BR112020018055A2

BR112020018055A2 - Redução na produção de acetato por meio de levedura que superexpressa pab1

Info

Publication number: BR112020018055A2
Application number: BR112020018055-6A
Authority: BR
Inventors: Min Qi; Paula Johanna Maria Teunissen; Quinn Qun Zhu
Original assignee: Danisco Us Inc.
Priority date: 2018-03-06
Filing date: 2019-03-04
Publication date: 2020-12-29
Also published as: US20200407734A1; DK3762499T5; AR114132A1; HUE065696T2; DK3762499T3; US11447783B2; PL3762499T3; CN112041449A; EP3762499B1; WO2019173204A1; RS65389B1; ES2973502T3; UY38134A; CN112041449B; EP3762499A1

Abstract

a presente invenção refere-se a composições e métodos que se referem à levedura modificada que superexpressa a proteína de ligação a poliadenilato (pab1). a levedura produz uma menor quantidade de acetato em comparação com as células parentais. tal levedura é particularmente útil para a produção de etanol em grande escala a partir de substratos de amido em que o acetato é um produto final indesejado.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "REDUÇÃO NA PRODUÇÃO DE ACETATO POR MEIO DE LEVEDURA QUE SUPEREXPRESSA PAB1".

CAMPO DA TÉCNICA

[0001] As presentes composições e métodos se referem a levedura modificada que superexpressa proteína de ligação de poliadenilato (PAB1). A levedura produz uma quantidade reduzida de acetato em comparação com suas células parentais. Tal levedura é particularmente útil para produção de etanol em grande escala a partir de substratos de amido, em que acetato é um subproduto indesejável.

ANTECEDENTES

[0002] A produção de etanol à base de levedura de primeira geração converte açúcares em etanol de combustível. A produção de etanol combustível anual por levedura é cerca de 90 bilhões de litros mundialmente (Gombert, A.K. e van Maris. A.J. (2015) Curr. Opin. Biotechnol. 33:81 a 86). É estimado que cerca de 70% do custo de produção de etanol é a matéria-prima. Visto que o volume de produção é tão grande, até mesmo pequenos aprimoramentos de rendimento têm um impacto econômico massivo através da indústria.

[0003] A via de fosfocetolase (PKL) foi geneticamente modificada em levedura para aumentar a produção de etanol, conforme descrito no documento WO2015148272 (Miasnikov et al.). Infelizmente, as cepas geneticamente também produzem mais acetato do que a levedura parental. O acetato não é um subproduto desejável, visto que tem efeitos negativos sobre o crescimento e a fermentação de levedura. Além disso, o acetato reduz o pH de água residual da fermentação e destilação, chamada de recuo, que é tipicamente reutilizada para liquefação de uma batelada subsequente de substrato. Como resultado, os produtores de etanol devem ajustar o pH do recuo (ou liquefeito) ou aumentar a quantidade de água fresca utilizada para a liquefação.

[0004] Há a necessidade de controlar a quantidade de acetato produzida por levedura, particularmente levedura geneticamente modificada que tende a produzir uma quantidade aumentada de acetato.

SUMÁRIO

[0005] As presentes composições e métodos se referem à levedura modificada que superexpressa o polipeptídeo de PAB1. Os aspectos e modalidades das composições e métodos são descritos nos parágrafos a seguir, independentemente enumerados.

[0006] Em um aspecto, são fornecidas células de levedura modificadas derivadas de células de levedura progenitoras, sendo que as células modificadas compreendem uma alteração genética que faz com que as células modificadas produzam uma quantidade maior de polipeptídeos de PAB1 em comparação com as células progenitoras, em que as células modificadas produzem, durante a fermentação, uma quantidade reduzida de acetato em comparação com a quantidade de acetato produzida pelas células progenitoras sob condições idênticas de fermentação.

[0007] Em algumas modalidades das células modificadas do parágrafo 1, a alteração genética compreende a introdução nas células progenitoras de um ácido nucleico com capacidade para direcionar a expressão de um polipeptídeo de PAB1 para um nível superior ao da célula progenitora cultivada sob condições equivalentes.

[0008] Em algumas modalidades das células modificadas do parágrafo 1, a alteração genética compreende a introdução de um cassete de expressão para expressar um polipeptídeo de PAB1.

[0009] Em algumas modalidades das células modificadas de qualquer um dos parágrafos 1 a 3, as células compreendem adicionalmente um ou mais genes da via de fosfocetolase.

[0010] Em algumas modalidades das células modificadas do parágrafo 4, os genes da via de fosfocetolase são selecionados a partir do grupo consistindo em fosfocetolase, fosfotransacetilase e acetil desidrogenase acetilante.

[0011] Em algumas modalidades das células modificadas de qualquer um dos parágrafos 1 a 5, a quantidade de aumento na expressão do polipeptídeo de PAB1 é pelo menos cerca de 200% em comparação com o nível de expressão nas células progenitoras cultivadas sob condições equivalentes.

[0012] Em algumas modalidades das células modificadas de qualquer um dos parágrafos 1 a 5, a quantidade de aumento na produção de mRNA que codifica o polipeptídeo de PAB1 é pelo menos cerca de 400% em comparação com o nível nas células progenitoras cultivadas sob condições equivalentes.

[0013] Em algumas modalidades das células modificadas, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 7, as células compreendem, ainda, um gene exógeno que codifica uma enzima processadora de carboidratos.

[0014] Em algumas modalidades, as células modificadas dos parágrafos 1 a 8, compreendem, ainda, uma alteração na trajetória de glicerol e/ou na trajetória de acetil-CoA.

[0015] Em algumas modalidades, as células modificadas, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 9, compreendem, ainda, uma trajetória alternativa para a produção de etanol.

[0016] Em algumas modalidades das células modificadas, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 10, as células são de um Saccharomyces spp.

[0017] Em outro aspecto, é fornecido um método para reduzir a produção de acetato a partir de células de levedura cultivadas em um substrato de carboidrato que compreende: introduzir em células de levedura progenitoras uma alteração genética que aumenta a produção de polipeptídeos de PAB1 em comparação com a quantidade produzida nas células progenitoras.

[0018] Em algumas modalidades do método do parágrafo 12, as células que têm a alteração genética introduzida são as células modificadas de qualquer um dos parágrafos 1 a 11.

[0019] Em algumas modalidades do método do parágrafo 12 ou 13, a redução na produção de acetato é de pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20% ou pelo menos 25%.

[0020] Em algumas modalidades do método de qualquer um dos parágrafos 12 a 14, os polipeptídeos de PAB1 são superexpressos por pelo menos 200%.

[0021] Em algumas modalidades do método de qualquer um dos parágrafos 12 a 14, os polipeptídeos de PAB1 são superexpressos por pelo menos 15 vezes.

[0022] Esses e outros aspectos e modalidades das presentes células modificadas e métodos estarão evidentes a partir da descrição, que inclui quaisquer Desenhos/Figuras em anexo.

DESCRIÇÃO DETALHADA I. Definições

[0023] Antes de descrever a presente levedura e métodos em detalhes, os seguintes termos são definidos para maior clareza. Os termos não definidos devem ser reconhecidos por seus significados ordinários, conforme usado na técnica relevante.

[0024] Como usado no presente documento, o termo "álcool" se refere a um composto orgânico no qual um grupo funcional hidroxila (- OH) está ligado a um átomo de carbono saturado.

[0025] Conforme usado no presente documento, os termos "células de levedura", "cepas de levedura" ou simplesmente "levedura" se referem a organismos dos filos Ascomycota e Basidiomycota. Uma levedura exemplificativa é uma levedura de germinação da ordem

Saccharomycetales. Os exemplos específicos de levedura são Saccharomyces spp., incluindo, porém sem limitação, S. cerevisiae. A levedura inclui organismos usados para a produção de álcool combustível, bem como organismos usados para a produção de álcool potável, incluindo cepas de levedura especializadas e patenteadas usadas para produzir cervejas de sabores distintos, vinhos e outras bebidas fermentadas.

[0026] Conforme usado no presente documento, o sintagma "células de levedura geneticamente modificadas", "células de levedura variantes", "células de levedura modificadas" ou sintagmas similares referem-se à levedura que inclui as modificações e características genéticas descritas no presente documento. A levedura variante/modificada não inclui levedura de ocorrência natural.

[0027] Conforme usado no presente documento, os termos "polipeptídeo" e "proteína" (e suas respectivas formas plurais) são usados intercambiavelmente para se referir a polímeros de qualquer comprimento que compreendem resíduos de aminoácidos ligados por ligações peptídicas. Os códigos convencionais de uma letra ou de três letras para resíduos de aminoácidos são usados no presente documento, e todas as sequências são apresentadas de uma direção N-terminal para C-terminal. O polímero pode compreender aminoácidos modificados e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente de identificação. Também estão incluídos na definição, por exemplo, polipeptídeos que contêm um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica.

[0028] Como usado no presente documento, as proteínas funcional e/ou estruturalmente similares são consideradas como "proteínas relacionadas" ou "homólogas". Tais proteínas podem ser derivadas de organismos de gêneros e/ou espécies diferentes, ou classes diferentes de organismos (por exemplo, bactérias e fungos), ou artificialmente projetadas. As proteínas relacionadas também englobam homólogos determinados por análise de sequência primária, determinados por análise de estrutura secundária ou terciária ou determinados por reatividade cruzada imunológica ou determinados por suas funções.

[0029] Conforme usado no presente documento, o termo "proteína homóloga" se refere a uma proteína que tem atividade e/ou estrutura similar a uma proteína de referência. Não se pretende que os homólogos necessariamente sejam relacionados evolutivamente. Portanto, pretende-se que o termo englobe uma enzima (ou enzimas) igual, similar ou correspondente (isto é, em termos de estrutura e função) obtida a partir de diferentes organismos. Em algumas modalidades, é desejável identificar um homólogo que tenha uma estrutura quaternária, terciária e/ou primária similar à proteína de referência. Em algumas modalidades, as proteínas homólogas induzem resposta imunológica similar (ou respostas imunológicas similares) à de uma proteína de referência. Em algumas modalidades, as proteínas homólogas são geneticamente modificadas para produzir enzimas com a atividade desejada (ou atividades desejadas).

[0030] O grau de homologia entre sequências pode ser determinado com o uso de qualquer método adequado conhecido na técnica (consultar, por exemplo, Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol., 48:443; Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:2.444; programas, tais como GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Pacote de Software de Genética de Wisconsin (Genetics Computer Group, Madison, WI); e

Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:387 a 395).

[0031] Por exemplo, PILEUP é um programa útil para determinar níveis de homologia de sequência. PILEUP cria um alinhamento de múltiplas sequências a partir de um grupo de sequências relacionadas com o uso de alinhamentos progressivos em pares. O mesmo também pode plotar uma árvore que mostra as relações de agrupamento usadas para criar o alinhamento. PILEUP usa uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng e Doolittle, (Feng e Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351 a 360). O método é similar àquele descrito por Higgins e Sharp ((1989) CABIOS 5:151 a 153). Os parâmetros de PILEUP úteis incluindo um peso de lacuna padrão de 3,00, um peso de comprimento da lacuna padrão de 0,10 e lacunas de extremidade ponderados. Um outro exemplo de um algoritmo útil é o algoritmo BLAST, descrito por Altschul et al. ((1990) J. Mol. Biol. 215:403 a 410) e Karlin et al. ((1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:5.873 a 5.887). Um programa BLAST particularmente útil é o programa WU-BLAST-2 (consultar, por exemplo, Altschul et al. (1996) Meth. Enzymol. 266:460 a 480). Parâmetros "W", "T" e "X" determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLAST usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, a matriz de pontuação BLOSUM62 (consultar, por exemplo, Henikoff e Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:10.915), alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M′5, N′-4 e uma comparação entre ambos os filamentos.

[0032] Conforme usado no presente documento, as frases "substancialmente similar" e "substancialmente idêntico" no contexto de pelo menos dois ácidos nucleicos ou polipeptídeos significam tipicamente que um polinucleotídeo ou polipeptídeo compreende uma sequência que tem pelo menos cerca de 70% de identidade, pelo menos cerca de 75% de identidade, pelo menos cerca de 80% de identidade, pelo menos cerca de 85% de identidade, pelo menos cerca de 90% de identidade, pelo menos cerca de 91% de identidade, pelo menos cerca de 92% de identidade, pelo menos cerca de 93% de identidade, pelo menos cerca de 94% de identidade, pelo menos cerca de 95% de identidade, pelo menos cerca de 96% de identidade, pelo menos cerca de 97% de identidade, pelo menos cerca de 98% de identidade ou até mesmo pelo menos cerca de 99% de identidade ou mais em comparação com a sequência de referência (isto é, de tipo selvagem). O percentual de identidade de sequência é calculado com o uso do algoritmo CLUSTAL W com parâmetros padrão. Consultar Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4.673 a 4.680. Parâmetros predefinidos para o algoritmo CLUSTAL W são: Penalidade por abertura de lacuna: 10,0 Penalidade por extensão de lacuna: 0,05 Matriz de ponderação de proteína: série BLOSUM Matriz de ponderação de DNA: IUB % de sequência divergente de atraso 40 Distância de separação de lacuna: 8 peso de transições de DNA: 0,50 Resíduos hidrofílicos de lista: GPSNDQEKR Uso de matriz negativa: DESLIGADO Alternar penalidades específicas de resíduo: LIGADO Alternar penalidades hidrofílicas: LIGADO Alternar penalidade de separação de vão final DESLIGADO

[0033] Uma outra indicação de que dois polipeptídeos são substancialmente idênticos é que o primeiro polipeptídeo é imunologicamente reativo de forma cruzada com o segundo polipeptídeo. Tipicamente, os polipeptídeos que diferem por substituições conservadoras de aminoácido são imunologicamente reativos de forma cruzada. Assim, um polipeptídeo é substancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, quando os dois peptídeos diferem apenas por uma substituição conservadora. Uma outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas é que as duas moléculas se hibridizam sob condições estringentes (por exemplo, dentro de uma faixa de estringência média a alta).

[0034] Conforme usado no presente documento, o termo "gene" é sinônimo do termo "alelo" em referência a um ácido nucleico que codifica e direciona a expressão de uma proteína ou RNA. Formas vegetativas de fungos filamentosos são geralmente haploides, portanto, uma única cópia de um gene especificado (isto é, um único alelo) é suficiente para conferir um fenótipo especificado. O termo "alelo" é geralmente preferencial quando um organismo contém mais de um gene similar, nesse caso, cada gene similar diferente é denominado um "alelo" distinto.

[0035] Como usado no presente documento, expressão "constitutiva" se refere à produção de um polipeptídeo codificado por um gene particular sob essencialmente todas as típicas condições de crescimento, em oposição à expressão "condicional", que exige a presença de um substrato particular, temperatura, ou semelhantes para induzir ou ativar a expressão.

[0036] Conforme usado no presente documento, o termo "expressar um polipeptídeo" e termos similares referem-se ao processo celular de produzir um polipeptídeo com o uso do maquinário de tradução (por exemplo, ribossomas) da célula.

[0037] Conforme usado no presente documento, "superexpressar um polipeptídeo", "aumentar a expressão de um polipeptídeo" e termos similares referem-se a expressar um polipeptídeo em níveis mais altos que o normal em comparação com aqueles observados com células progenitoras ou do tipo selvagem que não incluem uma modificação genética especificada.

[0038] Como usado no presente documento, um "cassete de expressão" se refere a um fragmento de DNA que inclui um promotor, e região codificadora de aminoácido e um terminador (isto é, promotor::região codificadora de aminoácido::terminador) e outra sequência de ácido nucleico necessária para permitir que o polipeptídeo codificado seja produzido em uma célula. Os cassetes de expressão podem ser exógenos (isto é, introduzidos em uma célula) ou endógenos (isto é, existentes em uma célula).

[0039] Como usado no presente documento, os termos "fundido" e "fusão" com relação a dois fragmentos de DNA, tais como um promotor e a região codificadora de um polipeptídeo, se referem a uma ligação física que faz com que os dois fragmentos de DNA se tornem uma única molécula.

[0040] Como usado no presente documento, os termos "tipo selvagem" e "nativo" são usados intercambiavelmente e se referem aos genes, proteínas ou cepas encontrados na natureza, ou que não são intencionalmente modificados para a vantagem da levedura atualmente descrita.

[0041] Conforme usado no presente documento, o termo "proteína de interesse" se refere a um polipeptídeo que se deseja que seja expresso na levedura modificada. Tal proteína pode ser uma enzima, uma proteína de ligação ao substrato, uma proteína de superfície ativa, uma proteína estrutural, um marcador selecionável, um transdutor de sinal, um receptor, um transportador, um fator de transcrição, um fator de tradução, um cofator ou semelhantes, e pode ser expressa. A proteína de interesse é codificada por um gene endógeno ou um gene heterólogo (isto é, gene de interesse") com relação à cepa parental. A proteína de interesse pode ser expressa intracelularmente ou como uma proteína secretada.

[0042] Conforme usado no presente documento, "ruptura de um gene" se refere amplamente a qualquer manipulação genética ou química, isto é, mutação, que impeça substancialmente que uma célula produza um produto gênico funcional, por exemplo, uma proteína, em uma célula hospedeira. Métodos exemplificativos de ruptura incluem deleção completa ou parcial de qualquer porção de um gene, incluindo uma sequência de codificação de polipeptídeos, um promotor, um intensificador ou um outro elemento regulador, ou mutagênese do mesmo, em que a mutagênese abrange substituições, inserções, deleções, inversões e combinações e variações das mesmas, sendo que qualquer uma das mutações impede substancialmente a produção de um produto gênico funcional. Um gene também pode ser rompido com o uso de CRISPR, RNAi, antissenso ou qualquer outro método que anule a expressão de genes. Um gene pode ser rompido por deleção ou manipulação genética de elementos de controle não adjacentes. Conforme usado no presente documento, "deleção de um gene" refere- se a sua remoção do genoma de uma célula hospedeira. Quando um gene inclui elementos de controle (por exemplo, elementos intensificadores) que não estão localizados imediatamente adjacentes à sequência de codificação de um gene, a deleção de um gene se refere à deleção da sequência de codificação e, opcionalmente, elementos intensificadores adjacentes, incluindo, porém sem limitação, por exemplo, sequências promotoras e/ou terminadoras, mas não requer a deleção de elementos de controle não adjacentes. A deleção de um gene também se refere à deleção de uma parte da sequência de codificação, ou uma parte de promotor imediatamente ou não imediatamente adjacente à sequência de codificação, em que não há atividade funcional do gene interessado existente na célula geneticamente modificada.

[0043] Conforme usado no presente documento, os termos "manipulação genética" e "alteração genética" são usados intercambiavelmente e referem-se à alteração/mudança de uma sequência de ácidos nucleicos. A alteração pode incluir, porém sem limitação, uma substituição, uma deleção, uma inserção ou uma modificação química de pelo menos um ácido nucleico na sequência de ácidos nucleicos.

[0044] Como usado no presente documento, um "polipeptídeo/proteína funcional" é uma proteína que tem uma atividade, como uma atividade enzimática, uma atividade de ligação, uma propriedade ativa em superfície, um transdutor de sinal, um receptor, um transportador, um fator de transcrição, um fator de tradução, um cofator ou similares, e que não foi mutada, truncada ou de outro modo modificada para abolir ou reduzir tal atividade. Polipeptídeos funcionais podem ser termoestáveis ou termoinstáveis, conforme especificado.

[0045] Conforme usado no presente documento, um "gene funcional" é um gene com capacidade para ser usado por componentes celulares para produzir um produto gênico ativo, tipicamente uma proteína. Genes funcionais são a antítese de genes rompidos, que são modificados de modo que não possam ser usados por componentes celulares para produzir um produto gênico ativo ou tenham uma capacidade reduzida para serem usados por componentes celulares para produzir um produto gênico ativo.

[0046] Conforme usado no presente documento, células de levedura foram "modificadas para impedir a produção de uma proteína especificada" se tiverem sido alteradas genética ou quimicamente para impedir a produção de uma proteína/polipeptídeo funcional que exibe uma atividade característica da proteína do tipo selvagem. Tais modificações incluem, porém sem limitação, deleção ou ruptura do gene que codifica a proteína (conforme descrito no presente documento), modificação do gene de modo que o polipeptídeo codificado careça da atividade supracitada, modificação do gene de modo a afetar a estabilidade ou o processamento prós-translacional e combinações das mesmas.

[0047] Conforme usado no presente documento, "atenuação de uma trajetória" ou "atenuação do fluxo através de uma trajetória", isto é, uma trajetória bioquímica, refere-se amplamente a qualquer manipulação genética ou química que reduza ou interrompa completamente o fluxo de substratos bioquímicos ou intermediários através de uma trajetória metabólica. Atenuação de uma via pode ser alcançada por uma variedade de métodos bem conhecidos. Tais métodos incluem, porém sem limitação: deleção completa ou parcial de um ou mais genes, substituição de alelos do tipo selvagem desses genes por formas mutantes que codificam enzimas com atividade catalítica reduzida ou maiores valores Km, modificação dos promotores ou outros elementos reguladores que controlam a expressão de um ou mais genes, modificação genética das enzimas ou do mRNA que codifica essas enzimas para uma diminuição de estabilidade, mau direcionamento de enzimas para compartimentos celulares onde têm menor probabilidade de interagirem com o substrato e intermediários, o uso de RNA de interferência e semelhantes.

[0048] Conforme usado no presente documento, "fermentação aeróbia" refere-se ao crescimento na presença de oxigênio.

[0049] Conforme usado no presente documento, "fermentação anaeróbica" refere-se ao crescimento na ausência de oxigênio.

[0050] Como usado no presente documento, a expressão "fim da fermentação" se refere ao estágio de fermentação quando a vantagem econômica de continuar a fermentação para produzir uma pequena quantidade de álcool adicional é excedida pelo custo de continuar a fermentação em termos de custos fixos e variáveis. Em um sentido mais geral, "fim da fermentação" se refere ao ponto em que uma fermentação não produzirá mais uma quantidade significativa de álcool adicional, isto é, não mais que cerca de 1% de álcool adicional ou sem mais substrato restante para produção de álcool adicional.

[0051] Como usado no presente documento, a expressão "fluxo de carbono" se refere à taxa de turnover de moléculas de carbono através de uma trajetória metabólica. O fluxo de carbono é regulado através de enzimas envolvidas nas trajetórias metabólicas, tal como a trajetória para metabolismo de glicose e a trajetória para metabolismo de maltose.

[0052] Conforme usado no presente documento, os artigos singulares "um", "uma", "o" e "a" abrangem os referentes plurais, a menos que o contexto claramente indique de outra forma. Todas as referências citadas no presente documento estão aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade. As seguintes abreviações/acrônimos têm os seguintes significados, a não ser que especificado de outro modo: EC comissão de enzima PKL fosfocetolase PTA fosfotransacetilase AADH acetaldeído desidrogenases ADH álcool desidrogenase EtOH etanol AA α-amilase GA glicoamilase °C graus centígrados bp pares de bases DNA ácido desoxirribonucleico ds ou DS sólidos secos g ou gm grama g/l gramas por litro H2O água HPLC cromatografia líquida de alto desempenho hr ou h hora kg quilograma M molar mg miligrama mL ou ml mililitro min minuto mM milimolar N normal nm nanômetro PAB1 proteína de ligação de poliadenilato PCR reação em cadeia de polimerase ppm partes por milhão Δ relacionado a uma deleção μg micrograma μL e µl microlitro μM micromolar II. Células de levedura modificadas que têm maior expressão de PAB1

[0053] São descritas a levedura modificada e métodos que têm uma alteração genética que resulta na produção de quantidades aumentadas de polipeptídeos de PAB1 em comparação com células parentais correspondentes (isto é, de outro modo, idênticas). PAB1 é a proteína de ligação de poli(A) principal na levedura. A mesma é uma proteína multifuncional residual de aproximadamente 577 aminoácidos, que media muitas funções celulares associadas à 3′-poli(A)-cauda de RNAs mensageiros (consultar, por exemplo, Brune, C. et al. (2005) RNA. 11:517 a 531). A superexpressão de PAB1 aumentou a tolerância ao estresse de levedura geneticamente modificada (Martani, F. et al., (2015), Sci. Rep. 5: 18318; doi: 10.1038/srep18318). Nenhuma associação foi feita, até o presente momento, entre a expressão de

PAB1 e a redução de acetato em levedura geneticamente modificada.

[0054] Os requerentes constataram que as células de levedura que superexpressam polipeptídeos de PAB1 produzem uma quantidade reduzida de acetato em comparação com células parentais de outro modo idênticas. O acetato reduzido é desejável, visto que o acetato afeta adversamente o crescimento e fermentação de levedura e resulta adicionalmente em recuo que tem um pH inferior ou desejável, exigindo o ajuste de pH ou o uso de mais água fresca para diluir o recuo.

[0055] Em algumas modalidades, o aumento na quantidade de polipeptídeos de PAB1 produzidos pelas células modificadas é um aumento de pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 70%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200%, pelo menos 500%, pelo menos 1.000% ou mais, especialmente em um estágio posterior da fermentação, em comparação com a quantidade de polipeptídeos de PAB1 produzidos por células parentais cultivadas sob as mesmas condições.

[0056] Em algumas modalidades, o aumento na quantidade de polipeptídeos de PAB1 produzidos pelas células modificadas é de pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes ou mais, em comparação com a quantidade de polipeptídeos de PAB1 produzidos por células parentais cultivados sob as mesmas condições.

[0057] Em algumas modalidades, o aumento na força do promotor usado para controlar a expressão dos polipeptídeos de PAB1 produzidos pelas células modificadas é de pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 13 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes ou mais, em comparação com a força do promotor nativo controlando a expressão de PAB1, com base na quantidade de mRNA produzido. Os dados de RNAseq (consultar, por exemplo, Wang, Z. et al. (2009) Nature Rev. Gen. 10:57 a 63)

indicam que o promotor EFB1 usado para o cassete de expressão de PAB1 exemplificado é aproximadamente 13 vezes mais forte do que o promotor PAB1 normal.

[0058] Em algumas modalidades, a redução na produção de acetato pelas células modificadas é uma redução de pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40% ou pelo menos 50%, ou mais em comparação com a quantidade de acetato produzido pelas células parentais cultivadas sob as mesmas condições.

[0059] De preferência, a expressão de PAB1 aumentada é alcançada por manipulação genética com o uso de técnicas de biologia molecular específicas de sequência em oposição à mutagênese química, que normalmente não é direcionada a sequências de ácidos nucleicos específicas. Entretanto, a mutagênese química não é excluída como um método para produzir células de levedura modificadas.

[0060] Em algumas modalidades, as presentes composições e métodos envolvem introduzir em células de levedura um ácido nucleico com capacidade para direcionar a superexpressão ou maior expressão de um polipeptídeo de PAB1. Particular métodos incluem, mas não são limitados a (i) introduzir um cassete de expressão exógeno para produzir o polipeptídeo em uma célula hospedeira, opcionalmente além de um cassete de expressão endógeno, (ii) substituir um cassete de expressão exógeno por um cassete endógeno que permite a produção de uma quantidade aumentada do polipeptídeo, (iii) modificar o promotor de um cassete de expressão endógeno para aumentar a expressão, (iv) aumentar o número de cópias dos cassetes iguais ou diferentes para superexpressão de PAB1, e/ou (v) modificar qualquer aspecto da célula hospedeira para aumentar a meia-vida do polipeptídeo na célula hospedeira.

[0061] Em algumas modalidades, a célula parental que é modifica já inclui um gene de interesse, tal como um gene que codifica um marcador selecionável, uma enzima processadora de carboidratos ou outro polipeptídeo. Em algumas modalidades, um gene de interesse é subsequentemente introduzido nas células modificadas.

[0062] Em algumas modalidades, a célula parental que já é modificada inclui uma via de interesse geneticamente modificada, como uma via de PKL para aumentar a produção de etanol, ou qualquer outra via para aumentar a produção de álcool.

[0063] A sequência de aminoácidos do polipeptídeo de PAB1 de S. cerevisiae exemplificado é mostrada abaixo como a SEQ ID NO: 1:

MADITDKTAEQLENLNIQDDQKQAATGSESQSVENSSASLYVGDLEP SVSEAHLYDIFSPIGSVSSIRVCRDAITKTSLGYAYVNFNDHEAGRKAI EQLNYTPIKGRLCRIMWSQRDPSLRKKGSGNIFIKNLHPDIDNKALYD TFSVFGDILSSKIATDENGKSKGFGFVHFEEEGAAKEAIDALNGMLLN GQEIYVAPHLSRKERDSQLEETKAHYTNLYVKNINSETTDEQFQELFA KFGPIVSASLEKDADGKLKGFGFVNYEKHEDAVKAVEALNDSELNGE KLYVGRAQKKNERMHVLKKQYEAYRLEKMAKYQGVNLFVKNLDDSV DDEKLEEEFAPYGTITSAKVMRTENGKSKGFGFVCFSTPEEATKAITE KNQQIVAGKPLYVAIAQRKDVRRSQLAQQIQARNQMRYQQATAAAA AAAAGMPGQFMPPMFYGVMPPRGVPFNGPNPQQMNPMGGMPKN GMPPQFRNGPVYGVPPQGGFPRNANDNNQFYQQKQRQALGEQLY KKVSAKTSNEEAAGKITGMILDLPPQEVFPLLESDELFEQHYKEASAA YESFKKEQEQQTEQA

[0064] O banco de dados de NCBI inclui mais de 100 entradas para polipeptídeos de PAB1 de S. cerevisiae. Não se espera que variações naturais na sequência de aminoácidos natural afetem sua função. Além disso, com base em tais dados de BLAST e Clustal W, é evidente que o polipeptídeo de PAB1 de S. cerevisiae exemplificativo compartilha um alto grau de identidade de sequência com polipeptídeos de outros organismos, e espera-se que a superexpressão de proteínas funcional e/ou estruturalmente similares, proteínas homólogas e/ou proteínas substancialmente similares ou idênticas produza resultados benéficos similares.

[0065] Em modalidades particulares das presentes composições e métodos, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de PAB1 que é superexpressa em células de levedura modificadas tem pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou ainda pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1. III. Células de levedura modificadas que têm expressão de PAB1 aumentada em combinação com genes de uma via de PKL exógena

[0066] A expressão aumentada de PAB1 pode ser combinada com a expressão de genes na via de PKL para reduzir a produção de quantidades elevadas de acetato, o que é associado à introdução de uma via de PKL exógena para a levedura.

[0067] As células de levedura geneticamente modificadas que têm uma via de PKL heteróloga foram descritas anteriormente no documento WO2015148272 (Miasnikov et al.). Estas células expressam fosfocetolase (PKL), fosfotransacetilase (PTA) e acetil desidrogenase acetilante (AADH) heterólogas, opcionalmente com outras enzimas, para canalizar o fluxo de carbono na direção oposta à via de glicerol e em direção à síntese de actil-CoA, que, então, é convertida em etanol. Tais células modificadas são capazes de produção de etanol aumentada em um processo de fermentação quando comparadas com células de levedura parentais, de outro modo, idênticas. IV. Combinação de produção de PAB1 ativa aumentada com outras mutações que afetam a produção de álcool

[0068] Em algumas modalidades, além de expressão quantidades aumentadas de polipeptídeos de PAB1 ativos, opcionalmente em combinação com a introdução de uma via de PKL exógena, as presentes células de levedura modificada incluem modificações adicionais que afetam a produção de etanol.

[0069] As células modificadas podem incluir adicionalmente as mutações que resultam em atenuação da via de biossíntese de glicerol nativa e/ou via de glicerol de reutilização, que são conhecidas por aumentar a produção de álcool. Métodos para a atenuação da via de biossíntese de glicerol em levedura são conhecidos e incluem redução ou eliminação da atividade de glicerol 3-fosfato desidrogenase (GPD) ou glicerol fosfato fosfatase atividade (GPP) dependente de NAD endógeno, por exemplo por meio da ruptura de um ou mais dentre os genes GPD1, GPD2, GPP1 e/ou GPP2. Consultar, por exemplo, as patentes nos U.S. 9.175.270 (Elke et al.), 8.795.998 (Pronk et al.) e

8.956.851 (Argyros et al.). Métodos para aprimorar a via de glicerol de reutilização por superexpressão de glicerol desidrogenase (GCY1) e di- hidroxiacetona quinase (DAK1) para converter glicerol em fosfato de di- hidroxiacetona (Zhang et al; J Ind Microbiol Biotechnol (2013) 40:1.153 a 1.160).

[0070] A levedura modificada pode apresentar, ainda, um aumento da atividade de acetil-CoA sintase (também denominada acetil-CoA ligase) (EC 6.2.1.1) para sequestrar (isto é, capturar) o acetato produzido pela hidrólise química ou enzimática de acetil-fosfato (ou presente no meio de cultura da levedura por qualquer outro motivo) e convertê-lo em Ac-CoA. Isso reduz parcialmente o efeito indesejável de acetato no crescimento de células de levedura e pode, ainda, contribuir para um melhoramento no rendimento de álcool. O aumento da atividade de acetil-CoA sintase pode ser conquistado introduzindo-se um gene heterólogo da acetil-CoA sintase em células, aumentando a expressão de um gene endógeno da acetil-CoA sintase e semelhantes.

[0071] Em algumas modalidades, as células modificadas podem incluir, ainda, um gene heterólogo que codifica uma proteína com atividade de acetaldeído desidrogenase acetilante dependente de NAD+ e/ou um gene heterólogo que codifica uma piruvato-formato liase. A introdução de tais genes em combinação com a atenuação da via de glicerol é descrita, por exemplo, na patente no U.S. 8.795.998 (Pronk et al.). Em algumas modalidades das presentes composições e métodos, a levedura carece expressamente de um gene heterólogo (ou genes heterólogos) que codifica uma acetaldeído desidrogenase acetilante, uma piruvato-formato liase ou ambas.

[0072] Em algumas modalidades, as presentes células de levedura modificadas podem, ainda, superexpressar um polipeptídeo semelhante a transportador de açúcar (STL1) para aumentar a absorção de glicerol (consultar, por exemplo, Ferreira et al., 2005; Dušková et al., 2015 e o documento no WO 2015023989 A1).

[0073] Em algumas modalidades, as presentes células de levedura modificadas incluem, ainda, uma via biossintética de butanol. Em algumas modalidades, a trajetória biossintética de butanol é uma trajetória biossintética de isobutanol. Em algumas modalidades, a trajetória biossintética de isobutanol compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que catalisa um substrato para a conversão de produto selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) piruvato em acetolactato; (b) acetolactato em 2,3-di-hidróxi- isovalerato; (c) 2,3-di-hidróxi-isovalerato em 2-cetoisovalerato; (d) 2- cetoisovalerato em isobutiraldeído; e (e) isobutiraldeído em isobutanol. Em algumas modalidades, a trajetória biossintética de isobutanol compreende polinucleotídeos que codificam polipeptídeos que têm atividade acetolactato sintase, ceto-ácido redutoisomerase, di-hidróxi- ácido desidratase, cetoisovalerato decarboxilase e álcool desidrogenase.

[0074] Em algumas modalidades, as células de levedura modificadas que compreendem uma via biossintética de butanol compreendem, ainda, uma modificação em um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem atividade piruvato decarboxilase. Em algumas modalidades, as células de levedura compreendem uma deleção, mutação e/ou substituição em um polinucleotídeo endógeno que codifica um polipeptídeo que tem atividade piruvato decarboxilase. Em algumas modalidades, o polipeptídeo que tem atividade piruvato decarboxilase é selecionado dentre o grupo que consiste em: PDC1, PDC5, PDC6 e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, as células de levedura compreendem, ainda, uma deleção, mutação e/ou substituição em um ou mais polinucleotídeos endógenos que codificam FRA2, ALD6, ADH1, GPD2, BDH1 e YMR226C. V. Combinação de expressão aumentada de PAB1 com outras mutações benéficas

[0075] Em algumas modalidades, além de expressão aumentada de polipeptídeos de PAB1 funcionais, opcionalmente em combinação com outras modificações genéticas que beneficiam a produção de álcool, as presentes células de levedura modificadas incluem, ainda, qualquer número de genes de interesse adicionais que codificam proteínas de interesse. Os genes adicionais de interesse podem ser introduzidos antes, durante ou depois de manipulações genéticas que resultam na produção aumentada de polipeptídeos de HAC1 ativos. As proteínas de interesse incluem marcadores selecionáveis, enzimas processadoras de carboidratos e outros polipeptídeos comercialmente relevantes, incluindo, porém sem limitação, uma enzima selecionada dentre o grupo que consiste em uma desidrogenase, uma transcetolase, uma fosfocetolase, uma transladolase, uma epimerase, uma fitase, uma xilanase, uma β-glucanase, uma fosfatase, uma protease, uma α-

amilase, uma β-amilase, uma glicoamilase, uma pululanase, uma isoamilase, uma celulase, uma trealase, uma lipase, uma pectinase, uma poliesterase, uma cutinase, uma oxidase, uma transferase, uma redutase, uma hemicelulase, uma mananase, uma esterase, uma isomerase, uma pectinase, uma lactase, uma peroxidase e uma lacase. Proteínas de interesse podem ser secretadas, glicosiladas e modificadas de outra forma. VI. Uso da levedura modificada para aumento de produção de álcool

[0076] As presentes composições e os métodos incluem métodos para aumentar a produção de álcool e/ou reduzir a produção de glicerol em reações de fermentação. Tais métodos não se limitam a um processo específico de fermentação. Espera-se que a presente levedura geneticamente modificada seja uma substituição "imprevista" para levedura convencional em qualquer instalação de fermentação de álcool. Embora seja principalmente destinada à produção de álcool combustível, a presente levedura também pode ser usada para a produção de álcool potável, incluindo vinho e cerveja. VII. Células de levedura adequadas para modificação

[0077] Leveduras são micro-organismos eucarióticos unicelulares classificados como membros do reino fúngico e incluem organismos dos filos Ascomycota e Basidiomycota. As leveduras que podem ser usadas para a produção de álcool incluem, porém sem limitação, Saccharomyces spp., incluindo S. cerevisiae, bem como Kluyveromyces, Lachancea e Schizosaccharomyces spp. Inúmeras cepas de levedura estão comercialmente disponíveis, muitas das quais foram selecionadas ou geneticamente modificadas para características desejadas, tais coimo alta produção de álcool, rápida taxa de crescimento e semelhantes. Algumas leveduras foram geneticamente modificadas para produzir enzimas heterólogas, tais como glicoamilase ou α-amilase. VII. Substratos e produtos

[0078] A produção de álcool a partir de vários substratos de carboidrato, incluindo, porém sem limitação, amido de milho, cana-de- açúcar, mandioca e melaço, é bem conhecida, assim como inúmeras variações e melhorias nas condições enzimáticas e químicas e processos mecânicos. Acredita-se que as presentes composições e métodos sejam completamente compatíveis com tais substratos e condições.

[0079] Produtos de fermentação de álcool incluem o composto orgânico que tem um grupo funcional hidroxila (-OH) ligado a um átomo de carbono. Álcoois exemplificativos incluem, porém sem limitação, metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, n- pentanol, 2-pentanol, isopentanol e álcoois superiores. Os álcoois combustíveis mais comumente produzidos são etanol e butanol.

[0080] Esses e outros aspectos e modalidades das presentes cepas de levedura e métodos serão evidentes para o versado na técnica em vista da presente descrição. Os exemplos a seguir destinam-se a ilustrar adicionalmente, porém, sem limitação, as composições e os métodos.

EXEMPLOS Exemplo 1 Materiais e métodos Preparação de liquefato:

[0081] Liquefato (pasta fluida de mistura de milho) foi preparado adicionando-se 600 ppm de ureia, 0,124 SAPU/g de ds FERMGENTM 2,5x (protease fúngica ácida), 0,33 GAU/g de ds CS4 (uma Trichoderma glucoamilase variante) e 1,46 SSCU/g de ds AKAA (Aspergillus kawachii α-amilase), ajustando-se a um pH de 4,8. Ensaios de ampola de soro:

[0082] 2 ml de YPD em placas de 24 poços foram inoculados com células de levedura e as culturas puderam se desenvolver de um dia para o outro a um OD entre 25 a 30. O liquefato de 5 ml (5,6 g) foi transferido para ampolas de soro (Chemglass, nº de catálogo CG-4904- 01) e a levedura foi adicionada a cada ampola a uma OD final de cerca de 0,3. As tampas das ampolas foram instaladas e perfuradas com agulha (BD, nº de catálogo: 305111) para ventilação (para liberar CO2), então, incubadas a 32 °C com agitação a 200 RPM por 55 horas. Ensaios de AnKom:

[0083] 300 µl de cultura de um dia para o outro de levedura concentrada foram adicionados a cada uma dentre diversas garrafas de ANKOM carregadas com 50 g de liquefato preparado (consultar acima) para um OD final de 0,3. As garrafas foram, então, incubadas a 32 °C com agitação a 150 RPM por 55 horas. Análise por HPLC:

[0084] As amostras das culturas de ampolas de soro e ensaios AnKom foram coletadas em tubos de Eppendorf por centrifugação por 12 minutos a 14.000 RPM. Os sobrenadantes foram filtrados com o uso de 0,2 µM de filtros de PTFE e, então, usados para análise de HPLC (Agilent Technologies, série 1200) com as seguintes condições: colunas Bio-Rad Aminex HPX-87H, temperatura de funcionamento de 55 °C. Fluxo isocrático a 0,6 ml/min de H2SO4 0,01 N, 2,5 µl de volume de injeção. Os padrões de calibragem foram usados para quantificação do acetato, etanol, glicerol, glicose e outras moléculas. Todos os valores são relatados em g/l. Exemplo 2 Preparação de um cassete de expressão de PAB1

[0085] O gene de PAB1 de Saccharomyces cerevisiae foi otimizado por códon e sintetizado para gerar o gene artificial, "PAB1s." O promotor EFB1 (locus YAL003W; SEQ ID NO: 3) e terminador TPI (locus YDR050C ; SEQ ID NO: 4) foram operacionalmente ligados à sequência de codificação para gerar EFB1Pro::PAB1s::cassete de expressão de Tpi1Ter. Este cassete de expressão foi introduzido na região a montante do locus de AAP1 (YHR047C) de (i) FERMAXTM Gold (Martrex Inc., Minnesota, EUA; aqui abreviado: "FG"), uma levedura de fermentação bem-conhecida usada na indústria de etanol de grãos, ou (ii) FG-PKR, levedura de FG geneticamente modificada que tem uma via de fosfocetolase (PKL) heteróloga que envolve a expressão de fosfocetolase (PKL), fosfotransacetilase (PTA) e acetil desidrogenase acetilante (AADH) conforme descrito no documento WO2015148272 (Miasnikov et al.) usando a tecnologia de CRISPR Cas9. A inserção esperada do cassete de expressão de PAB1 nas duas cepas parentais foi confirmada por PCR.

[0086] A sequência de aminoácidos do polipeptídeo de PAB1 é mostrada abaixo como SEQ ID NO: 1:

[0087] A região de codificação de PAB1 do gene de PAB1s é mostrada abaixo como SEQ ID NO: 2:

ATGGCTGACATCACCGACAAGACTGCCGAACAATTGGAAAACTTG AACATTCAAGACGATCAGAAGCAAGCTGCCACTGGTTCCGAATCT CAATCCGTCGAAAACTCTTCCGCTTCTTTGTACGTTGGTGACTTAG AACCATCTGTCTCCGAAGCTCACTTGTACGACATCTTCTCTCCAAT CGGTTCCGTCTCTTCCATCAGAGTTTGTCGTGATGCTATCACCAA GACCAGCTTGGGTTACGCTTACGTCAACTTTAACGACCATGAAGC TGGCAGAAAGGCTATCGAACAATTGAACTACACTCCAATCAAGGG TAGACTATGTAGAATCATGTGGTCTCAACGTGATCCATCCTTGAGA AAGAAAGGTTCTGGCAACATCTTCATCAAGAACTTGCATCCAGACA TTGACAACAAGGCTTTGTACGATACTTTCAGTGTCTTTGGTGACAT CTTATCTTCCAAGATTGCTACCGACGAAAACGGAAAGTCCAAGGG TTTTGGCTTTGTTCACTTCGAAGAGGAAGGTGCTGCCAAGGAAGC TATCGATGCTTTGAATGGTATGCTATTGAACGGTCAAGAAATCTAC GTTGCTCCTCACTTGTCCAGAAAGGAACGTGACTCTCAATTGGAA GAGACCAAGGCTCACTACACCAACTTGTACGTCAAGAATATCAAC TCCGAAACTACCGACGAACAATTTCAAGAATTGTTTGCCAAGTTTG GTCCAATTGTTTCTGCTTCCTTGGAAAAGGATGCCGACGGCAAGT TGAAGGGTTTCGGTTTCGTCAACTACGAAAAGCACGAAGACGCTG TCAAGGCTGTCGAAGCCTTGAACGATTCCGAACTAAATGGCGAAA AGTTGTACGTTGGTAGAGCACAGAAAAAGAACGAACGTATGCACG TCTTGAAGAAACAATACGAAGCTTACAGATTGGAAAAGATGGCCA AGTACCAAGGTGTTAATTTGTTCGTCAAGAACTTGGACGATTCTGT CGATGACGAAAAGTTGGAAGAGGAATTTGCTCCATACGGTACTAT CACCTCTGCCAAGGTCATGAGAACCGAAAACGGTAAGTCCAAGG GTTTTGGCTTCGTCTGTTTCTCTACTCCAGAGGAAGCTACCAAGG CTATCACCGAAAAGAATCAACAGATTGTTGCTGGCAAGCCATTGTA CGTTGCCATTGCTCAAAGAAAGGACGTCAGACGTTCTCAACTAGC TCAACAGATCCAAGCCAGAAACCAAATGAGATACCAACAGGCTAC TGCTGCCGCTGCAGCTGCCGCTGCAGGTATGCCAGGTCAATTCAT GCCTCCAATGTTTTACGGTGTCATGCCTCCAAGAGGTGTTCCATT CAACGGTCCAAACCCTCAACAGATGAATCCAATGGGTGGAATGCC AAAGAACGGTATGCCTCCACAATTCAGAAACGGTCCAGTCTACGG TGTCCCTCCACAAGGTGGCTTTCCAAGAAACGCTAACGACAACAA TCAATTCTACCAACAGAAGCAAAGACAAGCTTTGGGTGAACAATTG TACAAGAAAGTTTCTGCCAAGACTTCCAACGAAGAAGCTGCAGGC AAGATCACTGGTATGATCTTGGATTTACCACCTCAAGAAGTCTTCC CACTATTGGAATCCGACGAATTGTTCGAACAACACTACAAGGAGG CTTCTGCTGCCTACGAATCTTTCAAAAAGGAACAAGAGCAACAGA CTGAACAAGCCTAA

[0088] A região de promotor EFB1 usada para superexpressão de PAB1s mostrada abaixo como SEQ ID NO: 3:

TATGTTGTACCTAAATCAATACCGACAGCTTTTGACATATTATCTGT TATTTACTTGAATTTTTGTTTCTTGTAATACTTGATTACTTTTCTTTT GATGTGCTTATCTTACAAATAGAGAAAATAAAACAACTTAAGTAAG AATTGGGAAACGAAACTACAACTCAATCCCTTCTCGAAGATACATC AATCCACCCCTTATATAACCTTGAAGTCCTCGAAACGATCAGCTAA TCTAAATGGCCCCCCTTCTTTTTGGGTTCTTTCTCTCCCTCTTGCC GCCGATGGAACGTTCTGGAAAAAGAAGAATAATTTAATTACTTTCT CAACTAAAATCTGGAGAAAAAACGCAAATGACAGCTTCTAAACGTT CCGTGTGCTTTCTTTCTAGAATGTTCTGGAAAGTTTACAACAATCC ACAAGAACGAAAATGCCGTTGACAATGATGAAACCATCATCCACA CACCGCGCACACGTGCTTTATTTCTTTTTCTGAATTTTTTTTTTCCG CCATTTTCAACCAAGGAAATTTTTTTTCTTAGGGCTCAGAACCTGC AGGTGAAGAAGCGCTTTAGAAATCAAAGCACAACGCAACAATTTG TCGACAACCGAGCCTTTGAAGAAAAAATTTTTCACATTGTCGCCTC TAAATAAATAGTTTAAGGTTATCTACCCACTATATTTAGTTGGTTCT TTTTTTTTTCCTTCTACTCTTTATCTTTTTACCTCATGCTTTCTACCT TTCAGCACTGAAGAGTCCAACCGAATATATACACACATA

[0089] A região de terminador Tpi1 usada para a superexpressão de PAB1s mostrada abaixo como SEQ ID NO: 4:

[0090] ATTAATATAATTATATAAAAATATTATCTTCTTTTCTTTAT

ATCTAGTGTTATGTAAAATAAATTGATGACTACGGAAAGCTTTTTTA TATTGTTTCTTTTTCATTCTGAGCCACTTAAATTTCGTGAATGTTCT TGTAAGGGACGGTAGATTTACAAGTGATACAACAAAAAGCAAGGC GCTTTTTCTAATAAAAAGAAGAAAAGCATTTAACAATTGAACACCTC TATATCAACGAAGAATATTACTTTGTCTCTAAATCCTTGTAAAATGT GTACGATCTCTATATGGGTTACTCATAAGTGTACCGAAGACTGCAT TGAAAGTTTATGTTTTTTCACTGGAGGCGTCATTTTCGCGTTGAGA

AGATGTTCTTATCCAAATTTCAA Exemplo 3 Produção de álcool com o uso de levedura que superexpressa PAB1

[0091] As cepas que superexpressam PAB1 foram testadas em um ensaio de ampola pequena, contendo 5,6 g de liquefato e, então, em um ensaio de Ankom, contendo 50 g de liquefato, conforme descrito no Exemplo 1. As fermentações foram realizadas a 32°C por 55 horas. As amostrar do final da fermentação foram analisadas por HPLC. Os resultados são resumidos nas Tabelas 1 e 2. Tabela 1. Resultados de HPLC de ensaios de uma ampola pequena Características Glicerol Acetato Glicose Etanol Redução de de cepa (g/l) (g/l) (g/l) (g/l) acetato (%) FG 13,767 1,275 0,291 143,839 -0- FG-PAB1 14,707 1,063 0,173 143,039 16,6% FG-PKL 12,811 1,744 0,583 145,101 -0- FG-PKL-PAB1 13,554 1,308 0,661 144,524 25,0% Tabela 2. Resultados de HPLC de um ensaio de Ankom Características Glicose Glicerol Acetato Etanol Redução de de cepa (g/l) (g/l) (g/l) (g/l) acetato (%) FG 0,32 13,15 0,90 140,20 -0- FG-PAB1 0,31 13,91 0,79 140,11 12,2% FG-PKL 0,61 11,94 1,42 141,45 -0- FG-PKL-PAB1 0,71 12,69 1,06 140,33 25,4%

[0092] A superexpressão de PAB1 resultou em uma redução na produção de acetato de cerca de 12 a 17% em levedura de FG, que é reconhecida como uma levedura robusta de alta produção de etanol para a indústria de etanol de combustível, ao passo em que não é um organismo geneticamente modificado.

A superexpressão de PAB1 resultou em uma redução de até quase o dobro de levedura de FG geneticamente modificada para ter uma via de PKL exógena.

Estes resultados demonstram que a superexpressão de PAB1 é benéfica para reduzir o acetato, em geral, mas é particularmente benéfica para reduzir a quantidade aumentada de acetato produzida pela levedura que tem uma via de PKL.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Células de levedura modificadas derivadas de células de levedura parentais, caracterizadas pelo fato de que as células modificadas compreendem uma alteração genética que faz com que as células modificadas produzam uma maior quantidade de polipeptídeos de PAB1 em comparação com as células parentais, em que as células modificadas produzem, durante a fermentação, uma menor quantidade de acetato em comparação com a quantidade de acetato produzida pelas células parentais sob condições de fermentação idênticas.

2. Células modificadas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que a alteração genética compreende a introdução, nas células parentais, de um ácido nucleico com capacidade para direcionar a expressão de um polipeptídeo de PAB1 para um nível acima daquele da célula parental cultivada sob condições equivalentes.

3. Células modificadas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que a alteração genética compreende a introdução de um cassete de expressão para expressar um polipeptídeo de PAB1.

4. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadas pelo fato de que as células compreendem adicionalmente um ou mais genes da via de fosfocetolase.

5. Células modificadas, de acordo com a reivindicação 4, caracterizadas pelo fato de que os genes da via de fosfocetolase são selecionados a partir do grupo que consiste em fosfocetolase, fosfotransacetilase e acetil desidrogenase acetilante.

6. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizadas pelo fato de que a quantidade de aumento na expressão do polipeptídeo de PAB1 é pelo menos cerca de 200% em comparação com a expressão de nível nas células parentais cultivadas sob condições equivalentes.

7. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizadas pelo fato de que a quantidade de aumento na produção de mRNA que codifica o polipeptídeo de PAB1 é pelo menos cerca de 400% em comparação com o nível nas células parentais cultivadas sob condições equivalentes.

8. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizadas pelo fato de que as células compreendem adicionalmente um gene exógeno que codifica uma enzima processadora de carboidrato.

9. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizadas pelo fato de que compreendem adicionalmente uma alteração na via de glicerol e/ou na via de acetil- CoA.

10. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizadas pelo fato de que compreendem adicionalmente uma via alternativa para produzir etanol.

11. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizadas pelo fato de que as células são de um Saccharomyces spp.

12. Método para diminuir a produção de acetato a partir de células de levedura cultivadas em um substrato de carboidrato caracterizado pelo fato de que compreende: introduzir, nas células de levedura parentais, uma alteração genética que aumenta a produção de polipeptídeos de PAB1 em comparação com a quantidade produzida nas células parentais.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as células que têm a alteração genética introduzida são as células modificadas, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que a diminuição na produção de acetato é de pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20% ou pelo menos 25%.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que os polipeptídeos de PAB1 são superexpressos em pelo menos 200%.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que os polipeptídeos de PAB1 são superexpressos em pelo menos 15 vezes.