JP2002511258A - 改良表現型を得るための方法及び手段 - Google Patents
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Abstract
Description
胞に当該注目の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と相同性及び相補性で
あるヌクレオチド配列を各々含んで成るセンス及びアンチセンスRNA分子をコ
ードするキメラ遺伝子を同時に供与することにより、抑制するための方法に関連
する。このセンス及びアンチセンスRNA分子は、当該センス及びアンチセンス
RNAがスペーサーヌクレオチド配列により連結され、且つ二本鎖RNA分子を
形成できるようになっていることのある一のRNA分子として提供されうる。本
発明の一の観点において、これらの方法はウィルス感染を抑制し、それ故著しい
ウィルス耐性を供することを目的とする。別の態様において、これらの方法は植
物細胞内の内因性遺伝子の表現型発現の抑制を目的とする。本発明は更に植物細
胞内の注目の核酸に基づく表現型の同定のための大量スクリーニング方法に関連
する。また、かかるRNA分子を含んで成る植物細胞、並びにかかる植物細胞か
ら本質的に成る植物を提供する。
した。彼らは宿主内において機能不全形態で、過剰で、又は誤まった発育段階で
発現される寄生虫に由来する鍵となる遺伝子産物が宿主に対してごくわずかな作
用をもって寄生虫の機能を破壊するであろうと仮説をたてている(Sanford & Jo
hnston, 1985)。モデルとしてQBバクテリオファージを利用し、彼らは細菌内
でのバクテリオファージコートタンパク質もしくは修飾リバーゼ又はQBゲノム
に相補性であるアンチセンスRNAの発現が全て耐性を授けるものであると提唱
している。彼らは更にかかるアプローチが、植物において、植物ウィルスに対し
て、そして特に修飾植物ウィルスレプリカーゼの利用に有用性であろうとも提唱
している。植物ウィルス、タバコモザイクウィルス(TMV)のコートタンパク
質のタバコの中での発現が、植物ウィルス耐性についてのこの概念の最初の事実
上の確認である。この研究(Powell-Abel ら、1986)はカリフラワーモザイクウ
ィルス35Sプロモーターの制御下にある導入遺伝子由来TMVコートタンパク
質の発現がTMVに対する耐性を植物に授けたことを示している。このグループ
(Powellら、1990)は一般に、より高いレベルでコートタンパク質を発現する植
物は低レベル発現性の植物よりもTMVに対して耐性であることを示した。この
証明以来、ウィルスコートタンパク質遺伝子で形質転換された非常に多くの耐性
を示す植物の例がある(表1)。また、野生型レプリカーゼ(Braun and Hemenw
ay, 1992, Brederodeら、1995)、トランケーション化レプリカーゼ(Carr ら、
1992)、修飾レプリカーゼ(Longstaff ら、1993)又はアンチセンスウィルスR
NA(Kawchuckら、1991)を発現する植物における植物ウィルス耐性の数多くの
報告がある。
(tobacco etch virus)(TEV)のコートタンパク質遺伝子の様々な形態を利用
して、翻訳不能の「センス」コートタンパク質遺伝子及びアンチセンスコートタ
ンパク質遺伝子を含むいくつかの植物がウィルスに対して強力な耐性(ER)を
示すことを発見した(Lindbo & Dougherth, 1992 a, b)。この耐性は完全植物レ
ベル及び単独細胞レベルにおいて機能的であった。TEVはER植物に由来する
プロトプラスト内では複製できなかったが、非遺伝子導入タバコ由来のプロトプ
ラストでは高レベルで複製した。Dougherty らは翻訳不能センス構築体について
の強力な耐性を構築するメカニズムがよく報告されているコートタンパク質媒介
戦略と同じでないものと考えた。彼らは翻訳不能センス構築体のmRNAがウィ
ルスの負のセンスゲノムとハイブリダイズし、そして負のストランド上の複製複
合の進行を妨げると提唱する。彼らは分子内対合を形成できるウィルス配列の利
用は、それが標的ウィルスRNAに対してハイブリダイズする能力を妨害しうる
ため、避けるべきであると提案している。
potato virus Y)(PVY)コートタンパク質遺伝子を含む植物にまで広げた。彼
らはTEVによるものと似た結果を得ており、そしてERを有する植物が高度な
導入遺伝子コピー数、高度に活性な導入遺伝子転写、及び低レベルの定常状態の
PVY導入遺伝子由来のmRNAを有することを示した(Lindboら、1993, Smit
h ら、1994)。この耐性メカニズムについて下記のモデルが提唱されている:ウ
ィルス導入遺伝子の高レベルな転写は特異的なRNAを排除の標的とする細胞質
を基礎とする後転写細胞監視システムを誘引する。この導入遺伝子はウィルス配
列を含んで成る転写体をコードするため、このメカニズムは導入遺伝子mRNA
を分解するだけでなく、ウィルスゲノムRNA内の同じ配列をも分解する。この
モデルにおける重要な点は、高コピー数により供される導入遺伝子の高レベルな
転写の必要性にある(3-8; Goodwinら、1996)。他方、このメカニズムを誘引す
るのに必要なRNA基準は、早期感染における複製に由来するウィルスRNAに
より補助される一層軽い転写レベルにより達成されうる。これは「回復表現型」
を供する。それにおいては、植物は当初感染して症状を示すが、ウィルス症状の
ない新たな成長体を生み出し、そしてそれは感染に対して強力に耐性である。
RNAレベルで作動する後転写メカニズムに基づく、という発見により裏付けさ
れた(Ingelbrecht ら、1994 ; de Carvalho Niebelら、1995)。
遺伝子が後転写メカニズムによりサイレンス化されることで知られるような遺伝
子導入植物にGUS配列を含むウィルスを接種せしめることにより供される(En
glish ら、1996)。この場合、これらの植物はウィルス感染に対して極めて耐性
である。しかしながら、同植物はそれらがGUS配列を含まないと、ウィルスに
対して感受性である。
るわけではないため(Mueller ら、1995 ; Englishら、1996)、耐性を誘導する
別のメカニズムがあるかもしれないことが示唆される。このような矛盾に合わせ
るため、耐性に影響を及ぼす重要な因子が、導入遺伝子mRNAのレベルではな
く、そのmRNAの質であるような別のモデルが提案された(Englishら、1996)
。このモデルに従うと、導入遺伝子はそれが転写されて「異常RNA」を生成す
るときにだけ耐性を誘導できる(又は遺伝子をサイレンス化する)。後転写的遺
伝子サイレンス化及び導入遺伝子のメチル化の数多くの例があり(Hobbs ら、19
90 ; Ingelbrechtら、1994)、そして導入遺伝子のメチル化が強力なウィルス耐
性のいくつかの例に関係することも見い出されている(Smith ら、1994, Englis
h 1996)。提唱のモデルにおいて、導入遺伝子のメチル化は細胞質RNA監視シ
ステムを誘導する異常RNAの生成に結びつく。Baulcombe and English はこの
誘導法がA. immersus におけるmet2のサイレンス化で認められているものと
同じでありうることを提唱している。このシステムにおいて、met2RNAの
転写は内因性遺伝子のメチル化領域において終結し、かくして異常なトランケー
ションRNAが生み出される。このメチル化は導入遺伝子と内因遺伝子の対応の
領域の相同領域との正常な場所ではない相互作用の結果と考えられる(Barry ら
、1993)。多重導入遺伝子の存在は正常でない場所での対合の傾向を高め、それ
故高コピー数と強力なウィルス耐性との関係と一致する(Mueller ら、1995 ; G
oodwinら、1996 ; Pang ら、1996)。
97))、そしていくつかのモデルが紹介されている。全てのモデルは高度な配列特
異性を要し、その理由は耐性が非常に(株)特異的であり、それ故この導入遺伝
子から産生されるRNAとの塩基対相互作用を要するからである。センス導入遺
伝子によるウィルス耐性又は遺伝子サイレンス化の誘導についての一の説明は、
植物のRNA依存性RNAポリメラーゼが鋳型として導入遺伝子mRNAを利用
する相補性RNAを作り出すことにある(Schiebelら、1993 a, b)。この仮説的
な相補性RNA(cRNA)は検出されていないが(Baulcombe 1996)、cRN
Aが完全相補体よりも小さく且つヘテロ散在的なRNAであり(Schiebel 1993
a, b ; Baulcombe 1996)、それ故検出しにくいと予想されている。
えられる方法(Baulcombe ら1996により提唱)は: 1:cRNAが導入遺伝子mRNA又はウィルスRNAとハイブリダイズし、そ
してその二量体がdsRNAの標的となる; 2:cRNAが標的RNAとハイブリダイズして二量体を形成し、それが翻訳を
中断し、その結果安定性に対して間接的な作用を及ぼす(Green, 1993); 3:cRNAとウィルスRNAとで形成される二量体がウィルス複製のために必
要な補因子の翻訳のハイブリド中断を及ぼす;及び 4:cRNAのハイブリダイゼーションがウィルス複製のために必要とされる分
子内塩基対合に影響を及ぼす。
ベルの導入遺伝子転写又は異常一本鎖mRNAの産生のいずれかによる細胞質監
視システムの誘導を包含する。このシステムが一旦誘引されると、RNA依存性
RNAポリメラーゼはこの導入遺伝子mRNAからcDNAを作る。このような
cRNAは標的RNAにハイブリダイズし、その翻訳能力もしくは安定性に近接
影響を及ぼすか、又はRNAを分解の標的とする。
における遺伝子発現を、細胞の遺伝子材料にその細胞のこの遺伝子材料により産
生されるmRNAに相補的な及びそれに結合することのできるmRNAを産生す
るように転写される非天然核酸配列を組込む又は結合させることにより調節又は
阻害する方法及び手段が記載されている。
NAストランドに実質的に相補性である負のRNAストランドの植物細胞内での
転写を行うことにより引き起こすことが記載されている。この標的RNAストラ
ンドは遺伝子発現において構築されるmRNA転写体、ウィルスRNA、又は植
物細胞の中に存在するその他のRNAであってよい。この負のRNAストランド
は標的RNAストランドの少なくとも一部に対して相補性であり、その活性をi
n vivoで阻害する。
調節する方法が記載され、それは宿主内で機能性なプロモーターの転写制御下に
あり、且つそのDNAの転写ストランドが調節を所望する内因性遺伝子から転写
されたDNAのストランドに対して相補的である遺伝子の組込みにより達成され
る。
31,020及び5,283,184号には所望の表現型特徴を示す植物を生産
するための方法及び手段が記載され、それはプロモーターに作用可能式に連結さ
れたDNAセグメントを含んで成るトランスゲノーツ(transgenotes)を選別す
ることによるものであり、ここでこのセグメントの転写生成物は内因性遺伝子、
特に内因性フラボノイド生合成経路遺伝子の対応の転写体に対して実質的に相同
性である。
が記載され、それは標的遺伝子各々に対して相同性である異なるDNA領域を有
する単一コントロール遺伝子及びかかる異なる領域から標的遺伝子各々の発現を
阻害するRNAが転写されるような適合された植物において機能するプロモータ
ーを植物に導入することを含んで成る。
はポリペプチドをコードし、且つ更には調節ドメイン、支持体領域及びリボソー
ム認識配列を含む応答性RNA分子を特徴とする。この応答性RNA分子は調節
ドメイン内にインヒビター領域を有し、その調節ドメインはこの応答性RNA分
子の支持体領域及びシグナル核酸のアンチインヒビター領域の双方に対して相補
性であり、かくしてシグナル核酸の非存在下で、このインヒビター及び支持体領
域は塩基対合したドメインを形成し、その形成はシグナル核酸の存在下で観察さ
れる−タンパク質−コード領域の翻訳レベルと比べてこの応答性RNA分子にお
けるタンパク質コード領域の一つの翻訳レベルを抑制する。
ン(chalcone) シンターゼAサイレンシングについてのモデルが記載され、それ
は相補性配列間でのRNA−RNA対合、それに続く内性核酸分解RNA切断の
サイクルを包含し、どのようにしてRNA分解が促進される傾向にあるかを説明
する。Fireら、1998にはCaenorhabditis elegansにおける二本鎖RNAの実験導
入による特異的遺伝子妨害が記載されている。機能性ゲノムについてのこのよう
な発見の重要性が論じられている(Wagner and Sun, 1998)。
ルコーンシンターゼ導入遺伝子により産生される色素抑制の異なるパターンが記
載され、そして更にはセンス及びアンチセンスカルコーンシンターゼ対立形質に
ついてヘテロ接合である植物における花色パターンを分析している。
別な二次構造を有するアンチセンスRNAを開示する。
並びにリノール酸デサチュラーゼを発現する植物を開示する。
び2.5%未満のα−リノレン酸を含むブラッシカ(Brassica)種子を開示する
。この油は7%未満のリノール酸をも含む。このブラッシカ種子はミクロソーム
オレイン酸デサチュラーゼ及びミクロソームリノール酸デサチュラーゼ遺伝子発
現の種子特異的阻害を含む植物により生産され、ここでその阻害は同時抑制又は
アンチセンス技術により構築されうる。
タネを開示し、この植物油は総脂肪酸含有量を基準に異常に高い80〜90%の
オレイン酸含有量を有する。
制する、特に遺伝子、特に真核細胞のゲノムの中に組込まれた内因性遺伝子もし
くは外来導入遺伝子の表現型発現を抑制する、又は感染ウィルスのゲノムの中に
含まれている注目の核酸の表現型発現を抑制するための方法であって、真核細胞
の核ゲノムの中に、真核細胞の中で発現されることのできるプロモーター、並び
に任意的に転写終止及びポリアデニル化に関与するDNA領域、更にはそれらの
間にあるDNA領域であって、転写されると注目の核酸のヌクレオチド配列の少
なくとも一部と75〜100%の配列同一性を有する少なくとも10個の連続ヌ
クレオチド、特に少なくとも約550個の連続ヌクレオチドのセンスヌクレオチ
ド配列及び当該センスヌクレオチド配列の相補体の10個のヌクレオチドストレ
ッチと約75%〜約100%の配列同一性を有する少なくとも10個の連続ヌク
レオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を
有するRNA分子を生み出すDNA領域を含んで成るキメラDNAを導入、好ま
しくは組込むことを含んで成り、ここで当該RNAはセンス及びアンチセンスヌ
クレオチド配列を有する領域間での、当該センス配列の少なくとも10個の連続
ヌクレオチドが当該アンチセンス配列の10個の連続ヌクレオチドと塩基対合し
て好ましくは人工ヘアーピン構造をもたらすような塩基対合を介して、二本鎖R
NAステムを有する人工ヘアーピンRNA構造を形成することができる方法を提
供する。好ましくは、このキメラDNAはDNAのゲノムの中に安定的に組込ま
れる。
型発現を抑制するための方法であって、この注目の核酸のヌクレオチド配列の少
なくとも一部と75〜100%の配列同一性を有する少なくとも10個の連続ヌ
クレオチドのセンスヌクレオチド配列及びこのセンスヌクレオチド配列の相補体
の10ntのストレッチと約75%〜約100%の配列同一性を有する少なくと
も10個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列を含んで成る
ヌクレオチド配列を有するキメラRNA分子を導入する工程を含んで成り、ここ
で当該RNAはセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列を有する領域間での、
当該センス配列の少なくとも10個の連続ヌクレオチドが当該アンチセンス配列
の10個の連続ヌクレオチドと塩基対合して(人工)ヘアーピン構造をもたらす
ような塩基対合を介して、二本鎖RNA領域を形成することができる、方法を提
供する。
であって、第一及び第二キメラDNAであって双方のキメラDNAが遺伝子導入
植物細胞の核ゲノムの中に一緒に組込まれて一の組換DNA上に連結されている
ものを導入する工程を含んで成る、方法を提供する。ここで当該第一キメラDN
Aは、植物発現性プロモーター、注目の遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも
一部と75〜100%の配列同一性を有する少なくとも10個の連続ヌクレオチ
ドのセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を有するセンスRN
A分子へと転写されることのできる第一DNA領域、並びに任意的に植物細胞に
おいて機能する転写終止及びポリアデニル化に関与するDNA領域を含んで成る
。この第二キメラDNAは植物発現性プロモーター、当該センスヌクレオチド配
列の少なくとも10個の連続ヌクレオチドの相補体と約75%〜約100%の配
列同一性を有する少なくとも10個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスヌク
レオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を有するアンチセンスRNA分子へ
と転写されることのできる第二DNA領域、並びに任意的に植物細胞において機
能する転写終止及びポリアデニル化に関与するDNA領域を含んで成る。このセ
ンス及びアンチセンスRNA分子は相補性である領域間での塩基対合を介して二
本鎖二量体RNAを形成することができる。
、第一及び第二キメラDNAを有する当該生物の細胞を用意し、ここで当該第一
キメラDNAはプロモーター、ウィルスのゲノムのヌクレオチド配列の少なくと
も一部と75〜100%の配列同一性を有する少なくとも10個の連続ヌクレオ
チドのセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を有するセンスR
NA分子へと転写されることのできる第一DNA領域;並びに植物細胞において
機能する転写終止及びポリアデニル化に関与するDNA領域を含んで成る、方法
を提供する。ここで当該第二キメラDNAはプロモーター、前記センスヌクレオ
チド配列の前記少なくとも10個の連続ヌクレオチドの相補体と約75〜100
%の配列同一性を有する少なくとも10個の連続ヌクレオチドを含むアンチセン
スヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を有するアンチセンスRNA
分子へと転写されることのできる第二DNA領域、並びに植物細胞において機能
する転写終止及びポリアデニル化に関与するDNA領域を含んで成る。ここで当
該センス及びアンチセンスRNA分子は相補性である領域間での塩基対合により
二本鎖RNAを形成することができる。
込まれているか、又は一の組換DNA上に連結され、双方のキメラDNAが遺伝
子導入植物細胞の核ゲノムの中に一緒に組込まれている。
ための方法であって、注目のヌクレオチド配列内で、少なくとも10個の連続ヌ
クレオチドの標的配列を選定し、当該選定標的配列の長さに対応し、且つ当該選
定標的配列と少なくとも約75〜100%の配列同一性を有するセンスヌクレオ
チド配列を設計し、当該センスヌクレオチド配列の相補体と少なくとも約75〜
100%の配列同一性を有し、且つ当該センスヌクレオチド配列の一部の相補体
と100%の配列同一性を有する少なくとも約10個の連続ヌクレオチドのスト
レッチを含んで成るアンチセンスヌクレオチド配列を設計することを含んで成る
。この方法は更に、当該設計したセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列の双
方を含んで成るRNA分子を過去に同定されていない表現型を有するヌクレオチ
ド配列を含む核酸を含んで成る適当な真核宿主細胞に導入し;そして当該表現型
を適当な方法により観察する;ことを含んで成る。
真核細胞であって、更に前記真核細胞内で発現されることのできるプロモーター
、DNA領域であって、転写されると前記注目の核酸のヌクレオチド配列の少な
くとも一部と75〜100%の配列同一性を有する少なくとも10個の連続ヌク
レオチドのセンスヌクレオチド配列及び前記センスヌクレオチド配列の前記少な
くとも10個の連続ヌクレオチドの相補体と約75〜100%の配列同一性を有
する少なくとも10個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列
を含んで成るヌクレオチド配列を有するRNA分子を生成するDNA領域を含ん
で成るキメラDNA分子を含んで成る細胞を提供し、ここで当該RNA分子はセ
ンス及びアンチセンスヌクレオチド配列を有する領域間での、当該センス配列の
少なくとも前記10個の連続ヌクレオチドが当該アンチセンス配列の前記10個
の連続ヌクレオチドと塩基対合を形成してヘアーピンRNA構造、好ましくは人
工ヘアーピン構造をもたらすような塩基対合を介して、二本鎖RNA領域を形成
することができる。かかるキメラDNA分子は更に転写終止及びポリアデニル化
に関与するDNA領域を含んで成る。 ここで当該注目の核酸の表現的発現性は有意に抑制されている。
真核細胞であって、更に当該注目の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と
75〜100%の配列同一性を有する少なくとも10個の連続ヌクレオチドのセ
ンスヌクレオチド配列及び当該センスヌクレオチド配列の少なくとも10個の連
続ヌクレオチドの相補体と約75〜100%の配列同一性を有する少なくとも1
0個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌク
レオチド配列を有するキメラRNA分子を含んで成り、ここで当該RNAはセン
ス及びアンチセンスヌクレオチド配列を有する領域間での、当該センス配列の少
なくとも前記10個の連続ヌクレオチドが当該アンチセンス配列の前記少なくと
も10個の連続ヌクレオチドと塩基対合して人工ヘアーピンRNA構造をもたら
すような塩基対合を介して、二本鎖RNA領域を形成することができる。
で成る真核細胞であって、一の組換DNA上で連結された第一及び第二キメラD
NAを、当該真核細胞の核ゲノム内に一緒に組込まれて更に含んで成り;ここで
当該第一キメラDNAは下記の作用可能式に連結された要素を含んで成り:当該
真核細胞において発現されることのできるプロモーター、前記注目の遺伝子のヌ
クレオチド配列の少なくとも一部と75〜100%の配列同一性を有する少なく
とも10個の連続ヌクレオチドのセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオ
チド配列を有するセンスRNA分子へと転写されることのできる第一DNA領域
、並びに転写終止及びポリアデニル化に関与するDNA領域;そしてここで前記
第二キメラDNAは下記の作用可能式に連結された要素を含んで成り:当該真核
細胞において機能性であるプロモーター、前記センスヌクレオチド配列の前記少
なくとも10個の連続ヌクレオチドの相補体と約75〜100%の配列同一性を
有する少なくとも10個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配
列を含んで成るヌクレオチド配列を有するアンチセンスRNA分子へと転写され
ることのできる第二RNA領域;転写終止及びポリアデニル化に関与するDNA
領域;ここで当該センス及びアンチセンスRNA分子は相補性である領域間での
塩基対合により二本鎖RNAを形成することができる、細胞、の提供にある。
れているウィルス耐性植物の提供にある。ここで当該第一キメラDNAは植物発
現性プロモーター、当該植物に感染することのできるウィルスのゲノムのヌクレ
オチド配列の少なくとも一部と75〜100%の配列同一性を有する少なくとも
10個の連続ヌクレオチドのセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド
配列を有するセンスRNA分子へと転写されることのできる第一DNA領域;並
びに当該植物細胞において機能する転写終止及びポリアデニル化に関与するDN
A領域を含んで成る。当該第二キメラDNAは植物発現性プロモーター、前記セ
ンスヌクレオチド配列の前記少なくとも10個の連続ヌクレオチドの相補体と約
75〜100%の配列同一性を有する少なくとも10個の連続ヌクレオチドを含
むアンチセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を有するアンチ
センスRNA分子へと転写されることのできる第二DNA領域;並びに当該植物
細胞において機能する転写終止及びポリアデニル化に関与するDNA領域を含ん
で成る。当該センス及びアンチセンスRNA分子は相補性である領域間での塩基
対合により二本鎖RNAを形成することができる。この第一及び第二キメラDN
Aは核ゲノム内の一の遺伝子座又は異なる遺伝子座のいずれかに組込まれている
。
る、好ましくはオレイン酸含有量を高めるための方法であって、当該植物の細胞
の中にキメラDNAを導入する工程を含んで成る方法を提供する。ここで当該キ
メラDNAは下記の作用可能式に連結された要素を含んで成る:a)植物発現性
プロモーター、好ましくは種子特異的プロモーター、b)DNA領域、特にSE
Q ID NO:6のヌクレオチド配列を有するDNA領域、ここで当該領域は
転写されると人工ステムループ構造を形成することのできるRNA領域を含んで
成るRNA分子を生成し、ここで当該ステムループ構造のアニーリングRNA配
列の一つはΔ12デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレームの
ヌクレオチド配列の少なくとも一部と本質的に類似するヌクレオチド配列を含ん
で成り、そしてここで当該アニーリングRNA配列の第二のものは当該Δ12デ
サチュラーゼをコードするオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列の
少なくとも一部の相補体の少なくとも一部と本質的に類似する配列を含んで成る
;並びに任意的にc)転写終止及びポリアデニル化に関与するDNA領域。上記
のキメラ遺伝子を含んで成る改良脂肪酸プロファイル、特に増大したオレイン酸
含有量を有する植物も本発明により提供される。また、かかる植物又は種子から
得た油も包含される。
理解されるであろう。
むヘアーピン構造を含んで成るRNA分子を有する真核細胞、特に植物細胞を提
供することにある。潜在的には、RNA分子はいくつかの二次構造を形成するこ
とができ、その一部は所望のヘアーピンを含みうる。この細胞中のRNAの真の
二次構造は最低の自由エネルギーを有するであろうと予想される。本発明に従う
と、細胞内で生産すべきRNA分子は、細胞内でそれが帯びることができうる少
なくともその最低の自由エネルギー状態において、それは所望のヘアーピンを含
んで成るであろう。
本鎖RNA分子をいう。その最も簡単な代表例において、ヘアーピンRNAは一
本鎖RNAループで接続したアニーリングRNAストランドから成る二本鎖ステ
ムから成り、そして更には「パン−ハンドルRNA」とも呼ばれる。しかしなが
ら、「ヘアーピンRNA」なる語は自己アニーリング二本鎖配列を含んで成るよ
り複雑な二次RNA構造、更には内部のふくらみ及びループをも包括する。具備
した特異的な二次構造はRNA分子の自由エネルギーにより決定され、そして適
当なソフトウェア、例えばFULDRNA(Zuker and Stiegler, 1981)を利用
して様々な状況について予測できうる。
チドを有する位置の数を2本の配列のうちの短いもののヌクレオチドの数で除し
た値をいう。2本のヌクレオチド配列のアラインメントはWilbur and Lipman ア
ルゴリズム(Wilbur and Lipmann, 1983)により、20ヌクレオチドのウィンド
ーサイズ、4ヌクレオチドの文字長、4のギャップペナルティーを用いて実施す
る。上記の配列アラインメントを含む配列データーのコンピューター補助分析及
び解釈は、例えばIntelligenetics(商標)Suite (Intelligenetics Inc., CA)
のプログラムを用いて簡単に実施できる。配列は、それらが少なくとも約75%
、特に少なくとも約80%、より特に少なくとも約85%、かなり特に約90%
、特別には約95%、より特別には約100%の配列同一性を有するとき、かな
り特別には同一であるとき、「本質的に類似」と表示する。RNA配列が本質的
に類似である、又はDNA配列と所定の度合いの配列同一性を有すると言及する
とき、DNA配列内のチミン(T)はRNA配列内のウラシル(V)と均等と考
えることが明らかである。
始)することのできるDNA配列を意味する。これは任意の植物起源プロモータ
ーを含むが、植物細胞において転写を指令することのできる任意の非植物起源プ
ロモーター、即ち、ウィルス又は細菌起源の所定のプロモーター、例えばCaM
V35S、サブテラニアン・クローバー(subterranean clover)ウィルスプロ
モーターNo.4もしくはNo.7、又はT−DNA遺伝子プロモーターも含む
。
されたDNA領域が生物学的に活性なRNA、即ち、その他の核酸と相互作用で
きるとか又はポリペプチドもしくはタンパク質へと翻訳されることができるRN
Aへと転写される過程をいう。遺伝子はこの遺伝子の発現の最終産物が生物学的
に活性なRNA、例えばアンチセンスRNA、リボザイム又は複製中間体である
とき、RNAをコードするという。遺伝子はこの遺伝子の発現の最終産物がタン
パク質又はポリペプチドであるとき、タンパク質をコードするという。
き、その宿主細胞の中で転写して(又は複製して)RNAを生み出す及び/又は
翻訳されてポリペプチドもしくはタンパク質を生み出すとき、「発現されること
ができる」という。
能式に連結された細胞内でRNA分子(例えばmRNA)へと転写されるDNA
領域(「転写DNA領域」)を含んで成る任意のDNAフラグメントを意味する
。かくして、遺伝子は複数の作用可能式に連結されたDNAフラグメント、例え
ばプロモーター、5′リーダー配列、コード領域、及びポリアデニル化部位を含
んで成る3′領域を含んで成りうる。特定の植物の種に内因性である植物遺伝子
(内因性植物遺伝子)はその植物の種の中に天然で見い出される遺伝子又は慣用
の育成によりその植物種に導入されうる遺伝子をいう。キメラ遺伝子とは、植物
種において通常認められない任意の遺伝子、又はプロモーターが天然では転写D
NA領域の一部もしくは全体又はこの遺伝子の少なくとも一のその他の調節領域
と一体化していない遺伝子である。
性発現に結びついた任意の定量的特徴を意味し、それ故転写もしくは複製される
RNA分子の量、後転写修飾されたRNA分子の量、翻訳されたペプチドもしく
はタンパク質の量、かかるペプチドもしくはタンパク質の活性が含まれうる。
の定量的又は定性的特徴、並びに細胞に媒介される直接もしくは間接的な効果、
又はRNA分子、ペプチドもしくはタンパク質、又は後転写修飾されたペプチド
もしくはタンパク質の存在によりその細胞を含む生物を意味する。宿主細胞内で
の核酸の単なる存在は、たとえそれが定量的又は定性的に追跡できたとしても、
その核酸の表現型発現又は表現型特徴とは考えない。細胞又は生物に対して媒介
される直接又は間接的な効果の例は例えば農業経営又は産業上有用な特徴、例え
ば害虫もしくは病気に対する耐性、高度又は改良された油含有量、等である。
の存在下での真核細胞の注目の核酸の表現型発現の、本発明のRNA又はキメラ
遺伝子の非存在下での注目の核酸の表現型発現との対比に関連する。本発明のキ
メラRNAの存在下での表現型発現はかくしてその非存在下での表現型発現より
も少なく、好ましくはキメラRNAの非存在下での表現型発現のわずか約25%
、特にわずか約10%、より特にわずか約5%であり、特にこのキメラRNA又
はかかるRNAをコードするキメラ遺伝子の存在によりこの表現型発現は全ての
実用的な目的のため完全に阻害されるべきである。
NA又は遺伝子の存在下で、表現型特徴が、かかるRNA又は遺伝子のない状況
と比べて異なる別の状態へと変遷するときを意味する。核酸の表現型発現の抑制
はそれ故とりわけ、その核酸(の一部)の転写の抑制、核酸(の一部)の翻訳の
抑制、又は転写RNAもしくは翻訳ポリペプチドの存在が真核細胞又は生物に対
して有する効果の抑制として測定できることがあり、そして究極的には改変され
た表現的特徴へと結びつくであろう。注目の核酸の表現的発現の抑制は表現型特
徴の増大に付随する又は相関しうることが明らかである。
の中に存在しうる任意の特定のRNA分子又はDNA配列を意味する。
を言及するがまま特定されるものと解釈されるか、1又は複数の特徴、事項、工
程もしくは成分又はそれらの群の存在又は追加を排除するわけではない。かくし
て、例えばヌクレオチド又はアミノ酸の配列を含んで成る核酸又はタンパク質は
、実際に記載されたものより多くのヌクレオチド又はアミノ酸を含んで成ってよ
く、即ち、より大きな核酸又はタンパク質の中に埋設してよい。機能的又は構造
的に特定されたDNA領域を含んで成るキメラ遺伝子は追加のDNA領域等を含
んで成ってよい。
伝子又はその一部のセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列の双方を含んで成
るヌクレオチド配列を有するRNA分子へと転写されることのできるキメラ遺伝
子はその標的遺伝子の表現型発現を効率的且つ特異的に抑制できることが発見さ
れた。表現型発現の抑制はセンス又はアンチセンスRNA分子のいずれかをコー
ドするキメラ遺伝子を別々に標的遺伝子を有する類似の細胞に導入したときに観
察されるものよりも効率的且つ予測可能であった。
アンチセンス各々を含んで成るヌクレオチド配列と同時に導入すると、たとえキ
メラ遺伝子がより弱いプロモーターから転写されたときでさえも、非常に強いウ
ィルス耐性をもたらした。遺伝子サイレンス化及びウィルス耐性は類似の現象に
より媒介されうることが周知である。
とのできる注目の核酸の表現型発現性を抑制するための方法であって、下記の作
用可能式に連結された要素を含んで成るキメラDNAの導入工程を含んで成る方
法を提供する: a)前記真核細胞内で機能性であるプロモーター、特に植物発現性プロモーター
; b)DNA領域、ここで当該領域は転写されると i.前記注目の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と75〜100%の
配列同一性を有する少なくとも10nt、好ましくは15ntの連続ヌクレオチ
ドのセンスヌクレオチド配列;及び ii.前記センスヌクレオチド配列の前記少なくとも10、好ましくは15nt
の連続ヌクレオチドの相補体と約75〜100%の配列同一性を有する少なくと
も10nt、好ましくは15ntの連続ヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレ
オチド配列; を含んで成るヌクレオチド配列を有するRNA分子を生成し、ここで当該RN
Aはセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列を有する領域間での塩基対合を介
して二本鎖RNAを形成して、ヘアーピンRNA構造をもたらすことができる;
並びに c)適当な真核細胞において機能する、特に植物細胞において機能する転写終止
及びポリアデニル化に関与するDNA領域。
RNA分子であり、ヘアーピンRNAから本質的に成る。
でないと考える。
されると、人工ステム構造を形成することのできるRNA領域を含んで成るRN
A分子を生み出し、ここでこのステム−ループ構造のアニーリングRNA配列の
一方は注目の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と本質的に類似する配列
を含んで成り、そしてここでこのアニーリングRNA配列の第二のものは注目の
核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部の相補体の少なくとも一部と本質的に
類似する配列を含んで成る。
な注目の核酸の表現型発現を抑制するように設計できうる。
は真核細胞、特に植物細胞のゲノムの中に組込まれた遺伝子である。本発明の手
段及び方法は天然物として細胞のゲノムに属する遺伝子(内因性遺伝子)の表現
型発現の抑制、及び天然物として細胞のゲノムに属することのないが、細胞に導
入された遺伝子(導入遺伝子)の表現型発現の抑制のために利用されうる。この
導入遺伝子は安定的又は一過性的に導入されてよく、そして細胞の核ゲノムの中
に組込まれてよく、又は複製ベクター、例えばウィルスベクター上に存在してよ
い。
核酸はウィルス核酸、特に真核細胞、特に植物細胞に感染することのできるウィ
ルスRNA分子である。この場合、抑制すべき表現型はウィルスの複製、そして
究極的には感染ウィルスにより惹起される病的症状である。
配列は転写されるDNA領域、特に転写及び翻訳されるDNA領域の一部(換言
すればコード領域)である。特に好ましくは、この標的配列は1又は複数の連続
するエクソンであり、より特にはコード領域の単一のエキソン内に配置されてい
るものである。
全長(ヌクレオチド)に相当する長さに至るまで様々であってよい。好ましくは
、このセンスヌクレオチド配列の全長は少なくとも10nt、好ましくは15n
t、特に少なくとも約50nt、より特に少なくとも約100nt、特に少なく
とも約150nt、より特別には少なくとも約200nt、かなり特別には少な
くとも約550ntである。このセンスヌクレオチド配列の全長は、その標的核
酸の全長以外に上限となるものはないと予想される。しかしながら、実用的な理
由(例えばキメラ遺伝子の安定性)のため、センスヌクレオチド配列の長さは5
000ntを超えるべきでなく、特に2500ntを超えるべきでなく、そして
約1000ntにまで制限されうる。
遺伝子内の対応の配列間での配列同一性についての要件のストリンジェンシーは
弱まる。好ましくは、センスヌクレオチド配列全体は対応標的核酸と少なくとも
75%、特に少なくとも約80%、より特には少なくとも約85%、かなり特に
は約90%、特別には約95%、より特別には約100%の配列同一性を有すべ
きであり、かなり特別には標的核酸の対応部分と同一であるべきである。しかし
ながら、このセンスヌクレオチド配列は常に標的核酸の対応部分と100%の配
列同一性を有する約10個の連続ヌクレオチド、特に約20nt、より特に約5
0nt、特別には約100nt、かなり特別には約150ntの配列を含むこと
が好ましい。好ましくは、配列同一性の計算及び対応のセンス配列の設計のため
、ギャップの数は、特に短めのセンス配列の場合、最小限とすべきである。
かなり決定され、そして後者の配列の長さに相当するのが好ましいであろう。し
かしながら、長さにおいて約10%相違するアンチセンス配列を利用することが
可能である。同様に、アンチセンス領域のヌクレオチド配列はセンス領域のヌク
レオチド配列によりかなり決定され、そしてセンス領域のヌクレオチド配列の相
補体と同一であるのが好ましい。しかしながら、特に長いアンチセンス領域だと
、センスヌクレオチド配列の相補体と低めの配列同一性、より好ましくはセンス
ヌクレオチド配列の相補体と少なくとも約80%、特に少なくとも約85%、よ
り特に少なくとも約90%の配列同一性、特別には少なくとも約95%の配列同
一性を有するアンチセンス配列を利用することが可能である。にもかかわらず、
このアンチセンスヌクレオチド配列は常にセンスヌクレオチド配列の対応部分の
相補体と100%の配列同一性を有する約10、好ましくは15個の連続ヌクレ
オチド、特に約20nt、より特に約50nt、特別には約100nt、かなり
特別には約150ntの配列を含むのが好ましい。センスヌクレオチド配列の相
補体と100%の配列同一性を有する連続ヌクレオチドのストレッチの長さはセ
ンスヌクレオチド配列自体の長さより長くなることはできないことが明白である
。ここでも、好ましくはギャップの数に、特に短めのアンチセンス配列の場合、
最小限とすべきである。更に、このアンチセンス配列は標的配列の相補体と約7
5〜100%の配列同一性を有することも好ましい。
チド配列の間に配置されたスペーサーヌクレオチド配列を含んで成ってよい。か
かるスペーサー配列の非存在下で、このRNA分子は二本鎖RNAを、特にセン
ス及びアンチセンスヌクレオチド配列が約10ヌクレオチドより大きく、且つセ
ンス及び/又はアンチセンスヌクレオチドの一部がループを形成するのに用いら
れ、センス及びアンチセンスヌクレオチド配列を有する領域間での塩基対合及び
二本鎖RNAの形成を可能とするであろう。スペーサー領域に関連する長さの制
限や配列の要件は、これらのパラメーターがセンス及びアンチセンスヌクレオチ
ド配列を有するRNA領域の二本鎖RNAを形成する能力を損わない限り、ない
ものと予想される。好適な態様において、このスペーサー領域は長さにおいて4
〜約200bpで変動し、しかしながら前述の通り、それはなくてもよい。
域により形成されるヘアーピンRNAは人工ヘアーピンRNAである。「人工ヘ
アーピンRNA」又は「人工ステムループRNA構造」とはヘアーピンが天然で
は起こらないものを意味し、なぜなら上記のセンス及びアンチセンス領域は自然
には一のRNA分子内になく、又はセンス及びアンチセンス領域は標的遺伝子と
の関係で異種であるスペーサー領域によって隔てられているからである。特にス
ペーサーのヌクレオチド配列はセンスヌクレオチド配列の終点の5′又は3′の
対応の位置において標的配列のヌクレオチド配列と75%未満の配列同一性を有
する。ヘアーピンRNAは、それが通常一体化しているRNA分子内に含まれて
いないなら、人工物としても記載できうる。本発明に従い、転写が天然ヌクレオ
チド配列(それは本来、本明細書に記載の限定に合致する)とのヘアーピンRN
A構造をもたらすキメラDNAを使用することが、このヘアーピンRNAが周囲
のRNA(ヘアーピン構造形成に関与しない)を欠くことを条件に、想倒つくで
あろう。
とが好ましいが、かかるRNAをコードするキメラDNA遺伝子はその転写領域
の中に1又は複数のイントロンを含んで成ってよいことが明らかである。
をコードするキメラDNA遺伝子内、好ましくはスペーサー領域内、且つ好まし
くはセンス方向での合体が、標的核酸の発現の抑制の効率を高めることを発見し
た。効率の増大はサイレンス化が起こる植物の頻度の上昇又は表現型特徴の抑制
レベルの上昇として示されうる。特に好適な態様において、イントロンはフラベ
リア・トリネルビア・ピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ2イントロン2と配列
が本質的に同一であり、より特にはそれがSEQ ID NO:7の配列を含ん
で成る。
配列のいずれかを単独で用いる方法に反して(これは一般にセンス又はアンチセ
ンス分子の投与に依存し、それ故センス及びアンチセンス分子をコードするキメ
ラ遺伝子は比較的強力なプロモーターのコントロール下にある必要がある)、本
発明の方法はセンス及びアンチセンス領域の双方を含んで成るRNAの転写的生
産を駆動するのにかかる強力なプロモーター領域の存在を頼りとしないことが観
察された。換言すれば、プロモーター全域、特に植物発現性プロモーターが本発
明のキメラ遺伝子の転写を指令するのに有用である(例えば、Harpsterら、1988
)。当業者に公知の通り、CaMV35Sプロモーターの変異体の存在との関係
で、本発明の目的はこのような別のCaMV35Sプロモーター及び変異体を利
用することにより同等に達成されうる。また、その他の植物発現性プロモーター
、特に構成プロモーター、例えばアグロバクテリウム(Agrobacterium)Ti−又
はRi−プラスミドのオパインシンターゼプロモーター、特にノパリンシンター
ゼプロモーター、又はサブテラニアン・クローバーウィルスプロモーターが類似
の効果を得るために用いられる。また、本発明により考慮されるのは、宿主細胞
が対応のRNAポリメラーゼをも活性形態で含んで成ることを条件に、単独のサ
ブユニットバクテリオファージRNAポリメラーゼ特異的プロモーター、例えば
T7又はT3特異的プロモーターのコントロール下にある細胞内での核酸の表現
型発現を抑制するキメラ遺伝子である。
ロモーターのコントロール下に配することにより特定の細胞、特に特定の植物細
胞内での核酸の表現型発現を抑制するための方法の提供にある。かかる組織特異
的又は器官特異的プロモーターは当業界において周知であり、そして限定するこ
となく種子特異的プロモーター(例えばWO89/03887)、器官−始原特
異的プロモーター(Anら、1996)、幹特異的プロモーター(Kellerら、1988)、
葉特異的プロモーター(Hudspethら、1989)、葉肉特異的プロモーター(例えば
光誘導性ルビスコ(Rubisco)プロモーター)、根特異的プロモーター(Kellerら
、1989)、塊根特異的プロモーター(Keilら、1989)、脈管組織特異的プロモー
ター(Peleman ら、1989)、おしべ特異的プロモーター(WO89/10396
、WO92/13956)、裂解帯特異的プロモーター(WO97/13865
)等が挙げられる。
伝子の発現は、適当な化学誘導因子の適用により、本発明のキメラ遺伝子の転写
DNA領域の発現が化学化合物により誘導されるプロモーター、例えばヨーロッ
パ特許公開(「EP」)0,332,104に開示の遺伝子プロモーター又はW
O90/08826に開示の遺伝子プロモーターへの作用可能式連結によりコン
トロールされうるであろう。
は転写可能DNAをコードするセンス及びアンチセンスRNAを独立の導入遺伝
として、好ましくは一の遺伝子座に配されたもの、特に一の対立遺伝子に配され
たものとして供与することにより得ることができることが見い出された。
現されることのできる核酸の表現型発現を抑制するための方法であって、一の組
換DNA上で連結された第一及び第二キメラDNAを、遺伝子導入植物細胞の核
ゲノム内に双方のキメラDNAが一緒に組込まれるように導入することを含んで
成り;ここで当該第一キメラDNAは下記の作用可能式に連結された要素を含ん
で成り: a)植物発現性プロモーター、特に植物発現性プロモーター; b)前記注目の遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部と75〜100%の
配列同一性を有する少なくとも10個、好ましくは15個の連続ヌクレオチドの
センスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を有するセンスRNA分
子へと転写されることのできるDNA領域;及び c)対応の真核細胞において機能する転写終止及びポリアデニル化に関与するD
NA領域;そして ここで前記第二キメラDNAは下記の作用可能式に連結された要素を含んで成
り: a)植物発現性プロモーター、特に植物発現性プロモーター; b)前記センスヌクレオチド配列の前記少なくとも10個、好ましくは15個の
連続ヌクレオチドの相補体と約75〜100%の配列同一性を有する少なくとも
10個、好ましくは15個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド
配列を含んで成るヌクレオチド配列を有するアンチセンスRNA分子へと転写さ
れることのできるDNA領域;並びに c)対応の植物細胞において機能する転写終止及びポリアデニル化に関与するD
NA領域; ここで当該センス及びアンチセンスRNA分子は相補性である領域間での塩基
対合により二本鎖RNAを形成することができる、方法を提供する。
サー領域の長さ及び配列の好適な態様は本明細書に記載されている。
及びアンチセンスヌクレオチド配列を含んで成るRNA分子は標的核酸の表現型
発現を抑制するため、特に標的化内因性遺伝子又は標的化導入遺伝子の表現型発
現を抑制するために植物細胞に直接導入してもよい。かかるRNA分子は、例え
ば、 1.注目の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と75〜100%の配列同
一性を有する少なくとも10個の連続ヌクレオチドのセンスヌクレオチド配列及
び当該センスヌクレオチド配列のこの少なくとも10個の連続ヌクレオチドの相
補体と約75〜100%の配列同一性を有する少なくとも10個の連続ヌクレオ
チドを含むアンチセンスヌクレオチドを含んで成るヌクレオチド配列を有するR
NA分子へと転写されることのできるDNA領域(ここでこのRNAは当該セン
ス及びアンチセンスヌクレオチド配列を有する領域間でのヘアーピン構造をもた
らしめる塩基対合を介して二本鎖RNAを形成することができる)を、in v
itro転写反応におけるDNA依存性RNAポリメラーゼによる認識のために
適当なプロモーター、例えば限定することなく、T7−ポリメラーゼ特異的プロ
モーターのコントロール下にクローニングし; 2.とりわけ適当なDNA依存性RNAポリメラーゼ及び当該RNA分子を作製
するのに必要な試薬を添加することによりin vitro転写反応を行う;そ
して 3.このRNA分子を単離する; ことにより製造できる。
の方法は当業界において周知であり、そして市販のキットが入手できる。植物細
胞へのRNAの直接導入のための方法も当業者に知られ、そして例えば限定する
ことなく、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、等が挙げられ
る。
に導入してよく、又は細胞の核ゲノムの中に安定的に組込んでよい。一の態様に
おいて、このキメラ遺伝子は真核細胞、特に植物細胞内で複製できるウィルスベ
クター上に配置する(例えば、WO95/34668及びWO93/03161
)。
成る組換DNAには、特に宿主細胞のゲノム内への導入遺伝子の安定的な組込み
を企画している場合、キメラマーカー遺伝子が付随していてよい。このキメラマ
ーカー遺伝子は注目の宿主細胞内で機能するプロモーター、特に植物発現性プロ
モーター、好ましくは構成プロモーター、例えばCaMV35Sプロモーター、
又は光誘導性プロモーター、例えばルビスコの小サブユニットをコードする遺伝
子のプロモーターに5′末端において作用可能式に連結され、そしてその3′末
端において適当な植物転写3′末端形成(formation)及びポリアデニル化シグナ
ルに作用可能式に連結されている。例えば、マーカーDNAは形質転換植物細胞
に識別可能な着色を施すタンパク質をコードすることができ(例えばA1遺伝子
(Mayer ら、1987))、形質転換植物細胞に除草剤耐性力を授けることができ(
例えばホスフィノトリシンに対する耐性をコードするbar遺伝子(EP 0,
242,246))、又は形質転換細胞に抗生物質耐性力を授けることができる
(例えば、ゲンタマイシンに対する耐性をコードするaac(6′)遺伝子(W
O94/01560))。
NAは植物の細胞の核ゲノムの中に安定的に組込むことができる。遺伝子の導入
は本発明のキメラ遺伝子を含んで成るディス・アームドTi−プラスミドである
ベクターにより実施してよく、そしてアグロバクリウムにより実施される。この
形質転換は例えばEP 0,116,718に発表された手順を利用して実施で
きる。
粉媒介形質転換(例えば、EP 0,270,356、WO85/01856及
びUS 4,684,611に記載)、植物RNAウィルス媒介形質転換(例え
ば、EP 0,067,553及びUS 4,407,956に記載)、リポソ
ーム媒介形質転換(例えば、US 4,536,475に記載)、等の方法を適
用することにより、植物細胞を形質転換するのにあらゆるタイプのベクターが利
用できる。
モロコシについて発表されているマイクロプロジェクチル・ボンバードメントも
適当である。単子葉植物、例えば大半のシリアルの細胞は、コンパクトな体細胞
胚増殖カルスを形成することのできる傷害及び/もしくは酵素分解化コンパクト
体細胞胚増殖組織、又はWO92/09696に記載の傷害及び/もしくは分解
化未熟胚を利用して形質転換することもできる。得られる形質転換植物細胞は慣
用の手段で形質転換植物を再生するのに利用できる。
るために、又は本発明の注目の核酸の表現型発現の抑制のためのキメラ遺伝子を
その植物の他の品種もしくは近縁の種、又はハイブリド植物に導入するために慣
用の生育スキームで利用できる。この形質転換植物から得た種子は本発明のキメ
ラ遺伝子を安定ゲノムインサートとして含む。
のキメラ遺伝子を含んで成る真核細胞、好ましくは植物細胞及び生物(好ましく
は植物)の提供にある。
で成る植物細胞の提供にあり、それは更に i.注目の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と75〜100%の配列
同一性を有する少なくとも10個の連続ヌクレオチドのセンスヌクレオチド配列
;及び ii.当該センスヌクレオチド配列のこの少なくとも10個の連続ヌクレオチド
の相補体と約75〜100%の配列同一性を有し、且つ当該センスヌクレオチド
配列との結合により二本鎖RNAを形成することのできる少なくとも10個の連
続ヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列; を含むヌクレオチド配列を有するRNA分子を含んで成り、 ここでこの注目の核酸の表現型発現は、このRNA分子の非存在下での注目の
核酸の表現型発現と比べたとき、当該RNA分子の存在により有意に抑制される
。このRNA分子はキメラDNAによりコードされうる。特に長さ及び配列を考
慮したこのセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列の好適な態様は本明細書に
記載してある。
胞、特に植物細胞における今までに同定されていない核酸配列の発現に係る表現
型の同定もしくは確認のためにも利用できる。
酸配列内の標的配列を選定する。好ましくは、この核酸が複数の推定オープンリ
ーディングフレームを有するなら、この標的配列はこれらのオープンリーディン
グフレームのうちの一つの少なくとも一部を含んで成るべきである。標的ヌクレ
オチド配列の長さは約10ヌクレオチドから、未同定機能を有する注目の核酸の
(ヌクレオチド)長さと等しい長さまで様々であってよい。
含んで成るRNA分子を設計する。
双方を含んで成るRNA分子を今まで同定されていない表現型を有するヌクレオ
チド配列をもつ核酸を含んで成る適当な宿主細胞、特に植物細胞に導入する。こ
のRNAは直接導入してもよく、又は注目の宿主細胞において機能性であるプロ
モーター、特に植物発現性プロモーター、並びに宿主細胞において機能する適当
な3′末端形成及びポリアデニル化シグナルとして機能するDNA領域、並びに
その間にある当該センス及びアンチセンスヌクレオチド配列を含んで成るRNA
分子を生成するように転写されうるDNA領域を含んで成るキメラDNAを介し
て導入できる。このキメラDNAは一過性式に導入するか、又は核ゲノムの中に
組込んでよい。このキメラDNAはウィルスベクター上に載せてもよい(例えば
、WO95/34668及びWO93/03161を参照のこと)。
表現型は単独の細胞において観察又は測定するのに十分でありうるが、(統合し
た)多細胞レベルを得るように又は遺伝子導入生物、特に遺伝子導入植物を再生
するように細胞を培養する必要がある場合もある。
くとも一部に対するセンス及びアンチセンス配列の双方を含んで成るRNA分子
は選定の標的配列を反転リピート方向で有するDNA領域の2つのコピー(好ま
しくは、転写終止シグナルを含まず、且つスペーサー配列をコードする短いDN
A領域により隔てられている)を適当なプロモーターのコントロール下でクロー
ニングすることにより得られうる。このキメラDNAを次にin vitro転
写方法において鋳型DNAとして用い、宿主細胞の中に導入したRNA分子を作
り出すか、又はキメラDNA自体を宿主細胞の中に導入する。
おける核酸の表現型発現を抑制し、シャッター耐性を得る(WO97/1386
5)、改良花色パターンを得る(EP 522880、US 5,231,02
0)、線虫類耐性植物を得る(WO92/21757、WO93/10251、
WO94/17194)、果実の成熟を遅らす(WO91/16440、WO9
1/05865、WO91/16426、WO92/17596、WO93/0
7275、WO92/04456、US 5,545,366)、雄性不稔を得
る(WO94/29465、WO89/10396、WO92/18625)、
生物内の不要な(副次的な)代謝物、例えば植物中のグルコシノレート(WO9
7/16559)又はクロロフィル含有量(EP 779,364)の存在を減
らす、代謝工学により、例えば炭水化物代謝(WO92/11375、WO92
/11376、US 5,365,016、WO95/07355)もしくは脂
質生合成(WO94/18337、US 5,530,192)に関与する特定
の遺伝子の発現を抑制することにより真核細胞又は生物において合成された代謝
物のプロファイルを改変する、老化を遅らせる(WO95/07993)、植物
におけるリグニン化を改変する(WO93/05159、WO93/05160
)、綿の繊維質を改変する(US 5,597,718)、ポリフェノールオキ
シダーゼを減らすことによりポテトの傷害耐性を強める(WO94/03607
)、等に利用できる。
法と比べより良い結果及び/又は高い効率に結びつき、そして標的核酸の表現型
発現を調節するその他の配列特異性メカニズムが本明細書に記載の二本鎖RNA
分子の存在に関与及び/又は誘導されうるものと信じられている。
現型発現の抑制についての特定の用途は雄性不稔の復活について発表されており
、それは雄性不稔DNAを含んで成る導入遺伝子の導入により得られている(W
O94/09143、WO91/02069)。注目の核酸は雄性不稔DNAに
特異的である。繰り返すが、本発明に記載の方法及び産物は雄性不稔のより効率
的な復活の達成のためにこのような方法に適用できる。
子をコードするRNA分子を包含するそれらは植物、特に種子中の油含有物の組
成の改質のために極めて適当であることが実証された。特に好適な植物は油生産
のために利用される穀類(crop)植物、例えば限定することなくネタネ(ブ
ラッシカ・ジュンセア(Brassica juncea)、napus, rapa, deracea, campestris
)、トウモロコシ、綿、ピーナッツ、ヒマワリ、ヒマの種子、亜麻、ココナッツ
、亜麻に、ダイズである。好適な標的遺伝子はデサチュラーゼ遺伝子、特にΔ1
2デサチュラーゼコード遺伝子、例えばFad2遺伝子によりコードされるもの
、特にそのヌクレオチド配列がGenbank Databaseにおいて受託番号AF1234
60(ブラッシカ・カリナタ(Brassica carinata))、AF12042841(
ブラッシカ・ラパ(B. rapa)) 、L26296(アラビドプシス・タリアナ(Ar
abidopsis thaliana))又はA65102(コリルス・アベラナ(Corylus avella
na))で見い出せる遺伝子である。当業者は開示されたfad2遺伝子と相同性で
ある遺伝子を例えばハイブリダイゼーション及び/又はPCR技術により得るこ
とができることが明白である。
についての好適な態様は本明細書に記載してある。また、プロモーター要素を特
に考慮に入れたヘアーピン含有RNA分子をコードするキメラ遺伝子についての
好適な態様も本明細書に記載してある。この用途に関し、プロモーターが種子特
異的プロモーターであることが特に好ましい。
センス方向におけるΔ12デサチュラーゼコードORFの一部及びアンチセンス
方向における類似の部分を、好ましくはスペーサー配列により隔離されて含んで
成る。特に好適な態様において、この人工ヘアーピンRNA(又はそれをコード
するキメラ遺伝子)はSEQ ID NO:6のヌクレオチド配列を含んで成る
か、又は上記のブラッシカfad2遺伝子をもとに似たようにして構築されたヌ
クレオチド配列を含んで成る。
ロモーターのコントロール下、特に本明細書を記載のFPIプロモーターのコン
トロール下で転写される。
びにリノレン酸及びリノール酸の同時減少につながる。オレイン酸の増大並びに
リノレン酸及びリノール酸の同時減少が顕著である油を有する植物の高度な頻度
は、一般の同時抑制(cosuppression)構築体を担持する遺伝子導入植物よりも本
発明の手段及び方法を利用して認められる。更に、上記の増大及び減少の各々は
、一般の同時抑制構築を担持する遺伝子導入植物よりも各々大きい及び小さかっ
た。
酸含有量(総脂肪酸組成の%として表示)、特にコントロール植物と比べて3倍
上昇したオレイン酸含有量を有する油を含んで成る植物及び種子を得ることが可
能である。
を超える油をその種子が含んで成る遺伝子導入ブラッシカ植物が得られうる。
ィルス耐性、特に極めて強いウィルス耐性を得るために特に適するであろう。植
物をそれに対して耐性にすることができるウィルスの非限定的なリストを表1に
示す。
又はレプリカーゼ遺伝子の他にウィルス耐性植物を得るために今まで利用されて
いなかったウィルス遺伝子の利用を可能にする。かかる異なるウィルス遺伝子は
ウィルス耐性植物を得るための標的核酸配列としてプロテアーゼコード遺伝子(
Pro)、ゲノム連鎖タンパク質(Vpg)コード遺伝子、細胞質封入体コード
遺伝子(CI)を含む。
であろう。
物の全ての植物細胞における核酸の表現型発現の抑制に適し、特に穀物植物、例
えばトウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、サトウキビ、ナタネ、ダイズ、植
物(例えばチコリー、ブラッシカ植物、レタス、トマト)、タバコ、ポテト及び
テンサイ、更には園芸、花卉栽培又は植林において利用される植物にも適する。
本発明の手段及び方法は複雑なゲノムを有する植物、例えば倍数性植物に極めて
適するであろう。
物に全身的に広がることができ、それ故本発明のキメラ遺伝子を含んで成る遺伝
子導入ストック上にグラフティングした非遺伝子導入つぎ穂の細胞内の核酸の表
現型発現を抑制することが可能である(その逆もまた真なりである)。かかる方
法は園芸、花卉栽培又は果実の生産において重要でありうる。
のキメラ遺伝子の構築及びかかる遺伝子の利用を述べている。実施例に何らかの
ことわりのない限り、全ての組換DNA技術はSambrookら(1989)Molecular Cl
oning : A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press
, NY及びAusubelら(1994)Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1
及び2, Current Protocols, USA に記載の標準プロトコールに従って実施した。
植物分子研究についての標準の材料及び方法はPlant Molecular Biology Labfax
(1993), R.D.D. Croy又はBIOS Scientific Publications Ltd (UK) and Blackw
ell Scientific Publications, UKに記載されている。
センス構築体の構築のために利用したNia遺伝子のポテトウィルスYフラグメ
ントの配列。 SEQ ID NO:2:実施例1のGusd CoP構築体のコード領域の
配列。 SEQ ID NO:3:ジョンソングラス(Johnsongrass)モザイクウィル
ス由来の修飾5′非翻訳領域(5′UTR)の配列。 SEQ ID NO:4:S7エンハンサーを有するサブテラニアン・クロー
バーウィルスプロモーターNo.4の配列。 SEQ ID NO:5:サブテラニア・クローバーウィルス二重エンハンサ
ープロモーターNo.4の配列。 SEQ ID NO:6:Δ12デサチュラーゼ遺伝子発現阻害のためのCo
P構築体の配列。 SEQ ID NO:7:フラベリア・トリネルビア(Flaveria trinervia)
ピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼイントロンの配列。
発明を限定するものではない。
を利用した。使用した構築体の模式図を図1A及び1Bに示す。
内の3つの停止コドン、及びPstI部位(図1Aの構築体4及び5のようにイ
ントロンの挿入のため)を含む。図1Aのベクター構築体2及び6において、G
usdオープンリーディングフレームをNcoI部位に挿入し、停止コドンを除
く。図1Aのその全の構築体全てにおいて、それはPstI部位の下流に挿入す
る。* Wongら(1997)により改良されたヒマ種子カタラーゼイントロン(Ohtaら、19 90)(「intron」)
式に組立て、そして得られるキメラ遺伝子をT−DNAベクターpART27及
びpART7ベクター(Gleave, 1992)の中に左T−DNAボーターとキメラ植
物発現性neo遺伝子との間に挿入することにより構築した。
コードするDNAはgusコード領域から2つのEcoRV制限部位の間にある
配列を除くことにより得た。β−グルクロニダーゼ遺伝子に対するセンス及びア
ンチセンスヌクレオチド配列の双方を含んで成るRNA分子をコードするキメラ
遺伝子の構築のため、配列をGusd遺伝子に加えて5′末端を558塩基にわ
たり塩基対合させ、SEQ ID NO:2に示す配列を得た。この配列をメイ
ズユビキチンプロモーターとtm1′ターミネーターとの間にクローニングし、
そしてT−DNAベクターの中に挿入した。
の第一キメラ遺伝子は以下から成る: 1.CaMV35Sプロモーター配列(これは次のものに連結されている) 2.センス方向における、 ・Vpgタンパク質(例えばGenbank 寄託番号No.ZZ9526ヌクレオチ
ド1013〜ヌクレオチド1583参照)又は ・CIタンパク質の一部(例えばGenbank 寄託番号No.M95491ヌクレ
オチド3688〜ヌクレオチド4215参照)又は ・プロテアーゼ(Pro)(例えばEMBL寄託番号No.D00441ヌク
レオチド5714〜ヌクレオチド7009) のいずれかをコードするPVY由来のヌクレオチド配列、それに続く 3.上記のサブテラニアン・クローバーモザイクウィルス由来のS4ターミネー
ター。
域に由来する。
図2参照)。それは以下を含んで成る: 1.Stalbergらに記載の−309〜+1の間の配列を含むFP1プロモーター(
トランケーション種子特異的ナビンプロモーター)(これは次のものに連結され
ている) 2.623bpのスペーサー配列と連結した、センス方向及びアンチセンス方向に
おけるアラビドプシス・タリアナ(Fad2)由来のΔ12デサチュラーゼをコ
ードするORF内に5′側に配置された480bpを含んで成るSEQ ID N
O:6のヌクレオチド配列;それに続く 3.ノパリンシンターゼ遺伝子由来のターミネーター。
イントロン配列の存在の影響を検討するために構築した。従って、以下を含んで
成る構築体を作製した: 1.CamV35Sプロモーター、それに続く 2.センス方向におけるPVY(上記参照)由来のプロテアーゼをコードするO
RF; 3.SEQ ID NO:7の配列(フラベリア・トリネルビアピルビン酸オル
トリン酸ジキナーゼイントロン2をコード); 4.アンチセンス方向におけるPVY由来のプロテアーゼをコードするORF;
及び 5.オクトパインシンターゼ遺伝子ターミネーター。
の通りにして形質転換し、そして完全植物へと再生した。イネ(オリザ・サチバ
(Oryza sativa))をWangら(1997)に本質的に記載の通りにして形質転換した。
るイネ植物由来の成熟胚を成熟種子から取り出し、そしてカルス誘導培地の上に
7日間載せた。この培養物からカルスを回収し、様々なバイナリーベクターを含
むアグロバクテアと2日間インキュベーションし、次いでヒグロマイシン、ビア
ラフォス(bialaphos)及びTimentin(商標)を含むカルス形成培地上に載せた。
それから4週間の間でヒグロマイシン及びビアラフォス耐性カルスが発育した。
これらのカルス系をヒグロマイシン及びビアラフォス含有培地上に更に2ヶ月維
持し、それからGUS活性についてアッセイした。
化学染料X−グルクロニド又は蛍光色素基質4−メチル−ウンベリフェロングル
クロニド(MUG)を利用してGUS活性について試験した。
アンチセンスのみ、センスのみ、又はセンス及びアンチセンス(相補性ペアー(
CoP))の双方を含んで成るキメラ遺伝子の比較 単一の導入遺伝子に由来するβ−グルコニダーゼ(GUS)(及びhph遺伝
子由来のヒグロマイシン耐性)を発現する遺伝子導入イネ組織(系V10−28
及びV10−67)をホスフィノトリシン耐性を授けるbar遺伝子並びに不活
化(crippled)GUS(GUSd)遺伝子由来の様々なセンス、アンチ
センス及びCoP構築体(図1A参照)を含むベクターを用いて超形質転換した
。この超形質転換組織をヒグロマイシン及びビアラフォス選択培地上で3週間維
持し、次いで、GUS活性についてアッセイした。不活性GUS遺伝子を使用し
たのは、この遺伝子由来の発現が内因性GUS活性と重ならないようにするため
である。
量中で1.5μgの総タンパク質により測定したMUの生成速度を示す。この速
度は37℃で30分かけて測定した。非遺伝子導入イネカルスについての測定値
は0.162であった。導入構築体の説明に続くかっこ内の数値は図1Aに言及
してある。
による超形質転換が内因性GUS活性に対してサイレンシング効果を有さないこ
とを示した。イントロン又は早期停止コドンを有する又は有しないセンス又はア
ンチセンス方向におけるGUSdによる超形質転換は内因性GUS活性のある程
度の抑制(分析したカルスの約25%において)を示した(表2の最後の2列を
参照のこと。それは2.00未満のMUGアッセイ測定値を有する分析カルスの
%を示す)。しかしながら、CoP構築体による超形質転換は分析したカルスの
約75〜100%において、内因性GUSの活性の低下を供した。このCoP構
築体は生成されるmRNAの3′末端が転写体の5′末端との二量体を形成し、
「パンハンドル」構造を供するように設計した。
とができ、この設計が慣用のセンス又はアンチセンス構築体よりもはるかに効率
的であり、そしてこのアプローチが植物細胞中に存在する遺伝子の表現型発現を
抑制するのに利用できうることを示した。
子のみ、センス遺伝子のみ、又は両遺伝子を同時に含んで成るキメラ遺伝子を利
用する効率の比較 PVYプロテアーゼコード配列(SEQ ID NO:1)をセンス方向、ア
ンチセンス方向及び相補性ペアー(CoP)方向において用いて遺伝子構築体を
作った。ここでそのT−DNAはセンス及びアンチセンスキメラ遺伝子の双方を
それら自身のプロモーターのコントロール下でそれぞれ含んで成る。3つのアレ
ンジメント全てにおいて、CaMV35Sプロモーターを使用した。5種類のバ
ージョンのCoP構築体を作り、それにおいて第二のプロモーターはCaMV3
5Sプロモーター、S4プロモーター、二重S4プロモーター、S7増強S4プ
ロモーター、又は脈管特異的roICプロモーターである(図1B参照)。
介し)、そして約25の独立の形質転換植物が一のキメラ遺伝子構築体当りで回
収された。この遺伝子導入植物を土壌に移し、そして温室の中で維持した。土壌
に移してから約1ヶ月経過後、それらの植物に標準の適用方法を利用してポテト
ウィルスYを人的に接種した。2及び4週間後、植物をウィルス症状について採
点した。これらの結果(表3)は1ヶ月後、センス遺伝子だけを含んで成る27
の植物のうち2つ及びアンチセンス遺伝子だけを含んで成る25の植物のうちの
1つが症状を全く示さないことを示した。
5S−Nia/S4−アンチセンスNia構築体)、25のうちの7(35S−
Nia/RolC−アンチセンスNia構築体)、27のうちの10(35S−
Nia/35C−アンチセンスNia)、26のうちの7(35S−Nia/S
4S4−アンチセンスNia構築体)及び25のうちの7(35S−Nia/S
7S4−アンチセンスNiaの構築体)植物が各々症状を示さなかった。症状を
示さない植物はPVYに対する強力な耐性を示すと考える。それらは更に2ヶ月
の追跡にわたり症状を示さないであり続けた(表3では強力耐性(ER)として
示す)。いくつかのその他の植物、特にCoP構築体を含むものは症状の遅延及
び抑制を示した。これらは接種して2週間後に症状を示さなかったが、4週間後
には一部の植物において若干のささいな損傷を示した。これらの植物は非遺伝子
導入又は感受性タバコよりもPVYによる影響をはるかに受けにくく、そして耐
性として採点した(表3ではERと表示)。
はるかに高い頻度の強力な耐性及び耐性を有する遺伝子導入植物をもたらしたこ
とを示す。
した。従って、強力な耐性及び耐性を示す全ての遺伝子導入植物からDNAを抽
出した。このDNAをサザン分析を利用して遺伝子コピー数を調べた。データー
(表4)は強力な耐性を示すCoP植物のいくつかのゲノム、特に35S−Ni
a/S4−アンチセンスNia植物のゲノムが遺伝子構築体の単一のコピーだけ
を含むことを示した。
性並びに低コピー数のCoP構築体35S−Nia/S4−アンチセンスNia
及び35S−Nia/35S−アンチセンスNiaを示す植物由来の種子、並び
に強力耐性を示すセンス及びアンチセンス植物由来の種子を温室の中で発芽及び
成長させた。2つの感受性CoP系、2つの感受性センス遺伝子のみの系、及び
2つの感受性アンチセンス遺伝子のみの系から集めた種子からも植物を成育させ
た。各系由来の20の植物をサイズ及び発育段階の全体的な均質性に基づき選別
し、個別の鉢に植え、1週間かけて回復させ、次いでPVYを接種した。これら
の植物を接種して2,4及び7週間後にウィルスについて評価した。結果(表5
)は、1又は2の遺伝子コピーを含む35S−Nia/S4−アンチセンスNi
a及び35S−Nia/35S−アンチセンスNiaの8の植物系全てが約3:
1の強力耐性:感受性の分離比を示すことを示した。単一アンチセンス遺伝子の
みの系の子孫はT0において所定の強力な耐性を有し、そして一の遺伝子コピー
を含む強力耐性センス植物の子孫は異常な分離比(2:18;ER:感受性)を
示した。強力な耐性を示し、且つ6の遺伝子コピーを含む一のセンス植物の子孫
は約3:1の比(ER:感受性)を示した。感受性T0植物細胞の全ての子孫が
PVYに対する完全な感受性を示した。
れる耐性の安定な発現を供することを示す。このことは、これらの系において、
PVY CoP遺伝子座は強力耐性を供与するのに〜100%有効であり、一方
アンチセンス系、及び2つのセンス系のうちの一方における導入遺伝子座は強力
耐性を供与するのにある程度しか有効でないことも示す。
遺伝子及びアンチセンス遺伝子)による強力ウィルス耐性遺伝子導入タバコ センス導入遺伝子(これは孤立の導入遺伝子コピーを含む;表6参照)を含む
PVY感受性植物をアンチセンス導入遺伝子(これはサザン分析によりコピー数
についても分析済み;表6参照)を含むPVY感受性植物と交配させた。一回交
配当り得られる子孫20個を温室の中で繁殖させ、次いでPVYを接種し、そし
て実施例2に記載の通りにしてウィルス感染について評価した。交配(孤立遺伝
子/座・含有植物間)由来の子孫は下記の比にあると予測されるであろう:1/
4センス遺伝子のみ、1/4のアンチセンス遺伝子のみ、1/4のセンス及びア
ンチセンス遺伝子双方を含んで成るもの、及び1/4の遺伝子を全く含まないも
の。結果(表4)は、予測通り、有効な交配全てに由来する子孫が所定の比率で
強力な耐性を示し、一方で自己センス又は自己アンチセンス植物由来の子孫はい
ずれも強力な耐性を示さなかった。強力耐性を示さない一の交配体は8コピーの
アンチセンス遺伝子を含む親植物アンチセンス2(As2)に由来した。センス
1(S1)(雄性)×アンチセンス1(As1)(雌性)及びセンス3(S3)
(雌性)×アンチセンス4(As4)(雄性)の交配由来の20個の子孫植物全
てをサザン分析により調べた。結果は、双方の交配において、強力な耐性(又は
一のケースでは耐性)を示す植物はセンス及びアンチセンス遺伝子の双方を含み
、一方で導入遺伝子なし(無后)又はセンスもしくはアンチセンス遺伝子のみを
有する植物は全てPVYに対して感受性であることを示した。植物と強力耐性と
の間での相補性ペアー(センスとアンチセンス遺伝子)の存在の絶対的な関係を
確認するため、強力耐性を示す子孫植物全てをサザンブロットにより分析した。
これらの結果は全ての強力耐性又は耐性植物がセンス及びアンチセンス遺伝子の
双方を含むことを示した。
ードする遺伝子がゲノムの中に一緒に配置されていなくても、耐性又は強力耐性
を供することを示した。この「相補性ペアー現象」は単に導入遺伝子量の増大に
なるものではなく、なぜなら自己子孫の1/4がホモ接合性であり、それ故二重
の遺伝子量を有しても感受性であるからである。
VY感染して7週間後に非常にわずかな損傷を示した。S1,S2,S3,S4
及びS5は35S−センスNia遺伝子構築体を含んで成るPVY感受性遺伝子
導入タバコ植物であり、全て1コピーの導入遺伝子が組込まれたものである。
子が組込まれた35S−アンチセンスNia遺伝子構築体を含んで成るPVY感
受性遺伝子導入タバコ植物である。
ス遺伝子の利用の評価 本明細書に記載のPVY由来のプロテアーゼ、Vpg又はClタンパク質をコ
ードする領域に由来する配列を基礎とする第一及び第二キメラウィルス耐性遺伝
子を含んで成るT−DNAベクターを、後にPVYを負荷せしめる形質転換化タ
バコ植物を得るために用いた。その結果を以下の表にまとめる:
センス及びアンチセンス配列間にセンス方向又はアンチセンス方向のいずれかに
おいてイントロン(フラベリア・トリネルビアピルビン酸オルトリン酸ジキナー
ゼイントロン2)の挿入されたCoP構築体をコードするキメラ遺伝子を含んで
成るT−DNAベクターを、その後にPVYを負荷せしめる形質転換タバコ植物
を得るために用いた。その結果を以下の表にまとめる:
変 本明細書に記載の破砕種子から抽出した油中の脂肪酸組成を改良するためのT
−DNAベクターを、アラビドプシス・タリアナにおけるΔ12デサチュラーゼ
遺伝子(Fad12)の発現を抑制するためのCoP構築体をコードするキメラ
遺伝子(図2A;SEQ ID NO:6参照)を導入するために用いた。
、Fad2遺伝子の発現はアラビドプシス・タリアナ中のΔ12デサチュラーゼ
遺伝子(Fad12)由来の完全ORFに結合したFP1種子特異的プロモータ
ー及びノパリンシンターゼプロモーター(図2B参照)を含んで成るわかり易い
同時抑制構築体により抑制されている。
伝子導入アラビドプシスを利用した。
方法により決定した。2回の測定の平均値である結果を表9にまとめる。
X.X」と表示)は、オレイン酸の増大並びにリノレン酸及びリノール酸の同時
減少が同時抑制構築体を担持する遺伝子導入植物におけるものよりも有意である
植物を高頻度で有した。更に、上記の増大、上記の減少のそれぞれ絶対レベルは
、同時抑制構築体を担持する遺伝子導入植物よりもそれぞれ大きい及び小さかっ
た。
Aベクターをブラッシカナタネ種子に導入した。遺伝子導入ブラッシカ種から回
収した種子を破砕し、そして油抽出し、そして油中の脂肪酸の組成を分析した。
レイン酸含有量及び減少したリノレン酸及びリノール酸含有量を有した。実施例
6に記載のものと類似するが、Δ12デサチュラーゼコードORFに対応するセ
ンス及びアンチセンス領域の配列がブラッシカ種由来の相同性ORFを基礎とす
るCoP構築体をコードするキメラ遺伝子を担持するT−DNAベクターを構築
し、そしてブラッシカナタネ種子を導入した。
ッシカ種ORFの配列はGenbank データーベースから受託番号AF042841
及びAF124360で入手できる。
油中の脂肪酸の組成を分析した。CoP構築体を担持する遺伝子導入ブラッシカ
由来の油は有意に増大したオレイン酸含有量並びに減少したリノール酸及びリノ
レン酸含有量を有した。
約1500bp)(次のものにライゲーションされている) 3.アンチセンス方向における亜麻由来の内因性さび病耐性遺伝子の類似の部(
長さ約1450bp)、かくしてスペーサー配列抜きで完全な反転リピートが作ら
れ、各リピートは長さ約1450bpである;それに続く 4.nosターミネーター から成る。
ーミネーター間に挿入された上記のsub3に記載したものと類似のフラグメン
トを用いて作った。
これらのCoP及びアンチセンス構築体により形質転換した抑制が生じたら、植
物はさびに対して感受性な株となる。この構築体は何ら効果を有さず、形質転換
植物はさびに耐性な株であり続けた。
に用いる種々のセンス及びアンチセンス構築体並びにいわゆるCoP(相補性ペ
アー)構築体の模式図。
に用いる種々のセンス及びアンチセンス構築体並びにいわゆるCoP(相補性ペ
アー)構築体の模式図。
ために用いたいわゆるパンハンドル構築体及びCoP構築体の模式図(Nos
Pro:ノパリンシンターゼ遺伝子プロモーター;nptIIネオマイシンホスホ
トランスフェラーゼコード領域;Nos term:ノパリンシンターゼ遺伝子
ターミネーター;FP1:トランケーション化種子特異的ナピンプロモーター;
480bp:センス方向におけるアラビドプシス・タリアナのFad2遺伝子の5
′末端;623bp:スペーサー;480bp:アンチセンス方向におけるアラビド
プシス・タリアナのFad2遺伝子の5′末端。
を抑制するための一般の同時抑制構築体の模式図。
Claims (38)
- 【請求項1】 真核細胞において通常発現されることのできる注目の核酸の
表現型発現を抑制するための方法であって、下記の作用可能式的に連結された要
素を含んで成るキメラDNAの導入工程を含んで成る方法: a)前記真核細胞内で機能性であるプロモーター; b)DNA領域、ここで当該領域は転写されると人工ステム−ループ構造を形成
することのできるRNA領域を含んで成るRNA分子を生成し、ここで当該ステ
ム−ループ構造のアニーリングし合うRNA配列のうちの一方は前記注目の核酸
のヌクレオチド配列の少なくとも一部と本質的に類似する配列を含んで成り、そ
してここで当該アニーリングし合う配列の第二のものは当該注目の核酸の前記ヌ
クレオチド配列の少なくとも一部の相補体の少なくとも一部と本質的に類似する
配列を含んで成る;並びに任意的に c)転写終止及びポリアデニル化に関与するDNA領域。 - 【請求項2】 真核細胞において通常発現されることのできる注目の核酸の
表現型発現を抑制するための方法であって、下記の作用可能式に連結された要素
を含んで成るキメラDNAの導入工程を含んで成る方法: a)前記真核細胞内で機能性であるプロモーター; b)DNA領域、ここで当該領域は転写されると i.前記注目の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と75〜100%の
配列同一性を有する少なくとも10個の連続ヌクレオチドのセンスヌクレオチド
配列;及び ii.前記センスヌクレオチド配列の前記少なくとも10個の連続ヌクレオチド
の相補体と約75〜100%の配列同一性を有する少なくとも10個の連続ヌク
レオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列; を含んで成るヌクレオチド配列を有するRNA分子を生成し、ここで当該RN
Aはセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列を有する領域間での、当該アンチ
センス配列の前記少なくとも10個の連続ヌクレオチドが当該アンチセンス配列
の前記少なくとも10個の連続ヌクレオチドと塩基対合を形成するような塩基対
合を介して二本鎖RNAステムを有する人工ヘアーピンRNA構造を形成するこ
とができる;並びに任意的に c)転写終止及びポリアデニル化に関与するDNA領域。 - 【請求項3】 前記RNA分子が更に前記センス及び前記アンチセンスヌク
レオチド配列の間に配されたスペーサーヌクレオチド配列を含んで成る請求項2
記載の方法。 - 【請求項4】 前記センスヌクレオチド配列が前記核酸の前記ヌクレオチド
配列の少なくとも一部と75〜100%の配列同一性を有する少なくとも約55
0個の連続ヌクレオチドを含んで成る、請求項2記載の方法。 - 【請求項5】 前記注目の核酸が前記真核細胞のゲノムの中に組込まれた遺
伝子である、請求項2記載の方法。 - 【請求項6】 前記遺伝子が内因性遺伝子である、請求項5記載の方法。
- 【請求項7】 前記遺伝子が外来導入遺伝子である、請求項5記載の方法。
- 【請求項8】 前記キメラDNAが前記DNAのゲノムの中に安定的に組込
まれている、請求項2記載の方法。 - 【請求項9】 前記注目の核酸が感染性ウィルスのゲノムの中に含まれてい
る、請求項2記載の方法。 - 【請求項10】 前記感染性ウィルスがRNAウィルスである、請求項9記
載の方法。 - 【請求項11】 前記真核細胞が植物細胞である、請求項1記載の方法。
- 【請求項12】 前記植物細胞が植物の中に含まれている、請求項11記載
の方法。 - 【請求項13】 真核細胞において通常発現されることのできる注目の核酸
の表現型発現を抑制するための方法であって、 i.前記注目の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と75〜100%の
配列同一性を有する少なくとも10個の連続ヌクレオチドのセンスヌクレオチド
配列;及び ii.前記センスヌクレオチド配列の前記少なくとも10個の連続ヌクレオチド
の相補体と約75〜100%の配列同一性を有する少なくとも10個の連続ヌク
レオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列; を含んで成るヌクレオチド配列を有する少なくとも一のRNA領域を含んで成
るキメラRNA分子を導入する工程を含んで成り、 ここで当該RNA領域はセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列を有する領
域間での、当該センス配列の前記少なくとも10個の連続ヌクレオチドが当該ア
ンチセンス配列の前記少なくとも10個の連続ヌクレオチドと塩基対合を形成す
るような塩基対合を介して二本鎖RNAステムを有する人工ヘアーピンRNA構
造を形成することができる、方法。 - 【請求項14】 植物細胞における注目の遺伝子の遺伝子発現を抑制するた
めの方法であって、一の組換DNA上で連結された第一及び第二キメラDNAを
、遺伝子導入植物細胞の核ゲノム内に一緒に組込まれるように導入することを含
んで成り;ここで当該第一キメラDNAは下記の作用可能式に連結された要素を
含んで成り: a)植物発現性プロモーター; b)前記注目の遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部と75〜100%の
配列同一性を有する少なくとも10個の連続ヌクレオチドのセンスヌクレオチド
配列を含んで成るヌクレオチド配列を有するセンスRNA分子へと転写されるこ
とのできる第一DNA領域;及び任意的に c)植物細胞において機能する転写終止及びポリアデニル化に関与するDNA領
域;そして ここで前記第二キメラDNAは下記の作用可能式に連結された要素を含んで成
り: a)植物発現性プロモーター; b)前記センスヌクレオチド配列の前記少なくとも10個の連続ヌクレオチドの
相補体と約75〜100%の配列同一性を有する少なくとも10個の連続ヌクレ
オチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を有
するアンチセンスRNA分子へと転写されることのできる第二DNA領域;並び
に任意的に c)植物細胞において機能する転写終止及びポリアデニル化に関与するDNA領
域; ここで当該センス及びアンチセンスRNA分子は相補性である領域間での塩基
対合を介して二本鎖RNAを形成することができる、 方法。 - 【請求項15】 ウィルス耐性真核生物を獲得するための方法であって: 1)第一及び第二キメラDNAを有する当該生物の細胞を用意し、ここで当該第
一キメラDNAは下記の作用可能式に連結された要素を含んで成り: a)当該細胞において機能性であるプロモーター; b)当該生物に感染することのできるウィルスのゲノムのヌクレオチド配列の
少なくとも一部と75〜100%の配列同一性を有する少なくとも10個の連続
ヌクレオチドのセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を有する
センスRNA分子へと転写されることのできる第一DNA領域;並びに任意的に c)当該細胞において機能する転写終止及びポリアデニル化に関与するDNA
領域;そして ここで当該第二キメラDNAは下記の作用可能式に連結された要素を含んで成
り; a)当該細胞において機能性であるプロモーター; b)前記センスヌクレオチド配列の前記少なくとも10個の連続ヌクレオチド
の相補体と約75〜100%の配列同一性を有する少なくとも10個の連続ヌク
レオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を
有するアンチセンスRNA分子へと転写されることのできる第二DNA領域;並
びに任意的に c)当該細胞において機能する転写終止及びポリアデニル化に関与するDNA
領域;そして ここで当該センス及びアンチセンスRNA分子は相補性である領域間での塩基
対合を介して二本鎖RNAを形成することができる、 方法。 - 【請求項16】 前記生物が植物である、請求項15記載の方法。
- 【請求項17】 前記植物の前記細胞に前記第一及び第二キメラDNAが、
前記第一又は第二キメラDNAのいずれかを含んで成る親株植物を交配させるこ
とにより供与されたものである、請求項16記載の方法。 - 【請求項18】 前記植物の前記細胞に前記第一及び第二キメラDNAが、
植物細胞に前記第一及び第二キメラDNAを形質転換せしめ、そして前記形質転
換植物細胞から植物を再生せしめることにより供与されたものである、請求項1
6記載の方法。 - 【請求項19】 前記第一及び第二キメラDNAが前記植物細胞の前記核ゲ
ノムの中に別々に組込まれたものである、請求項16記載の方法。 - 【請求項20】 前記第一及び第二キメラDNAが一の組換DNA上に、双
方のキメラDNAが遺伝子導入植物細胞の核ゲノムの中に一緒に組込まれるよう
にして連結されている、請求項16記載の方法。 - 【請求項21】 真核細胞における注目の核酸の発現に関連する表現型を同
定するための方法であって: a.前記注目のヌクレオチド配列内で、少なくとも10個の連続ヌクレオチド
の標的配列を選定し; b.当該選定標的配列の長さに対応し、且つ当該選定標的配列と少なくとも約
75〜100%の配列同一性を有するセンスヌクレオチド配列を設計し; c.i.当該センスヌクレオチド配列の前記少なくとも10個の連続ヌクレオ チドの相補体と少なくとも約75〜100%の配列同一性を有し; ii.当該センスヌクレオチド配列の一部の相補体と100%の配列同一性 を有する少なくとも約10個の連続ヌクレオチドのストレッチを含んで成る アンチセンスヌクレオチド配列を設計し; d.当該センス及びアンチセンスヌクレオチド配列の双方を含んで成るRNA
分子を過去に同定されていない表現型を有するヌクレオチド配列を含む核酸を含
んで成る適当な真核宿主細胞に導入し;そして e.当該表現型を適当な方法により観察する; ことを含んで成る方法。 - 【請求項22】 通常表現的に発現されることのできる注目の核酸を含んで
成る真核細胞であって、更に下記の作用可能式に連結された要素を含んで成るキ
メラDNA分子を含んで成る細胞: a)前記真核細胞内で機能性であるプロモーター; b)DNA領域、ここで当該領域は転写されると i.前記注目の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と75〜100%の
配列同一性を有する少なくとも10個の連続ヌクレオチドのセンスヌクレオチド
配列;及び ii.前記センスヌクレオチド配列の前記少なくとも10個の連続ヌクレオチド
の相補体と約75〜100%の配列同一性を有する少なくとも10個の連続ヌク
レオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列; を含んで成るヌクレオチド配列を有する少なくとも一のRNA領域を有するR
NA分子を生成し、ここで当該RNAはセンス及びアンチセンスヌクレオチド配
列を有する領域間での塩基対合を介して二本鎖RNAステムを有する人工ヘアー
ピンRNA構造を形成することができる;並びに任意的に c)転写終止及びポリアデニル化に関与するDNA領域; ここで当該注目の核酸の表現的発現性は有意に抑制されている。 - 【請求項23】 真核細胞において通常発現されることのできる注目の核酸
を含んで成る真核細胞であって、 i.前記注目の核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と75〜100%の
配列同一性を有する少なくとも10個の連続ヌクレオチドのセンスヌクレオチド
配列;及び ii.前記センスヌクレオチド配列の前記少なくとも10個の連続ヌクレオチド
の相補体と約75〜100%の配列同一性を有する少なくとも10個の連続ヌク
レオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列; を含んで成るヌクレオチド配列を有する少なくとも一のRNA領域を含んで成
るキメラRNA分子を含んで成り、 ここで当該RNA領域はセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列を有する領
域間での、当該センス配列の前記少なくとも10個の連続ヌクレオチドが当該ア
ンチセンス配列の前記少なくとも10個の連続ヌクレオチドと塩基対合を形成す
るような塩基対合を介して二本鎖RNA領域を有する人工ヘアーピンRNAを形
成することができる、細胞。 - 【請求項24】 通常表現的に発現されることができる注目の遺伝子を含ん
で成る真核細胞であって、一の組換DNA上で連結された第一及び第二キメラD
NAを、当該真核細胞の核ゲノム内に一緒に組込まれて更に含んで成り;ここで
当該第一キメラDNAは下記の作用可能式に連結された要素を含んで成り: a)当該真核細胞において機能性であるプロモーター; b)前記注目の遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部と75〜100%の
配列同一性を有する少なくとも10個の連続ヌクレオチドのセンスヌクレオチド
配列を含んで成るヌクレオチド配列を有するセンスRNA分子へと転写されるこ
とのできる第一DNA領域;並びに任意的に c)転写終止及びポリアデニル化に関与するDNA領域;そして ここで前記第二キメラDNAは下記の作用可能式に連結された要素を含んで成
り: a)当該真核細胞において機能性であるプロモーター; b)前記センスヌクレオチド配列の前記少なくとも10個の連続ヌクレオチドの
相補体と約75〜100%の配列同一性を有する少なくとも10個の連続ヌクレ
オチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を有
するアンチセンスRNA分子へと転写されることのできる第二DNA領域;並び
に任意的に c)転写終止及びポリアデニル化に関与するDNA領域; ここで当該センス及びアンチセンスRNA分子は相補性である領域間での塩基
対合により二本鎖RNAを形成することができる、 細胞。 - 【請求項25】 植物細胞である請求項22記載の真核細胞。
- 【請求項26】 請求項25記載の植物細胞を含んで成る植物。
- 【請求項27】 第一及び第二キメラDNAが核ゲノムの中に組込まれてい
るウィルス耐性植物であって、ここで当該第一キメラDNAは下記の作用可能式
に連結された要素を含んで成り: a)植物発現性プロモーター; b)当該植物に感染することのできるウィルスのゲノムのヌクレオチド配列の
少なくとも一部と75〜100%の配列同一性を有する少なくとも10個の連続
ヌクレオチドのセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を有する
センスRNA分子へと転写されることのできる第一DNA領域;並びに任意的に c)当該植物細胞において機能する転写終止及びポリアデニル化に関与するD
NA領域;そして ここで当該第二キメラDNAは下記の作用可能式に連結された要素を含んで成
り; a)植物発現性プロモーター; b)前記センスヌクレオチド配列の前記少なくとも10個の連続ヌクレオチド
の相補体と約75〜100%の配列同一性を有する少なくとも10個の連続ヌク
レオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を
有するアンチセンスRNA分子へと転写されることのできる第二DNA領域;並
びに任意的に c)当該植物細胞において機能する転写終止及びポリアデニル化に関与するD
NA領域;そして ここで当該センス及びアンチセンスRNA分子は相補性である領域間での塩基
対合を介して二本鎖RNAを形成することができる、 植物。 - 【請求項28】 前記第一及び第二キメラDNAが核ゲノム内の一の遺伝子
座において組込まれている、請求項27記載の植物。 - 【請求項29】 前記第一及び第二キメラDNAが核ゲノム内の異なる遺伝
子座において組込まれている、請求項27記載の植物。 - 【請求項30】 植物油の脂肪酸プロファイルを改良するための方法であっ
て、当該植物の細胞の中にキメラDNAを導入する工程を含んで成り、ここで当
該キメラDNAは下記の作用可能式に連結された要素を含んで成る、方法: a)植物発現性プロモーター b)DNA領域、ここで当該領域は転写されると人工ステムループ構造を形成す
ることのできるRNA領域を含んで成るRNA分子を生成し、ここで当該ステム
ループ構造のアニーリングRNA配列の一つはΔ12デサチュラーゼをコードす
るオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列の少なくとも一部と本質的
に類似するヌクレオチド配列を含んで成り、そしてここで当該アニーリングRN
A配列の第二のものは当該Δ12デサチュラーゼをコードするオープンリーディ
ングフレームのヌクレオチド配列の少なくとも一部の相補体の少なくとも一部と
本質的に類似する配列を含んで成る;並びに任意的に c)転写終止及びポリアデニル化に関与するDNA領域。 - 【請求項31】 前記DNA領域がSEQ ID NO:6のヌクレオチド
配列を含んで成る、請求項30記載の方法。 - 【請求項32】 前記脂肪酸プロファイルの改良がオレイン酸含有量の増大
を含んで成る、請求項30記載の方法。 - 【請求項33】 前記植物発現性プロモーターが種子特異的プロモーターで
ある、請求項30記載の方法。 - 【請求項34】 前記植物がナタネ(oilseed rape)である、請求項30記
載の方法。 - 【請求項35】 キメラDNAを含んで成る改良脂肪酸プロファイルを有す
る油産生性植物であって、ここで当該キメラDNAは下記の作用可能式に連結さ
れた要素を含んで成る、植物: a)植物発現性プロモーター b)DNA領域、ここで当該領域は転写されると人工ステムループ構造を形成す
ることのできるRNA領域を含んで成るRNA分子を生成し、ここで当該ステム
ループ構造のアニーリングRNA配列の一つはΔ12デサチュラーゼをコードす
るオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列の少なくとも一部と本質的
に類似するヌクレオチド配列を含んで成り、そしてここで当該アニーリングRN
A配列の第二のものは当該Δ12デサチュラーゼをコードするオープンリーディ
ングフレームのヌクレオチド配列の少なくとも一部の相補体の少なくとも一部と
本質的に類似する配列を含んで成る;並びに任意的に c)転写終止及びポリアデニル化に関与するDNA領域。 - 【請求項36】 前記DNA領域がSEQ ID NO:6のヌクレオチド
配列を含んで成る、請求項35記載の植物。 - 【請求項37】 前記植物発現性プロモーターが種子特異的プロモーターで
ある、請求項35記載の植物。 - 【請求項38】 前記植物がなたねである、請求項35記載の植物。
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