JP4625454B2 - Rnaを作製するための工業的方法および該方法を行うためのシステム - Google Patents
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Description
本発明は、興味対象のRNAの工業的作製を行うためのシステムにも関する。
- 転写産物の不均一性を増大させ、RNAの完全な精製を必要とする付随的な好ましくない反応(N+1活性)の誘導;
- 合成されるRNAの量およびサイズに関する制限;
- 比較的高い生産コスト。
- 米国特許第3,272,714号は、亜鉛およびリン酸の濃度ならびに酸素吸収係数が制御された培地で培養された酵母からのRNAの工業的作製に関する。記載されたこの方法は、興味対象のRNAを特異的に作製することはできないが、大量の内因性の全ての酵母RNA(全酵母RNA)の作製を可能にする。
(1) ミトコンドリアDNAを欠く酵母細胞(rho0株)、特にS. cerevisiaeのミトコンドリアを、ミトコンドリア転写用の調節要素の制御下の上記の興味対象の異種RNAをコードするDNA、およびミトコンドリア転写レポーター遺伝子または該レポーター遺伝子の断片を含むミトコンドリア転写ベクターで形質転換する。よって、本発明による方法は、その種内または種間の起源にかかわらないいずれの異種DNA配列(酵母以外の生物のミトコンドリアDNAまたは葉緑体DNAを含む)および天然に存在しない合成DNA配列の転写も許容する。ミトコンドリア形質転換体または合成rho-株は、このようにして得られる。
(3) 工程(2)で選択された、好ましくは指数増殖期の酵母ミトコンドリア形質転換体を培養する。
(4) 工程(3)に従って培養した酵母ミトコンドリア形質転換体からミトコンドリアを単離する。および
(5) 上記のミトコンドリアから興味対象の異種RNAを抽出して精製する。
- 「酵母細胞」、「酵母株」、「細胞」、「酵母」および「株」の用語は、本発明の関係において同等であるとみなされ、区別なく用いられる。以下に定義されるrho+、rho0およびrho-酵母株についても同じである。
- 興味対象の異種RNA:酵母ミトコンドリアゲノムにコードされていないいずれの天然または合成のRNA。
- rho 0 株:非発酵性炭素源を含有する培地で増殖できずかつミトコンドリアタンパク質合成がないことにより特徴付けられるミトコンドリアDNAを欠く酵母株(図1)。
- 栄養要求性マーカー:生合成経路の既知の遺伝子またはアミノ酸、ヌクレオチド、炭素ベースの物質の使用などにおける変異。
- 容易に工業化でき(通常の培養槽を用いて)、そして
- 興味対象のRNAを大量に、低いコストで、精製後に容易に準備され得る興味対象のRNAを得ることを有利に可能にする。
- 酵母における興味対象のRNAのインビボ合成を含むという事実は、全ての細胞の品質管理、特に:(1) 最大限の転写忠実性、現在の方法に比較して数オーダーの大きさでエラー導入の危険性をかなり最小限にする、そして(2) 酵母ミトコンドリア内にはRNAの編集がないので、その遺伝子の配列と比較してRNAの配列を変える効果を有する転写後修飾の不在から利益を受けることを許容する。
(a0) 工程(1)の最後で得られた合成rho-形質転換酵母を、rho+ mit-型の酵母テスター株と、上記の形質転換細胞の同定を促進するように交雑させる。上記のテスター株は、局所的改変(ヌクレオチド置換(点突然変異)、短い欠失または挿入)を、工程(1)で用いられるミトコンドリア形質転換レポーター遺伝子、例えば酵母の呼吸鎖の遺伝子の一つ、例えばCOX2またはこの遺伝子の断片に対応するミトコンドリアゲノムの領域に有する。対応する野生型配列(遺伝子または遺伝子断片)は、工程(1)でrho0宿主株のミトコンドリアを形質転換するのに用いられるミトコンドリア転写ベクターが有する。
(a1) 適切な培地で培養することによる、上記で規定される核マーカーによる酵母細胞の第一選択または予備選択、
(b1) (a1)で選択された酵母細胞からの、上記で規定される工程(a0)、(b0)および(c0)による第二選択
を含む。
- 混入核酸、特にミトコンドリアの周囲に付着した多くのRNAを、第一のバッファーが少なくとも1種の二価イオンキレート剤、例えばEDTAおよびEGTAを含みかつ第二のバッファーがRNアーゼと任意にDNアーゼとを含む適切なバッファーの存在下に除去し、
- 少なくとも1種の界面活性剤と二価イオンキレート剤の存在下に、7〜8の範囲内のpHでミトコンドリアを溶解させ、例えば次のバッファー:1% SDS、10 mM EDTAおよびTris/HCl, pH 7.5が挙げられる;そして
- いずれの適切な手段により興味対象のRNAを単離して精製する
ことを含む。
上記のRNAは、そのまま用いられ得るか、または想定される使用に従ったさらなる修飾工程に付され得る。通常の技法により行なわれるこれらの修飾のうち、限定されないが、成熟配列の切断;特にインビボでのRNAの安定性を増加させるための化学修飾、特にsiRNAを形成するための二本鎖ハイブリダイゼーション、遺伝子全体をカバーする小さい断片を得るための消化を挙げることができる。
- ミトコンドリア転写の調節要素の制御下で興味対象の異種RNAをコードするDNA、およびミトコンドリア形質転換レポーター遺伝子または該レポーター遺伝子の断片を含む、少なくともミトコンドリア転写ベクターで形質転換された酵母細胞(合成rho-細胞)、
- 上記の形質転換細胞(ミトコンドリア形質転換体)を選択するのに適切な少なくとも1種の培地、
- rho+ mit-型のテスター酵母細胞、
- 適切な発酵槽および培地、ならびに
- ミトコンドリアを合成rho-細胞から単離してそこから興味対象のRNAを抽出するための適切なバッファー
を含むことを特徴とする、予備選択された興味対象の異種RNAの工業的製造を行うためのシステムでもある。
- 図1は、S. cerevisiaeのミトコンドリアDNAを図示する。ミトコンドリアDNAは、特に:ATPシンターゼの3つのサブユニット(6、8、9);呼吸鎖の4つのサブユニット;2つのrRNA + 1つのミトリボソーム;24のtRNAをコードする。
- 図3は、合成rho-株の構築を表す。
- 図4は、RIP1遺伝子を含むミトコンドリア転写ベクターで形質転換された合成rho-酵母のミトコンドリアRNAのノザンブロッティング分析を示す。
実施例:本発明の方法によるRIP1遺伝子のRNAの作製
A) 材料および方法
1) ミトコンドリア転写ベクター
COX1発現シグナル配列に挟まれた、呼吸鎖複合体IIIのサブユニットをコードするRIP1遺伝子のミトコンドリアのコード版であるRIP1m遺伝子がクローニングされたpJM2 (野生型COX2を有するpTZ18-U;YIN J.ら, Tsinghua Science and Technology, 1999, 4, 2; Bio-Rad)。
Yep352 (2μ, URA3) (ATCC No. 37673)
3) ミトコンドリアDNAを欠くS. cerevisiae細胞の、1)および2)に記載のベクターでの形質転換
W303-1B (ATCC No. 201238)/A/50とよばれるW303-1B株のrho0誘導体(Matα, ade2, trp1, his3, leu2, ura3)を、1)および2)に記載のベクターで、N. Bonnefoyら(Methods in Enzymology, 2001, 350, 97〜111)による文献に記載されたバイオリスティック法でPDS-1000/He バイオリスティック装置(BioRad)を用いて共形質転換(cotransform)する。
まず、核形質転換体を、ウラシルを欠く合成培地上で選択する。ミトコンドリア形質転換体を、URA3+核形質転換体の中から、テスター株TF145 (MATα, ade2) (Speno H.ら, J. Biol. Chem., 1995, 270, 43, 25363〜25369)との交雑の後に非発酵性培地上で増殖する二倍体を発生するその能力によって同定する。このテスター株は、ミトコンドリア遺伝子COX2に欠失を含む(cox2-17)ので、非発酵性培地(呼吸培地)上で増殖できない。
ミトコンドリア形質転換体を、発酵槽で指数増殖期の中間(medium)が得られるまで、炭素源としてガラクトースを含有するリッチ培地で培養する。
6.1) ミトコンドリアの単離
酵母ミトコンドリア形質転換体を、発酵槽で指数増殖期の中間が得られるまで、すなわち3〜4の間のODが得られるまで培養する。次いでこれらを回収し、溶解または粉砕し、そのミトコンドリアを常法により精製する。
ミトコンドリア形質転換体のミトコンドリアを、媒体(1.35 Mソルビトール)中のザイモリアーゼを用いてその細胞壁を消化した後に単離して精製する。この媒体は、細胞壁が除かれた細胞(スフェロプラストと呼ばれる)の完全性を浸透圧的に防御する。スフェロプラストを、ミトコンドリアの完全性を維持するバッファー(0.6 Mソルビトール)中の浸透圧ショックに付す。細胞破壊片(核、細胞壁)を、スフェロプラストの溶解物の数回(少なくとも2)の低速(750 g)の遠心分離で除去する。最終の上清を高速(12 500 g)で遠心分離してミトコンドリアをペレット化する。
I/ 酵母の回収
酵母は低速で遠心分離する(4℃、3800 gで10分)。
II/氷冷蒸留水での酵母の2洗浄
次いで、ペレットを冷却蒸留水(4℃)中に採取する。
遠心分離を4℃、3800 gで5分間行う。上清を除き、洗浄を蒸留水で第2回目に行い、その後、同じ条件でさらなる遠心分離を行う。
2-メルカプトエタノールは、細胞壁の種々のマンノプロテイン間のジスルフィドブリッジを壊して、その後のザイモリアーゼの作用を促進する。培養の600 nmでのODに基づいて、酵母の乾燥重量を次の式:
DW (g) = 0.28 OD volume_culture (L)
に基づいて測定する。
インキュベーションを、20 ml-バッファー/DW-gの容積で行う。
次いで、ペレットをプレインキュベーションバッファーSH (0.5 M 2-メルカプトエタノール、0.1 M Tris-Base, pH 9.3)中に採取し、10分間、30℃で攪拌しながらインキュベートする。
これらの洗浄の目的は、還元剤の全ての影響を除くことである。
KClバッファー(0.5 M KCl, 10 mM Tris-Base, pH 7.0)を、SHプレインキュベーションバッファーに加える。遠心分離を4℃、3800 gで5分間行う。上清を除く。次いで、KClバッファーでの洗浄を2回続けて行う。
ザイモリアーゼは細胞壁を破壊する。
酵母の細胞壁はキチンのバックボーンからなり、そこに他のタンパク質が付加している。
細胞壁を消化するために、一つの可能性は、細菌Arthrobacter luteusが産生するザイモリアーゼまたは酵素混合物(シトヘリカーゼ(cytohelicase)):カタツムリ(Helix pomatia)の胃液酵素を用いることにより酵母プロトプラストを得ることである。
ペレットを、10〜15 mg-ザイモリアーゼ/10 ml-消化バッファー(1.35 Mソルビトール、1 mM EGTA、10 mMクエン酸、30 mMリン酸二ナトリウム、pH 5.8)の割合で消化バッファーに採取する。
ザイモリアーゼ消化を、細胞の80〜90%が消化されたときに、KClでプロトプラストを洗浄するためのバッファーで容積を合わせることにより停止する。
次いで遠心分離を12,500 gで5分間行う。
べレットを、プロトプラスト(またはスフェロプラスト = 細胞壁が除かれた細胞)用洗浄バッファー(0.75 Mソルビトール、0.4 Mマンニトール、0.1% BSA、10 mM tris-マレエート、pH 6.8)中に迅速に採取する。遠心分離を12,500 gで5分間行う。上清を除き、次いでペレットを第2回目に洗浄する。
ペレットを数mlのホモジナイズバッファー(0.6 Mマンニトール、2 mM EGTA、0.2% BSA、10 mM tris-マレエート、pH 6.8)中に採取する。調製物を陶器(potter)のホモジナイザーに入れる。陶器のホモジナイザーを約10分間上下に動かす。調製物を中ぐらいの速度で混合し、最大量の沈殿を回収し、混合物全体をいくつかのチューブに再分配する。
低速(750 g)遠心分離を4℃で8分間行う。上清は保存する。ペレットはホモジナイズバッファーに任意に採取し、遠心分離することができ、上清は前の上清に加えることができる。
高速(12,500 g)での遠心分離を4℃で10分間行い、上清を除去する。
ペレットを回収バッファー(0.6 Mマンニトール、2 mM EGTA、10 mM tris-マレエート、pH 6.8)に採取する。
低速遠心分離(8分間、750 g、4℃)を行ない、その後上清の高速遠心分離(10分間、12,500 g、4℃)を行う。上清を除去し、第3の低速/高速遠心分離サイクルを任意に行う。
ミトコンドリアペレットを回収バッファー(マンニトール、EGTA、tris-マレエート、pH 6.8、上記で規定)の最小容積に採取し、ホモジナイズするために陶器のホモジナイザーに移す。
2リットルの培養当たり約2〜4 gの酵母が得られる。
ザイモリアーゼを用いるミトコンドリアの調製は、1〜1.5 mlのミトコンドリアを30 mg/mlのミトコンドリアタンパク質の濃度で、すなわち30〜45 mgのタンパク質を得ることを可能にする。
a) 方法A
まず、ポリソームおよびミトコンドリアの周囲にあるRNAをミトコンドリアから除くために、ミトコンドリアをEDTAおよびEGTAの存在下にインキュベートする。次いで、これらをEDTAやEGTAを含まないバッファーで洗浄し、この同じバッファー中にRNアーゼおよびDNアーゼの存在下に、ミトコンドリアの周囲にあるRNAおよび残存核DNAをミトコンドリアから除くために、インキュベートする。RNアーゼおよびDNアーゼの作用は、12,500 gで遠心分離することにより中止する。次いで、興味対象のRNAを、上記のDi Ragoら, 1988に記載のミトコンドリアRNA抽出プロトコルに従って抽出する。ミトコンドリアペレットをEDTAおよびEGTAを含有するバッファーで洗浄し、1% SDS、10 mM EDTAおよびTris HCl、pH 7.5の存在下に溶解させる。核酸を連続的なフェノール抽出により精製する。最終の水相をクロロホルム:イソアミル酸の作用により任意に洗浄し、次いで核酸を沈殿させる。この工程において、ミトコンドリアDNAはDNアーゼの添加により任意に分解される。このようにして精製されたRNAは、アッセイされ、アガロースゲル上で分析され、配列決定される。
10 mM EDTAを回収バッファー(上記で規定)に加えた。種々の遠心分離を4℃で行う。
- 12,500 gで10分間の遠心分離。
- EDTAまたはEGTAを含まない回収バッファー中での回収。
- 12,500 gで10分間の遠心分離。
- EDTAまたはEGTAを含まない回収バッファー中でのペレットの採取。RNアーゼおよびDNアーゼの添加ならびに37℃で15分間のインキュベーション。
- 12,500 gで10分間の遠心分離。
- 溶解バッファー(2% SDS, 10 mM EDTA, 10 mM Tris HCl, pH 7.5)でのペレットの採取、および同じ容積の49:49:2 フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール混液の添加。混合物は3分間ボルテックスし、4℃で2分間放置し、2〜3分間再びボルテックスする。
- 8,000 g、4℃で5分間の遠心分離。
- 最終の水相への0.3 M酢酸ナトリウム、pH 5.2、および2.5容量の100%エタノールの添加。混合物を-80℃で15分間放置し、次いで8,000 g、4℃で20分間遠心分離し、ペレットを洗浄した。
- 75μlの200 mM バナジル-リボヌクレオシド複合体(RNアーゼ阻害剤)と2μlのRNアーゼフリーDNアーゼ(50%グリセロール中に0.5 mg/mlの濃度)とを含有する3 mlの10 mM MgCl2、20 mM Tris/アセテートバッファー中でのペレットの採取。
- 0.3 Mの酢酸ナトリウムおよび2.5容量の100%エタノールの添加による水相でのRNAの沈殿。
- 50〜100μlの滅菌水でのペレットの採取。
- RNAのアッセイおよび確認、次いで必要であればさらなる調製および精製。
ミトコンドリアを、まず、EDTA、EGTAおよびRNアーゼの存在下に、ミトコンドリア区画の外周囲に通常は付着している細胞質ゾルRNAを試料から完全に除くために、インキュベートする。次いで、ミトコンドリアの内部にあるRNAの抽出を、適切な市販で入手可能なキット(Rneasy Protect Starter Kit (商標), QIAGEN, カタログ番号74121)を用いて行う。この手順において、ミトコンドリアの試料を特定のバッファーを用いて溶解し、その後直ちにRNAの精製を行う。このRNAの精製は、単一工程に、試料のRNAのみの適切な樹脂への吸着、その後の水を用いるRNAの分離を含む。このように精製されたRNAは、アッセイされ、アガロースゲルで分析され、配列決定される。
精製ミトコンドリアRNAは、RIP1遺伝子に特異的なP32-標識DNAプローブと、コントロールとして、放射性標識された、内因性ミトコンドリア遺伝子COX1に特異的なDNAプローブを用いてノザンブロッティング法により分析する。
Claims (20)
- 少なくとも以下の工程;
(1) ミトコンドリアDNAを欠く酵母細胞のミトコンドリアを、ミトコンドリア転写用の調節要素の制御下の興味対象の異種RNAをコードするDNAの少なくとも1コピー、およびミトコンドリア形質転換レポーター遺伝子または該レポーター遺伝子の断片を含むミトコンドリア転写ベクターで形質転換し、
(2) 興味対象のDNAを取り込んだ酵母ミトコンドリア形質転換体を同定し、
(3) 工程(2)で選択した酵母ミトコンドリア形質転換体を培養し、
(4) 工程(3)で得られた酵母ミトコンドリア形質転換体からミトコンドリアを単離し、そして
(5) 該ミトコンドリアから興味対象の異種RNAを抽出して精製する
を含むことを特徴とする、興味対象の異種RNAを作製する方法。 - ミトコンドリアDNAを欠く前記酵母細胞がrho0細胞であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ミトコンドリアDNAを欠く前記酵母細胞が、ΔSUV3またはΔDSS1株から得られることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
- ミトコンドリアDNAを欠く前記酵母細胞が、外因性RNAポリメラーゼをコードしかつミトコンドリア標的シグナルを有する遺伝子の染色体コピーを含むことを特徴とする請求項1〜3のいずれか1つに記載の方法。
- 興味対象のRNAをコードする前記DNAが、酵母ミトコンドリア内で機能的なプロモータと転写ターミネーターとの制御下にあることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1つに記載の方法。
- 前記ミトコンドリア形質転換レポーター遺伝子が、酵母呼吸鎖のタンパク質の1つをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1つに記載の方法。
- 前記ミトコンドリア転写ベクターが、ミトコンドリアDNAの複製起点の配列を含むことを特徴とする請求項1〜6のいずれか1つに記載の方法。
- 工程(1)に従う形質転換が、前記ミトコンドリア転写ベクターの金属微小弾丸への吸着および該微小弾丸の前記細胞への発射を含むことを特徴とする請求項1〜7のいずれか1つに記載の方法。
- 工程(1)が、前記ミトコンドリア転写ベクターと核選択マーカーを含む酵母で複製可能なベクターとを用いる前記酵母細胞の共形質転換を含むことを特徴とする請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
- 前記核マーカーが、前記形質転換細胞の栄養要求性マーカーであることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 工程(2)が、
(a0) 工程(1)で得られた酵母ミトコンドリア形質転換体をrho+ mit-型の酵母テスター株と交雑させ、
(b0) 一旦交雑させると非発酵性培地上で増殖できる二倍体細胞を与えるミトコンドリア形質転換体を同定し、そして
(c0) ミトコンドリア形質転換ベクターを有するミトコンドリア形質転換体であると同定される単離酵母コロニーが得られるまで前記の交雑を繰り返す
ことを含むことを特徴とする請求項1〜10のいずれか1つに記載の方法。 - 工程(2)が、
(a1) 選択培地で培養することによる、前記の核マーカーによる酵母細胞の第一選択または予備選択、
(b1) 工程(a1)で選択された酵母細胞からの、請求項11で規定される工程(a0)、(b0)および(c0)による第二選択
を含むことを特徴とする請求項9または10に記載の方法。 - 前記方法の工程(4)によるミトコンドリアの単離が、前記細胞の溶解または粉砕と、次いで好ましくは750 g〜12,500 gの速度での少なくとも2回の遠心分離工程と、最終の遠心分離ペレットの回収とを含むことを特徴とする請求項1〜12のいずれか1つに記載の方法。
- 工程(5)が、
- 第一のバッファーが少なくとも1種の二価イオンキレート剤を含みかつ第二のバッファーがRNアーゼと任意にDNアーゼとを含む適切なバッファーの存在下に、混入核酸を除去し、
- 少なくとも1種の界面活性剤と二価イオンキレート剤との存在下に、7〜8の範囲内のpHでミトコンドリアを溶解させ、そして
- 興味対象のRNAを単離および精製する
ことを含むことを特徴とする請求項1〜13のいずれか1つに記載の方法。 - ミトコンドリアDNAを欠き、外因性RNAポリメラーゼをコードしかつミトコンドリア標的シグナルを有する遺伝子の染色体コピーを含むことを特徴とする改変酵母細胞。
- ミトコンドリアDNAを欠き、ミトコンドリアが請求項1および5〜7のいずれか1つで規定されるミトコンドリア転写ベクターで形質転換されたことを特徴とする改変酵母細胞。
- ΔSUV3またはΔDSS1株から得られることを特徴とする請求項15または16に記載の改変酵母細胞。
- rho0株から得られることを特徴とする請求項15〜17のいずれか1つに記載の改変酵母細胞。
- ミトコンドリアDNAを欠く酵母ミトコンドリア形質転換体の、興味対象の異種RNAの工業的作製のための使用。
- - 請求項1および5〜7のいずれか1つで規定される少なくとも1つのミトコンドリア転写ベクターで形質転換された、ミトコンドリアDNAを欠く酵母細胞、
- 前記形質転換細胞を選択するための非発酵性炭素源を含む少なくとも1種の培地、
- rho+ mit-型の酵母テスター細胞、
- 発酵槽および培地、ならびに
- 合成rho-細胞からミトコンドリアを単離し、そこから興味対象の異種RNAを抽出するための試薬
を含むことを特徴とする興味対象の異種RNAの工業的作製を行うためのシステム。
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