JP2002543783A - ウイルス遺伝子発現の調節 - Google Patents
ウイルス遺伝子発現の調節Info
- Publication number
- JP2002543783A JP2002543783A JP2000616341A JP2000616341A JP2002543783A JP 2002543783 A JP2002543783 A JP 2002543783A JP 2000616341 A JP2000616341 A JP 2000616341A JP 2000616341 A JP2000616341 A JP 2000616341A JP 2002543783 A JP2002543783 A JP 2002543783A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- gene
- dna sequence
- expression
- fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8283—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for virus resistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
Description
あって、当該遺伝子のセンスおよびアンチセンスRNA断片を使用する方法、並
びに本発明の方法を使用して得られたウイルス遺伝子発現の変化を有する細胞、
植物または動物に関する。本発明は特に、ウイルスに抵抗性または耐性のそのよ
うな細胞、植物または動物に関する。
ウイルスはほとんどの生物に影響を及ぼす。作物において、収量の大部分がウイ
ルス感染のために失われ得る。家畜は、しばしばウイルスに感染し、重大な経済
的な結末を導く病気の蔓延を防止するため、時に屠殺される。コンパニオンアニ
マルもウイルスに襲われ、最終的にウイルスはヒトに感染し、多くの苦しみをも
たらす。ウイルスに対する処置が開発されてきたが、それらはしばしば非常に高
コストであるか効果が限定的である。
当該ウイルスに抵抗性または耐性の細胞、植物または動物を創出することが望ま
しい。遺伝子の発現を変化させる現行の方法は、通常、センスまたはアンチセン
スサプレッションの方法による。不幸なことに、これらの方法は、遺伝子発現を
変化させる能力がしばしば変動的で、予測不能であり、多くの場合、特定の遺伝
子活性を完全に崩壊させることはできない。 したがって、ウイルス遺伝子の発現を効率的かつ予測可能に変化させ、ウイル
スに抵抗性または耐性を有する細胞、植物または動物を得るのを可能にする、長
く考えられているが達成されていない、新規方法および組成物の必要性がある。
センスおよびアンチセンスRNA断片を使用して、変化させる方法に関する。この
ようなセンスおよびアンチセンスRNA断片が二本鎖RNA分子を形成することができ
るのが重要である。特に、本発明は、細胞、植物または動物に、ウイルスに対す
る抵抗性または耐性を付与する方法および組成物に関する。好ましくは、本発明
は、ウイルスに対する抵抗性または耐性を植物に付与する方法に関する。本発明
は、そのような方法を使用して得られた植物細胞、そのような細胞に由来する植
物、そのような植物の後代およびそのような植物に由来する種子にも関する。そ
のような植物細胞または植物において、特定のウイルス遺伝子の遺伝子発現の変
化は、当業界で既知の現行法を使用して得られた特定のウイルス遺伝子の遺伝子
発現の変化よりもより有効で、選択的でより予測可能である。
であって、少なくとも2個のサブ配列がウイルスRNAのセンスおよびアンチセンス
配列を有し、二本鎖RNA分子を形成することができることを特徴とする方法を提
供する。その方法は、好ましくは、細胞に複数のサブ配列からなるRNAを導入す
ることを含み、少なくとも2個のサブ配列がウイルスRNAの配列を有することを特
徴とする。好ましくは、そのRNAは、3’末端サブ配列の上流に位置する少なく
とも1個の翻訳停止コドンを含む。さらなる好ましい実施態様において、その方
法は、当該RNAの発現をコードするヌクレオチド配列またはDNA分子を細胞に導入
することを含む。
スRNA断片を導入することを含む方法を提供する。ここで、当該センスRNA断片お
よび当該アンチセンスRNA断片は、二本鎖RNA分子を形成することができる。ここ
で、当該細胞内の当該標的遺伝子の発現が変化する。好ましい実施態様では、そ
の標的遺伝子は、ウイルスゲノムまたはその一部を含み、その細胞は、好ましく
は、ウイルスに抵抗性または耐性である。好ましい実施態様では、そのウイルス
は、トスポウイルス、ポティウイルス、ポテックスウイルス、トバモウイルス、
ルテオウイルス、ククモウイルス、ブロモウイルス、クロステオルウイルス(clo
steorvirus)、トムブスウイルスおよびフロウイルスからなる群から選択される
。さらなる好ましい実施態様では、そのRNA断片は、ウイルスコートタンパク質
遺伝子、ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質遺伝子、ウイルスレプリカーゼ
遺伝子、ムーブメントタンパク質遺伝子またはその一部に由来するヌクレオチド
配列を含む。さらなる好ましい実施態様では、細胞は植物細胞、例えば、単子葉
植物または双子葉植物細胞である。さらなる好ましい実施態様では、そのRNA断
片は、2個の異なるRNA分子に含まれる。
る。さらなる好ましい実施態様では、そのRNA断片を当該細胞に導入する前に二
本鎖RNA分子を形成することのできる条件で混合する。さらなる好ましい実施態
様では、次にそのRNA断片を当該細胞に導入する。さらに好ましい実施態様では
そのRNA断片は1個のRNA分子に含まれる。その場合、そのRNA分子は好ましくはフ
ォールディングして、そこに含まれる当該RNA断片は二本鎖RNA分子を形成す
ることができる。
きる第1のDNA配列、および当該標的遺伝子のアンチセンスRNA断片を当該細
胞中で発現することのできる第2のDNA配列を導入することを含む方法を提供
する。ここで、当該センスRNA断片および当該アンチセンスRNA断片は、二
本鎖RNA分子を形成することができる。ここで、当該ウイルス標的遺伝子の当
該細胞中での発現が変化する。好ましい実施態様では、標的遺伝子は、ウイルス
ゲノムまたはその一部を含み、その細胞は、好ましくはウイルスに抵抗性または
耐性である。好ましい実施態様では、そのウイルスは、トスポウイルス、ポティ
ウイルス、ポテックスウイルス、トバモウイルス、ルテオウイルス、ククモウイ
ルス、ブロモウイルス、クロステオルウイルス(closteorvirus)、トムブスウイ
ルスおよびフロウイルスからなる群から選択される。さらなる好ましい実施態様
では、そのDNA配列は、ウイルスコートタンパク質遺伝子、ウイルスヌクレオ
キャプシドタンパク質遺伝子、ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ムーブメントタン
パク質遺伝子またはその一部に由来するヌクレオチド配列を含む。さらなる好ま
しい実施態様では、細胞は植物細胞、例えば、単子葉植物または双子葉植物細胞
である。好ましい実施態様では、DNA配列は、安定的に植物細胞のゲノムに組
み込まれる。好ましい実施態様では、そのDNA分子は、当該第1または第2の
DNA配列に実施可能なように連結されたプロモーターをさらに含む。さらなる
好ましい実施態様では、第1のDNA配列および第2のDNA配列は、2個の異
なる、すなわち別のDNA分子に含まれる。
含まれる。この場合、この第1のDNA配列および第2のDNA配列は、好まし
くは当該DNA分子の同じDNA鎖に含まれ、このことは、センスRNA断片お
よびアンチセンスRNA断片が1個のRNA断片に含まれることを意味する。好
ましくは、そのRNA分子はフォールディングして、そこに含まれる当該RNA
断片は、二本鎖領域を形成することができる。このようなRNA分子の例は、配
列番号13、配列番号17、配列番号18、配列番号25または配列番号28の
逆方向反復配列を含む。さらなる好ましい実施態様では、センスRNA断片およ
びアンチセンスRNA断片は、2個のRNA分子に含まれ、または2個のRNA
分子として発現される。この場合、第1のDNA配列および第2のDNA配列は
、好ましくは双方向性プロモーターに実施可能なように連結され、あるいは、第
1のDNA配列は第1のプロモーターに実施可能なように連結され、第2のDN
A配列は、第2のプロモーターに実施可能なように連結されている。ここで、そ
の第1のプロモーターおよび第2のプロモーターは、同じプロモーターまたは異
なるプロモーターである。さらなる好ましい実施態様では、第1のDNA配列お
よび第2のDNA配列は、当該DNA分子の相補鎖に含まれる。
第2のDNA配列の相補的DNA鎖である。この場合、このDNA分子は、当該
第1または第2のDNA配列に実施可能なように連結されている第1のプロモー
ターをさらに含む。好ましい実施態様では、このDNA分子は、当該第1のプロ
モーターおよび当該第1または第2のDNA配列の間の第1の部位特異的組換え
部位、並びに当該第1のDNA配列の3’末端の第2の部位特異的組換え部位を
さらに含む。ここで、当該第1および第2の部位特異的組換え部位は、当該第1
および第2の部位特異的組換え部位の間の当該第1または第2のDNA配列を、
部位特異的レコンビナーゼの存在下、逆方向化することができる。さらなる好ま
しい実施態様では、当該逆方向化の結果、当該第1のプロモーターは、当該第2
(または第1、最初にプロモーターに連結されたDNA配列による)のDNA配列
を発現することができる。その植物細胞は、好ましくは当該部位特異的組換え部
位を認識することのできる部位特異的レコンビナーゼをさらに含む。
に連結された第1のプロモーターおよび当該第2のDNA配列に実施可能なよう
に連結された第2のプロモーターをさらに含む。ここで、当該第1のプロモータ
ーおよび第2のプロモーターは、同じプロモーターを含むか、または異なるプロ
モーターを含む。 さらなる好ましい実施態様では、そのDNA分子中のプロモーターは当該細胞
の本来のプロモーターを含む。さらに好ましい実施態様では、そのプロモーター
は、異種性のプロモーター、例えば、組織特異的プロモーター、発育段階によっ
て調節されるプロモーター、構成的プロモーターまたは誘導可能プロモーターで
ある。所望により、プロモーターは、そのプロモーターのそれぞれの側のDNA
配列の転写を開始することのできるディバージェントまたは双方向性プロモータ
ーである。
スRNA断片をコードしているDNA配列の間のリンカーをさらに含む。そのリ
ンカーは、機能性遺伝子、例えば、選択マーカー遺伝子または調節配列、例えば
イントロンプロセシングシグナルを含む例えば発現カセットを含む。
に提供する。ここで、当該細胞内の当該ウイルス標的遺伝子の発現は、当該RN
A断片によって変化する。好ましい実施態様では、その細胞は、ウイルスに抵抗
性または耐性である。好ましい実施態様では、その細胞は植物細胞である。本発
明は、その植物細胞に由来する植物およびその後代、並びにその植物に由来する
種子を提供する。
施態様では、そのようなDNA構築物は、ウイルスゲノムまたはその一部のセン
スRNA断片を細胞内で発現させることのできる第1のDNA配列および当該ウ
イルスゲノムまたはその一部のアンチセンスRNA断片を当該細胞内で発現させ
ることのできる第2のDNA配列を含む。ここで、当該センスRNA断片および
当該アンチセンスRNA断片は、二本鎖RNA分子を形成することができる。更
なる好ましい実施態様では、当該細胞内の当該ウイルスゲノムまたはその一部の
発現が変化する。さらなる好ましい実施態様では、その細胞は植物細胞である。
さらなる好ましい実施態様では、そのウイルスは、トスポウイルス、ポティウイ
ルス、ポテックスウイルス、トバモウイルス、ルテオウイルス、ククモウイルス
、ブロモウイルス、クロステオルウイルス(closteorvirus)、トムブスウイルス
およびフロウイルスからなる群から選択される。さらなる好ましい実施態様では
、そのDNA配列は、ウイルスコートタンパク質遺伝子、ウイルスヌクレオキャ
プシドタンパク質遺伝子、ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ムーブメントタンパク
質遺伝子またはその一部に由来するヌクレオチド配列を含む。さらなる好ましい
実施態様では、そのDNA構築物は、当該第1または当該第2のDNA配列に実
施可能なように連結されたプロモーターをさらに含む。なおさらなる好ましい実
施態様では、そのDNA構築物は、当該第1のDNA配列に実施可能なように連
結された第1のプロモーターおよび当該第2のDNA配列に実施可能なように連
結された第2のプロモーターを含む。なおさらなる好ましい実施態様では、その
DNA構築物は、当該第1のDNA配列および当該第2のDNA配列に実施可能
なように連結された双方向性プロモーターをさらに含む。
NA配列および当該標的遺伝子のアンチセンスRNA断片を当該細胞内で発現さ
せることのできる第2のDNA配列。ここで、当該センスRNA断片および当該
アンチセンスRNA断片は、二本鎖RNA分子を形成することができる。ここで
、当該第1のDNA配列は、当該DNA構築物の当該第2のDNA配列の相補鎖
である。 (b)当該第1または第2のDNA配列に実施可能なように連結されたプロモータ
ー。 (c)当該プロモーターおよび当該第1または第2のDNA配列の間の第1の部位
特異的組換え部位。 (d)当該第1または第2のDNA配列の3’末端の第2の部位特異的組換え部位
。ここで、当該第1および第2の部位特異的組換え部位は、当該第1および第2
の部位特異的組換え部位の間の当該第1または第2のDNA配列を、部位特異的
レコンビナーゼの存在下、逆方向化することができる。 好ましい実施態様では、当該細胞の当該標的遺伝子の発現が変化する。
NA配列および当該標的遺伝子のアンチセンスRNA断片を当該細胞内で発現さ
せることのできる第2のDNA配列。ここで、当該センスRNA断片および当該
アンチセンスRNA断片は、二本鎖RNA分子を形成することができる。ここで
、当該第1のDNA配列は、当該DNA構築物の当該第2のDNA配列の相補鎖
である。 (b)当該第1のDNA配列に実施可能なように連結された第1のプロモーター。 (c)当該第2のDNA配列に実施可能なように連結された第2のプロモーター。 好ましい実施態様では、当該細胞の当該標的遺伝子の発現が変化する。
同じ標的遺伝子のアンチセンスRNA断片を含む。その両者は、互いに相補的な
ヌクレオチド配列を含む。それによって、そのセンスおよびアンチセンスRNA
断片は対となり、二本鎖RNA分子を形成することができる。 「相補的」は、逆位平行(antiparallel)ヌクレオチド配列における相補的塩基残
基の間で水素結合を形成することによって互いに対となることのできる逆位平行
ヌクレオチド配列を含む2本のヌクレオチド配列をいう。
、他方のヌクレオチド配列では3’−5’方向に渡るホスホジエステル結合を有
する相補的塩基残基の間の水素結合により対となった2本のヌクレオチド配列を
いう。 「標的遺伝子」は、既知の機能の任意のウイルス遺伝子であるか、その機能が未
知であるが全部または一部のヌクレオチド配列が既知である遺伝子である。標的
遺伝子は、細胞の本来の遺伝子であるか、予め細胞に好ましくは遺伝子形質転換
またはその細胞のウイルス感染によって導入された異種性の遺伝子である。好ま
しくは、その標的遺伝子は、植物細胞の遺伝子である。 「本来の」遺伝子とは、形質転換されない細胞のゲノムに存在する遺伝子をい
う。
成酵素、レセプター、情報伝達タンパク質、構造遺伝子産物、または輸送タンパ
ク質のようなタンパク質をコードしている遺伝子をいう。 細胞の標的遺伝子の発現の「変化」は、本発明の方法の適用の後、ある細胞内の
標的遺伝子の発現レベルが、その方法の適用のない細胞内でのその発現と異なる
ことを意味する。遺伝子発現の変化は、好ましくは、その細胞内での標的遺伝子
の発現が減少し、好ましくは大きく減少し、より好ましくはその遺伝子発現が検
出不可能となり、細胞またはそれに由来する植物もしくは動物にノックアウト突
然変異表現型をもたらすことを意味する。 「単離」は、本発明では、その本来の環境から離れて存在し、したがって天然
物ではない人手によって単離された核酸分子である。単離核酸分子は、精製形態
で存在してもよく、天然ではない環境、例えば、トランスジェニック宿主細胞内
に存在し得る。
当な宿主細胞にもたらすことができ、終結シグナルに実施可能なように連結され
る所望のヌクレオチド配列に実施可能なように連結されたプロモーターを含むこ
とができるDNA配列を意味する。典型的には、それは、ヌクレオチド配列の正
確な翻訳のために必要な配列をも含む。コード領域は、通常、所望のタンパク質
をコードするが、所望の機能性RNA、例えば、アンチセンスRNAまたは非翻
訳RNAをもセンスまたはアンチセンス配向でコードしてもよい。所望のヌクレ
オチド配列を含む発現カセットは、キメラ(少なくとも1個のその構成要素が少
なくとも1個の他のその構成要素について異種性である)であってよい。発現カ
セットは、天然に存在するが異種性の発現のために有用な組換え形態で得られた
ものであってもよい。しかし、典型的には、発現カセットは、宿主について異種
性であり、すなわち、発現カセットの特定のDNA配列は、宿主細胞内に天然に
存在せず、宿主細胞または宿主細胞の後代に形質転換事象によって導入されなけ
ればならない。発現カセット内のヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモータ
ーまたは宿主細胞がある特定の外部刺激にさらされるときのみ転写を開始させる
誘導可能プロモーターの制御下であってよい。多細胞生物、例えば植物の場合、
プロモーターは、特定の組織もしくは器官または発育段階に特異的であることが
できる。
天然状態を表す。例えば、もし宿主細胞が他の生物、特に他種の生物に由来する
核酸配列で形質転換されれば、その核酸配列を有するその宿主細胞について、お
よびその宿主細胞の子孫についてその核酸配列は異種性である。同様に、異種性
とは、同じ天然の、もとの細胞型に由来し、挿入されているが、非天然状態、例
えば、異なるコピー数、または異なる調節エレメントの制御下で存在するヌクレ
オチド配列をいう。
は、最も広い意味で、引用ヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を意味
する。ここで、この対応する配列は、引用ヌクレオチド配列によってコードされ
たポリペプチドとして、実質的に同じ構造および機能を有するポリペプチドをコ
ードする。例えば、ポリペプチド機能に影響を及ぼさないアミノ酸の変化のみ存
在する場合である。望ましくは、その実質的に類似のヌクレオチド配列が、引用
ヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドをコードする。実質的に類
似のヌクレオチド配列および引用ヌクレオチド配列の間の同一性のパーセンテー
ジ(相補的配列内の相補的塩基の数を、相補的配列中の塩基の総数で割る)は、
望ましくは少なくとも80%、より望ましくは85%、好ましくは少なくとも90
%、より好ましくは少なくとも95%、さらにより好ましくは少なくとも99%である
。
調節エレメントは、所望のヌクレオチド配列および終結シグナルに実施可能なよ
うに連結されたプロモーターを含む。これらは、典型的には、ヌクレオチド配列
の適当な翻訳に要する配列を包含する。 「植物」は、任意の発育段階にある任意の植物または植物の一部をいう。ここ
に、挿し木、細胞または組織培養物および種子も含まれる。本発明に使用される
ように、「植物組織」の語は、植物体、植物細胞、植物器官、植物種子、プロト
プラスト、カルス、細胞培養物、並びに構造および/または機能単位に組織化さ
れた植物細胞の任意の群を含むがこれらに限定されない。
と比較したときに1種またはそれ以上のウイルスに対して感受性ではないか低い
感受性である抵抗性または耐性細胞、植物または動物を意味する。例えば、抵抗
性または耐性は、ウイルス感染の通常の症状が不存在であるか減少していること
、または細胞内のウイルスの蓄積もしくは複製が防止されるか減少していること
、または例えば、細胞から細胞へのウイルスの移動が防止されるか減少している
ことを意味する。 「ウイルスゲノムまたはその一部の発現の変化」は、典型的には、ウイルスま
たはその一部もしくはその構成要素、例えば、ウイルスのRNA、DNAまたは
タンパク質の蓄積、複製または移動が、細胞内で影響を受けていることと理解さ
れる。
ち変化させる方法に関する。細胞、植物または動物における遺伝子の発現を調節
するために通常利用される方法は、予測可能性に欠け、調節されるべき遺伝子に
よって変動的である。本発明はこれらの課題を解決し、細胞、植物または動物に
おける遺伝子の再現可能で、効率的な調節を提供する。 発現が調節される遺伝子は、ウイルスゲノムまたはその一部である。好ましい
実施態様では、細胞は真核細胞、より好ましくは植物細胞、例えば、単子葉植物
もしくは双子葉植物細胞、または動物細胞、例えば、哺乳動物、例えばヒト、ウ
シ、ヒツジ、ブタ、ネコもしくはイヌ、もしくは鳥類からのものである。本発明
は、ウイルス標的遺伝子のセンスRNA断片およびアンチセンスRNA断片を利
用し、細胞内の遺伝子の発現を変化させる。第1の実施態様では、本発明は、細
胞に標的遺伝子のセンスRNA断片および当該標的遺伝子のアンチセンスRNA
断片を導入することを含む方法を提供する。ここで、当該センスRNA断片およ
び当該アンチセンスRNA断片は、二本鎖RNA分子を形成することができる。
ここで、当該細胞内の当該標的遺伝子の発現が変化する。そのRNA断片を、そ
の細胞に種々の形質転換方法、例えば、パーティクルボンバードメントまたはP
EG介在形質転換またはエレクトロポレーションによって導入する。さらなる好
ましい実施態様では、他の方法、例えば、RNA断片のマイクロインジェクショ
ンを使用する。
この場合、RNA断片を当該細胞に導入する前に、例えば、二本鎖RNA分子を
形成することのできるような条件下で混合する。さらなる好ましい実施態様では
、RNA断片を次に当該細胞に導入する。好ましくは、それぞれのRNA分子の
導入の間の時間間隔は短く、好ましくは1時間より短い。なおさらなる実施態様
では、RNA断片は、1個のRNA分子に含まれる。単一のRNA分子を使用す
ることによって、2個の相補的RNA断片は対となるほどにきわめて近接してい
るのが好ましい。その場合、好ましくはRNA分子は、フォールディングして、
そこに含まれる当該RNA断片は二本鎖領域を形成することができる。この場合
、RNA断片の相補的部分は、互いに認識し、互いに対となり、二本鎖RNA分
子を形成する。好ましい実施態様では、このRNA断片を細胞に導入する前に二
本鎖RNA分子を形成することのできる条件でインキュベートする。なおさらな
る実施態様では、このRNA分子は、センスRNA断片とアンチセンスRNA断
片の間にリンカーを含む。このリンカーは、好ましくは、機能性遺伝子、例えば
、選択マーカー遺伝子を含む発現カセットによってコードされたRNA配列を含
む。さらなる実施態様では、このリンカーは、例えばイントロンプロセッシング
シグナルを含む調節配列によってコードされているRNA配列を含む。
あって、細胞に当該ウイルスゲノムのセンスRNA断片を当該細胞中で発現する
ことのできる第1のDNA配列および当該ウイルスゲノムのアンチセンスRNA
断片を当該細胞中で発現することのできる第2のDNA配列を導入することを含
む方法を提供する。ここで、当該センスRNA断片および当該アンチセンスRN
A断片は、二本鎖RNA分子を形成することができる。好ましい実施態様では、
その第1のDNA配列およびその第2のDNA配列は、その細胞のゲノムに安定
的に組みこまれる。さらなる好ましい実施態様では、それらのDNA配列は2個
の異なるDNA分子に含まれる。さらなる好ましい実施態様では、それらのDN
A配列は、1個のDNA分子に含まれる。この場合、そのDNA分子は、好まし
くはセンスおよびアンチセンスRNA断片を含む単一のRNA分子をコードする
。単一のRNA分子を使用することによって、その2個の相補的RNA断片は対
となるほどに非常に近接しているので、それは好ましい。そのDNA分子は、2
個の別々のRNA分子、例えば、センスRNA断片を含む1個のRNA分子およ
びアンチセンスRNA断片を含む1個のRNA分子を含む1個のRNA分子をコ
ードする。単一のRNA分子またはそららの2個の別のRNA分子は、好ましく
は、フォールディングして、そこに含まれる当該RNA断片は、二本鎖領域を形
成することができる。そのRNA断片の相補的部分は互いに認識し、互いに対と
なり、二本鎖RNA分子を形成する。
は当該DNA配列に実施可能なように連結されたプロモーターを含む。好ましい
実施態様では、DNA配列中のプロモーターは、本来の植物プロモーターまたは
不活性化されるべき当該ウイルス遺伝子の本来のプロモーターを含む。その二本
鎖RNAがウイルス標的遺伝子として同じ組織で発育中に同時に発現するのを確
保するためである。さらなる実施態様では、そのプロモーターは、異種性のプロ
モーター、例えば、組織特異的プロモーター、発育段階に応じて調節されるプロ
モーター、構成的プロモーターまたは誘導可能プロモーターである。 なおさらなる実施態様では、このDNA配列は、当該2個の相補的RNA断片
をコードするDNA配列の間にリンカーを含む。このリンカーは、好ましくは、
機能性遺伝子、例えば、選択マーカー遺伝子を含む発現カセットを含む。さらな
る実施態様では、このリンカーは、例えばイントロンプロセッシングシグナルを
含む調節配列を含む。 本発明のDNA分子を、当業界で周知の方法または後記に示す方法を使用して
細胞に形質転換する。本発明は、本発明のDNA配列を含むDNA構築物、その
ようなDNA構築物を含む組換えベクターおよび本発明のDNA配列を含む組成
物を提供する。
しくは少なくとも15ヌクレオチド長、より望ましくは少なくとも50ヌクレオ
チド長、好ましくは少なくとも500bp長である。好ましくはその相補的領域
は、5kbより小さく、より好ましくは2kbより小さい。ある特定の実施態様
では、センスおよびアンチセンスRNA断片の間の相補的領域は、標的遺伝子の
コード領域を含む。さらなる好ましい実施態様では、その相補的領域は、標的遺
伝子の非翻訳領域(UTR)、例えば、5’UTRまたは3’UTRを含む。なお
さらなる好ましい実施態様では、本発明のセンスまたはアンチセンスRNA断片
をコードするDNA配列はcDNA分子に由来し、あるいは、発現を変化させる
べきウイルス標的遺伝子の調節エレメント、例えば、プロモーターまたは終結シ
グナルを含む。
相補的領域は、発現が変化する遺伝子の対応する配列と同一である。さらなる好
ましい実施態様では、センスおよびアンチセンスRNA断片の間の相補的領域は
、発現が変化させられる遺伝子の対応する配列と実質的に類似であり、なお、そ
の遺伝子の発現を変化させることができる。この場合、その相補的領域は、望ま
しくは発現が変化させられる遺伝子の対応する配列と少なくとも50%同一、よ
り望ましくは少なくとも70%同一、好ましくは少なくとも90%同一、より好ま
しくは少なくとも95%同一である。それによって、単一の二本鎖RNA分子を
使用して、単一の遺伝子または複数の遺伝子の発現を変化させることができる。
ここで、当該単一の遺伝子は二本鎖RNAに同一な配列を含むか、その二本鎖R
NAと実質的の類似である。
相補的領域は、センスおよびアンチセンスRNA断片の間に全くミスマッチを含
まない。さらなる好ましい実施態様では、センスおよびアンチセンスRNA断片
の間の相補的領域は、センスおよびアンチセンスRNA断片の間に少なくとも1
個のミスマッチを含む。そのとき、2個のRNA断片は対となり、二本鎖RNA
分子を形成し、それによってその遺伝子の発現を変化させることができる。望ま
しくは、相補的領域のセンスおよびアンチセンスRNA断片の間のミスマッチは
50%より少なく、より望ましくは30%より少なく、好ましくは20%より少
なく、より好ましくは10%より少なく、なおさらに好ましくは5%より少ない。
。本発明を使用して制御されるウイルスは、dsDNAウイルス、dsRNAウ
イルス、プラス鎖およびマイナス鎖ssRNAウイルス、アンビセンスRNAウ
イルス並びにレトロウイルスを含むがこれらに限定されない。好ましくは、制御
される植物ウイルスは、例えば、トスポウイルス(例えば、トマト黄化えそウイ
ルス、TSMVと略称)、ポティウイルス(例えば、カブモザイクウイルス、Tu
MVと略称、レタスモザイクウイルス、LMVと略称、カボチャモザイクウイル
スII、WMVIIと略称、ズッキーニ黄化モザイクウイルス、ZYMVと略称
、ジャガイモYウイルス、RVYと略称、およびパパイヤリングスポットウイル
ス、PRSVと略称)、ポテックスウイルス、トバモウイルス(例えば、ペッパー
微班ウイルス、PMMVと略称、およびトマトモザイクウイルス、ToMVと略
称)、ルテオウイルス(例えばビート西部萎黄ウイルス、BWYVと略称、および
beet mild yellowing virus、BMYVと略称)、ククモウイルス(例えば、キュ
ウリモザイクウイルス、CMVと略称)、ジェミニウイルス(例えば、tomato yel
low leafcurl virus、TYLCVと略称)、カウリモウイルス(例えばカリフラワ
ーモザイクウイルス、CaMVと略称)、ブロモウイルス、クロステオルウイル
ス(closteorvirus)、トンブスウイルス並びにフロウイルス(例えば、ビートえそ
性葉脈黄化ウイルス、BNYVVと略称)である。本発明を使用して制御可能な
さらなるウイルスのクラスが、Zacomer et al.(1995) Journal of General Viro
logy, 76:231-247およびMartelli(1992)Plant Disease, 76: 436-441に記載され
ている。ウイルス制御を達するためにウイルスゲノムの好ましいDNA配列は、
ウイルスコートタンパク質、ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質、ウイルス
レプリカーゼ、ムーブメントタンパク質等をコードしている遺伝子の領域に対応
する。ウイルスゲノム発現を制御するために有用なさらなるヌクレオチド配列は
、WO95/09920に記載されている。好ましいDNA配列はタンパク質に
翻訳されないウイルスゲノムの一部、例えば、5’または3’非翻訳領域を含み
うる。
をもたらす。例えば、本発明の方法はウイルスゲノムによってコードされている
ウイルスおよび同じウイルス綱、群または属の他のウイルスへの抵抗性または耐
性をもたらす。あるいは、本発明の方法は、ウイルスゲノムおよび同じウイルス
の他の分離株によってコードされているウイルスへの抵抗性または耐性をもたら
す。本発明の方法は、ウイルスゲノムおよび異なる種であって好ましくは関連す
る種、好ましくはそのようなウイルスが存在する種である異なる種における同じ
ウイルス群または属の他のウイルスによってコードされているウイルスに対する
抵抗性または耐性をももたらす。所望により、1対より多い、すなわち少なくと
も2対の、dsRNAを形成することのできるセンスおよびアンチセンスRNA
断片を使用する。そのような対は例えば、同じウイルスゲノムだけでなく同じウ
イルスゲノムの異なる部分に由来する。あるいは、そのような対は、異なるウイ
ルスゲノムに由来する。したがって、異なるウイルスクラス、群または属への抵
抗性または耐性を、本発明を使用して達成する。
あるのだが、好ましくは双子葉植物である。シュガービートおよびキャノーラに
おけるフロウイルス(例えばRush and Heidel(1995)Plant Disease 79: 868-875
参照)の抵抗性または耐性を付与する方法を、本発明に記載し、BNYVV、シ
ュガービートにおけるrhizomania(crazy roots)の原因病原体についてさらなる
詳細を実施例9に記載する。「ウイルス黄化」(例えば、CRC Handbook on Disease
of Sugar Beet, Volume II, pp. 35-52参照)例えば、BMYVおよびビート西部
萎黄ウイルス(BWYV)(シュガービートおよび脂肪種子ナタネにそれぞれ感染
する)への抵抗性または耐性を付与する方法を、実施例8にさらに詳細に記載する
。 本発明の方法は、単子葉植物のウイルスへの耐性または抵抗性を付与する。例
えば、本発明および米国特許5,569,828の方法を使用して、Maize chlorotic dwa
rf virusに対する耐性または抵抗性を得る。同様に本発明および米国特許5,428,
144の方法を使用して、Maize dwarf mosaic virusに対する耐性または抵抗性を
得る。
を使用して組みこむ。一般に、本発明のDNA分子は形質転換ベクターに含まれ
る。当分野で既知の多くのそのようなベクター系、例えば、プラスミド、バクテ
リオファージウイルスおよび他の修飾されたウイルスを使用する。発現系の構成
要素を修飾して、例えば、センスおよびアンチセンスRNA断片の発現を増大さ
せる。例えば、配列の切除、ヌクレオチドの置換、または他の修飾を実施する。
当分野で既知の発現系を使用して、実質的に任意の作物植物細胞を適当な条件で
形質転換する。本発明のDNA分子を含む導入遺伝子を、宿主細胞のゲノムに好
ましくは安定的に組みこむ。さらなる好ましい実施態様では、本発明のDNA分
子を含む導入遺伝子を、自己複製ベクター中に置く。自己複製ベクターの例は、
ウイルス、特にジェミニウイルスである。形質転換された細胞を好ましくは植物
体に再生する。本発明の形質転換された植物は、単子葉または双子葉植物であっ
てよく、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、カンショ、(インゲン)マ
メ、エンドウ、チコリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カ
ブ、ダイコン、ホウレンソウ、アウパラガス、タマネギ、ニンニク、ペッパー、
セルリー、カボチャ、ペポカボチャ、アサ、ズッキーニ、リンゴ、ナシ、マルメ
ロ、メロン、スモモ、サクランボ、モモ、ネクタリン、アンズ、イチコ、ブドウ
、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボガド、パパイヤ、マンゴー
、バナナ、ダイズ、トマト、ソルガム、サトウキビ、シュガービート、ヒマワリ
、ナタネ、クローバー、タバコ、ニンジン、ワタ、アルファルファ、イネ、ジャ
ガイモ、ナス、キュウリ、アラビドプシス、並びに樹木植物、例えば、針葉樹お
よび落葉樹を含むがこれらに限定されない。望ましいヌクレオチド配列を特定の
植物種に形質転換し、その種内で増殖し、または伝統的な育種法を使用して同じ
種の特に商業的な変種を含む他の変種に導入する。
セットに、植物で発現可能な適当なプロモーターの後方に組みこむ。発現カセッ
トは、導入遺伝子の発現のために要するか選択された任意のさらなる配列を含み
うる。そのような配列は、例えば、転写ターミネーター、イントロンのような発
現を増強する外来配列、必須配列および特定のオルガネラおよび細胞構成要素へ
の遺伝子産物のターゲッティングを意図する配列を含むがこれらに限定されない
。これらの発現カセットを、後記の植物形質転換ベクターに容易に送達すること
ができる。典型的な発現カセットの種々の構成要素を後述する。
物における導入遺伝子の位置および時間的発現パターンが決定される。選択され
たプロモーターは、特異的な細胞型(例えば、葉表皮細胞、葉肉細胞、根皮層細
胞)または特異的な組織または器官(例えば、根、葉または花)中で導入遺伝子を
発現させ、その選択はその遺伝子産物の蓄積の望ましい位置に影響を及ぼす。あ
るいは、選択されたプロモーターは、種々の誘導条件で遺伝子の発現を駆動する
。プロモーターはその力、すなわち転写を促進する能力が異なる。利用される宿
主細胞系によって、当分野で既知の任意の数の適当なプロモーターを使用する。
例えば、構成的発現のために、CaMV 35Sプロモーター、イネアクチンプ
ロモーター、またはユビキチンプロモーターを使用する。例えば、調節可能な発
現のためには、タバコまたはアラビドプシスに由来する化学的に誘導可能なPR
−1プロモーターを使用する(例えば、米国特許5,689,044参照)。
現される多くのプロモーターが記載されている。この種の好ましいプロモーター
は、Stanford et al. Mol Gen. Genet. 215: 200-208(1989), Xu et al. Plant
Molec. Biol. 22: 573-588(1993), Logemann et al. Plant Cell 1: 151-158(19
89),Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22: 783-792(1993), Firek et al
. Plant Molec. Biol. 22: 129-142(1993) and Warner et al. Plant J.3:191-2
01(1993)に記載されているものを含む。 好ましい組織特異的発現型は、緑色組織特異的、根特異的、茎特異的および花
特異的なものを含む。緑色組織での発現に適当なプロモーターは、光合成に関係
する遺伝子を調節する多くのものを含む。これらの多くは、単子葉植物および双
子葉植物からクローニングされた。好ましいプロモーターは、ホスホエノールカ
ルボキシラーゼ遺伝子に由来するトウモロコシPEPCプロモーターである(Hud
speth & Grula, Plant Molec. Biol. 12: 579-589(1989))。根特異的発現に好ま
しいプロモーターは、de Framondによって記載されたものである(FEBS 290: 103
-106(1991); EP0452269)。さらに好ましい根特異的プロモーターは、本発明によ
って提供するT−1遺伝子に由来するものである。好ましい茎特異的プロモータ
ーは、米国特許5,625,136に記載されたものであり、トウモロコシtrpA遺伝
子の発現を駆動する。 本発明の好ましい実施態様は根特異的な方法でヌクレオチド配列を発現するト
ランスジェニック植物である。さらに好ましい実施態様は、傷誘導可能または病
原体感染誘導可能な方法でヌクレオチド配列を発現するトランスジェニック植物
である。
これらは導入遺伝子を超えた転写の終結および正確なポリアデニル化に必要であ
る。適当な転写ターミネーターが植物で機能するとして知られているものであり
、CaMV 35Sターミネーター、tmlターミネーター、ノパリンシンター
ゼターミネーター、およびエンドウrbcS E9ターミネーターを含む。これ
らは単子葉植物および双子葉植物の両方に使用される。
これらの配列は、本発明の遺伝子と結合させて使用して、トランスジェニック植
物内での発現を増加させることができる。例えば、種々のイントロン配列、例え
ば、トウモロコシAdhl遺伝子のイントロンは、特に単子葉植物細胞で発現を
増強することが示された。さらに、ウイルスに由来する多くの非翻訳リーダー配
列が発現を増強すると知られており、これらは双子葉植物細胞で特に効果的であ
る。
のためにコード配列を変化させることによって改変し得る。コード配列を修飾し
て特定の作物種で最適な発現を達成する方法が周知である(例えば、Perlak et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324(1991); and Koziel et al., Bio/te
chmol. 11:194(1993)参照)。 さらなる好ましい実施態様では、本発明のDNA分子を色素体ゲノムに直接的
に形質転換する。色素体形質転換法が米国特許番号5,451,513、5,545,817および
5,545,818、PCT出願番号WO95/16783、およびMcBride et al.(1994)Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 91,7301-7305に詳細に記載されている。葉緑体形質転換の基
本的な方法は、選択マーカーにフランキングなクローニングされた色素体DNA
の領域を所望の遺伝子と共に、適当な標的組織に、例えば、バイオリスティック
またはプロトプラスト形質転換(例えば、塩化カルシウムまたはPEG仲介形質
転換)を使用して導入することに関する。ターゲティング配列と称する1ないし
1.5kbフランキング領域によって、色素体ゲノムの同種性の組み換えを容易
化し、plastomeの特異的領域の置換または修飾が可能になる。
トマイシンに対する抵抗性を付与するrps12遺伝子における点突然変異を形
質転換のための選択マーカーとして利用する(Svab, Z., Hajdukiewicz, P., and
Maliga, P.(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530; Staub, J. M.,
and Maliga, P. (1992)Plant Cell 4,39-45)。これらのマーカーの間のクロー
ニング部位の存在によって、外来DNA分子の導入のための色素体ターゲッティン
グベクターを生成することができる(Staub, J.M.,and Maliga, P. (1993)EMBO J
.12, 601-606)。劣性のrRNAまたはr−タンパク質抗生物質抵抗性遺伝子を、優
性の選択マーカー、例えば、スペクチノマイシン解毒酵素アミノグリコシド−3'
-アデニルトランスフェラーゼをコードしているバクテリアaadA遺伝子で置
換することによって、形質転換頻度を実質的に増加できる(Svab, Z., and Malig
a, P. (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917)。以前、このマーカー
を使用して、緑藻Chlamydomonas reinhardtiiの色素体ゲノムの高頻度形質転換
に成功している(Goldschmidt-Clermont, M. (1991)Nucl. Acids Res. 19:4083-4
089)。色素体形質転換に有用な他の選択マーカーが当分野で知られ、本発明の範
囲に入る。
ピーの環状色素体ゲノムに挿入されることである。好ましい実施態様では、本発
明のDNAを色素体ターゲッティングベクターに挿入し、所望の植物宿主の色素
体ゲノムに形質転換する。本発明のDNA分子を含む色素体ゲノムについてホモ
プラスミックな植物を得て、それはそのDNA分子を選択的に高度に発現するこ
とができる。好ましくは、そのDNA分子をコードしているセンスおよびアンチ
センスRNA断片は、対となって、植物色素体内で二本鎖RNA分子を形成し、
色素体遺伝子の発現を変化させることができる。好ましい実施態様では、センス
およびアンチセンス断片は相補的領域に全くミスマッチを含まない。さらなる好
ましい実施態様では、センスおよびアンチアセンス断片は少なくとも1個のミス
マッチをその相補的領域に含む。この場合、RNA断片をコードしているDNA
分子内のDNA配列は、互いに再結合することができない。
者に既知であり、本発明に関係する遺伝子を任意のそのベクターと結合させて使
用することができる。そのベクターの選択は好ましい形質転換法および形質転換
の標的の種に依存する。ある種の標的種のために、種々の抗生物質または除草剤
選択マーカーが好ましい。形質転換にルーチンに使用される選択マーカーは、カ
ナマイシンおよび関連する抗生物質に対する抵抗性を付与するnptll遺伝子
(Messing & Vierra. Gene 19:259-268(1982); Bevan et al., Nature 304: 184-
187(1983))、除草剤ホスヒノトリシンに対する抵抗性を付与するBar遺伝子(Wh
ite et al., Nucl. Acids Res 18: 1062(1990),Spencer et al. Theor. Appl. G
enet 79: 625-631(1990))抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を付与する
hph遺伝子(Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4: 2929-2931)および
メタトレキセートに対する抵抗性を付与するdhfr遺伝子(Bourouis et al.,
EMBO J.2(7): 1099-1104(1983))並びにグリホサートに対する抵抗性を付与する
EPSPS遺伝子(米国特許番号4,940,935 and 5,188,642)を含む。
利用できる。これらは典型的には少なくとも1個のT−DNAボーダー配列を有
し、例えばpBIN19(Bevan, Nucl. Acids Res. (1984))およびpXYZのよ
うなベクターを含む。アグロバクテリウム形質転換に適当な典型的なベクターは
、バイナリーベクターpCIB10およびpCIB2001並びにバイナリーベ
クターpCIB10およびそのハイグロマイシン選択誘導体を含む。(例えば米
国特許番号5,639,949参照)。
質転換ベクター中のT−DNA配列の必要性を回避し、結果的に、これらの配列
を欠いたベクターをT−DNA配列を含む前記のもののようなベクターに加えて
利用する。アグロバクテリウムに依存しない形質転換法は、パーティクルボンバ
ードメント、プロトプラスト取り込み(例えば、PEGおよびエレクトロポレー
ション)およびマイクロインジェクションによる形質転換を含む。ベクターの選
択は、形質転換される種の好ましい選択に多くは依存する。非アグロバクテリウ
ム形質転換に適当な典型的なベクターは、pCIB3064、pSOG19、お
よびpSOG35を含む。(例えば、米国特許番号5,639,949参照)。
の形質転換および再生の方法は当分野で周知である。例えば、Tiプラスミドベ
クター、並びに直接的DNA取り込み、リポソーム、エレクトロポレーション、
マイクロインジェクション、およびマイクロプロジェクタイルを外来DNAの送
達のために使用する。さらにアグロバクテリウム属からのバクテリアを植物細胞
を形質転換するために利用できる。
に基づく方法およびアグロバクテリウムを要しない方法を含む。非アグロバクテ
リウム方法は、外生遺伝的物質をプロトプラストまたは細胞に直接的に取り込む
ことを含む。これは、PEGまたはエレクトロポレーション仲介取り込み、パー
ティクルボンバードメント仲介送達またはマイクロインジェクションによって達
成する。いずれの場合も、形質転換した細胞を、当分野で既知の標準的方法を使
用して植物体に再生する。 殆どの単子葉植物種の形質転換は、現在ではルーチンとなった。好ましい方法
は、PEGまたはエレクトロポレーションを使用するプロトプラストへの直接的
遺伝子導入、カルス組織へのパーティクルボンバードメントおよびアグロバクテ
リウム仲介形質転換を含む。
の実施例は例示のみのために提供し、特に明示しない限り限定することを意図し
ていない。
知であり、Sambrook, et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY(1989) and T.J. Silhavy, M.L. Ber
man, and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbo
r Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1984) and by Ausubel, F.M. et al.,
Current Protocols in Molecular Biology, pub. by Greene Publishing Assoc.
and Wiley-Interscience(1987)に記載されている。
構築 プラスミドpLuc+(Promega)からのホタルルシフェラーゼ遺伝子の783
bpの「センス」配向断片を、pPH108プラスミDNAからオリゴヌクレオチ
ドプライマーds Luc1(5’−CGC GGA TCC TGG AAG
ACG CCA AAA ACA−3’、配列番号1;BamHI制限部位に
下線を付す)およびds Luc2(5’−CGG AAG CTT AGG
CTC GCC TAA TCG CAG TAT CCG GAA TG−3
’、配列番号2;HindIII制限部位に下線を付す)を使用して増幅する。
TurboPfu熱安定性DNAポリメラーゼ(Stratagene)を、50μl反応物
中で、製造者のプロトコールにしたがって、95℃/1分、55℃/1.5分、
72℃/2分の5サイクル、続いて95℃/1分、72℃/3.5分の25サイ
クルで使用する。同様の方法で、プラスミドpLuc+からのホタルルシフェラ
ーゼ遺伝子の737bp「アンチセンス」配向断片をpPH108プラスミドDN
Aから、オリゴヌクレオチドプライマーds Luc3(5’−CGG TCT
AGA GGA AGA CGC CAA AAA CAT A−3’、配列
番号3;XbaI制限部位に下線を付す)およびds Luc2(5’−CGG
AAG CTT AGG CTC GCC TAA TCG CAG TAT
CCG GAA TG−3’、配列番号2;HindIII制限部位に下線を
付す)を使用してPCRによって増幅する。得られたDNA断片を低融点アガロ
ース(FMC)から作成した1%トリスアセテートゲルによる電気泳動、続いて
PCR産物を含む切除したゲルスライスをフェノール−クロロホルム抽出により
精製する。標準的方法(制限酵素をNew England Biolabsから得た)にしたがって
、センス産物(ds Luc1/2)からのDNAをBamHIおよびHind
IIIで消化し、アンチセンス産物(ds Luc3/2)からのDNAを、X
baIおよびHindIIIで消化する。得られた粘着末端DNA断片を前記の
ようにゲル精製する。mas1’プロモーター(Velten et al. (19984)EMBO J.
3: 2723-2730)を含むDNA断片をプラスミドCSA104をEcoRIおよび
HincIIで消化し、564bp DNA断片を精製することによって得る。
この断片をBamHIで再消化し、mas1’プロモータを含む484bpのE
coRI−BamHIサブ断片を単離し、ゲル精製する。プラスミドpPH16
9を構築するために、クローニングベクターpLitmus29(New England B
iolabs)からのDNAを、EcoRIおよびXbaIで消化し、単離した断片を
T4 DNAリガーゼ(New England Biolabs)を使用して4通りの反応でmas
1’プロモーター EcoRI−BamHI断片並びにセンス(BamHI−H
indIII)およびアンチセンス(HindIII―XbaI)ds Luc
ルシフェラーゼ遺伝子断片にライゲートする。ds Luc1/2/3RNAデ
ュプレックス構築物でのアグロバクテリウム仲介植物形質転換のためのバイナリ
ーベクターpPH170を構築するために、バクテリア選択のためのカナマイシ
ン抵抗性遺伝子およびトランスジェニック植物選択のためのハイグロマイシン抵
抗性遺伝子を有するバイナリープラスミドpSGCHC1からのDNAを、Ec
oRIおよびXbaIで消化する。得られたpSGCHC1からの11.6kb
単離断片を4通りの反応でT4 DNAリガーゼ(New England Biolabs)を使用
してmas1’プロモーターEcoRI−BamHI断片並びにセンス(Bam
HI−HindIII)およびアンチセンス(HindIII−XbaI)ds
Lucルシフェラーゼ遺伝子断片にライゲートする。
にエレクトロポレーションによって導入し、形質転換されたコロニーを選択し、
増幅する。ルシフェラーゼを構成的に(UBQ3プロモーター(Norris et al.(1
993)PMB 21:895-906)/UBQ3+CaMV 35S5’UTR/luc+;p
PH108)または誘導可能に(アラビドプシスPR−1プロモーター/luc
+;pPH135、系統6E)発現しているアラビドプシス(Arabidopsis thali
ana)突然変異系統の4ないし5週齢の植物を、pPH170バイナリーT−DN
Aベクターを有するアグロバクテリウムコロニーで減圧浸潤する。形質転換した
植物を、ハイグロマイシンおよびカナマイシンで共選択し、制御されたファイト
トロン条件下でルシフェラーゼ活性の決定のために育成する。さらに、pPH1
35−6Eバックグラウンドのルシフェラーゼ活性をBTH(BTH処理はLawt
on et al. Plant J. 10: 71-82に詳細に記載されている)で誘導の48時間後に
評価する。ルシフェラーゼ活性を、ルシフェリン基質の添加に続く組織エキスト
ラクト中でのルミネッセンスに基づくアッセイを使用して定量する。ルシフェラ
ーゼ活性をCCD-cooledビデオイメージングシステム(Hamamatsu)を使用して植
物体でもモニターする。
に要するmyb様転写因子をコードする(Oppenheimer et al.(1991)Cell 67: 48
3-493)。発育の初期のGL1発現のノックアウトは、植物にトリコームの欠如を
もたらす。ノックアウト表現型は幼苗で容易に同定でき、致死ではない。構成的
発現のための3種のベクターおよびGal4CI調節された発現のための3種の
ベクターを構築する。それぞれのプロモーターを試験するための3種の異なるベ
クターは、GL1遺伝子断片のセンス(+)発現、アンチセンス(−)発現およ
びデュプレックス(+/−)RNA発現である。(+)および(−)ベクターは
、GL1の発現に及ぼす効果を比較するためのコントロールである。それぞれの
場合、GL1配列(GenBank Accession M79448)の塩基#739ないし#1781
からの5’断片をベクター構築のために使用する。
−SacI断片としてクローニングする。プラスミドpJG304をpBSSK
+から誘導する。プラスミドpBS SK+(Stratagene, LaJolla,CA)をSac
Iで線形化し、マングビーンヌクレアーゼで処理し、SacI部位を除去し、T
4リガーゼで再ライゲートし、pJG201を作成する。10XGAL4コンセ
ンサス結合部位/CaMV 35Sミニマルプロモーター/GUS遺伝子/Ca
MVターミネーターカセットをpAT71からKpnIで除去し、pJG201
のKpnI部位にクローニングし、pJG304を作成する。プラスミドpJG
304を制限エンドヌクレアーゼAsp718で一部消化し、全長線形断片を単
離する。この断片をモル過剰の22塩基のオリゴヌクレオチドJG−L(5’−
GTA CCT CGA G TC TAG ACT CGA G−3’、配列
番号4)とライゲートする。制限分析を使用して、GAL4 DNA結合部位の
5’にこのリンカーを挿入されたクローンであると同定し、このプラスミドをp
JG304DXhoIと命名する。 NcoIおよびSacI部位を、5’末端に適当な制限部位を有するPCRプ
ライマーを合成することによって(+)および(−)断片の末端に付加する。(
+/)GL1断片を2個の断片:5’末端にNcoI部位、3’末端にHind
III部位を有する(+)断片および5’末端にHindIII部位、3’末端
にSacI部位を有する(−)断片を最初に生成することによって生成する。デ
ュプレックスユニットを得られた断片にEcoRI部位でライゲートすることに
よって生成する。発現ユニットは、Gal4 DNA結合ドメイン、続いてミニ
マルTATA配列、および(+)、(−)または(+/−)配向であるGL1遺
伝子断片を含む。
ノピンシンターゼのmas1’プロモーターを使用する。前記のように、GL(
+)、(−)および(+/−)断片をpBluescriptの1’プロモーターの後方に
ライゲートする。3種類の異なる発現カセットをpCIB200にEcoRI/
SalI断片としてライゲートする(Uknes et al.(1993)Plant Cell 5:159-169)
。
る段階をコードしている。植物におけるその発現の調節の影響をセンスおよびア
ンチセンス構築物、並びに二本鎖RNA構築物を使用して試験する。 アンチセンス構築物:pJG304DXhoIベクターからの断片を含み、アン
チセンス配向のCGL遺伝子(ヌクレオチド#13−1159、Genbbank access
ion #L40511)の一部が挿入された、バイナリーBASTAベクターpJG261
を使用する。 センス構築物:CBL断片が反対配向である以外は、アンチセンス構築物と同様
である。この構築物はATG開始コドンおよび殆どのCBL ORFを含み、C
BL遺伝子の発現の制御および調節として働く。 二本鎖RNA構築物:センス配向のCBL遺伝子断片(#13−1159)を、
CBL遺伝子のアンチセンス配向バージョンの下流であってベクターpJG30
4−1のSalI部位に挿入する。約10bpのリンカーが2コピーのCBLの
間に存在する。
ータの後方であって適当な転写ターミネーターの上流の発現カセット中に最初に
組みたてる。植物発現カセットの構築に必要なすべては、本発明のDNA分子に
当てはまり、当分野で周知の技術を使用して実施する。
DNA分子の位置および時間的発現パターンを決定する。選択されたプロモータ
ーは、特異的な細胞型(例えば、葉表皮細胞、葉肉細胞、根皮層細胞)でまたは
特異的な組織または器官(例えば、根、葉または花)でDNA分子を発現させ、
その選択はそのDNA分子によってコードされたRNA断片の生合成の望ましい
位置に影響を及ぼす。あるいは、選択したプロモーターは、光誘導または他の時
間的に調節されたプロモーターの下でDNA分子の発現を駆動し得る。あるいは
選択されたプロモーターは、化学的に調節されるものである。これにより、望ま
しく、化学的インデューサーでの処理によって引き起こされるときのみDNA分
子の発現を誘導する可能性を提供される。 転写ターミネーター 種々の転写ターミネーターが発現カセット中での使用のために利用可能である
。これらは、転写の終結および好ましくは正確なポリアデニル化のために必要で
ある。適当な転写ターミネーターおよび植物中で機能すると知られているものは
、CaMV 35Sターミネーター、tmlターミネーター、ノパリンシンター
ゼターミネーター、エンドウrbcS E9ターミネーターを含む。これらは単
子葉および双子葉植物の両方で使用できる。
た。これらの配列を本発明のDNA分子と組み合わせて使用し、トランスジェニ
ック植物中でのその発現を増大させることができる。 種々のイントロン配列が特に単子葉植物細胞での発現を増強させることが示さ
れている。例えば、トウモロコシAdh1遺伝子のイントロンが、トウモロコシ
細胞に導入されたときそのコグネイトプロモーターの下で野生型遺伝子の発現を
有意に増強することが見出された。イントロン1は、特に有効であると見出され
、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子との融合構築物にお
いて発現を増強する(Callis et al., Genes Dvelop 1: 1183-1200(1987))。同じ
実験系で、トウモロコシbronze1遺伝子からのイントロンが発現の増強に
同様の効果を有する(Callis et al.,前掲)。イントロン配列は、日常的に植物形
質転換ベクターに、典型的には非翻訳リーダー内に組みこまれている。 ウイルス由来の多くの非翻訳リーダー配列が、発現を増強することが知られて
いる。これらは双子葉植物細胞で特に有効である。特に、タバコモザイクウイル
ス(TMV、「Ω配列」)、トウモロコシ退緑斑紋ウイルス(Maize Chlorotic Mottle
Virus(MCMV))、およびアルファルファモザイクウイルス(AMV)からのリー
ダー配列が、発現を増強するのに有効であると示されている(例えば、Gallie et
al., Nucl. Acids Res. 15: 8693-8711(1987); Skuzeski et al. Plant Molec.
Biol. 15; 65-79(1990))。
ーの調節の下での本発明のDNA分子の発現を含む。したがって、DNA分子を
、当分野で周知の方法によって任意の発現カセットに挿入する。これらの発現カ
セットは、後記の植物形質転換ベクターに容易に移入することができる。さらに
本発明は、DNA分子の発現のために要されまたは選択される任意のさらなる配
列と組み合わせて任意の発現可能プロモーターを使用することを含む。そのよう
な配列は、転写ターミネーター、発現を増強するための外来配列を含むがこれら
に限定されない(例えば、イントロン[例えば、Adhイントロン1]、ウイルス
性配列[例えばTMV−Ω])。
5に記載されている。pCGN1761は「ダブル」35Sプロモーターおよび
tml転写ターミネーターを含み、プロモーターおよびターミネーターの間に特
異的EcoRI部位を有しており、pUC−タイプバックボーンを有する。存在
するEcoRI部位に加えNotIおよびXhoI部位を含む修飾されたポリリ
ンカーを有するpCGN1761の誘導体を構築する。この誘導体をpCGN1
761ENXと命名する。pCGN1761ENXはトランスジェニック植物で
の35Sプロモーターの制御の下での発現のためのポリリンカー内のcDNA配
列または遺伝子配列(微生物ORF配列を含む)のクローニングに有用である。
そのような構築物の完全な35Sプロモーター−遺伝子配列−tmlターミネー
ターカセットを、プロモーターの5’側のHindIII、SphI、SalI
、およびXbaI部位で、ターミネーターの3’側のXbaI、BamHIおよ
びBglI部位で、形質転換ベクターへ送達するため切除することができる。さ
らにダブル35Sプロモーター断片を、HindIII、SphI、SalI、
XbaIまたはPstIでの5’切除、および任意のポリリンカー制限部位(E
coRI、NotIまたはXhoI)での3’切除によって、他のプロモーター
と置き換えるために除去することができる。 したがって、本発明のDNA分子を、pCGN1761ENXに、CaMV
35Sプロモーターの制御の下での構成的発現のために挿入することができる。
選択されたプロモーターで置換えることについて記載する。例証として化学的に
調節されるPR−1aプロモーターを記載する。選択されたプロモーターを好ま
しくはそのソースから制限酵素によって切除するが、あるいは適当な末端制限部
位を有するプライマーを使用してPCR−増幅することができる。もしPCR−
増幅を実施するならば、プロモーターは標的ベクター中の増幅されたプロモータ
ーのクローニングの後、増幅エラーを確認するために再配列決定するべきである
。化学的に調節可能なタバコPR−1aプロモーターをプラスミドpCIB10
04(EP0332104参照)から切断し、プラスミドpCGN1761EN
Xに送達する。pCIB1004をNcoIで切断し、得られた線状断片の3’
オーバーハングをT4 DNAポリメラーゼで処理することによって平滑末端化
する。次に、その断片をHindIIIによって切断し、得られたPR−1aプ
ロモーターを含む断片をゲル精製し、ダブル35Sプロモーターを除去されたp
CGN1761ENXにクローニングする。これを、XhoIで切断し、T4ポ
リメラーゼで平滑末端化し、続いてHindIIIで切断し、pCIB1004
プロモーター断片がクローニングされるべきより大きなベクターターミネーター
を含む断片を単離することによって実施する。これにより、PR−1aプロモー
ターおよびtmlターミネーター、並びに特有のEcoRIおよびNotI部位
を有する介在しているポリリンカーを有するpCGN1761ENX誘導体を作
成する。 本発明のDNA分子をこのベクターに挿入し、融合産物(すなわちプロモータ
ー−遺伝子−ターミネーター)をその後、本出願に記載されたものを含む任意の
選択された形質転換ベクターに送達する。そしてそのDNA分子の化学的に誘導
可能発現を実現する。
的に、構成的プロモーターとしてアクチンプロモーターを選択するのがよいと知
られている。特にイネAct1遺伝子からのプロモーターはクローニングされ、
特性が把握されている(McElroy et al.Plant Cell 2:163-171(1990))。そのプロ
モーターの1.3kbの断片は、イネプロトプラスト中の発現に要求されるすべ
ての調節エレメントを含んでいることが発見されている。さらにAct1プロモ
ーターに基づく多くの発現ベクターが、特に単子葉植物における使用のために構
築されてきた(McElroy et al.Mol.Gen.Genet.231:150-160(1991))。これらはA
ct−イントロン1、Adh1 5’フランキング配列、およびAdh1−イン
トロン1(トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子から)およびCaM
V 35Sプロモーターからの配列を含む。最高の発現を示すベクターは、35
SおよびAct1イントロンまたはAct1 5’フランキング配列およびAc
t1イントロンの融合物である。McElroy et al.(Mol.Gen.Genet.231:150-160(1
991))によって記載されたプロモーター発現カセットを、本発明のDNA分子の
発現のために容易に修飾することができ、単子葉植物宿主における使用に特に好
適である。例えばプロモーターを含む断片をMcElroyの構築物から取り外
して使用し、pCGN1761ENXにおけるダブル35Sプロモーターを置き
換えることができ、それは挿入または特定の遺伝子配列のために利用可能である
。こうして構築した融合遺伝子を、その後適当な形質転換ベクターに送達するこ
とができる。別の報告では、第1のイントロンを有するイネAct1プロモータ
ーが培養オオムギ細胞中で高度の発現をディレクトすることも発見された(Chibb
ar et al.Plant Cell Rep.12:506-509(1993))。 本発明のDNA分子をそのようなプロモーターの下流に挿入し、続いて、融合
産物(すなわちプロモーター-遺伝子−ターミネーター)を任意の選択された、本
明細書に記載されているものを含む、形質転換ベクターに送達する。
であり、そのプロモーターはいくつかの種からトランスジェニック植物における
使用のためにクローニングされてきた(例えばヒマワリ−Binet et al.Plant Sci
ence 79:87-94(1991)、トウモロコシ−Christensen et al.Plant Molec.Biol.12
:619-632(1989))。トウモロコシユビキチンプロモーターはトランスジェニック
単子葉系で開発されており、その配列および単子葉植物の形質転換のために構築
されたベクターは特許出願EP0342926に公開された。さらに、Taylor e
t al.(Plant Cell Rep.12:491-495(1993))はトウモロコシユビキチンプロモータ
ーおよび第1のイントロンを含むベクター(pAHC25)、およびマイクロプ
ロジェクタイルボンバードにより導入されたときの多くの単子葉植物の細胞懸濁
物中でのその高い活性について記載している。そのユビキチンプロモーターはト
ランスジェニック植物、特に単子葉植物中でのDNA分子の発現に特に好適であ
る。適当なベクターは、適当なユビキチンプロモーターおよび/またはイントロ
ン配列の導入によって修飾された、pAHC25の誘導体または本明細書中に記
載された任意の形質転換ベクターである。 したがって、本発明のDNA分子を任意のこれらのベクターに挿入し、融合産
物(すなわちプロモーター−遺伝子−ターミネーター)を植物の形質転換に使用
して、DNA分子を構成的に発現させる。
みでのヌクレオチド配列の発現は、葉および花組織並びに種子での発現を変化さ
せることなく、根のみで標的遺伝子の発現を変化させる利点がある。適当な根プ
ロモーターは、de Framond(FEBS 290:103-106(1991))によって、また公開された
特許出願EP0452269において記載されたようなものである。このプロモ
ーターをpCGN1761ENXのような適当なベクターに送達し、DNA分子
をそのようなベクターに挿入する。その完全なプロモーター−遺伝子−ターミネ
ーターカセットをその後、所望の形質転換ベクターへ送達する。
.22:573-588(1993)、Logemann et al.Plant Cell 1:151-158(1989)。Rohrmeier&
Lehle,Plant Molec.Biol.22:783-792(1993)、Firek et al.Plant Molec.Biol.22
:129-142(1993)、Warner et al.Plant J.3:191-201(1993))、すべて本発明での
使用に好適である。Logemann et al.(前掲)は双子葉植物ジャガイモwun1遺
伝子の5’上流配列を記載している。Xu et al.(前掲)は双子葉植物ジャガイモ
(pin2)からの傷誘導可能プロモーターは単子葉植物イネでも活性があるこ
とを記載している。さらにRohrmeier&Lehle(前掲)は傷に誘導され、標準的な技
術を使用してコグネイトプロモーターを単離するのに使用可能であるトウモロコ
シWip1 cDNAのクローニングを記載している。同様にFirek et al.(前掲)およ
びWarner(前掲)は、局部的傷および病原体侵入部位で発現される、単子葉植物As
paragus officinalisからの傷誘導可能遺伝子を記載している。当技術分野で周
知のクローニング技術を使用して、これらのプロモーターを適当なベクターに送
達し、本発明のDNA分子と融合し、これらの遺伝子を害虫感染の部位で発現さ
せるために使用することができる。
コシtrpA遺伝子の単離を記載している。標準的な分子生物学的な技術を使用
して、このプロモーターまたはその一部を、pCGN1761のようなベクター
に送達することができ、35Sプロモーターを置き換え、髄に好ましいように本
発明のDNA分子の発現を駆動するために使用することができる。実際、髄に好
ましいプロモーターまたはその一部を含む断片を任意のベクターに送達し、トラ
ンスジェニック植物における便宜のために修飾する。DNA分子の髄に好ましい
発現を、そのようなベクター中のDNA分子に挿入することによって達成する。
ルシウム依存性タンパク質キナーゼ(CDPK)遺伝子の単離をさらに記載して
いる。その遺伝子配列およびプロモーターは転写開始から1400bpにわたる
。標準的な分子生物学的技術を使用して、プロモーターまたはその一部を、pC
GN1761のようなベクターに送達し、35Sプロモーターを置き換え、花粉
特異的な方法で本発明のDNA分子の発現を駆動するために使用する。実際、花
粉特異的プロモーターまたはその一部を含む断片を任意のベクターに送達し、ト
ランスジェニック植物における便宜のために修飾することができる。 葉特異的発現 ホスホエノールカルボキシラーゼ(PEPC)をコードしているトウモロコシ
遺伝子が、Hudspeth&Grula(Plant Molec Biol 12:579-589(1989))によって記載
された。標準的な分子生物学的な技術を使用して、この遺伝子のためのプロモー
ターを使用し、トランスジェニック植物における葉特異的方法で、本発明のDN
A分子の発現を駆動する。
子を前述の任意の発現カセットに挿入し、適当な条件の下で望まれる細胞中でD
NA分子を発現させることができる。ヌクレオチド配列を含む発現カセットを、
任意の後記の適当な形質転換ベクターに組み込む。使用のためのベクターの選択
は、好ましい形質転換技術および形質転換のための標的種による。ある標的種で
は、種々の抗生物質または除草剤選択マーカーが好ましい。形質転換にルーチン
的に使用される選択マーカーは、カナマイシンおよび関連する抗生物質に対する
抵抗性を付与するnptII遺伝子(Messing & Vieria, Gene 19:259-268(1982)
;Bevan et al.,Nature 304:183-187(1983))、除草剤ホスヒノトリシンに対する
抵抗性を付与するbar遺伝子(White et al.,Nucl Acids Res 18:1062(1990)、
Spencer et al.Theor Appl Genet 79:625-631(1990))、抗生物質ハイグロマイシ
ンに対する抵抗性を付与するhph遺伝子(Blochiger&Diggelmann,Mol Cell Bio
l 4:2929-2931)、およびメタトレキセート(methatrexate)に対する抵抗性を付与
するdhfr遺伝子(Bourouis and Jarry.,EMBO J.2(7):1099-1104(1983))を含
む。
用可能である。典型的にはこれらは少なくとも1個のT−DNAボーダー配列を
有し、pBIN19(Bevan,Nucl.Acids Res.(1984))およびpVictor H
INK(配列番号5)のようなベクターを含む。以下に2種の典型的なベクター
の構築を記載する。 pCIB200およびpCIB2001の構築 バイナリーベクターpCIB200およびpCIB2001をアグロバクテリ
ウムでの使用のための組換えベクターの構築に使用し、以下のような方法で構築
する。pTJS75kanを、pTJS75(Schmidhauser&Helinski,J Bacteri
ol.164:446-455(1985))をNarIによって消化し、テトラサイクリン抵抗性遺
伝子を切除し、続いてNPTIIを有するpUC4KからのAccI断片を挿入
して作成する(Messing & Vieira, Gene 19:259-268(1982);Bevan et al.,Nature
304:184-187(1983);McBride et al.,Plant Molecular Biology 14:266-276(199
0))。XhoIリンカーを、レフトおよびライトT-DNAボーダー、植物選択可
能nos/nptIIキメラ遺伝子およびpUCポリリンカーを含むpCIB7
(Rothstein et al.,Gene 53:153-161(1987))のEcoRV断片にライゲートし、
XhoI−消化された断片をSalI−消化されたpTJS75kanにクロー
ニングし、pCIB200を作成する(EP0332104参照)。pCIB2
00は以下の特有なポリリンカー制限部位:EcoRI、SstI、KpnI、
BglII、XbaI、およびSalIを含む。pCIB2001はさらなる制
限部位のポリリンカーへの挿入により作成されたpCIB200の誘導体である
。pCIB2001のポリリンカーにおける特有の制限部位は、EcoRI、S
stI、KpnI、BglII、XbaI、SalI、MluI、BcII、A
vrII、ApaI、HpaI、およびStuIである。pCIB2001は、
これらの特有の制限部位を含むことに加えて、植物およびバクテリアのカナマイ
シン選択、アグロバクテリウム−仲介形質転換のためのレフトおよびライトT−
DNAボーダー、RK2由来のE.coliおよび他の宿主間の移動のためのt
rfA機能、並びにRK2からのOriTおよびOriV機能を有する。pCI
B2001ポリリンカーはこれらの自身の調節シグナルを含む植物発現カセット
のクローニングに適当である。本発明のDNA分子を含む前記した植物発現カセ
ットのいずれかを、pCIB2001に好ましくはポリリンカーを使用して挿入
する。
をコードしている遺伝子、T−DNAライトおよびレフトボーダー配列を含んで
おり、広宿主−範囲プラスミドpRK252からの配列を組み入れており、E.
coliおよびアグロバクテリウム双方で複製することが可能である。その構築
はRothstein et al.(Gene53:153-161(1987))によって記載されている。Gritz et
al.(Gene25:179-188(1983))によって記載されたハイグロマイシンBホスホトラ
ンスフェラーゼの遺伝子を組み入れている種々のpCIB10の誘導体が構築さ
れてきた。これらの誘導体によってハイグロマイシンのみ(pCIB743)、
またはハイグロマイシンおよびカナマイシン(pCIB715、pCIB717
)によるトランスジェニック植物細胞の選択が可能となる。このベクターを使用
して本発明のDNA分子を含む発現カセットを形質転換する。
れた形質転換ベクターにおけるT−DNA配列の必要性が回避され、結果的にこ
れらの配列を欠いたベクターを、T−DNA配列を含む前述のもののようなベク
ターに加えて利用することができる。アグロバクテリウムによらない形質転換技
術は、パーティクルボンバードメント、プロトプラスト取り込み(例えばPEG
およびエレクトロポレーション)、マイクロインジェクションまたは花粉形質転
換(米国特許5629183)による形質転換を含む。ベクターの選択について
は、多くは形質転換される種にとって好ましいように選択する。以下にある典型
的なベクターの構築を記載する。
組み合わされた直接的遺伝子導入法に適当なpUC−由来ベクターである。プラ
スミドpCIB246はE.coli GUS遺伝子に実施可能なように融合し
たCaMV 35SプロモーターおよびCaMV 35S転写ターミネーターを
含み、公開されたPCT出願WO93/07278に記載されている。このベク
ターの35Sプロモーターは、開始部位の5’位に2個のATG配列を含む。こ
れらの部位を、標準的PCR法を使用して変異させ、ATGを除去し、制限部位
SspIおよびPvuIIを作成する。新しい制限部位は特有のSalI部位か
ら96および37bp離れており、真の開始部位から101および42bp離れ
ている。得られたpCIB246の誘導体をpCIB3025と命名する。そし
てpCIB3025からSalIおよびSacIでの消化によってGUS遺伝子
を切除し、平滑末端化してライゲートし、プラスミドpCIB3060を作成す
る。プラスミドpJIT82をJohn Innes Centre,Norwichより入手し、Strepto
myces viridochromogenesからのbar遺伝子を含む400bpのSmaI断片
を切除し、pCIB3060(Thompson et al.EMBO J 6:2519-2523(1987))のH
paI部位に挿入する。この作成したpCIB3064は、CaMV 35Sプ
ロモーターおよびターミネーターの制御の下での除草剤選択のためのbar遺伝
子、アンピシリン抵抗性の遺伝子(E.coliにおける選択のため)および特有の部位
SphI、PstI、HindIII、およびBamHIを有するポリリンカー
を含む。このベクターは本発明のDNA分子の発現をディレクトするそれ自身の
調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングに適当である。
してE.coli遺伝子ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHER)を利用する形質転換ベ
クターである。PCRを使用して、35Sプロモーター(〜800bp)、トウ
モロコシAdh遺伝子からのイントロン6(〜550bp)およびpSOG10
からの18bpのGUS非翻訳リーダー配列を増幅する。E.coliジヒドロ葉酸レ
ダクターゼタイプII遺伝子をコードしている250bpの断片をPCRによっ
て増幅し、これらの2種のPCR断片を、pUC19ベクターバックボーンおよ
びノパリンシンターゼターミネーターを含むpBI221(Clontech)からのSa
cI-PstI断片と構築する。これらの断片の構築によって、イントロン6配列
、GUSリーダー、DHFR遺伝子およびノパリンシンターゼターミネーターと
融合された35Sプロモーターを含むpSOG19を作成する。pSOG19の
GUSリーダーを、トウモロコシ退録斑紋ウイルス(MCMV)からのリーダー
配列と置換してベクターpSOG35を作成する。pSOG19およびpSOG
35はアンピシリン抵抗性のpUC遺伝子を有しており、外来配列、特に本発明
のDNA分子のクローニングに利用可能なHindIII、SphI、PstI
およびEcoRI部位を有する。
pPH143(WO97/32011、実施例36)を使用する。DNA分子を
、pPH143に挿入し、それによってPROTOXコード配列を置換する。次
にこのベクターを色素体形質転換およびスペクチノマイシン抵抗性についての形
質転換体の選択のために使用する。あるいは、DNA分子をpPH143に挿入
し、aadH遺伝子を置換する。この場合、形質転換体を、PROTOX阻害剤
に対する抵抗性について選択する。 葉緑体形質転換 タバコNicotiana tawbacum c.v.「Xanthi nc」の種子をプレート当たり7粒、
1''の環状に並べてTアガー培地上に発芽させる。播種12−14日後に、詳細
に記載されたプラスミドpPH143およびpPH145(Svab, Z. and Maliga
, P.(1993)PNAS 90, 913-917)からのDNAでコートした1μmタングステン粒
子(M10, Biorad, Hercules, CA)でボンバードする。ボンバードした苗を、T培
地上で2日インキュベートし、その後葉を切除し、背軸側を上にして明光(35
0−500μmol光量子/m2/s)中で、500μg/mlスペクチノマイ
シンジヒドロクロリド(Sigma, St. Louis,MO)を含むPMOP培地(Svab, Z., Ha
jdukiewicz, P. and Maliga, P.(1990)PNAS 87, 8526-8530)のプレート上に置く
。ボンバードメントの3ないし8週間後に下方に白化した葉を示す抵抗性シュー
トを、同じ選択培地上にサブクローニングしカルスを形成させ、二次的シュート
を単離しサブクローニングする。独立したサブクローンにおける形質転換した色
素体ゲノムコピーの完全な分離(ホモプラスミシティ)を、サザンブロッティン
グの標準的な方法によって評価した(Sambrook et al.,(1989)Molecular Cloning
: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor)
。BamHI/EcoRI消化した総細胞DNA(Mettler, I. J. (1987)Plant
Mol Biol Reporter 5, 346-349)を、1%トリスボレート(TBE)アガロースゲ
ル上で分離し、ナイロン膜(Amersham)に移し、rps7/12色素体ターゲッテ
ィング配列の一部を含むpC8からの0.7kb BamHI/HindIII
DNA断片に対応する、32P標識したランダムプライマーDNA配列で探索
した。ホモプラスミックなシュートをスペクチノマイシン含有MS/IBA培地
(McBride, K. E. et al.(1994)PNAS 91, 7301-7305)上で無菌的に発根させ、グ
リーンハウスに移す。
パク質遺伝子についてのセンスおよびアンチセンスデュプレックスRNA断片を
コードするキメラ遺伝子カセットの構築 ビート西部萎黄病ウイルス(BWYV)(いわゆるウイルスイエロー)コートタ
ンパク質(CP)遺伝子の0.6Kbの「センス」配向断片をプライマーHiNK
025bis(5’−CAA TTA CCA TGG ACA CGG TC
G TGG−3’、配列番号6;NcoI制限部位に下線を付す)およびHiN
K226(5’−GCC AAA TGT TTG AAC GCT GCA G CC TAT TTG−3’、配列番号7;PstI制限部位に下線を付す)
を使用してプラスミドpZU046から増幅する。あるいは、断片をプラスミド
pBW17(Veidt et al, Nucleic Acids Research 16: 9917-9932, 1988; acce
ssion number X13063)から、プライマーHiNK025bis2(5’− AA
T CGT CCA TGG ATA CGG TCG TGG−3’、配列番
号8;ヌクレオチド3475ないし3498、NcoI制限部位に下線を付す)
およびHiNK226bis(5’−CTA GGG CCG GGT TCC
TCT GCA GCC TAT TTG−3’配列番号9、ヌクレオチド4
114ないし4085、PstI制限部位に下線を付す)を使用して増幅する。
TaqDNAポリメラーゼ(Life Technologies)を、製造者の規定にしたがって
25μl反応中で使用し、30サイクルの94℃/30秒、55℃/30秒、7
2℃/90秒(+2秒/サイクル)を適用する。得られたPCR断片を、Seakem
GTG アガロース(FMC)から作成した1%トリスアセテートゲルでの電気泳動、続
いてPCR産物を含むゲルスライスからQIAquickゲルエキストラクショ
ンキット(QIAGEN)での抽出によって精製する。その後、標準的方法にしたがって
NcoIおよびPstI(すべての制限酵素は、Life Technologiesから入手)
で消化し、再びゲル精製した。精製した断片を、RolCプロモーターおよびN
osターミネーターの間にT4 DNAリガーゼ(Life Technologies)を使用し
てライゲートする。得られたクローンをpHiNK138と命名する。
、プラスミドpZU174AからプライマーHiNK251(5’― CTC
CCA GGT TGA GAC TGC CCT GCA GTG CCC
A―3’、配列番号10;PstI制限部位に下線を付す)およびHiNK22
8(5’―TTA CCA TGC ATA CGG TCG TGG GTA
GG―3’、配列番号11;NsiI制限部位に下線を付する)を使用して、
あるいは、プラスミドpBW17からプライマーHiNK251(ヌクレオチド
4844ないし4814)およびHiNK228bis(5’−CGT TAA TGC AT A CGG TCG TGG GTA GG−3’、配列番号1
2;ヌクレオチド3478ないし3503、NsiI制限部位に下線を付す)を
使用して増幅する。ゲル精製して、PCR産物をNsiIおよびPstIで消化
する。4.9Kb プラスミドpHiNK138をPstIで線形化し、熱感受
性アルカリフォスファターゼ(Life Technologies)を使用して脱リン酸化する。
ベクターおよびPCR断片をゲル精製し、続いてpHiNK138にPCR断片
を双方向ライゲーションする。CP遺伝子(配列番号13)についてのデュプレ
ックスRNAを生ずる配向を制限部位分析によって決定し、それは、逆方向の繰
り返しがCP遺伝子の下流のBWYVゲノムに由来する0.7Kbスペーサー配
列(ORF6という)によって分離されている0.6Kb CP遺伝子からなる
pHiNK152を生じた。スペーサー配列はアンチセンス配向である。最終的
に、当該遺伝子カセットを、選択マーカー遺伝子としてホスホマンノースイソメ
ラーゼを有する特許のバイナリーベクターpVictorHiNK(WO 94/20627
)に送達し、pHiNK179を得る。
、BNYVVからのレプリカーゼ遺伝子についてのセンスおよびアンチセンス(
デュプレックス)RNA断片をコードするキメラ遺伝子カセットの構築 総RNAをビートえそ性葉脈黄化ウイルス(BNYVV)フロウイルスに感染
したシュガービート根から、QIAGENのRNAeasy Plantミニキットを使用して抽出
する。BNYVVレプリカーゼ遺伝子(RNA1)の3’末端を増幅するために
、RNAを、Superscript(商標)II RNAse H-Reverse Transcriptase(RT)(Life
Technologies)および逆プライマーHiNK285(5’−TCG TAG A
AG AG A ATT CAC CCA AAC TAT CC−3’、配列
番号14)を使用して逆転写し、cDNAを生成する。プライマーHiNK28
5は、BNYVV RNA1配列(accession number D00115)のヌクレオチド6
378および6405の間に位置し、EcoRI部位を導入するよう設計されて
いる。次に、RT反応を使用して2種類のPCR反応のためのテンプレートとし
て使用する: BamHI部位を導入するよう設計されたBNYVV RNA1のヌクレオチド
5168bpおよび5178bpの間に位置するプライマーHiNK283(5
’―AAG AAT TGC AGG ATC CAC AGG CTC GG
T AC―3’配列番号15)、およびEcoRI部位を導入するよう設計され
たBNYVV RNA1のヌクレオチド5597および5620の間に位置する
プライマーHiNK284(5’−TTC CAA CGA ATT CGG
TCT CAG AC A―3’、配列番号16)を使用する反応A。 プライマーHiNK283をプライマーHiNK285と組み合わせて使用する
反応B。両者は前記した。
るヌクレオチド5168−5620の間にBNYVV RNA1配列を有する。
将来のスペーサー配列は、プライマーHiNK283およびHiNK285で得
られるRT−PCR産物に存在するBNYVV RNA1のヌクレオチド562
1−6405bpに対応する。 TaqDNAポリメラーゼ(Life Technologies)を製造者の規定にしたがって
25μl反応中で使用し、94℃/30秒、55℃/30秒、72℃/90秒(
+2秒/サイクル)の30サイクルを適用する。得られたRT−PCR産物を、
Seakem GTG アガロース(FMC)から作成した1%トリスアセテートゲルによ
る電気泳動、続いてQIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)による増幅産物を含
むゲルスライスの抽出によって精製する。ゲル精製の後、RT−PCR産物を制
限酵素BamHIおよびEcoRI(life Technologies)によって標準的方法に
したがって消化し、前記のように精製する。 最終的に、RT−PCR産物をアラビドプシスユビキチン3(Ubo3int)プロモ
ーターおよびNosターミネーターの間にT4 DNAリガーゼ(Life Technolo
gies)を使用する3段階のライゲーション反応によってクローニングする。2種
類の得られたクローンを、pHiNK181(アンチセンス配向のスペーサー、
配列番号17参照)およpHiNK184(センス配向のスペーサー、配列番号
18参照)と称する。
ーを構築するために、選択マーカーとしてホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子
を有するバイナリーベクターpVictorHiNK(WO 94/20627)、並びにプ
ラスミドpHiNK181およびpHiNK184からのDNAを、AscIお
よびPacI(New England Biolabs)によって消化し、ベクターおよび挿入断片
を前記のように電気泳動で精製する。得られた7.7kb pVictorHi
NKベクター断片を、T4 DNAリガーゼ(Life Technologies)を使用して、
BNYVVレプリカーゼ遺伝子のデュプレックスRNAをコードしている遺伝子
カセットにライゲートし、それぞれpHiNK187(アンチセンススペーサー
)およびpHiNK188(センススペーサー)を得る。
り、外植体型、アグロバクテリウム株、または使用される選択マーカーおよび再
生系によって変化してもよい。ここで以下のプロトコールには、外植体のソース
として子葉、選択マーカー遺伝子としてマンノース−6−フォスフェートイソメ
ラーゼを使用するシュガービートのアグロバクテリウム仲介形質転換を記載する
(Joersbo et al, Molecular Breeding 4: 111-117, 1998)。表面殺菌したシュガ
ービート種子をウォーターアガー上に弱光下で約12℃の温度で発芽させる。十
分に展開した子葉を、節領域のすぐ下方で横断的に切断することによって苗から
切除し、両方の子葉をやさしく引っ張り切裂く。子葉外植体を、20g/lスク
ロース、0.25mg/l BA、0.05mg/l NAA、500μM ア
セトシリンゴンを補足したMS培地pH5.2に希釈した適当な形質転換ベクタ
ーを有するアグロバクテリウム株EHA101の最適密度(OD600)0.1
ないし0.3に希釈した懸濁液に子葉を浸すことによって接種する。インキュベ
ーションの5分後、外植体をアグロバクテリウム懸濁液から移動し、無菌濾紙に
浸し、接種懸濁液の接触を除去し、共培養プレート上に移す。共培養プレートは
、30g/l スクロース、200μM アセトシリンゴンを含み、4.7g/
l アガロースで固めた1/10MS培地pH5.7を含み、固めた培地の上に
1.5ml TXD培地(PGOビタミン、0.005mg/l カイネチン、
4mg/l CPA(p−クロロフェノキシ酢酸)、30g/l スクロースで
補足したMS塩、pH5.7)で湿らせた濾紙で覆ったペトリ皿からなる。外植
体を弱光下21℃で4日間共培養し、次に20g/l スクロース、1.25g
/l マンノース、0.25mg/l BA、0.05mg/l NAA、50
0mg/l カルベニシリンで補足し9g/l アガーで固めたMS培地pH5
.9からなる選択再生培地に移す。3週間ごとに、外植体を次第にマンノースの
濃度を最大15g/lまで増加させる新しい培地に継代培養する。21℃の12
週間の選択および再生の後、再生したシュートを収穫し、発根させ、Feramisco
and co-workers(Feramisco et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. 55: 636-641
. 1973)に記載された共役酵素反応に本質的にしたがってPMI活性を分析する
。陽性の植物を土でポット植えして、最終的にグリーンハウスに移す。
するPolymyxa betaeが蔓延している土壌に移植する前に、最初に約4週間の期間
、根系を十分に発達させる。蔓延した土壌をドイツのrhizomania汚染圃場から収
集する。抵抗性検定の間、植物を12cmポットで約21℃、16時間明期で成
長させる。蔓延した土壌への移植の4週間後、植物を土壌から抜き取り、根系の
底半分を固着した泥から水洗して除去する。0.5gの根組織の無作為サンプル
からの液汁を、Pollaehne pressの方法で収集し、2% PVPおよび0.2%
卵白アルブミンで補足したリン酸バッファー塩水pH7.2からなる10ml
の抽出バッファーに添加する。サンプル中の存在ウイルスの量を、BNYVVの
ためのトリプル抗体サンドイッチ(TAS)ELISA(Adgen Ltd, Scotland,
UKから入手可能、供給者の指示に本質的に従う)で決定する。標準曲線を各プレ
ートについて作成し、根サンプルのウイルス含量を測定した吸光値から算出する
。非形質転換感受性シュガービート植物を否定的なコントロールとして使用し、
自然のrhizomania抵抗性のためのC28遺伝子を有する植物を肯定的なコントロ
ールとする。表1は、プラスミドpHINK188で得られた形質転換事象の結果の
要約である。
)およびパパイヤリングスポットポティウイルス(PRSV)抵抗性のための植
物形質転換ベクターの構築: NOSターミネーター(Beven, M., et al, 1983 Nucleic Acids Res. 11(2),
369-385)を260bp HindIII/PistI断片としてHindIII
/PstIで消化してプラスミドpZO1560にクローニングする。PZO1
560は、多数のクローニング部位より有用なものと置換されたpUC由来プラ
スミドである。NOSターミネーターの挿入の後、新しい構築物をpZU553
と命名する。 1728bp Ubi3プロモーター/イントロン断片(Callis, J., et al,
(1995 Genetics 139(2), 921-939)をBamHIで消化、次にT4 DNAポリ
メラーゼ処理およびKpnI消化によって単離する。この断片をpZU553に
クローニングし、SmaIで消化する。新しい構築物をpZU615と命名する
。
ラーゼを使用するPCRによって最初に増幅し、得られたPCR断片をpBluescr
ipt SK+にクローニングする。513bpアクチン2イントロンL(リーダー
イントロン)断片を増幅するために、2種のプライマーをAn et al, The Plant
Journal: 10: 107-121, 1996からの配列に基づいて設計する。5’プライマー(
ZUP1563:5’−GGGCGGATCCGCTAGCCCGCGGCCG
CTCTTTCTTTCCAAGG−3’、配列番号19)は5’スプライシン
グ部位の上流に直接アニーリングし、BamHI、NheIおよびSacII制
限部位を増幅されるべきアクチン2イントロンL断片の5’末端に付加する。3
’プライマー(ZUP1564:5’―CCCGCCATGGGTCGACGC
CATTTTTTATGAGCTGC―3’、配列番号20)は3’スプライシ
ング部位の下流に直接アニーリングし、SalIおよびNcoI制限部位を増幅
されるべきアクチン2イントロンL断片の3’末端に付加する。PCR断片をZ
UP1563および1564によって増幅し、pBluescriptのEco
RV部位にクローニングする。新しいプラスミドをpZU611と命名する。プ
ラスミドpZU615にAct2イントロンLを供給するために、499bp
BamH/NcoI Act2イントロンL断片をpZU611から単離し、B
amHIおよびNcoIで消化したpZU615のUbi3プロモーター/イン
トロンの下流およびNOSターミネーターの上流にクローニングする。新しい構
築物をpZU616と命名する。この断片の挿入は、同時に、次の3段階のクロ
ーニングのためのさらなる制限部位をカセットに提供する。
2).Journal of General Virology 73, 2531-2541)を増幅するために、二種のプ
ライマーをShyi-Dong Yehからのフランスの圃場の分離株の配列に基づいて設計
する。5’プライマー(ZUP1565:5’―CCCGCCATGGGATC
CGATGATTTCTACCGAGAATTAAGGG―3’、配列番号21
)はPRSV CPの開始コドンの285bp下流にアニーリングし、非翻訳P
RSV CP断片の5’末端にNcoIおよびBamHI制限部位を付加する。
3’プライマー(ZUP1566:5’―GGGCGCTAGCCTAATGC
TTATATAGTACC―3’、配列番号22)は、PRSV CPの停止コ
ドンの55bp下流にアニーリングし、非翻訳PRSV CP断片の3’末端に
NheI制限部位を付加する。増幅したPCR断片を、pBluescript
のEcoRV部位にクローニングし、新しいプラスミドをpZU612と命名す
る。
73-277)を増幅するために、2種のプライマーをGal-On, A.からのフランス圃場
分離株の配列に基づいて設計する。5’プライマー(ZUP1567:5’―G
GGCGCTAGCCTTGCTGGAGTATAAGCCGG―3’、配列番
号23)はZYMV CPの開始コドンの253bp下流にアニーリングし、Z
YMV CP非翻訳断片の5’末端にNheI制限部位を含む。3’プライマー
(ZUP1568:5’―GGGCGTCGACCGCGGGCTTTAAAG
GTGGGAGGCCC―3’、配列番号24)は、ZYMV CP停止コドン
の89bp下流にアニーリングし、非翻訳ZYMV CP断片の3’末端にSa
cIIおよびSalI制限部位を含む。増幅したPCR断片をpBluescr
iptのEcoRV部位にクローニングする。新しいプラスミドをpZU613
と命名する。ZYMV CP非翻訳断片を次に、pZU616にUbi3プロモ
ーター/イントロンの下流でAct2イントロンLの上流にクローニングする。
この目的のために、719bp NheI/SaclI ZYMV CP非翻訳
断片をpZU613から単離し、pZU616のNheIおよびSaclI部位
にクローニングする。この構築物をpZU617と命名する。次に、PRSV
CP非翻訳断片をpZU617にUbi3プロモーター/イントロンの下流でZ
YMV CP非翻訳断片の上流にクローニングする。この目的のために720b
p BamHI/NheI pRSV CP非翻訳断片をpZU612から単離
し、pZU617のBamHIおよびNheI部位にクローニングする。この新
しい構築物をpZU618と命名する。
V CP非翻訳断片および同じ配向でその下流にZYMV CP非翻訳断片を含
む。対応する断片をテンプレートとしてpZU618からPfx PCR並びに
プライマーZUP1565およびZUP1568を使用して増幅する。このPC
R断片をpBluescript SK+のEcoRV部位にクローニングし、
得られたプラスミドをpZU619と命名する。 逆方向反復遺伝子カセットを構築するためにPRSV CP(nt)/ZYM
V CP(nt)断片を、pZU618プラスミドにすでに存在するPRSV
CP(nt)/ZYMV CP(nt)断片と逆方向にpZU618に挿入する
。この目的のために1445bp SalI/NcoI PRSV CP(nt
)/ZYMV CP(nt)断片をpZU619から単離し、SalIおよびN
coIで消化したpZU618にAct2イントロンLの下流でNOSターミネ
ーターの上流にクローニングする。得られたプラスミドをpZU622と命名す
る。当該カセットをバイナリーベクターpZU547、SMASプロモーター/
PMI/NOSターミネーター選択カセットをさらに含むプラスミドpVict
orHinkに由来するバイナリーベクターに挿入する。この末端に逆方向反復
遺伝子カセットを含む5414bp AscI/PacI DNA断片をpZU
622から単離し、pZU547のAscIおよびPacI部位にタンデム配向
で選択カセットの上流にクローニングする。最終的な構築物をpZU623(配
列番号25)と命名する。
転換ベクターの構築 R.A.A. van der Vlugtの論文「Engineering resistance against potato viru
s Y」(1993)に公開されたPVYn(PVYのフランス圃場分離株)の配列に基
づいて、2種のプライマー(ZUP1598:5’―CATGCCATGGAT
CCAATGGCCACGAATTAAAGCTATCACGTC―3’、配列
番号26、およびZUP1590:5’― ACGCGTCGACCGCGGA
TTCAAACGATTATTAATTACGATAAAAG―3’、配列番号
27)を使用して、標準的PCRによって、Life TechnologiesからのPlatinum
Pfx DNAポリメラーゼを使用して、コートタンパク質シストロン配列および99
ヌクレオチドの3’末端非翻訳領域を含む804bp断片を増幅する。増幅した
PCR断片を平滑末端断片としてpBluescript SK+のEcoRV
部位にクローニングし、pZUAと命名する。増幅したPVY特異的挿入物をB
amHI/SaclI断片として切除し、pZU616のBamHI/Sacl
I部位にクローニングし(実施例10参照)、pZUBを得る。PZUBおよび
pZUCの両方をNcoIおよびSalIで消化する。pZUAからのPVY特
異的断片をアガロースゲルから精製し、NcoIおよびSalIで消化したpZ
UBにライゲートし、以下のエレメントを含むpZUCを得る: イントロンを有するUBI3プロモーター、続いてBamHI/SacII断片
トしてのセンス配向のPVY PCR産物、続いてSacII/SalI AC
T2イントロン、続いてSaII/NcoI断片としてのアンチセンス配向のP
VY PCR産物、さらに最後にNcoI/HindIII断片としてのnos
ターミネーター。最終的にpZUCを、pHiNK085バイナリーベクター由
来のSMASプロモーター/PMI/NOSターミネーター選択カセットを含む
バイナリーベクターpZU547にクローニングする。最終的な構築物をpZU
634(配列番号28)と命名する。
その方法を、例えば、使用するアグロバクテリウム株の相違、外植体材料の起源
の相違、再生系の相違、および形質転換されるべき植物種の品種の相違によって
変える。前記実施例10および11のバイナリー植物形質転換ベクターを、後記
手段にしたがって形質転換実験に使用する。バイナリーベクターをエレクトロポ
レーションによってアグロバクテリウムツメファシエンスに送達し、続いて植物
外植体材料と形質転換したアグロバクテリウム株を接種、共培養し、適当な抗生
物質を使用してアグロバクテリウム株を選択的に殺し、マンノースを含む選択培
地上で成長させることによって形質転換した細胞を選択し、組織をシュート誘導
培地に移し、発根誘導培地に選択したシュートを移し、小植物体を土に移す。前
記実施例10および11の遺伝子カセットの存在を確認するために、トランスジ
ェニック植物からの全DNAを周知のサザンブロッティング分析法を使用して分
析する。
植物のスクリーニング 病原体に感染しないように、形質転換した植物をグリーンハウスで標準的隔離
条件で成長させる。最初の形質転換体を自殖させ、種子を収穫する。 最初の形質転換体のS1後代の100植物を、挿入した遺伝子の分離について
分析し、次に機械的接種によってZYMVで感染させる。ZYMVで全体に感染
した宿主植物からの組織を、5体積の氷温接種バッファー(10mMリン酸バッ
ファー)中で磨砕し、カーボランダム粉末とともに1週齢の苗の子葉および第1
葉上にこすりつける。接種した植物を接種後3週間の間、症状の発生をモニター
する。ZYMV配列を有する植物は、ZYMV感染に対する感受性が減少し、こ
れに対して非形質転換コントロール植物は、接種後7日以内に重度の全身性ZY
MV感染を示す。ZYMV耐性植物を自殖し、種子を収穫する。トランスジェニ
ックZYMV抵抗性植物を、前記の方法にしたがってPRSVで機械的に接種す
る。ZYMVにすでに抵抗性の植物は、PRSV感染に対しても感受性が減少し
ており、これに対して非形質転換コントロール植物は、接種後7日以内に重度の
全身性PRSV症状を示す。
リーンハウス内で成長させる。最初の形質転換体を自殖させ種子を収穫する。 最初の形質転換体のS1後代の50植物を、挿入した遺伝子の分離について分
析し、次に機械的接種によってPVYで感染させる。PVYで全身的に感染した
宿主植物からの組織を、5体積の氷温接種バッファー(10mMリン酸バッファ
ー)中で磨砕し、カーボランダム粉末とともに5週齢の苗の最初の2枚の十分に
伸長した葉上にこすりつける。接種した植物を接種後3週間の間、症状の発生を
モニターする。PVY配列を有する植物は、PVY感染への感受性が減少し、こ
れに対して非形質転換コントロール植物は、接種後7日以内に重度の全身性PV
Y症状を示す。 前記の実施態様は例示である。本発明の記載は当業者に本発明の多くの変更を
有するものを提供する。自明で予測可能な変更は、すべて添付のクレームに包含
することを意図している。
Claims (33)
- 【請求項1】 ウイルスゲノムの発現を変化させる方法であって、細胞に当
該細胞で当該ウイルスゲノムのセンスRNA断片を発現させることのできる第1
のDNA配列および当該細胞で当該ウイルスゲノムのアンチセンスRNA断片を
発現させることのできる第2のDNA配列を導入することを含む方法であって、
当該センスRNA断片および当該アンチセンスRNA断片が二本鎖RNAを形成
することのできる方法。 - 【請求項2】 当該細胞をウイルス抵抗性または耐性にする請求項1の方法
。 - 【請求項3】 細胞が植物細胞である請求項1の方法。
- 【請求項4】 請求項1の方法であって、当該ウイルスがトスポウイルス、
ポティウイルス、ポテックスウイルス、トバモウイルス、ルテオウイルス、クク
モウイルス、ブロモウイルス、クロステオルウイルス、トムブスウイルスおよび
フロウイルスからなる群から選択される方法。 - 【請求項5】 請求項1の方法であって、当該DNA配列がウイルスコート
タンパク質遺伝子、ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質遺伝子、ウイルスレ
プリカーゼ遺伝子、またはウイルスムーブメントタンパク質遺伝子に由来するヌ
クレオチド配列を含む方法。 - 【請求項6】 請求項1の方法であって、当該第1のDNA配列および当該
第2のDNA配列が当該細胞のゲノムに安定的に組みこまれている方法。 - 【請求項7】 請求項1の方法であって、当該第1のDNA配列および当該
第2のDNA配列が2個の別々のDNA分子に含まれている方法。 - 【請求項8】 請求項1の方法であって、少なくとも2対の第1および第2
のDNA配列が細胞に導入されている方法。 - 【請求項9】 請求項8の方法であって、各対のDNA配列が、異なるウイ
ルス種または分離株のセンスおよびアンチセンスRNA断片をコードしている方
法。 - 【請求項10】 請求項1の方法であって、当該第1のDNA配列および当
該第2のDNA配列が1個のDNA分子に含まれている方法。 - 【請求項11】 請求項10の方法であって、当該第1のDNA配列および
当該第2のDNA配列が当該DNA分子の同じDNA鎖に含まれている方法。 - 【請求項12】 請求項11の方法であって、当該センスRNA断片および
当該アンチセンスRNA断片が1個のRNA分子に含まれている方法。 - 【請求項13】 請求項12の方法であって、当該RNA分子がフォールデ
ィングし、そこに含まれる当該RNA断片が二本鎖領域を形成することのできる
方法。 - 【請求項14】 請求項1の方法であって、発現されたRNA分子が、配列
番号13、配列番号17、配列番号18、配列番号25または配列番号28の逆
方法反復配列を含む方法。 - 【請求項15】 請求項24の方法であって、当該RNA分子の発現が異種
性の、組織特異的な、発育段階によって調節される、構成的な、または誘導可能
なプロモーターによって駆動される方法。 - 【請求項16】 請求項15の方法であって、当該RNA分子の発現がアラ
ビドプシスUbi3プロモーターのようなユビキチンプロモーターによって駆動
される方法。 - 【請求項17】 請求項15の方法であって、当該RNA分子の発現がアグ
ロバクテリウムrolCプロモーターによって駆動される方法。 - 【請求項18】 請求項12の方法であって、当該DNA分子が、当該セン
スRNA断片および当該アンチセンスRNA断片をコードしているDNA配列の
間のリンカーを含む方法。 - 【請求項19】 請求項18の方法であって、当該リンカーがアラビドプシ
スアクチン2遺伝子のリーダーイントロンのヌクレオチド配列によって定義され
る方法。 - 【請求項20】 請求項18の方法であって、当該リンカーが、該センスま
たはアンチセンスRNA断片にフランキングなウイルス領域のヌクレオチド配列
によって定義される方法。 - 【請求項21】 請求項18の方法であって、当該リンカーが、選択マーカ
ー遺伝子のような機能性遺伝子の発現カセットを含む方法。 - 【請求項22】 請求項21の方法であって、当該リンカーが、イントロン
プロセッシングシグナルのような調節配列を含む方法。 - 【請求項23】 請求項11の方法であって、当該センスRNA断片および
当該アンチセンスRNA断片が2個の別々のRNA分子に含まれる方法。 - 【請求項24】 請求項23の方法であって、当該第1のDNA配列および
当該第2のDNA配列が、双方向性プロモーターに実施可能なように連結されて
いる方法。 - 【請求項25】 請求項11の方法であって、当該第1のDNA配列および
当該第2のDNA配列が、当該DNA分子の相補鎖に含まれる方法。 - 【請求項26】 請求項25の方法であって、当該第1のDNA配列が、当
該DNA分子の当該第2のDNA配列の相補的DNA鎖である方法。 - 【請求項27】 細胞でウイルスゲノムのセンスRNA断片を発現すること
のできる第1のDNA配列および当該細胞で当該ウイルスゲノムのアンチセンス
RNA断片を発現することのできる第2のDNA配列を含む、ウイルスゲノムの
発現を変化させるDNA構築物であって、当該センスRNA断片および当該アン
チセンスRNA断片が二本鎖RNA分子を形成することのできるDNA構築物。 - 【請求項28】 請求項27のDNA構築物であって、当該DNA構築物が
、当該第1のDNA配列に実施可能なように連結されている第1のプロモーター
および当該第2のDNA配列に実施可能なように連結されている第2のプロモー
ターを含むDNA構築物。 - 【請求項29】 請求項27のDNA構築物であって、当該DNA構築物が
、当該第1のDNA配列および当該第2のDNA配列に実施可能なように連結さ
れている双方向性プロモーターを含むDNA構築物。 - 【請求項30】 ウイルスゲノムの発現の変化を示す細胞であって、当該細
胞で当該ウイルスゲノムのセンスRNA断片を発現することのできる第1のDN
A配列および当該細胞で当該ウイルスゲノムのアンチセンスRNA断片を発現す
ることのできる第2のDNA配列を含む細胞であって、当該センスRNA断片お
よび当該アンチセンスRNA断片が二本鎖RNAを形成することのできる細胞。 - 【請求項31】 ウイルスゲノムの発現の変化を示す植物およびそれから誘
導された後代であって、細胞で当該ウイルスゲノムのセンスRNA断片を発現す
ることのできる第1のDNA配列および当該細胞で当該ウイルスゲノムのアンチ
センスRNA断片を発現することのできる第2のDNA配列を含む植物およびそ
れから誘導された後代であって、当該センスRNA断片および当該アンチセンス
RNA断片が二本鎖RNAを形成することのできる植物およびそれから誘導され
た後代。 - 【請求項32】 請求項31の植物であって、当該植物がウイルス抵抗性ま
たは耐性である植物。 - 【請求項33】 請求項31の植物由来の種子。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US09/309,038 | 1999-05-10 | ||
US09/309,038 US7019195B1 (en) | 1998-05-26 | 1999-05-10 | Method for conferring resistance or tolerance aganist furovirus, potyvirus, tospovirus, and cucomovirus to plant cells |
PCT/EP2000/004117 WO2000068374A1 (en) | 1999-05-10 | 2000-05-08 | Regulation of viral gene expression |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008224753A Division JP2009022291A (ja) | 1999-05-10 | 2008-09-02 | ウイルス遺伝子発現の調節 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002543783A true JP2002543783A (ja) | 2002-12-24 |
Family
ID=23196412
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000616341A Withdrawn JP2002543783A (ja) | 1999-05-10 | 2000-05-08 | ウイルス遺伝子発現の調節 |
JP2008224753A Withdrawn JP2009022291A (ja) | 1999-05-10 | 2008-09-02 | ウイルス遺伝子発現の調節 |
JP2009255087A Pending JP2010088435A (ja) | 1999-05-10 | 2009-11-06 | ウイルス遺伝子発現の調節 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008224753A Withdrawn JP2009022291A (ja) | 1999-05-10 | 2008-09-02 | ウイルス遺伝子発現の調節 |
JP2009255087A Pending JP2010088435A (ja) | 1999-05-10 | 2009-11-06 | ウイルス遺伝子発現の調節 |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP1801215B1 (ja) |
JP (3) | JP2002543783A (ja) |
KR (1) | KR20010112952A (ja) |
CN (2) | CN101348785A (ja) |
AR (1) | AR023885A1 (ja) |
AU (1) | AU4563300A (ja) |
BR (1) | BR0010496A (ja) |
CA (1) | CA2369422A1 (ja) |
CZ (1) | CZ20014028A3 (ja) |
EA (1) | EA200101186A1 (ja) |
HK (2) | HK1045325A1 (ja) |
HU (1) | HUP0201235A3 (ja) |
IL (2) | IL145538A0 (ja) |
PL (1) | PL351385A1 (ja) |
SK (1) | SK16222001A3 (ja) |
TR (1) | TR200103088T2 (ja) |
WO (1) | WO2000068374A1 (ja) |
ZA (1) | ZA200109152B (ja) |
Families Citing this family (57)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19956568A1 (de) | 1999-01-30 | 2000-08-17 | Roland Kreutzer | Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens |
US7531718B2 (en) | 1999-08-26 | 2009-05-12 | Monsanto Technology, L.L.C. | Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids |
IL148374A0 (en) | 1999-08-26 | 2002-09-12 | Calgene Llc | Plants with modified polyunsaturated fatty acids |
US7067722B2 (en) | 1999-08-26 | 2006-06-27 | Monsanto Technology Llc | Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids |
DE10100586C1 (de) | 2001-01-09 | 2002-04-11 | Ribopharma Ag | Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens |
CH695778A5 (de) * | 2000-11-29 | 2006-08-31 | Hoffmann La Roche | Hemmung der Transkription eines Zielgens in einer Zelle oder in Geweben. |
US8546143B2 (en) | 2001-01-09 | 2013-10-01 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene |
US7423142B2 (en) | 2001-01-09 | 2008-09-09 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes |
US7767802B2 (en) | 2001-01-09 | 2010-08-03 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes |
US8022272B2 (en) | 2001-07-13 | 2011-09-20 | Sungene Gmbh & Co. Kgaa | Expression cassettes for transgenic expression of nucleic acids |
US7456335B2 (en) | 2001-09-03 | 2008-11-25 | Basf Plant Science Gmbh | Nucleic acid sequences and their use in methods for achieving pathogen resistance in plants |
US7745418B2 (en) | 2001-10-12 | 2010-06-29 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting viral replication |
DE10163098B4 (de) | 2001-10-12 | 2005-06-02 | Alnylam Europe Ag | Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren |
DE10202419A1 (de) | 2002-01-22 | 2003-08-07 | Ribopharma Ag | Verfahren zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen Zielgens |
CN100510084C (zh) | 2002-03-21 | 2009-07-08 | 孟山都技术有限公司 | 核酸构建体及其生产改良的种子油组合物的方法 |
US7166771B2 (en) | 2002-06-21 | 2007-01-23 | Monsanto Technology Llc | Coordinated decrease and increase of gene expression of more than one gene using transgenic constructs |
US7566813B2 (en) | 2002-03-21 | 2009-07-28 | Monsanto Technology, L.L.C. | Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions |
CA2493364A1 (en) | 2002-07-26 | 2004-02-12 | Basf Plant Science Gmbh | Inversion of the negative-selective effect of negative marker proteins using selection methods |
US20060064784A1 (en) | 2002-08-07 | 2006-03-23 | Basf Plant Science Gmbh | Nucleic acid sequences encoding proteins associated with abiotic stress response |
WO2006032707A2 (en) | 2004-09-24 | 2006-03-30 | Basf Plant Science Gmbh | Plant cells and plants with increased tolerance to environmental stress |
BRPI0413118A (pt) | 2003-08-01 | 2006-10-03 | Basf Plant Science Gmbh | construção de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, processo para a produção de um polipeptìdeo, polipeptìdeo, anticorpo, tecido vegetal, material de propagação, material coletado ou uma planta, método para a avaliação de agonistas e antagonistas de uma atividade de um poliptìdeo codificado pela molécula de ácido nucleico, processo para a identificação de um composto que confere produção de produto quìmico fino aumentada em uma planta ou microorganismo, método para a identificação de um produto genético que confere um aumento na produção de produto quìmico fino em uma célula, método para a produção de uma composição agrìcola, composição, e, uso da molécula de ácido nucleico, do polipeptìdeo, ou da construção de ácido nucleico, ou do produto genético identificado |
EP1765857A2 (en) | 2004-07-02 | 2007-03-28 | Metanomics GmbH | Process for the production of fine chemicals |
CN101001951B (zh) | 2004-08-02 | 2011-06-15 | 巴斯福植物科学有限公司 | 分离转录终止序列的方法 |
EP2166098B1 (en) | 2004-10-05 | 2013-11-06 | SunGene GmbH | Constitutive expression cassettes for regulation of plant expression |
KR20070085421A (ko) * | 2004-10-21 | 2007-08-27 | 벤간자 아이엔씨 | 식물들의 해충들 및 병원균들에 대한 내성을 제공하기 위한방법들 및 물질들 |
EP1655364A3 (en) | 2004-11-05 | 2006-08-02 | BASF Plant Science GmbH | Expression cassettes for seed-preferential expression in plants |
EP1662000B1 (en) | 2004-11-25 | 2011-03-30 | SunGene GmbH | Expression cassettes for guard cell-preferential expression in plants |
EP1666599A3 (en) | 2004-12-04 | 2006-07-12 | SunGene GmbH | Expression cassettes for mesophyll- and/or epidermis-preferential expression in plants |
EP2163634A1 (en) | 2004-12-08 | 2010-03-17 | SunGene GmbH | Expression cassettes for vascular tissue-preferential expression in plants |
EP1669456A3 (en) | 2004-12-11 | 2006-07-12 | SunGene GmbH | Expression cassettes for meristem-preferential expression in plants |
EP2096177A3 (en) | 2004-12-17 | 2010-01-13 | Metanomics GmbH | Process for the production of lutein |
CN103131727A (zh) | 2005-02-09 | 2013-06-05 | 巴斯福植物科学有限公司 | 在单子叶植物中调控表达的表达盒 |
CA2598307C (en) | 2005-02-26 | 2014-12-30 | Basf Plant Science Gmbh | Expression cassettes for seed-preferential expression in plants |
CN101137752B (zh) | 2005-03-08 | 2013-04-03 | 巴斯福植物科学有限公司 | 增强表达的内含子序列 |
WO2006120197A2 (en) | 2005-05-10 | 2006-11-16 | Basf Plant Science Gmbh | Expression cassettes for seed-preferential expression in plants |
WO2006128572A1 (en) * | 2005-06-02 | 2006-12-07 | Syngenta Participations Ag | Ce46-02a insecticidal cotton |
US7994399B2 (en) | 2005-06-23 | 2011-08-09 | Basf Plant Science Gmbh | Methods for the production of stably transformed, fertile Zea mays plants |
AU2006298844B2 (en) | 2005-09-20 | 2012-01-12 | Basf Plant Science Gmbh | Methods for controlling gene expression using ta-siRAN |
CA2628505A1 (en) | 2005-11-08 | 2007-05-18 | Basf Plant Science Gmbh | Use of armadillo repeat (arm1) polynucleotides for obtaining resistance to pathogens in plants |
CA2632872A1 (en) | 2006-01-12 | 2007-07-19 | Basf Plant Science Gmbh | Use of stomatin (stm1) polynucleotides for achieving a pathogen resistance in plants |
CN101421406B (zh) | 2006-02-13 | 2016-08-31 | 孟山都技术有限公司 | 用于产生改变的种子油组成的核酸构建体和方法 |
AU2007299219A1 (en) | 2006-04-05 | 2008-03-27 | Metanomics Gmbh | Process for the production of a fine chemical |
KR100809736B1 (ko) | 2006-05-15 | 2008-03-05 | 대한민국 | 안토시아닌 생합성 억제 활성을 가진 myb60 유전자와상기 유전자가 도입된 형질전환 상추 및 그 제조방법 |
EP2121921A4 (en) * | 2006-12-13 | 2010-08-04 | Idiverse Inc | NEW, STRESSTOLERANZ TRANSMITTING GENES AND RNA MOLECULES |
CA2673361A1 (en) | 2007-01-15 | 2008-07-24 | Basf Plant Science Gmbh | Use of subtilisin (rnr9) polynucleotides for achieving a pathogen resistance in plants |
BRPI0808008B1 (pt) | 2007-02-16 | 2016-08-09 | Basf Plant Science Gmbh | molécula de ácido nucleico isolada, cassete de expressão, vetor de expressão, métodos para excisão de sequências alvo de uma planta, para produzir uma planta com rendimento aumentado, e/ou tolerância a estresse aumentada, e/ou qualidade nutritional aumentada, e/ou teor de óleo aumentado ou modificado de uma semente ou broto para a planta, e, uso da molécula de ácido nucleico |
US20100162432A1 (en) | 2007-05-22 | 2010-06-24 | Basf Plant Science Gmbh | Plant cells and plants with increased tolerance and/or resistance to environmental stress and increased biomass production-ko |
AU2008340002A1 (en) | 2007-12-21 | 2009-07-02 | Basf Plant Science Gmbh | Plants with increased yield (KO NUE) |
AR075549A1 (es) | 2008-09-29 | 2011-04-20 | Monsanto Technology Llc | Evento transgenico de soja mon87705 y metodos para detectar el mismo |
EP2208785A1 (en) * | 2009-01-15 | 2010-07-21 | Newbiotechnic, S.A. | Methods and kits to generate miRNA- and smallRNA-expressing vectors, and its application to develop lentiviral expression libraries |
DE112010003162T5 (de) | 2009-04-22 | 2012-08-16 | Basf Plant Science Company Gmbh | Gesamtsamen-spezifischer Promotor |
CA2766858A1 (en) | 2009-07-10 | 2011-01-13 | Basf Plant Science Company Gmbh | Expression cassettes for endosperm-specific expression in plants |
EP2507375A4 (en) | 2009-12-03 | 2013-04-24 | Basf Plant Science Co Gmbh | EXPRESSION CASSETTES FOR EMBRYOSPECIFIC EXPRESSION IN PLANTS |
KR101457958B1 (ko) * | 2010-07-14 | 2014-11-04 | 대한민국 | 다종 바이러스 저항성을 갖는 형질전환 감자 식물체의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 감자 식물체 |
CN103667322B (zh) * | 2013-11-21 | 2015-11-11 | 上海市农业科学院 | 一种抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体avctc及其制备方法和应用 |
EP3116998A4 (en) * | 2014-03-12 | 2017-10-11 | The University Of Sydney | Sirna production in plastids of higher plants |
CA3067988A1 (en) * | 2017-05-22 | 2018-11-29 | Pebble Labs Usa Inc. | Transbiotic regulation of bacterial gene expression |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1995009920A1 (en) * | 1993-10-06 | 1995-04-13 | Sandoz Ltd. | Virus resistant or tolerant cells |
WO1998053083A1 (en) * | 1997-05-21 | 1998-11-26 | Zeneca Limited | Gene silencing |
WO1999049029A1 (en) * | 1998-03-20 | 1999-09-30 | Benitec Australia Ltd | Control of gene expression |
WO1999053050A1 (en) * | 1998-04-08 | 1999-10-21 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Methods and means for obtaining modified phenotypes |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH04507083A (ja) * | 1989-05-19 | 1992-12-10 | ヘム・リサーチ・インコーポレーテッド | 規定された構造の短い治療用dsRNA |
DK0517833T4 (da) * | 1990-03-02 | 2008-11-17 | Bayer Bioscience Nv | Genetisk transformation og regenering af sukkerroer |
GB9703146D0 (en) * | 1997-02-14 | 1997-04-02 | Innes John Centre Innov Ltd | Methods and means for gene silencing in transgenic plants |
US6903248B2 (en) * | 1997-02-19 | 2005-06-07 | Cornell Research Foundation, Inc. | DNA constructs and methods to impart resistance to at least one virus on plants |
GB9720148D0 (en) * | 1997-09-22 | 1997-11-26 | Innes John Centre Innov Ltd | Gene silencing materials and methods |
US6506559B1 (en) * | 1997-12-23 | 2003-01-14 | Carnegie Institute Of Washington | Genetic inhibition by double-stranded RNA |
AR020078A1 (es) * | 1998-05-26 | 2002-04-10 | Syngenta Participations Ag | Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta |
WO2000044914A1 (en) * | 1999-01-28 | 2000-08-03 | Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. | Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna |
-
2000
- 2000-05-08 SK SK1622-2001A patent/SK16222001A3/sk unknown
- 2000-05-08 AR ARP000102213A patent/AR023885A1/es not_active Application Discontinuation
- 2000-05-08 HU HU0201235A patent/HUP0201235A3/hu unknown
- 2000-05-08 EP EP06026160A patent/EP1801215B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-08 BR BR0010496-5A patent/BR0010496A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-05-08 WO PCT/EP2000/004117 patent/WO2000068374A1/en not_active Application Discontinuation
- 2000-05-08 EA EA200101186A patent/EA200101186A1/ru unknown
- 2000-05-08 JP JP2000616341A patent/JP2002543783A/ja not_active Withdrawn
- 2000-05-08 EP EP00927165A patent/EP1177283A1/en not_active Withdrawn
- 2000-05-08 CN CNA2008102106166A patent/CN101348785A/zh active Pending
- 2000-05-08 KR KR1020017014335A patent/KR20010112952A/ko not_active Application Discontinuation
- 2000-05-08 PL PL00351385A patent/PL351385A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-05-08 AU AU45633/00A patent/AU4563300A/en not_active Abandoned
- 2000-05-08 CN CNB008073597A patent/CN100420748C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-05-08 CZ CZ20014028A patent/CZ20014028A3/cs unknown
- 2000-05-08 IL IL14553800A patent/IL145538A0/xx unknown
- 2000-05-08 CA CA002369422A patent/CA2369422A1/en not_active Abandoned
- 2000-05-08 TR TR2001/03088T patent/TR200103088T2/xx unknown
-
2001
- 2001-09-21 IL IL145538A patent/IL145538A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-11-06 ZA ZA200109152A patent/ZA200109152B/en unknown
-
2002
- 2002-07-17 HK HK02105312.8A patent/HK1045325A1/zh unknown
- 2002-12-30 HK HK02109393.2A patent/HK1047769B/zh not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-09-02 JP JP2008224753A patent/JP2009022291A/ja not_active Withdrawn
-
2009
- 2009-11-06 JP JP2009255087A patent/JP2010088435A/ja active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1995009920A1 (en) * | 1993-10-06 | 1995-04-13 | Sandoz Ltd. | Virus resistant or tolerant cells |
WO1998053083A1 (en) * | 1997-05-21 | 1998-11-26 | Zeneca Limited | Gene silencing |
WO1999049029A1 (en) * | 1998-03-20 | 1999-09-30 | Benitec Australia Ltd | Control of gene expression |
JP2002507416A (ja) * | 1998-03-20 | 2002-03-12 | ベニテック オーストラリア リミティッド | 遺伝子発現の制御 |
WO1999053050A1 (en) * | 1998-04-08 | 1999-10-21 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Methods and means for obtaining modified phenotypes |
JP2002511258A (ja) * | 1998-04-08 | 2002-04-16 | コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼーション | 改良表現型を得るための方法及び手段 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
NATURE, vol. 391, JPN4006016509, 1998, pages 806 - 811, ISSN: 0000769630 * |
PLANT CELL, vol. 1, JPN4006016511, 1989, pages 665 - 670, ISSN: 0000769632 * |
PLANT PHYSIOL., vol. 119, JPN4006016510, April 1999 (1999-04-01), pages 2277 - 2294, ISSN: 0000769631 * |
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 95, JPN4006016279, 1998, pages 13959 - 13964, ISSN: 0000769629 * |
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 95, JPN6008066286, 1998, pages 13959 - 13964, ISSN: 0001216738 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HK1047769A1 (en) | 2003-03-07 |
KR20010112952A (ko) | 2001-12-22 |
AU4563300A (en) | 2000-11-21 |
BR0010496A (pt) | 2002-04-02 |
AR023885A1 (es) | 2002-09-04 |
PL351385A1 (en) | 2003-04-07 |
HUP0201235A2 (en) | 2002-08-28 |
EP1177283A1 (en) | 2002-02-06 |
EP1801215B1 (en) | 2013-02-27 |
IL145538A0 (en) | 2002-06-30 |
CZ20014028A3 (cs) | 2002-02-13 |
HK1047769B (zh) | 2009-08-14 |
IL145538A (en) | 2010-11-30 |
CA2369422A1 (en) | 2000-11-16 |
HK1045325A1 (zh) | 2002-11-22 |
CN1357040A (zh) | 2002-07-03 |
CN101348785A (zh) | 2009-01-21 |
SK16222001A3 (sk) | 2002-04-04 |
TR200103088T2 (tr) | 2002-05-21 |
CN100420748C (zh) | 2008-09-24 |
EP1801215A3 (en) | 2008-12-17 |
ZA200109152B (en) | 2002-09-06 |
EP1801215A2 (en) | 2007-06-27 |
WO2000068374A1 (en) | 2000-11-16 |
JP2010088435A (ja) | 2010-04-22 |
HUP0201235A3 (en) | 2004-10-28 |
EA200101186A1 (ru) | 2002-04-25 |
JP2009022291A (ja) | 2009-02-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1801215B1 (en) | Regulation of viral gene expression | |
CA2328058C (en) | Dsrna-mediated regulation of gene expression in plants | |
US7030294B2 (en) | Expression of trehalose 6-phosphate synthase and trehalose 6-phosphate phosphatase in plant plastids | |
US20020192813A1 (en) | Plant expression vectors | |
JP2002512775A (ja) | Mloタンパク質をコードし、植物に真菌耐性を付与する遺伝子 | |
ZA200505067B (en) | Arificial promoter for the expression of DNA sequences in vegetal cells | |
US7019195B1 (en) | Method for conferring resistance or tolerance aganist furovirus, potyvirus, tospovirus, and cucomovirus to plant cells | |
KR20010108021A (ko) | 티오레독신 및 곡물 처리방법 | |
JP2003509027A (ja) | クリーンな合成ベクター、プラスミド、トランスジェニック植物、及びこれらを含む植物の部分、並びにこれらを得る方法 | |
JP2000511427A (ja) | 線虫誘導性植物遺伝子プロモーター | |
WO2000078799A2 (en) | Mlo-genes controlling diseases | |
WO2002012450A1 (en) | Gossypium hirsutum tissue-specific promoters and their use | |
JP4010356B2 (ja) | 植物ウイルス由来プロモーター | |
WO2000015812A1 (fr) | Fragment d'adn a fonction promoteur | |
MXPA00009108A (en) | Genes controlling diseases | |
WO2000015811A1 (fr) | Fragment d'adn dote d'une fonction de promoteur |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20031209 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060905 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20061205 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20061212 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070301 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20080507 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080902 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20081029 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20081226 |
|
A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20090317 |