CN115820714A - 一种提高多聚半乳糖醛酸酶分泌的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高多聚半乳糖醛酸酶分泌的基因工程菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明提供了一种与多聚半乳糖醛酸酶分泌相关的基因Km_JEN1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过对该基因的功能验证，Km_JEN1基因具有促进多聚半乳糖醛酸酶分泌的作用。本发明对马克思克鲁维酵母进行基因工程改造，获得Km_JEN1过表达的基因工程菌，该菌株分泌多聚半乳糖醛酸酶的量是对照的1.32倍，本发明为蛋白分泌系统优化提供理论基础和相关基因。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及构建一种提高多聚半乳糖醛酸酶分泌的基因工程菌及该菌株的应用。
背景技术
果胶是一类广泛存在于植物细胞壁的初生壁和细胞中间片层中的杂多糖，伴随纤维素而存在，构成相邻细胞中间层粘结物，使植物组织细胞紧紧黏结在一起。果胶大量存在于柑橘、柠檬、柚子等果皮中，在水果加工的废弃物以及排放水中果胶含量高，果胶中的COD含量高，且具有很高的粘性，因此需要对这些废弃物以及排放水进行处理以满足排放要求。目前果胶处理的方法中利用果胶酶处理可以达到很好的效果，不仅对能源的消耗，废弃物的排放有重要的作用，还可以给社会带来巨大的经济效益。
从细菌到高等真核生物的各种宿主都会产生异源蛋白，利用模式生物如细菌、酵母、动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白是蛋白表达的分子生物学技术，在基因工程技术中占有核心地位。原核表达蛋白系统在蛋白分子的转译后修饰及折叠等功能上，相较于真核生物粗陋。酵母为真核单细胞真菌，酵母蛋白表达系统具有表达量高，可诱导，糖基化机制接近高等真核生物，分泌蛋白易纯化，易实现高密发酵等优点。然而，酵母中异源蛋白的分泌表达通常被限制在相对较低的水平，所以对分泌蛋白进行分子工程以优化其分泌途径是特别困难且至关重要的。
马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)是一种食品安全级酵母，具有生长周期短、耐高温等优点。马克斯克鲁维酵母具有内源性的多聚半乳糖醛酸水解酶，多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)是一种解旋酶，属于糖苷水解酶第28家族(GH28)，是可分解果胶或果胶酸酶类中的一种，可水解果胶中的主要成分多聚半乳糖醛酸生成寡聚半乳糖醛酸。马克斯克鲁维酵母是一种生产多聚半乳糖醛酸水解酶的理想宿主。但是马克斯克鲁维酵母同样存在内源性果胶酶分泌水平低的问题，需要对马克斯克鲁维酵母进行分子工程改造以优化其分泌途径提高果胶酶的分泌量。
目前提高异源蛋白表达主要有两种途径，第一是提高异源蛋白的表达量，可以通过提高基因拷贝数和优化密码子等方式，第二是增强异源蛋白的分泌途径，可以通过对分泌途径相关的关键基因进行调控从而提高蛋白的分泌效率。酵母利用高度保守的运输机制传递新合成的分泌蛋白，从核糖体合成后，分泌蛋白首先被转移到内质网中进行折叠和修饰，然后将这些蛋白输送到到高尔基体进行进一步的修饰，随后通过质膜分泌到细胞外。
因此，通过对马克斯克鲁维酵母转录水平分析，挖掘与多聚半乳糖醛酸水解酶分泌相关基因，探究酵母蛋白分泌机制，构建提高多聚半乳糖醛酸水解酶分泌的基因工程菌对蛋白酶开发具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于通过对马克斯克鲁维酵母转录水平分析，筛选出与跨膜运输相关的基因，对关键基因进行调控从而筛选能提高多聚半乳糖醛酸酶分泌的基因。通过基因工程改造构建一种提高多聚半乳糖醛酸酶分泌的基因工程菌，应用到酶制剂开发。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明通过对马克斯克鲁维酵母和敲除多聚半乳糖醛酸酶菌株的转录组测序分析，筛选了一个与蛋白分泌关键基因Km_JEN1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该基因在野生型菌株中的相对表达水平是敲除处理菌株的3.8倍。通过分子生物学手段将该基因克隆，构建载体并转入马克斯克鲁维酵母菌株中，结果显示转入该基因的菌株分泌的多聚半乳糖醛酸酶的量显著提升，表明Km_JEN1基因具有促进酶分泌的作用。
因此，本发明提供了Km_JEN1基因在促进酵母分泌多聚半乳糖醛酸酶中的应用，所述Km_JEN1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
进一步的，所述应用包括：以酵母为出发菌，利用生物学技术手段在基因组中插入含有Km_JEN1基因的过表达模块或者在宿主菌中导入含有Km_JEN1基因的重组表达质粒，获得功能性获得的基因工程菌。
所述酵母具有表达内源性多聚半乳糖醛酸酶的功能。进一步的，所述酵母为马克思克鲁维酵母。
进一步的，重组表达质粒的原始质粒为pIW1146载体。pIW1146载体为公众可获得材料，参见文献(CRISPR-mediated multigene integration enables Shikimate pathwayrefactoring for enhanced 2-phenylethanol biosynthesis in Kluyveromycesmarxianus[J].Biotechnology for Biofuels,2021,14(1).)。
进一步的，所述基因工程菌采用SD培养基进行发酵培养。研究发现，马克思克鲁维酵母在SD培养基中培养可以分泌多聚半乳糖醛酸水解酶到胞外。SD培养基的组成包括：酵母基础氮源(无氨基酸和硫酸铵)、氨基酸核苷酸混合物、葡萄糖。
本发明还提供了一种提高多聚半乳糖醛酸酶分泌的基因工程菌，所述基因工程菌以马克思克鲁维酵母为出发菌，基因工程菌中具有包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的Km_JEN1基因的过表达模块。
所述过表达模块中Km_JEN1基因上游具有过表达启动子，可以采用PGPD、PTEF等启动子。
进一步的，所述基因工程中含有包含Km_JEN1基因的重组表达质粒，所述重组表达质粒的原始载体为pIW1146载体，所述Km_JEN1基因替换了原始载体中的GFP基因。pIW1146载体中具有GPD启动子和CYC1终止子。
本发明还提供了一种构建所述基因工程的方法，所述方法包括：以马克思克鲁维酵母为出发菌，利用生物学技术手段在基因组中插入含有Km_JEN1基因的过表达模块或者在宿主菌中导入含有Km_JEN1基因的重组表达质粒。
进一步的，本发明提供了一种利用双酶切去除pIW1146载体中的GFP基因，再利用无缝克隆的方法将Km_JEN1基因片段与载体连接，构建获得重组表达载体pIW1146-Km_JEN1，再转入马克思克鲁维酵母构建基因工程菌的方法。
本发明还提供了所述的基因工程菌在制备多聚半乳糖醛酸酶制剂中的应用。
进一步的，所述应用包括：所述应用包括：将扩大培养后的基因工程菌接种于SD液体培养基中发酵培养，收集发酵液，从发酵液中分离获得多聚半乳糖醛酸酶。针对包含重组表达载体pIW1146-Km_JEN1的基因工程菌，发酵培养采用缺乏组氨酸的SD培养基。
所述发酵培养包括：基因工程菌接种于SD培养基的初始OD600值约为0.05～1，在30～37℃、200～220rpm条件下培养至OD600值为6-7。
本发明具备的有益效果：
(1)本发明提供了一种与多聚半乳糖醛酸酶分泌相关的基因Km_JEN1，通过对该基因的功能验证显示该基因具有促进多聚半乳糖醛酸酶分泌的作用，为蛋白分泌系统优化提供理论基础和相关基因。
(2)本发明对马克思克鲁维酵母进行基因工程改造，获得Km_JEN1过表达的基因工程菌，该菌株分泌多聚半乳糖醛酸酶的量是对照的1.32倍，对于蛋白酶制剂的开发具有重要意义。
附图说明
图1为转录组测序结果显示的Km_JEN1在对照菌株(Km)和敲除多聚半乳糖醛酸酶菌株(Km_ΔPG)中的相对表达量。
图2为Km_JEN1的蛋白结构中跨膜结构区的预测。
图3为Km_JEN1的克隆结果，M为DNA marker，泳道1为PCR产物。
图4为SDS-PAGE结果，其中control为野生型菌株，Km_JEN1为转入Km_JEN1基因质粒的工程菌株，Km_ΔPG为敲除多聚半乳糖醛酸酶菌株，下同。
图5为imageJ的相对灰度值分析。
图6为PG的相对酶活。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
菌株马克斯克鲁维酵母CBS6556购自宁波明舟生物科技有限公司。
敲除多聚半乳糖醛酸酶菌株(Km_ΔPG)构建：利用CRISPR-Cas9技术将多聚半乳糖醛酸酶基因从马克斯克鲁维酵母CBS6556基因组上完全敲除。多聚半乳糖醛酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
菌株培养基：YPD培养基：10g/L酵母提取物(oxoid公司)，20g/L蛋白胨(oxoid公司)，20g/L葡萄糖(coolaber公司)。
SD培养基：1.7g/L BD Difco TM酵母氮源基础无氨基酸和硫酸铵(BD公司)，氨基酸混合物(包含核苷酸)(coolaber公司)，20g/L葡萄糖(coolaber公司)。
SD-His培养基为上述SD培养基基础上缺少组氨酸。
实施例1
转录组测序样本：用SD培养基培养马克斯克鲁维酵母CBS6556(对照菌株)与敲除多聚半乳糖醛酸酶菌株Km_ΔPG，选取8h的酵母菌为对数期样本，14h的酵母菌为平台期样本。
分别对上述对数期样本、平台期样本进行转录组测序，通过分析转录组数据筛选出差异显著的与跨膜运输相关的基因。
转录组测序结果显示，与对照菌株相比，在对数期，共有449个基因表现为差异表达基因，其中有313个基因在Km_ΔPG中下调，有136个基因表现为上调。同时，在平台期，共有177个基因为差异基因，其中63个基因为下调基因，114个基因为上调基因。多聚半乳糖醛酸酶为分泌蛋白，因此主要针对平台期的差异表达基因进行筛选分析。
根据差异基因GO富集分析，分为分子功能(Molecular function)、生物过程(Biological Process)和细胞组成(Cellular Component)三个部分。我们主要从富集最显著的30个GO term(每个部分都有10个term)里筛选我们所需要的关键基因。因为我们所研究的是分泌蛋白，所以主要分析与转运过程相关的蛋白，包括膜组分蛋白，与运输相关的蛋白，与胞吞胞吐过程相关的蛋白。其中在生物过程(Biological Process)中，有13个差异基因被富集到跨膜转运过程(transmembrane transport)，16个差异基因富集到运输过程(transport)；在细胞组成(Cellular Component)中，有13个差异基因被注释为是与膜(membrane)相关的基因，2个基因与细胞外围(cell periphery)相关，6个基因与膜整体组分(integral component of membrane)相关，6个基因与膜的固有成分(intrinsiccomponent of membrane)相关，1个基因与核膜(nuclear envelope)相关，7个基因与膜部分(membrane part)相关，1个基因与细胞膜(plasma membrane)相关，1个基因与细胞质囊(cytoplasmic vesicle)相关，1个基因与囊泡(vesicle)相关，1个基因与细胞质囊泡部分(cytoplasmic vesicle part)相关；在分子功能(Molecular function)中，有8个差异基因与跨膜转运蛋白活性(transmembrane transporter activity)有关，8个基因与转运活性(transporter activity)有关，2个基因与金属离子跨膜转运活性(metal iontransmembrane transporter activity)有关。
结合GO富集结果，发现Km_JEN1基因不仅是膜组分相关蛋白，还与跨膜转运过程相关，因此针对Km_JEN1基因进行试验验证。Km_JEN1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
转录组测序结果显示对照菌株的Km_JEN1的相对表达量是处理组Km_ΔPG的3.8倍，见图1。
通过HMMER网站的hmmscan(https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscan)对Km_JEN1蛋白的功能结构域进行预测分析，结果显示Km_JEN1蛋白具有12个跨膜结构区(Transmembrane)，分别在以下氨基酸位置：139-157位，177-199位，206-225位，231-252位，264-286位，298-317位，365-384位，404-422位，434-452位，458-479位，491-511位，537-556位，见图2。
实施例2
1、针对转录组数据结果筛选出的关键基因，我们提取了马克斯克鲁维酵母CBS6556的基因组(使用天根酵母基因组DNA提取试剂盒提取)并克隆了Km_JEN1基因。
设计PCR引物，序列(5’-3’)如下：Km_JEN1_F：agaactagtggatcccccgggATGTCAGAAGGAAACGAAGAAAAAG；Km_JEN1_R：taactaattacatgactcgagCTAAGCGTTCTCGACTTGTTCTTCC。
PCR反应体系(50μL)：2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTP Mix(10mM)1μL，上下游引物(10μM)2μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL，模板DNA 50-400ng，ddH2O补齐。
PCR反应程序：95℃3min，95℃15sec，56-72℃15sec，72℃1min/kb，35个循环，72℃5min。
PCR产物进行凝胶电泳检测，结果如图3所示。
2、构建重组表达质粒，质粒载体采用pIW1146载体框架(Li M,Lang X,Cabrera MM,et al.CRISPR-mediated multigene integration enables Shikimate pathwayrefactoring for enhanced 2-phenylethanol biosynthesis in Kluyveromycesmarxianus[J].Biotechnology for Biofuels,2021,14(1).)，该载体由pIW 578改造得到，其中含有GPD启动子序列、GFP编码基因、CYC1终止子序列。
先将载体用酶切的方法将GFP基因切除，后利用无缝克隆的方法将Km_JEN1构建至pIW1146载体，随后将质粒转染至酵母菌中，构建成新的菌株。空载质粒的构建则是将GFP去除。
其中转染方法如下：将原始菌株于2mL YPD培养基中在30℃培养箱摇16h，取1mL菌体5000×g离心1min，倒掉上清液，用1mL ddH2O洗涤两次后，加入500μL的转染buffer(40％3350PEG，0.1M LiAc，10mM pH7.5的Tris-HCl，1mM EDTA，10mM DTT)，10μL salmon spermDNA，1μg质粒，常温放置15min，47℃热激15min，5000×g离心1min，用500μL选择培养基(SD-His培养基)重悬，随后吸50μL于2mL的选择培养基振荡培养24-48h，最后涂布于选择培养基固体培养基板上，获得阳性克隆。阳性克隆送公司测序，测序正确的单克隆进行扩繁，菌液保存。
实施例3
将实施例2构建的转入Km_JEN1基因质粒的工程菌活化后接种于2ml的SD-His液体培养基中，30℃，220rpm条件下培养17h后测OD600，再接种于25mL SD-His液体培养基的摇瓶中(初始OD600都为0.05)，30℃，220rpm条件下培养20h，取2mL菌液离心，取上清液至浓缩管中，离心最后浓缩至180μL(期间用PBS缓冲液洗两次)。利用SDS-PAGE进行蛋白分析，并用imageJ分析其灰度值。
结果如图4和图5所示，敲除多聚半乳糖醛酸酶菌株Km_ΔPG没有目的蛋白条带，表明野生型菌株和重组菌株分泌到胞外的蛋白为多聚半乳糖醛酸酶。与对照(马克斯克鲁维酵母CBS6556)相比，重组菌株分泌的多聚半乳糖醛酸酶的量是对照的1.32倍。
酶活的测定：取上述浓缩管中蛋白溶液100μL，与900μL果胶溶液(2g/L)混合，在50℃培养5min，加入4mL DNS溶液(100mL DNS溶液包含80mL 0.5M NaOH，1g DNS，30g酒石酸钾钠)，100℃反应10min，立即放于冰上，测540nm下的吸光值。结果如图6所示，重组菌株组的相对酶活是对照的1.4倍，与酶量一致，证明过表达Km_JEN1对多聚半乳糖醛酸酶的分泌起促进作用。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.Km_JEN1基因在促进酵母分泌多聚半乳糖醛酸酶中的应用，其特征在于，所述Km_JEN1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Km_JEN1基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：以酵母为出发菌，利用生物学技术手段在基因组中插入含有Km_JEN1基因的过表达模块或者在宿主菌中导入含有Km_JEN1基因的重组表达质粒，获得功能性获得的基因工程菌。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述酵母为马克思克鲁维酵母。
5.如权利利要求4所述的应用，其特征在于，重组表达质粒的原始质粒为pIW1146载体。
6.一种提高多聚半乳糖醛酸酶分泌的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以马克思克鲁维酵母为出发菌，基因工程菌中具有包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的Km_JEN1基因的过表达模块。
7.如权利要求6所述的提高多聚半乳糖醛酸酶分泌的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程中含有包含Km_JEN1基因的重组表达质粒，所述重组表达质粒的原始载体为pIW1146载体，所述Km_JEN1基因替换了原始载体中的GFP基因。
8.如权利要求6所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括：以马克思克鲁维酵母为出发菌，利用生物学技术手段在基因组中插入含有Km_JEN1基因的过表达模块或者在宿主菌中导入含有Km_JEN1基因的重组表达质粒。
9.如权利要求6或7所述的基因工程菌在制备多聚半乳糖醛酸酶制剂中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括：所述应用包括：将扩大培养后的基因工程菌接种于SD液体培养基中发酵培养，收集发酵液，从发酵液中分离获得多聚半乳糖醛酸酶。
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