JP2777947B2 - Ｎｓｐ ７５２４Ｖ制限・修飾系酵素遺伝子及び製造方法 - Google Patents
Ｎｓｐ ７５２４Ｖ制限・修飾系酵素遺伝子及び製造方法Info
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- restriction
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- nsp7524v
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子工学試薬として
有用な制限酵素及び修飾酵素に関し、更に詳細にはNsp
７５２４Ｖ制限酵素及び修飾酵素及びその製造方法に関
する。
有用な制限酵素及び修飾酵素に関し、更に詳細にはNsp
７５２４Ｖ制限酵素及び修飾酵素及びその製造方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】Ｎｓｐ ７５２４Ｖ制限及び修飾酵素
は、１９８２年にノストック スピーシーズ（Ｎｏｓｔ
ｏｃ ｓｐｅｃｉｅｓ）ＰＣＣ７５２４より単離され、
その生化学的研究がなされてきた。Ｎｓｐ ７５２４Ｖ
制限・修飾系酵素は、ＤＮＡを切断する活性を有するＮ
ｓｐ７５２４Ｖ制限酵素とＮｓｐ ７５２７Ｖ制限酵素
による切断よりＤＮＡを保護する修飾酵素により構成さ
れる。Ｎｓｐ ７５２７Ｖ制限酵素は、典型的ＩＩ型制
限酵素であり、ＤＮＡ塩基配列中二回転対称構造の６塩
基からなる配列（５’−ＴＴＣＧＡＡ−３’）を認識
し、その認識配列のＴとＣの間を、５’突出となるよう
に切断する酵素である。一方、Ｎｓｐ ７５２４Ｖ修飾
酵素は、Ｎｓｐ ７５２４Ｖ制限酵素による切断よりＤ
ＮＡを保護する機能を有する酵素である。従来から知ら
れているＮｓｐ ７５２４Ｖ制限酵素の製造方法として
は、リーストン（Ｒｅａｓｔｏｎ）らの方法がある。リ
ーストンらは、前出のＮｏｓｔｏｃ ｓｐｅｃｉｅｓＰ
ＣＣ７５２４（以下、Ｎｓｐ菌と略記する）より回収す
る方法を確立している。当該方法はジーン（Ｇｅｎ
ｅ）、第２０巻、第１０３〜１１０頁（１９８２）に記
載されている。Ｎｓｐ ７５２４Ｖ修飾酵素の製造方法
については、いまだ詳細な確立した方法の報告はない。
しかしながら、Ｎｓｐ 菌より得られるＮｓｐ ７５２
４Ｖ制限酵素及びＮｓｐ ７５２４Ｖ修飾酵素の含量は
少なく、両酵素を大量に得ることは困難であった。ま
た、Ｎｓｐ 菌は、Ｎｓｐ ７５２４Ｖ制限酵素及び修
飾酵素のほか、Ｎｓｐ ７５２４Ｉ、Ｎｓｐ ７５２４
ＩＩ、Ｎｓｐ ７５２４ＩＩＩ、Ｎｓｐ７５２４ＩＶ制
限酵素及び修飾酵素も同時に生産するため、Ｎｓｐ ７
５２４Ｖ制限酵素及び修飾酵素のみを製造するための操
作は煩雑であった。一方、Ｎｓｐ７５２４Ｖ制限・修飾
系酵素の遺伝子の単離及び当該遺伝子を種々のベクター
に結合してクローニングする方法についてはいまだに明
らかにされていない。
は、１９８２年にノストック スピーシーズ（Ｎｏｓｔ
ｏｃ ｓｐｅｃｉｅｓ）ＰＣＣ７５２４より単離され、
その生化学的研究がなされてきた。Ｎｓｐ ７５２４Ｖ
制限・修飾系酵素は、ＤＮＡを切断する活性を有するＮ
ｓｐ７５２４Ｖ制限酵素とＮｓｐ ７５２７Ｖ制限酵素
による切断よりＤＮＡを保護する修飾酵素により構成さ
れる。Ｎｓｐ ７５２７Ｖ制限酵素は、典型的ＩＩ型制
限酵素であり、ＤＮＡ塩基配列中二回転対称構造の６塩
基からなる配列（５’−ＴＴＣＧＡＡ−３’）を認識
し、その認識配列のＴとＣの間を、５’突出となるよう
に切断する酵素である。一方、Ｎｓｐ ７５２４Ｖ修飾
酵素は、Ｎｓｐ ７５２４Ｖ制限酵素による切断よりＤ
ＮＡを保護する機能を有する酵素である。従来から知ら
れているＮｓｐ ７５２４Ｖ制限酵素の製造方法として
は、リーストン（Ｒｅａｓｔｏｎ）らの方法がある。リ
ーストンらは、前出のＮｏｓｔｏｃ ｓｐｅｃｉｅｓＰ
ＣＣ７５２４（以下、Ｎｓｐ菌と略記する）より回収す
る方法を確立している。当該方法はジーン（Ｇｅｎ
ｅ）、第２０巻、第１０３〜１１０頁（１９８２）に記
載されている。Ｎｓｐ ７５２４Ｖ修飾酵素の製造方法
については、いまだ詳細な確立した方法の報告はない。
しかしながら、Ｎｓｐ 菌より得られるＮｓｐ ７５２
４Ｖ制限酵素及びＮｓｐ ７５２４Ｖ修飾酵素の含量は
少なく、両酵素を大量に得ることは困難であった。ま
た、Ｎｓｐ 菌は、Ｎｓｐ ７５２４Ｖ制限酵素及び修
飾酵素のほか、Ｎｓｐ ７５２４Ｉ、Ｎｓｐ ７５２４
ＩＩ、Ｎｓｐ ７５２４ＩＩＩ、Ｎｓｐ７５２４ＩＶ制
限酵素及び修飾酵素も同時に生産するため、Ｎｓｐ ７
５２４Ｖ制限酵素及び修飾酵素のみを製造するための操
作は煩雑であった。一方、Ｎｓｐ７５２４Ｖ制限・修飾
系酵素の遺伝子の単離及び当該遺伝子を種々のベクター
に結合してクローニングする方法についてはいまだに明
らかにされていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、Nsp
７５２４Ｖ制限・修飾系酵素遺伝子を提供し、Nsp ７５
２４Ｖ制限酵素及び修飾酵素の工業的製造に適したNsp
７５２４Ｖ制限・修飾系酵素の遺伝子を含むプラスミド
を導入した新規微生物、特に大腸菌を創製し、該微生物
を用いたNsp ７５２４Ｖ制限酵素及び／又は修飾酵素の
製造方法を提供することにある。
７５２４Ｖ制限・修飾系酵素遺伝子を提供し、Nsp ７５
２４Ｖ制限酵素及び修飾酵素の工業的製造に適したNsp
７５２４Ｖ制限・修飾系酵素の遺伝子を含むプラスミド
を導入した新規微生物、特に大腸菌を創製し、該微生物
を用いたNsp ７５２４Ｖ制限酵素及び／又は修飾酵素の
製造方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は、特許請求の範囲に記載の地図、す
なわち図面の図１に示す制限酵素地図を有するノストッ
ク スピーシーズ由来のＮｓｐ ７５２４Ｖ制限・修飾
系酵素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片に関す
る。また本発明の第２の発明は、Ｎｓｐ ７５２４Ｖ制
限酵素及び／又は修飾酵素の製造方法に関する発明であ
って、上記第１の発明のＤＮＡ断片が組込まれたプラス
ミドを保有する微生物を培養し、培養物よりＮｓｐ ７
５２４Ｖ制限酵素及び／又は修飾酵素を採取することを
特徴とする。
発明の第１の発明は、特許請求の範囲に記載の地図、す
なわち図面の図１に示す制限酵素地図を有するノストッ
ク スピーシーズ由来のＮｓｐ ７５２４Ｖ制限・修飾
系酵素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片に関す
る。また本発明の第２の発明は、Ｎｓｐ ７５２４Ｖ制
限酵素及び／又は修飾酵素の製造方法に関する発明であ
って、上記第１の発明のＤＮＡ断片が組込まれたプラス
ミドを保有する微生物を培養し、培養物よりＮｓｐ ７
５２４Ｖ制限酵素及び／又は修飾酵素を採取することを
特徴とする。
【０００５】Nsp ７５２４Ｖ制限及び修飾系酵素の遺伝
子にはＤＮＡを切断する活性を有するNsp ７５２４Ｖ制
限酵素をコードする遺伝子と、Nsp ７５２４Ｖ制限酵素
による切断よりＤＮＡを保護する修飾酵素をコードする
遺伝子を含んでいる。
子にはＤＮＡを切断する活性を有するNsp ７５２４Ｖ制
限酵素をコードする遺伝子と、Nsp ７５２４Ｖ制限酵素
による切断よりＤＮＡを保護する修飾酵素をコードする
遺伝子を含んでいる。
【０００６】なお、本明細書において、制限・修飾系酵
素の遺伝子とは、制限及び修飾の両酵素遺伝子をもつ遺
伝子とその各個別の遺伝子との両者を統合した意味の用
語である。換言すれば、制限及び／又は修飾酵素遺伝子
を意味する。これらの遺伝子は、単独あるいは複合体の
形で利用できる。
素の遺伝子とは、制限及び修飾の両酵素遺伝子をもつ遺
伝子とその各個別の遺伝子との両者を統合した意味の用
語である。換言すれば、制限及び／又は修飾酵素遺伝子
を意味する。これらの遺伝子は、単独あるいは複合体の
形で利用できる。
【０００７】また、上記の両遺伝子を組込んだプラスミ
ドを用いる場合、そのプラスミドは両遺伝子を同一のプ
ラスミドに組込んだものでも、あるいは両遺伝子を各個
別に複数のプラスミドに組込んだもののいずれであって
もよい。本発明者らは、Nsp 菌よりNsp ７５２４Ｖ制限
・修飾系酵素遺伝子全領域を含む約２．７kbのＤＮＡ断
片をクローニングすることに成功し、更にこれらのＤＮ
Ａ断片全体あるいは一部が同一又は個別のプラスミドに
組込まれたプラスミドを導入した微生物、特に大腸菌を
培養することにより菌体中に著量のNsp ７５２４Ｖ制限
酵素遺伝子及び／又はNsp ７５２４Ｖ修飾酵素が蓄積
し、これらの培養物より大量のNsp ７５２４Ｖ制限酵素
及び／又はNsp ７５２４Ｖ修飾酵素が単離できることを
見出し本発明を完成した。
ドを用いる場合、そのプラスミドは両遺伝子を同一のプ
ラスミドに組込んだものでも、あるいは両遺伝子を各個
別に複数のプラスミドに組込んだもののいずれであって
もよい。本発明者らは、Nsp 菌よりNsp ７５２４Ｖ制限
・修飾系酵素遺伝子全領域を含む約２．７kbのＤＮＡ断
片をクローニングすることに成功し、更にこれらのＤＮ
Ａ断片全体あるいは一部が同一又は個別のプラスミドに
組込まれたプラスミドを導入した微生物、特に大腸菌を
培養することにより菌体中に著量のNsp ７５２４Ｖ制限
酵素遺伝子及び／又はNsp ７５２４Ｖ修飾酵素が蓄積
し、これらの培養物より大量のNsp ７５２４Ｖ制限酵素
及び／又はNsp ７５２４Ｖ修飾酵素が単離できることを
見出し本発明を完成した。
【０００８】以下本発明を具体的に説明する。本発明に
係わる新規微生物、例えば大腸菌は次に例示する工程に
より得ることができる。 １）ＤＮＡ供与体であるNsp 菌から染色体ＤＮＡを抽出
し、染色体ＤＮＡの制限酵素部分分解産物を、あらかじ
め制限酵素で開裂しておいたNsp ７５２４Ｖ制限酵素の
認識配列をもつベクターに結合させる。 ２）１）で作製したプラスミドライブラリーで大腸菌を
形質転換し、プラスミド抽出法によりプラスミドライブ
ラリーを得る。 ３）２）で作製したプラスミドライブラリーをNsp ７５
２４Ｖ制限酵素で切断し、切断されないプラスミドすな
わちNsp ７５２４Ｖ修飾酵素が発現しているプラスミド
を選択する。 ４）３）で選択したプラスミドを再び大腸菌に形質転換
により導入し、この形質転換体について、Nsp ７５２４
Ｖ制限酵素活性を解析し、制限酵素及び修飾酵素を生産
する新規微生物を得る。
係わる新規微生物、例えば大腸菌は次に例示する工程に
より得ることができる。 １）ＤＮＡ供与体であるNsp 菌から染色体ＤＮＡを抽出
し、染色体ＤＮＡの制限酵素部分分解産物を、あらかじ
め制限酵素で開裂しておいたNsp ７５２４Ｖ制限酵素の
認識配列をもつベクターに結合させる。 ２）１）で作製したプラスミドライブラリーで大腸菌を
形質転換し、プラスミド抽出法によりプラスミドライブ
ラリーを得る。 ３）２）で作製したプラスミドライブラリーをNsp ７５
２４Ｖ制限酵素で切断し、切断されないプラスミドすな
わちNsp ７５２４Ｖ修飾酵素が発現しているプラスミド
を選択する。 ４）３）で選択したプラスミドを再び大腸菌に形質転換
により導入し、この形質転換体について、Nsp ７５２４
Ｖ制限酵素活性を解析し、制限酵素及び修飾酵素を生産
する新規微生物を得る。
【０００９】Nsp 菌の染色体ＤＮＡは、培養液より菌体
を回収し、それより抽出する。抽出、精製、制限酵素に
よる切断などは、公知の方法を用いることができる。当
該方法の詳細はトーマス（Thomas）ほか著、プロセデュ
アス イン ヌクレイックアシッズ リサーチ（Proced
ures in Nucleic Acids Research）、第５３５頁、ハー
バー アンド ロー（Harber and Row）出版（１９６６
年）及びサムブルック（Sambrook）ほか著、モレキュラ
ー クローニング（Molecular Cloning)、コールド ス
プリング ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harb
or Laboratory)出版（１９８９年）に記載されている。
を回収し、それより抽出する。抽出、精製、制限酵素に
よる切断などは、公知の方法を用いることができる。当
該方法の詳細はトーマス（Thomas）ほか著、プロセデュ
アス イン ヌクレイックアシッズ リサーチ（Proced
ures in Nucleic Acids Research）、第５３５頁、ハー
バー アンド ロー（Harber and Row）出版（１９６６
年）及びサムブルック（Sambrook）ほか著、モレキュラ
ー クローニング（Molecular Cloning)、コールド ス
プリング ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harb
or Laboratory)出版（１９８９年）に記載されている。
【００１０】一方、プラスミドベクターの開裂も同様の
方法で行うことができる。プラスミドとしては公知のも
のが使用できるが、例えばｐＡＣＹＣ１８４等が挙げら
れる。なお、ｐＡＣＹＣ１８４はNsp ７５２４Ｖ制限酵
素の認識配列を含んでおり、Nsp ７５２４Ｖ修飾酵素の
遺伝子のスクリーニングを容易に行うことができる。
方法で行うことができる。プラスミドとしては公知のも
のが使用できるが、例えばｐＡＣＹＣ１８４等が挙げら
れる。なお、ｐＡＣＹＣ１８４はNsp ７５２４Ｖ制限酵
素の認識配列を含んでおり、Nsp ７５２４Ｖ修飾酵素の
遺伝子のスクリーニングを容易に行うことができる。
【００１１】染色体ＤＮＡとベクターを結合させる方法
は公知の方法によるものである。プラスミドを大腸菌宿
主に導入する当該方法の詳細には ジャーナル オブモ
レキュラー バイオロジー（J. Mol. Biol）、第１６６
巻、第５５７頁（１９８３年）に記載されているハナハ
ン（Hanahan)の方法がある。
は公知の方法によるものである。プラスミドを大腸菌宿
主に導入する当該方法の詳細には ジャーナル オブモ
レキュラー バイオロジー（J. Mol. Biol）、第１６６
巻、第５５７頁（１９８３年）に記載されているハナハ
ン（Hanahan)の方法がある。
【００１２】大腸菌宿主からプラスミドを調製する方法
はアルカリ法で行う。調製したプラスミドのうちNsp ７
５２４Ｖ修飾酵素の遺伝子をコードしていて、且つ発現
しているものは、Nsp ７５２４Ｖ制限酵素による切断に
対して保護されているので選択できる。その結果、図１
に示す制限酵素部位をもつ約2.７kbのNsp 菌由来のＤＮ
Ａ断片を含むプラスミドが選択された。
はアルカリ法で行う。調製したプラスミドのうちNsp ７
５２４Ｖ修飾酵素の遺伝子をコードしていて、且つ発現
しているものは、Nsp ７５２４Ｖ制限酵素による切断に
対して保護されているので選択できる。その結果、図１
に示す制限酵素部位をもつ約2.７kbのNsp 菌由来のＤＮ
Ａ断片を含むプラスミドが選択された。
【００１３】このプラスミドを更に詳しく解析し、Nsp
７５２４Ｖ制限酵素の遺伝子を含んでいるかどうかを以
下の方法で調べた。すなわち、選択されたプラスミドを
形質転換によって大腸菌に導入し新規微生物を創製す
る。得られた新規微生物についてNsp ７５２４Ｖ制限酵
素活性を解析する。Nsp ７５２４Ｖ制限酵素活性を調べ
る手段としては、次のようなイン ビトロ（in vitro）
の方法により調べることができる。試験するクローンを
培養し、その培養物を粉砕し、超遠心分離を行い残渣を
除去した上清を行い、緩衝液〔１０mM トリス ＨＣｌ
（pH8.０）−７mMMgCl2 −７mM２−メルカプトエタノー
ル−４０mM NaCl−0.０１％ＢＳＡ〕中、例えば、ラム
ダファージＤＮＡを基質として、３７℃で制限酵素反応
を行いアガロースゲル電気泳動により解析することがで
きる。当該方法を用いて、上記新規微生物についてNsp
７５２４Ｖ制限酵素活性を解析したところ活性が認めら
れた。このことからNsp ７５２４Ｖ制限・修飾系遺伝子
を単離できたことが確認された。
７５２４Ｖ制限酵素の遺伝子を含んでいるかどうかを以
下の方法で調べた。すなわち、選択されたプラスミドを
形質転換によって大腸菌に導入し新規微生物を創製す
る。得られた新規微生物についてNsp ７５２４Ｖ制限酵
素活性を解析する。Nsp ７５２４Ｖ制限酵素活性を調べ
る手段としては、次のようなイン ビトロ（in vitro）
の方法により調べることができる。試験するクローンを
培養し、その培養物を粉砕し、超遠心分離を行い残渣を
除去した上清を行い、緩衝液〔１０mM トリス ＨＣｌ
（pH8.０）−７mMMgCl2 −７mM２−メルカプトエタノー
ル−４０mM NaCl−0.０１％ＢＳＡ〕中、例えば、ラム
ダファージＤＮＡを基質として、３７℃で制限酵素反応
を行いアガロースゲル電気泳動により解析することがで
きる。当該方法を用いて、上記新規微生物についてNsp
７５２４Ｖ制限酵素活性を解析したところ活性が認めら
れた。このことからNsp ７５２４Ｖ制限・修飾系遺伝子
を単離できたことが確認された。
【００１４】上記方法によりプラスミドベクターにＮｓ
ｐ 菌由来のＮｓｐ ７５２４Ｖ制限・修飾酵素遺伝子
をコードしているＤＮＡ断片を連結して作製したプラス
ミドをｐＮｓｐ ７５２４Ｖと命名した。このプラスミ
ドを大腸菌、例えば大腸菌ＥＤ１６４８株に導入して形
質転換法によって得られる新規微生物はＥｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＥＤ １６４８／ｐＮｓｐ ７５
２４Ｖと命名、表示され、通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ −４６３８として
寄託されている。
ｐ 菌由来のＮｓｐ ７５２４Ｖ制限・修飾酵素遺伝子
をコードしているＤＮＡ断片を連結して作製したプラス
ミドをｐＮｓｐ ７５２４Ｖと命名した。このプラスミ
ドを大腸菌、例えば大腸菌ＥＤ１６４８株に導入して形
質転換法によって得られる新規微生物はＥｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＥＤ １６４８／ｐＮｓｐ ７５
２４Ｖと命名、表示され、通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ −４６３８として
寄託されている。
【００１５】このようにして得られた新規微生物の培養
に当っては、通常のエシェリヒア属の微生物の生育に適
した条件を採りうる。上記組換体Esherichia coli ED１
６４８／pNsp７５２４Ｖを培養し、培養物からNsp ７５
２４Ｖ制限酵素及び修飾酵素を回収するに当っては、例
えば培養物より菌体を集菌後、超音波破砕、超遠心分離
等により酵素を抽出し、次いで除核酸法、塩析法、アフ
ィニティクロマトグラフィー法、ゲルろ過法、イオン交
換クロマトグラフィー法等を組合せ精製すればよく、こ
の方法により、Nsp ７５２４Ｖ制限酵素及び／又は修飾
酵素を大量に得ることができる。
に当っては、通常のエシェリヒア属の微生物の生育に適
した条件を採りうる。上記組換体Esherichia coli ED１
６４８／pNsp７５２４Ｖを培養し、培養物からNsp ７５
２４Ｖ制限酵素及び修飾酵素を回収するに当っては、例
えば培養物より菌体を集菌後、超音波破砕、超遠心分離
等により酵素を抽出し、次いで除核酸法、塩析法、アフ
ィニティクロマトグラフィー法、ゲルろ過法、イオン交
換クロマトグラフィー法等を組合せ精製すればよく、こ
の方法により、Nsp ７５２４Ｖ制限酵素及び／又は修飾
酵素を大量に得ることができる。
【００１６】
【実施例】以下に本発明の実施例を挙げるが本発明はこ
れらの実施例に限定されるものではない。
れらの実施例に限定されるものではない。
【００１７】実施例１ （１）Nsp 菌染色体ＤＮＡの調製 ジャーナル オブ ジェネラル マイクロバイオロジー
（Journal of GeneralMicrobiology)、第１１５巻、第
２７３〜２８７頁（１９７９）に記載されているスザー
ランド（Sutherland）らの方法に従いNsp 菌を培養し、
湿菌体を得た。Nsp 菌湿菌体２ｇを１０mlの２５mMトリ
スＨＣｌ（pH8.０）−５０mMグルコース−１０mM ＥＤ
ＴＡ液に懸濁し、リゾチームを同液に２mg／mlになる様
に溶かしたものを1.０ml加えかくはんし、３７℃で１５
分静置した。次に当該溶液に２８mlの１００mM NaCl−
１００mMトリスＨＣｌ（pH8.０）溶液を加えかくはん
し、更に４mlの１０％ ＳＤＳ溶液を加えかくはんし、
３７℃で１時間静置した。当該溶液に１０％ ＳＤＳ−
８％サルコシル（Sarcosyl）溶液を１ml加えてかくはん
し、６０℃で１５分静置した。当該溶液を静置後、等容
量のフェノール：クロロホルム（１：１）混液を加え、
１０分間穏やかにかくはんした後、遠心分離（５０００
ｇ、１０分）により、水層とクロロホルム層を分離し
た。分離後水層を取り、これに等量のイソプロピルアル
コールを加えかくはんし、０℃で１０分間静置した後、
遠心分離（１３５００ｇ、１０分）により沈殿を回収し
た。これを７０％エタノールで洗浄し、１０mlのＴＥ溶
液〔１０mMトリスＨＣｌ（pH8.０）−１mM ＥＤＴＡ〕
に溶解させ、４℃で保存した。
（Journal of GeneralMicrobiology)、第１１５巻、第
２７３〜２８７頁（１９７９）に記載されているスザー
ランド（Sutherland）らの方法に従いNsp 菌を培養し、
湿菌体を得た。Nsp 菌湿菌体２ｇを１０mlの２５mMトリ
スＨＣｌ（pH8.０）−５０mMグルコース−１０mM ＥＤ
ＴＡ液に懸濁し、リゾチームを同液に２mg／mlになる様
に溶かしたものを1.０ml加えかくはんし、３７℃で１５
分静置した。次に当該溶液に２８mlの１００mM NaCl−
１００mMトリスＨＣｌ（pH8.０）溶液を加えかくはん
し、更に４mlの１０％ ＳＤＳ溶液を加えかくはんし、
３７℃で１時間静置した。当該溶液に１０％ ＳＤＳ−
８％サルコシル（Sarcosyl）溶液を１ml加えてかくはん
し、６０℃で１５分静置した。当該溶液を静置後、等容
量のフェノール：クロロホルム（１：１）混液を加え、
１０分間穏やかにかくはんした後、遠心分離（５０００
ｇ、１０分）により、水層とクロロホルム層を分離し
た。分離後水層を取り、これに等量のイソプロピルアル
コールを加えかくはんし、０℃で１０分間静置した後、
遠心分離（１３５００ｇ、１０分）により沈殿を回収し
た。これを７０％エタノールで洗浄し、１０mlのＴＥ溶
液〔１０mMトリスＨＣｌ（pH8.０）−１mM ＥＤＴＡ〕
に溶解させ、４℃で保存した。
【００１８】（２）ライブラリーの作製 （１）で得られたNsp 菌の染色体ＤＮＡ２５μｇを制限
酵素Sau ３ＡＩ １ユニットと緩衝液〔５０mM トリス
ＨＣｌ（pH7.５）−１０mM MgCl2 −１mMジチオスレ
イトール−１００mM NaCl〕中、３７℃で１〜１０分間
反応させ、アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルより２
〜７kbの断片を回収した。このＤＮＡ断片をあらかじめ
BamHI で開裂しておいたpACYC １８４に結合した後、こ
のプラスミド大腸菌ＥＤ１６４８を形質転換した。こう
して得られた形質転換体からアルカリ法によってプラス
ミドを調製した。
酵素Sau ３ＡＩ １ユニットと緩衝液〔５０mM トリス
ＨＣｌ（pH7.５）−１０mM MgCl2 −１mMジチオスレ
イトール−１００mM NaCl〕中、３７℃で１〜１０分間
反応させ、アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルより２
〜７kbの断片を回収した。このＤＮＡ断片をあらかじめ
BamHI で開裂しておいたpACYC １８４に結合した後、こ
のプラスミド大腸菌ＥＤ１６４８を形質転換した。こう
して得られた形質転換体からアルカリ法によってプラス
ミドを調製した。
【００１９】（３）修飾酵素遺伝子の単離 （２）で得られたプラスミドを制限酵素Nsp ７５２４Ｖ
で切断した。このときNsp ７５２４Ｖ修飾酵素が発現し
ているプラスミドは切断されない。こうして得られた切
断されているあるいは切断されていないＤＮＡの混合物
で大腸菌ＥＤ１６４８を形質転換した。切断されていな
いプラスミドのみが大腸菌中に導入されるので、アンピ
シリンを含むプレートで形質転換体を選択し、Nsp ７５
２４Ｖ修飾酵素遺伝子を含んでいる形質転換体を得た。
で切断した。このときNsp ７５２４Ｖ修飾酵素が発現し
ているプラスミドは切断されない。こうして得られた切
断されているあるいは切断されていないＤＮＡの混合物
で大腸菌ＥＤ１６４８を形質転換した。切断されていな
いプラスミドのみが大腸菌中に導入されるので、アンピ
シリンを含むプレートで形質転換体を選択し、Nsp ７５
２４Ｖ修飾酵素遺伝子を含んでいる形質転換体を得た。
【００２０】（４）制限酵素活性の測定 （３）で選択されたプラスミドにより大腸菌ＥＤ１６４
８を形質転換し、インビトロでNsp ７５２４Ｖ制限酵素
活性を測定したところ、活性が認められた。そこで、こ
のプラスミドをpNsp７５２４Ｖと命名し、このプラスミ
ドを保有する大腸菌をEsherichia coli ED１６４８／pN
sp７５２４Ｖと命名した。
８を形質転換し、インビトロでNsp ７５２４Ｖ制限酵素
活性を測定したところ、活性が認められた。そこで、こ
のプラスミドをpNsp７５２４Ｖと命名し、このプラスミ
ドを保有する大腸菌をEsherichia coli ED１６４８／pN
sp７５２４Ｖと命名した。
【００２１】実施例２ （１）Ｎｓｐ ７５２４Ｖ制限・修飾酵素タンパクの生
産 実施例１−（４）で得られたＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ ＥＤ１６４８／ｐＮｓｐ７５２４Ｖ（ＦＥＲＭ
ＢＰ−４６３８）をクロラムフェニコール３０μｇ／
ｍｌを含む１００ｍｌのＬ培地に接種し、３７℃で１２
時間培養した。集菌後、１．２ｍｌの１０ｍＭ２−メル
カプトエタノール−０．１５％トリトンＸ１００を含む
２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁
し、超音波処理で菌を破砕し、超遠心分離（１００００
ｇ、３０分）により、上清を回収した。上清の活性を測
定したところ、Ｎｓｐ ７５２４Ｖ制限酵素が４０，０
００ユニット、修飾酵素が８００ユニット生産されてい
た。
産 実施例１−（４）で得られたＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ ＥＤ１６４８／ｐＮｓｐ７５２４Ｖ（ＦＥＲＭ
ＢＰ−４６３８）をクロラムフェニコール３０μｇ／
ｍｌを含む１００ｍｌのＬ培地に接種し、３７℃で１２
時間培養した。集菌後、１．２ｍｌの１０ｍＭ２−メル
カプトエタノール−０．１５％トリトンＸ１００を含む
２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁
し、超音波処理で菌を破砕し、超遠心分離（１００００
ｇ、３０分）により、上清を回収した。上清の活性を測
定したところ、Ｎｓｐ ７５２４Ｖ制限酵素が４０，０
００ユニット、修飾酵素が８００ユニット生産されてい
た。
【００２２】（２）Nsp ７５２４Ｖ制限酵素の精製 Esherichia coli ED１６４８／pNsp７５２４Ｖ（FERMＰ
−１２７５３）をクロラムフェニコール３０μｇ／mlを
含む２リットルのＬ培地に接種し、３７℃で１２時間培
養した。集菌後、１０ｇの湿菌体を、２０mlの１０mM２
−メルカプトエタノール−0.１５％トリトンＸ１００を
含む２０mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.５）に懸濁し、
超音波処理で菌を破砕し、超遠心分離（１００００ｇ、
３０分）により、上清を回収した。これに等量の緩衝液
Ａ〔２０mM ＫＰＢ（pH7.５）−１０mM２−メルカプト
エタノール−５％グリセリン〕を加え同緩衝液で平衡化
したホスホ セルロースカラムに添加した。０〜１Ｍ塩
化カリウム直線濃度勾配により溶出し、Nsp ７５２４Ｖ
制限酵素活性を含む画分を回収した。次にこの画分を緩
衝液Ｂ〔１０mM ＫＰＢ（pH7.５）−１０mM２−メルカ
プトエタノール−５％グリセリン〕に対し透析し、同緩
衝液で平衡化したアフィ ゲル ブルー カラム（バイ
オラッド社）に添加した。０〜0.７５Ｍ塩化カリウム直
線濃度勾配により溶出し、Nsp ７５２４Ｖ制限酵素活性
を含む画分約５mlを回収した。この画分を再び緩衝液Ｂ
に対し透析し、ヘパリンセファロースカラムに添加し、
０〜１Ｍ塩化カリウム直線濃度勾配により溶出した。回
収したNsp ７５２４Ｖ制限酵素活性を含む画分をセファ
デックスＧ−１００カラムに添加した。得られた活性画
分の酵素活性は約１０0,０００ユニットであった。本精
製標本には他のエンドヌクレアーゼ、ホスファターゼ、
非特異的DNase 等は夾雑していなかった。
−１２７５３）をクロラムフェニコール３０μｇ／mlを
含む２リットルのＬ培地に接種し、３７℃で１２時間培
養した。集菌後、１０ｇの湿菌体を、２０mlの１０mM２
−メルカプトエタノール−0.１５％トリトンＸ１００を
含む２０mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.５）に懸濁し、
超音波処理で菌を破砕し、超遠心分離（１００００ｇ、
３０分）により、上清を回収した。これに等量の緩衝液
Ａ〔２０mM ＫＰＢ（pH7.５）−１０mM２−メルカプト
エタノール−５％グリセリン〕を加え同緩衝液で平衡化
したホスホ セルロースカラムに添加した。０〜１Ｍ塩
化カリウム直線濃度勾配により溶出し、Nsp ７５２４Ｖ
制限酵素活性を含む画分を回収した。次にこの画分を緩
衝液Ｂ〔１０mM ＫＰＢ（pH7.５）−１０mM２−メルカ
プトエタノール−５％グリセリン〕に対し透析し、同緩
衝液で平衡化したアフィ ゲル ブルー カラム（バイ
オラッド社）に添加した。０〜0.７５Ｍ塩化カリウム直
線濃度勾配により溶出し、Nsp ７５２４Ｖ制限酵素活性
を含む画分約５mlを回収した。この画分を再び緩衝液Ｂ
に対し透析し、ヘパリンセファロースカラムに添加し、
０〜１Ｍ塩化カリウム直線濃度勾配により溶出した。回
収したNsp ７５２４Ｖ制限酵素活性を含む画分をセファ
デックスＧ−１００カラムに添加した。得られた活性画
分の酵素活性は約１０0,０００ユニットであった。本精
製標本には他のエンドヌクレアーゼ、ホスファターゼ、
非特異的DNase 等は夾雑していなかった。
【００２３】（３）Nsp ７５２４Ｖ修飾酵素の精製 Esherichia coli ED１６４８／pNsp７５２４Ｖをクロラ
ムフェニコール３０μｇ／mlを含む２リットルのＬ培地
に接種し、３７℃で１２時間培養した。集菌後、湿菌体
１０ｇを、３０mlの緩衝液Ａに懸濁し、超音波処理で菌
を破砕し、超遠心分離（１００００ｇ、３０分）によ
り、上清を回収した。この上清に、２％になるように硫
酸ストレプトマイシン溶液を加え、かくはん後遠心によ
り上清を回収した。次に硫酸アンモニウム粉末を６５％
飽和となるように加え、超遠心分離（１３５００ｇ、３
０分）により回収した。この回収沈殿物を３０mlの緩衝
液Ｂに懸濁し、緩衝液Ｂに対して透析した。続いて緩衝
液Ｂで平衡化したヘパリンセファロースカラムに添加
し、0.０５Ｍ〜0.８０Ｍ塩化ナトリウム直線濃度勾配に
より溶出を行った。Nsp ７５２４Ｖ修飾酵素活性を含む
画分を回収し、緩衝液Ｂに対して透析した。これを緩衝
液Ｂで平衡化したDEAE−セファデックス（Sephadex）
（Ａ−５０）カラムに添加し、0.０５Ｍ〜0.６０Ｍ塩化
ナトリウム直線濃度勾配により溶出した。Nsp ７５２４
Ｖ修飾酵素活性を含む画分を回収し、緩衝液Ｂに対して
透析した後、あらかじめ緩衝液Ｂで平衡化したホスホセ
ルロースカラムに添加し、0.０５Ｍ〜1.０Ｍ塩化ナトリ
ウム直線濃度勾配により溶出した。得られた活性画分の
酵素活性は約３0,０００ユニットであった。本精製標本
にはエンドヌクレアーゼ、ホスファターゼ、非特異的DN
ase などは夾雑していなかった。
ムフェニコール３０μｇ／mlを含む２リットルのＬ培地
に接種し、３７℃で１２時間培養した。集菌後、湿菌体
１０ｇを、３０mlの緩衝液Ａに懸濁し、超音波処理で菌
を破砕し、超遠心分離（１００００ｇ、３０分）によ
り、上清を回収した。この上清に、２％になるように硫
酸ストレプトマイシン溶液を加え、かくはん後遠心によ
り上清を回収した。次に硫酸アンモニウム粉末を６５％
飽和となるように加え、超遠心分離（１３５００ｇ、３
０分）により回収した。この回収沈殿物を３０mlの緩衝
液Ｂに懸濁し、緩衝液Ｂに対して透析した。続いて緩衝
液Ｂで平衡化したヘパリンセファロースカラムに添加
し、0.０５Ｍ〜0.８０Ｍ塩化ナトリウム直線濃度勾配に
より溶出を行った。Nsp ７５２４Ｖ修飾酵素活性を含む
画分を回収し、緩衝液Ｂに対して透析した。これを緩衝
液Ｂで平衡化したDEAE−セファデックス（Sephadex）
（Ａ−５０）カラムに添加し、0.０５Ｍ〜0.６０Ｍ塩化
ナトリウム直線濃度勾配により溶出した。Nsp ７５２４
Ｖ修飾酵素活性を含む画分を回収し、緩衝液Ｂに対して
透析した後、あらかじめ緩衝液Ｂで平衡化したホスホセ
ルロースカラムに添加し、0.０５Ｍ〜1.０Ｍ塩化ナトリ
ウム直線濃度勾配により溶出した。得られた活性画分の
酵素活性は約３0,０００ユニットであった。本精製標本
にはエンドヌクレアーゼ、ホスファターゼ、非特異的DN
ase などは夾雑していなかった。
【００２４】
【発明の効果】以上詳細に説明した通り、本発明により
Ｎｓｐ ７５２４Ｖ制限・修飾系酵素をコードする遺伝
子を含有するＤＮＡ断片が単離された。該ＤＮＡ断片を
含有するプラスミドで形質転換した大腸菌により、遺伝
子工学において有用なＮｓｐ７５２４Ｖ制限酵素及び／
又は修飾酵素を効率よく製造することが可能となった。
Ｎｓｐ ７５２４Ｖ制限・修飾系酵素をコードする遺伝
子を含有するＤＮＡ断片が単離された。該ＤＮＡ断片を
含有するプラスミドで形質転換した大腸菌により、遺伝
子工学において有用なＮｓｐ７５２４Ｖ制限酵素及び／
又は修飾酵素を効率よく製造することが可能となった。
【図１】Nsp ７５２４Ｖ制限・修飾系酵素遺伝子を含む
約2.７kbのＤＮＡの制限酵素部位を示した図である。
約2.７kbのＤＮＡの制限酵素部位を示した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 中島 和男 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (56)参考文献 ＧＥＮＥ 20 Ｐ．103−110 （1982) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/16 C12N 9/10 C12N 15/54 C12N 15/55 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
Claims (2)
- 【請求項１】 下記に示す制限酵素地図を有するノスト
ック スピーシーズ由来のＮｓｐ ７５２４Ｖ制限・修
飾系酵素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片。 - 【請求項２】 請求項１に記載のＤＮＡ断片が組込まれ
たプラスミドを保有する微生物を培養し、培養物よりＮ
ｓｐ ７５２４Ｖ制限酵素及び／又は修飾酵素を採取す
ることを特徴とするＮｓｐ ７５２４Ｖ制限酵素及び／
又は修飾酵素の製造方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4069985A JP2777947B2 (ja) | 1992-02-21 | 1992-02-21 | Ｎｓｐ ７５２４Ｖ制限・修飾系酵素遺伝子及び製造方法 |
| US08/285,439 US5441881A (en) | 1992-02-21 | 1994-08-04 | NSP7524V restriction-modification genes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4069985A JP2777947B2 (ja) | 1992-02-21 | 1992-02-21 | Ｎｓｐ ７５２４Ｖ制限・修飾系酵素遺伝子及び製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05227956A JPH05227956A (ja) | 1993-09-07 |
| JP2777947B2 true JP2777947B2 (ja) | 1998-07-23 |
Family
ID=13418477
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4069985A Expired - Fee Related JP2777947B2 (ja) | 1992-02-21 | 1992-02-21 | Ｎｓｐ ７５２４Ｖ制限・修飾系酵素遺伝子及び製造方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5441881A (ja) |
| JP (1) | JP2777947B2 (ja) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4018441A1 (de) * | 1990-06-08 | 1991-12-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Rekombinantes restriktionsenzym sau3ai |
| US5202248A (en) * | 1990-11-02 | 1993-04-13 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and producing the nco i restriction endonuclease and methylase |
-
1992
- 1992-02-21 JP JP4069985A patent/JP2777947B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-08-04 US US08/285,439 patent/US5441881A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＧＥＮＥ ２０ Ｐ．１０３−１１０ （１９８２） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05227956A (ja) | 1993-09-07 |
| US5441881A (en) | 1995-08-15 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
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| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |