BR112019012306A2

BR112019012306A2 - polipeptídeos de fusão de fosfocetolase-fosfotransacetilase bifuncionais

Info

Publication number: BR112019012306A2
Application number: BR112019012306-7A
Authority: BR
Inventors: Urszula Kozak Barbara; Hollands Kerry; Johanna Maria Teunissen Paula; Qun Zhu Quinn
Original assignee: Danisco Us Inc
Priority date: 2016-12-16
Filing date: 2017-12-12
Publication date: 2019-11-12
Also published as: HUE054304T2; EP3555295B1; CN110366594A; WO2018111792A1; CA3047268A1; CN110366594B; EP3555295A1

Abstract

a presente invenção refere-se a composições e métodos que se referem a polipeptídeos de fusão de fosfocetolase-fosfotransacetilase bifuncionais e ao uso dos mesmos em processos de hidrólise de amido para a produção de álcool.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para POLIPEPTÍDEOS DE FÜSÃO DE FOSFOCETOLASE»

FOSFOTRANSACETILASE BIFUNCIONAIS.

prioridade [001] O presente pedido reivindicado o benefício dos pedidos provisórios U.S. n² 62/435.212, depositado em 16 de dezembro de 2016; n² 62/520.604, depositado em 16 de junho de 2017; e n²62/556.788, depositado em 11 de setembro de 2017, cada um dos quais incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

CAMPO DA TÉCNICA [002] As presentes composições e métodos referem-se a polipeptídeos de fusão de fosfocetolase-fosfotransacetílase bifuncionais e ao uso dos mesmos em processos de hidrólise de amido para a produção de álcool.

ANTECEDENTES [003] A produção de etanol à base de levedura se baseia na conversão de açúcares em etanol. A atual produção anual de etanol combustível por meio desse método é de cerca de 90 bilhões de litros em todo o mundo. Estima-se que cerca de 70% dos custos da produção de etanol seja a matéria-prima. Visto que o volume da produção de etanol é tão grande, até mesmo pequenas melhorias de rendimento têm massivo impacto econômico para a indústria. A conversão de um mol de glicose em dois mol de etanol e dois mol de dióxido de carbono é redox neutra, sendo que o rendimento teórico máximo é de cerca de 51%. O atual rendimento industrial é de cerca de 45%; portanto, há possibilidades para aumentar a produção de etanol.

[004] Dióxido de carbono, glicerol e biomassa de levedura são os principais subprodutos da fermentação de etanol. Durante o crescimento e a fermentação da levedura, um excedente de NADH é

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 4/71

2/44 gerado, o qual é usado para produzir glicerol com o propósito de equilíbrio redox e proteção osmótica. O glicerol é considerado um produto de baixo valor, e diversas abordagens foram adotadas para reduzir a produção de glicerol. Entretanto, a redução da síntese de glicerol pode resultar no aumento de outros subprodutos metabólicos, tais como acetato. O acetato não é um subproduto desejado, visto que afeta adversamente a taxa de produção de álcool, a titulação e o rendimento da fermentação de levedura.

[005] Existe a necessidade de modificar as vias metabólicas de levedura para maximizar a produção de etanol, enquanto não aumenta a produção de subprodutos de via indesejável, tais como acetato.

SUMÁRIO [006] As presentes composições e métodos referem-se a polipeptídeos de fusão de fosfocetolase-fosfotransacetilase bifuncionais e ao uso dos mesmos em processos de hidrólise de amido para a produção de etanol. Aspectos e modalidades das composições e métodos são descritos nos parágrafos independentemente numerados a seguir.

1. Em um aspecto, é fornecido um polipeptídeo de fusão recombinante que compreende uma primeira sequência de aminoácidos que tem atividade de fosfocetalase fundida a uma segunda sequência de aminoácidos que tem atividade de fosfotransacetilase, em que o polipeptídeo de fusão, quando expresso em uma célula, tem capacidade para converter frutose~6~P (F-6-P) e/ou xilulose-5-P (X-5-P) em acetilCoA.

2. Em algumas modalidades do polipeptídeo de fusão, de acordo com o parágrafo 1, a primeira sequência de aminoácidos e a segunda sequência de aminoácidos são fundidas por meio de um peptídeo ligante.

3. Em algumas modalidades do polipeptídeo de fusão, de

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 5/71

3/44 acordo com o parágrafo 1 ou 2, a primeira sequência de aminoácidos está presente no N-terminal do polipeptídeo de fusão e a segunda sequência de aminoácidos está presente no N-terminal do polipeptídeo de fusão.

4. Em algumas modalidades do polipeptídeo de fusão, de acordo com o parágrafo 1 ou 2, a segunda sequência de aminoácidos está presente no N-terminal do polipeptídeo de fusão e a primeira sequência de aminoácidos está presente no N-terminal do polipeptídeo de fusão.

5. Em algumas modalidades do polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores, a primeira sequência de aminoácidos é a fosfocetolase de Gardnerella vaginalis.

6. Em algumas modalidades do polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores, a segunda sequência de aminoácidos é a fosfotransacetilase de Lactobacillus plantarum.

7. Em um outro aspecto, é fornecido um plasmídeo que compreende uma sequência de DNA que codifica o polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores.

8. Em um outro aspecto, são fornecidas células de levedura que compreendem uma sequência de DNA que codifica o polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 7.

9. Em um outro aspecto, são fornecidas células de levedura que expressam o polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 7.

10. Em algumas modalidades das células de levedura, de acordo com o parágrafo 9, as células de levedura não expressam adicionalmente polipeptídeos separados que têm atividade de fosfocetolase e/ou fosfotransacetilase.

11. Em um outro aspecto, é fornecido um método para

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 6/71

4/44 aumentar a produção de álcool durante a fermentação que compreende colocar um substrato de carboidrato em contato com as células de levedura modificadas que expressam um polipeptídeo de fusão recombinante que compreende uma primeira sequência de aminoácidos que tem atividade de fosfocetalase fundida a uma segunda sequência de aminoácidos que tem atividade de fosfotransacetilase; e permitir que a levedura produza mais álcool a partir do substrato de carboidrato; em que a levedura produziu menos acetato que as células de levedura comparáveis que expressam os mesmos primeiros polipeptídeos e os mesmos segundos polipeptídeos que as moléculas separadas.

12. Em um outro aspecto, é fornecido um método para reduzir a produção de acetato durante a fermentação de álcool que compreende colocar um substrato de carboidrato em contato com as células de levedura modificadas que expressam um polipeptídeo de fusão recombinante que compreende uma primeira sequência de aminoácidos que tem atividade de fosfocetalase fundida a uma segunda sequência de aminoácidos que tem atividade de fosfotransacetilase; e permitir que a levedura produza álcool a partir do substrato de carboidrato; em que a levedura produziu menos acetato que as células de levedura comparáveis que expressam os mesmos primeiros polipeptídeos e os mesmos segundos polipeptídeos que as moléculas separadas.

13. Em um outro aspecto, é fornecido um método para reduzir a produção de acetato por meio de células de levedura que têm uma via de fosfocetolase exógena que compreende produzir, em células de levedura modificadas, um polipeptídeo de fusão recombinante que compreende uma primeira sequência de aminoácidos que tem atividade de fosfocetalase fundida a uma segunda sequência de aminoácidos que tem atividade de fosfotransacetilase.

14. Em algumas modalidades do método, de acordo com o

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 7/71

5/44 parágrafo 13, as células de levedura modificadas produziram menos acetato que a levedura comparável que expressa os mesmos primeiros polipeptídeos e os mesmos segundos polipeptídeos que as moléculas separadas.

15. Em algumas modalidades do método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 11 a 14, as células de levedura modificadas produziram pelo menos 10% menos acetato que a levedura comparável que expressa os mesmos primeiros polipeptídeos e os mesmos segundos polipeptídeos que as moléculas separadas.

16. Em um outro aspecto, é fornecido um método para aumentar a expressão de glicoamilase em levedura que compreende um gene heterólogo que codifica uma glicoamilase que compreende expressar adicionalmente na levedura um polipeptídeo de fusão recombinante que compreende uma primeira sequência de aminoácidos que tem atividade de fosfocetolase fundida a uma segunda sequência de aminoácidos que tem atividade de fosfotransacetilase; em que a levedura produz, durante a fermentação, uma quantidade aumentada de glicoamilase em comparação com a levedura de outro modo idêntica que produz moléculas separadas que têm atividade de fosfocetolase e/ou fosfotransacetilase.

17. Em algumas modalidades do método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 11 a 16, as células de levedura modificadas não produzem moléculas separadas que têm atividade de fosfocetolase e/ou fosfotransacetilase.

18. Em algumas modalidades do método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 11 a 17, a levedura modificada é a levedura, de acordo com qualquer um dos parágrafos 8 a 10.

[007] Esses e outros aspectos e modalidades das presentes células modificadas e métodos serão evidentes a partir da descrição, incluindo as Figuras anexas.

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 8/71

6/44

BREVE DESCRiÇÃO DOS DESENHOS [008] A Figura 1 é um diagrama da via de fosfocetolase geneticamente modificada para produzir etanol e acetato a partir de açúcares.

[009] A Figura 2 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão de fosfocetolase e fosfotransacetilase 1 (GvPKL~L1-LpPTA; SEQ ID NO: 5). Na proteína de fusão, GvPKL está no N-terminal, LpPTA está no C-terminal e o ligante 1 (L1) está localizado entre os mesmos, indicado em itálico e negrito.

[0010] A Figura 3 é um mapa do plasmídeo pZK41W-GLAF12, O pZK41W-GLAF22 é similar, mas tem um ligante diferente.

[0011] A Figura 4 é a sequência de aminoácidos da proteína de fusão de fosfocetolase e fosfotransacetilase 2 (GvPKL-L2-LpPTA; SEQ ID NO: 6). Na proteína de fusão, GvPKL está no N-terminal, LpPTA está no C-terminal e o ligante 2 (L2) está localizado entre os mesmos, indicado em itálico e negrito.

[0012] A Figura 5 é um mapa do plasmídeo pZK41W-(H3C19).

[0013] A Figura 6 é um mapa do plasmídeo pTOPO ll-Blunt ura3loxP-KanMX-loxP-ura3.

[0014] A Figura 7 é um mapa do fragmento EcoRI de 2.018 bp do plasmídeo pTOPO ll-Blunt ura3-toxP~KanMX-loxP-ura3.

[0015] A Figura 8 é um mapa do plasmídeo pGAL-Cre-316.

[0016] A Figura 9 é um mapa do fragmento Swal do plasmídeo pZK41W-GLAF12 [0017] A Figura 10 é um mapa do fragmento Swal do plasmídeo pZK41W-GLAF22 [0018] A Figura 11 é um mapa do fragmento Swal do plasmídeo pZK41W-(H3C19) [0019] As Figuras 12A e 12B são gráficos que mostram comparações do desempenho das cepas POL-SC-00675 (·), POL-SC

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 9/71

7/44

0692 (o), POL-SC-0696 (Δ) e POL-SC-00699 (A) em ensaios em frascos de agitação com o uso do liquefeito como um substrato a 32 Ό e 36 Ό. As cepas que expressam o polipeptídeo fund ido PKL-PTA são representadas por símbolos sólidos e as cepas que expressam dois polipeptídeos separados de PKA e PTA são representadas por símbolos vazados.

[0020] A Figura 13 é um gráfico que mostra uma comparação do desempenho de cepas POL-SC-0696 (Δ) e P0L--SO00699 (A) em ensaios em frascos de agitação com o uso de farinha de milho não liquefeita como um substrato a 32 Ό e 36 Ό. As ce pas que expressam o polipeptídeo fundido PKL-PTA são representadas por símbolos sólidos e as cepas que expressam dois polipeptídeos separados de PKA e PTA são representadas por símbolos vazados.

DESCRIÇÃO DETALHADA

I. Definições [0021] Antes de descrever as presentes cepas de levedura e os métodos em detalhes, os termos a seguir são definidos para maior clareza. Os termos não definidos devem ser reconhecidos por seus significados ordinários, conforme usado na técnica relevante.

[0022] Conforme usado no presente documento, álcool refere-se a um composto orgânico no qual um grupo funcional hidroxila (-OH) é ligado a um átomo de carbono saturado.

[0023] Conforme usado no presente documento, células de levedura, cepas de levedura ou simplesmente levedura referem-se a organismos dos filos Ascomycota e Basidiomycota. Uma levedura exemplificativa é uma levedura de germinação da ordem Saccharomycetales. Um exemplo específico de levedura é Saccharomyces spp., incluindo, porém sem limitação, S. cerevisiae. A levedura inclui organismos usados para a produção de álcool combustível, bem como organismos usados para a produção de álcool

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 10/71

8/44 potável, incluindo cepas de levedura especializadas e patenteadas usadas para produzir cervejas de sabores distintos, vinhos e outras bebidas fermentadas.

[0024] Conforme usado no presente documento, a frase células de levedura geneticamente modificadas, células de levedura variantes, células de levedura modificadas ou frases similares referem-se à levedura que inclui as modificações e características genéticas descritas no presente documento. A levedura variante/modificada não inclui levedura de ocorrência natural.

[0025] Conforme usado no presente documento, os termos polipeptídeo e proteína (e suas respectivas formas plurais) são usados intercambiavelmente para se referir a polímeros de qualquer comprimento que compreendem resíduos de aminoácidos ligados por ligações peptídicas. Os códigos convencionais de uma letra ou de três letras para resíduos de aminoácidos são usados no presente documento, e todas as sequências são apresentadas de uma direção N-terminal para C-terminal. O polímero pode compreender aminoácidos modificados e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente de identificação. Também estão incluídos na definição, por exemplo, polipeptídeos que contêm um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica.

[0026] Conforme usado no presente documento, proteínas funcional e/ou estruturalmente similares são consideradas proteínas relacionadas. Tais proteínas podem ser derivadas de organismos de gêneros e/ou espécies diferentes, ou classes diferentes de organismos

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 11/71

9/44 (por exemplo, bactérias e fungos), ou artificial mente projetadas. As proteínas relacionadas também abrangem homólogos determinados por análise de sequência primária, determinados por análise de estrutura secundária ou terciária ou determinados por reatividade cruzada imunológica.

[0027] Conforme usado no presente documento, o termo proteína homóloga se refere a uma proteína que tem atividade e/ou estrutura similar a uma proteína de referência. Não se pretende que os homólogos necessariamente sejam relacionados evolutivamente. Assim, pretende-se que o termo abranja enzimas iguais, similares ou correspondentes (isto é, em termos de estrutura e função) obtidas de diferentes organismos. Em algumas modalidades, é desejável identificar um homólogo que tenha uma estrutura quaternária, terciária e/ou primária similar à proteína de referência. Em algumas modalidades, as proteínas homólogas induzem resposta imunológica similar (ou respostas imunológicas similares) à de uma proteína de referência. Em algumas modalidades, as proteínas homólogas são geneticamente modificadas para produzir enzimas com a atividade desejada (ou atividades desejadas).

[0028] O grau de homologia entre sequências pode ser determinado com o uso de qualquer método adequado conhecido na técnica (consultar, por exemplo, Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol., 48:443; Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:2.444; programas, tais como GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Pacote de Software de Genética de Wisconsin (Genetics Computer Group, Madison, Wl); e Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:387 a 395).

[0029] Por exemplo, PILEUP é um programa útil para determinar níveis de homologia de sequência. PILEUP cria um alinhamento de múltiplas sequências a partir de um grupo de sequências relacionadas

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 12/71

10/44 com o uso de alinhamentos progressivos em pares. O mesmo também pode plotar uma árvore que mostra as relações de agrupamento usadas para criar o alinhamento. PILEUP usa uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng e Doolittle, (Feng e Doolittle (1987) J. Moi. Evol. 35:351 a 360). O método é similar àquele descrito por Higgins e Sharp ((1989) CABIOS 5:151 a 153). Parâmetros úteis de PILEUP incluindo um peso de lacuna padrão de 3,00, um peso de comprimento de lacuna padrão de 0,10 e lacunas finais ponderadas. Um outro exemplo de um algoritmo útil é o algoritmo BLAST, descrito por Altschul et al. ((1990) J. Mol. Biol. 215:403 a 410) e Karlin et al. ((1993) Prec. Natl. Acad. Sei. EUA 90:5.873 a 5.887). Um programa BLAST particularmente útil é o programa WU-BLAST-2 (consultar, por exemplo, Altschul et al. (1996) Meth. Enzymol. 266:460 a 480). Parâmetros W, T e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLAST usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, a matriz de pontuação BLOSUM62 (consultar, por exemple, Henikoff e Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 89:10.915), alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M'5, N’~4 e uma comparação entre ambos os filamentos.

[0030] Conforme usado no presente documento, as frases substancialmente similar e substancialmente idêntico no contexto de pelo menos dois ácidos nucleicos ou polipeptídeos significam tipicamente que um polinucleotídeo ou polipeptídeo compreende uma sequência que tem pelo menos cerca de 70% de identidade, peto menos cerca de 75% de identidade, pelo menos cerca de 80% de identidade, pelo menos cerca de 85% de identidade, pelo menos cerca de 90% de identidade, pelo menos cerca de 91% de identidade, pelo menos cerca de 92% de identidade, pelo menos cerca de 93% de identidade, pelo menos cerca de 94% de identidade, pelo menos cerca de 95% de identidade, pelo menos cerca de 96% de identidade, pelo menos cerca

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 13/71

11/44 de 97% de identidade, pelo menos cerca de 98% de identidade ou até mesmo pelo menos cerca de 99% de identidade ou mais em comparação com a sequência de referência (isto é, de tipo selvagem). O percentual de identidade de sequência é calculado com o uso do algoritmo CLUSTAL W com parâmetros padrão. Consultar Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4.673 a 4.680. Parâmetros predefinidos para o algoritmo CLUSTAL W são: Penalidade por abertura de lacuna: 10,0 Penalidade por extensão de lacuna: 0,05 Matriz de peso de proteína: série BLOSUM Matriz de peso de DNA: IUB % de sequência divergente de atraso40 Distância de separação de lacuna: 8 Peso de transições de DNA: 0,50 Lista de resíduos hidrofílicos: GPSNDQEKR Uso de matriz negativa: DESLIGADO Alternar penalidades específicas de resíduo: LIGADO

Alternar penalidades hidrofílicas: LIGADO

Alternar penalidade por separação de lacuna final DESLIGADO [0031] Uma outra indicação de que dois polipeptídeos são substancialmente idênticos é que o primeiro polipeptídeo é imunologicamente reativo de forma cruzada com o segundo polipeptídeo. Tipicamente, os polipeptídeos que diferem por substituições conservadoras de aminoácido são imunologicamente reativos de forma cruzada. Assim, um polipeptídeo é substancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, quando os dois peptídeos diferem apenas por uma substituição conservadora. Uma outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas é que as duas moléculas se hibridizam sob condições estringentes (por exemplo, dentro de uma faixa de

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 14/71

12/44 estringência média a alta).

[0032] Conforme usado no presente documento, o termo gene é sinônimo do termo alelo em referência a um ácido nucleico que codifica e direciona a expressão de uma proteína ou RNA. Formas vegetativas de fungos filamentosos são geralmente haploides, portanto, uma única cópia de um gene especificado (isto é, um único alelo) é suficiente para conferir um fenótipo especificado.

[0033] Conforme usado no presente documento, o termo expressar um polipeptídeo e termos similares referem-se ao processo celular de produzir um polipeptídeo com o uso do maquinário de tradução (por exemplo, ribossomas) da célula.

[0034] Conforme usado no presente documento, os termos fundido e fusão em relação aos dois polipeptídeos se referem a uma ligação física que faz com que o polipeptídeo se torne uma única molécula.

[0035] Conforme usado no presente documento, os termos tipo selvagem e nativo são usados de forma intercambiável e referem-se a genes, proteínas ou cepas encontradas na natureza.

[0036] Conforme usado no presente documento, o termo proteína de interesse se refere a um polipeptídeo que se deseja que seja expresso na levedura modificada. Tal proteína pode ser uma enzima, uma proteína de ligação ao substrato, uma proteína tensoativa, uma proteína estrutural, um marcador selecionável ou semelhantes e pode ser expressa em altos níveis. A proteína de interesse é codificada por um gene endógeno modificado ou um gene heterólogo (isto é, gene de interesse) em relação à cepa parental. A proteína de interesse pode ser expressa intracelularmente ou como uma proteína secretada.

[0037] Conforme usado no presente documento, deleção de um gene refere-se a sia remoção do genoma de uma célula hospedeira. Quando um gene inclui elementos de controle (por exemplo, elementos

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 15/71

13/44 intensificadores) que não estão localizados imediatamente adjacentes à sequência de codificação de um gene, a deleção de um gene se refere à deleção da sequência de codificação e, opcionalmente, elementos intensificadores adjacentes, incluindo, porém sem limitação, por exemplo, sequências promotoras e/ou terminadoras, mas não requer a deleção de elementos de controle não adjacentes.

[0038] Conforme usado no presente documento, ruptura de um gene se refere amplamente a qualquer manipulação genética ou química, isto é, mutação, que impeça substancialmente que uma célula produza um produto gênico funcional, por exemplo, uma proteína, em uma célula hospedeira. Métodos exemplificativos de ruptura incluem deleção completa ou parcial de qualquer porção de um gene, incluindo uma sequência de codificação de polipeptídeos, um promotor, um intensificador ou um outro elemento regulador, ou mutagênese do mesmo, em que a mutagênese abrange substituições, inserções, deleções, inversões e combinações e variações das mesmas, sendo que qualquer uma das mutações impede substancialmente a produção de um produto gênico funcional. Um gene também pode ser rompido com o uso de RNAi, antissenso ou qualquer outro método que anule a expressão de genes. Um gene pode ser rompido por deleção ou manipulação genética de elementos de controle não adjacentes.

[0039] Conforme usado no presente documento, os termos manipulação genética e alteração genética são usados intercambiavelmente e referem-se à alteração/mudança de uma sequência de ácidos nucleicos. A alteração pode incluir, porém sem limitação, uma substituição, uma deleção, uma inserção ou uma modificação química de pelo menos um ácido nucleico na sequência de ácidos nucleicos.

[0040] Conforme usado no presente documento, um polipeptídeo/proteína funcional é uma proteína que possui uma

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 16/71

14/44 atividade, tai como uma atividade enzimática, uma atividade de ligação, uma propriedade tensoativa ou semelhantes, e que não foi mutagenizada, truncada ou, de outra forma, modificada para anular ou reduzir essa atividade. Polipeptídeos funcionais podem ser termoestáveis ou termoinstáveis, conforme especificado.

[0041] Conforme usado no presente documento, um gene funcional é um gene com capacidade para ser usado por componentes celulares para produzir um produto gênico ativo, tipicamente uma proteína. Genes funcionais são a antítese de genes rompidos, que são modificados de modo que não possam ser usados por componentes celulares para produzir um produto gênico ativo ou tenham uma capacidade reduzida para serem usados por componentes celulares para produzir um produto gênico ativo.

[0042] Conforme usado no presente documento, células de levedura foram modificadas para impedir a produção de uma proteína especificada se tiverem sido alteradas genética ou quimicamente para impedir a produção de uma proteína/polipeptídeo funcional que exibe uma atividade característica da proteína do tipo selvagem. Tais modificações incluem, porém sem limitação, deleção ou ruptura do gene que codifica a proteína (conforme descrito no presente documento), modificação do gene de modo que o polipeptídeo codificado careça da atividade supracitada, modificação do gene de modo a afetar a estabilidade ou o processamento prós-translacional e combinações das mesmas.

[0043] Conforme usado no presente documento, atenuação de uma via ou atenuação do fluxo através de uma via, isto é, uma via bioquímica, refere-se amplamente a qualquer manipulação genética ou química que reduza ou interrompa completamente o fluxo de substratos bioquímicos ou intermediários através de uma via metabólica. A atenuação de uma via pode ser alcançada por meio de uma variedade

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 17/71

15/44 de métodos bem conhecidos. Tais métodos incluem, porém sem limitação: deleção completa ou parcial de um ou mais genes, substituição de alelos do tipo selvagem desses genes por formas mutantes que codificam enzimas com atividade catalítica reduzida ou maiores valores Km, modificação dos promotores ou outros elementos reguladores que controlam a expressão de um ou mais genes, modificação genética das enzimas ou do mRNA que codifica essas enzimas para uma diminuição de estabilidade, mau direcionamento de enzimas para compartimentos celulares onde têm menor probabilidade de interagirem com o substrato e intermediários, o uso de RNA de interferência e semelhantes.

[0044] Conforme usado no presente documento, fermentação aeróbia refere-se ao crescimento na presença de oxigênio.

[0045] Conforme usado no presente documento, fermentação anaeróbica refere-se ao crescimento na ausência de oxigênio.

[0046] Conforme usado no presente documento, os artigos singulares um, uma, o e a abrangem os referentes plurais, a menos que o contexto claramente indique de outra forma. Todas as referências citadas no presente documento estão aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade. As seguintes abreviações/acrônimos têm os seguintes significados, a menos que

especificado de outra forma:
EC	comissão de enzima
PKL	fosfocetolase
PTA	fosfotransacetilase
XFP	5-fosfato de xilulose/6-fosfato de frutose
	fosfocetolase
AADH	acetaldeído desidrogenases
ADH	álcool desidrogenase
EtOH	etanol

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 18/71

16/44

AA	a-amilase
GA	glicoamilase
Ό	graus centígrados
bp DNA	pares de bases ácido desoxirribonucleico
DP	grau de polimerização
ds ou DS	sólidos secos
9 ou gm g/l GAU/g ds sólidos secos	grama gramas por litro unidades de glicoamilase por grama de
H₂O	água
HPLC desempenho hr ou h	cromatografia líquida de alto hora
kg M	quilograma molar
mg mL ou ml	miligrama mililitro
ml/min	mililitros por minuto
mM	milimolar
N	normal
nm	nanometre
OD	densidade óptica
PCR	reação em cadeia de polimerase
ppm SSCU/g ds	partes por milhão unidades de alfa-amilase fúngica por

grama de sólidos secos

Δ	relacionado a uma deleção
pg	micrograma

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 19/71

17/44 pL e μΙ microlitro μΜ micromolar

SSF sacarificação e fermentação simultâneas

MTP placa de microtitulação

II. Células de levedura geneticamente modificadas que produzem um polipeptideo de fusão de PKL-PTÂ bifuncional [0047] As células de levedura geneticamente modificadas que têm uma via de fosfocetolase heteróloga foram anteriormente descritas (por exemplo, documento n² WO2015148272). Essas células expressam fosfocetolase (PKL; EC 4.1.2.9) e fosfotransacetilase (PTA; EC 2.3.1.8) heterólogas, opcionalmente com outras enzimas, para canalizar o fluxo de carbono na direção oposta à via de glicerol e em direção à síntese de acetil-coA, que é, então, convertido em etanol (Figura 1). Essas células têm capacidade para aumentar a produção de etanol em um processo de fermentação em comparação com outras células de levedura progenitoras de outro modo idênticas. Infelizmente, tal modificação também produz aumento de acetato, o que afeta adversamente o crescimento celular e representa um desperdício de carbono.

[0048] Constatou-se agora que o rendimento de etanol pode ser aumentado e a produção de acetato reduzida modificando-se geneticamente células de levedura de modo a produzirem um polipeptideo de fusão de PKL-PTA bifuncional, o qual inclui porções ativas de ambas as enzimas. A superexpressão de tais polipeptídeos de fusão bifuncionais aumenta o rendimento de etanol enquanto reduz a produção de acetato até 37% em comparação com a superexpressão das enzimas separadas.

[0049] Em referência contínua à Figura 1, e sem se ater a uma teoria, acredita-se que a expressão de enzimas de PKL e PTA heterólogas separadas em uma célula de levedura permite a produção

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 20/71

18/44 dos intermediários gliceraldeído-3-fosfato (G-3-P) e aceti I-fosfato (Acetil-P), sendo que o último é convertido em acetato indesejado por meio de uma glicerol-3-fosfatase promíscua endógena com atividade de acetil-fosfatase (GPP1/RHR2). Entretanto, expressando-se um polipeptideo de fusão de PKL-PTA bifuncional, o acetil-fosfato é rapidamente convertido em acetil-CoA, o que reduz o acúmulo de acetilfosfato, reduzindo, assim, a produção de acetato. Consequentemente, a proteína de fusão fornece um mecanismo para a conversão eficaz de frutose-6-P (F-6-P) e/ou xilulose-5-P (X-5-P) em acetil-CoA.

[0050] Conforme evidenciado pelos dados experimentais descritos, no presente documento, polipeptídeos de fusão de PKL-PTA tiveram desempenho de acordo com a hipótese supracitada. Esses polipeptídeos de fusão incluíram diferentes ligantes entre os polipeptídeos de PKL e PTA. É completamente esperado que o uso de diferentes polipeptídeos de PKL e PTA produzirá resultados similares. Também espera-se que a orientação dos polipeptídeos de PKL e PTA dentro do polipeptideo de fusão não seja crítica e que a PKL ou o polipeptideo possa estar no N-terminal ou C-terminal do polipeptideo de fusão. Várias enzimas PKL e PTA foram descritas na técnica e devem ser consideradas alternativas para as enzimas exemplificadas.

[0051] Espera-se, ainda, que o polipeptideo de fusão de PKL-PTA possa incluir funcionalidades adicionais e características estruturais dentro da região do ligante, incluindo, porém sem limitação, proteínas fluorescentes, enzimas adicionais, etiquetas de anticorpo, marcadores de resistência a antibiótico e semelhantes, que podem estar no Nterminal e/ou C-terminal do polipeptideo de fusão de PKL-PTA, podem separar o polipeptideo de fusão de PKL-PTA ou podem estar contidas em uma região do ligante de um polipeptideo de fusão de PKL-PTA.

IIL Polipeptídeos de fusão de PKL e PTA exemplificativos [0052] Em algumas modalidades específicas, o polipeptideo de

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 21/71

19/44 fusão de PKL-PTA é um dos poHpeptídeos de fusão de PKL-PTA bifuncionais exemplificados. Os poHpeptídeos de fusão têm projetos relativamente simples visto que incluem PKL de comprimento completo de Gardnerella vaginalis (isto é, GvPKL) e PTA de comprimento completo de Lactobacillus plantarum (isto é, LpPTA) conectadas por meio de um dentre dois ligantes diferentes (isto é, L1 ou L2).

[0053] A sequência de aminoácidos de G. vaginalis PKL é mostrada abaixo (SEQ ID NO: 1): MTSPVIGTPWKKLNAPVSEAAIEGVDKYWRVANYLSIGQIYLRSNPLM KEPFTREDVKHRLVGHWGTTPGLNFLIGHINRFIAEHQQNTVIIMGPG HGGPAGTAQSYLDGTYTEYYPKITKDEAGLQKFFRQFSYPGGIPSHF APETPGSIHEGGELGYALSHAYGAVMNNPSLFVPAIVGDGEAETGPL ATGWQSNKLVNPRTDGIVLPILHLNGYKIANPTILSRISDEELHEFFHG MGYEPYEFVAGFDDEDHMSIHRRFADMFETIFDEICDIKAEAQTNDVT RPFYPMIIFRTPKGWTCPKFIDGKKTEGSWRAHQVPLASARDTEAHF EVLKNWLKSYKPEELFNEDGSIKEDVLSFMPQGELRIGQNPNANGGR IREDLKLPNLDDYEVKEVKEFGHGWGQLEATRRLGVYTRDVIKNNPD SFRIFGPDETASNRLQAAYEVTNKQWDAGYLSELVDEHMAVTGQVT EQLSEHQMEGFLEAYLLTGRHGIWSSYESFVHVIDSMLNQHAKWLE ATVREIPWRKPISSMNLLVSSHVWRQDHNGFSHQDPGVTSVLLNKTF NNDHVIGIYFPVDSNMLLAVGEKVYKSTNMINAIFAGKQPAATWLTLD EAREELEKGAAEWKWASNAKNNDEVQWLAGIGDVPQQELMAAAD KLNKLGVKFKWNIVDLLKLQSAKENNEALTDEEFTELFTADKPVLLAY HSYAHDVRGLIFDRPNHDNFNVHGYKEQGSTTTPYDMVRVNDMDR YELTAEALRMVDADKYADEIKKLEDFRLEAFQFAVDKGYDHPDYTDW VWPGVKTDKPGAVTATAATAGDNE [0054] A sequência de aminoácidos de L. plantarum PTA é mostrada abaixo (SEQ ID NO: 2): MDLFESLAQKITGKDQTIVFPEGTEPRIVGAAARLAADGLVKPIVLGAT DKVQAVANDLNADLTGVQVLDPATYPAEDKQAMLDALVERRKGKNT

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 22/71

20/44

PEQAAKMLEDENYFGTMLVYMGKADGMVSGAIHPTGDTVRPALQIIK

TKPGSHRISGAFIMQKGEERYVFADCAINIDPDADTLAEIATQSAATAK VFDIDPKVAMLSFSTKGSAKGEMVTKVQEATAKAQAAEPELAIDGEL

QFDAAFVEKVGLQKAPGSKVAGHANVFVFPELQSGNIGYKIAQRFGH FEAVGPVLQGLNKPVSDLSRGCSEEDVYKVAIITAAQGLA [0055] A sequência de aminoácidos do Ligante 1 (L1) é mostrada abaixo (SEQ ID NO: 3):

GAGPARPAGLPPATYYDSLAVTS [0056] A sequência de aminoácidos do Ligante 2 (L2) é mostrada abaixo (SEQ ID NO: 4):

AGGGGTS [0057] A sequência de aminoácidos de GvPKL-L1-LpPTA é mostrada abaixo (SEQ ID NO: 5), com o ligante em negrito e itálico: MTSPVIGTPWKKLNAPVSEAAIEGVDKYWRVANYLSIGQIYLRSNPLM KEPFTREDVKHRLVGHWGTTPGLNFLIGHINRFIAEHQQNTVIIMGPG

HGGPAGTAQSYLDGTYTEYYPKITKDEAGLQKFFRQFSYPGGIPSHF

APETPGSIHEGGELGYALSHAYGAVMNNPSLFVPAIVGDGEAETGPL ATGWQSNKLVNPRTDGIVLPILHLNGYKIANPTILSRISDEELHEFFHG

MGYEPYEFVAGFDDEDHMSIHRRFADMFETIFDEICDIKAEAQTNDVT

RPFYPMIIFRTPKGWTCPKFIDGKKTEGSWRAHQVPLASARDTEAHF EVLKNWLKSYKPEELFNEDGSIKEDVLSFMPQGELRIGQNPNANGGR IREDLKLPNLDDYEVKEVKEFGHGWGQLEATRRLGVYTRDVIKNNPD

SFRIFGPDETASNRLQAAYEVTNKQWDAGYLSELVDEHMAVTGQVT EQLSEHQMEGFLEAYLLTGRHGIWSSYESFVHVIDSMLNQHAKWLE

ATVREIPWRKPISSMNLLVSSHVWRQDHNGFSHQDPGVTSVLLNKTF NNDHVIGIYFPVDSNMLLAVGEKVYKSTNMINAIFAGKQPAATWLTLD

EAREELEKGAAEWKWASNAKNNDEVQWLAGIGDVPQQELMAAAD

KLNKLGVKFKVVNIVDLLKLQSAKENNEALTDEEFTELFTADKPVLLAY

HSYAHDVRGUFDRPNHDNFNVHGYKEQGSTTTPYDMVRVNDMDR YELTAEALRMVDADKYADEIKKLEDFRLEAFQFAVDKGYDHPDYTDW

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 23/71

21/44

VW PGVKTDKPG AVTATAATAG D N E GA GPARPA GLPPÂ TYYDSLA V TSMDLFESLAQKITGKDQTIVFPEGTEPRIVGAAARLAADGLVKPIVLG ATDKVQAVANDLNADLTGVQVLDPATYPAEDKQAMLDALVERRKGK NTPEQAAKMLEDENYFGTMLVYMGKADGMVSGAIHPTGDTVRPALQ IIKTKPGSHRISGAFIMQKGEERYVFADCAINIDPDADTLAEIATQSAAT AKVFDIDPKVAMLSFSTKGSAKGEMVTKVQEATAKAQAAEPELAIDG ELQFDAAFVEKVGLQKAPGSKVAGHANVFVFPELQSGNIGYKIAQRF

GHFEAVGPVLQGLNKPVSDLSRGCSEEDVYKVAIITAAQGLA [0058] A sequência de aminoácidos de GvPKLL2~LpPTA é mostrada abaixo (SEQ ID NO: 6) com o Hgante em negrito e itálico: MTSPVIGTPWKKLNAPVSEAAIEGVDKYWRVANYLSIGQIYLRSNPLM KEPFTREDVKHRLVGHWGTTPGLNFLIGHINRFIAEHQQNTVIIMGPG HGGPAGTAQSYLDGTYTEYYPKITKDEAGLQKFFRQFSYPGGIPSHF APETPGSIHEGGELGYALSHAYGAVMNNPSLFVPAIVGDGEAETGPL ATGWQSNKLVNPRTDGIVLPILHLNGYKIANPTILSRISDEELHEFFHG

MGYEPYEFVAGFDDEDHMSIHRRFADMFETIFDEICDIKAEAQTNDVT RPFYPMIIFRTPKGWTCPKFIDGKKTEGSWRAHQVPLASARDTEAHF EVLKNWLKSYKPEELFNEDGSIKEDVLSFMPQGELRIGQNPNANGGR IREDLKLPNLDDYEVKEVKEFGHGWGQLEATRRLGVYTRDVIKNNPD SFRIFGPDETASNRLQAAYEVTNKQWDAGYLSELVDEHMAVTGQVT EQLSEHQMEGFLEAYLLTGRHGIWSSYESFVHVIDSMLNQHAKWLE ATVREIPWRKPISSMNLLVSSHVWRQDHNGFSHQDPGVTSVLLNKTF NNDHVIGIYFPVDSNMLLAVGEKVYKSTNMINAIFAGKQPAATWLTLD

EAREELEKGAAEWKWASNAKNNDEVQWLAGIGDVPQQELMAAAD KLNKLGVKFKVVNIVDLLKLQSAKENNEALTDEEFTELFTADKPVLLAY HSYAHDVRGUFDRPNHDNFNVHGYKEQGSTTTPYDMVRVNDMDR

YELTAEALRMVDADKYADEIKKLEDFRLEAFQFAVDKGYDHPDYTDW VWPGVKTDKPGAVTATAATAGDNEAGGGGTSMDLFESLAQKITGKD QTIVFPEGTEPRIVGAAARLAADGLVKPIVLGATDKVQAVANDLNADL

TGVQVLDPATYPAEDKQAMLDALVERRKGKNTPEQAAKMLEDENYF

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 24/71

22/44

GTMLVYMGKADGMVSGAIHPTGDTVRPALQIIKTKPGSHRISGAFIMQ KGEERYVFADCAINIDPDADTLAEIATQSAATAKVFDIDPKVAMLSFST KGSAKGEMVTKVQEATAKAQAAEPELAIDGELQFDAAFVEKVGLQKA PGSKVAGHANVFVFPELQSGNIGYKIAQRFGHFEAVGPVLQGLNKPV SDLSRGCSEEDVYKVAIITAAQGLA [0059] Conforme sugerido acima, espera-se que outros polipeptídeos de PKL e PTA funcionem conforme descrito, incluindo aqueles que têm pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos com PKL e PTA, respectivamente, e homólogos estruturais e funcionais. PKL e PTA são enzimas bem conhecidas e um grande número foi clonado e caracterizado. Bancos de dados públicos incluem muitas sequências de PKL e PTA.

[0060] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de PKL e PTA incluem substituições que não afetam substancialmente a estrutura e/ou função do polipeptídeo. Substituições exemplificativas são mutações conservadoras, conforme sumarizado na Tabela 1.

Tabela 1. Substituições de aminoácido exemplificativas

Resíduo de aminoácido original	Código	Substituições Aceitáveis
Alanina	A	D-Ala, Gly, β-Ala, L-Cys, D-Cys
Arginina	R	D-Arg, Lys, D-Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, He, D-Met, D-lle, Orn, D-Orn
Asparagina	N	D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gin, D-GIn
Ácido Aspártico	D	D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D-GIn
Cisteína	C	D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
Gluts mi na	Q	D-GIn, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 25/71

23/44

Resíduo de aminoácido original	Código	Substituições Aceitáveis
Ácido Glutâmico	E	D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gin, D-GIn
Glicina	G	Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, β-Ala, Acp
ísoíeucina	1	D-lle, Vai, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Leucina	L	D-Leu, Vai, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Lisina	K	D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, He, D-lle, Orn, D-Orn
Metionina	M	D-Met, S-Me-Cys, He, D-lle, Leu, D-Leu, Vai, DVal
Fenilalanina	F	D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, DTrp, Trans-3,4 ou 5-fenilprolina, cis-3,4 ou 5fenilprolina
Prolina	P	D-Pro, ácido L-l-tioazolidina-4-carboxílico, ácido D ou L-1-oxazolidina-4-carboxílico
Serina	S	D-Ser, Thr, D-Thr, alo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), L-Cys, D-Cys
Treonina	T	D-Thr, Ser, D-Ser, alo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), Vai, D-Val
Tirosina	Y	D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
Valina	V	D-Val, Leu, D-Leu, lie, D-lle, Met, D-Met

[0061] Também espera-se que outros ligantes funcionem conforme descrito, incluindo aqueles que têm pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos com o Ligante 1 e o Ligante 2. Visto que ambos os ligantes testados parecem resultar em enzimas ativas, não acredita-se que a natureza do ligado seja crítica. Entretanto, é provável que experimentos futuros identifiquem ligantes que otimizam a atividade enzimática. Ligantes preferenciais são peptídeos, mas ligantes maiores,

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 26/71

24/44 incluindo proteínas funcionais, também podem ser usados como ligantes. Tais ligantes podem, por exemplo, permitir o isolamento de uma enzima, fornecer uma etiqueta fluorescente, incluir uma atividade enzimática adicional e semelhantes. Idealmente, o ligante, PKL e PTA são uma única sequência de aminoácidos contígua que pode ser produzida em uma célula com o uso de maquinário de tradução normal; no entanto, o princípio de ligação de enzimas PKL e PTA inclui a possibilidade de um ligante sintético adicionado aos polipeptídeos de PKL e PTA quimicamente.

[0062] Em algumas modalidades, a levedura que expressa o polipeptídeo de fusão de PKL-PTA bifuncional produz pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5% ou até mesmo pelo menos 6% mais etanol a partir de um substrato que a levedura que carece da proteína bifuncional. Em algumas modalidades, a levedura que expressa o polipeptídeo de fusão de PKL-PTA bifuncional produz pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3% e até mesmo pelo menos 4% mais etanol a partir de um substrato que a levedura que expressa polipeptídeos de PKL e PTA separados. Em algumas modalidades, a levedura que expressa o polipeptídeo de fusão de PKL-PTA bifuncional produz pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% ou até mesmo pelo menos 60% menos acetato a partir de um substrato que a levedura que expressa polipeptídeos de PKL e PTA separados. Em algumas modalidades, a levedura que contém o polipeptídeo de fusão de PKLPTA bifuncional produz pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15% ou até mesmo pelo menos 20% menos glicerol a partir de um substrato que a levedura que carece da proteína bifuncional.

[0063] Em algumas modalidades, a levedura que expressa o polipeptídeo de fusão de PKL-PTA bifuncional não expressa adicionalmente polipeptídeos de PKL e PTA separados. Em outras

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 27/71

25/44 modalidades, a levedura que expressa o polipeptídeo de fusão de PKLPTA bifuncional também expressa polipeptídeos de PKL e/ou PTA separados.

IV. Combinação de expressão de polipeptídeo de fusão de PKLPTA com outras modificações genéticas que beneficiam a produção de álcool [0064] Em algumas modalidades, além de expressar polipeptídeos de fusão de PKL-PTA bifuncionais, as presentes células de levedura modificadas incluem modificações adicionais que afetam a produção de etanol.

[0065] As células modificadas podem, ainda, incluir mutações que resultam na atenuação da via de biossíntese de glicerol nativa, que são conhecidas por aumentar a produção de álcool. Métodos para a atenuação da via de biossíntese de glicerol em levedura são conhecidos e incluem redução ou eliminação da atividade de glicerol 3~fosfato desidrogenase (GPD) ou glicerol fosfato fosfatase (GPP) dependente de NAD endógeno, por exemplo, por meio da ruptura de um ou mais dentre os genes GPD1, GPD2, GPP1 e/ou GPP2. Consultar, por exemplo, as patentes n- U.S. 9.175.270 (Elke et al.), 8.795.998 (Pronk et al.) e 8.956.851 (Argyros et al.).

[0066] A levedura modificada pode apresentar, ainda, um aumento da atividade de acetil-CoA sintase (também denominada acetil-CoA ligase) (EC 6.2.1.1) para sequestrar (isto é, capturar) o acetato produzido pela hidrólise química ou enzimática de acetil-fosfato (ou presente no meio de cultura da levedura por qualquer outro motivo) e convertê-lo em Ac-CoA. Isso evita o efeito indesejável de acetato no crescimento de células de levedura e pode, ainda, contribuir para um melhoramento no rendimento de álcool. O aumento da atividade de acetil-CoA sintase pode ser conquistado introduzindo-se um gene heterólogo da acetil-CoA sintase em células, aumentando a expressão

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 28/71

26/44 de um gene endógeno da acetil-CoA sintase e semelhantes. Uma acetilCoA sintase particularmente útil para a introdução em células pode ser obtida a partir de Methanosaeta concílíi (Número de Acesso UniProt/TrEMBL: WP___013718460). Homólogos dessas enzimas, incluindo enzimas que têm pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% e até mesmo pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a acetil-CoA sintase de Methanosaeta concilii supracitada, também são úteis nas presentes composições e métodos.

[0067] Em algumas modalidades, as células modificadas podem incluir, ainda, um gene heterólogo que codifica uma proteína com atividade de acetaldeído desidrogenase acetilante dependente de NAD⁺e/ou um gene heterólogo que codifica uma piruvato-formato liase. A introdução de tais genes em combinação com a atenuação da via de glicerol é descrita, por exemplo, na patente n~U.S. 8.795.998 (Pronk et al.). Em algumas modalidades das presentes composições e métodos, a levedura carece expressamente de um gene heterólogo (ou genes heterólogos) que codifica uma acetaldeído desidrogenase acetilante, uma piruvato-formato liase ou ambas.

[0068] Em algumas modalidades, as presentes células de levedura modificadas podem, ainda, superexpressar um polipeptídeo semelhante a transportador de açúcar (STL1) para aumentar a absorção de glicerol (consultar, por exemplo, Ferreira et al., 2005; Dusková et al., 2015 e o documento n²W0 2015023989 A1).

[0069] Em algumas modalidades, as presentes células de levedura modificadas incluem, ainda, uma via biossintética de butanol. Em algumas modalidades, a via biossintética de butanol é uma via biossintética de isobutanol. Em algumas modalidades, a via biossintética de isobutanol compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que catalisa um substrato para a conversão de produto

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 29/71

27/44 selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) piruvato em acetolactato; (b) acetolactato em 2,3-di-hidróxi-isovalerato; (c) 2,3-dihidróxi-isovalerato em 2-cetoisovalerato; (d) 2-cetoisovalerato em isobutiraldeído; e (e) isobutiraldeído em isobutanol. Em algumas modalidades, a via biossintética de isobutanol compreende polinucleotídeos que codificam polipeptídeos que têm atividade acetolactato sintase, ceto-ácido redutoisomerase, di-hidróxi-ácido desidratase, cetoisovalerato decarboxilase e álcool desidrogenase.

[0070] Em algumas modalidades, as células de levedura modificadas que compreendem uma via biossintética de butanol compreendem, ainda, uma modificação em um polinucleotídeo que codifica um polipeptideo que tem atividade piruvato decarboxilase. Em algumas modalidades, as células de levedura compreendem uma deleção, mutação e/ou substituição em um polinucleotideo endógeno que codifica um polipeptideo que tem atividade piruvato decarboxilase. Em algumas modalidades, o que tem atividade piruvato decarboxilase é selecionado dentre o grupo que consiste em: PDC1, PDC5, PDC6 e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, as células de levedura compreendem, ainda, uma deleção, mutação e/ou substituição em um ou mais polinucleotídeos endógenos que codificam FRA2, ALD6, ADH1, GPD2, BDH1 e YMR226C.

V. Combinação de expressão de polipeptideo de fusão de PKL» PTA com outras mutações benéficas [0071] Em algumas modalidades, além de expressar polipeptídeos de fusão de PKL-PTA bifuncionais, opcionalmente em combinação com outras modificações genéticas que beneficiam a produção de álcool, as presentes células de levedura modificadas incluem, ainda, qualquer número de genes de interesse adicionais que codificam proteínas de interesse. Genes de interesse adicionais podem ser introduzidos antes, durante ou após manipulações genéticas que resultam na expressão

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 30/71

28/44 dos polipeptídeos de fusão. As proteínas de interesse incluem marcadores selecionáveis, enzimas processadoras de carboidrato e outros polipeptídeos comercialmente relevantes, incluindo, porém sem limitação, uma enzima selecionada dentre o grupo que consiste em uma desidrogenase, uma transcetolase, uma fosfocetolase, uma transladolase, uma epimerase, uma fitase, uma xilanase, uma βglucanase, uma fosfatase, uma protease, uma o-amilase, uma β~ amilase, uma glicoamilase, uma pululanase, uma isoamilase, uma celulase, uma trealase, uma lipase, uma pectinase, uma poliesterase, uma cutinase, uma oxidase, uma transferase, uma redutase, uma hemicelulase, uma mananase, uma esterase, uma isomerase, uma pectinase, uma lactase, uma peroxidase e uma lacase. Proteínas de interesse podem ser secretadas, glicosiladas e modificadas de outra forma.

VI. Uso da levedura modificada para aumento de produção de álcool [0072] As presentes composições e os métodos incluem métodos para aumentar a produção de álcool com o uso da levedura modificada em reações de fermentação. Tais métodos não se limitam a um processo específico de fermentação. Espera-se que a presente levedura geneticamente modificada seja uma substituição imprevista para levedura convencional em qualquer instalação de fermentação de álcool. Embora seja principalmente destinada à produção de etanol combustível, a presente levedura também pode ser usada para a produção de álcool potável, incluindo vinho e cerveja.

VIL Células de levedura adequadas para modificação [0073] Leveduras são micro-organismos eucarlóticos unicelulares classificados como membros do reino fúngico e incluem organismos dos filos Ascomycota e Basidiomycota. As leveduras que podem ser usadas para a produção de álcool incluem, porém sem limitação,

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 31/71

29/44

Saccharomyces spp., incluindo S. cerevisiae, bem como Kluyveromyces, Lachancea e Schizosaccharomyces spp. Várias cepas de levedura estão comercialmente disponíveis, muitas das quais foram selecionadas ou geneticamente modificadas para características desejadas, tais como alta produção de álcool, rápida taxa de crescimento e semelhantes. Algumas leveduras foram geneticamente modificadas para produzir enzimas heterólogas, tais como glicoamilase ou a-amilase.

VUL Substratos e produtos [0074] A produção de álcool a partir de vários substratos de carboidrato, incluindo, porém sem limitação, amido de milho, cana-deaçúcar, mandioca e melaço, é bem conhecida, assim como inúmeras variações e melhorias nas condições enzimáticas e químicas e processos mecânicos. Acredita-se que as presentes composições e métodos sejam completamente compatíveis com tais substratos e condições.

[0075] Esses e outros aspectos e modalidades das presentes cepas e métodos serão evidentes para o versado na técnica em vista da presente descrição. Os exemplos a seguir destinam-se a ilustrar adicionalmente, mas não a limitar, as cepas e os métodos.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Materiais e Métodos

Preparação de liquefeito [0076] O liquefeito (pasta fluida de milho moído) foi preparado adicionando-se 600 ppm de ureia, 0,124 SAPU/g ds de FERMGEN™ 2,5X (uma protease fúngica ácida), 0,33 GAU/g ds de glicoamilase (uma glicoamilase variante de Trichoderma) e 1,46 SSCU/g ds de GC626 (oamilase de Aspergillus), ajustado para um pH de 4,8.

Preparação de substrato de farinha de milho não liquefeita

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 32/71

30/44 [0077] Uma pasta fluida de farinha de milho não liquefeita foi preparada adicionando-se água desmineralizada à farinha de milho obtida moendo-se grãos de milho secos e ajustando-se o pH para 4,8. Adicionalmente, 600 ppm de ureia, 0,124 SAPU/g ds de FERMGEN™ 2,5X (protease fúngica ácida), 0,22 mg/g ds de TrGA (uma glicoamilase de Trichoderma) e 0,033 mg/g ds de AcAA (α-amilase de Aspergillus) foram adicionados.

Ensaios em frascos de soro [0078] 2 ml de YPD em placas de 24 poços foram inoculados com células de levedura, e permitiu-se que as células crescessem durante a noite para alcançar uma OD entre 25 e 30. 2,5 ml de liquefeito foi dividido em alíquotas em frascos de soro (Chemglass, n²de catálogo: CG-4904-01), e levedura foi adicionada a cada frasco para uma OD final de cerca de 0,4 a 0,6. As tampas dos frascos foram atarraxadas e puncionadas com agulha (BD, n^sde catálogo: 305111) para ventilação (para liberar CO2), então, incubadas a 32 O com agitação (200 RPM por 65 horas).

Ensaios de AnKom [0079] 300 μΙ da cultura de levedura concentrada durante a noite foram adicionados a cada um dentre os inúmeros recipientes ANKOM preenchidos com 30 g de liquefeito preparado para uma OD final de 0,3. Os recipientes foram, então, incubados a 32 Ό com agitação (150 RPM) por 65 horas.

Ensaios em frasco de agitação [0080] 500 μί de cultura de levedura concentrada durante a noite foram adicionados a cada um dentre inúmeros vasos de agitação preenchidos com 100 g de liquefeito preparado ou substrato não liquefeito para uma OD final de 0,1. Os vasos foram incubados a 32 Ό ou 36 Ό com agitação (170 RPM) por 66 horas, no ca so de SSF com liquefeito, ou 90 horas, no caso de farinha de milho não liquefeita.

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 33/71

31/44

Análise de HPLC [0081 ] As amostras dos experimentos de frasco de soro e AnKom foram coletadas em tubos Eppendorf por centrifugação por 12 minutos a 14.000 RPM. Os sobrenadantes foram filtrados com filtros de PTFE 0,2 μΜ e, então, usados para análise de HPLC (Agilent Technologies série 1200) com as seguintes condições: Colunas Bio-Rad Aminex HPX-87H, temperatura de execução de 55 Ό. Fluxo isocrático a 0,6 ml/min de H2SO4 0,01 N, 2,5 μΙ de volume de injeção. Padrões de calibração foram usados para quantificação de acetato, etanol, glicerol e glicose. As amostras dos experimentos de vasos de agitação foram coletadas em tubos Eppendorf por centrifugação por 15 minutos a 14.000 RPM. Os sobrenadantes foram diluídos por um fato de 11 com 0 uso de H2SO4 5 mM e incubados por 5 min a 95 Ό. Após 0 resfriamento, as amostras foram filtradas com filtros de 0,2 μΜ Corning FiltrEX CLS3505 e, então, usadas para análise de HPLC. 10 μΙ foram injetados em um HPLC Agilent série 1200 equipado com um detector de índice de refração. A coluna de separação usada foi uma coluna Phenomenex Rezex-RFQ Fast Acid H+ (8%). A fase móvel foi H2SO4 5 mM, e a taxa de fluxo foi 1,0 ml/min a 85 Ό. A Mistura Padrão de Calibração de HPLC da Bion Analytical foi usada para a quantificação de acetato, etanol, glicerol e glicose. Valores são expressos em g/l.

Determinação de crescimento [0082] Placas de microtitulação de 96 poços de 2 ml que contêm 500 μΙ de YPD foram inoculadas com 20 μΙ de cultura de levedura concentrada durante a noite para OD final de 0,1. As MTPs foram incubadas a 32 Ό ou 36 Ό com agitação (150 RPM) p or 24 horas. As culturas de levedura foram diluídas 50 vezes em água desmineralizada até um volume final de 100 μΙ em 500 μΙ de volume em placas transparentes de fundo plano (Greiner Bio-one 655101). A OD foi medida a um comprimento de onda de 660 nm.

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 34/71

32/44

Preparação d© amostras para determinação de atividade enzimátiea [0083] Para a determinação da atividade enzimátiea de glicoamilases secretadas por cepas de levedura desenvolvidas em meios YPD e em liquefeito a 32 O no ensaio em fras co de agitação, as amostras de 1 ml de volume foram centrifugadas por 10 minutos a 14.000 RPM. Os sobrenadantes foram filtrados com filtro de 0,2 μΜ Corning FILTREX™ CLS3505 e usados para ensaio de atividade enzimátiea.

Ensaio de atividade enzimátiea [0084] Para determinar a atividade enzimátiea de glicoamilases secretadas, 10 μΙ de amostra foram misturados com 90 μ! de maltodextrina DP4-7 a 8% (p/p) (Sigma): solução tampão de NaCI 50 mM, pH 4,3 (razão 5:4) e incubados por 30 min a 32 Ό. A glicose liberada foi determinada com o uso de Kit de Ensaio D~Glicose (Formato GOPOD; Megazyme) de acordo com as instruções do fabricante. Uma glicoamilase de Trichoderma foi usada como um padrão. Valores são expressos em ppm.

Exemplo 2

Plasmídeo pZK41 W-GLAF12 com gene de fusão de PKL-PTA 1 [0085] O gene de fusão de fosfocetolase e fosfotransacetilase 1 sintético, GvPKL-L1-LpPTA, inclui as regiões de codificação otimizadas por códon para a fosfocetolase de Gardnerella vaginalis (GvPKL; SEQ ID NO: 1) e a fosfotransacetilase de Lactobacillus plantarum (LpPTA; SEQ ID NO: 2) juntas com o ligante sintético L1 (SEQ ID NO: 3). A sequência de aminoácidos do polipeptídeo de fusão resultante é mostrada na Figura 2 (SEQ ID NO: 5) com a região do ligante em negrito e itálico:

[0086] O plasmídeo pZK41W~GLAF12, mostrado na Figura 3, contém três cassetes para expressar o polipeptídeo de fusão de GvPKL

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 35/71

33/44

L1~LpPTA, a acetaldeido desidrogenase acetilante de Desuifospira joergensenii (DjAADH) e a acetil-CoA sintase de Methanosaeta conciiii (McACS). Tanto DjAADH quanto McACS foram otimizados por códon. A expressão de GvPKL-LI-LpPTA está sob o controle de um promotor HXT3 e um terminador FBA1. A expressão de DjAADH está sob o controle do promotor TDH3 e do terminador EN02. A expressão de McACS está sob o controle do promotor PDC1 e do terminador PDC1. O plasmídeo pZK41W~GLAF12 foi projetado para integrar os três cassetes de expressão no cromossomo de Saccharomyces a jusante do locus YHL041W. A composição funcional e estrutural do plasmídeo pZK41W-GLAF12 é descrita na Tabela 2.

Tabela 2. Elementos funcionais e estruturais do plasmídeo pZK41W~ GLAF12

Localização (bp)	Elemento funcional/estrutural	Descrição
4-81	Fragmento inferior, a jusante do locus YHL041W	Fragmento de DNA de 78 bp (identificado como YHL041WInferior na Figura 3) de S. cerevisiae
120-153	sítio de LoxP71	sítio de LoxP71
154-1442	sítio de Ura3	Gene Ura3 usado como marcador de seleção
1443-1476	LoxP66	sítio de LoxP66
1483-1562	Fragmento M. a jusante do locus YHL041W	Fragmento de DNA de 80 bp (identificado como YHL041WM na Figura 3) de S. cerevisiae
1563-4242	Gene ColE1 marcador de replicação e resistência à ampicilina	Essas sequências não fazem parte do fragmento de DNA integrado no genoma da levedura
4243-4318	Fragmento Superior, a jusante do locus YHL041W	Fragmento de DNA de 76 bp (identificado como YHL041WSuperior na Figura 3)
4416-7804	Promotor PDC1:: McACS:: Terminador PDC	Cassete para a expressão de McACS otimizado por códon que codifica acetil-CoA sintase, derivada de M. consilii

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 36/71

34/44

Localização (bp)	Elemento funcional/estrutural	Descrição
7873-10463	Promotor TDH3:: DjAADH:: Terminador ENO	Cassete para a expressão de DjAADH otimizado por códon que codifica acetaldeído desidrogenase acetilante, derivada de D. joergensenii
10497-15037	Promotor HXT3:: GvPKL-L1-LpPTA:: Terminador FBA1.	Cassete para a expressão de gene de fusão de GvPKL-L1 LpPTA otimizado por códon de codificação

Exemplo 3

Plasmídeo pZK41W»GLAF22 com gene de fusão de PKL-PTA 2 [0087] GvPKL~L2LpPTA sintético inclui as mesmas fosfocetolase e fosfotransacetilase que no Exemplo 2 juntar com o ligante sintético 2 (L2; SEQ ID NO 4). A sequência de aminoácidos do polipeptideo de fusão resultante é mostrada na Figura 4 (SEQ ID NO: 6), com a região do ligante em negrito e itálico. O plasmídeo pZK41W~GLAF22 contém o cassete para expressar o GvPKL-IJLLpPTA. O plasmídeo pZK41WGLAF22 (não mostrado) é similar ao plasmídeo pZK41W-GLAF12, mas tem um ligante diferente.

Exemplo 4

Plasmídeo pZK41W-(H3C19) com PKL e PTA como genes individuais [0088] O plasmídeo pZK41W-(H3C19) (Figura 5) foi projetado como um controle para testar os plasmídeos pZK41W-GLAF12 e pZK41WGLAF22 descritos acima. pZK41W-(H3C19) contém quatro cassetes de expressão. Os cassetes para a expressão de DjAADH e McACS são os mesmos que nos plasmídeos pZK41W-GLAF12 e pZK41W~GLAF22. Entretanto, em vez de expressar polipeptídeos de fusão de GvPKLLpPTA, a expressão do GvPKL e LpPTA é individualmente controlada. A expressão de GvPKL está sob o controle do promotor HXT3 e do terminador FBA1, enquanto a expressão de LpPTA está sob o controle do promotor PGK1 e do terminador PGK1. O construto pZK41W

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 37/71

35/44 (H3C19) também é projetado para integrar os quatro cassetes de expressão a jusante do locus YHL041W.

Exemplo 5

Geração de uma cepa FG-ura3 com um genótipo wa3 [0089] A cepa de S. cerevisiae, FERMAX™ Gold Label (doravante abreviada FG), é bem conhecida na indústria de etanol de grãos e foi usada como a cepa progenitora do tipo selvagem para produzir a presente levedura geneticamente modificada.

[0090] O plasmídeo pTOPO ll-Blunt ura3-loxP~KanMX-loxP~ura3 (Figura 6) foi projetado para substituir o gene URA3 na cepa FG por fragmentos mutados de ura3 e L/RA3-loxP-TEFp-KanMX-TEFt-loxPURA3. Os elementos funcionais e estruturais do plasmídeo são listados na Tabela 3.

Tabela 3. Elementos funcionais/estruturais de pTOPO ll-Blunt ura3loxP-KanMX-loxP-ura3

Localização (bp)	Elemento funcional/estrutural	Descrição
763-1695	gene KanR em E. coli	Sequência vetor
2388-3061	origem de pUC	Sequência vetor
3520-3569 Orientação inversa	Região flanqueadora de URA3 3',	DNA sintético idêntico à sequência genômica de S. cerevisiae para o locus URA3
3601-3634 Orientação inversa	loxP66	DNA idêntico ao consenso loxP66
3635-5400 Orientação inversa	TEF1::KanMX4::Termi nador TEF	Cassete de expressão de KanMX
5406-5439 Orientação inversa	loxP71	DNA idêntico ao consenso loxP71
5470-5519 Orientação inversa	Região flanqueadora de URA3 5’	DNA sintético idêntico ao locus URA3 no genoma de S. cerevisiae

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 38/71

36/44 [0091 ] Um fragmento de DNA de 2.018 bp (Figura 7) que contém o cassete ura3-loxP-KanMX-loxP-ura3 foi liberado do plasmídeo TOPO IlBlunt ura3-loxP-KanMX-loxP-ura3 por digestão de EcoRI. O fragmento foi usado para transformar células FG de S. cerevisiae por eletroporação.

[0092] As colônias transformadas com capacidade para crescem em meios que contêm G418 foram semeadas em placas sintéticas mínimas contendo 20 pg/ml de uracila e 2 mg/ml de ácido 5~fluoro~ orótico (5-FOA). As colônias com capacidade para crescem em placas de 5-FOA foram, ainda, confirmadas quanto à deleção de URA3 por crescimento de fenótipo em placas de SD-Ura e por PCR. Os transformantes de deleção de ura3 foram incapazes de crescem em placas de SD-Ura. Um único fragmento de PCR de 1,98 kb foi obtido com iniciadores de teste. Em contrapartida, os mesmos pares de iniciadores geraram um fragmento de 1,3 kb com o uso do DNA da cepa FG progenitora, indicado a presença do gene ura3 intacto. A cepa de deleção ura3 foi nomeada FG-KanMX-ura3.

[0093] Para remover o cassete de expressão de KanMX da cepa FG-KanMX~ura3, o plasmídeo pGAL-Cre-316 (Figura 8) foi usado para transformar células da cepa FG-KanMX-ura3 por eletroporação. O propósito de usar esse plasmídeo é para expressar temporariamente a enzima Cre, de modo que o gene KanMX intercalado com LoxP seja removido da cepa FG-KanMX-ura3 para gerar a cepa FG-ura3. pGALCre-316 é um plasmídeo circular autorreplicante que foi subsequentemente removido da cepa FG-ura3. Nenhum dos elementos de sequência de pGAL-cre-316 foi inserido no genoma da cepa FG~ ura3. Os elementos funcionais e estruturais do plasmídeo pGAL-Cre316 são listados na Tabela 4.

Tabela 4. Elementos funcionais e estruturais de pGAL-Cre-316.

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 39/71

37/44

Localização (bp)	Elemento funcional/estrutural
1-4810	Sequência de vetores bifuncionais pRS316 de levedura-bacteriano
440-1059	Origem de replicação de pBR322
2984-4080	gene URA3 de S. cerevisiae
4355-4454	Origem de F1
4813-6603, Orientação inversa	Cassete de GALp-Cre-ADHt, orientação inversa

[0094] As células transformadas foram plaqueadas em placas de SDUra. Colônias únicas foram transferidas para uma placa de YPG e incubadas por 2 a 3 dias a 300. As colônias foram, então, transferidas para uma nova placa de YPD por mais 2 dias. Finalmente, suspensões de células provenientes da placa de YPD foram manchadas nas placas a seguir: YPD, G418 (150 pg/ml), 5-FOA (2 mg/ml) e SD-Ura. As células com capacidade para crescer em YPD e 5-FOA e incapazes de crescer em placas de G418 e SD-Ura foram escolhidas para confirmação de PCR conforme descrito acima. O tamanho de produto de PCR esperado foi de 0,4 kb e confirmou a identidade da cepa de deleção ura3 sensível a KanMX (geneticina), derivada de FG-KanMX-ura3. Essa cepa foi nomeada FG-ura3.

Exemplo 7

Geração de cepas que expressam PKL e PTA como um polipeptídeo de fusão ou como polipeptídeos separados [0095] A cepa FG~ura3 foi usada como um progenitor para introduzir os genes de PKL e PTA descritos acima. As células foram transformadas com (i) um fragmento Swal de 12.372 bp contendo o cassete de expressão de GvPKL-L1-LpPTA do plasmídeo pZK41WGLAF12 (Figura 9), (ii) um fragmento Svval de 12.324 bp contendo o cassete de expressão de GvPKL-L2-LpPTA do plasmídeo pZK41WGLAF22 (Figura 10) ou (iii) um fragmento Swal de 13.568 bp contendo os cassetes de expressão individuais de GvPKL e LpPTA do plasmídeo

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 40/71

38/44 pZK41W-(H3C19) (Figura 11). Os transformantes foram selecionados e projetados conforme mostrado na Tabela 5:

Tabela 5. Designação de transformantes selecionados

Cepa	Inserto	Locus de Integração	Transgene(ou transgenes) expresso
G177	Fragmento Svral de pZK41WGLAF12 (Figura 9)	YHL041W	Fusão de GvPKL- L1-LpPTA
G320	Fragmento Swal de pZK41WGLAF22 (Figura 10)	YHL041W	Fusão de GvPKL- L2-LpPTA
G376	Fragmento Swal de pZK41W(H3C19) (Figura 11)	YHL041W	GvPKL e LpPTA, individualmente
Exemplo	3

Comparação de cepas que expressam PKL e PTA como um polipeptídeo de fusão ou como polipeptídeos separados em ensaios em frascos [0096] As novas cepas de levedura de FG G177, G320 e G376, juntamente com a cepa progenitora, FG, foram desenvolvidas em culturas de frasco e seus produtos de fermentação analisados conforme descrito no Exemplo 1. O desempenho em temos de produção de etanol, glicerol e acetato (em g/l) é mostrado na Tabela 6.

Tabela 6. FG versus G177, G320 e G376 em ensaios em frasco

Cepa	Transgene (ou transgenes) expresso	EtOH	Glicerol	Acetato
FG	nenhuma	131,89	16,30	0,60
G177	Fusão de GvPKL-L1-LpPTA	139,61	13,46	1,08

Cepa	Transgene (ou transgenes) expresso	EtOH	Glicerol	Acetato
FG	nenhuma	141,58	18,00	1,04
G320	Fusão de GvPKL-L2-LpPTA	146,81	15,83	1,55

Cepa	Transgene (ou transgenes) expresso	EtOH	Glicerol	Acetato
FG	nenhuma	138,93	17,42	0,63
G376	GvPKL e LpPTA, individualmente	141,28	14,00	1,43

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 41/71

39/44 [0097] Toda a levedura geneticamente modificada produziu mais etanol e menos glicerol que o progenitor FG, o que é desejável em termos de desempenho. Toda a levedura geneticamente modificada produziu mais acetato que o progenitor FG, o que não é desejável. Entretanto, a comparação do desempenho das cepas G177, G320, G376 revela que o aumento na produção de etanol é muito maior com as cepas G177 e G320 (5,9 e 3,7%, respectivamente) que expressam as proteínas de fusão em comparação com a cepa G376 que expressa proteínas separadas (1,7%). Além disso, o aumento na produção de acetato é muito menor nas cepas G177 e G320 (80 e 49%, respectivamente) em comparação com a cepa G376 (127%). Esses resultados sugerem que o polipeptídeo de fusão de PKL-PTA canaliza mais açúcar em etanol e menos em acetato que os polipeptídeos de PKL e PTA expressos separadamente.

Exemplo 9

Comparação de cepas que expressam PKL e PTA como um polipeptídeo de fusão ou como polipeptídeos separados em ensaios de AnKom [0098] Para confirmar os benefícios das proteínas bifuncionais, o desempenho das cepas G177, G320 e G376 foram mais precisamente analisadas em ensaios de AnKom, conforme descrito no Exemplo 1. O desempenho em temos de produção de etanol, glicerol e acetato (em g/l) é mostrado na Tabela 7.

Tabela 7. FG versus G177, G320 e G376 em ensaios de AnKom

Cepa	Transgene (ou transgenes) expresso	EtOH	Glicerol	Acetato
FG	nenhuma	134,26	17,24	0,78
G177	Fusão de GvPKL-L1-LpPTA	142,38	14,50	1,12
G320	Fusão de GvPKL-L2-LpPTA	141,09	14,95	1,22
G376	GvPKL e LpPTA, individualmente	139,39	13,58	1,54

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 42/71

40/44 [0099] O aumento na produção de etanol com as cepas G177 e G320 foi de 6,0 e 5,1%, respectivamente, em comparação com apenas 3,9% com a cepa G376. O aumento na produção de acetato foi de 44 e 56%, respectivamente, com as cepas G177 e G320, em comparação com 97% com a cepa G376.

Exemplo 10

Geração de cepas que expressam GA juntamente com PKL e PTA como um polipeptídeo de fusão ou como polipeptídeos separados [00100] Cepas de levedura que expressam qualquer uma das duas glicoamilases diferentes em combinação com os genes de PKL e PTA fundidos ou não fundidos foram construídos transformando-se várias cepas que expressão fusão ou não fusão de PKL e PTA com um cassete de DNA que contém um gene de GA otimizado por códon fundido ao promotor FBA1 e ao terminador FBA1 da levedura. Os transformantes nos quais os cassetes de expressão de GA foram integrados no cromossomo foram identificados e projetados conforme indicado na Tabela 8.

Tabela 8. Designação de Transformantes de GA selecionados

Cepa	Transgene de PKL e PTA (ou transgenes de PKL e PTA) expresso	GA expressa
POL-SC-00692	GvPKL e LpPTA, individualmente	GA n²1
POL-SC-00675	Fusão de GvPKL-L1-LpPTA	GA n²1
POL-SC-00696	GvPKL e LpPTA, individualmente	GA n-2
POL-SC-00699	Fusão de GvPKL-L1-LpPTA	GA n-2

Exemplo 11

Comparação do crescimento de cepas que expressam GA juntamente com PKL e PTA como um polipeptídeo de fusão ou como polipeptídeos separados [00101] Para confirmar o impacto positivo da fusão de PKL e PTA no crescimento das cepas de levedura geneticamente modificadas, o

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 43/71

41/44 crescimento de pares de cepas de outro modo isogênicas que expressam PKL e PTA como um polipeptídeo de fusão ou como polipeptídeos separados foi comparado. A ODeeo após 24 h de crescimento em YPD a 32 Ό ou 36 Ό é mostrada na T abela 9.

Tabela 9. Comparação do crescimento de GPY10008, GPY10009, POL-SC-00675, POL-SC-0692, POL-SC-0696 e POL-SC-00699

Par de cepas	Nome da cepa	Transgene de PKL e PTA (ou transgenes de PKL e PTA) expresso	GA expressa	ODa 32Ό	ODa 36%;
1	POL-SC-00692	GvPKL e LpPTA, individualmente	GA n²1	3,04	2,48
POL-SC-00675	Fusão de GvPKLL1-LpPTA	GA n²1	2,69	2,75
2	POL-SC-00696	GvPKL e LpPTA, individualmente	GA n²2	3,05	2,50
POL-SC-00699	Fusão de GvPKLL1 -LpPTA	GA n^s2	3,02	2,79
3	GPY10008	GvPKL e LpPTA, individualmente	Nenhuma	2,74	2,61
GPY10009	Fusão de GvPKLL1-LpPTA	Nenhuma	3,13	2,90

[00102] A comparação das densidades ópticas após 24 h revela que as cepas GPY10009, POL-SC-00675 e POL-SC-0699, que expressam a proteína de fusão de PKL-PTA, se desenvolveram melhor que as cepas isogênicas correspondentes que expressam PKL e PTA individualmente (cepas GPY10008, POL-SC-00692, POL-SC-00696, respectivamente).

Exemplo 12

Comparação de secreção de GA por cepas que expressam PKL e PTA como um polipeptídeo de fusão ou como polipeptídeos separados em culturas líquidas de YPD [00103] Para confirmar a influência positiva da expressão de PKL e PTA como um único polipeptídeo na expressão de GA, atividades enzimáticas das glicoamilases secretadas por pares de cepas que

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 44/71

42/44 expressam PKL e PTA como um polipeptídeo de fusão ou como polipeptídeos separados foram comparadas. A Tabela 10 mostra as atividades enzimáticas (expressam em ppm de GA) medidas nos sobrenadantes de culturas após o crescimento em YPD a 32T; ou 36Ό.

Tabela 10. Comparação de atividades enzimáticas de glicoamilases secretadas por cepas POL-SC-00675, POL-SC-00692, POL-SC00696 e POL-SC-00699.

Par de cepas	Nome da cepa	Transgene de PKL e PTA (ou transgenes de PKL e PTA) expresso	GA expressa	Atividade enzimática a 32 Ό	Atividade enzimática a 36Ό
1	POL-SC-00692	GvPKL e LpPTA, individualmente	GA n²1	1,04	1,21
POL-SC-00675	Fusão de GvPKL-L1- LpPTA	GAn²1	1,11	1,49
2	POL-SC-00696	GvPKL e LpPTA, individualmente	GA n²2	0,58	0,36
POL-SC-00699	Fusão de GvPKL-L1- LpPTA	GA n²2	0,69	0,63
[00104]	Atividades enzimáticas mais altas foram medidas nos

sobrenadantes das cepas POL-SC-00675 e POL-SC-00699 que expressam a proteína de fusão de PKL-PTA que nos sobrenadantes das cepas isogênicas correspondentes que expressam PKL e PTA individualmente (POL-SC-00692 e POL-SC-00696, respectivamente). Isso indica níveis mais altos de glicoamilases expressas por cepas que expressam a proteína de fusão.

Exemplo 13

Comparação de cepas que expressam GA juntamente com PKL e PTA como um polipeptídeo de fusão ou como polipeptídeos separados em ensaio em frasco de agitação com liquefeito [00105] O desempenho em fermentações em vasos de agitação com liquefeito como um substrato das cepas de levedura geneticamente modificadas POL-SC-00675, POL-SC-00692, POL-SC-00696 e POL

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 45/71

43/44

SC-00699 que expressam PTA, PKL e GA foi comparado a fim de avaliar o efeito de fusão de PKL e PTA na expressão de GA durante processo de SSF. Para tomar o impacto mais visível, GA não foi adicionada ao liquefeito. Os resultados obtidos são mostrados na Figura 12Ae 12B.

[00106] Os dados na Figura 12 mostram que as cepas POL-SC00675 e POL-SC-00699 que expressam a proteína de fusão de PKLPTA mostram melhor cinética de fermentação em comparação com as cepas isogênicas correspondentes que expressam PKL e PTA individualmente (POL-SC-00692 e POL-SC-00696, respectivamente). Isso indica que os níveis mais altos de glicoamilases que são expressos pelas cepas que expressam proteínas fundidas tem um impacto positivo no processo de SSF.

Exemplo 14

Comparação de cepas que expressam GA juntamente com PKL e PTA como um polipeptídeo de fusão ou como polipeptídeos separados com o uso de um substrato de farinha de milho não liquefeita [00107] O impacto benéfico da fusão de PKL e PTA no processo de fermentação também foi testado em ensaio em frasco de agitação com substrato de farinha de milho não liquefeita, o que requer uma dose mais alta de glicoamilases do que é usada para liquefeito convencional. Consequentemente, GA exógena de Trichoderma foi adicionada ao substrato para simular as típicas condições encontradas em uma usina de etanol. Os resultados obtidos são mostrados na Figura 13.

[00108] A cepa POL-SC-00699, que expressa a proteína de fusão de PKL-PTA, mostra melhor cinética de fermentação e níveis finais de fermentação mais altos de etanol em comparação com a cepa isogênica correspondente POL-SC-00696 que expressa PKL e PTA individualmente. Isso indica níveis mais altos de expressão de

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 46/71

44/44 glicoamilases pelas cepas com a fusão de PKL-PTA, bem como uma influência positiva da fusão da PKL e PTA no desempenho daquelas cepas em SSF.

Exemplo 15

Comparação de secreção de GA por cepas que expressam PKL e PTA como um polipeptideo de fusão ou como polipeptídeos separados com o uso de um substrato liquefeito de amido [00109] Para confirmar que o desempenho melhorado de cepas que expressam proteína bifuncional em ensaio em vasos de agitação está relacionado à expressão mais alta de GA, medições de atividade enzimática foram realizadas no caldo obtido a partir das culturas de fermentação das cepas POLSC”00696 e POL-SC-00699. As atividades enzimáticas medidas são apresentadas na Tabela 11.

Tabela 11. Comparação das atividades enzimáticas em ppm de GA secretada por cepas POLSC~00696 e POL-SC-O0699 desenvolvidas em frasco de agitação com o uso de liquefeito a 32 Ό.

Cepa	Transgene de PKL e PTA (ou transgenes de PKL e PTA) expresso	GA expressa	Atividade enzimática
POL-SC-00696	GvPKL e LpPTA, individualmente	G A n²1	1,529
POL-SC-00699	Fusão de GvPKL-L1-LpPTA	G A n²1	1,572
[00110] Ativid	ades enzimáticas de glicoamilase mais altas foram

medidas no caldo de fermentação da cepa POL-SC-00699 que expressa a proteína de fusão de PKL-PTA em comparação com a cepa isogênica correspondente POL-SC-00696 que expressa PKL e PTA individualmente. Isso confirma que cepas que expressam PKL e PTA como um único polipeptideo expressam mais glicoamilase que as cepas nas quais PKL e PTA são expressas como proteínas separadas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo de fusão recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende uma primeira sequência de aminoácidos que tem atividade de fosfocetolase fundida a uma segunda sequência de aminoácidos que tem atividade de fosfotransacetilase, em que o polipeptídeo de fusão, quando expresso em uma célula, tem capacidade de converter frutose-6-P (F-6-P) e/ou xilulose-5-P (X-5-P) em acetilCoA.
2. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira sequência de aminoácidos e a segunda sequência de aminoácidos são fundidas por meio de um peptídeo ügante.
3. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato deque a primeira sequência de aminoácidos está presente no N-termlnal do polipeptídeo de fusão e a segunda sequência de aminoácidos está presente no N-terminal do polipeptídeo de fusão.
4. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a segunda sequência de aminoácidos está presente no N-terminal do polipeptídeo de fusão e a primeira sequência de aminoácidos está presente no N-terminal do polipeptídeo de fusão.
5. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a primeira sequência de aminoácidos é a fosfocetolase de Gardnerella vaginalis.
6. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a segunda sequência de aminoácidos é a fosfotransacetilase de Lactobacillus plantarum.
7. Plasmídeo, caracterizado pelo fato de que compreende

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 48/71

2/4 uma sequência de DNA que codifica o polipeptídeo de fusão, como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes.
8. Células de levedura, caracterizadas pelo fato de que compreendem uma sequência de DNA que codifica o polipeptídeo de fusão, como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes.
9. Células de levedura, caracterizadas pelo fato de que expressam o polipeptídeo de fusão, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
10. Células de levedura, de acordo com a reivindicação 9, caracterizadas pelo fato de que as células de levedura não expressam ainda polipeptídeos separados que têm atividade de fosfocetolase e/ou fosfotransacetilase.
11. Método para aumentar a produção de álcool durante a fermentação, caracterizado pelo fato de que compreende colocar um substrato de carboidrato em contato com as células de levedura modificadas que expressam um polipeptídeo de fusão recombinante que compreende uma primeira sequência de aminoácidos que tem atividade de fosfocetolase fundida a uma segunda sequência de aminoácidos que tem atividade de fosfotransacetilase; e que permite que a levedura produza mais álcool a partir do substrato de carboidrato; em que a levedura produziu menos acetato que as células de levedura comparáveis que expressam os mesmos primeiros polipeptídeos e os mesmos segundos polipeptídeos que as moléculas separadas.
12. Método para reduzir a produção de acetato durante a fermentação de álcool, caracterizado pelo fato de que compreende colocar um substrato de carboidrato em contato com as células de levedura modificadas que expressam um polipeptídeo de fusão recombinante que compreende uma primeira sequência de aminoácidos que tem atividade de fosfocetolase fundida a uma segunda sequência de aminoácidos que tem atividade de fosfotransacetilase; e que permite

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 49/71

3/4 que a levedura produza álcool a partir do substrato de carboidrato; em que a levedura produziu menos acetato que as células de levedura comparáveis que expressam os mesmos primeiros polipeptídeos e os mesmos segundos polipeptídeos que as moléculas separadas.
13. Método para reduzir a produção de acetato através de células de levedura que têm uma via de fosfocetolase exógena, caracterizado pelo fato de que compreende produzir em células de levedura modificadas um polipeptídeo de fusão recombinante que compreende uma primeira sequência de aminoácidos que tem atividade de fosfocetolase fundida a uma segunda sequência de aminoácidos que tem atividade de fosfotransacetilase.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que as células de levedura modificadas produziram menos acetato que a levedura comparável que expressa os mesmos primeiros polipeptídeos e os mesmos segundos polipeptídeos que as moléculas separadas.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelo fato de que as células de levedura modificadas produziram pelo menos 10% menos acetato que a levedura comparável que expressa os mesmos primeiros polipeptídeos e os mesmos segundos polipeptídeos que as moléculas separadas.
16. Método para aumentar a expressão de glucoamilase em levedura, caracterizado pelo fato de que compreende um gene heterólogo que codifica uma glucoamilase, que compreende expressar ainda na levedura um polipeptídeo de fusão recombinante que compreende uma primeira sequência de aminoácidos que tem atividade de fosfocetolase fundida a uma segunda sequência de aminoácidos que tem atividade de fosfotransacetilase; em que a levedura produz, durante a fermentação, uma quantidade aumentada de glucoamilase em comparação com a levedura de outro modo idêntica que produz

Petição 870190065251, de 11/07/2019, pág. 50/71

4/4 moléculas separadas que têm fosfocetolase e/ou atividade de fosfotransacetilase.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 16, caracterizado pelo fato de que as células de levedura modificadas não produzem moléculas separadas que têm atividade de fosfocetolase e/ou fosfotransacetilase.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 17, caracterizado peto fato de que a levedura modificada é a levedura, como definida em qualquer uma das reivindicações 8 a 10.