JP2002543783A

JP2002543783A - ウイルス遺伝子発現の調節

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Publication number: JP2002543783A
Application number: JP2000616341A
Authority: JP
Inventors: ピーター・バーナード・ハイフェッツ; デイビッド・アンドリュー・パットン; ジョシュア・ズビ・レビン; ケ・キウデン; ペトルス・テオドルス・デ・ハーン; ヨハネス・ヤコブス・ルドヘルス・ヒーレン
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1999-05-10
Filing date: 2000-05-08
Publication date: 2002-12-24
Also published as: HK1047769A1; KR20010112952A; AU4563300A; BR0010496A; AR023885A1; PL351385A1; HUP0201235A2; EP1177283A1; EP1801215B1; IL145538A0; CZ20014028A3; HK1047769B; IL145538A; CA2369422A1; HK1045325A1; CN1357040A; CN101348785A; SK16222001A3; TR200103088T2; CN100420748C

Abstract

(57)【要約】本発明は、細胞でウイルスゲノムの発現を変化させる方法であって、当該遺伝子のセンスおよびアンチセンスＲＮＡ断片を使用する方法に関する。該センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片は対となって、二本鎖ＲＮＡ分子を形成し、それによって該遺伝子の発現を変化させることができる。本発明はまた、本発明の方法を使用して得られた細胞、植物または動物、それらの後代およびそれから誘導された種子にも関する。好ましくはそのような細胞、植物または動物は、ウイルスに抵抗性または耐性である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、細胞、植物または動物中のウイルス遺伝子発現を変化させる方法で
あって、当該遺伝子のセンスおよびアンチセンスＲＮＡ断片を使用する方法、並
びに本発明の方法を使用して得られたウイルス遺伝子発現の変化を有する細胞、
植物または動物に関する。本発明は特に、ウイルスに抵抗性または耐性のそのよ
うな細胞、植物または動物に関する。

【０００２】ウイルスへの抵抗性または耐性は、大きな関心が寄せられている分野である。
ウイルスはほとんどの生物に影響を及ぼす。作物において、収量の大部分がウイ
ルス感染のために失われ得る。家畜は、しばしばウイルスに感染し、重大な経済
的な結末を導く病気の蔓延を防止するため、時に屠殺される。コンパニオンアニ
マルもウイルスに襲われ、最終的にウイルスはヒトに感染し、多くの苦しみをも
たらす。ウイルスに対する処置が開発されてきたが、それらはしばしば非常に高
コストであるか効果が限定的である。

【０００３】細胞、植物または動物を変更し、特定のウイルス遺伝子の発現を変化させて、
当該ウイルスに抵抗性または耐性の細胞、植物または動物を創出することが望ま
しい。遺伝子の発現を変化させる現行の方法は、通常、センスまたはアンチセン
スサプレッションの方法による。不幸なことに、これらの方法は、遺伝子発現を
変化させる能力がしばしば変動的で、予測不能であり、多くの場合、特定の遺伝
子活性を完全に崩壊させることはできない。したがって、ウイルス遺伝子の発現を効率的かつ予測可能に変化させ、ウイル
スに抵抗性または耐性を有する細胞、植物または動物を得るのを可能にする、長
く考えられているが達成されていない、新規方法および組成物の必要性がある。

【０００４】本発明は、細胞、植物または動物中のウイルス遺伝子の発現を、その遺伝子の
センスおよびアンチセンスRNA断片を使用して、変化させる方法に関する。この
ようなセンスおよびアンチセンスRNA断片が二本鎖RNA分子を形成することができ
るのが重要である。特に、本発明は、細胞、植物または動物に、ウイルスに対す
る抵抗性または耐性を付与する方法および組成物に関する。好ましくは、本発明
は、ウイルスに対する抵抗性または耐性を植物に付与する方法に関する。本発明
は、そのような方法を使用して得られた植物細胞、そのような細胞に由来する植
物、そのような植物の後代およびそのような植物に由来する種子にも関する。そ
のような植物細胞または植物において、特定のウイルス遺伝子の遺伝子発現の変
化は、当業界で既知の現行法を使用して得られた特定のウイルス遺伝子の遺伝子
発現の変化よりもより有効で、選択的でより予測可能である。

【０００５】本発明は、複数のサブ配列、例えばRNA断片またはDNA配列を細胞に導入することを含む方法
であって、少なくとも2個のサブ配列がウイルスRNAのセンスおよびアンチセンス
配列を有し、二本鎖RNA分子を形成することができることを特徴とする方法を提
供する。その方法は、好ましくは、細胞に複数のサブ配列からなるRNAを導入す
ることを含み、少なくとも2個のサブ配列がウイルスRNAの配列を有することを特
徴とする。好ましくは、そのRNAは、３’末端サブ配列の上流に位置する少なく
とも1個の翻訳停止コドンを含む。さらなる好ましい実施態様において、その方
法は、当該RNAの発現をコードするヌクレオチド配列またはDNA分子を細胞に導入
することを含む。

【０００６】本発明は、細胞にウイルス標的遺伝子のセンスRNA断片および当該標的遺伝子のアンチセン
スRNA断片を導入することを含む方法を提供する。ここで、当該センスRNA断片お
よび当該アンチセンスRNA断片は、二本鎖RNA分子を形成することができる。ここ
で、当該細胞内の当該標的遺伝子の発現が変化する。好ましい実施態様では、そ
の標的遺伝子は、ウイルスゲノムまたはその一部を含み、その細胞は、好ましく
は、ウイルスに抵抗性または耐性である。好ましい実施態様では、そのウイルス
は、トスポウイルス、ポティウイルス、ポテックスウイルス、トバモウイルス、
ルテオウイルス、ククモウイルス、ブロモウイルス、クロステオルウイルス(clo
steorvirus)、トムブスウイルスおよびフロウイルスからなる群から選択される
。さらなる好ましい実施態様では、そのRNA断片は、ウイルスコートタンパク質
遺伝子、ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質遺伝子、ウイルスレプリカーゼ
遺伝子、ムーブメントタンパク質遺伝子またはその一部に由来するヌクレオチド
配列を含む。さらなる好ましい実施態様では、細胞は植物細胞、例えば、単子葉
植物または双子葉植物細胞である。さらなる好ましい実施態様では、そのRNA断
片は、2個の異なるRNA分子に含まれる。

【０００７】さらなる好ましい実施態様では、RNA断片を、当該細胞に導入する前に混合す
る。さらなる好ましい実施態様では、そのRNA断片を当該細胞に導入する前に二
本鎖RNA分子を形成することのできる条件で混合する。さらなる好ましい実施態
様では、次にそのRNA断片を当該細胞に導入する。さらに好ましい実施態様では
そのRNA断片は1個のRNA分子に含まれる。その場合、そのRNA分子は好ましくはフ
ォールディングして、そこに含まれる当該ＲＮＡ断片は二本鎖RNA分子を形成す
ることができる。

【０００８】本発明は、さらに、細胞に、当該細胞中でウイルス標的遺伝子のセンスRNA断片を発現することので
きる第１のDNA配列、および当該標的遺伝子のアンチセンスＲＮＡ断片を当該細
胞中で発現することのできる第２のＤＮＡ配列を導入することを含む方法を提供
する。ここで、当該センスＲＮＡ断片および当該アンチセンスＲＮＡ断片は、二
本鎖ＲＮＡ分子を形成することができる。ここで、当該ウイルス標的遺伝子の当
該細胞中での発現が変化する。好ましい実施態様では、標的遺伝子は、ウイルス
ゲノムまたはその一部を含み、その細胞は、好ましくはウイルスに抵抗性または
耐性である。好ましい実施態様では、そのウイルスは、トスポウイルス、ポティ
ウイルス、ポテックスウイルス、トバモウイルス、ルテオウイルス、ククモウイ
ルス、ブロモウイルス、クロステオルウイルス(closteorvirus)、トムブスウイ
ルスおよびフロウイルスからなる群から選択される。さらなる好ましい実施態様
では、そのＤＮＡ配列は、ウイルスコートタンパク質遺伝子、ウイルスヌクレオ
キャプシドタンパク質遺伝子、ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ムーブメントタン
パク質遺伝子またはその一部に由来するヌクレオチド配列を含む。さらなる好ま
しい実施態様では、細胞は植物細胞、例えば、単子葉植物または双子葉植物細胞
である。好ましい実施態様では、ＤＮＡ配列は、安定的に植物細胞のゲノムに組
み込まれる。好ましい実施態様では、そのＤＮＡ分子は、当該第１または第２の
ＤＮＡ配列に実施可能なように連結されたプロモーターをさらに含む。さらなる
好ましい実施態様では、第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列は、２個の異
なる、すなわち別のＤＮＡ分子に含まれる。

【０００９】あるいは、第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列は、１個のＤＮＡ分子に
含まれる。この場合、この第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列は、好まし
くは当該ＤＮＡ分子の同じＤＮＡ鎖に含まれ、このことは、センスＲＮＡ断片お
よびアンチセンスＲＮＡ断片が１個のＲＮＡ断片に含まれることを意味する。好
ましくは、そのＲＮＡ分子はフォールディングして、そこに含まれる当該ＲＮＡ
断片は、二本鎖領域を形成することができる。このようなＲＮＡ分子の例は、配
列番号１３、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５または配列番号２８の
逆方向反復配列を含む。さらなる好ましい実施態様では、センスＲＮＡ断片およ
びアンチセンスＲＮＡ断片は、２個のＲＮＡ分子に含まれ、または２個のＲＮＡ
分子として発現される。この場合、第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列は
、好ましくは双方向性プロモーターに実施可能なように連結され、あるいは、第
１のＤＮＡ配列は第１のプロモーターに実施可能なように連結され、第２のＤＮ
Ａ配列は、第２のプロモーターに実施可能なように連結されている。ここで、そ
の第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは、同じプロモーターまたは異
なるプロモーターである。さらなる好ましい実施態様では、第１のＤＮＡ配列お
よび第２のＤＮＡ配列は、当該ＤＮＡ分子の相補鎖に含まれる。

【００１０】なおさらなる好ましい実施態様では、第１のＤＮＡ配列は、当該ＤＮＡ分子の
第２のＤＮＡ配列の相補的ＤＮＡ鎖である。この場合、このＤＮＡ分子は、当該
第１または第２のＤＮＡ配列に実施可能なように連結されている第１のプロモー
ターをさらに含む。好ましい実施態様では、このＤＮＡ分子は、当該第１のプロ
モーターおよび当該第１または第２のＤＮＡ配列の間の第１の部位特異的組換え
部位、並びに当該第１のＤＮＡ配列の３’末端の第２の部位特異的組換え部位を
さらに含む。ここで、当該第１および第２の部位特異的組換え部位は、当該第１
および第２の部位特異的組換え部位の間の当該第１または第２のＤＮＡ配列を、
部位特異的レコンビナーゼの存在下、逆方向化することができる。さらなる好ま
しい実施態様では、当該逆方向化の結果、当該第１のプロモーターは、当該第２
(または第１、最初にプロモーターに連結されたＤＮＡ配列による)のＤＮＡ配列
を発現することができる。その植物細胞は、好ましくは当該部位特異的組換え部
位を認識することのできる部位特異的レコンビナーゼをさらに含む。

【００１１】なおさらなる好ましい実施態様では、当該第１のＤＮＡ配列に実施可能なよう
に連結された第１のプロモーターおよび当該第２のＤＮＡ配列に実施可能なよう
に連結された第２のプロモーターをさらに含む。ここで、当該第１のプロモータ
ーおよび第２のプロモーターは、同じプロモーターを含むか、または異なるプロ
モーターを含む。さらなる好ましい実施態様では、そのＤＮＡ分子中のプロモーターは当該細胞
の本来のプロモーターを含む。さらに好ましい実施態様では、そのプロモーター
は、異種性のプロモーター、例えば、組織特異的プロモーター、発育段階によっ
て調節されるプロモーター、構成的プロモーターまたは誘導可能プロモーターで
ある。所望により、プロモーターは、そのプロモーターのそれぞれの側のＤＮＡ
配列の転写を開始することのできるディバージェントまたは双方向性プロモータ
ーである。

【００１２】なおさらなる好ましい実施態様では、ＤＮＡ配列は、センスおよびアンチセン
スＲＮＡ断片をコードしているＤＮＡ配列の間のリンカーをさらに含む。そのリ
ンカーは、機能性遺伝子、例えば、選択マーカー遺伝子または調節配列、例えば
イントロンプロセシングシグナルを含む例えば発現カセットを含む。

【００１３】本発明は、本発明のセンスおよびアンチセンスＲＮＡ断片を含む細胞をもさら
に提供する。ここで、当該細胞内の当該ウイルス標的遺伝子の発現は、当該ＲＮ
Ａ断片によって変化する。好ましい実施態様では、その細胞は、ウイルスに抵抗
性または耐性である。好ましい実施態様では、その細胞は植物細胞である。本発
明は、その植物細胞に由来する植物およびその後代、並びにその植物に由来する
種子を提供する。

【００１４】本発明は、本発明のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物をも提供する。好ましい実
施態様では、そのようなＤＮＡ構築物は、ウイルスゲノムまたはその一部のセン
スＲＮＡ断片を細胞内で発現させることのできる第１のＤＮＡ配列および当該ウ
イルスゲノムまたはその一部のアンチセンスＲＮＡ断片を当該細胞内で発現させ
ることのできる第２のＤＮＡ配列を含む。ここで、当該センスＲＮＡ断片および
当該アンチセンスＲＮＡ断片は、二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができる。更
なる好ましい実施態様では、当該細胞内の当該ウイルスゲノムまたはその一部の
発現が変化する。さらなる好ましい実施態様では、その細胞は植物細胞である。
さらなる好ましい実施態様では、そのウイルスは、トスポウイルス、ポティウイ
ルス、ポテックスウイルス、トバモウイルス、ルテオウイルス、ククモウイルス
、ブロモウイルス、クロステオルウイルス(closteorvirus)、トムブスウイルス
およびフロウイルスからなる群から選択される。さらなる好ましい実施態様では
、そのＤＮＡ配列は、ウイルスコートタンパク質遺伝子、ウイルスヌクレオキャ
プシドタンパク質遺伝子、ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ムーブメントタンパク
質遺伝子またはその一部に由来するヌクレオチド配列を含む。さらなる好ましい
実施態様では、そのＤＮＡ構築物は、当該第１または当該第２のＤＮＡ配列に実
施可能なように連結されたプロモーターをさらに含む。なおさらなる好ましい実
施態様では、そのＤＮＡ構築物は、当該第１のＤＮＡ配列に実施可能なように連
結された第１のプロモーターおよび当該第２のＤＮＡ配列に実施可能なように連
結された第２のプロモーターを含む。なおさらなる好ましい実施態様では、その
ＤＮＡ構築物は、当該第１のＤＮＡ配列および当該第２のＤＮＡ配列に実施可能
なように連結された双方向性プロモーターをさらに含む。

【００１５】本発明は、下記のものを含むＤＮＡ構築物をさらに提供する。 (ａ)標的遺伝子のセンスＲＮＡ断片を細胞内で発現させることのできる第１のＤ
ＮＡ配列および当該標的遺伝子のアンチセンスＲＮＡ断片を当該細胞内で発現さ
せることのできる第２のＤＮＡ配列。ここで、当該センスＲＮＡ断片および当該
アンチセンスＲＮＡ断片は、二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができる。ここで
、当該第１のＤＮＡ配列は、当該ＤＮＡ構築物の当該第２のＤＮＡ配列の相補鎖
である。 (ｂ)当該第１または第２のＤＮＡ配列に実施可能なように連結されたプロモータ
ー。 (ｃ)当該プロモーターおよび当該第１または第２のＤＮＡ配列の間の第１の部位
特異的組換え部位。 (ｄ)当該第１または第２のＤＮＡ配列の３’末端の第２の部位特異的組換え部位
。ここで、当該第１および第２の部位特異的組換え部位は、当該第１および第２
の部位特異的組換え部位の間の当該第１または第２のＤＮＡ配列を、部位特異的
レコンビナーゼの存在下、逆方向化することができる。好ましい実施態様では、当該細胞の当該標的遺伝子の発現が変化する。

【００１６】本発明は下記のものを含むＤＮＡ構築物をさらに提供する。 (ａ)標的遺伝子のセンスＲＮＡ断片を細胞内で発現させることのできる第１のＤ
ＮＡ配列および当該標的遺伝子のアンチセンスＲＮＡ断片を当該細胞内で発現さ
せることのできる第２のＤＮＡ配列。ここで、当該センスＲＮＡ断片および当該
アンチセンスＲＮＡ断片は、二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができる。ここで
、当該第１のＤＮＡ配列は、当該ＤＮＡ構築物の当該第２のＤＮＡ配列の相補鎖
である。 (ｂ)当該第１のＤＮＡ配列に実施可能なように連結された第１のプロモーター。 (ｃ)当該第２のＤＮＡ配列に実施可能なように連結された第２のプロモーター。好ましい実施態様では、当該細胞の当該標的遺伝子の発現が変化する。

【００１７】「二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)」分子は、標的遺伝子のセンスＲＮＡ断片および
同じ標的遺伝子のアンチセンスＲＮＡ断片を含む。その両者は、互いに相補的な
ヌクレオチド配列を含む。それによって、そのセンスおよびアンチセンスＲＮＡ
断片は対となり、二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができる。「相補的」は、逆位平行(antiparallel)ヌクレオチド配列における相補的塩基残
基の間で水素結合を形成することによって互いに対となることのできる逆位平行
ヌクレオチド配列を含む２本のヌクレオチド配列をいう。

【００１８】「逆位平行」は、本明細書では、一方のヌクレオチド配列では５’−３’方向に
、他方のヌクレオチド配列では３’−５’方向に渡るホスホジエステル結合を有
する相補的塩基残基の間の水素結合により対となった２本のヌクレオチド配列を
いう。「標的遺伝子」は、既知の機能の任意のウイルス遺伝子であるか、その機能が未
知であるが全部または一部のヌクレオチド配列が既知である遺伝子である。標的
遺伝子は、細胞の本来の遺伝子であるか、予め細胞に好ましくは遺伝子形質転換
またはその細胞のウイルス感染によって導入された異種性の遺伝子である。好ま
しくは、その標的遺伝子は、植物細胞の遺伝子である。「本来の」遺伝子とは、形質転換されない細胞のゲノムに存在する遺伝子をい
う。

【００１９】「必須」遺伝子は、タンパク質、例えば、細胞の成長または生存に必須な生合
成酵素、レセプター、情報伝達タンパク質、構造遺伝子産物、または輸送タンパ
ク質のようなタンパク質をコードしている遺伝子をいう。細胞の標的遺伝子の発現の「変化」は、本発明の方法の適用の後、ある細胞内の
標的遺伝子の発現レベルが、その方法の適用のない細胞内でのその発現と異なる
ことを意味する。遺伝子発現の変化は、好ましくは、その細胞内での標的遺伝子
の発現が減少し、好ましくは大きく減少し、より好ましくはその遺伝子発現が検
出不可能となり、細胞またはそれに由来する植物もしくは動物にノックアウト突
然変異表現型をもたらすことを意味する。「単離」は、本発明では、その本来の環境から離れて存在し、したがって天然
物ではない人手によって単離された核酸分子である。単離核酸分子は、精製形態
で存在してもよく、天然ではない環境、例えば、トランスジェニック宿主細胞内
に存在し得る。

【００２０】本明細書で使用される「発現カセット」は、特定のヌクレオチド配列の発現を適
当な宿主細胞にもたらすことができ、終結シグナルに実施可能なように連結され
る所望のヌクレオチド配列に実施可能なように連結されたプロモーターを含むこ
とができるＤＮＡ配列を意味する。典型的には、それは、ヌクレオチド配列の正
確な翻訳のために必要な配列をも含む。コード領域は、通常、所望のタンパク質
をコードするが、所望の機能性ＲＮＡ、例えば、アンチセンスＲＮＡまたは非翻
訳ＲＮＡをもセンスまたはアンチセンス配向でコードしてもよい。所望のヌクレ
オチド配列を含む発現カセットは、キメラ(少なくとも１個のその構成要素が少
なくとも１個の他のその構成要素について異種性である)であってよい。発現カ
セットは、天然に存在するが異種性の発現のために有用な組換え形態で得られた
ものであってもよい。しかし、典型的には、発現カセットは、宿主について異種
性であり、すなわち、発現カセットの特定のＤＮＡ配列は、宿主細胞内に天然に
存在せず、宿主細胞または宿主細胞の後代に形質転換事象によって導入されなけ
ればならない。発現カセット内のヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモータ
ーまたは宿主細胞がある特定の外部刺激にさらされるときのみ転写を開始させる
誘導可能プロモーターの制御下であってよい。多細胞生物、例えば植物の場合、
プロモーターは、特定の組織もしくは器官または発育段階に特異的であることが
できる。

【００２１】本明細書で使用する「異種性の」は、「天然の起源と異なる」を意味するか、非
天然状態を表す。例えば、もし宿主細胞が他の生物、特に他種の生物に由来する
核酸配列で形質転換されれば、その核酸配列を有するその宿主細胞について、お
よびその宿主細胞の子孫についてその核酸配列は異種性である。同様に、異種性
とは、同じ天然の、もとの細胞型に由来し、挿入されているが、非天然状態、例
えば、異なるコピー数、または異なる調節エレメントの制御下で存在するヌクレ
オチド配列をいう。

【００２２】本明細書でヌクレオチド配列について使用するとき、「実質的に類似な」の語
は、最も広い意味で、引用ヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を意味
する。ここで、この対応する配列は、引用ヌクレオチド配列によってコードされ
たポリペプチドとして、実質的に同じ構造および機能を有するポリペプチドをコ
ードする。例えば、ポリペプチド機能に影響を及ぼさないアミノ酸の変化のみ存
在する場合である。望ましくは、その実質的に類似のヌクレオチド配列が、引用
ヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドをコードする。実質的に類
似のヌクレオチド配列および引用ヌクレオチド配列の間の同一性のパーセンテー
ジ（相補的配列内の相補的塩基の数を、相補的配列中の塩基の総数で割る）は、
望ましくは少なくとも８０％、より望ましくは８５％、好ましくは少なくとも90
％、より好ましくは少なくとも95%、さらにより好ましくは少なくとも99%である
。

【００２３】「調節エレメント」は、ヌクレオチド配列の発現付与に関係する配列をいう。
調節エレメントは、所望のヌクレオチド配列および終結シグナルに実施可能なよ
うに連結されたプロモーターを含む。これらは、典型的には、ヌクレオチド配列
の適当な翻訳に要する配列を包含する。「植物」は、任意の発育段階にある任意の植物または植物の一部をいう。ここ
に、挿し木、細胞または組織培養物および種子も含まれる。本発明に使用される
ように、「植物組織」の語は、植物体、植物細胞、植物器官、植物種子、プロト
プラスト、カルス、細胞培養物、並びに構造および／または機能単位に組織化さ
れた植物細胞の任意の群を含むがこれらに限定されない。

【００２４】「ウイルス抵抗性または耐性」は、本明細書では、感受性細胞、植物または動物
と比較したときに１種またはそれ以上のウイルスに対して感受性ではないか低い
感受性である抵抗性または耐性細胞、植物または動物を意味する。例えば、抵抗
性または耐性は、ウイルス感染の通常の症状が不存在であるか減少していること
、または細胞内のウイルスの蓄積もしくは複製が防止されるか減少していること
、または例えば、細胞から細胞へのウイルスの移動が防止されるか減少している
ことを意味する。「ウイルスゲノムまたはその一部の発現の変化」は、典型的には、ウイルスま
たはその一部もしくはその構成要素、例えば、ウイルスのＲＮＡ、ＤＮＡまたは
タンパク質の蓄積、複製または移動が、細胞内で影響を受けていることと理解さ
れる。

【００２５】本発明は、ウイルス遺伝子の細胞、植物または動物内での発現を調節、すなわ
ち変化させる方法に関する。細胞、植物または動物における遺伝子の発現を調節
するために通常利用される方法は、予測可能性に欠け、調節されるべき遺伝子に
よって変動的である。本発明はこれらの課題を解決し、細胞、植物または動物に
おける遺伝子の再現可能で、効率的な調節を提供する。発現が調節される遺伝子は、ウイルスゲノムまたはその一部である。好ましい
実施態様では、細胞は真核細胞、より好ましくは植物細胞、例えば、単子葉植物
もしくは双子葉植物細胞、または動物細胞、例えば、哺乳動物、例えばヒト、ウ
シ、ヒツジ、ブタ、ネコもしくはイヌ、もしくは鳥類からのものである。本発明
は、ウイルス標的遺伝子のセンスＲＮＡ断片およびアンチセンスＲＮＡ断片を利
用し、細胞内の遺伝子の発現を変化させる。第1の実施態様では、本発明は、細
胞に標的遺伝子のセンスＲＮＡ断片および当該標的遺伝子のアンチセンスＲＮＡ
断片を導入することを含む方法を提供する。ここで、当該センスＲＮＡ断片およ
び当該アンチセンスＲＮＡ断片は、二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができる。
ここで、当該細胞内の当該標的遺伝子の発現が変化する。そのＲＮＡ断片を、そ
の細胞に種々の形質転換方法、例えば、パーティクルボンバードメントまたはＰ
ＥＧ介在形質転換またはエレクトロポレーションによって導入する。さらなる好
ましい実施態様では、他の方法、例えば、ＲＮＡ断片のマイクロインジェクショ
ンを使用する。

【００２６】好ましい実施態様では、ＲＮＡ断片は、2個の異なるＲＮＡ分子に含まれる。
この場合、ＲＮＡ断片を当該細胞に導入する前に、例えば、二本鎖ＲＮＡ分子を
形成することのできるような条件下で混合する。さらなる好ましい実施態様では
、ＲＮＡ断片を次に当該細胞に導入する。好ましくは、それぞれのＲＮＡ分子の
導入の間の時間間隔は短く、好ましくは１時間より短い。なおさらなる実施態様
では、ＲＮＡ断片は、1個のＲＮＡ分子に含まれる。単一のＲＮＡ分子を使用す
ることによって、2個の相補的ＲＮＡ断片は対となるほどにきわめて近接してい
るのが好ましい。その場合、好ましくはＲＮＡ分子は、フォールディングして、
そこに含まれる当該ＲＮＡ断片は二本鎖領域を形成することができる。この場合
、ＲＮＡ断片の相補的部分は、互いに認識し、互いに対となり、二本鎖ＲＮＡ分
子を形成する。好ましい実施態様では、このＲＮＡ断片を細胞に導入する前に二
本鎖ＲＮＡ分子を形成することのできる条件でインキュベートする。なおさらな
る実施態様では、このＲＮＡ分子は、センスＲＮＡ断片とアンチセンスＲＮＡ断
片の間にリンカーを含む。このリンカーは、好ましくは、機能性遺伝子、例えば
、選択マーカー遺伝子を含む発現カセットによってコードされたＲＮＡ配列を含
む。さらなる実施態様では、このリンカーは、例えばイントロンプロセッシング
シグナルを含む調節配列によってコードされているＲＮＡ配列を含む。

【００２７】さらなる実施態様では、本発明は、ウイルスゲノムの発現を変化させる方法で
あって、細胞に当該ウイルスゲノムのセンスＲＮＡ断片を当該細胞中で発現する
ことのできる第１のＤＮＡ配列および当該ウイルスゲノムのアンチセンスＲＮＡ
断片を当該細胞中で発現することのできる第２のＤＮＡ配列を導入することを含
む方法を提供する。ここで、当該センスＲＮＡ断片および当該アンチセンスＲＮ
Ａ断片は、二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができる。好ましい実施態様では、
その第１のＤＮＡ配列およびその第２のＤＮＡ配列は、その細胞のゲノムに安定
的に組みこまれる。さらなる好ましい実施態様では、それらのＤＮＡ配列は２個
の異なるＤＮＡ分子に含まれる。さらなる好ましい実施態様では、それらのＤＮ
Ａ配列は、１個のＤＮＡ分子に含まれる。この場合、そのＤＮＡ分子は、好まし
くはセンスおよびアンチセンスＲＮＡ断片を含む単一のＲＮＡ分子をコードする
。単一のＲＮＡ分子を使用することによって、その２個の相補的ＲＮＡ断片は対
となるほどに非常に近接しているので、それは好ましい。そのＤＮＡ分子は、２
個の別々のＲＮＡ分子、例えば、センスＲＮＡ断片を含む1個のＲＮＡ分子およ
びアンチセンスＲＮＡ断片を含む１個のＲＮＡ分子を含む１個のＲＮＡ分子をコ
ードする。単一のＲＮＡ分子またはそららの２個の別のＲＮＡ分子は、好ましく
は、フォールディングして、そこに含まれる当該ＲＮＡ断片は、二本鎖領域を形
成することができる。そのＲＮＡ断片の相補的部分は互いに認識し、互いに対と
なり、二本鎖ＲＮＡ分子を形成する。

【００２８】ある実施態様では、単一のＤＮＡ分子または２個の別のＤＮＡ分子のそれぞれ
は当該ＤＮＡ配列に実施可能なように連結されたプロモーターを含む。好ましい
実施態様では、ＤＮＡ配列中のプロモーターは、本来の植物プロモーターまたは
不活性化されるべき当該ウイルス遺伝子の本来のプロモーターを含む。その二本
鎖ＲＮＡがウイルス標的遺伝子として同じ組織で発育中に同時に発現するのを確
保するためである。さらなる実施態様では、そのプロモーターは、異種性のプロ
モーター、例えば、組織特異的プロモーター、発育段階に応じて調節されるプロ
モーター、構成的プロモーターまたは誘導可能プロモーターである。なおさらなる実施態様では、このＤＮＡ配列は、当該２個の相補的ＲＮＡ断片
をコードするＤＮＡ配列の間にリンカーを含む。このリンカーは、好ましくは、
機能性遺伝子、例えば、選択マーカー遺伝子を含む発現カセットを含む。さらな
る実施態様では、このリンカーは、例えばイントロンプロセッシングシグナルを
含む調節配列を含む。本発明のＤＮＡ分子を、当業界で周知の方法または後記に示す方法を使用して
細胞に形質転換する。本発明は、本発明のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物、その
ようなＤＮＡ構築物を含む組換えベクターおよび本発明のＤＮＡ配列を含む組成
物を提供する。

【００２９】本発明では、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の間の相補的領域は、望ま
しくは少なくとも１５ヌクレオチド長、より望ましくは少なくとも５０ヌクレオ
チド長、好ましくは少なくとも５００ｂｐ長である。好ましくはその相補的領域
は、５ｋｂより小さく、より好ましくは２ｋｂより小さい。ある特定の実施態様
では、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の間の相補的領域は、標的遺伝子の
コード領域を含む。さらなる好ましい実施態様では、その相補的領域は、標的遺
伝子の非翻訳領域(ＵＴＲ)、例えば、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む。なお
さらなる好ましい実施態様では、本発明のセンスまたはアンチセンスＲＮＡ断片
をコードするＤＮＡ配列はｃＤＮＡ分子に由来し、あるいは、発現を変化させる
べきウイルス標的遺伝子の調節エレメント、例えば、プロモーターまたは終結シ
グナルを含む。

【００３０】さらなる好ましい実施態様では、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の間の
相補的領域は、発現が変化する遺伝子の対応する配列と同一である。さらなる好
ましい実施態様では、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の間の相補的領域は
、発現が変化させられる遺伝子の対応する配列と実質的に類似であり、なお、そ
の遺伝子の発現を変化させることができる。この場合、その相補的領域は、望ま
しくは発現が変化させられる遺伝子の対応する配列と少なくとも５０％同一、よ
り望ましくは少なくとも７０%同一、好ましくは少なくとも９０%同一、より好ま
しくは少なくとも９５%同一である。それによって、単一の二本鎖ＲＮＡ分子を
使用して、単一の遺伝子または複数の遺伝子の発現を変化させることができる。
ここで、当該単一の遺伝子は二本鎖ＲＮＡに同一な配列を含むか、その二本鎖Ｒ
ＮＡと実質的の類似である。

【００３１】さらなる好ましい実施態様では、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の間の
相補的領域は、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の間に全くミスマッチを含
まない。さらなる好ましい実施態様では、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片
の間の相補的領域は、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の間に少なくとも１
個のミスマッチを含む。そのとき、２個のＲＮＡ断片は対となり、二本鎖ＲＮＡ
分子を形成し、それによってその遺伝子の発現を変化させることができる。望ま
しくは、相補的領域のセンスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の間のミスマッチは
５０％より少なく、より望ましくは３０％より少なく、好ましくは２０%より少
なく、より好ましくは１０%より少なく、なおさらに好ましくは５%より少ない。

【００３２】ウイルスに対する抵抗性または耐性本発明は、ウイルス抵抗性または耐性である細胞、動物または植物をもたらす
。本発明を使用して制御されるウイルスは、ｄｓＤＮＡウイルス、ｄｓＲＮＡウ
イルス、プラス鎖およびマイナス鎖ｓｓＲＮＡウイルス、アンビセンスＲＮＡウ
イルス並びにレトロウイルスを含むがこれらに限定されない。好ましくは、制御
される植物ウイルスは、例えば、トスポウイルス(例えば、トマト黄化えそウイ
ルス、ＴＳＭＶと略称)、ポティウイルス(例えば、カブモザイクウイルス、Ｔｕ
ＭＶと略称、レタスモザイクウイルス、ＬＭＶと略称、カボチャモザイクウイル
スＩＩ、ＷＭＶＩＩと略称、ズッキーニ黄化モザイクウイルス、ＺＹＭＶと略称
、ジャガイモＹウイルス、ＲＶＹと略称、およびパパイヤリングスポットウイル
ス、ＰＲＳＶと略称)、ポテックスウイルス、トバモウイルス(例えば、ペッパー
微班ウイルス、ＰＭＭＶと略称、およびトマトモザイクウイルス、ＴｏＭＶと略
称)、ルテオウイルス(例えばビート西部萎黄ウイルス、ＢＷＹＶと略称、および
beet mild yellowing virus、ＢＭＹＶと略称)、ククモウイルス(例えば、キュ
ウリモザイクウイルス、ＣＭＶと略称)、ジェミニウイルス(例えば、tomato yel
low leafcurl virus、ＴＹＬＣＶと略称)、カウリモウイルス(例えばカリフラワ
ーモザイクウイルス、ＣａＭＶと略称)、ブロモウイルス、クロステオルウイル
ス(closteorvirus)、トンブスウイルス並びにフロウイルス(例えば、ビートえそ
性葉脈黄化ウイルス、ＢＮＹＶＶと略称)である。本発明を使用して制御可能な
さらなるウイルスのクラスが、Zacomer et al.(1995) Journal of General Viro
logy, 76:231-247およびMartelli(1992)Plant Disease, 76: 436-441に記載され
ている。ウイルス制御を達するためにウイルスゲノムの好ましいＤＮＡ配列は、
ウイルスコートタンパク質、ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質、ウイルス
レプリカーゼ、ムーブメントタンパク質等をコードしている遺伝子の領域に対応
する。ウイルスゲノム発現を制御するために有用なさらなるヌクレオチド配列は
、ＷＯ９５／０９９２０に記載されている。好ましいＤＮＡ配列はタンパク質に
翻訳されないウイルスゲノムの一部、例えば、５’または３’非翻訳領域を含み
うる。

【００３３】好ましくは、本発明の方法は広いスペクトルのウイルスへの抵抗性または耐性
をもたらす。例えば、本発明の方法はウイルスゲノムによってコードされている
ウイルスおよび同じウイルス綱、群または属の他のウイルスへの抵抗性または耐
性をもたらす。あるいは、本発明の方法は、ウイルスゲノムおよび同じウイルス
の他の分離株によってコードされているウイルスへの抵抗性または耐性をもたら
す。本発明の方法は、ウイルスゲノムおよび異なる種であって好ましくは関連す
る種、好ましくはそのようなウイルスが存在する種である異なる種における同じ
ウイルス群または属の他のウイルスによってコードされているウイルスに対する
抵抗性または耐性をももたらす。所望により、1対より多い、すなわち少なくと
も2対の、ｄｓＲＮＡを形成することのできるセンスおよびアンチセンスＲＮＡ
断片を使用する。そのような対は例えば、同じウイルスゲノムだけでなく同じウ
イルスゲノムの異なる部分に由来する。あるいは、そのような対は、異なるウイ
ルスゲノムに由来する。したがって、異なるウイルスクラス、群または属への抵
抗性または耐性を、本発明を使用して達成する。

【００３４】植物細胞およびそれに由来する植物は、それらはウイルス抵抗性または耐性で
あるのだが、好ましくは双子葉植物である。シュガービートおよびキャノーラに
おけるフロウイルス(例えばRush and Heidel(1995)Plant Disease 79: 868-875
参照)の抵抗性または耐性を付与する方法を、本発明に記載し、ＢＮＹＶＶ、シ
ュガービートにおけるrhizomania(crazy roots)の原因病原体についてさらなる
詳細を実施例9に記載する。「ウイルス黄化」(例えば、CRC Handbook on Disease
of Sugar Beet, Volume II, pp. 35-52参照)例えば、ＢＭＹＶおよびビート西部
萎黄ウイルス(ＢＷＹＶ)(シュガービートおよび脂肪種子ナタネにそれぞれ感染
する)への抵抗性または耐性を付与する方法を、実施例8にさらに詳細に記載する
。本発明の方法は、単子葉植物のウイルスへの耐性または抵抗性を付与する。例
えば、本発明および米国特許5,569,828の方法を使用して、Maize chlorotic dwa
rf virusに対する耐性または抵抗性を得る。同様に本発明および米国特許5,428,
144の方法を使用して、Maize dwarf mosaic virusに対する耐性または抵抗性を
得る。

【００３５】植物形質転換技術本発明のＤＮＡ分子を植物またはバクテリア細胞に通常の組換えＤＥＮＡ技術
を使用して組みこむ。一般に、本発明のＤＮＡ分子は形質転換ベクターに含まれ
る。当分野で既知の多くのそのようなベクター系、例えば、プラスミド、バクテ
リオファージウイルスおよび他の修飾されたウイルスを使用する。発現系の構成
要素を修飾して、例えば、センスおよびアンチセンスＲＮＡ断片の発現を増大さ
せる。例えば、配列の切除、ヌクレオチドの置換、または他の修飾を実施する。
当分野で既知の発現系を使用して、実質的に任意の作物植物細胞を適当な条件で
形質転換する。本発明のＤＮＡ分子を含む導入遺伝子を、宿主細胞のゲノムに好
ましくは安定的に組みこむ。さらなる好ましい実施態様では、本発明のＤＮＡ分
子を含む導入遺伝子を、自己複製ベクター中に置く。自己複製ベクターの例は、
ウイルス、特にジェミニウイルスである。形質転換された細胞を好ましくは植物
体に再生する。本発明の形質転換された植物は、単子葉または双子葉植物であっ
てよく、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、カンショ、(インゲン)マ
メ、エンドウ、チコリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カ
ブ、ダイコン、ホウレンソウ、アウパラガス、タマネギ、ニンニク、ペッパー、
セルリー、カボチャ、ペポカボチャ、アサ、ズッキーニ、リンゴ、ナシ、マルメ
ロ、メロン、スモモ、サクランボ、モモ、ネクタリン、アンズ、イチコ、ブドウ
、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボガド、パパイヤ、マンゴー
、バナナ、ダイズ、トマト、ソルガム、サトウキビ、シュガービート、ヒマワリ
、ナタネ、クローバー、タバコ、ニンジン、ワタ、アルファルファ、イネ、ジャ
ガイモ、ナス、キュウリ、アラビドプシス、並びに樹木植物、例えば、針葉樹お
よび落葉樹を含むがこれらに限定されない。望ましいヌクレオチド配列を特定の
植物種に形質転換し、その種内で増殖し、または伝統的な育種法を使用して同じ
種の特に商業的な変種を含む他の変種に導入する。

【００３６】Ａ．植物発現カセットの構築に要するものトランスジェニック植物における発現を意図された遺伝子配列を、まず発現カ
セットに、植物で発現可能な適当なプロモーターの後方に組みこむ。発現カセッ
トは、導入遺伝子の発現のために要するか選択された任意のさらなる配列を含み
うる。そのような配列は、例えば、転写ターミネーター、イントロンのような発
現を増強する外来配列、必須配列および特定のオルガネラおよび細胞構成要素へ
の遺伝子産物のターゲッティングを意図する配列を含むがこれらに限定されない
。これらの発現カセットを、後記の植物形質転換ベクターに容易に送達すること
ができる。典型的な発現カセットの種々の構成要素を後述する。

【００３７】１．プロモーター発現カセットに使用されるプロモーターの選択によって、トランジェニック植
物における導入遺伝子の位置および時間的発現パターンが決定される。選択され
たプロモーターは、特異的な細胞型(例えば、葉表皮細胞、葉肉細胞、根皮層細
胞)または特異的な組織または器官(例えば、根、葉または花)中で導入遺伝子を
発現させ、その選択はその遺伝子産物の蓄積の望ましい位置に影響を及ぼす。あ
るいは、選択されたプロモーターは、種々の誘導条件で遺伝子の発現を駆動する
。プロモーターはその力、すなわち転写を促進する能力が異なる。利用される宿
主細胞系によって、当分野で既知の任意の数の適当なプロモーターを使用する。
例えば、構成的発現のために、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、イネアクチンプ
ロモーター、またはユビキチンプロモーターを使用する。例えば、調節可能な発
現のためには、タバコまたはアラビドプシスに由来する化学的に誘導可能なＰＲ
−１プロモーターを使用する(例えば、米国特許5,689,044参照)。

【００３８】プロモーターの好ましいカテゴリーは、傷誘導可能なものである。傷部位で発
現される多くのプロモーターが記載されている。この種の好ましいプロモーター
は、Stanford et al. Mol Gen. Genet. 215: 200-208(1989), Xu et al. Plant
Molec. Biol. 22: 573-588(1993), Logemann et al. Plant Cell 1: 151-158(19
89),Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22: 783-792(1993), Firek et al
. Plant Molec. Biol. 22: 129-142(1993) and Warner et al. Plant J.3:191-2
01(1993)に記載されているものを含む。好ましい組織特異的発現型は、緑色組織特異的、根特異的、茎特異的および花
特異的なものを含む。緑色組織での発現に適当なプロモーターは、光合成に関係
する遺伝子を調節する多くのものを含む。これらの多くは、単子葉植物および双
子葉植物からクローニングされた。好ましいプロモーターは、ホスホエノールカ
ルボキシラーゼ遺伝子に由来するトウモロコシＰＥＰＣプロモーターである(Hud
speth & Grula, Plant Molec. Biol. 12: 579-589(1989))。根特異的発現に好ま
しいプロモーターは、de Framondによって記載されたものである(FEBS 290: 103
-106(1991); EP0452269)。さらに好ましい根特異的プロモーターは、本発明によ
って提供するＴ−１遺伝子に由来するものである。好ましい茎特異的プロモータ
ーは、米国特許5,625,136に記載されたものであり、トウモロコシｔｒｐＡ遺伝
子の発現を駆動する。本発明の好ましい実施態様は根特異的な方法でヌクレオチド配列を発現するト
ランスジェニック植物である。さらに好ましい実施態様は、傷誘導可能または病
原体感染誘導可能な方法でヌクレオチド配列を発現するトランスジェニック植物
である。

【００３９】２．転写ターミネーター広範な転写ターミネーターが発現カセット中の使用のために利用可能である。
これらは導入遺伝子を超えた転写の終結および正確なポリアデニル化に必要であ
る。適当な転写ターミネーターが植物で機能するとして知られているものであり
、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ｔｍｌターミネーター、ノパリンシンター
ゼターミネーター、およびエンドウｒｂｃＳＥ９ターミネーターを含む。これ
らは単子葉植物および双子葉植物の両方に使用される。

【００４０】３．発現の増強または調節のための配列多くの配列が転写単位内からの遺伝子発現を増強することが見出されている。
これらの配列は、本発明の遺伝子と結合させて使用して、トランスジェニック植
物内での発現を増加させることができる。例えば、種々のイントロン配列、例え
ば、トウモロコシＡｄｈｌ遺伝子のイントロンは、特に単子葉植物細胞で発現を
増強することが示された。さらに、ウイルスに由来する多くの非翻訳リーダー配
列が発現を増強すると知られており、これらは双子葉植物細胞で特に効果的であ
る。

【００４１】４．コード配列の最適化一般に、選択された遺伝子のコード配列を、所望の作物種における最適な発現
のためにコード配列を変化させることによって改変し得る。コード配列を修飾し
て特定の作物種で最適な発現を達成する方法が周知である(例えば、Perlak et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324(1991); and Koziel et al., Bio/te
chmol. 11:194(1993)参照)。さらなる好ましい実施態様では、本発明のＤＮＡ分子を色素体ゲノムに直接的
に形質転換する。色素体形質転換法が米国特許番号5,451,513、5,545,817および
5,545,818、ＰＣＴ出願番号WO95/16783、およびMcBride et al.(1994)Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 91,7301-7305に詳細に記載されている。葉緑体形質転換の基
本的な方法は、選択マーカーにフランキングなクローニングされた色素体ＤＮＡ
の領域を所望の遺伝子と共に、適当な標的組織に、例えば、バイオリスティック
またはプロトプラスト形質転換(例えば、塩化カルシウムまたはＰＥＧ仲介形質
転換)を使用して導入することに関する。ターゲティング配列と称する１ないし
１．５ｋｂフランキング領域によって、色素体ゲノムの同種性の組み換えを容易
化し、plastomeの特異的領域の置換または修飾が可能になる。

【００４２】最初に、葉緑体16S ｒRNA並びにスペクチノマイシンおよび／またはストレプ
トマイシンに対する抵抗性を付与するｒｐｓ１２遺伝子における点突然変異を形
質転換のための選択マーカーとして利用する(Svab, Z., Hajdukiewicz, P., and
Maliga, P.(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530; Staub, J. M.,
and Maliga, P. (1992)Plant Cell 4,39-45)。これらのマーカーの間のクロー
ニング部位の存在によって、外来DNA分子の導入のための色素体ターゲッティン
グベクターを生成することができる(Staub, J.M.,and Maliga, P. (1993)EMBO J
.12, 601-606)。劣性のｒRNAまたはr−タンパク質抗生物質抵抗性遺伝子を、優
性の選択マーカー、例えば、スペクチノマイシン解毒酵素アミノグリコシド−3'
-アデニルトランスフェラーゼをコードしているバクテリアａａｄＡ遺伝子で置
換することによって、形質転換頻度を実質的に増加できる(Svab, Z., and Malig
a, P. (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917)。以前、このマーカー
を使用して、緑藻Chlamydomonas reinhardtiiの色素体ゲノムの高頻度形質転換
に成功している(Goldschmidt-Clermont, M. (1991)Nucl. Acids Res. 19:4083-4
089)。色素体形質転換に有用な他の選択マーカーが当分野で知られ、本発明の範
囲に入る。

【００４３】色素体発現とは、遺伝子が相同組換えでそれぞれの植物細胞に存在する数千コ
ピーの環状色素体ゲノムに挿入されることである。好ましい実施態様では、本発
明のＤＮＡを色素体ターゲッティングベクターに挿入し、所望の植物宿主の色素
体ゲノムに形質転換する。本発明のＤＮＡ分子を含む色素体ゲノムについてホモ
プラスミックな植物を得て、それはそのＤＮＡ分子を選択的に高度に発現するこ
とができる。好ましくは、そのＤＮＡ分子をコードしているセンスおよびアンチ
センスＲＮＡ断片は、対となって、植物色素体内で二本鎖ＲＮＡ分子を形成し、
色素体遺伝子の発現を変化させることができる。好ましい実施態様では、センス
およびアンチセンス断片は相補的領域に全くミスマッチを含まない。さらなる好
ましい実施態様では、センスおよびアンチアセンス断片は少なくとも1個のミス
マッチをその相補的領域に含む。この場合、ＲＮＡ断片をコードしているＤＮＡ
分子内のＤＮＡ配列は、互いに再結合することができない。

【００４４】Ｂ．植物形質転換ベクターの構築植物形質転換に利用可能な多くの形質添加ベクターが植物形質転換技術の当業
者に既知であり、本発明に関係する遺伝子を任意のそのベクターと結合させて使
用することができる。そのベクターの選択は好ましい形質転換法および形質転換
の標的の種に依存する。ある種の標的種のために、種々の抗生物質または除草剤
選択マーカーが好ましい。形質転換にルーチンに使用される選択マーカーは、カ
ナマイシンおよび関連する抗生物質に対する抵抗性を付与するｎｐｔｌｌ遺伝子
(Messing & Vierra. Gene 19:259-268(1982); Bevan et al., Nature 304: 184-
187(1983))、除草剤ホスヒノトリシンに対する抵抗性を付与するＢaｒ遺伝子(Wh
ite et al., Nucl. Acids Res 18: 1062(1990),Spencer et al. Theor. Appl. G
enet 79: 625-631(1990))抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を付与する
ｈｐｈ遺伝子(Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4: 2929-2931)および
メタトレキセートに対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ遺伝子(Bourouis et al.,
EMBO J.2(7): 1099-1104(1983))並びにグリホサートに対する抵抗性を付与する
ＥＰＳＰＳ遺伝子(米国特許番号4,940,935 and 5,188,642)を含む。

【００４５】１．アグロバクテリウム形質転換に適当なベクター多くのベクターがアグロバクテリウムツメファシエンスを使用する形質転換に
利用できる。これらは典型的には少なくとも1個のＴ−ＤＮＡボーダー配列を有
し、例えばｐＢＩＮ１９(Bevan, Nucl. Acids Res. (1984))およびｐＸＹＺのよ
うなベクターを含む。アグロバクテリウム形質転換に適当な典型的なベクターは
、バイナリーベクターｐＣＩＢ１０およびｐＣＩＢ２００１並びにバイナリーベ
クターｐＣＩＢ１０およびそのハイグロマイシン選択誘導体を含む。(例えば米
国特許番号5,639,949参照)。

【００４６】２．非アグロバクテリウム形質転換に適当なベクターアグロバクテリウムツメファシエンスを使用しない形質転換は、選択された形
質転換ベクター中のＴ−ＤＮＡ配列の必要性を回避し、結果的に、これらの配列
を欠いたベクターをＴ−ＤＮＡ配列を含む前記のもののようなベクターに加えて
利用する。アグロバクテリウムに依存しない形質転換法は、パーティクルボンバ
ードメント、プロトプラスト取り込み(例えば、ＰＥＧおよびエレクトロポレー
ション)およびマイクロインジェクションによる形質転換を含む。ベクターの選
択は、形質転換される種の好ましい選択に多くは依存する。非アグロバクテリウ
ム形質転換に適当な典型的なベクターは、ｐＣＩＢ３０６４、ｐＳＯＧ１９、お
よびｐＳＯＧ３５を含む。(例えば、米国特許番号5,639,949参照)。

【００４７】Ｃ．形質転換法所望のＤＮＡ配列を発現系にクローニングし、植物細胞に形質転換する。植物
の形質転換および再生の方法は当分野で周知である。例えば、Ｔｉプラスミドベ
クター、並びに直接的ＤＮＡ取り込み、リポソーム、エレクトロポレーション、
マイクロインジェクション、およびマイクロプロジェクタイルを外来ＤＮＡの送
達のために使用する。さらにアグロバクテリウム属からのバクテリアを植物細胞
を形質転換するために利用できる。

【００４８】双子葉植物のための形質転換方法は当分野で周知であり、アグロバクテリウム
に基づく方法およびアグロバクテリウムを要しない方法を含む。非アグロバクテ
リウム方法は、外生遺伝的物質をプロトプラストまたは細胞に直接的に取り込む
ことを含む。これは、ＰＥＧまたはエレクトロポレーション仲介取り込み、パー
ティクルボンバードメント仲介送達またはマイクロインジェクションによって達
成する。いずれの場合も、形質転換した細胞を、当分野で既知の標準的方法を使
用して植物体に再生する。殆どの単子葉植物種の形質転換は、現在ではルーチンとなった。好ましい方法
は、ＰＥＧまたはエレクトロポレーションを使用するプロトプラストへの直接的
遺伝子導入、カルス組織へのパーティクルボンバードメントおよびアグロバクテ
リウム仲介形質転換を含む。

【００４９】本発明を後記の詳細な実施例を記載することによってさらに説明する。これら
の実施例は例示のみのために提供し、特に明示しない限り限定することを意図し
ていない。

【００５０】実施例ここで使用した標準的組み換えＤＮＡおよび分子クローニング法は当分野で周
知であり、Sambrook, et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY(1989) and T.J. Silhavy, M.L. Ber
man, and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbo
r Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1984) and by Ausubel, F.M. et al.,
Current Protocols in Molecular Biology, pub. by Greene Publishing Assoc.
and Wiley-Interscience(1987)に記載されている。

【００５１】実施例１：ルシフェラーゼ遺伝子の発現の調節ルシフェラーゼＲＮＡデュプレックス(duplex)をコードするキメラＤＮＡ分子の
構築プラスミドｐＬｕｃ＋(Promega)からのホタルルシフェラーゼ遺伝子の７８３
ｂｐの「センス」配向断片を、ｐＰＨ１０８プラスミＤＮＡからオリゴヌクレオチ
ドプライマーｄｓＬｕｃ１（５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧ
ＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡ−３’、配列番号１；ＢａｍＨＩ制限部位に
下線を付す）およびｄｓＬｕｃ２（５’−ＣＧＧＡＡＧＣＴＴＡＧＧ
ＣＴＣＧＣＣＴＡＡＴＣＧＣＡＧＴＡＴＣＣＧＧＡＡＴＧ−３
’、配列番号２；ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に下線を付す）を使用して増幅する。
ＴｕｒｂｏＰｆｕ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ(Stratagene)を、５０μｌ反応物
中で、製造者のプロトコールにしたがって、９５℃／１分、５５℃／１．５分、
７２℃／２分の５サイクル、続いて９５℃／１分、７２℃／３．５分の２５サイ
クルで使用する。同様の方法で、プラスミドｐＬｕｃ＋からのホタルルシフェラ
ーゼ遺伝子の７３７ｂｐ「アンチセンス」配向断片をｐＰＨ１０８プラスミドＤＮ
Ａから、オリゴヌクレオチドプライマーｄｓＬｕｃ３（５’−ＣＧＧＴＣＴ
ＡＧＡＧＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴＡ−３’、配列
番号３；ＸｂａＩ制限部位に下線を付す）およびｄｓＬｕｃ２（５’−ＣＧＧ
ＡＡＧＣＴＴＡＧＧＣＴＣＧＣＣＴＡＡＴＣＧＣＡＧＴＡＴ
ＣＣＧＧＡＡＴＧ−３’、配列番号２；ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に下線を
付す）を使用してＰＣＲによって増幅する。得られたＤＮＡ断片を低融点アガロ
ース（ＦＭＣ）から作成した１％トリスアセテートゲルによる電気泳動、続いて
ＰＣＲ産物を含む切除したゲルスライスをフェノール−クロロホルム抽出により
精製する。標準的方法（制限酵素をNew England Biolabsから得た)にしたがって
、センス産物（ｄｓＬｕｃ１／２）からのＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄ
ＩＩＩで消化し、アンチセンス産物（ｄｓＬｕｃ３／２）からのＤＮＡを、Ｘ
ｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化する。得られた粘着末端ＤＮＡ断片を前記の
ようにゲル精製する。ｍａｓ１’プロモーター(Velten et al. (19984)EMBO J.
3: 2723-2730)を含むＤＮＡ断片をプラスミドＣＳＡ１０４をＥｃｏＲＩおよび
ＨｉｎｃＩＩで消化し、５６４ｂｐＤＮＡ断片を精製することによって得る。
この断片をＢａｍＨＩで再消化し、ｍａｓ１’プロモータを含む４８４ｂｐのＥ
ｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩサブ断片を単離し、ゲル精製する。プラスミドｐＰＨ１６
９を構築するために、クローニングベクターｐＬｉｔｍｕｓ２９(New England B
iolabs)からのＤＮＡを、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、単離した断片を
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(New England Biolabs)を使用して４通りの反応でｍａｓ
１’プロモーターＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片並びにセンス（ＢａｍＨＩ−Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ）およびアンチセンス（ＨｉｎｄＩＩＩ―ＸｂａＩ）ｄｓＬｕｃ
ルシフェラーゼ遺伝子断片にライゲートする。ｄｓＬｕｃ１／２／３ＲＮＡデ
ュプレックス構築物でのアグロバクテリウム仲介植物形質転換のためのバイナリ
ーベクターｐＰＨ１７０を構築するために、バクテリア選択のためのカナマイシ
ン抵抗性遺伝子およびトランスジェニック植物選択のためのハイグロマイシン抵
抗性遺伝子を有するバイナリープラスミドｐＳＧＣＨＣ１からのＤＮＡを、Ｅｃ
ｏＲＩおよびＸｂａＩで消化する。得られたｐＳＧＣＨＣ１からの１１．６ｋｂ
単離断片を４通りの反応でＴ４ＤＮＡリガーゼ(New England Biolabs)を使用
してｍａｓ１’プロモーターＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片並びにセンス(Ｂａｍ
ＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ）およびアンチセンス（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ）ｄｓ
Ｌｕｃルシフェラーゼ遺伝子断片にライゲートする。

【００５２】アグロバクテリウムの形質転換およびアラビドプシス植物の減圧浸潤プラスミドｐＰＨ１７０をアグロバクテリウムツメファシエンスＧＶ３１０１
にエレクトロポレーションによって導入し、形質転換されたコロニーを選択し、
増幅する。ルシフェラーゼを構成的に（ＵＢＱ３プロモーター(Norris et al.(1
993)PMB 21:895-906)／ＵＢＱ３＋ＣａＭＶ３５Ｓ５’ＵＴＲ／ｌｕｃ＋；ｐ
ＰＨ１０８）または誘導可能に（アラビドプシスＰＲ−１プロモーター／ｌｕｃ
＋；ｐＰＨ１３５、系統６Ｅ）発現しているアラビドプシス(Arabidopsis thali
ana)突然変異系統の４ないし５週齢の植物を、ｐＰＨ１７０バイナリーＴ−ＤＮ
Ａベクターを有するアグロバクテリウムコロニーで減圧浸潤する。形質転換した
植物を、ハイグロマイシンおよびカナマイシンで共選択し、制御されたファイト
トロン条件下でルシフェラーゼ活性の決定のために育成する。さらに、ｐＰＨ１
３５−６Ｅバックグラウンドのルシフェラーゼ活性をＢＴＨ（ＢＴＨ処理はLawt
on et al. Plant J. 10: 71-82に詳細に記載されている）で誘導の４８時間後に
評価する。ルシフェラーゼ活性を、ルシフェリン基質の添加に続く組織エキスト
ラクト中でのルミネッセンスに基づくアッセイを使用して定量する。ルシフェラ
ーゼ活性をＣＣＤ-cooledビデオイメージングシステム(Hamamatsu)を使用して植
物体でもモニターする。

【００５３】実施例２：アラビドプシスＧＬ１遺伝子の発現の調節ＧＬ１遺伝子は、通常のトリコーム（リーフヘアー）形成のイニシエーション
に要するｍｙｂ様転写因子をコードする(Oppenheimer et al.(1991)Cell 67: 48
3-493)。発育の初期のＧＬ１発現のノックアウトは、植物にトリコームの欠如を
もたらす。ノックアウト表現型は幼苗で容易に同定でき、致死ではない。構成的
発現のための３種のベクターおよびＧａｌ４ＣＩ調節された発現のための３種の
ベクターを構築する。それぞれのプロモーターを試験するための３種の異なるベ
クターは、ＧＬ１遺伝子断片のセンス（＋）発現、アンチセンス（−）発現およ
びデュプレックス（＋／−）ＲＮＡ発現である。（＋）および（−）ベクターは
、ＧＬ１の発現に及ぼす効果を比較するためのコントロールである。それぞれの
場合、ＧＬ１配列(GenBank Accession M79448)の塩基＃７３９ないし＃１７８１
からの５’断片をベクター構築のために使用する。

【００５４】Ｇａｌ４ＣＩ調節された発現ＧＬ１遺伝子断片を交差誘導可能ベクター構築物ｐＪＧ３０４−１にＮｃｏＩ
−ＳａｃＩ断片としてクローニングする。プラスミドｐＪＧ３０４をｐＢＳＳＫ
＋から誘導する。プラスミドｐＢＳＳＫ＋(Stratagene, LaJolla,CA)をＳａｃ
Ｉで線形化し、マングビーンヌクレアーゼで処理し、ＳａｃＩ部位を除去し、Ｔ
４リガーゼで再ライゲートし、ｐＪＧ２０１を作成する。１０ＸＧＡＬ４コンセ
ンサス結合部位／ＣａＭＶ３５Ｓミニマルプロモーター／ＧＵＳ遺伝子／Ｃａ
ＭＶターミネーターカセットをｐＡＴ７１からＫｐｎＩで除去し、ｐＪＧ２０１
のＫｐｎＩ部位にクローニングし、ｐＪＧ３０４を作成する。プラスミドｐＪＧ
３０４を制限エンドヌクレアーゼＡｓｐ７１８で一部消化し、全長線形断片を単
離する。この断片をモル過剰の２２塩基のオリゴヌクレオチドＪＧ−Ｌ（５’−
ＧＴＡＣＣＴＣＧＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧ−３’、配列
番号４）とライゲートする。制限分析を使用して、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合部位の
５’にこのリンカーを挿入されたクローンであると同定し、このプラスミドをｐ
ＪＧ３０４ＤＸｈｏＩと命名する。ＮｃｏＩおよびＳａｃＩ部位を、５’末端に適当な制限部位を有するＰＣＲプ
ライマーを合成することによって（＋）および（−）断片の末端に付加する。（
＋／）ＧＬ１断片を２個の断片:５’末端にＮｃｏＩ部位、３’末端にＨｉｎｄ
ＩＩＩ部位を有する（＋）断片および５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位、３’末端
にＳａｃＩ部位を有する（−）断片を最初に生成することによって生成する。デ
ュプレックスユニットを得られた断片にＥｃｏＲＩ部位でライゲートすることに
よって生成する。発現ユニットは、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメイン、続いてミニ
マルＴＡＴＡ配列、および（＋）、（−）または（＋／−）配向であるＧＬ１遺
伝子断片を含む。

【００５５】構成的発現双子葉植物で比較的強力で構成的なアグロバクテリウム（ｒｅｆ）からのマン
ノピンシンターゼのｍａｓ１’プロモーターを使用する。前記のように、ＧＬ（
＋）、（−）および（＋／−）断片をpBluescriptの１’プロモーターの後方に
ライゲートする。３種類の異なる発現カセットをｐＣＩＢ２００にＥｃｏＲＩ／
ＳａｌＩ断片としてライゲートする(Uknes et al.(1993)Plant Cell 5:159-169)
。

【００５６】実施例３：シスタチオンベータリアーゼ遺伝子の発現の調節シスタチオンベータリアーゼ（ＣＢＬ）遺伝子は、メチオニン生合成経路のあ
る段階をコードしている。植物におけるその発現の調節の影響をセンスおよびア
ンチセンス構築物、並びに二本鎖ＲＮＡ構築物を使用して試験する。アンチセンス構築物：ｐＪＧ３０４ＤＸｈｏＩベクターからの断片を含み、アン
チセンス配向のＣＧＬ遺伝子(ヌクレオチド＃１３−１１５９、Genbbank access
ion #L40511)の一部が挿入された、バイナリーＢＡＳＴＡベクターｐＪＧ２６１
を使用する。センス構築物：ＣＢＬ断片が反対配向である以外は、アンチセンス構築物と同様
である。この構築物はＡＴＧ開始コドンおよび殆どのＣＢＬＯＲＦを含み、Ｃ
ＢＬ遺伝子の発現の制御および調節として働く。二本鎖ＲＮＡ構築物：センス配向のＣＢＬ遺伝子断片（#１３−１１５９）を、
ＣＢＬ遺伝子のアンチセンス配向バージョンの下流であってベクターｐＪＧ３０
４−１のＳａｌＩ部位に挿入する。約１０ｂｐのリンカーが２コピーのＣＢＬの
間に存在する。

【００５７】実施例４:植物発現カセットの構築のために必要なものトランスジェニック植物における発現を意図する遺伝子配列を、適当なプロモ
ータの後方であって適当な転写ターミネーターの上流の発現カセット中に最初に
組みたてる。植物発現カセットの構築に必要なすべては、本発明のＤＮＡ分子に
当てはまり、当分野で周知の技術を使用して実施する。

【００５８】プロモーター選択発現カセットに使用するプロモーターの選択は、トランスジェニック植物での
ＤＮＡ分子の位置および時間的発現パターンを決定する。選択されたプロモータ
ーは、特異的な細胞型（例えば、葉表皮細胞、葉肉細胞、根皮層細胞）でまたは
特異的な組織または器官（例えば、根、葉または花）でＤＮＡ分子を発現させ、
その選択はそのＤＮＡ分子によってコードされたＲＮＡ断片の生合成の望ましい
位置に影響を及ぼす。あるいは、選択したプロモーターは、光誘導または他の時
間的に調節されたプロモーターの下でＤＮＡ分子の発現を駆動し得る。あるいは
選択されたプロモーターは、化学的に調節されるものである。これにより、望ま
しく、化学的インデューサーでの処理によって引き起こされるときのみＤＮＡ分
子の発現を誘導する可能性を提供される。転写ターミネーター種々の転写ターミネーターが発現カセット中での使用のために利用可能である
。これらは、転写の終結および好ましくは正確なポリアデニル化のために必要で
ある。適当な転写ターミネーターおよび植物中で機能すると知られているものは
、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ｔｍｌターミネーター、ノパリンシンター
ゼターミネーター、エンドウｒｂｃＳＥ９ターミネーターを含む。これらは単
子葉および双子葉植物の両方で使用できる。

【００５９】発現の増強または調節のための配列多くの配列が転写ユニット内からの遺伝子発現を増強することが見出されてき
た。これらの配列を本発明のＤＮＡ分子と組み合わせて使用し、トランスジェニ
ック植物中でのその発現を増大させることができる。種々のイントロン配列が特に単子葉植物細胞での発現を増強させることが示さ
れている。例えば、トウモロコシＡｄｈ１遺伝子のイントロンが、トウモロコシ
細胞に導入されたときそのコグネイトプロモーターの下で野生型遺伝子の発現を
有意に増強することが見出された。イントロン１は、特に有効であると見出され
、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子との融合構築物にお
いて発現を増強する(Callis et al., Genes Dvelop 1: 1183-1200(1987))。同じ
実験系で、トウモロコシｂｒｏｎｚｅ１遺伝子からのイントロンが発現の増強に
同様の効果を有する(Callis et al.,前掲)。イントロン配列は、日常的に植物形
質転換ベクターに、典型的には非翻訳リーダー内に組みこまれている。ウイルス由来の多くの非翻訳リーダー配列が、発現を増強することが知られて
いる。これらは双子葉植物細胞で特に有効である。特に、タバコモザイクウイル
ス(TMV、「Ω配列」）、トウモロコシ退緑斑紋ウイルス(Maize Chlorotic Mottle
Virus(MCMV))、およびアルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）からのリー
ダー配列が、発現を増強するのに有効であると示されている(例えば、Gallie et
al., Nucl. Acids Res. 15: 8693-8711(1987); Skuzeski et al. Plant Molec.
Biol. 15; 65-79(1990))。

【００６０】実施例５：発現カセット構築物の例本発明は、プロモーターの起源に関わらず植物で発現可能な任意のプロモータ
ーの調節の下での本発明のＤＮＡ分子の発現を含む。したがって、ＤＮＡ分子を
、当分野で周知の方法によって任意の発現カセットに挿入する。これらの発現カ
セットは、後記の植物形質転換ベクターに容易に移入することができる。さらに
本発明は、ＤＮＡ分子の発現のために要されまたは選択される任意のさらなる配
列と組み合わせて任意の発現可能プロモーターを使用することを含む。そのよう
な配列は、転写ターミネーター、発現を増強するための外来配列を含むがこれら
に限定されない(例えば、イントロン[例えば、Ａｄｈイントロン１]、ウイルス
性配列[例えばＴＭＶ−Ω]）。

【００６１】構成的発現：ＣａＭＶ３５ＳプロモータープラスミドｐＣＧＮ１７６１の構築は、公開された特許出願ＥＰ０３９２２２
５に記載されている。ｐＣＧＮ１７６１は「ダブル」３５Ｓプロモーターおよび
ｔｍｌ転写ターミネーターを含み、プロモーターおよびターミネーターの間に特
異的ＥｃｏＲＩ部位を有しており、ｐＵＣ−タイプバックボーンを有する。存在
するＥｃｏＲＩ部位に加えＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ部位を含む修飾されたポリリ
ンカーを有するｐＣＧＮ１７６１の誘導体を構築する。この誘導体をｐＣＧＮ１
７６１ＥＮＸと命名する。ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸはトランスジェニック植物で
の３５Ｓプロモーターの制御の下での発現のためのポリリンカー内のｃＤＮＡ配
列または遺伝子配列（微生物ＯＲＦ配列を含む）のクローニングに有用である。
そのような構築物の完全な３５Ｓプロモーター−遺伝子配列−ｔｍｌターミネー
ターカセットを、プロモーターの５’側のＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、ＳａｌＩ
、およびＸｂａＩ部位で、ターミネーターの３’側のＸｂａＩ、ＢａｍＨＩおよ
びＢｇｌＩ部位で、形質転換ベクターへ送達するため切除することができる。さ
らにダブル３５Ｓプロモーター断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、ＳａｌＩ、
ＸｂａＩまたはＰｓｔＩでの５’切除、および任意のポリリンカー制限部位（Ｅ
ｃｏＲＩ、ＮｏｔＩまたはＸｈｏＩ）での３’切除によって、他のプロモーター
と置き換えるために除去することができる。したがって、本発明のＤＮＡ分子を、ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸに、ＣａＭＶ
３５Ｓプロモーターの制御の下での構成的発現のために挿入することができる。

【００６２】化学的に調節可能なプロモーターの下での発現この節はｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸにおけるダブル３５Ｓプロモーターを任意の
選択されたプロモーターで置換えることについて記載する。例証として化学的に
調節されるＰＲ−１ａプロモーターを記載する。選択されたプロモーターを好ま
しくはそのソースから制限酵素によって切除するが、あるいは適当な末端制限部
位を有するプライマーを使用してＰＣＲ−増幅することができる。もしＰＣＲ−
増幅を実施するならば、プロモーターは標的ベクター中の増幅されたプロモータ
ーのクローニングの後、増幅エラーを確認するために再配列決定するべきである
。化学的に調節可能なタバコＰＲ−１ａプロモーターをプラスミドｐＣＩＢ１０
０４（ＥＰ０３３２１０４参照）から切断し、プラスミドｐＣＧＮ１７６１ＥＮ
Ｘに送達する。ｐＣＩＢ１００４をＮｃｏＩで切断し、得られた線状断片の３’
オーバーハングをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理することによって平滑末端化
する。次に、その断片をＨｉｎｄＩＩＩによって切断し、得られたＰＲ−１ａプ
ロモーターを含む断片をゲル精製し、ダブル３５Ｓプロモーターを除去されたｐ
ＣＧＮ１７６１ＥＮＸにクローニングする。これを、ＸｈｏＩで切断し、Ｔ４ポ
リメラーゼで平滑末端化し、続いてＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＣＩＢ１００４
プロモーター断片がクローニングされるべきより大きなベクターターミネーター
を含む断片を単離することによって実施する。これにより、ＰＲ−１ａプロモー
ターおよびｔｍｌターミネーター、並びに特有のＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ部位
を有する介在しているポリリンカーを有するｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸ誘導体を作
成する。本発明のＤＮＡ分子をこのベクターに挿入し、融合産物（すなわちプロモータ
ー−遺伝子−ターミネーター）をその後、本出願に記載されたものを含む任意の
選択された形質転換ベクターに送達する。そしてそのＤＮＡ分子の化学的に誘導
可能発現を実現する。

【００６３】構成的発現:アクチンプロモーターアクチンのいくつかのイソフォームは、ほとんどの細胞型中で発現され、結果
的に、構成的プロモーターとしてアクチンプロモーターを選択するのがよいと知
られている。特にイネＡｃｔ１遺伝子からのプロモーターはクローニングされ、
特性が把握されている(McElroy et al.Plant Cell 2:163-171(1990))。そのプロ
モーターの１．３ｋｂの断片は、イネプロトプラスト中の発現に要求されるすべ
ての調節エレメントを含んでいることが発見されている。さらにＡｃｔ１プロモ
ーターに基づく多くの発現ベクターが、特に単子葉植物における使用のために構
築されてきた(McElroy et al.Mol.Gen.Genet.231:150-160(1991))。これらはＡ
ｃｔ−イントロン１、Ａｄｈ１５’フランキング配列、およびＡｄｈ１−イン
トロン１（トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子から）およびＣａＭ
Ｖ３５Ｓプロモーターからの配列を含む。最高の発現を示すベクターは、３５
ＳおよびＡｃｔ１イントロンまたはＡｃｔ１５’フランキング配列およびＡｃ
ｔ１イントロンの融合物である。McElroy et al.(Mol.Gen.Genet.231:150-160(1
991))によって記載されたプロモーター発現カセットを、本発明のＤＮＡ分子の
発現のために容易に修飾することができ、単子葉植物宿主における使用に特に好
適である。例えばプロモーターを含む断片をＭｃＥｌｒｏｙの構築物から取り外
して使用し、ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸにおけるダブル３５Ｓプロモーターを置き
換えることができ、それは挿入または特定の遺伝子配列のために利用可能である
。こうして構築した融合遺伝子を、その後適当な形質転換ベクターに送達するこ
とができる。別の報告では、第１のイントロンを有するイネＡｃｔ１プロモータ
ーが培養オオムギ細胞中で高度の発現をディレクトすることも発見された(Chibb
ar et al.Plant Cell Rep.12:506-509(1993))。本発明のＤＮＡ分子をそのようなプロモーターの下流に挿入し、続いて、融合
産物(すなわちプロモーター-遺伝子−ターミネーター)を任意の選択された、本
明細書に記載されているものを含む、形質転換ベクターに送達する。

【００６４】構成的発現:ユビキチンプロモーターユビキチンは多くの細胞型中に蓄積すると知られているもう一つの遺伝子産物
であり、そのプロモーターはいくつかの種からトランスジェニック植物における
使用のためにクローニングされてきた(例えばヒマワリ−Binet et al.Plant Sci
ence 79:87-94(1991)、トウモロコシ−Christensen et al.Plant Molec.Biol.12
:619-632(1989))。トウモロコシユビキチンプロモーターはトランスジェニック
単子葉系で開発されており、その配列および単子葉植物の形質転換のために構築
されたベクターは特許出願ＥＰ０３４２９２６に公開された。さらに、Taylor e
t al.(Plant Cell Rep.12:491-495(1993))はトウモロコシユビキチンプロモータ
ーおよび第１のイントロンを含むベクター（ｐＡＨＣ２５）、およびマイクロプ
ロジェクタイルボンバードにより導入されたときの多くの単子葉植物の細胞懸濁
物中でのその高い活性について記載している。そのユビキチンプロモーターはト
ランスジェニック植物、特に単子葉植物中でのＤＮＡ分子の発現に特に好適であ
る。適当なベクターは、適当なユビキチンプロモーターおよび／またはイントロ
ン配列の導入によって修飾された、ｐＡＨＣ２５の誘導体または本明細書中に記
載された任意の形質転換ベクターである。したがって、本発明のＤＮＡ分子を任意のこれらのベクターに挿入し、融合産
物（すなわちプロモーター−遺伝子−ターミネーター）を植物の形質転換に使用
して、ＤＮＡ分子を構成的に発現させる。

【００６５】根特異的発現本発明のＤＮＡ分子に好ましい発現のパターンは根での発現である。根組織の
みでのヌクレオチド配列の発現は、葉および花組織並びに種子での発現を変化さ
せることなく、根のみで標的遺伝子の発現を変化させる利点がある。適当な根プ
ロモーターは、de Framond(FEBS 290:103-106(1991))によって、また公開された
特許出願ＥＰ０４５２２６９において記載されたようなものである。このプロモ
ーターをｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸのような適当なベクターに送達し、ＤＮＡ分子
をそのようなベクターに挿入する。その完全なプロモーター−遺伝子−ターミネ
ーターカセットをその後、所望の形質転換ベクターへ送達する。

【００６６】傷誘導可能プロモーター多くのそのようなプロモーターが記載され(例えばXu et al.Plant Molec.Biol
.22:573-588(1993)、Logemann et al.Plant Cell 1:151-158(1989)。Rohrmeier&
Lehle,Plant Molec.Biol.22:783-792(1993)、Firek et al.Plant Molec.Biol.22
:129-142(1993)、Warner et al.Plant J.3:191-201(1993))、すべて本発明での
使用に好適である。Logemann et al.(前掲)は双子葉植物ジャガイモｗｕｎ１遺
伝子の５’上流配列を記載している。Xu et al.(前掲)は双子葉植物ジャガイモ
（ｐｉｎ２）からの傷誘導可能プロモーターは単子葉植物イネでも活性があるこ
とを記載している。さらにRohrmeier&Lehle(前掲)は傷に誘導され、標準的な技
術を使用してコグネイトプロモーターを単離するのに使用可能であるトウモロコ
シWip1 cＤＮＡのクローニングを記載している。同様にFirek et al.(前掲)およ
びWarner(前掲)は、局部的傷および病原体侵入部位で発現される、単子葉植物As
paragus officinalisからの傷誘導可能遺伝子を記載している。当技術分野で周
知のクローニング技術を使用して、これらのプロモーターを適当なベクターに送
達し、本発明のＤＮＡ分子と融合し、これらの遺伝子を害虫感染の部位で発現さ
せるために使用することができる。

【００６７】髄における好ましい発現特許出願ＷＯ９３／０７２７８は、髄細胞で選択的に発現されているトウモロ
コシｔｒｐＡ遺伝子の単離を記載している。標準的な分子生物学的な技術を使用
して、このプロモーターまたはその一部を、ｐＣＧＮ１７６１のようなベクター
に送達することができ、３５Ｓプロモーターを置き換え、髄に好ましいように本
発明のＤＮＡ分子の発現を駆動するために使用することができる。実際、髄に好
ましいプロモーターまたはその一部を含む断片を任意のベクターに送達し、トラ
ンスジェニック植物における便宜のために修飾する。ＤＮＡ分子の髄に好ましい
発現を、そのようなベクター中のＤＮＡ分子に挿入することによって達成する。

【００６８】花粉特異的発現特許出願ＷＯ９３／９７２７８は、花粉細胞で発現されているトウモロコシカ
ルシウム依存性タンパク質キナーゼ（ＣＤＰＫ）遺伝子の単離をさらに記載して
いる。その遺伝子配列およびプロモーターは転写開始から１４００ｂｐにわたる
。標準的な分子生物学的技術を使用して、プロモーターまたはその一部を、ｐＣ
ＧＮ１７６１のようなベクターに送達し、３５Ｓプロモーターを置き換え、花粉
特異的な方法で本発明のＤＮＡ分子の発現を駆動するために使用する。実際、花
粉特異的プロモーターまたはその一部を含む断片を任意のベクターに送達し、ト
ランスジェニック植物における便宜のために修飾することができる。葉特異的発現ホスホエノールカルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）をコードしているトウモロコシ
遺伝子が、Hudspeth&Grula(Plant Molec Biol 12:579-589(1989))によって記載
された。標準的な分子生物学的な技術を使用して、この遺伝子のためのプロモー
ターを使用し、トランスジェニック植物における葉特異的方法で、本発明のＤＮ
Ａ分子の発現を駆動する。

【００６９】実施例６：植物形質転換ベクターの構築多くの形質転換ベクターが植物形質転換に利用可能であり、本発明のＤＮＡ分
子を前述の任意の発現カセットに挿入し、適当な条件の下で望まれる細胞中でＤ
ＮＡ分子を発現させることができる。ヌクレオチド配列を含む発現カセットを、
任意の後記の適当な形質転換ベクターに組み込む。使用のためのベクターの選択
は、好ましい形質転換技術および形質転換のための標的種による。ある標的種で
は、種々の抗生物質または除草剤選択マーカーが好ましい。形質転換にルーチン
的に使用される選択マーカーは、カナマイシンおよび関連する抗生物質に対する
抵抗性を付与するｎｐｔＩＩ遺伝子(Messing & Vieria, Gene 19:259-268(1982)
;Bevan et al.,Nature 304:183-187(1983))、除草剤ホスヒノトリシンに対する
抵抗性を付与するｂａｒ遺伝子(White et al.,Nucl Acids Res 18:1062(1990)、
Spencer et al.Theor Appl Genet 79:625-631(1990))、抗生物質ハイグロマイシ
ンに対する抵抗性を付与するｈｐｈ遺伝子(Blochiger&Diggelmann,Mol Cell Bio
l 4:2929-2931)、およびメタトレキセート(methatrexate)に対する抵抗性を付与
するｄｈｆｒ遺伝子(Bourouis and Jarry.,EMBO J.2(7):1099-1104(1983))を含
む。

【００７０】アグロバクテリウム形質転換に好適なベクターアグロバクテリウムツメファシエンスを使用する形質転換に多くベクターが利
用可能である。典型的にはこれらは少なくとも１個のＴ−ＤＮＡボーダー配列を
有し、ｐＢＩＮ１９(Bevan,Nucl.Acids Res.(1984))およびｐＶｉｃｔｏｒＨ
ＩＮＫ（配列番号５）のようなベクターを含む。以下に２種の典型的なベクター
の構築を記載する。ｐＣＩＢ２００およびｐＣＩＢ２００１の構築バイナリーベクターｐＣＩＢ２００およびｐＣＩＢ２００１をアグロバクテリ
ウムでの使用のための組換えベクターの構築に使用し、以下のような方法で構築
する。ｐＴＪＳ７５ｋａｎを、ｐＴＪＳ７５(Schmidhauser&Helinski,J Bacteri
ol.164:446-455(1985))をＮａｒＩによって消化し、テトラサイクリン抵抗性遺
伝子を切除し、続いてＮＰＴＩＩを有するｐＵＣ４ＫからのＡｃｃＩ断片を挿入
して作成する(Messing & Vieira, Gene 19:259-268(1982);Bevan et al.,Nature
304:184-187(1983);McBride et al.,Plant Molecular Biology 14:266-276(199
0))。ＸｈｏＩリンカーを、レフトおよびライトT-ＤＮＡボーダー、植物選択可
能ｎｏｓ／ｎｐｔＩＩキメラ遺伝子およびｐＵＣポリリンカーを含むｐＣＩＢ７
(Rothstein et al.,Gene 53:153-161(1987))のＥｃｏＲＶ断片にライゲートし、
ＸｈｏＩ−消化された断片をＳａｌＩ−消化されたｐＴＪＳ７５ｋａｎにクロー
ニングし、ｐＣＩＢ２００を作成する（ＥＰ０３３２１０４参照）。ｐＣＩＢ２
００は以下の特有なポリリンカー制限部位：ＥｃｏＲＩ、ＳｓｔＩ、ＫｐｎＩ、
ＢｇｌＩＩ、ＸｂａＩ、およびＳａｌＩを含む。ｐＣＩＢ２００１はさらなる制
限部位のポリリンカーへの挿入により作成されたｐＣＩＢ２００の誘導体である
。ｐＣＩＢ２００１のポリリンカーにおける特有の制限部位は、ＥｃｏＲＩ、Ｓ
ｓｔＩ、ＫｐｎＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、ＭｌｕＩ、ＢｃＩＩ、Ａ
ｖｒＩＩ、ＡｐａＩ、ＨｐａＩ、およびＳｔｕＩである。ｐＣＩＢ２００１は、
これらの特有の制限部位を含むことに加えて、植物およびバクテリアのカナマイ
シン選択、アグロバクテリウム−仲介形質転換のためのレフトおよびライトＴ−
ＤＮＡボーダー、ＲＫ２由来のＥ．ｃｏｌｉおよび他の宿主間の移動のためのｔ
ｒｆＡ機能、並びにＲＫ２からのＯｒｉＴおよびＯｒｉＶ機能を有する。ｐＣＩ
Ｂ２００１ポリリンカーはこれらの自身の調節シグナルを含む植物発現カセット
のクローニングに適当である。本発明のＤＮＡ分子を含む前記した植物発現カセ
ットのいずれかを、ｐＣＩＢ２００１に好ましくはポリリンカーを使用して挿入
する。

【００７１】ｐＣＩＢ１０の構築およびその誘導体のハイグロマイシン選択バイナリベクターｐＣＩＢ１０は、植物での選択のためのカナマイシン抵抗性
をコードしている遺伝子、Ｔ−ＤＮＡライトおよびレフトボーダー配列を含んで
おり、広宿主−範囲プラスミドｐＲＫ２５２からの配列を組み入れており、Ｅ．
ｃｏｌｉおよびアグロバクテリウム双方で複製することが可能である。その構築
はRothstein et al.(Gene53:153-161(1987))によって記載されている。Gritz et
al.(Gene25:179-188(1983))によって記載されたハイグロマイシンＢホスホトラ
ンスフェラーゼの遺伝子を組み入れている種々のｐＣＩＢ１０の誘導体が構築さ
れてきた。これらの誘導体によってハイグロマイシンのみ（ｐＣＩＢ７４３）、
またはハイグロマイシンおよびカナマイシン（ｐＣＩＢ７１５、ｐＣＩＢ７１７
）によるトランスジェニック植物細胞の選択が可能となる。このベクターを使用
して本発明のＤＮＡ分子を含む発現カセットを形質転換する。

【００７２】非アグロバクテリウム形質転換に適当なベクターアグロバクテリウムツメファシエンスを使用しない形質転換によって、選択さ
れた形質転換ベクターにおけるＴ−ＤＮＡ配列の必要性が回避され、結果的にこ
れらの配列を欠いたベクターを、Ｔ−ＤＮＡ配列を含む前述のもののようなベク
ターに加えて利用することができる。アグロバクテリウムによらない形質転換技
術は、パーティクルボンバードメント、プロトプラスト取り込み（例えばＰＥＧ
およびエレクトロポレーション）、マイクロインジェクションまたは花粉形質転
換（米国特許５６２９１８３）による形質転換を含む。ベクターの選択について
は、多くは形質転換される種にとって好ましいように選択する。以下にある典型
的なベクターの構築を記載する。

【００７３】ｐＣＩＢ３０６４の構築ｐＣＩＢ３０６４は、除草剤バスタ（またはホスヒノトリシン）による選択と
組み合わされた直接的遺伝子導入法に適当なｐＵＣ−由来ベクターである。プラ
スミドｐＣＩＢ２４６はＥ．ｃｏｌｉＧＵＳ遺伝子に実施可能なように融合し
たＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＣａＭＶ３５Ｓ転写ターミネーターを
含み、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９３／０７２７８に記載されている。このベク
ターの３５Ｓプロモーターは、開始部位の５’位に２個のＡＴＧ配列を含む。こ
れらの部位を、標準的ＰＣＲ法を使用して変異させ、ＡＴＧを除去し、制限部位
ＳｓｐＩおよびＰｖｕＩＩを作成する。新しい制限部位は特有のＳａｌＩ部位か
ら９６および３７ｂｐ離れており、真の開始部位から１０１および４２ｂｐ離れ
ている。得られたｐＣＩＢ２４６の誘導体をｐＣＩＢ３０２５と命名する。そし
てｐＣＩＢ３０２５からＳａｌＩおよびＳａｃＩでの消化によってＧＵＳ遺伝子
を切除し、平滑末端化してライゲートし、プラスミドｐＣＩＢ３０６０を作成す
る。プラスミドｐＪＩＴ８２をJohn Innes Centre,Norwichより入手し、Strepto
myces viridochromogenesからのｂａｒ遺伝子を含む４００ｂｐのＳｍａＩ断片
を切除し、ｐＣＩＢ３０６０(Thompson et al.EMBO J 6:2519-2523(1987))のＨ
ｐａＩ部位に挿入する。この作成したｐＣＩＢ３０６４は、ＣａＭＶ３５Ｓプ
ロモーターおよびターミネーターの制御の下での除草剤選択のためのｂａｒ遺伝
子、アンピシリン抵抗性の遺伝子(E.coliにおける選択のため)および特有の部位
ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＢａｍＨＩを有するポリリンカー
を含む。このベクターは本発明のＤＮＡ分子の発現をディレクトするそれ自身の
調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングに適当である。

【００７４】ｐＳＯＧ１９およびｐＳＯＧ３５の構築ｐＳＯＧ３５は、メトトレキセートに対する抵抗性を付与する選択マーカーと
してE.coli遺伝子ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＥＲ）を利用する形質転換ベ
クターである。ＰＣＲを使用して、３５Ｓプロモーター（〜８００ｂｐ）、トウ
モロコシＡｄｈ遺伝子からのイントロン６（〜５５０ｂｐ）およびｐＳＯＧ１０
からの１８ｂｐのＧＵＳ非翻訳リーダー配列を増幅する。E.coliジヒドロ葉酸レ
ダクターゼタイプＩＩ遺伝子をコードしている２５０ｂｐの断片をＰＣＲによっ
て増幅し、これらの２種のＰＣＲ断片を、ｐＵＣ１９ベクターバックボーンおよ
びノパリンシンターゼターミネーターを含むｐＢＩ２２１(Clontech)からのＳａ
ｃＩ-ＰｓｔＩ断片と構築する。これらの断片の構築によって、イントロン6配列
、ＧＵＳリーダー、ＤＨＦＲ遺伝子およびノパリンシンターゼターミネーターと
融合された３５Ｓプロモーターを含むｐＳＯＧ１９を作成する。ｐＳＯＧ１９の
ＧＵＳリーダーを、トウモロコシ退録斑紋ウイルス（ＭＣＭＶ）からのリーダー
配列と置換してベクターｐＳＯＧ３５を作成する。ｐＳＯＧ１９およびｐＳＯＧ
３５はアンピシリン抵抗性のｐＵＣ遺伝子を有しており、外来配列、特に本発明
のＤＮＡ分子のクローニングに利用可能なＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ
およびＥｃｏＲＩ部位を有する。

【００７５】実施例７：葉緑体形質転換形質転換ベクター本発明のＤＮＡ分子の植物色素体での発現のために、色素体形質転換ベクター
ｐＰＨ１４３（ＷＯ９７／３２０１１、実施例３６）を使用する。ＤＮＡ分子を
、ｐＰＨ１４３に挿入し、それによってＰＲＯＴＯＸコード配列を置換する。次
にこのベクターを色素体形質転換およびスペクチノマイシン抵抗性についての形
質転換体の選択のために使用する。あるいは、ＤＮＡ分子をｐＰＨ１４３に挿入
し、ａａｄＨ遺伝子を置換する。この場合、形質転換体を、ＰＲＯＴＯＸ阻害剤
に対する抵抗性について選択する。葉緑体形質転換タバコNicotiana tawbacum c.v.「Xanthi nc」の種子をプレート当たり７粒、
1''の環状に並べてＴアガー培地上に発芽させる。播種１２−１４日後に、詳細
に記載されたプラスミドｐＰＨ１４３およびｐＰＨ１４５(Svab, Z. and Maliga
, P.(1993)PNAS 90, 913-917)からのＤＮＡでコートした１μｍタングステン粒
子(M10, Biorad, Hercules, CA)でボンバードする。ボンバードした苗を、Ｔ培
地上で２日インキュベートし、その後葉を切除し、背軸側を上にして明光（３５
０−５００μｍｏｌ光量子／ｍ^２／ｓ）中で、５００μｇ／ｍｌスペクチノマイ
シンジヒドロクロリド(Sigma, St. Louis,MO)を含むＰＭＯＰ培地(Svab, Z., Ha
jdukiewicz, P. and Maliga, P.(1990)PNAS 87, 8526-8530)のプレート上に置く
。ボンバードメントの３ないし８週間後に下方に白化した葉を示す抵抗性シュー
トを、同じ選択培地上にサブクローニングしカルスを形成させ、二次的シュート
を単離しサブクローニングする。独立したサブクローンにおける形質転換した色
素体ゲノムコピーの完全な分離（ホモプラスミシティ）を、サザンブロッティン
グの標準的な方法によって評価した(Sambrook et al.,(1989)Molecular Cloning
: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor)
。ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化した総細胞ＤＮＡ(Mettler, I. J. (1987)Plant
Mol Biol Reporter 5, 346-349)を、１％トリスボレート(ＴＢＥ)アガロースゲ
ル上で分離し、ナイロン膜(Amersham)に移し、ｒｐｓ７／１２色素体ターゲッテ
ィング配列の一部を含むｐＣ８からの０．７ｋｂＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ
ＤＮＡ断片に対応する、^３２Ｐ標識したランダムプライマーＤＮＡ配列で探索
した。ホモプラスミックなシュートをスペクチノマイシン含有ＭＳ／ＩＢＡ培地
(McBride, K. E. et al.(1994)PNAS 91, 7301-7305)上で無菌的に発根させ、グ
リーンハウスに移す。

【００７６】実施例８：ＰｏｌＣプロモーターによって駆動されるＢＷＹＶからのコートタン
パク質遺伝子についてのセンスおよびアンチセンスデュプレックスＲＮＡ断片を
コードするキメラ遺伝子カセットの構築ビート西部萎黄病ウイルス(ＢＷＹＶ)（いわゆるウイルスイエロー)コートタ
ンパク質（ＣＰ）遺伝子の０．６Ｋｂの「センス」配向断片をプライマーＨｉＮＫ
０２５ｂｉｓ（５’−ＣＡＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＧＧＴＣ
ＧＴＧＧ−３’、配列番号６；ＮｃｏＩ制限部位に下線を付す）およびＨｉＮ
Ｋ２２６（５’−ＧＣＣＡＡＡＴＧＴＴＴＧＡＡＣＧＣＴＧＣＡＧＣＣＴＡＴＴＴＧ−３’、配列番号７；ＰｓｔＩ制限部位に下線を付す）
を使用してプラスミドｐＺＵ０４６から増幅する。あるいは、断片をプラスミド
ｐＢＷ１７(Veidt et al, Nucleic Acids Research 16: 9917-9932, 1988; acce
ssion number X13063)から、プライマーＨｉＮＫ０２５ｂｉｓ２（５’− ＡＡ
ＴＣＧＴＣＣＡＴＧＧＡＴＡＣＧＧＴＣＧＴＧＧ−３’、配列番
号８；ヌクレオチド３４７５ないし３４９８、ＮｃｏＩ制限部位に下線を付す）
およびＨｉＮＫ２２６ｂｉｓ（５’−ＣＴＡＧＧＧＣＣＧＧＧＴＴＣＣ
ＴＣＴＧＣＡＧＣＣＴＡＴＴＴＧ−３’配列番号９、ヌクレオチド４
１１４ないし４０８５、ＰｓｔＩ制限部位に下線を付す）を使用して増幅する。
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Life Technologies)を、製造者の規定にしたがって
２５μｌ反応中で使用し、３０サイクルの９４℃／３０秒、５５℃／３０秒、７
２℃／９０秒（＋２秒／サイクル）を適用する。得られたＰＣＲ断片を、Seakem
GTG アガロース(FMC)から作成した１％トリスアセテートゲルでの電気泳動、続
いてＰＣＲ産物を含むゲルスライスからＱＩＡｑｕｉｃｋゲルエキストラクショ
ンキット(QIAGEN)での抽出によって精製する。その後、標準的方法にしたがって
ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩ（すべての制限酵素は、Life Technologiesから入手）
で消化し、再びゲル精製した。精製した断片を、ＲｏｌＣプロモーターおよびＮ
ｏｓターミネーターの間にＴ４ＤＮＡリガーゼ(Life Technologies)を使用し
てライゲートする。得られたクローンをｐＨｉＮＫ１３８と命名する。

【００７７】前記と同様な方法で、１．４Ｋｂ「アンチセンス」配向ＢＷＹＶＣＰ断片を
、プラスミドｐＺＵ１７４ＡからプライマーＨｉＮＫ２５１（５’― ＣＴＣ
ＣＣＡＧＧＴＴＧＡＧＡＣＴＧＣＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＣ
Ａ―３’、配列番号１０；ＰｓｔＩ制限部位に下線を付す）およびＨｉＮＫ２２
８（５’―ＴＴＡＣＣＡＴＧＣＡＴＡＣＧＧＴＣＧＴＧＧＧＴＡ
ＧＧ―３’、配列番号１１；ＮｓｉＩ制限部位に下線を付する）を使用して、
あるいは、プラスミドｐＢＷ１７からプライマーＨｉＮＫ２５１（ヌクレオチド
４８４４ないし４８１４）およびＨｉＮＫ２２８ｂｉｓ（５’−ＣＧＴＴＡＡＴＧＣＡＴＡＣＧＧＴＣＧＴＧＧＧＴＡＧＧ−３’、配列番号１
２；ヌクレオチド３４７８ないし３５０３、ＮｓｉＩ制限部位に下線を付す）を
使用して増幅する。ゲル精製して、ＰＣＲ産物をＮｓｉＩおよびＰｓｔＩで消化
する。４．９ＫｂプラスミドｐＨｉＮＫ１３８をＰｓｔＩで線形化し、熱感受
性アルカリフォスファターゼ(Life Technologies)を使用して脱リン酸化する。
ベクターおよびＰＣＲ断片をゲル精製し、続いてｐＨｉＮＫ１３８にＰＣＲ断片
を双方向ライゲーションする。ＣＰ遺伝子（配列番号１３）についてのデュプレ
ックスＲＮＡを生ずる配向を制限部位分析によって決定し、それは、逆方向の繰
り返しがＣＰ遺伝子の下流のＢＷＹＶゲノムに由来する０．７Ｋｂスペーサー配
列（ＯＲＦ６という）によって分離されている０．６ＫｂＣＰ遺伝子からなる
ｐＨｉＮＫ１５２を生じた。スペーサー配列はアンチセンス配向である。最終的
に、当該遺伝子カセットを、選択マーカー遺伝子としてホスホマンノースイソメ
ラーゼを有する特許のバイナリーベクターｐＶｉｃｔｏｒＨｉＮＫ(WO 94/20627
)に送達し、ｐＨｉＮＫ１７９を得る。

【００７８】実施例９．１：アラビドプシスＵｂｉ３ｉｎｔプロモーターによって駆動される
、ＢＮＹＶＶからのレプリカーゼ遺伝子についてのセンスおよびアンチセンス（
デュプレックス）ＲＮＡ断片をコードするキメラ遺伝子カセットの構築総ＲＮＡをビートえそ性葉脈黄化ウイルス（ＢＮＹＶＶ）フロウイルスに感染
したシュガービート根から、QIAGENのRNAeasy Plantミニキットを使用して抽出
する。ＢＮＹＶＶレプリカーゼ遺伝子（ＲＮＡ１）の３’末端を増幅するために
、ＲＮＡを、Superscript（商標）II RNAse H-Reverse Transcriptase(RT)(Life
Technologies)および逆プライマーＨｉＮＫ２８５（５’−ＴＣＧＴＡＧＡ
ＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＣＣＣＡＡＡＣＴＡＴＣＣ−３’、配列
番号１４）を使用して逆転写し、ｃＤＮＡを生成する。プライマーＨｉＮＫ２８
５は、ＢＮＹＶＶＲＮＡ１配列(accession number D00115)のヌクレオチド６
３７８および６４０５の間に位置し、ＥｃｏＲＩ部位を導入するよう設計されて
いる。次に、ＲＴ反応を使用して２種類のＰＣＲ反応のためのテンプレートとし
て使用する：ＢａｍＨＩ部位を導入するよう設計されたＢＮＹＶＶＲＮＡ１のヌクレオチド
５１６８ｂｐおよび５１７８ｂｐの間に位置するプライマーＨｉＮＫ２８３（５
’―ＡＡＧＡＡＴＴＧＣＡＧＧＡＴＣＣＡＣＡＧＧＣＴＣＧＧ
ＴＡＣ―３’配列番号１５）、およびＥｃｏＲＩ部位を導入するよう設計され
たＢＮＹＶＶＲＮＡ１のヌクレオチド５５９７および５６２０の間に位置する
プライマーＨｉＮＫ２８４（５’−ＴＴＣＣＡＡＣＧＡＡＴＴＣＧＧ
ＴＣＴＣＡＧＡＣＡ―３’、配列番号１６）を使用する反応Ａ。プライマーＨｉＮＫ２８３をプライマーＨｉＮＫ２８５と組み合わせて使用する
反応Ｂ。両者は前記した。

【００７９】こうして得られたＲＴ−ＰＣＲ産物は、将来のＲＮＡデュプレックスを構成す
るヌクレオチド５１６８−５６２０の間にＢＮＹＶＶＲＮＡ１配列を有する。
将来のスペーサー配列は、プライマーＨｉＮＫ２８３およびＨｉＮＫ２８５で得
られるＲＴ−ＰＣＲ産物に存在するＢＮＹＶＶＲＮＡ１のヌクレオチド５６２
１−６４０５ｂｐに対応する。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Life Technologies)を製造者の規定にしたがって
２５μｌ反応中で使用し、９４℃／３０秒、５５℃／３０秒、７２℃／９０秒（
＋２秒／サイクル）の３０サイクルを適用する。得られたＲＴ−ＰＣＲ産物を、
Seakem GTG アガロース（ＦＭＣ）から作成した１％トリスアセテートゲルによ
る電気泳動、続いてQIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)による増幅産物を含
むゲルスライスの抽出によって精製する。ゲル精製の後、ＲＴ−ＰＣＲ産物を制
限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ(life Technologies)によって標準的方法に
したがって消化し、前記のように精製する。最終的に、ＲＴ−ＰＣＲ産物をアラビドプシスユビキチン３(Ubo3int)プロモ
ーターおよびＮｏｓターミネーターの間にＴ４ＤＮＡリガーゼ(Life Technolo
gies)を使用する３段階のライゲーション反応によってクローニングする。２種
類の得られたクローンを、ｐＨｉＮＫ１８１（アンチセンス配向のスペーサー、
配列番号１７参照）およｐＨｉＮＫ１８４（センス配向のスペーサー、配列番号
１８参照）と称する。

【００８０】シュガービートのアグロバクテリウム仲介形質転換のためのバイナリーベクタ
ーを構築するために、選択マーカーとしてホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子
を有するバイナリーベクターｐＶｉｃｔｏｒＨｉＮＫ(WO 94/20627)、並びにプ
ラスミドｐＨｉＮＫ１８１およびｐＨｉＮＫ１８４からのＤＮＡを、ＡｓｃＩお
よびＰａｃＩ(New England Biolabs)によって消化し、ベクターおよび挿入断片
を前記のように電気泳動で精製する。得られた７．７ｋｂｐＶｉｃｔｏｒＨｉ
ＮＫベクター断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Life Technologies)を使用して、
ＢＮＹＶＶレプリカーゼ遺伝子のデュプレックスＲＮＡをコードしている遺伝子
カセットにライゲートし、それぞれｐＨｉＮＫ１８７（アンチセンススペーサー
）およびｐＨｉＮＫ１８８（センススペーサー）を得る。

【００８１】実施例９．２：シュガービートのアグロバクテリウム仲介形質転換植物種のアグロバクテリウム仲介形質転換法はよく確立され当業者に既知であ
り、外植体型、アグロバクテリウム株、または使用される選択マーカーおよび再
生系によって変化してもよい。ここで以下のプロトコールには、外植体のソース
として子葉、選択マーカー遺伝子としてマンノース−６−フォスフェートイソメ
ラーゼを使用するシュガービートのアグロバクテリウム仲介形質転換を記載する
(Joersbo et al, Molecular Breeding 4: 111-117, 1998)。表面殺菌したシュガ
ービート種子をウォーターアガー上に弱光下で約１２℃の温度で発芽させる。十
分に展開した子葉を、節領域のすぐ下方で横断的に切断することによって苗から
切除し、両方の子葉をやさしく引っ張り切裂く。子葉外植体を、２０ｇ／ｌスク
ロース、０．２５ｍｇ／ｌＢＡ、０．０５ｍｇ／ｌＮＡＡ、５００μＭア
セトシリンゴンを補足したＭＳ培地ｐＨ５．２に希釈した適当な形質転換ベクタ
ーを有するアグロバクテリウム株ＥＨＡ１０１の最適密度（ＯＤ６００）０．１
ないし０．３に希釈した懸濁液に子葉を浸すことによって接種する。インキュベ
ーションの5分後、外植体をアグロバクテリウム懸濁液から移動し、無菌濾紙に
浸し、接種懸濁液の接触を除去し、共培養プレート上に移す。共培養プレートは
、３０ｇ／ｌスクロース、２００μＭアセトシリンゴンを含み、４．７ｇ／
ｌアガロースで固めた１／１０ＭＳ培地ｐＨ５．７を含み、固めた培地の上に
１．５ｍｌＴＸＤ培地（ＰＧＯビタミン、０．００５ｍｇ／ｌカイネチン、
４ｍｇ／ｌＣＰＡ（ｐ−クロロフェノキシ酢酸）、３０ｇ／ｌスクロースで
補足したＭＳ塩、ｐＨ５．７）で湿らせた濾紙で覆ったペトリ皿からなる。外植
体を弱光下２１℃で４日間共培養し、次に２０ｇ／ｌスクロース、１．２５ｇ
／ｌマンノース、０．２５ｍｇ／ｌＢＡ、０．０５ｍｇ／ｌＮＡＡ、５０
０ｍｇ／ｌカルベニシリンで補足し９ｇ／ｌアガーで固めたＭＳ培地ｐＨ５
．９からなる選択再生培地に移す。３週間ごとに、外植体を次第にマンノースの
濃度を最大１５ｇ／ｌまで増加させる新しい培地に継代培養する。２１℃の１２
週間の選択および再生の後、再生したシュートを収穫し、発根させ、Feramisco
and co-workers(Feramisco et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. 55: 636-641
. 1973)に記載された共役酵素反応に本質的にしたがってＰＭＩ活性を分析する
。陽性の植物を土でポット植えして、最終的にグリーンハウスに移す。

【００８２】実施例９．３：rhizomaniaに対する抵抗性のスクリーニング土に播種またはポット植えして、苗またはＴ０形質転換体を、ＢＮＹＶＶを有
するPolymyxa betaeが蔓延している土壌に移植する前に、最初に約４週間の期間
、根系を十分に発達させる。蔓延した土壌をドイツのrhizomania汚染圃場から収
集する。抵抗性検定の間、植物を１２ｃｍポットで約２１℃、１６時間明期で成
長させる。蔓延した土壌への移植の４週間後、植物を土壌から抜き取り、根系の
底半分を固着した泥から水洗して除去する。０．５ｇの根組織の無作為サンプル
からの液汁を、Pollaehne pressの方法で収集し、２％ＰＶＰおよび０．２％
卵白アルブミンで補足したリン酸バッファー塩水ｐＨ７．２からなる１０ｍｌ
の抽出バッファーに添加する。サンプル中の存在ウイルスの量を、ＢＮＹＶＶの
ためのトリプル抗体サンドイッチ（ＴＡＳ）ＥＬＩＳＡ(Adgen Ltd, Scotland,
UKから入手可能、供給者の指示に本質的に従う）で決定する。標準曲線を各プレ
ートについて作成し、根サンプルのウイルス含量を測定した吸光値から算出する
。非形質転換感受性シュガービート植物を否定的なコントロールとして使用し、
自然のrhizomania抵抗性のためのＣ２８遺伝子を有する植物を肯定的なコントロ
ールとする。表１は、プラスミドｐHINK１８８で得られた形質転換事象の結果の
要約である。

【表１】

【表２】

【００８３】実施例１０：メロンにおけるズッキーニ黄化モザイクポティウイルス（ＺＹＭＶ
）およびパパイヤリングスポットポティウイルス（ＰＲＳＶ）抵抗性のための植
物形質転換ベクターの構築：ＮＯＳターミネーター(Beven, M., et al, 1983 Nucleic Acids Res. 11(2),
369-385)を２６０ｂｐＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｉｓｔＩ断片としてＨｉｎｄＩＩＩ
／ＰｓｔＩで消化してプラスミドｐＺＯ１５６０にクローニングする。ＰＺＯ１
５６０は、多数のクローニング部位より有用なものと置換されたｐＵＣ由来プラ
スミドである。ＮＯＳターミネーターの挿入の後、新しい構築物をｐＺＵ５５３
と命名する。１７２８ｂｐＵｂｉ３プロモーター／イントロン断片(Callis, J., et al,
(1995 Genetics 139(2), 921-939)をＢａｍＨＩで消化、次にＴ４ＤＮＡポリ
メラーゼ処理およびＫｐｎＩ消化によって単離する。この断片をｐＺＵ５５３に
クローニングし、ＳｍａＩで消化する。新しい構築物をｐＺＵ６１５と命名する
。

【００８４】ｐＺＵ６１５に挿入されるべきさらなるＤＮＡ断片を、ＰｆｘＤＮＡポリメ
ラーゼを使用するＰＣＲによって最初に増幅し、得られたＰＣＲ断片をpBluescr
ipt SK＋にクローニングする。５１３ｂｐアクチン２イントロンＬ（リーダー
イントロン）断片を増幅するために、２種のプライマーをAn et al, The Plant
Journal: 10: 107-121, 1996からの配列に基づいて設計する。５’プライマー（
ＺＵＰ１５６３：５’−ＧＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＧＣＣＣＧＣＧＧＣＣＧ
ＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＣＡＡＧＧ−３’、配列番号１９）は５’スプライシン
グ部位の上流に直接アニーリングし、ＢａｍＨＩ、ＮｈｅＩおよびＳａｃＩＩ制
限部位を増幅されるべきアクチン２イントロンＬ断片の５’末端に付加する。３
’プライマー（ＺＵＰ１５６４：５’―ＣＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＴＣＧＡＣＧＣ
ＣＡＴＴＴＴＴＴＡＴＧＡＧＣＴＧＣ―３’、配列番号２０）は３’スプライシ
ング部位の下流に直接アニーリングし、ＳａｌＩおよびＮｃｏＩ制限部位を増幅
されるべきアクチン２イントロンＬ断片の３’末端に付加する。ＰＣＲ断片をＺ
ＵＰ１５６３および１５６４によって増幅し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏ
ＲＶ部位にクローニングする。新しいプラスミドをｐＺＵ６１１と命名する。プ
ラスミドｐＺＵ６１５にＡｃｔ２イントロンＬを供給するために、４９９ｂｐ
ＢａｍＨ／ＮｃｏＩＡｃｔ２イントロンＬ断片をｐＺＵ６１１から単離し、Ｂ
ａｍＨＩおよびＮｃｏＩで消化したｐＺＵ６１５のＵｂｉ３プロモーター／イン
トロンの下流およびＮＯＳターミネーターの上流にクローニングする。新しい構
築物をｐＺＵ６１６と命名する。この断片の挿入は、同時に、次の３段階のクロ
ーニングのためのさらなる制限部位をカセットに提供する。

【００８５】非翻訳（ｎｔ）７３９ｂｐＰＲＳＶＣＰ断片(Shyi-Dong, Y., et al,(199
2).Journal of General Virology 73, 2531-2541)を増幅するために、二種のプ
ライマーをShyi-Dong Yehからのフランスの圃場の分離株の配列に基づいて設計
する。５’プライマー（ＺＵＰ１５６５：５’―ＣＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＡＴＣ
ＣＧＡＴＧＡＴＴＴＣＴＡＣＣＧＡＧＡＡＴＴＡＡＧＧＧ―３’、配列番号２１
）はＰＲＳＶＣＰの開始コドンの２８５ｂｐ下流にアニーリングし、非翻訳Ｐ
ＲＳＶＣＰ断片の５’末端にＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を付加する。
３’プライマー（ＺＵＰ１５６６：５’―ＧＧＧＣＧＣＴＡＧＣＣＴＡＡＴＧＣ
ＴＴＡＴＡＴＡＧＴＡＣＣ―３’、配列番号２２）は、ＰＲＳＶＣＰの停止コ
ドンの５５ｂｐ下流にアニーリングし、非翻訳ＰＲＳＶＣＰ断片の３’末端に
ＮｈｅＩ制限部位を付加する。増幅したＰＣＲ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
のＥｃｏＲＶ部位にクローニングし、新しいプラスミドをｐＺＵ６１２と命名す
る。

【００８６】７３５ｂｐ非翻訳ＺＹＭＶＣＰ断片(Gal-On, A., et al,(1990. Gene 87, 2
73-277)を増幅するために、２種のプライマーをGal-On, A.からのフランス圃場
分離株の配列に基づいて設計する。５’プライマー（ＺＵＰ１５６７：５’―Ｇ
ＧＧＣＧＣＴＡＧＣＣＴＴＧＣＴＧＧＡＧＴＡＴＡＡＧＣＣＧＧ―３’、配列番
号２３）はＺＹＭＶＣＰの開始コドンの２５３ｂｐ下流にアニーリングし、Ｚ
ＹＭＶＣＰ非翻訳断片の５’末端にＮｈｅＩ制限部位を含む。３’プライマー
（ＺＵＰ１５６８：５’―ＧＧＧＣＧＴＣＧＡＣＣＧＣＧＧＧＣＴＴＴＡＡＡＧ
ＧＴＧＧＧＡＧＧＣＣＣ―３’、配列番号２４）は、ＺＹＭＶＣＰ停止コドン
の８９ｂｐ下流にアニーリングし、非翻訳ＺＹＭＶＣＰ断片の３’末端にＳａ
ｃＩＩおよびＳａｌＩ制限部位を含む。増幅したＰＣＲ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔのＥｃｏＲＶ部位にクローニングする。新しいプラスミドをｐＺＵ６１３
と命名する。ＺＹＭＶＣＰ非翻訳断片を次に、ｐＺＵ６１６にＵｂｉ３プロモ
ーター／イントロンの下流でＡｃｔ２イントロンLの上流にクローニングする。
この目的のために、７１９ｂｐＮｈｅＩ／ＳａｃｌＩＺＹＭＶＣＰ非翻訳
断片をｐＺＵ６１３から単離し、ｐＺＵ６１６のＮｈｅＩおよびＳａｃｌＩ部位
にクローニングする。この構築物をｐＺＵ６１７と命名する。次に、ＰＲＳＶ
ＣＰ非翻訳断片をｐＺＵ６１７にＵｂｉ３プロモーター／イントロンの下流でＺ
ＹＭＶＣＰ非翻訳断片の上流にクローニングする。この目的のために７２０ｂ
ｐＢａｍＨＩ／ＮｈｅＩｐＲＳＶＣＰ非翻訳断片をｐＺＵ６１２から単離
し、ｐＺＵ６１７のＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩ部位にクローニングする。この新
しい構築物をｐＺＵ６１８と命名する。

【００８７】遺伝子カセットを完成するためにクローンニングすべき最後の断片は、ＰＲＳ
ＶＣＰ非翻訳断片および同じ配向でその下流にＺＹＭＶＣＰ非翻訳断片を含
む。対応する断片をテンプレートとしてｐＺＵ６１８からＰｆｘＰＣＲ並びに
プライマーＺＵＰ１５６５およびＺＵＰ１５６８を使用して増幅する。このＰＣ
Ｒ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋のＥｃｏＲＶ部位にクローニングし、
得られたプラスミドをｐＺＵ６１９と命名する。逆方向反復遺伝子カセットを構築するためにＰＲＳＶＣＰ（ｎｔ）／ＺＹＭ
ＶＣＰ（ｎｔ）断片を、ｐＺＵ６１８プラスミドにすでに存在するＰＲＳＶ
ＣＰ（ｎｔ）／ＺＹＭＶＣＰ（ｎｔ）断片と逆方向にｐＺＵ６１８に挿入する
。この目的のために１４４５ｂｐＳａｌＩ／ＮｃｏＩＰＲＳＶＣＰ（ｎｔ
）／ＺＹＭＶＣＰ（ｎｔ）断片をｐＺＵ６１９から単離し、ＳａｌＩおよびＮ
ｃｏＩで消化したｐＺＵ６１８にＡｃｔ２イントロンＬの下流でＮＯＳターミネ
ーターの上流にクローニングする。得られたプラスミドをｐＺＵ６２２と命名す
る。当該カセットをバイナリーベクターｐＺＵ５４７、ＳＭＡＳプロモーター／
ＰＭＩ／ＮＯＳターミネーター選択カセットをさらに含むプラスミドｐＶｉｃｔ
ｏｒＨｉｎｋに由来するバイナリーベクターに挿入する。この末端に逆方向反復
遺伝子カセットを含む５４１４ｂｐＡｓｃＩ／ＰａｃＩＤＮＡ断片をｐＺＵ
６２２から単離し、ｐＺＵ５４７のＡｓｃＩおよびＰａｃＩ部位にタンデム配向
で選択カセットの上流にクローニングする。最終的な構築物をｐＺＵ６２３（配
列番号２５）と命名する。

【００８８】実施例１１：トマトにおけるジャガイモＹウイルス（ＰＶＹ）のための植物形質
転換ベクターの構築 R.A.A. van der Vlugtの論文「Engineering resistance against potato viru
s Y」(1993)に公開されたＰＶＹｎ（ＰＶＹのフランス圃場分離株）の配列に基
づいて、２種のプライマー（ＺＵＰ１５９８：５’―ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＴ
ＣＣＡＡＴＧＧＣＣＡＣＧＡＡＴＴＡＡＡＧＣＴＡＴＣＡＣＧＴＣ―３’、配列
番号２６、およびＺＵＰ１５９０：５’― ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＧＣＧＧＡ
ＴＴＣＡＡＡＣＧＡＴＴＡＴＴＡＡＴＴＡＣＧＡＴＡＡＡＡＧ―３’、配列番号
２７）を使用して、標準的ＰＣＲによって、Life TechnologiesからのPlatinum
Pfx DNAポリメラーゼを使用して、コートタンパク質シストロン配列および９９
ヌクレオチドの３’末端非翻訳領域を含む８０４ｂｐ断片を増幅する。増幅した
ＰＣＲ断片を平滑末端断片としてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋のＥｃｏＲＶ
部位にクローニングし、ｐＺＵＡと命名する。増幅したＰＶＹ特異的挿入物をＢ
ａｍＨＩ／ＳａｃｌＩ断片として切除し、ｐＺＵ６１６のＢａｍＨＩ／Ｓａｃｌ
Ｉ部位にクローニングし（実施例１０参照）、ｐＺＵＢを得る。ＰＺＵＢおよび
ｐＺＵＣの両方をＮｃｏＩおよびＳａｌＩで消化する。ｐＺＵＡからのＰＶＹ特
異的断片をアガロースゲルから精製し、ＮｃｏＩおよびＳａｌＩで消化したｐＺ
ＵＢにライゲートし、以下のエレメントを含むｐＺＵＣを得る：イントロンを有するＵＢＩ３プロモーター、続いてＢａｍＨＩ／ＳａｃＩＩ断片
トしてのセンス配向のＰＶＹＰＣＲ産物、続いてＳａｃＩＩ／ＳａｌＩＡＣ
Ｔ２イントロン、続いてＳａＩＩ／ＮｃｏＩ断片としてのアンチセンス配向のＰ
ＶＹＰＣＲ産物、さらに最後にＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてのｎｏｓ
ターミネーター。最終的にｐＺＵＣを、ｐＨｉＮＫ０８５バイナリーベクター由
来のＳＭＡＳプロモーター／ＰＭＩ／ＮＯＳターミネーター選択カセットを含む
バイナリーベクターｐＺＵ５４７にクローニングする。最終的な構築物をｐＺＵ
６３４（配列番号２８）と命名する。

【００８９】実施例１２：メロンおよびトマト植物材料へのバイナリーベクターの形質転換植物材料へのバイナリーベクターの送達方法は確立され当業者に既知である。
その方法を、例えば、使用するアグロバクテリウム株の相違、外植体材料の起源
の相違、再生系の相違、および形質転換されるべき植物種の品種の相違によって
変える。前記実施例１０および１１のバイナリー植物形質転換ベクターを、後記
手段にしたがって形質転換実験に使用する。バイナリーベクターをエレクトロポ
レーションによってアグロバクテリウムツメファシエンスに送達し、続いて植物
外植体材料と形質転換したアグロバクテリウム株を接種、共培養し、適当な抗生
物質を使用してアグロバクテリウム株を選択的に殺し、マンノースを含む選択培
地上で成長させることによって形質転換した細胞を選択し、組織をシュート誘導
培地に移し、発根誘導培地に選択したシュートを移し、小植物体を土に移す。前
記実施例１０および１１の遺伝子カセットの存在を確認するために、トランスジ
ェニック植物からの全ＤＮＡを周知のサザンブロッティング分析法を使用して分
析する。

【００９０】実施例１３：ＺＹＭＶおよびＰＲＳＶ抵抗性についてのトランジェニックメロン
植物のスクリーニング病原体に感染しないように、形質転換した植物をグリーンハウスで標準的隔離
条件で成長させる。最初の形質転換体を自殖させ、種子を収穫する。最初の形質転換体のＳ１後代の１００植物を、挿入した遺伝子の分離について
分析し、次に機械的接種によってＺＹＭＶで感染させる。ＺＹＭＶで全体に感染
した宿主植物からの組織を、５体積の氷温接種バッファー（１０ｍＭリン酸バッ
ファー）中で磨砕し、カーボランダム粉末とともに１週齢の苗の子葉および第１
葉上にこすりつける。接種した植物を接種後３週間の間、症状の発生をモニター
する。ＺＹＭＶ配列を有する植物は、ＺＹＭＶ感染に対する感受性が減少し、こ
れに対して非形質転換コントロール植物は、接種後７日以内に重度の全身性ＺＹ
ＭＶ感染を示す。ＺＹＭＶ耐性植物を自殖し、種子を収穫する。トランスジェニ
ックＺＹＭＶ抵抗性植物を、前記の方法にしたがってＰＲＳＶで機械的に接種す
る。ＺＹＭＶにすでに抵抗性の植物は、ＰＲＳＶ感染に対しても感受性が減少し
ており、これに対して非形質転換コントロール植物は、接種後７日以内に重度の
全身性ＰＲＳＶ症状を示す。

【００９１】実施例１４：ＰＶＹに抵抗性のトランスジェニックトマト植物のスクリーニング形質転換した植物を、病原体の感染を防止するために、標準的隔離条件下でグ
リーンハウス内で成長させる。最初の形質転換体を自殖させ種子を収穫する。最初の形質転換体のＳ１後代の５０植物を、挿入した遺伝子の分離について分
析し、次に機械的接種によってＰＶＹで感染させる。ＰＶＹで全身的に感染した
宿主植物からの組織を、５体積の氷温接種バッファー（１０ｍＭリン酸バッファ
ー）中で磨砕し、カーボランダム粉末とともに５週齢の苗の最初の２枚の十分に
伸長した葉上にこすりつける。接種した植物を接種後３週間の間、症状の発生を
モニターする。ＰＶＹ配列を有する植物は、ＰＶＹ感染への感受性が減少し、こ
れに対して非形質転換コントロール植物は、接種後７日以内に重度の全身性ＰＶ
Ｙ症状を示す。前記の実施態様は例示である。本発明の記載は当業者に本発明の多くの変更を
有するものを提供する。自明で予測可能な変更は、すべて添付のクレームに包含
することを意図している。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者デイビッド・アンドリュー・パットンスイス4054バーゼル、タンナーシュトラーセ66番 (72)発明者ジョシュア・ズビ・レビンアメリカ合衆国27615ノースカロライナ州ローリー、ハンティング・リッジ・ロード 1001−ジー番 (72)発明者ケ・キウデンアメリカ合衆国27502ノースカロライナ州エイペックス、フォレスト・ブルック・ドライブ108番 (72)発明者ペトルス・テオドルス・デ・ハーンオランダ2343エルエル・ウーフストヘースト、ビンセント・ファン・ゴッホラーン46 番 (72)発明者ヨハネス・ヤコブス・ルドヘルス・ヒーレンフランス31140オーカンビル、アンパス・マネ６ア番Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD04 AD05 CA06 CA17 CA19 CB02 4B024 AA08 AA10 BA80 CA01 CA11 DA01 DA02 DA05 EA01 EA02 EA04 FA02 FA10 GA11 HA20 4B065 AA01X AA87X AA95Y AB01 BA01 CA53 CA60

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ウイルスゲノムの発現を変化させる方法であって、細胞に当
該細胞で当該ウイルスゲノムのセンスＲＮＡ断片を発現させることのできる第１
のＤＮＡ配列および当該細胞で当該ウイルスゲノムのアンチセンスＲＮＡ断片を
発現させることのできる第２のＤＮＡ配列を導入することを含む方法であって、
当該センスＲＮＡ断片および当該アンチセンスＲＮＡ断片が二本鎖ＲＮＡを形成
することのできる方法。
【請求項２】当該細胞をウイルス抵抗性または耐性にする請求項１の方法
。
【請求項３】細胞が植物細胞である請求項１の方法。
【請求項４】請求項１の方法であって、当該ウイルスがトスポウイルス、
ポティウイルス、ポテックスウイルス、トバモウイルス、ルテオウイルス、クク
モウイルス、ブロモウイルス、クロステオルウイルス、トムブスウイルスおよび
フロウイルスからなる群から選択される方法。
【請求項５】請求項１の方法であって、当該ＤＮＡ配列がウイルスコート
タンパク質遺伝子、ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質遺伝子、ウイルスレ
プリカーゼ遺伝子、またはウイルスムーブメントタンパク質遺伝子に由来するヌ
クレオチド配列を含む方法。
【請求項６】請求項１の方法であって、当該第１のＤＮＡ配列および当該
第２のＤＮＡ配列が当該細胞のゲノムに安定的に組みこまれている方法。
【請求項７】請求項１の方法であって、当該第１のＤＮＡ配列および当該
第２のＤＮＡ配列が２個の別々のＤＮＡ分子に含まれている方法。
【請求項８】請求項１の方法であって、少なくとも２対の第１および第２
のＤＮＡ配列が細胞に導入されている方法。
【請求項９】請求項８の方法であって、各対のＤＮＡ配列が、異なるウイ
ルス種または分離株のセンスおよびアンチセンスＲＮＡ断片をコードしている方
法。
【請求項１０】請求項１の方法であって、当該第１のＤＮＡ配列および当
該第２のＤＮＡ配列が１個のＤＮＡ分子に含まれている方法。
【請求項１１】請求項１０の方法であって、当該第１のＤＮＡ配列および
当該第２のＤＮＡ配列が当該ＤＮＡ分子の同じＤＮＡ鎖に含まれている方法。
【請求項１２】請求項１１の方法であって、当該センスＲＮＡ断片および
当該アンチセンスＲＮＡ断片が１個のＲＮＡ分子に含まれている方法。
【請求項１３】請求項１２の方法であって、当該ＲＮＡ分子がフォールデ
ィングし、そこに含まれる当該ＲＮＡ断片が二本鎖領域を形成することのできる
方法。
【請求項１４】請求項１の方法であって、発現されたＲＮＡ分子が、配列
番号１３、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５または配列番号２８の逆
方法反復配列を含む方法。
【請求項１５】請求項２４の方法であって、当該ＲＮＡ分子の発現が異種
性の、組織特異的な、発育段階によって調節される、構成的な、または誘導可能
なプロモーターによって駆動される方法。
【請求項１６】請求項１５の方法であって、当該ＲＮＡ分子の発現がアラ
ビドプシスＵｂｉ３プロモーターのようなユビキチンプロモーターによって駆動
される方法。
【請求項１７】請求項１５の方法であって、当該ＲＮＡ分子の発現がアグ
ロバクテリウムｒｏｌＣプロモーターによって駆動される方法。
【請求項１８】請求項１２の方法であって、当該ＤＮＡ分子が、当該セン
スＲＮＡ断片および当該アンチセンスＲＮＡ断片をコードしているＤＮＡ配列の
間のリンカーを含む方法。
【請求項１９】請求項１８の方法であって、当該リンカーがアラビドプシ
スアクチン２遺伝子のリーダーイントロンのヌクレオチド配列によって定義され
る方法。
【請求項２０】請求項１８の方法であって、当該リンカーが、該センスま
たはアンチセンスＲＮＡ断片にフランキングなウイルス領域のヌクレオチド配列
によって定義される方法。
【請求項２１】請求項１８の方法であって、当該リンカーが、選択マーカ
ー遺伝子のような機能性遺伝子の発現カセットを含む方法。
【請求項２２】請求項２１の方法であって、当該リンカーが、イントロン
プロセッシングシグナルのような調節配列を含む方法。
【請求項２３】請求項１１の方法であって、当該センスＲＮＡ断片および
当該アンチセンスＲＮＡ断片が２個の別々のＲＮＡ分子に含まれる方法。
【請求項２４】請求項２３の方法であって、当該第１のＤＮＡ配列および
当該第２のＤＮＡ配列が、双方向性プロモーターに実施可能なように連結されて
いる方法。
【請求項２５】請求項１１の方法であって、当該第１のＤＮＡ配列および
当該第２のＤＮＡ配列が、当該ＤＮＡ分子の相補鎖に含まれる方法。
【請求項２６】請求項２５の方法であって、当該第１のＤＮＡ配列が、当
該ＤＮＡ分子の当該第２のＤＮＡ配列の相補的ＤＮＡ鎖である方法。
【請求項２７】細胞でウイルスゲノムのセンスＲＮＡ断片を発現すること
のできる第１のＤＮＡ配列および当該細胞で当該ウイルスゲノムのアンチセンス
ＲＮＡ断片を発現することのできる第２のＤＮＡ配列を含む、ウイルスゲノムの
発現を変化させるＤＮＡ構築物であって、当該センスＲＮＡ断片および当該アン
チセンスＲＮＡ断片が二本鎖ＲＮＡ分子を形成することのできるＤＮＡ構築物。
【請求項２８】請求項２７のＤＮＡ構築物であって、当該ＤＮＡ構築物が
、当該第１のＤＮＡ配列に実施可能なように連結されている第１のプロモーター
および当該第２のＤＮＡ配列に実施可能なように連結されている第２のプロモー
ターを含むＤＮＡ構築物。
【請求項２９】請求項２７のＤＮＡ構築物であって、当該ＤＮＡ構築物が
、当該第１のＤＮＡ配列および当該第２のＤＮＡ配列に実施可能なように連結さ
れている双方向性プロモーターを含むＤＮＡ構築物。
【請求項３０】ウイルスゲノムの発現の変化を示す細胞であって、当該細
胞で当該ウイルスゲノムのセンスＲＮＡ断片を発現することのできる第１のＤＮ
Ａ配列および当該細胞で当該ウイルスゲノムのアンチセンスＲＮＡ断片を発現す
ることのできる第２のＤＮＡ配列を含む細胞であって、当該センスＲＮＡ断片お
よび当該アンチセンスＲＮＡ断片が二本鎖ＲＮＡを形成することのできる細胞。
【請求項３１】ウイルスゲノムの発現の変化を示す植物およびそれから誘
導された後代であって、細胞で当該ウイルスゲノムのセンスＲＮＡ断片を発現す
ることのできる第１のＤＮＡ配列および当該細胞で当該ウイルスゲノムのアンチ
センスＲＮＡ断片を発現することのできる第２のＤＮＡ配列を含む植物およびそ
れから誘導された後代であって、当該センスＲＮＡ断片および当該アンチセンス
ＲＮＡ断片が二本鎖ＲＮＡを形成することのできる植物およびそれから誘導され
た後代。
【請求項３２】請求項３１の植物であって、当該植物がウイルス抵抗性ま
たは耐性である植物。
【請求項３３】請求項３１の植物由来の種子。