KR101351989B1 - 2,3-부탄다이올 제조용 효모의 제조방법 - Google Patents

2,3-부탄다이올 제조용 효모의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알코올 디히드로제나아제(alcohol dehydrogenase) 1, 알코올디히드로제나아제 3 및 알코올 디히드로제나아제 5로 구성된 군으로부터 선택되는 하나이상의 알코올 디히드로제나아제를 불활성화시키는 단계를 포함하는 2,3-부탄다이올 제조용 효모의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 화학공업에 유용한 기초가 될 플랫폼용 화합물인 2,3-부탄다이올 제조용 효모 제조방법, 2,3-부탄다이올 제조용 효모 및 2,3-부탄다이올을 제공할 수 있으며, 본 발명의 2,3-부탄다이올 제조용 효모는 야생형 균주와 비교하여 50-100배 향상된 우수한 2,3-부탄다이올 효율을 나타낸다.

Description

2,3-부탄다이올 제조용 효모의 제조방법{Method for Preparing Yeast Producing 2,3-butanediol}
본 발명은 2,3-부탄다이올 제조용 효모의 제조방법에 관한 것이다.
석유의 높은 수요에도 치솟는 유가로, 다양한 지속가능한 형태의 대체 에너지 및 화학물질을 찾고 있다. 미생물은 실물 바이오매스 및 농산폐기물과 같은 기질을 광범위하게 이용할 수 있고 이를 귀중한 화학물질 및 바이오연료로 전환 할 수 있다. 미생물 공학기술의 급속한 발전으로, 이러한 생물-기반의 정제는 화석연료에 대한 의존도를 감소시킬 수 있다.
2,3-부탄다이올은 대사 물질로서 그의 유도체는 합성 고무, 용액 및 약물 등 산업 전반에 사용될 수 있다. 2,3-부탄다이올은 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia), 크렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 엔테로박터 애로지네스(Enterobacter aerogenes), 세라티아(Serratia) 및 바실러스 폴리믹사(Bacillus polymyxa)와 같은 원핵생물의 혼합 산(mixed acid) 발효를 통해 효율적으로 제조할 수 있다.1 이러한 박테리아는 피루브산을 아세토락테이트 합성효소에 의해 α-아세토락테이트로 전환한다. 무산소 상태에서, α-아세토락테이트 디카르복실라제는 α-아세토락테이트를 아세토인으로 촉매한다(도 1, 녹색 화살표). 유산소 조건에서, α-아세토락테이트의 자발적인 디카르복실레이션으로 디아세틸(diacetyl)을 생산한다. 디아세틸 환원효소는 디아세틸을 아세토인으로 전환한다. 2,3-부탄다이올은 부탄다이올 디히드로제나제에 의한 아세토인의 환원으로 생산된다. 그러나, 이러한 박테리아의 대부분은 안전성 조절 문제로 산업 규모의 발효에 적절하지 않다.2 2,3-부탄다이올은 식품 첨가물 및 화장품의 전구물질로 사용되기 때문에 안전한 2,3-부탄다이올의 생산이 요구된다. Saccharomyces cerevisiae는 산업적으로 이용가능한 GRAS(Generally Regarded As Safe)급의 미생물이다.
S. cerebisiae에서, 아세트알데히드, 피루브산 및 α-아세토락테이트는 2,3-부탄다이올의 전구체이다(도 1). 중간물질로 디아세틸을 갖는 생합성 경로는 박테리아의 경로와 유사하다. 그러나, α-아세토락테이트 디타르복실라제는 대부분의 S. cerebisiae에서 존재하지 않는다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 유해한 폐기물의 생산 및 에너지 소비를 최소화할 수 있는 신재생에너지 자원인 탄화수소 형태의 화합물을 제조하기 위해 2,3-부탄다이올을 제조할 수 있는 재조합 미생물의 제조방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, OptKnock 분석법을 이용하여 효모의 대사 중 탄소유동을 2,3-부탄다이올 생산 경로가 우세하도록 알코올 디히드로제나아제 1, 알코올 디히드로제나아제 3 및 알코올 디히드로제나아제 5로 구성된 군으로부터 선택되는 하나이상의 알코올 디히드로제나아제를 불활성화하여 효율적으로 2,3-부탄다이올 제조용 미생물을 제조할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 2,3-부탄다이올(butanediol) 제조용 효모의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 2,3-부탄다이올 제조용 효모를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 2,3-부탄다이올을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 효모 변이체의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 알코올 디히드로제나아제(alcohol dehydrogenase) 1, 알코올디히드로제나아제 3 및 알코올 디히드로제나아제 5로 구성된 군으로부터 선택되는 하나이상의 알코올 디히드로제나아제를 불활성화시키는 단계를 포함하는 2,3-부탄다이올(butanediol) 제조용 효모의 제조방법을 제공한다.
본 발명자들은 유해한 폐기물의 생산 및 에너지 소비를 최소화할 수 있는 신재생에너지 자원인 탄화수소 형태의 화합물을 제조하기 위해 2,3-부탄다이올을 제조할 수 있는 재조합 미생물의 제조방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, OptKnock 분석법을 이용하여 효모의 대사 중 탄소유동을 2,3-부탄다이올 생산 경로가 우세하도록 알코올 디히드로제나아제 1, 알코올 디히드로제나아제 3 및 알코올 디히드로제나아제 5로 구성된 군으로부터 선택되는 하나이상의 알코올 디히드로제나아제를 불활성화하여 효율적으로 2,3-부탄다이올 제조용 미생물을 제조할 수 있음을 확인하였다.
본 명세서에서 용어 ‘알코올 디히드로제나아제’는 다음의 반응식을 통해 아세트알데히드를 알코올로 상호전환하는 효소를 말한다.
[반응식]
Figure 112012012350367-pat00001
바람직하게는, 서열목록 제4서열에 기재된 아미노산 서열을 갖는 알코올 디히드로제나아제 1를 코딩하는 핵산 분자, 제5서열에 기재된 아미노산 서열을 갖는 알코올 디히드로제나아제 3를 코딩하는 핵산 분자 및 제6서열에 기재된 아미노산 서열을 갖는 알코올 디히드로제나아제 5를 코딩하는 핵산 분자이고, 보다 바람직하게는, 상기 알코올 디히드로제나아제 1를 코딩하는 핵산 분자는 서열목록 제1서열, 알코올 디히드로제나아제 3을 코딩하는 핵산 분자는 제2서열 및 알코올 디히드로제나아제 5를 코딩하는 핵산 분자는 제3서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
본 명세서에서 알코올 디히드로제나아제 1, 알코올 디히드로제나아제3 및 알코올 디히드로제나아제 5를 언급하면서 사용되는 용어, “불활성화(inactivation)”란 유전자의 전사 또는 해독, 유전자 산물의 활성의 손상(impairment)을 초래하는 알코올 디히드로제나아제 1, 알코올 디히드로제나아제3 및 알코올 디히드로제나아제 5의 지놈 열상에서의 변형(modifications)을 의미한다. 이런 유전자 변형은 알코올 디히드로제나아제 1, 알코올 디히드로제나아제3 및 알코올 디히드로제나아제 5 코딩 서열의 불활성화뿐만 아니라 이의 프로모터의 불활성화도 포함될 수 있다. 효모 지놈 상에서 목적한 유전자만의 특이적 불활성화는 코딩하는 유전자의 전체 또는 하나 이상의 부분 영역에서 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통하여 돌연변이시킴으로서 가능하다. 예들 들어, 유전자의 결실 및 유전자로의 이형 서열(heterogenous sequence)의 삽입은 유전자의 절단(truncation), 넌센스 돌연변이(nonsense mutation), 프레임쉬프트 돌연변이(frameshift mutation), 미스센스 돌연변이(missense mutation) 등을 초래할 수 있다. 이러한 유전자의 특이적 불활성화는 당 분야에서 확립된 방법을 통하여 수행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 알코올 디히드로제나아제 1, 알코올 디히드로제나아제3 및 알코올 디히드로제나아제 5로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 알코올 디히드로제나아제를 불활성화시키는 단계를 알코올 디히드로제나아제 1, 알코올 디히드로제나아제3 및 알코올 디히드로제나아제 5로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 알코올 디히드로제나아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 결실시켜 실시된다.
본 명세서에서 알코올 디히드로제나아제 1, 알코올 디히드로제나아제3 및 알코올 디히드로제나아제 5를 언급하면서 사용되는 용어, ‘결실(deletion)'은 알코올 디히드로제나아제 1, 알코올 디히드로제나아제3 및/또는 알코올 디히드로제나아제 5의 기능을 상실케 하는 모든 결실 변이를 포함하는 의미를 갖는다. 예를 들면, 알코올 디히드로제나아제 1, 알코올 디히드로제나아제3 및 알코올 디히드로제나아제 5로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 알코올 디히드로제나아제 코딩 서열의 부분 결실 또는 전체 결실을 모두 포함한다.
이러한 알코올 디히드로제나아제의 결실은 당업계에 공제된 다양한 변이유발(mutagenesis) 방법을 통하여 실시할 수 있다. 예컨대, NST1 코딩 서열의 결실은 PCR 돌연변이유발법 및 카세트 돌연변이유발법으로 실시할 수 있다(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).
바람직하게는, 본 발명의 방법에 의해 제조된 효모는 2,3-부탄다이올의 생성 효율이 야생형 효모와 비교하여 50 내지 100배 증가하며, 이러한 효모 변이체는 고온에서 야생형 효모의 최적 온도(예컨대, 30℃)에서의 생장과 실질적으로 동일한 생장곡선을 나타낸다.
본 발명이 적용되는 효모는 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 사카로마이세스( Saccharomyces ), 사이조사카로마이세스 ( Schizosaccharomyces ), 스포로보로마이세스( Sporobolomyces ), 토루로프시스 ( Torulopsis ), 트리코스포론 ( Trichosporon ), 윅커하미아( Wickerhamia ), 아쉬바이아 ( Ashbya ), 블라스토마이세스 ( Blastomyces ), 캔디다( Candida ), 사이테로마이세스( Citeromyces ), 크레브로테슘 ( Crebrothecium ), 크립토코커스 ( Cryptococcus ), 드바리오마이세스( Debaryomyces ), 에노마이코프시스 ( Endomycopsis ), 지오트리컴 ( Geotrichum ), 한세눌라( Hansenula ), 클로엑케라 ( Kloeckera ), 리포마이세스 ( Lipomyces ), 피키아 ( Pichia ), 로도스포리듐( Rhodosporidium ) 또는 로도토룰라 ( Rhodotorula ) 속(genus)에 속하는 효모이고, 보다 바람직하게는 사카로마이세스에 속하는 효모이고, 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비시애이다.
본 발명의 2,3-부탄다이올 제조용 효모의 2,3-부탄다이올 효율을 높이기 위해서 이종 경로를 도입할 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 크렙시엘라 옥시토카 budC, 엔테로박터 애로지네스 budA 및 엔테로박터 애로지네스 budC를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현벡터를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 발현벡터를 본 발명의 2,3-부탄다이올 제조용 효모에 형질전환 한다.
상기 용어 “형질전환”은 상기 제작된 벡터를 미생물 내로 운반하는 방법을 의미하며, 형질전환 하고자 하는 세포가 원핵세포인 경우에는, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 형질전환 하고자 하는 세포가 진핵세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell. Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990))등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 효모와 같은 진균의 형질전환의 경우에는, 일반적으로 리튬 아세테이트(Lithium acetate, R.D. Gietz, Yeast 11, 355360(1995)) 및 열 충격( Keisuke Matsuura, Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol. 100, 5;538-544(2005))을 이용한 형질전환법과 전기천공법(Nina SkoluckaAsian, Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 94-98(2011))에 의해 실시될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 제조된 2,3-부탄다이올 제조용 효모를 제공한다.
바람직하게는, 알코올 디히드로제나아제 1, 알코올 디히드로제나아제 3 및 알코올 디히드로제나아제 5를 결실시킨 효모이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 2,3-부탄다이올 제조용 효모에 의해 제조된 2,3-부탄다이올을 제공한다.
본 발명의 효모에 의해서 제조된 2,3-부탄다이올은 화학적 전환을 통해 고무의 재료, 연료 첨가제, 부동액, 화장품 및 의약품으로 응용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 알코올 디히드로제나아제(alcohol dehydrogenase) 1, 알코올디히드로제나아제 3 및 알코올 디히드로제나아제 5를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나이상의 알코올 디히드로제나아제를 불활성화시키는 단계를 포함하는 2,3-부탄다이올(butanediol) 제조용 효모 변이체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 화학공업에 유용한 기초가 될 플랫폼용 화합물인 2,3-부탄다이올 제조용 효모 제조방법, 2,3-부탄다이올 제조용 효모 및 2,3-부탄다이올을 제공할 수 있다.
(b) 본 발명의 2,3-부탄다이올 제조용 효모는 야생형 균주와 비교하여 50-100배 향상된 우수한 2,3-부탄다이올 효율을 나타낸다.
(c) 본 발명은 대사공학 모델링을 통하여 효모의 2,3-부탄다이올 생성을 극대화함으로써, 대량생산에 유리하고 우수한 경제성을 갖는 2,3-부탄다이올 제조용 효모를 제공할 수 있다.
도 1은 S. cerevisiae의 2,3-부탄다이올 생합성 및 피루브산 대사 경로를 보여준다. 녹색 화살표는 α-아세토락테이트 디카르복실라아제를 통한 박테리아의 2,3-부탄다이올 생합성 경로를 보여준다. 파란색 박스는 S. cerevisiae 본래 유전자로 구성되며, 노란색 박스는 외부 유전자의 도입을 나타낸다.
도 2는 선별된 OptKnock 균주의 2,3-부탄다이올 생산 엔벨롭을 보여준다. 플롯은 최대 바이오매스 생성율의 기능으로 최대 달성가능한 2,3-부탄다이올 효율을 나타낸다. 회색 및 검은색 원는 OptKnock 돌연변이 및 기준 균주 각각의 FBA 최적 포인트를 나타낸다.
도 3은 비연속 배양의 세포외 대사물 농도를 보여준다. 저산소 조건 하에 비연속 배양의 종료 시, (a) 2,3-부탄다이올, (b) 에탄올, (c) 아세트산 및 (d) 글리세롤의 농도를 나타낸다. 플러스(+) 또는 마이너스(-) 표시는 해당하는 유전자 결실의 존재 또는 부재를 나타낸다. 첫 번째 컬럼은 야생형 균주에 해당한다. 오차막대는 3회 실험의 표준편차로 구하였다.
도 4는 글루코우즈에 대한 바이오매스 및 대사산물 효율의 분포그래프를 보여준다. 저산소 조건 하에 비연속 배양의 종료 시, 바이오매스 및 대사산물 프로필을 보여준다. 주발효산물의 변화는 유전자의 결실에 기인한다.
도 5는 저산소(M) 및 혐기성(A) 배양의 대사산물 프로필을 나타낸다. 막대 차트는 선별된 균주 및 야생형 균주의 20 gl-1 글루코오즈 기질에서 저산소 비연속 배양 및 혐기성 비연속 배양에 대한 글리세롤, 2,3-부탄다이올, 에탄올 및 아세트산 농도를 보여준다.
도 6은 유전자 과발현 방법에 대한 2,3-부탄다이올 효율의 비교를 나타낸다. 각 막대는 다른 숙주 균주의 저산소 진탕배양에 대한 2,3-부탄다이올 효율을 나타낸다. 빨간색 컬럼은 숙주 균주; 노란색 컬럼은 S. cerevisiae BDH1 과발현; 녹색 컬럼은 박테리아의 alsS-budA-budC 공동발현.
도 7은 콜로니 PCR을 통해 유전자 결실 돌연변이를 확인한 전기영동 결과를 보여준다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
재료 및 방법
컴퓨터를 이용한 과정
FBA(Flux Balance Analysis)-기반 시뮬레이션 및 OptKnock 알고리즘을 이용하여 COBRA 툴박스 v2.0을 장치한 Matlab R2010a(The MathWorks, 미국)로 균주 디자인을 실시하였다.13 선형 프로그래밍 계산을 수행하는데 구로비(Gurobi) 옵티마이저 4.5(Gurobi Optimization, 미국)를 사용하였다. 최근 보고된 904 유전자, 1577 반응 및 1228 대사물질을 포함하는 효모 게놈-스케일 모델 iMM904를 사용하였다. 모든 시뮬레이션은 다음의 제한 조건으로 실시하였다:
산소 흡수율, 2 mmolgDCW-1.hr-1; 글루코오즈 흡수율, 10 mmolgDCW-1.hr-1; 유지를 위해 요구되는 ATP, 1 mmolgDCW-1.hr-1.
균주, 플라스미드 및 생장 조건
본 발명의 모든 균주는 S. cerebisiae(BY4742 MAT α his3 △1 leu2 △0 lys2 △0 ura3 △0)(Euroscarf, 독일)로부터 유래하였다. 컨스트럭션 과정은, 균주를 1%(w/v) 박토 효모 추출물, 2%(w/v) 효모 박토 펩톤 및 탄소원으로 20 gl-1 글루코오즈를 포함하는 완전 배지(YPD)에서 배양하고 유지하였다. 형질전환체 및 재조합 플라스미드를 포함하는 균주를 20 gl-1 글루코오즈, 6 gl-1 아미노산 무첨가 효모 질소 베이스(Difco, 미국) 및 적당한 아미노산 첨가물(CSM, 미국)을 포함하는 합성 완전 드롭아웃(dropout) 배지(SC)에서 배양하였다. 글루코오즈는 오토클레이브하여 사용하였다. 이스케리치아 콜라이(Escherichia coli) DH5α균주로 플라스미드를 증폭하였으며, LB(Luria-Bertani) 배지에서 37℃로 배양하였다.
유전자 돌연변이 균주 제조
본 발명에 사용된 모든 균주를 표 1에 기재하였다. S. cerevisiae의 유전자 결실은 Cre/loxP 시스템을 이용하여 수행하였다. pCNKanMX6는 pFA6a-KanMX6로부터 제조하였다.14 pTKURA3은 KanMX6 카세트를 200 뉴클레오타이드 업스트림 및 +77 뉴클레오타이드 다운스트림을 포함하는 S. cerevisiae URA3 유전자와 교체하여 제조하였다. BY4742 야생형 균주에 ADH1 유전자의 45 뉴클레오타이드 업스트림 및 다운스트림을 갖는 loxP-URA3-loxP 서열을 포함하는 선형 유전자(linearized gene) 결실 카세트를 도입하여 ADH1 유전자를 결실하였다. B2C-a1a3, B2C-a1a5 및 B2C-a1a6 이중 유전자 돌연변이를 제조하기 위해 같은 방법을 이용하여 △adh1 결실주에서 ADH3, ADH5 또는 ALD6 유전자를 결실하였다. 삼중 유전자 돌연변이 B2C-a1a6a3 및 B2C-a1a6a5를 제조하기 위해, ADH3 및 ADH5를 △adh1 △ald6 결실주로부터 각각 결실하였다. B2C-a1a3a5 삼중 유전자 돌연변이는 B2C-a1a5 결실주에서 ADH3 유전자를 결실하였다. B2C-a1a6 결실주의 GPD2 유전자를 결실하여 B2C-a1a6g2를 제조하였다. 완성된 균주는 표 2의 프라이머를 이용하여 PCR로 확인하였다(도 7).
Figure 112012012350367-pat00002
Figure 112012012350367-pat00003
Figure 112012012350367-pat00004

플라스미드 제조 및 형질전환
본 발명에서 사용한 플라스미드를 표 3에 정리하였다. BY4742 균주의 게놈 DNA를 BDH1-F-BamHⅠ 및 BDH1-R-XhoⅠ 프라이머를 이용하여 S. cerevisiae BDH1 유전자를 증폭하였다. 증폭된 프래그먼트(fragment)를 BamHⅠ 및 XhoⅠ으로 제한효소 처리하고 p423GPD 및 p423TEF에 라이게이션 하여 p423GPD-BDH1 및 p423TEF-BDH1을 제조하였다. E. aerogenes KCTC 2190 균주로부터 E.a.budC-F-BamHⅠ 및 E.a.budC-R-EcoRⅤ 프라이머를 이용한 콜로니 PCR을 수행하여 E. aerogenes budC 유전자를 증폭하였다. budC 유전자 프래그먼트를 p423GPD의 BamHⅠ-EcoRⅤ 부위에 삽입하여 p423GPD-E.a.budC를 완성하였다.
pESC-URA(Stratagene, 미국)의 2-단계 클로닝을 통해 GAL1/GAL10 프로모터 부위를 제거하고 PGK1p/TEF1p 프로모터로 대체하였다. S. cerevisiae BY4742 게놈 DNA로부터 PGK1p-F-AatⅡ-NotⅠ 및 PGK1p-R-BamHⅠ 프라이머를 이용하여 증폭한 PGK1 프로모터 서열을 BamHⅠ및 NotⅠ으로 제한효소 처리하고 pESC-URA에 클로닝하여 pCP-URA를 제조하였다. p425TEF로부터 TEF1p-R-NotⅠ 및 TEFp-F-AatⅡ 프라이머를 이용하여 TEF1 프로모터 부위를 증폭하였다. TEF1 프로모터 프래그먼트 및 pCP-URA를 AatⅡ 및 NotⅠ로 제한효소 처리하였다. 신규한 플라스미드, pCTP-URA를 제조하였다. Bacillus subtilis 세포를 B.s.alsS-F-NotⅠ 및 B.s.alsS-R-BgⅢ 프라이머를 이용한 콜로니 PCR을 통해 B. subtilis alsS 유전자를 증폭하였다. E. aerogenes KCTC 2190 균주를 E.a.budA-F-BamHⅠ 및 E.a.budA-R-XhoⅠ 프라이머를 이용한 콜로니 PCR을 수행하여 E. aerogenes budA를 증폭하였다. B. subtilis alsS 및 E. aerogenes budA 프래그먼트를 TEF1 프로모터 및 PGK1 프로모터를 갖는 pCTP-URA에 각각 클로닝하였다.
본 발명에서 실시한 모든 PCR은 GC 버퍼(Takara Bio Inc, 일본)에서 Takara LA Taq 폴리머라아제를 사용하여 실시하였다. 리튬 아세테이트/PEG/SS-DNA 방법을 이용하여 효모 균주를 형질전환하였다.15 형질전환 후, 아미노산을 포함하지 않는 SC 배지("균주, 플라스미드 및 생장 조건"에 SC배지 또는 "합성 완전 드롭아웃 배지"의 조성)에서 형질전환체를 선별하였다.
Figure 112012012350367-pat00005
비연속 발효( Batch fermentation )
본 발명의 모든 발효에서 전배양은 50 ㎖ 스크류-캡 튜브에 담긴 합성 완전 드롭아웃 배지 5 ㎖에 고체배지에서 자란 신선한 콜로니를 접종하여 준비하였다. 50 ㎖의 합성 완전 드롭아웃 배지를 포함하는 250 ㎖ 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크에서 비연속 발효를 실시하였다. 플라스크를 고무 마개로 봉합하고 저산소(microaerobic) 조건을 유지하였다. 혐기성 조건은 50 ㎖ 배지가 담긴 150 ㎖ 혈청 병에 15분 동안 질소 가스를 주입하여 혐기성 조건을 확립하였다. 초기 OD600은 0.05로 측정되었다. 발효는 30℃에서 250 rpm으로 실시하였다.
분석방법
UV-VIS 분광 광도계(Shimazu UV mini 1240, 일본)을 사용하여 660 ㎚에서 흡광도를 측정하여 세포 성장을 확인하였다. 또한, 진탕 배양 후 배양물 30 ㎖을 0.45 ㎛의 공극 크기를 갖는 셀룰로오즈 아세테이트 막필터(Chmlab Group, 스페인)를 통과시켜 효모의 건조중량을 확인하였다. 필터를 65℃에서 48시간동안 건조하고 중량을 측정하였다. 건조 세포 중량을 산출하고 건조 세포 중량/OD600 비율을 이용하여 세포 생물량을 추정하였다.
글루코오즈, 글리세롤, 에탄올, 아세테이트, 숙신산, 아세토인 및 2,3-부탄다이올의 세포외 농도를 굴절율 검출기(Refractive Index Detector; RID)를 갖춘 HPLC(High Performance Liquid Chromatography, 영진기구 ACME-9000, 대한민국)를 이용하여 측정하였다. 분석물은 이동상으로 10 mM 황산을 사용하여 슈가(Sugar) SH1011 컬럼(Shodex, 일본)을 0.5 ㎖/분으로 분리하였다. 컬럼 및 검출기는 75℃ 및 45℃로 각각 설정하였다.
결과 및 토론
OptKnock 을 이용한 2,3- 부탄다이올 생성 균주의 인 실리코 디자인
OptKnock을 통해 R,R-2,3-부탄아이올의 생합성을 이끄는 부탄다이올 디히드로제나아제의 유동을 제어하는 것를 고려하였다. 모든 시뮬레이션은 혐기성 조건 하에 글루코오즈를 기질로 하여 실시하였다. OptKnock 분석은 단일 반응의 결실이나 이중 반응의 결실은 2,3-부탄다이올의 생산에 영향이 없는 것을 보여주었다.
발명자들은 다수의 반응을 결실하기 위해, 초기에 4가지 및 5가지의 반응을 타겟하는 모델 C 및 모델 D를 각각 구하였다(표 4). 양 모델은 피루브산을 아세틸-coA로 전환하는 반응을 촉매하는 피루브산 디히드로제나아제(PDHm)의 결실을 포함한다. 상기 반응이 결실되는 경우, 피루브산의 더 많은 유동이 2,3-부탄다이올 타겟 반응에 이를 수 있다. NADPH 의존적인 GDH1 및 GDH3 유전자는 효모의 암모늄 대사와 관련되며, GDH1의 결실은 성장을 감소시킨다.3 모델 C 및 모델 D의 다른 모든 반응을 완전히 해석할 수는 없지만, 아스파탐 트랜스아미나아제 및 글루탐산 디히드로제나아제는 아미노산 대사에 관여하며, 시티일산 키나아제, NAD 키나아제, 뉴클레오사이드 다이포스페이트 키나아제 및 티미딘 포스포릴라아제는 뉴클레오타이드 구조경로 및 퓨린/피리미딘 생합경 경로와 관련 있다.
Figure 112012012350367-pat00006
녹아웃을 위한 타겟 반응 풀(pool)에서 이러한 반응을 제거하여, 모델 A를 구하였다. 모델 A는 모든 알코올 디히드로제나아제 반응의 결실을 제안한다. 2,3-부탄다이올 및 에탄올은 피루브산 및 아세트알데히드의 동일한 전구물질을 공유하고 2,3-부탄다이올 및 에탄올의 생산에는 NADH의 산화가 관련된다. 그러므로, S. cerevisiae의 고활성 알코올 발효경로의 제거는 2,3-부탄다이올의 제조에 유리할 것이다. 상기 균주가 기존 균주의 성장률보다 20% 낮아지더라도 2,3-부탄다이올의 예상 효율은 0.313 g·g-1 글루코오즈이다(도 2).
OptKnock 분석을 통해, 2,3-부탄다이올의 15% 향상된 효율을 갖는 4중 결실 돌연변이가 제안되었다. 모델 A에 세포질 알코올 디히드로제나아제 반응을 추가는, NAD+의 환원을 수반한 말레이트를 옥살로아세테이트로 전환시키는 말레이트 디히드로제나아제(MDH2)가 타겟 반응으로 제안되었다. 이러한 글루코네오제네시스(gluconeogenesis)는 글루코오즈를 억제한다. 그러나, 이러한 유동이 글루코오즈-성장 야생형에 대하여 음의 값을 나타내는 iMM904 모델의 시뮬레이션과 비교하여, 반대 반응이 활성된다. 그러므로, OptKnock은 2,3-부탄다이올과 NADH에 대하여 경쟁적인 상기 반응의 결실을 제한한 것이다. GTP 사이클로히드롤라아제 결실에 대한 근거는 알려져 있지 않다. 더욱이, 이러한 4중 결실 돌연변이는 기존 균주의 66% 성장률을 갖는다.
게놈 스케일 대사 모델에서 다수의 반응으로 인해, 컴퓨터를 이용한 균주 디자인은 해설이 어려운 결과을 보여준다. OptKnock은 2,3-부탄다이올로의 탄소 유동에 경쟁적인 피루브산 디히드로제나아제 및 알코올 디히드로제나아제 반응을 예상하였다. 그러므로, 모델 A는 최선의 결과임을 나타낸다. OptKnock에 의한 가설을 시험하기 위해, 알코올 디히드로제나아제 활성이 검소된 균주를 제조하였다.
균주 제조 및 저산소 발효
OptKnock 유전자 결실 전략에 따라, 아세트알데히드의 에탄올 전환과 관련한 모든 유전자를 결실하고자 하였다. SFA1 유전자와 함께 총 4 종류의 알코올 디히드로제나아제 유전자인, ADH1, ADH3, ADH4 및 ADH5를 제거하고자 하였다. ADH4는 에탄올 제조와 관련이 없는 것으로 알려져 있다. 또한, SFA1은 장쇄(long-chain) 알코올 디히드로제나아제 및 포름알데히드 디히드로제나아제로 알려져 있다.5,6 그러므로, 결실하고자 하는 목적 유전자는 ADH1, ADH3 및 ADH5이다.
각 유전자의 결실이 2,3-부탄다이올의 효율에 기여하는 정도를 확인하기 위해, 세 유전자의 다른 조합을 갖는 알코올 디히드로제나아제 돌연변이를 제조하였다. 각 균주에 대하여 저산소 조건에서 진탕배양을 실시하였다. 야생형 균주는 평균 20 g·l-1의 발효를 40시간 동안 나타내는 반면, 돌연변이 균주는 60시간 동안 나타내었다. BY4742 야생형 균주의 배양에서 2,3-부탄다이올(0.001 g·l-1)의 최대 30 ㎎·1-1 만이 검출되었다. 야생형 균주와 비교하여, 주요한 알코올 디히드로제나아제 유전자인 ADH1의 단일 결실은 알코올의 수율을 반으로 감소시키고 2,3-부탄다이올 수율을 28 배 이상 증가시켰다. 2,3-부탄다이올 최대 농도 및 생산 효율은 각각 0.825 g·l-1 및 0.041 g·l-1이다(도 3 및 표 4). 이중(double) 결실균주 B2C-a1a3(△adh1△adh3) 및 B2C-a1a5(△adh1△adh5)는 △adh1 단일 결실 균주와 비교하여, 88% 높은 수율로 1.55 g·l-1의 2,3-부탄다이올을 생산하였다. B2C-a1a5는 B2C-a1a3와 유사한 최대 농도의 2,3-부탄다이올을 제조하지만, 2,3-부탄다이올 생성율은 20% 이상 높았다. ADH1, ADH3 및 ADH5 유전자가 결실된 B2C-a1a3a5 균주의 2,3-부탄다이올 농도 및 효율은 돌연변이 균주 가운데 가장 높은 1.64 g·l-1 및 0.093 g·g- 1 를 나타내었다.
균주 건조세포중량 (g/l) 수율 (g/g 글루코오즈 )
2,3- 부탄다이올 글리세롤 에탄올 아세토인 아세트산
BY4742 WT 1.280 0.001 0.035 0.424 0.001 0.018
B2C- a1 0.787 0.041 0.225 0.243 0.016 0.020
B2C- a1a3 0.805 0.077 0.267 0.176 0.015 0.025
B2C- a1a5 0.532 0.083 0.320 0.142 0.011 0.019
B2C- a1a3a5 a 0.900 0.093 0.238 0.131 0.008 0.025
B2C- a1a6 0.740 0.046 0.265 0.231 0.010 0.002
B2C- a1a6a3 a 0.619 0.023 0.125 0.318 0.011 0
B2C- a1a6a5 0.569 0.052 0.309 0.210 0.013 0
B2C- a1a6g2a3a5 0.806 0.018 0.081 0.347 0.007 0
이전의 연구는 △adh1 돌연변이에서 아세트알데히드 축적으로 낮은 성장을 나타낸다고 보고된다.7 이전의 보고와 유사하게, 본 발명의 △adh1 결실 균주도 유사한 성장 패턴을 나타냈다(표 4). 더욱이, ADH1 또는 ADH1 -4 동위효소 결실 균주의 분석한 결과, 아세트알데히드 및 아세테이트가 상당량 생성되는데 반해 이러한 균주는 글리세롤이 주발효 산물로 생성되었다.4 이는 에탄올로 가는 유동이 감소하면서 NADH 및 아세트알데히드가 축적되기 때문이다. 글리세롤의 생성은 세포질에서 과도한 NADH를 재산화되게 하는 반면, 아세테이트 형성은 아세트알데히드의 축적을 감소시킨다. 2,3-부탄다이올은 효모의 선천적 경로를 통해 피루브산으로부터 직접적으로 합성될 수 있다. 2,3-부탄다이올의 제조는 NADH의 산화를 요구하는 반면, 아세트알데히드의 아세테이트로의 산화는 공동인자 NAD(P)+를 감소시킨다. 따라서, B2C-a1, B2C-a1a3 및 B2C-a1a5 균주에서 아세트알데히드의 축적은 2,3-부탄다이올의 생산을 증가시켰다. 이전의 보고와 같이, 아세테이트 생산이 뚜렷이 증가하지 않았다.
ADH3 유전자는 미토콘드리아의 알코올 디히드로제나아제로 알려져 있다.8 부탄다이올 디히드로제나아제는 효모의 세포질에서 활성을 가짐으로, △ adh1 균주의 세포질 내 다른 알코올 디히드로제나아제 유전자인 ADH5의 결실은 2,3-부탄다이올 생성율을 증가시키는데 있어 ADH3 유전자의 결실보다 조금 더 효율적이였다. 3중 결실 균주는 △ adh1 △ adh3 균주보다 35% 정도 감소된 에탄올 생산을 나타내었다. 또한, 탄소 유동은 돌연변이 균주에서 2,3-부탄다이올의 생산으로 성공적으로 전환되었으며, 이중 결실 돌연변이에 비해 25% 높은 바이오매스 효율을 나타내었다.
유전자 조작된 균주에서의 2,3-부탄다이올의 생산은 대개 피루브산 디카르복실라아제에 의해 촉매되는 경로를 통한다. △ adh1 균주에서 PDC1의 결실은 아세트알데히드의 생산을 감소시킨다는 보고가 있다.10 △ adh1 △ pdc1 균주에서, 2,3-부탄다이올의 0.6 g·l-1보다 덜 검출되었다. △ adh1 △ adh3 △ pdc1 3중 결실 균주는 2,3-부탄다이올을 덜 생산하였다. △ adh1 및 △ adh1 △ adh3 결실 균주로부터 PDC1의 결실은 아세트알데하이드로의 유동을 감소시켰으며, 아세토인의 생산을 감소시켰다. 이는 피루브산 디카르복실라아제 효소가 아세트알데히드 및 2,3-부탄다이올을 생산하는데 중요하다는 것을 증명한다. 하지만, 피루브산 디카르복실라아제 효소의 아세토인 합성효소 활성은 매우 낮은 농도에서 포화상태에 이른다고 보고된다.16 그러므로, 또다른 알코올 디히드로제나아제 유전자의 추가적인 결실은 2,3-부탄다이올 생산을 증가시키는데 유효하지 않을 것으로 판단하였다.
야생형 균주와 비교하여, 돌연변이 균주에서 아세트산 생성의 증가가 관찰되었다. 아세트산의 과생성은 pH를 감소시키고 발효동안 pH를 유지하기 위한 많은 양의 염을 요구한다. ALD6 유전자는 주요 세포질 알데하이드 디히드로제나아제를 코딩하고 아세트알데히드의 아세테이트로의 전환에 관여한다. Eglinton et al.은 글리세롤 과생산 균주에서 ALD6 알데히드 디히드로제나아제 유전자의 결실로 아세트산 생성을 감소시킬수 있음을 보여주었다.11 따라서, 2,3-부탄다이올 생산용 알코올 디히드로제나아제 돌연변이 균주에서 ADL6 결실의 영향을 조사하였다. 발명자들은 아세트산 생성을 감소시키면 피루브산 디카르복실라아제 반응을 통해 축적된 아세트알데히드의 더 많은 유동이 2,3-부탄다이올로 전환될 것이라고 추정하였다. 도 3에서와 같이, ALD3의 결실은 모든 균주에서 아세트산의 생성을 평균 400 ㎎·l-1에서 약 3 ㎎·l-1 ~ 34 ㎎·l- 1 로 감소시켰다. 그러나, 돌연변이 균주에서 ALD6의 결실은 2,3-부탄다이올의 생성에 영향을 주지 않았다. B2C-a1a6는 B2C-a1과 비교하여 2,3-부탄다이올 생성이 0.041 g·g-1에서 0.046 g·g- 1으로 약한 증가를 나타내었다. B2C-a1a6에 ADH3 결실한 균주의 2,3-부탄다이올 수율은 B2C-a1a3 균주의 30% 정도 나타내었으며, B2C-a1a6a5는 B2C-a1a5보다 38% 적은 수율로 2,3-부탄다이올을 생성하였다(도 3).
△ adh1 돌연변이에서 GPD2 유전자 결실에 의한 에탄올 발효의 회복
△ adh1 돌연변이 균주에서, 초과한 글리세롤-3-포스페이트는 글리세롤 디히드로제나아제에 의해 DHAP로부터 생성된다. 글리세롤은 글리세롤-3-포스페이트의 디포스포릴레이션 반응에 의해 형성된다. B2C-a1a6 균주의 주발효산물인 글리세롤이 본 발명의 균주에서 클리세롤 디히드로제나아제 반응을 저해할 것이라 생각하였다. 글리세롤 디히드로제나아제는 GPD1 및 GPD2 동위효소에 의해 코딩되어 있다. 두 유전자의 결실은 글리세롤 생산을 증가시키는 결과를 보여준다.12 그럼에도 불구하고, △ adh1 △ ald6에서 두 유전자 저해는 세포의 NADH를 재산화시키고 ATP를 생산하는 능력을 손실하여 치명적이다. △ adh1 △ ald6에서 삼투조절된 GPD1의 단일 결실은 글리세롤 생성을 약간 감소시키는 영향을 나타내었다. GPD2의 활성은 산화환원 조절에 영향 받으므로 산화환원 상태가 불균형인 △ adh1 △ adh6 균주에서는 GPD2 의 고발현이 유도되어 글리세롤이 과다 생성된다. △adh1△ ald6 균주에서 GPD2의 추가적인 결실은 효과적으로 글리세롤 생성을 감소시켰다. 그러나, 이는 주발효산물은 에탄올로 전환되었다. 유사하게, B2C-a1a3a5 균주에서 GPD2의 결실은 발효의 대사 프로필을 상당히 변화시켰다(도 4). GPD2의 추가결실은 2,3-부탄다이올 생성을 감소시켰다.
산화환원 균형을 유지하기 위해, 효모 S. cerevisiae는 에탄올 발효에 의존적이다. 글리세롤 생성을 통해 세포의 NADH 산화능을 감소시킴으로써, 결실되지 않은 알코올 디히드로제나아제의 발현을 유도하였다. 따라서, △ adh1 및 △ adh1 △adh3△ adh5 균주에서 GPD2를 결실하였을 때, 주발효산물이 에탄올로 전환됨이 관찰되었다. 이는 NADH가 과도한 조건에서 결실되지 않은 알코올 디히드로제나아제가 고활성을 가질 수 있는 것을 나타낸다.
혐기성 비연속 발효
고도의 발효 조건에서 2,3-부탄다이올 생산이 향상되는지 조사하기 위해, B2C-a1a5, B2C-a1a6 및 B2C-a1a3a5을 혐기성 비연속 배양하였다. 산소가 없는 조건에서, S. cerevisiae 세포는 상당한 양의 에탄올 및 글리세롤을 생산하였다. 이는 세포에서 산화환원 균형이 유지되는 것을 의미한다. 혐기성 상태에서 야생형 균주 및 돌연변이 균주의 바이오매스 효율은 저산소 조건과 비교하여 크게 감소하였다. 모든 균주에서, 혐기적 조건으로 인해 글리세롤의 형성이 증가하였다. 동시에, 야생형 균주 및 돌연변이 균주에서 비교적 산화 상태가 높은 아세테이트의 생산이 감소하는 것을 관찰하였다.
알코올 디히드로제나아제 유전자가 결실된 상태에서, B2C-a1a5, B2C-a1a6 및 B2C-a1a3a5 균주는 주발효산물로 글리세롤을 생산하였다. 저산소 조건 하에, 두 번째 부산물은 에탄올이고 다음은 2,3-부탄다이올이였다. 흥미롭게도, B2C-a1a5 및 B2C-a1a3a5의 혐기성 조건에서의 생장은 2,3-부탄다이올의 농도가 에탄올보다 높은 정반대 경우를 나타내었다(도 5). 3중 결실 균주의 발효 배지에서 최대 2.5 g·l-1의 2,3-부탄다이올이 검출되었다. 그러나, 에탄올 생산은 B2C-a1a5 및 B2C-a1a3a5보다 각각 43% 및 24% 감소하였다. 2,3-부탄다이올은 혐기성 조건의 야생형 균주 배양 배지에서는 검출되지 않았다.
2,3-부탄다이올 및 에탄올의 생산 농도에 있어 산소량의 관계는 다른 결과에서도 추론할 수 있다. 2,3-부탄다이올 효율은 산소량과 반비례 관계이다. 2,3-부탄다이올 및 에탄올은 동일한 전구물질을 공유하므로, 2,3-부탄다이올 및 에탄올의 농도는 반비례 관계이다.
향상된 2,3- 부탄다이올 효율
야생형, B2C-a1a5 및 B2C-a1a6 균주의 3 종의 숙주에서 2,3-부탄다이올 합성 경로에 BDH1 고발현을 도입하여 비교하였다. 2 다중복제 플라스미드를 이용하여 B. subtilis 아세토락테이트 합성효소 유전자 alsS, E. aerogenes의 budA 및 budC 유전자를 공동발현하였다(표 3). 다중복제 플라스미드의 GPD1 프로모터 하에 Klebsiella oxytoca budC, E. aerogenes budC 또는 S. cerevisiae BDH1의 부탄다이올 디히드로제나아제의 과발현은 2,3-부탄다이올로 유동을 이끄는데 어느 유전자가 우세한지 알 수 없었다. 야생형 균주에서 박테리아 경로 유전자의 과발현은 12.8배 증가시켰지만, 2,3-부탄다이올의 생산은 저조하였다. B2C-a1a6 균주에 아세토락테이트 디카르복실라아제 경로를 도입하여 2,3-부탄다이올 생산을 2배 증가시켰다. B2C-a1a5 균주에서, 2,3-부탄다이올 생산은 내재적 부탄다이올 디히드로제나아제 유전자의 과발현에 의해 영향받지 않았다. 그러나, 이종(heterologous) 경로는 진탕배양 시 2,3-부탄다이올의 수율을 15% 증가시켰다. B2C-a1a5-ABC 균주는 저산소 조건에서 진탕배양시 0.096 g·g-1에 해당하는 최대 1.665 g·l- 1농도의 2,3-부탄다이올을 생산하였다.
결론
2,3-부탄다이올 생성 돌연변이로써, 미토콘드리아 및 세포질 알코올 디히드로제나아제 경로를 결실한 S. cerevisiae 균주를 인 실리코 분석하였다. ADH1, ADH3 및 ADH5 유전자를 결실하여 낮은 알코올 디히드로제나아제 활성을 갖는 돌연변이 균주를 제조하였다. 주요한 세포질 알코올 디히드로제나아제 유전자인 ADH1의 단일 결실은 약 30 배정도 생산 농도를 증가시켰다. 돌연변이 균주에서 증가한 아세트알데이드로 인한 세포의 해독 기작 및 알코올 디히드로제나아제를 통해 효율적으로 초과한 NADH를 재생산하지 못하는 것이 2,3-부탄다이올 생산을 자극하였다. ADH3 또는 ADH5 또는 두 유전자의 추가적인 결실에 의한 알코올 디히드로제나아제 활성의 추가적인 감소는 단일 결실 돌연변이와 비교하여 2,3-부탄다이올의 생산을 2배 증가시켰다. 높은 생산은 감소된 알코올 디히드로제나아제 효율로 인해 아세트알데히드를 아세토인으로, 이어 2,3-부탄다이올로 전환된 결과이다. 또한, 대체경로를 통한 돌연변이 균주에서 2,3-부탄아이올의 생산이 증가됨을 보여주었다.
결론적으로, S. cerevisiae의 발효산물의 생산을 위한 인 실리코 대사 제어 접근법을 통해 2,3-부탄다이올을 고생산하는 S. cerevisiae를 제조하였다.
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이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (9)

  1. (a) 알코올 디히드로제나아제(alcohol dehydrogenase) 1; 및 (b) 알코올디히드로제나아제 3, 알코올 디히드로제나아제 5 또는 이의 조합으로 구성되는 알코올 디히드로제나아제를 불활성화시키는 단계를 포함하는 2,3-부탄다이올(butanediol) 제조용 효모의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 알코올 디히드로제나아제(alcohol dehydrogenase) 1, 알코올디히드로제나아제 3 및 알코올 디히드로제나아제 5로 구성된 군으로부터 선택되는 하나이상의 알코올 디히드로제나아제를 불활성화시키는 단계는 알코올 디히드로제나아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통하여 돌연변이시켜 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 알코올 디히드로제나아제(alcohol dehydrogenase) 1, 알코올디히드로제나아제 3 및 알코올 디히드로제나아제 5를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나이상의 알코올 디히드로제나아제를 불활성화시키는 단계는 알코올 디히드로제나아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 결실시켜 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 효모는 2,3-부탄다이올의 생성 효율이 야생형 효모와 비교하여 50 내지 100배 증가한 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스 ( Saccharomyces ), 사이조사카로마이세스( Schizosaccharomyces ), 스포로보로마이세스 ( Sporobolomyces ), 토루로프시스 ( Torulopsis ), 트리코스포론( Trichosporon ), 윅커하미아 ( Wickerhamia ), 아쉬바이 아( Ashbya ), 블라스토마이세스 ( Blastomyces ), 캔디다( Candida ), 사이테로마이세스( Citeromyces ), 크레브로테슘 ( Crebrothecium ), 크립토코커스 ( Cryptococcus ), 드바리오마이세스( Debaryomyces ), 에노마이코프시스 ( Endomycopsis ), 지오트리컴 ( Geotrichum ), 한세눌라 ( Hansenula ), 클로엑케라 ( Kloeckera ), 리포마이세스( Lipomyces ), 피키아 ( Pichia ), 로도스포리듐 ( Rhodosporidium ) 또는 로도토룰라( Rhodotorula )인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 상기 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 효모.
  8. 삭제
  9. 알코올 디히드로제나아제(alcohol dehydrogenase) 1, 알코올디히드로제나아제 3 및 알코올 디히드로제나아제 5를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나이상의 알코올 디히드로제나아제를 불활성화시키는 단계를 포함하는 2,3-부탄다이올(butanediol) 제조용 효모 변이체의 제조방법.
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