ培地収容のマゼンタボックスに移し、根をもつ小植物
を最終的に回収し、温室内の土壌に移植する。
【０１６２】 標準的培養技法を用い、形質転換事象を未成熟接合子胚から得られたＩ型カル
スにより形成させる。遺伝子搬入のために、約３００ｍｇのＩ型カルスを遺伝子
搬入の１〜２日前に、新たな培地に対する継代培養により調製し、標的組織片を
選択し、それらを再度１２％スクロース含有培地上、標的プレートの中心から１
０ｍｍのところに環状に置く。約４時間後、該組織にＰＤＳ−１０００Ｈｅバイ
オリスティックス装置（デュポン）により衝撃処理する。デュポンの標準プロト
コールを用い、１μｍ金粒子上にプラスミドを沈着させる。遺伝子は６５０ｐｓ
ｉで標的プレート当たり２ショット用いて搬入する。遺伝子搬入約１６時間後に
、カルスを２％スクロース含有の標準培地（選択剤不含）に移す。遺伝子搬入の
１２または１３日後に、標的組織片をバスタまたはバイラホス（bialaphos）と してホスフィノスリシン４０ｍｇ／Ｌを含む選択培地に移す。カルスを１２〜１
６週間選択培地上継代培養し、その後生存し、かつ、増殖するカルスを標準再生
培地に移す。
【０１６３】 実施例９：コムギの形質転換 粒子衝撃法を用いる未成熟胚および未成熟胚誘導カルスの形質転換についてバ
シルら（Ｖasilら、Ｂiotechnology １１：１５５３〜１５５８（１９９３）） およびウイークスら（Ｗeeksら、Ｐlant Ｐhysiol. １０２：１０７７〜１０８ ４（１９９３））が記載している。
【０１６４】 好適なコムギの形質転換技法は未成熟コムギ胚の粒子衝撃からなり、遺伝子搬
入に先立って高スクロースまたは高マルトース工程のいずれかを含む。衝撃処理
に先立ち、胚（長さ０．７５〜１ｍｍ）を、３％スクロースと暗所で体細胞胚の
誘導進行を可能とする２，４−Ｄ３ｍｇ／Ｌを含むＭＳ培地（Ｍurashigeおよび
Ｓkoog、１９６２）上に何度か塗付する。衝撃の選定日に、誘導培地から胚を取
出し、浸透培地（すなわち、所望の濃度、一般には１５％濃度でスクロースまた
はマルトースを添加した誘導培地）上に置く。胚を２〜３時間原形質分離させ、
次いで衝撃処理する。標的プレート当たり２０個の胚が典型的であるが、絶対的
ではない。標準手法を用い、適当な遺伝子担持プラスミドをマイクロメーターサ
イズの金粒子上に沈着させる。デュポン・バイオリスティック・ヘリウム装置に
より標準８０メッシュスクリーンを用いる〜１０００psiのバースト圧で胚の各 プレートをショットする。衝撃処理後、胚を暗所に戻し、約２４時間（なお浸透
培地上）回復させる。２４時間後、胚を浸透培地から取出し、誘導培地上に戻し
、再生させるまで、そこで約１ヵ月留める。約１ヶ月後、胚形成途上カルスをも
つ胚外植片を再生培地（ＭＳ＋１ｍｇ／ＬのＮＡＡ，５ｍｇ／ＬのＧＡ；さらに
適切な選択剤を含む）に移す。約１ヵ月後、発生した苗条をＧＡ７ｓとして知ら
れる大型の無菌容器に移すが、該容器は半濃度のＭＳ、２％スクロース、および
同じ濃度の選択剤を収容している。ＥＰ特許出願０ ６７４ ７１５にはコムギの
安定な形質転換法が詳細に記載されている。
【０１６５】 実施例１０：コメの形質転換 ジャポニカ米種「タイペイ３０９」の乳白色内乳をもつ未成熟小穂の外皮を除
き、その表面を７０％（ｖ／ｖ）エタノールで１分間、６％次亜塩素酸カルシウ
ムで２０分間滅菌し、次いで滅菌蒸留水で３回すすぐ。単離した未成熟胚を３％
スクロースおよび２ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）
とを含む０．３５％アガロース固化ＭＳ培地（ＭurashigeおよびＳkoog、１９６
２）（ｐＨ５．８）上、２８℃で培養する。１週間後、胚盤から生成したカルス
物質を分割し、１週間ごとに新たな培地に移して培養する。開始から４週間後、
２０ｍｌのＲ２−培地（Ｒ２塩およびビタミン類（Ｏhiraら、１９７３）、１ｍ
ｇ／Ｌの２，４−Ｄ、５００ｍｇ／Ｌの２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥ
Ｓ）、３％スクロース、ｐＨ５．８）を容れた５０ｍｌ培養容器に３〜４個のカ
ルスを移す。培養物は２２０ｒｐｍのロータリーシェーカー上、ほの暗い光の中
、２８℃で維持し、培地は等量の新たな培地で１週間ごとに取り替える。迅速に
分割して、砕け易いカルスを選択、澄明なカルス懸濁液２ｍｌを２０ｍｌのＲ２
−培地に移すことにより、新たな容器内で継代培養する。
【０１６６】 予め３〜４日継代培養した２〜３ヵ月経過の培養物を衝撃用標的細胞として使
用する。粒子衝撃の４時間前に、約５００ｍｇの細胞を、５．５ｃｍ径のペトリ
皿に容れた０．３５％アガロース固化原形質分離培地（Ｒ２塩およびビタミン類
、１ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３％スクロース、０．５Ｍスクロース、ｐＨ５．８
）上、直径２ｃｍの単層として展開する。
【０１６７】 粒子流入ガン（Ｆineら、１９９２）を用い、ＤＮＡ被覆金粒子（アルドリッ チカタログ＃３２，６５８−５、球状金粉、１．５〜３．０μｍ）を胚形成懸濁
細胞に搬入する。粒子のコーティングは実質的にベインら（１９９３）記載のと
おりに実施する：５μｌ分量のプラスミド溶液を０．５ｍｌ用量反応管に分配し
、氷上に置く。粒子を９６％エタノール中１００ｍｇ／ｍｌで懸濁し、２分間ボ
ルテックスする。エタノールを等用量の無菌蒸留水と置換え、懸濁液を１分間ボ
ルテックスする。この工程はもう一度繰返さなければならない。最後に、粒子を
無菌蒸留水に１００ｍｇ／ｍｌ濃度で再懸濁する。粒子懸濁液２５μｌをＤＮＡ
分割液それぞれに加え、チューブを１分間ボルテックスし、次いで直ちに無菌の
氷冷ＣａＣｌ2（２．５Ｍ蒸留水液）２５μｌを添加し、さらに１分間ボルテッ クスする。無菌のスペルミジン（０．１Ｍ蒸留水液）１０μｌを添加し、懸濁液
を再度ボルテックスし、５分間氷上に置き、その間に粒子が沈降する。粒子を含
まない上清５０μｌを除き、残りの懸濁液（１５μｌ）を５回の衝撃処理に使用
する。各衝撃処理に先立って、粒子は十分なピペッティングにより再懸濁する必
要がある。
【０１６８】 細胞を５００μｍメッシュの隔壁で被い、粒子を容れたフィルターユニットの
下１４ｃｍに位置させる。粒子を部分的減圧（２×１０4Ｐａ）下、単回の５０ ミリ秒の８バール圧パルスにより放出する。
【０１６９】 上記形質転換ベクターの１つにつき衝撃処理の２４時間後、細胞を、適当な選
択剤、例えば、３０ｍｇ／Ｌのパロマイシン含有０．３％アガロース固化選択カ
ルス増大培地Ｒ２Ｉ（Ｒ２塩、１ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、１ｍｇ／Ｌのチアミン
ＨＣｌ、５００ｍｇ／ＬのＭＥＳ、６％スクロース、ｐＨ５．８）上に移し、暗
所に３週間、立体顕微鏡下にパロマイシン抵抗（ＰamR）コロニーが見えるよう になるまで、２８℃に維持する。ＰamRコロニーを４０ｍｇ／Ｌパロマイシン含 有の新鮮Ｒ２Ｉ培地に移し、暗所にて培養する（週ごとに継代培養）。２週間後
、ＰamRコロニーを４０ｍｇ／Ｌパロマイシン含有０．５％アガロース固化Ｒ２ Ｉに移し、暗所にて１週間培養する。再生のために、次いでコロニーを０．８％
アガロース固化苗条誘導培地（Ｒ２Ｒ：Ｒ２塩、ＭＳビタミン、２％スクロース
、３％ソルビトール、１ｍｇ／Ｌゼアチン（zeatin）、０．５ｍｇ／ＬのＩＡＡ
、４０ｍｇ／Ｌパロマイシン）上に移し、苗条が形成されるまで明所にて培養す
る。並行して、カルス物質を４０ｍｇ／Ｌパロマイシン含有Ｒ２Ｉ培地に維持し
、同型細胞質体細胞系を得るために、週ごとの継代培養により暗所で培養する。
【０１７０】 Ｂ．植物色素体中でのトレハロース−６−リン酸シンターゼおよびトレハロース
−６−リン酸ホスファターゼ遺伝子の発現Ｂ１．誘導可能な発現 実施例１１：色素体ゲノムへの相同組換え用ベクターｐＡＴ２３６の構築 タバコ色素体ゲノムのtrnＶおよびrps１２／７遺伝子間領域を相同組換えによ
りキメラ遺伝子の挿入用に修飾する。１．７８ｋｂ領域（１３９２５５ないし１
４１０３６位置、Ｓhinozakiら（１９８６）ＥＭＢＯ Ｊ．５：２０４３〜２０ ４９）をタバコ色素体ゲノムからＰＣＲ増幅し、ＰstＩ部位を１４０１６９位置
の後に挿入し、ＰstＩ挿入部位の５'および３'に９１５ｂｐと８６７ｂｐのフラ
ンキング色素体ＤＮＡを生成させる。ＰＣＲ増幅（Ｐfu Ｔurbo ＤＮＡポリメラ
ーゼ、ストラタジーン、ラホーラ、ＣＡ）は１３９２５５位置の前のＢsiＥＩ部
位（５'−ＴＡＡ ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＧＣ ＣＣＡ ＡＴＣ ＡＴＴ ＣＣＧ ＧＡＴ
Ａ−３'；配列番号５）および１４０１６９位置の後のＰstＩ部位（５'−ＴＡＡ
ＣＴＧ ＣＡＧ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＧＣ ＣＣＧ ＧＣＴ ＣＣＡ Ａ−３'；配列番
号６）を挿入するプライマー対により実施する。ＰＣＲ増幅はまた１４０１７０
位置の前のＰstＩ部位（５'−ＣＧＣ ＣＴＧ ＣＡＧ ＴＣＧ ＣＡＣ ＴＡＴ Ｔ ＡＣ ＧＧＡ ＴＡＴ Ｇ−３'；配列番号７）および１４１０３６位置の後のＢsi
ＷＩ部位（５'−ＣＧＣ ＣＧＴ ＡＣＧ ＡＡＡ ＴＣＣ ＴＴＣ ＣＣＧ ＡＴＡ ＣＣＴ Ｃ−３'；配列番号８）を挿入するプライマー対によっても実施する。Ｐ
stＩ−ＢsiＥＩフラグメントをピーブルースクリプト（pＢlue script）ＳＫ＋ （ストラタジーン）のＰstＩ−ＳacII部位に挿入してｐＡＴ２１６とし、また、
ＰstＩ−ＢsiＷＩフラグメントをピーブルースクリプトＳＫ＋のＰstＩ−Ａcc６
５Ｉ部位に挿入し、ｐＡＴ２１５とする。ＰＡＴ２１８はキメラ遺伝子と選択性
マーカーの挿入用ＰstＩ部位をもつ１．７８ｋｂの色素体ＤＮＡを含み、ｐＡＴ
２１５の２．０ｋｂ ＰstＩ−ＳcaＩフラグメントとｐＡＴ２１６の２．７ｋｂ ＰstＩ−ＳcaＩバンドの結合により構築される。
【０１７１】 Ｉ．タバコ１６ＳｒＲＮＡプロモーターとrbcＬ遺伝子のrbsの増幅 タバコ１６ＳｒＲＮＡプロモーターをタバコＤＮＡ（Ｎ．tabacum cv Ｘanthi
）からＰＣＲ増幅し、タバコ色素体rbcＬ遺伝子の合成リボソーム結合部位（rbs
）に融合する。「上部鎖」プライマーは１０２５６８位置前の１６ＳｒＲＮＡプ
ロモーターの５'末端にＥcoＲＩ部位を挿入する（５'−ＧＣＣ ＡＧＡ ＡＴＴ ＣＧＣ ＣＧＴ ＣＧＴ ＴＣＡ ＡＴＧ ＡＧＡ ＡＴＧ−３'；配列番号９）。「 下部鎖」プライマーは１６ＳｒＲＮＡプロモーターの１０２６７５位置までを増
幅し、１０２６６１（ＡからＣ）および１０２６７０（ＡからＣ）位置を変えて
２つの上流ＡＴＧを除去し、プライマーの５'伸長としてrbcＬ遺伝子（５７５６
９〜５７５８４位置）のrbsを付加し、次いでrbsの３'末端にＢspＨＩ部位を挿 入する（５'−ＧＣＣ ＴＴＣ ＡＴＧ ＡＴＣ ＣＣＴ ＣＣＣ ＴＡＣ ＡＡＣ Ｔ ＡＴ ＣＣＡ ＧＧＣ ＧＣＴ ＴＣＡ ＧＡＴ ＴＣＧ−３'；配列番号１０）。１ ４２ｂｐの増幅産物をゲル精製し、ＥcoＲＩとＢspＨＩでの切断により、rbcＬ 遺伝子のrbsに融合したタバコ１６ＳｒＲＮＡプロモーター含有の１２８ｂｐフ ラグメントを得る。
【０１７２】 II. タバコ色素体rps１６遺伝子の３'非翻訳ＲＮＡ配列（３'ＵＴＲ）の増幅 タバコ色素体rps１６ ３'ＵＴＲは以下のオリゴヌクレオチド対を用いてタバ コＤＮＡ（Ｎ．tabacum cv Ｘanthi）からＰＣＲ増幅する。ＳpeＩ部位はリボソ
ームタンパク質Ｓ１６をエンコードする色素体rps１６遺伝子停止コドンの直後 に「上部鎖」プライマー（５'−ＣＧＣ ＧＡＣ ＴＡＧ ＴＴＣ ＡＡＣ ＣＧＡ ＡＡＴ ＴＣＡ ＡＴ−３'；配列番号１１）により付加し、ＰstＩ部位はrps１６ ３'ＵＴＲの３'末端に「下部鎖」プライマー（５'−ＣＧＣ ＴＣＴ ＧＣＡ Ｇ ＴＴ ＣＡＡ ＴＧＧ ＡＡＧ ＣＡＡ ＴＧ−３'；配列番号１２）により付加する
。増幅産物をゲル精製し、ＳpeＩとＰstＩにより消化して、ＳpeＩ部位により５
'を、また、ＰstＩ部位により３'を接するタバコrps１６ ３'ＵＴＲ（タバコ色 素体ゲノムの４９４１〜５０９３位置、Ｓhinozakiら、１９８６）含有の１６３
ｂｐフラグメントを生じる。
【０１７３】 III. 色素体形質転換選択用１６ＳｒＲＮＡプロモーター::aadＡ遺伝子::rps１
６ ３'ＵＴＲカセットの構築 スペクチノマイシンとストレプトマイシンに対し抵抗性を付与する酵素アミノ
グリコシド３"アデニルトランスフェラーゼをエンコードする細菌遺伝子であるa
adＡ遺伝子のコーディング配列をｐＲＬ２７７から単離する（Ｂlackら（１９９
３）Ｍolecular Ｍicrobiology ９：７７〜８４、およびＰrentkiら（１９９１ ）Ｇene １０３：１７〜２３）。aadＡコーディング配列の５'主要部分はｐＲＬ
２７７（開始コドンはＢspＨI部位にある）から７２４ｂｐのＢspＨI−ＢssＨII
フラグメントとして単離され、aadＡ遺伝子の３'残部は鋳型としてのｐＲＬ２７
７と以下のオリゴヌクレオチド対を用いるＰＣＲ増幅により、停止コドンの２０
ｂｐ後にＳpeＩ部位を付加することによって修飾する：「上部鎖」（５'−ＡＣ Ｃ ＧＴＡ ＡＧＧ ＣＴＴ ＧＡＴ ＧＡＡ−３'；配列番号１３）およびＳpeＩ部
位を付加する「下部鎖」（５'−ＣＣＣ ＡＣＴ ＡＧＴ ＴＴＧ ＡＡＣ ＧＡＡ ＴＴＧ ＴＴＡ ＧＡＣ−３'；配列番号１４）。６５８ｂｐの増幅産物をゲル精 製し、ＢssＨII、ＳpeＩで消化し、８９ｂｐフラグメントを７２４ｂｐのＢspＨ
I−ＢssＨIIフラグメントに担持されるaadＡ遺伝子の５'部分、１２８ｂｐのＥc
oＲＩ−ＢspＨI ＰＣＲ増幅フラグメントに担持されるrbcＬの１６Ｓプロモータ
とrbs、そしてＥcoＲＩ−ＳpeＩ消化したｐＬＩＴＭＵＳ２８ベクター（ニュー イングランド・バイオラブス）に結合し、ｐＡＴ２２３とする。3行程の連結反 応は、１６ＳｒＲＮＡプロモーター−rbs推進aadＡ遺伝子含有ｐＡＴ２２３のＥ
coＲＩ−ＳpeＩ０．９４ｋｂフラグメント、rps１６ ３'ＵＴＲ含有の１６３ｂ ｐのＳpeＩ、ＰstＩ消化ＰＣＲフラグメント、およびＥcoＲＩ、ＳptＩで切り出
したpuc１９（ニューイングランド・バイオラブス）について実施し、rps１６ ３'ＵＴＲをもつaadＡ遺伝子を推進する１６ＳｒＲＮＡプロモーター含有ｐＡＴ
２２９を得る。
【０１７４】 ＩＶ．バクテリオファージＴ７遺伝子１０プロモーターの増幅 バクテリオファージＴ７遺伝子１０プロモーターは以下のオリゴヌクレオチド
対を用い、ｐＥＴ−３ｄ（ストラタジーン）からＰＣＲ増幅する：「上部鎖」プ
ライマーはＴ７プロモーターの５'末端にＥcoＲＩ部位を挿入（５'−ＣＣＣ Ｇ ＡＡ ＴＴＣ ＡＴＣ ＣＣＧ ＣＧＡ ＡＡＴ ＴＡＡ ＴＡ−３'；配列番号１５）
し、「下部鎖」プライマーは３'末端にＮcoＩ部位を挿入した（５'−ＣＧＧ Ｃ ＣＡ ＴＧＧ ＧＴＡ ＴＡＴ ＣＴＣ ＣＴＴ ＣＴＴ ＡＡＡ ＧＴＴ ＡＡＡ−３'
；配列番号１６）。増幅産物をゲル精製し、ＥcoＲＩ、ＮcoＩでの切断がＴ７プ
ロモーターを含む９６ｂｐフラグメントを生成する。
【０１７５】 Ｖ．バクテリオファージＴ７遺伝子１０ターミネーターの増幅 バクテリオファージＴ７遺伝子１０ターミネーターは以下のオリゴヌクレオチ
ド対を用い、ｐＥＴ−３ｄ（ストラタジーン）からＰＣＲ増幅する：「上部鎖」
プライマーはターミネーターの５'末端にＨindIII部位を挿入（５'−ＧＣＧ Ａ ＡＧ ＣＴＴ ＧＣＴ ＧＡＧ ＣＡＡ ＴＡＡ ＣＴＡ ＧＣＡ ＴＡＡ−３'；配列 番号１７）し、「下部鎖」プライマーはターミネーターの３'末端にＰstＩ部位 を挿入する（５'−ＧＣＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ＴＣＣ ＧＧＡ ＴＡＴ ＡＧＴ ＴＣＣ
ＴＣＣ Ｔ−３'；配列番号１８）。増幅産物をゲル精製し、ＨindIII−ＰstＩ での切断がＴ７ターミネーターを含む８６ｂｐフラグメントを生成する。
【０１７６】 ＶＩ．しろいぬなずな（Ａrabidopsis thaliana）色素体psbＡ ３'非翻訳ＲＮＡ
配列の増幅 しろいぬなずな色素体psbＡ ３'ＵＴＲは以下のオリゴヌクレオチド対を用い 、しろいぬなずなＤＮＡ（生態型、ランズバーク）からＰＣＲ増幅する：「上部
鎖」プライマーは３'ＵＴＲの５'末端にＳpeＩ部位を挿入し、ＧをＡ（下線）に
変異することにより在来配列のＸbaＩ部位を除き（５'−ＧＣＧ ＡＣＴ ＡＧＴ
ＴＡＧ ＴＧＴ ＴＡＧ ＴＣＴ ＡＡＡ ＴＣＴ ＡＧＴ Ｔ−３'；配列番号１９）
、「下部鎖」プライマーはＵＴＲの３'末端にＨindIII部位を付加する（５'−Ｃ
ＣＧ ＣＡＡ ＧＣＴ ＴＣＴ ＡＡＴ ＡＡＡ ＡＡＡ ＴＡＴ ＡＴＡ ＧＴＡ−３'
；配列番号２０）。増幅領域はジェンバンク受託番号Ｘ７９８９８の１３５０か
ら１５５２の位置に伸長する。２１８ｂｐのＰＣＲ産物をゲル精製し、ＨindIII
−ＰstＩ切断したＴ７ターミネーター担持ＰＣＲフラグメントをピーブルースク
リプト（pＢluescript）ｓｋ−（ストラタジーン）のＳpeＩ−ＰstＩ部位に結合
し、ｐＰＨ１７１とする。ｐＰＨ１７１のpsbＡ３'ＵＴＲ領域を配列分析し、ジ
ェンバンク受託番号Ｘ７９８９８に比較して、１４４０および１４５２位置のＡ
が欠失していることを明らかにする。
【０１７７】 ＶII．色素体形質転換ベクターにおけるバクテリオファージＴ７遺伝子１０プロ
モーターとターミネーターに融合したＧＵＳレポーター遺伝子およびアラビドプ
シス色素体psbＡ３'ＵＴＲを含むキメラ遺伝子の調製 バクテリオファージＴ７遺伝子１０プロモーター::ＧＵＳ遺伝子:: しろいぬ なずなpsbＡ３'ＵＴＲ::Ｔ７ターミネーターカセットは、Ｔ７プロモーターを含
む９６ｂｐのＥcoＲＩ、ＮcoＩ ＰＣＲフラグメント、ＧＵＳ遺伝子を含むｐＣ ８からの１．８６ｂｐのＮcoＩ、ＸbaＩフラグメント、およびしろいぬなずなps
bＡ３'ＵＴＲとＴ７ターミネーターを含む２９５ｂｐのＸbaＩ、ＰstＩフラグメ
ントを、ｐＧＥＭ−３Ｚ（ストラタジーン）のＥcoＲＩ、ＰstＩ部位に４−行程
連結反応し、プラスミドｐＡＴ２２１とすることにより構築する。Ｔ７プロモー
ター推進ＧＵＳ遺伝子カセットは、１６ＳｒＲＮＡプロモーター−rbs::aadＡ::
rps１６ ３'ＵＴＲカセットを含むｐＡＴ２２９の１．１ｋｂ ＨindIII、ＥcoＲ
Ｉフラグメントと、Ｔ７プロモーター::ＧＵＳ:: psbＡ３'ＵＴＲ::Ｔ７ターミ ネーターカセットを担持する２．２６ｋｂのＥcoＲＩ、ＰstＩ ｐＡＴ２２１フ ラグメントとを、ピーブルースクリプト（pＢluescript）ｓｋ＋（ストラタジー
ン）のＨindIII、ＰstＩ部位にクローニングすることにより、aadＡ選択可能マ ーカーカセットに連接し、プラスミドｐＡＴ２３２を調製する。色素体形質転換
ベクターｐＡＴ２３６は、ＧＵＳと選択可能マーカーカセットを含むｐＡＴ２３
２からの３．３６ｋｂ ＰstＩバンドをｐＡＴ２１８のＰstＩ部位に連接し、Ｇ ＵＳ遺伝子がrps１２／７ＯＲＦと同じ方向に転写される挿入方向をスクリーニ ングすることにより構築する。
【０１７８】 実施例１２：３'ＵＴＲの代替としてポリグアノシン系を用いるベクターの構築 ポリグアノシン系は生体内で色素体atpＢ遺伝子３'ＵＴＲに置換わることが示
されている（Ｄragerら（１９９６）ＲＮＡ２：６５２〜６６３）。それぞれ５'
および３'にＳpeＩ、ＨindIII付着末端に隣接した１８個の連続グアノシンを含 むポリＧ系は、以下の２種類のキナーゼ処理オリゴヌクレオチドをアニーリング
することにより組上げる：（５'−ＣＴＡ ＧＴＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＧ
ＧＧＧ ＧＧＡ−３'；配列番号２１）および（５'−ＡＧＣ ＴＴＣ ＣＣＣ Ｃ ＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＡ−３'；配列番号２２）。ＳpeＩ、ＨindIII 付着末端を含むポリＧ18系は、Ｔ７ターミネーターを含むＨindIII、ＰstＩ消化
ＰＣＲフラグメントとともにピーブルースクリプト（pＢluescript）ＳＫ＋（ス
トラタジーン）のＳpeＩ、ＰstＩ部位に連接する。
【０１７９】 実施例１３：色素体形質転換ベクターにおけるファージＴ７遺伝子１０プロモー
ターに融合した大腸菌トレハロース−６−リン酸シンターゼ遺伝子（ＯtsＡ）含
有キメラ遺伝子の調製 大腸菌株ＤＨ５−アルファからのゲノムＤＮＡは、ＡＴＧ開始コドンと、次い
で新たに加えられたＧＣＡコドンを取込みＮcoＩ制限部位を形成する上部鎖プラ
イマー（プライマーｐＯＴＳＡＮ＋：５'−ＴＧＡ ＣＣＡ ＴＧＧ ＣＡＡ ＧＴ Ｃ ＧＴＴ ＴＡＧ ＴＣＧ ＴＡＧ Ｔ−３'；配列番号２３）およびＯtsＡのユニ
ークＳfuＩ制限部位下流の下部鎖プライマー（ｐＯＴＳＡＮ−：５'−ＡＧＣ Ａ
ＡＣ ＧＣＴ ＴＣＡ ＴＡＧ−３'；配列番号２４）によるＯtsＡ遺伝子５'部分 のＰＣＲ増幅用鋳型として用いる。ＰＣＲ反応はＰＦＵ ＤＮＡポリメラーゼ（ プロメガ）を用い、ＤＮＡサーモサイクラー４８０（パーキン・エルマー／ロッ
シュ、ブランチバーグ、ＮＪ）により製造業者の推奨に従い、９４℃（３０秒）
、４０℃（６０秒）および７２℃（３０秒）で５サイクル、次いで９４℃（３０
秒）、５５℃（６０秒）および７２℃（３０秒）で２５サイクル、５０μｌの容
量で実施する。８５０ｂｐのＰＣＲ産物を標準手法によりゲル精製し、ＮcoＩ（
特に注記しない限り、制限酵素はすべてニューイングランド・バイオラブスから
入手した）およびＳfuＩ（ベーリンガー・マンハイム・コープ、インディアナポ
リス）で切断し、６６１ｂｐのＤＮＡフラグメントを放出させる。ＯtsＡの３' 部分はＯtsＡのＳfuＩ上流に位置する上部鎖プライマー（ｐＯＴＳＡＸ＋：５' −ＧＣＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＧＡＴ ＴＧＴ Ｃ−３'；配列番号２５）、および停止
コドンの下流にＸbaＩ制限部位を導入し、ＯtsＡの３'末端に存在するＨindIII を、ＣＴＴ ＬeuコドンをＣＴＣに変えることにより分解する下部鎖プライマー （ｐＯＴＳＡＸ−：５'−ＧＧＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＧＡＴ ＴＣＡ ＣＧＣ ＧＡＧ
ＣＴＴ ＴＧＧ ＡＡＡ ＧＧＴ ＡＧＣ Ａ−３'；配列番号２６）を用い、上記同
様に入手する。８６１ｂｐの増幅産物をゲル精製し、ＳfuＩおよびＸbaＩで消化
し、得られる７７２ｂｐのＤＮＡフラグメントを、ＮcoＩとＸbaＩで消化したｐ
Ｌitmus２８（プロメガ）の５'ＯtsＡ ＮcoＩ／ＳfuＩフラグメントと接合し、 ｐＯＴＳＡを形成する。
【０１８０】 色素体形質転換ベクターにおけるｐＥＴ３ａ（ノバゲン）からのファージＴ７
遺伝子１０プロモーターカセットを含むｐＡＴ２３６（実施例１１）からのプラ
スミドＤＮＡを、ＮcoＩとＳphＩ（１６４６ｂｐのフラグメントを生成）および
ＳphＩとＸbaＩ（４５１４ｂｐフラグメントを生成）で消化する。これらのベク
ターフラグメントを３行程反応により、完全ＯtsＡ遺伝子を含むｐＯＴＳＡの１
４３３ｂｐＮcoＩ／ＸbaＩフラグメントと接合し、色素体形質転換ベクターｐＴ
７−ＯＴＳＡを形成する。
【０１８１】 実施例１４：色素体形質転換ベクターにおけるファージＴ７遺伝子１０プロモー
ターに融合した大腸菌トレハロース−６−リン酸ホスファターゼ遺伝子（ＯtsＢ
）含有キメラ遺伝子の調製 ＯtsＢ遺伝子の５'部分は、大腸菌ゲノムＤＮＡから上記のように、上部鎖プ ライマーｐＯＴＳＢＮ＋（５'−ＧＴＣ ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＣＡ ＧＡＡ Ｃ ＣＧ ＴＴＡ ＡＣＣ−３'；配列番号２７；本プライマーはＯtsＢのＧＴＧ開
始コドンをＡＴＧに変換し、第二位置にＧＴＧ Ｖalコドンを添加する）および 下部鎖プライマーｐＯＴＳＢＮ−（５'−ＧＴＴ ＣＧＣ ＣＣＧ ＡＴＡ ＡＡＧ
ＧＧＡ Ｇ−３'；配列番号２８；ＯtsＢのユニークＢglII部位下流に位置する）
を使用し、増幅する。５８４ｂｐの産物をゲル精製し、ＮcoＩとＢglIIで消化し
、得られる４５９ｂｐのフラグメントを単離する。ＯtsＢ遺伝子の３'部分は同 様に、上部鎖プライマーｐＯＴＳＢＸ＋（５'−ＴＡＧ ＣＧＣ ＡＡＣ ＧＴＡ ＴＴＡ ＣＴＣ−３'；配列番号２９；ＯtsＢＢglII部位の上流に位置する）およ
び下部鎖プライマーｐＯＴＳＢＸ−（５'−ＧＣＣ ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＴＣ ＡＴ Ｃ ＡＴＴ ＡＧＡ ＴＡＣ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＡＡ ＡＣ−３'；配列番号３０；Ｏ
tsＢ停止コドンの下流にＸbaＩ制限部位を取込む）を使用し、増幅する。ゲル精
製した３８１ｂｐの産物をＢglIIおよびＸbaＩで消化し、得られる３５４ｂｐの
ＢglII／ＸbaＩ制限フラグメントを５'ＯtsＢ ＮcoＩ／ＢglII制限フラグメント
とともにＮcoＩとＸbaＩで消化したベクターｐＬitmus２８に接合し、ｐＯＴＳ Ｂを形成する。
【０１８２】 プラスミドｐＯＴＳＢは次いでＮcoＩおよびＸbaＩで消化し、得られる完全Ｏ
tsＢ遺伝子を含む８２０ｂｐのフラグメントを３行程反応により上記プラスミド
ｐＡＴ２３６のＮcoＩ／ＳphＩおよびＳphＩ／ＸbaＩフラグメントと接合し、色
素体形質転換ベクターｐＴ７ ＯＴＳＢを形成する。
【０１８３】 実施例１５：バクテリオファージＴ７プロモーターおよびターミネーターに融合
したＯtsＡとＯtsＢを含むオペロン様キメラ遺伝子構築物含有の色素体形質転換
ベクターの調製 プラスミドｐＯＴＳＢをＮcoＩおよびＳpeＩで消化し、３５３４ｂｐベクター
バックボーン／ＯtsＢフラグメントを単離し、脱リン酸する。このフラグメント
は、ファージＴ７遺伝子１０ ５'ＵＴＲの一部と、上部鎖オリゴヌクレオチド（
５'−ＣＴＡ ＧＴＧ ＧＧＡ ＧＡＣ ＣＡＣ ＡＡＣ ＧＧＴ ＴＴＣ ＣＣＴ ＣＴ
Ａ ＧＡＡ ＡＴＡ ＡＴＴ ＴＴＧ ＴＴＴ ＡＡＧ ＴＴＴ ＡＡＧ ＡＡＧ ＧＧＧ
ＡＧＡ ＧＡＡ Ｔ−３'；配列番号３１；ＳpeＩ制限部位のオーバーハングに下
線）および下部鎖オリゴヌクレオチド（５'−ＣＡＴ ＧＡＴ ＴＣＴ ＣＴＣ Ｃ ＣＣ ＴＴＣ ＴＴＡ ＡＡＣ ＴＴＡ ＡＡＣ ＡＡＡ ＡＴＴ ＡＴＴ ＴＣＴ ＡＧ
Ａ ＧＧＧ ＡＡＡ ＣＣＧ ＴＴＧ ＴＧＧ ＴＣＴ ＣＣＣ Ａ−３'；配列番号３ ２；ＢspＨI制限部位のオーバーハングに下線）をアニーリングおよび引続くＴ ４キナーゼによるリン酸化により調製したキメラ共通色素体リボソーム結合部位
とを含む合成オリゴヌクレオチドリンカーに接合する。得られるプラスミドｐＯ
ＴＳＢＬをＳpeＩで消化し、ＳpeＩＯtsＡ::リンカー::ＯtsＢ配向を選択したｐ
ＯＴＳＡの１５１６ｂｐ ＳpeＩ／ＸbaＩフラグメントに接合し、ｐＯＴＳＡＢ Ｌを形成する。プラスミドｐＯＴＳＡＢＬは次いでＮcoＩとＸbaＩ（部分的）で
消化し、得られる完全ＯtsＡ::Ｔ７５'／ＲＢＳ::ＯtsＢカセット含有の２３１ ３ｂｐフラグメントを３行程反応により、上記プラスミドｐＡＴ２３６のＮcoＩ
／ＳphＩおよびＳphＩ／ＸbaＩフラグメントと接合し、色素体形質転換ベクター
ｐＴ７ ＯＴＳＡＢを形成する。
【０１８４】 ファージＴ７遺伝子１０ ５'ＵＴＲの部分を欠くことからなる同様の色素体形
質転換ベクターも、分子生物学の標準的方法により形成される。
【０１８５】Ｂ２．構成的発現 実施例１６：タバコ色素体clpＰ遺伝子プロモーターおよび完全５'非翻訳ＲＮＡ
（５'ＵＴＲ）の増幅 タバコc.v.“Ｘanthi ＮＣ”からの総ＤＮＡを、構成的に発現した色素体clp Ｐ遺伝子のＡＴＧ開始コドンに関し−１９７位に導入されたＥcoＲＩ制限部位を
含んでなる左から右への「上部鎖」プライマー（プライマーＰclp Ｐ1ａ：５'−
ＧＣＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＡＴＡ ＣＴＴ ＡＴＴ ＴＡＴ ＣＡＴ ＴＡＧ ＡＡＡ Ｇ
−３'；配列番号３３；ＥcoＲＩ制限部位に下線）および翻訳開始点に導入され たＮcoＩ制限部位を取込むclpＰプロモーターのＡＴＧ開始コドンに関し−２１ から−１までの領域に相同の右から左への「下部鎖」プライマー（プライマーＰ
clp Ｐ２ｂ：５'−ＧＣＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＴＡＡ ＡＴＧ ＡＡＡ ＧＡＡ ＡＧＡ
ＡＣＴ ＡＡＡ−３'；配列番号３４；ＮcoＩ制限部位に下線）とともにＰＣＲ 用鋳型として用いる。このＰＣＲ反応はＰfu熱安定 ＤＮＡポリメラーゼ（スト ラタジーン、ラホーラ、ＣＡ）を用い、パーキンエルマー・サーマルサイクラー
４８０により製造業者の推奨に従い（パーキン・エルマー／ロッシュ、ブランチ
バーグ、ＮＪ）以下のとおり実施する：７分９５℃、次いで１分９５℃／２分４
３℃／１分７２℃で４サイクル、次いで１分９５℃／２分５５℃／１分７２℃で
２５サイクル。２１３ｂｐの増幅産物は、その左末端にＥcoＲＩ部位、右末端に
ＮcoＩ部位を含み、タバコ（Ｎ.tabacum）色素体ＤＮＡ配列（Ｓhinozakiら、Ｅ
ＭＢＯ Ｊ．５：２０４３〜２０４９（１９８６））のヌクレオチド７４７００ 〜７４５０５に相当するclpＰ遺伝子のプロモーターと５'非翻訳領域とを含んで
なるが、これを標準的手法によりゲル精製し、ＥcoＲＩとＮcoＩにより消化する
（制限酵素はすべてニューイングランド・バイオラブス、ビバリー、ＭＡから購
入）。
【０１８６】 実施例１７：タバコ色素体rps１６遺伝子３'非翻訳ＲＮＡ配列の増幅 タバコc.v.“Ｘanthi ＮＣ”からの総ＤＮＡを、リボソームタンパク質Ｓ１６
をエンコードする色素体rps１６遺伝子遺伝子のＴＡＡ停止コドンの直後に導入 されたＸbaＩ制限部位を含んでなる左から右への「上部鎖」プライマー（プライ
マーrps１６Ｐ １ａ：５'−ＧＣＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＣＡ ＡＣＣ ＧＡＡ ＡＴ Ｔ ＣＡＡ ＴＴＡ ＡＧＧ−３'；配列番号３５；ＸbaＩ制限部位に下線）および
rps１６ ３'ＵＴＲの３'末端に導入されたＨindIII制限部位を取込むrps１６の ＴＡＡ停止コドンに関し＋１３４から＋１５１までの領域に相同の右から左への
「下部鎖」プライマー（プライマーrps１６Ｐ １ｂ：５'−ＣＧＣ ＡＡＧ ＣＴ Ｔ ＣＡＡ ＴＧＧ ＡＡＧ ＣＡＡ ＴＧＡ ＴＡＡ−３'；配列番号３６；ＨindII
I制限部位に下線）とともに上記のようにＰＣＲ用鋳型として用いる。１６９ｂ ｐの増幅産物は、その左末端にＸbaＩ部位、右末端にＨindIII部位を含み、タバ
コ（Ｎ.tabacum）色素体ＤＮＡ配列（Ｓhinozakiら、１９８６）のヌクレオチド
４９４３〜５０９３に相当する領域を含むrps１６遺伝子の３'非翻訳領域を含ん
でなるが、これをゲル精製し、ＸbaＩとＨindIIIにより消化する。
【０１８７】 実施例１８：clpＰ遺伝子プロモーターに接合したＧＵＳレポーター遺伝子フラ グメントと５'および３'ＵＴＲを含む色素体形質転換ベクターの調製 ＡＴＧ開始コドン位置にＮcoＩ制限部位、および未変性３'ＵＴＲに続くＸba Ｉ部位を含むプラスミドｐＲＡＪ２７５（クロンテック）から誘導される１８６
４ｂｐのβ−ガラクトウロニダーゼ（ＧＵＳ）レポーター遺伝子フラグメントを
ＮcoＩとＸbaＩでの消化により産生させる。このフラグメントを４行程反応によ
り、２０１ｂｐのＥcoＲＩ／ＮcoＩ clpＰプロモーターフラグメント、１５７ｂ
ｐのＸbaＩ／ＨindIII rps１６ ３'ＵＴＲフラグメント、およびクローニングベ
クターｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）（プロメガ、マディソン、ＷＩ）からの３１４８ｂ
ｐのＥcoＲＩ／ＨindIIIフラグメントに接合し、プラスミドｐＰＨ１３８を構築
する。色素体形質転換ベクターｐＰＨ１４０は、プラスミドｐＰＲＶ１１１ａ（
Ｚoubenkoら（１９９４）Ｎucleic Ａcids Ｒes ２２：３８１９〜２４）をＥco
ＲＩとＨindIIIにより消化し、得られる７２８７ｂｐのフラグメントをｐＰＨ１
３８の２２２２ｂｐＥcoＲＩ／ＨindIIIフラグメントに接合することにより構築
する。
【０１８８】 実施例１９：clpＰ遺伝子プロモーターに接合したＯtsＡ遺伝子と５'および３' ＵＴＲを含む色素体形質転換ベクターの調製 完全ＯtsＡ遺伝子を含むｐＯＴＳＡの１４３３ｂｐＮcoＩ／ＸbaＩフラグメン
トを４行程反応により、２０１ｂｐのＥcoＲＩ／ＮcoＩclpＰプロモーターフラ グメント、１５７ｂｐのＸbaＩ／ＨindIII rps１６ ３'ＵＴＲフラグメント、お
よびクローニングベクターｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）（プロメガ、マディソン、ＷＩ
）からの３１４８ｂｐのＥcoＲＩ／ＨindIIIフラグメントに接合し、プラスミド
ｐclpＯtsＡを構築する。色素体形質転換ベクターは、プラスミドｐＰＲＶ１１ １ａをＥcoＲＩとＨindIIIにより消化し、得られる７２８７ｂｐのフラグメント
をｐclpＯtsＡの１７９１ｂｐＥcoＲＩ／ＨindIIIフラグメントに接合すること により構築する。
【０１８９】 実施例２０：clpＰ遺伝子プロモーターに接合したＯtsＢ遺伝子と５'および３' ＵＴＲを含む色素体形質転換ベクターの調製 プラスミドｐＯＴＳＢをＮcoＩおよびＸbaＩで消化し、得られる完全ＯtsＢ遺
伝子を含む８２０ｂｐのフラグメントを４行程反応により、２０１ｂｐのＥcoＲ
Ｉ／ＮcoＩclpＰプロモーターフラグメント、１５７ｂｐのＸbaＩ／ＨindIII rp
s１６ ３'ＵＴＲフラグメント、およびクローニングベクターｐＧＥＭ３Ｚｆ（ −）（プロメガ、マディソン、ＷＩ）からの３１４８ｂｐのＥcoＲＩ／ＨindIII
フラグメントに接合し、プラスミドｐclpＯtsＢを構築する。色素体形質転換ベ クターは、プラスミドｐＰＲＶ１１１ａをＥcoＲＩとＨindIIIにより消化し、得
られる７２８７ｂｐのフラグメントをｐclpＯtsＢの１１７８ｂｐＥcoＲＩ／Ｈi
ndIIIフラグメントに接合することにより構築する。
【０１９０】 実施例２１：clpＰ遺伝子プロモーターに接合したＯtsＡ遺伝子およびＯtsＢ遺 伝子と５'および３'ＵＴＲを含むオペロン様キメラ遺伝子構築物含有の色素体形
質転換ベクターの調製 プラスミドｐＯＴＳＡＢＬをＮcoＩおよびＸbaＩ（部分的）で消化し、得られ
る完全ＯtsＡ::Ｔ７５'／ＲＢＳ::ＯtsＢカセットを含む２３１３ｂｐのフラグ メントを４行程反応により、２０１ｂｐのＥcoＲＩ／ＮcoＩclpＰプロモーター フラグメント、１５７ｂｐのＸbaＩ／ＨindIII rps１６ ３'ＵＴＲフラグメント
、およびクローニングベクターｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）（プロメガ、マディソン、
ＷＩ）からの３１４８ｂｐのＥcoＲＩ／ＨindIIIフラグメントに接合し、プラス
ミドｐclpＯtsＡＢを構築する。色素体形質転換ベクターは、プラスミドｐＰＲ Ｖ１１１ａ（Ｚoubenkoら、１９９４）をＥcoＲＩとＨindIIIにより消化し、得 られる７２８７ｂｐのフラグメントをｐclpＯtsＡＢの２６７１ｂｐＥcoＲＩ／ ＨindIIIフラグメントに接合することにより構築する。
【０１９１】 実施例２２：タバコ色素体ゲノムのバイオリスティック形質転換 タバコc.v.‘Ｘanthi nc’の種子をＴ寒天培地上１インチの円形に配列し、１
プレート当たり７個発芽させ、播種後１２〜１４日目に、実質的に記載どおりに
（Ｓvab，ＺおよびＭaliga，Ｐ．（１９９３）ＰＮＡＳ９０：９１３〜９１７）
、プラスミドｐＣ８Ｅ５およびｐＣ＋Ｅ５からのＤＮＡで被覆した１μｍタング
ステン粒子（Ｍ１０、バイオラッド、ハーキュレス、ＣＡ）により衝撃処理する
。衝撃処理した実生をＴ培地上、葉の除去後２日間培養し、スペクチノマイシン
二塩酸塩（シグマ、セントルイス、ＭＯ）５００μｇ／ｍｌ含有のＲＭＯＰ培地
（Ｓvab，Ｚ．，Ｈajdukiewicz，Ｐ．およびＭaliga，Ｐ．（１９９０）ＰＮＡ Ｓ８７：８５２６〜８５３０）プレート上、明るい光（３５０〜５００μモル光
子／ｍ2／ｓ）のもとに、背軸側を上にして置く。衝撃処理３ないし８週間後に 脱色した葉の下に現われる抵抗性苗条を同じ選択培地上にサブクローン化し、カ
ルスを形成させ、次いで二次苗条を単離、サブクローン化する。独立したサブク
ローンの形質転換した色素体ゲノムコピー（同型細胞質性）の完全分離をサザン
ブロッティングの標準技法により評価する（Ｓambrookら（１９８９）分子クロ ーニング：実験室マニュアル；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
、コールド・スプリング・ハーバー）。ＢamＨＩ／ＥcoＲＩ消化総細胞ＤＮＡ（
Ｍettler，I.J.（１９８７）Ｐlant Ｍol Ｂiol Ｒeporter ５：３４６〜３４９
）を１％トリス−ホウ酸（ＴＢＥ）アガロースゲル上で分離し、ナイロンメンブ
ラン（アマーシャム）に転移し、rps７／１２色素体標的配列の一部を含むｐＣ ８からの０．７ｋｂＢamＨＩ／ＨindIII ＤＮＡフラグメントに相当する32Ｐ− 標識ランダムプライムＤＮＡ配列でプローブする。同型細胞質苗条を無菌的にス
ペクチノマイシン含有ＭＳ／ＩＢＡ培地（ＭｃＢride，Ｋ．Ｅ．ら（１９９４）
ＰＮＡＳ ９１：７３０１〜７３０５）上に根づかせ、温室に移す。
【０１９２】 実施例２３：化学的に誘導可能な色素体標的化Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現す
るトランスジェニックタバコの調製 ＮcoＩ制限部位とＡＴＧ開始コドン、それに続いてのrbcＳ遺伝子（リブロー ス二リン酸カルボキシラーゼの小型サブユニットをエンコードする）から最初の
７個の色素体移行ペプチドコドンと内在性ＰstＩ制限部位（上部鎖：５'−ＣＡ Ｔ ＧＧＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＡＧＴ ＴＣＴ ＴＴＣ ＣＴＣ ＴＧＣ Ａ−３'；配列
番号３７；下部鎖：５'−ＧＡＧ ＧＡＡ ＡＧＡ ＡＣＴ ＧＡＧ ＧＡＡ ＧＣ− ３'；配列番号３８）とを含んでなる合成オリゴヌクレオチドリンカー、、rbcＳ
遺伝子移行ペプチドコーディング配列の３'部分に枠内融合したバクテリオファ ージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（Ｔ７Ｐol）含有のｐＣＧＮ４２０５（Ｍｃ
Ｂride，Ｋ．Ｅ．ら（１９９４）ＰＮＡＳ ９１：７３０１〜７３０５）の２． ８ｋｂ ＰstＩ／ＳacＩ ＤＮＡフラグメント、開始コドンに導入されたＮcoＩ制
限部位をもつタバコＰＲ−１ａプロモーター含有のｐＣＩＢ２９６の０．９ｋｂ
ＮcoＩ／ＫpnＩ ＤＮＡフラグメント（Ｕknesら（１９９３）Ｐlant Ｃell ５ ：１５９〜１６９）、およびバイナリーアグロバクテリウム形質転換ベクターｐ
ＳＧＣＧＣ１（ＳacＩ／ＨindIII部位にクローン化したｐＧＥＭ４（プロメガ、
マディソンＷＩ）からのポリリンカーを含むｐＧＰＴＶ−Ｈygの誘導体）の４．
９ｋｂ ＳfiＩ／ＫpnＩおよび６．６ｋｂ ＳacＩ／ＳfiＩフラグメントを接合し
、ｐＰＨ１１０を構築する。
【０１９３】 ハイグロマイシン抵抗性ＮＴ−ｐＰＨ１１０タバコ植物を、記載どおりに、タ バコ（Ｎ．tabacum）‘Ｘanthi’および“ＮahＧ”の葉盤とｐＰＨ１１０バイナ リーベクター担持ＧＶ３１０１アグロバクテリウムとの同時培養に続いて得られ る苗条から再生する。各トランスジェニック系統について、約２〜３ｃｍ2の二 葉のパンチを、約３００μモル／ｍ2／ｓの照射下に３ｍｌのＢＴＨ（５．６ｍ ｇ／１０ｍｌ）または滅菌蒸留水中にて２日間培養する。葉材料を収獲し、さっ と凍結し、液体窒素中で粉砕する。総ＲＮＡを抽出し（Ｖerwoerdら（１９８９ ）ＮＡＲ１７：２３６２）、放射標識Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子プローブを 用い記載（Ｗardら（１９９１）Ｔhe Ｐlant Ｃell ３：１０８５〜１０９４） どおりにノーザンブロット分析を実施する。一定のＴ７ＰｏＩ発現を示す１９種 のＮＴ−１１０Ｘ（Ｘanthi遺伝背景）および７種のＮＴ−１１０Ｎ（ＮahＧ遺 伝背景）Ｔ１系統の植物を温室に移し、自家受粉させる。連鎖したハイグロマイ シン抵抗性マーカーを３：１で分離する子孫を同系繁殖させ、同型接合Ｔ２系統 を選択する。
【０１９４】 実施例２４：トウモロコシの色素体形質転換 自家所有の遺伝子型ＣＧ００５２６およびＣＧ００７１４のＩ型胚形成性カル
ス培養（Ｇreenら（１９８３）、Ａ．Ｆazelahmad，Ｋ．Ｄowney，J.Ｓchultz，
Ｒ.Ｗ．Ｖoellmy、編纂、Ａdvances in Ｇene Ｔechnology：植物および動物に おける分子遺伝学。マイアミ冬期シンポジウムシリーズ、第２０巻、アカデミッ
クプレス、Ｎ.Ｙ.）は温室生育材料からの未成熟な１．５〜２．５ｍｍの長さの
胚から開始する。胚は受粉約１４日後の表面滅菌した穂から無菌的に切り出す。
ＣＧ００５２６の胚を２％スクロースと５ｍｇ／Ｌクロランベン（chloramben）
（Ｄuncanら（１９８５）Ｐlanta １６５：３２２〜３３２）含有のＤカルス開 始培地上に置き、一方、ＣＧ００７１４の胚は３％スクロースと０．７５ｍｇ／
Ｌの２，４−Ｄ（ＫaoおよびＭichayluk（１９７５）Ｐlannta １２６：１０５ 〜１１０）含有のＫＭカルス開始培地上に置く。胚および胚形成性培養物は、次
いで暗所で培養する。胚形成応答体は〜１４日後に外植片から除く。ＣＧ００５
２６応答体は２％スクロースと０．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ含有のＤカルス維持
培地上に置き、一方、ＣＧ００７１４のものは２％スクロースと５ｍｇ／Ｌのデ
ィカンバ（Ｄicamba）含有のＫＭカルス維持培地上に置く。週ごとに新たな維持
培地に継代培養し、その３ないし８週間後に、高品質の緊密な胚形成性培養物を
確立する。活発に増殖する胚形成性カルス片を遺伝子搬入用標的組織として選択
する。遺伝子搬入の約４時間前に１２％スクロース含有維持培地を含む標的プレ
ート上にカルス片を塗付する。カルス片を標的プレートの中心から半径８および
１０ｍｍの円形に並べる。デュポン・バイオリスティックス・マニュアル記載ど
おりに金ミクロキャリヤー上にプラスミドＤＮＡを沈着させる。各プラスミド２
〜３μｇを各６ショットミクロ担体調製品に使用する。ＰＤＳ−１０００Ｈｅバ
イオリスティックス装置により遺伝子を標的組織細胞に搬入する。バイオリステ
ィックス装置の設定は以下のとおりである：破裂板とマクロキャリヤーの間８ｍ
ｍ、マクロキャリヤーと停止スクリーンの間１０ｍｍ、および停止スクリーンと
標的の間７ｃｍ。各標的プレートは６５０ｐｓｉの破裂板を用い、２回ショット
する。２００×２００ステンレス網（マックマスター−カー、ニューブルンスイ
ック、ＮＪ）を停止スクリーンと標的組織の間に置く。
【０１９５】 ５日後、衝撃処理したカルス片を、２％スクロースと０．５ｍｇ／Ｌの２，４
−Ｄを含み、アミノ酸を含まず、また、７５０または１０００ｎＭの式ＸＶIIを
含む維持培地に移す。転移４〜５時間後または翌日、カルス片を照明棚に１時間
置き、次いで暗所２７℃に５〜６週間保存する。５〜６週間の一次選択段階の後
、黄色ないし白色の組織を５００または７５０ｎＭの式ＸＶIIを補充した同一培
地含有の新たなプレートに移す。転移４〜５時間後または翌日、カルス片を照明
棚に１時間置き、次いで暗所２７℃に３〜４週間保存する。３〜４週間の二次選
択段階の後、組織を５００ｎＭの式ＸＶIIを補充した同一培地含有プレートに移
す。健常増殖組織を照明棚に１時間置き、次いで暗所２７℃に保存する。コロニ
ーが再生のために十分の大きさとなるまで２週間ごとに継代培養する。
【０１９６】 この時点で、コロニーは、３％スクロース含有の修飾ＭＳ培地（Ｍurashigeお
よびＳkoog（１９６２）Ｐhysiol．Ｐlant １５：４７３〜４９７）（ＭＳ３Ｓ ）であって選択剤を含まない培地に移し、明所に置く。ＣＧ００５２６について
はアンシミドール（ancymidol）０．２５ｍｇ／Ｌとキネチン０．５ｍｇ／Ｌと をこの培地に加え、胚発芽を誘導する一方、ＣＧ００７１４についてはベンジル
アデニン２ｍｇ／Ｌを加える。再生コロニーは、ＣＧ００５２６またはＣＧ００
７１４それぞれについて２週間後に、アンシドールおよびキネチン、またはベン
ジルアデニンを含まないＭＳ３Ｓ培地に移す。根のある、またはない再生苗条は
、ＭＳ３Ｓ培地を容れた箱に移し、根のある小さい植物は最終的に回収し、温室
内の土壌に移す。
【０１９７】 Ｃ．トレハロース生合成遺伝子の化学的誘導と植物中トレハロース含量の測定 実施例２５：トレハロース生合成遺伝子の化学的誘導 種子を発芽させ、植物を温室内で３〜６週間成長させる。次いでそれらに１．
２ｍＭ−ＢＴＨ（または、さらにはＦriedrichら（１９９６）Ｐlant J.１０： ６１〜７０に説明されているように）または水和剤を散布する。植物材料のサン
プルを異なる時点で収獲し、さっと凍結する。ノーザンブロット分析を実施し、
ＢＴＨでの処理によるトレハロース生合成遺伝子の発現誘導をモニターする。
【０１９８】 実施例２６：凍結乾燥タバコ組織からの可溶性糖およびポリオールの抽出 １０〜２０ｍｇの凍結乾燥組織にマノヘプチュロース（manoheptulose）（内 部基準）４０ｍｇを加えた後、４００ｍｌの８０％メタノールにより６５℃で１
０分間３回抽出する。併合した上清（エッペンドルフ卓上遠心機により１３００
０ｒｐｍで５分間の遠心分離後）をスピードバック（Ｓpeedvac）により２５℃ で減圧下乾燥する。次いで、乾燥した抽出物を７００ｍｌのミリポア水に再懸濁
し、混合床イオン交換樹脂（セルドライト（Ｓerdolit）ミクロブルーおよびレ ッド、２：１（ｖ／ｖ））５０ｍｌを加え脱塩する。イオン交換樹脂を１３００
０ｒｐｍの遠心により沈降させ、３００ｍｌのミリポア水で洗浄する。併合した
上清を再度スピードバックにより２５℃で減圧下乾燥する。かくして、主として
糖とポリオールを含む残渣は、ＨＰＬＣによる分析用に、または引続くキャピラ
リーガスクロマトグラフィー（ＧＣ）による分析用誘導化のために準備する。
【０１９９】 実施例２７：ＨＰＬＣ分析 乾燥残渣を水２００ｍｌに再懸濁し、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心する。
１０ｍｌ分量を、パルス電流検出器を備えたディオネックス（Ｄionex）からＨ ＰＬＣシステムを用いるディオネックスＰ１００イオン交換カラム上１００ｍＭ
−ＮａＯＨで無勾配的に分離する。
【０２００】 実施例２８：キャピラリーＧＣ 乾燥残渣を５０％メタノール２００ｍｌに再懸濁し、１５０００ｒｐｍで１５
分間遠心する。上清８０ｍｌを２００ｍｌＧＣインジェクションバイアルに移す
。糖およびポリオールをスピードバックにより減圧下乾燥する。次いで残渣を８
０℃の加熱ブロック上添加したメタノールの繰返し蒸発により無水とする。無水
残渣をネジぶた付き隔膜で封じる。サンプルを次いで６２５ｍｇのヒドロキシル
アミンと５０ｍｇのフェニル−β−グルコピラノシドを含む無水ピリジンに溶解
する。この混合物を８０℃で３０分間培養する。１％トリメチルクロロシラン（
ｖ／ｖ）含有Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリル−ヘプタフルオロ−ブチルアミ
ド５０ｍｌを添加した後、誘導化反応を８０℃で３０分間実施する。かくして糖
およびポリオールのＴＭＳ−（トリメチルシリル）誘導体のＧＣによる分析準備
が整う。この反応混合物１〜３ｍｌの分離は下記条件を用い、ＦＩＤ検出器を備
えたカルロ・エルバ（Ｃarlo Ｅerba）ＧＣで実施する：キャピラリー：ＳＷサ イエンティフィック、３０ｍ、ＩＤ０．３２３ｍｍ、液相ＤＢ−１７。温度プロ
グラム：７０℃、２分、２５℃／分ないし１７０℃、７０℃／分ないし３４０℃
、３４０℃、５分。
【０２０１】 実施例２９：ＨＰＬＣによるトランスジェニック植物のトレハロース含量の定量 ２つの独立したトランスジェニック系統（トランスジェニック系統Ｎ５につい
てはＮ５／３およびＮ５／４；トランスジェニック系統Ｎ６についてはＮ６／１
、Ｎ６／２、Ｎ６／７およびＮ６／８）の子孫を生育させ、実施例２５記載のよ
うにＢＴＨで処理する。サンプルを収獲し、実施例２６記載のように抽出する。
トレハロース含量はＨＰＬＣにより定量する（実施例２７）。
【表１】
【表２】
【表３】
【０２０２】 実施例３０：ＨＰＬＣ／ＧＣによるトランスジェニック植物トレハローズ含量の
定量 ２つの独立したトランスジェニック系統（トランスジェニック系統Ｎ５につい
てはＮ５／３およびＮ５／４；トランスジェニック系統Ｎ６についてはＮ６／１
、Ｎ６／２、Ｎ６／７およびＮ６／８）の子孫を増殖させ、実施例２５記載のよ
うにＢＴＨで処理する。サンプルを収獲し、実施例２６記載のように抽出する。
トレハロース含量はＨＰＬＣ／ＧＣにより定量する（実施例２８）。
【表４】
【表５】
【０２０３】 実施例３１：トランスジェニック植物の干ばつ抵抗性の決定 ＢＴＨまたは水和剤での処理7日後に（実施例２５参照）、植物を潅漑システ ムから取出し、それ以降給水をとめる。植物はさらに生育し、その表現型をモニ
ターする。１４日後、ＢＴＨ処理植物はさらに成長し、潅漑した対照植物のよう
に見えるが、一方、水和剤処理した植物は完全に乾燥する。ＢＴＨ処理植物はさ
らに成長し、種子をつけることが可能である。したがって、干ばつ抵抗性はトレ
ハロース生合成遺伝子の発現およびトレハロースの蓄積と相関する。
【０２０４】 実施例３２：トウモロコシからトレハロース−６-リン酸シンターゼ遺伝子の単 離 変性したオリゴヌクレオチドＡＦＯＲ、ＢＦＯＲおよびＥＲＥＶを選択するが
、その理由はそれらがアラビドプシス・トレハロース−６−リン酸シンターゼお
よび酵母トレハロース−６−リン酸シンターゼの間に保存された配列に位置する
からである。変性したオリゴヌクレオチドＡＦＯＲ：５'−ＴＩＴ ＧＧＣ ＣＩ Ｔ（Ａ／Ｃ） ＴＩＴ ＴＴ（Ｃ）Ｃ ＡＣ（Ｔ）Ｔ ＡＣ(Ｔ)−３'、配列番号３ ９（Ｉはイノシンであり、括弧内の塩基は変性したオリゴヌクレオチドの括弧前
の位置に加わった塩基を表す）はペプチドＬ（Ｉ）ＷＰＬ（Ｉ）ＦＨＹ、配列番
号４０（括弧内のアミノ酸は該ペプチドの括弧前の位置に加わったアミノ酸を表
す）をエンコードし、変性したオリゴヌクレオチドＥＲＥＶ：５'−ＣＣＡ ＩＧ
Ｇ Ｇ（Ａ）ＴＴ ＩＡＣ ＩＣ（Ａ）Ｔ（Ｇ） Ｔ（Ｇ／Ａ）ＡＴ ＩＧＣ ＩＣＣ
−３'、配列番号４１はペプチドＧＡＩＲ（Ｉ）ＶＮＰＷ、配列番号４２をエン コードするＤＮＡ配列に相補的であり、これらはＰＣＲ反応に用いて、切り出し
たトウモロコシｃＤＮＡライブラリーからのトレハロース−６−リン酸シンター
ゼを増幅する（ストラタジーン、ラホーラ、ＣＡ、カタログ番号９３７００５）
。ＰＣＲの条件は製造業者（パーキン・エルマー）に従い、４ｍＭ−ＭｇＣｌ2 により３０秒／９４℃、２分／６０℃、２分／７２℃で２５サイクルとする。約
１，０００ｂｐのフラグメントを増幅し、標準技法を用いるアガロースゲルから
精製して、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（インビトロゲン）を用いベクタ ーにクローン化する。同様の反応はペプチドＷＶ（Ｉ）Ｈ（Ｑ）ＤＹＨＬＭ、配
列番号４４をエンコードする変性オリゴヌクレオチドＢＦＯＲ：５'−ＴＧＧ Ｇ
（Ａ）ＴＩ ＣＡＩ ＧＡＣ（Ｔ） ＴＡＣ（Ｔ） ＣＡＣ（Ｔ） Ｔ（Ｃ）ＴＩ Ａ
ＴＧ−３'、配列番号４３により実施する。約８５０ｂｐのＤＮＡフラグメント を増幅し、標準技法を用いるアガロースゲルから精製し、ＴＯＰＯ ＴＡクロー ニングキット（インビトロゲン）を用いベクターにクローン化する。プライマー
ＢＦＯＲおよびＥＲＥＶとの反応から得られるフラグメントをＢＥ３と呼称し、
配列決定する（配列番号４５）。ＢＥ３のヌクレオチド配列に基づき予測した翻
訳化ポリペプチド（配列番号４６）は保存アミノ酸ドメインを含む。
【０２０５】 ＢＥ３プローブは標準技法に従いトウモロコシｃＤＮＡライブラリーの選抜に
使用する（例えば、（Ｓambrookら、分子クローニング、出版コールド・スプリ ング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（１９８９））。ライブラリーはペトリ
皿に約１０，０００プラークの濃度で塗付し、３７℃一夜の増殖後、プラークの
フィルターリフトを形成させる。このプラークリフトをランダムプライム法によ
り、32Ｐ−ｄＣＴＰ標識したＢＥ３プローブの一つでプローブする。ハイブリッ
ド形成条件は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ−ＮａＰＯ4
ｐＨ７．０、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、５０℃である。一夜ハイブリッド形成した後、
フィルターを０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで洗浄する。陽性にハイブリッド形成
しているプラークをオートラジオグラフィーにより検出する。単一のプラークに
精製したのち、ｃＤＮＡ挿入物を単離し、その配列を決定する。
【０２０６】 単離した３種の独立ｃＤＮＡクローンは、配列番号４７（クローン４．１１）
、配列番号４９（クローン６）および配列番号５１（クローン９）を含んでなる
。
【０２０７】 実施例３３：トウモロコシ・トレハロース−６−リン酸シンターゼ遺伝子のサザ
ーンブロット分析 ゲノムトウモロコシＤＮＡを標準技法により無菌条件下に成長させた小植物か
ら精製する。精製ＤＮＡをＥcoＲＩ、ＨindIIIおよびＳpeＩにより消化し、アガ
ロースゲル上泳動させ、膜上に転移する。該膜を放射活性標識したＢＥ３フラグ
メントでプローブする。検出された数個のバンドはＢＥ３が少なくとも１つのト
ウモロコシ遺伝子に相当することを示す。
【０２０８】 上記開示の態様は説明のためのものである。本発明の開示は本発明の多様な変
更を当業者に所有させることとなる。かかる明瞭予見可能な変更は添付の請求項
に包含されるものとする。
【０２０９】
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 19/12 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 スティーブン・アーサー・ゴッフ アメリカ合衆国92024カリフォルニア州エ ンシニタス、カリェ・アナカパ1040番 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 CD13 CD16 CD17 4B024 AA08 BA10 BA11 BA80 CA03 DA01 EA04 FA02 FA07 GA11 GA17 HA08 4B050 CC03 DD02 EE10 HH02 LL05 4B064 AF03 CA11 CA19 CC24 DA11 4B065 AA26Y AA88X AA88Y AA89X AA98Y AC01 AC07 AC08 AC14 BA02 CA20 CA27 CA53

Claims (44)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 トレハロース生合成酵素の異種遺伝子を発現する植物。
  2. 【請求項２】 その核ゲノムに、誘導性プロモーターの制御下トレハロース
    生合成酵素をエンコードするヌクレオチド配列を含んでなる異種発現カセットま
    たはその部分を含んでなる請求項１記載の植物。
  3. 【請求項３】 誘導性プロモーターの制御下トレハロース６−リン酸シンタ
    ーゼをエンコードするヌクレオチド配列を含んでなる第一異種発現カセットまた
    はその部分と、誘導性プロモーターの制御下トレハロース６−リン酸ホスファタ
    ーゼをエンコードするヌクレオチド配列を含んでなる第二異種発現カセットまた
    はその部分とを含んでなる請求項２記載の植物。
  4. 【請求項４】 当該プロモーターが化学的にまたは傷害により誘導可能なプ
    ロモーターである請求項２または３記載の植物。
  5. 【請求項５】 その色素体に、プロモーターの制御下にトレハロース生合成
    酵素をエンコードするヌクレオチド配列を含んでなる異種発現カセットまたはそ
    の部分を含んでなり、そのプロモーターが当該植物の色素体中で当該ヌクレオチ
    ド配列の発現を指令し得るものであることを特徴とする請求項１記載の植物。
  6. 【請求項６】 プロモーターの制御下トレハロース６−リン酸シンターゼを
    エンコードするヌクレオチド配列と、プロモーターの制御下トレハロース６−リ
    ン酸ホスファターゼをエンコードするヌクレオチド配列とを含んでなり、その各
    プロモーターが当該植物の色素体中で当該各ヌクレオチド配列の発現を指令し得
    るものであることを特徴とする請求項５記載の植物。
  7. 【請求項７】 トレハロース６−リン酸シンターゼをエンコードする当該ヌ
    クレオチド配列およびトレハロース６−リン酸ホスファターゼをエンコードする
    当該ヌクレオチド配列がオペロン様ポリシストロン性遺伝子の単一プロモーター
    から転写されたものであり、その場合の当該プロモーターが当該植物の色素体中
    で当該オペロン様ポリシストロン性遺伝子の発現を指令し得るものであることを
    特徴とする請求項６記載の植物。
  8. 【請求項８】 当該プロモターがトランス活性化因子調節プロモーターであ
    り、その場合、対応するトランス活性化因子の発現が当該植物中で当該トランス
    活性化因子の発現を指令し得るプロモーターの制御下にあることを特徴とする請
    求項５ないし７のいずれかに記載の植物。
  9. 【請求項９】 （ａ）トランス活性化因子をエンコードするヌクレオチド配
    列に操作可能に連鎖したプロモーターを含んでなる異種核発現カセットまたはそ
    の部分であって、その場合の当該プロモーターが当該植物中で当該トランス活性
    化因子の発現を指令し得るものであり、当該トランス活性化因子が色素体を標的
    とする配列に融合しているカセットまたはその部分；および （ｂ）該トランス活性化因子により調節され、かつ、少なくとも1種のトレハロ ース生合成酵素をエンコードするヌクレオチド配列に操作可能に連鎖したトラン
    ス活性化因子介在プロモーターを含んでなる異種色素体発現カセットまたはその
    部分； とを含んでなる請求項８記載の植物。
  10. 【請求項１０】 当該トランス活性化因子調節プロモーターがＴ７遺伝子１
    ０プロモーターを含んでなり、かつ、当該対応するトランス活性化因子がＴ７Ｒ
    ＮＡポリメラーゼを含んでなる請求項８または９記載の植物。
  11. 【請求項１１】 当該植物において当該トランス活性化因子の発現を指令し
    得る当該プロモーターが誘導性プロモーター、組織特異プロモーターまたは構成
    プロモーターである請求項８または９記載の植物。
  12. 【請求項１２】 当該誘導性プロモーターが化学的にまたは傷害により誘導
    可能である請求項１１記載の植物。
  13. 【請求項１３】 当該プロモーターが当該植物の色素体中に通常存在するＲ
    ＮＡポリメラーゼにより転写されることを特徴とする請求項５ないし１２のいず
    れかに記載の植物。
  14. 【請求項１４】 当該ＲＮＡポリメラーゼが核エンコードポリメラーゼまた
    は色素体エンコードポリメラーゼである請求項１３記載の植物。
  15. 【請求項１５】 当該プロモーターがclpＰプロモーター、１６Ｓｒ−ＲＮ Ａ遺伝子プロモーター、psbＡプロモーターまたはrbcＬプロモーターである請求
    項１４記載の植物。
  16. 【請求項１６】 植物の色素体ゲノムに、オペロン様ポリシストロン性遺伝
    子の単一プロモーターから転写された2つ以上の遺伝子を含んでなり、その場合 の当該プロモーターが当該植物の色素体中で当該オペロン様ポリシストロン性遺
    伝子の発現を指令し得るものであり、当該オペロン様ポリシストロン性遺伝子が
    さらに当該オペロン様ポリシストロン性遺伝子中の２つの遺伝子間に介在ＤＮＡ
    配列を含んでなることを特徴とする植物。
  17. 【請求項１７】 当該介在ＤＮＡ配列の直ぐ下流に位置する遺伝子の発現を
    増加すること特徴とする請求項１６記載の植物。
  18. 【請求項１８】 当該介在ＤＮＡ配列が当該植物の色素体ゲノムには存在し
    ないことを特徴とする請求項１７記載の植物。
  19. 【請求項１９】 当該介在ＤＮＡ配列が非真核５'ＵＴＲの一部を含んでな ることを特徴とする請求項１８記載の植物。
  20. 【請求項２０】 当該介在ＤＮＡ配列を、当該オペロン様ポリシストロン性
    遺伝子の転写物においてＲＮＡ二次構造の形成を防止するために修飾することを
    特徴とする請求項１６ないし１９のいずれかに記載の植物。
  21. 【請求項２１】 当該オペロン様ポリシストロン性遺伝子が少なくとも1種 のトレハロース生合成酵素をエンコードするヌクレオチド配列を含んでなる遺伝
    子を含んでなることを特徴とする請求項１６ないし２０のいずれかに記載の植物
    。
  22. 【請求項２２】 当該オペロン様ポリシストロン性遺伝子がトレハロースリ
    ン酸シンターゼをエンコードするヌクレオチド配列を含んでなる遺伝子と、トレ
    ハロースリン酸ホスファターゼをエンコードするヌクレオチド配列を含んでなる
    遺伝子とを含んでなることを特徴とする請求項２１記載の植物。
  23. 【請求項２３】 前記請求項のいずれかに記載の植物の種子。
  24. 【請求項２４】 請求項７に記載の植物の生産方法であって、 （ａ）少なくとも1種のトレハロース生合成酵素をエンコードするヌクレオチド 配列またはオペロン様ポリシストロン性遺伝子に操作可能に連鎖したトランス活
    性化因子介在プロモーターを含んでなる異種色素体発現カセットまたはその部分
    を含んでなる植物に、当該トランス活性化因子介在プロモーターを調節し得るト
    ランス活性化因子をエンコードするヌクレオチド配列に操作可能に連鎖したプロ
    モーターを含んでなる異種核発現カセットまたはその部分を含んでなる植物から
    の花粉を受粉させること、その際、トランス活性化因子をコードするＤＮＡ配列
    に操作可能に連鎖した当該プロモーターが当該植物において当該トランス活性化
    因子の発現を指令し得ること； （ｂ）このように受粉した植物からの種子を回収すること；および （ｃ）当該種子から下記のように植物を栽培すること； を特徴とする方法。
  25. 【請求項２５】 植物中トレハロースの製造方法であって、誘導性プロモー
    ターの制御下に当該植物の核ゲノムからの、または当該植物の色素体において当
    該ヌクレオチド配列を発現し得るプロモーターの制御下に当該植物の色素体ゲノ
    ムからのトレハロース生合成酵素をエンコードする少なくとも１種のヌクレオチ
    ド配列を発現することにより製造する方法。
  26. 【請求項２６】 干ばつ、高塩度、浸透ストレスおよび温度極限に対し植物
    を保護する方法であって、誘導性プロモーターの制御下に当該植物の核ゲノムか
    らの、または当該植物の色素体において当該ヌクレオチド配列を発現し得るプロ
    モーターの制御下に当該植物の色素体ゲノムからのトレハロース生合成酵素をエ
    ンコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列を発現することにより保護する
    方法。
  27. 【請求項２７】 収獲した植物の貯蔵性を高める方法であって、誘導性プロ
    モーターの制御下に当該植物の核ゲノムからの、または当該植物の色素体におい
    て当該ヌクレオチド配列を発現し得るプロモーターの制御下に当該植物の色素体
    ゲノムからのトレハロース生合成酵素をエンコードする少なくとも１種のヌクレ
    オチド配列を発現することにより植物の貯蔵性を高める方法。
  28. 【請求項２８】 果実および野菜類の貯蔵期間を改善し、花卉を保存する方
    法であって、誘導性プロモーターの制御下に当該植物の核ゲノムからの、または
    当該果実、野菜類または花卉の色素体において当該遺伝子を発現し得るプロモー
    ターの制御下に当該植物の色素体ゲノムからのトレハロース生合成酵素をエンコ
    ードする少なくとも１種のヌクレオチド配列を発現することにより改善、保存す
    る方法。
  29. 【請求項２９】 形質転換植物において発現したタンパク質を安定化する方
    法であって、誘導性プロモーターの制御下に当該植物の核ゲノムからの、または
    当該植物の色素体において当該遺伝子を発現し得るプロモーターの制御下に当該
    植物の色素体ゲノムからのトレハロース生合成酵素をエンコードする少なくとも
    １種のヌクレオチド配列を発現することによりタンパク質を安定化する方法。
  30. 【請求項３０】 植物の色素体中で単一プロモーターから２種以上の遺伝子
    を発現する方法であって、当該植物の色素体ゲノムにオペロン様ポリシストロン
    性遺伝子を導入することを特徴とし、当該オペロン様ポリシストロン性遺伝子が
    当該植物の色素体において当該オペロン様ポリシストロン性遺伝子を発現し得る
    プロモーターに操作可能に連鎖した２種以上の遺伝子を含んでなり、その場合当
    該オペロン様ポリシストロン性遺伝子がさらに２つの遺伝子の間に介在ＤＮＡ配
    列を含んでなることを特徴とする方法。
  31. 【請求項３１】 当該介在ＤＮＡ配列の直ぐ下流に位置する遺伝子の発現が 増大することを特徴とする請求項３０記載の方法。
  32. 【請求項３２】 トレハロース生合成酵素またはその一部をエンコードする
    ヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡ分子。
  33. 【請求項３３】 当該ヌクレオチド配列がトレハロース−６−リン酸シンタ
    ーゼまたはその一部をエンコードする請求項３２記載のＤＮＡ分子。
  34. 【請求項３４】 当該ヌクレオチド配列がトレハロース−６−リン酸ホスフ
    ァターゼまたはその一部をエンコードする請求項３２記載のＤＮＡ分子。
  35. 【請求項３５】 トレハロース生合成酵素またはその一部を含んでなるタン
    パク質分子。
  36. 【請求項３６】 当該タンパク質がトレハロース−６−リン酸シンターゼま
    たはその一部を含んでなる請求項３５記載のタンパク質分子。
  37. 【請求項３７】 当該タンパク質がトレハロース−６−リン酸ホスファター
    ゼまたはその一部を含んでなる請求項３５記載のタンパク質分子。
  38. 【請求項３８】 請求項３２ないし３４のいずれかに記載されたＤＮＡ分子
    を含んでなる発現カセットまたはその一部を含んでなる植物であって、その場合
    の当該発現カセットが当該植物のゲノムに安定に組込まれていることを特徴とす
    る植物。
  39. 【請求項３９】 当該植物が干ばつ、浸透ストレス、または温度ストレスな
    どのストレスに抵抗性であることを特徴とする請求項３８記載の植物。
  40. 【請求項４０】 誘導性プロモーター、例えば、傷害により誘導可能なまた
    は化学的に誘導可能なプロモーターの制御下に、トレハロース−６−リン酸シン
    ターゼおよび／またはトレハロース−６−リン酸ホスファターゼなどのトレハロ
    ース生合成酵素をエンコードするヌクレオチド配列を含んでなることを特徴とす
    る植物発現カセット。
  41. 【請求項４１】 プロモーターの制御下にトレハロース−６−リン酸シンタ
    ーゼおよび／またはトレハロース−６−リン酸ホスファターゼなどのトレハロー
    ス生合成酵素をエンコードするヌクレオチド配列を含んでなる植物発現カセット
    であって、該プロモーターが当該植物の色素体中で当該ヌクレオチド配列の発現
    を指令し得るものであることを特徴とする植物発現カセット。
  42. 【請求項４２】 核エンコードポリメラーゼまたは色素体エンコードポリメ
    ラーゼなどの、通常色素体に存在するＲＮＡポリメラーゼにより転写され、かつ
    、例えば、トレハロース−６−リン酸シンターゼおよび／またはトレハロース−
    ６−リン酸ホスファターゼなどの少なくとも１種のトレハロース生合成酵素をエ
    ンコードするヌクレオチド配列に操作可能に連鎖したプロモーターを含んでなる
    ことを特徴とする色素体発現カセット。
  43. 【請求項４３】 植物色素体においてトレハロース生合成酵素を発現し得る
    プロモーター、例えば、核エンコードポリメラーゼまたは色素体エンコードポリ
    メラーゼなどの通常色素体に存在するＲＮＡポリメラーゼにより転写されるプロ
    モーター、あるいはトランス活性化因子により調節されるトランス活性化因子介
    在プロモーター（例えば、トランス活性化因子がＴ７ＲＮＡポリメラーゼである
    場合のＴ７プロモーター）であって、両方のトレハロース生合成酵素をエンコー
    ドするヌクレオチド配列を含んでなるオペロン様ポリシストロン性遺伝子に操作
    可能に連鎖したプロモーターを含んでなることを特徴とする色素体発現カセット
    。
  44. 【請求項４４】 請求項４０ないし４３のいずれかに記載の発現カセットを
    含んでなるベクター。
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IN (1) IN2000CN00368A (ja)
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WO (1) WO1999046370A2 (ja)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7214858B2 (en) * 1999-03-31 2007-05-08 E. I. Du Pont De Nemours And Company Plant genes encoding trehalose metabolism enzymes
AR024934A1 (es) * 1999-07-27 2002-10-30 Novartis Ag Genes quimericos
CA2635905C (en) 1999-12-16 2012-03-13 Monsanto Technology Llc Novel plant expression constructs
EP1263934A4 (en) * 2000-02-29 2004-05-06 Univ Auburn GENETIC ENGINEERING OF DROUGHT TOLERANCE USING A PLASTIC GENOME
US20040064846A1 (en) * 2001-02-28 2004-04-01 Henry Daniell Genetic engineering of drought tolerance via a plastid genome
EP1576101A4 (en) * 2002-04-23 2007-10-31 Scripps Research Inst EXPRESSION OF POLYPEPTIDES IN CHLOROPLASTS AND COMPOSITIONS AND METHODS OF EXPRESSION THEREOF
EP1375669A1 (en) * 2002-06-13 2004-01-02 Stichting Voor De Technische Wetenschappen Method for enhancing the disease resistance in plants by altering trehalose-6-phosphate levels
KR100440725B1 (ko) * 2002-06-20 2004-07-15 주식회사 그린진 바이오텍 비생물성 스트레스에 대한 단자엽 식물의 내성을증가시키는 방법
US20040187175A1 (en) * 2002-11-06 2004-09-23 Wu Ray J. TPS plant gene constructs and transformants
US20040146960A1 (en) * 2002-11-08 2004-07-29 Blaise Darveaux Methods for the identification of inhibitors of Trehalose-6-Phosphate Synthase as antibiotics
WO2005102034A2 (en) * 2004-04-20 2005-11-03 Syngenta Participations Ag Regulatory sequences for expressing gene products in plant reproductive tissue
CA2588372A1 (en) * 2004-12-03 2006-06-08 Syngenta Participations Ag Stress tolerance in plants through selective inhibition of trehalose-6-phosphate phosphatase
CN100355883C (zh) * 2004-12-10 2007-12-19 中国科学院上海生命科学研究院 水稻抗逆相关基因－海藻糖－6－磷酸磷酸化酶基因及其应用
EP1846561A1 (en) 2005-01-07 2007-10-24 E.I. Dupont De Nemours And Company Nucleotide sequences encoding ramosa3 and sister of ramosa3 and methods of use for same
WO2007030001A1 (en) 2005-09-06 2007-03-15 Plant Research International B.V. A transgenic plant having enhanced drought tolerance
EP2142652B1 (en) * 2007-04-03 2013-10-02 Tabletop Energy Methods for transforming eukaryotic algae
EP2162537B1 (en) * 2007-06-01 2012-01-04 Sapphire Energy, Inc. Use of genetically modified organisms to generate biomass degrading enzymes
CA2700008A1 (en) * 2007-08-01 2009-02-05 Bioglow Inc. Bioluminescent plants comprising bacterial lux operon and methods of making same
JP2010539294A (ja) * 2007-09-11 2010-12-16 サファイア エナジー，インコーポレイティド 光合成生物を用いた有機製品の製造方法ならびにその製品および組成物
AR073437A1 (es) * 2007-09-11 2010-11-10 Sapphire Energy Inc Produccion de isoprenoides mediante organismos fotosinteticos
BR122018014094B1 (pt) 2008-02-15 2021-01-05 Ceres, Inc. métodos de produção de uma planta dicotiledônea e para aumentar a tolerância ao calor em uma planta dicotiledônea
CN101289514B (zh) * 2008-06-13 2011-01-19 北京北方杰士生物科技有限责任公司 一种培育耐逆植物的方法及其专用dna片段
WO2010061404A1 (en) * 2008-11-27 2010-06-03 International Centre For Genetic Engineering And Biotechnology A method of expressing foreign protein in plastids
CN105755036A (zh) * 2009-10-22 2016-07-13 巴斯夫植物科学有限公司 具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法
JP2014527817A (ja) * 2011-09-13 2014-10-23 ストーラー エンタープライズィズ，インク トレハロースの使用による作物収穫高の増大方法
CN103998611A (zh) 2011-11-03 2014-08-20 先正达参股股份有限公司 用于增强植物中光同化作用的多核苷酸、多肽和方法
GB201609969D0 (en) 2016-06-07 2016-07-20 Univ Cape Town Drought resistance multigene construct
CN106801102B (zh) * 2017-02-23 2020-11-20 浙江省检验检疫科学技术研究院 苋属的实时荧光pcr鉴定方法
ES2972654T3 (es) * 2017-05-04 2024-06-13 Cargill Inc Levaduras que expresan trehalasa genéticamente modificadas y procedimientos de fermentación que usan tales levaduras genéticamente modificadas
US11242536B2 (en) * 2017-09-26 2022-02-08 Rutgers, The State University Of New Jersey Quality protein maize based on increased sulfur reduction in leaf cells
CN108624598A (zh) * 2018-06-06 2018-10-09 福建农林大学 Tppf基因在调控植物海藻糖合成和提高植物抗旱性中的应用
CN108728457B (zh) * 2018-06-22 2021-09-17 山东省药学科学院 一种海藻糖合成酶基因优化序列及其应用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5614395A (en) * 1988-03-08 1997-03-25 Ciba-Geigy Corporation Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof
US5693507A (en) * 1988-09-26 1997-12-02 Auburn University Genetic engineering of plant chloroplasts
US5792921A (en) * 1992-02-14 1998-08-11 Londesborough; John Increasing the trehalose content of organisms by transforming them with combinations of the structural genes for trehalose synthase
US5422254A (en) * 1992-02-14 1995-06-06 Oy Alko Ab Method to increase the trehalose content of organisms by transforming them with the structural genes for the short and long chains of yeast trehalose synthase
FI943133A0 (fi) * 1994-06-29 1994-06-29 Alko Ab Oy Transgena vaexter
CZ290830B6 (cs) 1993-06-30 2002-10-16 Syngenta Mogen B.V. Nukleová kyselina, vektor, mikroorganismus, rostlinný DNA genom, buňka a rostlina, způsob jejího získávání a způsob výroby trehalózy z ní
US5780709A (en) * 1993-08-25 1998-07-14 Dekalb Genetics Corporation Transgenic maize with increased mannitol content
CN1061376C (zh) * 1993-11-19 2001-01-31 生物技术研究及发展有限公司 用于植物体内基因表达的嵌合调节区和基因盒
US5545818A (en) * 1994-03-11 1996-08-13 Calgene Inc. Expression of Bacillus thuringiensis cry proteins in plant plastids
US5925806A (en) * 1995-06-06 1999-07-20 Mcbride; Kevin E. Controlled expression of transgenic constructs in plant plastids
MX205414B (es) * 1996-05-08 2001-12-07 Univ Mexico Nacional Autonoma Metodo para incrementar de trehalosa de los organismos por medio de su transformacion con el adnc de la trehalosa-6-fosfato sintasa/fosfatasa de selaginella lepidophylla.
CA2232741A1 (en) * 1996-07-23 1998-01-29 Novartis Ag Chemically-inducible arabidopsis pr-1 promoter
ZA989886B (en) * 1997-10-30 1999-04-30 Mogen Int Nuclear male sterile plants method of producing same and methods to restore fertility

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Publication number Publication date
US20040078848A1 (en) 2004-04-22
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