CN114292867B - 芽孢杆菌表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了芽孢杆菌表达载体及其构建方法和应用，该表达载体以pTC、pTN、pBE、pTK为出发载体将不同的启动子PlacI‑IPTG、Psrf、P43、PrepU与终止子T1T2组合分别插入上述载体中，构建四种表达载体。本发明以绿色荧光蛋白和β‑半乳糖苷酶作为报告基因明确该系列表达载体启动异源基因特征，四种表达载体均能在芽孢杆菌宿主中成功表达绿色荧光蛋白和β‑半乳糖苷酶基因，本发明构建的四种表达载体采用强启动子与强的转录终止子进行组合表达，可以在芽孢杆菌中稳定表达的转录出来的RNA，可以进行外源基因的高表达、特异性表达。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及芽孢杆菌表达载体及其构建方法和应用。
背景技术
芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，它可以进行厌氧繁殖，生成抗逆性孢子，广泛的存在于环境中。芽孢杆菌具有抗酸碱能力强、耐高温、耐高压、耐氧化、快速复活和较强分泌酶等特点，且分泌系统完善，能直接将许多蛋白分泌到培养基中；但它们同时会分泌一些蛋白酶，具有很强的蛋白降解活性，会降低外源蛋白的表达效率。
芽孢杆菌中大多数可以作为表达宿主，主要包括枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，其中枯草芽孢杆菌是目前使用最多的表达宿主。芽孢杆菌细孢只有一层膜结构，可以直接将细孢外酶分泌到培养基中，无需细孢破碎，无孢内蛋白污染，利于后续分离纯化，且表达产物折叠状态接近天然蛋白，不易形成包涵体、溶解度更好，可以更好地保持生物活性。因此，芽孢杆菌在重组蛋白的高效、经济的制备中具有独特的先天优势。目前，芽孢杆菌表达系统已经成功用于酶制剂、多肽类药物、等外源蛋白的规模化制备。
启动子是基因或操纵子的重要组成部分，是外源基因表达过程中的必需元件。启动子是RNA聚合酶与DNA结合位点，也是起始转录的区域；它的序列通常位于基因编码框的上游。目前，枯草芽孢杆菌启动子主要分为组成型启动子和诱导型启动子两大类。而目前常用芽孢杆菌表达载体表达水平较低，很多芽孢杆菌表达载体表达量不高，表达特异性不强。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种芽孢杆菌表达载体，包括四种芽孢杆菌表达载体，这四种表达载体包含了不同的启动子，均能在芽孢杆菌宿主中表达绿色荧光蛋白和β-半乳糖苷酶基因。
本发明还提供所述芽孢杆菌表达载体的构建方法和应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种芽孢杆菌表达载体，其包括芽孢杆菌表达载体pTC-PlacI-IPTGT1T2、pTN-PsrfT1T2、pBE-P43T1T2和pTK-PrepUT1T2中的任意一种，所述pTC-PlacI-IPTGT1T2、pTN-PsrfT1T2、pBE-P43T1T2和pTK-PrepUT1T2分别由不同的启动子PlacI-IPTG、Psrf、P43、Prep U及终止子T1T2分别插入pTC、pTN、pBE、pTK载体将序列中构建，所述pTC、pTN、pBE、pTK其碱基序列分别如SEQ ID NO.1-4所示；所述所述pTC-PlacI-IPTGT1T2、pTN-PsrfT1T2、pBE-P43T1T2和pTK-PrepUT1T2其碱基序列分别如SEQ IDNO.5-8所示。所述pTC、pTN、pBE、pTK含有大肠杆菌复制起点ori、芽孢杆菌热敏复制起点rep-ts、用于大肠杆菌的筛选标记基因青霉素抗性基因AmpR和相对应的抗性基因分别为氯霉素抗性基因ClR、新霉素抗性基因NeoR、红霉素抗性基因ErmR和卡那霉素抗性基因KanaR。
其中pTC、pTN、pBE、pTK四个穿梭质粒载体可在不同芽孢杆菌中进行穿梭，四个穿梭质粒载体可在不同芽孢杆菌中进行消除，四种穿梭质粒载体可在不同芽孢杆菌中共存，在先申请的中国专利202111297649.0中有明确记载。
其中，所述pTC-PlacI-IPTGT1T2表达载体含有异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导的启动子PlacI-IPTG，能与大肠杆菌的转录阻遏蛋白LacI结合，诱导下游基因的表达，该启动子序列如SEQ ID NO.9所示。
其中，所述pTN-PsrfT1T2表达载体中的Psrf为时期特异性启动子，在对数生长后期表达酶活性较高，其序列如SEQ ID NO.10所示。
其中，所述pBE-P43T1T2表达载体中P43为组成型启动子，不需要任何诱导物，可以驱动下游基因持续性表达目的蛋白的启动子，且P43启动子为强组成型启动子，该启动子序列如SEQ ID NO.11所示。
其中，所述pTK-PrepUT1T2表达载体中PrepU为组成型启动子，不需要任何诱导物，可以驱动下游基因稳定、持表达目的蛋白的启动子，通过构建胞内或分泌表达载体表达目的蛋白，该启动子序列如SEQ ID NO.12所示。
其中，所述T1T2终止子位于操纵子末端，负责控制转录的终止和目的产物的释放，该终止子序列如SEQ ID NO.13所示。
本发明所述芽孢杆菌表达载体的构建方法，包括以下步骤，从质粒pMUTIN4中获得的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导的启动子PlacI-IPTG，从质粒FZB42中获得的时期特异性启动子Psrf启动子，从质粒FZB42中获得的组成型启动子P43启动子，从质粒GFP中获得的组成型启动子PrepU启动子，从质粒pMUTIN4中获得的终止子T1T2；经过酶切和酶链接将PlacI-IPTG和T1T2插入pTC，将Psrf和T1T2插入pTN，将P43和T1T2插入pBE，将Prep U和T1T2插入pTK分别构建了表达载体pTC-PlacI-IPTGT1T2、pTN-PsrfT1T2、pBE-P43T1T2和pTK-PrepUT1T2。
其中，所述pTC、pTN、pBE、pTK载体的构建为从质粒PUC19中获得大肠杆菌复制起点ori和用于大肠杆菌筛选的氨苄青霉素抗性基因AmpR，从质粒pMarA中获得芽孢杆菌热敏复制起点rep-ts、红霉素抗性基因ErmR及卡那霉素抗性基因KanaR，从质粒载体pBEST502(ECE48)和质粒载体pSG1164(ECE155)中分别获得新霉素抗性基因NeoR和氯霉素抗性基因ClR，经过酶切和酶链接构建了系列大肠杆菌芽孢杆菌穿梭质粒载体pTC、pBE、pTN和pTK。构建的四种穿梭质粒载体可在同一个芽孢杆菌菌株中共存，说明四个载体可以在同一种芽孢杆菌中共同使用，协同作用，为后续不同外源功能蛋白在同一芽孢杆菌菌株共表达奠定基础；同时构建的穿梭质粒载体具有热不稳定性，当质粒执行完功能后，采用高温可在芽孢杆菌中进行消除，这样遗传修饰的基因芽孢杆菌将不再含有外源质粒，可防止质粒携带的抗性基因飘移，对环境友好。本发明所述芽孢杆菌表达载体在芽孢杆菌宿主中表达绿色荧光蛋白的应用。
本发明所述芽孢杆菌表达载体在芽孢杆菌宿主中表达β-半乳糖苷酶基因的应用。
具体地，本发明设计了带异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的PlacI启动子和T1T2终止子，通过PCR扩增出所需的目的片段，经过酶切和T4酶连接到穿梭质粒PTC上，最终构建成表达载体PTC-PlacL-IPTGT1T2。
设计了带有在对数生长后期表达的Psrf启动子和T1T2终止子，通过PCR扩增出所需的目的片段，经过酶切和T4酶连接到穿梭质粒PTN上，最终构建成表达载体PTN-PsrfT1T2。
设计了带有组成型的P43启动子和T1T2终止子，通过PCR扩增出目的片段，经过酶切和T4酶连接到穿梭质粒PBE上，最终构建成表达载体PBE-P43T1T2。
本发明设计了带有组成型的PrepU启动子和T1T2终止子，通过PCR扩增出目的片段，经过酶切和T4酶连接到穿梭质粒PTK上，最终构建成表达载体PTK-PrepUT1T2。
本发明中使用的组成型启动子(如P43)能够持续表达目的蛋白，不需要添加诱导物或者其他诱导条件就可以表达外源基因。这类启动子启动强度通常要求较强，且成本低，一些组成型启动子常通过构建胞内或分泌表达载体表达目的蛋白。诱导型启动子(如PlacI-IPTU)相较于组成型启动子，可根据需要在特定的诱导条件，快速诱导基因转录的“开”与“关”。诱导型启动子可以分为两类：一类与环境应答有关，如渗透压、pH值、氧气匮乏等，在这些环境下，启动子启动相应基因转录，以适应环境变化；另一类是化学诱导启动子，即受化学诱导物诱导而提高相应基因的表达量。枯草芽孢杆菌中最常见的是受异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的启动子，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)能够与大肠杆菌的转录阻遏蛋白LacI结合，使得LacI从操纵位点上脱离，从而诱导下游基因的表达。
本发明采用强启动子与强的转录终止子进行组合表达，可以稳定表达转录出来的RNA，可以进行外源基因的高表达、特异性表达。
本发明构建了一系列载体，带有不同特性的强启动子，可以强表达绿色荧光蛋白(GFP)，β-半乳糖苷酶报告基因进一步强调每个启动子的表达特征。同时本发明的出发载体里含有热敏复制起点(rep-ts)，具有热不稳定性，当质粒执行完功能后，采用高温可在芽孢杆菌中进行消除，这样遗传修饰的基因芽孢杆菌将不再含有外源质粒，可防止质粒携带的抗性基因飘移，对环境友好。
本发明的四个表达载体，两个组成型表达启动子，一个诱导型表达启动子，一个对数生长后期表达启动子，都可以强表达绿色荧光蛋白(GFP)，报告基因进一步强调每个启动子的表达特征，实现表达强度不同，可用于不同的条件和环境。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明构建的四种表达载体采用强启动子与强的转录终止子进行组合表达，可以在芽孢杆菌中稳定表达的转录出来的RNA，可以进行外源基因的高表达、特异性表达。本发明还具备不同的抗性基因，这四个表达载体质粒可以在同一个芽孢杆菌中共存，多个基因潜在协同表达。同时构建的表达质粒载体具有热不稳定性，当质粒执行完功能后，采用高温可在芽孢杆菌中进行消除，这样遗传修饰的基因芽孢杆菌将不再含有外源质粒，可防止质粒携带的抗性基因飘移，对环境友好。
本发明以绿色荧光蛋白(GFP)和β-半乳糖苷酶作为报告基因明确该系列表达载体启动异源基因特征。上述四种表达载体均能在芽孢杆菌宿主中成功表达绿色荧光蛋白和β-半乳糖苷酶基因。组成型启动子P43和PrepU均能够在早期持续表达外源蛋白基因，表达β-半乳糖苷酶酶活性分别最高达到340U/mL和280U/mL；诱导型启动子PlacI-IPTU不加IPTG诱导的酶活性最高达仅有0.012U/mL，加入IPTG诱导的酶活性最高达到450U/mL，诱导表达比例高达4500倍。Psrf启动子在对数生长后期启动表达，酶活性最高达到210U/mL。本发明提供的表达载体可用于芽孢杆菌外源基因高效表达。
附图说明
图1中A.表达载体PTC-PlacI-IPTGT1T2的构建过程；B.M、DNA 10000bp Marker,1、穿梭质粒载体PTC(5633bp)。C.M、DNA1000bp Marker,1、表达载体PTC-PlacI-IPTGTT1T2(7796bp)。
图2中A.表达载体PTN-PsrfT1T2的构建过程；B.M、DNA 5000bp Marker,1、2、穿梭质粒载体PTN(5423bp)。C.M、DNA1 000bp Marker,1、表达载体PTN-PsrfT1T2(6193bp)。
图3中A.表达载体PBE-P43T1T2的构建过程；B.M、DNA 5000bp Marker,1、2、穿梭质粒载体PBE(5536bp)。C.M、DNA 1000bp Marker,1、PBE-P43T1T2(6283bp)。
图4中A.表达载体PTK-PrepUT1T2的构建过程；B.M、DNA 5000bp Marker,1、2、穿梭质粒载体PTK(5398bp)。C.M、DNA1 000bp Marker,1、PTK-PrepUT1T2(6130bp)。
图5中A.PTC-PlacI-IPTGT1T2表达荧光蛋白(GFP)划线图；B.PTN-PsrfT1T2表达荧光蛋白(GFP)划线图；C.PBE-P43T1T2表达荧光蛋白(GFP)划线图；D.PTK-PrepUT1T2表达荧光蛋白(GFP)划线图。
图6中A.IPTG诱导下lacI启动子作用下β-半乳糖苷酶活性示意图；B.Psrf启动子作用下β-半乳糖苷酶活性示意图；C.P43启动子作用下β-半乳糖苷酶活性示意图；D.PrepU启动子作用下β-半乳糖苷酶活性示意图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
本发明中的抗性基因和人工合成多克隆位点均是现有已知基因。
本发明中使用枯草芽孢杆菌为常规的野生型菌株由淮阴工学院提供，由常规方法制备成芽孢杆菌感受态细胞。
芽孢杆菌感受态细胞制备方法
以枯草芽孢杆菌为例：具体步骤；将低温保存于甘油中的枯草芽抱杆菌JCL16划线接种于LB固体培养基，37℃培养12h；挑单菌落接种于新鲜、预热的SPC肉汤培养基中(20mL)，调整菌体浓度，使菌体OD600值约为0.5；恒温水浴振荡培养(37℃，180r/min)，每间隔30min测定一次OD值，取对数生长期的菌液2mL接种于200mL预热的SpⅡ培养基中，在恒温水浴振荡器中继续培养(37℃，180r/min)90min，8000r离心5min收集菌体沉淀；取1.8mL上清液轻轻重悬菌体沉淀，此时的枯草芽抱杆菌己呈感受态状态可直接用于转化，100μL小份分装，-20℃保存。其余三种芽孢杆菌感受态细胞制备方法相同。
本发明所用基础载体质粒PUC19、质粒pMarA、质粒载体pBEST502(ECE48)、质粒载体pSG1164(ECE155)等均购自美国芽孢杆菌遗传资源保藏中心(BGSC)。
实施例1
1、pTC穿梭质粒载体的构建
以质粒载体pSG1164(ECE155)为模板，设计带有多克隆位点(MCS)的氯霉素(ClR)抗性基因片段的引物pTCCF和pTCCR，扩增出氯霉素(ClR)抗性基因通过酶切链接(EcoRⅠ/SmaⅠ)到质粒PUC19多克隆位点；以质粒载体pMarA为模板，设计枯草芽孢杆菌热敏复制起点(rep-ts)基因片段的引物pTCMF和pTCMR，扩增出枯草芽孢杆菌热敏复制起点(rep-ts)基因通过酶切连接(SmaⅠ/PstⅠ)插入上一步的重组PUC19中；以质粒PUC19为模板，设计带有多克隆位点(MCS)的大肠杆菌复制起点(ori)和氨苄青霉素(AmpR)抗性基因的引物pTC19F和pTC19R，将pcr扩增所得到的目的产物与前两步所得到的重组质粒载体分别EcorRⅠ/KpnⅠ双酶切，将两段酶切产物与T4连接酶混合，16℃恒温过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，然后涂布于含有100mg/L氨苄青霉素抗性平板37℃过夜培养，筛选重组子，经酶切初步验证正确，送生物公司测序，序列如SEQ ID NO.1所示。
所用引物序列为：
pTCCF：
TTTGAATTCACTAGTGGGCCCAGATCTCTCGAGTTAAGCCAGCCCCGACAC
pTCCR:TTTCCCGGGTAAATATTTCTTGTGATAAAGTT
pTCMF:TTTCCCGGGGTCCAGAAGGTCGATAGAAA
pTCMR：TTTCTGCAGGGTACCGTTAAGGGATGCAT AAACTG
pTC19F：TTTGGTACCACTGGCCGTCGTTTTACAAC
pTC19R：
TTTGAATTCTCTAGAGCTAGCGGATCCCCGCGGGCATGCAAGCTTGGCGTAAT。
2、PBE载体的构建
以质粒PUC19为模板，设计带有多克隆位点的大肠杆菌复制起点(ori)和氨苄青霉素(AmpR)基因片段的引物pBE19F和pBE19R；以质粒pMarA为模板，设计带有多克隆位点的枯草芽孢杆菌热敏复制起点(rep-ts)和红霉素(ErmR)抗性基因片段的引物pBEMF和pBEMR。分别以pBE19F和pBE19R，pBEMF和pBEMR这两对引物进行PCR扩增出所需目的片段，经凝胶电泳检测大小正确，用胶回收试剂盒获得纯化的目的片段，将目的片段分别进行EcoRⅠ/KpnⅠ双酶切，将两段酶切产物与T4连接酶混合，16℃恒温过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，然后涂布于含有100mg/L氨苄青霉素抗性平板37℃过夜培养，筛选重组子，经酶切初步验证正确，送生物公司测序，序列如SEQ ID NO.2所示。
所用引物序列为：
pBE19F：TTTGGTACCACTGGCCGTCGTTTTACAAC
pBE19R:TTTGAATTCTCTAGACCATGGGGATCCCCGCGGGCATGCAAGCTTGGCGTAAT
pBEMF：
TTTGAATTCACTAGTGGGCCCAGATCTCTCGAGGTCCAGAAGGTCGATAGAAA
pBEMR:TTTGGTACCCATCGCTTTATGTTCTCGTTC。
3、pTN穿梭质粒载体的构建
以质粒载体pBEST502(ECE48)为模板，设计带有多克隆位点(MCS)的新霉素(NeoR)抗性基因片段的引物pTNNF和pTNNR，扩增出新霉素(NeoR)抗性基因通过酶切连接(EcoRⅠ/PstⅠ)插入到质粒PUC19多克隆位点；以质粒载体pMarA为模板，设计枯草芽孢杆菌热敏复制起点(rep-ts)基因片段的引物pTNMF和pTNMR，扩增出枯草芽孢杆菌热敏复制起点(rep-ts)基因通过酶切连接(PstⅠ/HindⅢ)插入到上一步的重组PUC19中；以质粒PUC19为模板，设计带有多克隆位点(MCS)的大肠杆菌复制起点(ori)和氨苄青霉素(AmpR)抗性基因的引物pTN19F和pTN19R，将pcr扩增所得到的目的产物与前两步所得到的重组质粒载体分别EcorRⅠ/KpnⅠ双酶切，将两段酶切产物与T4连接酶混合，16℃恒温过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，然后涂布于含有100mg/L氨苄青霉素抗性平板37℃过夜培养，筛选重组子，经酶切初步验证正确，送生物公司测序，序列如SEQ ID NO.3所示。所用引物序列为：
pTNNF:
TTTGAATTCACTAGTGCTAGCAGATCTCTCGAGGAGATCAGGGAATGAGTTTAT
pTNNR:TTTCTGCAGGATAATTACTAATACTAGGAGAA
pTNMF:TTTCTGCAGGTCCAGAAGGTCGATAGAAA
pTNMR:TTTAAGCTTGGTACCGTTAAGGGATGCATAAACTG
pTN19F:TTTGGTACCACTGGCCGTCGTTTTACAAC
pTN19R:TTTGAATTCTCTAGACCATGGGGATCCCCGCGGGCATGCAAGCTTGGCGTAAT。
4、pTK穿梭质粒载体的构建
以质粒载体pMarA为模板，设计带有多克隆位点(MCS)的卡那霉素(KanaR)抗性基因片段的引物pTKKF和pTKKR，扩增出卡那霉素(KanaR)抗性基因通过酶切连接(EcorRⅠ/SmaⅠ)插入到质粒PUC19多克隆位点；以质粒载体pMarA为模板，设计枯草芽孢杆菌热敏复制起点(rep-ts)基因片段的引物pTKMF和pTKMR，扩增出枯草芽孢杆菌热敏复制起点(rep-ts)基因通过酶切连接(SmaⅠ/PstⅠ)上一步的重组PUC19中；以质粒PUC19为模板，设计带有多克隆位点(MCS)的大肠杆菌复制起点(ori)和氨苄青霉素(AmpR)抗性基因的引物pTK19F和pTK19R，将pcr扩增所得到的目的产物与前两步所得到的重组质粒载体分别EcorRⅠ/KpnⅠ双酶切，将两段酶切产物与T4连接酶混合，16℃恒温过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，然后涂布于含有100mg/L氨苄青霉素抗性平板37℃过夜培养，筛选重组子，经酶切初步验证正确，送生物公司测序，序列如SEQ ID NO.4所示。
所用引物序列为：
pTKKF:
TTTGAATTCACTAGTGGGCCCAGATCTCTCGAGGATAAACCCAGCGAACCATTT
pTKKR:TTTCCCGGGATCGATACAAATTCCTCGTAG
pTKMF:TTTCCCGGGGTCCAGAAGGTCGATAGAAA
pTKMR:TTTCTGCAGGGTACCGTTAAGGGATGCATAAACTG
pTK19F:TTTGGTACCACTGGCCGTCGTTTTACAAC
pTK19R:TTTGAATTCTCTAGACCATGGGGATCCCCGCGGGCATGCAAGCTTGGCGTAAT。
实施例2
PTC-PlacI-IPTGT1T2表达载体的构建方法。
以质粒pMUTIN4为模板(购自美国芽孢杆菌遗传资源保藏中心BGSC)，设计带有异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的启动子PlacI-IPTG基因片段的引物PlacI-IPTGF和PlacI-IPTGR。以PlacI-IPTGF和PlacI-IPTGR引物进行PCR扩增出所需的目的片段，经凝胶电泳检查大小正确，用胶回收试剂盒获得纯化的目的片段，将目的片段与穿梭载体PTC(实施例1制备)进行scaII/BamHI双酶切。将两段酶切产物与T4连接酶混合，16℃恒温过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，然后涂布于含有100mg/L氨苄青霉素抗性平板37℃过夜培养，筛选重组子，经酶切初步验证正确。以质粒pMUTIN4为模板设计终止子(Terminator)基因片段的引物T1T2F和T1T2R，以T1T2F和T1T2R引物进行PCR扩增出所需的目的片段，经凝胶电泳检查大小正确，将目的片段与上一步筛选得到的正确质粒进行BgIII/XhoI双酶切。将两段酶切产物与T4连接酶混合，16℃恒温过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，然后涂布于含有100mg/L氨苄青霉素抗性平板37℃过夜培养，筛选重组子，经酶切初步验证正确。参见图1所示，并送生物公司测序，序列如SEQ ID NO.5所示。所用引物序列为：
PlacI-IPTGF：TTTCCGCGGGGAAACGAGGTCATCATTTC
PlacI-IPTGR：TTTGGATCCCACAGTAGTTCACCACCTTT
T1T2F：TTTAGATCTGAGGCATCAAATAAAACGAAA
T1T2R：TTTCTCGAGTCTAGAGCAACGTTCTTGC
实施例3
PTN-PsrfT1T2表达载体的构建方法
以质粒FZB42为模板(购自美国芽孢杆菌遗传资源保藏中心BGSC)，设计启动子Psrf基因片段的引物Psrf F和Psrf R。以Psrf F和Psrf R引物进行PCR扩增出所需的目的片段，经凝胶电泳检查大小正确，用胶回收试剂盒获得纯化的目的片段，将目的片段与穿梭载体PTN(实施例1制备)进行scaII/BamHI双酶切。将两段酶切产物与T4连接酶混合，16℃恒温过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，然后涂布于含有100mg/L氨苄青霉素抗性平板37℃过夜培养，筛选重组子，经酶切初步验证正确。以质粒pMUTIN4为模板设计终止子(Terminator)基因片段的引物T1T2F和T1T2R，以T1T2F和T1T2R引物进行PCR扩增出所需的目的片段，经凝胶电泳检查大小正确，将目的片段与上一步筛选得到的正确质粒进行BgI II/XhoI双酶切。将两段酶切产物与T4连接酶混合，16℃恒温过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，然后涂布于含有100mg/L氨苄青霉素抗性平板37℃过夜培养，筛选重组子，经酶切初步验证正确。参见图2所示，并送生物公司测序，序列如SEQ ID NO.6所示。所用引物序列为：
Psrf F：TTTCCGCGGGTACGTAAATTTTTTTCATTCT
Psrf R：TTTGGATCCTTCCATATGTGTGCGCCT
T1T2F：TTTAGATCTGAGGCATCAAATAAAACGAAA
T1T2R：TTTCTCGAGTCTAGAGCAACGTTCTTGC
实施例4
PBE-P43T1T2表达载体的构建方法。
以质粒FZB42为模板(购自美国芽孢杆菌遗传资源保藏中心BGSC)，设计启动子P43基因片段的引物P43F和P43R。以P43F和P43R引物进行PCR扩增出所需的目的片段，经凝胶电泳检查大小正确，用胶回收试剂盒获得纯化的目的片段，将目的片段与穿梭载体PBE(实施例1制备)进行scaII/BamHI双酶切。将两段酶切产物与T4连接酶混合，16℃恒温过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，然后涂布于含有100mg/L氨苄青霉素抗性平板37℃过夜培养，筛选重组子，经酶切初步验证正确。以质粒pMUTIN4为模板设计终止子(Terminator)基因片段的引物T1T2F和T1T2R，以T1T2F和T1T2R引物进行PCR扩增出所需的目的片段，经凝胶电泳检查大小正确，将目的片段与上一步筛选得到的正确质粒进行BgIII/XhoI双酶切。将两段酶切产物与T4连接酶混合，16℃恒温过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，然后涂布于含有100mg/L氨苄青霉素抗性平板37℃过夜培养，筛选重组子，经酶切初步验证正确。参见图3所示，并送生物公司测序,序列如SEQ ID NO.7所示。所用引物序列为：
P43F：TTTCCGCGGTTCCTGAAGAGCTTTGTCCA
P43R：TTTGGATCCCATGTGTACTTAATTCCTCTC
T1T2F：TTTAGATCTGAGGCATCAAATAAAACGAAA
T1T2R：TTTCTCGAGTCTAGAGCAACGTTCTTGC
实施例5
PTK-PrepUT1T2表达载体的构建方法。
以质粒GFP为模板(购自美国芽孢杆菌遗传资源保藏中心BGSC)，设计启动子PrepU基因片段的引物PrepUF和PrepUR。以PrepUF和PrepUR引物进行PCR扩增出所需的目的片段，经凝胶电泳检查大小正确，用胶回收试剂盒获得纯化的目的片段，将目的片段与穿梭载体PTK(实施例1制备)进行scaII/BamHI双酶切。将两段酶切产物与T4连接酶混合，16℃恒温过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，然后涂布于含有100mg/L氨苄青霉素抗性平板37℃过夜培养，筛选重组子，经酶切初步验证正确。以质粒pMUTIN4为模板设计终止子(Terminator)基因片段的引物T1T2F和T1T2R，以T1T2F和T1T2R引物进行PCR扩增出所需的目的片段，经凝胶电泳检查大小正确，将目的片段与上一步筛选得到的正确质粒进行BgI II/XhoI双酶切。将两段酶切产物与T4连接酶混合，16℃恒温过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，然后涂布于含有100mg/L氨苄青霉素抗性平板37℃过夜培养，筛选重组子，经酶切初步验证正确。参见图4所示，并送生物公司测序,序列如SEQID NO.8所示。所用引物序列为：
PrepUF：TTTCCGCGGGAGTTTATAAAATAAAAAAAGCA
PrepUR：TTTGGATCCCACTATTCTCATTCCCTTTT
T1T2F：TTTAGATCTGAGGCATCAAATAAAACGAAA
T1T2R：TTTCTCGAGTCTAGAGCAACGTTCTTGC
实施例6
四个表达载体可以表达绿色荧光蛋白(green fluorescent proteins，GFP)。
通过PCR扩增出绿色荧光蛋白(GFP)基因片段(NCBI编号LN515608)，经凝胶电泳检查大小正确，用胶回收试剂盒获得纯化的目的片段，将目的片段与表达载体进行双酶切(其中PTK-PrepUT1T2表达载体、PTN-PsrfT1T2表达载体、PBE-P43T1T2表达载体使用的限制性内切酶为BamHI/NcoI，PTC-PlacI-IPTGT1T2表达载体使用的限制性内切酶为NheI/SpeI)，将两段酶切产物与T4连接酶混合，16℃恒温过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，然后涂布于含有100mg/L氨苄青霉素抗性平板37℃过夜培养，筛选重组子，经酶切初步验证正确，将正确的质粒转化入枯草芽孢杆菌感受态细胞中，涂布于具有相对应的抗性平板37℃过夜培养，挑选单菌落划线。参见图5所示，证明本发明构建的四种载体均可以强表达绿色荧光蛋白，说明本发明的的四种载体可以用于外源基因的高效表达。
本发明构建的四个表达载体，两个组成型表达启动子，一个诱导型表达启动子，一个对数生长后期表达启动子，都可以强表达GFP蛋白。报告基因进一步强调每个启动子的表达特征。强启动子与强的转录终止子进行组合表达，可以在芽孢杆菌中稳定表达的转录出来的RNA，可以进行外源基因的高表达、特异性表达。本发明构建的载体还具备不同的抗性基因，这四个表达载体质粒可以在同一个芽孢杆菌中共存，多个基因潜在协同表达，同时构建的表达质粒载体具有热不稳定性，当质粒执行完功能后，采用高温可在芽孢杆菌中进行消除，这样遗传修饰的基因芽孢杆菌将不再含有外源质粒，可防止质粒携带的抗性基因飘移，对环境友好。
实施例7
四个表达载体β-半乳糖苷酶基因活性(β-galatosidase)测定。
通过PCR扩增出β-半乳糖苷酶基因片段(NCBI编号FJ906071)，经凝胶电泳检查大小正确，用胶回收试剂盒获得纯化的目的片段，将目的片段与表达载体进行双酶切(其中PTK-PrepUT1T2表达载体、PTN-PsrfT1T2表达载体、PBE-P43T1T2表达载体使用的限制性内切酶为BamHI/NcoI，PTC-PlacI-IPTGT1T2表达载体使用的限制性内切酶为NheI/SpeI)，将两段酶切产物与T4连接酶混合，16℃恒温过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，然后涂布于含有100mg/L氨苄青霉素抗性平板37℃过夜培养，筛选重组子，经酶切初步验证正确。将正确的质粒转化入枯草芽孢杆菌感受态细胞中，涂布于具有相对应的抗性平板37℃过夜培养，挑选正确表达重组菌单菌落于LB培养基中，37℃、200r/振荡培养，OD600约1时，按1％接种量转接含50mL的DSM培养基的250mL三角瓶中，继续培养48h。过滤收集菌体，充分洗涤，加入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液研磨，破壁菌液获得粗酶液，加入100μL邻硝基苯酚-β-D半乳糖苷酶(ONPG)，800μL 10.2mol/L NaCO3终止反应，测定获得酶活力。
PTC-PlacI-IPTGT1T2表达载体表达的重组菌在PlacL-IPTG启动子下的β-半乳糖苷酶活性其中不加IPTG诱导的酶活性仅有0.012U/mL，加入IPTG诱导的酶活性从9h时活性增强，在第13h时活性达到最大，活性最高达到450U/mL，诱导表达比例高达4500倍。PTN-PsrfT1T2表达载体表达的重组菌在Psrf启动子在对数生长后期启动表达，在第8h时活性增强，13h时活性达到最大，酶活性最高达到210U/mL。PBE-P43T1T2表达载体表达的重组菌在P43启动子下的β-半乳糖苷酶活性早期酶活较低，9h时活性增强，11h时活性达到最大值，酶活性最高达到340U/mL。PTK-PrepUT1T2表达载体表达的重组菌在PrepU启动子下的β-半乳糖苷酶在生长早期活性较低，8h时活性开始增强，11h时活性达到最大，酶活性最高达到280U/mL，参见图6所示，说明在不同启动子表达下，β-半乳糖苷酶报告基因的酶活力能力强度不一，本发明构建了不同酶活力能力强度表达载体。本发明构建的载体具有多种表达情况，诱导表达启动子下的表达载体可以高强度诱导表达外源蛋白基因，组合型启动子下表达载体能够在早期持续表达外源蛋白基因，对数生长后期表达启动子下表达载体可以在对数生长后期启动表达外源蛋白基因，可以满足后期实验、生产中的不同的表达要求。
序列表
<110> 淮阴工学院
<120> 芽孢杆菌表达载体及其构建方法和应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5633
<212> DNA
<213> 人工序列(PTCArtificial Sequence)
<400> 1
gaattcacta gtgggcccag atctctcgag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc 60
gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg ctcacagaca agctgtgacc 120
gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga 180
aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag 240
acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa 300
atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataataa 360
aaaaggattg attctaatga agaaagcaga caagtaagcc tcctaaattc actttagata 420
aaaatttagg aggcatatca aatgaacttt aataaaattg atttagacaa ttggaagaga 480
aaagagatat ttaatcatta tttgaaccaa caaacgactt ttagtataac cacagaaatt 540
gatattagtg ttttataccg aaacataaaa caagaaggat ataaatttta ccctgcattt 600
attttcttag tgacaagggt gataaactca aatacagctt ttagaactgg ttacaatagc 660
gacggagagt taggttattg ggataagtta gagccacttt atacaatttt tgatggtgta 720
tctaaaacat tctctggtat ttggactcct gtaaagaatg acttcaaaga gttttatgat 780
ttataccttt ctgatgtaga gaaatataat ggttcgggga aattgtttcc caaaacacct 840
atacctgaaa atgctttttc tctttctatt attccatgga cttcatttac tgggtttaac 900
ttaaatatca ataataatag taattacctt ctacccatta ttacagcagg aaaattcatt 960
aataaaggta attcaatata tttaccgcta tctttacagg tacatcattc tgtttgtgat 1020
ggttatcatg caggattgtt tatgaactct attcaggaat tgtcagatag gcctaatgac 1080
tggcttttat aatatgagat aatgccgact gtacttttta cagtcggttt tctaatgtca 1140
ctaacctgcc ccgttagttg aagaaggttt ttatattaca gctccagatc catatccttc 1200
tttttctgaa ccgacttctc ctttttcgct tctttattcc aattgcttta ttgacgttga 1260
gcctcggaac ccttaacaat cccaaaactt gtcgaatggt cggcttaata gctcacgcta 1320
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<212> DNA
<213> 人工序列(pTC-PlacI-IPTGT1T2Artificial Sequence)
<400> 5
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aaagctctag gatttttaat ggacgcagcg catcacacgc aaaaaggaaa ttggaataaa 1800
tgcgaaattt gagatgttaa ttaaagacct ttttgaggtc tttttttctt agatttttgg 1860
ggttatttag gggagaaaac ataggggggt actacgacct cccccctagg tgtccattgt 1920
ccattgtcca aacaaataaa taaatattgg gtttttaatg ttaaaaggtt gttttttatg 1980
ttaaagtgaa aaaaacagat gttgggaggt acagtgatgg ttgtagatag aaaagaagag 2040
aaaaaagttg ctgttacttt aagacttaca acagaagaaa atgagatatt aaatagaatc 2100
aaagaaaaat ataatattag caaatcagat gcaaccggta ttctaataaa aaaatatgca 2160
aaggaggaat acggtgcatt ttaaacaaaa aaagatagac agcactggca tgctgcctat 2220
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tgtctccatt acatgatagg gatactgata cagaaggtag gatgaaaaaa gagcattatc 2460
atattctagt gatgtatgag ggtaataaat cttatgaaca gataaaaata attaacagaa 2520
gaattgaatg cgactattcc gcagattgca ggaagtgtga aaggtcttgt gagatatatg 2580
cttcacatgg acgatcctaa taaatttaaa tatcaaaaag aagatatgat agtttatggc 2640
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attcaagaat atataaaatc aaatcggtat aaatctgacc gatagatttt gaatttaggt 2880
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tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga 3120
ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat ggcgcctgat 3180
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tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa cacccgctga 3300
cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc 3360
cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga gacgaaaggg 3420
cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt cttagacgtc 3480
aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca 3540
ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa 3600
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caaataacta aatagatggg ggtttctttt aatattatgt gtcctaatag tagcatttat 5940
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gcttatgcgt aggaagacga gttattaata gctgaataag aacggtgctc tccaaatatt 6060
cttatttaga aaagcaaatc taaaattatc tgaaaaggga atgagaatag tgggatcccc 6120
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<211> 1881
<212> DNA
<213> 人工序列(PlacI-IPTGArtificial Sequence)
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taactatccg ctggatgacc aggatgccat tgctgtggaa gctgcctgca ctaatgttcc 660
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acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag 1440
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gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag 1560
agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag 1620
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gttctacatc cagaacaacc tctgctaaaa ttcctgaaaa attttgcaaa aagttgttga 1740
ctttatctac aaggtgtggc ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa ttaagcttga 1800
attcccgggc ggccgccgcg gatccccagc ttgttgatac actaatgctt ttatataggg 1860
aaaaggtggt gaactactgt g 1881
<210> 10
<211> 488
<212> DNA
<213> 人工序列(PsrfArtificial Sequence)
<400> 10
gtacgtaaat ttttttcatt ctgccataac tggatattcg acagcttttc attatagttt 60
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taccctctgg atttgtcgga atttttttcg gtgtgccgca tgaaactttt cacccatttt 180
tcggtgataa aaacaatatt ttcatataaa gtgaacgtaa gtagatatat agaaatacat 240
gcagaaatag gtaaaccttt cgtgcttaca atcaatggct ttttgtcttg atttctcata 300
aatttgatgc cgcatttcgg actgcgcggg tgaacggatg acggatttcg gcggtgattg 360
aatcgggatc gtttttggag gtaagtggtt cttttggctt gagaatgagt tagggacata 420
gagggaggct gtttctaagg gagaattgac atctttatct taaaaagggg aggcgcacac 480
atatggaa 488
<210> 11
<211> 465
<212> DNA
<213> 人工序列(P43Artificial Sequence)
<400> 11
ttcctgaaga gctttgtcca tgcatggagg ggaatctgga aaacggcgcg gtcagagcgg 60
aattttcaat ttcatattac cgcggcctgc gccgttatcg tttgcggttt tctcaccggg 120
ctgagcacag ccgaatgggc cgttgttttg atgctgatcg gaggaatgct tgctttggag 180
ctgttaaata ccgcgataga gcatgttgtg gatttagtta ccgatcagta tcacccgctc 240
gcaaaagcgg caaaggacgc ggccgccgga gccgtttgcg tctttgccgt gatatcgtgt 300
atcattggtt tactcatctt cttgccgaag atatgttagc agaagattct tacaattatt 360
ttacattgcc aaaaatgggc gtgaaaaacc aatcataatt atgtaaaata aaagtgacag 420
cggtatcata caggataaag gtaagagagg aattaagtac acatg 465
<210> 12
<211> 450
<212> DNA
<213> 人工序列(PrepUArtificial Sequence)
<400> 12
gagtttataa aataaaaaaa gcacctgaaa aggtgtcttt ttttgatggt tttgaacttg 60
ttctttctta tcttgataca tatagaaata acgtcatttt tattttagtt gctgaaaggt 120
gcgttgaagt gttggtatgt atgtgtttta aagtattgaa aacccttaaa attggttgca 180
cagaaaaacc ccatctgtta aagttataag tgactaaaca aataactaaa tagatggggg 240
tttcttttaa tattatgtgt cctaatagta gcatttattc agatgaaaaa tcaagggttt 300
tagtggacaa gacaaaaagt ggaaaagtga gaccatgagc ttatgcgtag gaagacgagt 360
tattaatagc tgaataagaa cggtgctctc caaatattct tatttagaaa agcaaatcta 420
aaattatctg aaaagggaat gagaatagtg 450
<210> 13
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列( T1T2Artificial Sequence)
<400> 13
gaggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg 60
tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg ctctagctaa gcagaaggcc 120
atcctgacgg atggcctttt tgcgtttcta caaactcttg ttaactctag agctgcctgc 180
cgcgtttcgg tgatgaagat cttcccgatg attaattaat tcagaacgct cggttgccgc 240
cgggcgtttt ttatgcagca atggcaagaa cgttgctcta ga 282
Claims (1)
1.一种芽孢杆菌表达载体在枯草芽孢杆菌宿主中表达β-半乳糖苷酶基因的应用，所述芽孢杆菌表达载体包括pTC-PlacI-IPTGT1T2、pTN-PsrfT1T2、pBE-P43T1T2和pTK-PrepUT1T2，所述pTC-PlacI-IPTGT1T2、pTN-PsrfT1T2、pBE-P43T1T2和pTK-PrepUT1T2分别由不同的启动子PlacI-IPTG、Psrf、P43、Prep U及终止子T1T2分别插入pTC、pTN、pBE、pTK载体中构建，所述pTC、pTN、pBE、pTK其碱基序列分别如SEQ ID NO.1-4所示，所述pTC-PlacI-IPTGT1T2、pTN-PsrfT1T2、pBE-P43T1T2和pTK-PrepUT1T2其碱基序列分别如SEQ ID NO.5-8所示。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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