JP2002512035A - 増加した数の気孔を有する植物を産生する方法におけるポリヌクレオチド配列およびその使用 - Google Patents

増加した数の気孔を有する植物を産生する方法におけるポリヌクレオチド配列およびその使用

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Abstract

(57)【要約】 コントロール植物に比べて増加した数の気孔を有する植物を産生する方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）植物材料において転写因子の１４−３−３クラスの合成を刺激する脂肪酸の産生を阻害するか、あるいはさもなければ、脂肪酸がこの因子の合成を刺激することを防止する工程；（ｉｉ）このように阻害された材料を選択する工程；および（ｉｉｉ）このように選択された材料を植物体へと再生する工程。阻害は、０．１％ ＳＤＳを含む０．３強度のクエン酸緩衝化生理食塩水中で６０℃と６５℃との間の温度にてインキュベートされ、続いて０．１％ ＳＤＳを含む０．３強度のクエン酸緩衝化生理食塩水を用いて同じ温度でリンスされた場合に、配列番号１に示される配列となおハイブリダイズする配列と相補的な配列を含む内因性遺伝子のセンスコサプレッションまたはアンチセンス阻害によって達成され得る。この方法における使用に好ましい配列が、配列番号１および２として示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、特に、遺伝子操作した植物に関する。詳細には、本発明は、形質転
換されていない（先行技術の）同種植物に比べて増加した数の気孔を保有する植
物を産生する方法におけるポリヌクレオチド配列、およびその使用に関する。適
切な条件下では、本発明の植物は、先行技術の植物と比較して増加した収量を示
し得る。本発明はまた、新規な調節配列を提供する。
【０００２】 英国において、多くの商業栽培者は、天然ガス、灯油バーナーまたは液体二酸
化炭素を使用して、温室中の二酸化炭素のレベルを増加させる。温室作物に対す
る利点は、低い外部の冬の光において、品質、収量の増大および生長を最大限に
することの増加を含む。しかし、長期間の栽培の間、収穫量についての最大限の
潜在的利点は、この手順によっては達成されない。光合成の馴化を含む多数の生
理学的および生化学的要因は、この現象に寄与すると考えられている。しかし、
比較的わずかな注意しか向けられていない１つの重要な因子は、気孔の孔辺細胞
における高い二酸化炭素の効果である。二酸化炭素は、気孔の孔の直径を減少さ
せるのみならず、また、孔辺細胞の発生に影響し、特に、二酸化炭素濃度の上昇
での葉の生長の際に発生する気孔の数を減少させる。これらの要因は、拡散抵抗
性の増加および二酸化炭素の取り込みの減少をもたらすと予測される。温室で生
長したレタス、ナス、シシトウガラシ、キュウリおよびトマトの場合、これは実
際の問題となる。次に、二酸化炭素の取り込みの減少は、収量の減少としてそれ
自体が顕れると予測される。
【０００３】 温室栽培者にとって別の等しく重要な問題は、一般的に近代の省エネルギー実
施の使用および高い二酸化炭素環境の維持の結果として生じる、高レベルの湿度
によって引き起こされる作物の損傷である。この問題の深刻さを例示するために
、高湿度で生長したトマト作物は通常、１０〜１５％果実収量が減少することが
推定され、そして高湿度の条件を維持すると、３５％の収量の減少が記録されて
いる。高湿度で栽培されたキュウリおよび旬が長いトマト（ｌｏｎｇ ｓｅａｓ
ｏｎ ｔｏｍａｔｏ）では、蒸散は抑制され、それにより栄養素（特にカルシウ
ム）の取り込みが減少し、葉焼けの症状および有効葉面積および実際の葉面積の
減少を生じる。カルシウム欠乏の場合、関連する組織壊死は、作物を、病原体の
攻撃に対して特に感受性にし、作物の能力のさらなる減少を生じる。トマトの場
合、高湿度での栽培は、果実の低収量および質の低下をもたらす。平均湿度より
高い湿度もまた、作物の質に影響を及ぼし得る特定の病害虫の繁殖を招く環境を
提供する。それゆえ、これらの病害虫および増加した二酸化炭素レベルからの結
果である有害効果を制御することは有益である。当然のことながら、高い二酸化
炭素での生長に関連する気孔の抵抗性の付随する増加に起因して、上記の問題の
全ては、悪化するようである。
【０００４】 本発明は、その葉の表面の気孔の数を増加させることによって、二酸化炭素濃
度の上昇に特に応答する植物を提供することにより、上述の問題を軽減する。他
の限定要因が存在しない場合、このことは、光合成のための二酸化炭素の取り込
みを増加し、そして水の損失のためにより広い有効表面領域を存在させて蒸散の
増加をもたらし、それによりカルシウム欠乏を相殺すると予測される。コムギ、
オオムギ、イネおよびインゲンマメにおける炭素同位体の識別研究からのデータ
は、より低い気孔の抵抗性を有する表現型がより収量が高いことを示す。
【０００５】 本発明はまた、ポリヌクレオチド配列およびその改変体に関し、これらは、特
に気孔の孔辺細胞における遺伝子発現を調節し得る。
【０００６】 植物における遺伝子の発現は、多数の調節成分（核酸およびタンパク質エレメ
ントを含む）によって制御される。植物遺伝子が二本鎖ＤＮＡとして存在する場
合、発現の一次工程は、ポリメラーゼ酵素によるメッセンジャーＲＮＡの生成に
関与する。発現プロセスのこの部分の開始は、通常「プロモーター」と一般的に
いわれる領域によって制御される。このプロモーターは、タンパク質コード領域
の上流（５’）に位置し、そして構成性または組織特異的、発生的調節性、およ
び／または誘導性であり得る。
【０００７】 プロモーター領域内では、プロモーターの完全な機能に必要ないくつかのドメ
インが存在する。これらのドメインの第１は、構造遺伝子のすぐ上流に位置し、
そして、通常、遺伝子のすぐ上流の７０塩基対であるコンセンサス配列を含む「
コアプロモーター領域（ｃｏｒｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ）」を形成
する。コアプロモーター領域は、特徴的なＣＡＴＴおよびＴＡＴＡボックスに加
えて周辺配列（ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含み、そして構
造遺伝子についての転写開始点を規定する転写開始配列を提示する。コアプロモ
ーター領域の正確な長さは不明瞭であるが、通常は容易に認識可能である。この
ような領域は通常、全てのプロモーター中に、いくつかの変動を伴って存在する
。様々な十分特徴付けられた「ボックス」の間に位置する塩基配列は、あまり重
要ではないようである。
【０００８】 コアプロモーター領域の存在は、配列がプロモーターであることを規定する：
この領域が存在しない場合、このプロモーターは非機能的である。さらに、コア
プロモーター領域は、完全なプロモーター活性を提供するには不充分である。一
連の調節配列（通常、コアの上流）は、プロモーターの残りを構成する。調節配
列は、発現レベル、発現の空間的および時間的パターン、ならびにプロモーター
の重要なサブセット、誘導条件下（光、温度、化学物質、ホルモンのような外部
要因による調節）での発現について決定する。
【０００９】 表現形特徴（例えば、生産性品質または収量）を変更および／または改良する
ように作物植物を操作することは、植物組織における異種遺伝子の発現を必要と
し得る。それゆえ、このような遺伝子操作は、必要な遺伝子の発現を駆動しかつ
制御する手段の利用能（例えば、植物において有効であり、遺伝子発現を調節し
てトランスジェニック植物に所望の効果を与える適切なプロモーターの利用能お
よび使用）に頼る。最も適切なプロモーターが特定の遺伝子、構築物、細胞、組
織、植物または環境について選択され得るように、種々の異なるプロモーターを
選択することは有用である。
【００１０】 細菌、ウイルス、真菌および植物由来のプロモーター（および他の調節成分）
は、植物細胞における遺伝子発現を制御するために使用されている。様々な外来
遺伝子（例えば、細菌のマーカー遺伝子）に融合された様々なプロモーター配列
を含むＤＮＡ構築物を使用する多くの植物形質転換実験は、有用なプロモーター
配列の同定をもたらした。ほとんどの例で、５００〜１０００塩基までの配列が
、外来遺伝子の発現の調節を可能にするに十分であることが実証されている。し
かし、１ｋｂよりずっと長い配列が、トランスジェニック植物における高いレベ
ルの遺伝子発現を可能にするという有用な特徴を有し得ることもまた示されてい
る。一定範囲の天然に存在するプロモーターは、植物において作動可能であるこ
とが公知であり、そして植物における異種（外来および内因性の両方）遺伝子の
発現を駆動するために使用されている；例えば、構成性３５Ｓカリフラワーモザ
イクウイルスプロモーター、成熟を増強したトマトのポリガラクツロナーゼプロ
モーター（Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，１１：６５１−６６２）、Ｅ８プロモーター（ＤｉｅｋｍａｎおよびＦ
ｉｓｃｈｅｒ，１９８８，ＥＭＢＯ，７：３３１５−３３２０）および果実特異
的２Ａ１１プロモーター（Ｐｅａｒら、１９８９、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３：６３９−６５１）など。
【００１１】 本発明に従って、以下の工程を包含する、コントロール同種植物に比べて増加
した数の気孔を有する植物を産生する方法が提供される：（ｉ）植物材料におい
て転写因子の１４−３−３クラスの合成を刺激する脂肪酸の産生を阻害するか、
あるいはさもなければ、脂肪酸がこの因子の合成を刺激することを防止する工程
；（ｉｉ）このように阻害された材料を選択する工程；および（ｉｉｉ）このよ
うに選択された材料を植物体へと再生し、そして再生体の集団から、コントロー
ル同種植物に比べて増加した数の気孔を有する再生植物を選択する工程。
【００１２】 本発明はさらに、以下の工程を包含する、コントロール同種植物に比べて増加
した数の気孔を有する植物を産生する方法が提供する：（ｉ）配列番号１または
配列番号２または配列番号８に示されるポリヌクレオチド配列を含む内因性遺伝
子の機能を阻害するか、あるいはさもなければ、この内因性遺伝子の活性を破壊
する工程；（ｉｉ）上記のように阻害された材料を選択する工程；（ｉｉｉ）上
記のように選択された材料を植物体へと再生し、そして再生体の集団から、コン
トロール同種植物に比べて増加した数の気孔を有する再生植物を選択する工程。
【００１３】 上記のような本発明の方法の実施において、内因性遺伝子は、０．１％ ＳＤ
Ｓを含む０．３強度のクエン酸緩衝化生理食塩水中で６０℃と６５℃との間の温
度にてインキュベートされ、続いて０．１％ ＳＤＳを含む０．３強度のクエン
酸緩衝化生理食塩水を用いて同じ温度でリンスされた場合に、配列番号１または
配列番号２または配列番号８に示される配列となおハイブリダイズする配列と相
補的なポリヌクレオチド配列を含み得る。
【００１４】 以下の工程を包含する、コントロール同種植物に比べて増加した数の気孔を有
する植物を産生する方法もまた提供される：（ｉ）植物材料を、配列番号１また
は配列番号２または配列番号８に示される配列を含むポリヌクレオチドを用いて
形質転換する工程；（ｉｉ）上記のように形質転換された材料を選択する工程；
（ｉｉｉ）上記のように選択された材料を植物体へと再生し、そして再生体の集
団から、コントロール同種植物に比べて増加した数の気孔を有する再生植物を選
択する工程。
【００１５】 上記の方法において使用されるポリヌクレオチドは、０．１％ ＳＤＳを含む
０．３強度のクエン酸緩衝化生理食塩水中で６０℃と６５℃との間の温度にてイ
ンキュベートされ、続いて０．１％ ＳＤＳを含む０．３強度のクエン酸緩衝化
生理食塩水を用いて同じ温度でリンスされた場合に、配列番号１または配列番号
２または配列番号８に示される配列となおハイブリダイズする配列と相補的なポ
リヌクレオチド配列を含み得る。この方法において使用されるポリヌクレオチド
は、アンチセンス配向にあることが特に好ましい。増加した数の気孔を有する植
物は、形質転換されていないコントロール植物と、上記のように形質転換された
植物がともに、発芽後、以下：（ｉ）二酸化炭素濃度の上昇；（ｉｉ）カルシウ
ムの上昇；（ｉｉｉ）極端な温度または極端な圧力；（ｉｖ）水利用能の減少；
（ｖ）オゾン、窒素酸化物または硫黄酸化物のような環境汚染気体の上昇、およ
び（ｖｉ）光条件の上昇、の少なくとも１つに供される場合に、形質転換されて
いないコントロール植物と、上記のように形質転換された植物との間の差異に基
づいて選択され得る。好ましくは、二酸化炭素濃度は、約４５０百万分率（ｐｐ
ｍ）より高い。より好ましくは、二酸化炭素濃度は、約５５０百万分率より高い
。より好ましくは、二酸化炭素濃度は、約６５０百万分率より高い。
【００１６】 本発明はまた、上記の材料から再生されてコントロール同種植物に比べて増加
した数の気孔を有する、形態学的に正常な稔性の全植物体ならびにその種子およ
び後代を提供する。本発明の方法に従って形質転換された植物としては、以下が
挙げられ得る：ダイズ、ワタ、タバコ、テンサイ、アブラナ、カノラ（ｃａｎｏ
ｌａ）、アマ、ヒマワリ、ジャガイモ、トマト、アルファルファ、レタス、トウ
モロコシ、コムギ、モロコシ、ライムギ、バナナ、オオムギ、オートムギ、芝草
（ｔｕｒｆ ｇｒａｓｓ）、牧草（ｆｏｒａｇｅ ｇｒａｓｓ）、サトウキビ、
エンドウ、野生のマメ（ｆｉｅｌｄ ｂｅａｎ）、イネ、マツ、ポプラ、リンゴ
、ブドウ、つる植物（ｖｉｎｅｓ）、キュウリ、コショウ、柑橘類および堅果植
物。
【００１７】 本発明はさらに、コントロール同種植物に比べて増加した数の気孔を有する植
物を産生する方法における、配列番号１または配列番号２または配列番号８とし
て示される配列を含むポリヌクレオチドの使用を提供する。この方法において使
用され得る他のポリヌクレオチドは、０．１％ ＳＤＳを含む０．３強度のクエ
ン酸緩衝化生理食塩水中で６０℃と６５℃との間の温度にてインキュベートされ
、続いて０．１％ ＳＤＳを含む０．３強度のクエン酸緩衝化生理食塩水を用い
て同じ温度でリンスされた場合に、配列番号１または配列番号２または配列番号
８に示される配列となおハイブリダイズする配列と相補的な配列を含み得る。こ
の方法において使用するためのポリヌクレオチドは、植物の作動可能なプロモー
ターの発現制御下にあり得、かつこのポリヌクレオチドのタンパク質コード領域
の下流に転写終結領域をさらに含み得る。詳細には、以下のプロモーターが使用
され得る：ＣａＭＶ３５Ｓ；ＦＭＶ３５Ｓ；ＮＯＳ；ＯＣＳおよびＥ９。より好
ましくは、プロモーターは、気孔の孔辺細胞特異的プロモーターであり得る。さ
らにより好ましくは、このプロモーターは、配列番号２または配列番号８に示さ
れるポリヌクレオチド配列によって含まれ得る。
【００１８】 配列番号２または配列番号８として示される配列を含む単離されたポリヌクレ
オチドもまた提供される。
【００１９】 本発明はなおさらに、配列番号２または配列番号８として示される配列を含む
発現調節配列を提供する。驚くべきことに、この配列は、気孔の孔辺細胞におけ
る異種遺伝子の発現を提供し得ることが見出された。本発明において提供される
調節配列は、上記のポリヌクレオチドおよび方法と組み合わせて使用され得る。
しかし、当業者は、これらの調節配列が、転写が特に気孔の孔辺細胞において必
要である場合、任意の方法において、任意の他のポリヌクレオチドと組み合わせ
て使用され得ることを認識する。
【００２０】 本発明に従って、０．１％ ＳＤＳを含む０．３強度のクエン酸緩衝化生理食
塩水中で６０℃と６５℃との間の温度にてインキュベートされ、続いて０．１％
ＳＤＳを含む０．３強度のクエン酸緩衝化生理食塩水を用いて同じ温度でリン
スされた場合に、配列番号１に示される配列となおハイブリダイズするが、この
温度が６５℃と７０℃との間である場合には上記のようにはハイブリダイズしな
い配列と相補的な配列を含むポリヌクレオチドがさらに提供される。このポリヌ
クレオチドは、二酸化炭素濃度の上昇の条件に供される場合に、気孔指数（ｓｔ
ｏｍａｔａｌ ｉｎｄｅｘ）（下記）を減少するよりはむしろ増加する植物を産
生するために使用され得る。
【００２１】 このポリヌクレオチドは、配列番号２または配列番号８に示される配列を含み
得る。このポリヌクレオチドによって含まれるタンパク質コード領域は、植物の
作動可能なプロモーターおよびターミネーターによって結合され得る。このよう
なプロモーターおよびターミネーター（これらは、それ自体、本発明とは密接に
関係しない）は、当業者に周知であり、そして例えば、ＣａＭＶ３５Ｓ、ＦＭＶ
３５Ｓ、ＮＯＳ、ＯＣＳおよびＥ９（ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットに由来す
る）プロモーターおよびターミネーターが挙げられる。しかし、本発明に従うポ
リヌクレオチドのタンパク質コード領域は、気孔の孔辺細胞特異的プロモーター
の発現制御下にあることが、特に好ましい。当業者は、用語「特異的」が、「〜
に単に制限される」ことを意味する必要はなく、上記の配列の発現が、このよう
な領域を含むように形質転換された材料から再生された植物内の他のいずれの箇
所でも見出され得ないということを理解する。
【００２２】 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む植物形質転換ベクターを含む
。
【００２３】 このベクター中には、タンパク質コード領域（またはその実質的な部分）が、
配列番号１、２、および８に示される配列と比較した場合に、アンチセンス方向
で存在し得、その結果、この領域のＲＮＡ産物は（それを含む植物材料において
）、このタンパク質コード領域が実質的に同一性を示す、内因性遺伝子の抑制を
引き起こし得る。「実質的に」によって、配列に関して、少なくとも７０％同一
であることが意味される。
【００２４】 本発明はさらに、特に、本発明のポリヌクレオチドが脂肪酸エロンガーゼ（ｅ
ｌｏｎｇａｓｅ）の活性を有する場合、本発明のポリヌクレオチドによってコー
ドされる翻訳産物を提供する。
【００２５】 本発明はなお、さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはベクター、または
０．１％ ＳＤＳを含む０．３強度のクエン酸緩衝化生理食塩水中で６０℃〜６
５℃の間の温度でインキュベートし、続いて０．１％ ＳＤＳを含む０．３強度
のクエン酸緩衝化生理食塩水を用いて同じ温度でリンスした場合に、配列番号１
に記載の配列と、なおハイブリダイズする配列に相補的な配列を含む、ポリヌク
レオチドで形質転換した植物材料を提供する。
【００２６】 植物材料は、除草剤、昆虫、乾燥、および／または真菌感染、細菌感染、もし
くはウイルス感染に抵抗性あるいは耐性を有する植物を提供し得るタンパク質を
コードする領域を含むポリヌクレオチドを用いて、形質転換され得たか、または
引き続いてさらに形質転換され得る。
【００２７】 除草剤抵抗性を提供し得るタンパク質は、グリホサートオキシドレダクターゼ
（ＧＯＸ）、５−エノール−ピルビル−３−ホスホシキメート（ｐｈｏｓｐｈｏ
ｓｈｉｋｉｍａｔｅ）シンテターゼ（ＥＰＳＰＳ）、フォスフィノトリシン（ｐ
ｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）、ヒ
ドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）、グルタチオン Ｓ
トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、シトクロムＰ４５０、アセチル−ＣＯＡカル
ボキシラーゼ（ＡＣＧａｓｅ）、アセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）、プロ
トポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＲＯＴＯＸ）、ジヒドロプテロエート（
ｄｉｈｙｄｒｏｐｔｅｒｏａｔｅ）シンターゼ、ポリアミン輸送タンパク質、ス
ーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ブロモキシニルニトリラーゼ、フィト
エンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ
から得られ得るｔｆｄＡ遺伝子の産物、およびこれらのタンパク質の公知の変異
誘発された改変体またはさもなくば修飾された改変体からなる群より選択され得
る。
【００２８】 植物材料を形質転換し得るポリヌクレオチドは、以下をコードする５’タンパ
ク質コード領域を含み得る：（ｉ）葉緑体のような色素体、ミトコンドリア、他
のオルガネラもしくは植物細胞壁に対してその領域の翻訳産物を標的し得るペプ
チド；および／または（ｉｉ）非翻訳翻訳増強配列。
【００２９】 ポリヌクレオチドは、一旦植物材料に組み込まれると、コドンを最適化され得
るか、またはさもなくば少なくとも転写を増強するために改変され得る。従って
、植物材料を形質転換するために使用されるポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡの不
安定性をコードするモチーフおよび／または偶然のスプライス領域が除去され得
るか、あるいは植物に好ましいコドンが使用され得るという点で修飾され得、そ
の結果、植物におけるこのように修飾されたポリヌクレオチドの発現が、植物に
おいて非修飾ポリヌクレオチドの発現によって得られる活性／機能に対して実質
的に類似の活性／機能を有する実質的に類似のタンパク質を産生する。この生物
において、非修飾のポリヌクレオチドのタンパク質のコード領域は内因性である
が、ただし、除草剤抵抗性を付与する領域に関して、このように修飾されたポリ
ヌクレオチドが植物に好ましいコドンを含む場合、修飾されたポリヌクレオチド
中のタンパク質コード領域と、その植物中に内因的に含まれ、そして実質的にそ
の同じタンパク質をコードする同種のタンパク質コード領域との間の同一性の程
度は、約７０％未満である。
【００３０】 形質転換技術は周知であり、そして粒子が媒介する微粒子銃形質転換、Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換、プロトプラスト形質転換（必要に応じてポ
リエチレングリコールの存在下で行う）；ポリヌクレオチドまたはベクターを含
む培地中での植物組織、植物細胞、またはプロトプラストの超音波処理；全能性
植物材料への、ポリヌクレオチドまたはベクターの微小挿入（必要に応じて、公
知のシリコンカーバイド「ホイスカー（ｗｈｉｓｋｅｒ）」技術を利用する）、
エレクトロポレーションなどを含む。
【００３１】 本発明はなお、さらに、この段落の最後の直前において言及される材料から再
生された、形態学的に正常な稔性の全植物体、ならびにそのような植物の後代、
このような植物および後代の種子、ならびにこのような植物および後代の部分を
提供する。形質転換された本発明の植物は、小さい穀粒、脂肪種子作物、繊維植
物、果物、野菜、プランテーション作物および木を含む。特に好ましいそのよう
な植物としては、ダイズ、ワタ、タバコ、テンサイ、アブラナ、カノラ、アマ、
ヒマワリ、ジャガイモ、トマト、アルファルファ、レタス、トウモロコシ、コム
ギ、モロコシ、ライムギ、バナナ、オオムギ、オートムギ、芝草、牧草、サトウ
キビ、エンドウ、野生のマメ、イネ、マツ、ポプラ、リンゴ、ブドウ、キュウリ
、コショウ、柑橘類、および堅果の植物を含む。特に好ましい部分は、切り花を
含む。
【００３２】 本発明はなお、さらに、以下の工程を包含する、コントロール植物と比較して
気孔の数が増加した植物を産生する方法を提供する： （ｉ）植物材料において、１４−３−３クラスの転写因子の合成を刺激する脂
肪酸の産生を阻害するか、または、さもなくばこの脂肪酸がこの因子の合成を刺
激することを妨害する工程； （ｉｉ）このように阻害された材料を選択する工程；および （ｉｉｉ）このように選択された材料を植物に再生する工程。
【００３３】 本方法の好ましい実施態様において、転写因子の合成を刺激するか、または、
さもなくばそれを増強する脂肪酸の産生は、脂肪酸の生合成経路に関与するタン
パク質をコードする内因性植物遺伝子のセンスのコサプレッションによってか、
さもなければ同じ遺伝子の発現のアンチセンス阻害によってのいずれかで阻害さ
れる。アンチセンス阻害技術は、当業者によって周知であり、開発され、そして
慣用的に使用される。通常、その阻害技術は、内因性遺伝子によって産生される
センスｍＲＮＡと相補的であり、そしてそれとハイブリダイズし得るアンチセン
スｍＲＮＡの産生を通して植物中にもたらされる。
【００３４】 本発明の方法は、以下の工程を含み得る： （ｉ）０．１％ ＳＤＳを含む０．３強度のクエン酸緩衝化生理食塩水中で６
０〜６５℃の間の温度でインキュベートし、続いて０．１％ ＳＤＳを含む０．
３強度のクエン酸緩衝化生理食塩水を用いて同じ温度でリンスした場合に、配列
番号１に記載の配列となおハイブリダイズする配列に相補的である配列を含む内
因性植物遺伝子の機能を阻害するか、または、さもなくばその活性を破壊する工
程； （ｉｉ）このようにして阻害された材料を選択する工程； （ｉｉｉ）このようにして選択された材料を植物に再生する工程。
【００３５】 本発明の植物は、代表的には、先行技術の同種の植物よりも、少なくとも１０
％多い気孔を含む。これらが少なくとも１５％多い気孔を含むことが好ましく、
これらが少なくとも２０％多い気孔を含むことがより好ましく、これらが少なく
とも２５％多い気孔を含むことがなおより好ましく、そしてこれらが少なくとも
３０％多い気孔を含むことがなおさらにより好ましい。
【００３６】 当業者は、遺伝子の機能を阻害またはさもなくば破壊する多くの方法が存在す
ることを理解している。センスのコサプレッションおよびアンチセンス阻害は、
特に好ましい技術であるが、それはまた、内因性遺伝子のインサイチュ変異誘発
のいわゆるキメラ形成（ｃｈｉｍｅｒｏｐｌａｓｔｙ）技術を使用することもま
た可能である。この技術それ自体は、本発明に密接な関係はないが、手短には、
これは、相補性の領域中には、ＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ複製酵素の作用を介
して内因性遺伝子において表されるようにする「ミスマッチ」が存在するという
条件で、内因性遺伝子の標的配列に相補的な領域（代表的には、１００ヌクレオ
チド長未満）を含む、混合されたリボ−デオキシリボ核酸の植物材料への導入を
含む。このミスマッチは、代表的には、酵素の活性部位をコードする遺伝子の領
域内に存在し、その活性は、結果的に、破壊されるかまたは少なくとも厳しく削
減される。次に要約すると、一旦サイレントにさせるための内因性遺伝子が同定
されると、任意の遺伝子抑制技術が適用され得る。さらに、当業者はまた、所望
の遺伝子の抑制の効力を増強するために、当該分野で利用可能な技術を使用する
ことは自由である。そのような方法は、逆方向反復配列の使用を含み、そして国
際特許出願、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／５３０８３（これは、本明細書中で参考
として援用される）に記載される。
【００３７】 しかし、本発明の方法の実施において、当業者は、０．１％ ＳＤＳを含む０
．３強度のクエン酸緩衝化生理食塩水中で６０〜６５℃の間の温度でインキュベ
ートし、続いて０．１％ ＳＤＳを含む０．３強度のクエン酸緩衝化生理食塩水
を用いて同じ温度でリンスした場合に、配列番号１に記載の配列となおハイブリ
ダイズする配列に相補的である配列を含むポリヌクレオチドを用いて植物材料を
形質転換することを選択し得る。あるいは、この植物材料は、０．１％ ＳＤＳ
を含む０．３強度のクエン酸緩衝化生理食塩水中で６０〜６５℃の間の温度でイ
ンキュベートし、続いて０．１％ ＳＤＳを含む０．３強度のクエン酸緩衝化生
理食塩水を用いて同じ温度でリンスした場合に、配列番号１に記載の配列となお
ハイブリダイズするが、この温度が６５〜７０℃の間の場合は、そのようにハイ
ブリダイズしない配列に相補的である配列を含むポリヌクレオチドを用いて形質
転換され得る。本方法における使用のために特に好ましいポリヌクレオチドは、
配列番号２または配列番号８に記載の配列を含む。
【００３８】 気孔の数が増加した植物は、非形質転換コントロール植物およびそのように形
質転換した植物の両方が発芽後に少なくとも以下のうちの１つに供せられた場合
に、これらの非形質転換コントロール植物とそのように形質転換した植物との間
の差異に基づいて選択され得る：（ｉ）二酸化炭素濃度の上昇、（ｉｉ）カルシ
ウムの上昇；（ｉｉｉ）極端な温度または圧力；（ｉｖ）水の利用能の減少；（
ｖ）環境汚染気体（例えば、オゾン、窒素酸化物、または硫黄酸化物）の上昇；
（ｖｉ）光条件の上昇。この差異は、（ｉ）開花の遅延；（ｉｉ）成長特性の変
化；および（ｉｉｉ）気孔指数の上昇からなる群より選択され得る。あるいは、
その植物は、抗生物質に対する耐性に基づいて選択され得る。その耐性は、気孔
の数を増加させ得る遺伝子とともに植物材料に同時導入された、抗生物質耐性を
付与する遺伝子によって産生される。当業者は、用語「気孔」指数を承知してい
る。これは、（例えば）その領域内に含まれる細胞の総数のパーセンテージとし
て表される場合に、本質的に、１枚の葉の特定の領域における気孔の数である。
気孔指数は、以下のように定義され得る： ＳＩ＝気孔頻度／表皮細胞頻度＋気孔頻度 × １００。
【００３９】 本発明はまた、植物−およびその後代−を含み、それは結局は本発明の植物の
、コントロールの非形質転換の性的に適合性の植物との交雑から生じる。その植
物または後代は、導入遺伝子についてホモ接合性であり得る。
【００４０】 本発明はなお、さらに、上記に開示した方法より生じる植物、そのような植物
の後代、そのような植物および後代の種子、ならびにそのような植物および後代
の部分を含む。特に好ましい部分は、果実、花卉、および種子である。
【００４１】 本発明はなお、さらに、非形質転換コントロール植物と比較して気孔の数の増
加を有する植物の産生のための方法における、本発明のポリヌクレオチドまたは
ベクターの使用を含む。
【００４２】 本発明は、関連する図面および配列表と総合して、以下の記載からさらに明白
となる。
【００４３】 配列番号１は、種子中で発現される、ＦＡＥ−１と呼ばれる脂肪酸エロンガー
ゼ遺伝子の配列を示す。配列番号１は、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、第７巻
、１９９５の３１６頁に見い出され得る。
【００４４】 配列番号２は、配列番号１に記載の配列に関連し得るが、しかしそれから明白
に由来するものではない遺伝子の配列を表す。
【００４５】 配列番号３および４は、ベクターｐＦＬ３０およびベクターｐＦＬ４４の供給
において使用されたＰＣＲプライマーを表す。
【００４６】 配列番号５および６は、ＧＵＳ遺伝子プライマーを表す。
【００４７】 配列番号７は、ｐｆｕポリメラーゼとともに使用するためのプライマーを表す
。
【００４８】 配列番号８は、配列番号２に記載の配列に関連し得るが、しかしそれから明白
に由来するものではない遺伝子の配列を表す。
【００４９】 （実施例） 本実施例は、気孔の数の制御に関与する遺伝子の供給を例証する。この遺伝子
を、最初に、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ生態型Ｃ２４中でのプロモータートラップ
スクリーニングを通して単離した。このトラップされた構築物、ｐＭＯＧ５５３
は、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｙｇ）に連結され
たβグルクロニダーゼ酵素合成遺伝子（ＧＵＳ）の転写された配列からなり、両
方の遺伝子はＥ．ｃｏｌｉ由来であった。「トラップされた」内因性プロモータ
ーを通してのこの構築物の発現は、ＧＵＳ活性についての染色および変異体の単
離のための抗生物質選択マーカーを通して、遺伝子発現の位置決めを可能にした
。ＧＵＳレポーター遺伝子に基づいて、孔辺細胞特異的発現を示す初代変異体（
Ｍ１）植物（それおよびその後代を、本明細書以下でＴａｇ５９０と名付ける）
が同定され、これは、孔辺細胞特異的遺伝子が破壊されたことを示した。
【００５０】 （Ｔａｇ５９０植物の供給） Ｇｏｄｄｉｊｎら（Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊ．４（５）、８６３−８７３、１
９９３）は、タギング構築物ｐＭＯＧ５５３（Ｔ−ＤＮＡ上のプロモーターのな
いＧＵＳ）の産生を記載する。ｐＭＯＧ５５３は、図２に模式的に示される。こ
の参考文献はまた、この構築物を用いるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａ
ｎａの形質転換を記載し、そしてＧＵＳ分析のために使用される組織化学的アッ
セイの説明を提供する。ＧＵＳ分析に関して、全体の葉（子葉を含む）または葉
の切片を、アッセイ媒体（０．１Ｍ リン酸緩衝液ｐＨ７、１０ｍＭ ＥＤＴＡ
、０．５ｍＭ フェリシアン化カリウム、０．５ｍＭ フェロシアン化カリウム
、２．０ｍＭ Ｘ−Ｇｌｕｃ（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、０．
１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中にそれらを浸すことによってＧＵＳ活性に
ついてアッセイした（Ｓｔｏｍｐ、１９９２）。大きな組織サンプルを微量遠心
管中でアッセイしたが、一方小さな実生または子葉は、マイクロタイタープレー
トのウェル中に配置した。１５分間の連続した真空浸潤後、サンプルを３７℃で
２２時間インキュベートした。葉緑素および酸化されたフェノール性化合物を取
り除くための組織の除去を、クロラールラクトフェノール（ｃｈｌｏｒａｌａｃ
ｔｏｐｈｅｎｏｌ）（ＣＬＰ）（クロラール水和物、乳酸、およびフェノール結
晶の２：１：１混合物（Ｓｉｇｍａ）、ＢｅｃｋｍａｎおよびＥｎｇｌｅｒ、１
９９４）中で、スライドをマウントするか、またはサンプルを浸すことによって
達成した。結果を、Ｆｕｊｉｃｈｒｏｍｅ Ｓｅｎｓｉａ ２００フィルムスト
リップに写真で記録した。
【００５１】 （ＧＵＳ遺伝子の経時的および空間的発現） Ｔａｇ５９０系統中のＧＵＳ発現事象は、気孔の孔辺細胞（または排水組織（
ｈｙｄａｔｏｄｅｓ））に優先的に局在した。このことは、孔辺細胞特異的遺伝
子が破壊されたことを示唆する。この標識された系統は、導入遺伝子が孔辺細胞
で独占的に発現されることを可能にする特定のプロモーターを単離する機会を提
供する。とりわけ、従って、孔辺細胞を、植物における推定のシグナル伝達遺伝
子産物の役割の分析のためのインビボモデルとして利用することが可能であり、
そして気孔細胞の挙動を操作するために、気孔細胞の遺伝子発現の操作を可能に
する。
【００５２】 全部で１２のＴａｇ５９０ Ｓ２系統を、ハイグロマイシンを用いる選択に基
づいて同定した（系統５／１〜５／１２）。次いで、系統５を使用して、上記に
述べたＧＵＳ発現の結果を確認した。組織化学的染色の強度に基づくと、発現は
、２週齢植物の最初の２つの本葉において最大であった。ＧＵＳ発現は、気孔の
孔辺細胞に局在化した。より古い葉においてＧＵＳ染色はより弱い強度で、そし
て検出のために基質中でのインキュベーションを一晩必要とした。この結果は、
発現が若い発生中の植物の孔辺細胞において最大であること、およびこの遺伝子
が、成熟植物において弱く発現されることを示し得る。あるいは、これは、成熟
植物において、ＧＵＳタンパク質がより不安定であるという事実、または孔辺細
胞は、基質により近づきにくいという事実を反映し得る。より古い葉において、
染色はまた、排水組織および維管束組織においても観察された。１２すべての系
統での引き続く実験は、系統３、９、および１１が最高レベルのＧＵＳ発現を有
したことを示した。
【００５３】 （Ｔａｇ５９０植物における破壊された遺伝子の単離） ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）をＴａｇ５９０植物材料（ロゼット葉）から単離し
た。Ｔ−ＤＮＡインサートのコピー数を、プローブとして使用されるＧＵＳ遺伝
子の５’部分を用いて、ＥｃｏＲＶ、ＭｓｃＩを使用するこのゲノムＤＮＡの制
限酵素分析によって決定した。この制限レジメは、適切な電気泳動上で単一バン
ドを生じた。逆方向ＰＣＲを、以下のＧＵＳ遺伝子プライマーを使用してＴａｇ
５９０のｇＤＮＡ上で行った（Ｂａｒｔｈｅｌｓによって記載される方法に従っ
た。この文献の第２１３１頁、図７を参照のこと）。 プライマー７：５’−ＧＴＡ．ＡＴＧ．ＣＴＣ．ＴＡＣ．ＡＣＣ．ＡＣＧ．ＣＣ
Ｇ．−３’（配列番号５） プライマー５：５’−ＣＴＴ．ＴＣＣ．ＣＡＣ．ＣＡＡ．ＣＧＣ．ＴＧＡ．ＴＣ
−３’（配列番号６）。 ＥｃｏＲＶフラグメントについては、約１．８ｋｂのバンドを得、そこからの標
識は１．６ｋｂのサイズを有した。ＭｓｃＩフラグメントについても、同じ結果
を得た。このフラグメントのｐＧＥＭＴベクター（ＰＲＯＭＥＧＡから）へのク
ローニングは、ｐＦＬ１３と呼ばれるプラスミドを生じた。図４を参照のこと。
このクローンを、部分的に配列決定し、そして１．４ｋｂのＰｓｔＩフラグメン
トを単離しそしてプローブとして使用して（図４を参照のこと）、Ｂａｒｔｈｅ
ｌｓら、１９９７ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、第９巻、２１１９〜２１３４頁に記
載される方法によって構築した野生型Ｃ２１ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのゲノム
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。３回のコロニー精製の後、５クロー
ンを単離し、そのうちの２クローンは同一であり、そしてそのうちの３つが同一
であった。５．５ｋｂフラグメントを、ｐＵＣ２８（これは、さらなるＢｇｌＩ
Ｉ制限酵素認識部位を含むように改変されたｐＵＣ１８ベクターである）のＢｇ
ｌＩＩ部位にクローニングして、ｐＦＬ３０と呼ばれるプラスミドを生じた。
【００５４】 以下のプライマーをＰＣＲフラグメントの生成において使用した。このフラグ
メントは、ｐｆｕポリメラーゼ（プルーフリーディング能を有する）を使用して
、もともとのＴＡＧ５９０由来のゲノムＤＮＡ上で生成された。次いで、このフ
ラグメントを、ｐＧＥＭＴにクローニングし、ｐＦＬ４４として標識される構築
物を作製した。 ＧＵＳ９：５’−ＣＡＧ．ＡＡＡ．ＣＴＴ．ＡＣＧ．ＴＡＣ．ＡＣＴ．ＴＴＴ．
Ｃ−３’（配列番号７） ５９０−５：５’−ＣＡＴ．ＣＴＴ．ＣＴＴ．ＣＴＡ．ＴＧＣ．ＣＴＡ．ＣＴＣ
−３’（配列番号３） ｐＦＬ４４は、任意の認識可能なプロモーター配列を含んでいないが、これは、
いくつかの組織特異的な調節エレメントを含むことを示す植物に形質転換された
場合に、特異的な発現をもたらすことが示されている。
【００５５】 ＰＣＲフラグメント（ｐＦＬ４４）を両方の鎖で完全に配列決定した。ＧＵＳ
標識は、以前にトランスポゾンタギング実験によって同定されそしてＦＡＥＩと
呼ばれるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ遺伝子に対して広範な類似性を有するが、明確
に同一でない遺伝子中に挿入されたようである。配列番号２に記載の配列は、少
なくとも２つのエキソンを含み、そして推定の翻訳開始点および翻訳終結点を有
するが、ＦＡＥＩよりも有意に短いペプチドをコードするようである（１１０お
よび１２アミノ酸がＮ末端およびＣ末端でそれぞれ欠失している）。従って、こ
のクローニングされたフラグメント中にはないさらなるコード領域が存在する可
能性がある。このＧＵＳタグは、第２のエキソンに対して３’に挿入された（推
定の翻訳終結コドンに対して３’側の１８０ｂｐ）。これは、おそらく転写され
た配列の末端に密接しているか、または択一的にはイントロン中にあるのかもし
れない。別の遺伝子が、Ｆａｅ様コード配列からのこの距離内に存在し得ること
はありそうにない。
【００５６】 ゲノムクローン（ｐＦＬ３０）の対応する領域を、同じ内部プライマーを使用
して配列決定した。このより長いクローンを、以下の観点で配列決定した：（ｉ
）もし存在するのならば、さらなるエキソンを同定するため；および（ｉｉ）同
定されたコード配列の上流に存在し得る潜在的な遺伝子プロモーター領域を特徴
付けるため。ＦＡＥＩは、非常に長い鎖の脂肪酸の産生のために必要である脂肪
酸エロンガーゼをコードすると考えられている。トランスポゾンタグ化ＦＡＥＩ
変異体は、Ｃ１８より長い脂肪酸（すなわち、２０：０、２０：１、および２２
：１）を、その種子中に蓄積することができない。ＦＡＥＩは、マロニルＣｏＡ
との縮合反応を触媒する、種子特異的ケトアシルシンターゼをコードすると考え
られる。ＦＡＥＩにおいて、約５０アミノ酸を有するタンパク質の領域を同定し
た。この領域は、他の植物マロニルＣｏＡ縮合酵素（例えば、ＣＨＳおよびＳＴ
Ｓ）中の領域といくらかの配列類似性を共有する。ＤＮＡレベルにおいて、４つ
のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＥＳＴ（Ｔ６７００、Ｔ４４９３９、Ｔ４４３６８
、およびＡＴＴＳ１２８２）とのいくらかの類似性が存在する。これらの相同性
は、配列番号２の配列の提案されたコード領域中に全体的に存在する。このこと
は、ＦＡＥＩを含めて、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓゲノム中には、Ｔａｇ５９０コ
ード領域に類似性を有する少なくとも４つの他の配列が存在することを意味する
。これらの６つの遺伝子が、種子特異的であるＦＡＥＩおよび孔辺細胞特異的で
あるＴａｇ５９０を含む、異なる発現パターンを有する可能性がある。従って、
これらの結果は、Ｔａｇ５９０遺伝子が、発生しつつある孔辺細胞中で特異的に
発現する推定の脂肪酸エロンガーゼをコードすることを示唆する。この酵素は、
二酸化炭素濃度の変化に応答して気孔密度を決定する上で役割を果たす（以下に
記載する）。
【００５７】 （気孔の孔辺細胞プロモーターとしてのＦＡＥ配列の使用） この実験を、ＦＡＥ配列が気孔の孔辺細胞特異的プロモーターとして作用し得
ることを例証するために設計した。プラスミドｐＦＬ４４を、ＳｎａＢＩ（ＧＵ
Ｓ遺伝子の５’末端に位置する）で消化し、１．８ｋｂフラグメントを提供する
。このフラグメントを、ｐＦＬ７（これは、プロモーターのないＧＵＳ遺伝子お
よび３５Ｓターミネーターを有するマルチコピー構築物である）のＳｎａＢＩ／
ＳｍａＩ部位にクローニングして、ＧＵＳの５’末端を置き換えて「新しいマル
チコピー構築物」と呼ばれる構築物を生成した。この「新しいマルチコピー構築
物」から、以下のエレメントを含むＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐ
ＭＯＧ８００にクローニングした；Ｔａｇ５９０「プロモーター」；ＧＵＳ遺伝
子および３５Ｓターミネーター。最終構築物ｐＭＯＧ１０１７をＡｒａｂｉｄｏ
ｐｓｉｓ Ｃ２４形質転換のために使用して、その後４０のトランスジェニック
系統を産生し、そしてそれらの葉をＧＵＳ発現について組織化学的に試験した。
１４系統が気孔のみにおけるＧＵＳ遺伝子の特異的な発現を明確に示す。写真１
および２を参照のこと。残りの２６系統は明確な発現を示さず、そして低い発現
体であるかまたは発現体でないと考えられた。
【００５８】 （植物および生長条件） 単一のＭ１植物の１２の孔辺細胞特異的なＧＵＳ発現Ｍ２系統を、自殖により
生成した。Ｍ２系統を、すべての特徴付け分析のために使用した。播種に先立っ
て、種子を濾紙上で表面滅菌（１０％ ｖ／ｖブリーチで５分間、１回洗浄し、
続いて滅菌蒸留水で洗浄した（１ｍｌ×５回））した。その種子を、１％ ｗ／
ｖ ショ糖および０．６％ ｗ／ｖ 組織培養グレード寒天、ｐＨ ５．８（Ｋ
ＯＨ）を添加した、半分の強度のＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ基本培地
上で発芽させた。標準的な１０ｃｍ培養プレートを、野生型種子については抗生
物質の添加なしで、または変異体の実生の選択については１０ｍｇ／ｌハイグロ
マイシンＢ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）とともにのいずれかで調製した。播種した
プレートを、４８時間春化処理（０〜４℃）に供し、その後生長条件に移し、生
活環を通じて維持した（日中２２℃、夜間１７℃；１０／１４時間の昼／夜レジ
メ；Ｒ／Ｈ＞６０％；４００ｗ Ｏｓｒａｍ金属ハライド ２５０〜３００μｍ
ｏｌ ｍ-2ｓｅｃ-1）。選択後、植物を土に移した（ＳＨＬ汎用性コンポスト（
Ｗｉｌｌｉａｍ Ｓｉｎｃｌａｉｒ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｔｄ）：微
細な「シルバー」サンドの３：１混合物）。
【００５９】 （形態学的特徴付け） 制御された環境チャンバーを使用して、環境の二酸化炭素（３５０〜４５０ｐ
ｐｍ）下および上昇した二酸化炭素（環境＋６５０ｐｐｍ）下で、植物を生長さ
れた。これらの条件下で、花および葉の外見、植物の発生および開花時間がすべ
て記録された。野生型Ｃ２４を非形質転換コントロールとして使用し、そして３
５Ｓ構成的ＧＵＳ発現体をＧＵＳ陽性コントロールとして使用した。照明への露
光後（ｄａｌ）１６日間、または３５日間で、植物をチャンバーに移した。１６
日齢群の場合、植物を３５日間まで生長させ、一方、より加齢した植物を、実験
の終了前に種子を生産するために生長させた。開花の開始を、個々の植物につい
て、６７日まで記録した。収穫に際して、すべての植物を写真撮影した。Ｘａｎ
ｔｏｐｒｅｎ歯科用印象材料（Ｄｅｎｔａｌ Ｌｉｎｋｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）
を使用して、植物あたり２〜３枚の葉から、背軸表皮の印象をとった（Ｗｅｙｅ
ｒｓおよびＪｏｈａｎｓｅｎ １９８５）。葉の選択は葉の数よりもむしろ比較
的なサイズに基づいた。視覚的に明確なアセトンに基づくワニスを使用して、Ｘ
ａｎｔｏｐｒｅｎ印象からの陽画を作製した。単位領域（９．２-2ｍｍ2）あた
りの気孔細胞および表皮細胞の計数を、光学顕微鏡の下で２００倍に拡大して、
各々の陽画の３つの異なる部分から調べた。これらのデータを使用して、各々の
系統について、環境ＣＯ2および上昇したＣＯ2の下で、平均気孔指数（ＳＩ）値
（ＳＩ＝気孔頻度／表皮細胞頻度＋気孔頻度 × １００）を計算した。この結
果は、環境ＣＯ2条件下で、Ｃ２４植物とＴａｇ５９０植物との間の気孔頻度ま
たは気孔指数のいずれにおいても、違いが存在しないことを示した。上昇した二
酸化炭素下で、Ｃ２４植物において見られた気孔指数の減少と顕著に対照的に、
Ｔａｇ５９０植物は、気孔指数の増加を示した。この結果は、３５ｄａｌ植物お
よび６７ｄａｌ植物の両方において見られた。
【００６０】 ＧＵＳ発現についての組織化学的アッセイを、すべての系統における変異ＴＡ
Ｇ５９０の存在または非存在を確認するために実行した。Ｃ２４および３５Ｓ／
ＧＵＳ（構成的ＧＵＳ発現）植物を、コントロールとして含めた。
【００６１】 （Ｔａｇ５９０系統の表現型） ＧＵＳ発現データに基づいて、孔辺細胞特異的遺伝子を破壊した。孔辺細胞は
、二酸化炭素（ＣＯ2）の上昇に対して、２つの別個の応答を示すことが公知で
ある。このうちの１つである、気孔の開度の減少は、商業的な温室の農産物の栽
培者には周知である。ここでこの気孔の開度の減少は、ＣＯ2の上昇の際の、収
量に移される生育の十分な利点を妨害する。他方は、発生的な応答であり、そし
て特定の種において、ＣＯ2の上昇下で生育する植物の気孔の数の減少によって
明白に示される。以下に記載する結果は、Ｔａｇ５９０植物およびＣ２４コント
ロールの表現型が、上昇したＣＯ2および環境のＣＯ2の下で比較された実験から
得られた。
【００６２】 （実験１） ３つの系統をこの実験において使用した：（ｉ）Ｃ２４コントロール（上記を
参照のこと）（４植物／処理）；（ｉｉ）系統５／１０（７植物／処理；これは
、非常に低いＧＵＳ遺伝子発現を有する系統である）；および（ｉｉｉ）系統５
／５（２植物／このＧＵＳ発現系統の処理）。植物は、温室に移動したときに４
週齢であり、そして１７日間、環境ＣＯ2または環境の上の２５０ｐｐｍ ＣＯ2 のいずれかに維持した。実験の最後に、気孔の数を評価した。
【００６３】 （実験１の結果） 最も顕著な結果は、Ｔａｇ５９０ ５／５系統における開花時間の変化であっ
た。Ｃ２４または５／１０系統コントロールのいずれかと比較して、開花の開始
は５／５系統において顕著に遅延した。気孔の数を計数した場合（表１）、Ｃ２
４または５／１０植物について、環境ＣＯ2条件と上昇したＣＯ2条件との間には
違いがないことが見出された。しかし、強力にＧＵＳを発現する系統（５／５）
における気孔の数が増加したこととは顕著に対照的であった。
【００６４】
【表１】
【００６５】 （実験２） この実験の目的は、より注意深く制御された生育条件を使用して、ＴＡＧ５９
０表現型をより正確に研究することであった。この実験において、一対の一致し
た、環境的に制御された生育キャビネットが使用され、ここではＣＯ2濃度がコ
ンピューター制御され、そして実験を通して記録された。第１のキャビネットに
おいて、環境レベルのＣＯ2が実験の期間中維持された。第２のキャビネットに
おいて、ＣＯ2レベルは、環境の上の６５０ｐｐｍに保たれた。これは、実験１
で使用されたものよりもより高い濃度であったが、商業的な栽培者によって利用
されるＣＯ2レジメをより正確に反映するものとして選択された。
【００６６】 （実験２の結果） 生育室で種子を発芽させ、鉢に移し、そして４５日齢で生育キャビネットに移
した。次いで、植物をさらに２２日間生育させ、そして実験の終わりに、気孔の
数と同様に開花を記録した。気孔の数が、実験処理の間に生育した葉においての
み記録されたことに留意することは重要である。上昇したＣＯ2において、標識
された植物の開花の遅延がこの実験において再び見られた。すべての標識された
系統は、上昇処理および環境処理の両方において、コントロールよりもより遅く
開花した（約７日間遅れた）。気孔の数の決定の結果を、表２に要約する。ここ
では、気孔の数は、上昇したＣＯ2中で生育させたコントロール植物中では減少
したことが明らかであるが、両方の標識された系統において、これは増加したこ
とが明らかであり、従ってこのことは、上昇したＣＯ2に応答して気孔の数が増
加したことを示した、以前の実験の結果を確証する。
【００６７】
【表２】
【００６８】 これらの結果は、標識された変異系統が通常ＣＯ2濃度の変化には応答し得な
いことを暗示する。高いＣＯ2濃度下において、気孔密度の減少を示す代わりに
、これらは気孔密度の増加によって応答する。従って、ＣＯ2に応答して気孔の
パターン化に関与する遺伝子が破壊されたようである。推定の破壊された遺伝子
の配列は同定され、そして配列番号２に示される。この遺伝子のプロモーター領
域は、非常に興味深いものである。なぜなら、これは以下を含むと推定されてい
るからである：（ｉ）孔辺細胞特異的遺伝子発現を指向するエレメント；および
（ｉｉ）ＣＯ2応答性エレメント。変異体５９０表現型および変異遺伝子が特徴
付けられた。本発明者らの結果は、本発明者らを次のような考えに導いた。この
遺伝子および／またはその産物は：（ｉ）気孔密度の制御に関与している；（ｉ
ｉ）ＣＯ2に対して応答性である；そして（ｉｉｉ）この遺伝子産物は、長鎖脂
肪酸の合成に関与する脂肪酸エロンガーゼ（ＦＡＥ）であるか、またはそれにに
関連している。これらの結果はともに、長鎖脂肪酸またはその代謝物は、気孔の
パターン化の制御に重要な役割を果たすこと、およびこの遺伝子の非コード領域
は、孔辺細胞特異的およびＣＯ2誘導性プロモーターを含むことを示唆する。商
業的な植物バイオテクノロジストにとって興味深いことに加えて、気孔の挙動、
その遺伝子、およびそのプロモーターを操作することを望むことは、温室農作物
の状況において価値があり得る。この状況において、炭素の獲得（従って、収量
）を最大化する試みにおいて、商業的な栽培者は、しばしば彼らの植物を高いＣ
Ｏ2濃度で栽培する。しかし、気孔のコンダクタンスの減少を誘導するＣＯ2の上
昇によって、潜在的な利点は減少することが理解されている。気孔細胞数の増加
は、この効果について（少なくともある程度は）補う。
【００６９】 標識された変異体系統で観察される開花の遅延は、遺伝子破壊の第２の効果か
らから生じ得る。すなわち、これらの植物における気孔密度の変化は、炭素同化
の速度の変化を引き起こし、これは、次には花の分裂組織の開始に影響する。
【００７０】 当業者は、本発明が上記に記載されたものに限定されず、多くのバリエーショ
ンがこの範囲に含まれ、保護が要求される要素は、特許請求の範囲によって規定
されることを認識している。例えば、実施例は、配列番号２に記載の配列の発現
を駆動する気孔細胞特異的プロモーターがＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来であるこ
とを開示しているが、ブロッティング実験は、このプロモーター配列が、このＡ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ以外の植物においても存在することを示している。このよ
うな植物としては、例えば、ジャガイモ、トマト、およびニンジンが挙げられる
。さらに、特に例示していないが、配列番号１および／または２に記載の配列の
、同種の配列を有する内因性遺伝子の活性を破壊するための、植物材料への形質
転換は、このような形質転換材料から再生され、上昇した二酸化炭素濃度に供さ
れた場合に、同種の非形質転換コントロール植物と比較して、増加した数の気孔
を有する植物を提供することが期待され得る。これに加えて、配列番号８に示さ
れる配列が、気孔特異的プロモーター活性に関して、配列番号２と同じ方法で作
用することを疑う理由はない。
【００７１】
【表３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ｐＧＥＭＴベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングされたＡｒａ
ｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｃ２４系統５９０のプルーフリーディングＰＣＲ ＤＮＡク
ローンを模式的に表す。
【図２】 図２は、ベクターｐＭＯＧ５５３を表す。
【図３】 図３は、クローンｐＦＬ４４とｐＦＬ３０との間の関係を模式的に表す。
【図４】 図４は、ｐＦＬ１３の模式図を表す。
【図５】 図５は、ｐＭＯＧ１０１７のクローニングスキームを表す。
【図６】 図６は、孔辺細胞におけるＧＵＳ活性についての組織化学的染色後の、構築物
ｐＭＯＧ１０１７を用いて形質転換したＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ葉を表す。この
図において、「黒いスポット」は、実物は青色である染色を示す。
【図７】 図７は、図６に示す葉の拡大図である。染色が気孔中に、より具体的には孔辺
細胞に存在することをより明確に示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (71)出願人 Ｆｅｒｎｈｕｒｓｔ，Ｈａｓｌｅｍｅｒ ｅ，Ｓｕｒｒｅｙ ＧＵ27 ３ＪＥ，Ｕｎ ｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ (72)発明者 サイモンズ， ピーター クリスチャン オランダ国 エヌエル−1075 ゲーカー アムステルダム， バレリューシュトラッ セ 210 ザ フォース (72)発明者 ヘザリントン， アリステアー マクロッ ク イギリス国 エルエイ１ ４ワイエヌ ラ ンカスター ， ベイルリッグ （番地な し）， デパートメント オブ バイオロ ジカル サイエンシーズ， ランカスター ユニバーシティ内 (72)発明者 ホルロイド， ジェフリー ヘイズ イギリス国 エルエイ１ ４ワイエヌ ラ ンカスター ， ベイルリッグ （番地な し）， デパートメント オブ バイオロ ジカル サイエンシーズ， ランカスター ユニバーシティ内 (72)発明者 グレイ， ジュリー エリザベス イギリス国 エス10 １ユーエイチ シェ フィールド ， ピー．オー． ボックス 594， デパートメント オブ モレキ ュラー バイオロジー アンド バイオテ クノロジー， ユニバーシティ オブ シ ェフィールド内 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB04 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD10 CD12 CD13 CD21 4B024 AA08 BA07 CA04 DA01 FA02 FA07 GA14 GA17 HA12 4B065 AA88X AA88Y AB01 AC14 AC20 BA03 CA27 CA53

Claims (46)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 コントロール同種植物に比べて増加した数の気孔を有する植
    物を産生するための方法であって、以下の工程： （ｉ）植物材料において転写因子の１４−３−３クラスの合成を刺激する脂肪
    酸の産生を阻害するか、あるいはさもなければ、該脂肪酸が該因子の合成を刺激
    することを防止する工程； （ｉｉ）上記のように阻害された材料を選択する工程；および （ｉｉｉ）上記のように選択された材料を植物体へと再生し、そして再生体の
    集団から、コントロール同種植物に比べて増加した数の気孔を有する再生植物を
    選択する工程、 を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 コントロール同種植物に比べて増加した数の気孔を有する植
    物を産生するための方法であって、以下の工程： （ｉ）配列番号１または配列番号２に示されるポリヌクレオチド配列を含む内
    因性遺伝子の機能を阻害するか、あるいはさもなければ、該遺伝子の活性を破壊
    する工程； （ｉｉ）上記のように阻害された材料を選択する工程； （ｉｉｉ）上記のように選択された材料を植物体へと再生し、そして再生体の
    集団から、コントロール同種植物に比べて増加した数の気孔を有する再生植物を
    選択する工程、 を包含する、方法。
  3. 【請求項３】 前記内因性遺伝子が、０．１％ ＳＤＳを含む０．３強度の
    クエン酸緩衝化生理食塩水中で６０℃と６５℃との間の温度にてインキュベート
    され、続いて０．１％ ＳＤＳを含む０．３強度のクエン酸緩衝化生理食塩水を
    用いて同じ温度でリンスされた場合に、配列番号１または配列番号２に示される
    配列となおハイブリダイズする配列と相補的なポリヌクレオチド配列を含む、請
    求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 コントロール同種植物に比べて増加した数の気孔を有する植
    物を産生するための方法であって、以下の工程： （ｉ）植物材料を、配列番号１または配列番号２に示される配列を含むポリヌ
    クレオチドを用いて形質転換する工程； （ｉｉ）上記のように形質転換された材料を選択する工程； （ｉｉｉ）上記のように選択された材料を植物体へと再生し、そして再生体の
    集団から、コントロール同種植物に比べて増加した数の気孔を有する再生植物を
    選択する工程、 を包含する、方法。
  5. 【請求項５】 前記ポリヌクレオチドが、０．１％ ＳＤＳを含む０．３強
    度のクエン酸緩衝化生理食塩水中で６０℃と６５℃との間の温度にてインキュベ
    ートされ、続いて０．１％ ＳＤＳを含む０．３強度のクエン酸緩衝化生理食塩
    水を用いて同じ温度でリンスされた場合に、配列番号１または配列番号２に示さ
    れる配列となおハイブリダイズする配列と相補的なポリヌクレオチドを含む、請
    求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記ポリヌクレオチドがアンチセンス方向にある、請求項４
    または請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 増加した数の気孔を有する前記植物が、形質転換されていな
    いコントロール植物と上記のように形質転換された植物がともに、発芽後、以下
    ：（ｉ）二酸化炭素濃度の上昇；（ｉｉ）カルシウムの上昇；（ｉｉｉ）極端な
    温度または極端な圧力；（ｉｖ）水利用能の減少；（ｖ）オゾン、窒素酸化物ま
    たは硫黄酸化物のような環境汚染気体の上昇、および（ｖｉ）光条件の上昇、の
    少なくとも１つに供される場合に、該形質転換されていないコントロール植物と
    該上記のように形質転換された植物との間の差異に基づいて選択される、請求項
    １〜６のいずれか１つに記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記二酸化炭素濃度が、約４５０百万分率より高い、請求項
    ７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記二酸化炭素濃度が、約６５０百万分率より高い、請求項
    ８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 植物および後代が、コントロール同種植物およびコントロ
    ール同種後代に比べて増加した数の気孔を有する、請求項１〜９のいずれか１項
    に記載の材料から再生される、形態学的に正常な稔性の全植物体ならびにその種
    子および後代。
  11. 【請求項１１】 ダイズ、ワタ、タバコ、テンサイ、アブラナ、カノラ、ア
    マ、ヒマワリ、ジャガイモ、トマト、アルファルファ、レタス、トウモロコシ、
    コムギ、モロコシ、ライムギ、バナナ、オオムギ、オートムギ、芝草、牧草、サ
    トウキビ、エンドウ、野生のマメ、イネ、マツ、ポプラ、リンゴ、ブドウ、つる
    植物、キュウリ、コショウ、柑橘類および堅果植物からなる群より選択される、
    請求項１０に記載の形態学的に正常な稔性の全植物体。
  12. 【請求項１２】 コントロール同種植物に比べて増加した数の気孔を有する
    植物を産生する方法における、配列番号１または配列番号２に記載の配列を含む
    ポリヌクレオチドの使用。
  13. 【請求項１３】 前記ポリヌクレオチドが、０．１％ ＳＤＳを含む０．３
    強度のクエン酸緩衝化生理食塩水中で６０℃と６５℃との間の温度にてインキュ
    ベートされ、続いて０．１％ ＳＤＳを含む０．３強度のクエン酸緩衝化生理食
    塩水を用いて同じ温度でリンスされた場合に、配列番号１または配列番号２に示
    される配列となおハイブリダイズする配列と相補的なポリヌクレオチドを含む、
    請求項１２に記載の使用。
  14. 【請求項１４】 前記ポリヌクレオチドが、植物の作動可能なプロモーター
    の発現制御下にあり、そして該ポリヌクレオチドのタンパク質コード領域の下流
    の転写終結領域をさらに含む、請求項１２または請求項１３に記載の使用。
  15. 【請求項１５】 前記プロモーターが、ＣａＭＶ３５Ｓ；ＦＭＶ３５Ｓ；Ｎ
    ＯＳ；ＯＣＳおよびＥ９からなる群より選択される、請求項１２〜１４のいずれ
    か１項に記載の使用。
  16. 【請求項１６】 前記プロモーターが、気孔の孔辺細胞特異的である、請求
    項１４に記載の使用。
  17. 【請求項１７】 前記プロモーターが、配列番号２に示される配列のプロモ
    ーター活性領域を含む、請求項１６に記載の使用。
  18. 【請求項１８】 コントロール同種植物に比べて増加した数の気孔を有する
    植物を産生する方法における、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載のポリヌ
    クレオチドの使用であって、該方法が、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方
    法である、使用。
  19. 【請求項１９】 ０．１％ ＳＤＳを含む０．３強度のクエン酸緩衝化生理
    食塩水中で６０℃と６５℃との間の温度にてインキュベートされ、続いて０．１
    ％ ＳＤＳを含む０．３強度のクエン酸緩衝化生理食塩水を用いて同じ温度でリ
    ンスされた場合に、配列番号１に示される配列となおハイブリダイズするが、該
    温度が６５℃と７０℃との間である場合には上記のようにハイブリダイズしない
    配列と相補的な配列を含む、ポリヌクレオチド。
  20. 【請求項２０】 配列番号２に示される配列を含む、請求項１９に記載のポ
    リヌクレオチド。
  21. 【請求項２１】 前記ポリヌクレオチドにより含まれるタンパク質コード領
    域が、植物の作動可能なプロモーターおよびターミネーターによって結合される
    、請求項１９または請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
  22. 【請求項２２】 請求項１９〜２１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
    ドを含む、植物形質転換ベクター。
  23. 【請求項２３】 ５’〜３’の方向で、請求項１９〜２１のいずれか１項に
    記載のポリヌクレオチドの相補体を含む配列を含む、植物形質転換ベクター。
  24. 【請求項２４】 前記ポリヌクレオチドの前記タンパク質コード領域が、気
    孔の孔辺細胞特異的プロモーターの発現制御下にある、請求項２２または２３の
    いずれかに記載の植物形質転換ベクター。
  25. 【請求項２５】 請求項１９〜２１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
    ドによってコードされる、翻訳産物。
  26. 【請求項２６】 脂肪酸エロンガーゼの活性を有する、請求項２５に記載の
    産物。
  27. 【請求項２７】 請求項１９〜２１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
    ド、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載のベクター、または０．１％ ＳＤ
    Ｓを含む０．３強度のクエン酸緩衝化生理食塩水中で６０℃と６５℃との間の温
    度にてインキュベートされ、続いて０．１％ ＳＤＳを含む０．３強度のクエン
    酸緩衝化生理食塩水を用いて同じ温度でリンスされた場合に、配列番号１に示さ
    れる配列となおハイブリダイズする配列と相補的な配列を含むポリヌクレオチド
    、を用いて形質転換された、植物材料。
  28. 【請求項２８】 除草剤、昆虫、乾燥および／または真菌感染、細菌感染も
    しくはウイルス感染に対する抵抗性または耐性を有する植物材料を提供し得るタ
    ンパク質をコードする領域を含むポリヌクレオチドを用いてさらに形質転換され
    ている、請求項２７に記載の植物材料。
  29. 【請求項２９】 前記除草剤抵抗性を提供し得るタンパク質が、グリホサー
    トオキシドレダクターゼ（ＧＯＸ）、５−エノール−ピルビル−３−ホスホシキ
    メートシンセターゼ（ＥＰＳＰＳ）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェ
    ラーゼ（ＰＡＴ）、ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ
    ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、シトクロムＰ４５０、アセ
    チルＣＯＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）、アセトラクテートシンターゼ（
    ＡＬＳ）、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＲＯＴＯＸ）、ジヒドロ
    プテロエートシンターゼ、ポリアミン輸送タンパク質、スーパーオキシドジスム
    ターゼ（ＳＯＤ）、ブロモキシニルニトリラーゼ、フィトエンデサチュラーゼ（
    ＰＤＳ）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓから得られ得るｔｆｄ
    Ａ遺伝子の産物、および該タンパク質の公知の変異誘発された改変体あるいはさ
    もなければ修飾された改変体からなる群から選択される、請求項２８に記載の植
    物材料。
  30. 【請求項３０】 前記タンパク質コード配列が、（ｉ）前記領域の翻訳産物
    を、葉緑体のような色素体、ミトコンドリア、他のオルガネラ、または植物細胞
    壁に標的化し得るペプチド；ならびに／あるいは（ｉｉ）非翻訳翻訳増強配列、
    をコードする５’領域を含む、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の植物材
    料。
  31. 【請求項３１】 前記材料を形質転換するために使用される前記ポリヌクレ
    オチドが、ｍＲＮＡの不安定性をコードするモチーフおよび／または偶然のスプ
    ライス領域が除去されるか、あるいは植物の好ましいコドンを使用されるという
    点で修飾され、その結果、上記のように修飾されたポリヌクレオチドの植物にお
    ける発現が、生物における未修飾のポリヌクレオチドの発現によって得られる活
    性／機能と実質的に類似の活性／機能を有する実質的に類似のタンパク質を生じ
    、ここで該生物において、該未修飾のポリヌクレオチドのタンパク質コード領域
    が内因性であり、ただし、前記除草剤抵抗性を付与する領域に関して、上記のよ
    うに修飾されたポリヌクレオチドが植物の好ましいコドンを含む場合、該修飾さ
    れたポリヌクレオチド内のタンパク質コード領域と、該植物内に内因的に含まれ
    、そして実質的に同じタンパク質をコードする同種のタンパク質コード領域との
    間の同一性の程度が、約７０％未満である、請求項２７〜３０のいずれか１項に
    記載の植物材料。
  32. 【請求項３２】 請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の材料から再生さ
    れた形態学的に正常な稔性の全植物体、このような植物の後代、このような植物
    および後代の種子、ならびにこのような植物および後代の部分。
  33. 【請求項３３】 ダイズ、ワタ、タバコ、テンサイ、アブラナ、カノラ、ア
    マ、ヒマワリ、ジャガイモ、トマト、アルファルファ、レタス、トウモロコシ、
    コムギ、モロコシ、ライムギ、バナナ、オオムギ、オートムギ、芝草、牧草、サ
    トウキビ、エンドウ、野生のマメ、イネ、マツ、ポプラ、リンゴ、ブドウ、つる
    植物、キュウリ、コショウ、柑橘類および堅果植物からなる群より選択される、
    請求項３２に記載の植物。
  34. 【請求項３４】 コントロール植物に比べて増加した数の気孔を有する植物
    を産生する方法であって、以下の工程： （ｉ）０．１％ ＳＤＳを含む０．３強度のクエン酸緩衝化生理食塩水中で６
    ０℃と６５℃との間の温度にてインキュベートされ、続いて０．１％ ＳＤＳを
    含む０．３強度のクエン酸緩衝化生理食塩水を用いて同じ温度でリンスされた場
    合に、配列番号１に示される配列となおハイブリダイズする配列と相補的な配列
    を含む内因性遺伝子の機能を阻害するか、あるいはさもなければ該内因性遺伝子
    の活性を破壊する工程； （ｉｉ）上記のように阻害された材料を選択する工程； （ｉｉｉ）上記のように選択された材料を植物体へと再生する工程、 を包含する、方法。
  35. 【請求項３５】 前記植物材料が、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載
    のポリヌクレオチド、または請求項２２〜２４のいずれか１項に記載のベクター
    を用いて形質転換される、請求項３４に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 増加した数の気孔を有する前記植物が、形質転換されてい
    ないコントロール植物と上記のように形質転換された植物がともに、発芽後、以
    下：（ｉ）二酸化炭素濃度の上昇；（ｉｉ）カルシウムの上昇；（ｉｉｉ）極端
    な温度または極端な圧力；（ｉｖ）水利用能の減少；（ｖ）オゾン、窒素酸化物
    または硫黄酸化物のような環境汚染気体の上昇、および（ｖｉ）光条件の上昇、
    の少なくとも１つに供される場合に、該形質転換されていないコントロール植物
    と該上記のように形質転換された植物との間の差異に基づいて選択される、請求
    項３４または３５のいずれか１つに記載の方法。
  37. 【請求項３７】 前記差異が、（ｉ）開花の遅延；（ｉｉ）生長特性の変化
    ；および（ｉｉｉ）気孔指数の上昇、からなる群より選択される、請求項３６に
    記載の方法。
  38. 【請求項３８】 上記のように選択した植物、またはその後代を、形質転換
    されていない同種の植物と交配する工程をさらに包含する、請求項３４〜３７の
    いずれか１項に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 交配から最終的に得られる植物が、導入遺伝子についてホ
    モ接合性である、請求項３８に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の方法から得られ
    る植物、このような植物の後代、このような植物および後代の種子、ならびにこ
    のような植物および後代の部分。
  41. 【請求項４１】 果実、切花および種子からなる群より選択される、請求項
    ４０に記載の植物の部分。
  42. 【請求項４２】 形質転換していないコントロール植物に比べて増加した数
    の気孔を有する植物の産生のための方法における、請求項１９〜２１のいずれか
    １項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の
    ベクターの使用。
  43. 【請求項４３】 配列番号２に示される配列により含まれる、発現調節配列
    。
  44. 【請求項４４】 配列番号２に示される配列を含む、単離されたポリヌクレ
    オチド。
  45. 【請求項４５】 配列番号８に示される配列を含む、単離されたポリヌクレ
    オチド。
  46. 【請求項４６】 配列番号８に示される配列により含まれる、発現調節配列
    。
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