KR20220150328A - 낮은 내지 중간 발현을 부여하는 구성적 박테리아 프로모터를 생산하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 분자 생물학의 분야에 대한 것이며, 박테리아에서 낮은 내지 중간 발현하는 구성적 프로모터를 생산하는 방법 및 그에 의해 생산된 프로모터를 제공한다.

Description

낮은 내지 중간 발현을 부여하는 구성적 박테리아 프로모터를 생산하는 방법
본 발명은 분자 생물학의 분야에 대한 것이며, 박테리아에서 낮은 내지 중간 발현하는 구성적 프로모터를 생산하는 방법 및 그에 의해 생산된 프로모터를 제공한다.
오늘날에 미생물은 그의 발효 능력을 사용함으로써 산업에 널리 적용된다. 미생물은 특히 다양한 물질, 예컨대 효소, 단백질, 화학물질, 당 및 중합체의 발효 생산을 위한 숙주로서 사용된다. 이러한 목적을 위해, 미생물은 특정 생산 과정의 요구로 그의 유전자 발현을 조정하기 위해 유전자 조작을 받는다. 미생물의 합리적인 유전자 조작은 표적 특이적 게놈 편집, 예컨대 점 돌연변이의 도입, 유전자 결실, 유전자 삽입, 유전자 복제에 대한 기술을 필요로 한다.
여러 종에 대한 게놈 편집에 대한 많은 다양한 접근법이 개발되어 왔다. 이들 중 대다수는 비-상동성 단부-연결 (NHEJ)에 의해 게놈의 특정 부위에 무작위 돌연변이를 도입하기 위해 또는 공여자 DNA 분자의 전달을 필요로 하는 상동성 재조합 복구 메카니즘 (HR)을 사용하여 DNA를 도입하거나, 대체하거나 또는 결실시키기 위해, 이중 가닥 DNA 파단 또는 2개의 인접한 단일 가닥 DNA 파단의 도입을 필요로 한다. 사용된 기술은 예를 들어 Zn-핑거 뉴클레아제, TALEN, 귀소 엔도뉴클레아제 등이었다. CRISPR (클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부) 기반 시스템의 최근 개발은 그의 정확도 효능 및 속도로 인해 게놈 편집을 보다 더 매력적으로 만들었다.
CRISPR 시스템은 처음에 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속에 속하는 박테리아의 적응 방어 메커니즘으로서 확인되었다 (WO2007/025097). 이들 박테리아 CRISPR 시스템은 절단 단백질과 복합하여 침입 바이러스 DNA 내에 존재하는 상보성인 서열의 분해를 지시하는 가이드 RNA (gRNA)에 의존한다. CRISPR/Cas 시스템의 가장 먼저 확인된 단백질 Cas9는 2개의 비코딩 RNA: crRNA 및 트랜스-활성화 crRNA (tracrRNA)의 복합체에 의해 PAM (프로토스페이서 인접 모티프) 서열 모티프에 인접한 DNA 표적 서열에 가이드되는 큰 단량체 DNA 뉴클레아제이다. 이후에, crRNA를 tracrRNA와 융합함으로써 생성된 합성 RNA 키메라 (단일 가이드 RNA 또는 sgRNA)가 동등하게 기능적인 것으로 나타났다 (Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., and Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337(6096), 816-821. 17-8-2012).
여러 연구진은 CRISPR 절단 특성이 거의 모든 유기체의 게놈에서 유전자를 전례 없이 용이하게 파괴하는 데 사용될 수 있다는 것을 발견하였다 (Mali P, et al (2013) Science. 339(6121):819-823; Cong L, et al (2013) Science 339(6121)). 최근에는 복구를 위한 주형을 제공하는 것이 거의 모든 부위에서 거의 모든 목적하는 서열로 게놈을 편집하게 한다는 것이 명백해졌으며, 이는 CRISPR을 강력한 유전자 편집 도구로 전환시켰다 (WO/2014/150624, WO/2014/204728).
숙주 세포에서 유전자 발현을 구동시키는 주요 요소는 프로모터 서열이다. 유전자 발현이 일어나기 위해서, RNA 폴리머라제는 유전자 근처의 프로모터 서열에 부착해야 한다. 따라서, 프로모터는 RNA 폴리머라제 및 또한 RNA 폴리머라제를 인식 서열로 모집하는 다른 단백질 (즉, 전사 인자)에 대한 결합 부위를 제공하는 특이적 DNA 서열을 함유한다. 박테리아에서, 프로모터는 통상적으로 RNA 폴리머라제 및 연관 시그마 인자에 의해 인식되고, 이들은 근처에 있는 그 자체의 DNA 결합 부위에 대한 활성자 단백질의 결합에 의해 프로모터 DNA로 가이드된다 (Lee, D. J., Minchin, S. D., and Busby, S. J. Activating transcription in bacteria. Annu.Rev.Microbiol. 66, 125-152. 2012.). 예를 들어 많은 하우스-키핑 유전자의 발현을 구동시키는 구성적 프로모터는 활성자 또는 억제자 단백질에 의한 활성화 또는 탈억제에 비의존적이고 RNA 폴리머라제는 sigA-특이적 DNA 서열 요소 - -35 박스 및 -10 박스를 인식하는 연관 시그마 인자 sigA (또한 이. 콜라이(E. coli)에서 sig70으로 지칭됨)를 통해 구성적 프로모터에 결합한다. sigA 의존적 프로모터는 바실루스(Bacillus) 및 이. 콜라이에 대해 널리 연구되었고 sigA 프로모터 서열의 공통 모티프의 비교는 각각 상응하는 sig70 및 sigA 인자를 갖는 이. 콜라이 및 바실루스 RNA-폴리머라제에 의한 바실루스 및 이. 콜라이 유래된 sigA 프로모터의 교차-인식을 나타낸다 (Helmann, J. D. Compilation and analysis of Bacillus subtilis sigma A-dependent promoter sequences: evidence for extended contact between RNA polymerase and upstream promoter DNA. Nucleic Acids Res. 23(13), 2351-2360. 11-7-1995.).
진핵생물에서, 과정은 보다 복잡하고, 다양한 인자가 프로모터에 대한 RNA 폴리머라제의 결합에 필요하다. 핵산 서열의 영향으로, 프로모터는 낮은, 중간 또는 높은 발현 수준을 부여할 수 있고 구성적이거나 또는 유도성일 수 있다.
많은 구성적 프로모터가 바실루스에 대해 기재되었다. veg 유전자의 프로모터 Pveg는 널리 기재된 강한 구성적 프로모터이다. 게다가, 상이한 프로모터 강도를 갖는 바실루스의 구성적 프로모터를 포함하는 발현 모듈의 라이브러리가 구축되었다 (Guiziou, S., et al (2016). Nucleic Acids Res. 44(15), 7495-7508).
유도성 프로모터는 세포에 유도자 분자를 첨가함으로써 활성화되거나 또는 탈억제된다. 이로써, 활성화 단백질은 프로모터 서열 옆의 서열에 결합하고 RNA 폴리머라제 및 연관 시그마 인자를 활성적으로 모집하여 전사의 개시를 허용한다. 널리 공지되고 기재된 예는, 아라비노스의 첨가 시 그의 형태를 변경하고 작동자 부위 I1 및 I2에 이량체로서 결합하는 araC에 의해 조절되는 이. 콜라이로부터의 PBAD 프로모터, 및 활성자 manR에 의해 조절되는 바실루스로부터의 만노스-유도성 프로모터 시스템 PmanP이다. 유도성 프로모터, 예컨대 이. 콜라이에서의 발현을 위한 lacUV5 프로모터, T7-파지 프로모터 및 바실루스에서의 Pspac-I 및 Ppac-I 프로모터는 유도자 분자의 부재 하에 프로모터 서열 내, 예를 들어 -35 내지 -10 sigA 인식 부위 사이, 또는 그 부근, 즉 프로모터 서열의 3' 또는 5'의 그의 특이적 lac 작동자 부위에 대한 lac 억제자 (lacI 유전자에 의해 코딩됨) 결합에 의해 음성 조절되어 전사를 방지한다. 또 다른 예는 바실루스 발현 시스템에 널리 사용되는 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium)으로부터의 PxylA 유도성 프로모터 시스템이다. PxylA 프로모터는 전사 시작 부위의 xylR 작동자 부위 3'을 포함하는 xylR 억제자 단백질 결합에 의해 음성 조절된다.
이러한 프로모터의 제어 하에 유전자의 발현이 크게 감소하고, 따라서 예를 들어 세포 자원 탈취, 세포 물질대사 방해 등에 대한 부정적 영향이 최소화되므로 유도성 프로모터 시스템은 일반적으로 발현 벡터에서의 클로닝에 유리하지만, 목적하는 단백질 발현의 조정은 첨가되는 유도자 분자의 양 및 사용되는 각각의 균주에 대한 발현의 유도의 시점과 관련하여 면밀하게 분석될 필요가 있다. 반대로, 구성적 프로모터는 특정 조절자 또는 운반체를 필요로 하지 않는 유도자-비의존적 적용의 이점을 가지며, 이로써 다양한 박테리아에서 활성이다.
플라스미드는 숙주 세포에서 자율적으로 복제하는 염색체외 원형 DNA이므로, 숙주 염색체의 복제와 독립적이다.
자율 복제의 경우, 플라스미드는 벡터로 하여금 해당 숙주 세포에서 자율적으로 복제할 수 있게 하는 복제 기점을 포함한다. 박테리아 복제 기점의 예는 바실루스에서의 복제를 허용하는 플라스미드 pUB110, pE194, pC194, pTB19, pAMß1, pTA1060 및 이. 콜라이에서의 복제를 허용하는 플라스미드 pBR322, colE1, pUC19, pSC101, pACYC177, 및 pACYC184의 복제 기점이다 (Sambrook,J. and Russell,D.W. Molecular cloning. A laboratory manual, 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 2001.).
플라스미드의 카피 수는 일반 성장 조건 하의 박테리아 세포당 또는 염색체당 플라스미드의 평균 수로 정의된다. 게다가, 박테리아 숙주에서 상이한 카피 수를 초래하는 상이한 유형의 복제 기점 (또한 레플리콘으로 지칭됨)이 존재한다.
플라스미드 레플리콘 pBS72 및 플라스미드 pTB19 및 유도체 pTB51, pTB52는 바실루스 세포 내에서 각각 6개의 카피 및 1 내지 8개의 카피를 갖는 낮은 카피 수를 부여하는 반면에, 플라스미드 pE194 및 pUB110은 각각 세포당 14-20개를 갖는 낮은 내지 중간 카피 수 및 30-50개의 카피를 갖는 중간 카피 수를 부여한다. 플라스미드 pE194는 보다 자세하게 분석되었고 (Villafane, et al (1987): J.Bacteriol. 169(10), 4822-4829) 여러 pE194 - cop 돌연변이체는 바실루스 내에서 85개의 카피 내지 202개의 카피 범위의 높은 카피 수를 갖는 것으로 기재되었다. 게다가, 플라스미드 pE194는 37℃까지는 카피 수가 안정하지만, 43℃ 초과에서 복제가 제거되는 온도 민감성이다. 또한, 보다 급격한 온도 민감성 - 32℃까지는 카피 수가 안정하지만, 37℃에서 세포당 단지 1 내지 2개의 카피임 -을 야기하는 레플리콘 영역 내 2개의 점 돌연변이를 갖고 pE194ts로 지칭되는 pE194 변이체가 존재한다.
이. 콜라이에서, pMB1 레플리콘 또는 그의 가까운 동족, 콜리신 E1 (colE1) 레플리콘을 지니는 pBR322 플라스미드는 각각의 박테리아 세포에서 낮은 내지 중간 카피 수, 즉 15-20개의 카피를 유지한다. colE1 및 pMB1 플라스미드 유도체 내 rop/rom 유전자의 결실은 플라스미드 카피 수를 이. 콜라이 세포 내에서 25-50개의 중간 카피 수로 약간 증가시킨다. pUC 벡터 계열은 rop 단백질이 결여된 돌연변이된 pBR322 플라스미드로부터 유래되고 이. 콜라이 세포당 최대 200개의 카피를 갖는 작고, 높은 카피의 플라스미드이다. pUC 플라스미드는 상기 언급된 pBR322 및 ColE1 유래된 벡터와 비교하여 플라스미드 제조에서의 그의 작은 크기 및 높은 수율로 인해 널리 확립된 클로닝 벡터이다.
대안적으로, pACYC177/184 플라스미드에 존재하는 p15A 레플리콘은 세포당 20개의 카피를 갖는 낮은 내지 중간 카피 수를 부여하고 pSC101 레플리콘은 세포당 5-10개의 카피를 갖는 낮은 카피 수를 부여한다. 낮은 내지 중간 카피 수를 갖고 독성의 또는 불리한 발현 구축물을 코딩하는 플라스미드는 통상적으로 세포 내에서 안정하게 유지되지만, 플라스미드 제조에서의 수율이 낮다. 박테리아 세포의 후속 형질전환을 위해 플라스미드 DNA의 양은 높은 카피의 플라스미드의 플라스미드 제조와 비교하여 제한된다. 이는 동시에 다수의 제조를 수행할 때 중간 내지 높은 처리량 적용에 특히 중요하다.
플라스미드 카피 수와 유전자의 발현에 사용되는 프로모터의 선택의 조합은 전체 단백질 발현 수준, 및 따라서 세포의 생존율 및 플라스미드 안정성에 대한 영향을 결정한다.
단일-플라스미드 시스템 접근법에 기반한 그람 양성 유기체, 예컨대 바실루스 종에서의 적용을 위한 CRISPR-기반 발현 시스템, 즉 하나의 단일 이. 콜라이 - 바실루스 셔틀 벡터 상에 Cas9 엔도뉴클레아제, gRNA (예를 들어 sgRNA 또는 crRNA/tracrRNA), 복구 상동성 서열 (공여자 DNA)을 포함하는 것이 성공적으로 적용되었다.
알텐부흐너(Altenbuchner)는 Cas9 엔도뉴클레아제의 발현을 위한 유도성 프로모터 PmanP, PxylA 및 PtetLM과 조합된, 일련의 높은 카피의 pUC 레플리콘 기반 CRISPR/Cas9 게놈 편집 이. 콜라이-바실루스 셔틀 - 비. 서브틸리스(B. subtilis)를 위한 플라스미드를 고안하였다 (Altenbuchner, (2016): Applied and environmental microbiology 82 (17), 5421-5427). 이는 이. 콜라이 클로닝 숙주 내에서 매우 효율적인 플라스미드 DNA 제조 및 안정한 유지를 허용한다. 마찬가지로, 바실루스 메타놀리쿠스(Bacillus methanolicus)에서의 적용을 위한 높은 카피의 pUC-유래된 CRISPRi- 이. 콜라이-바실루스 셔틀 플라스미드의 구축에 대한 유사한 접근법이 만들어졌다. 결함이 있는 Cas9 발현의 발현을 구동시키는 비. 메타놀리쿠스 만니톨 활성자 유전자 mtlR의 프로모터가 프로모터의 lacO 부위 3'의 도입에 의해 변형되었고, 따라서 무손상 lacI를 갖는 이. 콜라이에서 전사 활성을 효율적으로 차단한다 (Schultenkaemper, et al (2019): Applied microbiology and biotechnology 103 (14), 5879-5889).
비. 서브틸리스에서의 CRISPR/Cas9 적용을 위한 또 다른 단일-플라스미드 접근법은 Cas9 발현을 위한 유도자-비의존적 프로모터 (비. 아밀로리퀘파시엔스(B. amyloliquefaciens)로부터의 PamyQ-아밀라제 프로모터)의 사용과 조합하여 낮은 내지 중간 카피 수 레플리콘 p15A를 사용하여 이. 콜라이에서의 CRISPR/Cas9-기반 게놈 편집 이. 콜라이-바실루스 셔틀 플라스미드의 성공적인 클로닝 및 안정한 유지를 허용하였다. 중간 카피의 pBR322 유래된 이. 콜라이-바실루스 셔틀 벡터와 강한 구성적 프로모터의 제어 하 Cas9의 유사한 조합이 적용되었다 (Zhou, et al. (2019): International journal of biological macromolecules 122, 329-337).
낮은 및 중간 카피의 백본은 대사 부담을 감소시키지만, 이는 이. 콜라이로부터의 감소된 플라스미드 수율을 동반하고 바실루스 균주를 형질전환시키거나 또는 높은 처리량 적용으로 적용하기 어려운 형질전환을 위한 많은 프로토콜에 요구되는 규모에서 플라스미드 DNA의 단리를 방해한다. 유도자-의존적 프로모터 시스템은 항상 다양한 상이한 미생물에 적용가능한 것은 아니고 또한 유도자-분자의 양 및 프로모터 유도의 시점이 분석될 필요가 있다. 게다가, 구성적 프로모터과 비교하여, 유도자 분자를 세포에 첨가하는 추가적인 프로모터 활성화 단계가 게놈 편집 절차 동안 전체 기간에 걸쳐 요구된다.
따라서, 구성적 프로모터의 사용과 조합하여 높은 카피 벡터의 사용을 허용하는 시스템을 제공하여 이들 한계를 극복할 필요가 관련 기술분야에 있다. 이러한 시스템의 한 요소는 박테리아의 성장 및/또는 활력을 방해하지 않거나 또는 단지 유의하지 않게만 방해하는 박테리아에서 감소된 발현을 부여하는 구성적 프로모터를 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 실시양태는 하기 단계를 포함하는, 박테리아 세포에서 각각의 시작 조절 핵산 분자와 비교하여 감소된 구성적 발현을 부여하는 하나 이상의 합성 조절 핵산 분자를 제조하는 방법을 포함한다:
a. 박테리아 세포에서 구성적 발현을 부여하는 적어도 하나의 시작 조절 핵산 분자를 확인하는 단계, 및
b. 상기 시작 조절 핵산 분자를 상기 시작 조절 핵산 분자에 이종성인 단백질을 코딩하는 코딩 영역에 작동가능하게 연결하는 단계, 및
c. 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 상기 시작 조절 핵산 분자를 포함하는 구축물을 박테리아 세포 내에서 벡터의 높은 카피 수를 부여하는 복제 기점을 포함하는 상기 벡터에 도입하는 단계로서, 여기서 상기 구축물은 상기 코딩 영역의 높은 발현을 부여하며, 여기서 박테리아 세포에서의 상기 코딩 영역의 높은 발현은 상기 박테리아 세포에 부담을 주어 감소된 또는 제거된 성장을 야기하는 것인 단계, 및
d. 상기 벡터를 박테리아 세포로 형질전환시키는 단계, 및
e. 상기 형질전환된 박테리아 세포를 성장시켜 단일 클론을 회수하는 단계, 및
f. 상기 구축물을 포함하지 않는 상응하는 WT 균주와 비교할 만한 성장률을 나타내는 단일 클론을 단리하는 단계, 및
g. 상기 클론으로부터 상기 구축물을 단리하는 단계; 및
h. 상기 구축물에 포함된 합성 조절 핵산 분자를 상기 합성 조절 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 코딩 영역의 기능적 발현에 대해 시험하는 단계 및 임의로
i. 합성 조절 핵산에 의해 부여된 발현을 시작 조절 핵산에 의해 부여된 발현에 대해 비교하는 단계 및 임의로
j. 상기 구축물에 포함된 각각의 조절 핵산 분자를 시퀀싱하며, 이로써 박테리아 세포에서 감소된 구성적 발현을 부여하는 합성 조절 핵산 분자를 확인하는 단계.
감소된 성장은, 각각의 박테리아에 적합한 조건 하에 특정 기간 동안 플레이트 상에서 인큐베이션 후 각각의 콜로니의 크기의 가시적인 차이가 상기 기재된 바와 같은 구축물을 포함하는 박테리아의 콜로니와 상기 구축물을 포함하지 않는 박테리아의 콜로니 사이에서 가시적인 것을 의미한다. 상기 구축물을 포함하는 박테리아의 콜로니는 상기 구축물을 포함하지 않는 콜로니와 비교하여 보다 작은 콜로니를 나타낼 것이다. 예를 들어, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 박테리아는 콜로니 크기의 차이를 비교하기 전에 8-16시간 동안 36-37℃에서 인큐베이션된다.
강한 구성적 프로모터의 제어 하에 코딩 영역을 발현하는 박테리아에 부담을 주는 상기 코딩 영역은 예를 들어, 예를 들어 Cas9 또는 Cas12a와 같은 150 kDa보다 더 큰 단백질을 코딩하는 임의의 코딩 영역, 예를 들어 Cas9, Cas12a 및 임의의 다른 CRISPR Cas 효소, 귀소 엔도뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 아데노신 데아미나제 또는 DNA 글리코실라제와 같은 DNA 가닥 파단 또는 돌연변이를 유도하는 코딩 영역, 예를 들어 에너지 등가물 (ATP) 또는 NADP와 같은 보조인자의 생산에 수반되는 효소와 같은 박테리아 대사를 방해하는 효소를 코딩하는 코딩 영역, 또는 박테리아 세포의 기질 흡수 또는 해독을 방해하는 수송체 또는 막관통 단백질을 코딩하는 코딩 영역일 수 있다.
박테리아 세포에서의 구성적 발현은 각각의 프로모터로부터 유래된 발현 강도가 다양한 조건 하에 실질적으로 일정한 것을 의미한다. 본 명세서에서, 구성적 발현은, 하기 조건: 각각의 세포에 최적의 온도 조건 하 풍부한 배지, 예를 들어 LB 배지 중, 당, 예를 들어 수크로스, 락토스 또는 글루코스, 바람직하게는 0.1% 내지 0.5%, 바람직하게는 0.3%의 농도의 글루코스로 대체된 풍부한 배지 중 및 최소 염 배지, 예를 들어 당, 예를 들어 수크로스, 락토스 또는 글루코스, 바람직하게는 0.1% 내지 0.5%, 바람직하게는 0.3%의 농도의 글루코스로 보충된 M9 배지 중 대수 성장기, 전이기 및 정지기 하에 하나의 프로모터로부터 유래된 발현이 10배 미만, 바람직하게는 9배 미만, 바람직하게는 8배 미만, 바람직하게는 7배 미만, 바람직하게는 6배 미만, 바람직하게는 5배 미만, 바람직하게는 4배 미만, 보다 바람직하게는 3배 미만, 보다 더 바람직하게는 2배 미만만큼 달라지는 것을 의미한다.
유전자가 차등적으로 발현되는 지 여부를 결정하기 위해, 그의 발현은 이들 조건에 걸쳐, 적어도 삼중으로 측정되고 이들 값은 관련 기술분야의 표준 접근법인 DESeq2 패키지를 사용하여 차이에 대해 시험된다 (Love, M.I., et al., Genome Biology 15(12):550 (2014)). 이러한 분석은 조건 사이의 관측된 배수 변화 뿐만 아니라 무작위의 가능성으로 인한 이러한 차이의 확률을 추정할 것이다. 상기 정의된 것보다 더 상향 또는 및/하향 조절되고 무작위의 가능성으로 인한 5% 미만의 확률을 갖는 임의의 유전자는 차등적으로 발현되고, 따라서 구성적으로 발현되지 않는 것으로 간주된다.
구성적 프로모터는 다른 세포 조절 인자에 비의존적이고 전사 개시는 시그마 인자 A (sigA)에 의존한다. sigA-의존적 프로모터는 시그마 인자 A 특이적 인식 부위 '-35'-영역 및 '-10'-영역을 포함한다.
바람직하게는, 구성적 프로모터 서열은 유전자 발현의 상이한 강도를 갖는 프로모터 Pveg, PlepA, PserA, PymdA, Pfba 및 그의 유도체 (Guiziou et al, (2016): Nucleic Acids Res. 44(15), 7495-7508), 박테리오파지 SPO1 프로모터 P4, P5, P15 (WO15118126), 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis)로부터의 cryIIIA 프로모터 (WO9425612), 및 이들의 조합, 또는 이들의 활성 단편 또는 변이체를 포함하는 군으로부터 선택된다.
높은 카피 수를 부여하는 복제 기점 (ORI)은 ORI가 기능적인 각각의 박테리아 세포에서 각각의 벡터의 적어도 51개의 카피를 야기하는 ORI를 의미한다. 카피의 수는 각각의 박테리아가 성장되는 온도에 의존하므로, 바람직하게는 정의는 통상의 기술자에게 공지되고 예를 들어 다양한 균주에 대해 기재된 바와 같은 실험실에서 각각의 박테리아가 성장되는 온도를 참조한다 (Bronikowski et al, (2001): Evolution 55(1):33-40).
바람직하게는 이. 콜라이의 경우, 이는 36-37℃에서의 성장 하에 검출된 카피 수를 의미하고, 바실루스의 경우, 이는 36-37℃에서의 성장 하에 검출된 카피 수를 의미한다.
중간 카피 수를 부여하는 ORI는 벡터의 25-50개의 카피를 유지하는 ORI를 의미하고, 낮은 내지 중간 카피 수를 부여하는 ORI는 세포당 11-24개의 카피를 유지하는 ORI를 의미하고 낮은 카피 수를 부여하는 ORI는 박테리아 세포 내에서 벡터의 1-10개의 카피를 유지하는 ORI를 의미한다.
바람직한 실시양태에서, 이. 콜라이 ORI는 높은 카피 수 ORI로부터 선택되고 바실루스 ORI는 낮은 카피 수 ORI, 낮은 내지 중간 카피 수 ORI 및 중간 카피 수 ORI로부터 선택된다.
보다 바람직하게는, 이. 콜라이 ORI는 높은 카피 수 ORI로부터 선택되고 바실루스 ORI는 낮은 내지 중간 카피 수 ORI로부터 선택된다.
보다 바람직하게는, 이. 콜라이 ORI는 높은 카피 수 ORI로부터 선택되고 바실루스 ORI는 온도 민감성인 낮은 내지 중간 카피 수 ORI, 예를 들어 36-37℃에서 낮은 내지 중간 카피 수 및 30-33℃에서 낮은 내지 중간 카피 수를 부여하고 43℃ 초과에서 복제가 없는 플라스미드 pE194의 유도체로부터 선택된다.
가장 바람직하게는, 이. 콜라이 ORI는 높은 카피 수 ORI, 예를 들어 pUC ORI로부터 선택되고, 바실루스 ORI는 온도 민감성인 낮은 내지 중간 카피 수 ORI, 예를 들어 36-37℃에서 낮은 카피 수 및 30-33℃에서 낮은 내지 중간 카피 수를 부여하고 38℃ 초과에서 복제가 없는 플라스미드 pE194ts의 유도체로부터 선택된다.
용어 "상기 구축물을 포함하지 않는 상응하는 WT 균주와 비교할 만한 성장률을 나타내는 클론"은 이러한 구축물을 포함하지 않는 또는 이로 형질전환되지 않은 박테리아와 비교할 때 WT 박테리아와 같은 성장률의 적어도 50%를 갖는 성장률을 나타내는 상기 정의된 바와 같은 구축물로 형질전환된 클론을 의미한다. 바람직하게는 이들은 WT 박테리아와 같은 성장률의 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%를 갖는다. 보다 바람직하게는 이들은 WT 박테리아와 같은 성장률의 적어도 90%, 95%를 갖거나 또는 이들은 WT 박테리아와 동일한 성장률을 갖는다. 성장률은 예를 들어 액체 배양에서 특정 시간의 인큐베이션 후 세포 밀도에 의해 또는 플레이트 상 콜로니 크기에 의해 결정될 수 있다.
코딩 영역의 기능적 발현은 이러한 코딩 영역의 발현이 예를 들어 RT-PCR, qPCR과 같은 RNA 검출 방법에 의해 또는 형광 단백질과 같은 검출가능한 단백질, GUS, 각각의 효소에 특이적인 효소 반응 또는 게놈에서 이중 가닥 파단을 유도하는 효소, 예컨대 CRISPR/Cas 효소를 코딩하는 코딩 영역에 대한 유전자 결실 효능을 사용함으로써 적어도 검출가능한 것을 의미한다.
본 발명의 추가 실시양태는 합성 조절 핵산 분자가 재조합 핵산이 생산되는 세포와 구별되는 박테리아 세포에서 낮은 내지 중간 높은 발현을 부여하는 것인 상기 정의된 바와 같은 방법이다. 예를 들어, 시작 조절 핵산 분자는 이. 콜라이에서 시험 및 돌연변이되고 이후에 바실루스 종에서 낮은 내지 중간 구성적 발현에 사용된다. 이러한 목적을 위해, 상기 정의된 방법에 사용된 바와 같은 구축물은 이. 콜라이를 위한 높은 카피의 ORI 및 바실루스 종을 위한 선택의 또 다른 ORI를 포함하는 셔틀 벡터로 클로닝될 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 합성 조절 핵산 분자는 그람-양성 및 그람-음성 박테리아의 세포, 바람직하게는 바실루스 강 및 감마프로테오박테리아(Gammaproteobacteria) 강의 세포, 보다 바람직하게는 바실라세아에(Bacillaceae) 과 및 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 과의 세포, 보다 더 바람직하게는 바실루스 속 및 에스케리키아 속의 세포, 보다 더 바람직하게는 바실루스 속의 세포에서 활성이다.
바실루스 속의 바람직한 세포는 바실루스 알칼로필루스(Bacillus alkalophilus), 바실루스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실루스 브레비스(Bacillus brevis), 바실루스 시르쿨란스(Bacillus circulans), 바실루스 클라우시이(Bacillus clausii), 바실루스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실루스 피르무스(Bacillus firmus), 바실루스 라우투스(Bacillus lautus), 바실루스 렌투스(Bacillus lentus), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실루스 메가테리움, 바실루스 푸밀루스(Bacillus pumilus), 바실루스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus), 바실루스 메틸로트로피쿠스(Bacillus methylotrophicus), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 바실루스 파라리케니포르미스(Bacillus paralicheniformis), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 바실루스 투린기엔시스의 세포를 포함한다.
바람직하게는 합성 조절 핵산 분자는 적어도 3종의 상이한 바실루스 종의 세포, 적어도 2종의 상이한 바실루스 종의 세포 또는 적어도 1종의 바실루스 종의 세포에서 활성이다.
보다 바람직하게는 바실루스 종은 바실루스 서브틸리스, 바실루스 리케니포르미스 또는 바실루스 푸밀루스 중 적어도 1종을 포함한다. 가장 바람직하게는 합성 조절 핵산 분자는 바실루스 리케니포르미스의 세포에서 활성이다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 박테리아에서 활성인 임의의 높은 발현 부여 구성적 조절 핵산 분자가 사용될 수 있다. 구이지오우(Guiziou) 등의 문헌 (Guiziou et al, (2016): Nucleic Acids Res. 44(15), 7495-7508)은 본 발명의 방법에 적합한 다양한 조절 핵산 분자를 기재하고 추가로 본 발명의 방법을 위한 추가적인 적절한 조절 핵산 분자 확인하는 방법을 소개한다. 바람직하게는 박테리아 세포에서 높은 구성적 발현을 부여하는 시작 조절 핵산 분자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
a) 서열식별번호(SEQ ID NO): 28 및 29,
b) 서열식별번호: 28 또는 29에 의해 기재된 서열의 20개, 바람직하게는 25개, 보다 바람직하게는 50개, 보다 바람직하게는 75개, 보다 바람직하게는 100개, 보다 더 바람직하게는 110개, 보다 더 바람직하게는 120개의 연속하는 염기 쌍과 동일한 적어도 20개, 바람직하게는 25개, 보다 바람직하게는 50개, 보다 바람직하게는 75개, 보다 바람직하게는 100개, 보다 더 바람직하게는 110개, 보다 더 바람직하게는 120개의 연속하는 염기 쌍을 포함하는 핵산 분자, 및
c) 서열식별번호: 28 또는 29에 의해 기재된 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95%, 보다 바람직하게는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 핵산 분자, 및
d) 높고 엄격한 조건 하에 서열식별번호: 28 또는 29에 의해 기재된 핵산 분자의 적어도 20개, 바람직하게는 25개, 보다 바람직하게는 50개, 보다 바람직하게는 75개, 보다 바람직하게는 100개, 보다 더 바람직하게는 110개, 보다 더 바람직하게는 120개의 연속하는 염기 쌍의 핵산 분자와 혼성화하는 핵산 분자 및
e) a) 내지 d)에 정의된 바와 같은 핵산 분자 중 임의의 것의 상보체.
본 발명의 추가 실시양태는 합성 조절 핵산 분자로서, 조절 핵산 분자가 하기로 이루어진 군에 포함되며:
A) 서열식별번호: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 43, 45, 46 또는 47의 서열을 갖는 핵산 분자, 및
B) 서열식별번호: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 43, 45, 46 또는 47에 의해 기재된 서열의 20개, 바람직하게는 25개, 보다 바람직하게는 50개, 보다 바람직하게는 75개, 보다 바람직하게는 100개, 보다 더 바람직하게는 110개, 보다 더 바람직하게는 120개의 연속하는 염기 쌍과 동일한 적어도 20개, 바람직하게는 25개, 보다 바람직하게는 50개, 보다 바람직하게는 75개, 보다 바람직하게는 100개, 보다 더 바람직하게는 110개, 보다 더 바람직하게는 120개의 연속하는 염기 쌍을 포함하는 핵산 분자 및
C) 서열식별번호: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 43, 45, 46 또는 47에 의해 기재된 서열에 대한 전체 길이에 걸쳐 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95%, 보다 바람직하게는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 핵산 분자 및
D) 높고 엄격한 조건 하에 서열식별번호: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 43, 45, 46 또는 47 중 임의의 것에 의해 기재된 핵산 분자의 적어도 20개, 바람직하게는 25개, 보다 바람직하게는 50개, 보다 바람직하게는 75개, 보다 바람직하게는 100개, 보다 더 바람직하게는 110개, 보다 더 바람직하게는 120개의 연속하는 염기 쌍의 핵산 분자와 혼성화하는 핵산 분자 및
E) A) 내지 D)에 정의된 바와 같은 핵산 분자 중 임의의 것의 상보체,
여기서 B) 내지 E)에 정의된 바와 같은 서열은 서열식별번호: 28 또는 29를 갖고 바람직하게는 각각의 시작 조절 핵산과 비교하여 적어도 1개의 염기 결실 또는 삽입을 포함하는 각각의 시작 조절 핵산 분자와 구별되는 것인
합성 조절 핵산 분자이다.
본 발명의 추가 실시양태는 핵산 분자가 상기 정의된 바와 같은 방법을 적용하여 생산된 것인 상기 기재된 바와 같은 합성 조절 핵산 분자이다.
상기 정의된 바와 같은 합성 조절 핵산 분자를 포함하는 발현 구축물이 또한 본 발명의 실시양태이다. 바람직하게는 상기 발현 구축물은 합성 조절 핵산 분자 및 그에 기능적으로 연결된 CRISPR/Cas 단백질, 메가뉴클레아제 단백질 또는 TALE/N 코딩 코딩 영역, 바람직하게는 Cas9 또는 Cas12a 단백질인 CRSIPR/Cas 단백질을 포함한다.
상기 정의된 바와 같은 합성 조절 핵산 분자 또는 상기 정의된 발현 구축물을 포함하는 벡터가 본 발명의 추가 실시양태이다.
본 발명의 추가 실시양태는 상기 정의된 바와 같은 조절 핵산 분자 또는 발현 구축물 또는 벡터를 포함하는 미생물이다.
정의
약어: GFP - 녹색 형광 단백질, GUS - 베타-글루쿠로니다제, BAP - 6-벤질아미노퓨린; 2,4-D - 2,4-디클로로페녹시아세트산; MS - 무라쉬게(Murashige) 및 스쿠그(Skoog) 배지; NAA - 1-나프탈렌아세트산; MES, 2-(N-모르폴리노-에탄술폰산, IAA 인돌 아세트산; Kan: 카나마이신 술페이트; GA3 - 지베렐산; 티멘틴(Timentin)™: 티카르실린 이나트륨 / 클라불라네이트 칼륨, microl: 마이크로리터.
본 발명이 특정 방법 또는 프로토콜로 제한되지 않음을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어가 단지 특정 실시양태를 기재하기 위한 목적이며, 첨부된 청구항에 의해서만 제한되는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다. 본원 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 지시되지 않는 한 복수형을 포함한다는 것을 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "벡터"에 대한 언급은 하나 이상의 벡터들에 대한 언급이고 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 그의 등가물 등을 포함한다. 용어 "약"은 본원에서 대략, 거의, 그 즈음 또는 그 정도를 의미하는 데 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되는 경우, 이는 명시된 수치 값의 상한 및 하한을 연장시킴으로써 해당 범위를 변형시킨다. 일반적으로, 용어 "약"은 본원에서 20 퍼센트, 바람직하게는 10 퍼센트만큼 위로 또는 아래로 (높게 또는 낮게) 변동시킴으로써 명시된 값의 위 및 아래의 수치 값을 변형시키는 데 사용된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 단어 "또는"은 특정 목록의 임의의 한 구성원을 의미하고, 또한 해당 목록의 구성원의 임의의 조합을 포함한다. 본 명세서 및 하기 청구항에서 사용될 때 단어 "포함하다" 및 "포함하는"은 하나 이상의 명시된 특징, 정수, 성분, 또는 단계의 존재를 구체화하기 위해 의도되지만, 이들은 그의 하나 이상의 다른 특징, 정수, 성분, 단계, 또는 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 명확성을 위해, 본 명세서에서 사용된 특정 용어들은 하기와 같이 정의되고 사용된다:
코딩 영역: 본원에서 사용된 바와 같이, 구조 유전자와 관련하여 사용될 때 용어 "코딩 영역"은 mRNA 분자의 번역의 결과로서 초기 폴리펩티드에서 발견되는 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 코딩 영역은 개시제 메티오닌을 코딩하는 뉴클레오티드 삼중체 "ATG"에 의해 5'-측에 및 정지 코돈을 나타내는 3가지 삼중체 (즉, TAA, TAG, TGA) 중 하나에 의해 3'-측에 경계가 있다. 대안적으로, 뉴클레오티드 삼중체는 "GTG" 또는 "TTG"일 수 있고 리보솜 결합 부위 (샤인 달가노(Shine Dalgarno))가 상기 뉴클레오티드 삼중체에 대해 5'에 4개의 뉴클레오티드 내지 12개의 뉴클레오티드의 거리로 위치할 때 시작 뉴클레오티드 삼중체로서 인식된다. 유전자의 게놈 형태는 RNA 전사체에 존재하는 서열의 5'- 및 3'-단부 둘 다에 위치하는 서열을 또한 포함할 수 있다. 이들 서열은 "플랭킹" 서열 또는 영역으로 지칭된다 (이들 플랭킹 서열은 mRNA 전사체에 존재하는 비-번역 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치함). 5'-플랭킹 영역은 유전자의 전사를 제어하거나 또는 그에 영향을 미치는 조절 서열, 예컨대 프로모터 및 인핸서 및 mRNA의 번역을 제어하거나 또는 그에 영향을 미치는 리보솜 결합 부위 (샤인 달가노)를 함유할 수 있다. 3'-플랭킹 영역은 전사의 종결 및 전사후 절단을 지시하는 서열을 함유할 수 있다.
상보성인: "상보성인" 또는 "상보성"은 역평행 뉴클레오티드 서열에서 상보성인 염기 잔기들 사이에서 수소 결합 형성 시 (염기 쌍 형성 규칙에 의해) 서로 쌍을 형성할 수 있는 역평행 뉴클레오티드 서열을 포함하는 2개의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 예를 들어, 서열 5'-AGT-3'은 서열 5'-ACT-3'에 대해 상보성이다. 상보성은 "부분적인" 또는 "전체적인" 것일 수 있다. "부분적인" 상보성은 하나 이상의 핵산 염기가 염기 쌍 형성 규칙에 따라 매칭되지 않는 것이다. 핵산 분자들 사이의 "전체적인" 또는 "완전한" 상보성은 각각의 모든 핵산 염기가 염기 쌍 형성 규칙 하에 또 다른 염기와 매칭되는 것이다. 핵산 분자 가닥들 사이의 상보성 정도는 핵산 분자 가닥들 사이의 혼성화의 효능 및 강도에 대해 유의한 효과를 갖는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 핵산 서열의 "상보체"는 핵산 분자가 핵산 서열의 핵산 분자에 대해 전체적인 상보성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
공여자 DNA 분자: 본원에서 사용된 바와 같이, 본원에서 모두 상호교환적으로 사용되는 용어 "공여자 DNA 분자", "복구 DNA 분자" 또는 "주형 DNA 분자"는 세포의 게놈에 도입되어야 하는 서열을 갖는 DNA 분자를 의미한다. 이는 상기 세포의 게놈의 표적 영역의 서열과 상동성이거나 또는 동일한 서열에 의해 5' 및/또는 3' 단부에서 플랭킹될 수 있다. 이는 각각의 세포에서 천연 발생이 아닌 서열, 예컨대 표적 영역에 도입되어야 하는 ORF, 비-코딩 RNA 또는 조절 요소를 포함할 수 있거나, 또는 이는 유전자 편집인 적어도 하나의 돌연변이를 제외하고는 표적 영역에 대해 상동성인 서열을 포함할 수 있으며: 공여자 DNA 분자의 서열은 게놈에 부가될 수 있거나, 또는 이는 공여자 DNA 서열의 길이의 게놈에서 서열을 대체할 수 있다.
이중-가닥 RNA: "이중-가닥 RNA" 분자 또는 "dsRNA" 분자는 뉴클레오티드 서열의 센스 RNA 단편 및 뉴클레오티드 서열의 안티센스 RNA 단편을 포함하며, 이들 둘 다 서로에 대해 상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이로써 센스 및 안티센스 RNA 단편이 쌍을 형성하고, 이중-가닥 RNA 분자를 형성하게 한다.
내인성: "내인성" 뉴클레오티드 서열은 형질전환되지 않은 세포의 게놈에 존재하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
발현: "발현"은 세포에서 유전자 산물의 생합성, 바람직하게는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 내인성 유전자 또는 이종성 유전자의 전사 및/또는 번역을 지칭한다. 예를 들어, 구조 유전자의 경우에, 발현은 구조 유전자의 mRNA로의 전사 및 - 임의로 - mRNA의 하나 이상의 폴리펩티드로의 후속 번역을 수반한다. 다른 경우에, 발현은 오직 RNA 분자를 보유하는 DNA의 전사만을 지칭할 수 있다.
발현 구축물: 본원에서 사용된 바와 같이, "발현 구축물"은 식물 또는 식물 세포의 적절한 부분에서 특정 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있는 DNA 서열을 의미하고, 그가 도입될 식물 또는 식물 세포의 상기 부분에서 기능적인 프로모터를 포함하며, 이는 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되며, 이는 - 임의로 - 종결 신호에 작동가능하게 연결된다. 번역이 요구되는 경우에, 이는 또한 전형적으로 뉴클레오티드 서열의 적절한 번역에 요구되는 서열을 포함한다. 코딩 영역은 관심 단백질을 코딩할 수 있지만, 또한 센스 또는 안티센스 방향에서 관심 기능적 RNA, 예를 들어 RNAa, siRNA, snoRNA, snRNA, 마이크로RNA, ta-siRNA 또는 임의의 다른 비코딩 조절 RNA를 코딩할 수 있다. 관심 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 구축물은 키메라일 수 있으며, 이는 그의 성분 중 하나 이상이 그의 다른 성분 중 하나 이상에 대해 이종성임을 의미한다. 발현 구축물은 또한 천연 발생이지만, 이종성 발현에 유용한 재조합 형태로 수득되었던 것일 수 있다. 그러나, 전형적으로, 발현 구축물은 숙주에 대해 이종성이며, 즉, 발현 구축물의 특정 DNA 서열은 숙주 세포에서 천연 발생하지 않고, 형질전환 사건에 의해 숙주 세포 또는 숙주 세포의 조상에 도입되었어야 했다. 발현 구축물에서 뉴클레오티드 서열의 발현은 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있으며, 이는 숙주 세포가 일부 특정 외부 자극에 노출되었을 때에만 전사를 개시한다. 세포 발생과 관련하여, 프로모터는 또한 발생의 특정 단계, 예를 들어 생물막 형성, 포자형성에 특이적일 수 있다.
외래: 용어 "외래"는 실험적 조작에 의해 세포의 게놈에 도입된 임의의 핵산 분자 (예를 들어, 유전자 서열)를 지칭하고, 도입된 서열이 일부 변형 (예를 들어, 점 돌연변이, 선택가능한 마커 유전자의 존재 등)을 함유하여, 천연 발생 서열에 대해 구별되는 한, 해당 세포에서 발견되는 서열을 포함할 수 있다.
기능적 연결: 용어 "기능적 연결" 또는 "기능적으로 연결된"은, 각각의 조절 요소가 그의 의도된 기능을 수행하여, 발현될 핵산 서열의 발현을 허용하거나, 변형시키거나, 용이하게 하거나, 또는 그에 달리 영향을 미칠 수 있는 방식으로, 예를 들어 조절 요소 (예를 들어 프로모터)와 상기 핵산 서열, 및 적절한 경우 추가 조절 요소의 순차적인 배열을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 동의어로서 단어 "작동가능한 연결" 또는 "작동가능하게 연결된"이 사용될 수 있다. 센스 또는 안티센스 RNA와 관련하여 핵산 서열의 배열에 따라 발현이 일어날 수 있다. 이를 위해, 화학적인 의미에서 직접적인 연결이 반드시 필요하지는 않다. 예를 들어 인핸서 서열과 같은 유전자 제어 서열은 또한 더 멀리 떨어진 위치로부터 또는 실제로 다른 DNA 분자로부터 표적 서열에 대한 그의 기능을 발휘할 수 있다. 바람직한 배열은 재조합적으로 발현될 핵산 서열이 프로모터로서 작용하는 서열 뒤에 위치하여, 두 서열이 서로 공유적으로 연결된 것이다. 프로모터 서열과 재조합적으로 발현될 핵산 서열 사이의 거리는 바람직하게는 200개 염기 쌍 미만, 특히 바람직하게는 100개 염기 쌍 미만, 매우 특히 바람직하게는 50개 염기 쌍 미만이다. 바람직한 실시양태에서, 전사 시작이 본 발명의 키메라 RNA의 목적하는 시작과 동일하도록 하는 방식으로, 전사될 핵산 서열은 프로모터 뒤에 위치한다. 기능적 연결 및 발현 구축물은 통상적으로 기재된 바와 같은 (예를 들어, Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY); Silhavy et al. (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY); Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience; Gelvin et al. (Eds) (1990) Plant Molecular Biology Manual; Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, The Netherlands) 재조합 및 클로닝 기술에 의해 생성될 수 있다. 그러나, 예를 들어 제한 효소에 특이적인 절단 부위를 갖는 링커로서, 또는 신호 펩티드로서 작용하는 추가 서열 또한 두 서열 사이에 위치할 수 있다. 서열의 삽입은 또한 융합 단백질의 발현을 야기할 수 있다. 바람직하게는, 조절 영역, 예를 들어 프로모터와 발현될 핵산 서열의 연결로 이루어진 발현 구축물은 벡터-통합된 형태로 존재할 수 있고, 예를 들어 형질전환에 의해 식물 게놈에 삽입될 수 있다.
유전자: 용어 "유전자"는 유전자 산물 (예를 들어, 폴리펩티드 또는 기능적 RNA)의 발현을 일부 방식으로 조절할 수 있는 적절한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 영역을 지칭한다. 유전자는 코딩 영역 (오픈 리딩 프레임, ORF)의 앞에 (상류) 및 뒤에 (하류) DNA의 비번역 조절 영역 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 억제자 등) 뿐만 아니라, 적용가능한 경우, 개별 코딩 영역들 (즉, 엑손) 사이에 개재 서열 (즉, 인트론)을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "구조 유전자"는 mRNA로 전사된 다음, 특정 폴리펩티드의 특징적인 아미노산의 서열로 번역되는 DNA 서열을 의미하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용될 때 "유전자 편집"은 세포의 게놈의 특이적 위치에서 특이적 돌연변이의 도입을 의미한다. 유전자 편집은 보다 진보된 기술을 적용하는, 예를 들어 CRISPR Cas 시스템 및 공여자 DNA, 또는 돌연변이유발 활성, 예컨대 데아미나제에 연결된 CRISPR Cas 시스템을 사용하는 정확한 편집에 의해 도입될 수 있다 (WO15133554, WO17070632).
게놈 및 게놈 DNA: 용어 "게놈" 또는 "게놈 DNA"는 숙주 유기체의 유전가능한 유전 정보를 지칭한다. 진핵생물에서, 상기 게놈 DNA는 핵의 DNA (또한 염색체 DNA로 지칭됨) 뿐만 아니라 색소체 (예를 들어, 엽록체) 및 다른 세포 소기관 (예를 들어, 미토콘드리아)의 DNA를 포함한다. 바람직하게는, 용어 게놈 또는 게놈 DNA는 핵의 염색체 DNA를 지칭한다. 원핵생물에서, 상기 게놈 DNA는 박테리아 세포 내 염색체 DNA를 포함한다.
이종성: 핵산 분자 또는 DNA와 관련하여 용어 "이종성"은 천연에서, 예를 들어 WT 식물의 게놈에서 작동가능하게 연결되지 않거나, 또는 천연에서, 예를 들어 WT 식물의 게놈에서 상이한 장소 또는 위치에서 작동가능하게 연결되는 제2 핵산 분자, 예를 들어 프로모터에 작동가능하게 연결되거나 또는 작동가능하게 연결되도록 조작된 핵산 분자를 지칭한다.
바람직하게는, 핵산 분자 또는 DNA, 예를 들어 NEENA와 관련하여 용어 "이종성"은 천연에서 작동가능하게 연결되지 않는 제2 핵산 분자, 예를 들어 프로모터에 작동가능하게 연결되거나 또는 작동가능하게 연결되도록 조작된 핵산 분자를 지칭한다.
핵산 분자 및 그에 연결된 하나 이상의 조절 핵산 분자 (예컨대 프로모터 또는 전사 종결 신호)를 포함하는 이종성 발현 구축물은 예를 들어 실험적 조작에 의해 기원하는 구축물이며, 여기서 a) 상기 핵산 분자, 또는 b) 상기 조절 핵산 분자 또는 c) 둘 다 (즉 (a) 및 (b))는 그의 천연 (본래의) 유전 환경에 위치하지 않거나 또는 실험적 조작에 의해 변형되었고, 변형의 예는 하나 이상의 뉴클레오티드 잔기의 치환, 부가, 결실, 역전 또는 삽입이다. 천연 유전 환경은 기원 유기체의 천연 염색체 로커스, 또는 게놈 라이브러리의 존재를 지칭한다. 게놈 라이브러리의 경우, 핵산 분자의 서열의 천연 유전 환경은 바람직하게는 적어도 부분적으로 유지된다. 환경은 적어도 한 측에서 핵산 서열을 플랭킹하고, 적어도 50 bp, 바람직하게는 적어도 500 bp, 특히 바람직하게는 적어도 1,000 bp, 매우 특히 바람직하게는 적어도 5,000 bp 길이의 서열을 갖는다. 천연 발생 발현 구축물 - 예를 들어 프로모터와 상응하는 유전자의 천연 발생 조합물 -은 예를 들어 돌연변이유발과 같은 비-천연의 합성 "인공적인" 방법에 의해 변형될 때 트랜스제닉 발현 구축물이 된다. 이러한 방법은 (US 5,565,350; WO 00/15815)에 기재되어 있다. 예를 들어, 핵산 분자의 본래의 프로모터가 아닌 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 분자를 코딩하는 단백질은 프로모터에 대해 이종성인 것으로 간주된다. 바람직하게는, 이종성 DNA는 내인성이 아니거나 또는 그가 도입되는 세포와 천연적으로 회합되지 않지만, 또 다른 세포로부터 수득되었거나 또는 합성되었다. 이종성 DNA는 또한 일부 변형, 내인성 DNA 서열의 비-천연 발생의 다중 카피, 또는 그에 물리적으로 연결된 또 다른 DNA 서열과 천연적으로 회합되지 않는 DNA 서열을 함유하는 내인성 DNA 서열을 포함한다. 일반적으로, 반드시 그런 것은 아니지만, 이종성 DNA는 그가 발현되는 세포에 의해 일반적으로 생성되지 않는 RNA 또는 단백질을 코딩한다.
본원에서 정의된 바와 같이 용어 "혼성화"는 실질적으로 상보성인 뉴클레오티드 서열이 서로 어닐링되는 과정이다. 혼성화 과정은 전적으로 용액 중에서 발생할 수 있고, 즉, 상보성인 핵산 둘 다 용액 중에 있다. 혼성화 과정은 또한 매트릭스, 예컨대 자성 비드, 세파로스 비드 또는 임의의 다른 수지에 고정된 상보성인 핵산 중 하나에 의해 발생할 수 있다. 혼성화 과정은 추가로 고체 지지체, 예컨대 니트로-셀룰로스 또는 나일론 막에 고정되거나 또는 예를 들어 포토리쏘그래피에 의해 규질 유리 지지체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 운반체에 고정된 상보성인 핵산 중 하나에 의해 발생할 수 있다 (후자는 핵산 어레이 또는 마이크로어레이로서 또는 핵산 칩으로서 공지되어 있음). 혼성화가 발생하게 하기 위해, 핵산 분자는 일반적으로 열적으로 또는 화학적으로 변성되어, 이중 가닥을 2개의 단일 가닥으로 용융시키고/거나 단일 가닥 핵산으로부터 헤어핀 또는 다른 이차 구조를 제거한다.
혼성체의 이러한 형성 또는 용융은 온도를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다양한 파라미터에 의존한다. 온도의 증가는 용융을 선호하는 반면에, 온도의 감소는 혼성화를 선호한다. 그러나, 이러한 혼성체 형성 과정은 적용된 온도 변화를 선형 방식으로 따르지 않는다: 혼성화 과정은 동적이고, 이미 형성된 뉴클레오티드 쌍은 인접한 뉴클레오티드의 쌍 형성 또한 지지하고 있다. 따라서, 충분히 근사적으로, 혼성화는 가부형 과정이고, 혼성화와 비혼성화 사이의 경계를 근본적으로 정의하는 온도가 있다. 이 온도가 용융 온도 (Tm)이다. Tm은 주어진 뉴클레오티드 서열의 모든 분자의 50%가 이중 가닥으로 혼성화되고, 50%가 단일 가닥으로서 존재하는 섭씨 도 단위의 온도이다.
용융 온도 (Tm)는 분석된 핵산 서열의 물리적 특성에 의존하여, 2개의 별개의 서열 사이의 관계를 나타낼 수 있다. 그러나, 용융 온도 (Tm)는 또한 서열과 직접적으로 관계되지 않은 다양한 다른 파라미터에 의해 영향을 받고, 혼성화 실험의 적용된 조건은 고려되어야 한다. 예를 들어, 염 (예를 들어 1가 양이온)의 증가는 보다 높은 Tm을 초래하고 있다.
주어진 혼성화 조건에 대한 Tm은 물리적 혼성화 실험을 수행함으로써 결정될 수 있지만, Tm은 또한 DNA 서열의 주어진 쌍에 대해 인실리코 추정될 수 있다. 본 실시양태에서, 마인코트(Meinkoth) 및 발(Wahl)의 방정식 (Anal. Biochem., 138:267-284, 1984)이 50개 이상의 염기의 길이를 갖는 스트레치에 대해 사용된다: Tm = 81.5℃ + 16.6 (log M) + 0.41 (% GC) - 0.61 (% 포름) - 500/L.
M은 1가 양이온의 몰 농도이고, % GC는 DNA 스트레치에서 구아노신 및 시토신 뉴클레오티드의 백분율이고, % 포름은 혼성화 용액 중 포름아미드의 백분율이고, L은 염기 쌍에서 혼성체의 길이이다. 방정식은 0.01 내지 0.4 M의 염 범위 및 30% 내지 75% 범위의 % GC에 대한 것이다.
상기 Tm은 완전히 매칭된 프로브에 대한 온도이지만, Tm은 각각의 1%의 미스매치에 대해 약 1℃만큼 감소된다 (Bonner et al., J. Mol. Biol. 81: 123-135, 1973): Tm = [ 81.5℃ + 16.6(log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (%포름아미드) - 500/L ] - %비-동일성.
이 방정식은 35개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 프로브에 유용하고 과학적 방법 문헌 (예를 들어: "Recombinant DNA Principles and Methodologies", James Greene, Chapter "Biochemistry of Nucleic acids", Paul S. Miller, page 55; 1998, CRC Press), 많은 특허 출원 (예를 들어: US 7026149), 및 또한 상업 회사의 데이터 시트 (예를 들어 www.genomics.agilent.com으로부터의 "Equations for Calculating Tm")에서 널리 참조된다.
본 실시양태에서 덜 선호되는 Tm 계산을 위한 다른 식은 단지 표시된 사례에 대해서만 사용될 수 있다:
DNA-RNA 혼성체의 경우 (Casey, J. and Davidson, N. (1977) Nucleic Acids Res.,4:1539):
Tm = 79.8℃ +18.5 (log M) + 0.58 (% GC) + 11.8 (%GC * % GC) -0.5 (% 포름) - 820/L.
RNA-RNA 혼성체의 경우 (Bodkin, D.K. and Knudson, D.L. (1985) J. Virol. Methods, 10: 45):
Tm = 79.8℃ +18.5 (log M) + 0.58 (% GC) + 11.8 (%GC * %GC) -0.35 (% 포름) - 820/L.
20개 미만의 염기의 올리고뉴클레오티드 프로브의 경우 (Wallace, R.B., et al. (1979) Nucleic Acid Res. 6: 3535): Tm = 2 x n(A+T) + 4 x n(G+C) (n은 혼성체를 형성하는 프로브에서의 각각의 염기의 수임).
20-35개의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드 프로브의 경우, 변형된 월리스(Wallace) 계산이 적용될 수 있다: Tm = 22 + 1.46 n(A+T) + 2.92 n(G+C) (n은 혼성체를 형성하는 프로브에서의 각각의 염기의 수임).
다른 올리고뉴클레오티드의 경우, 용융 온도 계산에 대한 가장 가까운 이웃 모델이 적절한 열역학적 데이터와 함께 사용되어야 한다:
Tm = (∑(ΔHd)+ΔHi) / ( ∑(ΔSd)+ΔSi+ΔS자기 + Rxln(cT/b) ) + 16.6log[ Na +] - 273.15
(Breslauer, K.J., Frank, R., Bloecker, H., Marky, L.A. 1986 Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc. Natl Acad. Sci. USA 833746-3750; Alejandro Panjkovich, Francisco Melo, 2005. Comparison of different melting temperature calculation methods for short DNA sequences. Bioinformatics, 21 (6): 711-722)
여기서:
Tm은 섭씨 도 단위의 용융 온도이고;
∑(ΔHd) 및 ∑(ΔSd)는 모든 내부의 가장 가까운 이웃 이중체에 걸쳐 계산된 엔탈피 및 엔트로피 (상응하게)의 합계이고;
ΔS자기는 자기-상보성인 서열에 대한 엔트로피 패널티이고;
ΔHi 및 ΔSi는 각각 개시 엔탈피 및 엔트로피의 합계이고;
R은 기체 상수이고 (1.987 cal/K·mol로 고정됨);
cT는 몰 단위의 총 가닥 농도이고;
상수 b는 비-자기-상보성인 서열에 대해 4의 값 또는 자기-상보성인 가닥의 이중체 또는 가닥 중 하나가 상당히 과량인 경우의 이중체에 대해 1과 동일한 값을 채택한다.
열역학적 계산은 어닐링이 거의 pH 7.0에서 완충 용액 중에 발생하고 두 상태 전이가 발생하는 것을 가정한다.
계산을 위한 열역학적 값은 문헌 (Alejandro Panjkovich, Francisco Melo, 2005. Comparison of different melting temperature calculation methods for short DNA sequences. Bioinformatics, 21 (6): 711-722)의 표 1로부터, 또는 원저 연구 논문 (Breslauer, K.J., Frank, R., Bloecker, H., Marky, L.A. 1986 Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc. Natl Acad. Sci. USA 833746-3750; SantaLucia, J., Jr, Allawi, H.T., Seneviratne, P.A. 1996 Improved nearest-neighbor parameters for predicting DNA duplex stability. Biochemistry 353555-3562; Sugimoto, N., Nakano, S., Yoneyama, M., Honda, K. 1996 Improved thermodynamic parameters and helix initiation factor to predict stability of DNA duplexes. Nucleic Acids Res. 244501-4505)으로부터 수득될 수 있다.
본 실시양태에 따른 Tm의 인실리코 추정에 대해, 먼저 2개의 서열 사이의 생물정보학적 서열 정렬의 세트가 생성된다. 이러한 정렬은 국소 정렬을 생성하는 프로그램 "Blast" (NCBI), "Water" (EMBOSS) 또는 "Matcher" (EMBOSS), 또는 전체 정렬을 생성하는 "Needle" (EMBOSS)과 같은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 도구에 의해 생성될 수 있다. 이들 도구는 그의 디폴트 파라미터 설정 뿐만 아니라, 일부 파라미터 변환에 적용되어야 한다. 예를 들어, 프로그램 "MATCHER"는 갭 개방/갭 연장에 대한 다양한 파라미터 (14/4; 14/2; 14/5; 14/8; 14/10; 20/2; 20/5; 20/8; 20/10; 30/2; 30/5; 30/8; 30/10; 40/2; 40/5; 40/8; 40/10; 10/2; 10/5; 10/8; 10/10; 8/2; 8/5; 8/8; 8/10; 6/2; 6/5; 6/8; 6/10과 같음)에 적용될 수 있고 프로그램 "WATER"는 갭 개방/갭 연장에 대한 다양한 파라미터 (10/0,5; 10/1; 10/2; 10/3; 10/4; 10/6; 15/1; 15/2; 15/3; 15/4; 15/6; 20/1; 20/2; 20/3; 20/4; 20/6; 30/1; 30/2; 30/3; 30/4; 30/6; 45/1; 45/2; 45/3; 45/4; 45/6; 60/1; 60/2; 60/3; 60/4; 60/6과 같음)에 적용될 수 있고, 또한 이들 프로그램은 제공된 바와 같은 두 뉴클레오티드 서열 모두를 사용함으로써 적용될 수 있을 뿐만 아니라, 그의 역 상보체 형태의 서열 중 하나에 적용될 수 있다. 예를 들어, BlastN (NCBI)은 증가된 e-값 컷-오프 (예를 들어 e+1 또는 심지어 e+10)에 적용되어 또한 특히 작은 크기의 데이터 베이스에서 매우 짧은 정렬을 확인할 수 있다.
혼성화가 반드시 2개의 서열의 완전한 길이에 걸쳐 발생하는 것은 아니지만, 별개의 영역에서 가장 잘 발생하여 실제 용융 온도를 결정할 수 있기 때문에, 국소 정렬이 고려되는 것이 중요하다. 따라서, 모든 생성된 정렬로부터, 정렬 길이, 정렬 %GC 함량 (보다 정확한 방식으로, 정렬 내에서 매칭되는 염기의 %GC 함량), 및 정렬 동일성이 결정되어야 한다. 이어서, 각각의 정렬에 대한 예측 용융 온도 (Tm)가 계산되어야 한다. 가장 높은 계산된 Tm이 실제 용융 온도를 예측하는 데 사용된다.
본원에서 정의된 바와 같이 용어 "본 발명의 완전한 서열에 걸친 혼성화"는 본 발명의 서열이 약 300 내지 500개 염기 길이의 조각으로 단편화될 때 300개 염기보다 더 긴 서열에 대해, 모든 단편이 혼성화해야 한다는 것을 의미한다. 예를 들어, DNA는 하나의 제한 효소 또는 제한 효소의 조합을 사용함으로써 조각으로 단편화될 수 있다. 이어서, Tm의 생물정보학적 인실리코 계산이 모든 단편에 대해 상기 기재된 바와 같이 동일한 절차에 의해 수행된다. 개별 단편의 물리적 혼성화 표준 서던 분석, 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 비교할 만한 방법에 의해 분석될 수 있다.
본원에서 정의된 바와 같이 용어 "엄격성"은 2개의 뉴클레오티드 서열 사이에서 혼성체 형성이 일어날 수 있는 용이성을 기재한다. "보다 높은 엄격성"의 조건은 1개의 서열의 보다 많은 염기가 다른 서열과 쌍 형성될 것을 필요로 하고 (용융 온도 Tm은 "보다 높은 엄격성"의 조건에서 낮아짐), "보다 낮은 엄격성"의 조건은 일부 보다 많은 염기가 쌍 형성되지 않게 한다. 따라서, 2개의 서열 사이의 관계의 정도가 이들이 여전히 혼성체를 형성할 수 있는 실제 엄격성 조건에 의해 추정될 수 있다. 엄격성의 증가는 실험 혼성화 온도 상수를 유지하고 염 농도를 낮추거나, 또는 염 상수를 유지하고 실험 혼성화 온도, 또는 이들 파라미터의 조합을 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 또한, 포름아미드의 증가는 엄격성을 증가시킬 것이다. 통상의 기술자는 혼성화 동안 변경될 수 있고 엄격성 조건을 유지하거나 또는 변화시킬 추가적인 파라미터를 알고 있다 (Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York or to Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 and yearly updates).
전형적인 혼성화 실험은 초기 혼성화 단계에 이어서, 하나 내지 여러 세척 단계에 의해 수행된다. 이들 단계에 사용된 용액은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 EDTA, SDS, 단편화된 정자 DNA 또는 유사한 시약과 같은, 분석된 서열의 분해를 방지하고 있고/거나 프로브의 비특이적 백그라운드 결합을 방지하는 추가적인 성분을 함유할 수 있다 (Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York or to Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 and yearly updates).
혼성화 실험을 위한 전형적인 프로브는 처음에 파인베르크(Feinberg) 및 포겔슈타인(Vogelstein)에 의해 개발된 무작위-프라이밍-표지 방법에 의해 생성되고 (Anal. Biochem., 132 (1), 6-13 (1983); Anal. Biochem., 137 (1), 266-7 (1984) 표지될 DNA에 대한 모든 가능한 헥사뉴클레오티드의 혼합물의 혼성화에 기반한다. 표지된 프로브 산물은 실제로 가변적인 길이의 단편의 수집일 것이고, 전형적으로 100 - 1000개 뉴클레오티드 길이의 크기 범위이며, 가장 높은 단편 농도는 전형적으로 200 내지 400 bp 즈음이다. 혼성화 실험을 위한 프로브로서 최종적으로 사용된 프로브 단편의 실제 크기 범위는 또한 사용된 표지 방법 파라미터, 생성된 프로브의 후속 정제 (예를 들어 아가로스 겔), 및 표지에 사용되는 사용된 주형 DNA의 크기 (큰 주형은 예를 들어 표지 전에 4 bp 커터, 예를 들어 HaeIII를 사용하여 제한 소화될 수 있음)에 의해 영향을 받을 수 있다.
본 발명에 대해, 본원에서 기재된 서열은 프로브가 다른 서열로부터 생성된 혼성화 실험에 의해 분석되고, 이 프로브는 표준 무작위-프라이밍-표지 방법에 의해 생성된다. 본 발명에 대해, 프로브는 약 200 - 400개 뉴클레오티드의 크기를 갖는 표지된 올리고뉴클레오티드의 세트로 이루어져 있다. 본 발명의 서열과 다른 서열 사이의 혼성화는, 상기 정의된 바와 같이, 프로브의 혼성화가 본 발명의 완전한 서열에 걸쳐 발생한 것을 의미한다. 혼성화 실험은 최종 세척 단계의 엄격성에 의해 가장 높은 엄격성을 달성함으로써 수행된다. 최종 세척 단계는 적어도 세척 조건 1: 50℃에서 1.06 x SSC, 0.1 % SDS, 0 % 포름아미드, 또 다른 실시양태로 적어도 세척 조건 2: 55℃에서 1.06 x SSC, 0.1 % SDS, 0 % 포름아미드, 또 다른 실시양태로 적어도 세척 조건 3: 60℃에서 1.06 x SSC, 0.1 % SDS, 0 % 포름아미드, 또 다른 실시양태로 적어도 세척 조건 4: 65℃에서 1.06 x SSC, 0.1 % SDS, 0 % 포름아미드, 또 다른 실시양태로 적어도 세척 조건 5: 65℃에서 0.52 x SSC, 0.1 % SDS, 0 % 포름아미드, 또 다른 실시양태로 적어도 세척 조건 6: 65℃에서 0.25 x SSC, 0.1 % SDS, 0 % 포름아미드, 또 다른 실시양태로 적어도 세척 조건 7: 65℃에서 0.12 x SSC, 0.1 % SDS, 0 % 포름아미드, 또 다른 실시양태로 적어도 세척 조건 8: 65℃에서 0.07 x SSC, 0.1 % SDS, 0 % 포름아미드의 엄격성 조건에 비교할 만한 엄격성 조건을 갖는다.
"낮은 엄격한 세척"은 적어도 세척 조건 1의 엄격성 조건과 비교할 만하지만, 세척 조건 3보다 더 엄격하지는 않은 엄격성 조건을 가지며, 여기서 세척 조건은 상기 기재된 바와 같다.
"높은 엄격한 세척"은 적어도 세척 조건 4, 또 다른 실시양태로 적어도 세척 조건 5, 또 다른 실시양태로 적어도 세척 조건 6, 또 다른 실시양태로 적어도 세척 조건 7, 또 다른 실시양태로 적어도 세척 조건 8의 엄격성 조건과 비교할 만한 엄격성 조건을 가지며, 여기서 세척 조건은 상기 기재된 바와 같다.
"동일성": 2개 이상의 핵산 또는 아미노산 분자의 비교와 관련하여 사용될 때 "동일성"은 상기 분자의 서열이 특정 정도의 서열 유사성을 공유하고, 서열이 부분적으로 동일한 것을 의미한다.
효소 변이체는 모 효소와 비교할 때 그들의 서열 동일성에 의해 정의될 수 있다. 서열 동일성은 통상적으로 "% 서열 동일성" 또는 "% 동일성"으로 제공된다. 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트-동일성을 결정하기 위해, 제1 단계에서 이들 2개의 서열 사이에서 쌍별 서열 정렬을 생성하며, 여기서 2개의 서열은 그들의 완전한 길이에 걸쳐 정렬된다 (즉, 쌍별 전체 정렬). 정렬은 니들만(Needleman) 및 운쉬(Wunsch) 알고리즘을 실행하는 프로그램에 의해 (J. Mol. Biol. (1979) 48, p. 443-453), 바람직하게는 프로그램 디폴트 파라미터 (갭 개방=10.0, 갭 연장=0.5 및 매트릭스=EDNAFULL)를 사용한 프로그램 "NEEDLE"을 사용함으로써 (The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS)) 생성된다.
하기 예시는 2개의 뉴클레오티드 서열을 예시하기 위해 의도되지만, 동일한 계산이 단백질 서열에 적용된다:
Seq A: AAGATACTG 길이: 9개 염기
Seq B: GATCTGA 길이: 7개 염기
따라서, 더 짧은 서열은 서열 B이다.
그들의 완전한 길이에 걸쳐 두 서열을 나타내는 쌍별 전체 정렬을 생성하면 다음과 같다:
Figure pct00001
정렬에서 "I" 기호는 동일한 잔기를 나타낸다 (이는 DNA의 경우 염기 또는 단백질의 경우 아미노산을 의미함). 동일한 잔기의 수는 6개이다.
정렬에서 "-" 기호는 갭을 나타낸다. Seq B 내에서 정렬에 의해 도입된 갭의 수는 1개이다. Seq B의 경계에서 정렬에 의해 도입된 갭의 수는 2개이고, Seq A의 경계에서는 1개이다.
그들의 완전한 길이에 걸쳐 정렬된 서열을 나타내는 정렬 길이는 10개이다.
본 발명에 따라 그의 완전한 길이에 걸쳐 보다 짧은 서열을 나타내는 쌍별 정렬을 생성하면 결과적으로 다음과 같다:
Figure pct00002
본 발명에 따라 그의 완전한 길이에 걸쳐 서열 A를 나타내는 쌍별 정렬을 생성하면 결과적으로 다음과 같다:
Figure pct00003
본 발명에 따라 그의 완전한 길이에 걸쳐 서열 B를 나타내는 쌍별 정렬을 생성하면 결과적으로 다음과 같다:
Figure pct00004
그의 완전한 길이에 걸쳐 보다 짧은 서열을 나타내는 정렬 길이는 8개이다 (보다 짧은 서열의 정렬 길이에 고려되는 1개의 갭이 존재함).
따라서, 그의 완전한 길이에 걸쳐 Seq A를 나타내는 정렬 길이는 9개일 것이다 (Seq A가 본 발명의 서열임을 의미함).
따라서, 그의 완전한 길이에 걸쳐 Seq B를 나타내는 정렬 길이는 8개일 것이다 (Seq B가 본 발명의 서열임을 의미함).
2개의 서열을 정렬시킨 후, 제2 단계에서, 생성된 정렬로부터 동일성 값이 결정된다. 이 설명의 목적을 위해, 퍼센트 동일성은 %-동일성 = (동일한 잔기 / 그의 완전한 길이에 걸쳐 본 발명의 각각의 서열을 나타내는 정렬 영역의 길이) *100에 의해 계산된다. 따라서, 본 실시양태에 따른 2개의 아미노산 서열의 비교와 관련하여 서열 동일성은 동일한 잔기의 수를 그의 완전한 길이에 걸쳐 본 발명의 각각의 서열을 나타내는 정렬 영역의 길이로 나누어서 계산된다. 이 값에 100을 곱하여 "%-동일성"을 제공한다. 상기 제공된 예시에 따라, %-동일성은 다음과 같다: Seq A가 본 발명의 서열인 경우 (6 / 9) * 100 = 66.7 %; Seq B가 본 발명의 서열인 경우 (6 / 8) * 100 =75%.
InDel은 NHEJ에 의한 DSB의 복구와 연관된 유기체의 게놈에서 염기의 무작위 삽입 또는 결실에 대한 용어이다. 이는 1 내지 10000개 염기 쌍 길이로 측정되는 작은 유전자 변형으로 분류된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 이는 표적 부위 내에 또는 그 부근에서 (예를 들어 1000 bp, 900 bp, 800 bp, 700 bp, 600 bp, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 250 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp, 50 bp, 40 bp, 30 bp, 25 bp, 20 bp, 15 bp, 10 bp 또는 5 bp 미만 상류 및/또는 하류) 염기의 무작위 삽입 또는 결실을 지칭한다.
표적 DNA의 표적 부위에서 공여자 DNA 분자의 도입과 관련하여 용어 "도입하는", "도입" 등은 예를 들어 표적 영역에의 공여자 DNA 분자 또는 그의 일부의 물리적 통합에 의한 표적 영역에의 공여자 DNA 분자의 서열의 임의의 도입, 또는 공여자 DNA가 폴리머라제를 위한 주형으로 사용되는 것인 표적 영역에의 공여자 DNA 분자의 서열 또는 그의 일부의 도입을 의미한다.
이소제닉: 이종성 DNA 서열의 존재 또는 부재에 의해 상이할 수 있다는 점을 제외하고는, 유전적으로 동일한 유기체 (예를 들어, 식물).
단리된: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 물질이 인간의 손에 의해 제거되었고, 그의 원래의 천연 환경으로부터 떨어져 존재하며, 따라서 천연 산물이 아닌 것을 의미한다. 단리된 물질 또는 분자 (예컨대 DNA 분자 또는 효소)는 정제된 형태로 존재할 수 있거나 또는 비-천연 환경, 예컨대, 예를 들어, 트랜스제닉 숙주 세포에 존재할 수 있다. 예를 들어, 살아있는 식물에 존재하는 천연 발생 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된 것이 아니지만, 자연계에서 공존하는 물질 중 일부 또는 전부로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부일 수 있고/거나, 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수 있으며, 이러한 벡터 또는 조성물은 그의 원래의 환경의 일부가 아니라는 점에서 단리된 것이다. 바람직하게는, "단리된 핵산 서열"에서와 같이 핵산 분자와 관련하여 사용될 때 용어 "단리된"은 그의 천연 공급원에서 일반적으로 회합되는 적어도 하나의 오염 핵산 분자로부터 식별되고 분리된 핵산 서열을 지칭한다. 단리된 핵산 분자는 천연에서 발견되는 것과 상이한 형태 또는 설정으로 존재하는 핵산 분자이다. 대조적으로, 비-단리된 핵산 분자는 천연에서 존재하는 상태로 발견되는 핵산 분자, 예컨대 DNA 및 RNA이다. 예를 들어, 주어진 DNA 서열 (예를 들어, 유전자)은 숙주 세포 염색체 상에서 이웃 유전자에 근접하여 발견되고; RNA 서열, 예컨대 특이적 단백질을 코딩하는 특이적 mRNA 서열은 다수의 단백질을 코딩하는 수많은 다른 mRNA와의 혼합물로서 세포에서 발견된다. 그러나, 예를 들어 서열식별번호: 12를 포함하는 단리된 핵산 서열은 예를 들어 핵산 서열이 천연 세포의 것과 상이한 염색체 또는 염색체외 위치에 있거나, 또는 천연에서 발견되는 것과 상이한 핵산 서열에 의해 달리 플랭킹된 것인 서열식별번호: 12를 일반적으로 함유하는 세포에서의 이러한 핵산 서열을 포함한다. 단리된 핵산 서열은 단일-가닥 또는 이중-가닥 형태로 존재할 수 있다. 단리된 핵산 서열을 이용하여 단백질을 발현하는 경우, 핵산 서열은 센스 또는 코딩 가닥의 최소한 적어도 일부를 함유할 것이다 (즉, 핵산 서열은 단일-가닥일 수 있음). 대안적으로, 이는 센스 및 안티센스 가닥 둘 다를 함유할 수 있다 (즉, 핵산 서열은 이중-가닥일 수 있음).
비-코딩: 용어 "비-코딩"은 발현된 단백질의 일부 또는 전부를 코딩하지 않는 핵산 분자의 서열을 지칭한다. 비-코딩 서열은 인트론, 인핸서, 프로모터 영역, 3' 비번역 영역, 및 5' 비번역 영역이 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
핵산 및 뉴클레오티드: 용어 "핵산" 및 "뉴클레오티드"는 천연 발생 또는 합성 또는 인공적인 핵산 또는 뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "핵산" 및 "뉴클레오티드"는 단일- 또는 이중-가닥, 센스 또는 안티센스 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 임의의 뉴클레오티드 유사체 및 이들의 중합체 또는 혼성체를 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 함축적으로 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 축퇴 코돈 치환) 및 상보성인 서열, 뿐만 아니라 명시적으로 나타낸 서열을 포함한다. 용어 "핵산"은 본원에서 "유전자", "cDNA", "mRNA", "올리고뉴클레오티드", 및 "폴리뉴클레오티드"와 상호교환적으로 사용된다. 뉴클레오티드 유사체는 5-위치 피리미딘 변형, 8-위치 퓨린 변형, 시토신 엑소시클릭 아민에서의 변형, 5-브로모-우라실의 치환 등; 및 2'-OH가 H, OR, R, 할로, SH, SR, NH2, NHR, NR2, 또는 CN으로부터 선택된 기로 대체된 당-변형된 리보뉴클레오티드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 2'-위치 당 변형을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 염기, 당 및/또는 포스페이트의 화학적 구조에서 변형을 갖는 뉴클레오티드를 포함한다. 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)는 또한 비-천연 요소, 예컨대 비-천연 염기, 예를 들어, 이노신 및 크산틴, 비-천연 당, 예를 들어 2'-메톡시 리보스, 또는 비-천연 포스포디에스테르 연결, 예를 들어, 메틸포스포네이트, 포스포로티오에이트 및 펩티드를 포함할 수 있다.
핵산 서열: 문구 "핵산 서열"은 5'-단부에서 3'-단부로 판독한 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일 또는 이중-가닥 중합체를 지칭한다. 이는 염색체 DNA, 자가-복제 플라스미드, DNA 또는 RNA의 감염성 중합체, 및 주로 구조적 역할을 수행하는 DNA 또는 RNA를 포함한다. "핵산 서열"은 또한 뉴클레오티드를 나타내는 약어, 문자, 기호 또는 단어의 연이은 목록을 지칭한다. 한 실시양태에서, 핵산은 통상적으로 100개 미만의 뉴클레오티드 길이인 비교적 짧은 핵산인 "프로브"일 수 있다. 종종 핵산 프로브는 약 50개의 뉴클레오티드 길이 내지 약 10개의 뉴클레오티드 길이이다. 핵산의 "표적 영역"은 관심의 대상인 것으로 확인된 핵산의 일부이다. 핵산의 "코딩 영역"은 적절한 조절 서열의 제어 하에 배치될 때 특정 폴리펩티드 또는 단백질을 생산하도록 서열-특이적 방식으로 전사되고 번역되는 핵산의 일부이다. 코딩 영역은 이러한 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩한다고 한다.
올리고뉴클레오티드: 용어 "올리고뉴클레오티드"는 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 그의 모방체의 올리고머 또는 중합체, 뿐만 아니라 유사하게 기능하는 비-천연 발생 부분을 갖는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 이러한 변형된 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는 바람직한 특성, 예컨대, 예를 들어, 증강된 세포 흡수, 핵산 표적에 대한 증강된 친화도, 및 뉴클레아제의 존재 하에 증가된 안정성으로 인해 종종 본래의 형태에 비해 바람직하다. 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 연결 (예를 들어, 포스포디에스테르) 또는 대체 연결에 의해 서로 공유적으로 커플링된 2개 이상의 핵단량체를 포함한다.
오버행: "오버행"은 이중-가닥 올리고뉴클레오티드 분자의 5'- 또는 3'-히드록실 단부 상의 비교적 짧은 단일-가닥 뉴클레오티드 서열이다 (또한 "연장부", "돌출 단부," 또는 "점착성 단부"로 지칭됨).
폴리펩티드: 용어 "폴리펩티드", "펩티드", "올리고펩티드", "폴리펩티드", "유전자 산물", "발현 산물" 및 "단백질"은 본원에서 연속하는 아미노산 잔기의 중합체 또는 올리고머를 지칭하는 데 상호교환적으로 사용된다.
전단백질: 일반적으로 세포 소기관, 예컨대 엽록체에 대해 표적화되고, 여전히 그의 수송 펩티드를 포함하는 단백질.
표적 영역에서 공여자 DNA 분자의 도입과 관련하여 "정확한"은 공여자 DNA 분자 서열에 포함되지 않는 표적 영역의 변경되지 않은 DNA 서열과 비교하여 임의의 InDel, 복제 또는 다른 돌연변이 없이 공여자 DNA 분자의 서열이 표적 영역에 도입되는 것을 의미한다.
일차 전사체: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "일차 전사체"는 유전자의 미성숙 RNA 전사체를 지칭한다. "일차 전사체"는 예를 들어 인트론을 여전히 포함하고/거나, 폴리A 꼬리 또는 캡 구조는 아직 포함하지 않고/거나, 전사체로서 그의 정확한 기능에 필요한 다른 변형, 예컨대 예를 들어 트리밍 또는 편집이 누락되어 있다.
"프로모터" 또는 "프로모터 서열" 또는 "조절 핵산"은 유전자의 전사를 가능하게 하는 유전자와 동일한 가닥 상에서 유전자의 상류에 위치한 뉴클레오티드 서열이다. 프로모터에 이어서 유전자의 전사 시작 부위가 있다. 프로모터는 RNA 폴리머라제 (임의의 요구되는 전사 인자와 함께)에 의해 인식되며, 이는 전사를 개시한다. 프로모터의 기능적 단편 또는 기능적 변이체는 RNA 폴리머라제의 의해 인식가능하고, 전사를 개시할 수 있는 뉴클레오티드 서열이다.
정제된: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "정제된"은 그들의 천연 환경으로부터 제거되거나, 단리되거나 또는 분리된 핵산 또는 아미노산 서열인 분자를 지칭한다. "실질적으로 정제된" 분자는 이들이 천연적으로 회합되는 다른 성분이 적어도 60% 없고, 바람직하게는 적어도 75% 없고, 보다 바람직하게는 적어도 90% 없다. 정제된 핵산 서열은 단리된 핵산 서열일 수 있다.
재조합: 핵산 분자와 관련하여 용어 "재조합"은 재조합 DNA 기술에 의해 생산된 핵산 분자를 지칭한다. 재조합 핵산 분자는 또한 천연에서는 존재하지 않지만, 변형되거나, 변화되거나, 돌연변이되거나 또는 인간에 의해 달리 조작된 분자를 포함할 수 있다. 바람직하게는, "재조합 핵산 분자"는 천연 발생 핵산 분자와 서열이 적어도 하나의 핵산만큼 상이한 비-천연 발생 핵산 분자이다. "재조합 핵산 분자"는 또한 천연 발생이 아닌 핵산 분자의 서열을 해당 순서로 포함하는, 바람직하게는 작동가능하게 연결된 "재조합 구축물"을 포함할 수 있다. 상기 재조합 핵산 분자를 생산하기 위한 바람직한 방법은 클로닝 기술, 지정 또는 비-지정 돌연변이유발, 합성 또는 재조합 기술을 포함할 수 있다.
감소된 발현: 세포에서 핵산 분자의 발현을 "감소시키다" 또는 "낮추다"는 본원에서 동등하게 사용되고 본 발명의 방법을 적용한 후 세포에서의 핵산 분자의 발현의 수준이 방법을 적용하기 전 세포에서의 그의 발현보다, 또는 본 발명의 재조합 핵산 분자가 결여된 참조 세포와 비교하여 더 낮다는 것을 의미한다. 예를 들어, 참조 세포는 시작 조절 핵산 분자를 포함하고 있는 동일한 구축물은 포함하고, 본 발명의 합성 조절 핵산 분자는 포함하지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "감소된" 또는 "낮아진"은 동의어이고 본원에서 발현될 핵산 분자의 감소된, 바람직하게는 유의하게 감소된 발현을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 작용제, 예컨대 단백질, mRNA 또는 RNA의 수준의 "감소"는 수준이 본 발명의 재조합 핵산 분자가 결여된, 예를 들어 시작 조절 핵산 분자는 포함하고 본 발명의 합성 조절 핵산 분자는 포함하지 않는, 실질적으로 동일한 조건 하에 성장한 실질적으로 동일한 세포에 비해 감소된 것을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 표적 유전자에 의해 발현되는 작용제, 예컨대 예를 들어 preRNA, mRNA, rRNA, tRNA, snoRNA, snRNA 및/또는 그에 의해 코딩되는 단백질 산물의 수준의 "감소"는, 수준이 본 발명의 재조합 핵산 분자가 결여된, 예를 들어 시작 조절 핵산 분자는 포함하고 본 발명의 합성 조절 핵산 분자는 포함하지 않는 세포에 비해 10% 이상, 예를 들어 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 예를 들어 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 감소된 것을 의미한다. 감소는 통상의 기술자에게 익숙한 방법에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 핵산 또는 단백질 양의 감소는 예를 들어 단백질의 면역학적 검출에 의해 결정될 수 있다. 게다가, 기술, 예컨대 단백질 검정, 형광, 노던 혼성화, 뉴클레아제 보호 검정, 역전사 (정량적 RT-PCR), ELISA (효소-결합 면역흡착 검정), 웨스턴 블롯팅, 방사선 면역검정 (RIA) 또는 다른 면역검정 및 형광-활성화된 세포 분석 (FACS)이 세포에서 특이적 단백질 또는 RNA를 측정하는 데 이용될 수 있다. 감소된 단백질 산물의 유형에 따라, 유기체 또는 세포의 표현형에 대한 그의 활성 또는 효과 또한 결정될 수 있다. 단백질 양을 결정하는 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 언급될 수 있는 예는 다음과 같다: 마이크로-뷰렛(micro-Biuret) 방법 (Goa J (1953) Scand J Clin Lab Invest 5:218-222), 폴린-시오칼토(Folin-Ciocalteau) 방법 (Lowry OH et al. (1951) J Biol Chem 193:265-275) 또는 CBB G-250 흡수의 측정 (Bradford MM (1976) Analyt Biochem 72:248-254).
센스: 용어 "센스"는 표적 서열과 상보성인 또는 동일한 서열, 예를 들어 단백질 전사 인자에 결합하고 주어진 유전자의 발현에 수반되는 서열을 갖는 핵산 분자를 의미하는 것으로 이해된다. 바람직한 실시양태에 따라, 핵산 분자는 관심 유전자, 및 상기 관심 유전자의 발현을 허용하는 요소를 포함한다.
유의한 증가 또는 감소: 측정 기술에서 고유한 오차 한계보다 큰, 예를 들어 효소 활성에서 또는 유전자 발현에서 증가 또는 감소, 바람직하게는 대조군 효소의 활성 또는 대조군 세포에서의 발현의 약 2배 이상 증가 또는 감소, 보다 바람직하게는 약 5배 이상 증가 또는 감소, 및 가장 바람직하게는 약 10배 이상 증가 또는 감소.
소형 핵산 분자: "소형 핵산 분자"는 핵산 또는 그의 유도체, 예컨대 RNA 또는 DNA로 이루어진 분자로 이해된다. 이들은 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있고, 약 15 내지 약 30 bp, 예를 들어 15 내지 30 bp, 보다 바람직하게는 약 19 내지 약 26 bp, 예를 들어 19 내지 26 bp, 보다 더 바람직하게는 약 20 내지 약 25 bp, 예를 들어 20 내지 25 bp이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 약 21 내지 약 24 bp, 예를 들어 21 내지 24 bp이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 소형 핵산 분자는 약 21 bp 내지 약 24 bp, 예를 들어 21 bp 내지 24 bp이다.
실질적으로 상보성인: 가장 넓은 의미에서, 참조 또는 표적 뉴클레오티드 서열과 관련하여 본원에서 뉴클레오티드 서열에 대해 사용될 때 용어 "실질적으로 상보성인"은 상기 참조 또는 표적 뉴클레오티드 서열의 실질적으로 상보성인 뉴클레오티드 서열과 정확하게 상보성인 서열 사이에 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80% 또는 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 93%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95% 또는 96%, 여전히 훨씬 더 바람직하게는 적어도 97% 또는 98%, 여전히 훨씬 더 바람직하게는 적어도 99% 또는 가장 바람직하게는 100%의 동일성 백분율을 갖는 뉴클레오티드 서열을 의미한다 (후자는 이 맥락에서 용어 "동일한"과 동등함). 바람직하게는 동일성은 (이후 달리 명시되지 않는 한) 상기 참조 서열에 대해 적어도 19개 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 50개 뉴클레오티드 길이, 보다 바람직하게는 핵산 서열의 전체 길이에 걸쳐 평가된다. 서열 비교는 니들만 및 운쉬의 알고리즘에 기반하여 유니버시티 오브 위스콘신(University of Wisconsin) GCG, GAP의 SEQWEB 적용에 의해 디폴트 GAP 분석을 사용하여 수행된다 (Needleman and Wunsch (1970) J Mol. Biol. 48: 443-453; 상기 정의된 바와 같음). 참조 뉴클레오티드 서열에 대해 "실질적으로 상보성인" 뉴클레오티드 서열은 낮은 엄격성 조건, 바람직하게는 중간 엄격성 조건, 가장 바람직하게는 높은 엄격성 조건 하에 (상기 정의된 바와 같음) 참조 뉴클레오티드 서열과 혼성화한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "표적 영역"은 예를 들어 표적 부위로부터 10개 염기, 20개 염기, 30개 염기, 40개 염기, 50개 염기, 60개 염기, 70개 염기, 80개 염기, 90개 염기, 100개 염기, 125개 염기, 150개 염기, 200개 염기 또는 500개 염기 또는 그 초과로 가까운 영역을 의미하거나, 또는 공여자 DNA 분자의 서열이 세포의 게놈에 도입되는 표적 부위를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "표적 부위"는 재조합 기술, 예컨대 Zn-핑거, TALEN, 제한 효소, 귀소 엔도뉴클레아제, RNA-가이드된 뉴클레아제, RNA-가이드된 니카제, 예컨대 CRISPR/Cas 뉴클레아제 또는 니카제 등을 사용하여 이중 가닥 파단 또는 1개 또는 1쌍의 단일 가닥 파단 (닉)이 유도되는 게놈에서의 위치를 의미한다.
트랜스진: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "트랜스진"은 실험적 조작에 의해 세포의 게놈에 도입된 임의의 핵산 서열을 지칭한다. 트랜스진은 "내인성 DNA 서열" 또는 "이종성 DNA 서열" (즉, "외래 DNA")일 수 있다. 용어 "내인성 DNA 서열"은 천연 발생 서열에 비해 일부 변형 (예를 들어, 점 돌연변이, 선택가능한 마커 유전자의 존재 등)을 함유하지 않는 한, 도입되는 세포에서 천연적으로 발견되는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
트랜스제닉: 유기체에 대해 언급될 때 용어 트랜스제닉은 바람직하게는 관심 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 적합한 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 분자로 형질전환된, 바람직하게는 안정하게 형질전환된 것을 의미한다.
벡터: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 연결된 또 다른 핵산 분자를 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 한 유형은 게놈 통합된 벡터, 또는 "통합된 벡터"이며, 이는 숙주 세포의 염색체 DNA에 통합될 수 있다. 벡터의 또 다른 유형은 에피솜 벡터, 즉, 염색체외 복제할 수 있는 핵산 분자이다. 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 문맥상 달리 명백하지 않는 한 상호교환적으로 사용된다. 시험관내 또는 생체내에서 본원에 기재된 바와 같이 RNA를 생산하도록 설계된 발현 벡터는 미토콘드리아 RNA 폴리머라제, RNA pol I, RNA pol II, 및 RNA pol III를 포함하는 임의의 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 서열을 함유할 수 있다. 이들 벡터는 본 발명에 따라 세포에서 목적하는 RNA 분자를 전사하는 데 사용될 수 있다.
도 1
단일 CRISPR/Cas9 플라스미드 pCC009의 플라스미드 맵이 도시된다. 플라스미드 pCC009는 바실루스 리케니포르미스의 amyB 유전자를 위한 스페이서 및 각각 amyB 유전자의 DNA 공여자 서열 HomA 및 HomB 5' 및 3'을 지니는 플라스미드 pJOE8999.1의 유도체이다. PmanP: 바실루스 서브틸리스 manP 유전자의 프로모터, pUC ORI: 높은 카피의 이. 콜라이 복제 기점, 바실루스 및 이. 콜라이 둘 다에서 기능적인 카나마이신 내성 유전자, rep pE194: 바실루스에서 온도-민감성 플라스미드 복제를 부여하는 플라스미드 pE194의 단편, PvanP: 스페이서-sgRNA (crRNA 반복부 + 'gRNA)의 발현을 구동시키는 프로모터, 람다로부터의 T0 종결자, 이. 콜라이 rrnB 유전자로부터의 t1 t2 종결자, HomA 및 HomB: 유전자 결실을 위해 함께 융합된 amyB 유전자의 서열 5' 및 3', Cas9: 에스. 피오게네스(S. pyogenes)로부터의 Cas9 엔도뉴클레아제.
도 2:
돌연변이된 프로모터 서열의 선택된 영역의 서열 정렬이 제시된다 - 프로모터 서열 PV4 (서열식별번호: 028) 및 PV8 (서열식별번호: 029)의 nt 15 내지 nt.128에 대해 참조됨. PV4 (서열식별번호: 028) 및 PV8 (서열식별번호: 029) 프로모터에 대한 참조 프로모터 서열 내에서, -35 및 -10 영역, 전사 시작 부위 (TSS) 및 샤인 달가노 서열 (SD)은 이탤릭체 및 회색 음영으로 도시된다. 뉴클레오티드 결실, 삽입 및 돌연변이는 볼드체로 도시된다.
도 3
단일 콜로니를 바실루스 리케니포르미스의 amyB 유전자의 결실에 대해 유전자 결실에 사용된 상동성 영역 외부에 있는 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 009 및 서열식별번호: 010을 사용하여 콜로니-PCR에 의해 분석하였다. 각각의 유전자 결실 구축물에 대해 분석된 총 20개 클론에 대한 불활성화된 아밀라제 유전자를 갖는 클론의 백분율로서의 바실루스 리케니포르미스의 아밀라제 amyB 유전자의 유전자 결실 효능이 나타낸 바와 같이 각각의 유전자 결실 구축물에 대해 플롯팅된다. A. PV4 프로모터 변이체로부터 유래된 결실 플라스미드의 상대적인 결실 효능을 도시한다. B. PV8 프로모터 변이체로부터 유래된 결실 플라스미드의 상대적인 결실 효능을 도시한다.
도 4
A. 분석된 총 20개 클론에 대한 불활성화된 hag 유전자를 갖는 클론의 백분율로서의 바실루스 리케니포르미스의 hag 유전자의 유전자 결실 효능이 나타낸 바와 같이 2개의 결실 구축물 및 프로모터 변이체 각각에 대해 플롯팅된다. 표준 편차와 함께 3회의 독립적인 실험의 평균이 제시된다. hag 유전자의 유전자 결실을 유전자 결실에 사용된 상동성 영역 외부에 있는 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 087 및 서열식별번호: 088을 사용한 콜로니 PCR에 의해 분석하였다. B. 바실루스 리케니포르미스의 degU 유전자 내의 점 돌연변이의 도입에 대한 2개의 결실 구축물 및 프로모터 변이체 각각의 상대적인 돌연변이 효능을 분석된 총 20개 클론에 대한 돌연변이된 degU 유전자를 갖는 클론의 백분율로서 도시한다. 표준 편차와 함께 3회의 독립적인 실험의 평균이 제시된다. degU 유전자의 유전자 돌연변이를 본래의 degU 로커스와 돌연변이된 degU 로커스 사이를 구별하기 위한 PstI에 의한 PCR 단편의 제한 후 유전자 돌연변이의 도입에 사용된 상동성 영역 외부에 있는 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 089 및 서열식별번호: 090을 사용한 콜로니 PCR에 의해 분석하였다.
도 5
A. 분석된 총 20개 클론에 대한 불활성화된 amyE 유전자를 갖는 클론의 백분율로서의 바실루스 서브틸리스의 아밀라제 amyE 유전자의 유전자 결실 효능이 나타낸 바와 같이 2개의 결실 구축물 및 프로모터 변이체 각각에 대해 플롯팅된다. 표준 편차와 함께 3회의 독립적인 실험의 평균이 제시된다. amyE 유전자의 유전자 결실을 유전자 결실에 사용된 상동성 영역 외부에 있는 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 091 및 서열식별번호: 092를 사용한 콜로니 PCR에 의해 분석하였다. B. 바실루스 서브틸리스의 서브틸리신 프로테아제 aprE 유전자의 결실에 대한 2개의 결실 구축물 및 프로모터 변이체 각각의 상대적인 결실 효능을 분석된 총 20개 클론에 대한 불활성화된 aprE 유전자를 갖는 클론의 백분율로서 도시한다. 표준 편차와 함께 3회의 독립적인 실험의 평균이 제시된다. aprE 유전자의 유전자 결실을 유전자 결실에 사용된 상동성 영역 외부에 있는 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 093 및 서열식별번호: 094를 사용한 콜로니 PCR에 의해 분석하였다.
도 6
A. 분석된 총 20개 클론에 대한 불활성화된 vpr 유전자를 갖는 클론의 백분율로서의 바실루스 리케니포르미스의 vpr 유전자의 유전자 결실 효능이 나타낸 바와 같이 3개의 결실 구축물 및 스페이서 변이체 각각에 대해 플롯팅된다. vpr 유전자의 유전자 결실을 유전자 결실에 사용된 상동성 영역 외부에 있는 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 095 및 서열식별번호: 096을 사용한 콜로니 PCR에 의해 분석하였다. B. 바실루스 리케니포르미스의 epr 유전자의 결실에 대한 3개의 결실 구축물 및 스페이서 변이체 각각의 상대적인 결실 효능을 분석된 총 20개 클론에 대한 불활성화된 epr 유전자를 갖는 클론의 백분율로서 도시한다. epr 유전자의 유전자 결실을 유전자 결실에 사용된 상동성 영역 외부에 있는 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 097 및 서열식별번호: 098을 사용한 콜로니 PCR에 의해 분석하였다.
도 7
분석된 총 20개 클론에 대한 통합된 PaprE-GFPmut2 발현 카세트를 갖는 클론의 백분율로서의 바실루스 리케니포르미스의 amyB 유전자를 대체하는 PaprE-GFPmut2 발현 카세트의 유전자 통합 효능이 나타낸 바와 같이 2개의 상이한 바실루스 리케니포르미스 균주 Bli#005 및 P308 각각에 대해 플롯팅된다. 표준 편차와 함께 2회의 독립적인 실험의 평균이 제시된다. 통합을 유전자 통합에 사용된 상동성 영역 외부에 있는 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 009 및 서열식별번호: 010을 사용한 콜로니 PCR에 의해 분석하였다.
도 8
분석된 각각의 포자형성 유전자에 대한 총 20개 클론에 대한 불활성화된 포자형성 유전자를 갖는 클론의 백분율로서의 바실루스 푸밀루스의 포자형성 유전자 sigE, sigF 및 spoIIE의 유전자 결실 효능이 나타낸 바와 같이 플롯팅된다. sigE, sigF 및 spoIIE 유전자의 유전자 결실을 유전자 결실에 사용된 상동성 영역 외부에 있는 각각 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 099 및 서열식별번호: 100, 서열식별번호: 101 및 서열식별번호: 102 및 서열식별번호: 103 및 서열식별번호: 104를 사용한 콜로니 PCR에 의해 분석하였다.
실시예
물질 및 방법
하기 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 역할을 한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백한 수많은 가능한 변형이 또한 본 발명의 범주 내에 속한다.
달리 명시되지 않는 한, 하기 실험은 미생물의 배양에 의한 화합물의 발효 생산 및 유전자 조작에 사용된 바와 같은 표준 장비, 방법, 화학물질, 및 생화학물질을 적용함으로써 수행되었다. 또한 샘브룩 (Sambrook) 등의 문헌 (Sambrook,J. and Russell,D.W. Molecular cloning. A laboratory manual, 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 2001) 및 문헌 (Chmiel et al., Bioprocesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)을 참조한다.
전기적격 바실루스 리케니포르미스 세포 및 전기천공
DNA의 바실루스 리케니포르미스 균주 DSM641 및 ATCC53926으로의 형질전환을 전기천공을 통해 수행한다. 전기적격 바실루스 리케니포르미스 세포의 제조 및 DNA의 형질전환을 하기 변형: DNA의 형질전환 시, 세포를 1ml LBSPG 완충제 중에 회수하고 선택적인 LB-아가 플레이트 상에 플레이팅한 후 60분 동안 37℃에서 인큐베이션함 (Vehmaanperae J., 1989, FEMS Microbio. Lett., 61: 165-170)과 함께 브리지디 (Brigidi) 등의 문헌 (Brigidi,P., Mateuzzi,D. (1991). Biotechnol. Techniques 5, 5)에 본질적으로 기재된 바와 같이 수행한다.
바실루스 리케니포르미스 균주 DSM641 및 ATCC53926의 바실루스 리케니포르미스 특이적 제한 변형 시스템을 극복하기 위해, 플라스미드 DNA를 아래 기재된 바와 같이 Ec#098 세포로부터 단리한다. 바실루스 리케니포르미스 제한 효소 녹아웃 균주로의 전달을 위해, 플라스미드 DNA를 이. 콜라이 INV110 세포 (라이프 테크놀로지스(Life technologies))로부터 단리한다.
전기적격 바실루스 푸밀루스 세포 및 전기천공
DNA의 바실루스 푸밀루스 DSM14395로의 형질전환을 전기천공을 통해 수행한다. 전기적격 바실루스 푸밀루스 DSM14395 세포의 제조 및 DNA의 형질전환을 바실루스 리케니포르미스 세포에 대해 기재된 바와 같이 수행한다.
바실루스 푸밀루스 특이적 제한 변형 시스템을 극복하기 위해, 플라스미드 DNA를 이. 콜라이 DH10B 세포로부터 단리하고 플라스미드 DNA를 특허 DE4005025에서 바실루스 리케니포르미스에 대해 기재된 바와 같은 방법에 따라 바실루스 푸밀루스 DSM14395로부터의 전세포 추출물로 시험관내 메틸화시킨다.
전기적격 바실루스 서브틸리스 세포 및 전기천공
DNA의 바실루스 서브틸리스 ATCC6051a로의 형질전환을 바실루스 리케니포르미스 및 바실루스 푸밀루스 각각에 대해 기재된 바와 같이 전기천공을 통해 수행한다. 이. 콜라이 DH10B 세포로부터 단리된 플라스미드 DNA는 바실루스 서브틸리스로의 전달에 용이하게 사용될 수 있다.
플라스미드 단리
플라스미드 DNA는 문헌 (Sambrook,J. and Russell,D.W. Molecular cloning. A laboratory manual, 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 2001)에 기재된 표준 분자 생물학적 방법 또는 알칼리성 용해 방법 (Birnboim, H. C., Doly, J. (1979). Nucleic Acids Res 7(6): 1513-1523)에 의해 바실루스 및 이. 콜라이 세포로부터 단리되었다. 바실루스 세포는 이. 콜라이와 비교하여 세포 용해 전에 30분 동안 37℃에서 10mg/ml 리소자임으로 처리되었다.
올리고뉴클레오티드-이중체를 형성하기 위한 올리고뉴클레오티드의 어닐링.
올리고뉴클레오티드를 물 중에서 100μM의 농도로 조정하였다. 5μl의 정방향 및 5μl의 상응하는 역방향 올리고뉴클레오티드를 90μl 30mM Hepes-완충제 (pH 7.8)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 0.1℃/초로 온도를 감소시키면서 95℃에서 4℃로 램핑함으로써 어닐링한 후 95℃로 5분 동안 가열하였다 (Cobb, R. E., Wang, Y., & Zhao, H. (2015). High-Efficiency Multiplex Genome Editing of Streptomyces Species Using an Engineered CRISPR/Cas System. ACS Synthetic Biology, 4(6), 723-728).
분자 생물학적 방법 및 기술
바실루스 및 이. 콜라이 미생물의 배양, DNA의 전기천공, 게놈 및 플라스미드 DNA의 단리, PCR 반응, 클로닝 기술에 제한되지 않는 분자 생물학의 표준 방법을 샘브룩과 러셀(Rusell)에 의해 문헌 (Sambrook,J. and Russell,D.W. Molecular cloning. A laboratory manual, 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 2001.)에 본질적으로 기재된 바와 같이 수행하였다.
균주
이. 콜라이 균주 Ec#098
이. 콜라이 균주 Ec#098은 DNA-메틸트랜스퍼라제 코딩 발현 플라스미드 pMDS003을 지니는 이. 콜라이 INV110 균주 (라이프 테크놀로지스)이다 (WO2019016051).
바실루스 리케니포르미스 유전자 녹아웃 균주의 생성
바실루스 리케니포르미스 균주 DSM641 및 ATCC53926 (US5352604) 및 그의 유도체에서의 유전자 결실을 위해, 결실 플라스미드를 37℃에서 100μg/ml 암피실린 및 30μg/ml 클로람페니콜을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에서 선택한 후 청(Chung)의 문헌 (Chung,C.T., Niemela,S.L., and Miller,R.H. (1989). One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 86, 2172-2175)의 방법에 따라 적격으로 제조된 이. 콜라이 균주 Ec#098로 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 개별 클론으로부터 단리하고 바실루스 리케니포르미스 균주로의 후속 전달에 사용하였다. 단리된 플라스미드 DNA는 각각 바실루스 리케니포르미스 균주 DSM641 및 ATCC53926의 DNA 메틸화 패턴을 지니고 비. 리케니포르미스로의 전달 시 분해로부터 보호된다.
비. 리케니포르미스 P304: 결실된 제한 엔도뉴클레아제
전기적격 바실루스 리케니포르미스 DSM641 세포 (US5352604)를 상기 기재된 바와 같이 제조하고 30℃에서 5 μg/ml 에리트로마이신을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에 플레이팅한 후 이. 콜라이 Ec#098로부터 단리된 1μg의 pDel006 제한 효소 유전자 결실 플라스미드로 형질전환시켰다.
하기에 기재된 바와 같이 유전자 결실 절차를 수행하였다:
플라스미드 보유 바실루스 리케니포르미스 세포를 45℃에서 5 μg/ml 에리트로마이신을 갖는 LB-아가 플레이트 상에서 성장시켜, 캠벨(Campbell) 재조합을 통한 결실 플라스미드의 aprE 유전자의 서열 5' 또는 3'에 상동성인 pDel006의 상동성 영역 중 하나를 갖는 염색체로의 통합을 구동시켰다. 클론을 고르고 30℃에서 5 μg/ml 에리트로마이신을 갖는 LB-아가 플레이트 상에 플레이팅한 후 선택 압력 없이 45℃에서 6시간 동안 LB-배지 중에 배양하였다. 개별 클론을 고르고 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 014 및 서열식별번호: 015를 사용한 콜로니-PCR 분석에 의해 제한 효소 유전자의 성공적인 게놈 결실에 대해 스크리닝하였다. 추정되는 결실 양성 개별 클론을 고르고 45℃에서 항생제가 없는 LB 배지 중에 2회의 연속하는 밤새 인큐베이션하여 플라스미드를 큐어링하고 37℃에서 밤새 인큐베이션 동안 LB-아가 플레이트 상에 플레이팅하였다. 단일 클론을 콜로니 PCR에 의해 제한 효소 유전자의 성공적인 게놈 결실에 대해 분석하였다. 정확히 결실된 제한 효소 유전자를 갖는 단일 에리트로마이신-민감성 클론을 단리하고 바실루스 리케니포르미스 P304로 지정하였다.
비. 리케니포르미스 P308: 결실된 폴리-감마 글루타메이트 합성 유전자
전기적격 바실루스 리케니포르미스 P304 세포를 상기 기재된 바와 같이 제조하고 30℃에서 5 μg/ml 에리트로마이신을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에 플레이팅한 후 이. 콜라이 INV110 세포 (라이프 테크놀로지스)로부터 단리된 1μg의 pDel007 pga 유전자 결실 플라스미드로 형질전환시켰다.
유전자 결실 절차를 제한 효소 유전자의 결실에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다.
pga 유전자의 결실을 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 017 및 서열식별번호: 018을 사용한 PCR에 의해 분석하였다. 결실된 pga 합성 유전자를 갖는 생성된 바실루스 리케니포르미스 균주는 바실루스 리케니포르미스 P308로 명명되었다.
비. 리케니포르미스 Bli#002: 결실된 aprE 유전자
전기적격 바실루스 리케니포르미스 ATCC53926 세포를 상기 기재된 바와 같이 제조하고 30℃에서 5 μg/ml 에리트로마이신을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에 플레이팅한 후 이. 콜라이 Ec#098로부터 단리된 1μg의 pDel003 aprE 유전자 결실 플라스미드로 형질전환시켰다.
유전자 결실 절차를 제한 효소 유전자의 결실에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다. aprE 유전자의 결실을 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 020 및 서열식별번호: 021을 사용한 PCR에 의해 분석하였다. 결실된 aprE 유전자를 갖는 생성된 바실루스 리케니포르미스 균주는 Bli#002로 명명되었다.
비. 리케니포르미스 Bli#005: 결실된 폴리-감마 글루타메이트 합성 유전자
폴리-감마-글루타메이트 합성 유전자는 바실루스 리케니포르미스 P304에서의 pga 유전자의 결실에 대해 기재된 바와 같이 바실루스 리케니포르미스 Bli#002에서 결실되었지만, pDel007 플라스미드는 이. 콜라이 Ec#098 세포로부터 단리되었다는 차이가 있다. 생성된 균주는 Bli#005로 명명되었다.
플라스미드
pEC194RS - 바실루스 온도 민감성 결실 플라스미드.
플라스미드 pE194는 PvuII 부위에 플랭킹된 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 001 및 서열식별번호: 002를 사용하여 PCR-증폭되고, 제한 엔도뉴클레아제 PvuII로 소화되고 제한 효소 SmaI로 소화된 벡터 pCE1로 라이게이션된다. pCE1은 암피실린 내성 유전자 내 BsaI 부위가 침묵 돌연변이에 의해 제거된 pUC18 유도체이다. 라이게이션 혼합물을 이. 콜라이 DH10B 세포 (라이프 테크놀로지스)로 형질전환시켰다. 형질전환체를 펼치고 37℃에서 100μg/ml 암피실린을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에서 밤새 인큐베이션하였다. 플라스미드 DNA를 개별 클론으로부터 단리하고 제한 소화에 의해 정확성에 대해 분석하였다. 생성된 플라스미드는 pEC194S로 명명된다.
유형-II-조립 mRFP 카세트는 제한 부위 BamHI에 대한 추가적인 뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 pBSd141R (수탁 번호: KY995200)로부터 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 003 및 서열식별번호: 004를 사용하여 PCR-증폭된다 (Radeck, J., Meyer, D., Lautenschlager, N., and Mascher, T. 2017. Bacillus SEVA siblings: A Golden Gate-based toolbox to create personalized integrative vectors for Bacillus subtilis. Sci. Rep. 7: 14134). PCR 단편 및 pEC194S를 라이게이션 및 이. 콜라이 DH10B 세포 (라이프 테크놀로지스)로의 형질전환 후 제한 효소 BamHI로 처리하였다. 형질전환체를 펼치고 37℃에서 100μg/ml 암피실린을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에서 밤새 인큐베이션하였다. 플라스미드 DNA를 개별 클론으로부터 단리하고 제한 소화에 의해 정확성에 대해 분석하였다. 생성된 플라스미드 pEC194RS는 에리트로마이신 내성 유전자의 리딩 프레임과 반대인 오픈 리딩 프레임을 갖는 mRFP 카세트를 지닌다.
pDel003 - aprE 유전자 결실 플라스미드
바실루스 리케니포르미스의 aprE 유전자에 대한 유전자 결실 플라스미드를 플라스미드 pEC194RS 및 pEC194RS와 양립할 수 있는 BsaI 부위에 의해 플랭킹된 aprE 유전자의 게놈 영역 5' 및 3'을 포함하는 유전자 합성 구축물 서열식별번호: 019로 구축하였다. 제한 엔도뉴클레아제 BsaI로의 유형-II-조립을 기재된 바와 같이 수행하고 (Radeck, J., Meyer, D., Lautenschlager, N., and Mascher, T. 2017. Bacillus SEVA siblings: A Golden Gate-based toolbox to create personalized integrative vectors for Bacillus subtilis. Sci. Rep. 7: 14134) 반응 혼합물을 이. 콜라이 DH10B 세포 (라이프 테크놀로지스)로 후속적으로 형질전환시켰다. 형질전환체를 펼치고 37℃에서 100μg/ml 암피실린을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에서 밤새 인큐베이션하였다. 플라스미드 DNA를 개별 클론으로부터 단리하고 제한 소화에 의해 정확성에 대해 분석하였다. 생성된 aprE 결실 플라스미드는 pDel003으로 명명된다.
pDel006 - 제한 효소 유전자 결실 플라스미드
바실루스 리케니포르미스 DSM641의 제한 변형 시스템 (서열식별번호: 011)의 제한 효소 유전자 (서열식별번호: 012)에 대한 유전자 결실 플라스미드를 플라스미드 pEC194RS 및 pEC194RS와 양립할 수 있는 BsaI 부위에 의해 플랭킹된 제한 효소 유전자의 게놈 영역 5' 및 3'을 포함하는 유전자 합성 구축물 서열식별번호: 013으로 구축하였다. 제한 엔도뉴클레아제 BsaI로의 유형-II-조립을 상기 기재된 바와 같이 수행하고 반응 혼합물을 이. 콜라이 DH10B 세포 (라이프 테크놀로지스)로 후속적으로 형질전환시켰다. 형질전환체를 펼치고 37℃에서 100μg/ml 암피실린을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에서 밤새 인큐베이션하였다. 플라스미드 DNA를 개별 클론으로부터 단리하고 제한 소화에 의해 정확성에 대해 분석하였다. 생성된 제한 효소 결실 플라스미드는 pDel006으로 명명된다.
pDel007 - 폴리-감마-글루타메이트 합성 유전자 결실 플라스미드
폴리-감마-글루타메이트 (pga) 생산에 수반되는 유전자, 즉 바실루스 리케니포르미스의 ywsC (pgsB), ywtA (pgsC), ywtB (pgsA), ywtC (pgsE)의 결실에 대한 결실 플라스미드를 pDel006에 대해 기재된 바와 같이 구축하였지만, pEC194RS와 양립할 수 있는 BsaI 부위에 의해 플랭킹된 ywsC, ywtA (pgsC), ywtB (pgsA), ywtC (pgsE) 유전자에 플랭킹된 게놈 영역 5' 및 3'을 포함하는 유전자 합성 구축물 서열식별번호: 016을 사용하였다. 생성된 pga 결실 플라스미드는 pDel007로 명명된다.
플라스미드 p689-T2A-lac
플라스미드 p689-T2A-lac는 BpiI 제한 부위에 의해 플랭킹되고, 다시 이. 콜라이 rrnB 유전자의 T1 종결자에 의해 5' 플랭킹되고 T0 람다 종결자에 의해 3' 플랭킹된 lacZ-알파 유전자를 포함하고 유전자 합성 구축물 (서열식별번호: 073)로 정리되었다.
플라스미드 p890 PaprE-GFPmut2
플라스미드 pCB56C (US5352604)의 바실루스 리케니포르미스로부터의 aprE 유전자의 프로모터는 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 074 및 서열식별번호: 075를 사용하여 PCR-증폭되었다. BpiI 제한 부위에 플랭킹된 GFPmut2 유전자 변이체 (수탁 번호 AF302837) (서열식별번호: 076)가 유전자 합성 단편 (진아트 레겐스부르크(Geneart Regensburg))으로 정리되었다. GFPmut2 변이체에 융합된 바실루스 리케니포르미스로부터의 PaprE 프로모터를 포함하는 유전자 발현 구축물은 기재된 바와 같이 제한 엔도뉴클레아제 BpiI로의 유형-II-조립에 의해 플라스미드 p689-T2A-lac로 클로닝되고 (Radeck, J., Meyer, D., Lautenschlager, N., and Mascher, T. 2017. Bacillus SEVA siblings: A Golden Gate-based toolbox to create personalized integrative vectors for Bacillus subtilis. Sci. Rep. 7: 14134) 반응 혼합물을 전기적격 이. 콜라이 DH10B 세포로 후속적으로 형질전환시켰다. 형질전환체를 펼치고 37℃에서 100μg/ml 암피실린을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에서 밤새 인큐베이션하였다. 플라스미드 DNA를 개별 클론으로부터 단리하고 제한 소화 및 시퀀싱에 의해 정확성에 대해 분석하였다. 생성된 플라스미드는 p890 PaprE-GFPmut2로 명명된다.
플라스미드 pJOE8999.1:
문헌 (Altenbuchner J. 2016. Editing of the Bacillus subtilis genome by the CRISPR-Cas9 system. Appl Environ Microbiol 82:5421-5).
플라스미드 pJOE-T2A
sgRNA 및 DSB 복구를 위한 상동성 영역의 유형-II-조립 (T2A) 기반 1-단계 클로닝을 허용하기 위해, CRISPR/Cas9 플라스미드 pJOE8889.1을 하기와 같이 변형시켰다. 플라스미드 pBSd141R (수탁 번호: KY995200)로부터의 유형-II-조립 mRFP 카세트 (Radeck, J., Meyer, D., Lautenschlager, N., and Mascher, T. 2017. Bacillus SEVA siblings: A Golden Gate-based toolbox to create personalized integrative vectors for Bacillus subtilis. Sci. Rep. 7: 14134)는 다수의 제한 부위 및 BpiI 제한 부위를 제거하도록 변형되고 SfiI 제한 부위에 플랭킹된 유전자 합성 단편 (서열식별번호: 005)으로 정리되었다. 플라스미드는 p#732로 명명된다. 플라스미드 p#732 및 플라스미드 pJOE8999.1을 SfiI (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), NEB)로 소화시키고 p#732의 mRFP 카세트를 적격 이. 콜라이 DH10B 세포로 형질전환시킨 후 SfiI-소화된 pJOE8999.1로 라이게이션하였다. 양성 클론을 IPTG/X-Gal 및 카나마이신 (20 μg/ml) 함유 LB 아가 플레이트 상에서 보라색 콜로니에 대해 스크리닝하였다 (파란색-흰색 스크리닝 및 mRFP1 발현). 생성된 서열-확인된 플라스미드는 pJOE-T2A로 명명되었다.
플라스미드 pBW732
바실루스 리케니포르미스 DSM641의 아밀라제 amyB 유전자에 인접한 5' 상동성 영역 (또한 HomA로 지칭됨) 및 3' 상동성 영역 (또한 HomB로 지칭됨)은 XmaI 제한 부위에 플랭킹된 합성 유전자 합성 단편 (서열식별번호: 006)으로 정리되었다. 플라스미드 pJOE8999.1 및 합성 amyB-HomAB 단편은 T4-DNA 리가제 (NEB)로 라이게이션 및 전기적격 이. 콜라이 DH10B 세포로의 형질전환 후 제한 엔도뉴클레아제 XmaI로 절단된다. 정확한 플라스미드를 회수하고 pBW732로 명명하였다.
플라스미드 pBW742
sgRNA를 위한 amyB 유전자의 20 bp 표적 서열을 지니어스(Geneious) 11.1.5 (https://www.geneious.com)를 사용하여 설계하였다. 5' 인산화를 갖는 생성된 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 007 및 서열식별번호: 008을 어닐링하여 올리고뉴클레오티드 이중체를 형성하였다. 바실루스 리케니포르미스의 amyB 유전자에 대한 CRISPR/Cas9 기반 유전자 결실 플라스미드를 하기 성분: pBW732 및 올리고뉴클레오티드 이중체 (서열식별번호: 007, 서열식별번호: 008)와 함께 기재된 바와 같이 제한 엔도뉴클레아제 BsaI로의 유형-II-조립에 의해 구축하였다 (Radeck, J., Meyer, D., Lautenschlager, N., and Mascher, T. 2017. Bacillus SEVA siblings: A Golden Gate-based toolbox to create personalized integrative vectors for Bacillus subtilis. Sci. Rep. 7: 14134). 반응 혼합물을 이. 콜라이 DH10B 세포 (라이프 테크놀로지스)로 형질전환시켰다. 형질전환체를 펼치고 37℃에서 20μg/ml 카나마이신을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에서 밤새 인큐베이션하였다. 플라스미드 DNA를 개별 클론으로부터 단리하고 제한 소화 및 시퀀싱에 의해 정확성에 대해 분석하였다. 생성된 amyB 결실 플라스미드는 pBW742로 명명된다.
T2A CRISPR 목적지 벡터 pCC027 및 pCC028
플라스미드 pCC014 및 pCC025는 스페이서-sgRNA 및 상동성 영역에 플랭킹된 amyB 유전자를 포함하는 영역이 플라스미드 pJOE-T2A로부터의 T2A 카세트에 의해 대체되도록 변형되었다. pCC014 및 pCC025의 백본을 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 050 및 서열식별번호: 051을 사용하여 PCR 증폭시켰고 T2A 조립 카세트를 하이 퓨어(High Pure) PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 정제, DpnI로 소화 및 겔 정제 후 pJOE-T2A로부터 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 048 및 서열식별번호: 049를 사용하여 PCR-증폭시켰다. 상응하는 백본 PCR 단편 및 T2A 카세트 PCR 단편을 이. 콜라이 DH10B 세포 (라이프 테크놀로지스)로 형질전환시킨 후 10μl 깁슨(Gibson) 반응 중에 어닐링하였다. 형질전환체를 펼치고 37℃에서 20μg/ml 카나마이신을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에서 밤새 인큐베이션하였다. 플라스미드 DNA를 개별 클론으로부터 단리하고 제한 소화 및 시퀀싱에 의해 정확성에 대해 분석하였다. 생성된 pCC014 및 pCC025 유래된 T2A 플라스미드 유도체는 각각 pCC027 및 pCC028로 지정된다.
pCC029 - hag 유전자 결실 플라스미드
sgRNA를 위한 hag 유전자의 20 bp 표적 서열을 이전에 기재된 바와 같이 지니어스 11.1.5를 사용하여 설계하였다. 5' 인산화를 갖는 생성된 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 056 및 서열식별번호: 057을 어닐링하여 상기 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드 이중체를 형성하였다. hag 유전자의 게놈 영역 5' 및 3'을 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 053 및 서열식별번호: 054에 플랭킹되는 중첩 연장 PCR에 의한 융합 후 바실루스 리케니포르미스 DSM641로부터의 게놈 DNA 상에서 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 054 및 서열식별번호: 053 및 서열식별번호: 052 및 서열식별번호: 55를 사용하여 PCR-증폭시켰다. 생성된 PCR 산물을 칼럼 정제하였다 (퀴아젠(Qiagen) PCR 정제 키트). 바실루스 리케니포르미스의 hag 유전자에 대한 CRISPR/Cas9 기반 유전자 결실 플라스미드를 하기 성분: 플라스미드 pCC027 (PV4-5 프로모터 변이체), BsaI 제한 부위에 플랭킹된 hag 유전자의 융합된 상동성 영역 및 올리고뉴클레오티드 이중체 (서열식별번호: 056, 서열식별번호: 057)와 함께 이전에 기재된 바와 같이 제한 엔도뉴클레아제 BsaI로의 유형-II-조립에 의해 구축하였다. 반응 혼합물을 이. 콜라이 DH10B 세포 (라이프 테크놀로지스)로 형질전환시켰다. 형질전환체를 펼치고 37℃에서 20μg/ml 카나마이신을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에서 밤새 인큐베이션하였다. 플라스미드 DNA를 개별 클론으로부터 단리하고 제한 소화 및 시퀀싱에 의해 정확성에 대해 분석하였다. 생성된 hag 유전자 결실 플라스미드는 pCC029로 명명된다.
pCC030 - hag 유전자 결실 플라스미드
hag 유전자 결실 구축물을 pCC029에 대해서와 같이 구축하였지만 플라스미드 pCC028 (PV8-7 프로모터 변이체)을 사용하였다.
pCC031 - degU32 유전자 편집 플라스미드
degU H12L 돌연변이를 도입하기 위한 degU32 게놈 편집 구축물의 구축을 하기 변형과 함께 pCC029에 대해서와 같이 수행하였다.
degU H12L 돌연변이에 대한 돌연변이의 도입 뿐만 아니라 PAM 부위를 제거하기 위한 침묵 점 돌연변이를 도입하는 degU32 상동성 영역은 BsaI 부위에 플랭킹된 유전자 합성 구축물 (진아트, 레겐스부르크) (서열식별번호: 058)로 정리되었다. sgRNA를 위한 degU 유전자의 20 bp 표적 서열을 설계하고 5' 인산화를 갖는 생성된 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 059 및 서열식별번호:060을 어닐링하여 상기 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드 이중체를 형성하였다.
pCC032 - degU32 유전자 편집 플라스미드
degU32 게놈 편집 구축물을 pCC031에 대해 기재된 바와 같이 제조하였지만 플라스미드 pCC028 (PV8-7 프로모터 변이체)을 사용하였다.
pCC033 - amyE 유전자 결실 플라스미드
amyE 스페이서-sgRNA 및 바실루스 서브틸리스로부터의 amyE 유전자의 5' 및 3' 영역의 상동성 영역을 포함하는 단편을 플라스미드 pCC004 (WO17186550)로부터 BsaI 제한 부위에 플랭킹된 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 061 및 서열식별번호: 062를 사용하여 PCR-증폭시켰다. 아밀라제 amyE 유전자에 대한 CRISPR/Cas9 기반 유전자 결실 플라스미드를 플라스미드 pCC027 (PV4-5 프로모터 변이체) 및 PCR-증폭 단편으로 상기 기재된 바와 같이 제한 엔도뉴클레아제 BsaI로의 유형-II-조립에 의해 후속적으로 구축하였다. 반응 혼합물을 이. 콜라이 DH10B 세포 (라이프 테크놀로지스)로 형질전환시켰다. 형질전환체를 펼치고 37℃에서 20μg/ml 카나마이신을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에서 밤새 인큐베이션하였다. 플라스미드 DNA를 개별 클론으로부터 단리하고 제한 소화 및 시퀀싱에 의해 정확성에 대해 분석하였다. 생성된 amyE 유전자 결실 플라스미드는 pCC033으로 명명된다.
pCC034 - amyE 유전자 결실 플라스미드
amyE 유전자 결실 구축물을 pCC033에 대해서와 같이 구축하였지만, 플라스미드 pCC028 (PV8-7 프로모터 변이체)을 사용하였다.
pCC035 - aprE 유전자 결실 플라스미드
aprE 스페이서 (서열식별번호: 064)-sgRNA 및 바실루스 서브틸리스의 aprE 유전자의 5' 및 3' 영역의 상동성 영역을 포함하는 단편은 BsaI 제한 부위에 플랭킹된 합성 유전자 단편 (서열식별번호: 063)으로 정리되었다. 프로테아제 aprE 유전자에 대한 CRISPR/Cas9 기반 유전자 결실 플라스미드를 플라스미드 pCC027 (PV4-5 프로모터 변이체) 및 유전자 합성 구축물로 상기 기재된 바와 같이 제한 엔도뉴클레아제 BsaI로의 유형-II-조립에 의해 후속적으로 구축하였다. 반응 혼합물을 이. 콜라이 DH10B 세포 (라이프 테크놀로지스)로 형질전환시켰다. 형질전환체를 펼치고 37℃에서 20μg/ml 카나마이신을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에서 밤새 인큐베이션하였다. 플라스미드 DNA를 개별 클론으로부터 단리하고 제한 소화 및 시퀀싱에 의해 정확성에 대해 분석하였다. 생성된 aprE 유전자 결실 플라스미드는 pCC035로 명명된다.
pCC036 - aprE 유전자 결실 플라스미드
aprE 유전자 결실 구축물을 pCC035에 대해서와 같이 구축하였지만, 플라스미드 pCC028 (PV8-7 프로모터 변이체)을 사용하였다.
pCC037 - pCC039 - vpr 유전자 결실 플라스미드
바실루스 리케니포르미스의 프로테아제 vpr 유전자의 CRISPR/Cas9 유전자 결실 구축물 pCC037, pCC038 및 pCC039를 pCC035에 대해 기재된 바와 같이 구축하였지만, vpr 스페이서-sgRNA 및 vpr 유전자의 5' 및 3' 영역의 상동성 영역을 포함하는 합성 유전자 단편 (서열식별번호: 065)으로 구축하였다. 생성된 플라스미드 pCC037, pCC038 및 pCC039는 서열식별번호: 065 내에서 vpr 스페이서 서열 (서열식별번호: 066, 서열식별번호: 067, 서열식별번호: 068)이 상이하다.
pCC040 - pCC042 - epr 유전자 결실 플라스미드
바실루스 리케니포르미스의 프로테아제 epr 유전자의 CRISPR/Cas9 유전자 결실 구축물 pCC040, pCC041 및 pCC042를 pCC035에 대해 기재된 바와 같이 구축하였지만, epr 스페이서-sgRNA 및 epr 유전자의 5' 및 3' 영역의 상동성 영역을 포함하는 합성 유전자 단편 (서열식별번호: 069)으로 구축하였다. 생성된 플라스미드 pCC040, pCC041 및 pCC042는 서열식별번호: 069 내에서 epr 스페이서 서열 (서열식별번호: 070, 서열식별번호: 071, 서열식별번호: 072)이 상이하다.
pCC043 - GFP 유전자 통합 플라스미드
sgRNA를 위한 amyB 유전자의 20 bp 표적 서열을 어닐링하여 올리고뉴클레오티드 이중체를 형성한 후 5' 인산화를 갖는 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 007 및 서열식별번호: 008로 정리하였다. 바실루스 리케니포르미스의 amyB 유전자의 5' 및 3' 영역을 각각 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 077 및 서열식별번호: 078 및 서열식별번호: 079 및 서열식별번호: 080을 사용하여 PCR-증폭시켰다.
바실루스 리케니포르미스의 amyB 유전자를 대체하는 CRISPR/Cas9 기반 유전자 통합 플라스미드를 하기 성분: pCC027, 올리고뉴클레오티드 이중체 (서열식별번호: 007, 서열식별번호: 008), amyB 유전자의 5' 상동성 영역의 PCR-단편, p890-PaprE-GFPmut2 및 amyB 유전자의 3' 상동성 영역의 PCR-단편과 함께 상기 기재된 바와 같이 제한 엔도뉴클레아제 BsaI로의 유형-II-조립에 의해 구축하였다. 반응 혼합물을 이. 콜라이 DH10B 세포 (라이프 테크놀로지스)로 형질전환시켰다. 형질전환체를 펼치고 37℃에서 20μg/ml 카나마이신을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에서 밤새 인큐베이션하였다. 플라스미드 DNA를 개별 클론으로부터 단리하고 제한 소화 및 시퀀싱에 의해 정확성에 대해 분석하였다. 생성된 CRISPR/Cas9 기반 유전자 통합 플라스미드는 pCC043으로 명명된다.
pCC044 - sigE 유전자 결실 플라스미드 바실루스 푸밀루스
바실루스 푸밀루스 DSM14395의 sigE 유전자의 CRISPR/Cas9 유전자 결실 구축물 pCC044를 pCC035에 대해 기재된 바와 같이 구축하였지만, sigE 스페이서 (서열식별번호: 081)-sgRNA 및 sigE 유전자의 5' 및 3' 영역의 상동성 영역을 포함하는 합성 유전자 단편 (서열식별번호: 082)으로 구축하였다.
pCC045 - sigF 유전자 결실 플라스미드 바실루스 푸밀루스
바실루스 푸밀루스 DSM14395의 sigF 유전자의 CRISPR/Cas9 유전자 결실 구축물 pCC045를 pCC035에 대해 기재된 바와 같이 구축하였지만, sigF 스페이서 (서열식별번호: 083)-sgRNA 및 sigF 유전자의 5' 및 3' 영역의 상동성 영역을 포함하는 합성 유전자 단편 (서열식별번호: 084)으로 구축하였다.
pCC046 - spoIIE 유전자 결실 플라스미드 바실루스 푸밀루스
바실루스 푸밀루스 DSM14395의 spoIIE 유전자의 CRISPR/Cas9 유전자 결실 구축물 pCC046을 pCC035에 대해 기재된 바와 같이 구축하였지만, spoIIE 스페이서 (서열식별번호: 085)-sgRNA 및 spoIIE 유전자의 5' 및 3' 영역의 상동성 영역을 포함하는 합성 유전자 단편 (서열식별번호: 086)으로 구축하였다.
실시예 1: 구성적 프로모터를 갖는 CRISPR/Cas9 게놈 편집 플라스미드의 구축
플라스미드 pBW742에서 Cas9 효소의 발현을 구동시키는 구성적 프로모터를 도입하기 위해, 2-단계 절차를 적용하였다.
먼저, t1t2t0 종결자 (pMUTIN으로부터 유래됨)를 pBW742의 프로모터 PmanP의 5' 도입하여 카나마이신 선택 마커로부터 가능한 판독을 방지한다.
종결자 서열 t1t2t0을 깁슨 조립 (엔이빌더(NEBuilder)® 하이파이(HiFi) DNA 조립 클로닝 키트, 뉴 잉글랜드 바이오랩스)에 의해 만노스 프로모터의 pBW742 상류로 통합시켰다. 이러한 목적을 위해, 종결자 단편 (0.44kb)을 주형으로 pMutin2 (수탁 번호 AF072806)를 사용하여 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 024 및 서열식별번호: 025를 사용한 PCR에 의해 증폭시켰다. pBW742의 상응하는 벡터 백본을 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 022 및 서열식별번호: 023을 사용하여 증폭시켰다. pBW742 앰플리콘을 PCR 산물 정제 키트 (로슈(Roche))를 사용하여 정제하였다. DpnI (뉴 잉글랜드 바이오랩스)로의 pBW742 PCR 산물의 후속 소화 후, PCR 단편 둘 다를 퀴아퀵(Qiaquick) 겔 추출 키트 (퀴아젠, 독일 힐덴)를 사용하여 겔 정제하고 1시간 동안 50℃에서 1:2 비율로 어닐링하였다. 이. 콜라이 균주 DH10B를 20μg/ml 카나마이신을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에 플레이팅한 후 조립 반응으로 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 개별 클론으로부터 단리하고 제한 소화 및 시퀀싱에 의해 정확성에 대해 분석하였다.
pMutin2의 공개된 참조 서열로부터의 편차가 발견되었다. 서열식별번호: 026은 pMutin2 서열의 일부를 포함하고, 서열식별번호: 027은 생성된 플라스미드 pCC009에서 발견된 pMutin2의 상응하는 영역 내에서 발견된 서열 편차를 포함한다.
두 번째로, 만노스-유도성 프로모터 PmanP는 구이지오우 등 (Guiziou,S., V.Sauveplane, H.J.Chang, C.Clerte, N.Declerck, M.Jules, and J.Bonnet. 2016. A part toolbox to tune genetic expression in Bacillus subtilis. Nucleic Acids Res. 44: 7495-7508)으로부터 유래된 바실루스 서브틸리스로부터의 구성적 프로모터 Pveg의 2개의 프로모터 변이체 - 즉 PV4 및 PV8 -에 의해 교환되었다. Pveg 프로모터, 표준화된 TSS (전사 시작 부위) 영역 및 표준화된 리보솜 결합 부위 영역 R0을 포함하는 이들 프로모터 변이체는 그의 변경된 발현 수준과 관련하여 바실루스 서브틸리스의 단일 카피 수준에서 스크리닝된 조정된 Pveg 프로모터 라이브러리부터 유래된다. PV4 및 PV8 프로모터 서열은 각각 서열식별번호: 028 및 서열식별번호: 029로 열거된다.
두 프로모터 변이체의 통합은 깁슨 조립에 의해 수행되었다. PV4 및 PV8 단편의 증폭을 순차적으로 수행하였다. 두 프로모터 단편에 대해, 주형으로서 pCC009를 사용하여, 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 024 및 서열식별번호: 030을 제1 PCR (푸젼(Phusion) 높은 정확도 DNA 폴리머라제 - NEB)에 사용하였고 생성된 산물은 PV4에 대해 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 024 및 서열식별번호: 031 및 PV8에 대해 서열식별번호: 024 및 서열식별번호: 033을 사용한 제2 PCR을 위한 주형으로서 역할을 하였다.
pCC009의 벡터 백본을 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 022 및 서열식별번호: 032를 사용하여 PCR 증폭시켰다. PCR 정제 키트 (로슈)로의 벡터 앰플리콘의 정제 후, DpnI로의 PCR 산물 소화를 수행하여 PCR 반응으로부터 남아 있는 원형 플라스미드 DNA를 제거하였다. 후속적으로, 소화된 벡터 및 두 프로모터 단편을 퀴아퀵 겔 추출 키트 (퀴아젠, 독일 힐덴)를 사용하여 정제하였다. 이어서, pCC009의 벡터 앰플리콘을 각각 PV4 및 PV8의 프로모터 단편과 어닐링하며, 이로써 만노스 프로모터 PmanP를 Pveg 프로모터의 PV4 및 PV8 변이체로 대체하였다.
어닐링 반응물을 이. 콜라이 DH10B 세포 (라이프 테크놀로지스)로 후속적으로 형질전환시켰다. 형질전환체를 펼치고 37℃에서 20μg/ml 카나마이신을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에서 밤새 인큐베이션하였다. 플라스미드 DNA를 PV4 프로모터의 9개 개별 클론 및 프로모터 변이체 PV8로부터의 8개 개별 클론으로부터 단리하고 시퀀싱에 의해 정확성에 대해 분석하였다.
표 1은 다양한 프로모터 변이체의 시퀀싱 결과를 요약한다:
PV4-클로닝 반응으로부터의 클론의 분석은 오직 PV4 영역 내에서 점 돌연변이, 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 갖는 서열만이 회수될 수 있다는 것을 나타낸다.
PV8-클로닝 반응으로부터의 클론의 분석은 오직 PV8 영역 내에서 점 돌연변이, 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 갖는 서열만이 회수될 수 있다는 것을 나타낸다. 생성된 플라스미드가 표 1에 요약된다.
표 1
Figure pct00005
CRISPR/Cas9 기반 결실 플라스미드의 유전자 결실 효능
전기적격 바실루스 리케니포르미스 P308 세포를 상기 기재된 바와 같이 제조하고 20μg/ml 카나마이신을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에 플레이팅 및 37℃에서 밤새 인큐베이션 후 이. 콜라이 INV110 세포 (라이프 테크놀로지스)로부터 단리된 1μg의 amyB 결실 플라스미드 pCC010-012, pCC014-017, pCC019-026 (표 1에 도시된 바와 같이 상이한 프로모터 변이체를 가짐)로 형질전환시켰다.
다음 날, 각각의 형질전환 반응의 20개 클론을 콜로니-PCR에 적용하여 amyB 유전자의 성공적인 CRISPR/Cas9 기반 결실에 대해 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 009 및 서열식별번호: 010을 사용하여 분석하였고, 추가로 플라스미드 큐어링을 위해 48℃에서 밤새 인큐베이션 후 항생제가 없는 신선한 LB-아가 플레이트 상으로 옮겼다.
각각의 CRISPR/Cas9 기반 결실 플라스미드에 대한 amyB 유전자 결실의 효능을, 야생형 amyB 유전자 로커스의 보다 큰 특이적 PCR-앰플리콘과 비교하여 예상되는 보다 작은 특이적 PCR-앰플리콘의 외관에 기반하여 분석된 클론의 총 개수에 대한 성공적인 유전자 결실의 백분율의 비율로서 계산하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, 분석된 모든 세포가 야생형 amyB 로커스를 지녔기 때문에 CRISPR/Cas9 기반 amyB 유전자 결실 플라스미드 pCC010, pCC019 및 pCC022는 바실루스 리케니포르미스에서 기능적이지 않다.
다른 프로모터 변이체는 바실루스 리케니포르미스에서 기능적이고, Cas9의 발현을 구동시킨다. 특히, 각각 프로모터 변이체 PV4-5, PV4-7 및 PV8-7을 갖는 유전자 결실 플라스미드 pCC014, pCC016, pCC025는 60% 초과의 가장 높은 유전자 결실 효능을 나타낸다.
단일 정확한 클론을 플라스미드 큐어링을 위해 48℃에서 밤새 제2 인큐베이션 후 항생제가 없는 신선한 LB-아가 플레이트 상으로 쌓았다. 최종 클론을 다시 콜로니 PCR에 의해 성공적인 amyB 유전자 결실에 대해 분석하고 플라스미드 손실을 20μg/ml 카나마이신을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에 플레이팅함으로써 분석하였다. 큐어링된 결실 플라스미드 (카나마이신에 민감성) 및 결실된 amyB 유전자를 갖는 생성된 바실루스 리케니포르미스 균주는 바실루스 리케니포르미스 P310으로 명명되었다.
실시예 2: 바실루스 리케니포르미스에서 프로모터 PV4-5 및 PV8-7을 갖는 유전자 결실 및 유전자 돌연변이
전기적격 바실루스 리케니포르미스 P308 세포를 상기 기재된 바와 같이 제조하고 20μg/ml 카나마이신을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에 플레이팅 및 37℃에서 밤새 인큐베이션 후 이. 콜라이 INV110 세포 (라이프 테크놀로지스)로부터 단리된 각각 프로모터 PV4-5 (서열식별번호: 037) PV8-7 (서열식별번호: 046)을 갖는 hag 결실 플라스미드 pCC029 및 pCC030 각각의 1μg으로 형질전환시켰다.
다음 날, 각각의 형질전환 반응의 20개 클론을 콜로니-PCR에 적용하여 hag 유전자의 성공적인 CRISPR/Cas9-기반 결실에 대해 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 087 및 서열식별번호: 088을 사용하여 분석하였고, 추가로 플라스미드 큐어링을 위해 48℃에서 밤새 인큐베이션 후 항생제가 없는 신선한 LB-아가 플레이트 상으로 옮겼다.
각각의 CRISPR/Cas9-기반 결실 플라스미드에 대한 hag 유전자 결실의 효능을, 야생형 hag 유전자 로커스의 보다 큰 특이적 PCR-앰플리콘과 비교하여 예상되는 보다 작은 특이적 PCR-앰플리콘의 외관에 기반하여 분석된 클론의 총 개수에 대한 성공적인 유전자 결실의 백분율의 비율로서 계산하였다. 각각의 hag 유전자 결실 플라스미드에 대한 실험을 3회 수행하였다. 도 4A에 도시된 바와 같이, 플라스미드 pCC029 및 pCC030의 CRISPR/Cas9-기반 hag 유전자 결실 효능은 각각 95% 및 100%이다.
점 돌연변이의 도입에 대한 효능을 분석하기 위해, 바실루스 리케니포르미스 P308 세포를 hag 유전자의 결실에 대해 기재된 바와 같이 Cas9의 구성적 발현을 구동시키는 프로모터 PV4-5 (서열식별번호: 037) 및 PV8-7 (서열식별번호: 046)이 상이한 2개의 degU 돌연변이 플라스미드 pCC031 및 pCC032로 형질전환시켰다. 형질전환된 바실루스 리케니포르미스 세포를 30℃에서 밤새 인큐베이션 후 20μg/ml 카나마이신을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에 플레이팅하였다. H12L degU 돌연변이의 도입의 돌연변이 효능을, 야생형 degU 유전자 로커스의 본래의 degU-특이적 PCR-앰플리콘과 비교하여 제한 엔도뉴클레아제 PstI로 절단될 수 있는 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 089 및 서열식별번호: 090을 갖는 degU-특이적 PCR-앰플리콘의 외관에 기반하여 분석된 20개 클론의 총 개수에 대한 성공적인 돌연변이된 degU 유전자의 백분율의 비율로서 계산하였다. 각각의 degU 돌연변이 플라스미드에 대한 실험을 3회 수행하였다. 도 4B에 도시된 바와 같이, 플라스미드 pCC031 및 pCC032의 CRISPR/Cas9-기반 돌연변이 효능은 각각 19% 및 24%이다.
실시예 3: 바실루스 서브틸리스에서 프로모터 PV4-5 및 PV8-7을 갖는 유전자 결실
전기적격 바실루스 서브틸리스 ATCC6051a 세포를 상기 기재된 바와 같이 제조하고 20μg/ml 카나마이신을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에 플레이팅 및 37℃에서 밤새 인큐베이션 후 이. 콜라이 DH10B 세포로부터 단리된 각각 프로모터 PV4-5 (서열식별번호: 037) 및 PV8-7 (서열식별번호: 046)을 갖는 amyE 결실 플라스미드 pCC033 및 pCC034 각각의 1μg으로 형질전환시켰다.
다음 날, 각각의 형질전환 반응의 20개 클론을 콜로니-PCR에 적용하여 amyE 유전자의 성공적인 CRISPR/Cas9-기반 결실에 대해 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 091 및 서열식별번호: 092를 사용하여 분석하였고, 추가로 플라스미드 큐어링을 위해 48℃에서 밤새 인큐베이션 후 항생제가 없는 신선한 LB-아가 플레이트 상으로 옮겼다.
각각의 CRISPR/Cas9-기반 결실 플라스미드에 대한 amyE 유전자 결실의 효능을, 야생형 amyE 유전자 로커스의 보다 큰 특이적 PCR-앰플리콘과 비교하여 예상되는 보다 작은 특이적 PCR-앰플리콘의 외관에 기반하여 분석된 클론의 총 개수에 대한 성공적인 유전자 결실의 백분율의 비율로서 계산하였다. 각각의 amyE 유전자 결실 플라스미드에 대한 실험을 3회 수행하였다. 도 5A에 도시된 바와 같이, 바실루스 서브틸리스 내에서 플라스미드 pCC033 및 pCC034의 CRISPR/Cas9-기반 amyE 유전자 결실 효능은 각각 97% 및 100%이다.
바실루스 서브틸리스의 aprE 유전자의 결실에 대한 프로모터 PV4-5 (서열식별번호: 037) 및 PV8-7 (서열식별번호: 046)에 의존하는 플라스미드 pCC035 및 pCC036의 유전자 결실 효능을 amyE 유전자의 결실에 대해 기재된 절차와 유사하게 분석하였지만, 세포를 30℃에서 밤새 형질전환시킨 후 20μg/ml 카나마이신을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에서 인큐베이션하였다. 유전자 결실을 다시 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 093 및 서열식별번호: 094를 사용한 콜로니-PCR에 의해 분석하고 유전자 결실 효능을 3회의 독립적인 형질전환 반응에 대해 상기 기재된 바와 같이 계산하였다. 도 5B에 도시된 바와 같이, 바실루스 서브틸리스 내에서 플라스미드 pCC035 및 pCC036의 CRISPR/Cas9-기반 aprE 유전자 결실 효능은 각각 32% 및 47%이다.
실시예 4: 바실루스 리케니포르미스에서 프로모터 PV4-5 및 PV8-7 및 상이한 스페이서를 갖는 유전자 결실
전기적격 바실루스 리케니포르미스 Bli#005 세포를 상기 기재된 바와 같이 제조하고 20μg/ml 카나마이신을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에 플레이팅 및 37℃에서 밤새 인큐베이션 후 이. 콜라이 Ec#098 세포로부터 단리된 각각 프로모터 PV4-5 (서열식별번호: 037) 및 상이한 vpr-특이적 스페이서 서열 (서열식별번호: 066 - 068)을 갖는 vpr 결실 플라스미드 pCC037, pCC038 및 pCC039 각각의 1μg으로 형질전환시켰다.
다음 날, 각각의 형질전환 반응의 20개 클론을 콜로니-PCR에 적용하여 vpr 유전자의 성공적인 CRISPR/Cas9-기반 결실에 대해 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 095 및 서열식별번호: 096을 사용하여 분석하였고, 추가로 플라스미드 큐어링을 위해 48℃에서 밤새 인큐베이션 후 항생제가 없는 신선한 LB-아가 플레이트 상으로 옮겼다.
각각의 CRISPR/Cas9-기반 결실 플라스미드에 대한 vpr 유전자 결실의 효능을, 야생형 vpr 유전자 로커스의 보다 큰 특이적 PCR-앰플리콘과 비교하여 예상되는 보다 작은 특이적 PCR-앰플리콘의 외관에 기반하여 분석된 클론의 총 개수에 대한 성공적인 유전자 결실의 백분율의 비율로서 계산하였다. 도 6A에 도시된 바와 같이, 플라스미드 pCC037, pCC038 및 pCC039의 CRISPR/Cas9-기반 vpr 유전자 결실 효능은 각각 100%, 100% 및 84%이다.
바실루스 리케니포르미스의 epr 유전자의 결실에 대한 프로모터 PV4-5 (서열식별번호: 037) 및 상이한 epr-특이적 스페이서 서열 (서열식별번호: 070 - 072)을 갖는 플라스미드 pCC040, pCC041 및 pCC042의 유전자 결실 효능을 vpr 유전자에 대해 기재된 바와 같이 수행하였지만, 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 097 및 서열식별번호:098을 유전자 결실의 콜로니-PCR-기반 분석에 사용하였다. 도 6B에 도시된 바와 같이, 플라스미드 pCC040, pCC041 및 pCC042의 CRISPR/Cas9-기반 epr 유전자 결실 효능은 각각 87.5%, 100% 및 100%이다.
실시예 5: 바실루스 리케니포르미스에서 프로모터 PV4-5 및 PV8-7을 갖는 유전자 통합
전기적격 바실루스 리케니포르미스 Bli#005 세포를 상기 기재된 바와 같이 제조하고 20μg/ml 카나마이신을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에 플레이팅 및 37℃에서 밤새 인큐베이션 후 이. 콜라이 Ec#098 세포로부터 단리된 프로모터 PV4-5 (서열식별번호: 037)를 갖는 1μg의 유전자 통합 플라스미드 pCC043으로 형질전환시켰다.
다음 날, 형질전환 반응의 20개 클론을 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 009 및 서열식별번호: 010을 사용한 콜로니-PCR에 적용하여 바실루스 리케니포르미스의 amyB 유전자를 대체하는 PaprE-GFPmut2 발현 카세트의 성공적인 CRISPR/Cas9-기반 통합에 대해 분석하였고, 추가로 플라스미드 큐어링을 위해 48℃에서 밤새 인큐베이션 후 항생제가 없는 신선한 LB-아가 플레이트 상으로 옮겼다.
pCC043 CRISPR/Cas9-기반 유전자 통합 플라스미드에 대한 유전자 통합의 효능을, 야생형 amyB 유전자 로커스의 보다 큰 특이적 PCR-앰플리콘과 비교하여 예상되는 특이적 PCR-앰플리콘의 외관에 기반하여 분석된 클론의 총 개수에 대한 성공적인 유전자 통합의 백분율의 비율로서 계산하였다. 실험을 2회 수행하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, Bli#005로의 플라스미드 pCC043의 CRISPR/Cas9-기반 유전자 통합 효능은 67%이다.
플라스미드 pCC043을 갖는 PaprE-GFPmut2 발현 카세트의 유전자 통합의 효능을 바실루스 리케니포르미스 P308 균주에 대해 유사하게 결정하였고, 2회의 독립적인 형질전환 반응에서 도 7에 도시된 바와 같이 72%의 평균 유전자 통합 효능을 나타낸다.
실시예 6: 바실루스 푸밀루스에서 프로모터 PV4-5를 갖는 유전자 결실
전기적격 바실루스 푸밀루스 DSM14395 세포를 상기 기재된 바와 같이 제조하고 Cas9 엔도뉴클레아제의 발현을 구동시키는 프로모터 PV4-5 (서열식별번호: 037)를 갖는 포자형성 유전자 결실 플라스미드 pCC044 (sigE), pCC045 (sigF) 및 pCC046 (spoIIE) 각각의 1μg으로 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 이. 콜라이 DH10B 세포로부터 단리하고 형질전환 전에 상기 기재된 바와 같이 시험관내 메틸화시켰다. 형질전환된 바실루스 푸밀루스 세포를 20μg/ml 카나마이신을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에 플레이팅하고 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
다음 날, 각각의 형질전환 반응의 20개 클론을 sigE 결실의 분석을 위해 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 099 및 서열식별번호: 100, sigF 결실의 분석을 위해 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 101 및 서열식별번호: 102, 및 spoIIE 결실의 분석을 위해 올리고뉴클레오티드 서열식별번호: 103 및 서열식별번호: 104를 사용한 콜로니-PCR에 적용하였다. 개별 콜로니를 추가로 플라스미드 큐어링을 위해 48℃에서 밤새 인큐베이션 후 항생제가 없는 신선한 LB-아가 플레이트 상으로 옮겼다.
바실루스 푸밀루스에서 플라스미드 pCC044, pCC045 및 pCC046의 유전자 결실의 효능을, 야생형 유전자 로커스의 보다 큰 특이적 PCR-앰플리콘과 비교하여 예상되는 보다 작은 특이적 PCR-앰플리콘의 외관에 기반하여 분석된 클론의 총 개수에 대한 성공적인 유전자 결실의 백분율의 비율로서 계산하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 바실루스 푸밀루스 내에서 플라스미드 pCC044, pCC045 및 pCC046의 CRISPR/Cas9-기반 유전자 결실 효능은 각각 43%, 56% 및 50%이다.
SEQUENCE LISTING <110> BASF SE <120> Method for the production of constitutive bacterial promoters conferring low to medium expression <130> 191606WO01 <160> 104 <170> According Wipo Std 25 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide: PCR-amplification of pE194 <400> 1 tatatacagc tggattcaca aaaaataggc ac 32 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide: PCR-amplification of pE194 <400> 2 tatatacagc tggattatgt cttttgcgca gtc 33 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide: PCR-amplification of functional mRFP cassette <400> 3 tatatggatc cgtaatcagg gtatcgaggc 30 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide: PCR-amplification of functional mRFP cassette <400> 4 tatatggatc cctcattagg cgggctacta a 31 <210> 5 <211> 1345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> functional fragment: T2A mRFP cassette <400> 5 ggaatagatc tggccaacga ggcctcgagg atccgatatc atgcatggcg cgccaccctg 60 agacgaccct gatgcaggtg accctgagac cttcgcgccc agctgtctag ggcggcggat 120 ttgtcctact caggagagcg ttcaccgaca aacaacagat aaaacgaaag gcccagtctt 180 tcgactgagc ctttcgtttt atttgatgcc tttaattaag taccttgtcg gataaagctg 240 tgttatatta tgtcttggtg ttaaatacac acgcttaacg atttatgcag agggtgctgc 300 aggcggcagt tctgtacaaa aatgacctaa gcggaggaaa aaaaccatta tattaggagg 360 aaataacatg gcctcttcag aggatgttat taaagaattt atgcggttta aggtgaggat 420 ggaaggctcg gtgaacggac atgagttcga aattgaggga gaaggtgaag gccgccctta 480 tgaaggtact cagacagcga aattgaaagt cacgaaaggc ggaccgctgc cgtttgcttg 540 ggacattctc tcacctcaat ttcaatatgg ctcaaaagcc tacgtaaaac acccggctga 600 catccctgat tacttaaagc tatccttccc ggagggcttt aaatgggaac gagttatgaa 660 ttttgaggac ggcggcgtcg ttactgtcac acaggattct tcccttcagg atggcgaatt 720 tatttacaaa gtaaaacttc gtggaactaa cttcccaagt gatggtcccg tgatgcaaaa 780 aaaaacaatg ggatgggaag catctacgga acgtatgtat ccggaggatg gagccttaaa 840 gggtgaaatc aaaatgcgcc tgaaacttaa agatggcgga cactatgacg cggaagttaa 900 aacaacatat atggctaaaa aaccagtcca actgccggga gcatataaga cggatataaa 960 gttggacatt accagccata atgaagatta cacgattgtg gaacagtatg agagagcaga 1020 gggcagacat agcacaggcg cgtaagaatt aatgaaaaat aagcggcagc ctgcttttcc 1080 atgcgggctg ccgcttatcg ggttattgtc gtgactggga aaaccctggc gactagtctt 1140 ggactcctgt tgatagatcc agtaatgacc tcagaactcc atctggattt gttcagaacg 1200 ctcggttgcc gccgggcgtt ttttattggt gagaatccag gggtccccaa taattacgat 1260 ttggtctcac tcacacctgc tcgtctcact caatttaaat ggcggccgcg gatcctcgac 1320 gggccaataa ggccagatct ggatt 1345 <210> 6 <211> 1012 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> homology regions: Fusion of 5- and 3-prime regions of amyB gene with flanking XmaI sites <400> 6 cccgggataa tgccgtcgca ctggccgata ttgagagatt tccttgtgac aagctgcaaa 60 gcataatgat gacggtccag ctcgcggctg attcccgtta acagattcat ataataaggt 120 tctgttgtat ccatttcttc cagtatgagc agcttgacga cctgtgttct gttttgaacg 180 agcgctcttg ctgcatagtt cggtatataa ttgagctcct tcattgcgga atgaacaagc 240 tttttcaatt catccgtcac agtctcagga tgattgatca cccgcgatac cgtcattttc 300 gacacatttg ctttctttgc tacatcagat aacgttgcca tttcatcccc gccttaccta 360 tgcgattcaa actgtcagca agtccttcct gagggctgat gacactttgt taaaattaat 420 tataaaatgt aatcaaagaa atttataaga cgggcaaaat aaaaaaacgg atttccttca 480 ggaaatccgt cctctctgct cttctagatt ctcctcccct ttcaatgtga aacatatgat 540 attgtataaa tattccgaat ttttaacaaa taccattttc cctatatttt cttccaaaag 600 aaaagcgccg atatggcgct ttctactcat ttattcaata gcctctctgc ttcttcactt 660 cttcaagctg agatacagtt accaattgat agccttttgc tttcagcttt ttaataatct 720 cttcagcagc atctgcggac gttgcataaa tatcgtgcat taagacgatt tttccgtctc 780 ccgcatggct catgacatga ttgacaatct tttgcttatt tttgtacttc caatcttccg 840 gatcaacatc ccacaatgaa accttcagat tggaaagcga gcggacggaa tcattgatcc 900 cgccgtatgg aggacgcaag tgtacaggca ggtgtccgct gattttttcg atcatttctt 960 gcgtgtcgtt aatctcctga tacgcttttt cgtttgacag ccttgtcccg gg 1012 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide: Protospacer target sequence for amyB gene with 4nt 5-prime extension <400> 7 tacgtcgcag cagaaattaa gaga 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide: Protospacer target sequence for amyB gene with 4nt 5-prime extension <400> 8 aaactctctt aatttctgct gcga 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide: PCR-amplification of amyB genomic region <400> 9 ttgcccgaat acaacgacag 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide: PCR-amplification of amyB genomic region <400> 10 caacaacagg ctgtctgacg g 21 <210> 11 <211> 2143 <212> DNA <213> Bacillus licheniforms <220> <223> P300 DSM641 RMS: RMS region and flanking region <400> 11 aacttctata aatgtaacga tacgatttat tgtttcatta aagtcttcct ttatttcatg 60 ttcccatatt cttttaatgt tccaatcctt ttcctcgtaa tatttattaa cttccttatc 120 tcttttttta tttctttcga gttttttctc ccaatattcc gtattacttt ttggtatatt 180 cccgtgtttt tcacacgcat gccagaaaca agaatcaatg aatatgacta ttttatattt 240 ctgtattact atatctggac taccgtataa tttcttaaca ttttttcgga atcttattcc 300 acggtgccat agttctttag taaccttatc ttctaatttt gaacgagatt tgattgcctg 360 catgtttttt cttctttgtt cttttgaaac cgtgtcagtc atagaagagt cctccaaagc 420 cacaataatt gtattctata aacgaggaag caagccctca agcttacccc ctcttagttc 480 cttttttgcc tacttattta tttgttttca ttttcaaatt catcataaga acccatttca 540 caaaaatcaa tggagtaatg ttgttcgctg tgtttataaa caattactga gtcaatattt 600 agtctttcca gcatttcata ggttagaagt tctttttcct ctaagttcat aacttgtctt 660 agtagccatt ctccaagagc actatttgga ttagacataa gtgctttact attgtcttgg 720 cataccttgg ctgataaaag cgatttgtct ggcaagcgta actgaaaagg tttatcacga 780 gctgggaaaa atgttgggaa tacattatga atccattttg gaattggtat ataaatctcg 840 ttagggtttc gtggtcgacc taaagcattc cattggttta gaccgctttt ttctggtaca 900 tgacgctttg agccacggtc tgaaaagagt ggaagaataa cgtgctcaag gttttcaaaa 960 ggattgacag ttggtgctgg aatttttgga atttcaaagc caaatagttt agccaattca 1020 tgataaggat tttctaagat ttcaacatta atttcttcaa taggtttatc agtgataaaa 1080 cgcttataaa gggtgctctt agtgacatta aagctgtatt cgtgtagacc gtcttcaaag 1140 gtgattgtat ttctgttgtt acttactttc acatttgtaa ttgaggagat ttcaaccaag 1200 tccattggct cttcaaaaat aagaattttc cctggctttc ttgttacaca gtggtatatc 1260 attgaatcaa taccatatgt tcttttagta aattcaattc tctcgttacg gagagaagca 1320 accgtgttta ttagctcttt tggagatttc ccacgataca agtctgagtc tttattgaat 1380 tcagctactt tttgaagagt atgaccatta ccatgaagaa aagtcttaat accaattccg 1440 acacgattta atgaagcgtc agcagaacag tctgacctcc ccaagttttc agctccaaat 1500 gcttcacaaa aagcattttc cacattcctt gagaccaaat aaggcgagtc actttcagag 1560 aacaaattgg atagcgaacc agttgagcgg agcatttgtt tgtatgtagt gcagttgatg 1620 gctggttgat tagtatagaa cattattttt cctcctcttt tatgcttgtc atttcttctt 1680 tcagacccaa aaggtagtca gctgatacgt tcaatgtttc agctattctt ttgaaagtgt 1740 ccaatgatgg agttctattt tcactttcat atagtgacca agtgcttcta gtgaccccga 1800 ctttttcagc gatttggctg ggtaataacc tacgagcttc tcttgcattt tgaatacgat 1860 ttccaaggaa aggtatcatt tttgcacctc caagatttgt tgttttcaga gtatcaccag 1920 aacccccgaa aatagtccaa agttagctaa cagcaaacaa ataaaaataa ataagttgtt 1980 tactcttagc aaacttgtta ctaaaatttg ataaagttat tcatttaatc cagctcttat 2040 gctaaaattg cattagcgga caagcttaat gtttgcaagg aggtataatt ttgacttatc 2100 gagtaggtag tatgtttgct gggataggtg gaacttgttt agg 2143 <210> 12 <211> 1146 <212> DNA <213> Bacillus licheniforms <220> <223> cds: Restrictase P300 DSM641 <400> 12 ttatttgttt tcattttcaa attcatcata agaacccatt tcacaaaaat caatggagta 60 atgttgttcg ctgtgtttat aaacaattac tgagtcaata tttagtcttt ccagcatttc 120 ataggttaga agttcttttt cctctaagtt cataacttgt cttagtagcc attctccaag 180 agcactattt ggattagaca taagtgcttt actattgtct tggcatacct tggctgataa 240 aagcgatttg tctggcaagc gtaactgaaa aggtttatca cgagctggga aaaatgttgg 300 gaatacatta tgaatccatt ttggaattgg tatataaatc tcgttagggt ttcgtggtcg 360 acctaaagca ttccattggt ttagaccgct tttttctggt acatgacgct ttgagccacg 420 gtctgaaaag agtggaagaa taacgtgctc aaggttttca aaaggattga cagttggtgc 480 tggaattttt ggaatttcaa agccaaatag tttagccaat tcatgataag gattttctaa 540 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tgccgttctt gatatcatgc atgtggtcaa aacgatcaaa 1140 aaaacatggc caaccatcga cattcaaact gtcggaggcg ctgaagccat tgttgaaatt 1200 gatacaggca aacgccagct ttctcccgta ttatttgtgt tcgtgtggct tttattattt 1260 gtcggagcgg cgcttgccat tatgaatttc cacgaggatg tcagtatgcg gctcgtccat 1320 atctcaagag acccgttg 1338 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Protospacer: protospacer target sequence for spoIIE gene <400> 85 cttgtagctg aacagctgat 20 <210> 86 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA and homology regions: protospacer epr-sgRNA, homology region of the spoIIE gene with flanking BsaI sites <400> 86 ggttgcggtc tcatacgctt gtagctgaac agctgatgtt ttagagctag aaatagcaag 60 ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgctttttac 120 tccatctgga tttgttcaga acgctcggtt gccgccgggc gttttttatc taaactagta 180 ggcccagtcg atacgtaaag actgggcctt tttaatacga ctcactatag ggtcgacggc 240 caacgaggcc tcgaggatcc gatatcatgc atggcgcgcc accctgagac gaccctgatg 300 caggtgaccc ggatccacta gtcctgctgt ccgcaggtgc tttttttctt gacccacacg 360 acattttttg agatttcgtc atttaattta aaacttccta ttgacggaca agcgattcct 420 ttgtattata gatcttgtgc ttcttagcgc atttttatta tggcggtgta gctcagctgg 480 ctagagcgta cggttcatac ccgtgaggtc gggggttcga tcccctccgc cgctatcctt 540 ttgattagaa cataaaagca aggcccgttg gtcaagcggt taagacaccg ccctttcacg 600 gcggtaacac gggttcgaat cccgtacggg tcatcttcga aaacagcttt ctttaggaaa 660 gctgtttttt tgtgtcttca taaaattctg atgaaagaca tcgactttca agaaagtatg 720 cctctttgac gaataaagcg tcgaacgttt tatggaaacg acaacttctt ttgacaaaat 780 ttctttttca ccttcgctat aatgacaagc aacgaatatc agtgaaatat cgtataatat 840 gaatttcttc tggcgatgat ggggatataa agcattcagt acgatcccag gaggaatgaa 900 gatgcgaaaa ggtcacgtaa accaaatctt attgattaca gatggctgct caaatcacgg 960 ggaagatcca cttgcgattg cctcattggc aaaggaacaa gggattacag tcaatgttat 1020 tggcattatg gaggaaaaca gacacgacca tgaagcaatg aaagaagttg aagggattgc 1080 tctcgcaggt ggaggcatcc atcaagttgt ctacgtccag cagttatctc aaaccgtaca 1140 aatggttaca aaaaaagcga tgacacaaac cttgcaaggt gttgtgaata aagaattgca 1200 gcaaatactt ggcaaggaca ctgaaattga agagctgcca cctgataaac gcggggaagt 1260 gatggaagta gtcgatgagt taggagagac ggttcatctt caagtgcttg tgcttgttga 1320 tactcaagag acccgttg 1338 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide: PCR-amplification of hag genomic region <400> 87 tgatcttgat gaaacgacgg 20 <210> 88 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide: PCR-amplification of hag genomic region <400> 88 taatcctgat attctgatcg cc 22 <210> 89 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide: PCR-amplification of degU genomic region <400> 89 atgatttaag gccgatggc 19 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide: PCR-amplification of degU genomic region <400> 90 atccgccttc agctactact t 21 <210> 91 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide: PCR-amplification of amyE genomic region <400> 91 ggtcatgaat aatctgcgta atagac 26 <210> 92 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide: PCR-amplification of amyE genomic region <400> 92 gcgtgtacgt tttgaggcgc tgcgcc 26 <210> 93 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide: PCR-amplification of aprE genomic region B. subtilis <400> 93 gagctggcag atgaagccaa tattcc 26 <210> 94 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide: PCR-amplification of aprE genomic region B. subtilis <400> 94 gtacgcgcat gaggaacgac aaataag 27 <210> 95 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide: PCR-amplification of vpr genomic region <400> 95 ctgtcaccca cttcccatta tgag 24 <210> 96 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide: PCR-amplification of vpr genomic region <400> 96 gtgaccgaag gctttccatc attg 24 <210> 97 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide: PCR-amplification of epr genomic region <400> 97 cttgtcatcg tcgtcgggat tcag 24 <210> 98 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide: PCR-amplification of epr genomic region <400> 98 gtgccaatca caaatgtagc cagc 24 <210> 99 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide: PCR-amplification of sigE genomic region <400> 99 gaggaggcat gatcggagtt cattc 25 <210> 100 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide: PCR-amplification of sigE genomic region <400> 100 ctcctccgtc attatagatc ggttc 25 <210> 101 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide: PCR-amplification of sigF genomic region <400> 101 gtgacgaatt atttggaaac agagg 25 <210> 102 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide: PCR-amplification of sigF genomic region <400> 102 cgacataatg atcgagatcg agctg 25 <210> 103 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide: PCR-amplification of spoIIE genomic region <400> 103 ctcaacaaca acaatcaaga ccgag 25 <210> 104 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide: PCR-amplification of spoIIE genomic region <400> 104 gatagtgaat cgaatcgagg cgtcc 25

Claims (19)

  1. 하기 단계를 포함하는, 박테리아 세포에서 각각의 시작 조절 핵산 분자와 비교하여 감소된 구성적 발현을 부여하는 하나 이상의 합성 조절 핵산 분자를 생산하는 방법:
    a. 박테리아 세포에서 구성적 발현을 부여하는 적어도 하나의 시작 조절 핵산 분자를 확인하는 단계, 및
    b. 상기 시작 조절 핵산 분자를 상기 시작 조절 핵산 분자에 이종성인 단백질을 코딩하는 코딩 영역에 작동가능하게 연결하는 단계, 및
    c. 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 상기 시작 조절 핵산 분자를 포함하는 구축물을 박테리아 세포 내에서 벡터의 높은 카피 수를 부여하는 복제 기점을 포함하는 상기 벡터에 도입하는 단계로서, 여기서 상기 구축물은 상기 코딩 영역의 높은 발현을 부여하며, 여기서 박테리아 세포에서의 상기 코딩 영역의 높은 발현은 상기 박테리아 세포에 부담을 주어 감소된 또는 제거된 성장을 야기하는 것인 단계, 및
    d. 상기 벡터를 박테리아 세포로 형질전환시키는 단계, 및
    e. 상기 형질전환된 박테리아 세포를 성장시켜 단일 클론을 회수하는 단계, 및
    f. 상기 구축물을 포함하지 않는 상응하는 박테리아 균주와 비교할 만한 성장률을 나타내는 단일 클론을 단리하는 단계, 및
    g. 상기 클론으로부터 상기 구축물을 단리하는 단계; 및
    h. 상기 구축물에 포함된 합성 조절 핵산 분자를 상기 합성 조절 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 유전자의 기능적 발현에 대해 시험하는 단계 및 임의로
    i. 상기 구축물에 포함된 각각의 조절 핵산 분자를 시퀀싱하며, 이로써 박테리아 세포에서 감소된 구성적 발현을 부여하는 합성 조절 핵산 분자를 확인하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 합성 조절 핵산 분자가 재조합 핵산이 생산되는 세포와 구별되는 박테리아 세포에서 감소된 발현을 부여하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 합성 조절 핵산 분자가 그람-양성 및 그람-음성 박테리아의 세포에서 활성인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 합성 조절 핵산 분자가 바실루스(bacillus) 강 및 감마프로테오박테리아(gammaproteobacteria) 강의 세포에서 활성인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 합성 조절 핵산 분자가 바실라세아에(bacillaceae) 과 및 엔테로박테리아세아에(enterobacteriaceae) 과의 세포에서 활성인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 합성 조절 핵산 분자가 바실루스 속 및 에스케리키아(escherichia) 속의 세포에서 활성인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 합성 조절 핵산 분자가 바실루스 속의 세포에서 활성인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 합성 조절 핵산 분자가 바실루스 알칼로필루스(Bacillus alkalophilus), 바실루스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실루스 브레비스(Bacillus brevis), 바실루스 시르쿨란스(Bacillus circulans), 바실루스 클라우시이(Bacillus clausii), 바실루스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실루스 피르무스(Bacillus firmus), 바실루스 라우투스(Bacillus lautus), 바실루스 렌투스(Bacillus lentus), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실루스 푸밀루스(Bacillus pumilus), 바실루스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus), 바실루스 메틸로트로피쿠스(Bacillus methylotrophicus), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 바실루스 파라리케니포르미스(Bacillus paralicheniformis), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 세포, 및 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis) 세포에서 활성인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 합성 조절 핵산 분자가 적어도 3종의 상이한 바실루스 종의 세포에서 활성인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 합성 조절 핵산 분자가 적어도 2종의 상이한 바실루스 종의 세포에서 활성인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 합성 조절 핵산 분자가 적어도 1종의 바실루스 종의 세포에서 활성인 방법.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 바실루스 종이 바실루스 서브틸리스, 바실루스 리케니포르미스 또는 바실루스 푸밀루스 중 적어도 1종을 포함하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 합성 조절 핵산 분자가 바실루스 리케니포르미스의 세포에서 활성인 방법.
  14. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 세포에서 구성적 발현을 부여하는 시작 조절 핵산 분자가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법:
    a. 서열식별번호: 28 및 29,
    b. 서열식별번호: 28 또는 29에 의해 기재된 서열의 20개의 연속하는 염기 쌍과 동일한 적어도 20개의 연속하는 염기 쌍을 포함하는 핵산 분자, 및
    c. 서열식별번호: 28 또는 29에 의해 기재된 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 90%의 동일성을 갖는 핵산 분자, 및
    d. 높고 엄격한 조건 하에 서열식별번호: 28 또는 29에 의해 기재된 핵산 분자의 적어도 20개의 연속하는 염기 쌍의 핵산 분자와 혼성화하는 핵산 분자 및
    e. a) 내지 d)에 정의된 바와 같은 핵산 분자 중 임의의 것의 상보체.
  15. 합성 조절 핵산 분자로서, 조절 핵산 분자가 하기로 이루어진 군에 포함되며:
    a. 서열식별번호: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 43, 45, 46 또는 47의 서열을 갖는 핵산 분자, 및
    b. 서열식별번호: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 43, 45, 46 또는 47에 의해 기재된 서열의 20개의 연속하는 염기 쌍과 동일한 적어도 20개의 연속하는 염기 쌍을 포함하는 핵산 분자 및
    c. 서열식별번호: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 43, 45, 46 또는 47에 의해 기재된 서열에 대한 전체 길이에 걸쳐 적어도 90%의 동일성을 갖는 핵산 분자 및
    d. 높고 엄격한 조건 하에 서열식별번호: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 43, 45, 46 또는 47 중 임의의 것에 의해 기재된 핵산 분자의 적어도 20개의 연속하는 염기 쌍의 핵산 분자와 혼성화하는 핵산 분자 및
    e. a) 내지 d)에 정의된 바와 같은 핵산 분자 중 임의의 것의 상보체,
    여기서 b) 내지 e)에 정의된 바와 같은 서열은 각각의 시작 핵산 분자와 구별되는 것인
    합성 조절 핵산 분자.
  16. 제15항에 있어서, 핵산 분자가 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같이 생산된 것인 합성 조절 핵산 분자.
  17. 제15항 또는 제16항의 합성 조절 핵산 분자를 포함하는 발현 구축물.
  18. 제15항 또는 제16항의 조절 핵산 분자 또는 제17항의 발현 구축물을 포함하는 벡터.
  19. 제15항 또는 제16항의 조절 핵산 분자 또는 제17항의 발현 구축물 또는 제18항의 벡터를 포함하는 미생물.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114292867B (zh) * 2021-12-31 2024-01-23 淮阴工学院 芽孢杆菌表达载体及其构建方法和应用
WO2023166029A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Cas12a nickases

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4005025A1 (de) 1989-04-28 1990-10-31 Henkel Kgaa Verbessertes transformationsverfahren
DK0493398T3 (da) 1989-08-25 2000-05-22 Henkel Research Corp Alkalisk, proteolytisk enzym og fremgangsmåde til fremstilling deraf
FR2704860B1 (fr) * 1993-05-05 1995-07-13 Pasteur Institut Sequences de nucleotides du locus cryiiia pour le controle de l'expression de sequences d'adn dans un hote cellulaire.
ATE196311T1 (de) 1993-12-09 2000-09-15 Univ Jefferson Verbindungen und verfahren zur ortsspezifischen mutation in eukaryotischen zellen
US6555732B1 (en) 1998-09-14 2003-04-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Rac-like genes and methods of use
US7026149B2 (en) 2003-02-28 2006-04-11 Ajinomoto Co., Inc. Polynucleotides encoding polypeptides involved in the stress response to environmental changes in Methylophilus methylotrophus
NZ597299A (en) 2005-08-26 2013-03-28 Dupont Nutrition Biosci Aps Use of a cas gene in combination with CRISPR repeats for modulating resistance in a cell
RU2018122288A (ru) 2013-03-14 2019-03-06 Карибо Биосайенсиз, Инк. Композиции и способы с участием нуклеиновых кислот, нацеленных на нуклеиновые кислоты
ES2767318T3 (es) 2013-06-17 2020-06-17 Broad Inst Inc Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para generar modelos y actuar sobre enfermedades y trastornos de células posmitóticas
EP3102669B1 (en) 2014-02-07 2019-06-12 DSM IP Assets B.V. Improved bacillus host
EP3115457B1 (en) 2014-03-05 2019-10-02 National University Corporation Kobe University Genomic sequence modification method for specifically converting nucleic acid bases of targeted dna sequence, and molecular complex for use in same
JP7067793B2 (ja) 2015-10-23 2022-05-16 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 核酸塩基編集因子およびその使用
DK3448990T5 (da) 2016-04-29 2021-09-27 Basf Plant Science Co Gmbh Fremgangsmåder til modifikation af målnukleinsyrer ved anvendelse af et fusionsmolekyle bestående af guide- og donor-dna, rna-fusionsmolekyle og vektorsystemer, der koder for rna-fusionsmolekylet
WO2019016051A1 (en) 2017-07-21 2019-01-24 Basf Se PROCESS FOR TRANSFORMING BACTERIAL CELLS
CN107699533A (zh) * 2017-10-12 2018-02-16 江南大学 一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌
CN110157749B (zh) * 2019-06-06 2020-10-09 江南大学 应用枯草芽孢杆菌群体响应调控系统合成mk-7的方法

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