DE112009001860T5

DE112009001860T5 - Pflanzen mit modifizierten Wachstumseigenschaften und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE112009001860T5
Application number: DE112009001860T
Authority: DE
Inventors: Kristiina Himanen; Maria van Lijsebettens; Christophe Reuzeau; Tommaso Matteo Boccardi
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: Vip Vzw Be; Universiteit Gent; BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2008-07-31
Filing date: 2009-07-29
Publication date: 2012-01-12
Also published as: WO2010012760A2; AU2009275889A1; AR075545A1; CA2731038A1; CN102144033A; MX2011000778A; WO2010012760A3; US9074006B2; BRPI0916530A8; BRPI0916530A2; US20160017358A1; EP2669379A2; EP2318535A2; EP2669379A3; US20110162109A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung liegt allgemein auf dem Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zum Modifizieren von verschiedenen Pflanzenwachstumseigenschaften. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung unter anderem ein Verfahren für die Modifizierung der Wachstumseigenschaften durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein HUB1(Histone Monoubiquitination 1)-Polypeptid kodiert oder die für ein anderes, bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützliches Protein kodiert, in einer Pflanze. Die modifizierten Wachstumseigenschaften umfassen eine Modifikation von lichtregulierten Phänotypen, wie eine modifizierte circadiane Uhr und/oder Reaktionen auf die circadiane Uhr, oder eine modifizierte Pflanzenarchitektur.

Description

Die vorliegende Erfindung liegt allgemein auf dem Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zum Modifizieren von verschiedenen Pflanzenwachstumseigenschaften durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein HUB1 (Histone Monoubiquitination 1) kodiert oder die für ein sonstiges Protein, das sich für die Verfahren der vorliegenden Erfindung eignet, kodiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein HUB1 kodiert, oder einer Nukleinsäure, die für ein sonstiges Protein, das sich für die Verfahren der vorliegenden Erfindung eignet, kodiert, wobei diese Pflanzen modifizierte Wachstumseigenschaften verglichen mit entsprechenden Wildtyppflanzen oder sonstigen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch bis jetzt unbekannte, für HUB1 kodierende Nukleinsäuren sowie Konstrukte, die sich für die Verfahren der Erfindung eignen, bereit.
Durch das stete Zunehmen der Weltbevölkerung und die Tatsache, dass immer weniger Ackerland, das für die Landwirtschaft verfügbar ist, zur Verfügung steht, wird die Forschung nach einer schlagkräftigeren Landwirtschaft vorangetrieben. Traditionelle Mittel für pflanzenbauliche und gartenbauliche Verbesserungen bedienen sich Techniken der Selektionszüchtung, um Pflanzen mit wünschenswerten Eigenschaften zu identifizieren. Diese Techniken der Selektionszüchtung weisen jedoch einige Nachteile auf, sie sind nämlich typischerweise arbeitsintensiv und führen zu Pflanzen, die häufig heterogene genetische Komponenten enthalten, die nicht immer dazu führen, dass das wünschenswerte Merkmal von den Elternpflanzen aus weiter vererbt wird. Durch Fortschritte in der Molekularbiologie ist es der Menschheit möglich geworden, das Erbgut von Tieren und Pflanzen zu modifizieren. Die pflanzliche Gentechnik beinhaltet die Isolation und Manipulation von genetischem Material (typischerweise in Form von DNA oder RNA) und die anschließende Einführung dieses genetischen Materials in eine Pflanze. Mit solch einer Technologie lassen sich Kulturen oder Pflanzen mit verschiedenen verbesserten wirtschaftlichen, landwirtschaftlichen oder gartenbaulichen Merkmalen herstellen.
Ein Merkmal von besonderem wirtschaftlichem Interesse ist ein gesteigerter Ertrag. Der Ertrag wird normalerweise als messbares Kulturpflanzenprodukt mit wirtschaftlichem Wert definiert. Dies kann quantitativ und/oder qualitativ definiert werden. Der Ertrag hängt direkt von mehreren Faktoren ab, zum Beispiel der Anzahl und Größe der Organe, der Pflanzenarchitektur (zum Beispiel Anzahl Zweige), der Samenproduktion, der Blattalterung und anderen. Wurzelentwicklung, Nährstoffaufnahme, Stresstoleranz und Jungpflanzenvitalität können ebenfalls wichtige Faktoren bei der Festlegung des Ertrags sein. Ein Optimieren der obengenannten Faktoren kann daher zu einer Steigerung des Kulturpflanzenertrags beitragen.
Beim Samenertrag handelt es sich um ein besonders wertvolles Merkmal, da die Samen von vielen Pflanzen für die menschliche und tierische Ernährung wichtig sind. Kulturen wie Mais, Reis, Weizen, Canola und Sojabohne machen mehr als die Hälfte der Kalorienaufnahme des Menschen aus, egal, ob auf dem Weg des direkten Verzehrs der Samen selbst oder des Verzehrs von Fleischprodukten, die mit verarbeiteten Samen erzeugt worden sind. Sie stellen auch eine Quelle für Zucker, Öle und viele Arten von Metaboliten, die in industriellen Verfahren verwendet werden, dar. Samen enthalten einen Embryo (aus dem neue Sprosse und Wurzeln entstehen) und ein Endosperm (Nährstoffquelle für das Embroywachstum während der Keimung und des frühen Keimlingswachstums). An der Entwicklung eines Samens sind viele Gene beteiligt, und der wachsende Samen muss mit Stoffwechselprodukten aus den Wurzeln, Blättern und Stängeln beliefert werden. Insbesondere das Endosperm assimiliert die Stoffwechselvorstufen von Kohlenhydraten, Ölen und Proteinen und bildet daraus große Speichermoleküle, mit denen das Korn gefüllt wird.
Ein weiteres wichtiges Merkmal für viele Kulturpflanzen ist die Jungpflanzenvitalität. Die Verbesserung der Jungpflanzenvitalität ist ein wichtiges Ziel von modernen Reiszüchtungsprogrammen, sowohl bei Reissorten für gemäßigtes Klima als auch für tropische Reissorten. Beim Bewässerungsreis sind lange Wurzeln für eine gute Verankerung im Boden wichtig. Dort, wo Reis direkt in angestaute Felder gesät wird, und wo die Pflanzen rasch durch Wasser auflaufen müssen, sind längere Sprosse mit Vitalität assoziiert. Wird gedrillt, so sind längere Mesokotyle und Koleoptilen für ein gutes Auflaufen der Keimlinge wichtig. Die Fähigkeit, Jungpflanzenvitalität in Pflanzen hineinzuzüchten, wäre in der Landwirtschaft von großer Wichtigkeit So zum Beispiel war eine schlechte Jungpflanzenvitalität bei der Einführung von Hybriden von Mais (Zea mays L.), die auf genetischem Material des „Corn Belt” beruhten, in die europäischen atlantischen Regionen limitierend.
Ein weiteres interessantes Merkmal ist die Blütezeit einer Pflanze. Die Lebensdauer einer Pflanze kann in Phasen wie Keimung, vegetatives Wachstum, reproduktives Wachstum und Alterung eingeteilt werden. Die Blütezeit ist die Zeit zwischen dem Aussäen und dem Beginn des reproduktiven Wachstums. Es handelt sich dabei um einen wichtigen Augenblick im Leben einer Pflanze, der den Übergang vom vegetativen zum reproduktiven Wachstum bestimmt und der bei manchen Pflanzen mit dem Beginn der Alterung zusammenfällt. Bei vielen Pflanzen ist dies der Zeitpunkt, zu dem das Sprossapicalmeristem mit der Blattbildung aufhört und mit der Blütenproduktion beginnt, was eine starke Auswirkung auf die Morphogenese hat und zum Beispiel die Anzahl der gebildeten Organe sowie die Große und Form der Pflanze insgesamt beeinflusst. Die Blütezeit beeinflusst auch andere Ertragsmerkmale bei Pflanzen. Typischerweise ist eine frühblühende Sorte weniger stark verzweigt bzw. bestockt und ist daher weniger buschig. Solche Merkmale können für den Landwirt zum Beispiel für die Vereinfachung der Kulturmaßnahmen vorteilhaft sein. Andererseits kann eine verzögerte Blüte zu Pflanzen mit mehr vegetativen Organen führen, zum Beispiel mit mehr Blättern, was bei vielen Kulturen ein erwünschtes Merkmal ist, zum Beispiel bei Kulturen, bei denen die vegetativen Organe geerntet werden, wie Salat. Die relative Dauer der vegetativen und der reproduktiven Phase einer Pflanze beeinflusst direkt ihren Samenertrag. Bei manchen Pflanzen ist die Kontrolle der Blütezeit ein Mechanismus, der eingesetzt wird, um eine negative Auswirkung von Stressfaktoren wie Dürre zu vermeiden. Die Blütezeit kann auch Qualitätsmerkmale von Kulturen beeinflussen, zum Beispiel die Futtermittelqualität bei Futterkulturen, wo eine verzögerte Blüte zu einer höheren Verdaulichkeit führen kann. Die Blütezeit beeinflusst die Länge der Anbausaison. Eine Modifikation der Blütezeit einer Kultur kann dazu führen, dass es möglich ist, die geografische Anbaufläche auszudehnen und daher die mit Kulturpflanzen bebaute Fläche zu vergrößern. Sie kann auch dazu führen, dass Pflanzen In einer vorgegebenen Umwelt leichter angebaut werden; so kann es zum Beispiel eine frühe Blüte gestatten, dass dort, wo das Etablieren einer Kultur durch niedrige Temperaturen negativ beeinflusst wird, spät ausgepflanzt werden kann, bzw. kann eine frühe Blüte ein frühes Ernten am Ende der Saison gestatten, um biotischem und abiotischem Druck auszuweichen, was daher zu einem erhöhten Kulturpflanzenertrag führt. Die Fähigkeit, die Blütezeit zu bestimmen, ist daher ein wichtiger Faktor mit vielen industriellen Anwendungen auf dem Gebiet der Landwirtschaft.
Es ist auch wichtig, dass Kulturpflanzen entsprechend auf die Tagesrhythmen, denen sie ausgesetzt sind, reagieren. Ein Vorwegnehmen von regelmäßigen Veränderungen der Umwelt bedeutet für die Pflanzen einen Wachstumsvorteil dadurch, dass die Zeit, die zwischen der Umweltveränderung und der physiologischen Reaktion darauf vergeht, verkürzt wird. So zum Beispiel ermöglicht die Aktivierung der Photosynthesewege vor der Dämmerung eine optimale Nutzung der Lichtperiode, oder eine rechtzeitige Aktivierung von Dürrestressreaktionen schützt Pflanzen gegen Wasserknappheit während warmer Sommemachmittage.
Ein weiteres wichtiges Merkmal ist eine verbesserte abiotische Stresstoleranz. Abiotischer Stress ist ein Hauptgrund für weltweite Ernteverluste, der die durchschnittlichen Erträge für die meisten Hauptkulturpflanzen um mehr als 50% erniedrigt (Wang et al., Planta (2003) 218: 1–14). Abiotische Stressfaktoren können durch Dürre, Salinität, Temperaturextreme, chemische Toxizität und Oxidationsstress verursacht werden. Die Fähigkeit, die Toleranz von Pflanzen gegen abiotischen Stress zu verbessern, wäre weltweit für die Landwirte wirtschaftlich sehr vorteilhaft und würde die Kultivierung von Kulturen unter widrigen Bedingungen und in Gebieten, wo der Anbau von Kulturen sonst nicht möglich wäre, gestatten.
Der Kulturpflanzenertrag kann daher durch Optimieren von einem der obengenannten Faktoren gesteigert wenden.
Die Modifikation von gewissen Ertragsmerkmalen kann je nach dem schlussendlichen Verwendungszweck gegenüber anderen Modifikationen bevorzugt werden. So kann zum Beispiel für Anwendungen wie die Futtermittel- oder Holzproduktion oder als Rohstoff für Biokraftstoffe eine Zunahme der vegetativen Pflanzenteile wünschenswert sein und für Anwendungen wie die Mehl-, Stärke- oder Ölproduktion kann eine Steigerung bei den Samenparametern besonders wünschenswert sein. Ja, es können sogar je nach Anwendungszweck unter den Samenparametern manche gegenüber anderen bevorzugt werden. Es können verschiedene Mechanismen zu der Steigerung des Samenertrags beitragen, egal, ob in Form einer gesteigerten Samengröße oder einer gesteigerten Samenzahl.
Ein Ansatz für die Steigerung des Ertrags (Samenertrag und/oder Biomasse) bei Pflanzen kann über die Modifikation der intrinsischen Wachstumsmechanismen einer Pflanze erfolgen, wie des Zellzyldus, der circadianen Uhr oder von verschiedenen Signalleitungswegen, die am Pflanzenwachstum oder an Abwehrmechanismen beteiligt sind.
Circadiane Uhren steuern viele Aspekte des Metabolismus, der Physiologie und der Entwicklung von Pflanzen. Die Pflanzen nutzen Umweltsignale, wie den täglichen Licht-Dunkel-Zyklus, oder regelmäßige Temperaturschwankungen, um einen biologischen Zeitgebermechanismus aufrechtzuerhalten. Dieser Mechanismus, der als circadianer Rhythmus bezeichnet wird, wird üblicherweise als sogenannter Oszillator dargestellt, der aus einem Satz Proteine, die in einem komplexen Ablauf von positiven und negativen Transkriptions-Feedback-Loops miteinander interagieren, besteht; für einen Übersichtsartikel siehe McClung (Plant Cell 18, 792–803, 2006) und Gardner et al. (Biochemical Journal 397, 15–24, 2006). Der Oszillator wird von äußerlichen Signalen (wie Licht, das von Phytochromen und Cryptochromen wahrgenommen wird), die über die „Input-Wege” an den Oszillator weitergeleitet wenden, kalibriert. Der Oszillator wiederum kontrolliert verschiedene Wege (die „Output-Wege”), die physiologische Vorgänge, die von den täglichen umweltmäßigen Veränderungen beeinflusst werden, regulieren. Eine Übersicht findet sich bei Barak et al. (Trends in Plant Science 5, 517–522, 2000); dazu zählen zum Beispiel die Induktion der Blüte, das Öffnen der Petalen, das Öffnen oder Schließen der Stomata, das Hypokotylwachstum, die Bewegung von Kotyledonen und Blättern, die Bewegung der Chloroplasten, die Expression von mit der Photosynthese assoziierten Genen und verwandte biochemische und physiologische Vorgänge, die Calciumkonzentrationen im Cytoplasma und der Phosphorylierungszustand von Proteinen wie der Phosphoenolpyruvatcarboxylase.
Es wurde nun gefunden, dass verschiedene Wachstumseigenschaften in Pflanzen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein HUB1 (Histone Monoubiquitination 1) kodiert, in einer Pflanze verändert werden können.
Hintergrund
Die Ubiquitinierung spielt bei der Regulierung des Proteinumsatzes eine wesentliche Rolle. Das Ubiquitin ist ein hochkonserviertes Protein mit 76 Aminosäuren und eines der in Zellen am weitesten verbreiteten Proteine. Ubiquitinproteine finden sich in Verbindung mit anderen Proteinen als posttranslationelle Modfikation. Es wurde gezeigt, dass die Polyubiquitinierung, also die Anheftung von mehr als 4 Ubiquitinen, Proteine dem Abbau zuweist. Für die Ubiquitinkonjugation ist ein aufeinanderfolgendes Einwirken von drei Enzymen oder Proteinkomplexen erforderlich, nämlich dem ubiquitinaktivierenden Enzym (E1), dem ubiquitinkonjugierenden Enzym (E2) und einer Ubiquitin-Protein-Ligase (E3). Zuerst wird das Ubiquitin an das E1-Enzym in einer ATP-abhängigen Reaktion angeheftet. Nach der Aktivierung des Ubiquitins wird es über Thioesterbindung auf das E2-Enzym übertragen. Schließlich bringt das E3-Ligaseenzym das Substrat und das E2 mit dem angehefteten Ubiquitin zusammen. Sobald eine Polyubiquitinkette auf einem Substrat assembliert ist, wird das Substrat von den 26S-Proteasomen eingefangen und abgebaut. Der Schritt der Substraterkennung wird von den E3-Ligasen vermittelt, die typischerweise eine RING-Domäne als „Andockungsstelle” für die E2s enthalten. Die E3-Ligaseproteine treten in zwei Formen auf: als Einzelketten-E3s, die direkt E2 und ihre Substrate binden, und als Komplexe mit multiplen Untereinheiten, in denen ein RING-Fingerprotein eine wesentliche Komponente darstellt. Die Klassifikation der E3-Ligasen beruht auf dem Vorhandensein von Domänen wie E6-AP-C-Terminus, U-Box oder der „Really Interesting Gene” (RING)-Domäne. Bei der RING-Domäne handelt es sich um einen bestimmten Typ Zinkfingerdomäne, die zwei Zinkatome bindet und die an Protein-Protein-Interaktionen beteiligt ist. Der ubiquitinabhängige Proteinabbau ist als wichtiges Regulationsmittel des Zellzyklus, der DNA-Reparatur, der Transkription, der Kontrolle der Proteinqualität und der Immunreaktion anerkannt.
Die Mutante hub1 (histone monoubiquitination 1), auch unter der Bezeichnung hub1-1, ang4-1 oder rdo4 bekannt, zählt zu der angusta-Klasse rezessiver Mutanten, die durch eine verringerte Blattgröße und eine schmale Blattspreite (Berná et al., Genetics 152, 729–742, 1999) sowie reduzierte Samenruhe (Peeters et al., Physiol. Plant. 115, 604–612, 2002; Liu et al., Plant Cell 19, 433–444, 2007) gekennzeichnet sind. Keimtests (in denen der Prozentsatz gekeimter Samen nach 7 Tagen bonitiert wurde) zeigten, dass dieser Prozentsatz verglichen mit den Wildtypsamen höher war. Das Keimpflanzenwachstum war jedoch vom Vorhandensein von Saccharose in dem Medium abhängig (Liu et al., 2007). Die Mutantenpflanzen sind verglichen mit dem Wildtyp klein und weisen schmale Blätter auf; das Wurzelwachstum ist ebenfalls gestört (Fleury et al., Plant Cell 19, 417–432, 2007). Die überexpression des HUB1-Gens unter der Kontrolle des starken CaMV35S-Promoters in Arabidopsis führte zu Pflanzen mit gesteigerter Blattgröße (Cnops et al., WO 2006/027310 ). Es wird postuliert (Liu et al., 2007 und Fleury et al., 2007), dass HUB1 am Chromatin-Remodelling beteiligt ist, HUB1 kann jedoch auch am Proteinabbau beteiligt sein: BREI, das Hefe-Homolog von HUB1, interagiert nachweislich mit RAD6 und dem Proteasom (Xiao et al., Mol. Cell. Biol. 25, 637–651, 2005) und HUB1 oder HUB2 assoziiert weiterhin mit Staring, einem Protein, das ebenfalls am Proteinabbau beteiligt ist (Chin et al., J. Biol. Chem. 277, 35071–35079, 2002).
Zusammenfassung
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid kodiert, zu Pflanzen mit modifizierten Wachstumseigenschaften, insbesondere modifizierten lichtregulierten Phänotypen, gesteigertem Samenertrag, gesteigerter Stressresistenz und gesteigerter Jungpflanzenvitalität verglichen mit Kontrollpflanzen führt.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zum Modifizieren von Wachstumseigenschaften einer Pflanze verglichen mit Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze. Die modifizierten Wachstumseigenschaften umfassen gesteigerten Samenertrag, gesteigerte Stressresistenz, gesteigerte Jungpflanzenvitalität und modifizierte lichtregulierte Phänotypen verglichen mit Kontrollpflanzen, umfassen jedoch nicht gesteigerte vegetative Biomasse.
Die Erfindung umfasst auch die Konstruktion einer dominant-positiven Mutante von HUB1; in einer weiteren Ausführungsform wird daher eine dominant-positive Mutantenform von HUB1 und seine Verwendung für die Verbesserung der Wachstumseigenschaften von Pflanzen bereitgestellt.
Definitionen
Polypeptid(e)/Protein(e)
Die Begriffe „Polypeptid” und „Protein” werden im vorliegenden Text austauschbar verwendet und beziehen sich auf Aminosäuren in polymerer Form mit einer beliebigen Länge, die miteinander über Peptidbindungen verknüpft sind.
Polynukleotid(e)/Nukleinsäure(n)/Nukleinsäuresequenz(en)/Nukleotidsequenz(en)
Die Begriffe „Polynukleotid(e)”, „Nukleinsäuresequenz(en)”, „Nukleotidsequenz(en)”, „Nukleinsäure(n)”, „Nukleinsäuremolekül” werden im vorliegenden Text austauschbar eingesetzt und beziehen sich auf Nukleotide, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine Kombination von beiden, in polymerer unverzweigter Form mit einer beliebigen Länge.
Kontrollpflanze(n)
Die Auswahl von geeigneten Kontrollpflanzen ist Routinebestandteil einer Versuchsanordnung und kann entsprechende Wildtyppflanzen oder entsprechende Pflanzen ohne das interessierende Gen beinhalten. Typischerweise gehört die Kontrollpflanze zu derselben Pflanzenart oder sogar derselben Sorte wie die zu beurteilende Pflanze. Bei der Kontrollpflanze kann es sich auch um eine Nullizygote der zu beurteilenden Pflanze handeln. Nullizygoten sind Einzelorganismen, denen das Transgen aufgrund von Aufspaltung fehlt Eine „Kontrollpflanze” wie im vorliegenden Zusammenhang verwendet bezieht sich nicht nur auf ganze Pflanzen, sondern auch auf Pflanzenteile, darunter Samen und Samenteile.
Homolog(e)
„Homologe” eines Proteins umfassen Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, Proteine und Enzyme mit Aminosäuresubstitutionen, Deletionen und/oder Insertionen verglichen mit dem jeweiligen unmodifizierten Protein und weisen eine ähnliche biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, von dem sie abstammen, auf.
Eine Deletion bezieht sich auf die Entfernung von einer oder mehr Aminosäuren aus einem Protein.
Eine Insertion bezieht sich darauf, dass ein oder mehr Aminosäurereste an eine vorbestimmte Stelle in einem Protein eingeführt werden. Insertionen können N-terminale und/oder C-terminale Fusionen sowie Insertionen von einzelnen oder multiplen Aminosäuren innerhalb der Sequenz umfassen. Im Allgemeinen werden Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz kleiner als N- oder C-terminale Fusionen sein, und zwar in einer Größenordnung von ungefähr 1 bis 10 Resten. Beispiele für N- oder C-terminale Fusionsproteine oder -peptide beinhalten die Bindungsdomäne oder Aktivierungsdomäne von einem Transkriptionsaktivator, wie dies bei dem Hefe-Zwei-Hybridsystem der Fall ist, Phagenhüllproteine, (Histidin)-6-Tag, Glutathion-S-Transferase-Tag, Protein A, Maltosebindungsprotein, Dihydrofolatreduktase, Tag•100-Epitop, C-Myc-Epitop, FLAG^®-Epitop, lacZ, CMP (calmodulin-binding peptide), HA-Epitop, Protein-C-Epitop und VSV-Epitop.

Eine Substitution bezieht sich auf den Ersatz von Aminosäuren des Proteins durch andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (wie ähnlicher Hydrophobie, Hydrophilie, Antigenität, Neigung zur Bildung oder zum Bruch von α-Helixstrukturen oder β-Faltblattstrukturen). Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise solche von einzelnen Resten, sie können jedoch in Abhängigkeit von funktionellen Zwängen, die dem Polypeptid auferlegt werden, in Form von Cluster vorliegen. Insertionen liegen üblicherweise in der Größenordnung von ungefähr 1 bis 10 Aminosäureresten. Bei den Aminosäuresubstitutionen handelt es sich vorzugsweise um konservative Aminosäuresubstitutionen. Konservative Substitutionstabellen sind in der Fachwelt gut bekannt (siehe zum Beispiel Creighton (1984), Proteins. W.H. Freeman and Company (Hrsg.) und Tabelle 1 unten). Tabelle 1: Beispiele für konservierte Aminosäuresubstitutionen

Rest	konservative Substitutionen	Rest	konservative Substitutionen
Ala	Ser	Leu	Ile; Val
Arg	Lys	Lys	Arg; Gln
Asn	Gln; His	Met	Leu; Ile
Asp	Glu	Phe	Met; Leu; Tyr
Gln	Asn	Ser	Thr; Gly
Cys	Ser	Thr	Ser; Val
Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp; Phe
His	Asn; Gln	Val	Ile; Leu
Ile	Leu, Val

Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen lassen sich leicht mit Hilfe von fachbekannten Techniken der Peptidsynthese, wie Festphasen-Peptidsynthese und dergleichen, oder durch rekombinante DNA-Manipulation herstellen. Verfahren für die Manipulation von DNA-Sequenzen zur Herstellung von Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten eines Proteins sind in der Fachwelt gut bekannt. So sind dem Fachmann zum Beispiel Techniken zur Herstellung vor Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in DNA gut bekannt; dazu zählen M13-Mutagenese, T7-Gen-in vitro-Mutagenese (USB, Cleveland, OH), QuickChange Site Directed Mutagenese (Stratagene, San Diego, CA), PCR-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese oder sonstige Protokolle für die ortsgerichtete Mutagenese.
Derivate
„Derivate” beinhalten Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, die im Vergleich zu der Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden Form des Proteins, wie des interessierenden Proteins, Substitutionen von Aminosäuren durch nichtnatürlich vorkommende Aminosäurereste oder Additionen von nichtnatürlich vorkommenden Aminosäureresten umfassen. „Derivate” eines Proteins umfassen auch Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, die natürlich vorkommende veränderte (glykosylierte, acetylierte, prenylierte, phosphorylierte, myristoylierte, sulfatierte usw.) oder nichtnatürlich veränderte Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Form des Polypeptids umfassen. Ein Derivat kann auch eine(n) oder mehrere nicht-Aminosäure-Substituenten oder Additionen im Vergleich zu der Aminosäuresequenz, von der es abstammt, umfassen, zum Beispiel ein Reportermolekül oder einen anderen Liganden, das/der kovalent oder nichtkovalent an die Aminosäuresequenz gebunden ist, wie ein Reportermolekül, das gebunden ist, um seinen Nachweis zu gestatten, und nichtnatürlich vorkommende Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Proteins. „Derivate” beinhalten weiterhin auch Fusionen der natürlich vorkommenden Form des Proteins mit Tagging-Peiltiden wie FLAG, HIS6 oder Thioredoxin (ein Übersichtsartikel über Tagging-Peptide findet sich bei Terpe, Appl. Micobiol. Biotechnol. 60, 523–533, 2003).
Ortholog(e)/Paralog(e)
Orthologe und Paraloge umfassen Evolutionskonzepte, mit denen die Vorfahrenbeziehungen von Genen beschrieben werden. Paraloge sind Gene innerhalb derselben Art, die durch Duplikation eines Vorfahrengens entstanden sind; Orthologe sind Gene von unterschiedlichen Organismen, die durch Artbildung entstanden sind und die auch von einem gemeinsamen Vorfahrengen abstammen.
Domäne
Der Begriff „Domäne” bezieht sich auf einen Satz von Aminosäuren, die an spezifischen Positionen entlang eines Alignments von Sequenzen von evolutionsmäßig verwandten Proteinen konserviert sind. Während Aminosäuren an anderen Positionen zwischen Homologen schwanken können, zeigen Aminosäuren, die an spezifischen Positionen stark konserviert sind, Aminosäuren an, die wahrscheinlich für die Struktur, Stabilität oder Funktion eines Proteins essentiell sind. Sie werden durch ihren hohen Konservierungsgrad in als Alignment dargestellten Sequenzen einer Familie von Proteinhomologen identifiziert und können als Identifikationsmittel verwendet werden, um zu bestimmen, ob irgendein Polypeptid zu einer bereits identifizierten Polypeptidfamilie gehört.
Motiv/Konsensussequenz/Signatur
Der Begriff „Motiv” oder „Konsensussequenz” oder „Signatur” bezieht sich auf eine kurze konservierte Region in der Sequenz von evolutionsmäßig verwandten Proteinen. Bei Motiven handelt es sich häufig um hochkonservierte Teile von Domänen, sie können jedoch auch nur einen Teil der Domäne beinhalten oder außerhalb einer konservierten Domäne lokalisiert sein (wenn alle Aminosäuren des Motivs außerhalb einer definierten Domäne liegen).
Hybridisierung
Der Begriff „Hybridisierung” ist wie hier definiert ein Vorgang, bei dem sich im Wesentlichen homologe komplementäre Nukleotidsequenzen aneinander anlagern. Der Hybridisierungsvorgang kann vollständig in Lösung stattfinden, d. h. beide komplementären Nukleinsäuren liegen in Lösung vor. Der Hybridisierungsvorgang kann auch stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren auf einer Matrix wie magnetischen Perlen, Sepharose-Perlen oder einem sonstigen Harz immobilisiert ist. Der Hybridisierungsvorgang kann weiterhin stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren an einen festen Träger wie eine Nitrozellulose- oder Nylonmembran immobilisiert ist oder mittels z. B. Photolithographie auf z. B. einen kieselsäurehaltigen Glasträger immobilisiert ist (wobei letzteres als Nukleinsäure-Arrays oder „-micorarrays” oder Nukleinsäure-Chips bekannt ist). Die Nukleinsäuremoleküle werden im Allgemeinen thermisch oder chemisch denaturiert, um einen Doppelstrang zu zwei Einzelsträngen aufzuschmelzen und/oder um „Hairpins” oder sonstige Sekundärstrukturen aus einzelsträngigen Nukleinsäuren zu entfernen, so dass die Hybridisierung stattfinden kann.
Der Begriff „Stringenz” bezieht sich auf diejenigen Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung stattfindet. Die Stringenz der Hybridisierung wird von Bedingungen wie Temperatur, Salzkonzentration, Ionenstärke und Zusammensetzung des Hybridisierungspuffers beeinflusst. Im Allgemeinen werden niedrige Stringenzbedingungen so gewählt, dass sie ungefähr 30°C niedriger sind als die Schmelzpunkttemperatur (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert. Mittlere Stringenzbedingungen liegen dann vor, wenn die Temperatur 20°C unter T_m liegt, und hohe Stringenzbedingungen dann, wenn die Temperatur 10°C unter T_m liegt. Hochstringente Hybridisierungsbedingungen werden typischerweise für die Isolation von hybridisierenden Sequenzen, die eine hohe Sequenzähnlichkeit mit der Zielnukleinsäuresequenz aufweisen, eingesetzt Nukleinsäuren können jedoch aufgrund der Degeneration des genetischen Codes sequenzmäßig abweichen und trotzdem noch für ein im Wesentlichen identisches Polypeptid kodieren. Zum Identifizieren von solchen Nukleinsäuremolekülen können daher manchmal Hybridisierungsbedingungen mit mittlerer Stringenz erforderlich sein.
Bei dem T_m-Wert handelt es sich um diejenige Temperatur bei definierter Ionenstärke und definiertem pH-Wert, bei der 50% der Zielsequenz mit einer perfekt zusammenpassenden Sonde hybridisiert. Der T_m-Wert hängt von den Lösungsbedingungen und der Basenzusammensetzung und Länge der Sonde ab. Längere Sequenzen zum Beispiel hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Die maximale Hybridisierungsrate wird bei 16°C bis 32°C unter dem T_m-Wert erzielt. Das Vorliegen von einwertigen Kationen in der Hybridisierungslösung reduziert die elektrostatische Abstoßung zwischen den beiden Nukleinsäuresträngen und fördert so die Hybridbildung; dieser Effekt wird für Natriumkonzentrationen von bis zu 0,4 M beobachtet (bei höheren Konzentrationen kann dieser Effekt außer Acht gelassen werden). Formamid verringert die Schmelztemperatur von DNA-DNA- und DNA-RNA-Doppelsträngen mit 0,6 bis 0,7°C pro Prozent Formamid, und bei zusätzlich 50% Formamid ermöglicht es, bei 30 bis 45°C hybridisieren zu können, obwohl die Hybridisierungsrate erniedrigt wird. Basenpaar-Fehlpaarungen verringern die Hybridisierungsrate und die Hizestabilität der Doppelstränge. Durchschnittlich, und für längere Sonden, sinkt der T_m-Wert um ungefähr 1°C pro Prozent Basen-Fehlpaarung. Der T_m-Wert kann je nach der Art der Hybride mit den folgenden Gleichungen berechnet werden:

1) DNA-DNA-Hybride (Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138: 267–284, 1984): T_m = 81,5°C + 16,6xlog₁₀[Na⁺]^a + 0,41x%[G/C^b] – 500x[L^c]^-1 – 0,61x% Formamid
2) DNA-RNA- oder RNA-RNA-Hybride: T_m = 79,8 + 18,5(log₁₀[Na⁺]^a) + 0,58(%G/C^b) + 11,8(%G/C^b)² – 820/L^c
3) oligo-DNA- oder oligo-RNA^d-Hybride: Für < 20 Nukleotide: T_m = 2(I_n) Für 20–35 Nukleotide: T_m = 22 + 1,46(I_n) ^a oder für ein anderes einwertiges Kation, jedoch nur im Bereich von 0,01–0,4 M genau. ^b nur für %GC im 30%- bis 75%-Bereich genau. L = Länge des Doppelstrangs in Basenpaaren. ^d oligo, Oligonukleotid; I_n, = effektive Länge des Primers = 2 × (Anz. G/C) + (Anz. A/T).

Eine unspezifische Bindung kann dadurch bekämpft werden, dass man eine von mehreren bekannten Techniken einsetzt, wie zum Beispiel Blockieren der Membran mit proteinhaltigen Lösungen, Zusätze von heterologer RNA, DNA und SDS zum Hybridisierungspuffer und Behandlung mit Rnase. Für nichthomologe Sonden können eine Reihe von Hybridisierungen durchgeführt werden, und zwar dadurch, dass man entweder (i) die Anlagerungstemperatur nach und nach erniedrigt (zum Beispiel von 68°C auf 42°C) oder (ii) dass man die Formamidkonzentration nach und nach erniedrigt (zum Beispiel von 50% auf 0%). Der Fachmann ist mit verschiedenen Parametern vertraut, die während der Hybridisierung verändert werden können und die die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern werden.
Abgesehen von den Hybridisierungsbedingungen hängt die Spezifität der Hybridisierung typischerweise auch von der Funktion der Waschvorgänge nach der Hybridisierung ab. Um einen Hintergrund, der das Ergebnis von unspezifischer Hybridisierung ist, zu entfernen, werden die Proben mit verdünnten Salzlösungen gewaschen. Zu kritischen Faktoren von solchen Waschvorgängen zählen die Ionenstärke und Temperatur der letzten Waschlösung: Je niedriger die Salzkonzentration und je höher die Waschtemperatur ist, desto höher ist die Stringenz des Waschvorgangs. Waschen erfolgt typischerweise bei oder unterhalb Hybridisierungsstringenz. Eine positive Hybridisierung ergibt ein Signal, das mindestens zweimal so stark wie das Hintergrundsignal ist. Im Allgemeinen sind geeignete Stringenzbedingungen für Nukleinsäurehybridisierungs-Assays oder Genamplifizierungsnachweisevorgänge wie oben dargestellt. Es können auch Bedingungen mit höherer oder niedrigerer Stringenz ausgewählt werden. Der Fachmann ist mit verschiedenen Parameter vertraut, die während des Waschens verändert werden können und die die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern werden.
So umfassen zum Beispiel typische hochstringente Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, die Hybridisierung bei 65°C in 1 × SSC oder bei 42°C in 1 × SSC und 50% Formamid, wonach Waschen bei 65°C in 0,3 × SSC erfolgt. Beispiele für Hybridisierungsbedingungen mit mittlerer Stringenz für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen Hybridisierung bei 50°C in 4 × SSC oder bei 40°C in 6 × SSC und 50% Formamid, und anschließendes Waschen bei 50°C in 2 × SSC. Die Länge des Hybrids ist die erwartete Länge für die hybridisierende Nukleinsäure. Werden Nukleinsäuren mit einer bekannten Sequenz hybridisiert, so kann die Hybridlänge dadurch bestimmt werden, dass man mit den Sequenzen ein Alignment durchführt und die darin beschriebenen konservierten Regionen identifiziert. 1 × SSC ist 0,15 M NaCl und 15 mM Natriumcitrat; die Hybridisierungslösung und die Waschlösungen können zusätzlich 5 × Denhardt-Reagens, 0,5–1,0% SDS, 100 μ g/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA und 0,5% Natriumpyrophosphat beinhalten.
Um das Ausmaß der Stringenz zu bestimmen, kann Sambrook et al. (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laborstory Press, CSH, New York, oder Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 und jährliche Neufassungen) herangezogen werden.
Spleißvariante
Der Begriff „Spleißvariante” umfasst im vorliegenden Zusammenhang Varianten einer Nukleinsäuresequenz, in denen ausgewählte Introns und/oder Exons herausgeschnitten, ersetzt, verdrängt oder hinzugefügt wurden oder in denen Introns verkürzt oder verlängert wurden. Bei solchen Varianten wird die biologische Aktivität des Proteins im Wesentlichen erhalten bleiben; dies kann dadurch erzielt werden, dass man funktionelle Abschnitte des Proteins selektiv beibehält. Solche Spleißvarianten können in der Natur vorkommen oder vom Menschen hergestellt werden. Verfahren für die Prognostizierung und für das Isolieren von solchen Spleißvarianten sind in der Fachwelt gut bekannt (siehe zum Beispiel Foissac und Schiex (2005), BMC Bioinformatics 6: 25).
Allelvariante
Allele oder Allelvarianten sind alternative Formen eines bestimmten Gens, die an derselben chromosomalen Lage lokalisiert sind. Allelvarianten umfassen Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs), aber auch Small Insertion/Deletion Polymorphisms (INDELs). Die Große der INDELs beträgt üblicherweise weniger als 100 Bp. SNPs und INDELs bilden den größten Satz von Sequenzvarianten in natürlich vorkommenden polymorphen Stämmen der meisten Organismen.
„Gen-Shuffling”/gerichtete Evolution
„Gen-Shuffling” oder „gerichtete Evolution” besteht aus iterativem DNA-Shuffling und anschließendem entsprechendem Screening und/oder Selektieren, um Varianten von Nukleinsäuren oder Teilen davon zu erzeugen, die für Proteine mit modifizierter biologischer Aktivität kodieren (Castle et al. (2004), Science 304(5674): 1151–4; US-Patente 5,811,238 und 6,395,547 ).
Regulationselement/Kontrollsequenz/Promoter
Die Begriffe „Regulationselement”, „Kontrollsequenz” und „Promoter” werden im vorliegenden Text alle austauschbar verwendet und sollen dahingehend breit interpretiert werden, dass sie regulatorische Nukleinsäuresequenzen bedeuten, die fähig sind, eine Expression derjenigen Sequenzen, mit denen sie ligiert sind, zu bewirken. Der Begriff „Promoter” bezieht sich typischerweise auf eine Nukleinsäurekontrollsequenz, die sich stromaufwärts vom Transkriptionsstart eines Gens befindet und die am Erkennen und an der Bindung der RNA-Polymerase und anderer Proteine beteiligt ist, wodurch die Transkription einer operativ verknüpften Nukleinsäure gesteuert wird. Die oben genannten Begriffe umfassen auch Transkriptionsregulationssequenzen, die sich von einem klassischen eukaryontischen genomischen Gen ableiten (darunter auch die TATA-Box, die für eine präzise Initialion der Transkription erforderlich ist, mit oder ohne CCAAT-Box-Sequenz) sowie zusätzliche Regulationselemente (d. h. stromaufwärts aktivierende Sequenzen, Enhancer und Silencer), die die Genexpression als Reaktion auf Umweltreize und/oder von außen wirkende Reize oder auf gewebespezifische Art und Weise verändern. Der Begriff beinhaltet auch eine Transkriptionsregulationssequenz eines klassischen prokaryontischen Gens, und hier können eine -35-Boxsequenz und/oder -10-Box-Transkriptionsregulationssequenzen beinhaltet sein. Der Begriff „Regulationselement” umfasst auch ein synthetisches Fusionsmolekül oder Derivat, das die Expression eines Nukleinsäuremoleküls in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ vermittelt, aktiviert oder verbessert.
Ein „pflanzlicher Promoter” umfasst Regulationselemente, die die Expression eines Kodiersequenzabschnitts in pflanzlichen Zellen vermitteln. Ein pflanzlicher Promoter muss daher nicht pflanzlichen Ursprungs sein, sondern kann von Viren oder Mikroorganismen, zum Beispiel von Viren, die Pflanzenzellen angreifen, abstammen. Der „pflanzliche Promote” kann auch von einer Pflanzenzelle abstammen, z. B. von der Pflanze, die mit der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu exprimierenden und hier beschriebenen Nukleinsäuresequenz transformiert wird. Dies trifft auch auf andere „pflanzliche” Regulationssignale, wie „pflanzliche” Terminatoren zu. Die stromaufwärts der bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen Nukleotidsequenzen gelegenen Promoter können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitution(en), -insertion(en) und/oder -deletion(en) modifiziert werden, ohne die Funktionsfähigkeit oder Aktivität der Promoter, des offenen Leserasters (ORF) oder der 3'-Regulationsregion wie Terminatoren oder anderen 3'-Regulationsregionen, die vom ORF beabstandet liegen, zu stören. Weiterhin kann man auch die Aktivität der Promoter durch Modifizieren ihrer Sequenz modifizieren oder sie vollständig durch aktivere Promoter ersetzen, sogar durch Promoter von heterologen Organismen. Für die Expression in Pflanzen muss das Nukleinsäuremolekül wie oben beschrieben operativ mit einem geeigneten Promoter verbunden sein oder einen geeigneten Promoter umfassen, der das Gen zum richtigen Zeitpunkt und mit dem erforderlichen räumlichen Expressionsmuster exprimiert.
Für ein Identfizieren von funktionell äquivalenten Promoter kann die Promoterstärke und/oder das Expressionsmuster eines potentiellen Promoters zum Beispiel dadurch analysiert werden, dass man den Promoter operativ mit einem Reportergen verbindet und das Expressionsausmaß und – muster des Reportergens in verschiedenen Geweben der Pflanze testet Zu geeigneten gut bekannten Reportergenen zählen zum Beispiel die beta-Glucuronidase oder die beta-Galaktosidase. Die Promoteraktivität wird dadurch getestet, dass man die enzymatische Aktivität der beta-Glucuronidase oder der beta-Galaktosidase misst. Die Promoterstärke und/oder das Expressionsmuster können dann mit derjenigen/demjenigen eines Referenzpromoters (wie demjenigen, der bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird) verglichen werden. Die Promoterstärke kann jedoch auch dadurch getestet werden, dass man die mRNA-Mengen quantitativ bestimmt oder dadurch, dass man die mRNA-Mengen der in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Nukleinsäure mit den mRNA-Mengen von „Housekeeping”-Genen wie 18S rRNA unter Verwendung von fachbekannten Verfahren wie Northern-Blotting unter densitometrischer Analyse von Autoradiogrammen, quantitativer Echtzeit-PCR oder RT-PCR (Neid et al. 1996, Genome Methods 6: 986–994) vergleicht Im Allgemeinen versteht man unter „schwachem Promoter” einen Promoter, der die Expression einer Kodiersequenz auf niedrigem Niveau vorantreibt. Unter „niedrigem Niveau” versteht man Mengen von ungefähr 1/10 000 Transkripte bis 1/100 000 Transkripte bis ungefähr 1/500 0000 Transkripte pro Zelle. Im Gegensatz dazu treibt ein „starker Promoter” die Expression einer Kodiersequenz auf hohem Niveau bzw. mit ungefähr 1/10 Transkripten bis 1/100 Transkripten bis ungefähr 1/1000 Transkripten pro Zelle voran. Im Allgemeinen versteht man unter „mittelstarkem Promoter” einen Promoter, der die Expression einer Kodiersequenz auf einem niedrigeren Niveau als ein starker Promoter vorantreibt, insbesondere auf einem Niveau, das in allen Fällen unter demjenigen Niveau liegt, das erzielt wird, wenn die Expression unter der Kontrolle eines 35S-CaMV-Promoters steht
Operativ verknüpft
Der Begriff „operativ verknüpft” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang eine funktionelle Verknüpfung zwischen der Promotersequenz und dem interessierenden Gen, so dass die Promotersequenz fähig ist, die Transkription des interessierenden Gens zu initiieren.
Konstitutiver Promoter

Ein „konstitutiver Promoter” bedeutet einen Promoter, der während den meisten, jedoch nicht unbedingt allen, Wachstums- und Entwicklungsphasen und unter den meisten Umweltbedingungen in mindestens einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ transkriptionmäßig aktiv ist. Beispiele für konstitutive Promoter finden sich in Tabelle 2a unten. Tabelle 2a: Beispiele für konstitutive Promoter

Herkunftsgen	Literaturangabe
Actin	McElroy et al. Plant Cell, 2: 163–171, 1990
HMGP	WO 2004/070039
CAMV 35S	Odell et al. Nature, 313: 810–812, 1985
CaMV 19S	Nilsson et al. Physiol. Plant. 100: 456–462, 1997
GOS2	de Pater et al. Plant J. Nov.; 2(6): 837–44, 1992, WO 2004/065596
Ubiquitin	Christensen et al. Plant Mol. Biol. 18: 675–689, 1992
Reis-Cyclophilin	Buchholz et al. Plant Mol. Biol. 25(5): 837–43, 1994
Mais-H3-Histon	Lepetit et al. Mol. Gen. Genet. 231: 276–285, 1992
Luzeme-H3-Histon	Wu et al. Plant Mol. Biol. 11: 641–649, 1988
Actin 2	An et al. Plant J. 10(1); 107–121, 1996
34S FMV	Sanger et al. Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433–443
Kleine Rubisco-Untereinheit	US 4,962,028
OCS	Leisner (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(5): 2553
SAD1	Jain et al. Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
SAD2	Jain et al. Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
nos	Shaw et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12(20): 7831–846
V-ATPase	WO 01/14572
Superpromoter	WO 95/14098
G-Box-Proteine	WO 94/12015

Ubiquitärer Promoter
Ein ubiquitärer Promoter ist in im Wesentlichen allen Geweben oder Zellen eines Organismus aktiv.
Entwicklungsregulierter Promoter
Ein entwicklungsregulierter Promoter ist während gewissen Entwicklungsstadien oder in Teilen der Pflanze, bei denen entwicklungsmäßige Veränderungen auftreten, aktiv.
Induzierbarer Promoter
Ein induzierbarer Promoter weist eine induzierte oder erhöhte Transkriptionsinitiation als Reaktion auf einen chemischen Reiz (siehe Übersichtsartikel von Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89–108), einen Umweltreiz oder einen physikalischen Reiz auf, oder kann „stressinduzierbar” sein, d. h. dann aktiviert werden, wenn eine Pflanze verschiedenen Stressbedingungen ausgesetzt ist, oder „pathogeninduzierbar”, d. h. wird dann aktiviert, wenn eine Pflanze verschiedenen Pathogenen ausgesetzt ist.
Organspezfische/gewebespezfische Promoter
Ein organspezifischer oder gewebespezifischer Promoter ist ein Promoter, der fähig ist, die Transkription bevorzugt in gewissen Organen oder Geweben, wie den Blättern, Wurzeln, dem Samengewebe usw. zu initiieren. So ist zum Beispiel ein „wurzelspezifischer Promoter” ein Promoter, der in erster Linie in Pflanzenwurzeln transkriptionsmäßig aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch „leaky” – Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist. Promoter, die fähig sind, die Transkription nur in gewissen Zellen zu initiieren, werden im vorllegenden Text als „zellspezifisch” bezeichnet.

Beispiele für wurzelspezfische Promoter sind in Tabelle 2b unten angegeben: Tabelle 2b: Beispiele für wurzelspezifische Promoter

Herkunftsgen	Literaturangabe
RCc3	Plant Mol. Biol. 1995 Jan; 27(2): 237–4
Arabidopsis-PHT1	Kovama et al., 2005; Mudge et al. (2002, Plant J. 31: 341)
Phosphattransporter aus Medicago	Xiao et al., 2006
Arabidopsis-Pyk10	Nitz et al. (2001) Plant Sci. 161(2): 337–346
in Wurzeln exprimierbare Gene	Tingey et al., EMBO J. 6: 1, 1987.
Auxininduzierbares Gen aus Tabak	Van der Zaal et al., Plant Mol. Biol. 16, 983, 1991.
β-Tubulin	Oppenheimer et al., Gene 63: 87, 1988.
tabakwurzelspezifische Gene	Conkling et al., Plant Physiol. 93: 1203, 1990.
G1-3b-Gen aus B. napus	United States Patent Nr. 5,401,836
SbPRP1	Suzuki et al., Plant Mol. Biol. 21: 109–119, 1993
LRX1	Baumberger et al., 2001, Genes & Dev. 15: 1128
BTG-26 aus Brassica napus	US 20050044585
LeAMT1 (Tomate)	Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
Das LeNRT1-1 (Tomate)	Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
Klasse-I-Patatingen (Kartoffel)	Liu et al., Plant Mol. Biol. 153: 386–395, 1991
KDC1 (Daucus carota)	Downey et al. (2000, J. Biol. Chem. 275: 39420)
TobRB7-Gen	W. Song (1997) PhD Thesis, North Carolina State University, Raleigh, NC USA
OsRAB5a (Reis)	Wang et al. 2002, Plant Sci. 163: 273
ALF5 (Arabidopsis)	Diener et al. (2001, Plant Cell 13: 1625)
NRT2; 1 Np (N. plumbaginifolia)	Quesada et al. (1997, Plant Mol. Biol. 34: 265)

Ein samenspezifischer Promoter ist in erster Linie in Samengewebe, jedoch nicht unbedingt ausschließlich in Samengewebe (bei „leaky” – Expression) transkriptionsmäßig aktiv. Der samenspezifische Promoter kann während der Samenentwicklung und/oder während der Keimung aktiv sein. Der samenspezfische Promoter kann endosperm-, aleuron- und/oder embryospezifisch sein. Beispiele für samenspezifische Promoter sind in Tabelle 2c unten angegeben. Weitere Beispiele für samenspezifische Promoter sind bei Qing Qu und Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113–125, 2004) angegeben, und diese Beschreibung wird hiermit durch Bezugnahme als ob hier vollständig beschrieben aufgenommen. Tabelle 2c: Beispiele für samenspezifische Promoter

Herkunftsgen	Literaturangabe
Samenspezfische Gene	Simon et al. Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;
	Scofield et al. J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987;
	Baszczynski et al. Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990
Paranuss-Albumin	Pearson et al. Plant Mol. Biol. 18: 235–245, 1992
Legumin	Ellis et al. Plant Mol. Biol. 10: 203–214, 1988
Glutelin (Reis)	Takaiwa et al. Mol Gen. Genet. 208: 15–22, 1986;
	Takaiwa et al. FEBS Letts. 221: 43–47, 1987
Zein	Matzke et al. Plant Mol. Biol., 14(3): 323–32, 1990
napA	Stalberg et al. Planta 199: 515–519, 1996
LMW- und HMW-Glutenin-1 aus Weizen	Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, 1989; NAR 17: 461–2, 1989
Weizen-SPA	Albani et al. Plant Cell, 9: 171–184, 1997
α-, β-, γ-Gliadine aus Weizen	EMBO J. 3: 1409–15, 1984
Itr1-Promoter aus der Gerste	Diaz et al. (1995), Mol. Gen. Genet 248(5): 592–8
B1, C, D, Hordein aus der Gerste	Theor. Appl. Gen. 98: 1253–62, 1999; Plant J. 4: 343–55, 1993; Mol. Gen. Genet. 250: 750–60, 1996
Gerste-DOF	Mena et al. The Plant Journal, 116(1): 53–62, 1998
blz2	EP 99106056.7
synthetischer Promoter	Vicente-Carbajosa et al. Plant J. 13: 629–640, 1998
Reis-Prolamin NRP33	Wu et al. Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
α-Globulin Glb-1 aus Reis	Wu et al. Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
Reis-OSH1	Sato et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–822, 1996
α-Globulin REB/OHP-1 aus Reis	Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513–522, 1997
Reis-ADP-Glukosepyrophosphorylase	Trans. Res. 6: 157–68, 1997
Mais-ESR-Genfamilie	Plant J. 12: 235–46, 1997
α-Kafirin aus Sorghumhirse	DeRose et al. Plant Mol. Biol. 32: 1029–35, 1996
KNOX	Postma-Haarsma et al. Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
Reis-Oleosin	Wu et al. J. Biochem. 123: 386, 1998
Sonnenblumen-Oleosin	Cummins et al. Plant Mol. Biol. 19: 873–876, 1992
PRO0117, mutmaßliches 40S-Ribosomenprotein aus Reis	WO 2004/070039
PRO0136, Reis-Alaninaminotransferase	unveröffentlicht
PRO0147, Trypsinhemmer ITR1 (Gerste)	unveröffentlicht
PRO0151, Reis-WSI18	WO 2004/070039
PRO0175, Reis-RAB21	WO 2004/070039
PRO005	WO 2004/070039
PRO0095	WO 2004/070039
α-Amylase (Amy32b)	Lanahan et al. Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88: 7266–7270, 1991
Cathepsin-β-artiges Gen	Cejudo et al. Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
Gerste-Ltp2	Kalla et al. Plant J. 6: 849–60, 1994
Chi26	Leah et al. Plant J. 4: 579–89, 1994
Mais B-Peru	Selinger et al. Genetics 149; 1125–38, 1998

Ein für grünes Gewebe spezifischer Promoter wie im vorliegenden Text definiert ist ein Promoter, der in erster Linie in grünem Gewebe transkriptionsmäßig aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch „leaky” – Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist.

Beispiele für für grünes Gewebe spezfische Promoter, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, sind in Tabelle 2d unten dargestellt. Tabelle 2d: Beispiele für für grünes Gewebe spezifische Promoter

Gen	Expression	Literaturangabe
Orthophosphatdikinase aus dem Mais	blattspezifisch	Fukavama et al., 2001
Phosphoenolpyruvatcarboxylase aus dem Mais	blattspezifisch	Kausch et al., 2001
Phosphoenolpyruvatcarboxylase aus dem Reis	blattspezifisch	Liu et al., 2003
Kleine Rubisco-Untereinheit aus dem Reis	blattspezifisch	Nomura et al., 2000
Beta-Expansin EXBP9 aus dem Reis	sprossspezifisch	WO 2004/070039
Kleine Rubisco-Untereinheit aus der Straucherbse	blattspezifisch	Panguluri et al., 2005
Erbsen-RBCS3A	blattspezifisch

Ein weiteres Beispiel für einen gewebespezfischen Promoter ist ein meristemspezifischer Promoter, der in erster Linie in Meristemgewebe transkriptionsmäßig aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch „leaky” – Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist.

Beispiele für Promoter mit Spezifität für das grüne Meristem, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, sind in Tabelle 2e unten dargestellt. Tabelle 2e: Beispiele für meristemspezifische Promoter

Herkunftsgen	Expressionsmuster	Literaturangabe
Reis-OSH1	Sprossapikalmeristem, vom globulären Embryonenstadium bis zum Keimlingsstadium	Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122
Metallothionein aus dem Reis	meristemspezifisch	BAD87835.1
WAK1 & WAK2	Spross- und Wurzelapikalmeristeme, und in expandierenden Blättern und Sepalen	Wagner & Kohorn (2001) Plant Cell 13(2): 303–318

Terminator
Der Begriff „Terminator” umfasst eine Kontrollsequenz, bei der es sich um eine DNA-Sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit handelt, die die 3'-Prozessierung und Polyadenylierung eines primären Transkripts und die Transkriptionstermination signalisiert. Der Terminator kann von dem natürlichen Gen, von verschiedenen anderen pflanzlichen Genen oder von T-DNA abstammen. Der hinzuzufügende Terminator kann zum Beispiel vom Nopalinsynthasegen oder vom Octopinsynthasegen oder auch von einem anderen pflanzlichen Gen oder, was weniger bevorzugt ist, von einem beliebigen anderen eukaryontischen Gen abstammen.
Modulation
Der Begriff „Modulation” bedeutet in Bezug auf die Expression oder Genexpression einen Vorgang, bei dem das Expressionsniveau durch diese Genexpression im Vergleich zu der Kontrollpflanze verändert wird; das Expressionsniveau kann erhöht oder erniedrigt wenden. Bei der ursprünglichen, nichtmodulierten Expression kann es sich um eine beliebige Art von Expression einer Struktur-RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit anschließender Translation handeln. Unter dem Begriff „Modulieren der Aktivität” versteht man jegliche Veränderung der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder der kodierten Proteine, die zu erhöhtem Ertrag und/oder erhöhtem Wachstum der Pflanzen fuhrt.
Expression
Der Begriff „Expression” oder „Genexpression” bedeutet die Transkription eines bestimmten Gens bzw. von bestimmten Genen oder eines spezifischen Genkonstrukts. Insbesondere bedeutet der Begriff „Expression” oder „Genexpression” die Transkription eines Gens bzw. von Genen oder eines Genkonstrukts in Struktur-RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA, mit oder ohne anschließende(r) Translation von letzterer in ein Protein. Der Vorgang beinhaltet die Transkription von DNA und die Prozessierung des entstandenen mRNA-Produkts.
Erhöhte Expression/Überexpression
Der Begriff „erhöhte Expression” oder „Überexpression” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang jegliche Form von Expression, die zusätzlich zu dem ursprünglichen Expressionsniveau des Wildtyps ist.
Verfahren zur Erhöhung der Expression von Genen oder Genprodukten sind in der Fachwelt gut bekannt; dazu zählen zum Beispiel die von entsprechenden Promoter vorangetriebene Überexpression, die Verwendung von Transkriptions-Enhancern oder Translations-Enhancern. Isolierte Nukleinsäuren, die als Promoter- oder Enhancerelemente dienen, können in einer geeigneten Lage (typischerweise stromaufwärts) einer nichtheterologen Form eines Polynukleotids eingeführt werden, um die Expression einer Nukleinsäure, die für das interessierende Polypeptid kodiert, hinaufzuregutieren. So können zum Beispiel endogene Promoter in vivo durch Mutation, Deletion und/oder Substitution (siehe Kmiec, US 5,565,350 ; Zarling et al. WO9322443 ) verändert werden, oder es können isolierte Promoter in eine Pflanzenzelle in der korrekten Orientierung und in korrektem Abstand von einem Gen der vorliegenden Erfindung eingeführt werden, um die Expression des Gens zu kontrollieren.
Wünscht man, ein Polypeptid zu exprimieren, so ist es im Allgemeinen wünschenswert, am 3'-Ende einer Polynukleotid-Kodierregion eine Polyadenylierungsregion mitzuverwenden. Die Polyadenylierungsregion kann von dem natürlichen Gen, von verschiedenen anderen pflanzlichen Genen oder von T-DNA stammen. Die hinzuzufügende 3'-terminale Sequenz kann zum Beispiel von dem Nopalinsynthasegen oder dem Octopinsynthasegen oder alternativ von einem anderen pflanzlichen Gen, oder, was weniger bevorzugt wird, von jeglichem sonstigem eukaryontischem Gen abstammen.
Um die Menge der reifen Information, die im Cytosol akkumuliert zu erhöhen, kann der 5'- untranslatierten Region (UTR) oder der Kodiersequenz der Partialkodiersequenz auch eine Intronsequenz hinzugefügt wenden. Es wurde gezeigt, dass die Mitverwendung eines spleißbaren Introns in der Transkriptionsunit sowohl bei pflanzlichen als auch bei tierischen Expressionskonstrukten die Genexpression sowohl auf dem mRNA-Niveau als auch dem Proteinniveau bis um das 1000fache erhöht (Buchman und Berg (1988), Mol. Cell biol. 8: 4395–4405; Callis et al. (1987), Genes Dev. 1: 1183–1200). Solch eine Intronverstärkung der Genexpression ist typischerweise dann am größten, wenn sie in der Nähe des 5'-Endes der Transkriptionsunit platziert wird. Die Verwendung der Mais-Introns Adh1-S Intron 1, 2 und 6, das Bronze-1-Intron, sind in der Fachwelt gut bekannt. Allgemeine Informationen finden sich in: The Maize Handbook, Kapitel 116, Freeling und Walbot, Hrsg., Springer, N.Y. (1994).
Endogenes Gen
Wird im vorliegenden Text ein „endogenes” Gen erwähnt, so bezieht sich dies nicht nur auf das jeweilige Gen, wie es in einer Pflanze in seiner natürlichen Form vorkommt (d. h. ohne menschlichen Eingriff), sondern auch auf dasselbe Gen (oder eine im Wesentlichen homologe Nukleinsäure/ein im Wesentlichen homologes Gen) in isolierter Form, das anschließend in eine Pflanze (erneut) eingeführt wird (ein Transgen). So kann zum Beispiel bei einer transgenen Pflanze, die solch ein Transgen enthält, eine wesentliche Reduktion der Transgenexpression und/oder eine wesentliche Reduktion der Expression des endogenen Gens stattfinden. Das isolierte Gen kann von einem Organismus isoliert sein oder kann künstlich, zum Beispiel mittels chemischer Synthese, hergestellt sein.
Verringerte Expression
Wird im vorliegenden Text von „verringerter Expression” oder „Verringerung oder im Wesentlichen stattfindender Elimination” der Expression gesprochen, so bedeutet dies eine Verringerung der Expression des endogenen Gens und/oder der Polypeptidmengen und/oder Polypeptidaktivität im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination ist mit ansteigender Bevorzugung im Vergleich zu derjenigen der Kontrollpflanzen um mindestens 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% oder 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr reduziert.
Für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze ist eine ausreichende Länge von im Wesentlichen unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz erforderlich. Um ein „gene silencing” durchzuführen, muss diese nur 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 oder weniger Nukleotide lang sein; sie kann jedoch sogar die Länge des ganzen Gens (einschließlich der 5'- und/oder 3'-UTR, entweder ganz oder teilweise) betragen. Der Abschnitt von im Wesentlichen unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotiden kann von der Nukleinsäure, die für das interessierende Protein kodiert (Zielgen) oder von jeglicher Nukleinsäure, die fähig ist, für ein Ortholog, Paralog oder Homolog des interessierenden Proteins zu kodieren, abstammen. Vorzugsweise ist der Abschnitt der im Wesentlichen unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotide fähig, mit dem Zielgen (entweder dem sense- oder antisense-Strang) Wasserstoffbrückenbindungen zu bilden; stärker bevorzugt weist der Abschnitt der im Wesentlichen unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotide eine Sequenzidentität mit dem Zielgen (entweder dem sense- oder antisens-Strang) von mit ansteigender Bevorzugung 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% Sequenzidentität auf. Für die verschiedenen Verfahren, die im vorliegenden Text für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der Expression eines endogenen Gens diskutiert werden, ist eine Nukleinsäuresequenz, die für ein (funktionelles) Polypeptid kodiert, nicht Voraussetzung.
Diese Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der Expression kann unter Verwendung von Routinemaßnahmen und – techniken erzielt werden. Ein bevorzugtes Verfahren für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der endogenen Genexpression besteht darin, dass man ein Genkonstrukt, in das die Nukleinsäure (in diesem Fall ein Abschnitt von im Wesentlichen unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die fähig ist, für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einem der interessierenden Proteine zu kodieren, abstammen) als invertierte Wiederholung (teilweise oder ganz), die durch einen Spacer (nichtkodierende DNA) getrennt ist, kloniert wird, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
Bei solch einem bevorzugten Verfahren wird die Expression des endogenen Gens durch RNA-vermitteltes Silencing reduziert oder im Wesentlichen eliminiert, und zwar unter Verwendung einer invertierten Wiederholung einer Nukleinsäure oder eines Teils davon (in diesem Fall einem Abschnitt von im Wesentlichen aufeinander folgenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die fähig ist, für ein Ortholog, Paralog oder Homolog des interessierenden Proteins zu kodieren, abstammen), die bzw. der vorzugsweise fähig ist, eine „hairpin”-Struktur auszubilden. Die invertierte Wiederholung wird in einen Expressionsvektor, der Kontrollsequenzen umfasst, kloniert. Zwischen den beiden invertierten Nukleinsäuren, die die invertierte Wiederholung bilden, befindet sich eine nichtkodierende DNA-Nukleinsäuresequenz (ein Spacer, zum Beispiel ein „matrix attachment region”-Fragment (MAR), ein Intron, ein Polylinker usw.). Nach der Transkription der invertierten Wiederholung entsteht eine chimäre RNA mit selbstkomplementärer Struktur (teilweise oder vollständig). Diese doppelsträngige RNA-Struktur wird als „hairpin”-RNA (hpRNA) bezeichnet. Die hpRNA wird von der Pflanze zu siRNAs prozessiert, die in einen RNA-induzierten „silencing”-Komplex (RISC) eingebaut werden. Der RISC spaltet weiter die mRNA-Transkripte und reduziert dadurch die Anzahl der mRNA-Transkripte, die in Potypeptide zu translatieren sind, wesentlich. Weitere allgemeine Einzelheiten finden sich zum Beispiel bei Grierson et al. (1998), WO 98/53083 ; Waterhouse et al. (1999), WO 99/53050 ).
Für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren ist es nicht unbedingt erforderlich, dass man ein Genkonstrukt, in das die Nukleinsäure als invertierte Wiederholung kloniert ist, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert, sondern es können eine oder mehrere von verschiedenen gut bekannten „gene silencing”-Verfahren eingesetzt werden, um zu derselben Wirkung zu gelangen.
Ein solches Verfahren für die Reduktion der endogenen Genexpression ist das RNA-vermittelte Silencing der Genexpression (Herunterregulation). In diesem Fall wird das Silencing in einer Pflanze durch eine doppelsträngige RNA-Sequenz (dsRNA), die im Wesentlichen eine Ähnlichkeit mit der endogenen Zielsequenz aufweist, ausgelöst. Diese dsRNA wird von der Pflanze weiter zu ungefähr 20 bis ungefähr 26 Nukleotiden prozessiert, die als „short interfering” RNAs (siRNAs) bezeichnet werden. Die siRNAs werden in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC), der das mRNA-Transkript des endogenen Zielgens weiter spaltet und so die Anzahl der mRNA-Transkripte, die in ein Polypeptid zu translatieren sind, wesentlich reduziert, eingebaut. Vorzugsweise entspricht die doppelsträngige RNA-Sequenz einem Zielgen.
Bei einem weiteren Beispiel für ein RNA-Silencing-Verfahren führt man Nukleinsäuresequenzen oder Teile davon (in diesem Fall einen Abschnitt von im Wesentlichen unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotiden, abgeleitet von dem interessierenden Gen, oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die fähig ist, für ein Ortholog, Paralog oder Homolog des interessierenden Proteins zu kodieren) in sense-Orientierung in eine Pflanze ein. „Sense-Orientierung” bedeutet eine DNA-Sequenz, die zu einem mRNA-Transkript davon homolog ist. Es würde daher mindestens eine Kopie der Nukleinsäuresequenz in eine Pflanze eingeführt werden. Die zusätzliche Nukleinsäuresequenz wird die Expression des endogenen Gens reduzieren und so zu einem Phänomen, das als Cosuppression bekannt ist, führen. Die Reduktion der Genexpression ist dann starker ausgeprägt, wenn mehrere zusätzliche Kopien einer Nukleinsäureseguenz in die Pflanze eingeführt wenden, da eine positive Korrelation zwischen hohen Transkriptniveaus und dem Auslösen der Cosuppression besteht.
Bei einem weiteren Beispiel für ein RNA-Silencing-Verfahren verwendet man antisense-Nukleinsäuresequenzen. Eine „antisense”-Nukleinsäuresequenz umfasst eine Nukleotidsequenz, die zu einer „sense”-Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein kodiert, komplementär ist, d. h. komplementär zu dem Kodierstrang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Transkriptsequenz ist. Die antisense-Nukleinsäuresequenz ist vorzugsweise zu dem endogenen Gen, bei dem das Silencing erfolgen soll, komplementär. Die Komplementarität kann sich in der „Kodierregion” und/oder in der „Nichtkodierregion” eines Gens befinden. Der Begriff „Kodierregion” bezieht sich auf eine Region der Nukleotidsequenz, die Codons umfasst, die in Aminosäurereste translatiert wenden. Der Begriff „Nichtkodierregion” bezieht sich auf 5'- und 3'-Sequenzen, die die Kodierregion flankieren und die transkribiert, jedoch nicht in Aminosäuren translatiert werden (auch 5'- und 3'-nichttranslatierte Regionen genannt).
Antisense-Nukleinsäuresequenzen können nach den Regeln der Watson-Crick-Basenpaarung entwickelt werden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann zu der gesamten Nukleinsäuresequenz (in diesem Fall einem Abschnitt von im Wesentlichen unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotiden, abgeleitet von dem interessierenden Gen, oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die fähig ist, für ein Ortholog, Paralog oder Homolog des interessierenden Proteins zu kodieren) komplementär sein, kann jedoch auch ein Oligonukleotid sein, das nur gegenüber einem Teil der Nukleinsäuresequenz (einschließlich der mRNA-5'- und 3'-UTR) in antisense orientiert ist. So kann zum Beispiel die antisense-Oligonukleotidsequenz zu derjenigen Region, die den Translationsstartpunkt eines mRNA-Transkripts, das für ein Polypeptid kodiert, umgibt, komplementär sein. Die Länge einer geeigneten antisense-Oligonukleotidsequenz ist in der Fachwelt bekannt und kann ab ungefähr 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 oder 10 Nukleotide lang oder weniger sein. Eine erfindungsgemäße antisense-Nukleinsäuresequenz kann unter Verwendung von chemischen Synthesereaktionen und enzymatischen Ligationsreaktionen unter Verwendung von fachbekannten Verfahren konstruiert werden. So kann zum Beispiel eine antisense-Nukleinsäuresequenz (z. B. eine antisense-Oligonukleotidsequenz) chemisch synthetisiert werden, und zwar unter Verwendung von natürlich vorkommenden Nukleotiden oder verschiedenartig modifizierten Nukleotiden, so dass die biologische Stabilität der Moleküle vergrößert wird oder die physikalische Stabilität des Doppelstrangs, der zwischen der antisense-Nukleinsäuresequenz und der sense-Nukleinsäuresequenz gebildet wird, erhöht wird; es können zum Beispiel Phosphorthioatderivate und acridinsubstituierte Nukleotide eingesetzt werden. Beispiele für modifizierte Nukleotide, die eingesetzt werden können, um die antisense-Nukleinsäuresequenzen zu erzeugen, sind in der Fachwelt gut bekannt. Zu bekannten Nukleotidmodifikationen zählen Methylierung, Ringschluss und „Caps” sowie Substitution von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide durch ein Analog wie Inosin. Weitere Modifikationen von Nukleotiden sind in der Fachwelt gut bekannt.
Die antisense-Nukleinsäuresequenz kann biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors, in den eine Nukleinsäureseguenz in antisense-Orientierung subkloniert wurde (d. h. RNA, die von der insertierten Nukleinsäure transkribiert wird, wird in antisense-Orientierung in Bezug auf eine interessierende Zielnukleinsäure vorliegen), erzeugt wenden. Vorzugsweise erfolgt die Herstellung von antisense-Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen mittels eines stabil integrierten Nukleinsäurekonstrukts umfassend einen Promoter, ein operativ verknüpftes antisense-Oligonukleotid und einen Terminator.
Die für das Silencing in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküle (egal, ob in eine Pflanze insertiert oder in situ erzeugt) hybritdisieren mit bzw. binden an mRNA-Transkripte und/oder genomische DNA, die für ein Polypeptid kodieren, um so die Expression des Proteins zu hemmen, z. B. durch Hemmung der Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch traditionelle Nukleotidkomplementarität unter Bildung eines stabilen Doppelstrangs oder zum Beispiel bei einer antisense-Nukleinsäuresequenz, die an DNA-Doppelstränge bindet, durch spezifische Interaktionen in der Hauptfurche der Doppelhelix erfolgen. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können in eine Pflanze durch Transformation oder direkte Injektion in eine spezifische Gewebestelle eingeführt werden. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können jedoch auch so modifiziert wenden, dass sie bestimmte Zellen ansteuern, und dann systemisch verabreicht werden. So können zum Beispiel für die systemische Verabreichung antisense-Nukleinsäuresequenzen so modifiziert werden, dass sie spezfisch an Rezeptoren oder Antigene, die an einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, binden, z. B. dadurch, dass man die antisense-Nukleinsäuresequenz mit Peiltiden oder Antikörpern verknüpft, welche an Zelloberflächenrezeptoren oder – antigene binden. Die antisense-Nukleinsäuresequenzen können an die Zellen auch unter Verwendung der im vorliegenden Text beschriebenen Vektoren abgegeben wenden.
Gemäß einem weiteren Aspekt handelt es sich bei der antisense-Nukleinsäuresequenz um eine a-anomere Nukleinsäuresequenz. Eine a-anomere Nukleinsäuresequenz bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in denen im Gegensatz zu den üblichen b-Einheiten die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al. (1987), Nucl. Ac. Res. 15: 6625–6641). Die antisense-Nukleinsäuresequenz kann auch ein 2'-o-Methylribonukteotid (Inoue et al. (1987), Nucl. Ac. Res. 15, 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analog (Inoue et al. (1987), FERS Lett. 215, 327–330) umfassen.
Die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der endogenen Genexpression kann auch unter Verwendung von Ribozymen erfolgen. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonukleaseaktivität, die fähig sind, eine einzelsträngige Nukleinsäuresequenz, wie eine mRNA, für die sie eine komplementäre Region aufweisen, zu spalten. Ribozyme (z. B., „hammerhead”-Ribozyme (beschrieben bei Haselhoff und Gerlach (1988), Nature 334, 585–591) können also dazu verwendet werden, um mRNA-Transkripte, die für ein Polypeptid kodieren, katalytisch zu spalten, wodurch sie die Anzahl der mRNA-Transkripte, die in ein Polypeptid zu translatieren sind, wesentlich reduzieren. Ein Ribozym mit Spezifität für eine Nukleinsäuresequenz kann entwickelt werden (siehe zum Beispiel: Cech et al. U.S. Patent No. 4,987,071 ; und Cech et al. U.S. Patent No. 5,116,742 ). mRNA-Transkripte, die einer Nukleinsäuresequenz entsprechen, können jedoch auch dazu verwendet werden, um eine katalytische RNA mit spezifischer Ribonukleaseaktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen auszuwählen (Bartel und Szostak (1993), Science 261, 1411–1418). Die Verwendung von Ribozymen für das Gen-Silencing in Pflanzen ist in der Fachwelt bekannt (z. B. Atkins et al. (1994), WO 94/00012 ; Lenne et al. (1995), WO 95/03404 ; Lutziger et al. (2000), WO 00/00619 ; Prinsen et al. (1997), WO 97/13865 und Scott et al. (1997), WO 97/38116 ).
Ein Gen-Silencing kann auch mittels Insertionsmutagenese (zum Beispiel T-DNA-Insertion oder Transposon-Insertion) oder durch Strategien, wie sie unter anderem bei Angell und Baulcombe ((1999), Plant J. 20(3): 357–62), (Amplicon VIGS WO 98/36083 ) oder Baulcombe ( WO 99/15682 ) beschrieben sind, erreicht werden.
Gen-Silencing kann auch stattfinden, wenn eine Mutation an einem endogenen Gen und/oder eine Mutation an einem isolierten Gen bzw. einer isolierten Nukleinsäure, das/die anschließend in eine Pflanze eingeführt wird, vorliegt. Die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination kann von einem nichtfunktionellen Polypeptid verursacht werden. So kann das Potypeptid zum Beispiel an verschiedene interagierende Proteine binden; eine oder mehrere Mutation(en) und/oder Verkürzungen) können daher ein Polypeptid bereitstellen, das noch fähig ist, interagierende Proteine (wie Rezeptorproteine) zu binden, das jedoch nicht seine normale Funktion (wie Signalligand) ausüben kann.
Ein weiterer Ansatz beim Gen-Silencing besteht darin, dass man Nukleinsäuresequenzen, die zu der Regulationsregion des Gens (z. B. dem Promoter und/oder den Enhancern) komplementär ist, ansteuert, um dreifache Helixstrukturen zu bilden, die die Transkription des Gens in den Zielzellen verhindern. Siehe Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569–84, 1991; Helene et al. Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27–36, 1992; und Maher, L.J. Bioassays 14, 807–15, 1992.
Der Fachmann wird mit anderen Methoden, wie der Verwendung von Antikörpern, die gegen ein endogenes Polypeptid gerichtet sind, um dessen Funktion in planta zu hemmen, oder dem Eingreifen in den Signalleitungsweg, an dem ein Polypeptid beteiligt ist, gut vertraut sein. Insbesondere ist es vorstellbar, dass künstlich hergestellte Moleküle für die Hemmung der biologischen Funktion eines Zielpolypeptids oder für das Eingreifen in den Signalleitungsweg, an dem das Zielpolypeptid beteiligt ist, nützlich sein können.
Es kann jedoch auch ein Screening-Programm angelegt werden, um innerhalb einer Pflanzenpopulation natürliche Varianten eines Gens, die für Potypeptide mit verringerter Aktivität kodieren, zu identifizieren. Solche natürliche Varianten können zum Beispiel auch verwendet wenden, um eine homologe Rekombination durchzuführen.
Künstliche und/oder natürliche mikroRNAs (miRNAs) können dazu verwendet wenden, um ein Knock-Out der Genexpression und/oder mRNA-Translation durchzuführen. Endogene miRNAs sind einzelsträngige kleine RNAs, die typischerweise 19–24 Nukleotide lang sind. Ihre Funktion besteht in erster Linie in der Regulation der Genexpression und/oder mRNA-Translation. Die meisten pflanzlichen mikroRNAs (miRNAs) weisen eine komplette oder beinahe komplette Komplementarität zu ihren Zielsequenzen auf. Es gibt jedoch natürliche Ziele mit bis zu fünf Fehlpaarungen. Diese werden ausgehend von längeren nichtkodierenden RNAs mit charakteristischen „Fold-Back”-Strukturen durch doppelsträngige spezifische RNasen der Dicer-Familie prozessiert Bei der Prozessierung werden sie in den „RNA-induced silencing”-Komplex (RISC) eingebaut, und zwar durch Bindung an dessen Hauptkomponente, ein Argonautenprotein. miRNAs dienen als Spezifitätskomponenten des RISCs, da sie eine Basenpaarung mit Zielnukleinsäuren, in erster Linie mRNAs, im Cytoplasma eingehen. Anschließende Regulationsereignisse beinhalten die Spaltung der Ziel-mRNA und die Zerstörung und/oder translationelle Hemmung. Auswirkungen der miRNA-Überexpression spiegeln sich daher häufig in verringerten mRNA-Mengen der Zielgene wider.
Künstliche microRNAs (amiRNAs), die typischerweise 21 Nukleotide lang sind, können dahingehend einem Genetic Engineering unterworfen werden, dass sie spezifisch die Genexpression von einzelnen oder mehreren interessierenden Genen negativ regulieren. Determinanten der pflanzlichen microRNA-Zielauswahl sind in der Fachwelt gut bekannt. Es wurden empirische Parameter für die Zielerkennung definiert, und diese können als Hilfe beim Entwickeln von spezifischen amiRNAs verwendet werden (Schwab et al. Dev. Cell 8, 517–527, 2005). Praktische Werkzeuge für die Entwicklung und Erzeugung von amiRNAs und ihren Vorstufen sind ebenfalls für die Allgemeinheit verfügbar (Schwab et al. Plant Cell 18, 1121–1133, 2006).
Für eine optimale Leistung ist bei den Gen-Silencing-Techniken, die für die Reduktion der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze verwendet werden, die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen von monokotylen Pflanzen für die Transformation von monokotylen Pflanzen und von Nukleinsäuresequenzen von dikotylen Pflanzen für die Transformation von dikotylen Pflanzen erforderlich. Vorzugsweise wird eine Nukleinsäuresequenz von einer beliebigen Pflanzenart in dieselbe Art eingeführt. So wird zum Beispiel eine Nukleinsäuresequenz aus dem Reis in eine Reispflanze hineintransformiert. Es ist jedoch nicht unbedingt erforderlich, dass die einzuführende Nukleinsäuresequenz von derselben Pflanzenart wie diejenige Pflanze, in die sie eingeführt wenden wird, stammt. Es reicht aus, dass eine Art wesentliche Homologie zwischen dem endogenen Zielgen und der einzuführenden Nukleinsäure besteht.
Im obigen Text sind Beispiele für verschiedene Verfahren für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze beschrieben. Ein Fachmann wäre leicht fähig, die oben genannten Silencing-Verfahren dahingehend zu adaptieren, dass eine Reduktion der Expression eines endogenen Gens in eine ganzen Pflanze oder in Teilen davon durch die Verwendung von z. B. einem entsprechenden Promoter erzielt wird.
Selektionsmarker(gen)/Reportergen
„Selektionsmarker”, „Selektionsmarkergen” oder „Reportergen” beinhaltet jegliches Gen, das einer Zelle, in der es exprimiert wird, um die Identifikation und/oder Selektion von Zellen, die mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstnakt transfiziert sind oder transformiert sind, zu erleichtern, einen Phänotyp verleiht. Mit diesen Markergenen kann ein erfolgreicher Transfer der Nukleinsäuremoleküle mittels einer Reihe von unterschiedlichen Prinzipien identifiziert werden. Geeignete Marker können aus Markern ausgewählt werden, die Antibiotika- oder Herbizidresistenz verleihen, die ein neues Stoffwechselmerkmal einführen oder die eine visuelle Selektion gestatten. Zu Selektionsmarkergenen zählen zum Beispiel Gene, die Resistenz gegen Antibiotika (wie nptII, das Neomycin und Kanamycin phosphoryliert, oder hpt, das Hygromycin phosphoryliert, oder Gene, die Resistenz gegen zum Beispiel Bleomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Ampicillin, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin verleihen), gegen Herbizide (zum Beispiel bar, das Resistenz gegen Basta^® vermittelt; aroA oder gox, die Resistenz gegen Glyphosate vermitteln, oder die Gene, die Resistenz gegen z. B. Imidazolinon, Phosphinothricin oder Sulfonylhamstoff verleihen), vermitteln, oder Gene, die ein Stoffwechselmerkmal bereitstellen (wie manA, das es Pflanzen ermöglicht, Mannose als einzige Kohlenstoffquelle zu verwerten, oder Xyloseisomerase für die Verwerfung von Xylose, oder Antinährstoffmarker, wie Resistenz gegen 2-Desoxyglucose). Die Expression von visuellen Markergehen führt zur Bildung von Farbe (zum Beispiel β-Glucuronidase, GUS oder β-Galactosidase mit ihren gefärbten Substraten, zum Beispiel X-Gal), Lumineszenz (wie das Luziferin/Luziferase-System) oder Fluoreszenz (Green Fluorescent Protein, GFP, und seine Derivate). Diese Aufzählung stellt nur eine kleine Anzahl von möglichen Markern dar. Der Fachmann ist mit solchen Marker vertraut. Je nach dem Organismus und dem Selektionsverfahren werden unterschiedliche Marker bevorzugt.
Es ist bekannt, dass bei der stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuren in Pflanzenzellen nur ein kleiner Teil der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt und gewünschtenfalls in ihr Genom integriert, was von dem verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik abhängt. Um diese Integranten zu identifizieren und auszuselektieren, wird üblicherweise ein Gen, das für einen Selektionsmarker (wie die oben beschriebenen) kodiert, gemeinsam mit dem interessierenden Gen in die Wirtszellen eingebracht. Diese Marker können zum Beispiel bei Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene nichtfunktionell sind, und zwar zum Beispiel durch Deletion mit traditionellen Verfahren. Weiterhin können Nukleinsäuremoleküle, die für einen Selektionsmarker kodieren, in eine Wirtszelle auf demselben Vektor, der die Sequenz, die die erfindungsgemäßen Polypeptide oder die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide kodiert, umfasst, oder auch in einem separaten Vektor in eine Wirtszelle eingeführt werden. Zellen, die mit der eingeführten Nukleinsäure stabil transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (zum Beispiel überleben Zellen, die den Selektionsmarker integriert haben, während die anderen Zellen absterben).
Da, sobald die Nukleinsäuren erfolgreich eingeführt worden sind, die Markergene, insbesondere Gene für Resistenz gegen Antibiotika und Herbizide, in der transgenen Wirtszelle nicht mehr erforderlich sind oder unerwünscht sind, werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren für die Einführung der Nukleinsäuren vorteilhaft Techniken verwendet, die die Entfernung oder das Herausschneiden dieser Markergene gestatten. Eines dieser Verfahren ist die so genannte Cotransformation. Bei dem Cotransformatiorisverfahren werden zwei Vektoren gleichzeitig für die Transformation verwendet, wobei ein Vektor die erfindungsgemäße Nukleinsäure trägt und ein zweiter Vektor das Markergen bzw. die Markergene trägt. Ein Großteil der Transformanten erhält oder, im Fall von Pflanzen, umfasst (bis zu 40% oder mehr der Transformanten) beide Vektoren. Bei der Transformation mit Agrobakterien erhalten die Transformanten üblicherweise nur einen Teil des Vektors, d. h. diejenige Sequenz, die von der T-DNA flankiert ist, die üblicherweise die Expressionskassette darstellt. Die Markergene können anschließend von der transformierten Pflanze mittels Kreuzen entfernt werden. Bei einem anderen Verfahren werden für die Transformation Markergene, die in ein Transposon integriert sind, gemeinsam mit der gewünschten Nukleinsäure eingesetzt (dies ist unter der Bezeichnung Ac/Ds-Technologie bekannt). Die Transformanten können mit einer Transposasequelle gekreuzt werden, oder die Transformanten werden mit einem Nukleinsäurekonstrukt, das transient oder stabil die Expression einer Transposase vermittelt, transformiert. In manchen Fällen (ungefähr 10%) springt das Transposon, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, aus dem Genom der Wirtszelle heraus und geht verloren. In einer weiteren Anzahl von Fällen springt das Trarsposon an einen anderen Locus. In diesen Fällen muss das Markergen durch Kreuzen entfernt werden. In der Mikrobiologie wurden Techniken entwickelt, die den Nachweis solcher Ereignisse möglich machen oder erleichtern. Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren beruht auf den so genannten Rekombinationssystemen, deren Vorteil darin besteht, dass ein Entfernen durch Kreuzen nicht erforderlich ist. Das bekannteste System dieses Typs ist unter der Bezeichnung Cre/lox-System bekannt Cre1 ist eine Rekombinase, die die Sequenzen, die sich zwischen den loxP-Sequenzen befinden, entfernt. Ist das Markergen zwischen den loxP-Sequenzen integriert, so wird es, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, durch Expression der Rekombinase entfernt. Weitere Rekombinationssysteme sind das HIN/HIX-, FLP/FRT- und REP/STB-System (Tribble et al. J. Biol. Chem., 275, 2000: 72255–22267; Velmurugan et al. J. Cell Biol., 149, 2000: 553–566). Eine ortsspezifische Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in das Pflanzengenom ist möglich. Natürlich können diese Verfahren auch auf Mikroorganismen wie Hefe, Pilze oder Bakterien angewandt werden.
Transgen/transgen/rekombinant
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet „transgen”, „Transgen” oder „rekombinant” in Bezug auf z. B. eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette, ein Genkonstrukt oder einen Vektor umfassend die Nukleinsäuresequenz oder einen Organismus, der mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten oder Vektoren transformiert ist, wobei alle diese Konstrukte mittels rekombinanter Verfahren entstehen, in denen entweder

(a) die Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine kodieren, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, oder
(b) genetische Kontrollsequenz(en) in operativer Verknüpfung mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz, zum Beispiel einem Promoter, oder
(c) a) und b)

US 5,565,350

WO 00/15815

Unter einer transgenen Pflanze versteht man im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wie oben, dass die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrem natürlichen Locus im Genom dieser Pflanze vorliegen, wobei die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden können. Wie erwähnt bedeutet transgen auch, dass die Sequenz in Bezug auf die natürliche Sequenz modifiziert worden ist und/oder dass die Regulationssequenzen der natürlichen Sequenzen modifiziert worden sind, obwohl die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die Nukleinsäuren, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wenden, in ihrer natürlichen Position im Genom einer Pflanze vorliegen. Transgen bedeutet vorzugsweise die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an einem unnatürlichen Locus in dem Genom, d. h. dass eine homologe, oder vorzugsweise, heterologe Expression der Nukleinsäuren stattfindet. Bevorzugte transgene Pflanzen werden im vorliegenden Text erwähnt.
Transformation
Der Begriff „Einführung” oder „Transformation” umfasst im vorliegenden Zusammenhang den Transfer eines Fremdpolynukleotids in eine Wirtszelle, und zwar unabhängig von dem für den Transfer eingesetzten Verfahren. Pflanzengewebe, das anschließend durch Klonieren vermehrt werden kann, egal ob durch Organogenese oder Embryogenese, kann mit einem erfindungsgemäßen Genkonstrukt transformiert werden und eine ganze Pflanze daraus regeneriert werden. Das jeweilige ausgewählte Gewebe hängt von den jeweiligen Klonierungsvermehrungssytemen ab, die für die jeweilige zu transformierende Art verfügbar und am besten geeignet sind. Zu Zielgeweben zählen zum Beispiel Blattscheiben, Pollen, Embryonen, Kotyledonen, Hypokotyle, Megagametophyten, Kallusgewebe, existierendes Meristemgewebe (z. B. Apikalmeristem, Achselknospen und Wurzelmeristeme) und induziertes Meristemgewebe (z. B. Kotyledonenmeristem und Hypokotylmeristem). Das Polynukleotid kann in eine Wirtszelle transient oder stabil eingeführt werden und kann in nichtintegrierter Form, zum Beispiel als Plasmid, aufrechterhalten werden. Es kann jedoch auch in das Wirtsgenom integriert werden. Mit den erhaltenen transformierten Pflanzenzellen kann man dann eine transformierte Pflanze auf fachbekannte Art und Weise regenerieren.
Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird Transformation genannt. Die Transformation von Pflanzenarten ist heutzutage eine ziemliche Routineangelegenheit. Um das interessierende Gen in eine geeignete Vorfahrenzelle einzuführen, kann vorteilhafterweise irgendeine von verschiedenen Transformationsmethoden eingesetzt werden. Die für die Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschriebenen Methoden können für die transiente oder für die stabile Transformation eingesetzt werden. Zu Transformationsmethoden zählen die Verwendung von Liposomen, die Elektroporation, Chemikalien, die die freie DNA-Aufnahme verstärken, die Injektion der DNA direkt in die Pflanze, der Beschuss mit der Genkanone, die Transformation mit Viren oder Pollen und die Mikroprojektion. Die Methoden können aus den folgenden ausgewählt werden: Calcium/Polyethylenglykol-Methode für Protoplasten (Krens, F.A. et al. (1982), Nature 296, 72–74; Negrutiu I et al. (1987), Plant Mol. Biol. 8: 363–373); Elektroporation von Protoplasten (Shillito R.D. et al. (1985), Bio/Technol. 3, 1099–1102); Mikroinjektion in Pflanzenmaterial (Crossway A et al. (1986), Mol. Gen. Genet. 202: 179–185); Beschuss mit mit DNA oder RNA beschichteten Partikeln (Klein TM et al. (1987), Nature 327: 70), Infektion mit (nichtintegrierenden) Viren und dergleichen. Transgene Pflanzen, darunter auch transgene Kulturpflanzen, werden vorzugsweise mittels Agrobacterium-vermittelter Transformation erzeugt. Eine vorteilhafte Transformationsmethode ist die Transformation in planta. Zu diesem Zweck kann man zum Beispiel die Agrobakterien auf Pflanzensamen einwirken lassen oder das Pflanzenmeristem mit Agrobakterien inokulieren. Erfindungsgemäß hat sich besonders günstig erwiesen, eine Suspension von transformierten Agrobakterien auf die intakte Pflanze oder zumindest die Blütenprimordien einwirken zu lassen. Die Pflanze wird anschließend weiter herangezogen, bis man die Samen der behandelten Pflanze erhält (Clough und Bent, Plant J. (1998), 16, 735–743). Zu den Methoden für die Agrobacterium-vermittelte Transformation des Reises zählen gut bekannte Methoden für die Reistransformation, wie diejenigen, die in einer der folgenden Schriften beschrieben sind: Europäische Patentanmeldung EP 1198985 A1 , Aldemita und Hodges (Planta 199: 612–617, 1996); Chan et al. (Plant Mol. Biol. 22 (3): 491–506, 1993), Hiei et al. (Plant J. 6 (2): 271–282, 1994), die hiermit durch Bezugnahme als ob vollständig beschrieben in den vorliegenden Text aufgenommen werden. Bei der Transformation des Maises ist die bevorzugte Methode entweder wie bei Ishida et al. (Nat. Biotechnol. 14(6): 745–50, 1996) oder bei Frame et al. (Plant Physiol. 129(1): 13–22, 2002) beschrieben, die hiermit durch Bezugnahme als ob vollständig beschrieben in den vorliegenden Text aufgenommen werden. Diese Methoden sind weiterhin zum Beispiel bei B. Jenes et al. Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143 und in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205–225) beschrieben. Die zu exprimierenden Nukleinsäuren bzw. das zu exprimierende Konstrukt werden/wird vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der sich für die Transformation von Agrobacterium tumefaciens eignet, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al. Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Agrobakterien, die mit solch einem Vektor transformiert wurden, können dann auf bekannte Weise für die Transformation von Pflanzen eingesetzt werden, wie Pflanzen, die als Modell verwendet werden, wie Arabidopsis (Arabidopsis thaliana zählt im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung nicht als Kulturpflanze), oder Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, und zwar zum Beispiel dadurch, dass man verletzte Blätter oder zerkleinerte Blätter in einer Agrobakterienlösung badet und sie dann in geeigneten Medien kultiviert. Die Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens wird zum Beispiel bei Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988), 16, 9877 beschrieben oder ist unter anderem aus F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38 bekannt.
Zusätzlich zu der Transformation von somatischen Zellen, die dann zu intakten Pflanzen regeneriert werden müssen, kann man auch Zellen von pflanzlichen Meristemen transformieren, insbesondere solche Zellen, die sich zu Gameten entwickeln. In diesem Fall folgen die transformierten Gameten der natürlichen Pflanzenentwicklung und ergeben transgene Pflanzen. So werden zum Beispiel Samen von Arabidopsis mit Agrobakterien behandelt, und man erhält von den sich entwickelnden Pflanzen, von denen ein gewisser Teil transformiert und daher transgen ist, Samen [Feldman, KA und Marks MD (1987). Mol. Gen. Genet. 208: 274–289; Feldmann K (1992). In: C Koncz, N-H Chua und J Shell, Hrsg., Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, S. 274–289]. Andere Methoden beruhen auf der wiederholten Entfernung der Infloreszenzen und Inkubation der Exzisionsstelle in der Mitte der Rosette mit transformierten Agrobakterien, wodurch ebenfalls später transformierte Samen erhalten werden können (Chang (1994). Plant J. 5: 551–558; Katavic (1994). Mol. Gen. Genet., 245: 363–370). Eine besonders wirksame Methode ist jedoch die Vakuuminfiltrationsmethode mit ihren Modfikationen, wie der „floral dip” Methode. Bei der Vakuuminfiltration von Arabidopsis wenden intakte Pflanzen unter verringertem Druck mit einer Agrobakteriensuspension behandelt [Bechthold, N (1993). C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316: 1194–1199], während bei der „floral dip”-Methode das sich entwickelnde Blütengewebe kurz mit einer mit Tensid behandelten Agrobakteriensuspension inkubiert wird [Clough, SJ und Bent AF (1998), The Plant J. 16, 735–743]. Ein gewisser Anteil transgener Samen wird in beiden Fällen geerntet, und diese Samen lassen sich von nichttransgenen Samen dadurch unterscheiden, dass man sie unter den oben beschriebenen Selektionsbedingungen heranzieht. Außerdem ist die stabile Transformation von Plastiden vorteilhaft, da Plastide bei den meisten Kulturpflanzen mütterlich vererbt werden, wodurch die Gefahr des Transgenflusses durch Pollen reduziert oder eliminiert wird. Die Transformation des Chloroplastengenoms erfolgt im Allgemeinen durch ein Verfahren, das schematisch bei Klaus et al. 2004, [Nature Biotechnology 22 (2), 225–229] gezeigt wurde. Kurz gesagt werden die zu transformierenden Sequenzen gemeinsam mit einem Selektionsmarkergen zwischen flankierende Sequenzen, die zu dem Chloroplastengenom homolog sind, kloniert. Diese homologen flankierenden Sequenzen dirigieren die ortsgerichtete Integration in das Plastom. Die Plastidentransformation ist für viele unterschiedliche Pflanzenarten beschrieben worden, und eine Übersicht findet sich bei Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J. Mol. Biol. 2001 Sept. 21; 312 (3):425–38 oder Maliga, P (2003), Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20–28. Über einen weiteren Fortschritt in der Biotechnologie ist in jüngster Zeit in Form von markerfreien Plastidentransformanten, die durch ein transientes cointegriertes Markergen erzeugt werden können, berichtet worden (Klaus et al. 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225–229).
T-DNA-Aktivierungs-Tagging
T-DNA-Aktivierungs-Tagging (Hayashi et al. Science (1992), 1350–1353) beinhaltet die Insertion von T-DNA, die üblicherweise einen Promoter (kann auch ein Translationsenhancer oder ein Intron sein) enthält, in die Genomregion des interessierenden Gens oder 10 kB stromaufwärts oder stromabwärts von der Kodierregion eines Gens in solch einer Anordnung, dass der Promoter die Expression des Zielgens dirigiert. Typischerweise wird die Regulation der Expression des Zielgens durch seinen natürlichen Promoter unterbrochen, und das Gen gelangt unter die Kontrolle des neu eingeführten Promoters. Typischerweise ist der Promoter in eine T-DNA eingebettet. Diese T-DNA wird in das pflanzliche Genom zufallsmäßig insertiert, zum Beispiel mittels Agrobacterium-Infektion, und führt zu einer modifizierten Expression von Genen in der Nähe der insertierten T-DNA. Die entstehenden transgenen Pflanzen weisen aufgrund der modifizierten Expression von Genen in der Nähe des eingeführten Promoters dominante Phänotypen auf.
TILLING
Der Begriff „TILLING” ist eine Abkürzung von „Targeted Induced Local Lesions In Genomes” und bezieht sich auf eine Mutagenesetechrologie, die sich dazu eignet, Nukleinsäuren, die für Proteine mit modifizierter Expression und/oder Aktivität kodieren, zu erzeugen und/oder zu identifizieren. TILLING ermöglicht auch die Selektion von Pflanzen, die solche Mutantenvarianten tragen. Diese Mutantenvarianten können eine modifizierte Expression aufweisen, und zwar entweder bezüglich der Stärke oder der Lokalisierung oder des Zeitpunkts (wenn die Mutationen zum Beispiel den Promoter betreffen). Diese Mutantenvarianten können eine höhere Aktivität aufweisen als sie von dem Gen in seiner natürlichen Form aufgewiesen wird. Beim TILLING wird Mutagenese in hoher Dichte mit Screening-Methoden mit hohem Durchsatz kombiniert. Die Schritte, die beim TILLING typischerweise durchlaufen werden, lauten: (a) EMS-Mutagenese (Redei GP und Koncz C (1992), In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, Hrsg. Singapur, World Scientific Publishing Co, S. 16–82; Feldmann et al. (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, Hrsg, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 137–172; Lightner J und Caspar T (1998), In J Martinez-Zapater, J Salinas, Hrsg., Methods an Molecular Biology, Band 82. Humana Press, Totooma, NJ, S. 91–104); (b) DNA-Herstellung und Poolen von Individuen; (c) PCR-Amplifikation einer interessierenden Region; (d) Denaturieren und Annealing, um die Bildung von Heteroduplexen zu ermöglichen; (e) DHPLC, wo das Vorhandensein eines Heteroduplex in einem Pool als zusätzlicher Peak im Chromatogramm nachgewiesen wird; (f) Identifizieren der einzelnen Mutante; und (g) Sequenzieren des PCR-Produkts der Mutante. TILLING-Methoden sind in der Fachwelt gut bekannt (McCallum et al. (2000), Nat. Biotechnol. 18: 455–457; in einem Übersichtsartikel von Stemple (2004), Nat. Rev. Genet. 5(2): 145–50) erwähnt
Homologe Rekombination
Die homologe Rekombination gestattet die Einführung einer ausgewählten Nukleinsäure in ein Genom in einer definierten ausgewählten Position. Die homologe Rekombination ist eine Standardtechnik, die routinemäßig in den Biowissenschaften für niedere Organismen wie Hefe oder das Moos Physcomitrella eingesetzt wird. Methoden für die Durchführung der homologen Rekombination in Pflanzen sind nicht nur für Modellpflanzen (Offringa et al. (1990), EMBO J. 9(10): 3077–84), sondern auch für Kulturpflanzen, zum Beispiel Reis (Terada et al. (2002), Nat. Biotech. 20(10): 1030–4; Lide und Terada (2004), Curr. Opin. Biotech. 15(2): 132–8) beschrieben worden, und es gibt Ansätze, die unabhängig von dem Zielorganismus allgemein anwendbar sind (Miller et al. Nature Biotechnol. 25, 778–785, 2007).
Ertrag
Der Begriff „Ertrag” bedeutet im Allgemeinen ein messbares Produkt von wirtschaftlichem Wert, das typischerweise mit einer bezeichneten Kulturpflanze, einem Ort und einem Zeitraum in Relation steht. Die einzelnen Pflanzenteile tragen direkt aufgrund ihrer Anzahl, Größe und/oder ihres Gewichts zum Ertrag bei, bzw. ist der tatsächliche Ertrag der Ertrag pro Quadratmeter für eine Kultur und ein Jahr, der dadurch bestimmt wird, dass man die Gesamtproduktion (was sowohl geerntete als auch geschätzte Produktion beinhaltet) durch die bepflanzten Quadratmeter dividiert. Der Begriff „Ertrag” einer Pflanze kann sich auf die vegetative Biomasse (Wurzel- und/oder Sprossbiomasse), auf die Reproduktionsorgane und/oder auf Vermehrungsmaterial (wie Samen) derjenigen Pflanze beziehen.
Jungpflanzenvitalität
”Jungpflanzenvitalität” bezieht sich auf aktives gesundes balanciertes Wachstum, insbesondere während der Frühstadien des Pflanzenwachstums, und kann das Ergebnis einer erhöhten pflanzlichen Anpassungsfähigkeit aufgrund von z. B. einer besseren Adaption der Pflanzen an ihre Umwelt (d. h. Optimieren der Nutzung von Energieressourcen und Aufteilung zwischen Spross und Wurzel) sein. Pflanzen mit Jungpflanzenvrtalität weisen auch ein erhöhtes Überleben der Keimpflanzen und ein besseres Etablieren der Kultur auf, was häufig zu stark einheitlichen Feldern (wobei die Kultur einheitlich heranwächst, d. h. wobei der Großteil der Pflanzen die verschiedenen Entwicklungsstadien im Wesentlichen gleichzeitig erreicht) und häufig zu einem besseren und höheren Ertrag führt. Jungpflanzenvitalität lässt sich daher dadurch bestimmen, dass man verschiedene Faktoren misst, wie Tausendkorngewicht, Keimungsprozentsatz, Prozentsatz des Auflaufens, Keimpflanzenwachstum, Keimpflanzenhöhe, Wurzellänge, Wurzel- und Sprossbiomasse und viele andere mehr.
Steigern/Verbessern/Fördem
Die Begriffe „steigern”, „verbessern” oder „fördern” sind untereinander austauschbar und sollen im Rahmen der vorliegenden Anmeldung mindestens 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% oder 10%, vorzugsweise mindestens 15% oder 20%, stärker bevorzugt 25%, 30%, 35% oder 40% mehr Ertrag und/oder Wachstum im Vergleich zu Kontrollpflanzen wie im vorliegenden Text definiert bedeuten.
Samenertrag
Ein erhöhter Samenertrag kann sich als eine oder mehrere der folgenden Erscheinungen äußern: a) Erhöhung der Samenbiomasse (Samengesamtgewicht), entweder auf Grundlage der einzelnen Samen und/oder pro Pflanze und/oder pro Quadratmeter; b) erhöhte Anzahl Briten pro Pflanze; c) erhöhte Anzahl (gefüllte) Samen; d) erhöhte Samenfüllungsrate (die als Verhältnis zwischen der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen ausgedrückt wird); e) erhöhter Harvest Index, der als Verhältnis des Ertrags von Erntegut wie Samen dividiert durch die Gesamtbiomasse ausgedrückt wird; sowie f) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG), das aufgrund der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihres Gesamtgewichts extrapoliert wird. Ein erhöhtes TKG kann das Ergebnis einer erhöhten Samengröße und/oder eines erhöhten Samengewichts sein und kann auch das Ergebnis einer Erhöhung der Embryo- und/oder Endospermgröße sein.
Eine Erhöhung der Samenausbeute kann sich auch als Erhöhung der Samengröße und/oder des Samenvolumens äußern. Eine Erhöhung der Samenausbeute kann sich auch als Erhöhung der Samenfläche und/oder Samenlänge und/oder Samenbreite und/oder des Samenumfangs äußern. Ein erhöhter Ertrag kann auch zu einer modifizierten Architektur führen oder kann aufgrund einer modifizierten Architektur vorliegen.
„Greenness”-Index
Der „Greenness-Index” wird im vorliegenden Zusammenhang aufgrund von digitalen Bildern von Pflanzen berechnet. Für jedes Pixel, das zu dem pflanzlichen Subjekt des Bilds gehört, wird das Verhältnis zwischen dem Grünwert und dem Rotwert (im RGB-Modell für die Farbkodierung) berechnet Der „Greenness-Index” wird als Prozentsatz Pixel, bei denen das Grün/Rot-Verhältnis einen gegebenen Schwellenwert übersteigt, ausgedrückt. Unter normalen Wachstumsbedingungen, unter Satzstress-Wachstumsbedingungen und unter Nährstoffmangel-Wachstumsbedingungen wird der „Greenness-Index” von Pflanzen beim letzten Imaging vor der Blüte gemessen. Im Gegensatz dazu wird der „Greenness-Index” von Pflanzen unter Trockenstress-Wachstumsbedingungen beim ersten Imaging nach der Dürre gemessen.
Pflanze
Der Begriff „Pflanze” umfasst im vorliegenden Zusammenhang ganze Pflanzen, Vorfahren und Nachfahren der Pflanzen und Pflanzenteile, darunter Samen, Sprosse, Stängel, Blätter, Wurzeln (einschließlich Knollen), Blüten und Gewebe und Organe, wobei jedes der genannten Objekte das interessierende Gen bzw. die interessierende Nukleinsäure umfasst Der Begriff „Pflanze” umfasst auch Pflanzenzellen, Suspensionskulturen, Kallusgewebe, Embryonen, meristematische Regionen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, wobei wiederum jedes der genannten Objekte das interessierende Gen bzw. die interessierende Nukleinsäure umfasst.
Zu Pflanzen, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders eignen, zählen all diejenigen Pflanzen, die zu der Überfamilie Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, darunter Futterleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelpflanzen, Bäume oder Sträucher aus der Liste, die folgende umfasst: Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (z B. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris. Brassica spp. (z. B. Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola-Raps, normaler Raps, Rübsen]), Cadaba farinoss, Camellia sinansis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (z. B. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (z. B. Glycine max, Soja hispida oder Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (z. B. Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (z. B. Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (z. B. Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Muss spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (z. B. Oryza sativa, Oryza latifoila), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phasenlus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunes spp., Psidiem spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (z. B. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui Triticum spp. (z. B. Triticum aestivum, Triticum durum, Triticurn turgidum, Triticum hybernum, Triticur macha, Triticum sativum, Triticum monococcum oder Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., und andere.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze zu Pflanzen führt, die verglichen mit Kontrollpflanzen modifizierte Wachstumseigenschaften aufweisen. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Verändern der Wachstumseigenschaften in Pflanzen verglichen mit Kontrollpflanzen und insbesondere zum Modifizieren von lichtregulierten Phänotypen bereit, das das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid oder einen Teil davon kodiert, in einer Pflanze. In einer besonderen Ausführungsform, in der HUB1 falsch exprimiert wird, umfassen die modifizierten lichtregulierten Phänotypen eine Modifikation der circadianen Uhr der Pflanze, eine Modifikation der nachgeschalteten Signalleitungswege der circadianen Uhr, wie modifizierte Photosynthesekapazität (Beispiel: Reduktion der Photosynthesepigmente, defektive Plastidenstruktur), modifiziertes Expressionsmuster von Entwicklungsgenen und/oder modifizierte Pflanzenentwicklung, Beispiel: veränderte Blütezeit oder modifizierte Pflanzenarchitektur (einschließlich Blattmorphologie, Blütenmorphologie oder Hypokotyllänge). Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Verbesserung von Wachstumseigenschaften in Pflanzen bereit, insbesondere gesteigerte Jungpflanzenwüchsigkeit, gesteigerte Keimkraft und/oder gesteigerter Ertrag (Biomasse und/oder Samenertrag) verglichen mit Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze, und/oder umfassend das Modulieren der Expression von Genen, die für Zielproteine von HUB1 und/oder Proteine, die mit HUB1 interagieren, kodieren.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (Steigern oder Verringem) der Expression einer Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid kodiert, besteht darin, dass man eine Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid oder einen Teil davon kodiert, in eine(r) Pflanze einbringt und exprimiert. Der Begriff „Missexpression” eines Gens, wie er in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, umfasst die herunterregulierte Expression des Gens, jedoch auch die reduzierte Aktivität des Proteins, das von dem Gen kodiert wird, zum Beispiel das Reduzieren der Konzentration des Proteins (reduzierte Synthese oder gesteigerter Abbau), oder durch Einführen von Mutationen in das Protein zwecks Erniedrigung der intrinsischen Aktivität oder der Fähigkeit, mit Liganden, Cofaktoren oder sonstigen interagierenden Faktoren zu interagieren. Verfahren zum Herunterregulieren der Expression finden sich in dem Abschnitt „Definitionen”.
Wird im folgenden Text ein „Protein, das für die erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist,” erwähnt, so versteht man darunter ein HUB1-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert. Wird im folgenden Text eine „Nukleinsäure, die für die erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist,” erwähnt, so bedeutet dies eine Nukleinsäure, die fähig ist, für solch ein HUB1-Polypeptid oder einen Teil davon zu kodieren. Die in eine Pflanze einzuführende Nukleinsäure (und die daher beim Durchführen der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist) ist jede beliebige Nukleinsäure, die für die Art von Protein, die nun beschrieben werden wird, kodiert, und wird im Folgenden auch „HUB1-Nukleinsäure” oder„HUB1-Gen” genannt.
Ein „HUB1-Polypeptid”, wie es im vorliegenden Text definiert wird, bezieht sich auf eine Ubiquitin-Proteinligase (E3-Ligase), die eine RING-Domäne umfasst. Die E3-Ligasen vermitteln die Ubiquitinierung von Substratproteinen. Vorzugsweise gehört das HUB1-Polypeptid zu der RING-HCa-Klasse der E3-Ligase-Proteine (Stone et al., Plant Physiol. 137, 13–30, 2005). Bei der RING-Domäne handelt es sich um einen Spezialtyp der Zn-Fingerdomänen, die an Protein-Protein-Interaktionen berteiligt ist. Vorzugsweise handelt es sich bei der RING-Domäne um eine RING-Domäne des C3HC4-Typs, die dem Pfam-Eintrag PF00097 entspricht. Die C3HC4-Domänen weisen die folgende Consensus-Sequenz auf (Lorick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 11364–11369, 1999): C-X2-C-X(9-39)-C-X(1-3)-H-X(2-3)-C-X2-C-X(448)-C-X2-C (die Cofaktorkoordinationsreste sind fettgedruckt und unterstrichen, siehe auch das multiple Alignment in 2). Vorzugsweise lautet die Consensus-Sequenz C-X2-C-X11-C-X-H-X2-C-X2-C-X11-C-X2-C. Die C3HC4-Domänen binden angeblich an 2 Metallcofaktoren, insbesondere Zink; der erste Cofaktor wird mutmaßlich von den ersten vier Koordinationsresten (Nummer 1 bis 4 in 1B(i)) gebunden, und der zweite Cofaktor wird mutmaßlich von den letzten vier Koordinationsresten gebunden (Nummer 5 bis 8 in 1B(i)).
Der Begriff „HUB1-Polypeptid”, wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfasst auch Mutantenformen mit reduzierter Autopolyubiquitinierung, jedoch mit einer normalen, reduzierten oder vollständig eliminierten Substratubiquitinierungsaktivität (dominant-positive Formen eines HUB1-Polypeptids). In einer solch dominant-positiven Form wurden die Cys-Reste Nr. 1 und 2 der C3HC4-Domäne (1B(i)) zu Ser-Resten mutiert (1B(ii) und (iii)).
Altemativ dazu weist das Homolog eines HUB1-Proteins mit ansteigender Bevorzugung mindestens 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zu der Aminosäure gemäß SEQ ID NO: 2 auf, mit der Maßgabe, dass das homologe Protein die wie oben umrissenen konservierten Domänen umfasst. Die Gesamtsequenzidentität wird unter Verwendung eines Gesamt-Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus in dem GAP-Programm (GCG Wisconsin Package, Accelrys) bestimmt, vorzugsweise mit Default-Parametern. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn nur konservierte Domänen oder Motive (wie die RING-Domäne, siehe Beispiel 3) in Betracht gezogen werden.
Vorzugsweise bildet die Polypeptidsequenz die, wenn sie bei der Konstruktion eines phylogenetischen Baums wie dem in dargestellten eingesetzt wird, Cluster mit der Gruppe der HUB1-Polypeptide, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 (At2g44950) umfassen, und nicht mit einer beliebigen anderen Gruppe von Proteinen, die eine RING-Domäne umfassen.
Die Begriffe „Domäne”, „Signatur” und „Motiv” werden im vorliegenden Text in dem Abschnitt „Definitionen” definiert. Für die Identifikation von Domänen gibt es Spezialdatenbanken, zum Beispiel SMART (Schultz et al. (1998), Proc. Nato. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al. (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244), InterPro (Mulder et al. (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318), Prosite (Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altmau R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53-61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al. Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004)), oder Pfam (Bateman et al. Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002)). Ein Satz Werkzeuge für die in-silico-Analyse von Proteinsequenzen findet sich auf dem ExPASY-Proteomics-Server (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al. ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)). Domänen oder Motive können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie Sequenz-Alignment, identifiziert werden.
Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind in der Fachwelt gut bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASIA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mob. Biol. 48: 443–453) verwendet, um das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen, das die Anzahl der „matches” maximiert und die Anzahl der „gaps” minimiert, zu finden. Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al. (1990), J. Mob. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet, und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist der Öffentlichkeit über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) zugänglich. Homologe können leicht unter Verwendung von zum Beispiel dem multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parameter für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent Die Gesamtprozentsätze der Ähnlichkeit und der Identität können auch unter Verwendung von einer der in dem MatGAT-Software-Paket verfügbaren Methoden bestimmt werden (Campanella et al. BMC Bioinformatics. 2003, Jul, 10; 4:29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences.). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können, wie dem Fachmann klar wird, kleine händische Veränderungen vorgenommen werden. So können außerdem statt Volllängensequenzen für die Identifikation von Homologen auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können mit den oben erwähnten Programmen unter Einstellung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) bestimmt werden. Für lokale Alignments eignet sich der Smith-Waterman-Algorithmus besonders gut (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1); 195–7).
Weiterhin ermitteln HUB1-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) typischerweise die Monoubiquitinierung von Histon H2B. Werkzeuge und Techniken für die Bestimmung der in vitro-Ubiquitinierung sind in der Fachwelt gut bekannt, siehe zum Beispiel Fleury et al. (2007) oder Liu et al. (2007). Weitere Einzelheiten finden sich in Beispiel 6.
Weiterhin führen HUB1-Polypeptide, wenn sie nach Verfahren der vorliegenden Erfindung wie im Beispielteil umrissen in Reis oder Arabidopsis exprimiert werden, zu Pflanzen mit unter anderem modifizierten lichtregulierten Phänotypen, gesteigerter Jungpflanzenvitalität, gesteigerter Keimkraft und/oder gesteigerten Samenertragsmerkmalen, darunter (jedoch nicht ausschließlich) Gesamtzahl Samen, Anzahl gefüllter Samen oder Gesamtsamengewicht.
Die vorliegende Erfindung stellt auch dominant-positive Formen eines HUB1-Polypeptids bereit. In einer dominant-positiven Form (HUB1pm) wurden die Cys-Reste Nr. 1 und 2 der C3HC4-Domäne (1B(i)) in Ser-Reste mutiert (1B(ii) und (iii)). Überraschenderweise war die H2B-Monoubiquitinierung von diesen Punktmutationen nicht beeinflusst (5, HA-Ab), während die Autopolyubiquitinierungsaktivität von HUB1 negativ beeinflusst wurde. Auch reduzierte das Vorliegen von Substrat die Autopolyubiquitinierungsaktivität, was darauf schließen lässt, dass in Abwesenheit von Substrat HUB1-Protein mittels Proteinabbau entfernt werden kann. Diese reduzierte Autoregulation kann zu einer Stabilisierung des Proteins führen, wodurch eine dominant-positive Form des Proteins mit gesteigerter Aktivität erzeugt wird.
Die Überexpression von Wildtyp-HUB1 hat einen positiven Einfluss auf das Pflanzenwachstum, und es wird daher erwartet, dass eine dominant-positive oder stabilisierte Form von HUB1 eine weitere Steigerung dieser Wachstumseffekte ermöglichen kann (siehe Beispiel 16). Auch wird postuliert, dass andere Mutationen, die im Wesentlichen die Cofaktorbindung in einer von den beiden Zn-Bindungsstellen verhindert, eine vergleichbare Auswirkung auf die Proteinfunktion ausüben wird; diese anderen Mutationen umfassen jegliche Art von Mutation(en), einschließlich Insertionsmutagenese für die Störung oder Vergrößerung des offenen Leserasters. Der Begriff „HUB1-Polypeptid”, wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfasst daher auch Mutanterformen mit reduzierter Autopolyubiquitinierung, jedoch mit normaler, reduzierter oder vollständig eliminierter Substratubiquitinierungsaktivität.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird daher ein isoliertes Polypeptid ausgewählt aus der Reihe:

(i) Polypeptidsequenz, die für ein HUB1-Protein wie oben definiert kodiert, das in seiner RING-Domäne eine oder mehr Mutationen umfasst, die im Wesentlichen die Cofaktorbindung in den Zn-Bindungsstellen verhindern, und wobei die eine oder mehr Mutationen die Autopolyubiquitinierung verringern, ohne dabei die Substratubiquitinierung zu beeinflussen;
(ii) HUB1-Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 28;
(iii) Polypeptidsequenz mit mit steigernder Bevorzugung mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 28 und umfassend eine RING-Domäne, die eine oder mehr Mutationen gemäß (i) umfasst;
(iv) funktionelle Fragmente von einer beliebigen der Aminosäuresequenzen gemäß (i), (ii) oder (iii) oben, mit der Maßgabe, dass das funktionelle Fragment eine RING-Domäne umfasst, die eine oder mehr Mutationen gemäß (i) umfasst,

Vorzugsweise handelt es sich bei der HUB1-Polypeptidsequenz wie oben in (i) definiert um ein HUB1-Polypeptid, wobei die Bindung eines Cofaktors im Wesentlichen verhindert wird, stärker bevorzugt wobei die Bindung des ersten Cofaktors verhindert wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird auch ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für ein HUB1-Polypeptid wie in (i) bis (iv) oben definiert kodiert, oder eine Nukleinsäure, die fähig ist, unter stringenten Bedingungen mit dem Komplement einer isolierten Nukleinsäure, das für ein HUB1-Polypeptid wie in (i) bis (iv) oben definiert kodiert zu hybridisieren; vorzugsweise ist die isolierte Nukleinsäure wie in SEQ ID NO: 49, dargestellt.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung Gene mit veränderten Expressionsniveaus in Pflanzen, die ein HUB1-Polypeptid überexprimieren, verglichen mit Expressionsniveaus in entsprechenden Wildtyppflanzen bereit. Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung Mittel zum Modulieren der Expression dieser Gene bereit, was wiederum eine Modulation der biologischen Vorgänge, die sie kontrollieren, gestattet. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren für ein Mimicking des HUB1-Polypeptidgehalts und/oder der HUB1-Aktivität bereit, und zwar dadurch, dass man nachgeschaltete Faktoren, die an vom HUB1-Polypeptid regulierten Signalleitungswegen beteiligt sind, manipuliert. Diese Strategie gestattet eine Feinabstimmung der Auswirkungen des HUB1-Polypeptids. Während die Überexpression oder Herunterregulation eines HUB1-Polypeptids pleiotrop sein kann und/oder pleiotrope Auswirkungen haben kann, stellt die Erfindung Verfahren für die Veränderung von Pflanzeneigenschaften auf kontrolliertere und gezieltere Weise bereit, und zwar dadurch, dass man die HUB1-Polypeptid-Zielgene wie in der vorliegenden Erfindung definiert verwendet. Dies ermöglicht nun die Modulation von bestimmten biologischen Vorgängen und kann zu Pflanzen mit veränderten Eigenschaften führen, die besonders nützliche Anwendungen in Landwirtschaft und Gartenbau haben können, wie verbesserte Ertragsmerkmale für Pflanzen, die unter normalen Bedingungen oder unter Stressbedingungen herangezogen werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren für die Steigerung von einem oder mehreren Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Modifizieren der Expression von einer oder mehr Nukleinsäuren und/oder das Modifizieren des Gehalts und/oder der Akivität von einem oder mehr Proteinen in einer Pflanze, wobei die Nukleinsäuren oder Proteine im Wesentlichen einem der in den Tabellen G bis K aufgelisteten Gene ähnlich sind, und wobei das eine oder die mehr Ertragsmerkmal(e) im Vergleich zu entsprechenden Wildtyppflanzen verändert sind. Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Modifizieren der circacianen Uhr in Pflanzen, zum Modifizieren der Photosynthesekapazität und/oder zum Modifizieren der Pflanzenentwicklung bereit.
Die vorliegende Erfindung wird dadurch erläutert, dass man Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, die für die Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 kodiert, und mit Pflanzen umfassend eine Mutation in dem HUB1-Gen (hub1-1, Fleury et al. 2007) transformiert Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung können vorteilhaft unter Verwendung einer beliebigen für HUB1 kodierenden Nukleinsäure oder eines beliebigen HUB1-Polypeptids wie im vorliegenden Text definiert, oder unter Verwendung einer beliebigen dominant-positiven Mutante von HUB1, durchgeführt werden. Alternativ dazu können Pflanzen mutagenisiert wenden, um eine Mutantenform des endogenen HUB1-Gens mit denselben funktionellen Eigenschaften wie die dominant-positive Mutante oder die hub1-1-Mutante zu erzeugen. Techniken für die Herstellung von solchen Mutationstypen sind in der Fachweit bekannt (wie TILLING oder die ortsspezfische Rekombination (Thomson und Ow, Genesis 44, 465–476, 2006)). Weiterhin können beliebige der in Tabelle G bis K aufgelisteten Gene (einschließlich SEQ ID NO: 50 bis SEQ ID NO: 243) oder die Orthologe von solchen Genen in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Beispiele für Nukleinsäuren, die für HUB1-Polypeptide kodieren, finden sich in Tabelle A von Beispiel 1 im vorliegenden Text. Solche Nukleinsäuren eignen sich bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Die Aminosäuresequenzen gemäß Tabelle A von Beispiel 1 sind beispielhafte Sequenzen für Orthologe und Paraloge des HUB1-Polypeptids gemäß SEQ ID NO: 2, wobei die Begriffe „Orthologe” und „Paraloge” wie im vorliegenden Text definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Durchführen einer sogenannten reziproken BLAST-Suche identifiziert werden. Dies beinhaltet typischerweise eine erste BLAST, bei der mit einer Abfragesequenz ein „BLASTing” gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird (zum Beispiel unter Verwendung von einer Sequenz gemäß Tabelle A von Beispiel 1). BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen dann verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gewünschtenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein zweites BLASTing gegen Sequenzen des Organismus, von dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Sequenzen aus Arabidopsis). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralog wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing von derselben Art ist, von der die Abfragesequenz stammt, in diesem Fall führt ein zweites BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Ortholog wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von derselben Art wie derjenigen, von der die Abfragesequenz stammt, ist, und führt vorzugsweise beim zweiten BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der „Score” (anders ausgedrückt, desto niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist in der Fachwelt gut bekannt. Das „Scoring” der Vergleiche erfolgt nicht nur mittels E-Werten, sondern auch mittels dem Prozentsatz der Identität. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Anzahl der identischen Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Tree verwenden, um die Cluster der verwandten Gene leichter sichtbar zu machen und um Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
Beispiele für Proteine, die an der circadianen Uhr, an der Output-Reaktion der circadianen Uhr und/oder an der Entwicklung beteiligt sind, sind in den Tabellen G, H und I angeführt. Beispiele für Proteine, die mit HUB1 interagieren, sind in den Tabellen J, K und L angeführt. Alle diese Proteine (einschließlich Orthologe) eignen sich für die Verfahren der vorliegenden Erfindung, und wenden im folgenden Text als „andere Proteine, die sich für die Verfahren der vorliegenden Erfindung eignen” bezeichnet.
Nukleinsäurevarianten können sich ebenfalls für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen. Zu Beispielen für solche Varianten zählen Nukleinsäuren, die für Homologe und Derivate von beliebigen der Aminosäuresequenzen gemäß Tabelle A von Beispiel 1 oder von anderen Proteinen, die sich für die Verfahren der vorliegenden Erfindung eignen, kodieren, wobei die Begriffe „Homolog” und „Derivat” wie im vorliegenden Text definiert sind. Außerdem eignen sich auch Nukleinsäuren für die erfindungsgemäßen Verfahren, die für Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von beliebigen der Aminosäuresequenzen gemäß Tabelle A von Beispiel 1 oder von anderen Proteinen, die sich für die Verfahren der vorliegenden Erfindung eignen, kodieren. Homologe und Derivate, die sich für die Verfahren der vorliegenden Erfindung eignen, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität auf wie das unmodifizierte Protein, von dem sie abstammen.
Weitere Nukleinsäurevarianten, die sich für die Durchführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung eignen, beinhalten Abschnitte von Nukleinsäuren, die für HUB1-Polypeptide kodieren, Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren, die für HUB1-Polypeptide kodieren, hybridisieren, Spleissvarianten von Nukleinsäuren, die für HUB1-Polypeptide kodieren, Allelvarianten von Nukleinsäuren, die für HUB1-Polypeptide kodieren, und Varianten von Nukleinsäuren, die für HUB1-Polypeptide kodieren und die mittels „Gene-Shuffling” erhalten wurden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleissvariante, Allelvariante und „Gene-Shuffling” sind wie im vorliegenden Text definiert. Außerdem eignen sich Nukleinsäurevarianten von Nukleinsäuren, die für andere Proteine, die sich für die Verfahren der vorliegenden Erfindung eignen, kodieren, Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren, die für andere Proteine, die sich für die Verfahren der vorliegenden Erfindung eignen, hybridisieren, Spleissvarianten von Nukleinsäuren, die für andere Proteine, die sich für die Verfahren der vorliegenden Erfindung eignen, kodieren, Allelvarianten von Nukleinsäuren, die für andere Proteine, die sich für die Verfahren der vorliegenden Erfindung eignen, kodieren, und Varianten von Nukleinsäuren, die für andere Proteine, die sich für die Verfahren der vorliegenden Erfindung eignen, kodieren und die durch „Gene-Shuffling” erhalten werden, für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren.
Nukleinsäuren, die für HUB1-Polypeptide oder für andere Proteine, die sich für die Verfahren der vorliegenden Erfindung eignen, kodieren, müssen nicht unbedingt Volllängennukleinsäuren sein, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf die Verwendung von Volllängennukleinsäuresequenzen angewiesen ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren für die Modifizierung von Wachstumseigenschaften bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man einen Abschnitt von einer beliebigen der Nukleinsäuresequenzen gemäß Tabelle A von Beispiel 1 oder in den Tabellen G bis K oder einen Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der Aminosäuresequenzen gemäß Tabelle A von Beispiel 1 oder in den Tabellen G bis K kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen bei der Nukleinsäure durchführt Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder können an andere Kodiersequenzen (oder Nichtkodiersequenzen) fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, bei dem mehrere Aktivitäten kombiniert sind. Bei der Fusion an andere Kodiersequenzen kann das bei der Translation hergestellte Polypeptid größer sein, als für den Proteinabschnitt vorhergesagt wurde.
Abschnitte, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, kodieren für ein HUB1-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert und weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenzen gemäß Tabelle A von Beispiel 1 oder gemäß den Tabellen G bis K auf. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt von einer der Nukleinsäuren gemäß Tabelle A von Beispiel 1 oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der Aminosäuresequenzen gemäß Tabelle A von Beispiel 1 kodiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt mindestens 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000 aufeinanderfolgende Nukleotide lang, wobei es sich bei den aufeinander folgenden Nukleotiden um eine beliebige der Nukleinsäuresequenzen gemäß Tabelle A von Beispiel 1 oder gemäß den Tabellen G bis K oder um eine Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der Aminosäuresequenzen gemäß Tabelle A von Beispiel 1 oder gemäß den Tabellen G bis K kodiert, handelt Am stärksten bevorzugt handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 oder von einer Nukleinsäure, die für ein Protein gemäß den Tabellen G bis K kodiert. Vorzugsweise kodiert der Abschnitt für ein Fragment einer HUB1-Polypeptidsequenz, die, wenn sie für die Konstruktion eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 3 abgebildet ist, verwendet wird, eher mit der Gruppe der HUB1-Polypeptide umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 (At2g44950) Cluster bildet als mit irgendeiner anderen Gruppe von Proteinen umfassend eine RING-Domäne.
Eine andere Nukleinsäurevariante, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignet, ist eine Nukleinsäure, die fähig ist, unter reduzierten Stringenzbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert, kodiert oder mit einer Nukleinsäure, die für ein Protein gemäß einer der Tabellen G bis K kodiert, oder mit einem Abschnitt wie im vorliegenden Text definiert, zu hybridisieren.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Modifizieren von Wachstumseigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, bei dem man eine Nukleinsäure, die fähig ist, mit einer der Nukleinsäuren gemäß Tabelle A von Beispiel 1 oder gemäß den Tabellen G bis K zu hybridisieren, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert, oder bei dem man eine Nukleinsäure, die fähig ist, mit einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der Nukleinsäuresequenzen gemäß Tabelle A von Beispiel 1 oder gemäß den Tabellen G bis K kodiert, zu hybridisieren, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
Hybridsierende Sequenzen, die sich für die Verfahren der Erfindung eignen, kodieren für ein HUB1-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert und weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenzen gemäß Tabelle A von Beispiel 1 oder gemäß den Tabellen G bis K auf. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz fähig, mit dem Komplement von einer beliebigen der Nukleinsäuren gemäß Tabelle A von Beispiel 1 oder gemäß den Tabellen G bis K oder mit einem Abschnitt von einer beliebigen dieser Sequenzen, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, zu hybridisieren, oder die hybridisierende Sequenz ist fähig, mit dem Komplement einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder ein Paralog von einer der Aminosäuresequenzen gemäß Tabelle A von Beispiel 1 oder gemäß den Tabellen G bis K kodiert, zu hybridisieren. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz fähig, mit dem Komplement einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 oder mit einem Teil davon zu hybridisieren.
Für HUB1 kodiert die hybridisierende Sequenz vorzugsweise für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die bei voller Länge und wenn sie für die Konstruktion eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen in , eingesetzt wird, eher mit der Gruppe der HUB1-Polypeptide umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 (At2g44950) Cluster bildet als mit irgendeiner anderen Gruppe von Proteinen umfassend eine RING-Domäne. Vorzugsweise kodiert die hybridisierende Sequenz für ein Protein mit einer RING-Domäne des C3HC4Typs.
Eine weitere Nukleinsäurevariante, die sich für die Verfahren der Erfindung eignet, ist eine Spleissvariante, die für ein HUB1-Polypeptid wie oben definiert kodiert oder die für andere Proteine, die sich für die Verfahren der vorliegenden Erfindung eignen, kodiert, wobei eine Spleissvariante wie im vorliegenden Text definiert ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Modifizieren der Wachstumseigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, bei dem man eine Spleissvariante von einer beliebigen der Nukleinsäuresequenzen gemäß Tabelle A von Beispiel 1 oder gemäß den Tabellen G bis K oder eine Spleissvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der Aminosäuresequenzen gemäß Tabelle A von Beispiel 1 oder gemäß den Tabellen G bis K kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
Bevorzugte Spleissvarianten sind Spleissvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 oder eine Spleissvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 2 kodiert Vorzugsweise bildet die HUB1-Aminosäuresequenz, die von der Spleissvariante kodiert wird, wenn sie für die Konstruktion eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen gemäß 3, verwendet wird, eher mit der Gruppe der HUB1-Polypeptide umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 (At2g44950) Cluster als mit einer beliebigen anderen Gruppe von Proteinen umfassend eine RING-Domäne. Vorzugsweise kodiert die Spleissvariante für ein Protein mit einer RING-Domäne des C3HC4-Typs.
Eine weitere Nukleinsäurevariante, die sich für die Verfahren der Erfindung eignet, ist eine Allelvariante, die für ein HUB1-Potypeptid wie oben definiert kodiert oder die für andere Proteine, die sich für die Verfahren der vorliegenden Erfindung eignen, kodiert, wobei eine Allelvariante wie im vorliegenden Text definiert ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Modifizieren der Wachstumseigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, bei dem man eine Allelvariante von einer beliebigen der Nukleinsäuresequenzen gemäß Tabelle A von Beispiel 1 oder gemäß den Tabellen G bis K oder eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der Aminosäuresequenzen gemäß Tabelle A von Beispiel 1 oder gemäß den Tabellen G bis K kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
Die Polypeptide, die von Allelvarianten, die sich für die Verfahren der vorliegenden Erfindung eignen, kodiert werden, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das HUB1-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 und eine beliebige der Aminosäuren gemäß Tabelle A von Beispiel 1 oder gemäß den Tabellen G bis K auf. Allelvarianten kommen in der Natur vor, und die Verwendung von diesen natürlichen Allelen ist von den Verfahren der vorliegenden Erfindung mit umfasst. Vorzugsweise handelt es sich bei der Allelvariante um eine Alletvariante gemäß SEQ ID NO: 1 oder um eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 2 kodiert oder von einem Protein gemäß den Tabellen G bis K. Vorzugsweise bildet die HUB1-Aminosäuresequenz, die von der Allelvariante kodiert wird, wenn sie für die Konstruktion eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen gemäß 3, verwendet wird, eher mit der Gruppe der HUB1-Polypeptide umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 (At2g44950) Cluster als mit einer beliebigen anderen Gruppe von Proteinen umfassend eine RING-Domäne. Vorzugsweise kodiert die Alletvariante für ein Protein mit einer RING-Domäne des C3HC4-Typs.
„Gene-Shuffling” oder gerichtete Evolution kann auch dazu verwendet werden, um Varianten von Nukleinsäuren, die für HUB1-Polypeptide wie oben definiert kodieren, oder die für andere Proteine, die sich für die Verfahren der vorliegenden Erfindung eignen, kodieren, zu erzeugen, wobei der Begriff „Gene-Shuffling” wie oben definiert ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Modifizieren von Wachstumseigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, bei dem man eine Variante von einer beliebigen der Nukleinsäuresequenzen gemäß Tabelle A von Beispiel 1 oder gemäß den Tabellen G bis K in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert, oder bei dem man eine Variante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der Aminosäureseguenzen gemäß Tabelle A von Beispiel 1 oder gemäß den Tabellen G bis K kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert, wobei die Nukleinsäurevariante mittels „Gene-Shuffling” erhalten wird.
Vorzugsweise bildet die HUB1-Aminosäuresequenz, die von der mittels „Gene-Shuffling” erhaltenen Nukleinsäurevariante kodiert wird, wenn sie für die Konstruktion eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen gemäß 3, verwendet wird, eher mit der Gruppe der HUB1-Polypeptide umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 (At2g44950) Cluster als mit irgendeiner anderen Gruppe von Proteinen umfassend eine RING-Domäne.
Nuldeinsäurevarianten können weiterhin auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Zur Erzielung einer ortsgerichteten Mutagenese sind verschiedene Verfahren verfügbar, von denen die häufigsten Methoden auf PCR-Basis sind (Current Protocols in Molecular Biology. Verlegt bei Wiley).
Nukleinsäuren, die für HUB1-Potypeptide oder andere Proteine, die sich für die Verfahren der vorliegenden Erfindung eignen, kodieren, können von einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abstammen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezieltes menschliches Eingreifen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäure, die für das HUB1-Polypeptid kodiert, bzw. stammen Nukleinsäuren, die für andere Proteine, die sich für die Verfahren der vorliegenden Erfindung eignen, kodieren, von einer Pflanze, stärker bevorzugt von einer dikotylen oder einer monokotylen Pflanze. Die für das HUB1-Polypeptid kodierende Nukleinsäure von einer dikotylen Pflanze stammt vorzugsweise von der Familie Brassicaceae, stärker bevorzugt von Arabidopsis thaliana.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit modifizierten Wachstumseigenschaften. Insbesondere führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit modifizierten lichtregulierten Phänotypen, gesteigerter Keimkraft, gesteigerter Jungpflanzenvitalität, gesteigerter Stressresistenz, veränderter Fruchtform und/oder gesteigertem Samenertrag verglichen mit Kontrollpflanzen. Der Begriff „Samenertrag” wird im vorliegenden Text im Abschnitt „Definitionen” genauer beschrieben. Es ist anzumerken, dass die Begriffe „modifizierte Wachstumseigenschaften” oder „Ertrag”, wie sie in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, nicht die vegetative Biomasse (wie Wurzeln, Blätter, Stängel) umfassen, außer dann, wenn eine dominant-positive Mutante von HUB1 in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
Werden im vorliegenden Text modifizierte Wachstumseigenschaften erwähnt, so soll dies auch eine Modifikation der lichtregulierten Phänotypen umfassen, die eine Veränderung der circadianen Uhr und eine Modifikation der der circadianen Uhr nachgeschalteten Signalleitungswege (der Output-Reaktionen der circadianen Uhr) beinhalten, jedoch nicht hierauf beschränkt sein. Die modifizierten nachgeschalteten Signalleitungswege umfassen einen oder mehr der folgenden: modifizierte Photosynthesekapazität, veränderte Expression von Genen, die an der Pflanzenentwicklung beteiligt sind, und modifizierte Pflanzenentwicklung. Die Modifikation der circadianen Uhr umfasst die modifizierte Expression der Input-Gene der circadianen Uhr sowie Oszillatorgene und Output-Gene. Die „modifizierte Output-Reaktion der circadianen Uhr oder die „modifizierten nachgeschalteten Signalleitungswege” umfassen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine Modifikation der Photosynthesekapazität, wie eine Modifikation der Konzentration von Photosynthesepigmenten (Chlorophyll a und b und Gesamtcarotinoide) in einer Pflanzenzelle, modifizierte Plastidenstruktur oder modifizierte Chloroplastenstruktur. Die „modifizierte Output-Reaktion der circadianen Uhr” oder die „modifizierten nachgeschalteten Signalleitungswege” umfassen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auch veränderte Expression von Genen, die an der Pflanzenentwicklung beteiligt sind, und Modifikationen der Pflanzenentwicklung, wie veränderte Architektur (einschließlich reduzierte Hypokotyllänge, modifizierte Blattmorphologie, modifizierte Blütenmorphologie) und/oder veränderte Blütezeit.
Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zum Modifizieren der Expression von Input-Genen der circadianen Uhr, von Oszillatorgenen, von Output-Genen und/oder von Entwicklungsgenen bereit, wobei das Verfahren vorzugsweise das Modulieren der Expression eines HUB1-Polypeptids umfasst. Einige dieser Gene liegen auf dem Chromosom nahe beieinander. HUB1- kann daher als Transkriptionsregulator für die Synchronisierung der Transkription von Genen, die ein Cluster bilden, verwendet werden. Beispiele für solche Cluster sind Photosynthesegene, Gene der circadianen Uhr oder Entwicklungsgene. Die modifizierte Expression der Input-Gene der circadianen Uhr, der Oszillatorgene, der Output-Gene, der Entwicklungsgene und/oder der Gene nach einer der Tabellen G bis K (oder von ihren Orthologen) aufgrund der modulierten HUB1-Expression kann wiederum zu verbesserten Pflanzenwachstumseigenschaften wie erhöhtem Ertrag oder erhöhter Stresstoleranz führen. Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren für die Verbesserung von Pflanzenwachstumseigenschaften bereit, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression von Input-Genen der circadianen Uhr, Oszillatorgenen, Output-Genen und/oder Entwickungsgenen aufgrund einer modulierten HUB1-Expression umfasst. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Verbesserung der Wachstumseigenschaften bereit, die das Modulieren der Expression von einem beliebigen der Gene gemäß Tabelle G bis K oder des Orthologs von solch einem Gen umfasst. Verfahren zum Identifizieren des Orthologs eines Gens sind oben beschrieben. Die modulierte Expression kann eine verstärkte oder verringerte Expression sein.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Veränderung der Pflanzenentwicklung, insbesondere für die Veränderung der Blütezeit und/oder für die Modifikation der Pflanzenarchitektur, bereit.
Die Blütezeit ist diejenige Zeit, die zwischen dem Aussäen und dem Beginn des reproduktiven Wachstums vergeht. Zu traditionellen Verfahren für die Bestimmung des Beginns der Blüte zählen das Präparieren von Pflanzen unter Vergrößerung zwecks Bestimmung des Vorhandenseins von entweder einer vegetativen oder einer reproduktiven Struktur an dem Meristem; um das Heraustreten des Blütenstamms zu verfolgen, das auch als „Blütenschieben” bekannt ist, oder um die Anthese zu verfolgen. Ein weit verbreitetes Verfahren für die Bestimmung des Beginns der Blüte in Kulturpflanzen auf dem Feld beinhaltet das wiederholte Begutachten der Parzellen, um die Anzahl blühender Pflanzen, die in einer Parzelle vorhanden sind, abzuschätzen. In der Landwirtschaft ist traditionellerweise anerkannt, dass eine Parzelle „blüht”, wenn bei 50% der Pflanzen in einer Parzelle der Blütenstand hervorgetreten ist. Ein weiteres Verfahren wiederum wird in der WO 2007/093444 beschrieben, dieses Verfahren beruht auf der Computeranalyse von digitalen Aufnahmen, die von den wachsenden Pflanzen gemacht werden.
Der Begriff Pflanzenarchitektur umfasst das Erscheinungsbild bzw. die Morphologie einer Pflanze, einschließlich von einer beliebigen oder von mehr Strukturmerkmalen oder einer Kombination von Strukturmerkmalen davon. Zu solchen Strukturmerkmalen zählen die Form, Größe, Anzahl, Lage, Textur, Anordnung und das Muster von einer beliebigen Zelle, einem beliebigen Gewebe oder einem beliebigen Organ oder Gruppen von Zellen, Geweben oder Organen einer Pflanze, einschließlich Wurzel, Blatt, Spross, Stängel oder Bestockungstrieb, Petiole, Trichom, Blüte, Blütenstand (zum Beispiel monokotyle oder dikotyle Pflanzen), Rispen, Petale, Stigma, Griffel, Staubblatt, Pollen, Ovulum, Samen, Embryo, Endosperm, Samenhülle, Aleuron, Faser, Cambium, Holz, Kernholz, Parenchym, Aerenchym, Siebelemente, Phloem oder Gefäßbündelgewebe, sowie andere mehr. Eine modifizierte Architektur beinhaltet daher alle Aspekte eines modifizierten Wachstums der Pflanze.
Die erfindungsgemäßen Pflanzen weisen vorzugsweise eine modifizierte Architektur auf, wobei die modifizierte Architektur eine oder mehrere der folgenden Modifikationen beinhaltet: gestauchtes Wachstum, modifizierte Blattmorphologie, modifizierte Hypokotylmorphologie, veränderte Blütenmorphologie verglichen mit Kontrollpflanzen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zum Modifizieren der Architektur von Pflanzen bereitgestellt, insbesondere eine oder mehrere der folgenden Modifikationen: gestauchtes Wachstum, modifizierte Blattmorphologie, modifizierte Hypokotylmorphologie, geänderte Blütenmorphologie, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein HUB1-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert kodiert, umfasst. Der Begriff„gestauchtes Wachstum” soll im vorliegenden Zusammenhang eine verringerte Pflanzenhöhe, ohne dass dabei die Organgröße betroffen ist, bedeuten, was der Pflanze einen buschigen Phänotyp verleiht, und zwar im Gegensatz zu Zwergwuchs oder Miniaturwuchs, bei dem die Proportionen beibehatten werden, das Gesamtpflanzenwachstum jedoch reduziert ist.
Die RING-Domäne in HUB1-Proteinen ist bekanntlich an Protein-Protein-Interaktionen beteiligt. In der vorliegenden Erfindung wird gezeigt, dass HUB1 mit verschiedenen Proteinen interagiert (Beispiel 22). Abgesehen von einer Homodimerisierung und Dimerisierung mit seinem Paralog HUB2 interagiert HUB1 auch mit GCN5, einem Histonacylierungsenzym, das an der Stressreaktion, an der Abwehr, an der Signaltransduktion, an der Transkription, am Metabolismus, am Transport beteiligt ist. GCN5 ist auch an der Blütenentwicklung beteiligt, und zwar dadurch, dass es die Expression von WUSCHEL und AGAMOUS beeinflusst. Der MYB-Transkriptionsfaktor At1g58220, ein weiterer mit HUB1 interagierender Faktor, ist an Reaktionen auf Pflanzenhormonreize (wie Abscisinsäure, Jasmonsäure und Salicylsäure) beteiligt Die vorliegende Erfindung stellt daher auch ein Verfahren für die Änderung von Reaktionen auf einen oder mehrere der folgenden Faktoren: Stressreaktionen, Abwehrreaktionen, Hormonsignaltransduktion und Blütenentwicklung bereit, wobei das Verfahren das Modulieren der HUB1-Expression umfasst.
Werden im vorliegenden Text verbesserte Wachstumseigenschaften erwähnt, so soll dies auch eine Erhöhung der Biomasse bzw. des Biomassegewichts von einem oder mehr erntbaren Teilen einer Pflanze bedeuten, wobei solche erntbaren Teile insbesondere Samen sind, und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit einem gesteigerten Samenertrag verglichen mit dem Samenertrag von Kontrollpflanzen. Die verbesserten Wachstumseigenschaften umfassen auch eine gesteigerte Keimkraft (gesteigerte Keimungsgeschwindigkeit), eine gesteigerte Jungpflanzervitalität und eine gesteigerte Stressresistenz, insbesondere gegenüber abiotischem Stress. Weiterhin wurde auch beobachtet, dass die Größe der Zellen verglichen mit Kontrollpflanzen erhöht war, insbesondere in Blättern.
Wählt man Mais als Beispiel, so kann sich eine Ertragserhöhung als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: Erhöhte Anzahl Pflanzen, die pro Quadratmeter etabliert sind, Erhöhung der Anzahl Ähren pro Pflanze, Erhöhung der Anzahl Reihen, der Anzahl Körner pro Reihe, des Korngewichts, Tausendkorngewichts, Ährenlänge/-durchmessers, Erhöhung der Samenfüllungsrate (Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen und multipliziert mit Hundert) und viele andere mehr. Wählt man Reis als Beispiel, so kann sich eine Ertragserhöhung als Erhöhung bezüglich einem oder mehreren der folgenden Merkmale ausdrücken: Anzahl Pflanzen pro Quadratmeter, Anzahl Rispen pro Pflanze, Anzahl Ährchen pro Rispe, Anzahl Blüten pro Rispe (ausgedrückt als Verhältnis der Anzahl der gefüllten Samen zu der Anzahl der Primärrispen), erhöhte Samenfüllungsrate (Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen und multipliziert mit Hundert), erhöhtes Tausenkorngewicht und viele andere mehr.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Erhöhung des Ertrags, insbesondere des Samenertrags von Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert kodiert oder die für ein anderes Protein, das sich für die Verfahren der vorliegenden Erfindung eignet, kodiert, in einer Pflanze umfasst.
Da die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen einen erhöhten Ertrag aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen (zumindestens während eines Teils ihres Lebenszyklus) eine im Vergleich zu der Wachstumsrate von Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus erhöhte Wachstumsrate aufweisen.
Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (darunter Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszylus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze braucht, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze trockene reife Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren wie Keimungsgeschwindigkeit (Keimkraft), Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, „Greenness Index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenabreifung beeinflusst werden. Die erhöhte Wachstumsrate kann in einem Stadium oder in mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze stattfinden. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte Vitalität widerspiegeln. Die erhöhte Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können, als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, so kann dies ein weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen innerhalb einer traditionellen Wachstumsperiode). Auf ähnliche Weise kann, wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, dies ein weiteres Aussäen von Samen von unterschiedlichen Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließendes z. B. Aussäen und gewünschtenfalls Ernten von Sojabohnen, Kartoffeln oder sonstigen geeigneten Pflanzen). Bei manchen Kulturpflanzen kann es auch möglich sein, dass man zusätzlich mehrmals von demselben Wurzelstock ernten kann. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Quadratmeter fuhren (und zwar aufgrund einer Erhöhung der Häufigkeit (z. B. pro Jahr), mit der eine bestimmte Pflanze herangezogen und geerntet werden kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch den Anbau von transgenen Pflanzen in einem weiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke ermöglichen, da die räumlichen Begrenzungen für den Anbau einer Kultur häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (früh in der Saison) oder während der Erntezeit (spät in der Saison) bestimmt wird. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten von verschiedenen Parameter von Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter folgende sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und viele mehr.
Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereit, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nuldeinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert oder die für ein anderes Protein, das sich für die Verfahren der vorliegenden Erfindung eignen, kodiert, moduliert.
Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate findet statt, egal, ob die Pflanze unter Nichtstressbedingungen steht oder ob die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen verschiedenen Stressfaktoren unterworfen wird. Typischerweise reagieren Pflanzen auf Stress dadurch, dass sie langsamer wachsen. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum einstellen. Leichter Stress wiederum wird im vorliegenden Zusammenhang als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze ihr Wachstum völlig einstellt, ohne ihr Wachstum wieder aufnehmen zu können. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, stärker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund der Fortschritte bei den landwirtschaftlichen Kulturmaßnahmen (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starken Stress. Daher ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Leichter, Stress ist der alltägliche biotische und/oder abiotische Stress (Umweltstress), dem eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Dürre oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und Hitze, Kälte oder Minustemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Dürre), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird. Biotische Stressfaktoren sind typischerweise Stressfaktoren, die von Pathogenen wie Bakterien, Viren, Pilzen, Nematoden und Insekten verursacht werden.
Insbesondere können die erfindungsgemäßen Verfahren unter Nichtstressbedingungen oder milden Dürrebedingungen durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit einem im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Ertrag erhält. Wie von Wang et al. (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Produktivität negativ beeinflussen. Es ist bekannt, dass Dürre, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress miteinander in Verbindung stehen und über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren können.
Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung von Dürrestress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. So äußern sich Düse und/oder Versalzung in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig hohe oder niedrige Temperaturen, Salinität oder Dürrestress begleitet, kann zur Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen führen. Das Ergebnis ist, dass diese verschiedenen Umweltstressfaktoren häufig ähnliche Signalleitungswege der Zelle und Zellreaktionen aktivieren, wie die Produktion von Stressproteinen, die Hinaufregulation von Antioxidantien, die Akkumulation von kompatiblen gelösten Stoffen und ein Einstellen des Wachstums. Der Begriff „Nichtstress” – Bedingungen bedeutet im vorliegenden Zusammenhang diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum der Pflanzen gestatten. Die Fachwelt ist mit den normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen bestimmten Standort vertraut.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verleiht Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder milden Dürrebedindungen herangezogen wenden, verbesserte Wachstumseigenschaften verglichen mit Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren für die Verbesserung von Wachstumseigenschaften in Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Dürrebedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, das das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid kodiert oder die für ein anderes Protein, das sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignet, kodiert, in einer Pflanze umfasst. Weiterhin verleiht die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren auch Pflanzen, die unter starken Dürrebedingungen herangezogen werden, verbesserte Wachstumseigenschaften verglichen mit Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren für die Verbesserung von Wachstumseigenschaften in Pflanzen, die unter starken Dürrebedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid kodiert oder die für ein anderes Protein, das sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignet, kodiert, in einer Pflanze umfasst.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verleiht Pflanzen, die unter Salzstressbedingungen herangezogen werden, verbesserte Wachstumseigenschaften verglichen mit Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren für die Verbesserung von Wachstumseigenschaften in Pflanzen, die unter Salzstressbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid kodiert oder die für ein anderes Protein, das sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignet, kodiert, in einer Pflanze umfasst. Der Begriff Salzstress ist nicht auf Kochsalz (NaCl) beschränkt, es kann sich dabei auch um ein beliebiges oder mehrere der folgenden Salze handeln: NaCl, KCl, Lid, MgCl₂, CaCl₂ und andere mehr.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verleiht Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen heranwachsen, verglichen mit unter vergleichbaren Bedingungen wachsenden Kontrollpflanzen verbesserte Wachstumseigenschaften, anders ausgedrückt, die erfindungsgemäßen Pflanzen weisen eine gesteigerte Nährstoffaufnahmefähigkeit auf. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren für die Verbesserung von Wachstumseigenschaften in Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid kodiert oder die für ein anderes Protein, das sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignet, kodiert, in einer Pflanze umfasst. Nährstoffmangel kann das Ergebnis einer Unterversorgung mit Nährstoffen wie Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor und anderen mehr sein.
Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen), die nach den erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Die Pflanzen oder die Teile davon umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das für ein HUB1-Polypeptid wie oben definiert kodiert oder das für ein anderes Protein, das sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignet, kodiert.
Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren bereit, um die Einführung und/oder Expression von Nukleinsäuren, die für HUB1-Polypeptide kodieren oder die für ein anderes Protein, das sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignet, kodieren, zu erleichtern. Die Genkonstrukte können in Vektoren insertiert werden, die im Handel erhältlich sein können und die für die Transformation in Pflanzen und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines wie im vorliegenden Text definierten Genkonstrukts in den erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
Genauer ausgedrückt stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt umfassend

(a) eine Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid wie oben definiert kodiert oder die für ein anderes Protein, das sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignet, kodiert;
(b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß (a) voranzutreiben vermag/vermögen; sowie gegebenenfalls
(c) eine Transkriptionsterminationssequenz

Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, die für HUB1-Polypeptid kodiert, wie oben definiert. Die Proteine, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignen, sind wie oben definiert und umfassen die Proteine gemäß Tabelle G bis K und ihre Orthologe. Der Begriff „Kontrollsequenz” und „Terminationssequenz” sind wie im vorliegenden Text definiert.
Die Pflanzen werden mit einem Vektor umfassend eine beliebige der oben beschriebenen Nukleinsäuren transformiert. Der Fachmann ist mit den genetischen Elementen, die in dem Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen, die die interessierende Sequenz enthalten, erfolgreich zu transformieren, zu selektieren und zu vermehren, gut vertraut. Die interessierende Sequenz ist operativ mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens mit einem Promoter) verbunden.
Für das Vorantreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz kann vorteilhaft jede Art von Promoter, egal, ob natürlich oder synthetisch, verwendet werden, der Promoter ist jedoch vorzugsweise pflanzlichen Ursprungs. Ein konstitutiver Promoter eignet sich ganz besonders für die Verfahren. Vorzugsweise ist der konstitutive Promoter auch ein ubiquitärer Promoter. Der Reis-GOS2-Promoter kann sich für monokotyle Pflanzen eignen, und ein CaMV35S-Promoter kann sich für dikotyle Pflanzen eignen. In manchen Fällen ist der konstitutive Promoter vorzugsweise nicht ein starker konstitutiver Promoter (wie der CaMV35S-Promoter) und ist weniger stark als der Reis-GOS2-Promoter. Um zu einer gesteigerten Jungpflanzenvitalität und/oder einer gesteigerten Keimkraft zu gelangen, eignet sich jedoch auch ein starker konstitutiver Promoter. In anderen Fällen ist ein organspezifischer, ein gewebespezifischer oder ein zellspezifischer Promoter besser geeignet Für Definitionen der verschiedenen Promotertypen siehe den Abschnitt „Definitionen” im vorliegenden Text.
Es ist klar, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1, die für das HUB1-Polypeptid kodiert, beschränkt ist bzw. dass die Anwendbarkeit der Erfindung nicht auf die Expression einer Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid kodiert, wenn sie von einen konstitutiven Promoter vorangetrieben wird oder wenn sie von einem samenspezifischen Promoter vorangetrieben wird, beschränkt ist.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem konstitutiven Promoter vorzugsweise um einen mittelstarken Promoter, der schwächer als der Reis-GOS2-Promoter und der CaMV35S-Promoter ist, wie ein „High Mobility Group Protein” (HMGP)-Promoter, vorzugsweise handelt es sich bei dem Promoter um einen HMGP-Promoter aus dem Reis. Weiterhin wird bevorzugt, dass der konstitutive Promoter einer Nukleinsäuresequenz entspricht, die im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NO: 6 ist, am stärksten bevorzugt entspricht der konstitutive Promoter SEQ ID NO: 6. Für weitere Beispiele für konstitutive Promoter, siehe Tabelle 2a in Abschnitt „Definitionen” im vorliegenden Text.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid kodiert, operativ mit einem samenspezifischen Promoter verknüpft. Bei dem samenspezifischen Promoter handelt es sich vorzugsweise um einen WSI18-Promoter, stärker bevorzugt stammt der WSI18-Promoter aus dem Reis, stärker bevorzugt entspricht der WSI18-Promoter einer Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen SEQ ID NO: 7 ähnlich ist, am stärksten bevorzugt entspricht der Promoter SEQ ID NO: 7. Beispiele für andere samenspezifische Promoter, die ebenfalls für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind in Tabelle 2c im Abschnitt „Definitionen” oben dargestellt.
Gewünschtenfalls kann/können eine oder mehrere Terminatorsequenz(en) in dem in eine Pflanze eingeführten Konstrukt verwendet werden.
Zusätzliche Regulationselemente können Transkriptions-Enhancer, jedoch auch Translations-Enhancer, beinhalten. Dem Fachmann sind Terminator- und Enhancer-Sequenzen, die sich für die Durchführung der Erfindung eignen können, bekannt. Auch eine Intronsequenz kann der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der Kodiersequenz angefügt werden, um die Menge der reifen Botschaft, die im Cytosol akkumuliert, zu erhöhen, wie dies in Abschnitt„Definitionen” beschrieben ist Andere Kontrollsequenzen (zusätzlich zu Promoter, Enhancer, Silencer, Intronsequenzen, 3'-UTR- und/oder 5'- UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen wären bekannt oder können leicht von einem Fachmann erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz, die für die Aufrechterhaltung und/oder Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist, beinhalten. Ein Beispiel ist, wenn ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element (z. B. als Plasmid- oder Cosmidmolekül) aufrechterhalten werden soll. Zu bevorzugten Replikationsursprüngen zählen, jedoch nicht ausschließlich, f1-ori und colE1.
Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, und/oder für die Selektion von transgenen Pflanzen, die diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Das Genkonstrukt kann gewünschtenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind genauer im Abschnitt „Definitionen” im vorliegenden Text beschrieben. Die Markergene können, wenn sie nicht mehr benötigt werden, aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden. Techniken für die Entfernung von Markern sind in der Fachwelt bekannt, und nützliche Techniken sind oben im Abschnitt „Definitionen” beschrieben.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzen mit modfizierten Wachstumseigenschaften verglichen mit Kontrollpflanzen, umfassend das Einführen und Exprimieren von einer beliebigen Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid wie oben definiert oder die für ein anderes Protein, das sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignet, kodiert, in eine(r) Pflanze bereit.
Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzen mit modifizierten Wachstumseigenschaften, insbesondere mit gesteigertem (Samen-)Ertrag, bereit, das Folgendes umfasst:

(i) Einführen und Exprimieren einer Nukledeinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid kodiert oder die für ein anderes Protein, das sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignet, kodiert, in einer) Pflanze oder Pflanzenzelle; und
(ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.

Bei der Nukleinsäure gemäß (i) kann es sich um eine beliebige der Nukleinsäuren handeln, die fähig ist, für ein HUB1-Polypeptid wie oben definiert zu kodieren oder für ein anderes Protein, das sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignet, zu kodieren.
Die Nukleinsäure kann in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst direkt eingeführt werden (was das Einführen in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen sonstigen Teil einer Pflanze beinhaltet). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure in eine Pflanze vorzugsweise mittels Transformation eingeführt. Der Begriff „Transformation” wird im vorliegenden Text im Abschnitt „Definitionen” genauer beschrieben.
Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können nach alten Verfahren, mit denen der Fachmann vertraut ist, regeneriert werden. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Arbeiten von S.D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder Zellgruppen auf das Vorhandensein von einem oder mehreren Markern, die von den mit dem interessierenden Gen gemeinsam transferierten, in Pflanzen exprimierbaren Genen kodiert werden, selektiert, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial im Allgemeinen Selektionsbedingungen unterworfen, so dass man transformierte Pflanzen von untransfomierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel Samen, die auf die oben beschriebene Art und Weise erhalten wurden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase durch Spritzen einer geeigneten Selektion unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten heranzieht, wobei man ein geeignetes Selektionsmittel verwendet, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ dazu werden die transformierten Pflanzen auf das Vorhandensein eines Selektionsmarkers wie die oben beschriebenen gescreent.
Nach dem DNA-Transfer und der Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse auf das Vorhandensein des interessierenden Gens, die Kopienzahl und/oder die Genomorganisation ausgewertet werden. Alternativ dazu oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA mittels Northern- und/oder Western-Analyse verfolgt werden; beide Techniken sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt.
Die erzeugten transformierten Pflanzen können mit unterschiedlichen Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder durch klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1-Pflanze) geselbstet werden, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanze) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann mit Hilfe von klassischen Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten transformierten Organismen können in verschiedener Form vorliegen. So kann es sich um Chimären von transformierten Zellen und untransformierten Zellen handeln; um klonale Transformanten (z. B. alle Zellen wurden dahingehend transformiert, dass sie die Expressionskassette enthalten); um Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf ein untransformiertes Edelreis gepfropft wurde).
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf jegliche Pflanzenzelle oder Pflanze, die nach einem der im vorliegenden Text beschriebenen Verfahren erzeugt wurde, und auf alle Pflanzenteile und alles Vermehrungsmaterial davon. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Nachkommenschaft einer/eines primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, die/das nach einem der oben genannten Verfahren erzeugt wurde, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass die Nachkommenschaft dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufweist, wie es/sie von dem Elter bei den erfindungsgemäßen Verfahren gezeigt wird/werden.
Die Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäure, die für ein wie oben definiertes HUB1-Polypeptid kodiert oder die für ein anderes Protein, das sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignet, kodiert, enthalten. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Nukleinsäuren oder den Vektor, für die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor sind im Prinzip vorteilhafterweise alle Pflanzen, die fähig sind, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide zu synthetisieren.
Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhaft auf jede beliebige Pflanze anwenden. Zu den Pflanzen, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die zu der Überfamilie Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, darunter Futter- oder Weidepflanzenleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelkulturen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Zu den Kulturpflanzen zählen zum Beispiel Sojabohne, Sonnenblume, Canola-Raps, Luzerne, Raps, Lein, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyle Pflanze. Zu den monokotylen Pflanzen zählt zum Beispiel das Zuckerrohr. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Zu den Getreiden zählen zum Beispiel Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Spelz, Secale, Einkorn, Teff, Milo-Hirse und Hafer.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf erntbare Teile einer Pflanze wie zum Beispiel, jedoch nicht einschränkend, Samen, Früchte, Blüten, wobei diese erntbaren Teile eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid kodiert oder die für ein anderes Protein, das sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignet, kodiert, enthalten. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die von einem erntbaren Teil von solch einer Pflanze abstammen, vorzugsweise direkt abstammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung handelt es sich bei der modulierten Expression um eine erhöhte Expression. Verfahren zum Erhöhen der Expression von Nukleinsäuren oder Genen, oder Genprodukten, sind in der Fachwelt gut beschrieben, und Beispiele finden sich im Abschnitt „Definitionen”.
Wie oben erwähnt besteht ein bevorzugtes Verfahren für Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid kodiert oder die für ein anderes Protein, das sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignet, kodiert, darin, dass man eine Nukleinsäure, die für ein HUB1-Potypeptid kodiert oder die für ein anderes Protein, das sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignet, kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert; die Auswirkungen der Durchführung des Verfahrens, d. h. des Modifizierens von Wachstumseigenschaften, können auch unter Verwendung von anderen gut bekannten Techniken erzielt werden, darunter, jedoch nicht einschränkend, T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologe Rekombination oder Mutagenese. Eine Beschreibung dieser Techniken findet sich im Abschnit „Definitionen”.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuren, die für wie im vorliegenden Text beschriebene HUB1-Polypeptide kodieren oder die für ein anderes Protein, das sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignet, kodieren, und die Verwendung dieser HUB1-Polypeptide oder anderer Proteine, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignen, beim Modifizieren von beliebigen der oben erwähnten Wachstumseigenschaften in Pflanzen.
Nukleinsäuren, die für ein wie im vorliegenden Text beschriebenes HUB1-Polypeptid kodieren oder die für ein anderes Protein, das sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignet, kodieren, bzw. die HUB1-Polypeptide selbst oder ein anderes Protein, das sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignet, können in Zuchtprogrammen eingesetzt werden, in denen ein DNA-Marker, der genetisch mit einem für ein HUB1-Polypeptid kodierenden Gen oder mit einem Gen, das für ein anderes Protein, das sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignet, kodiert, verbunden sein kann, identifiziert wird. Die Nukleinsäuren/Gene bzw. die HUB1-Polypeptide selbst oder die anderen Polypeptide, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, können dazu verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Zuchtprogrammen eingesetzt werden, um Pflanzen zu selektieren, die wie oben in den erfindungsgemäßen Verfahren definierte modifizierte Wachstumseigenschaften aufweisen.
Allelvarianten einer Nukleinsäure/eines Gens, die/das für ein HUB1-Polypeptid kodiert, oder einer Nukleinsäure/eines Gens, die/das für ein anderes Protein, das sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignet, kodiert, können ebenfalls in markergestützten Züchtungsprogrammen Verwendung finden. Für solche Züchtungsprogramme ist es manchmal erforderlich, dass mittels mutagener Behandlung von Pflanzen, zum Beispiel mittels EMS-Mutagenese, eine Allelvariation eingeführt wird; alternativ dazu kann dem Programm eine Kollektion von Alletvarianten so genannten „natürlichen” Ursprungs, die unabsichtlich erzeugt wurden, als Ausgangsmaterial dienen. Anschließend findet die Identifikation von Allelvarianten statt, zum Beispiel mittels PCR. Danach schließt sich ein Schritt für die Selektion von überlegenen Alletvarianten der jeweiligen Sequenz, die einen erhöhten Ertrag geben, an. Typischerweise wird die Selektion dadurch durchgeführt, dass man die Wachstumsleistung von Pflanzen, die unterschiedliche Alletvarianten der jeweiligen Sequenz enthalten, verfolgt. Die Wachstumsleistung kann in einem Gewächshaus oder auf dem Feld verfolgt werden. Zu weiteren optionalen Schritten zählt das Kreuzen von Pflanzen, in denen die überlegene Allelvariante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze. Damit könnte man zum Beispiel eine Kombination von interessanten phänotypischen Merkmalen erzeugen.
Nukleinsäuren, die für HUB1-Polypeptide kodieren oder die für ein anderes Protein, das sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignet, kodieren, können auch als Sonden für die genetische und physikalische Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verbunden sind, eingesetzt werden. Solche Informationen können in der Pflanzenzüchtung nützlich sein, um Linien mit erwünschten Phänotypen zu entwickeln. Für solch eine Verwendung von Nukleinsäuren, die für HUB1-Polypeptide kodieren, oder von Nukleinsäuren, die für ein anderes Protein, das sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignet, kodieren, ist nur eine Nukleinsäureseguenz mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden erforderlich. Die Nukleinsäuren, die für HUB1-Polypeptide kodieren, oder von Nukleinsäuren, die für ein anderes Protein, das sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignet, kodieren, können als Marker für den Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP) verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989), Molecular Cloning, A Laborstory Manual) von pflanzlicher genomischer DNA, mit der ein Restriktionsverdau durchgeführt wunde, können mit den Nukleinsäuren, die für HUB1-Polypeptide kodieren, als Sonde behandelt wenden. Mit den erhaltenen Bandierungsmustern kann man anschließend mit Hilfe von Computerprogrammen wie MapMaker (Lender et al. (1987), Genomics 1: 174–181) genetische Analysen durchführen, um eine Genkarte zu konstruieren. Weiterhin kann man mit den Nukleinsäuren als Sonde Southern-Blots behandeln, die mit Restriktiorisendonuklease behandelte genomische DNAs eines Satzes von Einzelorganismen, die Elter und Nachkommenschaft einer definierten genetischen Kreuzung darstellen, enthalten. Die Aufspaltung der DNA-Polymorphismen wird notiert und für die Berechnung der Position der Nukleinsäure, die für das HUB1-Polypeptid kodiert, in der zuvor unter Verwendung dieser Population erhaltenen Genkarte verwendet (Botstein et al. (1980), Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
Die Herstellung und die Verwendung von Sonden, die von pflanzlichen Genen abstammen, für die Verwendung in der genetischen Kartierung ist bei Bernatzky und Tanksley (1986), Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Die Genkartierung von spezfischen cDNA-Klonen unter Verwendung der oben beschriebenen Methodik bzw. Variationen davon ist in zahlreichen Publikationen beschrieben. So können für die Kartierung zum Beispiel F2-Heterozygotenkreuzungspopulationen, Rückkreuzungspopulationen, Populationen mit zufälliger Paarung, nahezu isogene Linien und andere Sätze von Einzelorganismen verwendet werden. Diese Methodiken sind dem Fachmann gut bekannt.
Die Nukleinsäuresonden können auch für eine physikalische Kartierung verwendet werden (d. h. die Platzierung von Sequenzen auf physikalische Karten; siehe Hoheisel et al. in: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, S. 319–346, und dann genannte Literaturhinweise).
In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden für ein direktes „fluorescence in-situ hybridisation mapping” (FISH) verwendet werden (Trask (1991), Trends Genet. 7: 149–154). Obwohl man bei den derzeitigen FISH-Kartierungsmethoden lieber größere Klone verwendet (mehrere kB bis mehrere Hundert kB; siehe Laan et al. (1995), Genome Res. 5: 13–20), können es Verbesserungen bezüglich der Empfindlichkeit ermöglichen, ein FISH-Mapping mit kürzeren Sonden durchzuführen.
Mit den Nukleinsäuren können verschiedene Verfahren für die genetische und physikalische Kartierung, die auf der Amplifikation von Nukleinsäuren beruhen, durchgeführt werden. Zu Beispielen zählen die alleispezifische Amplfikation (Kazazian (1989), J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), der Polymorphismus von PCR-amplifizierten Fragmenten (CAPS; Sheffield et al. (1993), Genomics 16: 325–332), die allelspezfische Ligation (Landegren et al. (1988), Science 241: 1077–1080), Nukleotidextensionsreaktionen (Sokolov (1990), Nucleic Acid Res. 18: 3671), „Radiation Hybrid Mapping” (Walter et al. (1997), Nat Genet 7: 22–28) und „Happy Mapping” (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Bei diesen Verfahren verwendet man die Sequenz einer Nukleinsäure, um Primer-Paare für die Verwendung in der Amplifikationsreaktion oder in Primer-Extensionsreaktionen zu entwickeln und herzustellen. Die Entwicklung von solchen Primern ist dem Fachmann gut bekannt. Bei Verfahren, bei denen eine Genkartierung auf PCR-Basis verwendet wird, kann es erforderlich sein, Unterschiede bezüglich der DNA-Sequenz zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in der Region, die der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht, zu identifizieren. Dies ist jedoch allgemein für Kartierungsmethoden nicht erforderlich.
Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung führen zu Pflanzen mit modifizierten Wachstumseigenschaften, wie oben beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen wirtschaftlich vorteilhaften Merkmalen, wie weiteren ertragsverbessernden Merkmalen, Toleranz für andere abiotische und biotische Stressfaktoren, Merkmalen, die verschiedene Architekturaspekte und/oder biochemische und/oder physiologische Aspekte modifizieren, kombiniert werden.
Beschreibung der Figuren
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Figuren beschrieben werden, in denen folgendes dargestellt ist:
1 Tafel A zeigt die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, wobei die RING-Domäne fett dargestellt ist; Tafel B zeigt die Mutagenesestrategie für die Erzeugung von HUB1pm: (i) Wildtyp-HUB1-RING-Domäne mit 8 Zinkbindungsresten, wobei X eine beliebige Aminosäure bedeutet. (ii) Mutagenesestrategie bei der HUB1-Gensequenz, wobei zwei Cys-Reste für die Mutagenese zu Ser ausgewählt wurden (kursiv und unterstrichen). (iii) mutagenisierte HUB1-RING-Domäne von HUB1pm mit zwei Serinresten.
2 stellt ein multiples Alignment von HUB1-Proteinen dar. Der N-terminale Teil (600 Aminosäuren) von CAO22034 ist in dem Alignment nicht dargestellt.
3 zeigt einen phylogenetischen Baum von HUB1-Proteinen. Der Baum wurde wie in Beispiel 2 beschrieben konstruiert.
4 zeigt den binären Vektor für die erhöhte Expression einer für HUB1 kodierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Reis-HMGP-Promoters (pHMGP) in Oryza sativa.
5 HUB1-vermittelte Monoubiquitinierug von Histon H2B (HA-Antikörper) und HUB1-Autoubiquitinierungsaktivität (HA-Antikörper).
6 Rosetten von Ler-, hub1-1- und OE-HUB1-Linien unter Kurztag-, Langtag- und Dauerlichtbedingungen nach 21tägigern Wachstum.
7 Chlorophyll-a- und -b-Messungen an in vitro herangezogenen Proben aus Kurztag (KT), Langtag (LT) und Dauerlicht (DL). Die beiden „hub1-1” – und „hubl-1 pale”-Proben wuchsen auf denselben Platten.
8 TEM-Aufnahmen von in KT herangezogenen Ler- und hub1-1-Blättern.
9 Herauspräparierte Hypokotyle von in Kurztag herangezogenen 21-Tage alten Ler-, OE-HUB1- und hub1-1-Pflanzen.
10 Blattflächenmessungen von in vitro herangezogenen Ler-, hub1-1- und OE-HUB1-Keimpflanzen unter Langtagbedingungen.
11 Blattflächenmessungen von in vitro herangezogenen Ler-, hub1-1- und OE-HUB1-Keimpflanzen unter Kurztagbedingungen.
12 Spießartige Strukturen (Pfeil) auf der Unterseite von schmalen hub1-1-Blättern von in vitro herangezogenen KT-Pflanzen.
13 Diagramme von hub1-1- und Wildtyp-Ler-Blüten.
14 organspeziflsche Expressionsmuster von differentiell exprimierten Entwicklungsgenen in HUB1.
15 Keimkraft in HUB1-Linien von Arabidopsis. TNV = Tage nach der Vernalisierung. (n = 30). Bei OE7a und OE17×5 handelt es sich um HUB1-überexprimierende Linien, bei Ler und hub1 (Mutante) um Kontrollen.
16 Epidermiszellengröße im Ler-Wildtyp von Arabidopsis und in OE-HUB1-Linien, dargestellt als log2-transformierte Werte.
17 Schotenflächenmessungen des Ler-Wildtyps von Arabidopsis, der hub1-1-Mutante und von zwei HUB1-Überexpressionslinien.
18 Schoten des Ler-Wildtyps, der hub1-1-Mutante und von HUB1-Überexpressionslinien.
19 Samenflächenmessungen des Ler-Wildtyps, der hub1-1-Mutante und von zwei HUB1-Überexpressionslinien.
20 Samenertrag (Gramm Samen pro Pflanze) des Ler-Wildtyps, der hub1-1-Mutante und von zwei HUB1-Überexpressionslinien.
21 Tafel A zeigt die Auswirkung der Überexpression von HUB1 und HUB1pm in dem Wildtyp(Ler)-Hintergrund auf die Blattbreite; Nr. 1247 stellt eine HUB1-überexprimierende Linie und Nr. 1249 die HUB1pm-überexprimierende Linie dar. Untransformierter Ler diente als Kontrolle. Tafel B zeigt, dass die reife Blattbreite durch Überexprimieren von HUB1pm im Hintergrund der hub1-1-Mutante beeinflusst wird. Nr. 1248 bedeutet eine WT HUB1-überexprimierende Linie in einem hub1-1-Hintergrund, Nr. 1250 bedeutet die HUB1pm-überexprimierende Linie in einem hub1-1-Hintergrund. Untransformierter hub1-1 diente als Kontrolle. Die Nummern 1 bis 11 stellen die beiden Kotylidonen und die Blätter 1 bis 9 der Rosette dar.
22 Phänotypische Charakterisierung der T-DNA-Insertionslinien sl-1 und sl-2 verglichen mit Col-0 und der Mutante hub1-4. A – Aufnahme von ganzen Pflanzen von allen vier Genotypen zur Blütezeit von WT, sl-1 und sl-2 (28 TNS). B – Die Blütezeitanalyse der vier Linien zeigt, dass die hub1-4-Blüten viel froher als die anderen (ebenfalls in A dargestellt) blühen, mit Ausnahme einer sehr geringen Reduktion bei sl-2 Andererseits ist der Trend bei der Anzahl Rosettenblätter zum Blütezeitpunkt bei allen Mutantenlinien unterschiedlich, da eine signifikante Reduktion hierbei bei sl-1, sl-2 und hub1-4 beobachtet wird. C – Die Blattfläche von sl-1 ist bei beinahe allen Blättern stark reduziert, während bei sl-2 die Reduktion wesentlich weniger stark ausgeprägt ist, da nur bei wenigen Blättern die Reduktion als signifikant bezeichnet wurde. Tafel oben: Die schwarzen Säulen sind Col-0, die weißen Säulen sind sl-1; Tafel unten: Die schwarzen Säulen sind Col-0, die grauen Säulen sind sl-2. E – Der Blütenstängeldurchmesser von sl-1 und sl-2 ist verglichen mit Wildtyppflanzen ebenfalls reduziert. Alle Student' s t-Tests wurden auf einem Signifikanzniveau von 5% (p = 0,05) durchgeführt.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele, die lediglich der Erläuterung dienen, beschrieben. Die folgenden Beispiele sollen den Umfang der Erfindung nicht vollständig definieren oder auf andere Weise begrenzen.
DNA-Manipulation: Falls nicht anders erwähnt werden die DNA-Rekombinationstechniken nach den Standardprotokollen durchgeführt, die in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben sind: (Sambrook (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laborstory Press, CSH, New York) oder in Band 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Standardmaterialien und – verfahren für molekularbiologische Arbeiten an Pflanzen sind beschrieben in Plant Molecular Biology Labfax (1993), von R.D.D. Croy, verlegt bei BIOS Scientfic Publications Ltd (UK) und Blackwell Scientific Publications (UK).
Bespiel 1: Identifikation von Sequenzen, die mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder dem Protein gemäß SEQ ID NO: 2 verwandt sind
Unter den Sequenzen in der Entrez Nucleotides Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) werden unter Verwendung von Datenbanksequenzabfragewerkzeugen, wie dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402), (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomische) Sequenzen, die mit der Nukleinsäuresequenz, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, verwandt sind, identifiziert. Das Programm wird dazu verwendet, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen aufzufinden, und zwar dadurch, dass man Nukleinsäure- oder Potypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken vergleicht und die statistische Signfikanz der „Matches” berechnet. Beispielsweise wurde das Polypeptid, das von den in der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuren kodiert wird, für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, und zwar unter Ausschaltung der Default-Einstellungen und des Filters für die Nichtmiteinbeziehung von Sequenzen mit niedriger Komplexität. Der Output der Analyse wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß der Wahrscheinlichkeits-Wertung (E-Wert) gereiht, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmtes Alignment zufallsmäßig vorkommt, widerspiegelt (je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der Hit). Zusätzlich zu den E-Werten werden die Vergleiche auch durch Prozentsatz der Identität gewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Anzahl identischer Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Aminosäure-(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. In manchen Fällen können die Default-Parameter verändert werden, um die Stringenz der Suche zu modfizieren. So kann zum Beispiel der E-Wert erhöht wenden, um Matches mit niedrigerer Stringenz aufzuzeigen. Auf diese Weise können kurze, beinahe exakte Matches identifiziert werden. Tabelle A stellt eine Aufzählung von Nukleinsäuresequenzen, die mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 und dem Protein gemäß SEQ ID NO: 2 verwandt sind, bereit. Tabelle A: Beispiele für HUB1-Polypeptide:
In manchen Fällen können verwandte Sequenzen vorläufig assembliert und von Forschungsinstituten, wie The Institute for Genomic Research (TIGR) der Offentlichkeit bekannt gemacht werden. Um solche verwandten Sequenzen zu identifzieren, kann man sich der Eukaryotic Gene Orthologs (EGO) Datenbank bedienen, und zwar entweder durch Schlagwortsuche oder unter Verwendung des BLAST-Algonithmus mit der interessierenden Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz.
Beispiel 2: Alignment von HUB1-Polypeptidsequenzen
Ein Alignment der Polypeptidsequenzen wird unter Verwendung des ClustalW-2./-Algorithmus des progressiven Alignments (Larkin et al., Bioinformatics 23, 2947–2948, 2007) durchgeführt. Die Default-Werte lauten: gap open penalty 10, gap extension penalty 0,1, und die gewählte „weight matrix” ist Gonnet (wenn die Polypeptide als Alignment vorliegen). Um das Alignment weiter zu optimieren, kann im geringen Ausmaß manuell editiert werden. Eine Sequenzkonservierung unter den HUB1-Polypeptiden liegt im Wesentlichen in der C-terminalen RING-Domäne der Polypeptide vor, während die N-terminale Domäne üblicherweise bezüglich Sequenzlänge und Zusammensetzung stärker variabel ist. Ein Alignment der HUB1-Polypeptide findet sich in 2.
Unter Verwendung eines „Neighbour-Joining”-Clustering-Algorithmus, wie er in dem Programm ClustalW 2.0 bereitgestellt wird, wurde mit dem Alignment ein phylogenetischer Baum von HUB1-Polypeptiden konstruiert (3). in den Figuren sind die Bootstrap-Werte für 1000 Wiederholungen angegeben.
Beispiel 3: Berechnung des Gesamtidentitätsprozentsatzes zwischen HUB1-Polypeptidsequenzen
Die Gesamtprozentsätze für Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängenpolypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, wurden unter Verwendung von einer der in der Fachwelt verfügbaren Techniken, nämlich der MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) Software (BMC Bioinformatics. 2003, 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; die Software wird von Ledion Bitincka gehostet) bestimmt. Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitätsmatrices für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein vorheriges Alignment der Daten erforderlich ist. Das Programm führt eine Reihe von paarweisen Alignments unter Verwendung des globalen Alignment-Algorithmus von Myers und Miller durch (gap opening penalty 12, gap extension penalty 2), berechnet die Ähnlichkeit und Identität unter Verwendung von z. B. Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert dann die Ergebnisse in einer Abstandsmatrix. Die Sequenzähnlichkeit ist in der unteren Hälfte der Trennlinie und die Sequenzidentität in der oberen Hälfte der diagonalen Trennlinie dargestellt.
Bei den in dem Vergleich eingesetzten Parameter handelte es sich um:
Scoring matrix: Blosum62
First Gap: 12
Extending gap: 2
Die Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B1 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen dargestellt. Der Prozentsatz der Identität ist oberhalb der Diagonale und der Prozentsatz der Identität unterhalb der Diagonale dargestellt. Der Prozentsatz der Identität zwischen den HUB1-Polypeptidsequenzen, die sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen, kann verglichen mit SEQ ID NO: 2 (At2g44950) nur 18% Aminosäureidentität betragen; werden jedoch nur die RING-Domänen verglichen, so ist die Identität wesentlich höher (Tabelle B2). Es ist jedoch anzumerken, dass das Hefe-BREI (CAA98640), das funktionelle Ortholog von HUB1 (At2g44950), nur 18,6% Sequenzidentität mit HUB1 aufweist.
Beispiel 4: Identifikation von Domänen innerhalb von HUB1-Polypeptidsequenzen
Bei der Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites (InterPro) Datenbank handelt es sich um eine integrierte Plattform für die häufig verwendeten Signatur-Datenbanken für Suchen auf Text- und Sequenzbasis. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, die unterschiedliche Methodiken und verschiedene Mengen an biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwenden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu den angeschlossenen Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITS, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Pfam ist eine große Sammlung von multiplen Sequenz-Alignments und versteckten Markov-Modellen, wobei viele häufige Proteindomänen und – familien abgedeckt werden. Pfam wird vom Server des Sanger Institute in Großbritannien gehostet. InterPro wird von dem European Bioinformatics Institute in Großbritannien gehostet.

Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenzen gemäß SEQ ID NO: 2 sind in Tabelle C dargestellt. Tabelle C: InterPro-Scan-Ergebnisse (der wichtigsten Eintragsnummem) der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2.

Datenbank	Eintragsnummer	Eintragsbezeichnung	Aminosäurekoordinaten auf SEQ ID NO: 2
InterPro	IPR001093	IMP-Dehydrogenase/GMP-Reduktase
HMMPfam	PF00478.12	IMP-Dehydrogenase/GMP-Reduktase, Domäne T	368–761
InterPro	IPR001841	Zn-Finger, RING
HMMPfam	PF00097.11	Zinkfinger, C3HC4-Typ (RING-Finger)	826–864
HMMSmart	SM00184	keine Beschreibung	826–864
ProfileScan	PS50089	ZF_RING_2	826–865
ScanRegExp	PS00518	ZF_RING_1	841–850
InterPro	IPR009054	Eukaryontische DNA Topoisomerasen I, entbehrliches Insert
Superfamilie	SSF46596	Eukaryontische DNA Topoisomerase I, entbehrliches Insert, Domäne T	598–664
InterPro	IPR011072	Proteinkinase PKN/PRK1, Effektor
Superfamilie	SSF46585	Effektordomäne der Proteinkinase pkn/prk1T	394–477
Superfamilie	SSF57850	RING/U-Box	803–877

Beispiel 5: Topologievorhersage der HUB1-Polypeptidsequenzen
TargetP 1.1 sagt die Lokalisierung von eukaryontischen Proteinen innerhalb der Zelle vorher. Die Lokalisierungszuordnung beruht auf dem vorhergesagten Vorliegen von einer der folgenden N-terminalen Präsequenzen: Chloroplasten-Transitpeptid (cTP), mitochondrial Targeting Peptide (mTP) oder Signalpeptid des sekretorischen Wegs (SP). Die Wertungen, auf denen die schlussendliche Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten und fügen nicht unbedingt etwas zu einer Wahrscheinlichkeit hinzu. Die Lokalisierung mit der höchsten Wertung ist jedoch gemäß TargetP die wahrscheinlichste, und die Beziehung zwischen den Wertungen (die Verlässlichkeitsklasse) kann ein Hinweis dafür sein, wie gewiss die Vorhersage ist. Die Verlässlichkeitsklasse (reliability dass RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage angibt. TargetP wird am Server der technischen Universität Dänemark gehalten.
Bei denjenigen Sequenzen, von denen vorhergesagt wird, dass sie eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann auch eine mögliche Spaltstelle vorhergesagt werden.
Es wurden mehrere Parameter ausgewählt, wie Organismengruppe (Nichtpflanze oder Pflanze), Cutoff-Sätze (keine, vorbestimmter Cutoff-Satz oder vom Benutzer spezifizierter Cutoff-Satz) und Berechnung der Vorhersage von Spaltstellen (ja oder nein).

Die Ergebnisse der TargetP-1.1-Analyse der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 sind in Tabelle D dargestellt. Es wurde die Organismusgruppe „Pflanze” ausgewählt, es wurden keine Cutoffs definiert, und es wurde die vorhergesagte Länge des Transitpeptids angefordert. Die subzelluläre Lokalisierung der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 kann das Cytoplasma oder der Zellkern sein, und es wird kein Transitpeptid vorhergesagt. Lokalisierungsversuche haben gezeigt, dass HUB1 im Zellkern vorliegt (Liu et al., 2007). Tabelle D: TargetP-1.1-Analyse der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2

Länge (AA)	878
Chloroplastentransitpeptid	0,133
Mitochondrientransitpeptid	0,342
Signalpeptid des sekretorischen Wegs	0,017
Sonstiges subzelluläres Targeting	0,635
Vorhergesagte Lage	/
Verlässlichkeitsklasse	4
Vorhergesagte Länge des Transitpeptids	/

Für die Durchführung solcher Analysen können viele andere Algorithmen verwendet
werden, darunter.

• ChloroP 1.1, gehosted am Server der Technischen Universität Dänemark;
• Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, gehostet am Server des Institute for Molecular Bioscience, University of Queenslend, Brisbane, Australien;
• PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, gehostet am Server der University of Alberta, Edmonton, Alberta, Kanada;
• TMHMM, gehostet am Server der Technischen Universität Dänemark;
• PSORT (URL: psort.org)
• PLOC (Park und Kanehisa, Bioinformatics, 19, 1656–1663, 2003).

Beispiel 6: Funkrionalitäts-Assay für das HUB1-Polpeptd
Auf der Grundlage von Sequenzhomologien wunde HUB1 bereits als BRE1-Homolog identifiziert (Hwang et al., 2003; Stone et al., 2005, Fleury et al., 2007). Um die vorgeschlagene Funktion als H2B-monoubiquitinierende E3-Ligase zu bestätigen, wurde eine Reihe von in vitro-Ubiquitinierungsassays mit dem epitopmarkierten rekombinanten HUB1-Protein durchgeführt. Bei solch einem Assay-Typ wird erwartet, dass die funktionelle BRE1-E3-Ligase mit einem Ubiquitinmolekül auf dem Histon H2B ligiert, was zu einer entsprechenden Erhöhung des Molekulargewichts von H2B führt (Zhu et al., Molecular Cell 20, 601–611, 2005).
cDNAs, die für HUB1 und die punktmutierte Form (HUB1pm) kodieren, wurden in rekombinante Expressionsvektoren mit GST- oder His-Epitop-Tags, die eine Aufreinigung mittels Affinitätschromatographie gestatten, kloniert. Das GST-markierte Protein wurde in vielen Fragmenten von E. coli exprimiert und das His-markierte Protein wurde in Einschlusskörpern ausgefällt. Die unlösliche His-markierte Proteinfraktion wurde über eine Dialysereihe mit abnehmenden Harnstoffkonzentrationen aufgereinigt und neugefaltet und in Neufaltungspuffer an NiNTA-Beads (Invitrogen) gebunden. Während der Neufaltung von HUB1 bildete das Protein Komplexe mit hohem Molekulargewicht, was nahelegt, dass es Dimere formt. Dieses Ergebnis zeigt an, dass auch in Pflanzen die HUB1-Aktivität von der Homo- oder Heterodimerisierung, wie sie für menschliche Bre1-Homologe beschrieben worden ist, abhängen kann (Zhu et al., 2005).
Mit den aufgereinigten Proteinen wurden in in vitro (Auto)Ubiquitinierungsassays sowie Histon-H2B-Ubiquitinierungs-Assays wie bei Fleury et al. (2007) beschrieben Selbstubiquitinierungs-Assays durchgeführt. Bei diesem Assay wurde die aufgereinigte HUB1-E3-Ligase mit ubiquitinaktivierenden und -konjugierenden Enzymen (E1 bzw. E2) und Ubiquitin in ATP-haltigem Puffer zusammengegeben und 1 h lang bei 37°C unter Rühren inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Kochen in SDS-Ladepuffer gestoppt und auf 6% SDS-PAGE getrennt und auf Membranen zwecks Hybridisierung mit anti-Histon-H2B oder anti-HA (gegen HA markiertes Ubiquitin)-Antikörpern übertragen. Die Hybridisierungssignale wurden mittels ECL (GE Healthcare)-Reagentien nachgewiesen und auf Autoradiographiefilm (Amersham Hyperfilm ECL, GE Healthcare) sichtbar gemacht. Sowohl die His- als auch die GST-Proteinfraktion waren enzymatisch aktiv und vermittelten in den in vitro-Ubiquitinierungs-Assays die Monoubiquitinierung von Histon H2B (5).
Sowohl HUB1 als auch HUB1pm vermittelten eine Monoubiquitinierung von Histon H2B (17 kDa), die als 10 kDa große H2B-Verschiebung in dem Proteingel-Blot sichtbar wurde (5, HA-Ab unten). Diese 27 kDa große Bande reagierte sowohl mit dem H2B-spezfischen Antikörper als auch mit dem HA-Antikörper, der das HA-markierte Ubiquitin nachwies. Bei Fehlen von E1, E2 oder Ub wurde keine Verschiebung der H2B-Wanderung beobachtet. Ähnliche Ergebnisse wurden bei Ubiquitinierungsreaktionen mit His-markiertem HUB1 erzielt. Zusammengenommen bestätigten diese Daten, dass es sich bei HUB1 um ein funktionelles Homolog der Bre1-Proteine aus dem Menschen und aus Hefe handelt. Interessanterweise hoben die Punktmutationen (HUBpm) in der RING-Domäne nicht die H2B-Monoubiquitinierungsaktivität von HUB1 auf.
In den Histon-H2B-Monoubiquitinierungs-Assays mit Volllängen-HUB1 und der punktmutierten Form wunde eine Autoregulation von HUB1 als Proteinmodifikationen mit hohem Molekulargewicht beobachtet (5, HA-Ab, oben). Diese Modifikationen reagierten mit Ubiquitinantikörper, was nahelegt, dass HUB1 eine Autopolyubiquitinierungsaktivität aufweist. Die Punktmutationen in der RING-Domäne schienen die Autopolyubiquitinierungsaktivität zu reduzieren, was aus den verringerten Mengen dieser Modifikationen in den Western-Blots hervorging (5, HA-Ab, oben). Die gleiche Beladung von GST-HUB1 wird mittels GST-Ab nachgewiesen (5, GST-Ab). Diese Daten bestätigten, dass die RING-Domäne für die Autoubiquitinierungsaktivität erforderlich war.
Beispiel 7: Klonierung der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 für die Reistransformation
Die für HUB1 kodierende Nukleinsäuresequenz, die in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, wurde unter Verwendung einer maßgeschneiderten cDNA-Bibliothek aus Arabidopsis thaliana-Keimlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, GB) als Matrize amplifiziert. Die PCR wurde mittels HiFi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen durchgeführt, wobei 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix eingesetzt wurden. Bei dem verwendeten Primern handelte es sich um prm09774 (SEQ ID NO: 3; sense, Start-Codon fettgedruckt): 5' -ggggacaagtttg tacaaaaaagcaggcttaaacaatggcgagcacaggcg-3' und prm09775 (SEQ ID NO: 4; revers, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcatatgtagatag gtttaatatcattt-3', die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombiniation beinhalten. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde aufgereinigt, und zwar ebenfalls unter Verwendung von Standardmethoden. Anschließend wurde der erste Schritt der Gateway-Vorgehensweise, die Bp-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung – gemäß Gateway-Teminologie – eines „entry clone” pHUB1 rekombiniert. Das Plasmid pDONR201 wurde käuflich von Invitrogen als Bestandteil der Gateway^® Technik erworben.
Der „entry clone” umfassend SEQ ID NO: 1 wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor für die Transformation von Oryza sativa eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionale Elemente innerhalb der T-DNA-Borders Folgendes: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine Expressionskassette für einen Screening-Marker, sowie eine Gateway-Kassette für die LR-in-vivo-Rekombination, wobei die interessierende Nukleinsäureseguenz bereits in den „entry klone” kloniert war. Ein Reis-HMGP-Promoter (SEQ ID NO: 6) für die konstitutive Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pHMGP::HUB1 ( ) nach fachbekannten Techniken in den Agrobactenum-Stamm LBA4404 transformiert.
Auf ähnliche Art und Weise können andere in der vorliegenden Erfindung beschriebene Gene unter Verwendung von Primern umfassend AttP-Stellen für die Gateway-Rekombination kloniert werden. Dem Fachmann ist bekannt, wie solche Primer entwickelt werden können.
Bespiel 8: Pflanzentransformation
Reistransformation
Mit dem Agrobakterium, das den Expressionsvektor enthielt, wurden Oryza-sativa-Pflanzen transformiert. Reife trockene Samen der japonica-Reissorte Nipponbare wurden entspelzt. Die Sterilisation erfolgte durch einminütiges Inkubieren in 70%igem Ethanol und anschließend 30 Minuten in 0,2% HgCl₂, wonach 6 mal je 15 Minuten mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen wurde. Anschließend wurden die sterilen Samen auf einem Medium, das 2,4-D enthielt (Kallusinduktionsmedium) keimen gelassen. Nach vierwöchigem Inkubieren im Dunkeln wurden embryogene, vom Scutellum stammende Kalli herauspräpariert und auf demselben Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Kalli vervielfacht oder vermehrt, und zwar durch Subkultur auf demselben Medium für weitere 2 Wochen. Embryogene Kallusstückchen wunden auf frischem Medium 3 Tage vor der Cokultivierung subkultiviert (um die Zellteilungsaktivität zu fördern).
Für die Cokultivierung verwendete man den Agrobacterium-Stamm LBA4404, der den Expressionsvektor enthielt. Agrobaderium wurde auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika inokuliert und 3 Tage bei 28°C kultiviert. Anschließend wurden die Bakterien gewonnen und bis zum Erreichen einer Dichte (OD₆₀₀) von ungefähr 1 in flüssigere Cakultivierungsmedium suspendiert. Anschließend wurde die Suspension in eine Petrischale gegeben und die Kalli wurden 15 Minuten in der Suspension eingetaucht. Dann wurden die Kallusgewebe auf einem Papierfilter trocken getupft und auf ein verfestigtes Cokuttivierungsmedium umgesetzt und 3 Tage im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Die cokultivierten Kalli wurden 4 Wochen im Dunkeln bei 28°C auf 2,4-D-haltigem Medium in Gegenwart eines Selektionsmittels herangezogen. Während dieses Zeitraums entwickelten sich rasch wachsende resistente Kallusinseln. Nach dem Umsetzen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation in Licht wurde das embryogene Potential freigesetzt, und in den nächsten vier bis fünf Wochen entwickelten sich Sprosse. Die Sprosse wurden aus den Kalli herauspräpariert und 2 bis 3 Wochen lang auf auxinhaltigem Medium inkubiert, von dem sie in Ende umgesetzt wurden. Abgehärtete Sprosse wurden im Gewächshaus unter hoher Feuchtigkeit und im Kurztag herangezogen.
Pro Konstrukt wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Überprüfung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wunden nur transgene Ein-Kopien-Pflanzen mit Toleranz für die Selektionsmittel zurückbehalten, um T1-Samen zu ernten. Die Samen wurden dann drei bis fünf Monate nach dem Umsetzen geerntet. Das Verfahren ergab Ein-Locus-Transformanten mit einer Rate von aber 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).
Maistransformation
Die Transformation von Mais (Zea mays) erfolgt unter Abwandlung der von Ishida et al. (1996), Nature Biotech. 14(6): 745–50 beschriebenen Methode. Die Transformation beim Mais ist genotypabhängig, und nur bestimmte Genotypen eignen sich für die Transformation und Regeneration. Gute Herkünfte von Donormaterial für die Transformation sind die Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als Elter, es können jedoch auch andere Genotypen erfolgreich verwendet werden. Ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (TNB), wenn die Länge des unreifen Embryos ungefähr 1 bis 1,2 mm beträgt, werden die Kolben von den Maispflanzen geerntet. Die unreifen Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, das den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Die herauspräparierten Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium und anschließend Maisregenerationsmedium, das das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, es können jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden), herangezogen. Die Petrischalen wenden 2 bis 3 Wochen lang, oder bis sich Sprosse entwickeln, in Licht bei 25°C inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Maisbewurzelungsmedium umgesetzt und 2 bis 3 Wochen lang, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Weizentransformation
Die Transformation von Weizen erfolgt mit der von Ishida et al. (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50 beschriebenen Methode. Die Sorte Bobwhite (von CIMMYT, Mexiko, erhältlich) wird häufig für Transformationszwecke verwendet. Die unreifen Embryonen werden mit Agrobacterium tumefacens, das den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen wenden mittels Organogenese gewonnen. Nach Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Kallusinduktionsmedium und anschließend Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, es können jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden), herangezogen. Die Petrischalen werden 2 bis 3 Wochen lang, oder bis sich Sprosse entwickeln, in Licht bei 25°C inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Bewurzelungsmedium umgesetzt und 2 bis 3 Wochen lang, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt T1-Samen wenden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Sojabohnentransformation
Die Transformation von Sojabohne erfolgt unter Abwandlung der in dem Texas A&M Patent US 5,164,310 beschriebenen Methode. Für die Transformation nach dieser Methode eignen sich mehrere im Handel erhältliche Sojabohnensorten. Die Sorte Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) wird häufig für Transformationszwecke verwendet. Sojabohnensamen werden sterilisiert, um in vitro ausgesät zu werden. Hypokotyl, Keimwurzel und ein Keimblatt von sieben Tage alten Jungkeimpflanzen werden herauspräpariert. Das Epikotyl und das verbleibende Keimblatt werden weiter herangezogen, um Achselnodien zu entwickeln. Diese Achselnodien werden herauspräpariert und mit Agrobacterium tumefaciens, das den Expressionsvektor enthält, inkubiert Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und in Selektionsmedium umgesetzt Regenerierte Sprosse werden herauspräpariert und auf Sprosselongationsmedium gesetzt. Sprosse mit einer Länge von nicht mehr als 1 cm werden auf Bewurzelungsmedium gesetzt, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Raps/Canola-Transformation
Als Explantate für die Gewebekultur werden Keimblattpetiolen und Hypokotyle von 5–6 Tage alten Jungkeimpflanzen verwendet und nach dem Verfahren von Babic et al. (1998, Plant Cell Rep. 17: 183–188) transformiert. Die im Handel erhältliche Sorte Westar (Agriculture Canada) ist die für Transformationszwecke verwendete Standardsorte, es können jedoch auch andere Sorten verwendet werden. Die Canola-Samen werden oberflächensterilisiert, um in vitro ausgesät zu werden. Die Keimblattpetiolenexplantate mit dem daran haftenden Keimblatt werden aus den in vitro-Keimpflanzen herauspräpariert und dadurch mit Agrobacterium (das den Expressionsvektor enthält) inokuliert, dass man das Schnittende des Petiolenexplantats in die Bakteriensuspension eintaucht. Die Explantate werden anschließend bei 23°C und 16 Stunden Licht 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium mit 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar kultiviert. Nach zweitägiger Cokultur mit Agrobacterium werden die Petiolenexplantate 7 Tage lang auf MSBAP-3-Medium mit 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) umgesetzt und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration kultiviert. Sobald die Sprosse 5–10 mm lang sind, werden sie abgeschnitten und auf Sprosselongationsmedium (MSBAP-0.5, mit 0,5 mg/l BAP) umgesetzt. Sprosse mit einer Länge von ungefähr 2 cm werden zur Induktion von Wurzeln auf Bewurzelungsmedium (MS0) umgesetzt. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen wenden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Luzemetransformation
Ein regenerierender Klon von Luzerne (Medicago sativa) wird nach dem Verfahren von (McKersie et al. 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Luzerne ist genotypabhängig und es ist daher eine regenerierende Pflanze erforderlich. Verfahren zur Gewinnung von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Diese können zum Beispiel wie von Brown DCW und A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben aus der Sorte Rangelander (Agriculture Canada) oder einer beliebigen sonstigen im Handel erhältlichen Luzemesorte selektiert werden. Alternativ dazu wurde die Sorte RA3 (University of Wisconsin) für die Verwendung in der Gewebekultur selektiert (Welker et al. 1978, Am. J. Bot. 65: 654–659). Es werden Petiolenexplantate mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al. 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) oder LBA4404, die den Expressionsvektor enthält, cokultiviert. Die Explantate werden 3 Tage im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium mit 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K₂SO₄ und 100 μ m Acetosyringinon cokultiviert. Die Explantate werden mit halbkonzentriertem Murashige-Skoog-Medium (Murashige und Skoog, 1962) gewaschen und auf dasselbe SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon, jedoch mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum für die Hemmung des Agrobacterium-Wachstums ausplattiert. Nach mehreren Wochen werden die somatischen Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium ohne Wachstumsregulatoren ohne Antibiotika, jedoch mit 50 g/l Saccharose umgesetzt. Somatische Embryonen keimten anschließend auf halbkonzentriertem Murashige-Skoog-Medium aus. Bewurzelte Keimlingspflanzen wurden in Töpfe umgesetzt und im Gewächshaus herangezogen. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Baumwolltransformation
Baumwolle wird unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens nach dem in US 5,159,135 beschriebenen Verfahren transformiert. Baumwollsamen werden in 3%iger Natriumhypochloritlösung 20 Minuten lang oberflächensterilisiert und in destilliertem Wasser mit 500 μg/ml Cefotaxim gewaschen. Die Samen werden dann zur Keimung auf SH-Medium mit 50 μg/ml Benomyl umgesetzt. Die Hypokotyle von 4 bis 6 Tage alten Keimlingspflanzen werden entfernt, in 0,5 cm große Stücke geschnitten und auf 0,8%igen Agar gesetzt. Zum Inokulieren der Hypokotylexplantate verwendet man eine Agrobacterium-Suspension (ungefähr 10⁸ Zellen pro ml, Verdünnung einer mit dem interessierenden Gen und geeigneten Selektionsmarkern transformierten Übernachtkultur). Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur und Raumlicht werden die Gewebe auf ein festes Medium (1,6 g/l Gelrite) mit Murashige-Skoog-Salzen mit B5-Vitaminen (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50: 151–158 (1968)), 0,1 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l 6-Furfurylaminopurin und 750 μg/ml MgCl₂ sowie mit 50 bis 100 μg/ml Cefotaxim und 400–500 μg/ml Carbenicillin zum Abtöten von verbleibenden Bakterien umgesetzt. Einzelne Zelllinien werden nach zwei bis drei Monaten isoliert (wobei alle vier bis sechs Wochen subkultiviert wird) und auf selektivem Medium für die Gewebevermehrung weiter kultiviert (30°C, 16-h-Photoperiode). Transformierte Gewebe werden anschließend 2 bis 3 Monate lang auf nichtselektivem Medium weiterkultiviert, wodurch man zu somatischen Embryos gelangt. Gesund aussehende Embryos mit einer Länge von mindestens 4 mm werden in Röhrchen mit SH-Medium in feinem Vermiculit mit einem Zusatz von 0,1 mg/l Indolessigsäure, 6-Furfurylaminopurin und Gibberellinsäure umgesetzt. Die Embryos werden bei 30°C mit einer Photoperiode von 16 h kultiviert und Pflänzchen im 2- bis 3-Blattstadium werden in Töpfe mit Vermiculit und Nährstoffen umgesetzt. Die Pflanzen werden abgehärtet und anschließend für die weitere Anzucht in das Gewächshaus umgesetzt.
Bespiel 9: Vorgehen bei der phänotypischen Auswertung von Reis, der mit SEQ ID NO: 1 transformiert wurde
9.1 Aufbau der Auswertung
Es wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgestellt. Sechs Events, von denen die T1-Nachkommenschaft im Verhältnis 3:1 für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens aufspaltete, wurden behalten. Für jedes dieser Events wurden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthielten (Hetero- und Homozygoten) und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlte (Nullizygoten) durch Beobachten der visuellen Markerexpression selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Die Gewächshausbedingungen waren Kurztage (12 Stunden Licht), 28°C im Licht und 22°C in der Dunkelheit, und eine relative Feuchtigkeit von 70%. Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen herangezogen wunden, wurden in regelmäßigen Abständen gegossen, um sicherzustellen, dass Wasser und Nährstoffe nicht begrenzend waren, um die Erfordernisse der Pflanzen für eine Vervollständigung von Wachstum und Entwicklung abzudecken.
Vier T1-Events wurden in der T2-Generation gemäß demselben Auswertungsverfahren wie bei der T1-Generation, jedoch mit mehr Einzelpflanzen pro Event, weiter ausgewertet. Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze von mindestens 6 unterschiedlichen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixels, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
Screening unter Dürrebedingungen
Pflanzen von T2-Samen werden unter Normalbedingungen in Blumenerde herangezogen, bis sie das Stadium des Rispenschiebens erreichen. Anschließend wenden sie in ein „trockenes” Areal gestellt, wo keine Bewässerung erfolgt. Um den Bodenwassergehalt (BWG) zu verfolgen, werden Feuchtigkeitssonden in zufallsmäßig ausgewählte Töpfe eingeführt. Sinkt der BWG unter gewisse Schwellenwerte, so werden die Pflanzen automatisch erneut gegossen, bis wiederum ein Normalgehalt erreicht wird. Dann werden die Pflanzen wiederum in Normalbedingungen umgestellt. Ansonsten wird wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen kultiviert (Pflanzenabreife, Samenernte). Wachstums- und Ertragsparameter werden wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben aufgezeichnet.
Screening auf Stickstoffverwertungseffizienz
Reispflanzen von T2-Samen wenden in Blumenerde unter Normalbedingungen mit Ausnahme der Nährlösung herangezogen. Die Töpfe werden vom Umsetzen bis zur Abreife mit einer speziellen Nährlösung mit verringertem N-Stickstoff-Gehalt (N), üblicherweise zwischen 7 bis 8 mal weniger, gegossen. Ansonsten wird wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen kultiviert (Pflanzenabreife, Samenernte). Wachstums- und Ertragsparameter wenden wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben aufgezeichnet.
Salzstress-Screening
Die Pflanzen werden auf einem Substrat aus Kokosfasern und Argex (Verhältnis 3 zu 1) herangezogen. Während der ersten zwei Wochen nach dem Umsetzen der Pflänzchen in das Gewächshaus wird eine normale Nährlösung verwendet. Nach den ersten zwei Wochen wird die Nährlösung mit 25 mM Salz (NaCl) versetzt, bis die Pflanzen geerntet werden. Anschließend werden die Wachsstums- und Ertragsparameter bestimmt.
9.2 Statistische Analyse: F-Test
Als statistisches Modell für die Gesamtauswertung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanze wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Mit allen Parameter, die bei allen Pflanzen von allen Events, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert wurden, bestimmt wurden, wurde ein F-Test durchgeführt. Der F-Test erfolgte als Überprüfung auf einen Effekt des Gens über alle Transformations-Events und zur Feststellung eines Gesamteffekts des Gens, auch unter der Bezeichnung globaler Geneffekt bekannt. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wunde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter F-Test-Wert weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die Unterschiede im Phänotyp verursacht.
Da zwei Versuche mit überlappenden Events durchgeführt wurden, erfolgte eine kombinierte Analyse. Hierdurch lässt sich die Übereinstimmung der Auswirkungen über die zwei Versuche hinweg überprüfen, und, wenn dies der Fall ist, können die Werte der beiden Versuche gepoolt werden, um die Verlässlichkeit der Schlussfolgerung zu erhöhen. Bei dem eingesetzten Verfahren handelt es sich um einen Mixed-Model-Ansatz, der die Multilevel-Struktur der Daten (d. h. Versuch – Event – Segreganten) berücksichtigt. Durch Vergleichen des Likelihood-Quotienten-Tests mit Chi-Quadrat-Verteilungen erhält man p-Werte.
9.3 Messparameter
Biomasseparameter-Messung
Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze von mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen. Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse) wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl Pixel der Digitalbilder der vom Hintergrund unterschiedlichen oberirdischen Pflanzenteile zählte. Von diesem Wert wunde über die am selben Zeitpunkt von den unterschiedlichen Winkeln aus aufgenommenen Bilder ein Durchschnitt berechnet und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandett. Versuche zeigen, dass die auf diese Weise bestimmte oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert.
Die oberirdische Fläche ist diejenige Fläche, die zu dem Zeitpunkt, an dem die Pflanzen ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatten, bestimmt wurde. Die Jungpflanzenvitalität ist die oberirdische Fläche der Pflanzen (Keimpflanzen) drei Wochen nach der Keimung. Die Erhöhung der Wurzelbiomasse wird als Erhöhung der Gesamtwurzelbiomasse (gemessen als maximale Wurzelbiomasse, die während der Lebensdauer einer Pflanze beobachtet wurde) oder als Erhöhung des Wurzel/Spross-Index (gemessen als Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse im Zeitraum des aktiven Wachstums von Wurzel und Spross) ausgedrückt.
Die Jungpflanzenvitalität wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl Pixel der vom Hintergrund unterschiedlichen oberirdischen Pflanzenteile zählte. Von diesem Wert wurde über die am selben Zeitpunkt von den unterschiedlichen Winkeln aus aufgenommenen Bilder ein Durchschnitt berechnet und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Die Ergebnisse beziehen sich auf Pflanzen drei Wochen nach der Keimung. Die Keimkraft wird als die Anzahl gekeimter Samen ein, zwei oder drei Wochen nach dem Aussäen, bezogen auf Kontrollpflanzen, gemessen.
Samenparameter-Messungen
Die reifen Primärrispen wunden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann wurden die Rispen gedroschen, und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Die leeren Spelzen wurden verworfen, und die restliche Fraktion wurde nochmals gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl gefüllter Samen wurde dadurch bestimmt, dass man die Anzahl der gefüllten Spelzen, die nach dem Abtrennungsschritt verblieben, auszählte. Der Gesamtsamenertrag wurde dadurch bestimmt, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wog. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde dadurch bestimmt, dass man die von einer Pflanze geerntete Anzahl Spelzen auszählte. Das Tausendkorngewicht (TKG) wird aufgrund der Anzahl der gezählten gefüllten Samen, und ihrem Gesamtgewicht berechnet. Der Harvest Index (HI) wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm²), multipliziert mit einem Faktor 106, definiert. Bei der wie in der vorliegenden Erfindung definierten Gesamtanzahl an Blüten pro Rispe handelt es sich um das Verhältnis der Gesamtanzahl an Samen zur Anzahl reifer Primärrispen. Die Samenfüllungsrate, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist das Verhältnis (ausgedrückt als Prozentsatz) der Anzahl der gefüllten Samen zu der Gesamtsamenzahl (oder Gesamtblütenzahl).
Beispiel 10: Ergebnisse der phänotypischen Auswertung der trensgenen Reispflanzen

Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, die eine HUB1-Nukleinsäure unter Nichtstressbedingungen exprimieren, sind in Tabelle E unten dargestellt. Eine Steigerung von mehr als 5% wurde für die Auflaufvitalität (Jungpflanzenvitalität), das Samengesamtgewicht (Gesamtsamenertrag), Anzahl gefüllter Samen und Gesamtsamenanzahl beobachtet. Tabelle E: Verbesserte Wachstumsparameter in transgenem Reis, der HUB1 unter der Kontrolle eines mittelstarken Promoters (HMGP) exprimiert:

Parameter	% Anstieg in der Ti-Generation	% Anstieg in der T2-Generation	p-Wert der kombinierten Analyse
Auflaufvitalität	18,9	35,8	0,007
Samengesamtgewicht	21,6	24,6	0,006
Anzahl gefüllter Samen	20,6	24,6	0,006
Gesamtsamenanzahl	13,8	22,7	0,021

Werden die transgenen Reispflanzen, die HUB1 exprimieren, unter Stressbedingungen herangezogen, so weisen sie verglichen mit Kontrollpflanzen einen Anstieg bei einem oder mehreren der folgenden Parameter auf: oberirdische Fläche (bzw. Blattbiomasse), Jungpflanzenvitalität, Keimkraft, Wurzelbiomasse, Samengesamtanzahl, Anzahl gefüllter Samen, Samengesamtertrag (Samengesamtgewicht), Tausendkorngewicht, Harvest Index, Anzahl Blüten pro Rispe.
Beispiel 11. Vergleich der Prommoteraktivität in Reis

Reispflanzen wurden mit dem GUS-Gen unter der Kontrolle des CaMV35S-Promoters, des Reis-GOS2-Promoters oder des Reis-HMGP-Promoters transformiert. Die Pflanzentransformation erfolgte wie oben beschrieben, und es wunden sechs Ein-Kopien-Events (oder Wenig-Kopien-Events) pro Konstrukt ausgewählt. Es wurden sechzig T1-Samen pro Event ausgesät, und transgene Keimpflanzen wurden mittels visueller Markerselektion identifiziert. Die Integrität des Transgens wunde weiter mittels qPCR am Terminator bestätigt. Pro Event wurden individuell von neun 1 Woche alten Pflanzen Proben des Keimblatts, des Stängels und der Wurzel gezogen (destruktive Probenahme). Weitere neun transgene Pflanzen pro Event wurden im Gewächshaus bis zum Ernten der T2-Samen für eine Probenahme in einem späteren Stadium herangezogen. Zu den Proben zählten 6 Wochen alte Blätter, junge Influoreszenzen (1–2 Tage vor der Blüte) sowie reife T2-Samen. Zwei Events von 35S-GUS-transgenem Reis wunden ausgesät, und es wurden davon Proben entnommen und parallel mit den Linien mit dem GOS2-Promoter und dem HMGP-Promoter als Referenz und als Kontrolle analysiert. Die Promoteraktivitäten wurden mittels eines standardmäßigen quantitativen GUS-Assays bestimmt, und die Ergebnisse sind in Tabelle F dargestellt. Tabelle F: Übersicht über die Promoteraktivität gemäß quantitativem GUS-Assay. Die Bonitur erfolgte auf Grundlage des Mittelwerts von jedem Konstrukt (6 Events, 54 Proben). 1W: eine Woche alte Keimpflanzen; 6W: sechs Wochen alte Pflanzen. Das Bonitursystem entspricht der GUS-Aktivität (U/mg löslichem Gesamtprotein), und zwar folgendermaßen: -: < 1; +: 1–10; ++: 10–100; +++: 100–1000; ++++: > 1000.

Promoter	Spezifität	1W-Blatt	1W-Wurzel	1W-Stängel	6W-Blatt	Infloreszenz	T2-Samen
PRO0170	konstitutiv	++	+	+	+	+	+
PRO0129	konstitutiv	++	++	++	++	+++	++
PRO35S	konstitutiv	++++	+++	++	+++	+++	++

Beispiel 12: Arabidopsis-Pflanzenmaterial, Gentechnik und Wachstumsbedingungen Samen von Arabidopsis thaliana Ler wurden vom Nottingham Arabidopsis Stock Centre bezogen. Die hub1-1-Mutante wurde zuvor unter der Bezeichnung ang4-1 beschrieben (Berna' et al., 1999). Im Allgemeinen wurden die Pflanzen in vitro auf Keimungsmedium herangezogen (Valvekens et al., 1988). Für Wurzelwachstumsversuche wurde eine Einzelreihe von fünf Pflanzen in viereckigen Platten (BD Falcon) senkrecht in Keimungsmedium, das 10 g/l Pflanzengewebekulturagar (Lab M) enthielt, ausgesät. Die Wachstumskammerbedingungen waren eine 16-h-Licht/8-h-Dunkel-Photoperiode mit Weißlicht (Cool-White Neonröhren; Radium Lampenwerke), 100 μEM^–2 h^–1 photosynthetisch aktive Strahlung, und 20°C. Die Pflanzen wurden in einer Mischung aus Erde:Vermiculit (3:1; v/v) unter Gewächshausbedingungen mit einer Einstellungstemperatur zwischen 21 und 30°C, einer relativen Feuchtigkeit von 50 bis 60% und einer Strahlungsintensität (natürliches Licht und Fluoreszenzlampen) zwischen 100 und 120 μE M^–2 h^–1 photosynthetisch aktiver Strahlung in einem 16-h-Licht/8-h-Dunkel-Rhythmus herangezogen.
Um HUB1-Überexpressionslinien (OE-HUB1) zu erhalten, wurde das offene Leseraster (einschließlich ATG- und Stopp-Codon) von HUB1 (2637 bp) mittels Pfu-Polymerase amplifrziert und mit Hilfe der GATEWAY-Rekombinationsstrategie (Invitrogen) in den Vektor pDONRT221 kloniert, wodurch man zu ENTRY-Klonen gelangte. Der ENTRY-Klon wurde mit dem Vektor pK7WG2 (Karimi et al., Trends Plant Sci. 7, 193–195, 2002) rekombiniert, wodurch man einen DESTINATION-Vektor mit dem ORF unter der Kontrolle eines 35S-Promoters erhielt. Dieses Konstrukt wurde in Agrobacterium tumefaciens eingeführt, und Ler-Pflanzen wurden anschließend mit der Agrobacterium-tumefaciens-Suspension mittels floral dip” transformiert Die T0-Samen wurden in hoher Dichte auf Wachstumsmedium, das Kanamycin (50 μg/ml), Nystatin (50 μg/ml) und Carbenicilin (250 μg/ml) enthielt, herangezogen, um die Transformanten zu selektieren. Diese T1-Transformanten wurden in Erde umgesetzt, um zu T2-Samen zu gelangen.
Der Ler-Wildtyp, die hub1-1-Mutante und OE-HUB1-Samen wurden sterilisiert und auf MS-Medien mit 1% Agar ausplattiert. Nach Vernalisation über 2 Nächte im Dunklen bei 4°C wurden die Platten in Wachstumskammern mit 21°C mit einer relativen Feuchtigkeit von 50–60%, PAR 100–120 μE/m²/h und einem 16/8-Stunden dauernden Tag/Nacht-Rhythmus gestellt (Langtag (LT)-Wachstumsbedingungen). Die Kurztag(KT)-Wachstumsbedingungen umfassten einen 8/16-Stunden dauernden Tag/Nacht-Rhythmus.
Belspiel 13: Analysie der Ambidopsis-Pflanzen
Die Blattspreitenlänge, -breite und – fläche der hub1-1-Mutante, der HUB1-Überexpressionslinie und des Ler-Wildtyps wurden im Verlauf von drei Wochen nach dem Aussäen gemessen. Während dieser Zeit wurden Proben aus dem ersten und dem zweiten Juvenilblatt dadurch gezogen, dass man das Chlorophyll über Nacht in 70%igem Ethanol extrahierte. Die Extraktionsproben wurden dann zwecks Konservierung in 100% Milchsäure übertragen. Die extrahierten Blätter wurden auf einem Objektträger fixiert und mit einer Axiom-Videokamera (ZEISS, USA), die auf einem Mikroskop des Typs Bino-Leica montiert war, fotografiert, und die Messung der Blattspreitenlänge, -breite und – fläche erfolgte mit dem Software-Programm ImageJ 1.34. Für die statistische Analyse erfolgte ein paarweiser Vergleich der Daten mit einem Online-Statistikprogramm (Uitenbroek, D. G, Binomial. SISA. 1997. www.quantitativeskills.com/sisa/distributions/binomial.htm).
Bestimmung der Blütezeit: der Beginn des Streckungswachstums wurde visuell beobachtet und wird in Tagen nach der Vernalisierung ausgedrückt.
Für die Bestimmung der Fotosynthesepigmente wunden Blattproben zu 50 mg von 25 Tage alten in vitro herangezogenen Keimpflanzen gezogen. Die Proben wurden in 2 ml kaltes 80%iges Aceton eingetaucht und mit Glasperlen gemahlen. Die Proben wurden zentrifugiert (5 min bei 4°C) und der Überstand wurde in frische Röhrchen übergeführt und mit 80%igem Aceton auf 5 ml aufgefüllt. Die Pigmente wurden über Nacht bei –20°C extrahiert, zentrifugiert und in einem Spektralfotometer in Plastikküvetten bei 3 Wellenlängen analysiert (bei 663, 646 und 470 nm).
Der Chlorophyll-a-Gehalt wurde folgendermaßen berechnet (12,21*A663)-(2,81*A646),
der Chlorophyll-b-Gehalt folgendermaßen: (20,31*A646)-(5,03*A663),
und der Gesamtcarotinoidgehalt folgendermaßen: (1000*A470)-(1,82*chl a)-(85,02*chl b).
Der Pigmentgehalt wurde jeweils pro 50 mg Frischgewicht berechnet. Der Versuch wurde zweimal wiederholt, und jede Probe wurde dreifach analysiert.
Microarray-Analyse:
Sprossapices von Keimpflanzen der drei Linien wurden im Entwicklungsstadium 1.02 geerntet, und die Gesamt-RNA wurde mittels RNeasy (Qiagen) wie im Handbuch beschrieben extrahiert. Die Proben wurden auf Agilent-Arrays hybridisiert und die Daten wurden normalisiert. Alle Analysen erfolgten auf dem Logarithmus zur Basis 2 der Vordergrundfluoreszenzintensitätsmessungen. Die Expressionsdaten wurden in zwei Schritten analysiert: 1) einer Analyse „innerhalb des Objektträgers”, die darauf abzielte, die mit unterschiedlichen Farbstoffreaktionen auf die Bindung assoziierte Variation als Hintergrund zu entfernen; und 2) einer Analyse „zwischen den Objektträgern”, die darauf abzielte, die mittleren Unterschiede zwischen den Genotypen und ihren Standardfehler zu schätzen. Für die Analyse innerhalb des Objektträgers wurde ein räumlich-lineares fixes Modell der Form Response = μ + Spline(intensität) + Residuen (1) angewandt, wobei die Response-Variable das log₂-Verhältnis der an den 37971 Genspots gemessenen Vordergnundfluoreszenzintensitäten (M) ist. Innerhalb des Modells (1) entsprach dem Farbstoff-Biss eine kubische Smoothing Spline Kurve (Spline(intensität)), wie dies in der GenStat-Auswahlfunktion für die Analyse von Microarray-Daten implementiert wird. Sobald die berichtigten log₂-Verhältnisse (M) für jedes Gen erhalten wurden, wurden die berichtigten log₂R- und log₂T-Signalintensitäten berechnet. Für die Analyse zwischen den Objektträgern wurde ein zweischrittige Mixed-Model-Varianzanalyse verwendet und mit GenStat durchgeführt. Mit jeder der 24 Hybridisierungsproben wurde ein lineares Normalisierungsmodell der folgenden Form durchgeführt: (die Gesamtresiduen sind unterstrichen): Response = μ + Array + Residuen (2), wobei die Response-Variable die korrigierten log2-transformierten Cy3- und Cy5-Fluoreszenzintensitätsmessungen der 37971 genspezifischen Tags bedeuten. Array-Modelling der Hybridisierungseffekte von jedem der 12 Mikroarrays wurden als Gesamtresiduen hinzugefügt Im letzten Schritt wurde das Verhältnis der exprimierten Gene, bei denen ein signifikanter Anteil der Variation auf genotypische Unterschiede zurückgeführt werden kann ist, d. h. genetisch ist, geschätzt. Die Residuen des Modells (2) wurden für jedes der 37971 Gene separat mittels eines Mixed-Model der folgenden Form analysiert: Residuen = μ + Farbstoff + Wiederholung + Genotyp_ij + Array + Fehler (3), wodurch die genspezifische Variation in genspezifische fixe Farbstoffeffekte (Cy3 und Cy5), Wiederholungseffekte (A und B) und Genotypeffekte sowie zufallsmäßige Spot-Effekte zerlegt wurde. Der Genotypeffekt, Genotyp_ij, bezieht sich auf die 3 Genotypen Ler, hub1-1, OE-HUB1. Der Array-Terrn modelliert die Effekte für jeden Spot und entspricht dem Wechselwirkungseffekt (Gen.Array). Es wurde angenommen, dass die zufallsmäßigen Effekte in dem Modell unabhängig und mit einem Mittel von null und einer Varianz von σ 2 / i normal verteilt waren, wobei t = A (Array) und E (Fehler).
Das lineare Mixed-Model (3) wurde angepasst und als Maß für die Variabilität der Expressionsniveaus zwischen den vier Genotypen wurden Wald-Schätzwerte berechnet und jedem der sechs paarweise Vergleichen zwischen den Genotypen wurde eine Signifikanz zugeordnet. Die „False Discovery Rates” (FDRs) wurden anschließend mittels Modelling der berichtigten P-Werte als 2-Komponenten-Mischung der Uniform- und Beta-Dichten geschätzt, wie dies in GenStat implementiert wird; mit den Default-Parametereinstellungen wurde π₀, der Anteil der Merkmale, die wirklich null waren, geschätzt. Schließlich wurde eine zweifache Veränderung des Genotypexpressionsunterschieds auferlegt, um Gene, von denen wahrscheinlich ist, dass sie einen statistisch und biologisch signifikanten Unterschied bei der Genotypexpression aufweisen, weiter herauszufiltern. Mit den Daten wurde eine BinGo-Analyse durchgeführt, um die überrepräsentierten und die unterrepräsentierten biologischen Vorgänge, die bei den unterschiedlichen HUB1-Linien mit falscher Expression betroffen sind, zu identifizieren (Maere et al., Bioinformatics 21, 3448–3449, 2005).
Beispiel 14: Die Überexpression von HUB1 unter der Kontrolle des CaMV35S-Promoters in Arabidopsis führt zu verbesserten Wachstumseigenschaften
Samen von HUB1 überexprimierenden Linien (OE-HUB1) wiesen verglichen mit dem Wildtyp (Ler) oder hub1-1-Mutantenlinien eine gesteigerte Keimkraft auf: Ler-Wildtyp-, hub1-1-Mutanten- und OE-HUB1-Samen wurden sterilisiert und auf MS-Medien mit 1% Agar ausplattiert. Nach Vemalisation für 2 Nächte im Dunklen bei 4°C wurden die Pflanzen in Wachstumskammern bei 21°C mit einer relativen Feuchtigkeit von 50–60%, PAR 100–120 μE/m²/h und unter 16/8 Stunden Tages-Nachtbedingungen gestellt. Die Keimung wurde täglich verfolgt, und sichtbare Anzeichen von Keimung wurden aufgezeichnet. Der keimungsfördernde Effekt der HUB1-Überexpression wurde als verstärkte Keimkraft der transgenen Keimpflanzen verglichen mit dem Wildtyp oder der hub1-1-Mutante beobachtet. Bei Wildtyppflanzen keimten die meisten Keimpflanzen zwei Tage nach der Vemalisation (TNV) (15). Bei 50% der OE-HUB1-Keimpflanzen wurde eine Keimung bereits am ersten Tage nach der Vemalisation beobachtet, und die restlichen 50% keimten am zweiten Tag. Bei der hub1-1-Mutante war die Keimung um einen Tag verzögert und bei 50% der Keimpflanzen wurde eine Keimung erst am dritten Tag beobachtet Um die zugrundeliegenden Mechanismen für die gesteigerte Keimkraft zu analysieren, wurden Zellflächen von Ler und OE-HUB1-Linien während des Juvenilblattwachstums gemessen. Zu Wachstumsbeginn zeigt OE-HUB1 tatsächlich ein gesteigertes Zellwachstum, das jedoch, wenn die Blätter ihre reife Größe erreicht haben, wieder abflacht (16). Der positive Effekt von HUB1 auf das Wachstum von Arabidopsis findet daher frühzeitig während der Entwicklung statt.
Weiterhin wurde untersucht, ob die hub1-1-Mutation zu Veränderungen bei der Schoten- und Samenentwicklung führt. Für die Analyse wurden ausgewachsene grüne Schoten (4 bis 8 Tage nach der Befruchtung) geerntet und für die Analyse gescannt oder für Aufnahmen fotografiert. Die Fläche der gescannten Schoten wurde mit dem Software-Programm ImageJ (Image Processing and Analysis in Java, entwickelt bei Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA berechnet. Die Anzahl Schoten pro Pflanze wurde aus den gescannten ganzen Pflanzen gezählt.
Von den getrockneten Schoten wurden Samen geerntet und gescannt. Die Samenfläche wurde von Scans mit Hilfe des Programms ImageJ berechnet. Das Samengewicht wurde dadurch bestimmt, dass man 200 Samen in ein Stück Aluminiumfolie mit bekanntem Gewicht einwickelte und maß. Der Samenertrag pro Pflanze wunde mit t-Testanalysen unterzogen. Es stellte sich heraus, dass die Fläche der hub1-1-Schoten stark verringert war (17 und 18). Die hub1-1-Schoten enthielten auch weniger Samen mit 50–80% unbefruchteten Samen, was zu einem reduzierten Gesamtsamenertrag führte. Die hub1-1-Samen waren auch kleiner (19). Insgesamt war daher der Gesamtsamenertrag der hub1-1-Pflanzen verglichen mit dem Ler-Wildtyp drastisch reduziert (20). Während bei hub1-1-Mutantenpflanzen die Schoten- und Samenparameter stark beeinflusst waren, wunden bei den HUB1-Überexpressionslinien keine signfikanten Auswirkungen auf die Samenparameter beobachtet. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass die Samenentwicklung bei Arabidopsis nicht vom Zellwachstum abhängig ist, oder dass die Überexpression unter der Kontrolle des 35S-CaMV-Promoters nicht optimal war. Bei den HUB1-Überexpressionslinien war jedoch die Morphologie der Schoten (Früchte) insofern verändert, als die Fläche breitenmäßig erhöht war (18).
Beispiel 15: Mutagenese von HUB1 und funktionelle Charakterisierung der HUB1pm-Mutante.
Die Kodiersequenz des Oktamers von Cysteinen und Histidinen in der RING-Domäne von HUB1 wurde mittels PCR-vermittelter ortsgerichteter Mutagenese mutagenisiert (QuickChange, Stratagene), so dass Cys1 und Cys2 zu Ser-Resten verändert wurden (1, Tafel B). Die rekombinanten Proteine wurden als Fusionsproteine mit His- und GST-Epitop-Tags kloniert, in E. coli exprimiert und an Affinitätssäulen aufgereinigt. Die aufgereinigten Proteine wurden in einem in vitro-(auto)-Ubiquitinierungs-Assay gemäß Fleury et al. (2007) auf Histon-H2B-Monoubiquitinierung und auf Selbstubiquitinierungsaktivität getestet, siehe auch Beispiel 6.
Die Punktmutationen in der RING-Domäne reduzierten die Autopolyubiquitinierungsaktivität, wie aus den verringerten Niveaus dieser Modifikationen auf den Western-Blots hervorgeht (5, HA-Ab). Die gleiche Beladung von GST-HUB1 wird durch GST Ab gezeigt (Figur 5, GST-Ab). Diese Daten bestätigten, dass die RING-Domäne für die Autoubiquitinierungsaktivität erforderlich war. Unerwarteterweise war die Histon-H2B-Monoubiquitinierung von den Punktmutationen nicht betroffen (5, HA-Ab). Weiterhin verringerte das Vorliegen von H2B-Substrat die Autopolyubiquitinierungsaktivität, was nahelegt, dass bei Fehlen von Substrat HUB1-Protein mittels Proteinabbau entfernt werden kann. Es wird angenommen, dass die Punktmutationen das Protein dominant-positiv machen, und zwar dadurch, dass sie die Autoregulation reduzieren und so das Protein stabilisieren. In einem ersten Test mit Behandlung mit Proteasomhemmer (MG132) wurde jedoch keine Anhäufung von HUB1-Protein beobachtet, was nahelegt, dass es sich nicht um ein unstabiles Protein handeln könnte, sondern dass die Potyubiquitinierung eine andere, noch zu identifizierende Regulationsfunktion ausüben könnte.
Die RING-Domäne ist hauptsächlich an der Interaktion mit dem E2-Enzym beteiligt, und es scheint, dass die in dieser Beschreibung erzeugten Punktmutationen diese Interaktion nicht zunichte machen bzw. dass eine vollfunktionelle RING-Domäne für das Vermitteln der Histonmodifikationen nicht unbedingt erforderlich ist. Weitere mögliche Mutationen der Ubiquitin-E3-Ligasen und der RING-Domänen würden das Targeting von zusätzlichen Aminosäuren in dem Oktamer von Cysteinen und Histidinen, die die zwei Zinkatome halten, beinhalten. Zu den Möglichkeiten zählt das Ersetzen von einem oder zwei Cysteinen, die ein Zn halten, oder das Ersetzen von zwei oder vier Cysteinen, die die zwei Zn-Atome halten. Eine stärkere Veränderung ist Deletion der gesamten RING-Domäne, mit der eine Mutante erzeugt würde, die mit der hub1-1-Mutante vergleichbar ist. Die hub1-1-Phänotypen sind verglichen mit den Knockout-Allelen in Col-0-Hintergrund einzigartig stark (Fleury et al., 2007), was nahelegen könnte, dass das frühe Stopp-Codon vor der RING-Domäne zu der Entstehung eines verkürzten Proteins mit einem dominant-negativen Effekt auf die Proteinfunktion führt. Zur Bestätigung der Verkürzung des HUB1-Proteins in hub1-1-Linien werden derzeit Antikörper erzeugt. Mit NTAP-markierte HUB1- und HUB1pm-Konstrukte wurden für „Tandem Affinity Purfication” -Versuche für Wechselwirkungsuntersuchungen erzeugt. Die RING-Domäne einer Ubiquitin-E3-Ligase vermittelt üblicherweise Interaktionen mit dem E2-Enzym. Die in der HUB1-RING-Domäne herbeigeführten Punktmutationen hatten jedoch eine Auswirkung auf die Wechselwirkungen. Während das Volllängen-HUB1 fähig war, an das homologe Protein HUB2 zu binden, schienen die Punktmutationen diese Bindungsaktivität zunichte zu machen.
Um die Rolle der RING-Domäne in HUB1 (wenn sie eine Funktion beim Proteinabbau ausübt) bei der Regulation des Pflanzenwachstums weiter zu analysieren, wurden der TAP-markierte Wildtyp und Punktmutantenkonstrukte in Arabidopsis-Pflanzen hineintransformiert. Zum Nachweisen der Proteinmengen in Pflanzen und zum Beurteilen der Auswirkung der Proteasomhemmerbehandlung auf die Hub1-Proteinmengen bediente man sich der Western-Blot-Analyse. Üblicherweise führen Punktmutationen in der RING-Domäne zu dominant-negativen Formen der E3-Ligasen, die die Substrate einfangen, jedoch nicht ihre Ubiquitinierung vermitteln, wodurch die Targets stabilisiert werden. Es wird erwartet, dass die Phänotypen von punktmutantentransgenen Pflanzen weniger stark ausgeprägt als diejenigen von null Mutanten sind, und zwar dadurch, dass nur ein Titrationseffekt auf das Substrat ausgeübt wird. Eine molekulare Charakterisierung des Punktmutantenproteins in vitro legt jedoch nahe, dass HUB1 aufgrund einer reduzierten Autoregulation ziemlich stabilisiert wird, während keine Verringerung bei der H2B-Monoubiquitinierung beobachtet wurde.
Beispiel 16: Die Überexpression von HUB1pm in transgenem Arabidopsis verbessert die Pflanzenwachstumseigenschaften
Die hub1-1-Mutante von Arabidopsis thaliana bzw. der Wildtyp Ler wurde mit der HUB1- oder HUB1pm-Kodiersequenz, jeweils unter der Kontrolle des CaMV35S-Promoters, transformiert und wie oben beschrieben herangezogen. Unerwarteterweise wurde gefunden, dass eine Überexpression der HUB1pm-Mutante im Ler-Hintergrund eine Auswirkung auf die Blattbreite hatte, und dass die vergrößerte Blattbreite bei HUB1pm stärker ausgeprägt als bei HUB1 ist (21A); derselbe Effekt wurde in dem hub1-1-Mutantenhintergrund beobachtet, insbesondere wiesen das 3. bis 9. Blatt der HUB1pm-Transformante eine vergrößerte Blattbreite verglichen mit der Kontrolle oder der HUB1-Transformante auf (21B).
Beispiel 17: Die Überexpression des HUB1pm-Proteins unter der Kontrolle eines mittelstarken Promoters erhöht den Samenertrag
Oryza sativa wird mit der HUB1pm-Kodiersequenz in operativer Verknüpfung mit einem mittelstarken Promoter (wie dem HMGP-Promoter) transformiert und wie oben herangezogen. Die Pflanzen weisen verbesserte Wachstumseigenschaften auf, umfassend eine oder mehrere Eigenschaften der folgenden: erhöhte Biomasse, verstärkte Keimkraft, verstärkte Jungpflanzenwüchsigkeit, erhöhter Samenertrag, erhöhte Stresstoleranz.
Beispiel 18: Die Expression von Genen der circadianen Uhr wird durch modulierte HUB1-Expression beeinflusst
Aus OE-HUB1-Microarray-Daten geht hervor, dass die circadiane Uhr bei HUB1-Missexpressionslinien gestört ist. Es wurde nachgewiesen, dass in der HUB1-Überexpressionslinie Input-Gene, Rhythmusoszillatorgene sowie Output-Gene hinaufreguliert waren. Um echte HUB1-Zielgene zu identifizieren, wurden in dem Microarray-Versuch gegensätzlich regulierte Gene zwischen der hub1-1-Mutante und OE-HUB1-Linien aufgezeichnet. Tabelle G zeigt eine Liste von 43 Genen, die in der hub1-1-Mutante signifikant herunterreguliert und in der OE-HUB1-Linie hinaufreguliert waren, wobei die Daten gemäß ansteigenden log2-Verhältnissen zwischen hub1-1 und OE-HUB1 gereiht sind. Von den ersten 43 gegensätzlich regulierten Genen zwischen der Überexpressionslinie (hinauf) und der Mutante (hinunter) waren 18 diurnal reguliert, und 8 von diesen diurnal regulierten Genen waren unter den ersten 10 (Tabelle G). Unter diesen Genen wurden Komponenten des circadianen Rhythmusoszillators wie CCA1, LHY und APRR9 nachgewiesen. Zusätzlich wurde in der hub1-1-Mutante die Expression des Proteins der F-Box-Familie (FKF1)/adagio 3 (ADO3) E3-Ubiquitinligase SCF-Komplex F-Box-Untereinheit und ELF4 (At1g68050 bzw. At2g40080, beide Rhythmus-Input-Gene), der Rhythmusoszillatorgene APRR5 („pseudo-response” Regulator 5, At5g24470), APRR3 („pseudo-response” Regulator 3, At5g60100) und TOC1 hinaufreguliert, jedoch in den OE-HUB1-Pflanzen hinunterreguliert. Mehrere Rhythmus-Output-Gene, einschließlich Chlorophyll-A-B-Bindungsproteine (wie LHCB4.3, At2g40100) wurden in den OE-HUB1-Pflanzen hinaufreguliert. Gemeinsam betrachtet bestätigen diese Daten, dass der circadiane Rhythmus von der HUB1-Missexpression beeinflusst wird. Um weiter zu bestätigen, ob die Frequenz oder Amplitude des circadianen Rhythmus in den hub1-Linien beeinflusst wird, wurde ein Zeitveraufversuch mit QPCR-Analyse von Rhythmusgenen durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden in vitro herangezogene Keimpflanzen verwendet, die unter Kurztagbedingungen gekeimt hatten und nach 12 bis 14 Tagen in Dauerlichtbedingungen gestellt wurden. Mit der Probenahme wurde nach 24 Stunden im Dauerlicht begonnen, und es wunden während einer 4-Stunden-Periode alle 4 Stunden oberirdische Teile geerntet RNA wurde mittels RNeasy (Qiagen) extrahiert und dann mit DNase behandelt cDNA wurde mit einem Erststrangsynthese-Kit (Invitrogen) hergestellt, wobei man von 3 μg Gesamt-RNA ausging. In jeder Reaktion wunden 5 μl verdünnte cDNA (20 ng/μl) zusammen mit SYBR Green und genspezifischen Primern eingesetzt. Die QPCR wurde in einem iCycler von Bio Rad unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt.
Die ersten Ergebnisse zeigten, dass die CCA1-Expression in der hub1-1-Mutante in ihrer Amplitude reduziert war und dass die Welle verschoben war. Tabelle G: Gegensätzlich regulierte Gene zwischen hub1-1 mit negativen log2-Werten und OE-HUB1 (mit positiven log2-Werten). Die Gene sind mit ansteigendem log2-Verhältnis zwischen hub1-1 und OE-HUB1 gereiht, wobei bei einem log2-Verhältnis bei –1,99 ein Cut-Off erfolgte. D: diurnal reguliert. Log2: Expressionswerte.
Beispiel 19: Die Downstream-Signalleitungswege des circadianen Rhythmus werden von der modulierten Expression von HUB1 beeinflusst 1
Zu den Output-Genen des circadianen Rhythmus zählen Regulatoren der Photosynthesekapazität und der Plastidenentwicklung. Um die lichtabhängigen Phänotypen zu erforschen, wurden die hub1-1-Mutante, der Ler-Wildtyp und HUB1-Überexpressionspflanzen für die phänotypische Charakterisierung unter drei unterschiedlichen Lichtbedingungen herangezogen, nämlich Langtag (LT), Kurztag (KT) und Dauerlicht (DL) (6). Die unter Kurztaglichtbedingungen herangezogene hub1-1-Mutante wies deutlich eine blasse Farbe auf. Unter Langtagbedingungen war der hub1-1-Wachstumsphänotyp am wenigsten stark ausgeprägt und war hauptsächlich wie bei Fleury et al. (2007) beschrteben. Unter LT- und DL-Bedingungen wiesen hub1-1-Keimpflanzen nur gelegentlich einen Pigmentmangel auf.
Um zu bestätigen, dass hub1-1-Mutantenpflanzen eine reduzierte Photosynthesekapazität aufwiesen, wurde der Photosynthesepigmentgehalt, nämlich der Gehalt an Chlorophyll a und b und der Gesamtcarotinoidgehalt in Pflanzen, die unter den drei Lichtbedingungen herangezogen wurden, analysiert. Im KT waren alle Pigmente reduziert (7). Aufgrund der blassen Blattfärbung und des reduzierten Pigmentgehalts können Defekte bei den Plastidenstrukturen vorhergesagt werden, und diese Hypothese wird von den Transkriptomdaten gestützt Dies wunde bei der Untersuchung der subzellulären Eigenschaften, auf denen die hellen Phänotypen beruhten, mittels Trarismissionselektronenmikroskopie bestätigt. Die ersten TEM-Aufnahmen zeigten veränderte Thylakoidmembranstrukturen für die hub1-1-Mutante (8). Die Gesamtmenge an Membranen und Grana war reduziert, und es lagen mehr Plastoglobuli im Stroms vor.
Beispiel 20: Die lichtabhängigen Phänotypen von hub1-1 sind unter Kurztagbedingungen C gesteigert
Zusätzlich zu der reduzierten Photosynthesekapazität beinhalten über den circadianen Rhythmus regulierte Phänotypen bei hub1-1 reduzierte Hypokotyllänge, reduziertes Blattwachstum und frühe Blütezeit. Diese rhythmusabhängigen Phänotypen bei den HUB1-Missexpressionslinien (OE und Mutante) wurden mit dem Wildtyp Ler verglichen. Die Pflanzen wurden unter Kurztagbedingungen herangezogen, und ihre Hypokotyllängen wurden nach 21tägigern Wachstum gemessen. Die Hypokotyllängen der hub1-1-Mutante waren reduziert (9). Bei im Dunklen herangezogenen Keimpflanzen wurden keine Unterschiede bei den Hypokotyllängen beobachtet.
Es wurde auch nahegelegt, dass eine gestörte Plastidenentwicklung die Blattmorphologie beeinflussen kann. Um die Wachstumsphänotypen unter den drei Bedingungen zu vergleichen, wurde die Blattfläche der 21 Tage alten in vitro herangezogenen Keimpflanzen gemessen. Während des Wachstums der Kotyledonen der hub1-1-Mutante nicht beeinflusst wird, ist das Spreitungswachstum der echten Blätter unter allen Bedingungen stark reprimiert (6, 10 und 11).
Weiterhin wurden bei der unter Kurztagbedingungen herangezogenen hub1-1-Mutante neue morphologische Effekte beobachtet. Vom dritten und vierten Blatt an entwickelten sich manche Blätter lediglich als spießartige Strukturen bzw. es trat ihre Mittelrippe von der Unterseite eines schmalen Blatts hervor (12). Zusätzlich zu den spitzen Strukturen wiesen hub1-1-Mutanten veränderte Blattmorphologien wie reduziertes Wachstum, schmale Blattspreite und verändertes Blattadermuster auf. Es wurden auch veränderte Blütenmorphologien beobachtet. Die Blütenstrukturen von hub1-1-Mutantenpflanzen zeigten, dass Blütenmeristeme und – Organe fehlten und/oder sich am falschen Ort befanden (13).
Weiterhin blühen hub1-1-Mutantenpflanzen unter KT-Bedingungen wie auch unter beiden anderen Wachstumsbedingungen früh, und zwar aufgrund des Beginns des Streckungswachstums.
Beispiel 21: Die veränderte Expression von Entwicklungsgenen korreliert mit hub1-1-Phänotypen
hub1-1-Mutantenpflanzen weisen extreme Blattphänotypen mit reduziertem Wachstum, veränderten Blattadermustern und gelegentlich auftretenden hervortretenden Mittelrippen oder spießartigen echten Blättern auf. Die Microarray-Daten von HUB1-Missexpressionslinien zeigten Veränderungen bei verschiedenen Entwicklungsgenen wie dem KNAT-, dem WUS-, dem AP2-, dem CLAVATA-Gen (Tabelle H). 14 zeigt die Expressionsmuster der in HUB1-Microarrays gemäß Genevestigator identifizierten Entwicklungsgene. Tabelle H: in hub1-1 und in dem Ler-Wildtyp bzw. in OE-HUB1-Linien unterschiedlich exprimierte Entwicklungsgene. Fehlende Werte waren nicht signifikant (p). Die Sortierung der Gene erfolgte nach aufsteigendem Verhältnis zwischen hub1-1 und dem Ler-Wildtyp.
Beispiel 22: Modulation von biologischen Vorgängen in hub1-1 verglichen mit Ler-Wildtyppflanzen und mit HUB1 OE:
Mit den Microanay-Daten (Beispiel 13) wurde eine BINGO-Analyse (ein Werkzeug für die Bestimmung, welche Gene Ontology(GO)-Terme in einem Satz von Genen signifikant überrepräsentiert sind) durchgeführt, um die biologische Vorgänge zu identifizieren, die durch eine HUB1-Missexpression beeinflusst wurden. In den Tabellen I1 und I2 ist eine Aufzählung von Genen, die in hub1-1-Pflanzen verglichen mit Ler-WT-Pflanzen unterschiedlich exprimiert wurden, angegeben: Tabelle I1: In hub1-1 im Vergleich zu Ler hinunterregulierte Gene (SEQ ID NO: 244 bis SEQ ID NO: 835)
Die Gene in Tabelle I1 sind an der Photosynthese (Gene Ontology (GO) ID Nr. 15979), an der Photosyntheseregulation, an der Lichtreaktion (GO ID Nr. 42548), an der Chlorophyllbiosynthese (GO ID Nr. 15995), am Chlorophyllmetabolismus (GO ID Nr. 15994), an der Carotinoidbiosynthese (GO ID Nr. 16117), an der Reaktion auf Rotlicht oder Dunkelrotlicht (GO ID Nr. 9639), an der Photosynthese, an der Lichternte (GO ID Nr. 9765), an der Photomorphogenese (GO ID Nr. 9640), an der Entwicklungsregulation (GO ID Nr. 50793), an der Samenentwicklung (GO ID Nr. 48316), an der Entwicklung (GO ID Nr. 7275), am Zellzyklus (GO ID Nr. 7049), an der Zellzyklusregulation (GO ID Nr. 51726) beteiligt. Tabelle I2: In hub1-1 verglichen mit Ler hinaufregulierte Gene (SEQ ID NO: 836 bis SEQ ID NO: 961)
Die Gene in Tabelle I2 sind an der Regulation der Zellgröße (GO ID Nr. 8361), an der Spezifizierung der Längenachse (GO ID Nr. 9942), an der Spezifizierung des primären Sprossapicalmeristems (GO ID Nr. 10072), an der Zellmorphogenese (GO ID Nr. 7148), am Meristemaufbau (GO ID Nr. 9933), am Gravitropismus (GO ID Nr. 9630), an der Reaktion auf Brassinosteroid-Reiz (GO ID nr 9741) beteiligt.
In den Tabellen I3 und I4 ist eine Aufzählung von Genen, die in hub1-1-Pflanzen verglichen mit HUB1-überexprimierenden Pflanzen (HUB1 OE) unterschiedlich exprimiert wurden, angegeben: Tabelle I3: In hub1-1 verglichen mit HUB OE herunterregulierte Gene (SEQ ID NO: 962 bis SEQ ID NO: 1023)
Die Gene in Tabelle I3 sind an der Chromatinassemblierung (GO ID Nr. 31497), am circadianen Rhythmus (GO ID Nr. 7623) beteiligt. Tabelle I4: In hub1-1 verglichen mit HUB OE hinaufregulierte Gene (SEQ ID NO: 1024 bis SEQ ID NO: 1045)
Die Gene in Tabelle I4 sind an der Musterspezifizierung (GO ID Nr. 7389), an der Spezifizierung des primären Sprossapicalmeristems (GO ID Nr. 10072) beteiligt.
Aus diesen Daten kann klar geschlossen werden, dass der circadiane Rhythmus unter der Kontrolle von HUB1 steht.
Beispiel 23: Interactom von HUB1
Erster Versuch:
Die Rolle von HUB1 bei der Histon-H2B-Monoubiquitinierung legt nahe, dass es sich bei HUB1 um ein funktionelles Homolog der Bre1-E3-Ligase handelt. Um mit HUB1 interagierende Proteine zu identifizieren, bediente man sich der „Tandem Affinity Purification” (TAP)-Technologie, die eine rasche Aufreinigung von Proteinkomplexen unter ihren nativen Bedingungen gestattet und die auf der Fusion von TAP-Tags in den interessierenden Proteinen beruht (Puig et al., Methods. 24(3): 218–29, 2001).
Da die RING-Proteine ihre funktionell wichtige Domäne am C-terminalen Ende aufweisen, wurde statt der traditionellen C-terminalen Fusion eine N-terminale Fusion hergestellt, und zwar dadurch, dass man sowohl die Volllängen-Form als auch die Punktmutantenform von HUB1 (HUB1pm, HUB1fl) klonierte. Die Arabidopsis-Zellkulturen wurden mit den beiden Konstrukten transformiert und im 10-Liter-Maßstab kultiviert, geerntet und mittels TAP aufgereinigt (Van Leene et al., Mol. Cell Proteomics 6, 1226–38, 2007). Die Proteinextrakte wurden auf 1-D SDS-PAGE-Gelen aufgetrennt und aus dem Gel isoliert, um die Proteine massenspektrometrisch zu identifizieren (Laukens et al., Proteomics. 4, 720–7, 2004, Van Leene et al, 2007). Es wunden zwei Ausschlussgrenzen verwendet, was zu einer bestätigten” und einer „zu bestätigenden” Aufzählung von mutmaßlichen Interaktoren führte (Tabelle J). Tabelle J: Alle bestätigten und eine Auswahl von zu bestätigenden mittels TAP identifizierten HUB1-Interaktoren.
In dem Datensatz der bestätigten Interaktoren TAP waren HUB1 und HUB2 vorhanden, was die dimere Bildung zwischen den Homologen bestätigt. Weiterhin wurden die Acetyltransferase GCN5, RNA-Bindungsproteine und ein KH-Domänenprotein als mit HUB1 interagierende Proteine identifiziert. Von den meisten dieser Proteine ist bekannt, dass sie im Zellkern oder in Nucleoli lokalisiert sind. Auch wurden GFP-Konstrukte von HUB1 als im Zellkern befindlich lokalisiert (Liu et al., 2007). Wurde HUB1pm für die TAP-Aufreinigung verwendet, so konnte kein HUB2 als interagierendes Protein identifiziert werden. Aus diesen Daten geht hervor, dass für die Dimerisierung von HUB1 und HUB2 eine funktionsfähige RING-Domäne erforderlich ist. Eine Auswahl von Proteinen, die in den TAP-Aufreinigungsversuchen nur einmal interagierten, ist in der Tabelle als ”zu bestätigend” angeführt.
Bei GCN5 handelt es sich um ein Historacytilierungsenzym, das an der Stressreaktion, an der Abwehr, an der Signaltransduktion, an der Transkription, am Metabolismus, am Transport und an der Blütenentwicklung beteiligt ist, wo es zwei wesentliche Gene wie WUSCHEL (WUS) und AGAMOUS (AG) beeinflusst. NOP56 ist bei der Ribosomenbiogenese in der Hefe erforderlich. Bei Myb handelt es sich um ein DNA-Bindungsprotein mit Transkriptionsfaktoraktrvität, das in der Reaktion auf Abszisinsäure-, Jasmonsäure- und Salicylsäurestimuli beteiligt ist. Fibrillarin 2 ist eine RNA-Methyltransferase und ein mögliches Substrat für AIPRMT1a und AtPRMT1b, zwei Proteinmethyltransferasen, die unter anderen posttranslationellen Modifikationen an mH4K3 beteiligt sind. Direkte Interaktionen mit HUB1 wurden auch für SEUSS und für ein „Spen-like” Nukleinsäurebindungsprotein gezeigt Mehrere der bestätigten und der zu bestätigenden Interaktoren wurden in einem Hefe-Zwei-Hybrid-Assay getestet, um zu überprüfen, ob sie direkt mit HUB1 interagieren. Eine direkte Interaktion mit HUB1 wurde für HUB2, SEUSS und „Spen-like” Proteine gezeigt. Andere bestätigte Interaktoren können für die Interaktion mit HUB1 eventuell vermittelnde Proteine erfordern.
Zweiter Versuch:
Statt dem ursprünglichen TAP-Tag wurde der von Van Leene et al. (Trends in Plant Science 13, 517–520, 2008) entwickelte, optimierte GS-TAP-Tag N-terminal mit den verschiedenen „Bait”-Proteinen fusioniert (siehe Tabelle K). Die Konstrukte wurden in Protoplastenzellen von Arabidopsis thaliana hinein transformiert und die Expression der Fusionsproteine wurde mittels Western-Analyse bestätigt Die markierten Proteine wurden in Zellkutturen im 5-Liter-Maßstab erzeugt, extrahiert und die Proteinkomplexe wurden mit dem von Van Leene et al. (2008) beschriebenen „Tandem Affinity Purification”-Protokoll aufgereinigt. Gebundene Komplexe wurden eluiert, ausgefällt und einer SDS-PAGE unterzogen. Mit Coomassie gefärbte Proteinbanden wunden extrahiert, mit Trypsin verdaut und mittels MALDI-TOF-TOF-Massenspektrometrie analysiert.
Für jeden Versuch wurden zwei unabhängige Aufreinigungen (a & b) aus derselben Zellkultur vorgenommen und bei HUB1 wurden zwei unterschiedliche Aufreinigungen durchgeführt, um einen besseren Beweis für sein Interaktionsnetzwerk zu liefern. Die Ergebnisse der verschiedenen TAP-Aufreinigungen sind in Tabelle K angeführt. Diese Daten zeigen das Vorhandensein eines Komplexes umfassend HUB1, HUB2, SL und KH an. Tatsächlich konnte mit allen TAP-Assays, die unter Verwendung von HUB1, HUB2 und SL als „Barts” durchgeführt wurden, diese drei Proteine gemeinsam mit KH identifiziert werden. Zusätzlich wurden die Ergebnisse von HUB1-TAP durch Aufreinigung mit zwei unterschiedlichen TAP-Tags bestätigt. Tabelle K: Aufzählung von mittels TAP-Aufreinigung gewonnenen Proteinen unter Verwendung von Fusionen mit dem GS-TAP-Tag. (a) und (b) stellen unabhängige Aufreinigungen dar, der Erwartungswert beruht auf der Homologie zwischen der Peptidsequenz und dem Protein.

*) 14 Ubiquitine weisen unterschiedliche Eintragsnummem auf
In beiden TAP-Versuchen mit HUB1 als „Bait” wurde nicht nur dessen Homolog HUB2, sondern auch ein Protein mit einem Motiv mit K-Homologie (umbenannt in KH), ein uncharakterisiertes Molekül mit fünf KH-Domänen, die an der RNA-Bindung beteiligt sind, gewonnen. Ein weiteres uncharakterisiertes Protein, das in den zwei technischen Wiederholungen eines Versuchs sowie in den mit ursprünglichen TAP-Tag durchgeführten Versuchen auftrat, ist „Spen-Like” (SL). Dieses Protein weist zusätzlich zu einer SPOC-Domäne am C-terminalen Ende ebenfalls eine RNA-Bindungsdomäne (RRM) auf. Vergleichbare Ergebnisse wurden unter Verwendung von HUB2 als „Bait” erzielt. Die gegenseitige Aufreinigung von HUB1 und HUB2 legt die Bildung einer Tetramerstruktur für die Kontrolle der Histon-H2B-Monoubiquitinierung nahe. In einer technischen Wiederholung eines TAP-Versuchs mit HUB1 wurde K3K7 gewonnen. Dieses Protein enthält fünf Pentatricopeptid-Sequenzwiederholungen (PPRs), die bei der RNA-Stabilisierung funktionell sind, da dieselbe Domäne in Chloroplast RNA Processing 1 (Crp1), einem Protein, das an der RNA-Prozessierung beteiligt ist, vorliegt. TAP mit SL als„Bait” zeigte, wie eng dessen Assoziation mit HUB1, HUB2 und KH ist. Beim Kombinieren der TAP-Versuchsdaten für HUB1, HUB2 und SL (KH wird später durchgeführt) als „Baits” können wir schließen, dass der sogenannte Histon-H2B-Monoubiquitinierungs-Tetramer-„Core”-Komplex, der sich aus HUB1–HUB2 zusammensetzt, mindestens zwei zusätzliche Proteine, nämlich SL und KH, enthält. Beide Proteine weisen RNA-Bindungsmoleküle auf. Diese Art von Proteinen ist bis jetzt noch nie mit der Histon-H2B-Monoubiquitinierung assoziiert worden, aufgrund der Tatsache, dass dieser Vorgang wie andere epigenetische Anzeichen eng mit DNA und neu erzeugter mRNA assoziiert ist, wird jedoch vorgeschlagen, dass diese Proteine wesentliche Rollen bei der Histon-H2B-Monoubiquitinierung spielen, wo ihre Affinität für RNA zu einem Einbau von Upstream- oder Feedback-Information (z. B. aus kleinen RNA-Molekülen) in den HUB1/HUB2-Komplex führen könnte. UBC2 ermöglichte das Abtrennen der anderen Grundbestandteile des Ubiquitinierungskomplexes wie Ubiquitin, das von 14 unterschiedlichen UBQ-Eintragsnummern, die aufgrund der hohen Homologie untereinander nicht unterschieden werden können, dargestellt ist, und zwei E1-aktivierenden Enzymen AtUBA1 und AtUBA2.
Dritter Versuch:
Um direkte Interaktoren von HUB1 zu identifizieren, wurde ein Hefe-2-Hybrid-Versuch durchgeführt. Für jedes der ausgewählten Proteine wurden AD- und BD-Fusionen konstruiert, deren Expression mittels Western-Blot bestätigt wurde. Die Stämme HUB2, verkürztes HUB1, SEUSS und KH zeigten, wie durch eine Blaufärbung von Kolonien nachgewiesen wurde, eine Selbstaktivieningsaktivität und wurden daher nicht in dem Y2H-Versuch als „Prey” eingesetzt, um falsch-positive Ergebnisse zu vermeiden. Die Ergebnisse sind in Tabelle L zusammengefasst: Tabelle L: Matrix mit paarweisen Interaktionen. ++ = starke Interaktion; + = schwache Interaktion; - = keine Interaktionen; die Interaktion zwischen den unterschiedlichen Versionen von HUB1, HUB2 und SEUSS wurden in zwei unabhängigen Versuchen getestet.

pDEST22/pDEST32 HUB1 HUB2 no RING SL

HUB1 ++ ++ ++

HUB1 no RING ++ ++ -

HUB2 ++ ++ -

HUB2 no RING - -

SL ++ - ++

SEUSS + + -
Die Volllängenversion und die verkürzte Version von HUB1 sowie das Volllängen-HUB2 interagierten in vivo. Die RING-Domäne schien die Interaktion des HUB1-Interactom-Komplexes zu beeinflussen, was bei HUB2, wo die Deletion dieser Domäne die Interaktion zwischen HUB1 und HUB2 zunichte machte, am stärksten hervortrat. Die stärkste Interaktion von HUB1 war mit SL.
Um zu testen, welcher Teil von SL an HUB1 bindet, wurden zwei unterschiedliche Versionen des Proteins erzeugt. Die Ergebnisse zeigten, dass nur die N-terminale Region, jedoch nicht der C-terminale Abschnitt, mit HUB1 interagiert. SL wies auch eine Dimerisierungsaktivität auf, und beide Regionen des Proteins schienen beteiligt zu sein. Bei HUB1 und bei der verkürzten Version von HUB2 wurde auch eine schwache Interaktion mit SEUSS gezeigt. Weiterhin zeigte SEUSS eine starke Interaktion mit sich selbst, was eine Homodimerisierung widerspiegelt. Eine starke Interaktion zwischen SEUSS und LUG/RON2 wurde nachgewiesen, was, wie in früheren Untersuchungen berichtet, die Verlässlichkeit des Assays stützt. Es wunde gezeigt, dass weder HUB1 noch HUB2 eine nachweisbare Interaktion mit dem an der Histon-H2B-Monoubiquitinierung beteiligten E2-konjugierenden Enzymen, die in dem Genom von Arabidopsis thaliana vorhanden sind, aufweisen (UBC1, UBC2, UBC3), es ist jedoch möglich, dass der dimere oder tetramere HUB1/HUB2-Komplex für die Interaktion mit einem der UBC-Polypeptide essentiell ist.
Beispiel 24: Phanotypische Charakterisierung von „„Spen-like” Mutantenpflanzen
Das „Spen-like” Protein umfasst ein RNA-Erkennungsmotiv (RRM) in der Mitte der Sequenz und eine „spen paralog and ortholog C-terminal”-Domäne (SPOC) in der C-temninalen Region, was die typische Zusammensetzung von „Split Ends” (Spen)-Proteinen ist. Samen von Arabidopsis thaliana sl-1(SALK_025388) und sl-2 (GABI_461F01) wurden vom Nottingham Arabidopsis Stock Centre bzw. GABI-Kat bezogen. Homozygote Samen wurden auf einem Jiffy-7-Pellet (www.jiffypot.com), ausgesät, über Nacht vernalisiert und anschließend in Wachstumskammern unter Langtagbedingungen wie oben beschrieben herangezogen. Zur Blütezeit (wobei der Stängel der Influoreszenz ungefähr 0,5 cm lang war) wurden Blattserien hergestellt, und zwar dadurch, dass man alle Rosettenblätter auf 1% Agarplatten in einer Reihe anordnete (n = 10). Die Blätter wurden fotografiert und gescannt, um die Blattfläche mittels ImageJ 1.41 zu messen. Die Anzahl Blätter zum Blütezeitpunkt wurde ebenfalls an der Gesamtpopulation (n = 25) bonitiert.
Fünfundzwanzig Pflanzen des Wildtyps (Col-0), hub1-4(SALK_122512) (Fleury et al., 2007) sowie die zwei T-DNA-Linien (sl-1 und sl-2) wurden in Erde für die Phänotypanalyse herangezogen. Die Blütezeit war bei sl-2 leicht, jedoch signfikant reduziert und bei hub1-4 stark verändert. Andererseits wies sl-1 eine durchgehende Reduktion der Anzahl Blätter zum Blütezeitpunkt auf, während die Zeit dieses Entwicklungsschalters mit einer der Col-0-Pflanzen vergleichbar war (22A und B). Zehn Pflanzen jedes Genotyps wurden solange herangezogen, bis der blühende Stamm ungefähr 0,5 mm lang war, und dann auf ihre Blattgröße analysiert, ein Maß, das einen deutlichen Hinweis auf die Rosettengröße gibt. Die Ergebnisse dieser Analyse zeigen, dass die Fläche von beinahe allen Blättern (einschließlich Kotyledonen) der sl-1-Pflanzen signifikant kleiner war als beim Wildtyp. Im Gegensatz dazu war diese Reduktion bei der sl-2-Mutante weniger stark ausgeprägt, und nur wenige Blätter waren signifikant kleiner (22C). Die fünfzehn verbleibenden Pflanzen wurden weiter herangezogen, um die reproduktiven Strukturen zu analysieren. Der Blütenstängeldurchmesser von jedem Genotyp wurde gemessen, und sowohl bei sl-1 und sl-2 als auch bei hub1-4 wurde eine signifikante Reduktion beobachtet. Bei den Blütenorganen wurden jedoch zwischen den sl-Allelen und dem Wilddtyp keine offensichtlichen Unterschiede bemerkt. Aus diesen Anzeichen geht hervor, dass im Gegensatz zu FPA (das im Gegensatz zu SL multiple RRM-Domänen umfasst) SL wahrscheinlich nicht an der Blüenentwicklung beteiligt ist, als dies durch das Fehlen von irgendwelchen Phänotypen zur Blütezeit und Veränderung von Blütenstrukturen gezeigt wird (22). SL weist keinen Blütephänotyp auf, die Veränderungen, die von seinen Mutanten gezeigt werden, sind jedoch auf das Wachstum beschränkt. Dies geht aus 22B hervor, wo, obwohl die Blütezeit einem des WT entspricht, sl-1 1,3 Blätter weniger als Col-0 produziert. Zusätzlich sind Merkmale, die klar mit dem Wachstum einhergehen, wie Blattfläche und Blütenstängeldurchmesser, signifikant verringert. Die Blütenstrukturen von sl-1 und sl-2 weisen keine Veränderungen auf, und die Produktion von Schoten und daher von Samen ist ebenfalls bei keiner der T-DNA-Linien verändert. In den obigen Beispielen wurde gezeigt, dass SL direkt mit HUB, einer an der Histon-H2B-Mionoubiquitinierung beteiligten E3-Ligase, die auch eine Funktion beim Pflanzenwachstum ausübt, direkt interagiert (Fleury et al., 2007). Im Sinne dieser Daten schlagen wir daher SL aufgrund seines Einflusses auf diesen epigenetischen Marker als Pflanzenwachstumsregulator vor.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Verfahren zur Verbesserung von Wachstumseigenschaften in Pflanzen verglichen mit Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid kodiert, in operativer Verknüpfung mit einem mittelstarken konstitutiven Promoter in einer Pflanze, wobei das HUB1-Polypeptid eine RING-Domäne umfasst
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die RING-Domäne einen C3HC4-Typ aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die modulierte Expression dadurch erzielt wird, dass man eine isolierte Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid kodiert, für ein beliebiges der Proteine gemäß Tabelle A kodiert oder ein Abschnitt von solch einer Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure, die fähig ist, mit solch einer Nukleinsäure zu hybridisieren, ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem beliebigen der Proteine gemäß Tabelle A kodiert
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die verbesserten Wachstumseigenschaften eine oder mehr der Eigenschaften gesteigerte Keimkraft, gesteigerte Jungpflanzenvitalität und gesteigerter Ertrag, vorzugsweise gesteigerte Biomasse und/oder gesteigerter Samenertrag, verglichen mit Kontrollpflanzen, umfasst
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die verbesserten Wachstumseigenschaften unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die verbesserten Wachstumseigenschaften unter Dürrestress-, Salzstress- oder Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei es sich bei dem mittelstarken konstitutiven Promoter um einen HMGP-Promoter, stärker bevorzugt einen HMGP-Promoter aus Reis, handelt
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid kodiert, von einer Pflanze, vorzugsweise von einer dikotylen Pflanze, stärker bevorzugt von der Familie der Brassicaceen, noch stärker bevorzugt von der Gattung Arabidopsis, am stärksten bevorzugt von Arabidopsis thaliana, stammt.
Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich mit einem Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid kodiert, umfasst.
Isoliertes Polypeptid, ausgewählt aus der Reihe: (i) Polypeptidsequenz, die für ein HUB1-Protein nach Anspruch 1 oder 2 kodiert, das in seiner RING-Domäne eine oder mehr Mutationen umfasst, die im Wesentlichen die Cofaktorbindung in den Zn-Bindungsstellen verhindern, und wobei die eine oder mehr Mutationen die Autopolyubiquitinierung verringern, ohne dabei die Substratubiquitinierung zu beeinflussen; (ii) HUB1-Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO.: 28; (iii) Polypeptidsequenz mit mit steigernder Bevorzugung mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.: 28 und umfassend eine RING-Domäne, die eine oder mehr Mutationen gemäß (i) umfasst; (iv) funktionelle Fragmente von einer beliebigen der Aminosäuresequenzen gemäß (I), (ii) oder (iii) oben, mit der Maßgabe, dass das funktionelle Fragment eine RING-Domäne umfasst, die eine oder mehr Mutationen gemäß (I) umfasst.
Isolierte Nukleinsäure, ausgewählt aus der Reihe: (i) isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für ein HUB1-Polypeptid nach (i) bis (iv) in Anspruch 12 kodiert; (ii) Nukleinsäure, die fähig ist, unter stringenten Bedingungen mit dem Komplement einer isolierten Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid gemäß (I) bis (iv) von Anspruch 12 kodiert, zu hybridisieren; (iii) isolierte Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO.: 49.
Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid gemäß den Ansprüchen 1, 2 oder 12 kodiert, oder Nukleinsäure gemäß Anspruch 13; (ii) eine oder mehr mittelstarke Kontrollsequenzen, die fähig sind, die Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) voranzutreiben; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
Konstrukt nach Anspruch 14, wobei eine der mittelstarken Kontrollsequenzen ein konstitutiver Promoter, vorzugsweise ein HMGP-Promoter, am stärksten bevorzugt ein HMGP-Promoter aus Reis, ist.
Verwendung eines Konstrukts nach Anspruch 14 oder 15 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit einer oder mehr der Eigenschaften gesteigerte Keimkraft, gesteigerte Jungpflanzenvitalität und gesteigerter Ertrag, verglichen mit Kontrollpflanzen.
Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die/der mit einem Konstrukt nach Anspruch 14 oder 15 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit verbesserten Wachstumseigenschaften, insbesondere gesteigerter Keimkraft, gesteigerter Jungpflanzenvitalität und/oder gesteigertem Ertrag, verglichen mit Kontrollpflanzen, das Folgendes umfasst (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 kodiert, in eine(r) Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die Pflanzenwachstum und Pflanzenentwicklung fördern.
Transgene Pflanze mit verbesserten Wachstumseigenschaften, insbesondere gesteigerter Keimkraft, gesteigerter Jungpflanzenvitalität und/oder gesteigertem Ertrag, verglichen mit Kontrollpflanzen, als Ergebnis der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 kodiert, oder transgene Pflanzenzelle, die von der transgenen Pflanze abstammt.
Transgene Pflanze nach Anspruch 11, 17 oder 19, oder transgene Pflanzenzelle, die davon abstammt, wobei es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze oder eine monokotyle Pflanze oder um ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Spelz, Roggen, Einkorn, Teff, Milo und Hafer handelt.
Erntbare Teile einer Pflanze nach Anspruch 20, wobei es sich bei den erntbaren Teiten vorzugsweise um Sprossbiomasse und/oder Samen handelt.
Produkte, die von einer Pflanze nach Anspruch 20 und/oder von erntbaren Teilen einer Pflanze nach Anspruch 21 abstammen.
Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein HUB1-Polypeptid kodiert, bei der Verbesserung von Wachstumseigenschaften, insbesondere der Steigerung der Keimkraft, der Steigerung der Jungpflanzenvitalität und/oder der Steigerung des Ertrags, verglichen mit Kontrollpflanzen.
Verfahren zum Modifizieren eines lichtregulierten Phänotyps bei einer Pflanze, umfassend das Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein HUB1-Potypeptid kodiert, in einer Pflanze.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei es sich bei dem lichtregulierten Phänotyp um einen oder mehr der Folgenden handelt: (a) modifizierte circadiane Uhr (b) Output-Reaktion der modifizierten circadianen Uhr.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei es sich bei der Output-Reaktion der modifizierten circadianen Uhr um eine oder mehr der Folgenden handelt: (a) modifizierte Photosynthesekapazität; (b) veränderte Expression von Entwicklungsgenen; (c) veränderte Pflanzenentwicklung.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei die modifizierte Photosynthesekapazität eine modifizierte Konzentration von Photosynthesepigmenten und/oder eine modifizierte Plastidenstruktur umfasst.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei es sich bei den Entwicklungsgenen um eine oder mehr der Sequenzen gemäß Tabelle H oder ein Ortholog davon handelt.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei die veränderte Pflanzenentwicklung eine veränderte Architektur und/oder eine veränderte Blütezeit umfasst.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei die veränderte Architektur eine oder mehr der Folgenden umfasst: modifizierte Hypokotyllänge, modifizierte Blattmorphologie und modifizierte Blütenmorphologie.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei der modifizierte circadiane Rhythmus die modifizierte Expression einer Nukleinsäure, die für ein Protein gemäß Tabelle G kodiert oder die für ein Ortholog solch eines Proteins kodiert, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Gene diurnal reguliert sind.
Verfahren zum Synchronisieren der Transkription von Genen, umfassend das Modulieren der Expression von HUB1.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei die Gene Gene, die an der Photosynthese, an der circadianen Uhr und/oder an der Entwicklung beteiligt sind, umfassen.
Verwendung von HUB1 als Transkriptionsregulator für die Synchronisierung der Transkription von Genen.
Verwendung nach Anspruch 35, wobei die Gene Gene, die an der Photosynthese, an der circadianen Uhr und/oder an der Entwicklung beteiligt sind, umfassen.
Verfahren zum Modifizieren von Pflanzenwachstumseigenschaften verglichen mit Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein Protein ausgewählt aus einer der Tabellen G bis K kodiert, oder die für ein Ortholog dieses Proteins kodiert, in einer Pflanze, wobei die Pflanzenwachstumseigenschaften gesteigerten Ertrag und/oder gesteigerte Stressresistenz umfassen.
Verfahren nach Anspruch 37, wobei die Expression eine gesteigerte Expression ist.
Verfahren nach Anspruch 37, wobei die Expression eine verringerte Expression ist.
Verfahren nach Anspruch 37, wobei die modifizierten Wachstumseigenschaften gesteigerten Ertrag, gesteigerte Stressresistenz und/oder modifizierte Architektur umfassen.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei der gesteigerte Ertrag gesteigerten Biomasseertrag und/oder gesteigerten Samenertrag umfasst.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei es sich bei der gesteigerten Stressresistenz um eines oder mehr der folgenden Merkmale handelt: gesteigerte Trockenstressresistenz, gesteigerte Salzstressresistenz, gesteigertes Wachstum unter Nährstoffmangelbedingungen.