BR112019021553A2

BR112019021553A2 - Enzimas de acetil-coa sintase selecionadas para redução de produção de acetato em levedura

Info

Publication number: BR112019021553A2
Application number: BR112019021553-0A
Authority: BR
Inventors: Miasnikov Andrei
Original assignee: Danisco Us Inc.
Priority date: 2017-04-17
Filing date: 2018-04-11
Publication date: 2020-05-12
Also published as: EP3612626A1; US20210147885A1; CN110678545B; WO2018194892A1; CN110678545A

Abstract

a presente invenção refere-se a levedura que tem produção de acetato reduzida como consequência da expressão de enzimas de acetil-co sintase (acs) heterólogas selecionadas. tal levedura pode ser ainda modificada para reduzir a produção aumentada de etanol e/ou glicerol. a levedura é útil para produzir etanol a partir de substratos que contêm carboidrato.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ENZIMAS DE ACETIL-COA SINTASE SELECIONADAS PARA REDUÇÃO DE PRODUÇÃO DE ACETATO EM LEVEDURA.

CAMPO DA TÉCNICA

[0001 ] As presentes composições e métodos referem-se à levedura que tem produção de acetato reduzida como consequência da expressão de enzimas acetil-Co sintase (ACS) selecionadas. Tal levedura também pode ser modificada para produção de glicerol reduzida e/ou de etanol aumentada. A levedura é útil para produzir etanol a partir de substratos que contêm carboidrato.

ANTECEDENTES

[0002] A produção de etanol à base de levedura se baseia na conversão de açúcares em etanol. A atual produção anual de etanol combustível por meio desse método é de cerca de 90 bilhões de litros em todo o mundo. Estima-se que cerca de 70% dos custos da produção de etanol seja a matéria-prima. Visto que o volume da produção de etanol é tão grande, até mesmo pequenas melhorias de rendimento têm massivo impacto econômico para a indústria. A conversão de um mol de glicose em dois mois de etanol e dois mol de dióxido de carbono é redox neutra, sendo que o rendimento teórico máximo é de cerca de 51%. O atual rendimento industrial é de cerca de 45%; portanto, há possibilidades para aumentar a produção de etanol.

[0003] Dióxido de carbono, glicerol e biomassa de levedura são os principais subprodutos da fermentação de etanol. Durante o crescimento e a fermentação da levedura, um excedente de NADH é gerado, o qual é usado para produzir glicerol com o propósito de equilíbrio redox e proteção osmótica. O glicerol é considerado um produto de baixo valor, e diversas abordagens foram adotadas para reduzir a produção de glicerol.

[0004] As células de levedura geneticamente modificadas que têm

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2/32 uma via de fosfocetolase heteróloga foram anteriormente descritas (por exemplo, documento n²WO2015148272). Essas células expressam fosfocetolase heteróloga (PKL; EC 4.1.2.9) e fosfotransacetilase (PTA; EC 2.3.1.8), opcionalmente com outras enzimas, para canalizar o fluxo de carbono na direção oposta à via de glicerol e em direção à síntese de acetil-coA, que é, então, convertida em etanol. Essas células têm capacidade para aumentar a produção de etanol em um processo de fermentação em comparação com outras células de levedura progenitoras de outro modo idênticas. Infelizmente, tal modificação também produz acetato aumentado.

[0005] Acetato é tóxico para a maior parte dos micro-organismos que incluem levedura. Levedura de tipo selvagem produz apenas quantidades menores de acetato (por exemplo, 100 a 300 mg/l em um meio que contém 60 g/l de glicose). Produção de acetato em levedura que expressa PKL é muito aumentada (por exemplo, 1 a 2 g/l no mesmo meio). Sob condições de produção de etanol de grão industrial onde a quantidade total de glicose fermentada alcança 300 g/l, a produção de acetato por cepas de levedura que expressam PKL pode ser extrapolada em 5 a 10 g/l. Na realidade, tais concentrações não são observadas pois as células param de crescer devido à intoxicação de acetato.

[0006] Diversos pesquisadores tentaram superexpressar acetil-Co sintase (ACS) para reduzir o acúmulo de acetato em levedura que expressa PKL. Por exemplo, a levedura de baker contém duas isoenzimas ACS, ACS1 e ACS2. ACS1 está sob controle pós-translacional restrito que é submetido à inativação de catabólito na presença de glicose (De Jong-Gubbels, P. et al. (1997) FEMS Microbiology Letters 153:75 a 81), enquanto ACS2 tem Km cerca de 30 vezes maior para acetato que ACS1 (van den Berg et al. (1996) J. Biol.Chem. 271:28.953 a 59). Em um estudo que busca, especificamente, reduzir a produção de acetato em levedura, de Jong-Gubbels etal. se concluiu que a superexpressão

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3/32 de qualquer uma das duas ACS de Saccharomyces cerevisiae nativa falha em diminuir o nível de acetato em meio de cultura de levedura ((1998) FEMS Microbiology Letters 165:15 a 20). Nos últimos estudos aplicados, tentativas foram feitas em usar enzima ACSI nativa ou uma variante de mutante (L614P) de ACS de Salmonella, typimurium que foi relatada como resistente à inativação de catabólito. Embora a enzima de S. typhimurium tenha se desempenhado um pouco melhor que ACSI, a redução de acetato foi apenas discreta.

[0007] Além de serem produzidas por determinada levedura, algumas matérias-primas usadas para a produção de etanol contêm naturalmente acetato, que tem o mesmo efeito prejudicial sobre levedura. Consequentemente, por várias razões, existe uma necessidade em modificar as vias metabólicas de levedura para maximizar a produção de etanol, enquanto não se aumenta a produção de subprodutos de via indesejada, tais como acetato.

SUMÁRIO

[0008] As presentes composições e métodos referem-se à levedura que exibe produção de acetato reduzida devido à expressão de enzimas acetil-Co sintase (ACS) selecionadas. Aspectos e modalidades das composições e métodos são descritos nos parágrafos com numeração independente a seguir.

1. Em um aspecto, células de levedura modificadas são fornecidas, as quais compreendem:

(i) um gene exógeno que codifica uma enzima acetil-Co sintase derivado de um micro-organismo arqueal que pertence ao gênero Methanosaeta, (ii) um gene exógeno que codifica uma enzima acetil-Co sintase de baixa afinidade derivada de levedura ascomiceto, (iii) uma acetil-CoA sintase de baixa afinidade endógena superexpressa e/ou

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4/32 (iv) um gene exógeno que codifica uma proteína de funcionalmente similar que tem pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos com um polipeptídeo da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO: 10 ou um fragmento ativo do mesmo, em que as células modificadas produzem uma quantidade reduzida de acetato e/ou crescem na presença de uma quantidade aumentada de acetato, em comparação com células de levedura de outro modo idênticas que não compreendem o gene exógeno.

2. Em algumas modalidades, as células de levedura modificadas, de acordo com o parágrafo 1, que compreendem ainda uma modificação genética que, na ausência do gene exógeno, faz com que as células de levedura produzam uma quantidade aumentada de acetato.

3. Em algumas modalidades das células de levedura modificadas, de acordo com o parágrafo 2, a modificação genética é a introdução de um ou mais genes da via de fosfocetolase ou a deleção ou ruptura de genes da via de síntese de glicerol.

4. Em algumas modalidades das células de levedura modificadas, de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores, a redução na quantidade de acetato produzido é de pelo menos 20%, pelo menos 30% ou pelo menos 40%.

5. Em algumas modalidades das células de levedura modificadas, de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores, a proteína funcionalmente similar tem pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 97% de identidade de sequência de aminoácido com um polipeptídeo da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 9 ou um fragmento ativo do mesmo.

6. Em algumas modalidades, as células de levedura modificadas, de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores, compreendem ainda um gene que codifica uma enzima de processamento de carboidrato ou outra proteína de interesse.

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7. Em outro aspecto, um método para reduzir a quantidade de acetato produzido por células de levedura durante uma fermentação de um hidrolisado de amido é fornecido, o qual compreende introduzir na levedura:

(i) um gene exógeno que codifica uma enzima acetil-Co sintase derivado de um micro-organismo arqueal que pertence ao gênero Methanosaeta, (ii) um gene exógeno que codifica uma enzima acetil-Co sintase de “baixa afinidade” derivada de levedura ascomiceto, (iii) uma alteração genética que causa a superexpressão de uma acetil-CoA sintase de baixa afinidade endógena e/ou (iv) um gene exógeno que codifica uma proteína de funcionalmente similar que tem pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos com um polipeptídeo da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 9 ou um fragmento ativo do mesmo.

8. Em algumas modalidades do método, de acordo com o parágrafo 7, as células de levedura compreendem ainda uma modificação genética que, na ausência do gene exógeno, faria com que as células de levedura produzissem uma quantidade aumentada de acetato.

9. Em algumas modalidades do método, de acordo com o parágrafo 8, a modificação genética é a introdução de genes da via de fosfocetolase ou a deleção ou ruptura de genes da via de síntese de glicerol.

10. Em algumas modalidades do método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 7 a 9, a redução na quantidade de acetato produzido é de pelo menos 20%, pelo menos 30% ou pelo menos 40%.

11. Em algumas modalidades do método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 7 a 10, a proteína funcionalmente similar tem pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 97% de identidade de sequência de aminoácido com um polipeptídeo da SEQ ID NO:

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6/32 ou SEQ ID NO: 9 ou um fragmento ativo do mesmo.

12. Em outro aspecto, células de levedura modificadas produzidas pelo método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 7 a 11, são fornecidas.

[0009] Esses e outros aspectos e modalidades das presentes células modificadas e métodos serão evidentes a partir da descrição, incluindo as Figuras anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0010] A Figura 1 é um mapa funcional do vetor pX(DeltaTDH_ACSSalty), o protótipo para todos os construtos usados para expressar várias acetil-CoA sintases descritas no presente documento.

[0011] A Figura 2 é um mapa funcional do vetor pPATFU (TDH_A2_ADE2). Esse vetor carrega três cassetes de expressão para fosfocetolase de Bifidobacterium animalis, fosfotransacetilase de Lactobacillus plantarum e desidrogenase de acetaldeído de acilação de Salmonella enterica. Em conjunto, essas três enzimas formam uma via metabólica denominada a via de fosfocetolase.

[0012] A Figura 3 é um gráfico que mostra a produção de acetato reduzida em derivados de cepa de alta produção de acetato A2 que expressa várias enzimas ACS homólogas e heterólogas. Cepa FERMAXGOLD® é a cepa parental de A2 e produz acetato em quantidades típicas para cepas de levedura de tipo selvagem.

DESCRIÇÃO DETALHADA

I. Definições

[0013] Antes de descrever as presentes composições e métodos em detalhes, os termos a seguir são definidos por questão de clareza. Os termos não definidos devem estar de acordo com seus significados comuns conforme usado na técnica relevante.

[0014] Conforme usado no presente documento, o termo “gene” é sinônimo do termo “alelo” em referência a um ácido nucleico que codifica e

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7/32 direciona a expressão de uma proteína ou RNA.

[0015] Conforme usados no presente documento, os termos tipo selvagem e nativo são usados intercambiavelmente e se referem a genes, proteínas, cepas, e vias bioquímicas encontradas na natureza.

[0016] Conforme usado no presente documento, “deleção de um gene” refere-se a sua remoção do genoma de uma célula hospedeira. A deleção pode ser completa, o que significa um gene inteiro (isto é, pelo menos as sequências de codificação inteiras são removidas) ou parcial, que significa que apenas uma porção das sequências de codificação ou sequências reguladoras é removida, porém, que evita a produção de um produto genético funcional.

[0017] Conforme usado no presente documento, atenuação de uma via ou atenuação do fluxo através de uma via, isto é, uma via bioquímica, se refere amplamente a qualquer manipulação genética ou química que reduz ou paralisa completamente o fluxo de substratos bioquímicos ou intermediários através de uma via metabólica. A atenuação de uma trajetória pode ser obtida por meio de uma variedade de métodos bem conhecidos. Tais métodos incluem, mas sem limitação: deleção completa ou parcial de um ou mais genes, substituir alelos do tipo selvagem desses genes com formas mutantes que codificam enzimas com atividade catabólica reduzida ou valores de Km aumentados, modificar os promotores ou outros elementos reguladores que controlam a expressão de um ou mais genes, modificar geneticamente as enzimas ou o mRNA que codifica essas enzimas para uma estabilidade diminuída, extraviar as enzimas para compartimentos celulares em que as mesmas são menos prováveis de interagir com substrato e intermediários, o uso de RNA interferente, e similares.

[0018] Conforme usado no presente documento, “ruptura de um gene se refere amplamente a qualquer manipulação genética que evita substancialmente que uma célula produza um produto genético funcional.

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Os métodos exemplificativos de perturbação de gene incluem deleção completa ou parcial de um gene e fazer mutações nas sequências de codificação ou reguladoras.

[0019] Conforme usado no presente documento, os termos “manipulação genética” e “alteração genética” são usados intercambiavelmente e referem-se à alteração/mudança de uma sequência de ácidos nucleicos. A alteração pode ser incluída, porém, sem limitação a uma substituição, deleção, inserção ou modificação química de pelo menos um ácido nucleico na sequência de ácidos nucleicos.

[0020] Conforme usado no presente documento, “expressar um polipeptídeo” e termos similares referem-se ao processo celular de produzir um polipeptídeo com o uso do maquinário de tradução (por exemplo, ribossomas) da célula.

[0021] Conforme usado no presente documento, superexpressar um polipeptídeo, aumentar a expressão de um polipeptídeo e termos similares referem-se a expressar um polipeptídeo em níveis mais altos que o normal em comparação com aqueles observados com células progenitoras ou do tipo selvagem que não incluem uma modificação genética especificada, superexpressão pode ser alcançada com o uso de um promotor mais forte com um gene endógeno e/ou introduzindo-se cópias adicionais de um gene em uma célula, por exemplo, na forma de um cassete de expressão adicional, com o uso de um promotor adequado.

[0022] Conforme usado no presente documento, um cassete de expressão refere-se a um ácido nucleico que inclui uma sequência de codificação de aminoácido, promotores, terminadores e outra sequência de ácidos nucleicos necessários para permitir que o polipeptídeo codificado seja produzido em uma célula. Os cassetes de expressão podem ser exógenos (isto é, introduzidos em uma célula) ou endógenos (isto é, existentes em uma célula).

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[0023] Conforme usado no presente documento, “fermentação anaeróbica” refere-se ao crescimento na ausência de oxigênio.

[0024] Conforme usado no presente documento, “fermentação aeróbia” refere-se ao crescimento na presença de oxigênio.

[0025] Conforme usados no presente documento, os termos polipeptídeo e proteína (e/ou suas respectivas formas plurais) são usados intercambiavelmente para se referir a polímeros de qualquer comprimento que compreendem resíduos de aminoácido ligados por ligações peptídicas. São aqui usados os códigos convencionais de uma letra ou três letras para resíduos de aminoácidos. O polímero pode ser linear ou ramificado, o mesmo pode compreender aminoácidos modificados, e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também englobam um polímero de aminoácidos que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, a formação de ligações dissulfureto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente marcador. Também incluídos na definição estão, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica.

[0026] Conforme usado no presente documento, proteínas funcional e/ou estruturalmente similares são consideradas “proteínas relacionadas”. Tais proteínas podem ser derivadas de organismos de diferentes gêneros e/ou espécies, ou mesmo diferentes classes de organismos (por exemplo, bactérias e fungos). As proteínas relacionadas também abrangem homólogos determinados pela análise de sequência primária, determinados pela análise de estrutura primária, secundária ou terciária ou determinados pela reatividade imunológica cruzada.

[0027] Conforme usado no presente documento, o termo percentual de identidade de sequência de aminoácidos, ou similar, significa

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10/32 que uma sequência específica tem pelo menos uma determinada porcentagem de resíduos de aminoácido idênticos àqueles em uma sequência de referência, quando alinhadas com o uso do algoritmo CLUSTAL W com parâmetros padrão. Consultar Thompson etal. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4.673 a 80. Parâmetros predefinidos para o algoritmo CLUSTAL W são:

Penalidade de abertura de lacuna: 10,0

Penalidade de extensão de lacuna:	0,05
Matriz de pesos de proteína:	Série BLOSUM
Matriz de pesos de DNA:	IUB
% de Retardo de sequências divergentes: Distância de separação de lacunas:	40 8
Peso de transições de DNA:	0,50
Lista de resíduos hidrofílicos:	GPSNDQEKR
Usar matriz negativa:	DESLIGADO
Alternância de penalidades específicas de Resíduo:	LIGADO
Alternância de penalidades hidrofílicas:	LIGADO
Alternância de penalidade de separação da lacuna de extremidade	DESLIGADO

[0028]

Conforme usado no presente documento, os artigos singula-

res “um”, “uma”, “o” e “a” abrangem os referentes plurais, a menos que o contexto claramente indique de outra forma. Todas as referências citadas no presente documento são incorporadas ao presente documento em sua totalidade. As seguintes abreviações/acrônimos têm os seguintes significados, a menos que especificado de outra forma:

EC	comissão de enzima
kDa	quilodalton
kb	quilobase
MW	peso molecular
p/v	peso/volume

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p/p	peso/peso
v/v	volume/volume
% em peso	percentual em peso
°C	graus Centígrados
H₂O	água
H2O2	peróxido de hidrogênio
CIH2O ou Dl	água desionizada
CIIH2O	água desionizada, filtração Milli-Q
g OU gm	grama
pg	micrograma
mg	miligrama
kg	quilograma
lb	libra
μΙ_ e μΙ	microlitro
mL e ml	mililitro
mm	milímetro
pm	micrômetro
mol	mol
mmol	milimol
M	molar
mM	milimolar
μΜ	micromolar
nm	nanômetro
U	unidade
PPm	partes por milhão
se	segundo
min e'	minuto
hr e h	hora
EtOH	etanol
eq.	equivalente

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PCR reação em cadeia de polimerase

DNA ácido desoxirribonucleico

Δ em relação a uma deleção bp pares de base

II. Enzimas acetil-Co sintase selecionadas que expressam levedura [0029] As presentes composições e métodos se referem ao uso de enzimas acetil-Co sintase (ACS) selecionadas para reduzir a produção de acetato em células de levedura modificadas. As ACS selecionadas foram identificadas após exame de diversas ACS taxonomicamente divergentes diferentes. Diversas ACS superaram qualquer uma relatada na literatura. Uma ACS archaeal de ACS de Methanosaeta conciliito\ a vencedora geral enquanto uma ACS de baixa afinidade de Saccharomyces cerevisiae e Zygosaccharomyces rouxii (ACS2) de levedura também se desempenhou melhor que a ACS mais eficiente relatada anteriormente. A diminuição em produção de acetato em levedura que resulta da introdução de um gene exógeno que codifica uma dessas enzimas (ou que superexpressa um gene endógeno) é de pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30% e mesmo pelo menos 40%, em comparação com a quantidade de acetato produzido pela levedura que produz acetato em excesso.

[0030] Uso das enzimas acetil-Co sintase (ACS) selecionadas reduzirá a produção de acetato em levedura que produz um excesso indesejado de acetato, que inclui, porém, sem limitação à levedura modificada, tais como aquelas descritas por Miasnikov (WO2015148272) e Pronk et al. (WO2011010923), e/ou reduzirá a quantidade de acetato exógeno naturalmente presente no meio de fermentação.

III. Combinação com mutações adicionais que afetam a produção de álcool

[0031] Em algumas modalidades, as presentes células modificadas podem expressar, ainda, fosfocetolase heteróloga (PKL; EC 4.1.2.9) e

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13/32 fosfotransacetilase (PTA; EC 2.3.1.8), opcionalmente com outras enzimas, para canalizar o fluxo de carbono na direção oposta à via de glicerol e em direção à síntese de acetil-coA, que é, então, convertida em etanol. Uma fosfocetolase exemplificativa pode ser obtida a partir de Gardnerella vaginalis (Número de Acesso UniProt/TrEMBL: WP_016786789). Uma fosfotransacetilase exemplificativa pode ser obtida a partir de Lactobacillus plantarum (Número de Acesso UniProt/TrEMBL: WP_003641060). Em algumas modalidades, as presentes células modificadas podem ter, ainda, uma via alternativa artificial para produzir Ac-CoA que não contribui para um desequilíbrio de cofator redox nas células sob condições anaeróbicas, conforme descrito por Miasnikov (WO2015148272).

[0032] As presentes células modificadas podem incluir, ainda, mutações que resultam na atenuação da trajetória de biossíntese de glicerol nativa, que são conhecidas por aumentar a produção de álcool. Métodos para a atenuação da trajetória de biossíntese de glicerol em levedura são conhecidos e incluem redução ou eliminação da atividade de glicerol 3-fosfato desidrogenase (GPD) ou glicerol fosfato fosfatase atividade (GPP) dependente de NAD endógeno, por exemplo por meio da ruptura de um ou mais dentre os genes GPDA, GPD2, GPP1 e/ou GPP2. Consultar, por exemplo, os documentos de Patente n^Q U.S. 9.175.270 (Elke etal.), 8.795.998 (Pronk et al.) e 8.956.851 (Argyros et al.).

[0033] Em algumas modalidades, as presentes células modificadas podem incluir, ainda, um gene heterólogo que codifica uma proteína com atividade de desidrogenase acetaldeído de acetilação dependente de NAD+ e/ou um gene heterólogo que codifica um piruvato-formato liase. A introdução de tais genes em combinação com a atenuação da trajetória de glicerol é descrita, por exemplo, na patente n² U.S. 8.795.998 (Pronk et al.). No entanto, na maioria das modalidades das presentes composições e métodos, a introdução de uma desidrogenase

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14/32 de acetaldeído de acetilação e/ou a piruvato-formato liase não é necessária pois a necessidade dessas atividades é anulada pela atenuação da via biossintética nativa para produzir acetil-CoA que contribui para desequilíbrio de cofator redox.

[0034] Em algumas modalidades, as presentes células modificadas podem ter, ainda, uma via biossintética nativa atenuada em levedura para produzir Ac-CoA, que contribui para o desequilíbrio de cofator redox nas células sob condições anaeróbicas e assim necessita de produção de glicerol para restaurar o equilíbrio redox. Em algumas modalidades, as composições e métodos envolvem perturbação de um, diversos ou todos os genes nativos (por exemplo, ALD2 ALD3 ALDA ALD5 e ALD6) que codificam aldeído desidrogenase (EC 1.2.1.3). A trajetória de Ac-CoA de levedura nativa, que inclui aldeído desidrogenase, é bem descrita na literatura. Deleção desses genes nativos foi descrita em, por exemplo, Kozak et al. (2014) Metabolic Engineering 21:46 a 59).

[0035] Em algumas modalidades, as presentes células de levedura modificadas compreendem, ainda, uma trajetória biossintética de butanol. Em algumas modalidades, a trajetória biossintética de butanol é uma trajetória biossintética de isobutanol. Em algumas modalidades, a trajetória biossintética de isobutanol compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que catalisa um substrato para a conversão de produto selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) piruvato em acetolactato; (b) acetolactato em 2,3-di-hidróxi-isovalerato; (c) 2,3-di-hidróxi-isovalerato em 2-cetoisovalerato; (d) 2-cetoisovalerato em isobutiraldeído; e (e) isobutiraldeído em isobutanol. Em algumas modalidades, a trajetória biossintética de isobutanol compreende polinucleotídeos que codificam polipeptídeos que têm atividade acetolactato sintase, ceto-ácido redutoisomerase, di-hidróxi-ácido desidratase, cetoisovalerato decarboxilase e álcool desidrogenase.

[0036] Em algumas modalidades, as células de levedura modificadas

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15/32 que compreendem uma trajetória biossintética de butanol compreendem, ainda, uma modificação em um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem atividade piruvato decarboxilase. Em algumas modalidades, as células de levedura compreendem uma deleção, mutação e/ou substituição em um polinucleotídeo endógeno que codifica um polipeptídeo que tem atividade piruvato decarboxilase. Em algumas modalidades, o que tem atividade piruvato decarboxilase é selecionado dentre o grupo que consiste em: PDC1, PDC5, PDC6 e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, as células de levedura compreendem, ainda, uma deleção, mutação e/ou substituição em um ou mais polinucleotídeos endógenos que codificam FRA2, ALD6, ADH1, GPD2, BDH1 e YMR226C.

[0037] Em algumas modalidades, as presentes células modificadas incluem qualquer número de genes adicionais de interesse que codificam proteínas de interesse ainda à enzima ACS. As proteínas de interesse incluem marcadores selecionáveis, enzimas processadoras de carboidrato e outros polipeptídeos comercialmente relevantes, incluindo, porém sem limitação, uma enzima selecionada dentre o grupo que consiste em umadesidrogenase, umatranscetolase, umafosfocetolase, uma transladolase, uma epimerase, uma fitase, uma xilanase, uma βglucanase, uma fosfatase, uma protease, uma a-amilase, uma β-amilase, uma glicoamilase, uma pululanase, uma isoamilase, uma celulase, uma trealase, uma lipase, uma pectinase, uma poliesterase, uma cutinase, uma oxidase, uma transferase, uma redutase, uma hemicelulase, uma mananase, uma esterase, uma isomerase, uma pectinase, uma lactase, uma peroxidase e uma lacase. As proteínas de interesse podem ser secretadas, glicosiladas e, de outro modo, modificadas.

IV. Uso da levedura modificada para aumento de produção de álcool

[0038] As presentes composições e os métodos incluem métodos

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16/32 para aumentar a produção de álcool com o uso da levedura modificada em reações de fermentação. Tais métodos não se limitam a um processo específico de fermentação. Espera-se que a presente levedura geneticamente modificada seja uma substituição “imprevista” para levedura convencional em qualquer instalação de fermentação de álcool. Embora seja principalmente destinada à produção de etanol combustível, a presente levedura também pode ser usada para a produção de álcool potável, incluindo vinho e cerveja.

V. Células de levedura adequadas para modificação

[0039] Leveduras são micro-organismos eucarióticos unicelulares classificados como membros do reino fúngico e incluem organismos dos filos Ascomycota e Basidiomycota. As leveduras que podem ser usadas para a produção de álcool incluem, porém sem limitação, Saccharomyces spp., incluindo S. cerevisiae, bem como Kluyveromyces, Lachancea e Schizosaccharomyces spp. Várias cepas de levedura estão comercialmente disponíveis, muitas das quais foram selecionadas ou geneticamente modificadas para características desejadas, tais como alta produção de álcool, rápida taxa de crescimento e similares. Algumas leveduras foram geneticamente modificadas para produzir enzimas heterólogas, tais como glicoamilase ou a-amilase.

VI. Substratos de carboidrato e processos

[0040] Produção de etanol a partir de diversos substratos de carboidrato é bem conhecida, como são as inúmeras variações e melhoramentos em condições enzimáticas e químicas, e processos mecânicos. Acredita-se que as presentes composições e métodos sejam totalmente compatíveis com tais substratos e condições.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Construção de vetores de expressão para testar sintases de acetil-CoA

[0041] As regiões codificadoras dos genes de S. cerevisiae ACSÁ e

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ACS2, assim como do gene de Z. rouxii ACS2 foram amplificadas por PCR com o uso de DNA cromossômico dos hospedeiros correspondentes como modelos. Os genes que codificam o mutante de Salmonella typhimurium acs L641P e o gene que codifica Methanosaeta concilii acsA1 foram sintetizados com base na sequência de aminoácidos conhecida. A composição de códon dos genes sintéticos foi otimizada para corresponder à inclinação de códon dos genes altamente expressos de S. cerevisiae. Sequências de nucleotídeos e aminoácidos de todos os genes que codificam várias ACS desse estudo são listas como SEQ ID NO: 1 a 10.0 vetor pX(DeltaTDH_ACSSalty) (Figura 1) foi montado com o uso de métodos de engenharia genética convencionais. Todos os elementos derivados de levedura nesse vetor, isto é, o promotor THD3 e o terminador de transcrição ENO2, 3' e 5' sequências do δ-elemento de levedura, e o marcador selecionável URA3, foram derivados de DNA cromossômico de levedura. Sequências bacterianas (isto é, o gene de resistência à ampicilina e de origem de replicação colE1) foram derivadas do vetor pUC19 bastante conhecido. Os vetores para expressão de outras ACSs foram idênticos a pX(DeltaTDH_ACSSalty) exceto pelo fato de que a sequência codificadora de variante de S. typhimurium ACS L641P foi substituída pelas sequências de SEQ ID NO: 1,3, 5 ou 9.

Exemplo 2. Teste do efeito de diferentes ACS na produção de acetato em levedura

[0042] Para testar a habilidade de diferentes ACS em ajudar a levedura a assimilar acetato em excesso, uma cepa de teste de levedura que produz acetato em excesso foi usada. Essa cepa, denominada no presente documento A2, foi obtida transformando-se um mutante ura3, ade2 da cepa comercialmente disponível S. cerevisiae FERMAXGOLD® com o grande fragmento de Si/val de vetor PATH1 (TDH_A2_ADE2) (Figura 2). A cepa A2 expressa três enzimas: fosfocetolase, fosfotransacetilase e desidrogenase de acetaldeído de

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18/32 acetilação que constituem a via de fosfocetolase. A cepa A2 produz um nível significativamente maior de acetato do que a cepa de precursor de tipo selvagem FERMAXGOLD®. As razões para produção de acetato elevada na cepa A2 são, primeiro, que acetilfosfato, um produto da reação de fosfocetolase, é quimicamente instável e pode passar por hidrólise espontânea em ácidos acéticos e fosfóricos e, em segundo lugar, acetil-CoA formada na via de fosfocetolase reduz a demanda metabólica para sintetizar a mesma a partir de ácido acético (a levedura de via metabólica normalmente usa para produção de Ac-CoA citosólica anaerobicamente).

[0043] A cepa A2, que é um auxotrófo de uracila, foi transformada em protótrofo de uracila com uma série de cinco vetores que direcionam a expressão de cinco diferentes ACS. Exceto pelas sequências codificadoras de ACS, os vetores foram idênticos. O protótipo de vetor é pX(DeltaTDH_ACSSalty) que expressa a variante de S. typhimurium acs L641P (Figura 1). Em todo caso, o fragmento de Swal grande do respectivo vetor foi usado como o DNA de transformação (que inclui todos os elementos de levedura funcionais, porém, excluem as sequências necessárias para propagação do vetor em bactérias). Oito transformantes aleatoriamente selecionados de cada uma das cinco transformações foram selecionados e cultivados em um meio que contém 60 g/l de glicose, 0,67 g/l de base nitrogenada de levedura sem aminoácidos e sulfato de amônia, 2 g/l de ureia. As culturas foram realizadas por 48 horas a 32°C com agitação. O meio de cultura foi, então, analisado para produtos de fermentação por HPLC. Os resultados desses experimentos são resumidos na Tabela 1 e no gráfico na Figura 3.

[0044] Surpreendentemente, a superexpressão de ACS2 a partir de S. cerevisiae, que codifica a ACS de baixa afinidade, reduz de maneira eficiente o acúmulo de acetato em meio de cultura. Tais observações contradizem a literatura publicada que descreve que a superexpressão

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19/32 nem de ACS1 nem de ACS2 tem um efeito apreciável sobre o acúmulo de acetato em culturas de levedura (de Jong-Gubbels et al. (1998) FEMS Microbiology Letters 165:15 a 20). ACS2 de levedura osmofílica, Z. rouxii, foi menos eficiente que sua contrapartida de S. cerevisiae, porém, ainda teve um desempenho levemente melhor que a ACS de padrão industrial anteriormente descrita como útil para a produção de acetato reduzida em levedura (isto é, uma forma de mutante de L641P de ACS a partir de S. typhimurium). O vencedor geral do estudo foi a enzima codificada pelo gene acsA1 de M. concilii, um micro-organismo archaeal de solo conhecido por utilizar acetato como a fonte de carbono preferencial.

Tabela 1. Produção de acetato por cepa de alto teor de acetato A2 e seus derivados que expressam ACS

Cepa	Acetato (g/l) Média de 8 culturas
FERMAXGOLD® (via sem PKL)	0,286
A2 que expressa Methanosaeta concilii acsA1	0,641
A2 que expressa S. cerevisiae ACS2	0,666
A2 que expressa Z. rouxii ACS2	0,849
A2 que expressa S. typimurium asc L641P	0,852
A2 que expressa S. cerevisiae ACSI	0,925
A2 sem ACS	1,150

SEQUÊNCIAS

[0045] Sequência polinucleotídica do gene ACS1 a partir de cepa de S. cerevisiae FERMAXGOLD® (SEQ ID NO: 1):

ATGTCGCCCTCTGCCGTACAATCATCAAAACTAGAAGAACAGTCAAGTGAAATTGACAAGTTGAAAGCAAAAATGTCCCAGTCTGCCTCCACTGCGCAGCAGAA

GAAGGAACATGAGTATGAACATTTGACCTCGGTCAAGATCGTGPetição 870190119991, de 19/11/2019, pág. 26/47

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CCACAACGGCCCATCTCAGATAGACTGCAGCCCGCAATTGCTACCCACTATTCTCCACACTT

GGACGGGTTGCAGGACTATCAGCGCTTGCACAAGGAGTCTATTGAAGACCCTGCTAAGTTCTTCGGTTCTAAAGCTACCCAATTTTTAAACTGGTCTAAGCCATT

CGATAAGGTGTTCATCCCAGACCCTAAAACGGGCAGGCCCTCCTTCCAGAACAATGCATGGTTCCTCAACGGCCAATTAAACGCCTGTTACAACTGTGTTGACAGA

CATGCCTTGAAGACCCCTAACAAGAAAGCCATTATTTTCGAAGGTGACGAGCCTGGCCAAGGCTATTCCATTACCTACAAGGAACTACTTGAAGAAGTTTGTCAAGT

GGCACAAGTGCTGACTTACTCTATGGGCGTTCGCAAGGGCGATACTGTTGCCGTGTACATGCCTATGGTCCCAGAAGCAATCATAACCTTGTTGGCCATTTCCCG

TATCGGTGCCATTCACTCCGTAGTCTTTGCCGGGTTTTCTTCCAACTCCTTGAGAGATCGTATCAACGATGGGGACTCTAAAGTTGTCATCACTACAGATGAATCC

AACAGAGGTGGTAAAGTCATTGAGACTAAAAGAATTGTTGATGACGCGCTAAGAGAGACCCCAGGCGTGAGACACGTCTTGGTTTATAGAAAGACCAACAATC

CATCTGTTGCTTTCCATGCCCCCAGAGATTTGGATTGGGCAACAGAAAAGAAGAAATACAAGACCTACTATCCATGCACACCCGTTGATTCTGAGGATCCATTATT CTTGTTGTATACGTCTGGTTCTACTGGTGCCCCCAAGGGTGTTCAACATTCTACCGCAGGTTACTTGCTGGGAGCTTTGTTGACCATGCGCTACACTTTTGACACT CACCAAGAAGACGTTTTCTTCACAGCTGGAGACATTGGCTGGATTACAGGCCACACTTATGTGGTTTATGGTCCCTTACTATATGGTTGTGCCACTTTGGTCTTTG

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AAGGGACGCCTGCATACCCAAATTACTCCCGTTATTGGGATATTATTGATGAACACAAAGTCACCCAATTTTATGTTGCGCCAACTGCTTTGCGTTTGTTGAAAAG AGCTGGTGATTCCTACATCGAAAATCATTCCTTAAAATCTTTGCGTTGCTTGGGTTCGGTCGGTGAGCCAATTGCTGCTGAAGTTTGGGAGTGGTACTCTGAA AAAATAGGTAAAAATGAAATCCCCATTGTAGACACCTACTGGCAAACAGAATCTGGTTCGCATCTGGTCACCCCGCTGGCTGGTGGTGTCACACCAATGAAACC GGGTTCTGCCTCATTCCCCTTCTTCGGTATTGATGCAGTTGTTCTTGACCCTAACACTGGTGAAGAACTTAACACCAGCCACGCAGAGGGTGTCCTTGCCGTCA AAGCTGCATGGCCATCATTTGCAAGAACTATTTGGAAAAATCATGATAGGTATCTAGACACTTATTTGAACCCTTACCCTGGCTACTATTTCACTGGTGATGGTGCT GCAAAGGATAAGGATGGTTATATCTGGATTTTGGGTCGTGTAGACGATGTGGTGAACGTCTCTGGTCACCGTCTGTCTACCGCTGAAATTGAGGCTGCTATT ATCGAAGATCCAATTGTGGCCGAGTGTGCTGTTGTCGGATTCAACGATGACTTGACTGGTCAAGCAGTTGCTGCATTTGTGGTGTTGAAAAACAAATCTAGTTGG TCCACCGCAACAGATGATGAATTACAAGATATCAAGAAGCATTTGGTCTTTACTGTTAGAAAAGACATCGGGCCATTTGCCGCACCAAAATTGATCATTTT AGTGGATGACTTGCCCAAGACAAGATCTGGCAAAATTATGAGACGTATTTTAAGAAAAATCCTAGCAGGAGAAAGTGACCAACTAGGCGACGTTTCTACATTGTCA AACCCTGGCATTGTTAGACATCTAATTGATTCGGTCAAGTTGTAA [0046] Sequência de aminoácidos de ACS1 p a partir de cepa de S. cerevisiae FERMAXGOLD® (SEQ ID NO: 2):

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MSPSAVQSSKLEEQSSEIDKLKAKMSQSASTAQQKKEHEYEHLTSVKIVPQRPISDRLQPAIATHYSPHLDGLQDYQRLHKESIEDPAKFFGSKATQFLNWSKPFDKVF IPDPKTGRPSFQNNAWFLNGQLNACYNCVDRHALKTPNKKAIIFEGDEPGQGYSITYKELLEEVCQVAQVLTYSMGVRKGDTVAVYMPMVPEAIITLLAISRIGAIHSVVF AGFSSNSLRDRINDGDSKVVITTDESNRGGKVIETKRIVDDALRETPGVRHVLVYRKTNNPSVAFHAPRDLDWATEKKKYKTYYPCTPVDSEDPLFLLYTSGSTGAP KGVQHSTAGYLLGALLTMRYTFDTHQEDVFFTAGDIGWITGHTYVVYGPLLYGCATLVFEGTPAYPNYSRYWDIIDEHKVTQFYVAPTALRLLKRAGDSYIENHSLKSL RCLGSVGEPIAAEVWEWYSEKIGKNEIPIVDTYWQTESGSHLVTPLAGGVTPMKPGSASFPFFGIDAVVLDPNTGEELNTSHAEGVLAVKAAWPSFARTIWKNHDR YLDTYLNPYPGYYFTGDGAAKDKDGYIWILGRVDDVVNVSGHRLSTAEIEAAIIEDPIVAECAVVGFNDDLTGQAVAAFVVLKNKSSWSTATDDELQDIKKHLVFTVR

KDIGPFAAPKLIILVDDLPKTRSGKIMRRILRKILAGESDQLGDVSTLSNPGIVRHLIDSVKL

[0047] Sequência polinucleotidica do gene ACS2 a partir de cepa de S. cerevisiae FERMAXGOLD® (SEQ ID NO: 3):

ATGACAATCAAGGAACATAAAGTAGTTCATGAAGCTCACAACGTAAAGGCTCTTAAGGCTCCTCAACATTTTTACAACAGCCAACCCGGCAAGGGTTACGTTA CTGATATGCAACATTATCAAGAAATGTATCAACAATCTATCAATGAGCCAGAAAAATTCTTTGATAAGATGGCTAAGGAATACTTGCATTGGGATGCTCCATAC

ACCAAAGTTCAATCTGGTTCATTGAACAATGGTGATGTTGCATGGPetição 870190119991, de 19/11/2019, pág. 29/47

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TTTTTGAACGGTAAATTGAATGCATCATACAATTGTGTTGACAGACATGCCTTTGCTAATC CCGACAAGCCAGCTTTGATCTATGAAGCTGATGACGAATCCGACAACAAAATCATCACATTTGGTGAATTACTCAGAAAAGTTTCCCAAATCGCTGGTGTCTTAA

AAAGCTGGGGCGTTAAGAAAGGTGACACAGTGGCTATCTATTTGCCAATGATTCCAGAAGCGGTCATTGCTATGTTGGCTGTGGCTCGTATTGGTGCTATTCACT CTGTTGTCTTTGCTGGGTTCTCCGCTGGTTCGTTGAAAGATCGTGTCGTTGACGCTAATTCTAAAGTGGTCATCACTTGTGATGAAGGTAAAAGAGGTGGTAAGAC CATCAACACTAAAAAAATTGTTGACGAAGGTTTGAACGGAGTCGATTTGGTTTCCCGTATCTTGGTTTTCCAAAGAACTGGTACTGAAGGTATTCCAATGAAGGC

CGGTAGAGATTACTGGTGGCATGAGGAGGCCGCTAAGCAGAGAACTTACCTACCTCCTGTTTCATGTGACGCTGAAGATCCTCTATTTTTGTTATACACTTCCGGTTC

CACTGGTTCTCCAAAGGGTGTCGTTCACACTACAGGTGGTTATTTATTAGGTGCCGCTTTAACAACTAGATACGTTTTTGATATTCACCCAGAAGATGTTCTCTTCAC TGCCGGTGACGTCGGCTGGATCACGGGTCACACCTATGCTCTATATGGTCCATTAACCTTGGGTACCGCCTCAATAATTTTCGAATCCACTCCTGCCTACCCA GATTATGGTAGATATTGGAGAATTATCCAACGTCACAAGGCTACCCATTTCTATGTGGCTCCAACTGCTTTAAGATTAATCAAACGTGTAGGTGAAGCCGAAAT

TGCCAAATATGACACTTCCTCATTACGTGTCTTGGGTTCCGTCGGTGAACCAATCTCTCCAGACTTATGGGAATGGTATCATGAAAAAGTGGGTAACAAAAACTGT

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GTCATTTGTGACACTATGTGGCAAACAGAGTCTGGTTCTCATTTAATTGCTCCTTTGGCAGGTGCTGTCCCAACAAAACCTGGTTCTGCTACCGTGCCATTCTTTGGT ATTAACGCTTGTATCATTGACCCTGTTACAGGTGTGGAATTAGAAGGTAATGATGTCGAAGGTGTCCTTGCCGTTAAATCACCATGGCCATCAATGGCTAGATCTGTT TGGAACCACCACGACCGTTACATGGATACTTACTTGAAACCTTATCCTGGTCACTATTTCACAGGTGATGGTGCTGGTAGAGATCATGATGGTTACTACTGGATCA GGGGTAGAGTTGACGACGTTGTAAATGTTTCCGGTCATAGATTATCCACATCAGAAATTGAAGCATCCATCTCAAATCACGAAAACGTCTCGGAAGCTGCTG TTGTCGGTATTCCAGATGAATTGACCGGTCAAACCGTCGTTGCATATGTTTCCCTAAAAGATGGTTATCTACAAAACAACGCTACTGAAGGTGATGCAGAACACAT CACACCAGATAATTTACGTAGAGAATTGATCTTACAAGTTAGGGGTGAGATTGGTCCTTTCGCCTCACCAAAAACCATTATTCTAGTTAGAGATCTACCAAGAACAAG GTCAGGAAAGATTATGAGAAGAGTTCTAAGAAAGGTTGCTTCTAACGAAGCCGAACAGCTAGGTGACCTAACTACTTTGGCCAACCCAGAAGTTGTACCTGCCA TCATTTCTGCTGTAGAGAACCAATTTTTCTCTCAAAAAAAGAAATAA [0048] Sequência de aminoácidos de ACS2p a partir de cepa de S. cerevisiae FERMAXGOLD® (SEQ ID NO: 4): MTIKEHKVVHEAHNVKALKAPQHFYNSQPGKGYVTDMQHYQEMYQQSINEPEKFFDKMAKEYLHWDAPYTKVQSGSLNNGDVAWFLNGKLNASYNCVDRHAF ANPDKPALIYEADDESDNKIITFGELLRKVSQIAGVLKSWGVKKGDTVAIYLPMIPEAVIAMLAVARIGAIHSVVFAGFSAGSLKDRVVDANSKVVITCDEGKRGGK

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TINTKKIVDEGLNGVDLVSRILVFQRTGTEGIPMKAGRDYWWHEEAAKQRTYLPPVSCDAEDPLFLLYTSGSTGSPKGVVHTTGGYLLGAALTTRYVFDIHPEDVLFTAG DVGWITGHTYALYGPLTLGTASIIFESTPAYPDYGRYWRIIQRHKATHFYVAPTALRLIKRVGEAEIAKYDTSSLRVLGSVGEPISPDLWEWYHEKVGNKNCVIC DTMWQTESGSHLIAPLAGAVPTKPGSATVPFFGINACIIDPVTGVELEGNDVEGVLAVKSPWPSMARSVWNHHDRYMDTYLKPYPGHYFTGDGAGRDHDGYYWIRG RVDDVVNVSGHRLSTSEIEASISNHENVSEAAVVGIPDELTGQTVVAYVSLKDGYLQNNATEGDAEHITPDNLRRELILQVRGEIGPFASPKTIILVRDLPRTRSGKIMRR VLRKVASNEAEQLGDLTTLANPEVVPAIISAVENQFFSQKKK [0049] Sequência nucleotidica do gene ACS2 a partir de cepa de Z.

rouxii CBS762 (SEQ ID NO: 5) ATGACAACTAAGGAACATAAGACCGTTCATGAGGATAAACCATTTACAAAGACGAAGTTTGGTTCATTGGAAAATGGTGATACTACTTGGTTTTTAAACGGTGAGTTG AATGCTGCTTACAACTGTGTTGATAGACATGCTTTTGCCAATCCTGATAAACCAGCATTGATCTACGAAGCGGATGAAGAAGCAGACAACAGGGTTGTTA CATTCGGTGAGCTTTTGAGACAAGTTTCTCAAGTTGCTGGTGTTCTTCACAGCTGGGGGGTTAGAAAAGGTGATACCGTCGCAGTTTATCTACCAATGATTCCTGAA GCTGTTGTTGCAATGTTGGCCGTTGCCAGATTAGGTGCAATTCATTCTGTTGTTTTTGCAGGTTTTTCAGCAGGTTCCTTGAAGGATCGTGTTGTAGACGCAGGTTG TAAAGTTGTTATTACTTGTGATCAAGGTAAAAGAGGTAGCAAAACCGTTCATACAAAGAAAATTGTCGATGAAGGTTTAAATGGAATTTCTCAAGTTTCTCATATTCTT

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GTCTTCCAAAGGACAGGTGCTGAAGGGATCCCAATGACACCTGGCAGAGATTACTGGTGGCACGAAGAAGCTGCTAAGCAAAGAGGTTACATTCCACCAGTTCCT TGTAGTGCTGAAGATCCATTATTCCTCTTGTACACTTCAGGTTCCACCGGGTCACCAAAGGGTGTGGTCCATTCAACCGGTGGTTATCTATTGGGTGCAGCCATGAC CACTAGATATGTGTTTGACATCCATCCAGAAGATGTCTTATTCACAGCAGGTGATGTTGGTTGGATTACAGGTCATACTTATGCTCTTTATGGTCCATTAGCGCTA GGTACTGCATCAATCATCTTTGAATCAACACCAGCTTATCCTGATTACGGTAGATATTGGAGAATCATTCAGCGTCATAAGGCAACTCATTTCTACGTGGCTCCAAC

AGCCATGAGATTGATTAAGCGTGTAGGTGAGGCTGAAATTCCAAAATACGATCTATCTTCACTAAGAGTTCTTGGATCAGTCGGTGAACCAATTTCACCAGATCTTTG GGAATGGTACAACGAAAAAATTGGTCACAACAACTGTGTCGTTTGTGATACCATGTGGCAAACCGAATCTGGTTCTCATTTAATTGCTCCATTAGCAGGTGCAG TCCCAACAAAACCTGGTTCCGCTACAGTTCCATTCTTTGGTGTTGATGCTTGTATCATTGACCCAGTCACTGGTGTTGAATTACAAGGTAATGACGTGGAAGGTGTT TTGGCAGTAAAATCATCTTGGCCATCTATGGCAAGATCAGTTTGGCAAAATCACAACCGTTTCCAGGAGACTTACTTGCAACCATACCCTGGTTACTACTTTACAGGT

GATGGTGCAGGTAGAGACCATGATGGTTACTACTGGATCAGAGGTAGAGTTGATGATGTGGTTAACGTTTCTGGCCACAGATTGTCCACTGCTGAAATTGAAGCTTCA TTGACCAACCATGATAATGTTTCTGAATCTGCTGTCGTAGGTATTCCTGACGAATTGACCGGTCAAACCGTCATTGCCTTCGTTGCATTGAAAGATGGTACTCCAAGT

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CAAGGTGATGCGAGTGCTAACGTTCGTCGTGAATTGGTGCTCCAAGTTAGAGGTGAAATTGGTCCATTTGCTGCTCCTAAATGTGTCATCTTGGTTAAAGATCTGCCA AAGACTAGATCCGGTAAAATCATGAGAAGAGTCCTAAGAAAAGTTGCATCTAATGAAGCTGATCAACTGGGTGATCTATCTACTATGGCTAACGCTGAAGTCG TTCCAGGTATCATTGCAGCTGTTGATGAACAATATTTTGCTGAGAAGAAGAAATAA

[0050] Sequência de aminoácidos de ACS2p a partir de cepa de Z. rouxiiCBS762 (SEQ ID NO: 6):

MTTKEHKTVHEAQNVVARHAPEHFYKSQPGLGYVKDMKQYQEMYKQSVEDPETFFGTKAQELLHWDKPFTKTKFGSLENGDTTWFLNGELNAAYNCVDRHAFA NPDKPALIYEADEEADNRVVTFGELLRQVSQVAG VLHSWG VRKG DTVAVYLPMIP EAVVAMLAVARLGAIHSVVFAGFSAGSLKDRVVDAGCKVVITCDQGKRG SKTVHTKKIVDEGLNGISQVSHILVFQRTGAEGIPMTPGRDYWWHEEAAKQRGYIPPVPCSAEDPLFLLYTSGSTGSPKGVVHSTGGYLLGAAMTTRYVFDIHPEDVLFT AGDVGWITGHTYALYGPLALGTASIIFESTPAYPDYGRYWRIIQRHKATHFYVAPTAMRLIKRVGEAEIPKYDLSSLRVLGSVGEPISPDLWEWYNEKIGHNNCVVC DTMWQTESGSHLIAPLAGAVPTKPGSATVPFFGVDACIIDPVTGVELQGNDVEGVLAVKSSWPSMARSVWQNHNRFQETYLQPYPGYYFTGDGAGRDHDGYYWIRG RVD D VVN VSG H RLSTAEIEASLTN H DN VSESA VVGIP D ELTGQTVIAFVALKDGTPSQGDASANVRRELVLQVRGEIGPFAAPKCVILVKDLPKTRSGKIMRRVLRKVA SNEADQLGDLSTMANAEVVPGIIAAVDEQYFAEKKK

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[0051] Sequência de DNA adotada de levedura sintética que codifica mutante de Salmonella typhimurium ACS L641P (SEQ ID NO: 7): ATGAACCAACAAGACATAGAACAAGTAGTAAAAGCCGTATTATTAAAGATGAAAGACTCCTCTCAACCAGCCTCAACCGTACACGAAATGGGTGTTTTTGCC TCTTTGGATGACGCTGTCGCTGCAGCCAAAAGAGCCCAACAAGGTTTGAAGTCAGTTGCTATGAGACAATTAGCAATCCATGCCATTAGAGAAGCAGGTGAAAAAC ACGCCAGAGAATTGGCTGAATTAGCAGTATCCGAAACTGGTATGGGTAGAGTTGATGACAAATTCGCTAAGAATGTCGCTCAAGCAAGAGGTACACCAGGTGTCGAA TGTTTGAGTCCTCAAGTATTAACAGGTGACAATGGTTTGACCTTAATTGAAAACGCCCCATGGGGTGTTGTCGCTTCTGTTACACCATCAACCAATCCTG CTGCAACTGTTATAAATAACGCAATCTCTTTGATCGCCGCTGGTAACTCAGTAGTTTTTGCTCCACATCCTGCAGCCAAAAAGGTTTCCCAAAGAGCAATTACATT GTTAAATCAAGCCGTCGTAGCTGCAGGTGGTCCAGAAAATTTGTTAGTAACCGTTGCTAACCCTGATATCGAAACTGCACAAAGATTATTCAAGTATCCAGGTATCG GTTTGTTAGTTGTCACAGGTGGTGAAGCTGTAGTTGATGCCGCTAGAAAACACACCAATAAGAGATTGATTGCAGCCGGTGCAGGTAACCCACCTGTCGTAGT TGATGAAACTGCTGACTTACCAAGAGCTGCACAATCCATCGTTAAGGGTGCAAGTTTCGATAACAACATCATCTGCGCTGACGAAAAGGTTTTAATTGTCGTAGAT TCTGTCGCTGACGAATTGATGAGATTAATGGAAGGTCAACATGCAGTTAAATTGACAGCCGCTCAAGCCGAACAATTGCAACCAGTTTTGTTGAAAAATATAGATGA

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ACGTGGTAAAGGTACCGTATCAAGAGATTGGGTTGGTAGAGACGCAGGTAAAATTGCAGCCGCTATAGGTTTGAACGTTCCTGATCAAACTAGATTGTTGTTCGTTGA AACACCAGCTAACCATCCTTTCGCAGTAACAGAAATGATGATGCCAGTTTTACCTGTTGTCAGAGTTGCTAATGTCGAAGAAGCCATAGCTTTGGCAGTTCAATTAG AAGGTGGTTGTCATCACACCGCAGCCATGCACTCCAGAAATATCGATAATATGAACCAAATGGCCAACGCTATCGACACTTCTATTTTCGTTAAAAACGGTCCATG CATTGCTGGTTTGGGTTTAGGTGGTGAAGGTTGGACTACAATGACCATAACCACTCCTACTGGTGAAGGTGTCACTTCTGCAAGAACATTTGTAAGATTGAGAAG ATGTGTCTTAGTAGATGCTTTCAGAATTGTTTAG

[0052] Sequência de aminoácidos do mutante de Salmonella typhimurium ACS L641P (SEQ ID NO: 8):

MSQTHKHAIPANIADRCLINPEQYETKYKQSINDPDTFWGEQGKILDWITPYQKVKNTSFAPGNVSIKWYEDGTLNLAANCLDRHLQENGDRTAIIWEGDDTSQSK HISYRELHRDVCRFANTLLDLGIKKGDVVAIYMPMVPEAAVAMLACARIGAVHSVIFGGFSPEAVAGRIIDSSSRLVITADEGVRAGRSIPLKKNVDDALKNPNVTSVE HVIVLKRTGSDIDWQEGRDLWWRDLIEKASPEHQPEAMNAEDPLFILYTSGSTGKPKGVLHTTGGYLVYAATTFKYVFDYHPGDIYWCTADVGWVTGHSYL LYGPLACGATTLMFEGVPNWPTPARMCQVVDKHQVNILYTAPTAIRALMAEGDKAIEGTDRSSLRILGSVGEPINPEAWEWYWKKIGKEKCPVVDTWWQTETGG FMITPLPGAIELKAGSATRPFFGVQPALVDNEGHPQEGATEGNLVITDSWPGQARTLFGDHERFEQTYFSTFKNMYFSGDGARRDEDGYYWITGRVDDVLNVS

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GHRLGTAEIESALVAHPKIAEAAVVGIPHAIKGQAIYAYVTLNHGEEPSPELYAEVRNWVRKEIGPLATPDVLHWTDSLPKTRSGKIMRRILRKIAAGDTSNLGDTSTLA

DPGVVEKPLEEKQAIAMPS

[0053] Sequência de DNA adotada de levedura sintética que codifica Methanosaeta concilii acsA1 p (SEQ ID NO: 9):

ATGTTGAAGTTGGCCGGTAAAGAAGATAAGAAGTTGAAAACCACTGTTTTCCAAGACGAAACCAGAATTTTCAACCCACCAAAAGAATTGGTCGAAAAGTCCATAGTT ATGCAATGGATGAAGAAGAAGGGTTTCAAGACCGAAAAAGAAATGAGAGCTTGGTGTTCCTCTGATGAACACTATTTGGAATTTTGGGACGAAATGGCTAAGAC CTATGTTGATTGGCATAAGACTTACACCAAGGTTATGGATGATTCCGAAATGCCATACTTCCATTGGTTTACTGGTGGTGAAATCAACATTACCTACAACGCTGTT GATAGACATGCTAAAGGTGCTAAGAAAGATAAGGTTGCCTACATCTGGATTCCAGAACCTACTGATCAACCAGTTCAAAAGATTACTTACGGTGACTTGTACAAAGAA

GTCAACAAGTTTGCTAACGGTTTGAAGTCTTTGGGTTTGAAAAAGGGTGACAGAGTCTCTATCTACATGCCAATGATTCCACAATTGCCAATTGCTATGTTGGCTTG

TGCTAAGTTGGGTGTTATTCACTCTGTTGTTTTCTCCGGTTTTTCCAGTAAAGGTTTGATGGATAGAGCTGCTGATTGTGGTTCAAGAGCTATTATTACTGTTGACG GTTTCTACAGAAGAGGTAAACCAGTTCCATTGAAGCCAAATGCTGATGAAGCTGCTGGTGGTGCTCCATCTGTTGAAAAGATTATCGTTTACAAAAGAGCCGGTGTC

GATGTCTCTATGAAGGAAGGTAGAGATGTTTGGTGGCATGATTTGGTTAAGGGTCAATCTGAAGAATGTGAACCAGTTTGGGTTGATCCAGAACATAGATTGT

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ACATCTTGTACACCTCTGGTACTACTGGTAAGCCAAAAGGTATTGAACATGCAACTGGTGGTAATGCTGTTGGTCCAGCTCAAACTTTACATTGGGTTTTCGATTTG AAGGATGATGATGTATGGTGGTGTACTGCTGATATTGGTTGGGTTACTGGTCATTCTTACATCGTTTATGCCCCATTGATTTTGGGTATGACCTCTTTGATGTATGA AGGTGCTGCAGATTATCCAGATTTTGGTAGATGGTGGAAGAACATCCAAGATCATAAGGTTACTGTCTTGTATACTGCTCCAACTGCTGTTAGAATGTTCATGAAG CAAGGTGCTGAATGGCCAGATAAGTATGATTTGTCCTCCTTGAGATTATTGGGTTCTGTTGGTGAACCTATTAACCCTGAAGCCTGGATGTGGTATAGAGAACATATT

GGTAGAGGTGAATTGCAAATCATGGATACTTGGTGGCAAACTGAAACCGGTACTTTTTTGAACTCTCCATTGCCTATTACCCCATTGAAACCAGGTTCTT GTACTTTTCCATTGCCAGGTTACGATATCTCCATTTTGGACGAAGAAGGTAACGAAGTTCCATTAGGTTCAGGTGGTAATATCGTTGCTTTGAAACCATACCCAT CTATGTTGAGAGCTTTTTGGGGTGACAAAGAAAGATTCATGAAGGAATACTGGCAATTCTACTGGGATGTTCCAGGTAGAAGAGGTGTTTATTTGGCTGGTGATAAG

GCTCAAAGAGATAAGGACGGTTACTTCTTCATTCAAGGTAGAATCGATGATGTTTTGTCCGTTGCTGGTCATAGAATTGCTAATGCTGAAGTTGAATCTGCTTTGGT

TGCTCATCCAAAAATTGCTGAAGCTGCAGTTGTTGGTAAACCTGATGAAGTAAAAGGTGAATCTATCGTTGCCTTCGTTATCTTGAGAGTTGGTAATGAACCATCTC

CAGAATTGGCTAAAGATGCCATTGCTTTCGTTAGAAAAACTTTGGGTCCAGTTGCTGCTCCTACTGAAGTTCATTTTGTTAACGATTTGCCAAAGACTAGATCCGGT

Petição 870190119991, de 19/11/2019, pág. 38/47

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AAGATCATGAGAAGAGTTGTTAAGGCTAGAGCTTTGGGTAATCCAGTTGGTGATATTTCCACTTTGATGAATCCTGAAGCCGTTGATGGTATTCCAAAGATCGTTTAA [0054] Sequência de aminoácidos de Methanosaeta concilii acsA1 p (SEQ ID NO: 10):

MLKLAGKEDKKLKTTVFQDETRIFNPPKELVEKSIVMQWMKKKGFKTEKEMRAWCSSDEHYLEFWDEMAKTYVDWHKTYTKVMDDSEMPYFHWFTGGEINITY NAVDRHAKGAKKDKVAYIWIPEPTDQPVQKITYGDLYKEVNKFANGLKSLGLKKGDRVSIYMPMIPQLPIAMLACAKLGVIHSVVFSGFSSKGLMDRAADC GSRAIITVDGFYRRGKPVPLKPNADEAAGGAPSVEKIIVYKRAGVDVSMKEGRDVWWHDLVKGQSEECEPVWVDPEHRLYILYTSGTTGKPKGIEHA TGGNAVGPAQTLHWVFDLKDDDVWWCTADIGWVTGHSYIVYAPLILGMTSLMYEGAADYPDFGRWWKNIQDHKVTVLYTAPTAVRMFMKQGAEWPDKYDLSSLRLLG SVGEPINPEAWMWYREHIGRGELQIMDTWWQTETGTFLNSPLPITPLKPGSCTFPLPGYDISILDEEGNEVPLGSGGNIVALKPYPSMLRAFWGDKERFMKEYWQFY WDVPGRRGVYLAGDKAQRDKDGYFFIQGRIDDVLSVAGHRIANAEVESALVAHPKIAEAAVVGKPDEVKGESIVAFVILRVGNEPSPELAKDAIAFVRKTLGPVAAPT EVHFVNDLPKTRSGKIMRRVVKARALGNPVGDISTLMNPEAVDGIPKIV

Claims

1. Células de levedura modificadas, caracterizadas pelo fato de que compreendem:

(i) um gene exógeno que codifica uma enzima acetil-Co sintase derivado de um micro-organismo arqueal que pertence ao gênero Methanosaeta, (ii) um gene exógeno que codifica uma enzima acetil-Co sintase de baixa afinidade derivada de levedura ascomiceto, (iii) uma acetil-CoA sintase de baixa afinidade endógena superexpressa, e/ou (iv) um gene exógeno que codifica uma proteína funcionalmente similar que tem pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos com um polipeptídeo da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO: 10, ou um fragmento ativo do mesmo, em que as células modificadas produzem uma quantidade reduzida de acetato e/ou crescem na presença de uma quantidade aumentada de acetato, em comparação com células de levedura de outro modo idênticas que não compreendem o gene exógeno.

2. Células de levedura modificadas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que compreendem ainda uma modificação genética que, na ausência do gene exógeno, faz com que as células de levedura produzam uma quantidade aumentada de acetato.

3. Células de levedura modificadas, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadas pelo fato de que a modificação genética é a introdução de um ou mais genes da via de fosfocetolase ou a deleção ou ruptura de genes da via de síntese de glicerol.

4. Células de levedura modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizadas pelo fato de que a redução na quantidade de acetato produzido é de pelo menos 20%, pelo

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2/3 menos 30% ou pelo menos 40%.

5. Células de levedura modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizadas pelo fato de que a proteína funcionalmente similar tem pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 97% de identidade de sequência de aminoácido com um polipeptídeo da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 9 ou um fragmento ativo do mesmo.

6. Células de levedura modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizadas pelo fato de que compreendem ainda um gene que codifica uma enzima de processamento de carboidrato ou outra proteína de interesse.

7. Método para reduzir a quantidade de acetato produzido por células de levedura durante uma fermentação de um hidrolisado de amido, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir na levedura:

(i) um gene exógeno que codifica uma enzima acetil-Co sintase derivado de um micro-organismo arqueal que pertence ao gênero Methanosaeta, (ii) um gene exógeno que codifica uma enzima acetil-Co sintase de “baixa afinidade” derivada de levedura ascomiceto, (iii) uma alteração genética que causa a superexpressão de uma acetil-CoA sintase de baixa afinidade endógena, e/ou (iv) um gene exógeno que codifica uma proteína funcionalmente similar que tem pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos com um polipeptídeo da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 9 ou um fragmento ativo do mesmo.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as células de levedura compreendem ainda uma modificação genética que, na ausência do gene exógeno, faria com que as células de levedura produzissem uma quantidade aumentada de acetato.

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9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a modificação genética é a introdução de genes da via de fosfocetolase ou a deleção ou ruptura de genes da via de síntese de glicerol.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que a redução na quantidade de acetato produzido é de pelo menos 20%, pelo menos 30% ou pelo menos 40%.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a10, caracterizado pelo fato de que a proteína funcionalmente similar tem pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 97% de identidade de sequência de aminoácido com um polipeptídeo da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 9 ou um fragmento ativo do mesmo.

12. Células de levedura modificadas, caracterizadas pelo fato de que são produzidas pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 11.