CN106191083B

CN106191083B - 一种比酶活提高的木聚糖酶突变体及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN106191083B
Application number: CN201610570895.1A
Authority: CN
Inventors: 张桂敏; 卢毅宏; 王钦宏; 周玉玲; 马延和
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2016-07-19
Filing date: 2016-07-19
Publication date: 2019-05-10
Anticipated expiration: 2036-07-19
Also published as: CN106191083A

Abstract

本发明涉及一种比酶活提高的木聚糖酶突变体及其编码基因与应用。木聚糖酶突变体，包括(a)、(b)或(c)所示的蛋白质；(a)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有木聚糖酶活性的由(a)衍生的蛋白质；(c)编码(a)的核苷酸序列和编码(b)的核苷酸序列经分子杂交后编码出的并且具有木聚糖酶活性氨基酸序列组成的蛋白质。本发明所述的木聚糖酶突变体比酶活提高了2.8倍，可以用于降解木聚糖底物，具有作用温度和pH范围广，具有良好的耐酸耐碱性条件能力等优点。

Description

一种比酶活提高的木聚糖酶突变体及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种比酶活提高的木聚糖酶突变体及其编码基因与应用。

背景技术

木聚糖酶可以广泛应用在酿造、饲料、造纸纸浆、食品、纺织、能源等工业中。木聚糖酶(xylanase)是指可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一组酶的总称，主要包括外切β-1,4-木聚糖酶、内切β-1,4-木聚糖酶和β-木糖苷酶。木聚糖酶可以将饲料的非淀粉多糖(NSPS)分解成较小聚合度的低聚木糖，从而改善饲料性能，消除或降低非淀粉多糖在动物肠胃中因粘度较大而引起的抗营养作用。同时它可以破坏植物细胞壁的结构，提高内源性消化酶的活性，提高饲料养分的利用。在造纸工业中，用木聚糖酶预处理原料可大幅度降低原料中的半纤维素木聚糖的含量，可有效溶解部分酶解产物和少量木质素组分，由于结构更加疏松各种漂白试剂也可更好地渗入纸浆纤维内，从而大幅度降低漂白试剂的用量，具有较大的环境效益和社会效益。在食品烘焙行业，木聚糖酶能够降解面粉中的半纤维素，烘焙时，添加木聚糖酶能够加强面粉弹性使面团松软的同时更易揉捏，改善体积和口感，此外，适当的木聚糖酶还能对面筋网格结构进行优化，从而延缓小麦食品的老化从而延长货架期。

但是，目前使用的木聚糖酶存在比酶活低、不稳定、成本高，不能满足生产需要等问题，因此需要通过分子改造进行性质优化。

发明内容

鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种比酶活提高的木聚糖酶突变体及其编码基因与应用，本发明提供的木聚糖酶突变体具有比酶活高、作用温度和pH范围广、具有良好的耐酸耐碱性以及生产成本低等优点。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种比酶活提高的木聚糖酶突变体，包括(a)、(b)或(c)所示的蛋白质；

(a)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有木聚糖酶活性的由(a)衍生的蛋白质；

(c)编码(a)的核苷酸序列和编码(b)的核苷酸序列经分子杂交后编码出的并且具有木聚糖酶活性氨基酸序列组成的蛋白质。

上述分子杂交的条件可以为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

在具体的使用过程中为了方便蛋白质的纯化，可以在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上标签序列、标记序列或者其他对木聚糖酶活性无影响或影响不大的序列。

上述的蛋白可以人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

本发明的有益效果是：发明人在研究中发现，具有上述序列的蛋白质，具有比酶活高、作用温度和pH范围广、具有良好的耐酸耐碱性以及生产成本低等优点。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述比酶活提高的木聚糖酶突变体的氨基酸序列是以xynHBN3基因编码的氨基酸序列为出发序列的突变序列，将xynHBN3基因编码的氨基酸序列的第42位天冬酰胺N突变为天冬氨酸D，第149位苏氨酸T突变为丝氨酸S,具体为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

在具体制备时，可以采用定点突变、随机突变或者人工合成等方法制备突变体。

本发明还提供一种编码上述的木聚糖酶突变体的编码基因。由于基因的多态性，编码同一蛋白质的核苷酸序列可能有多条，任意一条能够编码上述木聚糖酶的核苷酸序列均在本发明的保护范围内。

进一步，包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。优选地，所述编码基因为SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。

本发明还提供一种包括上述的比酶活提高的木聚糖酶突变体的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

重组载体既可以是表达载体也可以是克隆载体。

在构建重组表达载体时，可以用现有的表达载体或者将现有的表达载体改造后用于构建含有所述基因的重组表达载体。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的所述的木聚糖酶突变体的编码基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

进一步，将编码上述的木聚糖酶突变体的编码基因插入到出发载体的多克隆位点处获得的重组载体。

本发明还提供一种木聚糖酶突变体的生产方法,操作为：培养包括上述的木聚糖酶突变体的重组菌。

后续的过程可以根据使用的要求进行设置，例如，如果纯度要求较高，可以进行木聚糖酶突变体的纯化等操作。

本发明还提供一种上述的木聚糖酶突变体在降解木聚糖中的应用。可以广泛应用于酿造、饲料、造纸纸浆、食品、纺织、能源等工业中。

本发明还提供一种利用上述的木聚糖酶突变体降解木聚糖的方法，包括以下步骤：收集含有上述的木聚糖酶突变体的溶液作用于含有木聚糖的溶液，进行降解，降解的条件为：温度为30℃-60℃，pH为5.5-9.0。优选地，降解的条件为：温度为45-55℃，pH为7.5。

采用上述方案的有益效果为：本发明所述的木聚糖酶突变体在30-60℃之间时，相对酶活均在60％以上，尤其是45-55℃相对酶活高于90％。本发明所述的木聚糖酶从pH5.5到pH 9.0都维持50％左右及以上活性，最适反应pH为7.5，具有良好的耐酸耐碱性条件能力。

附图说明

图1为大肠杆菌摇瓶培养复筛菌株破菌上清的结果；标记1为XynHBN3大肠杆菌破菌上清；标记2为XynHBN3217大肠杆菌破菌上清；标记3为XynHBN3大肠杆菌HIS纯化条带；标记4为XynHBN3217大肠杆菌HIS纯化条带。

图2为木聚糖酶xynHBN3217的DNA测序结果与xynHBN3的DNA序列比较的结果，其中Query为xynHBN3217基因序列，Sbjct为xynHBN3基因序列。

图3为木聚糖酶XynHBN3217最适反应温度的检测结果。

图4为木聚糖酶XynHBN3最适反应温度的检测结果。

图5为木聚糖酶XynHBN3217为60℃条件下热稳定性的检测结果。

图6为木聚糖酶XynHBN3217最适pH值的检测结果。

图7为木聚糖酶XynHBN3最适pH值的检测结果。

图8为木聚糖酶XynHBN3217的pH稳定性的检测结果。

图9为木聚糖酶XynHBN3的pH稳定性的检测结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明所述的材料和试剂等若无特别说明均可以通过市购或常规方法制备。

本发明所述的实验方法若如无特殊说明，均为常规方法。

发明人从前期工作获得的突变体XynHBN3编码基因出发，通过随机突变，获得一个木聚糖酶比酶活提高2.8倍的突变体，最适反应温度由50℃提升为55℃，其他性质变化不大。

前期工作获得的突变体XynHBN3已申请了发明专利并获得了授权，专利授权号为ZL200610020049.9,公开号为CN1924002A，专利名称为一种耐热耐碱木聚糖酶酵母工程菌及其耐热木聚糖酶的生产方法，申请人为湖北大学，发明人为张桂敏，马立新。

在本发明中，发明人采用易错PCR的定向进化技术对xynHBN3基因进行随机突变(xynHBN3基因的信息可以参照公开号为CN1924002A的专利文献)，利用突变的PCR产物与载体pET28a(购于美国Novagen公司)构建重组表达质粒，电转入大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞构建突变文库。采用木聚糖酶活性筛选平板观察水解圈的方法过对近2万个重组子的筛选，几轮粗筛后筛选出10个菌株，后进行第二轮摇瓶发酵复筛，菌体经过破菌HIS纯化后得到纯化的重组蛋白测定比酶活，得到一株比酶活提高了2.8倍的木聚糖酶突变体XynHBN3217。测序分析表明木聚糖酶突变体基因xynHBN3217的核苷酸序列突变了4个位点，分别为：第105位A突变为G，第124位A突变为G，第153位A突变为G，第445位A突变为T。造成两个氨基酸突变，分别为：第42位天冬酰胺N突变为天冬氨酸D，第149位苏氨酸T突变为丝氨酸S。

下面通过实施例来具体介绍。

实施例1易错PCR扩增基因xynHBN3

xynHBN3的信息可以参照专利公开号为CN1924002A的专利文献；以质粒pHBM130为模板(工业生物技术湖北省重点实验室保存，可以为公众所获得,该质粒上有木聚糖酶基因，具体信息详见张桂敏博士论文《木聚糖酶基因的克隆、表达与酶学性质研究》)，用引物18N3F(序列为：5’CGCGGATCCGCGGAAACG3’)和18N3R(序列为：5’ACGCGTCGACCTTTTATC3’)进行PCR扩增，引物在基因的上游添加BamH I酶切位点，下游添加Sal I酶切位点，PCR扩增条件为94℃，5min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，45s，30个循环；72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物后，BamHⅠ、SalⅠ双酶切。同时将pET28a质粒载体也采用BamH Ⅰ、Sal Ⅰ双酶切后，采用T4DNA连接酶将载体与片段连接，得到重组质粒pET28a-xynHBN3作为本发明的对照。

以重组质粒pET28a-xynHBN3为模板，用引物18N3F和18N3R进行PCR扩增，在扩增过程中通过改变dNTP浓度、添加Mn²⁺、Mg²⁺等条件引入随机诱变，扩增反应体系如下表：PCR扩增条件：94℃预变性5min；91℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸45s，循环25次，72℃延伸10min。0.7％的琼脂糖电泳跑胶检测PCR产物，溶液回收试剂盒分别回收方案一和方案二的目的条带，得到易错PCR产物。

PCR反应体系采用下面的几种方案：

方案一：

模板xynHBN3质粒(50ng/μL)	2.00μL
		引物18N3F(20μM)	2.50μL
引物18N3R(20μM)	2.50μL
		dATP(10mM)	2.00μL
dCTP(10mM)	2.00μL
		dGTP(10mM)	1.80μL
dTTP(100mM)	1.26μL
		MgCl<sub>2</sub>(50mM)	4.08μL
BSA(0.1μg/μL)	5.00μL
		Ni Taq DNA Polymerase	1.00μL
MnCl<sub>2</sub>(5mM)	10.00μL
		10×PCR Buffer(无Mg<sup>2+</sup>)	10.00μL
ddH<sub>2</sub>O	55.86μL

方案二：

本发明中，引物由南京金斯瑞公司合成；溶液回收试剂盒Plus DNA Clean/Extraction Kit型号DP034P购于GeneMark公司；dATP(货号4026)、dTTP(货号4029)、dCTP(货号4028)、dGTP(货号4027)、BSA、MnCl₂、MgCl₂购自Takara公司；Ni Taq DNA Polymerase、10×PCR Buffer(无Mg²⁺)(货号301101)购自沙船生物科技发展有限公司(天津)。

实施例2突变木聚糖酶重组表达载体的构建

1、双酶切质粒载体与基因片段

取5μg的pET28a载体与5μg易错PCR产物分别用Sal Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切，分5管酶切，每管体系如下：

Sal Ⅰ	3μL
		BamH Ⅰ	3μL
10×digestion buffer	10μL
		易错PCR产物或pET28a载体	1μg
ddH<sub>2</sub>O	Up to 100μL

反应体系置于1.5mL离心管管中，37℃水浴3h，经琼脂糖电泳检测后，将载体与易错PCR产物分别进行胶回收，回收产物要求A260/A230＞2.0，A260/A280≈1.8。

2、重组质粒连接

将双酶切回收后的易错PCR扩增的目的片段(简写为ep-PCR product)、双酶切回收后的pET28a载体(双酶切回收后的pET28a载体片段为5.3kb)，加入10×buffer和T₄DNA连接酶，混匀，16℃过夜连接后溶液回收，用超纯水洗脱，得到酶连接产物，将酶连接产物电转入大肠杆菌电转感受态Rosetta(DE3)。

大肠杆菌Rosetta(DE3)源自Novagen公司。

连接反应体系如下：

双酶切回收后的ep-PCR product	30μL
		双酶切回收后的pET28a载体	10μL
T<sub>4</sub>DNA Ligase	5μL
		10X T<sub>4</sub>DNA Ligase buffer	5μL

大肠杆菌电转化方法包括以下步骤：

吸取1-2μL酶连接产物与制备好的大肠杆菌电转感受态Rosetta(DE3)均匀混合，冰上静止2min，再转入提前冰预冷的1mm电转杯中，选择Bio-Rad电穿孔仪上的大肠杆菌电击参数进行电击。电击完毕后，立即加入200μL冰预冷的NZY培养基将菌体混匀，转至1.5mL离心管中，37℃温育1h后将菌体悬液涂布于LK平板，将平板置于37℃培养。重复操作，获得突变体文库。

本发明中，pET28a质粒购自Novagen公司；Sal Ⅰ、BamH Ⅰ、10×digestion buffer、T₄DNA Ligase、10X T DNA Ligase buffer购自NEB公司。

NZY培养基：1％NZ amine(casein hydrolysate)，0.5％酵母粉，0.5％氯化钠，10mM氯化镁，20mM葡萄糖。

LK：1％蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母粉，固体平板加1.5％琼脂，卡那霉素(Kan)为50μg/mL。

实施例3木聚糖酶突变体库的筛选

实施例2中的重组质粒的电转化后共获得了约20000株转化子。将全部转化子点至含有50μg/mL卡那青霉素抗性并涂布了20μL浓度为0.5mg/mL的IPTG的木聚糖酶活性筛选平板(0.5％交联木聚糖，1％蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母粉，1.5％琼脂)后，培养温度为37℃，从中选取透明圈比原始菌株透明圈明显较大的46株突变体。通过水解圈法初筛，再经过大肠杆菌摇瓶扩大培养诱导表达进行复筛如图1，最终筛选得到一株酶活最高的将其基因命名为xynHBN3217。

交联木聚糖制法可参考文献：木聚糖酶XYNZG在乳酸克鲁维酵母中的表达及在面包烘焙中的应用研究，战飞祥，湖北大学，2014年。

实施例4木聚糖酶的诱导表达和纯化

将大肠杆菌突变体及原始菌株挑单菌落至5mL LB(含50μg/mL Kan)中，37℃、220r/min恒温过夜培养。按1％接种量转接于100mL LB(含50μg/mL Kan)中，37℃、220r/min培养至OD600＝0.6-0.8左右，加入终浓度为0.01mmol/L的IPTG，18℃诱导培养，12h后离心取菌体，用PBS缓冲液重悬，超声破碎后，离心，上清液即为胞内酶液。蛋白纯化按照Novagen公司的Ni-NTA His Bind Resins的操作说明书进行。

实施例5木聚糖酶酶活测定步骤

用重组大肠杆菌发酵表达纯化的酶液，稀释至适当倍数，取1.0mL经50℃或55℃预热平衡，加入到试管中，再加入50℃或55℃预热的1.0mL 1％(质量分数)木聚糖底物，振荡混匀，50℃或55℃反应10min后，沸水浴5min终止酶解反应，迅速冷却至室温后加入2.5mLDNS试剂，振荡5s混匀后沸水浴加热5min，迅速冷却到室温，最后加水定容至12.5mL。

酶活力的计算参照下面的公式：

上式中，各符号代表的含义如下：

X_D代表试样木聚糖酶活力，U/mL；A代表测量的酶反应液的吸光度OD₅₄₀；K代表标准曲线的斜率；C_O代表标准曲线的截距；M代表木糖的摩尔质量(150.2)；t代表酶解反应时间，min；D_f代表酶反应液的总稀释倍数；1000为转化因子，1mmol＝1000μmol。

1、最适反应温度的测定方法

将酶液用50mM pH 7.5的Tris-Hcl缓冲液稀释适当倍数，按照木聚糖酶酶活测定步骤，在20-70℃之间，以5℃为梯度设置实验，分别进行酶促反应，每个反应做3个平行，实验数据用Microsoft Excel分析。

2、最适pH值的测定

将质量分数为1％木聚糖底物分别用不同pH的Buffer配制，并将酶液也稀释到适当倍数，在最适温度下按照木聚糖酶酶活测定步骤进行反应。实验采用了4种不同的缓冲液，它们分别是50mM HAc-NaAc缓冲液(pH 5.0,pH 5.4,pH 5.8,pH 6.2)、50mM磷酸钠缓冲液(pH 5.8,pH 6.2,pH 6.6,pH 7.0,pH 7.5,pH 8.0)、50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5,pH8.0,pH 8.6,pH 9.0)和50mM Gly-NaOH缓冲液(pH 8.6,pH 9.0,pH 9.4，pH 9.8)，每个反应做3个平行，实验数据用Microsoft Excel分析。

3、pH稳定性的测定方法

将酶液分别用不同pH的缓冲液按适当的倍数稀释，放4℃静置12h后，在最适温度和最适pH的条件下测量残余的酶活。4种不同的缓冲液，他们分别是50mM HAc-NaAc缓冲液(pH 5.0,pH 5.4,pH 5.8,pH 6.2)、50mM磷酸钠缓冲液(pH 5.8,pH 6.2,pH 6.6,pH 7.0,pH7.5,pH 8.0)、50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5,pH 8.0,pH 8.6,pH 9.0)和50mM Gly-NaOH缓冲液(pH 8.6,pH 9.0,pH 9.4，pH 9.8)，以初始酶活力为100％，每个反应做3个平行，实验数据用Microsoft Excel分析。

4、热稳定性的测定方法

将酶液用最适pH的缓冲液(50mM Tris-HCl缓冲液,pH 7.5)适当稀释后，取样，测定初始酶活力。其余酶液分别在60℃处理30min，每隔5min取样。以初始酶活力为100％。每个反应做3个平行，实验数据用Microsoft Excel分析。

实施例5xynHBN3217基因的序列分析

将突变木聚糖酶基因片段xynHBN3217测序结果与出发菌株xynHBN3基因序列进行比对，结果见图2，由图2可以看出木聚糖酶基因xynHBN3217序列有4个碱基发生突变，第105位碱基A突变为G，第124位碱基A突变为G，第153位碱基A突变为G，第445位碱基A突变为T，导致两个氨基酸发生突变，第42位氨基酸N突变为D，第149位氨基酸T突变为S。

实施例6木聚糖酶XynHBN3217的酶学性质

采用实施例3中的方法检测木聚糖酶XynHBN3217的酶学性质。

1、木聚糖酶XynHBN3217的比酶活测定

分别将XynHBN3217和XynHBN3纯化的酶稀释液于55℃和50℃分别预热10min；按木聚糖酶酶活测定步骤测量木聚糖酶XynHBN3217和XynHBN3的酶活性,根据实施例3中木聚糖酶酶活力的计算公式，算出XynHBN3217和XynHBN3的纯化酶液的酶活，最后根据测量的XynHBN3217和XynHBN3蛋白浓度，得到XynHBN3217和XynHBN3纯化酶液的比酶活。如表1所示，可知经His纯化后，XynHBN3217的比酶活比XynHBN3的比酶活提高了2.8倍。结果表明，木聚糖酶XynHBN3217的第42位天冬酰胺N突变为天冬氨酸D，第149位苏氨酸T突变为丝氨酸S，有助于该木聚糖酶比酶活的提高，详细的作用机理还有待进一步的研究。同时这种木聚糖酶突变体在工业生产中的推广应用，会带来可观的经济效益和社会效益，如在纸浆漂白、纺织、面包烘焙中。

表1突变体XynHBN3217和蛋白XynHBN3的比酶活(U/mg)

2、木聚糖酶XynHBN3217最适反应温度与热稳定性

参照实施例3中的方法检测木聚糖酶XynHBN3217最适反应温度与热稳定性。

在不同温度下测定酶活，结果见图3和图4，由图可知XynHBN3217的最适反应温度为55℃，与XynHBN3相比最适反应温度增加了5℃，在30-60℃之间时，相对酶活均在60％以上，尤其在45-55℃时，XynHBN3217的相对酶活高于90％，当温度高于55℃时，则酶活迅速下降。

将酶在60℃下孵育30min，且每隔5min取一个样，分别测量残余酶活，结果如图5显示XynHBN3217在60℃以下较为稳定，60℃下20min残余酶活仍有50％，与测量的XynHBN3的热稳定性比较知，XynHBN3217热稳定性和XynHBN3相比，变化不大。

3、木聚糖酶XynHBN3217最适反应pH和pH稳定性检测

采用实施例3中的方法检测木聚糖酶XynHBN3217最适反应pH和pH稳定性。

酶的反应pH用不同的缓冲液体系调到5.0-9.8，在最适温度55℃条件下测定木聚糖酶XynHBN3217的酶活力，结果如图6所示，从图6中可以看出，XynHBN3217的最适反应pH为7.5，从pH 5.5到pH 9.0都维持50％左右及以上活性，与XynHBN3相比最适反应pH(图7)变化不大，但是在8.5的相对酶活XynHBN3217明显高于XynHBN3。

当木聚糖酶XynHBN3217被同一浓度不同pH(5.0-9.8)的缓冲液稀释后4℃放置12h检测其剩余活性。如图8所示，结果表明,12h后木聚糖酶XynHBN3217从pH 5.0到pH 9.0都维持50％以上的活性，与图9测量的XynHBN3具有的pH稳定性进行比对，也可以看出XynHBN3217的pH稳定性同样高于XynHBN3。具有良好的耐酸耐碱性条件能力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种比酶活提高的木聚糖酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述的比酶活提高的木聚糖酶突变体的编码基因。

3.根据权利要求2所述一种比酶活提高的木聚糖酶突变体的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种包括权利要求1所述的比酶活提高的木聚糖酶突变体的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，将编码权利要求2所述的比酶活提高的木聚糖酶突变体的编码基因插入到出发载体的多克隆位点处获得的重组载体。

6.一种木聚糖酶突变体的生产方法，其特征在于：培养包括权利要求1所述的比酶活提高的木聚糖酶突变体的重组菌。

7.一种权利要求1所述的比酶活提高的木聚糖酶突变体在降解木聚糖中的应用。

8.一种利用权利要求1所述的比酶活提高的木聚糖酶突变体降解木聚糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：收集含有权利要求1所述的木聚糖酶突变体的溶液作用于含有木聚糖的溶液，进行降解；所述降解的条件为：温度为30℃-60℃，pH为5.5-9.0。

9.根据权利要求8所述利用比酶活提高的木聚糖酶突变体降解木聚糖的方法，其特征在于，降解的条件为：温度为45-55℃，pH为7.5。