JP2023502967A

JP2023502967A - バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のゲノムを改変するための、選択マーカーを使用しない方法及びその組成物

Info

Publication number: JP2023502967A
Application number: JP2022528304A
Authority: JP
Inventors: ホセアベンデズ、フェリペ; イレーヌロビダスタブス、ステーシー
Original assignee: ダニスコ・ユーエス・インク
Priority date: 2019-11-19
Filing date: 2020-11-18
Publication date: 2023-01-26
Also published as: WO2021101950A1; EP4061939A1; KR20220098245A; US20220389459A1; CN114981428A

Abstract

選択マーカーの使用なしに且つ誘導型Ｃａｓエンドヌクレアーゼの使用なしにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムを改変するための方法及び組成物が提供される。本開示は、ドナーＤＮＡ配列をバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムに、前記ゲノムへの選択マーカーの使用なしに且つＣａｓエンドヌクレアーゼの使用なしに組み込むための方法と、目的の遺伝子を除去するための方法及び／又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムに点変異を提供するための方法とを含む。【選択図】図１

Description

本発明は、細菌分子生物学の分野、特に選択マーカーの使用なしに且つＣａｓエンドヌクレアーゼの使用なしにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムを改変するための組成物及び方法に関する。

関連出願の相互参照
本出願は、全体として参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年１１月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／９３７，３７２号明細書に対する利益を主張するものである。

電子的に提出された配列表の参照
配列表の認証謄本は、２０２０年１１月２日に作成され、１８８キロバイトのサイズを有する、ＮＢ４１４２５－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔというファイル名の１ＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出され、本明細書と同時に出願される。このＡＳＣＩＩフォーマット文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｅｃｉｅｓ）（バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．））での酵素の商業的生産では、マーカーを含まない抗生物質耐性株を作製する方法が必要である。これらの方法は、いくつかの基準に適合する必要がある；（ｉ）目的の遺伝子の挿入と宿主の改変との両方に有用であること、（ｉｉ）迅速且つ効率的であること、及び（ｉｉｉ）使いやすいこと。

バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）の染色体を改変するために広く使用されている既知の方法は、プラスミドコンストラクトを構築し、それらを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）（大腸菌（Ｅｃｏｌｉ））に形質転換することを含む。続いて、プラスミドを大腸菌（Ｅｃｏｌｉ）から単離し、選択マーカーを使用してバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）に形質転換する。この方法が広く使用されているのは、少なくとも部分的には、大腸菌（Ｅｃｏｌｉ）がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）よりも形質転換が容易であるという考えに起因し得る。これに関連して、プラスミドのインビトロでのライゲーションは、大腸菌（Ｅｃｏｌｉ）を形質転換させ得るが、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）を形質転換しないニック産物をもたらす。ドナーＤＮＡをバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）に導入するための従来のアプローチは、プラスミドの複製に基づいている。残念ながら、そのようなアプローチは、一般に、細胞内でプラスミドを維持するための抗生物質又は他の選択マーカーの必要性を含む、いくつかの不利な点に関連している。これは、産生株にとって望ましくなく、スクリーニング条件の選択を制約する。プラスミド複製を使用することの別の欠点は、プラスミド上の遺伝子が複数のコピーで存在することが多く、遺伝子の調節及び発現に影響を与えることである。

代わりに、組み込みプラスミド又はベクターを使用し得る。組み込みベクターは、複製起点を含まないため、安定して維持するために宿主染色体への挿入が必要である。しかしながら、これらに問題がないわけではない。組み込みは、キャンベルタイプの組換えイベントを介して行われ、挿入された（現在では線状の）ベクターのいずれかの端部でクローニングされた領域が複製される。組み込み遺伝子の位置によっては、遺伝子が破壊され、形質転換効率が低下し得る。

非抗生物質選択カセットは、現在、ＡＲＭフリー株を構築するために使用することができる（Ｆｅｒｒａｒｉｅｔａｌ．１９８５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏｌ．３：１００３－１００７）。しかしながら、これには時間がかかり、同じ株で使用するためにカセットを除去する必要がある。

バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムへの遺伝子改変及び遺伝子組み込みのための以前の方法は、自発的な二本鎖切断の発生及び短いホモロジーアームとともに線状ＤＮＡ断片上で同じ場所に位置する選択マーカー（ゲノムに挿入されることになる目的の遺伝子（ＧＯＩ）と、そのゲノムに組み込まれる目的の遺伝子を有したバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞の同定も可能にするようにゲノムに挿入された選択マーカーとの両方を含む）の使用に依拠する（２００２年２月２１日に公開された国際公開第０２／１４４９０号パンフレット）。選択マーカー及びＧＯＩは、通常、細胞内のＤＮＡとの組換え時にＧＯＩ及び選択マーカーの両方が細胞のＤＮＡ中に組み込まれることになるように、２つの短いホモロジーアームによって隣接された。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞へのゲノム組み込みのための短いホモロジーアームによる、そのような線状断片の形質転換中の選択マーカーの使用は、ゲノムの特定の位置の効率的な改変のために選択することが必要となる。選択マーカーは、発現のための正確な遺伝子座に組み込む必要があり、この組み込みは、集団内及びゲノム内の確率的な様式で発生する希有な自発的ＤＮＡ損傷に依拠する。この希有な事象は、マーカーの使用及び染色体組み込みを組み合わせることによってのみ選択され得る。（２００２年２月２１日に公開された国際公開第０２／１４４９０号パンフレット）。

バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）において、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ／ＲＮＡガイド系と組み合わせた単一のプラスミド系の使用は、遺伝子欠失及び遺伝子における点変異の導入を可能にすることに関して記載されている（ＡｌｔｅｎｂｕｃｈｎｅｒＪ．，２０１６，ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．８２（１７）ｐｇ．５４２１－５４２７）。Ｃａｓベースのゲノム操作技術は、いくつかの異なる宿主細胞型に適用されているが、これらの技術には既知の制限がある。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法は、ＡＲＭフリーのマーカーレス株を構築するために使用されている（Ｓｏｅｔａｌ．２０１７，ＦｒｏｎｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｖｏｌ．８：１１６７，Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．２０１６，ＳｃｉＲｅｐ，Ｖｏｌ．６：２７９４３）。このアプローチでは、Ｃａｓ９技術へのアクセス、Ｃａｓ９をコードするプラスミド又は線状断片の構築及び改変されるゲノム上のすべての部位のガイドＲＮＡが必要である。また、手順の最後にＣａｓ９を除去する必要がある。以前の方法の改善にもかかわらず、Ｃａｓ９ベースの方法には依然として多くのステップが含まれている。

したがって、選択マーカー及び／又はＣａｓエンドヌクレアーゼを使用しない、ゲノム改変及びドナーＤＮＡ配列（目的のポリヌクレオチド、単一コピーの遺伝子発現カセット又は複数コピーの遺伝子発現カセットなどであるが、これらに限定されない）の、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムへの遺伝子組み込みのための効果的、効率的又は他により堅牢な方法の開発が依然として必要とされている。

本開示は、選択マーカーの使用なしに且つ誘導型Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系の使用なしにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムを改変するための方法及び組成物を含む。本開示は、ドナーＤＮＡ配列をバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムに、前記ゲノムへの選択マーカーの使用なしに且つＣａｓエンドヌクレアーゼの使用なしに組み込むための方法と、目的の遺伝子を除去するための方法及び／又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムに変異を提供するための方法とを含む。

いかなる特定の理論、機構又は作用機序にも拘束されることを望むものではないが、本出願人は、驚くべきことに且つ予想外に、その末端に長いホモロジーアーム（各ホモロジーアームは、少なくとも９００ヌクレオチドを有する）を含む線状ＤＮＡコンストラクトがバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞に導入されると、効率が高いゲノム改変（限定されないが、ドナーＤＮＡ配列の組み込み、ヌクレオチドの欠失、変異など）が観察され、この導入及び遺伝子改変が、選択マーカー又は誘導型Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系の使用なしに行われることを見出した。

この方法は、線状ＤＮＡコンストラクトをバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞に導入することを利用し、前記線状ＤＮＡコンストラクトは、少なくとも９００ｂｐのホモロジーアームによって隣接され、任意選択により前記ホモロジーアームによって隣接されるドナーＤＮＡを含み、前記ＤＮＡコンストラクトは、エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ断片を含まず、前記ＤＮＡコンストラクトは、選択マーカーをコードするＤＮＡ配列を含まない。

一実施形態では、この方法は、選択マーカーの使用なしにドナーＤＮＡをバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムに組み込むための方法であり、この方法は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞の集団を提供することと、前記細胞の集団の少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に線状ＤＮＡコンストラクトを導入することとを含み、前記ＤＮＡコンストラクトは、上流のホモロジーアーム（ＨＲ１）及び下流のホモロジーアーム（ＨＲ２）によって隣接されるドナーＤＮＡを含み、各ホモロジーアームは、少なくとも９００ヌクレオチド長であり、前記ＤＮＡコンストラクトは、選択マーカーを含まず、この方法は、任意選択により、選択マーカーを含まない培地において、前記少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に由来する子孫細胞を増殖させることと、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）子孫細胞であって、そのゲノムにドナーＤＮＡ配列が安定に組み込まれているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）子孫細胞を同定することとをさらに含む。

一実施形態では、この方法は、選択マーカーの使用なしにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムにおけるヌクレオチド配列を除去するための方法であり、この方法は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞の集団を提供することと、前記細胞の集団の少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に線状ＤＮＡコンストラクトを導入することとを含み、前記ＤＮＡコンストラクトは、上流のホモロジーアーム（ＨＲ１）及び下流のホモロジーアーム（ＨＲ２）を含み、各ホモロジーアームは、少なくとも９００ヌクレオチド長であり、且つ除去される前記ヌクレオチド配列に隣接するゲノムＤＮＡ領域に対して配列相同性を有し、前記ＤＮＡコンストラクトは、選択マーカーを含まない。

いくつかの実施形態では、各ホモロジーアームは、少なくとも９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、５０００、６０００ヌクレオチド長であり、且つ最大７０００ヌクレオチド長である。

本明細書に記載の線状ＤＮＡコンストラクトは、二本鎖ＤＮＡであり得る。

一実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌａｕｔｕｓ）及びバチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群から選択されるバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞である。

一実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞は、ＣｏｍＫ、ＣｏｍＳ又はそれらのいずれか１つの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む、導入された核酸コンストラクトの少なくとも１つのコピーによってコンピテントにされたものである。

一実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞は、限定されないが、Ｐｘｙｌ－ＣｏｍＫ株などのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）スーパーコンピテント株に由来する。

一実施形態では、この方法は、選択マーカーの使用なしにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムに変異を導入するための方法であり、この方法は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞の集団を提供することと、前記細胞の集団の少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に線状ＤＮＡコンストラクトを導入することとを含み、前記ＤＮＡコンストラクトは、上流のホモロジーアーム（ＨＲ１）及び下流のホモロジーアーム（ＨＲ２）によって隣接される、所望の変異を有するヌクレオチド配列を含み、各ホモロジーアームは、少なくとも９００ヌクレオチド長であり、前記ＤＮＡコンストラクトは、選択マーカーを含まない。

その末端において、長いホモロジーアーム（ＨＲ１及びＨＲ２、各ホモロジーアームは、少なくとも９００ヌクレオチド（≧０．９ｋｂ）を有する）をバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞に導入することを含む、線状ＤＮＡコンストラクトを使用してバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムを改変する方法を示す。上の図（図１）では、線状ＤＮＡコンストラクトは、少なくとも９００ヌクレオチド長の２つのホモロジーアーム（一方が５’上流のアームＨＲ１であり、及び他方が３’下流のアームＨＲ２である）によって隣接されるドナーＤＮＡを含む。ドナーＤＮＡは、目的の遺伝子を発現する発現カセットを含み得る。ドナーコンストラクトが細胞に導入されると、相同組換えが起こり得、ドナーＤＮＡが目的のゲノム遺伝子座に組み込まれる。下の図（図１）では、線状ＤＮＡコンストラクトは、少なくとも９００ヌクレオチド長の２つのホモロジーアーム（一方が５’上流のアームＨＲ１であり、及び他方が３’下流のアームＨＲ２である）を含み、ＨＲアーム間に追加のＤＮＡが存在しない。この線状ＤＮＡコンストラクトが細胞に導入されると、相同組換えが起こり得、ヌクレオチドの欠失（遺伝子の欠失）が起こり得る。線状ＤＮＡコンストラクトは、当業者に公知の任意の機構によってバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に導入することができる。

本開示は、選択マーカーの使用なしに且つガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系の使用なしにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムを改変するための方法及び組成物を含む。本開示は、選択マーカーをバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞のゲノムに組み込むことなく、ドナーＤＮＡ配列を前記ゲノムに組み込むための方法及び組成物を含む。一態様では、この方法は、前記ドナーＤＮＡをバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞のゲノムに導入するために、長いホモロジーアーム（≧９００ヌクレオチド長）によって隣接されるドナーＤＮＡ配列を含む線状ＤＮＡコンストラクトを使用し、したがって選択マーカーを前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムに組み込む必要なしに且つ誘導型Ｃａｓ系の必要なしに、ドナーＤＮＡ配列を前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞のゲノムに組み込むための非常に効果的な系を提供する。

本開示は、選択マーカーの使用なしにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムのヌクレオチド配列を除去するための方法及び組成物をさらに含み、この方法は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞の集団を提供することと、前記細胞の集団の少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に線状ＤＮＡコンストラクトを導入することとを含み、前記ＤＮＡコンストラクトは、上流のホモロジーアーム（ＨＲ１）及び下流のホモロジーアーム（ＨＲ２）を含み、各ホモロジーアームは、少なくとも９００ヌクレオチド長であり、且つ除去される前記ヌクレオチド配列に隣接するゲノムＤＮＡ領域に対して配列相同性を有し、前記ＤＮＡコンストラクトは、選択マーカーを含まない。

本明細書は、読み易くするためにいくつかの節で編成されている。しかしながら、読者は、１つの節でなされた記載が他の節に適用され得ることを理解するであろう。このように、本開示の異なる節で使用された見出しを限定的であると解釈すべきではない。

本明細書に示した見出しは、本明細書全体を参照することによって得ることができる本組成物及び方法の様々な態様又は実施形態を限定するものではない。したがって、直下で定義する用語は、本明細書全体を参照することによってより詳細に定義される。

他に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明の組成物及び方法が属する技術分野の当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書に記載のものに類似の又は均等な任意の方法及び材料も本発明の組成物及び方法を実施又は試験するために使用できるが、以下では、例示的な方法及び材料について記載する。

本明細書に引用されているすべての刊行物及び特許は、個々の刊行物又は特許が、参照により組み込まれ、それらの刊行物が関連して引用される方法及び／又は材料を開示し、記載するように具体的且つ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用する場合、用語「開示」又は「開示される開示」は、限定することを意味するものではなく、特許請求の範囲で定義されるか又は本明細書に記載される本開示のいずれかに一般的に適用される。これらの用語は、本明細書では互換的に用いられる。

Ｃａｓ遺伝子及びタンパク質
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）遺伝子座は、例えば、外来ＤＮＡを破壊するために細菌及び古細菌細胞によって使用される、ＤＮＡ切断系の成分をコードする特定の遺伝子座を指す（ＨｏｒｖａｔｈａｎｄＢａｒｒａｎｇｏｕ，２０１０，Ｓｃｉｅｎｃｅ３２７：１６７－１７０；２００７年３月１日公開の国際公開第２００７／０２５０９７号パンフレット）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、短い可変ＤＮＡ配列（「スペーサー」と呼ばれる）によって分離された短いダイレクトリピート（ＣＲＩＳＰＲリピート）を含むＣＲＩＳＰＲアレイからなり得、これは、多様なＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子によって隣接され得る。所与のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子の数は、種によって変わり得る。マルチサブユニットエフェクター複合体（Ｉ型、ＩＩＩ型及びＩＶ型サブタイプを含む）を有するクラス１系及び単一タンパク質エフェクター（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３などであるが、これらに限定されないＩＩ型及びＶ型サブタイプを含む）を有するクラス２系を含む複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が記載されている。クラス１系（参照により本明細書に組み込まれるＭａｋａｒｏｖａｅｔａｌ．２０１５，ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓ；ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＶｏｌ．１３：１－１５；Ｚｅｔｓｃｈｅｅｔａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ１６３，１－１３；及び２０１３年１１月２３日に公開された国際公開第２０１３／１７６７７２Ａ１号パンフレット）。細菌由来のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＣａｓエンドヌクレアーゼをそのＤＮＡ標的に誘導するために、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ）を使用する。ｃｒＲＮＡは、二本鎖ＤＮＡ標的の一方の鎖に相補的なスペーサー領域及びｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ）と塩基対合し、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを導いて、ＤＮＡ配列を切断させるＲＮＡ二本鎖を形成する領域を含有する。スペーサーは、Ｃａｓ１及びＣａｓ２タンパク質を伴う十分に解明されていないプロセスによって得られる。すべてのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座は、ｃａｓ９遺伝子に加えて、ｃａｓ１及びｃａｓ２遺伝子を含有する（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉｅｔａｌ．，２０１３，ＲＮＡＢｉｏｌｏｇｙ１０：７２６－７３７；Ｍａｋａｒｏｖａｅｔａｌ．２０１５，ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＶｏｌ．１３：１－１５）。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座は、それぞれのＣＲＩＳＰＲアレイ内のリピートに部分的に相補的なｔｒａｃｒＲＮＡをコードすることができ、Ｃｓｎ１及びＣｓｎ２などの他のタンパク質を含むことができる。Ｃａｓ１及びｃａｓ２遺伝子の近傍にｃａｓ９が存在することがＩＩ型遺伝子座の特徴である（Ｍａｋａｒｏｖａｅｔａｌ．２０１５，ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＶｏｌ．１３：１－１５）。Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）系は、侵入しているウイルスＤＮＡに対して防御するための単一のＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びＣａｓ３とともに機能するＣａｓｃａｄｅ（抗ウイルス防御のためのＣＲＩＳＰＲ関連複合体）と呼ばれるタンパク質の複合体からなる（全体として本明細書に組み込まれるＢｒｏｕｎｓ，Ｓ．Ｊ．Ｊ．ｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３２１：９６０－９６４；Ｍａｋａｒｏｖａｅｔａｌ．２０１５，ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓ；ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＶｏｌ．１３：１－１５）。

本明細書における用語「Ｃａｓ遺伝子」は、一般に、隣接しているＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と結合するか、会合するか若しくは近接するか又は近傍にある遺伝子を指す。用語「Ｃａｓ遺伝子」、「ｃａｓ遺伝子」、「ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子」及び「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連遺伝子」は、本明細書で互換的に使用される。

用語「Ｃａｓタンパク質」又は「Ｃａｓポリペプチド」は、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子によってコードされるポリペプチドを指す。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む。

Ｃａｓタンパク質は、細菌タンパク質又は古細菌タンパク質であり得る。本明細書におけるＩ～ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲＣａｓタンパク質は、典型的には、起源が原核生物であり；例えば、Ｉ型及びＩＩＩ型Ｃａｓタンパク質は、細菌種又は古細菌種に由来し得るが、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質（すなわちＣａｓ９）は、細菌種に由来し得る。他の態様において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ又はそれらの改変型の１つ以上を含む。Ｃａｓタンパク質としては、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、Ｃ２ｃ２タンパク質、Ｃ２ｃ３タンパク質、Ｃａｓ３、Ｃａｓ３－ＨＤ、Ｃａｓ５、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ１０又はこれらの組み合わせ若しくは複合体が挙げられる。

用語「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ」は、好適なポリヌクレオチド成分と複合体を形成するとき、特定のＤＮＡ標的配列のすべて又は一部を認識し、それに結合し、且つ任意選択により切れ目を入れるか又は切断をすることができるＣａｓポリペプチド（Ｃａｓタンパク質）を指す。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ガイドポリヌクレオチドによりガイドされて、二本鎖ＤＮＡ中の特定の標的部位のすべて又は一部を（例えば、細胞のゲノム中の標的部位で）認識し、それに結合し、且つ任意選択により切れ目を入れるか又は切断する。本明細書に記載されるＣａｓエンドヌクレアーゼは、１つ以上のヌクレアーゼドメインを含む。本明細書に記載されるドナーＤＮＡ挿入方法で用いられるＣａｓエンドヌクレアーゼは、標的部位でＤＮＡに一本鎖又は二本鎖切断を導入するエンドヌクレアーゼである。代わりに、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、好適なＲＮＡ成分と複合体を形成するとき、ＤＮＡ切断活性又はニッキング活性を欠く可能性があるが、ＤＮＡ標的配列に依然として特異的に結合することができる。

本明細書で使用する場合、「Ｃａｓ９」と称されるポリペプチド（Ｃａｓ５、Ｃｓｎ１又はＣｓｘ１２と以前に称された）、又は「Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ」、又は「Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ活性」を有することは、ＤＮＡ標的配列のすべて又は一部に特異的に結合し、且つ任意選択により切れ目を入れるか又は切断するためのｃｒヌクレオチド及びｔｒａｃｒヌクレオチド又はシングルガイドポリヌクレオチドと複合体を形成するＣａｓエンドヌクレアーゼを指す。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン及びＨＮＨ（Ｈ－Ｎ－Ｈ）ヌクレアーゼドメインを含み、これらは、それぞれ標的配列において一本鎖ＤＮＡを切断することができる（両方のドメインが協調して作用すると、ＤＮＡ二本鎖が切断されるが、一方のドメインの活性ではニックに至る）。一般に、ＲｕｖＣドメインは、サブドメインＩ、ＩＩ及びＩＩＩを含み、ドメインＩは、Ｃａｓ９のＮ末端近傍に位置し、サブドメインＩＩ及びＩＩＩは、タンパク質の中央に位置し、ＨＮＨドメインに隣接している（Ｍａｋａｒｏｖａｅｔａｌ．２０１５，ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＶｏｌ．１３：１－１５、Ｈｓｕｅｔａｌ．，２０１３，Ｃｅｌｌ１５７：１２６２－１２７８）。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、通常、少なくとも１つのポリヌクレオチド成分と複合体を形成するＣａｓ９エンドヌクレアーゼを利用するＤＮＡ切断系を含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に由来する。例えば、Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との複合体中に存在し得る。別の例では、Ｃａｓ９は、シングルガイドＲＮＡとの複合体中に存在し得る（Ｍａｋａｒｏｖａｅｔａｌ．２０１５，ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＶｏｌ．１３：１－１５）。

誘導型Ｃａｓ系
用語「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体」、「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系」、「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ複合体」、「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ系」、「ｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体」、「ｇＲＮＡ／Ｃａｓ系」、「ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ」、「ＲＧＥＮ」は、本明細書では互換的に使用され、複合体を形成することができる少なくとも１つのＲＮＡ成分及び少なくとも１つのＣａｓエンドヌクレアーゼを指し、ここで、前記ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的部位に導くことができ、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識し、それに結合し、且つ任意選択により切れ目を入れるか又は切断する（一本鎖又は二本鎖切断を導入する）ことを可能にする。

ＤＮＡコンストラクト及びドナーＤＮＡ
相同組換え修復（ＨＤＲ）は、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ切断を修復する細胞内の機構である。相同組換え修復としては、相同組換え（ＨＲ）及び一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）が挙げられる（Ｌｉｅｂｅｒ，２０１０Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７９：１８１－２１１）。ＨＤＲの最も一般的な形態は、相同組換え（ＨＲ）と呼ばれ、ドナーＤＮＡとアクセプターＤＮＡとの間で最も長い配列相同性を必要とする。ＨＤＲの他の形態には、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）及び切断誘導性複製が含まれ、これらは、ＨＲと比較してより短い配列相同性を必要とする。ニック（一本鎖切断）での相同組換え修復は、二本鎖切断でのＨＤＲと異なる機構で起こり得る（ＤａｖｉｓａｎｄＭａｉｚｅｌｓ．ＰＮＡＳ（００２７－８４２４），１１１（１０），ｐ．Ｅ９２４－Ｅ９３２）。

相同組換えには、相同部位での２つのＤＮＡ分子間のＤＮＡ断片の交換が含まれる。相同組換えの頻度は、いくつかの因子による影響を受ける。異なる生物は、相同組換えの量及び相同組換えと非相同組換えとの相対的な比率が異なる。相同組換えを観察するために必要な相同領域（ホモロジーアーム）の長さは、生物によって異なる。例えば、相同組換え（ＨＲ）による原核生物（細胞）のゲノムの改変は、遺伝子操作のための強力なツールである。相同組換えは、他の生物でも達成されている。例えば、寄生原虫であるリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）での相同組換えには、少なくとも１５０～２００ｂｐの相同性が必要であり（ＰａｐａｄｏｐｏｕｌｏｕａｎｄＤｕｍａｓ，（１９９７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ２５：４２７８－８６）、プロトバクテリアの大腸菌（Ｅｃｏｌｉ）での効率的な組換えには、１５０～２００ｂｐの相同性が必要である（Ｌｏｖｅｔｔｅｔａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１６０：８５１－８５９）。

「相同性」は、類似しているＤＮＡ配列を意味する。例えば、本明細書に記載のＤＮＡコンストラクト上に見られる「ゲノム領域に対する相同領域」とは、細胞又は生物のゲノムに所与の「ゲノム領域」と類似している配列を有するＤＮＡの領域である。相同領域は、相同組換えを促進するのに十分な任意の長さであり得る。例えば、本明細書に記載の線状ＤＮＡコンストラクト上の相同領域は、少なくとも約９００塩基対（ｂｐ）～２０００ｂｐ；９００塩基対（ｂｐ）～３０００ｂｐ；１０００塩基対（ｂｐ）～２０００ｂｐ；１０００塩基対（ｂｐ）～３０００ｂｐ；１０００塩基対（ｂｐ）～４０００ｂｐ；２０００ｂｐ～３０００ｂｐ；２０００ｂｐ～４０００ｂｐ；２０００ｂｐ～５０００ｂｐ；２０００ｂｐ～６０００ｂｐ、３０００ｂｐ～４０００ｂｐ；３０００ｂｐ～５０００ｂｐ；３０００ｂｐ～６０００ｂｐ、４０００ｂｐ～５０００ｂｐ；４０００ｂｐ～６０００ｂｐ、５０００ｂｐ～最大６０００ｂｐの長さを含み得るため、相同領域は、対応するゲノム領域で相同組換えを受けるのに十分な相同性を有する。「十分な相同性」は、２つのポリヌクレオチド配列が、相同組換え反応のための基質として作用するのに十分な構造的類似性を有することを示す。構造的類似性には、各ポリヌクレオチド断片の全長及びポリヌクレオチドの配列類似性が含まれる。配列類似性は、配列の全長にわたる配列同一性パーセント並びに／又は１００％配列同一性を有する連続ヌクレオチドなどの局在化した類似性を含む保存領域及び配列の長さの一部にわたる配列同一性パーセントで説明することができる。

相同性の程度は、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性パーセントを含む、２つのポリヌクレオチドの完全に整列した長さにわたる配列同一性パーセントによって説明することもできる。十分な相同性には、ポリヌクレオチド長、広範囲の配列同一性パーセント及び任意選択により連続ヌクレオチドの保存領域又は局所的な配列同一性パーセントの任意の組み合わせが含まれ、例えばゲノム領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する９００～７０００ｂｐの領域と説明することができる。十分な相同性は、高ストリンジェンシー条件下で特異的にハイブリダイズする２つのポリヌクレオチドの予測される能力によっても説明でき、例えばＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮＹ）；ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，Ｅｄｓ（１９９４）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，（ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）；及びＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ－－ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒｏｂｅｓ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ）を参照されたい。

本明細書で使用する場合、「ゲノム領域」とは、改変されるゲノム配列のいずれかの側に存在するか、又は代わりに改変されるゲノム領域の一部も含む、細胞のゲノムにおける染色体のセグメントである。本明細書に記載のゲノム領域は、少なくとも９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、５０００、６０００ヌクレオチド長であり、且つ最大７０００ヌクレオチド長であり得る。

本明細書に記載のゲノム領域は、ゲノム領域が対応する相同領域で相同組換えを受けるのに十分な相同性を有するように、少なくとも約９００塩基対（ｂｐ）～２０００ｂｐ、９００塩基対（ｂｐ）～３０００ｂｐ；１０００塩基対（ｂｐ）～２０００ｂｐ、１０００塩基対（ｂｐ）～３０００ｂｐ、１０００塩基対（ｂｐ）～４０００ｂｐ、２０００ｂｐ～３０００ｂｐ；２０００ｂｐ～４０００ｂｐ；２０００ｂｐ～５０００ｂｐ；２０００ｂｐ～６０００ｂｐ、３０００ｂｐ～４０００ｂｐ；３０００ｂｐ～５０００ｂｐ；３０００ｂｐ～６０００ｂｐ、４０００ｂｐ～５０００ｂｐ；４０００ｂｐ～６０００ｂｐ、５０００ｂｐ～最大６０００ｂｐの長さ又はそれよりも多い塩基を含み得る。

本明細書に記載されるように、改変されるゲノム配列は、改変される一塩基（本明細書に記載される点変異など）及び除去される遺伝子又は染色体断片を含む。ドナーＤＮＡをバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムに組み込むことが望ましい態様では、ゲノム領域は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ゲノム上で互いに直接隣接している。

所与のゲノム領域と、ＤＮＡコンストラクト上に見られる対応する相同領域（ＨＲ１、ＨＲ２）との間の構造的類似性は、相同組換えが起こることを可能にする任意の程度の配列同一性であり得る。例えば、ＤＮＡコンストラクトの「相同領域」と、生物ゲノムの「ゲノム領域」とによって共有される相同性又は配列同一性の程度は、配列が相同組換えされるように、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性であり得る。

本明細書で使用する場合、「ＤＮＡコンストラクト」は、少なくとも第１のホモロジーアーム（ＨＲ１、５プライムホモロジーアーム、５’ＨＲとも呼ばれる）及び第２のホモロジーアーム（ＨＲ２、３プライムホモロジーアーム、３’ＨＲとも呼ばれる）を含むＤＮＡ配列を指す。ＤＮＡコンストラクトは、第１のホモロジーアームと第２のホモロジーアームとの間にドナーＤＮＡ（ホモロジーアームによって隣接されるドナーＤＮＡ）をさらに含み得る。

本明細書で使用する場合、「線状ＤＮＡコンストラクト」は、線状である一本鎖又は二本鎖ＤＮＡコンストラクトを指す。

本明細書で使用する場合、「ホモロジーアーム」は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ゲノムのゲノム領域に対して相同である核酸配列を指す。所与のゲノム領域と、ＤＮＡコンストラクト上に見られる対応するホモロジーアーム（ＨＲ１、ＨＲ２）との間の構造的類似性は、相同組換えが起こることを可能にする任意の程度の配列同一性であり得る。例えば、ＤＮＡコンストラクトのＨＲ１及び／又はＨＲ２の「相同領域」と、生物ゲノムの「ゲノム領域」とによって共有される相同性又は配列同一性の程度は、配列が相同組換えされるように、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性であり得る。

一態様では、本開示のホモロジーアームは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ゲノムに組み込まれる目的のヌクレオチド配列を含む二本鎖ドナーＤＮＡに隣接し、且つ本明細書に記載の線状二本鎖ＤＮＡコンストラクト上に位置し、約９００塩基対（ｂｐ）～２０００ｂｐ、９００塩基対（ｂｐ）～３０００ｂｐ、１０００塩基対（ｂｐ）～２０００ｂｐ、１０００塩基対（ｂｐ）～３０００ｂｐ、１０００塩基対（ｂｐ）～４０００ｂｐ、９００塩基対（ｂｐ）～２０００ｂｐ；２０００ｂｐ～３０００ｂｐ；２０００ｂｐ～４０００ｂｐ；２０００ｂｐ～５０００ｂｐ；２０００ｂｐ～６０００ｂｐ、３０００ｂｐ～４０００ｂｐ；３０００ｂｐ～５０００ｂｐ；３０００ｂｐ～６０００ｂｐ、４０００ｂｐ～５０００ｂｐ；４０００ｂｐ～６０００ｂｐ、５０００ｂｐ～最大７０００ｂｐを含む。

一態様では、本開示のホモロジーアームは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ゲノムに組み込まれる目的のヌクレオチド配列を含む一本鎖ドナーＤＮＡに隣接し、且つ線状一本鎖ＤＮＡコンストラクト上に位置し、約９００ヌクレオチド～２０００ヌクレオチド、９００ヌクレオチド～３０００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド～２０００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド～３０００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド～４０００ヌクレオチド、９００ヌクレオチド～２０００ヌクレオチド；２０００ヌクレオチド～３０００ヌクレオチド；２０００ヌクレオチド～４０００ヌクレオチド；２０００ヌクレオチド～５０００ヌクレオチド；２０００ヌクレオチド～６０００ヌクレオチド；３０００ヌクレオチド～４０００ヌクレオチド；３０００ヌクレオチド～５０００ヌクレオチド；３０００ヌクレオチド～６０００ヌクレオチド；４０００ヌクレオチド～５０００ヌクレオチド；４０００ヌクレオチド～６０００ヌクレオチド；５０００ヌクレオチド間、６０００ヌクレオチド～最大７０００ヌクレオチを含む。

本明細書で使用する場合、「ドナーＤＮＡ」及び「ドナーＤＮＡ配列」は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムに挿入される目的のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ配列を指す。

本明細書に記載のドナーＤＮＡは、第１のホモロジーアーム（ＨＲ１、５プライムホモロジーアーム、５’ＨＲとも呼ばれる）及び第２のホモロジーアーム（ＨＲ２、３プライムホモロジーアーム、３’ＨＲとも呼ばれる）によって隣接され、これは、ドナーＤＮＡがコンピテントなバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ゲノムに組み込まれる位置を決定する。

一態様では、ドナーＤＮＡ配列の目的のヌクレオチド配列は、目的のポリヌクレオチド、組換えＤＮＡ、目的の合成配列、目的の異種配列、目的の相同配列、目的の遺伝子、１つ若しくは複数の発現カセット、１つ若しくは複数の組換えＤＮＡコンストラクト、１つ若しくは複数の発現カセット、天然の非形質転換ゲノム配列と比較して所望の修飾／変異（塩基の置換など）を有するヌクレオチド配列（限定されないが、一塩基など）、転写調節配列、翻訳調節配列、プロモーター配列、ターミネーター配列、トランスジェニック核酸配列、メッセンジャーＲＮＡの少なくとも一部と相補的なアンチセンス配列、異種配列又はそれらのいずれか１つの組み合わせを含む。

本明細書に記載の目的のポリヌクレオチドは、目的の生物での発現のために発現カセットに含めることができる。

本明細書で使用する場合、用語「発現」は、前駆体又は成熟形態のいずれかにおける機能的な最終産物（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、ｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ又はポリペプチド（タンパク質））の産生を指す。用語「発現」は、以下に限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾及び分泌を含むポリペプチドの産生に関与する任意の段階を含む。

発現カセットは、５’及び３’調節配列並びに又は本明細書で開示される通りのポリヌクレオチドに作動可能に連結されたタグ及び合成配列を含み得る。

本明細書で開示される発現カセットは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）（宿主）細胞において機能する転写、転写及び翻訳開始領域（すなわちプロモーター）、５’非翻訳領域、様々なタンパク質タグ及び配列をコードするポリヌクレオチド、目的のポリヌクレオチド並びに転写及び翻訳終結領域（すなわち終結領域）を５’－３’方向に含み得る。発現カセットは、本明細書の別の箇所で記載される調節領域の転写調節下にあるポリヌクレオチドの挿入のための複数の制限部位及び／又は組換え部位と一緒にも提供される。調節領域（すなわちプロモーター、転写調節領域及び翻訳終結領域）及び／又は目的のポリヌクレオチドは、宿主細胞に対して又は互いに天然／類似のものであり得る。様々なタンパク質配列をコードする他のポリヌクレオチド配列は、目的のポリヌクレオチドの５’又は３’末端のいずれかに付加され得る。代わりに、調節領域及び／又は目的のポリヌクレオチドは、宿主細胞に対して又は互いに異種であり得る。

特定の実施形態では、本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、本明細書の別の箇所で開示されるか又は当技術分野において知られる通りの目的のポリヌクレオチド配列又は発現カセットの任意の組み合わせとともに積み重ねられ得る。積み重ねられたポリヌクレオチドは、最初のポリヌクレオチドと同じプロモーターに作動可能に連結され得るか、又は別々のプロモーターポリヌクレオチドに作動可能に連結され得る。

発現カセットは、任意選択により、対応する終結領域とともに目的のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含み得る。終結領域は、転写開始領域に対して天然のものであるか、作動可能に連結された目的のポリヌクレオチド若しくはプロモーター配列に対して天然のものであるか、宿主生物体に対して天然のものであるか、又は別の供給源（すなわち外来若しくは異種）に由来し得る。従来の終結領域は、ファージ配列、例えばラムダファージｔ０終結領域又は原核生物リボソームＲＮＡオペロン若しくは細胞外タンパク質の分泌に関与する遺伝子（例えば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のａｐｒＥ、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のａｐｒＬ）由来の強力なターミネーターから入手可能である。適切な終結領域は、オクトピン合成酵素終結領域及びノパリン合成酵素終結領域などのＡ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉ－プラスミドから入手可能である。また、Ｇｕｅｒｉｎｅａｕｅｔａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１－１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ６４：６７１－６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎｅｔａｌ．（１９９１）ＧｅｎｅｓＤｅｖ．５：１４１－１４９；Ｍｏｇｅｎｅｔａｌ．（１９９０）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ２：１２６１－１２７２；Ｍｕｎｒｏｅｅｔａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ９１：１５１－１５８；Ｂａｌｌａｓｅｔａｌ．（１９８９）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７：７８９１－７９０３；及びＪｏｓｈｉｅｔａｌ．（１９８７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：９６２７－９６３９を参照されたい。

適切な場合、目的のポリヌクレオチドは、形質転換又はターゲティングされた生物体における発現を増加させるために最適化され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、発現の向上に関して生物体に好ましいコドンを使用するために合成又は改変され得る。

細胞宿主中で遺伝子発現を増強するために、追加の配列改変が知られる。これらには、遺伝子発現に有害であり得る、疑似ポリアデニル化シグナルをコードする配列、エクソン－イントロンスプライス部位シグナルをコードする配列、トランスポゾン様リピートをコードする配列及び他のそのようなよく特徴付けられた配列の除去が含まれる。配列のＧ－Ｃ含有量は、宿主細胞中で発現される既知の遺伝子を参照することによって算出される、所与の細胞宿主の平均的なレベルに調節され得る。可能な場合、予想されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を避けるように配列を改変する。

発現カセットは、５’リーダー配列をさらに含有し得る。そのようなリーダー配列は、翻訳又はＲＮＡ安定性のレベルを増強するように作用し得る。５’非翻訳領域と互換的に使用される５’リーダー配列は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ遺伝子若しくはバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬ遺伝子又は任意の細菌リボソームタンパク質遺伝子に由来するものなど、よく知られ且つよく特徴付けられた細菌ＵＴＲから得られるであろう。翻訳リーダーは、当技術分野で既知であり、下記が挙げられる：ピコルナウイルスリーダー、例えばＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コード領域）（Ｅｌｒｏｙ－Ｓｔｅｉｎ，ｅｔａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：６１２６－６１３０）；ポティウイルスリーダー、例えばＴＥＶリーダー（タバコエッチウイルス）（Ｇａｌｌｉｅｅｔａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ１６５（２）：２３３－２３８）、ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ萎縮モザイクウイルス）（Ｊｏｈｎｓｏｎｅｔａｌ．（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１５４：９－２０）及びヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）（Ｍａｃｅｊａｋｅｔａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３５３：９０－９４）；アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質ｍＲＮＡ由来の非翻訳リーダー（ＡＭＶＲＮＡ４）（Ｊｏｂｌｉｎｇｅｔａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２５：６２２－６２５）；タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ）（Ｇａｌｌｉｅｅｔａｌ．（１９８９）ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＲＮＡ，ｅｄ．Ｃｅｃｈ（Ｌｉｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ），ｐｐ．２３７－２５６）；並びにトウモロコシ退緑斑紋ウイルスリーダー（ＭＣＭＶ）（Ｌｏｍｍｅｌｅｔａｌ．（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ８１：３８２－３８５）。また、Ｄｅｌｌａ－Ｃｉｏｐｐａｅｔａｌ．（１９８７）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５－９６８も参照されたい。翻訳を増強することで知られている他の方法、例えばイントロンなども使用することができる。

発現カセットの調製において、様々なＤＮＡ断片が、適当な向きにおいて、必要に応じて適当なリーディングフレームにおいてＤＮＡ配列を提供するように操作され得る。この目標に向かって、アダプター又はリンカーがＤＮＡ断片の結合に使用され得るか、又は適当な制限部位、不要なＤＮＡの除去、制限部位の除去などを提供するための他の操作が行われ得る。この目的のために、インビトロの変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えば移行及びトランスバージョンが行われ得る。

いくつかの実施形態では、リパーゼ又はプロテアーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、制御エレメント、例えばプロモーターなどの転写制御エレメントに作動可能に連結される。転写制御エレメントは、真核細胞又は原核細胞（例えば、細菌又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞）のいずれかにおいて機能的であり得る。

バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞内での遺伝子の発現において使用するための好適な原核生物プロモーター（原核細胞において機能的なプロモーター）及びプロモーター配列領域、それらのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）並びに／又はそれらのバリアント配列の非限定的な例は、一般に当業者に知られている。本開示のプロモーター配列は、一般に、それらがバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞（例えば、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞など）において機能的であるように選択される。同様に、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞内での遺伝子発現を駆動するために有用なプロモーターとしては、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）アミラーゼ（ａｍｙＱ）のプロモーター、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子のプロモーター、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）プロモーター（Ｓｔａｈｌｅｔａｌ．，１９８４）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）のα－アミラーゼプロモーター（Ｙａｎｇｅｔａｌ．，１９８３）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のα－アミラーゼプロモーター（Ｔａｒｋｉｎｅｎｅｔａｌ．，１９８３）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の中性プロテアーゼ（ｎｐｒＥ）プロモーター（Ｙａｎｇｅｔａｌ．，１９８４）、変異体ａｐｒＥプロモーター（国際公開第２００１／５１６４３号パンフレット）又はバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）若しくは他の関連するバチルス綱（Ｂａｃｉｌｌｉ）由来の任意の他のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。特定の他の実施形態では、プロモーターは、米国特許出願公開第２０１４／０３２９３０９号明細書に開示されたリボソームタンパク質プロモーター又はリボソームＲＮＡプロモーター（例えば、ｒｒｎＩプロモーター）である。ｓｐａｃのような合成プロモーターは、他の副因子に依存して構成的又は誘導性であり得る。ｎ２５、ラムダｐＬ又はｐＲのようなファージプロモーターも同様に構成的又は誘導性であり得る。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞においてある範囲の活性（プロモーター強度）を有するプロモーターライブラリーをスクリーニング及び作製する方法は、国際公開第２００３／０８９６０４号パンフレットに記載されている。

バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）内で機能的な構成的プロモーターとしては、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）アミラーゼ（ａｍｙＱ）のプロモーター、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）プロモーター、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）のα－アミラーゼプロモーター（Ｙａｎｇｅｔａｌ．，１９８３）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のα－アミラーゼプロモーター（Ｔａｒｋｉｎｅｎｅｔａｌ．，１９８３）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の中性プロテアーゼ（ｎｐｒＥ）プロモーター（Ｙａｎｇｅｔａｌ．，１９８４）が挙げられるが、これらに限定されない。

一態様では、ドナーＤＮＡは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ゲノムに組み込まれる組換えＤＮＡを含む。

本明細書で使用する場合、「組換え」は、例えば、化学合成又は遺伝子工学技術による核酸の単離セグメントの操作により、２つのさもなければ分離している配列セグメントの人工的組み合わせを指す。用語「組換え体」は、生物学的構成要素又は組成物（例えば、細胞、核酸、ポリペプチド／酵素、ベクターなど）に関連して使用されるとき、それらの生物学的構成要素又は組成物が天然で見られない状態のものであることを示す。換言すると、この生物学的構成要素又は組成物は、人の介入により天然の状態から改変されている。例えば、組換え細胞は、天然（すなわち非組換え）細胞中に見出されない１つ以上の遺伝子を発現する細胞、１つ以上の天然遺伝子を天然細胞と異なる量で発現する細胞及び／又は１つ以上の天然遺伝子を天然細胞と異なる条件下で発現する細胞を包含する。組換え核酸は、天然配列と１つ以上のヌクレオチドが異なり、異種配列（例えば、異種プロモーター、非天然又はバリアントシグナル配列をコードする配列など）に作動可能に連結され、イントロン配列を欠き、且つ／又は単離された形態であり得る。組換えポリペプチド／酵素は、天然配列と１つ以上のアミノ酸が異なり、異種配列と融合され、トランケートされるか若しくはアミノ酸の内部欠失を有し、天然細胞に見られない様式で（例えば、ポリペプチドをコードする発現ベクターが細胞中に存在することにより、ポリペプチドを過剰発現する組換え細胞から）発現され、且つ／又は単離された形態であり得る。いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチド又はポリペプチド／酵素は、その野生型対応物と同一の配列を有するが、非天然形態（例えば、単離又は濃縮された形態）であることが強調される。

本明細書で使用する場合、「組換えＤＮＡ」は、核酸断片の人工的組み合わせを含む少なくとも１つの発現カセットを含むＤＮＡ配列を指す。組換えＤＮＡは、本明細書で開示される通りの目的のポリヌクレオチドに作動可能に連結された５’及び３’調節配列を含み得る。例えば、組換えＤＮＡは、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列を含み得る。

本明細書で使用される標準的な組換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は、当技術分野でよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ；ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）においてより詳細に説明されている。

スクリーニング可能なマーカーの表現型を使用せずに改変ゲノムを有するそれらの細胞を同定するために、様々な方法を利用することができる。そのような方法は、ＰＣＲ法、シークエンシング法、ヌクレアーゼ消化法、サザンブロット法及びそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、ゲノム配列内の何らかの変化を検出するために標的配列を直接的に分析することであると見なすことができる。

コンピテントなバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）における効率的なゲノム改変のための、少なくとも９００ヌクレオチド長の長いホモロジーアームを含む線状ＤＮＡコンストラクトの使用
本開示は、選択マーカーの使用又は組み込みなしに且つＣａｓエンドヌクレアーゼの使用又は組み込みなしにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムを改変するための方法を含む。

いかなる特定の理論、機構又は作用機序にも拘束されることを望むものではないが、本出願人は、驚くべきことに且つ予想外に、長いホモロジーアーム（各ホモロジーアームは、少なくとも９００ヌクレオチドを有する）を含む線状ＤＮＡコンストラクトがバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞に導入されると、効率が高いゲノム改変（限定されないが、ドナーＤＮＡ配列の組み込み、遺伝子の欠失、使用する線状ＤＮＡコンストラクトの種類に応じた変異など）が観察され、この導入及びゲノム改変が、選択マーカー又は誘導型Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系の使用なしに行われることを見出した。

本開示は、誘導型Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系の使用なしに、且つ選択マーカーのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞のゲノムの組み込みなしに、ドナーＤＮＡを含む線状ＤＮＡコンストラクトを使用してドナーＤＮＡ配列を前記ゲノムに組み込むための方法及び組成物を含む。

本明細書に記載されるように、選択マーカーの使用なしの且つ誘導型Ｃａｓ系の使用なしの、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムへのドナーＤＮＡの組み込みは、上流のホモロジーアーム（ＨＲ１）及び下流のホモロジーアーム（ＨＲ２）によって隣接されるドナーＤＮＡを含む線状ＤＮＡコンストラクトを導入することによって高頻度で起こり得、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞に導入される各ホモロジーアームは、少なくとも９００ヌクレオチド長である。

本開示は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムにおける目的の遺伝子を除去するための方法を含む。

本開示は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムに変異（限定されないが、点変異など）を導入するための方法を含む。

一実施形態では、この方法は、選択マーカーの使用なしにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムに変異を導入するための方法であり、この方法は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞の集団を提供することと、前記細胞の集団の少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に線状ＤＮＡコンストラクトを導入することとを含み、前記ＤＮＡコンストラクトは、上流のホモロジーアーム（ＨＲ１）及び下流のホモロジーアーム（ＨＲ２）によって隣接される、所望の変異を有するヌクレオチド配列を含み、各ホモロジーアームは、少なくとも９００ヌクレオチド長であり、前記ＤＮＡコンストラクトは、選択マーカーを含まない。一実施形態では、上記の方法は、選択マーカーを含まない培地において、前記少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に由来する子孫細胞の増殖をさせることと、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）子孫細胞であって、そのゲノムに変異を有するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）子孫細胞を同定することとをさらに含む。一態様では、所望の変異を有するヌクレオチド配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞の天然配列（修飾前のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ゲノムＤＮＡ配列）と比較して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０塩基の修飾又は置換を含む。一態様では、所望の変異（塩基の置換）を有するヌクレオチド配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０塩基からなる。

本開示は、遺伝子発現カセットの複数のコピーを導入するための方法を含む。酵素産生のためのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）宿主の開発におけるボトルネックの１つは、染色体における複数コピーの酵素発現カセットの抗生物質耐性マーカー（ＡＲＭ）を含まない組み込みである。組み込みベクター、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステム及び栄養要求性マーカーを使用するなどの既存の手法は、多くの時間を要し、編集効率が比較的低い。

本明細書に記載される方法は、上流のホモロジーアーム（ＨＲ１）及び下流のホモロジーアーム（ＨＲ２）によって隣接されるドナーＤＮＡを使用して目的の遺伝子（目的の遺伝子発現カセット）の複数のコピーの組み込みを可能にし、各ホモロジーアームは、少なくとも９００ヌクレオチド長であり、高い効率の遺伝子組み込みをもたらす。

複数コピーの遺伝子発現カセット又は複数コピーの発現カセットは、本明細書で互換的に使用され、少なくとも１つの目的の遺伝子を含む同じ発現カセットの複数のコピーを指す。一態様では、前記遺伝子発現カセットの複数のコピーは、２コピー、３コピー、４コピー、５コピー、６コピー、７コピー、８コピー、９コピー及び最大で１０コピーからなる群から選択される。

定義
他に定義されていない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明の組成物及び方法が属する技術分野の当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。

「対立遺伝子」又は「対立遺伝子バリアント」は、染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子の数種の代替形の１つである。染色体上の所定の遺伝子座に存在する対立遺伝子全部が同一である場合、その生物は、その遺伝子座でホモ接合性である。染色体上の所定の遺伝子座に存在する対立遺伝子が異なる場合、その生物は、その遺伝子座でヘテロ接合性である。ポリペプチドの対立遺伝子バリアントは、遺伝子の対立遺伝子バリアントによってコードされるポリペプチドである。

本明細書で使用する場合、「宿主細胞」は、新たに導入されるＤＮＡ配列のための宿主又は発現媒体として作用する能力を有する細胞を指す。したがって、本開示の特定の実施形態では、宿主細胞は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞である。

「組換え宿主細胞」（「遺伝子改変宿主細胞」とも呼ばれる）は、異種核酸、例えば組換えＤＮＡコンストラクトが導入されているか、又は本明細書に記載されるガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系などのゲノム改変系が導入されており、それを含む宿主細胞である。例えば、対象の細菌宿主細胞は、好適なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞への外来核酸（例えば、プラスミド又は環状組換えＤＮＡコンストラクト）の導入により、遺伝子改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞を含む。

本明細書で定義される通り、「親細胞」又は「親（宿主）細胞」は、互換的に使用され得、「未改変」親細胞を指す。例えば、「親」細胞は、「親」細胞のゲノムが（例えば、親細胞に導入された１つ以上の変異／改変によって）変更されて、その改変「娘」細胞を生成する微生物の任意の細胞又は株を指す。

本明細書で使用する場合、「改変細胞」又は「改変（宿主）細胞」は、互換的に使用され得、改変細胞が由来する「親」宿主細胞中に存在しない少なくとも１つの遺伝子改変を含む組換え（宿主）細胞を指す。

本明細書で使用する場合、「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属」又は「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）」細胞には、当業者に知られる「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」属内のすべての種、例えば、以下に限定されないが、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌａｕｔｕｓ）及びバチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）が含まれる。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属が分類学的再編成を受け続けていることは、認識されている。したがって、この属は、再分類された種、例えば、限定はしないが、現在、「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」と称されているＢ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの生物体を含むものとする。

本明細書で使用する場合、「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞」又は「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント株からの細胞」は、互換的に使用され、当技術分野で公知の任意の方法によってコンピテントにされたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞を指す。一態様では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞は、ＣｏｍＫ、ＣｏｍＳ、ＣｏｍＳ１、ＣｏｍＧ、ＣｏｍＣ、ＣｏｍＤＥ、Ｓｐｏ０Ｈ、ＡｂｒＢ、Ｓｐｏ０Ａ、Ｓｐｏ０Ｋ、Ｓｉｎ、ＤｅｇＵ、ＣｏｍＡ、ＣｏｍＰ、ＣｏｍＱ、ＣＯｍＢ、ｓｒｆＡ、ＣｏｍＫ又はそれらのいずれか１つの組み合わせの群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む、導入された核酸コンストラクトの少なくとも１つのコピーによってコンピテントにされる（ＤｕｂｎａｕＤ．，１９９１，ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ５５，Ｎｏ．３，ｐ．３９５－４２４；Ｈａｍｏｅｎｅｔａｌ．，２００３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４９，ｐｇ．９－１７）。

一態様では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞は、自然のコンピテンス、人工のコンピテンス又は誘導されるコンピテンスによってコンピテントにされる（ＤｕｂｎａｕＤ．，１９９１，ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ５５，Ｎｏ．３，ｐ．３９５－４２４；Ｈａｍｏｅｎｅｔａｌ．，２００３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４９，ｐｇ．９－１７；ＪａｒｍｅｒＨａｎｎｅｅｔａｌ．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ２０６，ｐｇ．１９７－２００）。

一態様では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）非コンピテント細胞をコンピテントにするための方法は、細胞がＤＮＡの取り込みに対してよりコンピテントになるように、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞におけるＣｏｍＳ、ＣｏｍＳ１、ＣｏｍＫ又はこれらのポリペプチド（又はこれらのポリペプチドをコードする遺伝子）の任意の組み合わせの導入及び発現を含む。

一態様では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）非コンピテント細胞をコンピテントにするための方法は、ＣｏｍＫ、ＣｏｍＳ、ＣｏｍＳ１、ＣｏｍＧ、ＣｏｍＣ、ＣｏｍＤＥ、Ｓｐｏ０Ｈ、ＡｂｒＢ、Ｓｐｏ０Ａ、Ｓｐｏ０Ｋ、Ｓｉｎ、ＤｅｇＵ、ＣｏｍＡ、ＣｏｍＰ、ＣｏｍＱ、ＣＯｍＢ、ｓｒｆＡ、ＣｏｍＫ又はそれらのいずれか１つの組み合わせの群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された誘導性プロモーターを含む核酸コンストラクトの少なくとも１つのコピーの、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）非コンピテント細胞への導入を含む。

そのような誘導性プロモーターの例には、限定されないが、ｘｙｌＡｐ；マルトース、マンニトール又はアラビノースなどの糖で誘導されるプロモーター；ｔｅｔＡ又はｓｐａｃプロモーターなどの小分子；温度誘導性プロモーター（ｙｄｈｌプロモーターなど）；タンデムプロモーター（国際公開第９９／０４３８３５号パンフレット及び同第０５／０９８０１６号パンフレットを参照されたい）（好ましくは、タンデムプロモーターは、ＰｃｏｎｓｅｎｓｕｓａｍｙＱ－ＰｃｒｙＩＩＩＡ－ｃｒｙＩＩＩＡ又はＰａｍｙＬ４１９９－ＰｃｏｎｓｅｎｓｕｓａｍｙＱ－ＰｃｒｙＩＩＩＡ－ｃｒｙＩＩＩＡ（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２００７／０８８１８６号明細書を参照されたい）である）；又はそれらのいずれか１つの組み合わせが含まれる。

本明細書で使用する場合、「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）スーパーコンピテント細胞」又は「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）スーパーコンピテント株からの細胞」は、互換的に使用され、細胞集団の１％超がバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）染色体ＤＮＡで形質転換可能であるバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞を指す。代わりに、スーパーコンピテントは、細胞集団の１０％超がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）自己複製プラスミドで形質転換可能であることを意味する。好ましくは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）スーパーコンピテント細胞は、野生型又は親細胞集団で観察されるよりも速い速度で形質転換される。

一態様では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）スーパーコンピテントＰｘｙｌ－ＣｏｍＫ株を産生するＣｏｍＫポリペプチド（Ｐｘｙｌ－ＣｏｍＫ）をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたキシロース誘導性プロモーター（Ｐｘｙｌ）を含む、導入された核酸コンストラクトの少なくとも１つのコピーによってスーパーコンピテントにされる。

一態様では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）スーパーコンピテント株は、ＣｏｍＫ、ＣｏｍＳ、ＣｏｍＳ１、ＣｏｍＧ、ＣｏｍＣ、ＣｏｍＤＥ、Ｓｐｏ０Ｈ、ＡｂｒＢ、Ｓｐｏ０Ａ、Ｓｐｏ０Ｋ、Ｓｉｎ、ＤｅｇＵ、ＣｏｍＡ、ＣｏｍＰ、ＣｏｍＱ、ＣＯｍＢ、ｓｒｆＡ、ＣｏｍＫ又はそれらのいずれか１つの組み合わせの群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（限定されないが、誘導性プロモーターなど）を含む核酸コンストラクトの少なくとも１つのコピーをバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に導入することによってスーパーコンピテントにされる株である。

一態様では、コンピテント又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）スーパーコンピテント株は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８（ＢＧＳＣ１Ａ１）、ｓｐｏＩＩＡＣ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＥ及びａｍｙＥ遺伝子が欠失したバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８ｄｅｌｔａ４、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ａ１６４ｄｅｌｔａ５（上記と同様であるが、ｓｒｆＡＣＵＳＰＴＯ５８９１７０１がさらに欠失）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＤＴ１０１（ｂ．リケニフォルミス（ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＳＪ１９０４のＤＮＡメチルトランスフェラーゼを発現）及びバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＳＪ１９０４（ＵＳＰＴＯ５７３３７５３）からなる群から選択される。

本明細書で使用する場合、用語「増加した」は、量又は活性の増加が比較されている量又は活性より少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、１００％又は少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３，１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０，４００、４１０、４２０，４３０、４４０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０若しくは５００倍多い量又は活性を指し得る。用語「増加した」、「～より大きい」及び「改善された」は、本明細書で互換的に使用される。用語「増加した」は、本明細書に記載される対照又は参照方法と比較して、本明細書に記載される多成分の方法によって得られる形質転換又は遺伝子編集効率を特徴付けるために使用され得る。

本明細書で使用する場合、用語「組み込み効率」は、そのゲノムに組み込まれる目的の所望の遺伝子を有する形質転換された細胞の数を、形質転換された細胞の総数で割ることによって定義される。この数に１００を掛けて、％としてそれを表すことができる。
組み込み効率（％）＝（ゲノムに組み込まれる目的の遺伝子を有する形質転換された細胞の数／形質転換された細胞の総数）＊１００。

用語「保存ドメイン」又は「モチーフ」は、進化的に関連するタンパク質のアラインメントされた配列に沿って特定位置で保存された１セットのアミノ酸を意味する。他の位置のアミノ酸は、相同タンパク質間で変動し得る一方、特定の位置に高度に保存されるアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性又は活性に必須のアミノ酸を示す。それらは、そのタンパク質ホモログのファミリーのアラインされた配列の高い保存度によって同定されるため、新しく決定された配列を有するタンパク質が予め同定されたタンパク質ファミリーに属するか否かを決定する識別子又は「シグネチャー」として使用することができる。

本明細書で使用する場合、「核酸」は、ポリヌクレオチドを意味し、デオキシリボヌクレオチド塩基又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーを含む。核酸は、断片及び修飾ヌクレオチドも含み得る。したがって、用語「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」及び「核酸断片」は、一本鎖又は二本鎖であるＲＮＡ、及び／又はＤＮＡ、及び／又はＲＮＡ－ＤＮＡのポリマーを示すために互換的に使用され、任意選択により合成ヌクレオチド塩基、非天然ヌクレオチド塩基又は改変ヌクレオチド塩基を含有する。ヌクレオチド（通常、５’－一リン酸塩形態で見出される）は、単一文字表示により、以下のように称される：アデノシン又はデオキシアデノシン（それぞれＲＮＡ又はＤＮＡに対して）に対して「Ａ」、シトシン又はデオキシシトシンに対して「Ｃ」、グアノシン又はデオキシグアノシンに対して「Ｇ」、ウリジンに対して「Ｕ」、デオキシチミジンに対して「Ｔ」、プリン（Ａ又はＧ）に対して「Ｒ」、ピリミジン（Ｃ又はＴ）に対して「Ｙ」、Ｇ又はＴに対して「Ｋ」、Ａ又はＣ又はＴに対して「Ｈ」、イノシンに対して「Ｉ」及び任意のヌクレオチドに対して「Ｎ」（例えば、ＤＮＡ配列について言及する場合、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧであり得；ＲＮＡ配列について言及する場合、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｕ又はＧであり得る）。

本明細書に記載されるポリヌクレオチド（又は核酸分子）は、「遺伝子」、「ベクター」及び「プラスミド」を含むことが理解される。

用語「遺伝子」は、あるタンパク質のコード配列のすべて又は一部を含む特定のアミノ酸配列などであるが、これらに限定されない機能的な分子をコードするポリヌクレオチドを指し、例えば遺伝子が発現される条件を決定するプロモーター配列などの調節（非転写）配列を含み得る。遺伝子の転写領域は、イントロン、５’－非翻訳領域（ＵＴＲ）及び３’－ＵＴＲを含む非翻訳領域（ＵＴＲ）並びにコード配列を含み得る。「天然遺伝子」は、それ自体の調節配列とともに天然に見出される遺伝子を指す。

「コドン改変遺伝子」、又は「コドン優先遺伝子」、又は「コドン最適化遺伝子」とは、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するように設計されているコドン使用頻度を有する遺伝子である。遺伝子をコドン最適化するために行われる核酸変更は、親遺伝子のコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更しないことを意味する「同義」である。しかしながら、天然遺伝子及びバリアント遺伝子の両方を特定の宿主細胞用にコドン最適化することができ、したがって、これに関して、制限は、意図されていない。コドン優先遺伝子を合成するための方法は、当技術分野で利用可能である。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号明細書及び同第５，４３６，３９１号明細書並びにＭｕｒｒａｙｅｔａｌ．（１９８９）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７：４７７－４９８（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

宿主生物体中で遺伝子発現を増強するために、追加の配列改変が知られる。これらとしては、例えば、疑似のポリアデ二ル化シグナルをコードする１つ以上の配列の除去、１つ以上のエクソン－イントロンスプライス部位シグナルの除去、１つ以上のトランスポゾン様リピートの除去及び遺伝子発現に有害である可能性のあるそうしたよく特徴付けられた他の配列の除去が挙げられる。配列のＧ－Ｃ含有量は、宿主細胞中で発現する既知の遺伝子を参照することによって算出される、所与の宿主生物体の平均的なレベルに調節され得る。可能な場合、１つ以上のｍＲＮＡの予測されるヘアピン二次構造を避けるために配列を改変する。

本明細書で使用する場合、用語「コード配列」は、その（コードされた）タンパク質産物のアミノ酸配列を直接的に指定するヌクレオチド配列を指す。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレーム（以下では「ＯＲＦ」）によって決定され、それは、通常、ＡＴＧ開始コドンで開始する。コード配列には、通常、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及び組換えヌクレオチド配列が含まれる。

本明細書で定義する場合、「オープンリーディングフレーム」（以下では「ＯＲＦ」）という用語は、（ｉ）開始コドン、（ｉｉ）アミノ酸を示す一連の２以上のコドン、及び（ｉｉｉ）終結コドンからなる連続するリーディングフレームを含む核酸又は核酸配列（天然に存在するか、天然に存在しないか、又は合成であるかにかかわらず）を意味し、ＯＲＦは、５’から３’の方向に読まれる（又は翻訳される）。

本明細書で使用する場合、用語「染色体組み込み」は、目的のポリヌクレオチドがバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）染色体に組み込まれるプロセスを指す。線状ドナーＤＮＡコンストラクト（ホモロジーアームによって隣接される線状ドナーＤＮＡ）のホモロジーアームは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）染色体の相同領域と整列されることになる。その後、ホモロジーアーム間の配列は、２つの交差（すなわち相同組換え）において目的のポリヌクレオチドによって置き換えられる。

「調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内又はコード配列の下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指し、それは、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性又は翻訳に影響を及ぼす。調節配列としては、以下に限定されないが、プロモーター、翻訳リーダー配列、５’非翻訳配列、３’非翻訳配列、イントロン、ポリアデニル化標的配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステムループ構造が挙げられる。

本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」は、コード配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御できる核酸配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’（下流）に位置する。プロモーターは、それらの全体が天然遺伝子に由来し得るか、又は天然に見出される種々のプロモーターに由来する種々のエレメントから構成され得るか、又はさらに合成核酸セグメントを含み得る。種々のプロモーターは、種々の細胞型において、又は種々の発生段階において、又は種々の環境若しくは生理的条件に応答して、遺伝子の発現を指示し得ることが当業者に理解される。大多数の場合にほとんどの細胞型で遺伝子の発現をもたらすプロモーターは、一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は、完全には明らかになっていないため、種々の長さのＤＮＡ断片が同一プロモーター活性を有し得ることがさらに認識されている。

「作動可能に連結される」は、２つ以上のエレメント間の機能的連結を意味するものとする。例えば、目的のポリヌクレオチドと調節配列（例えば、プロモーター）との間の作動可能な連結は、目的のポリヌクレオチドの発現を可能にする機能的連結である（すなわち、目的のポリヌクレオチドは、プロモーターの転写制御下にある）。作動可能に連結したエレメントは、連続的又は非連続的であり得る。コード配列（例えば、ＯＲＦ）は、センス又はアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結され得る。２つのタンパク質コード領域の結合を指すために使用される場合、コード領域が同じリーディングフレームに存在することは、作動可能に連結されることによって意図される。

核酸は、それが別の核酸配列と機能的関連性に置かれている場合、「作動可能に連結されて」いる。例えば、分泌リーダー（すなわちシグナルペプチド）をコードするＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現している場合、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結しているか；プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、そのコード配列に作動可能に連結しているか；又はリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に作動可能に連結している。一般に、「作動可能に連結された」は、連結されているＤＮＡ配列が連続していること及び分泌リーダーの場合、連続しており且つ読み取り枠内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接している必要はない。連結は、便宜的な制限部位でのライゲーションによって行われる。そのような部位が存在しない場合、従来の手法に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。

本明細書で使用する場合、「目的のタンパク質コード配列の遺伝子に連結した目的の遺伝子の発現を制御する機能的プロモーター配列（又はそれらのオープンリーディングフレーム）」は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）におけるコード配列の転写及び翻訳を制御するプロモーター配列を指す。例えば、特定の実施形態では、本開示は、５’プロモーター（又は５’プロモーター領域若しくはタンデム５’プロモーターなど）を含むポリヌクレオチドであって、そのプロモーター領域は、目的のタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結している、ポリヌクレオチドを対象とする。したがって、特定の実施形態では、機能的プロモーター配列は、目的のタンパク質をコードする目的の遺伝子の発現を制御する。他の実施形態では、機能的プロモーター配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞における目的のタンパク質をコードする異種遺伝子又は内在性遺伝子の発現を制御する。

プロモーター配列は、近位及びより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントは、エンハンサーと称されることが多い。「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、プロモーターの固有のエレメントであり得るか、又はプロモーターのレベル若しくは組織特異性を増強するために挿入された異種エレメントであり得る。

本明細書で開示される線状組換えＤＮＡ及び環状組換えＤＮＡは、当技術分野において知られる任意の方法を使用してバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に導入され得る。

本明細書で定義されるように、少なくとも１つの線状ＤＮＡコンストラクト、ポリヌクレオチド又はそれらの遺伝子若しくはそれらのベクターを「細菌細胞に導入する」又は「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に導入する」などの句で使用される「導入する」という用語には、限定されないが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に導入される線状ＤＮＡコンストラクトをバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞の集団と混合することを含む、ＤＮＡコンストラクトをバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に導入するための当技術分野で公知の方法が含まれる。

「導入する」は、成分が生物体の細胞の内部又は細胞自体へ侵入するような方法において、細胞又は生物体などの生物体に、本明細書で開示されるＤＮＡコンストラクトを提供することを意味することが意図される。方法及び組成物は、生物体又は細胞に配列を導入するための特定の方法に依存せず、この生物体の少なくとも１つの細胞の内部に、本明細書で開示されるＤＮＡコンストラクトを単に侵入させるのみである。導入することは、核酸が細胞のゲノム内に組み込まれ得る（統合され得る）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞内への核酸の組み込みに関する言及を含み、且つ細胞への核酸の一過性（直接的）提供についての言及を含む。

安定形質転換は、生物体に導入されたヌクレオチドコンストラクトが生物体のゲノムに組み込まれ、その子孫に受け継がれ得ることを意味することが意図される。一過性形質転換は、ポリヌクレオチドが生物体に（直接的又は間接的に）導入されるが、この生物体のゲノムに組み込まれないか、又はポリペプチドが生物体に導入されることを意味することが意図される。一過性形質転換は、導入された組成物は、生物体内で一時的にのみ発現又は存在することを示す。

ゲノムが改変され、且つ／又は挿入されたそれらのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞を同定するために、様々な方法が利用可能である。目的の所望の改変を有する形質転換細胞の同定は、当業者に公知の任意の方法によって決定することができる。例えば、本明細書に記載の方法によって得られるゲノムに改変を有するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞の同定は、当技術分野で公知の任意の表現型又は遺伝子型のスクリーニングによって同定することができる。スクリーニング可能な表現型には、スキムミルクを含むＬＢ寒天培地上で増殖するコロニーの周りのハローの存在が、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムへの発現カセットの組み込み（本明細書の実施例に記載）、抗菌薬感受性スクリーニング、指示薬の色を変化させる寒天培地中のトリグリセリドの加水分解をもたらす発現カセットの組み込み、色を変化させる指示薬基質の加水分解をもたらす発現カセットの組み込み、コロニー形態の違いをゲノム改変として使用できるコロニー表現型に影響を与える遺伝子の欠失、蛍光タンパク質の発現をもたらす発現カセットの組み込み又はそれらのいずれか１つの組み合わせを示す表現型スクリーニングが含まれる。

スクリーニング可能な遺伝子型の方法には、形質転換されたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノム配列を決定するための方法が含まれる。そのような方法は、限定されないが、ＰＣＲ法、配列決定法、ヌクレアーゼ消化、サザンブロット及びそれらの任意の組み合わせを含む、ゲノム配列を直接分析してゲノムヌクレオチド配列の変化を検出するものと見なすことができる。例えば、本明細書に記載される方法に必要な範囲で参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／１４７，８３４号明細書を参照されたい。方法は、ゲノムに組み込まれた目的のポリヌクレオチドを含む細胞から生物体を回収することも含む。

用語「ゲノム」、細菌（宿主）細胞「ゲノム」又はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（宿主）細胞「ゲノム」は、核内に見出される染色体ＤＮＡのみならず、細胞の細胞内成分内に見出されるオルガネラＤＮＡ（染色体外ＤＮＡ）を含む。

本明細書で使用する場合、用語「プラスミド」、「ベクター」及び「カセット」は、多くの場合、細胞の中心的な代謝に通常関与しない遺伝子を有し、通常、二本鎖ＤＮＡ分子の形態の染色体外エレメントを指す。そのようなエレメントは、任意の供給源に由来する、線状又は環状の一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡである自己複製配列、ゲノム組み込み配列ファージ又はヌクレオチド配列であり得、ここで、いくつかのヌクレオチド配列は、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片及びＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列とともに細胞に導入することができる固有の構成に結合又は組み換えられている。

用語「ベクター」は、細胞内で複製（増殖）することができ、新たな遺伝子又はＤＮＡセグメントを細胞中に運ぶことができる任意の核酸を含む。ベクターとしては、「エピソーム」（すなわち自律的に複製するか、又は宿主生物体の染色体に組み込むことができる）である、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、プラスミド、ファージミド、トランスポゾン及びＢＡＣ（細菌人工染色体）などの人工染色体が挙げられる。

用語「発現カセット」及び「発現ベクター」は、細胞内の特定の核酸の転写を許容する一連の特定の核酸要素を用いて、組換え的又は合成的に生成された核酸コンストラクトを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス又は核酸断片内に組み込むことができる。通常、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写対象の核酸配列及びプロモーターが含まれる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡコンストラクトには、標的細胞内の特定の核酸の転写を許容する一連の特定の核酸要素も含まれる。特定の実施形態では、本開示のＤＮＡコンストラクトは、本明細書で定義する選択マーカー及び不活化染色体若しくは遺伝子セグメント又はＤＮＡセグメントを含む。多数の原核生物発現ベクターが市販されており、当業者に知られている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。

本明細書で使用する場合、「ターゲティングベクター」は、その中にターゲティングベクターが形質転換される宿主細胞の染色体内の領域に相同なポリヌクレオチド配列を含み、その領域で相同組換えを駆動できるベクターである。例えば、ターゲティングベクターは、相同組換えによって宿主細胞の染色体に変異を導入する際に使用される。いくつかの実施形態では、ターゲティングベクターは、例えば、末端に付加された他の非相同配列（すなわちスタッファー配列又は隣接配列）を含む。末端は、例えば、ベクターへの挿入などのように、ターゲティングベクターが閉環を形成するように閉じることができる。適切なベクターの選択及び／又は構成は、十分に当業者の知識の範囲内である。

本明細書で使用する場合、用語「プラスミド」は、クローニングベクターとして使用され、且つ多くの細菌及び一部の真核生物において染色体外の自己複製遺伝要素を形成する環状の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡコンストラクトを指す。いくつかの実施形態では、プラスミドは、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。

目的のポリヌクレオチドは、本明細書にさらに記載され、商業市場及び酵素の生産（細菌の発酵によって酵素を生産することを介するが、これに限定されない）に関与する人々の関心を反映するポリヌクレオチドを含む。

目的のポリヌクレオチドは、１つ以上の目的のタンパク質をコードできる。それは、他の生体機能を有し得る。目的のポリヌクレオチドは、形質転換されることになるバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノム、すなわち同種又は異種配列のいずれかに既に存在しても又はしなくてもよい。

目的のヌクレオチドは、標的化される目的の遺伝子配列に関するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の少なくとも一部に相補的なアンチセンス配列を含み得る。アンチセンスヌクレオチドは、対応するｍＲＮＡとハイブリダイズするように構成されている。アンチセンス配列は、その配列が対応するｍＲＮＡにハイブリダイズして、その発現を妨げる限り、改変され得る。この方法において、対応するアンチセンス配列に対して７０％、８０％又は８５％の配列同一性を有するアンチセンス構築物を使用し得る。さらに、アンチセンスヌクレオチドの部分は、標的遺伝子の発現を妨げるために使用され得る。一般に、少なくとも５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド又はそれを超える配列が使用され得る。

さらに、目的のポリヌクレオチドは、生物体の内在性遺伝子の発現を抑制するセンス方向でも使用され得る。センス方向のポリヌクレオチドを使用して生物体の遺伝子発現を抑制するための方法は、当技術分野で知られている。この方法には、一般に、内在性遺伝子の転写に対応するヌクレオチド配列の少なくとも一部に作動可能に連結した、生物体内での発現を駆動するプロモーターを含むＤＮＡコンストラクトで生物体を形質転換することが含まれる。通常、そのようなヌクレオチド配列は、内在性遺伝子の転写配列に対する実質的な配列同一性、一般に約６５％を超える配列同一性、約８５％を超える配列同一性又は約９５％を超える配列同一性を有する。米国特許第５，２８３，１８４号明細書及び同第５，０３４，３２３号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

表現型マーカーは、陽性選択マーカーであるか又は陰性選択マーカーであるかにかかわらず、視覚マーカー及び選択マーカーを含むスクリーニング可能又は選択マーカーである。任意の表現型マーカーを使用することができる。詳細には、選択マーカー又はスクリーニング可能マーカーは、多くの場合に特定の条件下において、１つの分子若しくはそれを含有する細胞を同定するか、又はこの分子若しくは細胞に有利若しくは不利に選択することを可能にするＤＮＡセグメントを含む。これらのマーカーは、ＲＮＡ、ペプチド若しくはタンパク質の産生などであるが、これらに限定されない活性をコードすることができるか、又はＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機化合物及び有機化合物若しくは組成物などのための結合部位を提供することができる。

用語「選択マーカー」及び「選択マーカーをコードするヌクレオチド配列」は、（宿主）細胞内で発現することができ、選択マーカーの発現が、発現した遺伝子を含有する細胞に、対応する選択的作用物質の存在下又は必須栄養素の欠如下で増殖する能力を付与するヌクレオチド配列を指す。一態様では、選択マーカーは、ベクターを含有するそれらの宿主の選択を容易にできる、宿主細胞内で発現することができる核酸（例えば、遺伝子）を指す。そのような選択マーカーの例としては、抗菌剤が挙げられるが、これらに限定されない。

用語「選択マーカー」は、宿主細胞が目的の入来ＤＮＡを取り込んだか、又は何らかの他の反応が発生したことの兆候を提供する遺伝子を含む。通常、選択マーカーは、形質転換中に外来配列を受け入れていない細胞から外来ＤＮＡを含有する細胞を区別することを可能にする抗菌剤耐性又は代謝的優位性を宿主細胞に付与する遺伝子である。

「存在する選択マーカー」は、形質転換されることになる微生物の染色体上に位置するものである。存在する可能マーカーは、形質転換ＤＮＡコンストラクト上の選択マーカーと異なる遺伝子をコードする。選択マーカーは、当業者によく知られている。上記で示したように、マーカーは、抗微生物耐性マーカー（例えば、ａｍｐ^Ｒ、ｐｈｌｅｏ^Ｒ、ｓｐｅｃ^Ｒ、ｋａｎ^Ｒ、ｅｒｙ^Ｒ、ｔｅｔ^Ｒ、ｃｍｐ^Ｒ及びｎｅｏ^Ｒ（例えば、Ｇｕｅｒｏｔ－Ｆｌｅｕｒｙ，１９９５；Ｐａｌｍｅｒｏｓｅｔａｌ．，２０００；及びＴｒｉｅｕ－Ｃｕｏｔｅｔａｌ．，１９８３を参照されたい）であり得る。いくつかの実施形態では、本発明は、クロラムフェニコール耐性遺伝子（例えば、ｐＣ１９４上に存在する遺伝子及びバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のゲノム内に存在する耐性遺伝子）を提供する。この耐性遺伝子は、本発明において且つ染色体に組み込まれたカセット及び組み込み型プラスミドの染色体増幅を包含する実施形態において特に有用である（例えば、ＡｌｂｅｒｔｉｎｉａｎｄＧａｌｉｚｚｉ，１９８５；ＳｔａｈｌａｎｄＦｅｒｒａｒｉ，１９８４を参照されたい）。本発明に従って有用な他のマーカーとしては、セリン、リシン、トリプトファンなどの栄養要求性マーカー及びβ－ガラクトシダーゼなどの検出マーカーが挙げられるが、これらに限定されない。

目的のポリヌクレオチドは、他の形質と組み合わせて積み重ねられ得るか又は使用され得る遺伝子を含む。

本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、互換的に使用され、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基を含む任意の長さのポリマーを指す。本明細書では、アミノ酸残基に関して従来の１文字コード又は３文字コードを使用する。ポリペプチドは、直鎖状又は分岐鎖状であり得、改変アミノ酸を含み得、且つ非アミノ酸によって分断され得る。ポリポチペプチドという用語は、自然に又は介入；例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化若しくは標識化成分との結合などの任意の他の操作若しくは改変によって改変されているアミノ酸ポリマーも包含する。また、この定義の範囲には、例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド及び当技術分野において知られる他の改変も含まれる。

用語「目的のタンパク質」又は「ＰＯＩ」は、改変されたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞において発現することが所望される目的のポリペプチドを指す。したがって、本明細書で使用する場合、ＰＯＩは、酵素、基質結合タンパク質、表面活性タンパク質、構造タンパク質、受容体タンパク質、抗体などであり得る。

本明細書で使用する場合、「目的の遺伝子」又は「ＧＯＩ」は、ＰＯＩをコードする核酸配列（例えば、ポリヌクレオチド、遺伝子又はＯＲＦ）を指す。「目的のタンパク質」をコードする「目的の遺伝子」は、天然に存在する遺伝子、変異遺伝子又は合成遺伝子であり得る。

特定の実施形態では、本開示の目的の遺伝子は、酵素（例えば、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、α－グルカナーゼ、グルカンリザーゼ（ｇｌｕｃａｎｌｙｓａｓｅ）、エンド－β－グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノ－ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ及びこれらの組み合わせ）などの商業的に関連する工業用の目的のタンパク質をコードする。

「変異」は、核酸配列内の任意の変化又は変更を指す。点変異、欠失変異、サイレント変異、フレームシフト変異、スプライシング変異などを含む数種類の変異が存在する。変異は、特異的に（例えば、部位特異的変異誘発によって）又はランダムに（例えば、化学薬品、修復マイナス細菌株による継代によって）行われ得る。

本明細書に記載の「点変異」は、遺伝子配列中の１つ又はごく少数のヌクレオチドのみに影響を与える変異を指す。点変異は、最も一般的には、ある塩基を別の塩基に置換することを伴う（これによりＤＮＡの相補的塩基も変化する）。点変異という用語には、一塩基対の挿入又は除去も含まれる。点変異又は置換には、ＤＮＡ又はＲＮＡの配列から単一のヌクレオチド塩基が変更、挿入又は除去された遺伝子変異が含まれる。

バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞のゲノムに変異を導入するための方法が本明細書に記載される。

一実施形態では、この方法は、選択マーカーの使用なしにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムに変異を導入するための方法であり、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞の集団を提供することと、前記細胞の集団の少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に線状ＤＮＡコンストラクトを導入することとを含み、前記ＤＮＡコンストラクトは、上流のホモロジーアーム（ＨＲ１）及び下流のホモロジーアーム（ＨＲ２）によって隣接される、所望の変異を有するヌクレオチド配列を含み、各ホモロジーアームは、少なくとも９００ヌクレオチド長であり、前記ＤＮＡコンストラクトは、選択マーカーを含まない。一実施形態では、上記の方法は、選択マーカーを含まない培地において、前記少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に由来する子孫細胞を増殖させることと、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）子孫細胞であって、そのゲノムに変異を有するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）子孫細胞を同定することとをさらに含む。一態様では、所望の変異を有するヌクレオチド配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞の天然配列（修飾前のゲノムバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ＤＮＡ配列）と比較して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０塩基の修飾又は置換を含む。一態様では、所望の変異（塩基置換）を有するヌクレオチド配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０塩基からなる。

本開示の一態様では、ドナーＤＮＡは、少なくとも９００ヌクレオチド長の２つのホモロジーアーム（一方が５’上流のアームＨＲ１であり、及び他方が３’下流のアームＨＲ２である）によって隣接される、所望の変異を有するヌクレオチド配列を含む。このドナーコンストラクトが細胞に導入されると、相同組換えが起こり、元のゲノム配列が変異し得る。

「変異遺伝子」は、ヒトが介入して改変された遺伝子である。そのような「変異遺伝子」は、少なくとも１個のヌクレオチドの付加、欠失又は置換により、対応する非変異遺伝子の配列と異なる配列を有する。本開示の特定の実施形態では、この変異遺伝子は、本明細書で開示される通りの方法の結果として生じる変更を含む。変異細胞又は生物体は、変異遺伝子を含む細胞又は生物体である。

本明細書で使用する場合、ポリペプチド又はその配列に関連して、用語「置換」は、１つのアミノ酸の別のアミノ酸との置き換え（すなわち置換）を意味する。

本明細書で定義する場合、「内在性遺伝子」は、生物体のゲノム中の天然の位置に存在する遺伝子を指す。

本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に関連した「異種」は、外来種を起源とする配列であるか、又は同種からのものであれば、組成及び／又はゲノム遺伝子座が意図的な人的介入により天然の形態から実質的に改変されている配列である。例えば、異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターは、このポリヌクレオチドが由来した種と異なる種からのものであるか、又は同一／類似種からのものであれば、一方若しくは両方が元の形態及び／若しくはゲノム遺伝子座から実質的に改変されているか、又はこのプロモーターが、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの天然プロモーターではない。本明細書で使用する場合、別段の指定がない限り、キメラポリヌクレオチドは、コード配列に対して異種である転写開始領域に作動可能に連結したコード配列を含む。

本明細書で定義する場合、「異種」遺伝子、「非内在性」遺伝子又は「外来」遺伝子は、通常、宿主生物体に見出されないが、遺伝子導入によって宿主生物体に導入される遺伝子（又はＯＲＦ）を指す。本明細書で使用する場合、用語「外来」遺伝子は、非天然生物中に挿入された天然遺伝子（若しくはＯＲＦ）及び／又は天然若しくは非天然生物中に挿入されたキメラ遺伝子を含む。

本明細書で定義する場合、「異種」核酸コンストラクト又は「異種」核酸配列は、その中でそれが発現する細胞に対して天然ではない配列の部分を有する。

本明細書で定義する場合、「異種制御配列」は、天然では目的の遺伝子の発現を調節（制御）するために機能しない遺伝子発現制御配列（例えば、プロモーター又はエンハンサー）を指す。一般に、異種核酸配列は、その中にそれらが存在する細胞又はゲノムの一部に対して内在性（天然）ではなく、感染、トランスフェクション、形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどによって細胞に付加されている。「異種」核酸コンストラクトは、天然宿主細胞内で見出される制御配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせと同一の又は異なる制御配列／ＤＮＡコード（ＯＲＦ）配列の組み合わせを含有し得る。

本明細書で使用する場合、用語「シグナル配列」及び「シグナルペプチド」は、成熟タンパク質又はタンパク質の前駆体形の分泌又は直接輸送に関与する可能性があるアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配列は、一般的には、前駆体又は成熟タンパク質配列のＮ末端に位置する。シグナル配列は、内在性又は外来性であり得る。シグナル配列は、通常、成熟タンパク質に存在しない。シグナル配列は、一般的には、タンパク質が輸送された後にシグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。

用語「由来する」には、用語「～から生じた」、「～から得られた」、「～から入手可能な」及び「～から作製された」が含まれ、一般には、１つの特定の材料若しくは組成物が別の材料若しくは組成物にその起源が見出されるか、又は他の特定の材料若しくは組成物を参照して記載できる特徴を有することを示す。

本明細書で使用する場合、「隣接配列」は、考察対象の配列の上流又は下流にある任意の配列を指す（例えば、遺伝子Ａ－Ｂ－Ｃでは、遺伝子ＢがＡ及びＣの遺伝子配列によって隣接される）。特定の実施形態では、入来配列は、両側でホモロジーアームによって隣接される。いくつかの実施形態では、隣接配列は、一方の側（３’又は５’）にのみ存在するが、他の実施形態では、隣接されている配列の両側に存在する。各ホモロジーアームの配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ゲノム（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体など）中の配列に相同である。

本明細書で使用する場合、用語「スタッファー配列」は、ホモロジーアーム（一般的にはベクター配列）に隣接している任意の余分なＤＮＡを指す。しかし、この用語は、任意の非相同ＤＮＡ配列を包含する。いかなる理論によっても限定されるものではないが、スタッファー配列は、細胞がＤＮＡ取り込みを開始するために重要ではない標的を提供する。

核酸配列又はポリペプチド配列に関連して、「配列同一性」又は「同一性」は、特定の比較ウィンドウ全体にわたり最大の一致のために整列された場合に同一である２つの配列における核酸塩基又はアミノ酸残基を意味する。

用語「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウ全体にわたり２つの最適に整列された配列を比較することにより決定される値を指し、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の部分は、これらの２つの配列を最適に整列させるために、参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して付加又は欠失（すなわちギャップ）を含む場合がある。パーセンテージは、両方の配列内で同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が生じる位置の数を求めて、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除して、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。配列同一性パーセントの有用な例としては、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％又は５０％～１００％の任意の整数パーセンテージが挙げられるが、これらに限定されない。これらの同一性は、本明細書に記載したプログラムのいずれかを使用して決定することができる。

配列アラインメント及び同一性又は類似性のパーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲＩｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（これに限定されない）を含む、相同配列を検出するために設計された様々な比較方法を使用して決定することができる。本出願に関連して、配列分析ソフトウェアが分析に使用される場合、他に規定されない限り、分析結果は、言及したプログラムの「デフォルト値」をベースとすることが理解されるであろう。本明細書で使用する「デフォルト値」は、最初に初期化されると、ソフトウェアで最初にロードされる数値又はパラメーターの任意のセットを意味するであろう。

「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌＶ法」は、ＣｌｕｓｔａｌＶ（ＨｉｇｇｉｎｓａｎｄＳｈａｒｐ，（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ５：１５１－１５３；Ｈｉｇｇｉｎｓｅｔａｌ．，（１９９２）ＣｏｍｐｕｔＡｐｐｌＢｉｏｓｃｉ８：１８９－１９１により説明されている）と表示され、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲＩｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム中に見出されるアラインメント法に対応する。多重アラインメントの場合、デフォルト値は、ＧＡＰＰＥＮＡＬＴＹ＝１０及びＧＡＰＬＥＮＧＴＨＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用したタンパク質配列のペアワイズアラインメント及び同一性パーセントの算出のためのデフォルトパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５及びＤＩＡＧＯＮＡＬＳＳＡＶＥＤ＝５である。核酸の場合、これらのパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４及びＤＩＡＧＯＮＡＬＳＳＡＶＥＤ＝４である。ＣｌｕｓｔａｌＶプログラムを使用した配列のアラインメント後、同一プログラム中の「配列距離」表を調べることにより、「同一性パーセント」を得ることができる。

「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌＷ法」は、ＣｌｕｓｔａｌＷ（ＨｉｇｇｉｎｓａｎｄＳｈａｒｐ，（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ５：１５１－１５３；Ｈｉｇｇｉｎｓｅｔａｌ．，（１９９２）ＣｏｍｐｕｔＡｐｐｌＢｉｏｓｃｉ８：１８９－１９１により説明されている）と表示され、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲＩｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム中に見出されるアラインメント法に対応する。多重アラインメントのためのデフォルトパラメーター（ＧＡＰＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰＬＥＮＧＴＨＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、ＤｅｌａｙＤｉｖｅｒｇｅｎＳｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡＴｒａｎｓｉｔｉｏｎＷｅｉｇｈｔ＝０．５、ＰｒｏｔｅｉｎＷｅｉｇｈｔＭａｔｒｉｘ＝ＧｏｎｎｅｔＳｅｒｉｅｓ、ＤＮＡＷｅｉｇｈｔＭａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用した配列のアラインメント後、同一プログラム中の「配列距離」表を調べることにより、「同一性パーセント」を得ることができる。

別途指定しない限り、本明細書に示される配列同一性／類似性値は、以下のパラメーターを用いるＧＡＰＶｅｒｓｉｏｎ１０（ＧＣＧ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して得られた値を指す：ヌクレオチド配列の同一性％及び類似性％は、ギャップ生成ペナルティウエイト５０、ギャップ長伸長ペナルティウエイト３及びｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用；アミノ酸配列の同一性％及び類似性％は、ギャップ生成ペナルティウエイト８、ギャップ長伸長ペナルティ２及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用（ＨｅｎｉｋｏｆｆａｎｄＨｅｎｉｋｏｆｆ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５）。ＧＡＰは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，（１９７０）ＪＭｏｌＢｉｏｌ４８：４４３－５３のアルゴリズムを使用して、一致した数を最大化し、ギャップ数を最小限に抑える２種の配列全体のアラインメントを見出す。ＧＡＰは、すべての可能なアラインメント及びギャップ位置を考慮し、一致した塩基の単位でギャップ生成ペナルティ及びギャップ伸長ペナルティを使用して、一致した塩基の最大数及び最小のギャップを有するアラインメントを作成する。

「ＢＬＡＳＴ」は、国立生物工学情報センター（（ＮＣＢＩ）によって提供されている、生物学的配列の類似領域を見出すために使用される検索アルゴリズムである。このプログラムでは、ヌクレオチド配列又はタンパク質配列を配列データベースと比較し、一致の統計学的有意性を計算して、問い合わせ配列に十分類似した配列を、類似性がランダムに起こったと予想されないように特定する。ＢＬＡＳＴは、特定された配列及びそれらの問い合わせ配列に対するローカルアラインメントを報告する。

多くのレベルの配列同一性は、他の種からの又は天然に若しくは合成により改変されているポリペプチド（そのようなポリペプチドは、同一の又は類似した機能又は活性を有する）の特定に有用であることが当業者によく理解されるであろう。同一性パーセントの有用な例としては、限定はされないが、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％又は５０％～１００％の任意の整数パーセンテージが挙げられる。実際に、５０％～１００％の任意の整数のアミノ酸同一性、例えば５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性は、本開示の説明に有用であり得る。

「翻訳リーダー配列」は、遺伝子のプロモーター配列とコード配列との間に位置するポリヌクレオチド配列を指す。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡの翻訳開始配列の上流に存在する。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡへの一次転写物のプロセシング、ｍＲＮＡの安定性又は翻訳効率に影響し得る。翻訳リーダー配列の例が記載されている（例えば、ＴｕｒｎｅｒａｎｄＦｏｓｔｅｒ，（１９９５）ＭｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３：２２５－２３６を参照されたい）。

「３’非コード配列」、「転写ターミネーター」又は「終結配列」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化認識配列及びｍＲＮＡプロセシング又は遺伝子の発現に影響を及ぼすことができる、調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸区域の付加に影響を及ぼすことによって特徴付けられる。様々な３’非コード配列の使用は、Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔｅｔａｌ．，（１９８９）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ１：６７１－６８０によって例示されている。

本明細書で使用する場合、「ＲＮＡ転写物」は、ＲＮＡポリメラーゼにより触媒されるＤＮＡ配列の転写により生じる産物を指す。ＲＮＡ転写物が、ＤＮＡ配列の完全に相補的なコピーである場合、それは、一次転写物又はプレｍＲＮＡと呼ばれる。ＲＮＡ転写物が、一次転写物プレｍＲＮＡの転写後のプロセシングで得られたＲＮＡ配列である場合、それは、成熟ＲＮＡ又はｍＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ」又は「ｍＲＮＡ」は、イントロンを有しておらず、細胞によりタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡ鋳型に相補的であり、且つ逆転写酵素を使用してｍＲＮＡ鋳型から合成されるＤＮＡを指す。ｃＤＮＡは、単鎖であるか、又はＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を使用して二本鎖形態に変換され得る。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含むＲＮＡ転写物を指し、細胞内又はインビトロでタンパク質に翻訳することができる。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写物又はｍＲＮＡの全部又は一部に対して相補的であり、標的遺伝子の発現を遮断するＲＮＡ転写物を指す（例えば、米国特許第５，１０７，０６５号明細書を参照されたい）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物の任意の部分、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、イントロン又はコード配列との相補性であり得る。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ又は翻訳され得ないが、それにもかかわらず細胞内プロセスに影響を及ぼす他のＲＮＡを指す。用語「相補体」及び「逆相補体」は、ｍＲＮＡ転写物に関して本明細書では互換的に使用され、メッセージのアンチセンスＲＮＡを定義することが意図されている。

「成熟」タンパク質は、翻訳後にプロセシングされたポリペプチド（すなわち一次翻訳産物中に存在する任意のプレペプチド又はプロペプチドが除去されているもの）を指す。「前駆体」タンパク質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物（すなわちプレペプチド及びプロペプチドが依然として存在する）を指す。プレペプチド及びプロペプチドは、細胞内局在化シグナルであり得るが、これに限定されない。

タンパク質は、アミノ酸の置換、欠失、トランケーション及び挿入を含む様々な方法で改変され得る。そのような操作のための方法は、一般に知られている。例えば、タンパク質のアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡ内の変異によって調製することができる。変異誘発及びヌクレオチド配列改変の方法としては、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８－９２；Ｋｕｎｋｅｌｅｔａｌ．，（１９８７）ＭｅｔｈＥｎｚｙｍｏｌ１５４：３６７－８２；米国特許第４，８７３，１９２号明細書；ＷａｌｋｅｒａｎｄＧａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ）及びそこで引用された文献が挙げられる。タンパク質の生物学的活性に影響を与えそうにないアミノ酸置換についてのガイダンスは、例えば、Ｄａｙｈｏｆｆｅｔａｌ．，（１９７８）ＡｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ（ＮａｔｌＢｉｏｍｅｄＲｅｓＦｏｕｎｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出される。１つのアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸と交換するなどの保存的置換が好ましい可能性がある。保存的な欠失、挿入及びアミノ酸置換は、タンパク質の特性に過激な変化を引き起こさないことが予期され、置換、欠失、挿入又はこれらの組み合わせの影響は、通例のスクリーニング分析で評価することができる。

標準のＤＮＡ単離、精製、分子クローニング、ベクター構築及び検証／特徴付けの方法は、十分に確立されており、例えばＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮＹ）を参照されたい。ベクター及びコンストラクトは、環状プラスミド及び線形ポリヌクレオチドを含み、これらは、目的のポリヌクレオチド及び任意選択により、リンカー、アダプター、調節要素又は分析要素を含む他の構成要素を含む。いくつかの実施例では、目的のヌクレオチドは、イントロン、コード配列、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ及び／又は調節領域内に含有され得る。

略語の意味は、以下の通りである：「ｓｅｃ」は、秒を意味し、「ｍｉｎ」は、分を意味し、「ｈ」は、時間を意味し、「ｄ」は、日を意味し、「μＬ」は、マイクロリットルを意味し、「ｍＬ」は、ミリリットルを意味し、「Ｌ」は、リットルを意味し、「μＭ」は、マイクロモルを意味し、「ｍＭ」は、ミリモルを意味し、「Ｍ」は、モルを意味し、「ｍｍｏｌ」は、ミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」は、マイクロモルを意味し、「ｇ」は、グラムを意味し、「μｇ」は、マイクログラムを意味し、「ｎｇ」は、ナノグラムを意味し、「Ｕ」は、単位を意味し、「ｂｐ」は、塩基対を意味し、及び「ｋｂ」は、キロベースを意味する。

本明細書で開示する組成物及び方法の非限定的な実施形態は、下記の通りである：
１．選択マーカーの使用なしにドナーＤＮＡをバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムに組み込むための方法であって、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞の集団を提供することと、前記細胞の集団の少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に線状ＤＮＡコンストラクトを導入することとを含み、前記ＤＮＡコンストラクトは、上流のホモロジーアーム（ＨＲ１）及び下流のホモロジーアーム（ＨＲ２）によって隣接されるドナーＤＮＡを含み、各ホモロジーアームは、９００ヌクレオチド長又は９００ヌクレオチドを超える長さであり、前記ＤＮＡコンストラクトは、選択マーカーを含まない、方法。

２．選択マーカーの使用なしにドナーＤＮＡをバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムに組み込むための方法であって、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞の集団を提供することと、前記細胞の集団の少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に線状ＤＮＡコンストラクトを導入することとを含み、前記ＤＮＡコンストラクトは、上流のホモロジーアーム（ＨＲ１）及び下流のホモロジーアーム（ＨＲ２）によって隣接されるドナーＤＮＡを含み、各ホモロジーアームは、少なくとも９００ヌクレオチド長であり、前記ＤＮＡコンストラクトは、選択マーカーを含まない、方法。

３．選択マーカーの使用なしにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムにおけるヌクレオチド配列を除去するための方法であって、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞の集団を提供することと、前記細胞の集団の少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に線状ＤＮＡコンストラクトを導入することとを含み、前記ＤＮＡコンストラクトは、上流のホモロジーアーム（ＨＲ１）及び下流のホモロジーアーム（ＨＲ２）を含み、各ホモロジーアームは、少なくとも９００ヌクレオチド長であり、且つ除去されるヌクレオチド配列に隣接するゲノムＤＮＡ領域に対して配列相同性を有し、前記ＤＮＡコンストラクトは、選択マーカーを含まない、方法。

４．選択マーカーの使用なしにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムにおけるヌクレオチド配列を除去するための方法であって、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞の集団を提供することと、前記細胞の集団の少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に線状ＤＮＡコンストラクトを導入することとを含み、前記ＤＮＡコンストラクトは、上流のホモロジーアーム（ＨＲ１）及び下流のホモロジーアーム（ＨＲ２）からなり、各ホモロジーアームは、少なくとも９００ヌクレオチド長であり、且つ除去される前記ヌクレオチド配列に隣接するゲノムＤＮＡ領域に対して配列相同性を有し、前記ＤＮＡコンストラクトは、選択マーカーを含まない、方法。

５．各ホモロジーアームは、少なくとも９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、５０００、６０００ヌクレオチド長であり、且つ最大７０００ヌクレオチド長である、実施形態１～４のいずれかの方法。

６．線状ＤＮＡコンストラクトは、二本鎖ＤＮＡである、実施形態１～４のいずれかの方法。

７．バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌａｕｔｕｓ）及びバチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される、実施形態１～４のいずれかの方法。

８．前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞は、ＣｏｍＫ、ＣｏｍＳ又はそれらのいずれか１つの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む、導入された核酸コンストラクトの少なくとも１つのコピーによってコンピテントにされたものである、実施形態１～４のいずれかの方法。

９．前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）スーパーコンピテント株に由来する、実施形態１～４のいずれかの方法。

１０．前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）スーパーコンピテント株は、Ｐｘｙｌ－ＣｏｍＫ株である、実施形態９の方法。

１１．ドナーＤＮＡは、目的のポリヌクレオチド、目的の遺伝子、目的の遺伝子の複数のコピー、１つ若しくは複数の組換えＤＮＡ、転写調節配列、翻訳調節配列、プロモーター配列、ターミネーター配列、トランスジェニック核酸配列、メッセンジャーＲＮＡの少なくとも一部と相補的なアンチセンス配列、異種配列、ゲノムに導入される点変異を含むヌクレオチド配列又はそれらのいずれか１つの組み合わせからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、実施形態１又は２の方法。

１２．選択マーカーを含まない培地において、前記少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に由来する子孫細胞を増殖させることと、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）子孫細胞であって、そのゲノムにドナーＤＮＡ配列が安定に組み込まれているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）子孫細胞を同定することとをさらに含む、実施形態１又は２の方法。

１３．選択マーカーを含まない培地において、前記少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に由来する子孫細胞を増殖させることと、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）子孫細胞であって、そのゲノムからヌクレオチド配列が除去されているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）子孫細胞を同定することとをさらに含む、実施形態３又は４の方法。

１４．線状ＤＮＡコンストラクトは、前記上流のホモロジーアーム（ＨＲ１）及び下流のホモロジーアーム（ＨＲ２）によって隣接されるドナーＤＮＡをさらに含み、前記ドナーＤＮＡは、前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムに挿入される一方、前記ヌクレオチド配列は、前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞の前記ゲノムにおいて除去される、実施形態３又は４の方法。

１５．選択マーカーを含まない培地において、前記少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に由来する子孫細胞を増殖させることと、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）子孫細胞であって、そのゲノムからヌクレオチド配列が除去されており、且つそのゲノムにドナーＤＮＡが組み込まれているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）子孫細胞を同定することとをさらに含む、実施形態１４の方法。

１６．選択マーカーの使用なしにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムに変異を導入するための方法であって、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞の集団を提供することと、前記細胞の集団の少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に線状ＤＮＡコンストラクトを導入することとを含み、前記ＤＮＡコンストラクトは、上流のホモロジーアーム（ＨＲ１）及び下流のホモロジーアーム（ＨＲ２）によって隣接される、所望の変異を有するヌクレオチド配列を含み、前記ＤＮＡコンストラクトの前記一塩基は、前記少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）のゲノムにおける対応する一塩基と異なり、各ホモロジーアームは、少なくとも１２００ヌクレオチド長であり、前記ＤＮＡコンストラクトは、選択マーカーを含まない、方法。

１７．選択マーカーを含まない培地において、前記少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に由来する子孫細胞を増殖させることと、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）子孫細胞であって、そのゲノムに一塩基変異を有するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）子孫細胞を同定することとをさらに含む、実施形態１６の方法。

１８．所望の変異を有するヌクレオチド配列は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０塩基の修飾又は置換を含む、請求項１６の方法。

１９．ヌクレオチド配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０塩基からなる所望の変異を有する、請求項１６の方法。

開示される本開示は、以下の実施例においてさらに定義される。これらの実施例は、本開示の特定の好ましい態様を示すが、例示のためにのみ示されていることが理解されるべきである。上の議論及びこれらの実施例から、当業者であれば本開示の特徴の本質を確認することができ、またその趣旨及び範囲から逸脱することなく、本開示を様々な用途及び条件に適応させるために本開示の様々な変更形態及び変形形態をなし得る。

実施例１
選択を使用しない、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）の染色体への線状ドナーＤＮＡの組み込み
この実施例は、相同領域（ＨＲ１－ａｐｒＥ及びＨＲ２－ａｐｒＥ）によって隣接されるドナーＤＮＡ（目的の遺伝子をコードする）から構成される線状ＤＮＡコンストラクトの構築及びその後の形質転換並びにＣｏｍＫの発現のために誘導されたバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞の染色体への組み込みの頻度について説明した。目的の遺伝子（ＧＯＩ）は、リパーゼ及びプロテアーゼである。

線状ＤＮＡコンストラクトは、以下のようにゲノムＤＮＡから増幅した。ＨＲ１－ａｐｒＥ１（配列番号１）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ）由来のリパーゼ（配列番号２）、ＢＰＮ’ターミネーター（配列番号３）及びＨＲ２－ａｐｒＥ１（配列番号４）をコードする第１のコンストラクトを、オリゴ（配列番号５）及び（配列番号６）を使用するＰＣＲによって増幅して産物（配列番号７）を得た。ＨＲ１－ａｐｒＥ２（配列番号８）、Ｐ２プロモーター（配列番号９）、バチルス・ギブソニイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｇｉｂｓｏｎｉｉ）由来のプロテアーゼ（配列番号１０）、ＢＰＮ’ターミネーター（配列番号３）及びＨＲ２－ａｐｒＥ２（配列番号１１）をコードする第２のコンストラクトを、オリゴ（配列番号１２）及び（配列番号１３）を使用するＰＣＲによって増幅して産物（配列番号１４）を得た。

リパーゼ（配列番号７）又はプロテアーゼ（配列番号１４）をコードするドナーＤＮＡを組み込むためのこれらの合成線状ＤＮＡコンストラクトを、以下のようにバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））に形質転換した。発現のためにＰｘｙｌＡ誘導性プロモーターを使用してａｍｙＥ遺伝子座に導入されたＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｃｏｍＫ遺伝子（配列番号１５）を含むＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞を、１２５ｍｌのバッフル付きフラスコ内において、１５ｍｌのＬブロス（１％ｗ・ｖ^－１トリプトン、０．５％酵母エキスｗ・ｖ^－１、１％ＮａＣｌｗ・ｖ^－１）中で３７℃及び２５０ＲＰＭで一晩増殖させた。一晩培養物を、１２５ｍｌバッフルフラスコ内において、１０ｍｌの新鮮なＬブロスで０．２（ＯＤ_６００単位）に希釈した。培養物が３７℃（２５０ＲＰＭ）で０．９（ＯＤ_６００単位）に達するまで細胞を増殖させた。Ｄ－キシロースを、１０％（ｗ／ｖ）ストックから０．１％（ｗ／ｖ）になるまで添加した。細胞を３７℃（２５０ＲＰＭ）でさらに２時間増殖させた後、０．５×Ｌ－ブロス中の５０％グリセロール４ｍｌを加えて混合し、形質転換の準備ができるまで－８０℃で保存した。１００ｎｇの（配列番号７）及び（配列番号１４）ＤＮＡを１００μｌのコンピテント細胞に添加し、３７℃、１０００ＲＰＭで１時間インキュベートした後、９００μｌのＬＢを添加して細胞を１０倍に希釈する（これは１０^－１希釈である）ことにより、形質転換の準備をした。細胞をさらに４回、１０倍に希釈して１０^－５にした。次に、１０^－４及び１０^－５の希釈液１００μｌを、（配列番号７）についてはローダミンオリーブオイル寒天培地（ＲＯＡ）又は（配列番号１４）については１．６％スキムミルクを含むＬＢ寒天培地のいずれかにプレーティングした。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。リパーゼを発現している細胞は、ＲＯＡ上に濃いピンクのハローを有するピンクのコロニーとして現れ、親細胞は、白いコロニーとして現れる。プロテアーゼを発現している細胞は、ＬＢ－スキムミルク寒天培地上で透明なハローを形成する。

リパーゼをコードするドナーＤＮＡの組み込みの頻度を決定するために、ＲＯＡ上で非選択的に増殖したピンクのコロニーのパーセンテージをスコアリングした（表１）。スキムマイルドを含む非選択的ＬＢ寒天培地上のコロニーの周りのハローの存在を使用して、プロテアーゼの組み込みの頻度を決定した。表１に示されるように、コロニーの４６％がプロテアーゼの組み込みを示すハローを含むことが分かった。

実施例２
選択を使用しない、様々な長さのホモロジーアームを含む線状ＤＮＡコンストラクトを使用したバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）の染色体への線状ドナーＤＮＡの組み込み
この実施例は、様々な長さの相同領域によって隣接されるドナーＤＮＡ（目的の遺伝子をコードする）から構成される線状ＤＮＡコンストラクトの構築及びその後の形質変換並びにＣｏｍＫの発現のために誘導されたバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞の染色体への組み込みの頻度について説明した。

ａｐｒＥ遺伝子座にリパーゼを組み込むためのドナーＤＮＡ（配列番号７）及びプロテアーゼ（配列番号１４）を含むＤＮＡコンストラクトを、様々な長さのホモロジーアームを有する産物を増幅するためのＰＣＲの鋳型として使用した。鋳型、プライマー及びＨＲ１とＨＲ２の相同性の長さが表２に列挙されている。

上記の線状ドナーＤＮＡコンストラクト（配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３）を以下のようにＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に形質転換した。発現のためにＰｘｙｌＡ誘導性プロモーターを使用してａｍｙＥ遺伝子座に導入されたＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｃｏｍＫ遺伝子（配列番号１５）を含むＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞を、１２５ｍｌのバッフル付きフラスコ内において、１５ｍｌのＬブロス（１％ｗ・ｖ^－１トリプトン、０．５％酵母エキスｗ・ｖ^－１、１％ＮａＣｌｗ・ｖ^－１）中で３７℃及び２５０ＲＰＭで一晩増殖させた。一晩培養物を、１２５ｍｌのバッフルフラスコ内において、１０ｍｌの新鮮なＬブロスで０．２（ＯＤ_６００単位）に希釈した。培養物が３７℃（２５０ＲＰＭ）で０．９（ＯＤ_６００単位）に達するまで細胞を増殖させた。Ｄ－キシロースを、１０％（ｗ／ｖ）ストックから０．１％（ｗ／ｖ）になるまで添加した。細胞を３７℃（２５０ＲＰＭ）でさらに２時間増殖させた後、０．５×Ｌ－ブロス中の５０％グリセロール４ｍｌを加えて混合し、形質転換の準備ができるまで－８０℃で保存した。８０ｎｇのＤＮＡを１００μｌのコンピテント細胞に加え、３７℃、１０００ＲＰＭで１時間インキュベートした後、９００μｌのＬＢを加えて細胞を１０倍に希釈する（これは１０^－１希釈である）ことにより形質転換の準備をした。細胞をさらに４回、１０倍に希釈して１０^－５にした。次に、１０^－３、１０^－４及び１０^－５の希釈液１００μｌをＬＢ寒天培地にプレーティングした。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。

リパーゼをコードするドナーＤＮＡの組み込みの頻度を決定するために、ＲＯＡ上で非選択的に増殖したピンクのコロニーのパーセンテージをスコアリングした（表３）。スキムマイルドを含む非選択的ＬＢ寒天培地上のコロニーの周りのハローの存在を使用して、プロテアーゼの組み込みの頻度を決定した。表３に示されるように、９００ｂｐ未満のホモロジーアームの長さでは、高頻度の組み込みは得られなかった。

実施例３
選択を使用しない、様々な長さのホモロジーアームを含む線状ＤＮＡコンストラクトを使用したバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）の染色体でのマーカーを使用しない除去及び点変異
この実施例は、除去と点変異をもたらすための長さ約３ｋｂの相同領域を含む線状ＤＮＡコンストラクトの構築及びその後の形質転換並びにＣｏｍＫの発現のために誘導されたバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞の染色体での除去又は点変異の頻度について説明した。

Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｓｋｆ遺伝子座を除去するために、ＨＲ１－ｓｋｆ（配列番号３５）及びＨＲ２－ｓｋｆ（配列番号３６）配列を含むＰＣＲによって線状ＤＮＡコンストラクト（配列番号３４）を増幅した。

Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｌｉｐＡ遺伝子座を除去するために、ＨＲ１－ｌｉｐＡ（配列番号３８）及びＨＲ２－ｌｉｐＡ（配列番号３９）配列を含むＰＣＲによって線状ＤＮＡコンストラクト（配列番号３７）を増幅した。

Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のゲノムに組み込まれたプロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）ＨＲ２リパーゼ（配列番号４０）のコピーにＳ７９のアミノ酸変化を導入するために、変異原性ＰＣＲ戦略を使用した。最初に、合成Ｐ４プロモーター（配列番号４２）によって駆動されるリパーゼをコードするゲノム配列（配列番号４１）を、フォワードプライマー（配列番号１２）及びリバースプライマー（配列番号４３）を用いるＰＣＲの鋳型として使用して配列番号４４を作製した。次に、配列番号４１を、フォワードプライマー（配列番号４５）及びリバースプライマー（配列番号４６）を用いるＰＣＲの鋳型として使用して配列番号４７を作製した。最終的な線状ＤＮＡコンストラクトを作製するために、１０ｎｇの両方の断片を混合して、９８℃で３０秒間、９８℃で１０秒間を２４サイクル、７０℃で３０秒間（－０．５／サイクル）、７２℃で３．５分間、続いて７２℃で３分間インキュベートした。得られた産物を、オリゴ（配列番号１２）及び（配列番号１３）を用いるＰＣＲによって増幅して、配列番号４８の線状ＤＮＡコンストラクトを得た。

線状ＤＮＡコンストラクト（配列番号３４）、（配列番号３７）及び（配列番号４８）を、以下のようにＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に形質転換した。発現のためにＰｘｙｌＡ誘導性プロモーターを使用してａｍｙＥ遺伝子座に導入されたＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｃｏｍＫ遺伝子（配列番号１５）を含むＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞を、１２５ｍｌのバッフル付きフラスコ内において、１５ｍｌのＬブロス（１％ｗ・ｖ^－１トリプトン、０．５％酵母エキスｗ・ｖ^－１、１％ＮａＣｌｗ・ｖ^－１）中で３７℃及び２５０ＲＰＭで一晩増殖させた。一晩培養物を、１２５ｍｌバッフルフラスコ内において、１０ｍｌの新鮮なＬブロスで０．２（ＯＤ_６００単位）に希釈した。培養物が３７℃（２５０ＲＰＭ）で０．９（ＯＤ_６００単位）に達するまで細胞を増殖させた。Ｄ－キシロースを、１０％（ｗ／ｖ）ストックから０．１％（ｗ／ｖ）になるまで添加した。細胞を３７℃（２５０ＲＰＭ）でさらに２時間増殖させた後、０．５×Ｌ－ブロス中の５０％グリセロール４ｍｌを加えて混合し、形質転換の準備ができるまで－８０℃で保存した。１００ｎｇのＤＮＡを１００μｌのコンピテント細胞に添加し、３７℃、１０００ＲＰＭで１時間インキュベートした後、９００μｌのＬＢを添加して細胞を１０倍に希釈する（これは１０^－１希釈である）ことにより、形質転換の準備をした。細胞をさらに４回、１０倍に希釈して１０^－５にした。次に、１０^－３、１０^－４及び１０^－５の希釈液１００μｌを、ｓｋｆ（配列番号３４）の除去のためのＬＢ寒天培地又はｌｉｐＡ（配列番号３７）の除去及びリパーゼ（配列番号４８）点変異のためのローダミンオリーブオイル寒天培地（ＲＯＡ）にプレーティングした。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。

ｓｋｆの除去の頻度を決定するために、コロニーからのＤＮＡを、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｓｋｆ遺伝子座に特異的なプライマーを使用するＰＣＲによって増幅した。プライマー（配列番号４９）及び（配列番号５０）は、ｓｋｆ遺伝子座が正常に除去されると１２００ｂｐの産物を生成する。形質転換体のコロニーＰＣＲにより、すべてのコロニーの３１％にｓｋｆ遺伝子座の欠失があることが分かった（表４）。

Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｌｉｐＡ遺伝子の除去又は異種リパーゼの点変異の頻度を、ＲＯＡプレートの白いコロニーの頻度によって決定した。ｌｉｐＡの除去では、コロニーの２５％が白色であり、点変異では３２％が白色であることが確認された（表４）。各形質転換の白いコロニーの例は、染色体領域を増幅して、予想される除去のサイズの変化を探し、且つ点変異の部位を配列決定することによって除去又は点変異を含むことをさらに検証した。

Claims

選択マーカーの使用なしにドナーＤＮＡをバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムに組み込むための方法であって、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞の集団を提供することと、前記細胞の集団の少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に線状ＤＮＡコンストラクトを導入することとを含み、前記ＤＮＡコンストラクトは、上流のホモロジーアーム（ＨＲ１）及び下流のホモロジーアーム（ＨＲ２）によって隣接されるドナーＤＮＡを含み、各ホモロジーアームは、少なくとも９００ヌクレオチド長であり、前記ＤＮＡコンストラクトは、選択マーカーを含まない、方法。
選択マーカーの使用なしにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムにおけるヌクレオチド配列を除去するための方法であって、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞の集団を提供することと、前記細胞の集団の少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に線状ＤＮＡコンストラクトを導入することとを含み、前記ＤＮＡコンストラクトは、上流のホモロジーアーム（ＨＲ１）及び下流のホモロジーアーム（ＨＲ２）を含み、各ホモロジーアームは、少なくとも９００ヌクレオチド長であり、且つ除去される前記ヌクレオチド配列に隣接するゲノムＤＮＡ領域に対して配列相同性を有し、前記ＤＮＡコンストラクトは、選択マーカーを含まない、方法。
各ホモロジーアームは、少なくとも９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、５０００、６０００ヌクレオチド長であり、且つ最大７０００ヌクレオチド長である、請求項１又は２に記載の方法。
前記線状ＤＮＡコンストラクトは、二本鎖ＤＮＡである、請求項１又は２に記載の方法。
前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌａｕｔｕｓ）及びバチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞は、ＣｏｍＫ、ＣｏｍＳ又はそれらのいずれか１つの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む、導入された核酸コンストラクトの少なくとも１つのコピーによってコンピテントにされたものである、請求項１又は２に記載の方法。
前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）スーパーコンピテント株に由来する、請求項１又は２に記載の方法。
前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）スーパーコンピテント株は、Ｐｘｙｌ－ＣｏｍＫ株である、請求項７に記載の方法。
前記ドナーＤＮＡは、目的のポリヌクレオチド、目的の遺伝子、目的の遺伝子の複数のコピー、１つ若しくは複数の組換えＤＮＡ、転写調節配列、翻訳調節配列、プロモーター配列、ターミネーター配列、トランスジェニック核酸配列、メッセンジャーＲＮＡの少なくとも一部と相補的なアンチセンス配列、異種配列又はそれらのいずれか１つの組み合わせからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
選択マーカーを含まない培地において、前記少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に由来する子孫細胞を増殖させることと、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）子孫細胞であって、そのゲノムに前記ドナーＤＮＡ配列が安定に組み込まれているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）子孫細胞を同定することとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
選択マーカーを含まない培地において、前記少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に由来する子孫細胞を増殖させることと、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）子孫細胞であって、そのゲノムから前記ヌクレオチド配列が除去されているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）子孫細胞を同定することとをさらに含む、請求項２に記載の方法。
前記線状ＤＮＡコンストラクトは、前記上流のホモロジーアーム（ＨＲ１）及び下流のホモロジーアーム（ＨＲ２）によって隣接されるドナーＤＮＡをさらに含み、前記ドナーＤＮＡは、前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムに挿入される一方、前記ヌクレオチド配列は、前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞の前記ゲノムにおいて除去される、請求項２に記載の方法。
選択マーカーを含まない培地において、前記少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に由来する子孫細胞を増殖させることと、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）子孫細胞であって、そのゲノムから前記ヌクレオチド配列が除去されており、且つそのゲノムに前記ドナーＤＮＡが組み込まれているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）子孫細胞を同定することとをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
選択マーカーの使用なしにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞のゲノムに変異を導入するための方法であって、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）コンピテント細胞の集団を提供することと、前記細胞の集団の少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に線状ＤＮＡコンストラクトを導入することとを含み、前記ＤＮＡコンストラクトは、上流のホモロジーアーム（ＨＲ１）及び下流のホモロジーアーム（ＨＲ２）によって隣接される、前記所望の変異を有するヌクレオチド配列を含み、各ホモロジーアームは、少なくとも９００ヌクレオチド長であり、前記ＤＮＡコンストラクトは、選択マーカーを含まない、方法。
選択マーカーを含まない培地において、前記少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞に由来する子孫細胞を増殖させることと、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）子孫細胞であって、そのゲノムに前記変異を有するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）子孫細胞を同定することとをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
請求項１、２又は１４のいずれか一項に記載の方法に従って作製される、単離されたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞。