JPH09510360A

JPH09510360A - アルコール産生酵母に用いる解糖経路の酵素をコードするｄｎａ

Info

Publication number: JPH09510360A
Application number: JP7524494A
Authority: JP
Inventors: ランカシャー，ウィリアム・エドワード; ディキンソン，ジョン・リチャード; マロック，リチャード・アンソニー
Original assignee: Cardiff University College Consultants Ltd
Current assignee: Cardiff University College Consultants Ltd
Priority date: 1994-03-22
Filing date: 1995-03-22
Publication date: 1997-10-21
Also published as: AU1955495A; CA2185686A1; FI963716A; GB9405629D0; WO1995025799A1; US5786186A; BR9507156A; EP0751997A1; FI963716A0

Abstract

(57)【要約】酵母を形質転換し、酵素ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼおよび２−ケト−３−デオキシグルコネート６−ホスフェートアルドラーゼを発現可能にする；それによって、発酵において、糖質をエントナー・ドゥドロフ経路を経てピルベートに変換することができる。組換えＤＮＡは上記酵素をコードし、酵母中の酵素の転写および翻訳を促進する１種または２種以上の配列を含む。

Description

【発明の詳細な説明】アルコール産生酵母に用いる解糖経路の酵素をコードするＤＮＡ発明の分野本発明はアルコール発酵に用いる組換えＤＮＡおよび遺伝的に改良された酵母に関する。発明の背景 Saccharomyces cerevisiaeのよく知られた糖をアルコールに変換する解糖経路（Embden-Meyerhof経路、後述の反応工程Ａ参照）は、醸造、蒸留、ワイン製造、および製パン産業における重要性とそれが持つ本来の学問的魅力から多年にわたり精力的に研究されている。過去において、より多くのアルコールを産生する酵母を得る方法をみいだすために多大の努力が払われてきた。このためには、（１）生産物を最適化するためのモニター法と制御手順の開発と、（２）菌株の選択および改良プログラムの主に２つの方向がある。ベンチャーは、応々にして解糖経路そのものにしか関心がないため、酵母におけるこの経路の生理学的重要性を説明できていない。 Cuskeyらの、J.Bacteriol.（1985年、６月）162(3):865-871は、Pseudomonas の菌株への炭水化物の異化を特定する種々の遺伝子のクローニングを開示している。P.aeruginosaは、Entner-Doudoroff経路（後述の反応工程Ｂ参照）を介して炭水化物を代謝し、グルコース−６−ホスフェート脱水素酵素（ＺＷＦ）、６− ホスホグルコネートデヒドラターゼ（ＰＧＤ）および２−ケト−３−デオキシ− ６−ホスホグルコネートアルドラーゼ（ＫＧＡ）の遺伝子を持っている。Cuskey らは、ＰＧＤおよびグルコキナーゼ（ＧＬＫ）の遺伝子を含む組換えプラスミドを製造したが、クローンした断片上にＺＷＦおよびＫＧＡの構造遺伝子は存在しなかったと報告している。 Kawasakiらの、Biochem.Biophys.Res.Comm.(1982)108(3):1107-1112は、相補法による種々の酵母の解糖遺伝子のクローニングを開示している。 Banerjeeらの、J.Gen.Microbiol.(1987)133:1099-1107は、P.aeruginosaの糖新生突然変異体とフルクトース−ビスホスフェートアルドラーゼ（ＦＢＡ）、３ −ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ＮＡＤＰ連結グリセルアルデヒド− ３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）またはＫＧＡの遺伝子を有する組換えプラスミドを開示している。 WO-A-8703006は、ＣＯ₂、エタノール、および他の発酵産物の産生を増強し、バイオマスの産生を減少させるための解糖率を改善した酵母を開示している。大腸菌のｅｄａおよびｅｄｄ遺伝子（ＰＧＤとＫＧＡをコードしている）の配列はEganらの、J.Bacteriol．174:4638-4646(1992)に記載されている。これら配列の訂正されたものがCarterらの、Gene 130:155-6(1993)に開示されている。細菌系、例えばXymomonasによる燃料アルコールの生成は知られている。そのような系は基質の範囲が狭く、アルコールトレランスが低い。本発明は、より効率的に糖をエタノールに変換することができるように酵母を改良することにより、酵母細胞に利用されるエネルギーの減少を改良することを目的とするものである。発明の要約本発明の最初の目的は、ＰＧＤ（酵素委託番号4.2.1.12）およびＫＧＡ（酵素委託番号4.1.2.14）を発現することできるように酵母を遺伝的に改良することである。改良されていない酵母は、少なくとも反応工程Ａに示す酵素を発現することにより糖をエタノールに変換することができるのに加えて、反応工程Ａと異なる反応工程Ｂの最初の２つの酵素であるＺＷＦとホスホグルコネートラクトナーゼ（ＰＧＬ）を発現することができる。したがって、本発明の酵母は、酵母が触媒する発酵の一般的な基質である糖を反応工程Ｂ、すなわち、Entner-Dounoroff経路を介してピルベートに変換することができる手段を提供する。本発明の第二の目的は、ＰＧＤとＫＧＡをコードし、さらに酵母における酵素の転写と翻訳を促進する１またはそれ以上の配列を含有する新規組換えＤＮＡを提供することである。発明の説明本発明は、酵母細胞はエタノールを産生するために存在しているのではないという観察結果に基づいている。エタノールは、酵母の増殖と分裂を可能にする低酸素圧または高糖濃度の条件下で行われるエネルギー生成工程から生じる排泄産物である。酵母の培養によって生成されるプリンヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰのようなの形のエネルギーは細胞の生合成に向けられる。しかしながら、本発明においては増殖は必須ではない。醸造ならびに蒸留産業、および例えば燃料アルコールの生成において、バイオマスの生成は単なる原料物質の無駄な転換でしかない。反応工程ＡおよびＢにおいて、＊は１モルのＡＴＰが使われる反応を示し、† は１モルのＡＴＰが生成する反応をを示す（すなわち、反応工程Ａのグルコース１モルあたり２モル）。反応工程Ａの正味のエネルギー生成量はＡＴＰ２モルである。これは通常の生合成に用いられるエネルギーである。反応工程Ｂでは、正味のエネルギー生成量は１モルＡＴＰだけなので、与えられた量の出発物質に関してより効率的にエタノールが生成される。後記の反応工程は、グルコース−６−ホスフェートを介するグルコースの変換を示す。もちろんグルコースは、改良されていない酵母と本発明に従って改良された酵母によって変換することができる糖の一例に過ぎない。遺伝的な改良がなされていないSaccharomyces cerevisiaeを用いる発酵では、９５％以上のグルコース−６−ホスフェートがＰＧＩを介してフルクトース−６ −ホスフェートに変換され、ＺＷＦを介して６−ホスホグルコノラクトン（およびそこから五炭糖に）に変換されるのはほんのわずかである。反応工程Ｂおよび反応工程Ａの酵素すべてを発現するように遺伝的に改良された酵母が、ＡよりもＢを介してグルコースのような糖をエタノールに変換するかは明らかでなく、En tner-Doudoroff経路を介する変換を支持する物質や条件の使用が望ましい場合がある。反応工程Ｂによる変換を増強し得る一つの方法はＺＷＦの翻訳を促進することである。反応工程Ａを中断することが好ましく、すなわち、本発明の酵母はEmbd en-Meyerhof経路を介してグルコース−６−ホスフェートをピルベートに変換する酵素群の１つを発現することができないことが好ましい。これは、酵母ゲノムから適切な遺伝子配列を欠失させるか、または酵素のアンチセンスメッセージを転写するＤＮＡ配列を酵母中に導入することによって最も都合よく達成される。発現されない酵素はＰＦＫであることが好ましい。反応工程Ａの他の反応はすべて当該酵素を用いて可逆的（糖新生において）であるが、フルクトース−１，６−ビスホスフェートのフルクトース−６−ホスフェートへの変換はＰＦＫではなくフルクトースビスホスファターゼ（ＦＢＰ）によって触媒される。したがって、ＰＦＫの遺伝子を除去するとEmden-Meyerhof経路による解糖が阻害されるが、糖新生は阻害されない。あるいはまた、用いられている関連酵素を化学的に阻害してもよい。例えば、ＰＦＫはＡＴＰまたはクエン酸を用いて阻害してもよい。反応工程Ａは（正味）２モルのＮＡＤＨを生成する。反応工程Ｂは同じ正味の量の「還元力」を生じるが、１モルＮＡＤＨおよび１モルＮＡＤＰＨの形である（後者はグルコース−６ −ホスフェートの６−ホスホグリコノラクトンへの変換において生じる）。ＮＡＤＨはＡＤＨの特異的コファクター（共同因子）であるがＮＡＤＰＨはそうではないので、本発明の酵母はさらにＮＡＤＰＨをコファクターとして利用できるＡＤＨ（例えば、Thermoanaerobium brockiiにみられるようなＮＡＤＰＨ特異的ＡＤＨ）を発現することが好ましい。そのような酵素はZymomonas sppまたは隠れてS.cerevisiaeに存在していてもよい、後者であれば最も好ましい。本発明の酵母は、既知の改良／形質転換技術によって製造してもよい。さらに本発明の一局面を構成するこの目的のための組換えＤＮＡは関連酵素をコードするか、または適切であれば、関連酵素の欠失を含む。そのようなＤＮＡは発現を誘導するプロモーター配列を含むことが好ましいが、この配列が酵母中に天然に存在していればその必要はない。このＤＮＡは既知の技術によって構築してよい。このＤＮＡは動物、例えば、ヒトまたは家畜、食物連鎖において物質から誘導することが好ましい。本発明のＤＮＡは、例えば、ＰＧＤとＫＧＡ両方の転写および翻訳情報と選択的マーカーを包含するヌクレオチドを含み、酵母中に挿入可能なプラスミド上にあることが好ましい。ゲノム中の不要な／望ましくないＤＮＡを含まないように、所望の配列を酵母ゲノム中に組み込むことが好ましく、これは既知の手順（例えば、EP-A-0231608に記載）によって行うことができる。本発明の形質転換酵母は、市販用の蒸留酒のより効率的な製造や燃料アルコールの製造に用いてよい。既知の燃料アルコール製造システムに対する本発明の利点は、基質の範囲がはるかに広く、アルコールトレランスが増大していることである。本発明の形質転換酵母は、ビール、りんご酒、およびワインのようなアルコール飲料の発酵に使用してよい。またこの酵母はジンやウォッカのような飲用蒸留酒の発酵段階に使用してもよい。これらのどの目的にも、この酵母を固定化した形で提供することが好ましいであろう。通常の支持体および通常の固定化技術を使用してよい。本発明の酵母は、高いアルコールトレランス（例えば、１５％までかまたはそれ以上の）を持っている。したがって、この酵母は、例えば、水分含有量を減らすことによって使用および輸送が容易になる。この新規酵母またはＤＮＡは、試薬や条件を選択することによって各経路のいずれかのスイッチを入れるかまたは切る、切り替え可能な／条件付き発現系、例えば、既知のタイプの制御可能なプロモーターを含んでいてよい。例えば、既知のタイプの制御可能なプロモーターには、例えば、熱感受性の非天然のプロモーターを用いてよい。そのような系の存在によって、酵母が培養中に反応工程Ｂを、そして発酵中に反応工程Ａを利用するのを止めることが可能となる。参考文献と添付の図面と併せて以下の実施例において本発明を説明する。図１は、ClarkeとCarbon（1976）の構築した大腸菌遺伝子ライブラリーから分離されたｅｄｄおよびｅｄａ遺伝子を含むプラスミドｐＣＬ３７−４４を示す。図２は、ｚｗｆ、ｅｄｄ、およびｅｄａ座の物理的マップ（Eganら、およびCa rterらの、既述参照）と３つの転写解読枠のヌクレオチド配列を決定するのに用いる配列決定プライマーの物理的マップを示す。ベクターｐＧＥＭ７ｚｆ（＋）中にクローンされた挿入物も示している。図３は、ｅｄｄおよびｅｄａ転写解読枠と２つの遺伝子の増幅に用いる合成オリゴヌクレオチドの結合位置を示す。図４は、ｅｄａ細菌発現ベクターの構築に関する工程の模式図である。図５は、ｅｄａ酵母発現ベクターの構築に関する工程の模式図である。図６は、非機能性ＰＣＲ増幅ｅｄｄＤＮＡを包含するベクターの構築に関する工程の模式図である。図７は、ｅｄｄＤＮＡにおけるＰＣＲ誘導エラーの置換に使用する工程を示す。図８は、ｅｄｄ酵母発現ベクターの構築を示す。図９は、酵母ｅｄｄ／ｅｄａ組み込みベクターの構築を示す。図１０は、形質転換構築物を検査するためのＰＣＲ戦略（（１）37.1.6形質転換体におけるＥＤＡとＥＤＤの存在、（２）遺伝子の位置と配向、および（３）ｐＷＢ４４の組み込み部位の確認）を示す。図１１および１２は、最小合成増殖培地と醸造用麦汁培地における酵母の発酵プロフィールを現在の比重対時間（日）で示している。実施例プラスミドｐＬＣ３７−４４のサブクローニング（ClarkeとCarbon、1976）プラスミドｐＬＣ３７−４４は大腸菌ＪＡ２００株から分離された大腸菌遺伝子ライブラリー由来のクローン（Thomsonら、1979）であり、Entner-Doudoroff 経路の遺伝子ｅｄａおよびｅｄｄを含有することが知られている（ClarkeとCarb on、1976）。遺伝子ｅｄａおよびｅｄｄはそれぞれ酵素２−ケト−３−デオキシ −６−ホスホグルコネートアルドラーゼ（ＫＧＡ）と６−ホスホグルコネートデヒドラターゼ（ＰＧＤ）をコードしている。ｐＬＣ３７−４４の物理的マップを制限エンドヌクレアーゼ開裂分析によって作製し、図１に示す。通常の組換えＤＮＡ法と公的に利用可能な物質を用いてサブクローンを得た。制限酵素は特記しない限りすべてIBIまたはGibco BRLから購入した。Ｔ４ポリメラーゼとＴ４ＤＮＡリガーゼはPharmaciaから得た。より小さな断片（図２参照、EganらおよびCarterら、既述も参照）はPromega から得たｐＧＥＭ７ｚｆ（＋）中にサブクローンした。サブクローンは大腸菌ＪＭ１０９株中で維持した（Yanisch-Perronら、1985）。細胞抽出物の調製大腸菌株は２０ｍＭグルコースまたはグルコン酸ナトリウムを含む最小培地中、３７℃で増殖させた。標準最小培地の組成（ｇ／Ｌ蒸留水）は、ＫＨ₂ＰＯ₄，５；（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄（ｐＨ７．２に調整），１；ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，０．０５；およびＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，０．００５である。マグネシウム塩および鉄塩を５％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ₄・Ｈ₂Ｏおよび０．５％（ｗ／ｖ）ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂ Ｏの溶液として別々に滅菌し、これらをすでに滅菌した他の成分に無菌的に加えた。１％摂取物を１８時間培養して増殖させた後、Sigma 4K10遠心器で7000rev／分にて１５分間遠心し、培養物３００ｍＬを回収した。回収した細胞は１５ｍＭリン酸緩衝液で２回洗浄し、１ｍＭＤＴＴ（ジチオスレイトール）を含有する２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）２０ｍＬに再懸濁し、氷冷貯蔵した。２０μｍで操作するチタニウムプローブ（チップ直径９．５ｍｍ）付MSE Soni prep 150超音波破砕器を用い、洗浄細胞懸濁液２０ｍＬを総ばく露時間１．６７分で超音波処理した。細胞懸濁液を含む容器の周りを氷と海塩で囲んだ。超音波処理は冷却しながら９９秒間隔で２０秒間の短時間行った。２回目と４回目のインターバル中に冷却処理を温度計でモニターし、細胞懸濁液の温度が４℃以下に下がるのを待って次の超音波処理を行なった。破砕した細胞は、Bechman L8-70M超遠心器を用い、100000ｇにて９０分間遠心した。上清をデカントし、氷冷貯蔵した。酵素アッセイはNarbadら（1988）の記載に従って実施した。Kontron Uvikon 8 60分光光度計を用い１ｍＬキュベット中で反応を行った。表１の結果は、クローンした断片を持っていない菌株では、ＥＤ経路の酵素はグルコネートを用いる増殖中にのみ誘導され、染色体にコードされた酵素の発現はグルコースを用いる増殖中抑制されたことを示している。クローン１またはクローン２プラスミドのいずれかで形質転換したJM109細胞において、高レベルのＥＤ経路酵素がグルコースを用いる増殖中に検出され、プラスミドにコードされた酵素が構成的に発現することが示された。ｅｄａ転写解読枠の増幅オリゴヌクレオチドの合成はApplied Biosystems（ABI381A）DNA合成装置を用いて行った。ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を組み込み、ｅｄａ開始コドンの上流のコドンをＡＡＡに改変するために、天然の染色体配列から改変体を作製した。この改変はｅｄａ遺伝子が酵母中で発現する場合に重要である。ｅｄａ遺伝子は以下のポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて増幅された：精製クローン２ＤＮＡ（図２）５０ｎｇ、合成オリゴヌクレオチド各０．４ｎｇ、ＰＣＲ反応緩衝液（１０×）（Perkin-Elmer）１０μＬ、Ｔａｑポリメラーゼ（Perkin-Elmer）２単位（水１００μＬ中）、および鉱物油（６０μＬ）を０．５ｍＬ微量遠心管中で混合した。Perkin-Elmer熱サイクラーを用いて以下のサイクル条件を作製した：第一サイクル９０℃２分、第二サイクル９２℃／２分、５５℃／３分、８２℃／２分、さらに次の２８サイクルは９０℃／２分、５３℃ ／３分、および７２℃／２分。反応混合物を平板ゲル電気泳動（Maniatisら、1982、159頁）で分析すると６６０塩基対の単一バンドが認められた。ゲルからのＤＮＡの精製は、ＩＢＩ電気溶出装置を取り扱い説明書に従って使用し、３Ｍ酢酸ナトリウムを用いて行った。ＭＳＥ微量遠心器中で13000rpm、４℃で１０分間ＤＮＡを遠心した。上清を注意して除去し、ＤＮＡに７０％（ｖ／ｖ）エタノール５００μＬを加えた。試料を注意深く混合し、内容物を既述のごとく再遠心した。第二の７０％ｖ／ｖエタノール添加および遠心後、ＤＮＡを乾燥し、滅菌水６μＬ、１０×制限緩衝液Ｃ（ＩＢＩ）２μＬ、およびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ（ＩＢＩ）２０単位中に再懸濁し、３７℃の水浴中で３時間インキュベーションした。６０分後、反応混合物に４０ｍＭスペルミジン２μＬを加えた。この混合物を、既述のごとく平板ゲル電気泳動を用いて再度精製し、電気溶出した。eda細菌発現ベクターの構築第４図に示すように、eda ＰＣＲ増幅産物をｐＫＫ２２３−３(Ｐharmacia)にクローニングすることにより、eda細菌発現ベクターｐＫＫＥＤＡを構築した。１０Ｘ反応緩衝液Ｃ(ＩＢＩ)２μlを加えた全反応体積２０μlのＩＢＩ中、ベクターｐＫＫ２２３−３(６００μg)をＥcoＲＩ(２０単位)で切断した。その混合物を３７℃で３時間インキュベートしたが、４０mＭスペルミジン２μlを６０分後に加えた。平面アガロースゲル電気泳動を利用して、切断したベクターをゲル精製した(Ｍaniatisら、１９８２年、１５９頁)。４５８５塩基対のシングルバンドを切り取り、ＩＢＩ電気溶出装置を用いて電気溶出した。製造業者の説明書に記載されているように、ＤＮＡのレタデーションおよび沈降には３Ｍ酢酸ナトリウムを使用した。次いで、ＤＮＡを先に記載したように７０％Ｖ／Ｖエタノール中で洗浄して、滅菌蒸留脱イオン水６μlに再び懸濁させた。 edaコード領域を含むＤＮＡフラグメントのプラスミドｐＫＫ２２３−３への連結を以下の反応混合物中で行った。 eda ＰＣＲフラグメント１μl(３００μg) ＥcoＲＩ切断したｐＫＫ２２３−３２μl(２００μg) １０Ｘ連結緩衝液(Ｐharmacia) １μl Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Ｐharmacia) ０.５μl １０mＭＡＴＰ１μl 水４.５μl 上記の反応混合物を１０℃で１６時間インキュベートした。連結後、その混合物を２０ＸＳＳＣ(Ｍaniatisら、１９８２年、３９６頁)５μlおよび滅菌蒸留脱イオン水９５μlで１００μlに希釈した。連結混合物の大腸菌ＪＭ１０５株への形質転換は、Ｍaniatisら、１９８２年、２５０頁により記載されている通りであった。形質転換体混合物を、５０μg ／mlアンピシリンを添加したＬＢ寒天に接種し、３７℃で一晩インキュベートした後に５００個の形質転換細胞を得た。コロニーハイブリダイゼーションを１００個の形質転換細胞で行った(Ｍaniatisら、１９８２年、３２４頁)。ランダムにプライムされたα³²Ｐ−ｄＣＴＰ eda ＰＣＲ増幅産物を使用して、これらの形成転換細胞からＤＮＡをプローブした。ｐＫＫ２２３−３プラスミド中にeda挿入断片を有していない形質転換細胞のものと比較したそれらのシグナル強度により、陽性の可能性のあるedaクローンを検出した。１００個の形質転換細胞のうち、２６個が陽性反応を示した。小規模のプラスミド単離をこれらの２６個のクローンで行った(Ｍaniatisら、１９８２年、２５０頁)。挿入されたＤＮＡの方向を確証するために、１０Ｘ反応緩衝液２μlを含む全反応体積２０μl中、eda陽性プラスミドをＰvul制限エンドヌクレアーゼ（１０単位）で切断（開裂）した。その反応物を３７℃で３時間インキュベートした後、平面アガロースゲル電気泳動により分析した(Ｍaniatisら、１９８２年、１５９頁)。挿入されたedaを含むプラスミドｐＫＫ２２３−３を２回切断した(第４図)。eda遺伝子を正しい方向で含むプラスミドは、７７３塩基対フラグメントの存在により特徴付けられた。間違った方向でのeda挿入断片は、１０２５塩基対フラグメントの存在により特徴付けられる。２６個の形質転換細胞のうち５つは、eda遺伝子を正しい方向で有していた。これらの正しく方向づけられたプラスミドは、ｐＫＫＥＤＡと名付けられた。大腸菌におけるeda発現の確認大腸菌Ｎ３０４１株は、eda遺伝子産物を産生しない(Ｓhurvintonら、１９８４年)。５つの、正しい方向にedaを含むｐＫＫ２２３−３プラスミドを菌株Ｎ３０４１に形質転換した(Ｍaniatisら、１９８２年、２５０頁)。形質転換細胞を選択した。Ｎ３０４１における、正しい方向にクローンされたedaを有するｐＫＫ２２３−３(ｐＫＫＥＤＡ)の存在は、野生型の表現型、すなわち、機能的eda 遺伝子産物をもたらした。プラスミドｐＫＫＥＤＡに含まれるeda遺伝子の配列決定を行った。決定されたヌクレオチド配列は、以下のことを除き、プラスミドｐＬＣ３７−４４において見い出される通りであった：該遺伝子のＰＣＲ増幅に用いた合成オリゴヌクレオチドによる５'および３'末端での変化(第２図参照)；およびリジンをコードするコドンＡＡＡが、同じくリジンをコードするＡＡＴに変化した２９８８位での変化(Ｃarterら)。この保存的な変化は、edaタンパク（ＫＧＡ）のアミノ酸配列に対する変化を何らもたらさなかった。eda酵母発現ベクターの構築酵母発現プラスミドｐＣＨ１００(Ｃ.Ｈadfieldら、１９８７年)およびｐＫＫＥＤＡを以下のようにしてＥcoＲＩで切断した：プラスミドＤＮＡ１μgを、Ｅc oＲＩ制限エンドヌクレアーゼ(ＩＢＩ)２０単位、全反応体積２０μl中の１０Ｘ反応緩衝液Ｃ２μlで切断した。その混合物を３７℃で３時間インキュベートした。６０分インキュベートした後、４０mＭスペルミジン２μlを加えた。消化されたプラスミドを平面アガロースゲル電気泳動により分析した(Ｍaniat isら、１９８２年、１５９頁)。ｐＫＫＥＤＡから得られた６６０塩基対フラグメントおよびｐＣＨ１００の７４９０塩基対フラグメントをゲルから切り取った。製造業者の説明書で記載されている通り、両方のフラグメントをＧeneclean I Iキット(ＢＩＯ１０１、ＣＡ、ＵＳＡ)により精製した。 eda遺伝子フラグメント、およびベクターｐＣＨ１００の連結を以下の反応混合物中で行った。 eda ＤＮＡ３μl(２００ng) ｐＣＨ１００ＤＮＡ３μl(１００ng) １０Ｘリガーゼ緩衝液(Ｐharmacia) １μl Ｔ４ＤＮＡリカーゼ(Ｐharmacia) １μl １０mＭＡＴＰ１μl 水１μl 反応混合物を１５℃で１６時間インキュベートした後、滅菌水で５０μlに希釈した。大腸菌ＪＭ１０９株(Ｙanisch−Ｐerronら、１９８５年)を、Ｍaniatisら、１９８２年、２５０頁により記載されている上記の連結反応で形質転換した。形質転換細胞の選択を、５０μg／ml アンピシリンを添加したＬＢ寒天で行った。プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。３００個の形質転換細胞を、５０μg／ml アンピシリンを添加した２つのＬＢ寒天プレートに再び塗抹した。コロニーハイブリダイゼーションを形質転換細胞で行った。α³²Ｐ−ｄＣＴＰの、ランダムにプライムされた精製eda ＤＮＡを使用して、形成転換細胞ＤＮＡをプローブした。大腸菌は染色体上にこの遺伝子を１コピーだけ持っているため、プラスミドが保持するこの遺伝子の複数のコピーによる強度がバックグラウンド以上となるものを探した。２６個の形質転換細胞がオートラジオグラフにおいて明らかな強度の増大を示した。小規模のプラスミド単離をこれらの２６個の陽性ed aクローンで行った。以下の混合物中、その２６個のプラスミドを制限エンドヌクレアーゼＳphＩおよびＰstＩ(ＩＢＩ)で消化することにより、edaフラグメントの方向を決定した。プラスミドＤＮＡ８μl(２００ng) ＳphＩ１μl(１０単位) ＰstＩ１μl(１０単位) １０Ｘ反応緩衝液Ａ(ＩＢＩ) ２μl 水８μl 反応物を３７℃で３時間インキュベートした。次いで、その反応物を平面アガロースゲル電気泳動により分析した。正しい方向で挿入されたedaフラグメントを有するプラスミドは８００塩基対フラグメントを生じるが、間違った方向では１０５０塩基対フラグメントを生じた(第５図)。正しく方向づけられたプラスミドは、ｐＷＢ３７と名付けられた。edd転写解読枠の増幅ポリメラーゼチェインリアクション(ＰＣＲ)法を用い、２つの遺伝子に隣接する新たに導入されたＥcoＲＩ部位を用いて、edd遺伝子の完全なコード配列を細菌ベクターｐＫＫ２２３−３にサブクローンした。Ａpplied Ｂiosystems ＡＢ１３８１ＡＤＮＡ合成装置を用いて、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。上記プライマーを、ＡＴＧ開始コドンの３塩基上流をＡに変えるよう設計した。このことにより、酵母における遺伝子の発現効率が改良されるであろう。以下のＰＣＲ反応条件を使用して、精製したクローン２のＤＮＡからedd遺伝子を増幅した。０.５mlの微量遠心分離管中、精製したクローン２のＤＮＡ(５０ng)、各々の合成オリゴヌクレオチド０.４mg、ＰＣＲ反応緩衝液１０Ｘ(Ｐerkin−Ｅl mer)、Ｔaqポリメラーゼ(Ｐerkin−Ｅlmer)２単位、水１００μlまで、およびＰＣＲクルード鉱油(６０μl)を混合した。Ｐerkin-Ｅlmer熱循環機を以下の循環条件で用いた：第１循環、９２℃で２分間；第２循環、９２℃／２分、５３℃／３分、７２℃／２分；さらに９０℃／２分、５３℃／３分、７２℃／２分で２８循環続けた。増幅したedd ＤＮＡを平面アガロースゲル電気泳動により精製した (Ｍaniatisら、１９８２年、１５９頁)。そのゲルから１８００塩基対フラグメントを切り取り、ＩＢＩ電気溶出装置を用いて電気溶出により精製した。製造業者の説明書に記載されているように、ＤＮＡの捕獲および沈降には３Ｍ酢酸ナトリウム−エタノールを使用した。ＭＳＥミクロ遠心分離機中、ＤＮＡを４℃ 、１３,０００rpmで１０分間遠心分離した。上清を注意深く取り除いて、そのＤＮＡに７０％Ｖ／Ｖエタノール５００μlを加えた。試料を注意深く混合して、内容物を先のように再び遠心分離した。もう一度、７０％Ｖ／Ｖエタノールを加えて遠心分離した後、そのＤＮＡを乾燥して、滅菌水６μl、１０Ｘ制限緩衝液Ｃ (ＩＢＩ)２μl、およびＥcoＲＩ制限エンドヌクレアーゼ(ＩＢＩ)２０単位に再び懸濁させた後、水浴中、３７℃で３時間インキュベートした。６０分後、その反応混合物に４０mＭスペルミジン２μlを加えた。平面ゲル電気泳動を利用し、その混合物を再び精製して、先のように電気溶出した。edd細菌発現ベクターの構築 eddコード領域を含むＤＮＡフラグメントのプラスミドｐＫＫ２２３−３への連結を以下の反応混合物中で行った。 edd ＰＣＲフラグメント１μl(３００mg) ＥcoＲＩ切断したｐＫＫ２２３−３２μl(２００mg) １０Ｘ連結緩衝液(Ｐharmacia) １μl Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Ｐharmacia) ０.５μl １０mＭＡＴＰ１μl Ｈ₂Ｏ４.５μl 上記の反応物を１５℃で１６時間インキュベートした後、全量５０μlとなるまで希釈した。連結混合物を使用して、先に記載したようにＪＭ１０９を形質転換した(Ｍaniatisら、１９８２年、２５０頁)。アンピシリン(５０μg/ml)を添加したＬＢ寒天上、３７℃で２４時間培養することにより、形質転換細胞を選択した。無作為に選んだ形質転換細胞について、ｐＫＫ２２３−３中に正しい方向でedd挿入物が存在しているかを分析した。プラスミド単離を先に記載したように行った(Ｍaniatisら、１９８２年、２５０頁)。１０Ｘ反応緩衝液Ｅ(ＩＢＩ) ２μlを含む全反応体積２０μl中、プラスミドＤＮＡ３００ngをＳmaＩ制限エンドヌクレアーゼ(１０単位)で切断することにより、挿入断片の方向を決定した。３７℃で３時間インキュベートした後、そのようにして産生されたフラグメントを平面アガロースゲル電気泳動により分析した(Ｍaniatisら、１９８２年、１５９頁)。正しく方向づけられたクローンは１３３２塩基対フラグメントを生じるが、間違った方向のものは４８０塩基対フラグメントを生じた。正しく方向づけられたプラスミドは、ｐＫＫＥＤＤと名付けられた(第６図)。ｐＫＫＥＤＤにおけるＰＣＲ増幅eddクローンのＤＮＡ配列決定を行い、エラーを見い出した。これらのエラーは、リジン(ＡＡＡ)コドンを終止コドン(ＴＡＡ)に変えた(第２図中、９３１位)。第７図に示す図式を用いて、eddコード配列を修復した。先に記載したようにＥcoＲＩで消化することにより、ｐＫＫＥＤＤから得られたedd遺伝子を含むＥcoＲＩフラグメントを切断して取り出した。ベクターｐＩＣ１９Ｒもまた、ＥcoＲＩで消化した。特定部位が切断されたフラグメントを平面アガロースゲル電気泳動により分離した(Ｍaniatisら、１９８２年、１５９頁 )。製造業者の説明書に記載されているように、ＩＢＩ電気溶出装置および３Ｍ酢酸ナトリウムを使用して、edd遺伝子を含む１８０塩基対フラグメントおよび線状化されたｐＩＣ１９Ｒを電気溶出した。４℃、１３,０００rpmで遠心分離してＤＮＡをペレットとし、上清を取り除いた。そのＤＮＡに７０％Ｖ／Ｖエタノール５００μlを加えて、穏やかに撹拌した。再び遠心分離してＤＮＡを再びペレットとした後、エタノールを取り除き、ＤＮＡを乾燥して、微量のエタノールを取り除いた。そのＤＮＡを滅菌蒸留脱イオン水１０μlに再び懸濁させた。以下の反応混合物を用いて、線状化されたｐＩＣ１９Ｒベクターおよびedd遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを連結した(Ｍaniatisら、１９８２年、３９２頁) 。 edd ＤＮＡ５μl(３００ng) ＥcoＲＩ切断したｐＩＣ１９Ｒ２μl(２００ng) １０Ｘ連結緩衝液(Ｐharmacia) １μl Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０.５μl １０mＭＡＴＰ１μl 水０.５μl 反応物を１５℃で１６時間インキュベートした。連結後、その混合物を２０ＸＳＳＣ(Ｍaniatisら、１９８２年)５μlおよび滅菌蒸留脱イオン水８５μlで１００μlに希釈した。大腸菌ＪＭ１０９株をＭaniatisら、１９８２年、２５０頁に記載されているように形質転換した。形質転換細胞を、アンピシリン(５０μg ／m l)、および０.１５mg／ml ５−ブロモ−４−クロロ−３−ヨード−ＢＤ−ガラクトピラノシド(Ｘ−Ｇal)、および０.２５mg／ml イソプロピル−ＢＤ−チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)を添加したＬＢ寒天で選択した。その選択培地を３７ ℃で２４時間インキュベートした。可能性のあるクローンを、上記培地上での白色の外観により選択した。 edd遺伝子が挿入されたｐＩＣ１９Ｒを有する、無作為に選んだ白色のコロニーについて、小規模のプラスミド単離(Ｍaniatisら、１９８２年、３６８頁)を行った。制限エンドヌクレアーゼＳphＩおよびＡccＩで開裂させることにより、 eddヌクレオチド配列中にＰＣＲ法によって生じた誤りを含むedd遺伝子の中心( １５４５塩基対)部分を取り除いた。クローン１のプラスミドＤＮＡ(第２図)を上記のように単離し、制限酵素ＳphＩおよびＡccＩで消化して、中心領域の天然 edｄＤＮＡを切断した。平面アガロースゲル電気泳動を利用して、消化されたＤＮＡを分離した(Ｍaniatisら、１９８２年、１５９頁)。クローン１から切断したedd ＤＮＡのフラグメント、およびedd遺伝子の「末端」を含むｐＩＣＥＤＤの２９５５塩基対フラグメントをゲルから切り取り、先に記載したように電気溶出により精製した。２つのフラグメントを以下の反応により連結させた。ｐＩＣＥＤＤ１ＤＮＡ(ＳphＩ／ＡccＩ) ４μl(３００ng) edd ＤＮＡ(ＳphＩ／ＡccＩ) ３μl(２００ng) １０Ｘリガーゼ緩衝液(Ｐharmacia) １μl Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Ｐharmacia) １μl １０mＭＡＴＰ１μl 上記反応物を１５℃で１６時間インキュベートした後、滅菌蒸留脱イオン水で全量５０μlに希釈した。先に記載したように、連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した(Ｍaniatisら、１９８２年)。形質転換細胞を、５０μg／ml アンピシリンを添加したＬＢ寒天で選択した。４５０個の形質転換細胞のうち、１００個を、５０μg／ml アンピシリンを添加したＬＢ寒天に再び接種した。これらの再び接種した形質転換細胞のうち２０個を無作為に選び、小規模のプラスミド単離を行った(Ｍaniatisら、１９８２年、３６８頁)。１０Ｘ反応緩衝液Ｃ(ＩＢＩ)２μlを含む全反応体積２０μl中、これらのプラスミド(各々、３００ng) をＥcoＲＩ(２０単位)で消化した。その反応物を３７℃で３時間インキュベートした後、平面アガロースゲル電気泳動により分析した(Ｍaniatisら、１９８２年、１５９頁)。ＥcoＲＩによって生じた１８００塩基対のフラグメントを含む組換えプラスミドは、ＰＣＲ法によって生じたedd遺伝子の「末端」に連結したクローン１由来のedd ＤＮＡを含んでいた。このプラスミドは、ｐＩＣＥＤＤ１と名付けられた。edd酵母発現ベクターの構築 edd遺伝子の転写解読枠を細菌(tac)または酵母／細菌プロモーター(ＡＤＨＩ) のいずれかの隣にクローンしようとする試みは全て失敗した。プロモーターと逆の方向になったクローンしか得られなかった。こういった困難は、edd遺伝子発現の産物である酵素６−ホスホグルコネートデヒドラターゼの活性によって生成された化合物である２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコネート(ＫＤＰＧ)の毒性により生じた。この毒性の問題を克服するため、非常に厳格に調節された酵母プロモーターＴＨＩ４の下流にedd遺伝子転写解読枠をクローンした。さらに用心のため、この新規シャトルベクターは、eda発現ベクターを持つ大腸菌菌株に形質転換された。edaの遺伝子産物は、ＫＤＰＧを無毒性のピルベートとグリセルアルデヒド− ３−ホスフェートとに分解する。この戦略では、edaを含むプラスミド上の選択マーカーとは別の、大腸菌と酵母の両方に対する選択マーカーを有するようにed dシャトルベクターを設計する必要があった。第８図は、このベクター(ｐＦＬＡＮ１０)の段階的な構築を示す。第８図に示すｐＦＬＡＮ１０ベクターは、最初にｐＦＬ３８から誘導される。ＳalＩおよびＨindIIIを用い、ｐＦＬ３８の１８塩基対フラグメントを以下のように取り除く。ｐＦＬ１３８精製ＤＮＡ(ＳphＩ／ＡccＩ) ４μl(５００ng) ＳalＩ（１０単位）１μl ＨindIII(１０単位) １μl １０Ｘ反応緩衝液Ａ２μl 水１２μl 反応混合物を３７℃で３時間インキュベートした。６０分後、４０mＭスペルミジン２μlを加えた。その反応混合物を、平面アガロースゲル電気泳動、電気溶出により精製して、(先に記載したように)７０％ｖ／ｖエタノールで洗浄した。１０Ｘ反応緩衝液Ａ(ＩＢＩ)２μlを含む全量２０μl中、ベクター５００n gをＳalＩ１μl(１０単位)およびＨindIII１μl(１０単位)で消化することにより、このベクターから、ｐＣＨ９８から得られたＡＤＨ１プロモーター／ＣＹＣ１ターミネーターカセット(Ｃ.Ｈadfieldら、１９８７年)を切断した。３７℃で３時間インキュベートし、４０mＭスペルミジン２μlを６０分後に加えた。消化物を平面アガロースゲル電気泳動により分析した。１１００塩基対フラグメントをゲルから切り取り、電気溶出により精製して、先に記載したように７０％ｖ／ｖエタノールで洗浄した。以下の反応を利用して、１１００塩基対フラグメントのＡＤＨ１プロモーター／ＣＹＣ１ターミネーターを線状化されたｐＦＬ３８に結合させた：上記のように精製したｐＦＬ３８２μl(２００ng)、ＡＤＨ１／ＣＹＣ１フラグメント４μ l(３００ng)、１０Ｘリガーゼ緩衝液(Ｐharmacia)１ml、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ( Ｐharmacia)１μl、１０mＭＡＴＰ１μlを１５℃で１６時間インキュベートした後、滅菌蒸留脱イオン水で５０μlに希釈した。連結混合物を使用して、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した(Ｍaniatisら、１９８２年、２５０頁)。５０μg ／mlアンピシリンを添加したＬＢ寒天で培養した後、６個の形質転換細胞を検出した。小規模のプラスミド単離を６個の形質転換細胞で行った(Ｍaniatisら、１９８２年、２５０頁)。プラスミドＤＮＡの消化を以下のように行った：形質転換細胞ＤＮＡ３００ngを、ＳalＩ１μl(１０単位)、ＨindIII１μl(１０単位)、滅菌蒸留脱イオン水で２０μlとした反応緩衝液Ａ(ＩＢＩ)２μlと共に３７℃で３時間インキュベートした。平面アガロースゲル電気泳動による分析を先に記載したように行った。得られた６個の形質転換細胞は全て、１１００塩基対のＡＤＨ１／ＣＹＣ１フラグメントを含むことが明らかになった。このプラスミドは、ｐＦＬＡＮ１と名付けられた(第８図)。プラスミドｐＦＬＡＮ１を以下のように調製した：プラスミドｐＦＬＡＮ１ＤＮＡ(３００ng)を制限エンドヌクレアーゼＸmn１(１μl、１０単位)で消化した。この唯一の開裂部位は、ｐＦＬＡＮ１のアンピシリン耐性遺伝子内にある。１Ｘ反応緩衝液Ａ(ＩＢＩ)中、ＧenＢlock ＤＮＡ３００ngをＨincII制限エンドヌクレアーゼ１０単位で消化することにより、ＧenＢlockプラスミド(Ｐharmacia) からのカナマイシン耐性遺伝子を含む１３００塩基対フラグメントを開裂させた。両方の反応から得られた制限フラグメントを先に記載したように平面アガロースゲル電気泳動により分離した。線状化されたｐＦＬＡＮ１プラスミドおよびＧ enＢlockから得られた１３００塩基対フラグメントをゲルから切り取り、Ｌangr idgeら（１９８０年）の記載に従ってＣＴＡＢ／ブタノールを用いて精製した。２つの精製フラグメントを以下のように連結した：ｐＦＬＡＮ１ＤＮＡ(２００ ng)、１３００塩基対のカナマイシン耐性遺伝子を含むフラグメント(２００ng) 、１０Ｘリガーゼ緩衝液(Ｐharmacia)(１μl)、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Ｐharmac ia)(１μl)、１０mＭＡＴＰ(１μl)を滅菌蒸留脱イオン水で１０μlとした。その反応混合物を１５℃で１６時間インキュベートした後、滅菌蒸留脱イオン水で５０μlに希釈した。連結混合物を使用して、大腸菌ＪＭ１０９株をＭaniatisら、１９８２年、２５０頁に記載されているように形質転換した。形質転換細胞を、５０μg／ml カナマイシンを添加したＬＢ寒天で選択した。その選択培地を３７℃で２４時間インキュベートした。５０μg／ml アンピシリンを添加したＬＢ寒天上に形質転換細胞を再び接種することにより、アンピシリン耐性の消失を確認した。１０Ｘ反応緩衝液Ａ２μlを含む全反応容量２０μl中、ＥcoＲＩ(１０単位) で消化することにより、ｐＦＬＡＮ１の４３３塩基対のＡＤＨプロモーター(３００ng)を取り除いた。３７℃で３時間インキュベートした後、既述のごとく制限フラグメントを平面アガロースゲル電気泳動により分離した。６５７７塩基対フラグメントをゲルから切り出し、Ｌangridgeら（１９８０年）の記載に従ってＣＴＡＢ／ブタノール法を用いて精製した。ＥcoＲＩは、１０Ｘ反応緩衝液Ａ２μ lを含む全反応容量２０μl中、ｐＩＣＥＤＤ１ＤＮＡ３００ngをＥcoＲＩ１０単位で開裂させることによって、プラスミドｐＩＣＥＤＤ１からeddを含む１８００塩基対フラグメントを生成した。再び、１８００塩基対フラグメントを(先に記載した)平面アガロースゲル電気泳動により分離した。バンドを切り出し、ＣＴＡＢ／ブタノール法(Ｌangridgeら、１９８０年)を用いて精製した。単離されたフラグメントを両方とも、蒸留脱イオン水６μlに再び懸濁させた。２つのフラグメントを以下の反応で連結した：ｐＦＬＡＮ６ＤＮＡ(２００ng)、１８００bp eddフラグメント(３００ng)、１０Ｘリガーゼ緩衝液(Ｐharmacia)(１μ l)、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Ｐharmacia)(１μl)、１０mＭＡＴＰ(１μl)を滅菌蒸留脱イオン水で１０μlとした。連結混合物を１５℃で１６時間インキュベートした後、滅菌蒸留脱イオン水で５０μlに希釈した。この連結混合物を使用して、大腸菌ＪＭ１０９株を先に記載したように形質転換した。５０μg／ml カナマイシンを添加したＬＢ寒天上、３７℃で２４時間培養することにより、形質転換細胞を選択した。無作為に選んだ形質転換細胞からプラスミドを単離し(Ｍani atisら、１９８２年、２５０頁)、１０Ｘ反応緩衝液Ａ２μlを含む全反応容量２０μl中、各々のプラスミド５００ngをＢamＨＩ(１０単位)およびＨindIII(１０単位)で消化した。反応物を３７℃で３時間インキュベートした後、制限フラグメントを(先に記載した)平面アガロースゲル電気泳動により分析した。edd遺伝子を正しい方向で有するプラスミドは、２２００塩基対の制限フラグメントを産生した。このプラスミドは、ｐＦＬＡＮ８と名付けられた。全量１５０μlのＴ４ポリメラーゼ緩衝液中、ｐＷＢ２０ＤＮＡ３５μgをＥc oＲＩ５０単位で消化することにより、厳格に調節された酵母プロモーター、ＴＨ１４プロモーターをｐＷＢ２０から取り除いた。３７℃で一晩インキュベートした後、Ｔ４ポリメラーゼ１０単位の他に、ｄＮＴＰを加えて、その混合物を３７℃で６０分間インキュベートし、「平滑末端」ＤＮＡとした。次いで、微小遠心分離管を７５℃で１０分間インキュベートして、酵素を不活性化した。Ｐrome ga Ｗizard ＤＮＡ浄化(clean up)法を利用して、ＤＮＡを浄化した。次いで、そのＤＮＡを全量２００μlのＨindIII５０単位で消化した。３７℃で９０分間インキュベートした後、ローディング(loading)染料(ブロモフェノールブルー)４０ μlを加えて、全量を１％ｗ／ｖ低融点(ＬＭＰ)アガロースゲルにロードした。Ｐromega Ｗizard清浄法を利用して、１.１kbのＨindIII−ＥcoＲＩフラグメントをゲルから精製した(製造業者の説明書を参照)。回収されたＤＮＡをエタノールで沈降させ、ＴＥに再び溶解して、最終ＤＮＡ濃度を５０−２００μg ml^-1 とした。次いで、ｐＢＳＫＳ(２０μg)を全量１５０μlのＨindIII５０単位(３７℃で９０分間)およびＳmaＩ５０単位(３０℃で９０分間)で消化した。ゲルローディング染料４０μlを加えて、全量を１％ｗ／ｖＬＭＰアガロースゲルにロードした。次いで、Ｐromega Ｗizardシステムを利用して、大きな、４.０kbのフラグメントを精製した。精製したＴＨＩ４プロモーターフラグメントおよび消化されたｐＢＳＫＳフラグメントの連結を以下のように行った。ｐＢＳＫＳＤＮＡ１００ngおよびＴＨＩ４プロモーターフラグメントＤＮＡ２５０ngをＴ４ＤＮＡリガーゼ４単位および全量１０μlの１０Ｘリガーゼ反応緩衝液１μlと混合した。連結反応物を１６℃で１６時間インキュベートした。次いで、連結混合物５μlを使用して、コンピテントＪＭ１０９細胞２００μlを形質転換した。形質転換細胞を、アンピシリン、ＸgalおよびＩＰＴＧを添加したＬＢ寒天で増殖する白色のコロニーとして選択した。１プレートにつき２００個のコロニーが増殖し、これらのうち、８５％が白色であった。白色のコロニー(６個)を選び、小規模のプラスミド調製を行った。これらのプラスミドＤＮＡをＨindIIIおよびＢam ＨＩで消化した。消化したプラスミドを１％アガロースゲルで分析した。６個とも全て、１.１kbのＴＨＩ４プラスミドフラグメントを含んでいた。６個のうち１個を単離して、ｐＢＳＫＳ３６と名付けた。次いで、１０ＸＴ４ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液中、ＳalＩ(４０単位)を用い、ｐＢＳＫＳ３６ＤＮＡ４０μgを３７℃で一晩消化した。次いで、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ１０単位を加えて、その混合物を３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、微小遠心分離管を７５℃で１０分間インキュベートして、酵素を不活性化した。Ｐromega Ｗizard ＤＮＡ浄化法を用いて、ＤＮＡを浄化した。次いで、それを、３７℃で６０分間インキュベートすることにより、ＢamＨＩ(４０単位)で消化した。次いで、ゲルローディング染料４０μlを加えて、全量を１％ｗ／ｖＬＭＰアガロースＴＢＥゲルに流した。Ｐromega Ｗizard ＤＮＡ法を利用して、１.１kbのＴＨＩ４プロモーターＤＮＡフラグメントをゲルから精製した。１０ＸＴ４ポリメラーゼ緩衝液中、ＡatII４０単位を用い、ｐＦＬＡＮ８ＤＮＡ２７μgを３７℃で一晩消化した。次いで、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ１０単位を加えて、その混合物を３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、微小遠心分離管を７５℃で１０分間インキュベートして、酵素を不活性化した。Ｐro mega Ｗizard ＤＮＡ法を用いて、ＤＮＡを浄化した。次いで、ＢamＨＩ(４０単位)を用い、線状化されたＤＮＡを３７℃で６０分間再び消化した。このことにより、４００bpのフラグメントを取り除く。大きなベクターフラグメントを１％ｗ／ｖＬＭＰアガロースゲルで単離し、Ｐromega Ｗizard ＤＮＡ法を用いて精製した。全量１０μlの１０Ｘリガーゼ緩衝液の他に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ４単位を用いて、ＴＨＩ４プロモーターフラグメント(ＳalＩで平滑末端とした／ＢamＨＩ)２５０ngおよびこのｐＦＬＡＮ８ベクターＤＮＡ１００ngを連結した。この混合物を１６℃で一晩インキュベートした。この連結混合物５μlを使用して、コンピテントＪＭ１０９細胞２００μlを形質転換した。形質転換細胞を、カナマイシンを添加したＬＢ寒天での増殖に関して選択した。１プレートにつき１２個のコロニーが得られた。これらを小規模のプラスミド調製によりスクリーニングした。これらのうち１０％がＴＨＩ４プロモーター挿入断片を含むことを制限分析により示された。これらのうち１個が単離されて、ｐＦＬＡＮ１０と名付けられた。ｐＦＬＡＮ１０はそれ自体、大腸菌内で安定であることが分かったため、ｐＦＬＡＮ１０を、eda発現ベクターを持つ大腸菌菌株中に導入する必要はなかった。しかし、両プラスミド(ｐＦＬＡＮ１０およびｐＷＢ３７)を一緒に酵母に導入しようとする試みはすべて不成功に終わり、形質転換細胞は得られなかった。従って、edaおよびedd発現カセットを両方含む単一ベクターを構築することが決定された。eda−edd酵母発現ベクターの構築以下のごとく、(ＴＨＩ４プロモーター、eddコード配列およびＣＹＣ１ターミネーターを含む)edd発現カセットを３.５kbのＨindIIIフラグメントとしてｐＦＬＡＮ１０から遊離させた。消化ｐＦＬＡＮ１０ＤＮＡ１０μl(２０μg) １０Ｘ反応緩衝液Ａ２μl １ＸＴＥ６μl ＨindIII ２μl(２０単位) 反応混合物を３７℃で６０分間インキュベートした。その混合物に１０Ｘアガロースゲルローディング緩衝液２μlを加えた後、これを１５Ｖで１６時間泳動する０.６％ｗ／ｖアガロースＴＢＥゲルを用いる水平アガロースゲル電気泳動により精製した。剃刀の刃を用いて、３.５kbのフラグメントをゲルから切り出した。ＱＩＡＥＸＤＮＡＧel Ｅxtraction Ｋit(Ｑiagen Ｉnc.、ＣＡ、ＵＳＡ)を用いて、ＤＮＡを製造業者の説明書に記載されているように精製した。ｐＷＢ３７もまた、ＨindIIIで消化した。消化ｐＷＢ３７ＤＮＡ１２μl(３.６μg) １０Ｘ反応緩衝液Ａ２μl １ＸＴＥ５μl ＨindIII １μl(２０単位) 反応混合物を３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、１０Ｘアガロースゲルローディング緩衝液１μlを加えて、１５Ｖで１６時間泳動する０.６％ｗ／ｖアガロースＴＢＥゲルを用いる水平アガロースゲル電気泳動により、消化物を分析した。次いで、ｐＷＢ３７の、大きな、６.０kbのフラグメントをゲルから切り出し、Ｇeneclean II キット(ＢＩＯ，Ｉnc.、ＵＳＡ)を用いて、製造業者の説明書に記載されているように精製した。次いで、精製された６.０kbのｐＷＢ３７ＨindIIIフラグメントおよび精製された３.３kbのｐＦＬＡＮ１０ＨindIIIフラグメントを以下のように連結した。連結精製された６.０kbのｐＷＢ３７ＨindIII フラグメントＤＮＡ５μl(１μg) 精製された３.３kbのｐＦＬＡＮ１０ＨindIII フラグメントＤＮＡ１０μl(２μg) １０Ｘ連結緩衝液(Ｐharmacia) ２μl １０mＭＡＴＰ２μl Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Ｐharmacia) １μl 次いで、反応混合物を１６℃で１６時間インキュベートした。連結混合物を使用して、大腸菌ＤＨ５ａ株のコンピテント細胞(Ｈanahan、１９８３年、Ｂethes da Ｒesearch Ｌaboratories、１９８６年)を先に記載したように形質転換した( Ｍaniatisら、１９８２年、２５０頁)。アンピシリン(１００μg ml^-1)を添加したＬＢ寒天上、３７℃で２４時間培養することにより、形質転換細胞を選択した。３０個の形質転換細胞が、これらの選択プレートで増殖した。これらを選び取って、小規模のプラスミド単離を先に記載したように調製した(Ｍaniatisら、１９８２年、３６８頁)。これらのプラスミドを以下のようにＨindIIIで消化した。消化プラスミドＤＮＡ１０μl(約２μg) １０Ｘ反応緩衝液Ａ２μl １ＸＴＥ７μl ＨindIII １μl(１０単位) 反応混合物を３７℃で６０分間インキュベートした後、１０Ｘアガロースゲルローディング緩衝液２μlを加えて、１００Ｖで３時間泳動する０.８％ｗ／ｖアガロースＴＢＥゲルを用いる水平アガロースゲル電気泳動によって消化物を分析した。５つの組換えプラスミドを同定すると、これらは、６.０kbのｐＷＢ３７ＨindIIIフラグメントおよび３.３kbのｐＦＬＡＮ１０ＨindIIIフラグメントを含んでいた。これらの５個の形質転換細胞を、アンピシリン１００μg ml^-1 を添加したＬＢ寒天に再び接種して、３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、各々の５つのプレートから単一コロニーを選び、先に記載したように小規模のプラスミド調製に使用した(Ｍaniatisら、１９８２年、３６８頁)。次いで、これらのプラスミドをＳphＩで消化し、組換えプラスミド中のedaカセットに対するeddカセットの方向を決定した。消化プラスミドＤＮＡ１０μl(約２μg) １０Ｘ反応緩衝液２μl １ＸＴＥ７μl ＳphＩ１μl(１０単位) 反応混合物を３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、１０Ｘアガロースゲルローディング緩衝液２μlを加えて、１５Ｖで１６時間泳動する０.８％ｗ／ｖアガロースＴＢＥゲルを用いる水平アガロースゲル電気泳動により、消化物を分析した。５つの組換えプラスミドでは全てeddカセットは同じ挿入方向を示している：すなわち、eddカセットはedaカセットと同じ転写方向にある。遺伝子をこの方向で有するプラスミドは、６.７kbおよび２.６kbのＳphＩフラグメントを生じる。このプラスミドは、ｐＷＢ４４と名付けられている；第９図参照。 eda−edd酵母発現ベクターを用いる酵母菌株の形質転換菌株３７.１.６は、ＭＡＴa ura３−５２ leu２ trp１ pfk１−１ pfk２::ＬＥＵ２である。この菌株はグルコース培地上では成長することができない。菌株３７.１.６におけるpfk１突然変異およびpfk２突然変異の両方の存在を、菌株３４.１.６（ＭＡＴa leu２ trp１ pfk１Δ１ pfk２::ＬＥＵ２）と接合させることによって確認した。これらの菌株をＹＥＰＧ寒天（両方の単相体が発育しうる）上で接合させ、所定の時間経過後にＹＥＰＤ寒天上で複製させた。成長は起こらなかったが、このことは単一機能のＰＦＫ遺伝子がいずれの単相体にも存在しないことを示す。両方の菌株の接合受容能を、適当な接合テスターを用いて同時に検証した。 pＷＢ４４の構築中、酵母ＡＲＳ配列は自律性プラスミド維持を要求し、３'末端に存在するtrp１遺伝子の一部は除去され、edd発現カセットに置き換えられた。これは、酵母内にpＷＢ４４を維持するには、pＷＢ４４を染色体に組込まなければならないこと、およびpＷＢ４４が明確な酵母選択マーカーを持たないことを意味する。もしedaおよびeddカセットの両方が酵母内で発現するのであれば、組込まれたプラスミドpＷＢ４４を維持するための選択をグルコース培地上でなし得たであろう。このような理由から、pＷＢ４４ＤＮＡを用いて酵母菌株３７. １.６を形質転換し、ＹＥＰＤ寒天上で形質転換体を選択するためのひとつの方策を発案した。pＷＢ４４に存在するtrp１コーディング配列の５'部分は、プラスミド上の酵母ＤＮＡ配列の最大のセグメントであり、それゆえに酵母染色体への組込み的組換えが最も生じ易い乗り換え点である。プラスミドpＷＢ４４を用いる酵母菌株３７.１.６の形質転換を次のとおり行った：白金サジ量の３７.１.６細胞を寒天平板からすくい取り、０.５mlのＹＥＰＧＥを入れたマイクロ遠心分離管に移した。次いで、これを室温にて１０秒間マイクロ遠心分離機にかけ、ペレット化した。遠心分離管を逆さにして一回振り、上清を傾瀉した。次いで、１０μl（１００μg）の担体ＤＮＡ[音波処理し、変性したサケ精巣ＤＮＡ（シグマ製）]および１０μl（約２μg）の非切断pＷＢ４４ＤＮＡ(前述したように小さいスケールのプラスミド作製によって単離したもの)を加え、渦巻き混合に付した。次いで、０.５mlの新たに調製したＰＥＧ／酢酸リチウム／ＴＥ混合物（９mlのフィルター滅菌４５％w/vＰＥＧ４０００（シグマ製）、１mlの１Ｍ酢酸リチウム、０.１mlの１Ｍトリス−塩酸，ｐＨ７.５、０.０２mlの０.５ＭＥＤＴＡ）を加え、渦巻き混合した。次いで、遠心分離管を室温で１６時間インキュベートした。１００μlの該混合物をＹＥＰＤ寒天に直接散布した。平板を２１℃で１４日間インキュベートした。１２個の酵母コロニーがＹＥＰＤ寒天上で成長した。これらを採取し、ＹＥＰＤ寒天上に再度置き、２１℃で６日間インキュベートした。３７.１.６内でのedaおよびeddの存在を確認するための証拠。一連のＰＣＲ実験によって、edaおよびeddの相互に対する方向およびpＷＢ４４の組込み部位の情報を得た。ＰＣＲ方策の全容は図１０を参照せよ。１２個の３７.１.６形質転換体候補すべてにおいてeda発現カセットの存在を確認するために、オリゴヌクレオチドプライマーを用いてeda発現カセット増幅体の５'および３'末端配列にそれぞれハイブリッド形成させた。１２個の形質転換体すべてが７００ｂｐのedaフラグメントの存在を示したが、負対照３７.１. ６にはこのようなフラグメントは存在しなかった。３７.１.６形質転換体候補においてedd発現カセットの存在を確認するために、プライマーを用いてeddコーデイング領域内の配列にハイブリッド形成させた。増幅すると、１２個の形質転換体すべてが１kbのeddフラグメントの存在を示したが、負対照３７.１.６にはこのようなフラグメントは存在しなかった。形質転換体内のedaおよびedd遺伝子の方向を調べるために、プライマーを用いてeda内の配列およびedd内の配列それぞれにハイブリッド形成させた。この検査のために、１２個の形質転換体から無作為に取り上げた３個の形質転換体を増幅すると、３個の形質転換体すべてがeda−edd遺伝子をつなぐ３.５kbのフラグメントの存在を示したが、負対照３７.１.６にはこのようなフラグメントは存在しなかった。これは、予想どおりに、edaおよびedd遺伝子は形質転換体に同じ転写方向で、隣接して存在することを確証するものである。 pＷＢ４４上に存在するtrp１コーデイング配列の５'部分は、プラスミドに存在する酵母ＤＮＡの最大の配列であり、それゆえにpＷＢ４４を酵母染色体へ組込む際に最も生じ易い乗り換え点であると判断された。trp１がpＷＢ４４の組込み部位であることを確認するために、オリゴヌクレオチドプライマーを用いて内部eda遺伝子配列およびtrp１の染色体コピーに存在する配列（pＷＢ４４内のtrp １の部分にはそのような部位が存在しない）それぞれにハイブリッド形成させた。この実験のために取り上げた４個の形質転換体を増幅すると、すべてが４.８k bのeda−trp１フラグメントの存在を示した。負対照３７.１.６にはこのようなバンドは存在せず、同様に試験を行ったpＷＢ４４プラスミドＤＮＡにも存在しなかった。これは、pＷＢ４４が酵母菌株３７.１.６にtrp１の遺伝子座で組み込まれたことを確証するものである。小規模発酵３７.１.６形質転換体の発酵挙動を評価するために、最小培地プラスグルコースおよび市販のマントン・アンド・フィソンの醸造用麦芽汁を用いて実験室規模の発酵を行った。最小培地プラスグルコースは、ディフコ酵母窒素ベース（ＹＥＢ）０.６７％w/vプラスグルコース１０％w/vである。この溶液をオートクレーブにて２０分間滅菌した。次いで、清浄にし、滅菌したスバ栓付きトールチューブに５００mlのＹＥＢ−グルコースを入れた。植え込んだ酵母を好気的条件で３〜４日間、２１℃にて振とうしながら成長させ（ＹＥＰＤ中のＨ５４−２Ｂ：実験用野生型およびＤＥＹ７０（関連した遺伝子型のpfk１−１）およびＹＥＰＧＥ中の３７.１.６および３７.１.６／pＷＢ４４）、十分なクロップを収穫した。次いで、各菌株の１０gの回転処理した(spun)酵母を適当なトールチューブに入れ、エアロック付きゴム栓を使用して各チューブに栓をした。次いで、トールチューブを２１℃でインキュベートした。２mlずつのサンプルをアントン・パール比重計に移して発酵中の比重をモニターした。発酵のプロフィールを図１１に示す。発酵完了時に、ガスクロマトグラフィーによるエタノール定量用およびＨＰＬＣによる糖質分析用のサンプルを採取した。各トールチューブの内容物の残りを遠心分離管に移し、１０００×ｇで１０分間遠心分離して酵母を集めた。上清を除去し、容器と酵母クロップを秤量した。エタノールおよび糖質分析ならびに酵母クロップ測定の結果を表２にまとめた。これらの結果および図１１のプロフィールから、３７.１.６／pＷＢ４４が高効率(酵母クロップの生産を最小にして)でグルコースを発酵してエタノールを生産する能力があることは明らかである。次いで、ＹＥＢ−グルコース中の発酵から得られた３７.１.６／pＷＢ４４を５００mlのマントン・アンド・フィソンのエール麦芽汁を入れたトールチューブに加えた。このホップ風味を付けた麦芽汁は、麦芽汁濃縮液を熱湯で５分間ボイルし、次いで希釈して所望の比重１０６０°にすることによって調製した。次いで、２０分間オートクレーブ処理を行った。冷却し、麦芽汁を１０リットルのフラスコに移し、ガラス焼結物に４５分間通してしっかりと空気に触れさせた。次いで、５００mlの空気に触れさせた麦芽汁を清浄化し、滅菌したスバ栓付きトールチューブに入れた。各菌株の１０gの回転処理した(spun)酵母(前記参照)を１０mlの麦芽汁に再懸濁した後で植え込む。次いで、３ml（約３ｇ）の酵母をトールチューブに入れ、エアロック付きゴム栓を使用して各チューブに栓をした。次いで、トールチューブを２１℃でインキュベートした。前記と同様にして発酵中の比重をモニターした。発酵のプロフィールを図１２に示す。発酵完了時に、ガスクロマトグラフィーによるエタノール定量用およびＨＰＬＣによる糖質分析用のサンプルを採取した。各トールチューブの内容物の残りを遠心分離管に移し、１０００×ｇで１０分間遠心分離して酵母を集めた。上清を除去し、容器と酵母クロップを秤量した。エタノールおよび糖質分析ならびに酵母クロップ測定の結果を表３にまとめた。これらの結果から、３７.１.６／pＷＢ４４が効率的に（酵母クロップの生産を低く押えて）エタノールを生産する能力があることは明らかである。３７.１.６がマルトースの利用度が醸造用菌株よりも少ない実験用酵母菌株であるという事実を反映して、残留糖質は主としてマルトースである。表４は、３７.１.６／pＷＢ４４酵母と７種の異なる市販の酵母菌株との成長効率の比較を示す。すべての場合において、酵母はマントン・アンド・フィソンのエール麦芽汁中で成長させた。酵母を用いて一定量のエタノールを生産する際に生産される酵母バイオマスに関しては、標準の酵母菌株を用いた場合よりも、本発明酵母を用いた場合の方が、該バイオマスの量が少ないことは全く明白である。固定化発酵試験ＹＥＰＧＥ中のおよそ１５リットル（２５０mlのフラスコで６０個）の３７. １.６／pＷＢ４４を２１℃にて振とうしながら３〜４日間成長させた。フラスコを４℃にし、該酵母を自然に沈降させた。次いで、各フラスコから大部分の上清を傾瀉して酵母スラリーの最終体積を約３リットルまで減らした。次いで、反応器に充填するまで、これを４℃で貯蔵した。反応器を熱デコン（DECON）９０に２４時間浸して清浄化した；デコンを排液し、反応器を熱湯で数回濯いだ。シランガラスビーズ(１５４０ml)を反応器に加え、次いで、反応系にエタノール（７０v/v）を循環させて滅菌した。反応器からエタノール(８リットル)を排液し、醸造用麦芽汁と入れ換えた。麦芽汁の一部（３リットル）を反応器から排液し、等しい体積の酵母スラリーと入れ換えた。反応系を流動化し、２５℃で４日間反応を進行させた。麦芽汁の比重が１００５°に達したとき、麦芽汁ポンプのスイッチを入れ、発酵制御パッケージから麦芽汁ポンプの速度をフィードバック制御することによって反応器内の比重を制御して１０１０°にした。操作中、反応器は２０℃に維持した。この期間に測定した比重の読み取りプロフィールは安定したものであった。 ¹³Ｃ核磁気共鳴を用いた３７.１.６／pＷＢ４４における代謝の分析白金サジ量の菌株３７.１.６／pＷＢ４４を２５０mlの三角フラスコ中のＹＥＰＧ培地１００mlに植え込み、旋回回転式のインキュベーター（１８０rpm）中で３０℃にて７２時間インキュベートした。この時点で、６００nmで測定した培養物の光字密度（ＯＤ₆₀₀）は４.５であった。５mlの培養物を２５０mlの三角フラスコ中の９５mlの新たなＹＥＰＧ培地に加えた。これらの細胞を旋回回転式のインキュベーター中で３０℃にて２３時間インキュベートした。この時点で、ＯＤ₆₀₀は３.２であった。この菌株がＹＥＰＧ培地中、同じ条件下で培養され、ＯＤ₆₀₀を通常の間隔で記録すると、ＯＤ₆₀₀が３.２であるときに、細胞が成長の対数増殖期であることは先の実験からわかっていた（データは示さず）。遠心分離によって細胞を沈降させ、成長培地を捨てた。次いで、ＹＥＰＤ培地１００ml に細胞を再懸濁し、２リットル三角フラスコに入れ、同じ旋回回転式インキュベーター中で３０℃にてインキュベートした。インキュベートされた培養物の体積に比して、このように相対的に大きなフラスコを用いる理由は、細胞が豊富な酸素の供給を受けることを確実にするためであった。インキュベーションの７２時間後、ＯＤ₆₀₀は３.２８であった。次いで、３０℃にて遠心分離を行って細胞を採集し、培地を傾瀉し、次いで予め３０℃に加温した２mlのＹＥＰに細胞を再懸濁し、５０mlの三角フラスコに移した。次いで、２時間前に調製して３０℃に維持しておいた、最少量の滅菌蒸留水に７０.３mgの［２−¹³Ｃ］グルコースを溶かした溶液を細胞に加えた。実験に先立ってグルコースウエルを調製しておく理由は、グルコースのβおよびα−アノマー間に平衡状態を確立しておくためであった。標識されたグルコースを含むこの培養物を、同じ旋回回転式インキュベーターにて２４時間振とうした。終了後、マイクロ遠心分離機にて１１６００gで３０秒間遠心分離を行うことによって細胞を収穫した。成長培地を傾瀉し、次いで、細胞に３００μlの氷冷２０％（w/v）過塩素酸を加え、１分間激しく渦巻き撹拌した。３７.１.６／pＷＢ４４細胞と過塩素酸を含む遠心管を氷中に１時間静置した。１５分間隔で遠心管の内容物を徹底的に渦巻き撹拌した。この処置によって細胞は素早く殺され、酵母細胞から抽出されるべき小さい分子が過塩素酸中に生じるが、この処置は過去のこの種の研究において使用され、好結果を得ている［ディッキンソン＆ヒューリンズ（１９８８）；ディッキンソン＆ヒューリンズ（１９９１）；ディッキンソンら（１９９５）］。１時間後、内容物を再度渦巻き撹拌し、次いでマイクロ遠心分離機において４℃にて１１６００gで３０秒間遠心分離した。この操作により過塩素酸変性物質が沈降した。上清（過塩素酸可溶性物質）のすべてを新しい遠心分離管へ注意深く移し、氷中に静置し、次いで十分に氷冷した２Ｍ水酸化カリウムを加えて過塩素酸抽出物を中和した（すなわちｐＨ＝７にする）。この操作には、過塩素酸カリウムが白色沈殿で生成するという付加価値がある。中和された抽出物を氷中に１時間貯蔵し、１５分間隔で渦巻き撹拌した。１時間後、ｐＨを再調査すると７.０であることがわかり、次いでマイクロ遠心分離機において４℃にて１１６００gで３０秒間遠心分離を行って過塩素酸カリウムを沈降させた。透明な上清（５００μl）を注意深く新しい遠心管に移し、次いで、３０μlの１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝６.００）を加え、さらに１００μlの²Ｈ₂Ｏを加えた。次いで、前述の［ディッキンソン＆ヒューリンズ（１９８８）；ディッキンソン＆ヒューリンズ（１９９１）；ディッキンソンら（１９９５）］の記載にしたがって、これをBruker ＷＭ３６０ＮＭＲ分光計にて９０.５ＭＨｚで分析した。ブロードバンド¹Ｈデカップリング、２２０００Ｈｚ以上、３２Ｋデータポイントを用いた５mmのＮＭＲ管内の溶液のスペクトルを記録した。外部標準として²Ｈ₂Ｏ溶液中で測定した３−（トリメチルシリル）プロパン−１−スルホン酸ナトリウム（δ＝０）に対するｐｐｍで、すべての化学シフトを報告する。夥しい数の共鳴が観測された。菌株３７.１.６／pＷＢ４４の炭素代謝の解釈において主要な意味をもつ４個の共鳴のみを本明細書に記載する。これらの共鳴は、フルクトース６−ホスフェート（Ｆ−６−Ｐ）（１０７.５ｐｐｍ）のＣ− ２α、Ｆ−６−ＰのＣ−２β（１０４.４ｐｐｍ）、Ｆ−６−Ｐのフラノース体のＣ−３α（８４.７ｐｐｍ）およびＦ−６−Ｐのフラノース体のＣ−３β（７８.７）によるものであった。Ｆ−６−Ｐ（常套の解糖経路ではＦ−６−Ｐに続く中間体はない）のＣ−２における¹³Ｃ標識の蓄積は、グルコースが、Ｆ−６− Ｐまでグルコース６−ホスフェート（Ｇ−６−Ｐ）を経て代謝されており、その先はないことを示す。言い方を変えれば、このことは、pfk−１およびpfk２::ＬＥＵ２突然変異による解糖のホスホフルクトキナーゼ段階で創成された代謝ブロックが、考えられるいずれのメカニズムによっても突破されなかったことを証明する。Ｆ−６−ＰのＣ−３における¹³Ｃ標識の存在もまた非常に有意義である。このことは、トランスケトラーゼとトランスアルドラーゼの両方の作用を含むヘキソース−ホスフェート経路の酵素が関与してグルコースがＧ−６−Ｐへ変換する場合にのみ起こりえるものであり、その結果Ｃ−３が標識されたＦ−６−Ｐが得られる。再度言えば、¹³Ｃ標識されたＦ−６−Ｐから誘導された、常套の解糖経路における公知の代謝中間体または代謝産物では、いずれの位置においても¹³ Ｃ標識が観測されなかったことを強調すべきである。したがって、¹³ＣＮＭＲ分析から、本発明菌株におけるグルコースの代謝には、常套の解糖経路は用いられないことがわかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 7/24 9637−4ＢＣ１２Ｐ 7/24 //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ランカシャー，ウィリアム・エドワードイギリス、エムケイ５・８ディエックス、バッキンガムシャー、ミルトン・キーネス、ラクトン、アッシュポール・ファーロング64番 (72)発明者ディキンソン，ジョン・リチャードイギリス、シーエフ64・４ディキュー、サウス・グラモーガン、ダイナス・ポーイス、ジ・オールド・マルサウス３番 (72)発明者マロック，リチャード・アンソニーイギリス、エスケイ16・６ビーダブリュー、スターリング、ダウン、メイン・ストリート74番

Claims

【特許請求の範囲】１．発酵において、糖質がエントナー・ドゥドロフ（Entner-Doudoroff）経路を経てピルベートに変換し得るように、酵素ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼおよび２−ケト−３−デオキシグルコネート６−ホスフェートアルドラーゼを発現可能に形質転換した酵母。２．さらに、補助因子としてＮＡＤＰＨを利用しうるアルコールデヒドロゲナーゼを発現可能な請求項１に記載の酵母。３．グルコース６−ホスフェートがエムデン・マイヤーホフ（Embden-Meyerho f）経路を経てピルベートに変換する際に必要な酵素を発現できない請求項１または２に記載の酵母。４．発現できない酵素がホスホフルクトキナーゼである請求項３に記載の酵母。５．Entner-DoudoroffおよびEmbden-Meyerhof経路のいずれかまたは各々を稼働または停止できる請求項１〜４のいずれかに記載の酵母。６．固定化酵素の形体である請求項１〜５のいずれかに記載の酵母。７．サッカロミセス属である請求項１〜６のいずれかに記載の酵母。８．糖質をアルコールへ変換するための請求項１〜７のいずれかに記載の酵母の使用。９．燃料アルコールを生産するための請求項８に記載の酵母の使用。１０．醸造または蒸留、リンゴ酒製造またはワイン製造を行うための請求項８に記載の酵母の使用。１１．請求項１に記載の酵素をコードし、かつ酵母中の酵素の転写および翻訳を促進する１種または２種以上の配列を含む組換えＤＮＡ。１２．請求項３または４に記載の発現不可能な酵素のためのアンチセンスメッセージを転写する配列を含む請求項１１に記載の組換えＤＮＡ。１３．さらに、請求項２に記載の酵素をコードする請求項１１または１２に記載の組換えＤＮＡ。