ES2972654T3 - Levaduras que expresan trehalasa genéticamente modificadas y procedimientos de fermentación que usan tales levaduras genéticamente modificadas - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a levaduras modificadas genéticamente que tienen un gen de trehalasa heterólogo y a procesos de fermentación para utilizar dichas levaduras. Las levaduras pueden expresar trehalasa en una cantidad suficiente para convertir cantidades significativas de trehalosa en glucosa, mejorando así el rendimiento del producto en una fermentación y/o reduciendo o eliminando la necesidad de añadir trehalasa exógena a la fermentación. Las levaduras también pueden incluir otros genes heterólogos para expresar enzimas útiles para mejorar el rendimiento y/o para reducir o eliminar la necesidad de añadir enzimas exógenas a la fermentación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Levaduras que expresan trehalasa genéticamente modificadas y procedimientos de fermentación que usan tales levaduras genéticamente modificadas
Lista de secuencias
Todo el contenido del archivo de texto ASCII titulado “ N00525_ST25.txt” , creado el 04 de mayo de 2018 y que tiene un tamaño de 761 kilobytes.
Antecedentes de la invención
La trehalosa es un disacárido producido en microorganismos, incluyendoSaccharomyces cerevisiae.La trehalosa se produce a menudo como resultado de estrés en el organismo. La trehalasa es una enzima glucósido hidrolasa que cataliza la conversión de trehalosa en glucosa. Algunos microorganismos pueden producir de forma nativa una trehalasa de pH neutro y/o una trehalasa ácida. Sin embargo, las levaduras de tipo natural no producen cantidades significativas de trehalasa.
AMARAL F C Y COL.: “ Molecular cloning of the neutral trehalase gene from Kluyveromyces lactis and the distinction between neutral and acid trehalases” , ARCHIVES OF MICROBIOLOGY, marzo de 1997, describe la clonación del gen KlNTH1 de Kluyveromyces lactis.
El documento WO 2016/205127 A1 se refiere a polipéptidos que tienen actividad de trehalasa.
LIU Y COL.: “ Expression, purification, and characterization of recombinant Metarhizium anisopliae acid trehalase in Pichia pastoris” , PROTEIN EXPRESSION A<n d>PURIFICATION, 26 de abril de 2007, investiga la expresión del péptido maduro de trehalasa ácida deMetarhizium anisopliaeenPichia pastorisa altos niveles bajo el control del promotor de AOX1. DUJON B Y COL., “Glycoside Hydrolase Family 65 from Kluyveromyces lactis (strain ATCC 8585) (Yeast) (Candida sphaerica)” , UNIPROT:, UNIPROT, (16/08/2004) describe la secuencia con el n.° de registro Q6CP92_K<l>U<l>A. BUTLER G Y COL., “ alpha-Trehalase from Candida parapsilosis (strain CDC 317 / ATCC MYA-4646) (Yeast) (Monilia parapsilosis)” , UniProt, (25/01/2012), describe la secuencia con el n.° de registro G8BDA6.
ZILLI D M W Y COL., “ Secretion of the acid trehalase encoded by the CgATH1 gene allows trehalose fermentation by Candida glabrata” , MICROBIOLOGICAL RESEARCH, investiga la caracterización bioquímica y molecular del catabolismo de trehalosa porCandida glabrata.
Alpha,alpha-trehalase from Candida glabrata (strain ATCC 2001 / CBS 138 / JCM 3761 / NBRC 0622 / NRRLOS Y-65) (Torulopsis glabrata)” , UniProt, (19/07/2004), describe la secuencia con el n.° de registro Q6FMU4.
El documento WO 2017/077504 A1 se refiere a células huésped de levadura recombinantes que tienen (i) una primera modificación genética para reducir la producción de una o más enzimas nativas que funcionan para producir glicerol o regular la síntesis de glicerol y/o permitir la producción de una glucoamilasa heteróloga y (ii) una segunda modificación genética para reducir la producción de una o más enzimas nativas que funcionan para producir trehalosa o regular la síntesis de trehalosa y/o permitir la expresión de una trehalasa heteróloga.
DEAN R.A. Y COL., “Trehalase; EC=3.2.1.28;Alpha-trehalose glucohydrolase from Magnaporthe oryzae (strain 70-15 / ATCC MYA-4617 / FGSC 8958)” , UniProt, (20111214), describe la secuencia con el n.° de registro G4MY35.
ZHANG LISHA Y COL., “The Function of MoGlk1 in Integration of Glucose and Ammonium Utilization in Magnaporthe oryzae” , PLOS ONE, 27 de julio de 2011, investiga la expresión heteróloga de MoGlk1 y MoHxk1 enSaccharomyces cerevisiae.
Resumen de la invención
La invención se define por las reivindicaciones. La presente invención se refiere a una levadura genéticamente modificada que puede expresar una trehalasa heteróloga. La trehalasa expresada por la levadura aumenta la producción de etanol a partir de la fermentación convirtiendo trehalosa producida por la levadura, o trehalosa que de otro modo está presente en el caldo de fermentación, en glucosa.
En un aspecto, esta descripción se refiere a una levadura genéticamente modificada que comprende un gen heterólogo que codifica para una trehalasa (EC 3.2.1.28), en donde la levadura puede producir etanol cuando la levadura está presente en un medio de fermentación que comprende trehalosa. En algunas realizaciones, la trehalasa es una trehalasa ácida. En algunas realizaciones, la trehalasa es una trehalasa neutra. En algunas realizaciones, la levadura codifica tanto para una trehalasa ácida como para una trehalasa neutra. En algunas realizaciones, el gen que codifica para la trehalasa es deKluyveromyces lactis.En algunas realizaciones, el gen que codifica para la trehalasa es deCandida parapsilosis.En algunas realizaciones, el gen que codifica para la trehalasa es deCandida glabrata.En algunas realizaciones, el gen que codifica para la trehalasa es deMagnaporthe grisea.En algunas realizaciones, el polipéptido de trehalasa codificado por la levadura tiene una identidad de secuencia de al menos el 75, 80, 85, 90, 95 ó 97 % con respecto a al menos una de las siguientes secuencias de polipéptido: Id. de sec. n.°: 1, Id. de sec. n.°: 2, Id. de sec. n.°: 3 o la Id. de sec. n. °: 87. En algunas realizaciones, el polipéptido de trehalasa codificado por la levadura incluye una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70, 80, 90 ó 95 % con respecto a la Id. de sec. n.°: 83. En algunas realizaciones, el polipéptido de trehalasa codificado por la levadura incluye una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 94 % o el 100 % de identidad de secuencia con respecto a la Id. de sec. n.°: 84 y/o la Id. de sec. n.°: 85. En algunas realizaciones, la levadura es S.cerevisiaegenéticamente modificada. En algunas realizaciones, el polipéptido de trehalasa codificado por la levadura tiene una identidad de secuencia de al menos el 75, 80, 85, 90, 95 ó 97 % con respecto a al menos una de las siguientes secuencias de polipéptido: Id. de sec. n.°: 88, Id. de sec. n. °: 89, Id. de sec. n. °: 90 o la Id. de sec. n. °: 91.
En algunas realizaciones, la levadura comprende una secuencia señal para la trehalasa heteróloga que no es nativa de la especie de la que se deriva la trehalasa. En algunas realizaciones, la trehalasa heteróloga comprende una secuencia señal no nativa. En algunas realizaciones, la trehalasa heteróloga comprende su secuencia señal nativa. En algunas realizaciones, la secuencia señal es una secuencia señal de MFa2. En algunas realizaciones, la secuencia señal de MFa2 es la Id. de sec. n.°: 4. En algunas realizaciones, la secuencia señal de MFa2 tiene una identidad de secuencia de al menos el 84 %, el 89 % o el 94 % con respecto a la Id. de sec. n.°: 4. En algunas realizaciones, el polipéptido de trehalasa codificado por la levadura tiene una identidad de secuencia de al menos el 75, 80, 85, 90, 95 ó 97 % con respecto a al menos una de las siguientes secuencias de polipéptido: Id. de sec. n.°: 8, Id. de sec. n.°: 11, Id. de sec. n.°: 14 o la Id. de sec. n.°: 92.
En un aspecto, la levadura incluye al menos un gen heterólogo que codifica para un polipéptido distinto de una trehalasa. En algunas realizaciones, la levadura comprende un gen heterólogo que codifica para una glucoamilasa (EC 3.2.1.3). En algunas realizaciones, el gen heterólogo que codifica para una glucoamilasa es un gen de glucoamilasa de una especie seleccionada del grupo que consiste enAmorphotheca resinae, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Aspergillus kawachii, Aspergillus shirousami, Blastobotrys adeninivorans, Candida albicans, Rhizopus oryzae, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomycopsis fibuligera, Brettanomyces bruxellensisyCyberlindnera jadinii.En algunas realizaciones, la glucoamilasa codificada por la levadura tiene una identidad de secuencia de al menos el 70, 80, 90 ó 95 % con respecto a al menos una de las siguientes secuencias de polipéptido: Id. de sec. n.°: 16, Id. de sec. n. °: 17, Id. de sec. n.°: 18 o la Id. de sec. n.°: 19. En algunas realizaciones, la levadura comprende un gen heterólogo que codifica para una isomaltasa (EC 3.2.1.10). En algunas realizaciones, la levadura comprende un gen heterólogo para un transportador de azúcar con una identidad de secuencia de al menos el 70, 80, 90 ó 95 % con respecto al polipéptido de la Id. de sec. n.°: 20. En algunas realizaciones, la levadura comprende un gen heterólogo para un transportador de azúcar con una identidad de secuencia de al menos el 70, 80, 90 ó 95 % con respecto al polipéptido de la Id. de sec. n. °: 21.
En un aspecto, la levadura incluye características relacionadas con el consumo de lactato. En algunas realizaciones, la levadura comprende un gen heterólogo que codifica para un polipéptido de citocromo b2 (CYB2) (EC 1.1.2.3). En algunas realizaciones, el polipéptido de CYB2 tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 50 %, el 55 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 97 % o el 99 % con respecto a una cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos: Id. de sec. n.°: 27, Id. de sec. n.°: 28, Id. de sec. n. °: 29, Id. de sec. n. °: 30, Id. de sec. n. °: 31, Id. de sec. n. °: 32 o la Id. de sec. n. °: 33. En algunas realizaciones, la levadura codifica para un polipéptido de CYB2 que comprende uno o más de los siguientes residuos en las posiciones indicadas en la Id. de sec. n.°: 27, Id. de sec. n.°: 28, Id. de sec. n.°: 29, Id. de sec. n.°: 30, Id. de sec. n.°: 31, Id. de sec. n.°: 32 o la Id. de sec. n.°: 33: Lys349, Tyr143, Tyr254 y His373. En algunas realizaciones, la levadura comprende un gen heterólogo que codifica para un polipéptido de D-lactato deshidrogenasa (DLD) (EC 1.1.2.4). En algunas realizaciones, el polipéptido de DLD tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 50 %, el 55 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 97 % o el 99 % con respecto a una cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos: Id. de sec. n.°: 34, Id. de sec. n.°: 35, Id. de sec. n.°: 36, Id. de sec. n.°: 37, Id. de sec. n.°: 38, Id. de sec. n.°: 39, Id. de sec. n.°: 40 o la Id. de sec. n.°: 41. En algunas realizaciones, la levadura comprende un gen heterólogo que codifica para un transportador monocarboxílico/monocarboxilato. En algunas realizaciones, el transportador monocarboxílico/monocarboxilato codificado por la levadura tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 50 %, el 55 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 97 % o el 99 % con respecto a una cualquiera de la siguiente secuencia de aminoácidos: Id. de sec. n. °: 22, Id. de sec. n.°: 23, Id. de sec. n.°: 24, Id. de sec. n.°: 25 o la Id. de sec. n.°: 26.
En algunas realizaciones, la levadura secreta trehalasa en una cantidad suficiente para reducir el contenido de trehalosa de un caldo de fermentación hasta menos de 0,5 g/l, 1 g/l, 2 g/l, 3 g/l, 4 g/l, 5 g/l, 6 g/l, 7 g/l, 8 g/l, 9 g/l o 10 g/l cuando el título de etanol es de al menos 75 g/l. En algunas realizaciones, la levadura puede secretar la trehalasa de manera extracelular. En algunas realizaciones, el polipéptido de trehalasa codificado por la levadura tiene una identidad de secuencia de al menos el 76 %, al menos el 84 %, al menos el 92 % o el 100 % de identidad de secuencia con respecto a la Id. de sec. n.°: 86. En algunas realizaciones, la levadura puede producir etanol a un título de 80 g/l, 90 g/l, 100 g/l, 110 g/l, 120 g/l, 125 g/l, 130 g/l, 135 g/l o mayor.
En un aspecto, la descripción se refiere a procedimientos que usan cualquiera de las levaduras descritas en la presente memoria. En una realización, el procedimiento es un procedimiento para fabricar etanol que comprende: fermentar un medio usando una levadura genéticamente modificada, en donde la levadura comprende un gen de trehalasa heterólogo, en donde el título de etanol al final de la fermentación es de al menos 90 g/l. En algunas realizaciones, la temperatura de fermentación del procedimiento está en el intervalo de 25 a 45 0C, de 25 a 40 0C, de 25 a 35 0C, de 30 a 40 0C o de 28 a 38 0C. En algunas realizaciones, el título de etanol al final de la fermentación es de al menos 80, 90, 100, 110, 120, 130, 135, 140, 145, 150, 155 ó 160 g/litro.
En un aspecto, la descripción se refiere a una levadura genéticamente modificada que comprende un gen heterólogo que codifica para un polipéptido de trehalasa (EC 3.2.1.28) que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80 % con respecto a la Id. de sec. n.°: 1(K. lactis)en donde la levadura puede producir etanol cuando la levadura está presente en un medio de fermentación que comprende trehalosa y la levadura secreta trehalasa en una cantidad suficiente para reducir el contenido de trehalosa de un caldo de fermentación hasta menos de 2 g/l cuando el título de etanol es de al menos 110 g/l. En un aspecto, la descripción se refiere a una levadura genéticamente modificada que comprende un gen heterólogo que codifica para un polipéptido de trehalasa (EC 3.2.1.28) que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80 % con respecto a la Id. de sec. n.°: 2 (C.parapsilosis)en donde la levadura puede producir etanol cuando la levadura está presente en un medio de fermentación que comprende trehalosa y la levadura secreta trehalasa en una cantidad suficiente para reducir el contenido de trehalosa de un caldo de fermentación hasta menos de 2 g/l cuando el título de etanol es de al menos 110 g/l. En un aspecto, la descripción se refiere a una levadura genéticamente modificada que comprende un gen heterólogo que codifica para un polipéptido de trehalasa (EC 3.2.1.28) que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80 % con respecto a la Id. de sec. n.°: 3 (C.glabrata)en donde la levadura puede producir etanol cuando la levadura está presente en un medio de fermentación que comprende trehalosa y la levadura secreta trehalasa en una cantidad suficiente para reducir el contenido de trehalosa de un caldo de fermentación hasta menos de 2 g/l cuando el título de etanol es de al menos 110 g/l. En un aspecto, la descripción se refiere a una levadura genéticamente modificada que comprende un gen heterólogo que codifica para un polipéptido de trehalasa (EC 3.2.1.28) que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80 % con respecto a la Id. de sec. n.°: 87(M. grisea)en donde la levadura puede producir etanol cuando la levadura está presente en un medio de fermentación que comprende trehalosa y la levadura secreta trehalasa en una cantidad suficiente para reducir el contenido de trehalosa de un caldo de fermentación hasta menos de 2 g/l cuando el título de etanol es de al menos 110 g/l.
En algunas realizaciones, el polipéptido de trehalasa codificado por la levadura comprende incluye una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70, 80, 90 ó 95 % con respecto a la Id. de sec. n.°: 83. En algunas realizaciones, el polipéptido de trehalasa codificado por la levadura comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 94 % o el 100 % de identidad de secuencia con respecto a la Id. de sec. n. °: 84 y/o la Id. de sec. n. °: 85. En algunas realizaciones, la levadura es S.cerevisiaegenéticamente modificada. En algunas realizaciones, la trehalasa codificada por la levadura comprende una secuencia señal de MFa2. En algunas realizaciones, la secuencia señal de MFa2 es la Id. de sec. n.°: 4. En algunas realizaciones, la secuencia señal de MFa2 tiene una identidad de secuencia de al menos el 84 %, el 89 % o el 94 % con respecto a la Id. de sec. n. °: 4. En algunas realizaciones, la trehalasa codificada por la levadura tiene una identidad de secuencia de al menos el 75, 80, 85, 90, 95 ó 97 % con respecto a al menos una de las siguientes secuencias de polipéptido: Id. de sec. n.°: 8, Id. de sec. n.°: 11, Id. de sec. n.°: 14 o la Id. de sec. n.°: 92.
En un aspecto, la levadura comprende además un gen heterólogo que codifica para un polipéptido de glucoamilasa (EC 3.2.1.3). En algunas realizaciones, el polipéptido de glucoamilasa codificado por la levadura tiene una identidad de secuencia de al menos el 70, 75, 80, 85, 90 ó 95 % con respecto a al menos una de las siguientes secuencias de polipéptido: Id. de sec. n.°: 16 (Sf Ga ), Id. de sec. n.°: 17 (Ro GA), Id. de sec. n.°: 108 (Rmic GA) o la Id. de sec. n.°: 109 (Rdel GA).
En un aspecto, la levadura secreta trehalasa en una cantidad suficiente para reducir el contenido de trehalosa de un caldo de fermentación hasta menos de 0,5 g/l o 1 g/l cuando el título de etanol es de al menos 110 g/l. En algunas realizaciones, la levadura puede secretar la trehalasa de manera extracelular. En algunas realizaciones, el polipéptido de trehalasa codificado por la levadura comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 76 %, al menos el 84 %, al menos el 92 % o el 100 % de identidad de secuencia con respecto a la Id. de sec. n.°: 86.
En un aspecto, la levadura comprende un ácido nucleico recombinante que codifica para una gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (E.C. 1.2.1.9); y expresión reducida o eliminada de un gen que codifica para una glicerol-3-fosfato fosfatasa (E.C. 3.1.3.21). En un aspecto, la levadura comprende un ácido nucleico recombinante que codifica para una gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa(GAPN,E.C. 1.2.1.9). En algunas realizaciones, el ácido nucleico recombinante que codifica para una gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (E.C. 1.2.1.9) codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80 %, el 85 %, el 90 % o el 95 % con respecto a la Id. de sec. n.°: 111 (GAPN deBacillus cereus).
En algunas realizaciones, la levadura puede producir etanol a un título de 80 g/l, 90 g/l, 100 g/l, 110 g/l, 120 g/l, 125 g/l, 130 g/l, 135 g/l o mayor. En algunas realizaciones, la levadura produce un título y/o rendimiento más alto de etanol en comparación con una levadura que no expresa una trehalasa heteróloga. En algunas realizaciones, la levadura produce un título y/o rendimiento más alto de etanol en comparación con una levadura que no expresa una trehalasa heteróloga, pero por lo demás es idéntica a la levadura. En algunas realizaciones, la levadura produce un título y/o rendimiento más alto de etanol en comparación con una levadura que expresa una trehalasa heteróloga diferente.
En un aspecto, la descripción se refiere a un procedimiento para la fabricación de etanol que comprende: fermentar un medio usando una levadura genéticamente modificada, en donde la levadura comprende un gen de trehalasa heterólogo que codifica para un polipéptido de trehalasa (EC 3.2.1.28) que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80 % con respecto a una o más de las siguientes secuencias de polipéptido: Id. de sec. n.°: 1 (K. lactis), Id. de sec. n.°: 2 (C.parapsilosis),Id. de sec. n.°: 3 (C.glabrata)o la Id. de sec. n.°: 87(M. grisea),en donde el título de etanol al final de la fermentación es de al menos 105 g/l tal como se mide 36 h después de la inoculación y el contenido de trehalosa del caldo de fermentación al final de la fermentación es menor de 2 g/l. En algunas realizaciones, la levadura del procedimiento comprende un gen de trehalasa heterólogo que codifica para un polipéptido de trehalasa (EC 3.2.1.28) que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80 % con respecto a tan sólo una de las siguientes secuencias de polipéptido: Id. de sec. n.°: 1(K. lactis),Id. de sec. n.°: 2(C. parapsilosis),Id. de sec. n.°: 3 (C.glabrata)o la Id. de sec. n.°: 87(M. grisea).
En algunas realizaciones, la temperatura de fermentación está en el intervalo de 25 a 45 0C, de 25 a 40 0C, de 25 a 35 0C, de 30 a 40 0C o de 28 a 38 0C. En algunas realizaciones, el título de etanol al final de la fermentación es de al menos 120, 130, 135, 140, 145, 150, 155 ó 160 g/litro. En algunas realizaciones, la levadura es la levadura de cualquier realización o aspecto descrito en la presente memoria.
Los valores para el contenido de etanol y trehalosa en un caldo de fermentación pueden evaluarse y medirse según el método de matraz de agitación descrito a continuación en el ejemplo 1.
Breve descripción de los dibujos
La siguiente descripción detallada de la invención se entenderá mejor cuando se lea junto con los dibujos adjuntos. Sin embargo, debe entenderse que la invención no se limita a las disposiciones e instrumentos precisos de las realizaciones mostradas en los dibujos.
La Figura 1 es un gráfico que muestra la concentración de trehalosa a lo largo del tiempo en una fermentación usando diferentes cepas de levadura.
Las Figuras 2 y 3 son gráficos que muestran cantidades de etanol en una fermentación sin trehalosa añadida.
La Figura 4 es un gráfico que muestra la concentración de trehalosa a lo largo del tiempo en fermentaciones con trehalosa añadida.
Las Figuras 5 y 6 son gráficos que muestran cantidades de etanol en una fermentación con trehalosa añadida.
La Figura 7 es un gráfico que muestra la concentración de trehalosa a lo largo del tiempo en fermentaciones con trehalosa añadida.
Las Figuras 8 y 9 son gráficos que muestran cantidades de etanol en una fermentación con trehalosa añadida.
La Figura 10 es un gráfico que muestra las cantidades de etanol en una fermentación de mosto de maíz mediante usando diferentes cepas de levadura.
La Figura 11 es un gráfico que muestra las cantidades de trehalosa en una fermentación de mosto de maíz usando diferentes cepas de levadura.
Descripción detallada
Debe entenderse que las figuras y descripciones de la presente invención proporcionadas en la presente memoria se han simplificado para ilustrar elementos que son relevantes para una comprensión clara de la presente invención, al tiempo que se eliminan otros elementos encontrados en el/los campo(s) relacionado(s) de la técnica. Los expertos habituales en la técnica reconocerán que otros elementos o etapas pueden ser deseables o requerirse en la implementación de la presente invención. Sin embargo, debido a que tales elementos o etapas se conocen bien en la técnica o no facilitan una mejor comprensión de la presente invención, no se proporciona una discusión de tales elementos o etapas en la presente memoria.
Definiciones
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado tal como entiende habitualmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Tal como se usa en la presente memoria, cada uno de los siguientes términos tiene el significado asociado con el mismo como se define en esta sección.
Definiciones de procedimiento de fermentación
Como se usa en la presente memoria, “ inoculación” se define como el punto en el tiempo en donde un microorganismo que puede producir un producto de fermentación se introduce en un medio de fermentación. Este es un término muy conocido por los expertos en la técnica.
Como se usa en la presente memoria, “final de la fermentación” se define como el punto en el tiempo en donde un procedimiento de fermentación cumple con unos criterios predeterminados. Los criterios predeterminados pueden incluir cualquiera de los siguientes: un intervalo de tiempo predeterminado, agotamiento de la fracción deseada de fuente de carbono suministrada, cese del consumo de la fuente de carbono, o cese de la formación del producto de fermentación. En una realización, “final de la fermentación” se define como el punto en el tiempo donde se inicia la recogida del producto biológico. Como entenderá un experto en la técnica, “final de fermentación” puede referirse a un punto en el tiempo que es diferente dependiendo de la escala y el propósito del procedimiento de fermentación. Para un procedimiento de fermentación de producción a gran escala, el “final de la fermentación” es preferiblemente el punto en el que se inicia la recogida del producto biológico, es decir, después de que la formación del producto se haya detenido efectivamente.
Como se usa en la presente memoria, “peso seco celular” se refiere a la concentración de masa celular seca presente en un medio de fermentación en el momento de la medición, tal como se mide en una muestra de fermentación. El peso seco celular se expresa habitualmente en unidades de gramos/litro (g/l).
Como se usa en la presente memoria, “ peso seco celular en la inoculación” se refiere a la concentración de masa celular seca presente en un medio de fermentación inmediatamente después de la inoculación, tal como se mide en una muestra de fermentación. Para fermentaciones semicontinuas, el peso seco celular inicial se calcula basándose en el volumen final del medio de fermentación. La medición del peso celular seco es un método conocido por los expertos en la técnica. El peso seco celular en la inoculación se expresa habitualmente en unidades de g/l.
Como se usa en la presente memoria, “peso seco celular al final de la fermentación” se refiere a la concentración de masa celular seca presente en un medio de fermentación al final de la fermentación, tal como se mide en una muestra de fermentación. El peso seco celular al final de la fermentación se expresa habitualmente en unidades de g/l.
Como se usa en la presente memoria, “ título final” se refiere a la concentración de una sustancia en el caldo de fermentación al final de la fermentación. El título final se expresa habitualmente en unidades de g/l.
Como se usa en la presente memoria, “ título inicial” se refiere a la concentración de una sustancia presente en la inoculación. El título inicial se expresa habitualmente en unidades de g/l.
Como se usa en la presente memoria, “tiempo de lote” se refiere a la cantidad de tiempo que ha transcurrido entre la inoculación y el final de la fermentación. El tiempo del lote se expresa habitualmente en unidades de horas (h).
Como se usa en la presente memoria, “tasa de producción de fermentación” para un procedimiento discontinuo se refiere al título final menos el título inicial del producto de fermentación (título final menos título inicial) dividido entre el tiempo de lote. La tasa de producción se expresa habitualmente en unidades de gramos por litro-hora (g l-1 h-1). Cuando se aplica a un procedimiento continuo o semicontinuo, la “tasa de producción de fermentación” se determina mediante el uso de métodos conocidos en la técnica.
Como se usa en la presente memoria, la “tasa de producción específica” se refiere a la tasa de producción de fermentación dividida entre el peso seco celular al final de la fermentación. La tasa de producción específica se expresa habitualmente en unidades de (g de producto) (g de células)-1 h-1. Cuando se aplica a un procedimiento continuo o semicontinuo, la “tasa de producción específica” se determina mediante el uso de métodos conocidos en la técnica.
Como se usa en la presente memoria, “ rendimiento de producto” de un producto de fermentación se refiere a una razón de dos cantidades: a) masa de producto (por ejemplo, succinato) producido en el transcurso de la fermentación (numerador), b) la masa de fuente de carbono añadida a la fermentación (denominador). El rendimiento de producto como porcentaje se expresa habitualmente en unidades de gramo por gramo (g/g) multiplicado por 100. Debe indicarse particularmente que el rendimiento de producto se calcula como una razón de masas. La masa de producto de fermentación producida debe tener en cuenta la masa de producto de fermentación presente en el medio de fermentación al final del lote, así como la masa de cualquier producto de fermentación recogida durante el transcurso del lote, menos la masa de producto de fermentación presente al inicio del lote, y además menos la masa de cualquier producto de fermentación añadido durante el transcurso del lote. La masa de fuente de carbono añadida al lote debe incluir la masa de todas las fuentes de carbono presentes en el fermentador al inicio del lote además de la masa de cualquier fuente de carbono añadida durante el transcurso del lote.
Como se usa en la presente memoria, “tasa de captación de oxígeno” (“OUR” ) se refiere a la tasa volumétrica a la que se consume oxígeno durante una fermentación. Las concentraciones de oxígeno de entrada y salida se pueden medir con análisis de gases de escape, por ejemplo, mediante espectrómetros de masas. OUR puede calcularse por un experto habitual en las técnicas relevantes usando el método directo descrito en Bioreaction Engineering Principles, 2a edición, 2003, Kluwer Academic/Plenum Publishers, pág. 449, ecuación 1. Se mide habitualmente en unidades de (mmol de O2) l-1 h-1.
Como se usa en la presente memoria, “tasa de captación de oxígeno específica” se refiere a la tasa específica a la que se consume oxígeno durante una fermentación. Se calcula como la razón de OUR con respecto al peso seco celular medido. Se mide habitualmente en unidades de mmol de O2 (g de peso seco celular)-1 h-1.
Definiciones de características de levadura
Los términos “genéticamente modificado” y “ modificado por ingeniería genética” se usan de manera intercambiable en la presente memoria, y se refieren a cualquier alteración del material genético de un organismo, o a un organismo alterado de este modo. Para los fines de esta descripción, no se pretende que estos términos estén limitados por el método de alteración.
En ciertas realizaciones, las células de levadura genéticamente modificadas proporcionadas en la presente memoria comprenden además una deleción o alteración de uno o más genes nativos. Como se usa en la presente memoria, la frase “deleción o alteración” con respecto a un gen nativo significa o bien que se elimina la región codificante entera del gen (deleción) o bien se modifica la región codificante del gen, su promotor y/o su región de terminador (tal como mediante deleción, inserción o mutación) de manera que el gen ya no produce una enzima activa, produce una cantidad intensamente reducida (al menos el 75 % de reducción, preferiblemente al menos el 90 % de reducción) de una enzima activa, o produce una enzima con una actividad intensamente reducida (reducida en al menos el 75 %, preferiblemente reducida en al menos el 90 %).
En ciertas realizaciones, la deleción o alteración de uno o más genes nativos da como resultado una deleción o alteración de una o más rutas metabólicas nativas. La expresión “deleción o alteración” con respecto a una ruta metabólica significa que la ruta o bien es inoperativa o bien muestra una actividad que está reducida en al menos el 75 %, al menos el 85 % o al menos el 95 % con respecto a la ruta nativa.
En algunas realizaciones, la deleción o alteración de genes nativos se puede lograr mediante evolución forzada, mutagénesis o métodos de ingeniería genética, seguido por una selección o cribado apropiado para identificar los mutantes deseados. En algunas realizaciones, la deleción o alteración de un gen de la célula huésped nativa puede acoplarse a la incorporación de uno o más genes exógenos en la célula huésped, es decir, los genes exógenos pueden incorporarse mediante el uso de un constructo de integración de expresión génica que también es un constructo de deleción. En algunas realizaciones, la deleción o alteración puede lograrse mediante el uso de un constructo de deleción que no contiene un gen exógeno o mediante otros métodos conocidos en la técnica.
El término “ heterólogo” como se usa en la presente memoria con respecto a componentes genéticos significa que el componente genético está presente en una versión modificada de un microorganismo, pero no está presente en el genoma de una forma nativa de la célula de microorganismo particular. En algunas realizaciones, el componente genético heterólogo puede ser una forma modificada de un componente que era nativo con respecto a la célula, puede derivarse de otro organismo, puede ser una forma modificada de un componente derivado de otro organismo, o puede ser un componente derivado sintéticamente. En una realización preferida, el componente genético heterólogo se integra en el genoma del microorganismo modificado. Por ejemplo, el gen de trehalasa deK. lactises heterólogo cuando se introduce en S.cerevisiae.
El término “exógeno” como se usa en la presente memoria significa cualquier material que se origina fuera del microorganismo de interés. Por ejemplo, el término “exógeno” puede aplicarse al material genético que no está presente en la forma nativa de un organismo particular antes de la modificación genética (es decir, tal material genético exógeno también puede denominarse heterólogo), o también puede aplicarse a una enzima u otra proteína que no se origina de un organismo particular.
La inspección de secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos para dos ácidos nucleicos o dos polipéptidos revelará la identidad de secuencia y similitudes entre las secuencias comparadas. La alineación de secuencias y la generación de identidad de secuencia incluyen alineaciones globales y alineaciones locales que se llevan a cabo usando enfoques computacionales. Se puede realizar una alineación usando el software BLAST (National Center for Biological Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool) versión 2.2.31 con parámetros por defecto. La identidad de secuencia de aminoácidos en % entre secuencias de aminoácidos se puede determinar usando BLAST de proteínas convencional con los siguientes parámetros por defecto: secuencias diana máximas: 100; consultas cortas: ajustar automáticamente los parámetros para secuencias de entrada cortas; umbral esperado: 10; tamaño de palabra: 6; coincidencias máximas en un intervalo de consulta: 0; matriz: BLOSUM62; costes por huecos: (existencia: 11, extensión: 1); ajustes de la composición: ajuste de matriz de puntuación de composición condicionada; filtro: ninguno seleccionado; máscara: ninguna seleccionada. La identidad de secuencia de ácido nucleico en % entre secuencias de ácido nucleico se puede determinar usando BLAST de nucleótidos convencional con los siguientes parámetros por defecto: secuencias diana máximas: 100; consultas cortas: ajustar automáticamente los parámetros para secuencias de entrada cortas; umbral esperado: 10; tamaño de palabra: 28; coincidencias máximas en un intervalo de consulta: 0; puntuaciones de coincidencia/coincidencia errónea: 1, -2; costes por huecos: lineal; filtro: regiones de baja complejidad; máscara: máscara únicamente para tabla de consulta. Una secuencia que tiene una puntuación de identidad del XX %(por ejemplo, del 80 %) con respecto a una secuencia de referencia mediante el uso del algoritmo de NCBI BLAST versión 2.2.31 con parámetros por defecto se considera que es idéntica en al menos el XX % o, de manera equivalente, tiene una identidad de secuencia del XX % con respecto a la secuencia de referencia.
A lo largo de esta descripción, diversos aspectos de la invención pueden presentarse en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es simplemente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. Por consiguiente, debe considerarse que la descripción de un intervalo ha descrito específicamente todos los posibles subintervalos, así como valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, debe considerarse que la descripción de un intervalo tal como desde 1 hasta 7 ha descrito específicamente subintervalos tales como desde 1 hasta 3, desde 1 hasta 4, desde 1 hasta 6, desde 2 hasta 5, desde 3 hasta 5, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 3, 3,6, 4, 5, 5,8, 6, 7, y cualquier incremento completo y parcial entre los mismos. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.
Descripción
En la presente memoria se describen cepas de levadura genéticamente modificadas útiles para fabricar un producto de fermentación y procedimientos de fermentación que usan estas levaduras. Las cepas de levadura se modifican para incluir uno o más genes de trehalasa heterólogos. En algunas realizaciones, las cepas de levadura también pueden incluir otros genes heterólogos, por ejemplo, un gen de glucoamilasa heterólogo, sin tener ningún efecto adverso significativo sobre el nivel deseado de expresión de enzimas heterólogas y/o rendimiento de la levadura en procedimientos de fermentación.
Levadura modificada por ingeniería genética
La trehalasa es una enzima glucósido hidrolasa que cataliza la conversión de trehalosa en glucosa. En un aspecto, la levadura modificada por ingeniería genética (GE) descrita en la presente memoria se ha modificado para incluir un gen de trehalasa heterólogo. En algunas realizaciones, la levadura GE se produce a partir de una célula de levadura huésped de S.cerevisiae.En algunas realizaciones, la célula de levadura huésped es una cepa de levadura que es adecuada para la producción de etanol, por ejemplo, Ethanol Red™ o una cepa similar de S.cerevisiae.Por consiguiente, en algunas realizaciones, la levadura GE es tolerante a las condiciones usadas en un procedimiento de fermentación de etanol, tales como temperaturas y/o concentraciones de etanol relativamente altas. En algunas realizaciones, la inclusión de un gen de trehalasa heterólogo puede mejorar la tolerancia al calor y/o etanol en comparación con la célula huésped.
En algunas realizaciones, la levadura GE puede incluir uno o más genes para expresar un polipéptido de trehalasa a partir de una o más de las siguientes especies:Kluyveromyces lactis, Candida parapsilosisyCandida glabrata.En algunas realizaciones, la levadura GE expresa un polipéptido de trehalasa con una identidad de secuencia de al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o el 97 % con respecto a al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos: Id. de sec. n.°: 1(Kluyveromyces lactis),Id. de sec. n.°: 2(Candida parapsilosis)o la Id. de sec. n.°: 3(Candida glabrata).En algunas realizaciones, la levadura GE expresa un polipéptido de trehalasa a partir deMagnaporthe grisea(Id. de sec. n. °: 87). En algunas realizaciones, la levadura GE expresa un polipéptido de trehalasa con una identidad de secuencia de al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o el 97 % con respecto a la Id. de sec. n.°: 87. En un aspecto, la levadura GE puede incluir un gen de trehalasa nativo sobreexpresado en lugar o además de un gen de trehalasa heterólogo, por ejemplo, un gen de trehalasa de S.cerevisiaesobreexpresado en una levadura GE derivada de una levadura huésped de S.cerevisiae.Para los fines de esta descripción y las reivindicaciones, cualquier gen nativo sobreexpresado y cualquier polipéptido codificado a partir de tal gen se considerará heterólogo.
En algunas realizaciones (no según la invención reivindicada), la levadura GE puede incluir uno o más genes para expresar un polipéptido de trehalasa a partir de una o más de las siguientes especies, en donde la secuencia de polipéptido asociada para cada especie se incluye entre paréntesis junto al nombre de especie:Saccharomyces cerevisiae(Id. de sec. n.°: 42),Torulaspora delbrueckii(Id. de sec. n.°: 43),Kazachstania naganishii(Id. de sec. n.°: 44),Tetrapisispora blattae(Id. de sec. n.°: 45),Zygosaccharomyces rouxii(Id. de sec. n.°: 46),Zygosaccharomyces parabailii(Id. de sec. n.°: 47),Tetrapisispora phaffii(Id. de sec. n.°: 48),Eremothecium gossypii(Id. de sec. n.°: 49),Eremothecium sinecaudum(Id. de sec. n.°: 50),Lachancea mirantina(Id. de sec. n.°: 51),Candida orthopsilosis(Id.
de sec. n.°: 52),Candida maltose(Id. de sec. n.°: 53),Candida tropicalis(Id. de sec. n.°: 54),Candida albicans(Id. de sec. n.°: 55),Lodderomyces elongisporus(Id. de sec. n.°: 56),Candida dubliniensis(Id. de sec. n.°: 57),Spathaspora passalidarum(Id. de sec. n.°: 58),Scheffersomyces stipitis(Id. de sec. n.°: 59),Debaryomyces fabryi(Id. de sec. n.°: 60),Candida tanzawaensis(Id. de sec. n.°: 61),Kluyveromyces dobzhanskii(Id. de sec. n.°: 62),Kluyveromyces marxianus(Id. de sec. n.°: 63),Zygosaccharomyces rouxii(Id. de sec. n.°: 64),Naumovozyma dairenensis(Id. de sec. n.°: 65),Lachancea thermotolerans(Id. de sec. n.°: 66),Lachancea quebecensis(Id. de sec. n.°: 67),Tetrapisispora phaffii(Id. de sec. n.°: 68),Lachancea fermentati(Id. de sec. n.°: 69),Lachancea nothofagi(Id. de sec. n.°: 70),Tetrapisispora blattae(Id. de sec. n. °: 71),Gaeumannomyces tritici(Id. de sec. n.°: 72),Magnaporthiopsis poae(Id. de sec. n.°: 73),Thermothelomyces thermophila(Id. de sec. n.°: 74),Colletotrichum nymphaeae(Id. de sec. n.°: 75),Colletotrichum orchidophilum(Id. de sec. n.°: 76),Coniochaeta ligniaria(Id. de sec. n.°: 77),Thielavia terrestris(Id. de sec. n.°: 78),Madurella mycetomatis(Id. de sec. n.°: 79),Neurospora crassa(Id. de sec. n.°: 80),Verticillium dahlia(Id. de sec. n.°: 81) y/oGibberella zeae(Id. de sec. n. °: 82). La levadura GE puede expresar un polipéptido de trehalasa con una identidad de secuencia de al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o el 97 % con respecto a una o más de cualquiera de estas secuencias de aminoácidos.
En algunas realizaciones, la levadura GE codifica para un polipéptido de trehalasa heterólogo de una especie que incluye un patrón o motivo de firma, es decir, un subconjunto de aminoácidos en la secuencia completa para el polipéptido de trehalasa que es idéntico o casi idéntico a un subconjunto de aminoácidos de una trehalasa de otra especie. Por ejemplo, cada una de las trehalasas de la Id. de sec. n.°: 1(Kluyveromyces lactis),Id. de sec. n.°: 2(Candida parapsilosis),y la Id. de sec. n.°: 3(Candida glabrata)incluye el siguiente motivo de aminoácidos: QPYVANGYIGSRIPN (Id. de sec. n.°: 83). En algunas realizaciones, la levadura GE expresa un polipéptido de trehalasa que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 % o el 100 % con respecto a la Id. de sec. n.°: 83. Además, cada una de las trehalasas de la Id. de sec. n. °: 1(Kluyveromyces lactis),Id. de sec. n. °: 2(Candida parapsilosis)y la Id. de sec. n.°: 3 incluye ambos de los siguientes motivos con una identidad de secuencia de más del 90 %: GVAGLSSDSYGGMVFWD (Id. de sec. n.°: 84) y NITLEYSGMNSSVEIKQADV (Id. de sec. n.°: 85). En algunas realizaciones, la levadura GE expresa un polipéptido de trehalasa que tiene una porción de la secuencia con una identidad de secuencia de al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 94 % o el 100 % con respecto a la Id. de sec. n.°: 84 y/o la sea Id. de sec. n.°: 85. La siguiente secuencia de aminoácidos se incluye en la mayoría o en todas las trehalasas ácidas: NITLEYSGMNSSV (Id. de sec. n. °: 86). En algunas realizaciones, la levadura GE expresa un polipéptido de trehalasa que tiene una porción de la secuencia con una identidad de secuencia de al menos el 76 %, al menos el 84 %, al menos el 92 % o el 100 % con respecto a la Id. de sec. n. °: 86. Se sabe que S.cerevisiaetiene genes de trehalasa nativos que expresan dos tipos de trehalasa, tanto una trehalasa ácida (AT) como una trehalasa neutra (NT), que se caracterizan según el pH de expresión óptimo. Sin embargo, ambas trehalasas nativas están fuertemente reguladas y presentan baja actividad. En condiciones de bajo o ningún estrés, se producen muy pocas de estas trehalasas. Además, estas trehalasas pueden estar confinadas a la vacuola (para una discusión sobre trehalasas de S.cerevisiaevéase, por ejemplo, Parrou, J.L., Jules, M., Beltran, G., Francois, J. Acid trehalase in yeasts and filamentous fungi: Localization, regulation and physiological function (2005) FEMS Yeast Research, 5 (6-7), págs. 503-511; Eleutherio, E., Panek, A., De Mesquita, J.F., Trevisol, E., Magalhaes, R. Revisiting yeast trehalose metabolism (2015) Current Genetics, 61 (3), págs. 263-274).
Zilli y col. describieron la expresión heteróloga de la trehalasa deCandida glabrataenSaccharomyces(Zilli, D.M.W., Lopes, R.G., Alves, S.L., Barros, L.M., Miletti, L.C., Stambuk, B.U. Secretion of the acid trehalase encoded by the CgATH1 gene allows trehalose fermentation by Candida glabrata (2015) Microbiological Research, 179, págs. 12-19). Sin embargo, la cepa de levadura en Zilli que incluía la trehalasa deCandida glabrataprodujo cantidades muy bajas de etanol, es decir, una cantidad de etanol no útil para un procedimiento comercial. Las levaduras GE de la presente invención pueden producir cantidades de etanol comercialmente útiles, significativamente más altas.
En un aspecto, la levadura GE de la presente invención expresa una trehalasa que se secreta de manera extracelular en cantidades significativas, en lugar de expresarse y limitarse en una vacuola, como se observa en la trehalasa de S.cerevisiaenativa. Por consiguiente, la trehalasa expresada puede actuar sobre la trehalosa extracelular en el caldo de fermentación, es decir, la trehalosa producida como metabolito por la levadura durante la fermentación. En algunas realizaciones, la levadura GE secreta más trehalasa que una levadura de tipo natural, pero no produce una cantidad de trehalasa que provoque una carga metabólica significativa para la levadura, es decir, la levadura produce suficiente trehalasa para consumir la mayor parte o la totalidad de la trehalosa producida por la célula sin provocar otros problemas que afecten negativamente al rendimiento de fermentación. En algunas realizaciones, la levadura puede incluir un promotor que está asociado con evitar que la levadura produzca una cantidad de trehalasa que provoque una carga metabólica para la célula, o que de otro modo afecte negativamente al rendimiento de fermentación.
Para los fines de esta descripción, en un aspecto, una trehalasa es una enzima de EC 3.2.1.28. Por consiguiente, una trehalasa es cualquier enzima para la que la actividad primaria es hidrólisis de trehalosa. En un aspecto, una trehalasa es cualquier enzima que muestre una actividad significativa sobre trehalosa dentro de un intervalo de tiempo razonable.
En un aspecto, la expresión de trehalasa en la levadura GE puede optimizarse o mejorarse incluyendo una secuencia señal de péptido, es decir, una secuencia líder, que es diferente de la secuencia líder de tipo natural asociada con una determinada trehalasa. En algunas realizaciones, el péptido señal es una secuencia señal de MFa2. En un aspecto, una proteína de trehalasa expresada de la descripción puede incluir una secuencia señal que tiene una identidad de secuencia de aproximadamente el 79 % o más, el 84 % o más, el 89 % o más o el 94 % o más con respecto a la Id. de sec. n.°: 4, que se deriva del extremo N-terminal del gen del factor alfa 2 de acoplamiento deSaccharomyces cerevisiae (ScMFa2). En algunas realizaciones, la secuencia deScMFa2 SS es la siguiente: MKFISTFLTFILAAVSVTA (Id. de sec. n.°: 4). La secuencia deScMFa2 es del gen YGL089C (YGL089C), mientras que MFa1 se codifica por el gen YPL187W. MFa1 y MFa2 son feromonas secretadas por células MATa. Los polipéptidos de trehalasa modificados con señal de secreción deScMFa2 y cepas de levadura modificadas por ingeniería que expresan los mismos se describen en la solicitud de patente internacional con número de serie PCT/US 2016/016822, y presentada el 5 de febrero de 2016 (Miller, y col.). La señal de secreción de factor de acoplamiento alfa 2 deSaccharomyces cerevisiae (ScMFa2) se describe en la patente estadounidense n.° 4.546.082 (Kurjan y col.). En algunas realizaciones, la levadura incluye un gen para expresar una trehalasa codificada por la levadura que tiene una identidad de secuencia de al menos el 75, 80, 85, 90, 95 o 97 % con respecto a al menos una de las siguientes secuencias de polipéptido: Id. de sec. n.°: 8, Id. de sec. n.°: 11, Id. de sec. n.°: 14 o la Id. de sec. n. °: 92 (es decir, una trehalasa que tieneScMFa2 en lugar de su señal de secreción nativa).
En algunas realizaciones, la señal de secreción de MFa2 es una señal de secreción de trehalasa ácida deK. lactiscon una identidad de secuencia de al menos el 80 %, el 85 %, el 90 % o el 95 % con respecto a la secuencia de polipéptido de la Id. de sec. n.°: 8. En algunas realizaciones, la señal de secreción de MFa2 es una señal de secreción de trehalasa ácida de C.parapsilosiscon una identidad de secuencia de al menos el 80 %, el 85 %, el 90 % o el 95 % con respecto a la secuencia de polipéptido de la Id. de sec. n.°: 11. En algunas realizaciones, la señal de secreción de MFa2 es una señal de secreción de trehalasa ácida de Cglabratacon una identidad de secuencia de al menos el 80 %, el 85 %, el 90 % o el 95 % con respecto a la secuencia de polipéptido de la Id. de sec. n. °: 14.
No se pretende limitar esta descripción a ningún polipéptido de trehalasa específico, y la levadura GE puede incluir un gen para expresar cualquier polipéptido de trehalasa que sea útil para procedimientos de fermentación. En algunas realizaciones, un gen trehalasa ácida se integra en la levadura GE. En algunas realizaciones, un gen de trehalasa neutra se integra en la levadura GE. En algunas realizaciones, la levadura GE puede incluir tanto un gen trehalasa ácida como un gen de trehalasa neutra. Como entenderá un experto en la técnica, se pueden elegir secuencias promotoras o líder para optimizar la expresión de una trehalasa ácida y/o una trehalasa neutra dependiendo del pH previsto del caldo de fermentación, otras características de un procedimiento de fermentación y/u otras características de la propia levadura GE.
Además, no se pretende limitar esta descripción a ninguna secuencia líder específica para el uno o más genes de trehalasa que se integran en la levadura GE. Cualquier secuencia señal de secreción descrita en la presente memoria puede usarse con cualquier polipéptido de trehalasa descrito en la presente memoria, es decir, se pretende que esta descripción incluya cada combinación de secuencias líder y polipéptidos de trehalasa. Por consiguiente, la levadura GE puede incluir una secuencia líder para una trehalasa que es heteróloga con respecto a la propia levadura GE. Dicha secuencia líder puede ser el tipo natural asociado con la trehalasa heteróloga o puede ser heteróloga tanto con respecto a la levadura GE como con respecto a la especie de la que se toma la trehalasa. En algunas realizaciones, una secuencia líder nativa con respecto a un gen diferente en la levadura GE se puede usar con una trehalasa heteróloga.
Para los fines de esta descripción, cuando se identifica el porcentaje de identidad de secuencia de una secuencia con respecto a cualquier polipéptido de trehalasa, debe entenderse que los aminoácidos de secuencia líder nativa no se incluyen en el cálculo de la identidad de secuencia. Sin embargo, si los aminoácidos de la secuencia líder no pueden determinarse de manera fácil y completa usando dichos métodos, el porcentaje de identidad de secuencia se calcula usando toda la secuencia de polipéptido de trehalasa, es decir, incluyendo la secuencia líder nativa. Por ejemplo, Id. de sec. n.°: 87 es el polipéptido para trehalasa deMagnaporthe griseacon su secuencia líder nativa, y la Id. de sec. n.°: 88 es el polipéptido para trehalasa deMagnaporthe griseasin su secuencia líder nativa. Otros ejemplos de polipéptidos de trehalasa sin una secuencia líder de secreción incluyen la Id. de sec. n.°: 89(Candida glabrata),Id. de sec. n.°: 90(Candida parapsilosis)y la Id. de sec. n.°: 91(Kluyveromyces lactis).La levadura GE codifica para un polipéptido de trehalasa heterólogo que tiene una identidad de secuencia de al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 % o el 100 % con respecto a la Id. de sec. n.°: 88, Id. de sec. n.°: 89, Id. de sec. n.°: 90 o la Id. de sec. n.°: 91. La levadura GE codifica para un polipéptido de trehalasa heterólogo que tiene una identidad de secuencia de al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 % o el 100 % con respecto a cualquiera de las siguientes secuencias que representan polipéptidos de trehalasa con una señal de secreción de Mfa2: la combinación de la Id. de sec. n.°: 4 con la Id. de sec. n.°: 88; la combinación de la Id. de sec. n.°: 4 con la Id. de sec. n.°: 89; la combinación de la Id. de sec. n. °: 4 con la Id. de sec. n. °: 90; o la combinación de la Id. de sec. n.°: 4 con la Id. de sec. n.°: 91.
Sin pretender imponer ninguna teoría, el software de análisis de secuencias predice que el líder nativo (péptido señal) para los tresKluyveromyces lactis, Candida parapsilosisyCandida glabrataLas trehalasas es un dominio transmembrana, no una señal de secreción. Esto sugiere que las trehalasas se empujan fuera de la membrana celular hacia el espacio periplasmático, es decir, el espacio entre la membrana celular y la pared celular. Sin embargo, estas trehalasas probablemente todavía están ancladas a la membrana celular. Es probable que la sustitución del péptido señal nativo por la señal de secreción de MFa2 libere la proteína de la membrana, lo que permite la secreción extracelular.
He y col. (He, S., Bystricky, K., Leon, S., Francois, J.M., Parrou, J.L. The Saccharomyces cerevisiae vacuolar acid trehalase is targeted at the cell surface for its physiological function (2009) FEBS Journal, 276 (19), págs. 5432-5446) describe el reemplazo del péptido señal de trehalasa ácida deSaccharomycesnativo por los líderes de secreción de otros 2 genes. Sin embargo, parece que hay cantidades significativas de la proteína en la vacuola independientemente del péptido señal en ese estudio.
La expresión de trehalasa en la levadura GE puede optimizarse o mejorarse incluyendo un promotor. El promotor puede ser un promotor de TDH3. El promotor puede ser un promotor de TDH3 de S.cerevisiaecon una identidad de secuencia de al menos el 80 %, el 85 %, el 90 % o el 95 % con respecto a la Id. de sec. n.°: 5. El promotor puede ser un promotor de SAM2. El promotor puede ser un promotor de SAM2 de S.cerevisiaecon una identidad de secuencia de al menos el 80 %, el 85 %, el 90 % o el 95 % con respecto a la Id. de sec. n.°: 112.
En un aspecto, la expresión de una trehalasa por la levadura GE aborda un problema significativo a menudo asociado con las levaduras GE usadas para producir productos biológicos mediante fermentación. Las levaduras producen normalmente más trehalosa cuando se someten a estrés. Algunas condiciones de procedimiento de fermentación pueden provocar estrés en levaduras GE usadas para la producción de productos biológicos. Por ejemplo, algunos procedimientos de fermentación están asociados con altas temperaturas, lo que provoca estrés en la levadura. Las altas concentraciones de etanol o de otro producto biológico y/o altas concentraciones de sal también pueden provocar estrés que aumenta la producción de trehalosa. La expresión de enzimas heterólogas en levaduras GE también puede conducir a un aumento en la producción de trehalosa porque tal expresión enzimática puede provocar estrés en la levadura. En particular, se sabe que las levaduras genéticamente modificadas que expresan una glucoamilasa presentan una mayor producción de trehalosa.
Sin embargo, las levaduras que expresan trehalasa de la presente invención pueden abordar este problema reduciendo o eliminando la trehalosa producida por levaduras usadas para la fermentación de producto biológico. La trehalosa se convierte en glucosa y puede usarse por las levaduras como fuente de carbono para necesidades metabólicas y/o formación de productos biológicos. Por consiguiente, el carbono usado por la levadura para producir trehalosa puede reciclarse eficazmente por la levadura para producir proteínas o productos biológicos, mejorando de ese modo el rendimiento global de un procedimiento de fermentación que usa la levadura.
En algunos estudios, se han delecionado o alterado genes de trehalasa nativa en una levadura en un intento por reducir los problemas de estrés y aumentar la tolerancia de etanol, a diferencia de las enseñanzas de la presente descripción (véase, por ejemplo, Trevisol, E.T.V., Panek, A.D., Mannarino, S.C., Eleutherio, E.C.A., The effect of trehalose on the fermentation performance of aged cells of Saccharomyces cerevisiae (2011) Applied Microbiology and Biotechnology, 90 (2), págs. 697-704, que comenta la deleción o bien de trehalasa ácida (ATH1) o bien de trehalasa neutra (NTH1) y la tolerancia aumentada a etanol resultante). Sin embargo, se ha mostrado sorprendentemente que las levaduras GE de la presente invención que secretan trehalasas heterólogas mejoran el rendimiento de producción de etanol en comparación con las levaduras de tipo natural u otras modificadas por ingeniería.
En algunas realizaciones, la levadura GE puede incluir además genes heterólogos para expresar polipéptidos distintos de trehalasa. La levadura GE puede incluir uno o más genes heterólogos para expresar cualquiera o la totalidad de los siguientes: una amilasa, por ejemplo una glucoamilasa (EC 3.2.1.3), proteínas asociadas con el consumo de lactato (por ejemplo, un gen heterólogo que codifica para un transportador monocarboxílico/monocarboxilato y/o uno o más genes heterólogos que codifican para lactato deshidrogenasa (citocromo) (clasificadas como EC 1.1.2.3 o 1.1.2.4)), una isomaltasa (EC 3.2.1.10) y proteínas transportadoras de azúcar. La levadura GE puede incluir además uno o más promotores y/o secuencias líder útiles para optimizar la expresión de tales polipéptidos. La levadura GE puede incluir 2 o más copias de cualquiera de los genes heterólogos descritos en la presente memoria.
Las glucoamilasas (E.C. 3.2.1.3) son enzimas amilolíticas que hidrolizan residuos de a-D-glucosilo unidos por enlace 1,4 sucesivamente a partir del extremo no reductor de las cadenas de oligo y polisacárido con la liberación de D-glucosa. En algunas realizaciones, la levadura GE codifica tanto para una trehalasa heteróloga como para una glucoamilasa heteróloga.
Las modificaciones genéticas anteriores se describen adicionalmente en las siguientes referencias: documento WO 2016/127083, presentado el 05 de febrero de 2016 (MODIFIED GLUCOAMYLASE ENZYMES AND YEAST STRAINS HAVING EN<h>A<n>CED ETHANOL PRODUCTION); documento WO 2016/160584, presentado el 25 de marzo de 2016 (GLUCOAMYLASE-MODIFIED YEAST STRAINS AND METHODS FOR BIOPRODUCTPRODUCTION); documento PCT/US16/067314, presentado el 16 de diciembre de 2016, publicado como documento WO 2017/106739 (SUGAR TRANSPORTER-MODIFIED YEAST STRAINS AND METHODS FOR BIOPRODUCT PRODUCTION); solicitud de patente estadounidense 62/371.681, presentada el 05 de agosto de 2016, publicada como documento WO 2018/027131 (LEADER-MODIFIED GLUCOAMYLASE POLYPEPTIDES AND ENGINERED YEAST STRAIN HAVING ENHANCED BIOPRODUCT PRODUCTION); solicitud de patente estadounidense 62/395.792, presentada el 16 de septiembre de 2016, publicada como documento WO 2018/053230 (GENETICALLY MODIFIED LACTATE-CONSUMING YEASTS AND FERMENTATION PROCESSES USING SUCH GENETICALLY MODIFIED YEASTS).
La levadura GE puede incluir genes que tienen las siguientes Id. de sec. y/o que expresan una o más de cualquiera de las siguientes Id. de sec. de polipéptido, identidad de secuencia de más del 50 %, el 60 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 % o el 95 % con respecto a la Id. de sec. n.°: 16 (aminoácidos 19-515 de polipéptido de glucoamilasa (GA) deSaccharomycopsis fibuligera, Id. de sec. n.°: 17 (aminoácidos 26-604 de polipéptido de GA deRhizopus oryzae),Id. de sec. n.°: 18 (aminoácidos 19-639 de polipéptido de GA deAspergillus shirousami)y/o la Id. de sec. n.°: 19 (aminoácidos 21 -636 de polipéptido de GA deAspergillus terreus);identidad de secuencia de más del 75 %, el 80 %, el 81 %, el 85 %, el 90 % o el 95 % o más con respecto a la Id. de sec. n.°: 108 (polipéptido de GA deRhizopus microsporus);identidad de secuencia de más del 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o el 97 % o más con respecto a la Id. de sec. n.°: 109 (polipéptido de GA deRhizopus delemar);identidad de secuencia de más del 80 %, el 85 %, el 90 % o el 95 % o más con respecto a la Id. de sec. n.°: 20 (polipéptido transportador de azúcar deSaccharomyces mikatae);identidad de secuencia de más del 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 85 %, el 90 % o el 95 % o más con respecto a la Id. de sec. n. °: 21 (MAL11 de S.cerevisiae);una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 97 % o el 99 % con respecto a al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos: Id. de sec. n.°: 22, Id. de sec. n.°: 23, Id. de sec. n.°: 24, Id. de sec. n.°: 25 o la Id. de sec. n.°: 26 (un aminoácido de simportador de monocarboxilato/protones heterólogo, por ejemplo, un simportador JEN1, deIssatchenkia orientalis, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces dobzhanskiioKluyveromyces marxianus);un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 97 % o el 99 % con respecto a al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos: Id. de sec. n.°: 27, Id. de sec. n.°: 28, Id. de sec. n.°: 29, Id. de sec. n.°: 30, Id. de sec. n.°: 31, Id. de sec. n.°: 32 o la Id. de sec. n.°: 33 (un polipéptido de citocromo b2 (CYB2) deSaccharomyces cerevisiae, Issatchenkia orientalis, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces bayanus, Zygosaccharomyces rouxii, Kluyveromyces lactisoKluyveromyces dobzhanskii);o una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 97 % o el 99 % con respecto a al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos: Id. de sec. n.°: 34, Id. de sec. n.°: 35, Id. de sec. n.°: 36, Id. de sec. n.°: 37, Id. de sec. n.°: 38, Id. de sec. n.°: 39, Id. de sec. n.°: 40 o la Id. de sec. n.°: 41 (un polipéptido de D-lactato deshidrogenasa (DLD) deSaccharomyces cerevisiae, Issatchenkia orientalis, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces bayanus, Aspergillus fumigatus, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces dobzhanskiioKluyveromyces marxianus).En un aspecto, los residuos y las posiciones asociadas de Lys349, Tyr143, Tyr254 y His373 están conservados en la Id. de sec. n.°: 27, Id. de sec. n.°: 28, Id. de sec. n.°: 29, Id. de sec. n.°: 30, Id. de sec. n.°: 31, Id. de sec. n.°: 32 o la Id. de sec. n.°: 33. Cualquiera de las Id. de sec. anteriores codificadas por la levadura GE puede ser heteróloga como se define en la presente memoria.
Como entenderá un experto en la técnica, modificar una levadura huésped para incluir múltiples genes heterólogos puede dar como resultado un efecto impredecible en la levadura huésped. Por ejemplo, la levadura GE que contiene múltiples genes heterólogos, es decir, 2 o más genes heterólogos que expresan diferentes clases de enzimas u otras proteínas, puede dar como resultado efectos metabólicos negativos sobre la levadura, afectar adversamente a la tolerancia al calor de la levadura, o afectar adversamente a la cantidad de etanol producido por la levadura. Sin embargo, se ha descubierto sorprendentemente que, al menos en algunas realizaciones descritas en la presente memoria, la inclusión de un gen de trehalasa heterólogo no tiene ningún efecto adverso significativo sobre la levadura GE. En cambio, la levadura GE que incluye múltiples rasgos, es decir, múltiples genes heterólogos diferentes, funciona mejor en una fermentación de etanol que una levadura que no incluye la totalidad de los múltiples rasgos.
En un aspecto, se ha encontrado que incluir uno o más genes que expresan enzimas heterólogas, por ejemplo un gen que expresa la glucoamilasa, en una levadura puede dar como resultado un aumento de la producción de trehalosa por la levadura en comparación con la célula huésped no modificada. Además, también se ha encontrado que las levaduras genéticamente modificadas mediante mutagénesis para mejorar la tolerancia al calor, la tolerancia al etanol u otras características presentan una producción de trehalosa aumentada en comparación con la célula huésped previa a la mutación. Sin embargo, las levaduras GE de la presente invención pueden mostrar una producción de trehalosa más baja en comparación con la célula huésped no modificada, o una célula huésped que tiene las mismas modificaciones excepto por la inclusión de un gen de trehalasa heterólogo integrado. En algunas realizaciones, aunque la producción de trehalosa sea similar al comparar la levadura GE de la presente invención con una levadura que no contiene una trehalasa heteróloga, la levadura GE que expresa trehalasa puede producir más etanol al poder convertir la mayor parte o la totalidad de la trehalosa producida en glucosa, que puede convertirse adicionalmente en etanol y/o usarse para el metabolismo por la levadura.
Además, en un aspecto, la levadura GE puede reducir o eliminar la necesidad de añadir determinadas enzimas exógenas a la fermentación, concretamente cualquiera de las enzimas expresadas por la levadura como se describe en la presente memoria, tales como trehalasa y glucoamilasa, dando como resultado un ahorro de coste significativo.
La expresión de trehalasa por la levadura GE puede dar como resultado una mayor producción de etanol durante la fermentación. La levadura GE puede producir al menos el 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4 ó 1,5 % más de etanol que una levadura que no expresa una trehalasa heteróloga. En algunas realizaciones, la levadura GE que expresa una trehalasa heteróloga puede producir etanol a un título de al menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130 ó 135 g/l o más. En algunas realizaciones, la levadura es una levadura GE que expresa trehalasa y es útil para fermentar medios celulósicos o hemi-celulósicos. En tales realizaciones, el título de etanol puede ser menor que en otros procedimientos de producción de etanol y todavía ser un procedimiento comercialmente viable. Por ejemplo, una levadura que expresa trehalasa de este tipo puede producir un título de etanol de al menos 40, 45, 50, 55, 60 ó 65 g/l.
La levadura GE expresa una cantidad suficiente de trehalasa para convertir al menos el 25, 33, 50, 60, 70, 80 o 90 % de la trehalosa producida o presente de otro modo en el caldo de fermentación en glucosa al final de la fermentación. La levadura GE expresa una cantidad suficiente de trehalasa para reducir la cantidad de trehalosa en el caldo de fermentación hasta menos de 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 g/l al final de la fermentación. La levadura GE expresa una cantidad suficiente de trehalasa para reducir la cantidad de trehalosa en el caldo de fermentación hasta menos de 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 g/l sin necesidad de añadir trehalasa exógena a la fermentación, es decir, toda la trehalasa necesaria para reducir la cantidad de trehalosa hasta tales niveles se secreta por la levadura. La levadura GE puede reducir la cantidad de trehalasa hasta cualquiera de los niveles anteriores cuando el título de etanol es de al menos 40 g/l, 45 g/l, 50 g/l, 55 g/l, 60 g/l, 65 g/l, 70 g/l, 75 g/l, 80 g/l, 85 g/l, 90 g/l, 95 g/l, 100 g/l, 105 g/l, 110 g/l, 115 g/l, 120 g/l, 125 g/l, 130 g/l o 135 g/l. La levadura GE expresa una cantidad suficiente de trehalasa para convertir un total de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 g/l o más de la trehalosa producida y/o presente durante un procedimiento de fermentación antes del final del procedimiento de fermentación. Aunque se contempla que la mayor parte de la trehalasa producida por la levadura GE se secreta de manera extracelular para actuar sobre la trehalosa fuera de la célula de levadura, es decir, la trehalosa presente en el caldo de fermentación, también se contempla que una parte de la trehalasa producida por la levadura GE puede permanecer en la célula donde puede actuar sobre la trehalosa intracelular. En un aspecto, la levadura GE puede incluir modificaciones genéticas asociadas con cantidades reducidas de subproductos, incluyendo glicerol. Estas modificaciones genéticas (o combinación de modificaciones genéticas) pueden denominarse en la presente memoria “ rasgo de reducción de glicerol” . La levadura GE incluye las siguientes modificaciones: un ácido nucleico recombinante que codifica para una gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (E.C. 1.2.1.9) y expresión reducida o eliminada de un gen que codifica para una glicerol-3-fosfato fosfatasa (E.C. 3.1.3.21). Estas modificaciones se describen adicionalmente en la solicitud estadounidense n.° 62/648.679. La levadura GE incluye la siguiente modificación: un ácido nucleico recombinante que codifica para una gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (E.C. 1.2.1.9).
Las cepas de levadura modificadas por ingeniería descritas en la presente memoria pueden incluir modificaciones genéticas en una o más enzimas involucradas en la producción de glicerol. Por ejemplo, las cepas de levadura modificadas por ingeniería descritas en la presente memoria pueden tener una expresión reducida o eliminada de uno o más genes que codifican para una glicerol-3-fosfato fosfatasa (Gpp; correspondiente a E.C. 3.1.3.21; también conocida como “glicerol-1-fosfatasa” ). Las enzimas glicerol-3-fosfato fosfatasa hidrolizan glicerol-3-fosfato para dar glicerol y, por lo tanto, regulan los niveles celulares de glicerol-3-fosfato, un producto intermedio metabólico de glucosa, lípidos y metabolismo energético (Mugabo y col., PNAS (2016) 113:E430-439).
Saccharomyces cerevisiae(S.cerevisiae)tiene dos parálogos de glicerol-3-fosfato fosfatasa, denominados Gpp1p y Gpp2p, codificados por los genesGPP1(UniProt n.° p41277) yGPP2(UniProt n.° P40106), respectivamente (Norbeck y col. (1996) J. Biol. Chem. 10271 (23):13875-81; Pahlman y col. (2001) J. Biol. Chem. 276(5):3555-63). En algunas realizaciones, la levadura GE tiene una expresión reducida o eliminada deGPP1.En otras realizaciones, la levadura GE tiene una expresión reducida o eliminada deGPP2.En otras realizaciones, la levadura GE tiene una expresión reducida o eliminada tanto deGPP1como deGPP2.
Debe apreciarse que cualquier medio para lograr una expresión reducida o eliminada de un gen que codifica para una enzima glicerol-3-fosfato fosfatasa es compatible con aspectos de la invención. Por ejemplo, la expresión reducida o eliminada de un gen que codifica para una glicerol-3-fosfato fosfatasa puede lograrse alterando la secuencia del gen y/o una o más regiones reguladoras que controlan la expresión del gen, tal como introduciendo una o más mutaciones o inserciones en la secuencia del gen o en una o más regiones reguladoras que controlan la expresión del gen.
La expresión de un gen que codifica para una enzima glicerol-3-fosfato fosfatasa, tal como el genGPP1,se reduce en al menos aproximadamente el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 % o el 100 %. La expresión del gen que codifica para una enzima glicerol-3-fosfato fosfatasa, tal como el genGPP1,puede eliminarse. La expresión de un gen que codifica para una enzima glicerol-3-fosfato fosfatasa, tal un genGPP1,puede eliminarse mediante cualquier medio conocido por un experto habitual en la técnica, tal como mediante la inserción de un fragmento de ácido nucleico en el locus deGPP1o regiones reguladoras que rodean al locusGPP1.
La levadura GE puede ser diploide y tiene una expresión reducida o eliminada de ambas copias del genGPP1.La levadura GE puede ser diploide y contiene una deleción y/o inserción en ambas copias del genGPP1.
La levadura modificada por ingeniería descrita en la presente memoria puede tener una expresión reducida o eliminada de uno o más genes que codifican ara una gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (Gps; correspondiente a E.C.1.2.1.12). S.cerevisiaetiene dos gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasas, denominadas Gpd1p y Gpd2p, codificadas por los genesGPD1(UniProt n.° Q00055) yGDP2(UniProt n.° P41911), respectivamente. La levadura GE puede tener una expresión reducida o eliminada deGPD1.La levadura GE puede tener una expresión reducida o eliminada deGPD2.La levadura GE puede tener una expresión reducida o eliminada tanto deGPD1como deGPD2.
Debe apreciarse que cualquier medio para lograr una expresión reducida o eliminada de un gen que codifica para una enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa es compatible con aspectos de la invención. Por ejemplo, la expresión reducida o eliminada de un gen que codifica para una gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa puede lograrse alterando la secuencia del gen y/o una o más regiones reguladoras que controlan la expresión del gen, tal como introduciendo una o más mutaciones o inserciones en la secuencia del gen o en una o más regiones reguladoras que controlan la expresión del gen.
La expresión de un gen que codifica para una enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, tal como el genGPD1,se reduce en al menos aproximadamente el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 % o el 100 %. La expresión del gen que codifica para una enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, tal como el genGPD1,puede eliminarse. La expresión de un gen que codifica para una enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, tal un genGPD1,puede eliminarse mediante cualquier medio conocido por un experto habitual en la técnica, tal como mediante la inserción de un fragmento de ácido nucleico en el locus deGPD1o regiones reguladoras que rodean al locusGPD1.
La levadura GE descrita en la presente memoria, tal como S.cerevisiae,puede ser diploide y tiene una expresión reducida o eliminada de ambas copias del genGPD1.
La levadura GE puede ser diploide y contiene una deleción y/o inserción en ambas copias del genGPD1.La levadura GE puede tener una expresión reducida o eliminada de una copia del genGPD1.
La levadura modificada por ingeniería descrita en la presente memoria, tal como S.cerevisiae,tiene una expresión reducida o eliminada deGPP1y/oGPP2,y también puede tener una expresión reducida o eliminada deGPD1y/oGPD2.La levadura modificada por ingeniería descrita en la presente memoria, tal como S.cerevisiae,puede tener una expresión reducida o eliminada de dos copias deGPP1y también tiene una expresión reducida o eliminada de una copia deGPD1.
La levadura modificada por ingeniería descrita en la presente memoria expresa de manera recombinante uno o más ácidos nucleicos que codifican para una enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gapN; correspondiente a E.C.1.2.1.9; también conocida como “gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa no fosforilante dependiente de NADP” ). Las enzimas GapN convierten 3-fosfato de D-gliceraldehído en 3-fosfo-D-glicerato (Rosenberg y col., J Biol Chem (1955) 217:361-71).
Debe apreciarse que el ácido nucleico recombinante que codifica para una enzima gapN puede proceder de cualquier fuente. Una levadura modificada por ingeniería que expresa de manera recombinante un ácido nucleico que codifica para una enzima gapN puede o no contener un gen endógeno que codifica para una enzima gapN.
La levadura modificada por ingeniería que expresa de manera recombinante un ácido nucleico que codifica para una enzima gapN puede no contener una copia endógena de un gen que codifica para una enzima gapN. Por consiguiente, el ácido nucleico que codifica para una enzima gapN puede derivarse de una especie u organismo diferente de la levadura modificada por ingeniería.
La levadura modificada por ingeniería que expresa de manera recombinante un ácido nucleico que codifica para una enzima gapN puede contener una copia endógena de un gen que codifica para una enzima gapN. La copia endógena del gen que codifica para una enzima gapN, o una región reguladora para el gen, tal como un promotor, puede modificarse por ingeniería para aumentar la expresión del gen que codifica para una enzima gapN. Un ácido nucleico que codifica para una enzima gapN puede introducirse en la levadura. El ácido nucleico que codifica para la enzima gapN que se introduce en la levadura puede derivarse de la misma especie u organismo que la levadura modificada por ingeniería en la que se expresa, o puede derivarse de una especie u organismo diferente de la levadura modificada por ingeniería en la que se expresa.
El ácido nucleico recombinante que codifica para una enzima gapN puede comprender un gen deBacillus cereus(por ejemplo,GAPN,correspondiente a UniProt.2 Q2HQS1). En algunas realizaciones, el ácido nucleico recombinante que codifica para una enzima GapN, o una porción del mismo, está optimizado por codones. El ácido nucleico recombinante que codifica para una enzima gapN, o una porción del mismo, puede comprender Id. de sec. n.°: 110.
El ácido nucleico recombinante que codifica para una enzima gapN, o porción del mismo, puede tener una identidad de secuencia de al menos o aproximadamente el 50 %, al menos o aproximadamente el 60 %, al menos o aproximadamente el 70 %, al menos o aproximadamente el 75 %, al menos o aproximadamente el 80 %, al menos o aproximadamente el 81 %, al menos o aproximadamente el 82 %, al menos o aproximadamente el 83 %, al menos o aproximadamente el 84 %, al menos o aproximadamente el 85 %, al menos o aproximadamente el 86 %, al menos o aproximadamente el 87 %, al menos o aproximadamente el 88 %, al menos o aproximadamente el 89 %, al menos o aproximadamente el 90 %, al menos o aproximadamente el 91 %, al menos o aproximadamente el 92 %, al menos o aproximadamente el 93 %, al menos o aproximadamente el 94 %, al menos o aproximadamente el 95 %, al menos o aproximadamente el 96 %, al menos o aproximadamente el 97 %, al menos o aproximadamente el 98 %, al menos o aproximadamente el 99 %, al menos o aproximadamente el 99,5 % o al menos o aproximadamente el 99,9 % con respecto a la secuencia de la Id. de sec. n.°: 110.
La proteína gapN puede comprender Id. de sec. n.°: 111. La proteína gapN puede tener una identidad de secuencia de al menos o aproximadamente el 50 %, al menos o aproximadamente el 60 %, al menos o aproximadamente el
70 %, al menos o aproximadamente el 75 %, al menos o aproximadamente el 80 %, al menos o aproximadam 81 %, al menos o aproximadamente el 82 %, al menos o aproximadamente el 83 %, al menos o aproximadam 84 %, al menos o aproximadamente el 85 %, al menos o aproximadamente el 86 %, al menos o aproximadam 87 %, al menos o aproximadamente el 88 %, al menos o aproximadamente el 89 %, al menos o aproximadam 90 %, al menos o aproximadamente el 91 %, al menos o aproximadamente el 92 %, al menos o aproximadam 93 %, al menos o aproximadamente el 94 %, al menos o aproximadamente el 95 %, al menos o aproximadam 96 %, al menos o aproximadamente el 97 %, al menos o aproximadamente el 98 %, al menos o aproximadam 99 %, al menos o aproximadamente el 99,5 % o al menos o aproximadamente el 99,9 % con respecto a la secuencia de la Id. de sec. n.°: 111.
Un experto en la técnica entenderá que un genGAPNpuede derivarse de cualquier fuente y puede modificarse por ingeniería usando de métodos de rutina, tal como para mejorar la expresión en una célula huésped. Además, un experto en la técnica entenderá que un genGAPNpuede insertarse en cualquier locus adecuado en la célula huésped.
Como se describe en la presente memoria, en un aspecto, la levadura GE puede incluir múltiples modificaciones genéticas sin mostrar un cambio significativo en el rendimiento de la fermentación y/o un cambio en la salud de la célula de levadura durante la fermentación. Se ha encontrado sorprendentemente que una levadura GE que incluye el rasgo de trehalasa descrito en la presente memoria en combinación con un rasgo de expresión de glucoamilasa, y/o un rasgo de reducción de glicerol (es decir, una levadura GE que produce menos y/o consume más glicerol que una levadura de tipo natural comparativa) puede alcanzar títulos de etanol más altos que cualquier otra cepa de levadura productora de etanol actualmente disponible sin demostrar ningún efecto negativo significativo asociado con el rendimiento de la levadura GE. En un aspecto, la inclusión en la levadura GE de una o más de las modificaciones genéticas descritas en la presente memoria no afecta negativamente a las características de rendimiento en una fermentación. En algunas realizaciones, las características de rendimiento de fermentación que no se ven afectadas significativamente incluyen, pero no se limitan a: tasa promedio de producción de etanol; el título de etanol máximo en un sustrato dado, por ejemplo, un mosto de maíz dado, el tiempo para que la levadura
GE produzca el título de etanol máximo; y el tiempo para que la levadura GE produzca un título comercialmente relevante (por ejemplo, al menos 110 g/l, al menos 120 g/l o al menos 130 g/l). Los tiempos de fermentación comercialmente relevantes, es decir, un tiempo de ciclo de fermentación que puede producir un título comercialmente relevante al tiempo que permite que un fabricante obtenga un beneficio, pueden variar dependiendo de la planta de etanol específica. Sin embargo, para los fines de esta descripción, se considera que los tiempos de fermentación comercialmente relevantes son de 48 horas o menos, 40 horas o menos, o 36 horas o menos. Se considera que una cepa de levadura que no puede alcanzar un título de etanol relevante en el mercado dentro del plazo de 48 horas y/o muestra una tasa reducida de producción de etanol en cualquier momento dentro del plazo de 48 h en comparación con una cepa de tipo natural tal como Ethanol Red™ presenta una “ penalización de fermentación” . En algunas realizaciones, las levaduras GE de la presente invención pueden mostrar una penalización de fermentación significativamente reducida y/o una penalización de fermentación estadísticamente insignificante en comparación con una cepa de levadura de tipo natural comercialmente relevante.
La levadura GE puede incluir un ácido nucleico recombinante que codifica para una gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (E.C. 1.2.1.9) y expresión reducida o eliminada de un gen que codifica para una glicerol-3-fosfato fosfatasa (E.C. 3.1.3.21), y también un gen heterólogo que codifica para una trehalasa. La levadura GE puede comprender un ácido nucleico recombinante que codifica para una gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa(GAPN,
E.C. 1.2.1.9), y también un gen heterólogo que codifica para una trehalasa. La levadura GE puede incluir un gen heterólogo que codifica para una trehalasa y un gen heterólogo que codifica para una glucoamilasa.
La levadura GE puede incluir un gen heterólogo que codifica para una trehalasa; un gen heterólogo que codifica para una glucoamilasa; y un ácido nucleico recombinante que codifica para una gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
(E.C. 1.2.1.9) y expresión reducida o eliminada de un gen que codifica para una glicerol-3-fosfato fosfatasa (E.C.
3.1.3.21). La levadura GE puede incluir un gen heterólogo que codifica para una trehalasa; un gen heterólogo que codifica para una glucoamilasa; y un ácido nucleico recombinante que codifica para una gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (E.C. 1.2.1.9). Se ha mostrado sorprendentemente que una levadura GE que incluye un rasgo de expresión de trehalasa, un rasgo de expresión de glucoamilasa y/o un rasgo de reducción de glicerol (por ejemplo, un rasgo de expresión de GAPN) puede producir cantidades significativamente mayores de etanol que otras cepas de levadura sin mostrar ninguna característica significativa de rendimiento negativo asociada normalmente con la modificación genética de una levadura productora de etanol.
En algunas realizaciones, el gen heterólogo que codifica para una trehalasa puede ser un gen heterólogo que codifica para un polipéptido de trehalasa (EC 3.2.1.28) que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80 %, el 85 %, el
90 % o el 95 % con respecto a cualquiera de las siguientes secuencias de polipéptido: Id. de sec. n.°: 1(K. lactis),Id.
de sec. n.°: 2 (C.parapsilosis),Id. de sec. n.°: 3 (C.glabrata)o la Id. de sec. n.°: 87(M. grisea).En algunas realizaciones, el gen heterólogo que codifica para una glucoamilasa en la levadura GE codifica para un polipéptido de glucoamilasa que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70, 75, 80, 85, 90 o 95 % con respecto a al menos una de las siguientes secuencias de polipéptido: Id. de sec. n.°: 16 (Sf GA), Id. de sec. n.°: 17 (Ro GA), Id. de sec. n. °: 108 (Rmic GA) o la Id. de sec. n.°: 109(R. delemarGA, es decir, Rdel GA).
La levadura GE puede incluir cualquier combinación de genes de trehalasa heterólogos específicos y genes de glucoamilasa específicos descritos en la presente memoria. Ejemplos no limitativos son una levadura GE que incluye un gen de trehalasa heterólogo deM. gríseay un gen de GA heterólogo de R.microsporus;una levadura GE que incluye un gen de trehalasa heterólogo deM. gríseay un gen de GA heterólogo de S.fibuligera; una levadura GE que incluye un gen de trehalasa heterólogo deM. gríseay un gen de GA heterólogo deR. delemar;un gen de trehalasa heterólogo deM. gríseay un gen de GA heterólogo deR. oryzae;una levadura GE que incluye un gen de trehalasa heterólogo deC. glabratay un gen de GA heterólogo deR. microsporus;una levadura GE que incluye un gen de trehalasa heterólogo deC. glabratay un gen de GA heterólogo de S.fibuligera;una levadura G<e>que incluye un gen de trehalasa heterólogo deC. parapsilosisy un gen de GA heterólogo deR. microsporus;una levadura GE que incluye un gen de trehalasa heterólogo deC. parapsilosisy un gen de GA heterólogo de S.fibuligera,y una levadura GE que incluye un gen de trehalasa heterólogo deC. parapsilosisy un gen de GA heterólogo deR. delemar.Además, cualquiera de los ejemplos anteriores de la levadura Ge (y cualquier otro ejemplo de una levadura GE proporcionada en la presente memoria) también puede incluir una versión de una reducción de glicerol (GR) como se describe en la presente memoria. Debe entenderse que cuando la descripción se refiere a una levadura GE que incluye un gen heterólogo de una determinada especie, tales genes en la levadura GE codificarán para un polipéptido asociado con ese gen (en la lista de secuencias de esta solicitud se proporcionan ejemplos no limitativos de tales polipéptidos, incluyendo versiones de tales polipéptidos con y sin secuencias líder nativas, o con una secuencia líder no nativa).
Debe entenderse que la levadura GE puede incluir cualquier combinación de rasgos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, la levadura GE puede expresar cualquier trehalasa, también puede expresar cualquier glucoamilasa, y también puede incluir cualquier versión de un(os) rasgo(s) de reducción de glicerol. Además de estos tres rasgos (o cualquier combinación de dos de estos rasgos), la levadura GE puede expresar además cualquier isomaltasa y/o puede incluir un rasgo de consumo de lactato. Se ha encontrado sorprendentemente que la levadura GE puede incluir una versión de todos y cada uno de los rasgos descritos en la presente memoria sin mostrar una penalización de fermentación significativa.
Procedimientos de fermentación
En un aspecto, la presente invención se refiere a procedimientos de fermentación. En un aspecto, los procedimientos de fermentación pueden ser cualquier procedimiento que usa una realización de las levaduras genéticamente modificadas descritas en la presente memoria para producir un producto de fermentación. En algunas realizaciones, el producto de fermentación es etanol. El producto de fermentación puede ser un producto de fermentación distinto de etanol, por ejemplo, pero sin limitarse a, n-propanol, iso-propanol, n-butanol, isobutanol, butadieno o isopreno.
Un procedimiento de fermentación a modo de ejemplo puede incluir las etapas de proporcionar un medio de fermentación que contiene una fuente de carbono, añadir una levadura al medio de fermentación, fermentar el medio con la levadura para producir un producto biológico y recoger el producto biológico. En un aspecto, la fuente de carbono en el medio puede incluir almidones, azúcares, ácidos orgánicos o una mezcla de los mismos. En algunas realizaciones, los azúcares pueden incluir trehalosa. En algunas realizaciones, el medio puede incluir lactato.
En un aspecto, como entenderá un experto en la técnica, la composición del medio puede variar durante la fermentación. Por ejemplo, se puede generar glucosa u otra hexosa a partir de oligómeros durante la fermentación mediante actividad enzimática, luego consumirse. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el contenido de glucosa puede ser muy bajo o incluso indetectable en algunos puntos de la fermentación si la levadura consume la glucosa más rápido de lo que se genera a partir de los oligómeros de glucosa. En algunas realizaciones, por ejemplo, la fermentación semicontinua, el medio puede complementarse de manera continua o semicontinua con una corriente de alimentación, tal como una corriente de alimentación de procedimiento vegetal.
Por consiguiente, en un aspecto, las concentraciones de diversos componentes del medio de fermentación para los procedimientos descritos en la presente memoria pueden ser una concentración promedio. Las concentraciones promedio de componentes se pueden calcular mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, tomando el promedio de la concentración de un componente en el medio de fermentación al inicio de la fermentación y la concentración del mismo componente en el medio de fermentación del final de la fermentación. Tal cálculo de promedio también puede tener en cuenta la concentración del componente en cualquier corriente de entrada y/o salida durante el procedimiento de fermentación. Además, para un procedimiento de fermentación continuo, la concentración promedio de un componente puede referirse a la concentración promedio en cualquier recipiente individual, o puede referirse a la concentración promedio a lo largo de todo el procedimiento, es decir, teniendo en cuenta todas las corrientes de alimentación y todas las corrientes de salida del procedimiento.
Al menos el 5 %, el 10 %, el 15 %, el 20 %, el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o el 99 % de la trehalosa presente en el medio de fermentación y/o generada por la levadura durante la fermentación se consume al final de la fermentación.
La cantidad de trehalosa en el medio de fermentación al final de la fermentación está en el intervalo de 0 a 10 g/l, de 0 a 5 g/l, de 0 a 4 g/l, de 0 a 3 g/l, de 0 a 1 g/l, de 0 a 0,5 g/l, de 0 a 0,1 g/l, de 0,001 a 3 g/l, de 0,001 a 1 g/l o de 0,001 a 0,1 g/l. La cantidad de trehalosa en el medio de fermentación al final de la fermentación está en el intervalo de 0,5 a 5 g/l, de 1 a 5 g/l, de 0,5 a 4 g/l, de 0,5 a 3 g/l, de 0,5 a 2 g/l o de 0,1 a 2 g/l. La cantidad de trehalosa total en el medio de fermentación al final de la fermentación es inferior a 10 g/l, 7,5 g/l, 5 g/l, 4 g/l, 3 g/l, 2 g/l, 1 g/l, 0,5 g/l o 0,1 g/l.
Al menos 0,1 g/l, 0,5 g/l, 1 g/l, 2 g/l, 3 g/l, 4 g/l, 5 g/l, 6 g/l, 7 g/l, 8 g/l, 9 g/l o 10 g/l de trehalosa se convierte en glucosa en el procedimiento. Los parámetros anteriores relacionados con la conversión de trehalosa en glucosa se refieren a un procedimiento que no incluye enzima trehalasa exógena, es decir, la conversión de trehalosa se realiza por trehalasa expresada por la levadura Ge . La conversión de trehalosa en glucosa en cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria también está asociada con una producción de etanol significativa, por ejemplo, al menos 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130 ó 135 g/l. Además, en un aspecto, el procedimiento de la presente invención puede usarse para producir etanol a tasas y/o títulos comercialmente significativos. La tasa de etanol producida puede ser de 1 a 6 g l-1 h-1, de 1 a 5,5 g l-1 h-1, o de 1 a 5 g l-1 h-1.
En algunas realizaciones, se pueden añadir enzimas exógenas al procedimiento. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se puede añadir una trehalasa, glucoamilasa y/o isomaltasa exógena al procedimiento de fermentación.
En los presentes procedimientos de fermentación, la fuente de la trehalosa es principalmente de la propia levadura. Las pequeñas cantidades de trehalosa pueden estar presentes en el caldo de fermentación inicial, sin embargo, es probable que la mayor parte se produzca por la levadura. La cantidad de trehalosa producida por la levadura está relacionada con el nivel de estrés en la levadura. Por consiguiente, los procedimientos que producen cantidades significativas de etanol, tales como los presentes procedimientos, pueden provocar estrés relacionado con etanol en la levadura, aumentando por tanto la cantidad de trehalosa presente en el caldo de fermentación. El estrés que induce la síntesis de trehalosa por la levadura también puede estar provocado por otros factores, tales como calor o concentración de sal elevada. Los procedimientos de fermentación que se ejecutan usando materiales celulósicos como sustrato están asociados con cantidades significativas de formación de trehalosa. Estos procedimientos de etanol celulósicos pueden inducir más estrés en la levadura. Por consiguiente, las levaduras descritas en la presente memoria pueden ser particularmente ventajosas para procedimientos de fermentación que usan materiales celulósicos como un sustrato de fermentación primario, o tienen cantidades significativas de materiales celulósicos además de glucosa u oligómeros de glucosa.
Procedimientos de fermentación discontinuos
En un aspecto, el procedimiento puede ser un procedimiento de fermentación discontinuo. El procedimiento discontinuo es un procedimiento de producción de etanol de trituración en seco o molienda en seco. Los procedimientos de fermentación discontinuos, incluyendo procedimientos de etanol de trituración en seco, se conocen bien en la técnica.
Un procedimiento de fermentación discontinuo a modo de ejemplo incluye las etapas de proporcionar un medio de fermentación que contiene fuentes de carbono tales como hidratos de carbono y fermentar el medio usando una levadura genéticamente modificada de un tipo descrito en la presente memoria. La levadura contiene un gen de trehalasa heterólogo. El medio contiene glucosa u oligómeros de glucosa a una concentración de al menos 0,5, 1,2 ó 3 g/l al inicio de la fermentación.
Procedimientos de fermentación continuos
En un aspecto, el procedimiento puede ser un procedimiento de fermentación continuo o semicontinuo. El procedimiento continuo es un procedimiento de producción de etanol de molienda de maíz húmedo. Los procedimientos de fermentación continuos, incluyendo los procedimientos de etanol de molienda en húmedo, se conocen bien en la técnica. Un procedimiento de fermentación que tiene un modo de funcionamiento continuo incluye múltiples fermentadores que funcionan en serie en los que se suministra un hidrolizado de almidón en el primer fermentador, que se alimenta al segundo fermentador y así sucesivamente hasta que el hidrolizado de almidón se convierte en etanol. El funcionamiento continuo puede realizarse usando entre 1 y 10 o de 2 a 7 fermentadores. Un procedimiento de fermentación continuo puede realizarse en un único recipiente, en el que puede añadirse materia prima y puede retirarse caldo que contiene producto en un programa continuo o semicontinuo.
Un procedimiento de fermentación continuo a modo de ejemplo para producir etanol comprende las siguientes etapas: proporcionar un medio de fermentación inicial que contiene glucosa u oligómeros de glucosa, fermentar el medio de fermentación con una levadura genéticamente modificada y retirar al menos una corriente de salida que comprende etanol a partir del medio de fermentación.
El medio de fermentación inicial se añade a un recipiente de termentador previo o termentador de crecimiento, donde se añade la levadura genéticamente modificada y se hace crecer hasta que se logra una biomasa deseada. Las condiciones del procedimiento en el termentador previo se establecen para favorecer el crecimiento celular sobre la formación de producto de fermentación. Entonces puede transferirse el contenido del recipiente de termentador previo a un segundo recipiente de fermentador. En el segundo recipiente de fermentador, las condiciones del procedimiento se establecen para favorecer la formación de producto de fermentación sobre el crecimiento celular. Se añade medio de fermentación adicional al segundo recipiente de fermentador, ya sea en una sola porción o de manera continua o semicontinua. El medio de fermentación adicional añadido al segundo recipiente de fermentador contiene lactato y/u otras fuentes de carbono. El segundo fermentador mencionado anteriormente también puede denominarse “propagador” . El contenido del segundo recipiente de fermentador se puede transferir a un tercer recipiente de fermentador. Las condiciones del procedimiento del tercer recipiente de fermentador pueden ser iguales o diferentes al segundo recipiente de fermentador. El contenido de tercer recipiente de fermentador puede transferirse a uno o más recipientes de fermentador adicionales, como entenderá un experto en la técnica de procedimientos de fermentación continuos. En algunas realizaciones, el producto biológico, por ejemplo, etanol, se aísla del contenido del recipiente de fermentador final.
La concentración de glucosa promedio del medio de fermentación en el recipiente de fermentador previo está en el intervalo de 10 a 20 g/l. La concentración de glucosa promedio del medio de fermentación en el segundo recipiente de fermentador está en el intervalo de 30 a 40 g/l. La concentración de glucosa promedio del medio de fermentación en el tercer recipiente de fermentador, o cualquier recipiente de fermentador adicional, está en el intervalo de 30 a 40 g/l. La concentración de glucosa promedio del medio de fermentación en el recipiente de fermentador final está en el intervalo de 0 a 5 g/l. La concentración de glucosa promedio del medio de fermentación en el recipiente de fermentador previo, el recipiente de propagador o en cualquiera de los recipientes de fermentación está en el intervalo de 0-5, 2-5, 1-10, 5-10, 5-15, 5-20, 10-20, 15-25, 20-30, 25-35, 30-40 o 35-45 g/l. La concentración de glucosa promedio de la fermentación en el recipiente de fermentador previo, el recipiente de propagador o en cualquiera de los recipientes de fermentación se mantiene en un intervalo que es mayor que o igual que la concentración de glucosa asociada con represión de glucosa en una levadura. La concentración de glucosa asociada con represión de glucosa en una levadura está en el intervalo de 2 a 5 g/l. Por consiguiente, la concentración de glucosa promedio del medio de fermentación en el recipiente de fermentador previo o en cualquiera de los recipientes de fermentación puede mantenerse a un nivel mayor que o igual a 2, 3, 4 ó 5 g/l.
Otras condiciones de fermentación pueden ajustarse y/o mantenerse en el procedimiento de fermentación continuo, incluyendo, pero sin limitarse a: temperatura, pH, tasa de captación de oxígeno (OUR) volumétrica o específica, o la concentración de cualquier fuente de carbono o cualquier nutriente de medio de fermentación. La temperatura en el recipiente de fermentador previo, el recipiente del propagador o en cualquier otro recipiente de fermentación puede estar en el intervalo de 20-45, 20-40, 20-30, 25-35 ó 30-40 0C. El pH en el recipiente de fermentador previo, el recipiente del propagador o en cualquier otro recipiente de fermentación puede estar en el intervalo de 2 a 7, de 3 a 6, de 4,5 a 5,5 o de 3,5 a 4,5.
La densidad celular en el recipiente de fermentador previo está en el intervalo de 3 a 10 g/l o de 5 a 10 g/l. En algunas realizaciones, la densidad celular en el recipiente de propagador está en el intervalo de 10 a 50 g/l
En un aspecto, el procedimiento usa las levaduras descritas en la presente memoria que consumen glucosa generada a partir de trehalosa mediante catálisis usando trehalasa durante el procedimiento de fermentación. El contenido total de trehalosa en la suma de todas las corrientes de salida es inferior al 90 % de la trehalasa añadida o generada durante el procedimiento de fermentación. El contenido total de trehalosa en la salida del procedimiento de fermentación es inferior al 99 %, 95 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 % o 10 % de la trehalosa generada durante el procedimiento de fermentación. El contenido de trehalosa en la suma de todas las corrientes de salida del procedimiento de fermentación es inferior a 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1,0,5 ó 0,1 g/l.
Los procedimientos de fermentación continuos descritos en la presente memoria pueden producir etanol u otro producto biológico a tasas comercialmente significativas. Los procedimientos pueden producir el producto biológico a una tasa de al menos 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0 ó 3,2 g l-1 h-1.
Ejemplos experimentales
La invención se describe adicionalmente en detalle con referencia a los siguientes ejemplos experimentales. Estos ejemplos se proporcionan únicamente con fines de ilustración y no se pretende que sean limitativos a menos que se especifique lo contrario. Por lo tanto, no debe interpretarse de ninguna manera que la invención esté limitada a los siguientes ejemplos, sino que debe interpretarse que abarca todas y cada una de las variaciones que resulten evidentes como resultado de las enseñanzas proporcionadas en la presente memoria. Esta descripción se refiere de manera general a realizaciones de levaduras deS. cerevisiaeque producen etanol.
Ejemplo 1: Cepas de levadura genéticamente modificadas que expresan trehalasas
En este ejemplo, se transforman cepas deSaccharomyces cerevisiaepara expresar trehalasas ácidas deKluyveromyces lactis, Candida parapsilosisyCandida glabrata.Las trehalasas ácidas se expresan usando el promotor de TDH3. Se sintetiza una versión de cada trehalasa con el péptido señal nativo de ese gen, y se sintetiza una segunda versión de cada una con el péptido señal de MFa2 de S.cerevisiae.También se transforman cepas deSaccharomyces cerevisiaepara expresar una trehalasa deMagnaporthe griseaexpresada usando el promotor de SAM2. También se transforman cepas seleccionadas para incluir expresión de glucoamilasa y/o genes asociados con la reducción de glicerol. Las cepas transformadas se usan en fermentaciones de producción de etanol. Las cepas transformadas consumen trehalosa formada durante la fermentación y se muestra que las cepas transformadas producen cantidades más altas de etanol en comparación con una cepa que no expresa una trehalasa heteróloga.
Construcción de cepas
Cepa 1
La cepa 1-3, descrita en la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2016/160584, presentada el 25 de marzo de 2016, es una cepa deSaccharomyces cerevisiae(cepa 14883, una versión de Ethanol Red™Saccharomyces cerevisiae)en la que ambas copias del gen de ScURA3 están delecionadas. Para los fines de esta descripción, la cepa 1 -3 se denomina cepa 1.
Cepa 2
Se transforma la cepa 1 con la Id. de sec. n. °: 6. Id. de sec. n. °: 6 contiene: i) un casete de expresión vacío que contiene el promotor de ScTDH3; ii) un casete de expresión de ScURA3; iii) el centrómero CEN6 deSaccharomyces cerevisiaepara la replicación estable; y iv) un casete de expresión de beta-lactamasa. Se seleccionan los transformantes en placas de ScD-uracilo. Se siembran los transformantes resultantes en estrías para el aislamiento de colonias individuales en placas de ScD-uracilo. Se selecciona una colonia individual. La integración correcta de la Id. de sec. n.°: 6 en la colonia seleccionada se verifica mediante PCR. Un aislado verificado mediante PCR se denomina cepa 2.
Cepa 3
Se transforma la cepa 1 con la Id. de sec. n.°: 7. Id. de sec. n.°: 7 contiene: i) un casete de expresión para una trehalasa de K. lactis con la señal de secreción de MFa2 que codifica para la secuencia de aminoácidos Id. de sec. n.°: 8 expresada por el promotor de TDH3; ii) un casete de expresión de ScURA3; iii) el centrómero CEN6 deSaccharomyces cerevisiaepara la replicación estable; y iv) un casete de expresión de beta-lactamasa. Se seleccionan los transformantes en placas de ScD-uracilo. Se siembran los transformantes resultantes en estrías para el aislamiento de colonias individuales en placas de ScD-uracilo. Se selecciona una colonia individual. La integración correcta de la Id. de sec. n.°: 7 en la colonia seleccionada se verifica mediante PCR. Un aislado verificado mediante PCR se denomina cepa 3.
Cepa 4
Se transforma la cepa 1 con la Id. de sec. n.°: 9. Id. de sec. n.°: 9 contiene: i) un casete de expresión para una trehalasa deK. lactisque codifica para la secuencia de aminoácidos Id. de sec. n.°: 1 expresada por el promotor de TDH3; ii) un casete de expresión de ScURA3; iii) el centrómero CEN6 deSaccharomyces cerevisiaepara la replicación estable; y iv) un casete de expresión de beta-lactamasa. Se seleccionan los transformantes en placas de ScD-uracilo. Se siembran los transformantes resultantes en estrías para el aislamiento de colonias individuales en placas de ScD-uracilo. Se selecciona una colonia individual. La integración correcta de la Id. de sec. n.°: 9 en la colonia seleccionada se verifica mediante PCR. Un aislado verificado mediante PCR se denomina cepa 4.
Cepa 5
Se transforma la cepa 1 con la Id. de sec. n.°: 10. Id. de sec. n.°: 10 contiene: i) un casete de expresión para una trehalasa deC. parapsilosiscon la señal de secreción de MFa2 que codifica para la secuencia de aminoácidos Id. de sec. n.°: 11 expresada por el promotor de TDH3; ii) un casete de expresión de ScURA3; iii) el centrómero CEN6 deSaccharomyces cerevisiaepara la replicación estable; y iv) un casete de expresión de beta-lactamasa. Se seleccionan los transformantes en placas de ScD-uracilo. Se siembran los transformantes resultantes en estrías para el aislamiento de colonias individuales en placas de ScD-uracilo. Se selecciona una colonia individual. La integración correcta de la Id. de sec. n.°: 10 en la colonia seleccionada se verifica mediante PCR. Un aislado verificado mediante PCR se denomina cepa 5.
Cepa 6
Se transforma la cepa 1 con la Id. de sec. n.°: 12. Id. de sec. n.°: 12 contiene: i) un casete de expresión para una trehalasa deC. parapsilosisque codifica para la secuencia de aminoácidos Id. de sec. n.°: 2 expresada por el promotor de TDH3; ii) un casete de expresión de ScURA3; iii) el centrómero CEN6 deSaccharomyces cerevisiaepara la replicación estable; y iv) un casete de expresión de beta-lactamasa. Se seleccionan los transformantes en placas de ScD-uracilo. Se siembran los transformantes resultantes en estrías para el aislamiento de colonias individuales en placas de ScD-uracilo. Se selecciona una colonia individual. La integración correcta de la Id. de sec. n.°: 12 en la colonia seleccionada se verifica mediante PCR. Un aislado verificado mediante PCR se denomina cepa 6.
Cepa 7
Se transforma la cepa 1 con la Id. de sec. n.°: 13. Id. de sec. n.°: 13 contiene: i) un casete de expresión para una trehalasa deC. glabratacon la señal de secreción de MFa2 que codifica para la secuencia de aminoácidos Id. de sec. n.°: 14 expresada por el promotor de TDH3; ii) un casete de expresión de ScURA3; iii) el centrómero CEN6 deSaccharomyces cerevisiaepara la replicación estable; y iv) un casete de expresión de beta-lactamasa. Se seleccionan los transformantes en placas de ScD-uracilo. Se siembran los transformantes resultantes en estrías para el aislamiento de colonias individuales en placas de ScD-uracilo. Se selecciona una colonia individual. La integración correcta de la Id. de sec. n.°: 13 en la colonia seleccionada se verifica mediante PCR. Un aislado verificado mediante PCR se denomina cepa 7.
Cepa 8
Se transforma la cepa 1 con la Id. de sec. n.°: 15. Id. de sec. n.°: 15 contiene: i) un casete de expresión para una trehalasa deC. glabrataque codifica para la secuencia de aminoácidos Id. de sec. n.°: 3 expresada por el promotor de TDH3; ii) un casete de expresión de ScURA3; iii) el centrómero CEN6 deSaccharomyces cerevisiaepara la replicación estable; y iv) un casete de expresión de beta-lactamasa. Se seleccionan los transformantes en placas de ScD-uracilo. Se siembran los transformantes resultantes en estrías para el aislamiento de colonias individuales en placas de ScD-uracilo. Se selecciona una colonia individual. La integración correcta de la Id. de sec. n.°: 15 en la colonia seleccionada se verifica mediante PCR. Un aislado verificado mediante PCR se denomina cepa 8.
Cepa 9
Se transforma conjuntamente la cepa 1 con la Id. de sec. n. °: 93 y la Id. de sec. n. °: 94. Id. de sec. n. °: 93 contiene los siguientes elementos: i) ADN homólogo con respecto a la región 5' del genFCY1nativo; y ii) un casete de expresión para una variante con optimización de codones única de la glucoamilasa deRhizopus microsporus(Id. de sec. n.°: 95), bajo el control del promotor deTDH3y el terminador deCYC1;y iii) el promotor deURA3,así como una parte del genURA3.Id. de sec. n.°: 94 contiene los siguientes elementos: i) una parte del genURA3y terminador; y ii) ADN homólogo con respecto a la región 3' del genFCY1nativo. Se seleccionaron los transformantes en ScD-Ura. Se sembraron los transformantes resultantes en estrías para el aislamiento de colonias individuales en ScD-Ura. Se seleccionaron colonias individuales, y se confirmó la integración correcta del casete de expresión mediante PCR. Se sometieron tres transformantes independientes a prueba en una fermentación en matraz de agitación y un aislado representativo se denomina cepa 9.
Cepa 10
Se transforma conjuntamente la cepa 9 con la Id. de sec. n. °: 96 y la Id. de sec. n. °: 97. Id. de sec. n. °: 96 contiene los siguientes elementos: i) ADN homólogo con respecto a la región 5' del genFCY1nativo; y ii) un casete de expresión para una variante con optimización de codones única de la glucoamilasa deRhizopus microsporus(Id. de sec. n.°: 95), bajo el control del promotor deTDH3y el terminador deCYC1;y iii) el promotor deTEF1, así como una parte del genamdSde Aspergillus nidulans.Id. de sec. n.°: 97 contiene los siguientes elementos: i) una parte del gen de acetamidasa(amdS)deAspergillus nidulansy el terminador de TEF1; y ii) ADN homólogo con respecto a andes la región 3' del genFCY1nativo. Se seleccionaron los transformantes en placas de YNB acetamida. Se sembraron los transformantes resultantes en estrías para el aislamiento de colonias individuales en placas de YNB acetamida. Se seleccionaron colonias individuales, y se confirmó la integración correcta del casete de expresión mediante PCR. Se sometieron tres transformantes independientes a prueba en una fermentación en matraz de agitación y un aislado representativo se denomina cepa 10.
Cepa 11
Se transforma la cepa 10 con la Id. de sec. n.°: 98. Se seleccionaron los transformantes en medios completos sintéticos que contenían 3,5 g/l de p-fluorofenilalanina y 1 g/l de L-tirosina (ScD-PFP). Se sembraron los transformantes resultantes en estrías para el aislamiento de colonias individuales en ScD-PFP. Se selecciona una colonia individual. El aislado verificado mediante PCR se denomina cepa 11.
Cepa 12
Se transforma la cepa 11 con la Id. de sec. n.°: 99. Se seleccionaron los transformantes en ScD-Ura. Se sembraron los transformantes resultantes en estrías para el aislamiento de colonias individuales en ScD-Ura. Se selecciona una colonia individual. El aislado verificado mediante PCR se denomina cepa 12.
Cepa 13
Se transforma conjuntamente la cepa 11 con la Id. de sec. n. °: 100 y la Id. de sec. n.°: 101, y la Id. de sec. n. °: 102 y la Id. de sec. n.°: 103. Se seleccionaron los transformantes en placas de YNB acetamida. Se sembraron los transformantes resultantes en estrías para el aislamiento de colonias individuales en placas de YNB acetamida. Se seleccionaron colonias individuales, y se confirmó la integración correcta del casete de expresión mediante secuenciación. Se sometieron tres transformantes independientes a prueba en una fermentación en matraz de agitación y un aislado representativo se denomina cepa 13.
Cepa 14
Se transforma la cepa 13 con la Id. de sec. n.°: 98. Se seleccionaron los transformantes en medios completos sintéticos que contenían 3,5 g/l de p-fluorofenilalanina y 1 g/l de L-tirosina (ScD-PFP). Se sembraron los transformantes resultantes en estrías para el aislamiento de colonias individuales en ScD-PFP. Se selecciona una colonia individual. El aislado verificado mediante PCR se denomina cepa 14.
Cepa 15
Se transforma la cepa 14 con la Id. de sec. n.°: 99. Se seleccionaron los transformantes en ScD-Ura. Se sembraron los transformantes resultantes en estrías para el aislamiento de colonias individuales en ScD-Ura. Se selecciona una colonia individual. El aislado verificado mediante PCR se denomina cepa 15.
Cepa 16
Se transforma conjuntamente la cepa 11 con la Id. de sec. n. °: 93 y la Id. de sec. n. °: 104. Id. de sec. n.°: 93 contiene los siguientes elementos: i) ADN homólogo con respecto a la región 5' del genFCY1nativo; y ii) un casete de expresión para una variante con optimización de codones única de la glucoamilasa deRhizopus microsporus(Id. de sec. n.°: 95), bajo el control del promotor deTDH3y el terminador deCYC1;y iii) el promotor deURA3,así como una parte del genURA3.Id. de sec. n.°: 104 contiene los siguientes elementos: : i) una parte del genURA3y terminador; y ii) un casete de expresión para una variante con optimización en codones de la trehalasa deMagnaporthe griseacon la señal de secreción de MFa2 (Id. de sec. n.°: 105), bajo el control del promotor deSAM2(Id. de sec. n.°: 112) y el terminador deGAL10;y iii) ADN homólogo con respecto a: la región 3' del genFCY1nativo. Se seleccionaron los transformantes en ScD-Ura. Se sembraron los transformantes resultantes en estrías para el aislamiento de colonias individuales en ScD-Ura. Se seleccionaron colonias individuales, y se confirmó la integración correcta del casete de expresión mediante PCR. Se sometieron tres transformantes independientes a prueba en una fermentación en matraz de agitación y un aislado representativo se denomina cepa 16.
Cepa 17
Se transforma conjuntamente la cepa 16 con la Id. de sec. n.°: 96 y la Id. de sec. n.°: 105. Id. de sec. n.°: 96 contiene los siguientes elementos: i) ADN homólogo con respecto a la región 5' del genFCY1nativo; y ii) un casete de expresión para una variante con optimización de codones única de la glucoamilasa deRhizopus microsporus(Id. de sec. n.°: 95), bajo el control del promotor deTDH3y el terminador deCYC1;y iii) el promotor deTEF1, así como una parte del genamdSde Aspergillus nidulans.Id. de sec. n.°: 105 contiene los siguientes elementos: i) una parte del gen de acetamidasa(amdS)deAspergillus nidulansy el terminador de ADH1; y ii) un casete de expresión para una variante con optimización en codones de la trehalasa deMagnaporthe griseacon la señal de secreción de MFa2 (Id. de sec. n.°: 105), bajo el control del promotor deSAM2(Id. de sec. n.°: 112) y el terminador deGAL10;y iii) ADN homólogo con respecto a la región 3' del genFCY1nativo. Se seleccionaron los transformantes en placas de YNB acetamida. Se sembraron los transformantes resultantes en estrías para el aislamiento de colonias individuales en placas de YNB acetamida. Se seleccionaron colonias individuales, y se confirmó la integración correcta del casete de expresión mediante PCR. Se sometieron tres transformantes independientes a prueba en una fermentación en matraz de agitación y un aislado representativo se denomina cepa 17.
Cepa 18
Se transforma la cepa 17 con la Id. de sec. n.°: 98. Se seleccionaron los transformantes en medios completos sintéticos que contenían 3,5 g/l de p-fluorofenilalanina y 1 g/l de L-tirosina (ScD-PFP). Se sembraron los transformantes resultantes en estrías para el aislamiento de colonias individuales en ScD-PFP. Se selecciona una colonia individual. El aislado verificado mediante PCR se denomina cepa 18.
Cepa 19
Se transforma la cepa 18 con la Id. de sec. n.°: 99. Se seleccionaron los transformantes en ScD-Ura. Se sembraron los transformantes resultantes en estrías para el aislamiento de colonias individuales en ScD-Ura. Se selecciona una colonia individual. El aislado verificado mediante PCR se denomina cepa 19.
Cepa 20
Se transforma conjuntamente la cepa 11 con la Id. de sec. n. °: 93 y la Id. de sec. n. °: 106. Id. de sec. n.°: 93 contiene los siguientes elementos: i) ADN homólogo con respecto a la región 5' del genFCY1nativo; y ii) un casete de expresión para una variante con optimización de codones única de la glucoamilasa deRhizopus microsporus(Id. de sec. n.°: 95), bajo el control del promotor deTDH3y el terminador deCYC1;y iii) el promotor deURA3, así como una parte del genURA3.Id. de sec. n.°: 106 contiene los siguientes elementos: i) una parte del genURA3y terminador; y ii) un casete de expresión para una variante con optimización en codones de la trehalasa deCandida glabratacon la señal de secreción de MFa2 (Id. de sec. n.°: 14), bajo el control del promotor deSAM2(Id. de sec. n.°: 112) y el terminador deGAL10;y iii) ADN homólogo con respecto a la región 3' del genFCY1nativo. Se seleccionaron los transformantes en ScD-Ura. Se sembraron los transformantes resultantes en estrías para el aislamiento de colonias individuales en ScD-Ura. Se seleccionaron colonias individuales, y se confirmó la integración correcta del casete de expresión mediante PCR. Se sometieron tres transformantes independientes a prueba en una fermentación en matraz de agitación y un aislado representativo se denomina cepa 20.
Cepa 21
Se transforma conjuntamente la cepa 20 con la Id. de sec. n.°: 96 y la Id. de sec. n.°: 107. Id. de sec. n.°: 96 contiene los siguientes elementos: i) ADN homólogo con respecto a la región 5' del genFCY1nativo; y ii) un casete de expresión para una variante con optimización de codones única de la glucoamilasa deRhizopus microsporus(Id. de sec. n.°: 95), bajo el control del promotor deTDH3y el terminador deCYC1;y iii) el promotor deTEF1, así como una parte del genamdS de Aspergillus nidulans.Id. de sec. n.°: 107 contiene los siguientes elementos: i) una parte del gen de acetamidasa(amdS)deAspergillus nidulansy el terminador de ADH1; y ii) un casete de expresión para una variante con optimización en codones de la trehalasa deCandida glabratacon la señal de secreción de MFa2 (Id. de sec. n.°: 14), bajo el control del promotor deSAM2(Id. de sec. n.°: 112) y el terminador deGAL10;y iii) ADN homólogo con respecto a la región 3' del genFCY1nativo. Se seleccionaron los transformantes en placas de YNB acetamida. Se sembraron los transformantes resultantes en estrías para el aislamiento de colonias individuales en placas de YNB acetamida. Se seleccionaron colonias individuales, y se confirmó la integración correcta del casete de expresión mediante PCR. Se sometieron tres transformantes independientes a prueba en una fermentación en matraz de agitación y un aislado representativo se denomina cepa 21.
Cepa 22
Se transforma conjuntamente la cepa 14 con la Id. de sec. n.°: 93 y la Id. de sec. n.°: 104. Id. de sec. n.°: 93 contiene los siguientes elementos: i) ADN homólogo con respecto a la región 5' del genFCY1nativo; y ii) un casete de expresión para una variante con optimización de codones única de la glucoamilasa deRhizopus microsporus(Id. de sec. n.°: 95), bajo el control del promotor deTDH3y el terminador deCYC1;y iii) el promotor deURA3,así como una parte del genURA3.Id. de sec. n.°: 104 contiene los siguientes elementos: i) una parte del genURA3y terminador; y ii) un casete de expresión para una variante con optimización en codones de la trehalasa deMagnaporthe griseacon la señal de secreción de MFa2 (Id. de sec. n.°: 92), bajo el control del promotor deSAM2(Id. de sec. n.°: 112) y el terminador deGAL10;y iii) ADN homólogo con respecto a la región 3' del genFCY1nativo. Se seleccionaron los transformantes en ScD-Ura. Se sembraron los transformantes resultantes en estrías para el aislamiento de colonias individuales en ScD-Ura. Se seleccionaron colonias individuales, y se confirmó la integración correcta del casete de expresión mediante PCR. Se sometieron tres transformantes independientes a prueba en una fermentación en matraz de agitación y un aislado representativo se denomina cepa 22.
Cepa 23
Se transforma conjuntamente la cepa 22 con la Id. de sec. n.°: 96 y la Id. de sec. n.°: 105. Id. de sec. n.°: 96 contiene los siguientes elementos: i) ADN homólogo con respecto a la región 5' del genFCY1nativo; y ii) un casete de expresión para una variante con optimización de codones única de la glucoamilasa deRhizopus microsporus(Id. de sec. n.°: 95), bajo el control del promotor deTDH3y el terminador deCYC1;y iii) el promotor deTEF1,así como una parte del genamdS de Aspergillus nidulans.Id. de sec. n.°: 105 contiene los siguientes elementos: i) una parte del gen de acetamidasa(amdS)deAspergillus nidulansy el terminador de ADH1; y ii) un casete de expresión para una variante con optimización en codones de la trehalasa deMagnaporthe griseacon la señal de secreción de MFa2 (Id. de sec. n.°: 92), bajo el control del promotor deSAM2(Id. de sec. n.°: 112) y el terminador deGAL10;y iii) ADN homólogo con respecto a la región 3' del genFCY1nativo. Se seleccionaron los transformantes en placas de YNB acetamida. Se sembraron los transformantes resultantes en estrías para el aislamiento de colonias individuales en placas de YNB acetamida. Se seleccionaron colonias individuales, y se confirmó la integración correcta del casete de expresión mediante PCR. Se sometieron tres transformantes independientes a prueba en una fermentación en matraz de agitación y un aislado representativo se denomina cepa 23.
Tabla 1. Descripción de las cepas
Ejemplo 2: Caracterización de las cepas en ensayo de matraz de agitación
Método de matraz de agitación
Se siembran las cepas 2 a 8 en estrías en una placa ScD-Ura y se incuban a 30 0C hasta que son visibles colonias individuales (1-2 días). Se raspan células de la placa de ScD-Ura en medio de matraz de agitación estéril y se mide la densidad óptica (DO600). Se mide la densidad óptica a una longitud de onda de 600 nm con una longitud de trayectoria de 1 cm usando un espectrofotómetro modelo Genesy20 (Thermo Scientific). Se inocula un matraz de agitación con la suspensión celular hasta alcanzar una DO600 inicial de 0,1-0,3. Inmediatamente antes de la inoculación, se añaden 50 ml de medio de matraz de agitación a un matraz de agitación sin deflectores de 250 ml (Corning 4995-250) equipado con un tapón de rosca que contiene un sello permeable a los gases (Corning 1395-45LTMC). El medio de matraz de agitación consiste en 725 g de almidón de maíz parcialmente hidrolizado, 150 g de agua de remojo ligero filtrada, 50 g de agua, 25 g de glucosa y 1 g de urea. Se incuban matraces por duplicado para cada cepa a 30 0C y al 80 % de humedad con agitación en un agitador orbital a 100 rpm durante 48 horas. Se toman muestras y se analizan para determinar las concentraciones de etanol y de trehalosa en el caldo durante la fermentación mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC).
Resultados
En cada figura, la cepa de control es la cepa 2; las cepas que contienen la trehalasa heteróloga deK. lactisson las cepas 3 y 4; las cepas que contienen la trehalasa heteróloga de C.parapsilosisson las cepas 5 y 6; y las cepas que contienen la trehalasa heteróloga de C.glabratason las cepas 7 y 8.
La Figura 1 muestra que, en una fermentación sin trehalosa añadida, las cepas que contienen la trehalasa heteróloga de C.parapsilosisconsumen significativamente más trehalosa que se produce durante una fermentación que la cepa de control.
Las Figuras 2 y 3 muestran que, en una fermentación sin trehalosa añadida, las cepas que contienen la trehalasa heteróloga deC. parapsilosisproducen significativamente más etanol que la cepa de control.
La Figura 4 muestra que, en una fermentación con 10 g/l de trehalosa añadida antes del inicio, las cepas que contienen la trehalasa heteróloga deK. lactis(3 y 4),C. parapsilosis(5 y 6) yC. glabrata(7 y 8) consumen significativamente más trehalosa que la cepa de control (2). Además, las 3 trehalasas heterólogas que usan el péptido señal de MFa2 hidrolizan trehalosa a una tasa más rápida que el mismo gen que usa el péptido señal nativo del gen respectivo. Todas las cepas que contienen las trehalasas heterólogas deC. parapsilosisyC. glabrataalcanzan títulos de trehalosa finales de ~1 g/l, lo que da como resultado títulos de etanol de 48 horas similares mostrados en las Figuras 5 y 6.
Las Figuras 5 y 6 muestran que, en una fermentación con 10 g/l de trehalosa añadida antes del inicio, las cepas que contienen la trehalasa heteróloga deK. lacits, C. parapsilosisyC. glabrataproducen significativamente más etanol que la cepa de control. Las cepas que contienen las trehalasas heterólogas deC. parapsilosisyC. glabrataproducen significativamente más etanol que las cepas que contienen la trehalasa deK. lactis.
La Figura 7 muestra que, en una fermentación con 10 g/l de trehalosa añadida a la fermentación inmediatamente antes del muestreo a las 40 horas, las cepas que contienen la trehalasa heteróloga deC. parapsilosisconsumen significativamente más trehalosa que la cepa de control. Los datos muestran que la trehalasa todavía está significativamente activa más tarde durante la fermentación.
Las Figuras 8 y 9 muestran que, en una fermentación con 10 g/l de trehalosa añadida a la fermentación inmediatamente antes del muestreo a las 40 horas, las cepas que contienen la trehalasa heteróloga deC. parapsilosisproducen significativamente más etanol que la cepa de control.
Ejemplo 3: Caracterización de cepas en un mosto de maíz con el 32 % de DS a 33,3 0C.
Se siembran las cepas 12, 15, 19, 21,23 y 24 en estrías en una placa de YPD y se incuban a 30 0C hasta que son visibles colonias individuales (1-2 días). Se raspan células de la placa de YPD en tampón fosfato de pH 7,0 y se mide la densidad óptica (DO600). Se mide la densidad óptica a una longitud de onda de 600 nm con una longitud de trayectoria de 1 cm usando un espectrofotómetro modelo Genesy20 (Thermo Scientific). Se inocula un matraz de agitación con la suspensión celular hasta alcanzar una DO600 inicial de 0,1. Inmediatamente antes de la inoculación se añaden los siguientes materiales a cada matraz: se añaden 50 gramos de mosto de maíz licuado a un matraz de agitación con deflectores de 250 ml sellado con un bloqueo de aire que contiene 4 ml de aceite de canola esterilizado, 190 ul de urea esterilizada por filtración 500 g/l y 2,5 ul de 100 mg/ml de ampicilina esterilizada por filtración. se añaden 0,284 AGU/g de DS (70 pl de una dilución 1:2) de glucoamilasa (amiloglucosidasa deAspergillus niger,Sigma) a matraces que contienen la cepa 24 de control y se añaden 0,114 AGU/g de DS (28 pl de una dilución 1:2) de glucoamilasa (amiloglucosidasa deAspergillus niger,Sigma) a los matraces restantes. Se estima que la amiloglucosidasa deAspergillus niger,Sigma (n.° de catálogo A7095) tiene aproximadamente 260 AGU/ml de disolución enzimática acuosa. Se incuban matraces por duplicado para cada cepa a 33,3 0C con agitación en un agitador orbital a 100 rpm durante aproximadamente 48 horas. A las 48 horas, se toman muestras de 1 ml y se analizan para determinar las concentraciones de etanol y de trehalosa en el caldo mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento.
Las Figuras 10 y 11 muestran los resultados para cepas seleccionadas en una fermentación de mosto de maíz. Las cepas que contienen una trehalasa heteróloga (cepas 19, 21 y 23) y también GA deRhizopus microsporus(Rmic GA) muestran una producción de etanol significativamente mayor y una trehalosa significativamente menor presente al final de la fermentación en comparación con una cepa de tipo natural (cepa 24) o una cepa que tiene Rmic GA sin una trehalasa heteróloga (cepa 12). La cepa 15 (que incluye tanto Rmic GA como un rasgo de reducción de glicerol, pero sin trehalasa heteróloga) demuestra un título de etanol mayor que algunas cepas que contienen una trehalasa heteróloga. Sin embargo, la cepa correspondiente que tiene los mismos rasgos que la cepa 15, pero también incluye la trehalasa heteróloga (cepa 23), demuestra el mayor título de etanol de todas las cepas sometidas a prueba.
Claims (15)
- REIVINDICACIONESi. Una levadura genéticamente modificada que comprendeun gen heterólogo que codifica para un polipéptido de trehalasa (EC 3.2.1.28) que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80 % con respecto a al menos una de las siguientes secuencias de polipéptido: Id. de sec. n.°: 1(K. lactis),Id. de sec. n.°: 2 (C.parapsilosis),Id. de sec. n.°: 3 (C.glabrata)o la Id. de sec. n.°: 87(M. grisea);expresión reducida o eliminada de uno o más genes que codifican para una glicerol-3-fosfato fosfatasa; yun gen heterólogo que codifica para un polipéptido de glucoamilasa (EC 3.2.1.3), en donde la levadura puede producir etanol cuando la levadura está presente en un medio de fermentación que comprende trehalosa y la levadura secreta trehalasa en una cantidad suficiente para reducir el contenido de trehalosa de un caldo de fermentación hasta menos de 2 g/l cuando el título de etanol es de al menos 110 g/l.
- 2. La levadura de la reivindicación 1, en donde el polipéptido de trehalasa codificado por la levadura comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70, 80, 90 ó 95 % con respecto a la Id. de sec. n.°: 83.
- 3. La levadura de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el polipéptido de trehalasa codificado por la levadura comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 94 % o el 100 % de identidad de secuencia con respecto a la Id. de sec. n.°: 84 y/o la Id. de sec. n.°: 85.
- 4. La levadura de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la levadura es S.cerevisiaegenéticamente modificada.
- 5. La levadura de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la trehalasa codificada por la levadura comprende una secuencia señal de MFa2.
- 6. La levadura de la reivindicación 5, en donde la secuencia señal de MFa2 es la Id. de sec. n.°: 4.
- 7. La levadura de la reivindicación 6, en donde la secuencia señal de MFa2 tiene una identidad de secuencia de al menos el 84 %, el 89 % o el 94 % con respecto a la Id. de sec. n.°: 4.
- 8. La levadura de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la trehalasa codificada por la levadura tiene una identidad de secuencia de al menos el 85, 90, 95 ó 97 % con respecto a al menos una de las siguientes secuencias de polipéptido: Id. de sec. n.°: 8, Id. de sec. n.°: 11, Id. de sec. n.°: 14 o la Id. de sec. n. °: 92.
- 9. La levadura de cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, en donde la levadura secreta trehalasa en una cantidad suficiente para reducir el contenido de trehalosa de un caldo de fermentación hasta menos de 0,5 g/l o 1 g/l cuando el título de etanol es de al menos 110 g/l.
- 10. La levadura de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la levadura puede secretar la trehalasa de manera extracelular.
- 11. La levadura de cualquiera de las reivindicaciones 1 -10, en donde el polipéptido de trehalasa codificado por la levadura comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 76 %, al menos el 84 %, al menos el 92 % o el 100 % de identidad de secuencia con respecto a la Id. de sec. n.°: 86.
- 12. La levadura de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la levadura puede producir etanol a un título de 80 g/l, 90 g/l, 100 g/l, 110 g/l, 120 g/l, 125 g/l, 130 g/l, 135 g/l o mayor.
- 13. La levadura de la reivindicación 1, en donde la levadura comprende además 2 o más copias de un ácido nucleico exógeno que codifica para una glucoamilasa que comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia del 80 % o mayor con respecto a la Id. de sec. n. °: 108.
- 14. Un procedimiento para fabricar etanol que comprende:fermentar un medio usando una levadura genéticamente modificada, en donde la levadura comprende un gen de trehalasa heterólogo que codifica para un polipéptido de trehalasa (EC 3.2.1.28) que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80 % con respecto a al menos una de las siguientes secuencias de polipéptido: Id. de sec. n.°: 1(K. lactis),Id. de sec. n.°: 2 (C.parapsilosis),Id. de sec. n.°: 3 (C.glabrata)o la Id. de sec. n.°: 87 (M.grisea); expresión reducida o eliminada de uno o más genes que codifican para una glicerol-3-fosfato fosfatasa; y un gen heterólogo que codifica para un polipéptido de glucoamilasa (EC 3.2.1.3),en donde el título de etanol es de al menos 105 g/l tal como se mide 36 h después de la inoculación y el contenido de trehalosa del caldo de fermentación al final de la fermentación es menor de 2 g/l.
- 15. El procedimiento de la reivindicación 14, en donde la levadura es la levadura de cualquiera de las reivindicaciones 1-12.
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