ES2320896T3 - Procedimiento de produccion industrial de arn y sistema util para dicha produccion. - Google Patents

Abstract

Procedimiento de producción de un ARN heterólogo de interés, procedimiento que se caracteriza porque comprende al menos las siguientes etapas: 1) la transformación de las mitocondrias de células de levadura desprovistas de ADN mitocondrial con un vector de transcripción mitocondrial que comprende al menos una copia del ADN que codifica dicho ARN heterólogo de interés bajo el control de elemento(s) regulador(es) de la transcripción mitocondrial y un gen informador de la transformación mitocondrial o un fragmento de dicho gen informador, 2) la identificación de los transformantes mitocondriales de levadura que han incorporado el ADN de interés, 3) el cultivo de los transformantes mitocondriales de levadura seleccionados en la etapa 2), 4) el aislamiento de las mitocondrias, a partir de los transformantes mitocondriales de levadura obtenidos en la etapa 3) y 5) la extracción y la purificación del ARN heterólogo de interés, a partir de dichas mitocondrias.

Description

Procedimiento de producción industrial de ARN y sistema útil para dicha producción.

La presente invención se refiere a un procedimiento de producción industrial de ARN de interés.

La presente invención también se refiere a un sistema útil para la producción industrial de ARN de interés.

Existe, en efecto, una necesidad de producción en grandes cantidades de ARN de interés para la producción de medicamentos (ARN interferente o siRNA), el estudio de la estructura de los ARN (cristalización, RMN, complejos), así como el análisis de la función de los genes in vitro en cultivo celular o in vivo, particularmente mediante inhibición de la expresión de estos genes con siRNA.

Los métodos utilizados habitualmente para la producción de una secuencia específica de ARN son esencialmente la transcripción in vitro y la síntesis química.

Las reacciones de transcripción in vitro emplean ARN polimerasas de bacteriófago (SP6, T7 o T3). El rendimiento de estas reacciones de síntesis y las cantidades de producto obtenido están en general limitadas, particularmente debido a factores limitantes, tales como las concentraciones de nucleótidos (efecto inhibidor de concentraciones de nucleótidos > 8 mM, por ejemplo), las concentraciones de los diferentes elementos que constituyen el medio de reacción y particularmente la concentración de iones Mg^{++}. De manera general, se admite que las concentraciones de magnesio deben estar en exceso en las reacciones de transcripción in vitro. La utilización de piro-fosfatasa, en asociación con los iones Mg^{++} también se ha propuesto y se considera como mejoradora del rendimiento de la reacción de transcripción.

Otra complicación que se plantea en la síntesis in vitro de polinucleótidos es la inhibición de las polimerasas de fagos a concentraciones de iones relativamente bajas.

Para evitar estos diferentes inconvenientes, se propuso la utilización de medios de reacción mejorados en la patente US 5.256.555 que describe la utilización de un medio de reacción que comprende concentraciones totales molares elevadas de nucleótidos (entre 12 mM y 40 mM), que anteriormente se consideraban concentraciones inhibidoras y una cantidad eficaz de Mg^{++}, que está por debajo de la saturación con respecto a las concentraciones totales molares de nucleótidos, de piro-fosfatasa y de Mg^{++}-nucleótidos o Tris-nucleótidos.

A pesar de las diferentes mejoras propuestas, la transcripción in vitro para producir ARN de interés, presenta los siguientes inconvenientes:

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inducción de reacciones parásitas (actividad N+1) que aumentan la heterogeneidad de los productos de transcripción y requieren una purificación exhaustiva del ARN;

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limitación en cuanto a la cantidad y el tamaño del ARN sintetizado;

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coste de producción relativamente elevado.

Aunque existen sistemas celulares para producir proteínas de interés in vivo, particularmente en células de levadura, no existe un sistema comparable para producir ARN de interés.

En efecto:

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la Patente de Estados Unidos US 3.272.714 se refiere a la producción industrial de ARN a partir de levaduras cultivadas en un medio en el que la concentración de zinc y de ácido fosfórico así como el coeficiente de absorción de oxígeno están controlados: el procedimiento descrito no permite producir específicamente un ARN de interés sino únicamente una cantidad importante del conjunto de los ARN endógenos de levadura (ARN totales de levadura);

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la solicitud de patente europea 0 317 209 se refiere a la producción industrial de proteínas heterólogas. Para aumentar el nivel de expresión de un gen heterólogo de interés en la levadura, se recomienda sustituir las cepas convencionales de levadura transformadas con un vector de expresión del gen de interés de acuerdo con los protocolos convencionales de transformación citoplasmática (cloruro de litio), por cepas de levadura deficientes para la respiración obtenidas mediante deleción de todo o parte del genoma mitocondrial (cepas rho^{0} y rho^{-}), transformadas con este mismo vector. Dichas levaduras transformadas que son deficientes para la respiración se cultivan en un medio que contiene una fuente de carbono fermentable (glucosa). Incluso aunque este sistema descrito para la producción de proteínas se transponía a la producción de ARN, no permitía producir específicamente un ARN de interés, sino únicamente una mezcla de ARN endógenos de levadura y ARN exógenos de interés en la que la proporción de ARN de interés en la fracción de ARN totales de levadura, aumentó.

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Por consiguiente, la solicitante se ha fijado como objetivo proporcionar un procedimiento de producción de ARN que no presente los inconvenientes de los procedimientos utilizados habitualmente y que de este modo responda mejor a las necesidades de la práctica, ya que permita sintetizar in vivo, en un sistema celular, cualquier ARN de interés en grandes cantidades o con un rendimiento elevado y a un coste significativamente inferior al obtenido con los métodos in vitro de la técnica anterior.

Las mitocondrias son orgánulos celulares que poseen una información genética propia; el ADN mitocondrial de levadura contiene los genes de varias proteínas necesarias para la función respiratoria de las mitocondrias, así como algunos genes necesarios para el funcionamiento del aparato de síntesis proteica mitocondrial (figura 1). Se han desarrollado métodos de transformación mitocondrial (método de bombardeo biolístico) en levadura, con el fin de analizar la función de los genes mitocondriales y la regulación de su expresión (Jonhston et al., Science, 1988, 240, 1538; Bonnefoy et al., Methods in Enzymology, 2001, 350, 97, 111; Anziano y Butow, P.N.A.S., 1991, 88, 5592-5596). En una primera etapa, una cepa de levadura desprovista de ADN mitocondrial (cepa rho^{0}) se bombardea con un ADN exógeno adsorbido en microproyectiles metálicos, para producir una cepa rho^{-} sintética; el ADN exógeno, generalmente un plásmido, contiene todo o parte del gen a analizar y un fragmento de un marcador o informador (gen de la cadena respiratoria que permite el crecimiento en medio no fermentable). En una segunda etapa, las levaduras rho^{-} sintéticas que han incorporado el ADN exógeno se identifican mediante cruce con levaduras de prueba rho^{+} que comprenden una mutación en dicho gen marcador o informador, y aislamiento de las levaduras rho^{-} sintéticas adecuadas para producir diploides capaces de crecer en medio no fermentable.

La cepa rho^{-} sintética identificada de este modo se cruza con una cepa de levadura adecuada para el estudio de dicho gen mitocondrial (cepa que tiene una mutación en dicho gen o cepa de tipo silvestre (genética inversa)) y el efecto en cis (recombinación homóloga) o en trans del gen mitocondrial se analiza en las levaduras que resultan del cruce.

Los Solicitantes demostraron que las cepas de levadura rho^{0} pueden transformarse ventajosamente con un ADN que codifica un ARN heterólogo de interés (ARN no codificado por un gen mitocondrial) y utilizarse para producir el ARN de interés en sus mitocondrias. Este ARN se aísla fácilmente en forma estable y en gran cantidad, a partir de las mitocondrias de la cepa rho^{-} sintética, en la medida en que los únicos ARN producidos en las mitocondrias de dicha cepa rho^{-} sintética son los codificados por el ADN utilizado para la transformación.

La presente invención se refiere por consiguiente a un procedimiento de producción de un ARN heterólogo de interés, procedimiento que se caracteriza porque comprende al menos las siguientes etapas:

1)

la transformación de las mitocondrias de células de levadura, particularmente de S. cerevisiae, desprovistas de ADN mitocondrial (cepa rho^{0}) con un vector de transcripción mitocondrial que comprende ADN que codifica dicho ARN heterólogo de interés bajo el control de elemento(s) regulador(es) de la transcripción mitocondrial y un gen informador de la transformación mitocondrial o un fragmento de dicho gen informador; el procedimiento de acuerdo con la invención permite de este modo la transcripción de toda secuencia heteróloga de ADN ya sea de origen intra o inter-específico (incluyendo ADN mitocondriales de organismos diferentes de levadura o ADN cloroplásticos), así como secuencias de ADN sintéticas que no existen en la naturaleza; de este modo se obtiene un transformante mitocondrial o una cepa rho^{-} sintética.

2)

La identificación de los transformantes mitocondriales de levadura que han incorporado el ADN de interés,

3)

El cultivo de los transformantes mitocondriales de levadura seleccionados en la etapa 2), preferiblemente en fase exponencial de crecimiento,

4)

El aislamiento de las mitocondrias, a partir de los transformantes mitocondriales de levadura cultivados de acuerdo con la etapa 3) y

5)

La extracción y la purificación del ARN heterólogo de interés, a partir de dichas mitocondrias.

En las condiciones del procedimiento de acuerdo con la invención, el ARN obtenido es estable.

El procedimiento de la invención permite producir simultáneamente uno o más ARN de interés a partir del vector de transcripción mitocondrial.

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Definiciones (véase figuras 1 a 3)

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las expresiones "célula de levadura", "cepa de levadura", "célula", "levadura" y "cepa", se consideran equivalentes en el contexto de la presente invención y se emplean de forma indiferente; lo mismo ocurre para las cepas de levadura rho^{+}, rho^{0} y rho^{-} tales como se definen a continuación.

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ARN heterólogo de interés: cualquier ARN natural o sintético, no codificado por el genoma mitocondrial de levadura.

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Cepa rho^{+}: cepa de levadura que comprende un ADN mitocondrial intacto y funcional, como en cepas silvestres, o un ADN mitocondrial que tiene alteraciones locales en su secuencia, de tipo mit^{-}, que inactivan la función respiratoria de las mitocondrias (figura 1).

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Cepa rho^{0}: cepa de levadura desprovista de ADN mitocondrial, caracterizada por una incapacidad de crecimiento en un medio que contiene una fuente de carbono no fermentable y una ausencia de síntesis proteica mitocondrial (figura 1).

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Cepa rho^{-} : cepa de levadura que comprende una gran deleción, siempre superior al 50%, del genoma mitocondrial. La región del genoma mitocondrial conservada es reiterada, directamente o en palíndromo, para reconstituir una masa de ADN mitocondrial equivalente a la que existe en una célula silvestre de levadura. Las deleciones de tipo rho^{-} conllevan siempre con ellas al menos uno de los genes mitocondriales necesario para las síntesis proteicas mitocondriales, dado que estos genes se distribuyen uniformemente a lo largo del genoma mitocondrial. Las cepas rho^{-} son por lo tanto fenotípicamente equivalentes a cepas rho^{0} con la pérdida de toda actividad de síntesis proteica mitocondrial y por lo tanto la inactivación total de la función respiratoria del orgánulo (figura 1).

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Cepa rho^{-} sintética: cepa de levadura inicialmente rho^{0} cuyas mitocondrias se han transformado con un ADN exógeno (ADN heterólogo), particularmente mediante el método de bombardeo biolístico de células de levadura mencionada anteriormente. Esta transformación se hace posible por la capacidad de las células de levadura de poder replicar y mantener cualquier fragmento de ADN, particularmente un vector bacteriano (plásmido). Por las razones enumeradas anteriormente, no puede sintetizarse ninguna proteína en las mitocondrias de células rho^{-} sintéticas. Por el contrario, la maquinaria de transcripción mitocondrial es funcional en estas células. De este modo, la introducción de un fragmento de ADN que tiene un gen de interés dependiente de las secuencias señal de transcripción mitocondrial, en las mitocondrias de una célula rho^{0}, permite obtener una cepa de levadura que expresa en sus mitocondrias únicamente el ARN de dicho gen pero sin la proteína correspondiente. Como en una cepa rho^{-} natural, el ADN introducido artificialmente en las mitocondrias se reiterará para producir en el orgánulo una masa de ADN equivalente a la presente en mitocondrias de cepa silvestre rho^{+}. El gen de interés estará por lo tanto presente en la cepa rho^{-} sintética en un número relativamente elevado de copias (más de 3000 para un gen de interés de aproximadamente 1 kb). Por lo tanto, es por estas propiedades próximas a las de las células rho^{-} (naturales), que dichas células se denominan por analogía células rho^{-} sintéticas (figura 2).

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Cepa mit^{-}: cepa de levadura que comprende una alteración local (sustitución de nucleótidos, deleción o inserción corta) en la secuencia de un gen mitocondrial que codifica una de las sub-unidades del sistema energético mitocondria como el gen COXII o COX2.

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Transformantes mitocondriales: transformantes obtenidos particularmente mediante bombardeo de las células de levadura, de acuerdo con el método biolístico mencionado anteriormente. el bombardeo de una cepa rho^{0} conduce a la obtención de transformantes mitocondriales que son rho^{-} sintéticos. Cualquier vector puede utilizarse para los bombardeos, pero para identificar los transformantes mitocondriales, es preciso un vector que comprende un marcador del genoma mitocondrial de la levadura, por ejemplo el gen COX2 o un fragmento de dicho gen.

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Recombinantes mitocondriales: se obtienen mediante recombinación homóloga después de la puesta en contacto de la cepa rho^{-} sintética con una cepa rho^{+}.

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Marcador de auxotrofía: mutación en un gen conocido de la ruta de biosíntesis o de utilización de un aminoácido, de un nucleótido, de un sustrato carbonado, etc.

De manera sorprendente, el procedimiento de acuerdo con la invención:

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es fácilmente industrializable (utilización de fermentadores convencionales) y

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permite efectivamente obtener el ARN de interés en grandes cantidades, con un coste reducido, después de que se haya realizado una purificación fácil.

Además, el procedimiento presenta las siguientes ventajas:

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el hecho de que incluye una síntesis in vivo, en levaduras, del ARN de interés, le permite beneficiarse de todos los controles de calidad celular, particularmente: (1) una fidelidad de transcripción máxima, que minimiza considerablemente los riesgos de error de incorporación, en varios órdenes de magnitud con respecto a los procedimientos existentes, y (2) una ausencia de modificaciones post-transcripcionales que tienen como efecto cambiar la secuencia del ARN con respecto a la secuencia de su gen, debido a que no existe edición del ARN en las mitocondrias de levadura,

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los costes de fabricación son esencialmente independientes de la longitud del ARN. Están esencialmente constituidos por la compra de reactivos poco costosos (medios de cultivo y productos para la purificación del ARN), mientras que los procedimientos de la técnica anterior utilizan reactivos muy caros (nucleótidos, kit enzimáticos) en grandes cantidades.

Dicho procedimiento constituye por lo tanto una alternativa particularmente ventajosa a los procedimientos de producción de ARN in vitro, de acuerdo con la técnica anterior, económicamente y desde el punto de vista de la calidad de las moléculas fabricadas.

De acuerdo con la invención, previamente a la etapa (1), dicho ADN que codifica el ARN de interés puede amplificarse, particularmente por PCR y después se clona en dicho vector de transcripción mitocondrial. En dicho caso, los cebadores de oligonucleótidos se establecen de la siguiente manera: el oligonucleótido P1 es complementario de la región 5' del ADN de interés adyacente al +1 de la transcripción. Éste comprende ventajosamente un sitio de restricción que permite la clonación del ADN amplificado en el vector de transformación y opcionalmente un sitio que facilita la purificación del ARN de interés. El oligonucleótido P2 es, a su vez, complementario a la región 3' del ADN de interés adyacente al codón de terminación de la transcripción. También aquí, el oligonucleótido comprende ventajosamente un sitio de restricción para la clonación del ADN amplificado y opcionalmente secuencias que facilitan la purificación del ARN de interés. Las secuencias que facilitan la purificación del ARN de interés son particularmente secuencias complementarias de oligonucleótidos acoplados a una fase sólida; por ejemplo una secuencia oligodA permite purificar el ARN-oligoA obtenido de este modo, con ayuda de un oligoT acoplado particularmente a perlas magnéticas. Ventajosamente, dichas secuencias que facilitan la purificación del ARN de interés son secuencias que pueden escindirse.

De acuerdo con una realización ventajosa de dicho procedimiento, dicha secuencia de ADN que codifica el ARN de interés está bajo el control de un promotor y de un terminador de la transcripción funcionales en las mitocondrias de levadura. Entre las secuencias reguladoras utilizables pueden mencionarse de forma no limitante las secuencias señal de expresión de genes mitocondriales tales como COX1 y COX2.

De acuerdo con otra realización ventajosa del procedimiento de acuerdo con la invención, dicho gen informador de la transformación mitocondrial es un gen que codifica una de las proteínas de la cadena respiratoria de levadura [genes del apocitocromo b y de las sub-unidades I, II y III de la citocromo-oxidasa (COX)]; correspondiendo dicho gen a una unidad de transcripción funcional que incluye el promotor, la secuencia codificante y el terminador de la transcripción.

Cuando se emplea un vector que contiene un gen informador de la transformación mitocondrial, preferiblemente un vector de origen bacteriano (plásmido), por ejemplo el plásmido pUC18, solamente dos ARN son por lo tanto producidos en el sistema de acuerdo con la invención: ARN del gen informador (COX2) y el ARN de interés. Por lo tanto, es fácil separar estos dos ARN debido a sus tamaños respectivos, por ejemplo mediante electroforesis, HPLC, RMN, afinidad, etc. Además, este gen informador permite la complementación de un alelo mit^{-} del gen informador presente en la cepa de prueba de la transformación, en trans (transcomplementación) o mediante recombinación homóloga.

De acuerdo con otra realización ventajosa del procedimiento de acuerdo con la invención, dicho vector de transformación mitocondrial contienen un fragmento de un gen informador de la transformación mitocondrial tal como se ha definido anteriormente. Cuando el gen informador (COX2) se sustituye por un fragmento de este mismo gen que no se ha transcrito, la purificación del ARN de interés es más fácil dado que dicho ARN de interés es el único y exclusivo ARN presente en las mitocondrias. Además, este fragmento de gen informador permite la complementación mediante recombinación homóloga de un alelo mit^{-} de dicho gen informador presente en la cepa de prueba de la transformación.

El vector de transformación mitocondrial tal como se ha definido anteriormente puede mejorase además de la siguiente manera: introduciendo (i) secuencias que permitan una mayor estabilidad del gen de interés por ejemplo mediante adición de una secuencia Ori (origen de replicación del ADN mitocondrial) de levadura tal como S. cerevisiae, para aumentar la eficacia de replicación del vector en las mitocondrias y/o (ii) secuencias que facilitan la purificación del ARN tales como se han definido anteriormente y opcionalmente secuencias que permitan eliminar las secuencias de maduración del ARN.

De acuerdo con otra realización ventajosa del procedimiento de acuerdo con la invención, la transformación de acuerdo con la etapa (1) comprende la adsorción de dicho vector de transcripción mitocondrial en microproyectiles metálicos (tungsteno u oro) y la proyección de dichos microproyectiles en dichas células, de manera conocida por sí misma, de acuerdo con por ejemplo el procedimiento de biolística tal como se describe en el artículo de N. Bonnefoy et al., (Methods in Enzymology, 2001, 350, 97-111). El aparato utilizado es por ejemplo un sistema PDS-1000/He (BioRad). Este instrumento utiliza una onda de choque de helio para la aceleración de las partículas microscópicas en dirección a un tapiz de células en una placa de Petri. Estas partículas tienen un tamaño de 0,45 \mum de diámetro, lo que representa aproximadamente el 10% del diámetro de una célula de levadura. En un número limitado de células, estos microproyectiles atraviesan la pared de la levadura y alcanzan la mitocondria. Al no contener las mitocondrias de las células rho^{0} ADN propio, el ADN introducido por biolística es el único y exclusivo ADN presente en estos orgánulos y de este modo se obtienen células rho^{-} sintéticas.

De acuerdo con otra realización ventajosa del procedimiento de acuerdo con la invención, las células de levadura desprovistas de ADN mitocondrial son las de una cepa rho^{0}. Como ejemplo no limitante, pueden mencionarse las cepas rho^{0} siguiente derivadas de la cepa DBY947: ATCC 201440 (MCC109rho^{0} [MATa, ade2-101, ura3-52, karl-1 (rho^{0})]), ATCC 201442 (MCC123rho^{0} [MATa, ade2-101, ura3-52, karl-1 (rho^{0})]) y DFS160rho^{0} (M.E. Sanchirico et al., EMBO J., 1998, 17, 19, 5796-5804. d: Steele et al., PNAS, 1996, 93, 5253-5257).

De acuerdo con otra realización ventajosa del procedimiento de acuerdo con la invención, dichas células de levadura desprovistas de ADN mitocondrial se modifican de modo que los genes que codifican proteínas de degradación del ARN en la mitocondria estén inactivados (modificados o delecionados). Actualmente se conocen varias proteínas mitocondriales, todas de origen nuclear, que intervienen en el recambio de los ARN mitocondriales, como por ejemplo Suv3p y una sub-unidad de una exorribonucleasa 3'-5' (DSS1p). Utilizando cepas de levadura en las que los genes de estas proteínas se han inactivado (cepas \DeltaSUV3 o \DeltaDSS1) como particularmente las cepas \DeltaSUV3\Deltai y \DeltaDSS\Deltai (Dziembowski et al., J. Biol. Chem., 2003, 278, 1603-1611) o las cepas ATCC Nº 4002799, 4012799, 4022799 y 4032799, puede aumentarse la estabilidad de los ARN sintetizados en la mitocondria, de acuerdo con el procedimiento de la invención.

De acuerdo con otra realización ventajosa del procedimiento de acuerdo con la invención, dichas células de levadura desprovistas de ADN mitocondrial comprenden una copia de un gen que codifica una ARN polimerasa exógena y que incluye una secuencia de dirección mitocondrial, integrada en su cromosoma (copia cromosómica).

Las secuencias de ARN polimerasa exógenas funcionales en células de levadura y las secuencias de dirección mitocondriales se conocen; éstas se introducen en el cromosoma de levadura mediante recombinación homóloga, de acuerdo con las técnicas convencionales conocidas por el especialista en la técnica.

La mayoría de las proteínas mitocondriales son de origen nuclear. Éste es el caso en particular para la maquinaria proteica necesaria para la transcripción del ADN en ARN. Esta maquinaria es importada por lo tanto hacia la mitocondria y sigue siendo funcional incluso cuando las células son rho^{0} y por lo tanto desprovistas de ADN mitocondrial. Por el contrario, una parte de la maquinaria de traducción del ARN a proteína está codificada por el genoma mitocondrial. Por consiguiente, si el genoma mitocondrial está ausente, éste es el caso en las células rho^{-} sintéticas, el ADN extraño introducido en la mitocondria no se traduce a proteína. En este contexto, el ADN introducido por biolística es el único y exclusivo ADN presente en las mitocondrias de las células rho^{-} sintéticas obtenidas. Éste se transcribirá a ARN pero este ARN no se traducirá a proteína.

De acuerdo con otra realización ventajosa de dicho procedimiento, la etapa (1) comprende la co-transformación de la levadura con dicho vector de transcripción mitocondrial y un vector replicativo en la levadura que comprende un marcador de selección nuclear, como un marcador de auxotrofía de las células transformadas tal como LEU2, dicho vector es por ejemplo pFL46L (ATCC Nº 77210) o Yep351 (ATCC Nº 37672) (figura 3). El gen silvestre portado por el plásmido complementará de este modo funcionalmente al gen mutado portado por las células transformadas.

De acuerdo con otra realización ventajosa del procedimiento de acuerdo con la invención, la etapa (2) comprende:

(a_{0})

el cruce de las levaduras transformadas rho^{-} sintéticas, obtenidas al finalizar la etapa (1), con una cepa de prueba de levadura e tipo rho^{+} mit^{-}, para facilitar la identificación de dichas células transformadas, conteniendo dicha cepa de prueba una alteración local (sustitución de nucleótidos (mutación puntual), deleción o inserción corta) en una región del genoma mitocondrial que corresponde al gen informador de la transformación mitocondrial o al fragmento del este gen utilizado en la etapa (1), por ejemplo uno de los genes de la cadena respiratoria de levadura tal como COX2; la secuencia silvestre correspondiente (gen o fragmento de gen) es portada por el vector de transcripción mitocondrial utilizado para transformar la mitocondria de la cepa hospedadora rho^{0} en la etapa (1),

(b_{0})

la identificación de los transformantes mitocondriales (células rho^{-} sintéticas) que dan, una vez cruzados, células diploides, capaces de crecer en un medio no fermentable: solamente las células de la cepa hospedadora que contienen en sus mitocondrias el vector de transcripción mitocondrial que tiene el gen de interés y el alelo silvestre de la mutación mit^{-} presente en el ADN mitocondria de la cepa de prueba darán, después de la recombinación de los ADN mitocondriales parentales, células diploides recombinantes rho^{+} mit^{+} que se detectarán mediante su capacidad para crecer en un medio no fermentable (medio respiratorio), después de la réplica en placa (en terciopelo) de los diploides en dicho medio. En este medio, por ejemplo, en el caso en que el vector de transcripción mitocondrial contiene un fragmento de gen informador, ni los parentales del cruce (cepa hospedadora rho^{0} y cepa de prueba rho^{+} mit^{-}), ni los diploides no recombinantes rho^{+} mit^{-} obtenidos de este crecimiento serán capaces de crecer. Esta etapa permite delimitar en la placa inicial obtenida después del bombardeo de la cepa hospedadora rho^{0} zonas en las que se encuentran células de esta cepa hospedadora cuyas mitocondrias han adquirido el vector de transcripción mitocondrial que tiene el gen de interés y

(c_{0})

la repetición de dicho cruce hasta la obtención de colonias de levaduras aisladas, identificadas como transformantes mitocondriales portadores del vector de transformación mitocondrial (células rho^{-} sintéticas).

De manera más precisa, los transformantes nucleares obtenidos después del bombardeo se cruzan con una cepa que posee un ADN mitocondrial rho^{+} pero también una mutación mit^{-} que impide el crecimiento en un medio respiratorio; la secuencia silvestre correspondiente está presente en el gen informador o el fragmento de gen informador portado por el vector de transcripción mitocondrial comprendido en la cepa rho^{-} sintética. De esta manera, después del cruce, el ADN mitocondrial mutado y la secuencia silvestre correspondiente en la cepa rho^{-} sintética estarán presentes juntos. La recombinación homóloga permitirá entonces corregir la mutación mit^{-} y los diploides obtenidos recuperarán un crecimiento respiratorio, de ahí la expresión "marker rescue". En la práctica: se considera de 1000 a 10000 transformantes nucleares distribuidos en la placa después del bombardeo entre los cuales se quiere identificar los que también son transformantes mitocondriales. Se replica por lo tanto esta placa en terciopelo (para conservar la misma disposición de los clones en la placa de Petri) en una placa del mismo medio (placa de reserva) y en un tapiz de la cepa de prueba rho^{+} mit^{-}. Después del cruce, esta última se replica en un medio respiratorio para localizar los clones que permitieron el rescate de marcadores o "marker rescue". Volvemos entonces a la placa de reserva (sin crecimiento, réplica de la placa original) y se recuperan los clones rho^{-} sintéticas haploides correspondientes ya que son estos los que se seleccionan finalmente (figura 3).

En otras palabras, las dos cepas que se cruzan en la etapa (a_{0}) no pueden crecer en un medio no fermentable. Por lo tanto, será fácil localizar los clones recombinantes que recuperaron la capacidad de crecer en este tipo de medio. Por lo tanto, no es necesario seleccionar los diploides en un medio específico (a nivel de los marcadores de auxotrofía) antes de replicar los cruces en un medio no fermentable. Solamente las células de la cepa hospedadora que contienen en sus mitocondrias el vector de transcripción mitocondrial podrán dar, después del cruce, clones que pueden crecer en un medio no fermentable.

Son posibles varios casos: diploides recombinantes pero también diploides no recombinantes si el gen marcador está completo en el vector (complementación en trans con ARN producido por el ADN de la cepa rho^{-} sintética) y finalmente citoductantes recombinantes o no (la mutación kar 1-1 de una de las 2 cepas retrasa la fusión de los núcleos y permite obtener después del cruce de los haploides que han sufrido, cuando menos, una fusión de los citoplasmas y por lo tanto de las mitocondrias).

En la etapa (c_{0}), la purificación de los transformantes mitocondriales se realiza extrayendo en la placa de reserva (no cruzada) la zona en la que se ha localizado un clon que da, después del cruce, un crecimiento en un medio no fermentable y repitiendo el cruce después de nueva propagación de las células en colonias individuales; esta etapa (c_{0}) permite por lo tanto seleccionar, en la segunda o tercera vuelta, una colonia de un transformante mitocondrial puro. En efecto, el problema es que entre 5000 clones en una sola placa, no se puede estar seguro de haber recuperado un clon puro sino solamente una zona mezclada a partir de la cual es preferible purificar la cepa rho^{-} sintética. Para esto se extiende la zona recuperada en colonias individuales y se vuelve a realizar el mismo cruce de prueba. Después de aproximadamente 3 purificaciones sucesivas, se obtiene un clon puro rho^{-} sintético.

Como variante, la etapa (2) comprende:

(a_{1})

una primera selección o preselección de las células de levadura con ayuda del marcador nuclear tal como se ha definido anteriormente, mediante cultivo en un medio apropiado,

(b_{1})

una segunda selección a partir de las células de levadura seleccionadas en (a_{1}), de acuerdo con las etapas (a_{0}), (b_{0} y (c_{0}), tal como se han definido anteriormente.

Por ejemplo, una vez bombardeadas las células rho^{0}, éstas se incuban a 28ºC, temperatura óptima de crecimiento de la levadura. En un primer momento, las células se incuban en un medio selectivo desprovisto del aminoácido o del nucleótido correspondiente al marcador de auxotrofía de dichas células. Esta mutación hace al crecimiento de dichas células dependiente de la adición en el medio de cultivo por ejemplo del aminoácido que ya no puede sintetizarse. Para identificar los transformantes mitocondriales, las levaduras capaces de crecer en medio selectivo se cruzan con una cepa de signo sexual opuesto. Esta cepa es mit^{-}, su ADN mitocondrial está presente, pero el gen COX2 se delecionó. Los diploides se seleccionan en medio con fuente de carbono no fermentable. Solamente las levaduras cuyas mitocondrias se han transformado con el plásmido que tiene COX2 pueden formar diploides viables con la cepa mit^{-} COX2^{-} en este tipo de medio (complementación mediante recombinación de ADN o en trans con ARN "silvestre" de COX2 en la cepa rho^{-} sintética). Este cruce se repite entonces hasta la obtención de colonias aisladas iden-
tificadas como transformantes mitocondriales capaces de producir el ARN de interés en sus mitocondrias (figura 3).

Preferiblemente y de acuerdo con la invención, después de cruce con una cepa que tiene una mutación mit^{-}, por ejemplo en el gen COX2, la complementación de esta mutación puede hacerse transitoriamente en trans mediante traducción del ARN mensajero del gen silvestre (COX2) aportado por la cepa rho^{-} sintética, después de la fusión de las redes mitocondriales parentales. Este cruce constituye un ensayo para identificar y seleccionar los transformantes de interés para la producción del ARN de interés.

En otras palabras, después del bombardeo de las células rho^{0}, se procede en primer lugar y preferiblemente a la selección de los transformantes nucleares. Estos son numerosos (5000 por placa de Petri), de modo que las colonias a las que dan origen no se separan bien unas de otras. Por lo tanto, en un primer momento, los cruces con la cepa de prueba (con una réplica en terciopelo) permitirán delimitar en la placa de reserva original las regiones que contienen transformantes mitocondriales (en general diez por placa). Las células de esta zona se diluirán y se extenderán de nuevo en un medio sólido, para obtener esta vez colonias bien separadas. Estas colonias individuales se ponen a prueba de nuevo mediante cruce con la cepa mit^{-} de prueba para identificar las obtenidas de células que contienen en sus mitocondrias el ADN de interés.

De acuerdo con otra realización del procedimiento de acuerdo con la invención, el aislamiento de las mitocondrias, de acuerdo con la etapa (4) del procedimiento de acuerdo con la invención, comprende ventajosamente, después de la lisis o destrucción de dichas células, un aislamiento de las mitocondrias de acuerdo con métodos conocidos, particularmente en gradiente de sacarosa o de acuerdo con el método descrito en Guérin B. et al., Methods Enzymol., 1979, 55, 149-59.

Preferiblemente, la etapa (4) del procedimiento de acuerdo con la invención comprende ventajosamente después de la lisis o trituración de dichas células, el aislamiento de las mitocondrias mediante al menos dos etapas de centrifugado apropiadas, con velocidades comprendidas preferiblemente entre 750 g y 12.500 g; y la recuperación del último sedimento de centrifugado.

De acuerdo con la invención, la purificación del ARN mitocondrial de acuerdo con la etapa (5) se realiza mediante técnicas convencionales. Ésta puede realizarse de acuerdo con el protocolo descrito en el documento di Rago JP. et al., J. Biol. Chem., 1988, 263, 12564-12570 o un protocolo modificado en el que la etapa de extracción y de purificación del ARN de interés mediante extracciones fenólicas sucesivas se sustituye por una etapa de purificación del ARN mediante adsorción en una resina apropiada, seguida de la elución del ARN en una solución apropiada, particularmente en agua.

De acuerdo con otra realización del procedimiento de acuerdo con la invención, la purificación del ARN de acuerdo con la etapa (5) comprende:

-

la eliminación de los ácidos nucleicos contaminantes en particular de numerosos ARN fijados en la periferia de la mitocondria, en presencia de tampones apropiados, comprendiendo el primer tampón al menos un quelante de iones bivalentes como EDTA y EGTA y comprendiendo el segundo tampón una ARNasa y opcionalmente una ADNasa,

-

la lisis de las mitocondrias, en presencia de al menos un detergente, un quelante de iones bivalentes y en un intervalo de pH entre 7 y 8; como ejemplo, puede mencionarse el siguiente tampón: SDS al 1%, EDTA 10 mM y Tris/HCl pH 7,5; y

-

el aislamiento y la purificación del ARN de interés mediante cualquier medio apropiado.

El ARN purificado de este modo en solución acuosa se dosifica, se analiza en gel de agarosa y se secuencia.

Dicho ARN puede utilizarse tal cual o puede someterse a etapas suplementarias de modificación, en función de la utilización prevista. Entre estas modificaciones que se realizan de acuerdo con las técnicas convencionales, pueden mencionarse de forma no limitante: el corte de las secuencias de maduración; modificaciones químicas, particularmente para aumentar la estabilidad del ARN in vivo, hibridación de doble cadena, particularmente para formar un siRNA, digestión para obtener fragmentos de pequeño tamaño que abarquen todo el gen.

La presente invención también se refiere a una cepa de levadura desprovista de ADN mitocondrial que comprende una copia cromosómica de un gen que codifica una ARN polimerasa exógena y que incluye una secuencia de dirección mitocondrial. Preferiblemente, dicha cepa se obtiene a partir de las células rho^{0} y/o \DeltaSUV3 o \DeltaDSS1, tal como se han definido anteriormente.

La presente invención también se refiere a un transformante mitocondrial de levadura desprovisto de ADN mitocondrial tal como se ha definido anteriormente. Preferiblemente, dicho transformante se obtiene a partir de una cepa rho^{0} y/o \DeltaSUV3 o \DeltaDSS1 y/o que comprende una ARN polimerasa exógena, tal como se ha definido anteriormente.

La presente invención también se refiere a la utilización de transformantes mitocondriales de células de levadura desprovistas de ADN mitocondrial tal como se han definido anteriormente, para la producción industrial de un ARN heterólogo de interés.

La presente invención también se refiere a un sistema útil para la producción industrial de un ARN heterólogo de interés preseleccionado, caracterizado porque comprende:

-

células de levadura transformadas al menos con un vector de transcripción mitocondrial (células rho^{-} sintéticas) que comprende el ADN que codifica el ARN heterólogo de interés bajo el control de elemento(s) regulador(es) de la transcripción mitocondrial y un gen informador de la transformación mitocondrial o un fragmento de dicho gen informador,

-

al menos un medio de cultivo adecuado que permite seleccionar dichas células transformadas (transformantes mitocondriales),

-

células de levadura de prueba, de tipo rho^{+} mit^{-},

-

fermentadores y medios de cultivo apropiados, y

-

tampones apropiados para aislar las mitocondrias a partir de las células rho^{-} sintéticas y extraer de éstas el ARN de interés.

Además de las disposiciones anteriores, la invención también comprende otras disposiciones, que se verán en la siguiente descripción, que se refiere a ejemplos de realización del procedimiento objeto de la presente invención así como a los dibujos adjuntos, en los que:

- la figura 1 ilustra el ADN mitocondrial de S. cerevisiae; el ADN mitocondrial codifica particularmente: 3 sub-unidades de ATP sintetasa (6, 8, 9); 4 sub-unidades de la cadena respiratoria; 2 ARNr + 1 proteína del mitorribosoma; 24 ARNt;

- la figura 2 ilustra el principio de rescate de marcadores o "marker rescue";

- la figura 3 representa la construcción de una cepa rho^{-} sintética;

- la figura 4 ilustra el análisis de transferencia de Northern del ARN mitocondrial de levaduras rho^{-} sintéticas, transformadas con el vector de transcripción mitocondrial que comprende el gen RIP1.

Debe entenderse por supuesto, sin embargo, que estos ejemplos se proporcionan únicamente a título de ilustración del objeto de la invención, del que no constituyen en modo alguno una limitación.

Ejemplo Producción del ARN del gen PIP1 de acuerdo con el procedimiento de la invención A) Material y métodos 1) Vector de transcripción mitocondrial

pJM2 (pTZ18-U, con COX2 silvestre; YIN J. et al., Tsinghua Science and Technology, 1999, 4, 2; Bio-Rad) en el que se clonó el gen RIP1^{m}, versión en código mitocondria del gen RIP1, que codifica una sub-unidad del complejo III de la cadena respiratoria flanqueado por secuencias señal de expresión de COX1.

2) Vector lanzadera que comprende un marcador de selección nuclear

Yep352 (2 \mu, URA3) (ATCC Nº 37673)

3) Transformación de mitocondrias de S. cerevisiae desprovistas de ADN mitocondrial con los vectores tal como se han descrito en 1) y 2)

La derivada rho^{0} de la cepa W303-1B (Mat\alpha, ade2, trp1, his3, leu2, ura3), denominada W303-1B (ATCC Nº 201238)/A/50, se contransforma con los vectores tal como se han definido en 1) y 2) de acuerdo con el método de biolística descrito en el artículo de N Bonnefoy et al., (Methods in Enzymology, 2001, 350, 97-111), con ayuda de un aparato Biolistic PDS-1000/He (BioRad).

4) Método de identificación de las células transformadas

En un primer momento, se procede a la selección de los transformantes nucleares en un medio sintético desprovisto de uracilo. Los transformantes mitocondriales se identifican entre los transformantes nucleares URA3^{+} por su capacidad para producir diploides con un crecimiento en medio no fermentable después del cruce con la cepa de prueba TF145 (MAT\alpha, ade2) (Speno H. et al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 43, 25363-25369). Esta cepa no es capaz de crecer en medio no fermentable (medio respiratorio) debido a que comprende una deleción en el gen mitocondrial COX2 (cox2-17).

5) Condiciones de cultivo de las células de levadura

Los transformantes mitocondriales se cultivan en fermentadores hasta una fase de crecimiento exponencial en un medio rico que contiene galactosa como fuente de carbono.

6) Método de purificación de las mitocondrias y del ARN 6.1) Aislamiento de las mitocondrias

Los transformantes mitocondriales de levadura se cultivan en fermentador hasta que se obtiene un medio de fase exponencial de crecimiento, es decir una DO entre 3 y 4. Entonces se recogen y se lisan o trituran y sus mitocondrias se purifican mediante métodos convencionales.

En resumen, el protocolo empleado es el siguiente:

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Las mitocondrias de los transformantes mitocondriales se aíslan y purifican después de la digestión de su pared celular con zimolasa en un medio (sorbitol 1,35 M) que protege osmóticamente la integridad de las células a las que se les retiró su pared celular (llamadas esferoplastos). Los esferoplastos se someten a un choque osmótico en un tampón que preserva la integridad de las mitocondrias (sorbitol 0,6 M). Los restos celulares (núcleos, paredes) se eliminan mediante varios (como mínimo 2) centrifugados a baja velocidad (750 g) del lisado de los esferoplastos. El último sobrenadante se centrifuga a alta velocidad (12500 g) para sedimentar las mitocondrias.

De manera más precisa, las condiciones son las siguientes:

I/ Recogida de las levaduras

Las levaduras se centrifugan a baja velocidad (4ºC, 10 minutos a 3800 g).

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II/ 2 Lavados de las levaduras con agua destilada enfriada con hielo

Los sedimentos se resuspenden entonces en agua destilada fría (4ºC).

Se centrifugan a 4ºC, durante 5 minutos a 3800 g. Se elimina el sobrenadante y se lava una segunda vez con agua destilada y después se realiza un nuevo centrifugado en las mismas condiciones.

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III/ Fragilización de la pared celular

El 2-mercaptoetanol rompe los puentes disulfuro entre las diferentes manoproteínas de la pared, facilitando la acción posterior de la zimolasa. A partir de la D.O. a 600 nm del cultivo, se evalúa el peso seco de levadura por medio de la siguiente fórmula:

PS (g) = 0,28 DO Volumen cultivo (L)

Se incuba en un volumen de 20 ml de tampón/g de PS.

Se resuspende por lo tanto el sedimento en un tampón de pre-incubación "SH" (2-mercaptoetanol 0,5 M, Tris-Base 0,1 M, pH 9,3) y se incuba entonces durante 10 minutos a 30ºC con agitación.

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IV/ Lavados de las levaduras con tampón de lavado con KCl

El objetivo de estos lavados es eliminar todo resto de agente reductor.

Se añade el tampón KCl (KCl 0,5 M, Tris-Base 10 mM, pH 7,0) al tampón de pre-incubación SH. Se centrifuga a 4ºC durante 5 minutos a 3800 g. Se elimina el sobrenadante. De este modo se realizan 2 lavados sucesivos con tampón KCl.

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V/ Digestión con Zimolasa a 30ºC de la pared celular

La zimolasa destruye la pared celular.

La pared de las levaduras está constituida por un esqueleto de quitina al que se añaden otras proteínas.

Para digerir la pared, una posibilidad es utilizar la zimolasa producida por la bacteria Arthrobacter luteus o una mezcla enzimática (citohelicasa): enzima de jugo gástrico de caracol (Helix pomatia), que da entonces protoplastos de levadura.

Se resuspende el sedimento con la solución de digestión, a razón de 10 a 15 mg de zimolasa/10 ml de tampón de digestión (sorbitol 1,35 M, EGTA 1 mM, ácido cítrico 10 mM, fosfato disódico 30 mM, pH 5,8).

Se detiene la digestión con zimolasa cuando del 80 al 90% de las células se han digerido, completando con el tampón de lavado de los protoplastos con KCl.

Se centrifuga entonces durante 5 minutos a 12500 g.

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VI/ Lavados de los protoplastos

El sedimento se resuspende rápidamente en el tampón de lavado de los protoplastos (o esferoplastos = células sin su pared) (sorbitol 0,75 M, manitol 0,4 M, BSA al 0,1%, Tris-Maleato 10 mM, pH 6,8). Se centrifuga durante 5 minutos a 12.500 g. El sobrenadante se elimina y después se realiza un segundo lavado del sedimento.

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VII/ Homogeneización y trituraciones

Se resuspenden los sedimentos en varios ml del tampón de homogeneización (manitol 0,6 M, EGTA 2 mM, BSA al 0,2%, Tris-Maleato 10 mM, pH 6,8). Se vierte la preparación en un homogenizador Potter. Se mueve abajo y arriba el homogenizador Potter diez veces; se mezcla la preparación a velocidad moderada, se recupera un máximo de la preparación y después se redistribuye el total en varios tubos.

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VIII/ Aislamiento de las mitocondrias mediante centrifugado diferencial

Se centrifuga a baja velocidad (750 g) durante 8 minutos a 4ºC. Se conservan los sobrenadantes. El sedimento puede resuspenderse opcionalmente en el tampón de homogeneización, centrifugarse y añadirse el sobrenadante al sobrenadante anterior.

Se centrifuga a mayor velocidad (12.500 g) durante 10 minutos a 4ºC y después se eliminan los sobrenadantes.

Los sedimentos se resuspenden en el tampón de recuperación (manitol 0,6 M, EGTA 2 mM, Tris-Maleato 10 mM, pH 6,8).

Se centrifuga a baja velocidad (8 minutos, 750 g a 4ºC) y después se centrifugan los sobrenadantes a alta velocidad (10 minutos 12.500 g a 4ºC). Se elimina el sobrenadante y se realiza opcionalmente un tercer ciclo de centrifugado a baja velocidad/alta velocidad.

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IX/ Recuperación final de las mitocondrias

El sedimento de mitocondrias se resuspende en un volumen mínimo de tampón de recuperación (Manitol, EGTA, Tris-Maleato pH 6,8, tal como se ha definido anteriormente) y después se pasa al homogenizador Potter para homogeneizarlo.

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X/ Rendimiento

Para 2 litros de cultivo, se producen aproximadamente 2-4 g de levaduras.

Una preparación de mitocondrias con zimolasa permite obtener de 1 a 1,5 ml de mitocondrias a una concentración de 30 mg/ml de proteínas mitocondriales, es decir de 30 a 45 mg de proteínas

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6.2) Extracción de los ARN

a) método A

Las mitocondrias se incuban en un primer momento en presencia de EDTA y de EGTA para retirar los polisomas y los ARN situados en la periferia de la mitocondria. Después se lavan en tampón desprovisto de EDTA y de EGTA y se incuban en este mismo tampón en presencia de ARNasa y de ADNasa para retirar los ARN citoplasmáticos situados en la periferia de las mitocondrias y los restos de ADN nuclear. La acción de la ARNasa y la ADNasa se interrumpe mediante centrifugado a 12.500 g. La extracción del ARN de interés se realiza entonces de acuerdo con el protocolo de extracción de ARN mitocondrial descrito en Di Rago et al., 1988, mencionado anteriormente. El sedimento mitocondrial se lava en tampón que contiene EDTA y EGTA y se lisa en presencia de SDS al 1%, EDTA 10 mM y Tris HCl pH 7,5. Los ácidos nucleicos se purifican mediante extracciones fenólicas sucesivas. Las fase acuosa final se lava opcionalmente por acción de cloroformo:ácido isoamílico y después los ácidos nucleicos se precipitan. En esta etapa, el ADN mitocondrial se degrada opcionalmente mediante adición de ADNasa. El ARN purificado de este modo se dosifica, se analiza en gel de agarosa y se secuencia.

De manera más precisa, el protocolo de extracción del ARN mitocondrial es el siguiente:

Al tampón de recuperación (definido anteriormente) se le añadió EDTA 10 mM; los diferentes centrifugados se realizan a 4ºC.

-

Centrifugado a 12.500 g 10'

-

Recuperación en tampón de recuperación, sin EDTA ni EGTA

-

Centrifugado a 12.500 g 10'

-

Resuspensión en tampón de recuperación, sin EDTA ni EGTA. Adición de ARNasa y de ADNasa e incubación de 15' a 37ºC

-

Centrifugado a 12.500 g 10'

-

Lavados en tampón de recuperación, con EDTA y EGTA, seguidos de centrifugados

-

Resuspensión en tampón de lisis (SDS al 2%, EDTA 10 mM, Tris HCl 10 mM, pH 7,5) y adición del mismo volumen de la mezcla de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico 49:49:2. Agitar en vórtice 3', dejar reposar 2' a 4ºC, volver a agitar en vórtice 2-3'

-

Centrifugado 5' a 8.000 g y a 4ºC.

-

Extracción de la fase acuosa y adición de la mezcla de fenol/cloroformo, aproximadamente 5 veces.

-

Adición a la última fase acuosa de 0,3 M de acetato sódico pH 5,2 y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Dejar 15' a -80ºC y después centrifugar 20' a 8.000 g a 4ºC y lavar el sedimento.

-

Resuspensión del sedimento en 3 ml de tampón MgCl_{2} 10 mM, Tris/acetato 20 mM, pH 7,4 que contiene 75 \mul de complejo vanadil-ribonucleósidos (inhibidor de ARNasa) 200 mM y 2 \mul de ADNasa sin ARNasa (en el 50% de glicerol a una concentración de 0,5 mg/ml).

-

Eliminación de la ADNasa con un volumen de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico 49:49:2 y después un volumen de cloroformo/alcohol isoamílico 24:1 y después un volumen de dietiléter saturado en agua.

-

Precipitación de los ARN de la fase acuosa mediante adición de 0,3 M de acetato sódico y 2,5 volúmenes de etanol al 100%.

-

Resuspensión del sedimento en de 50 a 100 \mul de agua estéril.

-

Dosificación y verificación de los ARN y después preparación y purificación suplementaria si fuera necesario.

b) método B

Las mitocondrias se incuban en un primer momento en presencia de EDTA, de EGTA y de ARNasa para eliminar totalmente de la muestra los ARN citosólicos normalmente unidos a la periferia externa del compartimento mitocondrial. La extracción de los ARN situados en el interior de las mitocondrias se realiza entonces con un kit apropiado disponible en el mercado (Rneasy Protect Starter Kit^{TM}, QIAGEN, Nº de Cat. 74121). En este procedimiento, la muestra mitocondrial se lisa con un tampón específico seguido inmediatamente por la purificación de los ARN que contiene en una sola etapa mediante adsorción de los únicos ARN de la muestra en una resina apropiada seguido de la separación de los ARN con agua. El ARN purificado de este modo se dosifica, se analiza en gel de agarosa y se secuencia.

B) Resultados

Los ARN mitocondriales purificados se analizan mediante la técnica de transferencia de Northern con una sonda de ADN específica del gen RIP1, marcada con P^{32} y, como control, una sonda de ADN específica del gen mitocondrial endógeno COX1 también radiomarcado.

La señal con la sonda RIP1 y la ausencia de señal con la sonda COX1 demuestran que las mitocondrias de la cepa rho^{-} sintética contienen el ARN de interés pero no ARN mitocondrial endógeno (figura 4). Por comparación, se observa una señal con la sonda COX1 pero no con la sonda RIP1, con los ARN mitocondriales de una cepa silvestre de levadura rho^{+} mit^{+}.

Estos resultados demuestran por lo tanto que las mitocondrias de la cepa rho^{-} sintética son capaces de producir específicamente el ARN de interés.

De este modo, como se ve en lo anterior, la invención no se limita en absoluto a éstas formas de empleo, de realización y de aplicación que se han descrito anteriormente de forma más explícita; por el contrario, la invención abarca todas las variantes de las mismas que puedan ocurrírsele al especialista en la técnica, sin alejarse del marco, ni del alcance, de la presente invención.

Claims (21)

1. Procedimiento de producción de un ARN heterólogo de interés, procedimiento que se caracteriza porque comprende al menos las siguientes etapas:

1)

la transformación de las mitocondrias de células de levadura desprovistas de ADN mitocondrial con un vector de transcripción mitocondrial que comprende al menos una copia del ADN que codifica dicho ARN heterólogo de interés bajo el control de elemento(s) regulador(es) de la transcripción mitocondrial y un gen informador de la transformación mitocondrial o un fragmento de dicho gen informador,

2)

la identificación de los transformantes mitocondriales de levadura que han incorporado el ADN de interés,

3)

el cultivo de los transformantes mitocondriales de levadura seleccionados en la etapa 2),

4)

el aislamiento de las mitocondrias, a partir de los transformantes mitocondriales de levadura obtenidos en la etapa 3) y

5)

la extracción y la purificación del ARN heterólogo de interés, a partir de dichas mitocondrias.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dichas células de levadura desprovistas de ADN mitocondrial son células rho^{0}.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque dichas células desprovistas de ADN mitocondrial se obtienen a partir de una cepa \DeltaSUV3 o \DeltaDSS1.

4. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dichas células desprovistas de ADN mitocondrial comprenden una copia cromosómica de un gen que codifica una ARN polimerasa exógena y que incluye una señal de dirección mitocondrial.

5. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicho ADN que codifica el ARN de interés está bajo el control de un promotor y de un terminador de la transcripción, funcionales en las mitocondrias de levadura.

6. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho gen informador de la transformación mitocondrial es un gen que codifica una de las proteínas de la cadena respiratoria de levadura.

7. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dicho vector de transcripción mitocondrial comprende la secuencia de un origen de replicación del ADN mitocondrial.

8. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el fragmento del gen informador de la transformación mitocondrial es un fragmento no transcrito de dicho gen informador.

9. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la transformación de acuerdo con la etapa (1) comprende la adsorción de dicho vector de transcripción mitocondrial en microproyectiles metálicos y la proyección de dichos microproyectiles sobre dichas células.

10. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la etapa (1) comprende la co-transformación de dichas células de levadura con dicho vector de transcripción mitocondrial y un vector replicativo en levadura que comprende un marcador de selección nuclear.

11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque dicho marcador nuclear es un marcador de auxotrofía de dichas células transformadas.

12. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la etapa (2) comprende:

(a_{0})

el cruce de los transformantes mitocondriales de levadura obtenidos en la etapa (1) con una cepa de prueba de levadura de tipo rho^{+} mit^{-},

(b_{0})

la identificación de los transformantes mitocondriales que dan, una vez cruzados, células diploides, capaces de crecer en un medio no fermentable y

(c_{0})

la repetición de dicho cruce hasta la obtención de colonias de levaduras aisladas, identificadas como transformantes mitocondriales portadores del vector de transformación mitocondrial.

\newpage

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10 o la reivindicación 11, caracterizado porque la etapa (2) comprende:

(a_{1})

una primera selección o preselección de las células de levadura con ayuda de dicho marcador nuclear, mediante cultivo en un medio apropiado,

(b_{1})

una segunda selección a partir de las células de levadura seleccionadas en (a_{1}), de acuerdo con las etapas (a_{0}), (b_{0} y (c_{0}), tal como se han definido en la reivindicación 12.

14. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el aislamiento de las mitocondrias, de acuerdo con la etapa (4) del procedimiento, comprende la lisis o la trituración de dichas células y después al menos dos etapas de centrifugado, a velocidades preferiblemente comprendidas entre 750 g y 12.500 g y la recuperación del último sedimento de centrifugado.

15. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque la etapa (5) comprende ventajosamente:

-

la eliminación de los ácidos nucleicos contaminantes en presencia de tampones apropiados, comprendiendo el primer tampón al menos un quelante de iones bivalentes y comprendiendo el segundo tampón una ARNasa y opcionalmente una ADNasa,

-

la lisis de las mitocondrias, en presencia de al menos un detergente, un quelante de iones bivalentes y en un intervalo de pH entre 7 y 8, y

-

el aislamiento y la purificación del ARN de interés.

16. Célula de levadura modificada, caracterizada porque está desprovista de ADN mitocondrial y porque comprende una copia cromosómica de un gen que codifica una ARN polimerasa exógena y que incluye una señal de dirección mitocondrial.

17. Célula de levadura modificada, caracterizada porque está desprovista de ADN mitocondrial y porque sus mitocondrias están transformadas con un vector de transcripción mitocondrial que comprende al menos una copia del ADN que codifica un ARN heterólogo de interés bajo el control de elemento(s) regulador(es) de la transcripción mitocondrial, y un fragmento no transcrito de un gen informador de la transformación mitocondrial, tal como se ha definido en la reivindicación 7.

18. Célula de levadura modificada de acuerdo con la reivindicación 16 o la reivindicación 17, caracterizada porque se obtiene a partir de una cepa \DeltaSUV3 o \DeltaDSS1.

19. Célula de levadura modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizada porque se obtiene a partir de una cepa rho^{0}.

20. Utilización de transformantes mitocondriales de levadura desprovistos de ADN mitocondrial, para la producción industrial de un ARN heterólogo de interés.

21. Sistema útil para la producción industrial de un ARN heterólogo de interés, caracterizado porque comprende:

-

células de levadura desprovistas de ADN mitocondrial, particularmente de la cepa rho^{0}, transformadas al menos con un vector de transcripción mitocondrial tal como se ha definido en las reivindicaciones 1 y 5 a 8.

-

al menos un medio de cultivo adecuado que permite seleccionar dichas células transformadas,

-

células de levadura de prueba, de tipo rho^{+} mit^{-},

-

fermentadores y medios de cultivo apropiados y

-

reactivos apropiados para aislar las mitocondrias a partir de células rho^{-} sintéticas y extraer de éstas el ARN heterólogo de interés.