CN116814662A

CN116814662A - 一种重组海藻糖酶及其应用

Info

Publication number: CN116814662A
Application number: CN202311098852.4A
Authority: CN
Inventors: 曲元凯; 李明潭
Original assignee: Shidai Marine Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shidai Marine Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-08-30
Filing date: 2023-08-30
Publication date: 2023-09-29
Also published as: CN117925660A

Abstract

本发明提供了一种重组海藻糖酶及其应用，属于生物工程技术领域。本发明以核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的海藻糖酶基因tre37为基础，经过优化获得三个重组海藻糖酶基因tre37‑1、tre37‑2和tre37‑3，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7所示。构建工程菌株、摇瓶发酵、诱导表达、酶活测定，结果发现所述重组海藻糖酶具有催化pH范围广，发酵活力高等优点，具有很好的应用前景。

Description

一种重组海藻糖酶及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种重组海藻糖酶及其应用。

背景技术

海藻糖（Trehalose）是由2分子葡萄糖以α,α-1,1-糖苷键连接而成的二糖，没有还原性，性质稳定，难以降解。海藻糖在自然界中存在广泛，细菌、真菌、植物和无脊椎动物和昆虫体内都有海藻糖存在。海藻糖是生物体应激合成代谢产物，主要帮助生物体应对高温、冷冻、高渗透压等不利环境。在干旱环境中的生物体内有高浓度的海藻糖存在。这种情况下，海藻糖的功能是稳定大分子结构，特别是细胞中的蛋白质、细胞膜脂质和核酸，通过在这些分子周围形成玻璃状的结构，从而使它们可以免受脱水和氧化造成的损害。很多微生物在发酵后期，会在培养基中积累海藻糖，影响糖的转化效率。

海藻糖酶（Trehalase）是一种糖苷水解酶，国际酶学编号为EC3.2.1.28，可以特异性的催化1分子海藻糖水解为2分子葡萄糖，如图1所示。在发酵乙醇生产过程中，在发酵体系中添加海藻糖酶可以使最后的乙醇产量增加2%以上，因为酵母在乙醇发酵过程中会产生海藻糖，而不能将海藻糖作为碳源利用。因此，添加海藻酸酶可以提高最后的乙醇产量。在谷氨酸发酵过程中同样会产生较多的海藻糖，这些海藻糖同样不能为谷氨酸棒状杆菌利用，通过在发酵液中添加海藻糖酶，可以使发酵结束后的糖酸转化率提高0.5%~1%，从而提高最后的谷氨酸产量和降低发酵结束时发酵液中的残糖含量。

但目前海藻糖酶发酵活力较低，高活性海藻糖酶具有非常重要的应用价值。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种重组海藻糖酶及其应用。本发明以核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的海藻糖酶基因tre37为基础，经过优化获得三个重组海藻糖酶基因tre37-1、tre37-2和tre37-3，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 7所示。构建工程菌株、摇瓶发酵、诱导表达、酶活测定，结果发现所述重组海藻糖酶具有催化pH范围广，发酵活力高等优点，具有很好的应用前景。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明提供了一种海藻糖酶基因tre37，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

本发明还提供了一种重组海藻糖酶基因tre37-1，由所述海藻糖酶基因tre37优化获得，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。

本发明还提供了一种重组海藻糖酶基因tre37-2，也由所述海藻糖酶基因tre37优化获得，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示。

本发明还提供了一种重组海藻糖酶基因tre37-3，同样由所述海藻糖酶基因tre37优化获得，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示。

本发明还提供了一种载体，所述载体中含有所述海藻糖酶基因tre37或所述重组海藻糖酶基因tre37-1或所述重组海藻糖酶基因tre37-2或所述重组海藻糖酶基因tre37- 3。

本发明还提供了一种细胞，所述细胞含有所述载体。

本发明还提供了一种所述载体或所述细胞在发酵生产中的应用。

优选的，所述应用具体为在乙醇发酵生产中的应用。

优选的，所述应用具体为在氨基酸发酵生产中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

本发明中的重组海藻糖酶催化pH范围为2.5~7.5，且重组菌株GS115/tre37、GS115/tre37-1、GS115/tre37-2和GS115/tre37-3摇瓶发酵后酶活分别达到48.2U/mL、92.7U/mL、146.4U/mL和125.1U/mL，具有催化pH范围广，发酵活力高等优点，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为海藻糖在海藻糖酶催化下水解为葡萄糖的反应示意图；

图2为本发明实施例5中不同温度对酶催化活性的影响情况；

图3为本发明实施例5中不同pH值对酶催化活性的影响情况；

图4为本发明实施例6中海藻糖的降解率曲线图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。以下实施例中使用的试剂、试剂盒和仪器均可由市售获得，实施例中使用的方法如无特别说明，与常规使用的方法一致。

下面结合实施例，对本发明的技术方案进行进一步详细阐述。

实施例1 海藻糖酶基因tre37克隆

海藻糖酶基因来自于经过海藻糖驯化的土壤宏基因组DNA。每5天，将200mL海藻糖溶液（W/V，10%）浇灌于同一地点（威海市世代海洋生物科技股份有限公司）土壤中，连续30天。然后取该土壤于灭菌离心管中，加入300mL灭菌PBS缓冲液（pH7.2）溶解2h，然后离心去除沉淀。上清液用0.25μ超滤膜浓缩，然后用试剂盒（Omega公司产品）提取宏基因组DNA。

PCR扩增引物序列：

F：5’-ATGGCACCGCGAAGCTTCGT-3’（SEQ ID NO. 9）；

R：5’-TCAAGCAGCCAACAACCACC-3’（SEQ ID NO. 10）。

扩增反应体系：模板DNA2.0μL、引物F/R各1.0μL、2xPCRMix25μL、灭菌ddH₂O21μL，混匀。

PCR扩增条件：94℃预变性3min，然后94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸2min，35个循环，72℃保温10min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。送北京擎科生物技术有限公司测序，基因命名为tre37，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

tre37核苷酸序列（SEQ ID NO. 1）：

ATGGCACCGCGAAGCTTCGTAGCGGCGGCAGCACTCGCCGGCCTGATCTCGAGCGCTTCGGCGCTGTACATCAATGGCTCCGTCACGGCGCCGTGCGACTCGCCGCTGTACTGCCACGGCGAAATCCTGAAAGCGATTGAGCTTGCTCATCCCTTCACGGACTCTAAGACATTCGTTGACATGCCCACGATTCGGCCATTGGACGAGGTGATTGCAGCGTTCAACCGGCTGAGCCAACCGTTGTCCAATAACTCGGAGCTCAATGCCTTCCTGGCCGCCAACTTTGCGCCGGCCGGCGGCGAGCTCGAGGCAGTGCCCAGGGACCAGCTGCATACCGAACCCAGCTTCCTCAACAAACTCGACGATACCGTGATTAAGGAGTTCGTCGCCAAGGTCATCGACATCTGGCCCGACCTGACCAGGCGGTATGGCGGCCCCGGCAATTGCACGGCCTGTGCCAACAGCTTCATCCCCGTGAACCGGACCTTTGTGGTGGCGGGCGGCCGGTTTCGCGAACCCTATTACTGGGACTCGTACTGGATCCTCGAAGGCCTACTCCGCACGGGAGGTGCCTTCACCGAGATCTCCAAGAACATCATCGAGAACTTCCTCGATTTCGTGGAGACCATCGGCTTCATTCCCAATGGGGCGAGAATCTACTACTTGGATAGGCTTCAGCCGCCGCTCCTGGCACGCATGGTAAGGAGCTACGTCGACTATACCAACGACACCAGCATTCTCGACCGAGCTCTGCCGCTCTTGATCAAAGAGCACGAGTTCTGGTCCACGAACCGGAGCGTCTCCATCAAGGCCCCCAATGGGAAGACGTACACTCTGAACAGGTACTACGTCAACAACAACCAACCGCGCCCGGAATCGTTCCGGGAGGACTACATTACGGCCAACAATGGCTCTTATTACGCCGCGTCTGGGATAATATACCCGGTCAATACCCCGCTCAACGACACTGAAAAGGCGGAGCTCTACGCCAACCTGGCCAGCGGCGCCGAGACCGGGTGGGATTACAGCACGCGGTGGCTCAAGAACCCCAACGACGCCGCCAAGGAGATCTACTTCCCGCTGCGCTCCCTGAACGTGCGCGGGACGGTCCCGGTCGACCTCAAGTCGATCCTGTACGAGAACGAAGTCATCATCAGCCAGTATCTCAAGCGGGCAGGCAACAACTCGGAAGCCGAGCGGTGGGCTTACGCCGCCAGCCAGCGCAGCGATGCCATGTTCGAGCTGATGTGGAACGCCACCCAGTGGTCCTACTTCGACTACAACCTCACCAGCAACTCGCAGCGCATCTTCGTGCCCGTCGACGACGACGCCACCGCCGCCGAGCGCGCCGGCGCCCCCCGCGGCCAGCAGGTCCTCTTCAACATCGGCCAGTTCTACCCCTTCTGGACGGGCGCGGCCCCGGCGCAGCTCAAGAACAACCCGCTCGCGGTCCAGCAGGCCTACGCCCGCGTGGCGCGCATGCTCGACGAGAAGGCCGGCGGCATCCCCGCGACCAACTTCGTGACGGGCCAGCAGTGGGACCAGCCGAACGTCTGGCCGCCGCTGCAGCACGTGCTCATGGAGGGCCTGCTCAACACGCCGCCCACCTTCGGCGAAGCCGACCCGGCCTACCAGTCGGTGCGCGCCCTCGCGCTGCGCCTCGCCCAGCGCTACCTCGACTCGACCTTCTGCACGTGGTACGCCACGGGCGGGTCGACGAGCCAGACGCCGCAGCTGCAGGGCGTGGCGCCGGGGGCCGAGGGCATCATGTTCGAAAAGTACGCTGACAACTCGACCAACGTGGCCGGCAGCGGCGGCGAATACGAGGTCGTCGAGGGCTTCGGCTGGTCCAACGGCGTGCTGATCTGGGCCGCCGACGTGTTCGGCGCGCAGCTGAAGCGGCCCGAGTGCGGCAACATCACGGCCGCGCACACGTCGGGCAGTGGCGCGCAGAAGAGGAGCGGCGGCTCGCTCGCCCGGCGGGCGGTCGAGCTCGACCCGTGGGATGCCGCGTGGACCAAGATGTTGGGTAGGAGCGCGCTCAAGAAGAGGGAGGACGTGAGGAAGCGGTGGTTGTTGGCTGCTTGA

Tre37氨基酸序列（SEQ ID NO. 2）：

MAPRSFVAAAALAGLISSASALYINGSVTAPCDSPLYCHGEILKAIELAHPFTDSKTFVDMPTIRPLDEVIAAFNRLSQPLSNNSELNAFLAANFAPAGGELEAVPRDQLHTEPSFLNKLDDTVIKEFVAKVIDIWPDLTRRYGGPGNCTACANSFIPVNRTFVVAGGRFREPYYWDSYWILEGLLRTGGAFTEISKNIIENFLDFVETIGFIPNGARIYYLDRLQPPLLARMVRSYVDYTNDTSILDRALPLLIKEHEFWSTNRSVSIKAPNGKTYTLNRYYVNNNQPRPESFREDYITANNGSYYAASGIIYPVNTPLNDTEKAELYANLASGAETGWDYSTRWLKNPNDAAKEIYFPLRSLNVRGTVPVDLKSILYENEVIISQYLKRAGNNSEAERWAYAASQRSDAMFELMWNATQWSYFDYNLTSNSQRIFVPVDDDATAAERAGAPRGQQVLFNIGQFYPFWTGAAPAQLKNNPLAVQQAYARVARMLDEKAGGIPATNFVTGQQWDQPNVWPPLQHVLMEGLLNTPPTFGEADPAYQSVRALALRLAQRYLDSTFCTWYATGGSTSQTPQLQGVAPGAEGIMFEKYADNSTNVAGSGGEYEVVEGFGWSNGVLIWAADVFGAQLKRPECGNITAAHTSGSGAQKRSGGSLARRAVELDPWDAAWTKMLGRSALKKREDVRKRWLLAA

实施例2 tre37基因序列优化设计

按照毕赤酵母密码子偏好性，进行tre37基因序列的优化设计，用高频密码子替代低频密码子，同时考虑mRNA5’末端的二级结构，总共优化3条基因，进行优化序列的从头合成，分别命名为tre37-1、tre37-2和tre37-3，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 3、SEQ IDNO. 5、SEQ ID NO. 7所示，氨基酸序列分别如SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 8所示。为了便于构建重组表达质粒，在合成序列的5’末端和3’末端分别添加EcoRI和NotI酶切位点。

tre37-1核苷酸序列（SEQ ID NO .3）：有下划线的碱基为限制性酶切位点

GAATTCATGGCTCCTAGATCTTTCGTTGCTGCTGCTGCACTTGCCGGCCTAATATCATCTGCCTCAGCCCTTTACATCAATGGTTCAGTGACTGCCCCATGTGACTCCCCTCTTTACTGCCACGGCGAGATTTTAAAGGCCATTGAACTGGCTCATCCATTCACAGACTCTAAGACCTTCGTTGACATGCCTACTATCCGTCCATTAGATGAGGTCATCGCTGCTTTTAACCGATTGTCCCAGCCTTTATCCAATAACTCTGAGTTGAACGCATTCCTTGCTGCTAATTTCGCACCAGCTGGAGGAGAGCTTGAAGCTGTCCCACGTGATCAATTGCATACTGAACCTTCATTCTTGAACAAGTTGGACGACACAGTTATCAAGGAGTTTGTGGCTAAGGTTATTGACATATGGCCAGACCTTACGCGAAGGTATGGCGGACCTGGTAACTGTACGGCCTGTGCTAATAGTTTCATACCTGTTAATCGTACTTTTGTAGTTGCCGGTGGTAGATTCAGGGAACCTTATTACTGGGACTCTTATTGGATATTGGAAGGACTGCTGAGGACTGGTGGAGCCTTTACCGAAATTTCTAAGAATATCATTGAAAACTTTTTGGATTTTGTTGAAACAATTGGTTTTATTCCAAATGGTGCCCGTATTTATTACCTTGACAGATTGCAGCCACCTCTTTTAGCAAGAATGGTGCGTTCCTACGTTGATTATACTAACGACACTTCTATTCTGGATAGAGCCCTACCCTTACTGATAAAGGAACACGAGTTTTGGTCTACTAACCGTTCAGTTTCTATTAAGGCACCTAACGGTAAGACCTACACACTTAACAGATACTACGTGAATAACAATCAACCAAGACCTGAGTCCTTCAGAGAGGATTACATAACGGCTAACAACGGTTCCTACTACGCTGCCTCTGGTATCATATACCCTGTGAATACGCCTCTAAACGATACCGAGAAGGCTGAACTTTATGCCAACTTGGCTTCTGGTGCTGAAACCGGATGGGACTACTCAACCAGATGGCTGAAAAACCCCAATGACGCTGCAAAAGAAATATATTTCCCTCTGAGATCTCTTAACGTGAGGGGCACCGTTCCTGTCGACTTGAAATCTATTCTTTACGAGAACGAGGTGATAATTAGTCAATACCTAAAGAGAGCAGGCAACAATTCTGAGGCTGAGAGATGGGCTTATGCCGCAAGTCAAAGATCCGACGCCATGTTCGAACTAATGTGGAACGCCACTCAATGGTCTTATTTTGATTACAACCTAACTTCTAACTCTCAGAGGATTTTTGTTCCTGTTGATGACGACGCTACTGCTGCTGAGAGAGCTGGTGCTCCAAGGGGACAGCAAGTATTGTTTAACATTGGACAATTCTATCCATTTTGGACGGGTGCCGCTCCCGCTCAATTGAAAAATAACCCCCTTGCAGTTCAACAGGCTTATGCAAGGGTTGCTCGTATGTTGGACGAAAAGGCTGGCGGTATTCCAGCAACTAACTTCGTAACCGGCCAGCAGTGGGATCAGCCAAATGTCTGGCCCCCATTGCAGCATGTTCTAATGGAGGGTTTGCTTAACACCCCCCCCACATTTGGTGAGGCTGATCCAGCCTATCAGTCCGTTAGGGCTTTAGCTTTAAGATTAGCTCAGCGTTATCTTGATTCTACTTTCTGTACATGGTATGCAACGGGCGGTTCCACTTCTCAAACACCTCAGTTACAAGGTGTCGCTCCTGGCGCTGAAGGAATTATGTTTGAGAAGTACGCCGACAACTCTACAAATGTCGCCGGTTCAGGTGGAGAATATGAGGTGGTTGAGGGTTTCGGCTGGTCCAATGGAGTCCTAATTTGGGCAGCAGATGTCTTCGGTGCTCAGTTAAAGAGACCTGAGTGCGGCAACATTACTGCCGCCCACACCTCTGGTTCAGGTGCACAGAAGAGATCTGGAGGTAGTCTAGCAAGACGAGCTGTCGAACTTGATCCATGGGACGCTGCCTGGACGAAGATGCTTGGTAGGTCAGCCTTGAAAAAGAGAGAAGACGTGAGAAAAAGATGGCTGCTGGCTGCCTAAGCGGCCGC

Tre37-1氨基酸序列（SEQ ID NO .4）：

EFMAPRSFVATAALAGLISSASALYINGSVTAPCDSPLYCHGEILKAIELAHPFTDSKTFVDMPTIRPLDEVIAAFNRLSQPLSNNSELNAFLAANFAPAGGELEAVPRDQLHTEPSFLNKLDDTVIKEFVAKVIDIWPDLTRRYGGPGNCTACANSFIPVNRTFVVAGGRFREPYYWDSYWILEGLLRTGGAFTEISKNIIENFLDFVETIGFIPNGARIYYLDRLQPPLLARMVRSYVDYTNDTSILDRALPLLIKEHEFWSTNRSVSIKAPNGKTYTLNRYYVNNNQPRPESFREDYITANNGSYYAASGIIYPVNTPLNDTEKAELYANLASGAETGWDYSTRWLKNPNDAAKEIYFPLRSLNVRGTVPVDLKSILYENEVIISQYLKRAGNNSEAERWAYAASQRSDAMFELMWNATQWSYFDYNLTSNSQRIFVPVDDDATAAERAGAPRGQQVLFNIGQFYPFWTGAAPAQLKNNPLAVQQAYARVARMLDEKAGGIPATNFVTGQQWDQPNVWPPLQHVLMEGLLNTPPTFGEADPAYQSVRALALRLAQRYLDSTFCTWYATGGSTSQTPQLQGVAPGAEGIMFEKYADNSTNVAGSGGEYEVVEGFGWSNGVLIWAADVFGAQLKRPECGNITAAHTSGSGAQKRSGGSLARRAVELDPWDAAWTKMLGRSALKKREDVRKRWLLAA

tre37-2核苷酸序列（SEQ ID NO .5）：有下划线的碱基为限制性酶切位点

GAATTCATGGCTCCTAGGTCTTTCGTTGCTGCTGCTGCACTAGCCGGCCTAATATCCTCTGCCTCAGCCCTATACATCAATGGTTCAGTGACTGCCCCCTGTGACTCCCCTCTTTACTGCCATGGCGAGATTTTAAAGGCCATTGAACTAGCTCATCCATTCACAGACTCTAAGACCTTCGTTGACATGCCTACTATCCGTCCATTAGATGAGGTCATCGCTGCTTTTAACCGCTTGTCCCAGCCTTTATCCAATAACTCTGAGTTGAACGCATTCCTTGCTGCTAATTTCGCACCAGCTGGAGGAGAGCTTGAAGCTGTCCCACGTGATCAATTGCATACTGAACCTTCCTTCTTGAACAAGTTGGACGACACAGTTATCAAGGAGTTTGTGGCTAAGGTTATTGACATATGGCCAGACCTTACGCGAAGGTATGGCGGACCTGGTAACTGTACGGCCTGTGCTAATAGTTTCATACCTGTTAATCGTACTTTTGTAGTTGCCGGTGGTAGATTCAGGGAACCTTATTACTGGGACTCTTATTGGATATTGGAAGGACTGCTGAGGACTGGTGGAGCCTTTACCGAAATTTCTAAGAATATCATTGAAAACTTTTTGGATTTTGTTGAAACAATTGGTTTTATTCCAAATGGTGCCCGTATTTATTACCTTGACAGATTGCAGCCACCTCTTTTAGCAAGAATGGTGCGTTCCTACGTTGATTATACTAACGACACTTCCATTCTGGATAGAGCCCTACCCTTACTGATAAAGGAACACGAGTTTTGGTCTACTAACCGTTCAGTTTCTATTAAGGCACCTAACGGTAAGACCTACACACTTAACAGATACTACGTGAATAACAATCAACCAAGACCTGAGTCTTTCAGAGAGGATTACATAACGGCTAACAACGGTTCCTACTACGCTGCCTCCGGTATCATATACCCTGTGAATACGCCTCTAAACGATACCGAGAAGGCTGAACTTTATGCCAACTTGGCTTCTGGTGCTGAAACCGGATGGGACTACTCCACCAGATGGCTGAAAAACCCCAATGACGCTGCAAAAGAAATATATTTCCCTCTGAGATCTCTTAACGTGAGGGGCACCGTTCCTGTCGACTTGAAATCTATTCTTTACGAGAACGAGGTGATAATTAGTCAATACCTAAAGAGAGCAGGCAACAATTCTGAGGCTGAGAGATGGGCTTATGCCGCAAGTCAAAGATCCGACGCCATGTTCGAACTAATGTGGAACGCCACTCAATGGTCTTATTTTGATTACAACCTAACTTCTAACTCTCAGAGGATTTTTGTTCCTGTTGATGACGACGCTACTGCTGCTGAGAGAGCTGGTGCTCCAAGGGGACAGCAAGTATTGTTTAACATTGGACAATTCTATCCATTTTGGACGGGTGCCGCTCCCGCTCAATTGAAAAATAACCCCCTTGCAGTTCAACAGGCTTATGCAAGGGTTGCTCGTATGTTGGACGAAAAGGCTGGCGGTATTCCAGCAACTAACTTCGTAACCGGCCAGCAGTGGGATCAGCCAAATGTCTGGCCCCCATTGCAGCATGTTCTAATGGAGGGTTTGCTTAACACCCCCCCCACATTTGGTGAGGCTGATCCAGCCTATCAGTCCGTTAGGGCTTTAGCTTTAAGATTAGCTCAGCGTTATCTTGATTCTACTTTCTGTACATGGTATGCAACGGGCGGTTCCACTTCTCAAACACCTCAGTTACAAGGTGTCGCTCCTGGCGCTGAAGGAATTATGTTTGAGAAGTACGCCGACAACTCTACAAATGTCGCCGGTTCAGGTGGAGAATATGAGGTGGTTGAGGGTTTCGGCTGGTCCAATGGAGTCCTAATTTGGGCAGCAGATGTCTTCGGTGCTCAGTTAAAGAGACCTGAGTGCGGCAACATTACTGCCGCCCACACCTCTGGTTCAGGTGCACAGAAGAGATCTGGAGGTAGTCTAGCAAGACGAGCTGTCGAACTTGATCCATGGGACGCTGCCTGGACGAAGATGCTTGGTAGGTCAGCCTTGAAAAAGAGAGAAGACGTGAGAAAAAGATGGCTGCTGGCTGCCTAAGCGGCCGC

Tre37-2氨基酸序列（SEQ ID NO .6）：

tre37-3核苷酸序列（SEQ ID NO .7）：有下划线的碱基为限制性酶切位点

GAATTCATGGCTCCTAGATCTTTCGTTGCTACTGCTGCATTGGCCGGTTTGATTTCATCTGCCTCAGCCTTGTACATTAATGGTTCAGTGACTGCCCCATGTGACTCCCCTTTGTATTGCCACGGTGAGATTTTGAAGGCCATTGAGTTGGCTCATCCATTCACAGACTCTAAGACCTTCGTTGACATGCCTACTATCCGTCCATTGGATGAGGTCATCGCTGCTTTTAACCGATTGTCCCAGCCTTTATCCAATAACTCTGAATTGAACGCATTCCTTGCTGCTAATTTCGCACCAGCTGGTGGAGAACTTGAAGCTGTCCCACGTGATCAATTGCATACTGAACCTTCATTCTTGAACAAGTTGGACGACACAGTTATTAAAGAGTTTGTGGCTAAGGTTATTGACATATGGCCAGACCTTACGCGAAGGTATGGCGGACCTGGTAACTGTACGGCCTGTGCTAATAGTTTCATACCTGTTAATCGTACTTTTGTAGTTGCCGGTGGTAGATTCAGGGAACCTTATTACTGGGACTCTTATTGGATATTGGAAGGACTGCTGAGGACTGGTGGTGCCTTTACCGAAATTTCTAAGAATATCATTGAAAACTTTTTGGATTTTGTTGAAACAATTGGTTTTATTCCAAATGGTGCCCGTATTTATTACCTTGACAGATTGCAGCCACCTCTTTTAGCAAGAATGGTGCGTTCCTACGTTGATTATACTAACGACACTTCTATTCTGGATAGAGCCCTACCCTTACTGATAAAGGAACACGAGTTTTGGTCTACTAACCGTTCAGTTTCTATTAAGGCACCTAACGGTAAGACCTACACACTTAACAGATACTACGTGAATAACAATCAACCAAGACCTGAGTCCTTCAGAGAGGATTACATAACGGCTAACAACGGTTCCTACTACGCTGCCTCTGGTATCATATACCCTGTGAATACGCCTCTAAACGATACCGAGAAGGCTGAACTTTATGCCAACTTGGCTTCTGGTGCTGAAACCGGATGGGACTACTCAACCAGATGGCTGAAAAACCCCAATGACGCTGCAAAAGAAATATATTTCCCTCTGAGATCTCTTAACGTGAGGGGCACCGTTCCTGTCGACTTGAAATCTATTCTTTACGAGAACGAGGTGATAATTAGTCAATACCTAAAGAGAGCAGGCAACAATTCTGAGGCTGAGAGATGGGCTTATGCCGCAAGTCAAAGATCCGACGCCATGTTCGAACTAATGTGGAACGCCACTCAATGGTCTTATTTTGATTACAACCTAACTTCTAACTCTCAGAGGATTTTTGTTCCTGTTGATGACGACGCTACTGCTGCTGAGAGAGCTGGTGCTCCAAGGGGACAGCAAGTATTGTTTAACATTGGACAATTCTATCCATTTTGGACGGGTGCCGCTCCCGCTCAATTGAAAAATAACCCCCTTGCAGTTCAACAGGCTTATGCAAGGGTTGCTCGTATGTTGGACGAAAAGGCTGGCGGTATTCCAGCAACTAACTTCGTAACCGGCCAGCAGTGGGATCAGCCAAATGTCTGGCCCCCATTGCAGCATGTTCTAATGGAGGGTTTGCTTAACACCCCCCCCACATTTGGTGAGGCTGATCCAGCCTATCAGTCCGTTAGGGCTTTAGCTTTAAGATTAGCTCAGCGTTATCTTGATTCTACTTTCTGTACATGGTATGCAACGGGCGGTTCCACTTCTCAAACACCTCAGTTACAAGGTGTCGCTCCTGGCGCTGAAGGAATTATGTTTGAGAAGTACGCCGACAACTCTACAAATGTCGCCGGTTCAGGTGGAGAATATGAGGTGGTTGAGGGTTTCGGCTGGTCCAATGGAGTCCTAATTTGGGCAGCAGATGTCTTCGGTGCTCAGTTAAAGAGACCTGAGTGCGGCAACATTACTGCCGCCCACACCTCTGGTTCAGGTGCACAGAAGAGATCTGGAGGTAGTCTAGCAAGACGAGCTGTCGAACTTGATCCATGGGACGCTGCCTGGACGAAGATGCTTGGTAGGTCAGCCTTGAAAAAGAGAGAAGACGTGAGAAAAAGATGGCTGCTGGCTGCCTAAGCGGCCGC

Tre37-3氨基酸序列（SEQ ID NO .8）：

实施例3 海藻糖酶表达工程菌株构建

重组质粒构建：将实施例1中的野生型基因和实施例2中合成的基因用EcoRI/NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳，回收合成的基因片段。与同样酶切的质粒pPIC9连接。连接反应体系：DNA片段10μL，10x连接缓冲液2μl，T4DNA连接酶1μL，EcoRI/NotI双酶切的pPIC9质粒1μL，灭菌ddH₂O6μL。混匀，16℃水浴12hr以上。

连接产物转化大肠杆菌：大肠杆菌Top10感受态细胞购自北京擎科生物技术公司。将上述连接产物10μl与100μl感受态细胞混匀，置于冰上25min，42℃热激90s，加入500μlLB液体培养基（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl），37℃恢复培养3hr。涂布含100μg/mlAMP抗生素的LB平板上（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl、1.5%琼脂），37℃培养12hr以上。挑取单菌落划线培养，鉴定重组质粒。重组质粒命名为pPIC-tre37、pPIC-tre37-1、pPIC-tre37-2、pPIC-tre37-3。对重组质粒进行序列测定，分析序列连接是否正确。

重组质粒线性化：质粒10μL（约10μg）、SacI限制性内切酶5μL、10x酶切缓冲液10μL、灭菌水75μL，37℃水浴酶切12h以上。用DNA纯化试剂盒（Omega公司产品）纯化酶切产物，然后真空抽干，溶解于10μL灭菌水中。

毕赤酵母GS115菌株感受态细胞制备：接种GS115单菌落于YPD液体培养基中，28℃振荡培养12h，按0.1%比例转接50mLYPD，继续振荡培养12h。40℃、5000rpm离心5min收集菌体，用30mL冰冷的灭菌水洗涤菌体2-3次，然后用1mol/L山梨醇1mL悬浮菌体，即为GS115感受态细胞。

重组菌株构建：将线性化的质粒DNA10μL与冰冷的80μLGS115感受态细胞混合，放在电击杯中，置于冰上5min，用电击仪进行电击（电击条件：2000V，5mS），然后快速加入1mL冰冷的1mol/L山梨醇溶液，30℃静置恢复培养2~3h。然后涂布MD培养基（13.4g/LYNB、0.4mg/L生物素、20g/L葡萄糖、15g/L琼脂）平板，28℃培养3~4d。所获得重组菌株编号为：GS115/tre37、GS115/tre37-1、GS115/tre37-2、GS115/tre37-3。

实施例4 摇瓶发酵、诱导表达、酶活测定

挑上述重组菌株单菌落接种于5mLYPD液体培养基中，28℃、220rpm振荡培养12h，按照0.1%比例转接20mLBMGY培养基（每100mL中含有1mol/L磷酸钾缓冲液（pH6.0）10mL，酵母提取物1g，蛋白胨2g，10×YNB10mL，500×biotin200μL，甘油1g），继续28℃、220rpm振荡培养24h。4℃、5000rpm立项10min收集菌体，用灭菌水洗涤1-2次，然后用BMMY培养基（每100mL中含有1mol/L磷酸钾缓冲液（pH6.0）10mL，酵母提取物1g，蛋白胨2g，10×YNB10mL，500×生物素200μL，甲醇0.5%）悬浮，使OD600约为1.0，置于灭菌三角瓶中，继续在28℃、220rpm振荡培养96h。每隔24h取样，测酶活，并补加终浓度为0.5%的甲醇。

采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定海藻糖酶分解海藻糖产生的葡萄糖含量。取2mLEppendorf管，依次加入150μL稀释后的粗酶液和150μL10%的可溶性海藻糖底物做为实验组；依次加入150μL稀释后的酶液和150μLpH6．5的磷酸缓冲液，37℃反应5min作为对照组。实验组和对照组各加入0.30mL的DNS试剂，沸水浴5min终止反应，取出置于冰水混合物中冰浴2min。取200μL混合液在540nm测定其吸光度值。

准确称取1.0g干燥至恒重的无水葡萄糖，溶于去离子水中，并定容至100mL，即为10.0mg/mL的葡萄糖标准液，按照表1配制不同浓度的葡萄糖液，加入0.30mL的DNS试剂，沸水浴5min，540nm测定其吸光度值，制成葡萄糖标准曲线。对照组以pH6.5PBS缓冲液代替葡萄糖标准液。酶活计算方法：酶活定义为在上述实验条件下，1mL的酶液每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量，为1个酶活单位（U），测定均重复3次。

表1 海藻糖酶酶活测定标准曲线制作

管号	标准溶液/mL	蒸馏水/mL	葡萄糖浓度/(mg/mL)	DNS试剂/mL
					0	0.00	1.00	0.0	0.30
1	0.10	0.90	1.0	0.30
					2	0.30	0.70	3.0	0.30
3	0.50	0.50	5.0	0.30
					4	0.70	0.30	7.0	0.30
5	0.90	0.10	9.0	0.30
					6	1.00	0.00	10.0	0.30

重组菌株GS115/tre37、GS115/tre37-1、GS115/tre37-2和GS115/tre37-3摇瓶发酵，甲醇诱导96h后，酶活分别达到48.2U/mL、92.7U/mL、146.4U/mL和125.1U/mL，GS115/tre37-2的发酵活力最高。

实施例5 重组海藻糖酶的最适催化温度和最适催化pH值

选择实施例4中发酵活力最高的重组菌株GS115/tre37-2配制反应体系，在20~80℃区间测定酶的活性，以最高活性为100%相对活性，其他各温度的活性与之相比较，做图，结果如图2所示；将酶液和底物分别用不同pH值的缓冲液稀释，测定pH对酶活性的影响，以最高活性为100%相对活性，其他pH条件下的活性与之相比较，作图，结果如图3所示。注：测定温度对酶活影响的时候，pH值固定为5.5；测定pH值对酶活影响的时候，温度固定为60℃，其他反应条件如实施例4所示。

结果可知：随着温度的升高，重组海藻糖酶的催化活性逐渐增加，到60℃时催化活性最高，基本达到100%，但是60℃以后，随着温度的继续升高，催化活性开始降低，所以60℃左右是重组海藻糖酶的最适催化温度。同样的，随着pH值的增加，重组海藻糖酶的催化活性逐渐增加，到pH值为5.5时催化活性最高，接近100%，但是5.5以后，随着pH值的继续增加，催化活性开始降低，所以5.5是重组海藻糖酶的最适催化pH值。

实施例6 重组海藻糖酶降解海藻糖活性研究

海藻糖购自阿拉丁公司（货号：T100010）。用pH值为5.5的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液配制10%的海藻糖溶液，每支试管加入10mL海藻糖溶液，置于60℃水浴中预热5min。加入重组海藻糖酶tre37-2，使酶的终浓度分别为5U/mL和15U/mL，立即混匀，计时。每5min，取样测定海藻糖的降解率，绘制不同酶浓度下，海藻糖的降解曲线如图4所示。

结果可知：随着时间的推移，海藻糖无论使用5U/mL的重组海藻糖酶降解，还是使用15U/mL的重组海藻糖酶降解，降解率都逐渐增加，其中使用15U/mL重组海藻糖酶的降解速度更快，降解率更高，降解30min左右即使海藻糖的降解率达到99.1%，使用5U/mL得重组海藻糖酶的降解速度较慢，降解率较低，但是降解40min左右也能使海藻糖的降解率达到87.4%。

本申请中其他重组海藻糖酶海藻糖降解活性也十分优异。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种海藻糖酶基因tre37，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

2.一种重组海藻糖酶基因tre37-1，其特征在于，由权利要求1所述的海藻糖酶基因tre37优化获得，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。

3.一种重组海藻糖酶基因tre37-2，其特征在于，由权利要求1所述的海藻糖酶基因tre37优化获得，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示。

4.一种重组海藻糖酶基因tre37-3，其特征在于，由权利要求1所述的海藻糖酶基因tre37优化获得，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示。

5.一种载体，其特征在于，含有权利要求1所述的海藻糖酶基因tre37或权利要求2所述的重组海藻糖酶基因tre37-1或权利要求3所述的重组海藻糖酶基因tre37-2或权利要求4所述的重组海藻糖酶基因tre37-3。

6.一种细胞，其特征在于，含有权利要求5所述的载体。

7.权利要求5所述的载体或权利要求6所述的细胞在发酵生产中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用具体为在乙醇发酵生产中的应用。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用具体为在氨基酸发酵生产中的应用。