JP5825574B2 - 気孔増加剤、ポリペプチド、植物における気孔の数および／または密度の増加方法ならびに植物の収量の増加方法 - Google Patents

Description

本発明は、気孔増加剤、ポリペプチド、植物における気孔の数および／または密度の増加方法ならびに植物の収量の増加方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、植物による二酸化炭素の吸収量の増加などに有用な気孔増加剤、ポリペプチド、植物における気孔の数および／または密度の増加方法ならびに植物の生産量の向上などに有用な植物の収量の増加方法に関する。

葉における気孔の発生は、受容体様タンパク質〔トゥー・メニー・マウス（ＴＯＯ ＭＡＮＹ ＭＯＵＴＨ）；以下、「ＴＭＭ」と表記する〕およびＥＲＥＣＴＡファミリー受容体型リン酸化酵素（ＥＲ、ＥＲＬ１およびＥＲＬ２）によって負に制御されている（例えば、非特許文献１および２参照）。

これらの受容体に結合する可能性がある２つのリガンドであるエピダーマルパターニングファクター〔ＥＰＩＤＥＲＭＡＬ ＰＡＴＴＥＲＮＩＮＧ ＦＡＣＴＯＲ（以下、「ＥＰＦ」と表記する）〕１およびＥＰＦ２は、負のシグナル伝達因子として、気孔の発生において、異なるステップに影響を与えている（例えば、非特許文献３〜５参照）。また、別の負の制御因子であるズブチリシンタイプのプロテアーゼ〔ストマタル・デンシティー・アンド・ディストリビューション１（ＳＴＯＭＡＴＡＬ ＤＥＮＳＩＴＹ ＡＮＤ ＤＩＳＴＲＩＢＵＴＩＯＮ １）；以下、「ＳＤＤ１」と表記する〕は、ＴＭＭに依存して機能していることが報告されている（例えば、非特許文献６参照）。

Ｎａｄｅａｕ， Ｊ． Ａ． ＆ Ｓａｃｋ， Ｆ． Ｄ． Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｓｔｏｍａｔａｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｅａｆ ｓｕｒｆａｃｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６， １６９７−１７００ （２００２） Ｓｈｐａｋ， Ｅ． Ｄ．， ＭｃＡｂｅｅ， Ｊ． Ｍ．， Ｐｉｌｌｉｔｔｅｒｉ， Ｌ． Ｊ． ＆ Ｔｏｒｉｉ， Ｋ． Ｕ． Ｓｔｏｍａｔａｌ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９， ２９０−２９３ （２００５） Ｈａｒａ， Ｋ．， Ｋａｊｉｔａ， Ｒ．， Ｔｏｒｉｉ， Ｋ． Ｕ．， Ｂｅｒｇｍａｎｎ， Ｄ． Ｃ． ＆ Ｋａｋｉｍｏｔｏ， Ｔ． Ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐｅｐｔｉｄｅ ｇｅｎｅ ＥＰＦ１ ｅｎｆｏｒｃｅｓ ｔｈｅ ｓｔｏｍａｔａｌ ｏｎｅ−ｃｅｌｌ−ｓｐａｃｉｎｇ ｒｕｌｅｓ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ２１， １７２０−１７２５ （２００７） Ｈｕｎｔ， Ｌ． ＆ Ｇｒａｙ， Ｊ． Ｅ． Ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ＥＰＦ２ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｓｔｏｍａｔａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． １９， ８６４−８６９ （２００９） Ｈａｒａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｉｓ ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｖｉａ ａ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐｅｐｔｉｄｅ， ＥＰＩＤＥＲＭＡＬ ＰＡＴＴＥＲＮＩＮＧ ＦＡＣＴＯＲ ２ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｅａｖｅｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５０， １０１９−１０３１ （２００９） Ｂｅｒｇｅｒ，Ｄ．＆Ａｌｔｍａｎｎ， Ｔ． Ａｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ−ｌｉｋｅ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｏｍａｔａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １４，１１１９−１１３１ （２０００）

しかしながら、本発明者らは、現時点では、植物における気孔の発達を正に制御し、植物における気孔の数および／または密度を増加することができるシグナル伝達因子を具体的に記載した文献を発見していない。

本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、植物における気孔の数および／または密度を増加することができる、気孔増加剤、ポリペプチドならびに植物における気孔の数および／または密度の増加方法を提供することを目的とする。また、本発明は、植物の収量を簡便に増加させることができる、植物の収量の増加方法を提供することを目的とする。

すなわち、本発明の要旨は、
（１） 植物における気孔の数および／または密度を増加させる化合物を含有してなる気孔増加剤であって、
前記化合物が、（Ｉ）配列番号：６に示されるアミノ酸配列、
（ＩＩ）配列番号：６において、１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有し、かつ植物における気孔形成を正に制御する性質を少なくとも有するポリペプチドを構成するアミノ酸配列、
（ＩＩＩ）配列番号：６に示されるアミノ酸配列に対して、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ ３の条件でＢＬＡＳＴアルゴリズムでアライメントし算出した配列同一性が、９５％以上であり、かつコードされるポリペプチドが、植物における気孔形成を正に制御する性質を少なくとも有するアミノ酸配列、および
（ＩＶ）配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードする核酸の相補鎖核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸によりコードされ、かつコードされるポリペプチドが、植物における気孔形成を正に制御する性質を少なくとも有するアミノ酸配列
からなる群より選ばれたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、気孔増加剤、
（２） （Ｉ）配列番号：６に示されるアミノ酸配列、
（ＩＩ）配列番号：６において、１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有し、かつ植物における気孔形成を正に制御する性質を少なくとも有するポリペプチドを構成するアミノ酸配列、
（ＩＩＩ）配列番号：６に示されるアミノ酸配列に対して、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ ３の条件でＢＬＡＳＴアルゴリズムでアライメントし算出した配列同一性が、９５％以上であり、かつコードされるポリペプチドが、植物における気孔形成を正に制御する性質を少なくとも有するアミノ酸配列、および
（ＩＶ）配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードする核酸の相補鎖核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸によりコードされ、かつコードされるポリペプチドが、植物における気孔形成を正に制御する性質を少なくとも有するアミノ酸配列
からなる群より選ばれたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（３） 植物に、前記（１）に記載の気孔増加剤を接触させるか、または植物において、前記（２）のポリペプチドを過剰発現させることを特徴とする、植物における気孔の数および／または密度の増加方法、
（４） 前記植物が維管束植物である、前記（３）に記載の植物における気孔の数および／または密度の増加方法、
（５） 前記（３）または（４）に記載の植物における気孔の数および／または密度の増加方法により得られる植物、ならびに
（６） 植物に、前記（１）に記載の気孔増加剤を接触させるか、または植物において、前記（２）のポリペプチドを過剰発現させることを特徴とする、植物の収量の増加方法
に関する。

本発明の気孔増加剤、ポリペプチドならびに植物における気孔の数および／または密度の増加方法によれば、植物における気孔の数および／または密度を増加することができるという優れた効果を奏する。したがって、本発明によれば、植物による二酸化炭素の吸収量の向上を図ることができるので、大気中における二酸化炭素量の低減に有用である。また、本発明によれば、二酸化炭素の吸収量の増大によって植物における炭素固定量を増大させることができるので、植物の収量の増量などを図ることができる。さらに、本発明の植物の収量の増加方法によれば、植物の収量を簡便に増加させることができるという優れた効果を奏する。

本発明のポリペプチド（ストマジェン）およびその前駆体（ストマジェン前駆体）の構造を示す図である。 調製例２で得られた抗ストマジェン抗体のストマジェンに対する特異性を調べた結果を示す図面代用写真である。 （ａ）は試験例１において、野生株の成熟した第１葉の裏側表皮を観察した結果を示す微分干渉像の図面代用写真、（ｂ）は試験例１において、ストマジェン発現抑制株１０の成熟した第１葉の裏側表皮を観察した結果を示す微分干渉像の図面代用写真、（ｃ）は試験例１において、ストマジェン過剰発現株１０の成熟した第１葉の裏側表皮を観察した結果を示す微分干渉像の図面代用写真である。 試験例１において、野生型、ストマジェン発現抑制株２およびストマジェン過剰発現株２それぞれにおける子葉、茎および果実の表皮を観察した結果を示す微分干渉像ならびに葯の表皮を観察した結果を示す共焦点顕微鏡像の図面代用写真である。 試験例１において、ストマジェン遺伝子の発現様式と、子葉、果実および茎の各器官における気孔密度との関係を調べた結果を示すグラフである。 （ａ）は試験例１において、野生型における子葉の裏側の表皮を観察した結果を示す共焦点顕微鏡像の図面代用写真および（ｂ）は試験例１において、ストマジェン過剰発現株１０における子葉の裏側の表皮を観察した結果を示す共焦点顕微鏡像の図面代用写真である。 （ａ）は試験例１において、野生型における第１葉の表皮を観察した結果を示す共焦点顕微鏡像の図面代用写真および（ｂ）は試験例１において、ストマジェン過剰発現ｐＴＭＭ：：ＧＦＰ株における第１葉の表皮を観察した結果を示す共焦点顕微鏡像の図面代用写真である。 試験例２において、発芽後１８日目のｐＳＴＯＭＡＧＥＮ：：ＧＵＳ株の第９葉の横断切片を観察した結果を示す顕微鏡像の図面代用写真である。 （ａ）は試験例２において、葉原基におけるストマジェン遺伝子のアンチセンスプローブを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析を行なった結果を示す顕微鏡像の図面代用写真および（ｂ）は試験例２において、葉原基におけるストマジェン遺伝子のセンスプローブを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析を行なった結果を示す顕微鏡像の図面代用写真である （ａ）はストマジェン遺伝子を含む核酸におけるａｍｉ−Ａ、ａｍｉ−ＢおよびｄｓＲＮＡそれぞれの標的配列の位置を示す模式図、（ｂ）は試験例３において、野生株、ストマジェン発現抑制株（ａｍｉ−Ａ）、ストマジェン発現抑制株（ａｍｉ−Ｂ）およびストマジェン発現抑制株（ｄｓＲＮＡ）それぞれの成熟した第１葉の裏側表皮を観察した結果を示す微分干渉像の図面代用写真、（ｃ）は試験例３において、気孔密度とストマジェン遺伝子の相対発現量との関係を調べた結果を示すグラフである。 試験例４において、気孔密度とストマジェン遺伝子の相対発現量との関係を調べた結果を示すグラフである。 試験例５において、根、葉、茎、花芽および果実それぞれにおけるストマジェン遺伝子の発現の有無を調べた結果を示す電気泳動図の図面代用写真である。 （ａ）は試験例６において、ｐＳＴＯＭＡＧＥＮ：：ＧＵＳ株の発芽後２日目におけるストマジェン遺伝子のプロモーターの発現を解析した結果を示す図面代用写真、（ｂ）は試験例６において、ｐＳＴＯＭＡＧＥＮ：：ＧＵＳ株の発芽後９日目におけるストマジェン遺伝子のプロモーターの発現を解析した結果を示す図面代用写真および（ｃ）は試験例６において、ｐＳＴＯＭＡＧＥＮ：：ＧＵＳ株の発芽後１６日目におけるストマジェン遺伝子のプロモーターの発現を解析した結果を示す図面代用写真である。 試験例７において、ストマジェン遺伝子の発現様式と、気孔密度との関係を調べた結果を示すグラフである。 試験例８において、ＦＭ４−６４で染色したストマジェン−Ｖｅｎｕｓ発現株の発芽後３日後の子葉の裏側表皮を観察した結果を示す共焦点顕微鏡像の図面代用写真である。 （Ａ）は試験例８において、ＦＭ４−６４で染色したＳＰ−Ｖｅｎｕｓ発現株の発芽後３日後の子葉の裏側表皮を観察した結果を示す共焦点顕微鏡像の図面代用写真および（Ｂ）は試験例８において、ＦＭ４−６４で染色したＬｔｉ６ｂ−ＧＦＰ株の発芽後３日後の子葉の裏側表皮を観察した結果を示す共焦点顕微鏡像の図面代用写真を示す。 実施例２において、ストマジェン−Ｖｅｎｕｓ発現株から得られた画分について、抗ストマジェン抗体を用いたウエスタンブロット解析を行なった結果を示す図面代用写真である。 実施例２において、ストマジェン−ＶｅｎｕｓのＮ末端アミノ酸配列を解析した結果を示すグラフである。 （ａ）は実施例２において、リジルエンドペプチダーゼを用い、質量分析によってストマジェン−ＶｅｎｕｓのＮ末端アミノ酸配列を解析した結果を示すグラフおよび（ｂ）は実施例２において、トリプシンを用い、質量分析によってストマジェン−ＶｅｎｕｓのＮ末端アミノ酸配列を解析した結果を示すグラフである。 実施例２において、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗによるストマジェンのイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（Ｏｓ０１ｇ０９１４４００））、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ（ＡＭ４４４７３２））、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ（Ｐｔ０２ｇ２５５７））およびイヌカタヒバ（Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉ（Ｓｍ０８４７１１））それぞれにおけるオーソログのマルチプルアライメントの結果を示す図である。 実施例３において、ストマジェン発現ＢＹ−２細胞の培養物について、抗ストマジェン抗体を用いたウエスタンブロット解析を行なった結果を示す図面代用写真である。 実施例３において、逆相ＨＰＬＣカラムを用いたストマジェンの精製を行なった際のクロマトグラムである。 実施例３において、逆相ＨＰＬＣカラムを用いたクロマトグラフィーの各画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した結果を示す電気泳動図の図面代用写真である。 実施例３において、１０〜１３番目の画分に含まれるストマジェンのＮ末端アミノ酸配列をエドマン分解によって解析した結果を示す図である。 実施例３において、精製された組換えストマジェンの電気泳動図の図面代用写真である。 （ａ）は実施例４において、精製組換えストマジェンを投与していないＬｔｉ６ｂ−ＧＦＰ発現株の子葉の裏側表皮の共焦点顕微鏡像の図面代用写真および（ｂ）は実施例４において、精製組換えストマジェン（２μＭ）を投与したＬｔｉ６ｂ−ＧＦＰ発現株の子葉の裏側表皮の共焦点顕微鏡像の図面代用写真である。 実施例６において、合成ストマジェン量と気孔密度との関係を調べた結果を示すグラフである。 （ａ）は試験例９において、精製組換えストマジェンを投与していないｓｐｃｈ変異株の子葉の裏側表皮の共焦点顕微鏡像の図面代用写真、（ｂ）は試験例９において、精製組換えストマジェン（２μＭ）を投与したｓｐｃｈ変異株の子葉の裏側表皮の共焦点顕微鏡像の図面代用写真、（ｃ）は試験例９において、精製組換えストマジェン（２μＭ）を投与した野生株の子葉の裏側表皮の共焦点顕微鏡像の図面代用写真、（ｄ）は試験例９において、ｓｐｃｈ変異株の子葉の裏側表皮を観察した結果を示す微分干渉像の図面代用写真、（ｅ）は試験例９において、ストマジェン過剰発現ｓｐｃｈ変異株の子葉の裏側表皮を観察した結果を示す微分干渉像の図面代用写真、（ｆ）は試験例９において、ストマジェン過剰発現株の子葉の裏側表皮を観察した結果を示す微分干渉像の図面代用写真である。 （ａ）は試験例１０において、植物体の種類と茎における気孔密度との関係を調べた結果を示すグラフ、（ｂ）は試験例１０において、植物体の種類と葉における気孔密度との関係を調べた結果を示すグラフである。 （Ａ）は試験例１０において、野生株、ストマジェン発現抑制株、ストマジェン過剰発現株、ｔｍｍ変異株、ストマジェン発現抑制ｔｍｍ変異株およびストマジェン過剰発現ｔｍｍ変異株それぞれの第１葉の裏側表皮を観察した結果を示す微分干渉像の図面代用写真、（Ｂ）は試験例１０において、野生株、ストマジェン発現抑制株、ストマジェン過剰発現株、ｔｍｍ変異株、ストマジェン発現抑制ｔｍｍ変異株およびストマジェン過剰発現ｔｍｍ変異株それぞれの茎を観察した結果を示す微分干渉像の図面代用写真である。 試験例１１において、植物体の種類と気孔密度との関係を調べた結果を示すグラフである。 試験例１１において、植物体の種類と非気孔細胞密度との関係を調べた結果を示すグラフである。 試験例１１において、植物体の成熟した第一葉の裏側表皮を観察した結果を示す微分干渉像の図面代用写真である。 試験例１２において、ストマジェン遺伝子の発現様式と光合成速度との関係を調べた結果を示すグラフである。 試験例１２において、ストマジェン遺伝子の発現様式と気孔コンダクタンスとの関係を調べた結果を示すグラフである。 試験例１３において、植物体の種類と気孔密度との関係を調べた結果を示すグラフである。 試験例１３において、ストマジェン過剰発現ダイズの葉を観察した結果を示す微分干渉像の図面代用写真を示す。 試験例１３において、ダイズ（カリユタカ）〔野生株〕の葉を観察した結果を示す微分干渉像の図面代用写真を示す。 （ａ）は試験例１４において、合成ストマジェンを投与したイネの第２葉の裏側表皮の微分干渉顕微鏡像の図面代用写真および（ｂ）は試験例１４において、合成ストマジェンを投与していないイネの第２葉の裏側表皮の微分干渉顕微鏡像の図面代用写真を示す。 実施例８において、ストマジェン濃度と気孔密度との関係を調べた結果を示すグラフである。 試験例１５において、野生株またはストマジェン発現抑制株に取り込まれた¹¹ＣＯ₂を測定した結果の図面代用写真である。 試験例１６において、試料の種類と気孔密度との関係を調べた結果を示すグラフである。

１．本発明の気孔増加剤および本発明のポリペプチド
本発明の気孔増加剤は、植物における気孔の数および／または密度を増加させる化合物を含有していることを特徴とする。かかる気孔増加剤によれば、未分化の表皮細胞を、気孔を構成する孔辺細胞に分化させることができるので、植物における気孔の数および／または密度を増加させることができる。ここで、「植物における気孔の数の増加」とは、少なくとも野生型の植物における気孔の数よりも多いことをいい、「植物における気孔の密度の増加」とは、野生型の植物における気孔の密度よりも高い密度を有することをいう。気孔の数および密度の測定は、例えば、顕微鏡による観察などによって行なうことができる。

本発明者らは、植物における気孔が、植物において、配列番号：６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを過剰発現させること、または植物に前記ポリペプチドを投与することによって増加し、かかるポリペプチドが、表皮細胞における気孔形成において、正の細胞間シグナル伝達因子として働くことを見出した。また、本発明者らは、かかるポリペプチドの前駆体が、気孔が発達する表皮細胞よりも内部の葉肉細胞において発現し、シグナルペプチド配列およびプロペプチド配列が切断され、未分化の表皮細胞の受容体ＴＭＭに対して、負の制御因子であるＥＰＦ２と競争的に結合することによって、当該未分化の表皮細胞を孔辺細胞に分化させ、気孔を形成することができることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。

前記化合物としては、例えば、
（Ｉ）配列番号：６に示されるアミノ酸配列、
（ＩＩ）配列番号：６において、１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有し、かつ植物における気孔形成を正に制御する性質を少なくとも有するポリペプチドを構成するアミノ酸配列、
（ＩＩＩ）配列番号：６に示されるアミノ酸配列に対して、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ ３の条件でＢＬＡＳＴアルゴリズムでアライメントし算出した配列同一性が、６４％以上であり、かつコードされるポリペプチドが、植物における気孔形成を正に制御する性質を少なくとも有するアミノ酸配列、および
（ＩＶ）配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードする核酸の相補鎖核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸によりコードされ、かつコードされるポリペプチドが、植物における気孔形成を正に制御する性質を少なくとも有するアミノ酸配列
からなる群より選ばれたアミノ酸配列からなるポリペプチド、前記ポリペプチドに基づく擬似化合物、前記ポリペプチドをコードする核酸に対応するプロモーターを正に制御する物質、ストマジェンの安定化に寄与する物質（例えば、ストマジェンを切断するプロテアーゼに対する阻害剤など）などが挙げられる。

前記化合物が前記植物における気孔形成を正に制御する性質を有するかどうかは、例えば、被験対象の化合物を幼若植物に接触させ、数日間生育させ、得られた植物（「処理植物」ともいう）における気孔の密度や数を測定し、かかる処理植物における気孔の密度や数を、前記化合物を接触させていない植物における気孔の密度や数と比較することにより評価することができる。このとき、処理植物における気孔の密度や数が、前記化合物を接触させていない植物における気孔の密度や数に比べて多い場合、前記被験対象の化合物が前記植物における気孔形成を正に制御する性質を有すると評価することができる。

なお、前記ポリペプチドは、植物内において過剰発現させることにより、植物における気孔形成を正に制御することもできる。したがって、本発明には、かかるポリペプチドも包含される。

前記ポリペプチドは、前記アミノ酸配列を有しているため、植物において、未分化の表皮細胞の受容体ＴＭＭに作用して、当該未分化の表皮細胞から、気孔を構成する孔辺細胞への分化を促進し、植物における気孔の密度を増やすことができる。

本発明には、前記植物における気孔形成を正に制御する性質を示すのであれば、前記（Ｉ）の配列番号：６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのバリアントも包含される。本明細書において、かかるバリアントとは、前記（ＩＩ）〜（ＩＶ）のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドをいう。

前記（ＩＩ）のアミノ酸配列において、「１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入」は、配列番号：６に示されるアミノ酸配列の内部、Ｃ末端およびＮ末端の少なくともいずれかに有している。ここで、「１または数個」とは、前記植物における気孔形成を正に制御する性質を示すポリペプチドを構成する程度の範囲の個数をいい、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜３個をいう。

なお、前記置換は、前記植物における気孔形成を正に制御する性質を十分に確保する観点から、保存的置換が好ましい。かかる保存的置換としては、例えば、特定のアミノ酸残基と、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴などに類似した機能を発揮するアミノ酸残基（以下、本明細書においては、類似アミノ酸残基ともいう）との置換などが挙げられる。前記保存的置換としては、より具体的には、例えば、グリシン残基およびアラニン残基の相互間での置換、バリン残基、イソロイシン残基およびロイシン残基の相互間での置換、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基およびグルタミン残基の相互間での置換、セリン残基およびスレオニン残基の相互間での置換、リジン残基およびアルギニン残基の相互間での置換、フェニルアラニン残基およびチロシン残基の相互間での置換などが挙げられる。

前記（ＩＩＩ）のアミノ酸配列において、配列同一性は、前記植物における気孔形成を正に制御する性質を十分に確保する観点から、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ ３の条件でＢＬＡＳＴアルゴリズムでアライメントし算出した値として、６４％以上であり、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは１００％である。

前記（ＩＶ）において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、前記相補鎖核酸と、前記相補鎖核酸に対応するハイブリダイゼーション対象の核酸とを、ハイブリダイゼーション用溶液〔組成：６×ＳＳＣ（組成：０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に調整）、０．５質量％ドデシル硫酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、５０体積％ホルムアミド〕中で、室温、よりストリンジェントな条件として４２℃以上、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で１０時間インキュベーションし、つぎに、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントな条件として０．１×ＳＳＣのイオン強度条件下で、かつ室温、よりストリンジェントな条件として４２℃以上、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で洗浄を行なう条件などが挙げられる。また、「相補鎖核酸」とは、前記配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードする核酸に対して完全に相補的な核酸をいう。

本発明において、前記ポリペプチドは、前記植物における気孔形成を正に制御する性質を示すのであれば、前記（Ｉ）〜（ＩＶ）のアミノ酸配列の一部からなるポリペプチドであってもよい。

前記ポリペプチドは、例えば、ペプチド固相合成法などの化学合成法または前記ポリペプチドをコードする核酸を保持した細胞や細菌を用いる生物学的方法により製造することができる。これらのなかでは、安価で大量に前記ポリペプチドを製造できる観点から、前記生物学的方法が好ましい。

前記生物学的方法に用いられる細胞としては、例えば、植物細胞（例えば、ＢＹ−２細胞などのタバコ培養細胞など）、酵母細胞、大腸菌、昆虫細胞などの適切な宿主細胞に本発明のポリペプチドをコードする核酸を発現可能に導入した組換え細胞などが挙げられる。前記生物学的方法では、かかる細胞を適切な培地で培養することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。

前記ポリペプチドをコードする核酸としては、例えば、配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードする核酸またはその変異型核酸などが挙げられる。前記変異型核酸としては、前記（ＩＩ）〜（ＩＶ）のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸などが挙げられる。また、前記変異型核酸は、コードされるポリペプチドが、前記植物における気孔形成を正に制御する性質を示すのであれば、配列番号：６に示されるアミノ酸配列に対応する塩基配列に完全に相補的な塩基配列からなる核酸と前記したストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸であってもよい。かかる核酸は、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、トランスフェクション法、パーティクルガン法などにより前記宿主細胞に導入することができる。

ポリペプチドに基づく擬似化合物としては、例えば、前記ポリペプチドに基づく疑似化合物であって、未分化の表皮細胞の受容体ＴＭＭに作用して、植物における気孔の数および/または密度を増加させる化合物などが挙げられる。なお、本明細書において、「ポリペプチドに基づく擬似化合物」の概念には、例えば、前記ポリペプチドにおける生理活性に寄与する部分の立体構造を基に設計されたペプチド化合物または非ペプチド化合物、前記ポリペプチドの一部からなるペプチドなどが包含される。

また、「ポリペプチドをコードする核酸に対応するプロモーターを正に制御する物質」の概念には、前記プロモーターの活性を増加させる物質などが包含される。

本発明の気孔増加剤は、前記化合物のみからなるものであってもよく、前記化合物と適切な助剤とを含むものであってもよい。

本発明の気孔増加剤が、前記化合物と適切な助剤とを含むものである場合、当該気孔増加剤中の前記化合物の含有量は、適用対象になる植物やかかる気孔増加剤の用途に応じて適宜設定することができる。

前記助剤としては、例えば、前記化合物が有する前記性質や立体構造を安定的に維持することおよび／または植物を維持するのに適した緩衝液、当該気孔増加剤の適用対象となる植物に前記化合物を取り込ませやすくする吸収促進剤、植物を生育するための培地などが挙げられる。

前記緩衝液のｐＨは、当該気孔増加剤を植物に散布、噴霧などにより供給する場合には、前記化合物が有する前記性質や立体構造を安定的に維持するに適した範囲であればよく、例えば、好ましくはｐＨ５．５〜８．５、さらに好ましくはｐＨ６〜８、より好ましくはｐＨ７．５付近である。また、前記緩衝液のｐＨは、幼若植物を当該気孔増加剤に浸漬して供給する場合には、例えば、好ましくはｐＨ５〜７、より好ましくはｐＨ５．７付近である。

前記吸収促進剤としては、例えば、葉などに前記化合物を付着させ、前記葉などと前記化合物との接触時間を長くすることができる程度の粘度を有する溶媒（例えば、多糖類の水溶液など）、葉の内部への前記化合物の浸透を促進する溶媒などが挙げられる。

前記培地としては、植物の生育に適したものであればよい。

２．植物における気孔の数および／または密度の増加方法
本発明の植物における気孔の数および／または密度の増加方法は、植物に、前述した気孔増加剤を接触させるか、または植物において、前述したポリペプチドを過剰発現させることを特徴としている。

本発明の植物における気孔の数および／または密度の増加方法は、１つの側面では、植物に、前述した気孔増加剤を接触させることを特徴とする方法である（以下、「方法１」という）。方法１では、前記気孔増加剤を用いているので、未分化の表皮細胞を、気孔を構成する孔辺細胞に分化させ、植物における気孔の数および／または密度を増加させることができる。

方法１において、植物と前記気孔増加剤との接触は、前記気孔増加剤を含む溶液（例えば、前記気孔増加剤と助剤としての培地を少なくとも含む気孔形成剤など）への植物の浸漬や、植物の葉、茎、萼、葯などに対する前記気孔増加剤の直接塗布、散布、噴霧などの操作により行なわれる。方法１においては、植物と前記気孔増加剤との接触を前記したような簡単な操作で行なうことができる。

植物に接触させる前記気孔増加剤の量は、植物に形成させる気孔の量などに応じて適宜設定することができる。また、植物と前記気孔増加剤との接触時間は、植物の種類などに応じて、適宜設定することができる。

かかる方法１を適用する対象となる植物は、気孔を有し、かつ前記気孔増加剤中に含まれる前記化合物が結合するレセプターを有する植物であればよい。前記植物は、気孔形成効果が大きいことから、維管束植物が好ましい。前記維管束植物としては、特に限定されないが、例えば、ダイズなどに代表されるマメ科植物、イネなどに代表されるイネ科植物、シロイヌナズナに代表されるアブラナ科植物、ブラックコットンウッドなどに代表されるヤナギ科植物、イヌカタヒバに代表されるイワヒバ科植物などが挙げられる。また、前記植物は、気孔形成効果が大きいことから、若い葉や葉芽を有することが好ましい。特に、植物を、前記気孔増加剤を含む溶液（例えば、前記気孔増加剤と助剤としての培地を少なくとも含む気孔形成剤など）に浸漬させる場合には、気孔形成効果が大きいことから、幼若植物（例えば、２〜１６日齢の植物など）が好ましい。

さらに、本発明の植物における気孔の数および／または密度の増加方法は、他の側面では、植物において、前述したポリペプチドを過剰発現させることを特徴とする方法である（以下、「方法２」という）。方法２では、植物において、前記ポリペプチドを過剰発現させるので、未分化の表皮細胞を、気孔を構成する孔辺細胞に分化させ、植物における気孔の数および／または密度を増加させることができる。

植物において、前記ポリペプチドを過剰発現させる方法（ポリペプチド過剰発現法）としては、例えば、方法２を適用する対象となる植物のプロトプラスト、カルスまたはリーフディスクに、本発明のポリペプチドをコードする核酸を、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、トランスフェクション法などで導入し、葉、根などに再分化させ、植物体を再生する方法などが挙げられる。葉への再分化は、例えば、プロトプラストの場合、該プロトプラストを固体栄養培地で培養して、細胞壁を合成させ、ついで、液体培地中で、激しく攪拌させながら、培養し、カルスを得、得られたカルスをオーキシンおよびサイトカイニンの存在下に培養することにより行なわれうる。また、カルスから葉への再分化は、例えば、低濃度のオーキシンと高濃度のサイトカイニンとの存在下に培養することにより行なわれうる。リーフディスクから葉の再分化は、例えば、リーフディスクを低濃度のオーキシンと高濃度のサイトカイニンとの存在下に培養することにより行なわれうる。前記葉への再分化の際に用いられる培地としては、植物の種類などに応じて適宜選択することができ、例えば、カルス誘導培地（１ｍｇ／Ｌインドール酢酸と１ｍｇ／Ｌベンジルアミノプリンとを含むＭＳ培地）、シュート誘導培地（０．１ｍｇ／Ｌインドール酢酸と１ｍｇ／Ｌベンジルアミノプリンとを含むＭＳ培地）などが挙げられる。なお、本明細書において、「過剰発現」とは、少なくとも野生型の植物における前記ポリペプチドの発現量よりも多く本発明のポリペプチドを産生することをいう。

かかる方法２を適用する対象となる植物は、方法１を適用する対象となる植物と同様である。

以上のように、本発明の気孔増加剤、ポリペプチド、植物における気孔の数および／または密度の増加方法によれば、植物における気孔、例えば、植物の葉、茎、萼、葯などにおいて、気孔形成を正に制御して、未分化の表皮細胞を孔辺細胞に分化させ、気孔の数および／または密度を増加することができる。したがって、本発明によれば、植物による二酸化炭素の吸収量の向上を図ることができるので、大気中における二酸化炭素量の低減に有用である。また、本発明によれば、二酸化炭素の吸収量の増大によって植物における炭素固定量を増大させることができるので、植物体としての収量の増量などを図ることができる。

３．植物における気孔の数および／または密度の増加方法により得られる植物
前述した植物における気孔の数および／または密度の増加方法により得られる植物は、野生型の植物に比べて、気孔の数および／または密度が増加している。したがって、本発明の植物によれば、二酸化炭素の吸収量が向上しているので、大気中における二酸化炭素量を低減することが可能になる。また、本発明の植物によれば、二酸化炭素の吸収量の増大によって炭素固定量が増大しているので、収量の増量などを図ることができる。

前記植物としては、気孔の数および／または密度の増加による効果が大きいことから、維管束植物が好ましい。前記維管束植物としては、特に限定されないが、例えば、ダイズなどに代表されるマメ科植物、イネなどに代表されるイネ科植物、シロイヌナズナに代表されるアブラナ科植物、ブラックコットンウッドなどに代表されるヤナギ科植物、イヌカタヒバに代表されるイワヒバ科植物などが挙げられる。

４．植物の収量の増加方法
本発明の植物の収量の増加方法は、植物に、前述した気孔増加剤を接触させるか、または植物において、前述したポリペプチドを過剰発現させることを特徴としている。

本発明の植物の収量の増加方法は、１つの側面では、植物に、前記気孔増加剤を接触させることを特徴とする方法である（以下、「方法３」という）。方法３では、前記気孔増加剤を用いているため、野生型の植物（野生株）と比べて、植物における気孔の数および／または密度を増加させることができ、植物における炭素固定量を増加させ、植物の収量を増加させることができる。また、かかる方法３では、例えば、前記気孔増加剤を植物に直接塗布、散布または噴霧することなどの簡単な操作を行なうことで、簡便に植物の収量を増加させることができる。

植物と前記気孔増加剤との接触は、前記方法１における植物と前記気孔増加剤との接触と同様の方法により行なうことができる。また、植物に接触させる前記気孔増加剤の量および植物と前記気孔増加剤との接触時間は、前記方法１における植物に接触させる前記気孔増加剤の量および植物と前記気孔増加剤との接触時間と同様である。さらに、方法３を適用する対象となる植物は、前記方法１を適用する対象となる植物と同様である。

本発明の植物の収量の増加方法は、他の側面では、植物において、前記ポリペプチドを過剰発現させることを特徴とする方法である（以下、「方法４」という）。方法４では、植物において、前記ポリペプチドを過剰発現させるので、前記ポリペプチドを過剰発現していない野生型の植物（野生株）と比べて、植物における気孔の数および／または密度を増加させることができ、植物における炭素固定量を増加させ、植物の収量を増加させることができる。

植物における前記ポリペプチドの過剰発現は、前記方法２におけるポリペプチド過剰発現法と同様の手法により行なうことができる。方法４を適用する対象となる植物は、前記方法２を適用する対象となる植物と同様である。

以上の説明したように、本発明の植物の収量の増加方法によれば、植物における炭素固定量を増加させ、植物の収量を増加させることができる。したがって、本発明の植物の収量の増加方法は、食糧の増産、植物による有用物質の生産量の増加などに有用である。

５．気孔増加剤の評価方法
植物において、本発明のポリペプチドの発現量または当該ポリペプチドをコードする核酸の量を指標として、気孔増加剤を評価することができる。具体的には、被験物質を、本発明のポリペプチドを発現する細胞または当該細胞を少なくとも保持する植物と接触させ、前記被験物質の非接触時における前記ポリペプチドの発現量に対する前記被験物質の接触時におけるポリペプチドの発現量の変化、および前記被験物質の非接触時における前記ポリペプチドをコードする核酸の量に対する前記被験物質の接触時におけるポリペプチドをコードする核酸の量の変化の少なくとも１つを測定する。

ここで、前記被験物質としては、特に限定されないが、例えば、無機化合物、有機化合物、植物や微生物の抽出物、動物代謝産物、微生物培養物などが挙げられる。前記被験物質は、そのまま用いてもよく、必要に応じて、溶媒に溶解させて用いてもよい。前記溶媒は、前記生理学的事象の測定に影響を与えない溶媒であることが好ましい。前記溶媒としては、例えば、生理的食塩水、水などが挙げられる。

被験物質と前記細胞との接触は、前記被験物質を含む培地で前記細胞を培養することなどにより行なうことができる。また、被験物質と前記植物との接触は、前記被験物質を含む溶液に前記植物を浸漬させること、前記植物の葉、茎、萼、葯などに被験物質を直接塗布、散布、噴霧などをすることなどにより行なわれる。

前記培地としては、前記細胞または植物が生育するのに適した成分〔例えば、グルコース、アミノ酸、ペプトン、ビタミンなど〕を含む培地であればよい。前記培地は、慣用の基本培地に前記成分を補った培地であってもよく、市販されている培地であってもよい。かかる培地は、細胞や植物の種類に応じて適宜選択することができる。

また、前記溶液を構成する溶媒としては、前記細胞や植物を維持するに適した緩衝液などが挙げられる。

植物に接触させる被験物質の量は、被験物質の種類に応じて適宜設定することができる。

ポリペプチドの発現量の発現量は、前記ポリペプチドに結合する抗体を用い、例えば、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法などを行なうことにより測定することができる。また、核酸の量は、前記核酸に基づいて作製されたプローブを用いたサザンブロット法やノーザンブロット法、前記核酸に基づいて作製されたプライマー対などを用いたリアルタイムＰＣＲなどにより測定することができる。

かかる気孔増加剤の評価方法では、前記被験物質の非接触時における前記ポリペプチドの発現量に対して、前記被験物質の接触時におけるポリペプチドの発現量が多くなっている場合、および前記被験物質の非接触時における前記ポリペプチドをコードする核酸の量に対して、前記被験物質の接触時におけるポリペプチドをコードする核酸の量が多くなっている場合のそれぞれにおいて、被験物質が気孔増加剤であると評価することができる。

以下、実施例などにより、本発明を詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。

なお、以下の実施例などにおいて、配列番号：６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを「ストマジェン」とも表記する。また、前記ストマジェンをコードする遺伝子を「ストマジェン遺伝子」とも表記する。さらに、配列番号：６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの前駆体であるポリペプチド（配列番号：１）についても、便宜的に、「ストマジェン」と表記することもある。

（実施例１）
コンピュータによる遺伝子の探索（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）
シロイヌナズナのトランスクリプトームのデータベースＡＴＴＥＤ−ＩＩ（ウェブページアドレス ｈｔｔｐ：／／ａｔｔｅｄ．ｊｐ／）と、プログラムとしてＡＴＴＥＤ−ＩＩのＴｏｏｌにある「ＮｅｔｗｏｒｋＤｒａｗｅｒ」とを用いてコンピュータによる遺伝子探索を行ない、ＴＭＭ遺伝子、ＳＤＤ１遺伝子およびＥＰＦ１遺伝子それぞれと共発現している遺伝子を検討した。遺伝子探索は、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ３の中で［Ｅｘｅｃｕｔｅ］、［ＭＲ−ｒａｎｋ ｍｅｔｈｏｄ］および［ｔｏｐ ３００ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ２２，２６３ ｇｅｎｅｓ］を選択する工程、Ａｔ１ｇ８００８０（ＴＭＭ遺伝子）、Ａｔ１ｇ０４１１０（ＳＤＤ１遺伝子）およびＡｔ２ｇ２０８７５（ＥＰＦ１遺伝子）の３つの遺伝子を入力する工程、ならびに「ｓｕｂｍｉｔ」で解析する工程を行なうことにより実施した。

かかる解析結果に基づいて、ＥＰＦファミリーに属するＥＰＦＬ９遺伝子（Ａｔ４ｇ１２９７０）という機能未知の遺伝子（ストマジェン遺伝子）に注目した。

（調製例１）
プライマーのデザイン
以下の実施例などに用いるプライマーおよびその塩基配列を表１に示す。

なお、プライマーＣＡＣＣ＿ａｍｉＡ、プライマーＰ１０ａｍｉ１＿Ｉ ｍｉＲ−ｓ、プライマーＰ１０ａｍｉ１＿ＩＩ ｍｉＲ−ａ、プライマーＰ１０ａｍｉ１＿ＩＩＩ ｍｉＲ＊ｓ、プライマーＰ１０ａｍｉ１＿ＩＶ ｍｉＲ＊ａ、プライマーＰ１０ａｍｉ２＿ＩｍｉＲ−ｓ、プライマーＰ１０ａｍｉ２＿ＩＩｍｉＲ−ａ、プライマーＰ１０ａｍｉ２＿ＩＩＩｍｉＲ＊ｓ、プライマーＰ１０ａｍｉ２＿ＩＶｍｉＲ＊ａおよびプライマーａｍｉＢは、ストマジェン遺伝子（遺伝子番号Ａｔ４ｇ１２９７０）の発現抑制を行なうための人工マイクロＲＮＡを含むヘアピン構造を形成する配列を作製するためのプライマーである。かかる人工マイクロＲＮＡは、ストマジェン遺伝子の３’末端側のコーディング領域をターゲットにしている。人工マイクロＲＮＡの設計には、マイクロＲＮＡデザインプログラムＷＭＤ２〔ウェブアドレス ｈｔｔｐ：／／ｗｍｄ２．ｗｅｉｇｅｌｗｏｒｌｄ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｍｉｒｎａｔｏｏｌｓ．ｐｌ〕を用いた。

（調製例２）
ストマジェンに対する抗体の作製
シロイナズナＣｏｌ−０系統（ＣＳ６００００）〔野生株〕のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示されたプライマーＰ１０＿ＦおよびプライマーＰ１０＿Ｒを用い、ストマジェンをコードしている領域をＰＣＲで増幅した。その後、得られたＰＣＲ産物をベクター〔ｐＥＴ３２（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に由来するベクター（文献２３参照）〕に挿入した。得られた構築物を、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１系統に導入し、ストマジェンを発現させた。

前記大腸菌の発現産物を、アフィニティーカラム〔ＧＥヘルスケア社製、商品名：Ｈｉ−Ｔｒａｐ キレーティングカラム〕を用いたアフィニティークロマトグラフィーに供した後、陰イオン交換カラム〔ＧＥヘルスケア社製、商品名：Ｈ−ＳＰ〕を用いたクロマトグラフィーに供して組換えタンパク質（ストマジェン）の精製を行なった。

つぎに、得られた精製産物を、文献２６の記載に従って、ウサギに注射した。その後、ウサギの血清を採取した。得られた血清から、ストマジェンに対する抗体（以下、「抗ストマジェン抗体」を得た。

（調製例３）
タバコ培養細胞ＢＹ−２を用いた組み換えタンパク質の発現
ストマジェンと緑色蛍光タンパク質（以下、「ＧＦＰ」という）との融合タンパク質（以下、「ストマジェン−ＧＦＰ」という）およびＥＰＦ１とＧＦＰとの融合タンパク質（以下、「ＥＰＦ１−ＧＦＰ」という）を、文献２０に記載の方法に準じ、トマトモザイクウィルスによる発現ベクターと誘導型ウィルス感染システムを用いたタバコ培養細胞系を用いて作製した。

まず、ストマジェンをコードするＤＮＡを、シロイナズナＣｏｌ−０系統（ＣＳ６００００）〔野生株〕のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示されたプライマーＰ１０＿ＦおよびプライマーＰ１０Ｒを用いてＰＣＲを行なうことにより得た。また、ＧＦＰをコードするＤＮＡを、ＧＦＰのｃＤＮＡを鋳型とし、表１に示されたプライマーＧＦＰ−ＣｆｕｓＦ ＢｓｔおよびプライマーＧＦＰ−ＣｆｕｓＲ Ｂｓｔを用いてＰＣＲを行なうことにより得た。ストマジェンをコードするＤＮＡと、ＧＦＰをコードするＤＮＡとを連結して、ＤＮＡ構築物（以下、「ストマジェン−ＧＦＰ ＤＮＡ」という）を得た。つぎに、トマトモザイクウィルスベクターｐＢＩＣＥＲ８−ＴｏＭＶ−Ｃ０．３−ＨｕＩＦＮγ−ＳＲｚ２２中のＨｕＩＦＮγ遺伝子の領域を、ストマジェン−ＧＦＰ ＤＮＡと置き換え、ストマジェン−ＧＦＰを発現させるためのベクター（以下、「ストマジェン−ＧＦＰ発現ベクター」という）を得た。

また、ＥＰＦ１をコードするＤＮＡを、シロイナズナＣｏｌ−０系統（ＣＳ６００００）〔野生株〕のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示されたプライマーＥＰＦ１＿ＦおよびプライマーＥＰＦ１＿Ｒを用いてＰＣＲを行なうことにより得た。ＥＰＦ１をコードするＤＮＡと、ＧＦＰをコードするＤＮＡとを連結して、ＤＮＡ構築物（以下、「ＥＰＦ１−ＧＦＰ ＤＮＡ」という）を得た。つぎに、トマトモザイクウィルスベクターｐＢＩＣＥＲ８−ＴｏＭＶ−Ｃ０．３−ＨｕＩＦＮγ−ＳＲｚ２２中のＨｕＩＦＮγ遺伝子の領域を、ＥＰＦ１−ＧＦＰ ＤＮＡと置き換え、ＥＰＦ１−ＧＦＰを発現させるためのベクター（以下、「ＥＰＦ１−ＧＦＰ発現ベクター」という）を得た。

得られたストマジェン−ＧＦＰ発現ベクターまたはＥＰＦ１−ＧＦＰ発現ベクターを、エストロジェンで誘導される転写因子であるＸＶＥを持つＢＹ−２細胞に導入した。その後、文献２０に記載の方法に従い、β−エストロジェンによる誘導を行なった。その後、細胞を回収し、破砕した。得られた破砕物を８００ｒｐｍで３分間の遠心分離に供して、上清を得た。得られた上清からストマジェン−ＧＦＰまたはＥＰＦ１−ＧＦＰを含む画分を得た。

（実験例１）
抗ストマジェン抗体の特異性の評価
調製例３で得られたストマジェン−ＧＦＰを含む画分およびＥＰＦ１−ＧＦＰを含む画分それぞれをＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルと、抗ストマジェン抗体および抗ＧＦＰ抗体それぞれとを用い、文献２４に記載の方法に準じてウエスタンブロット解析を行ない、調製例２で得られた抗ストマジェン抗体の特異性を評価した。なお、抗ストマジェン抗体は、１／１０００の濃度で用いた。二次抗体として、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合型抗ウサギＩｇＧ−ヤギ抗体〔ＧＥヘルスケア社製、商品名：ＮＡ９３４〕を１／５０００の濃度で用いた。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルをクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色した。調製例２で得られた抗ストマジェン抗体の特異性を調べた結果を図２に示す。図中、矢印はストマジェン−ＧＦＰに対応するバンドの位置、アスタリスクは非特異的なバンドの位置を示す。

図２に示された結果から、抗ストマジェン抗体は、ストマジェン−ＧＦＰに結合するが（図２のレーン６参照）、ＥＰＦ１−ＧＦＰには結合しないことがわかる（図２のレーン５参照）。すなわち、抗ストマジェン抗体は、ストマジェン−ＧＦＰのみを認識し、ＥＰＦ１−ＧＦＰを認識しないことがわかる。これに対し、抗ＧＦＰ抗体は、ストマジェン−ＧＦＰおよびＥＰＦ１−ＧＦＰの両方に結合することがわかる（図２のレーン３および４参照）。すなわち、抗ＧＦＰ抗体は、ストマジェン−ＧＦＰおよびＥＰＦ１−ＧＦＰの両方を認識することがわかる。

（調製例４）
まず、以下のように操作を行ない、ゲートウェイ・クローニング・テクノロジー〔Ｇａｔｅｗａｙ ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ｛インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）｝〕に基づくプラント・バイナリーベクター（Ｐｌａｎｔ ｂｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒ）を利用してストマジェン過剰発現用ベクターの作製を行なった。ストマジェンをコードするＤＮＡを、シロイナズナＣｏｌ−０系統（ＣＳ６００００）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示されたプライマーＰ１０＿ＦおよびプライマーＰ１０＿Ｒを用いてＰＣＲを行なうことにより得た。ＢＰクロナーゼ〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製〕を用い、前記ＤＮＡをベクター〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製、商品名：ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ〕に導入した。その後、得られた構築物とＬＲクロナーゼとを用い、前記ＤＮＡを前記構築物からバイナリーベクターｐＢ２ＧＷ７〔Ｇｅｎｔ大学ＶＩＢより供与〕に移しかえた。これにより、ストマジェン過剰発現用ベクターを得た。

つぎに、ストマジェン過剰発現用ベクターをアグロバクテリウム（系統ＧＶ３１０１）に導入した。つぎに、得られたアグロバクテリウムをシロイヌナズナＣｏｌ−０系統（ストック番号ＣＳ６００００）に感染させることにより、前記ＤＮＡをシロイヌナズナＣｏｌ−０系統に導入した。その後、得られたシロイヌナズナを生育させ、種子を採取した。採取された種子を、グルホシネートアンモニウム含有ＧＭ培地〔５０μＭグルホシネートアンモニウム、０．５質量％ＭＳソルト、１質量％ショ糖、０．５質量％ＭＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ５．７）、０．５質量％ ゲランガム〕に播種し、２２℃で光量を一定に維持しながら生育させた。これにより、グルホシネートアンモニウム耐性の個体を選抜した。

選抜された個体（Ｔ１）を、個体ごとに生育させて次世代の種子（Ｔ２）を得た。選抜された個体（Ｔ１）のうちの１０番目の個体（Ｔ１）から得た種子をストマジェン過剰発現株１０とした。選抜された個体（Ｔ１）のうちの２番目の個体（Ｔ１）から得た種子をストマジェン過剰発現株２とした。

（調製例５）
人工マイクロＲＮＡクローニング用プラスミドｐＲＳ３００〔デトレフ・ウェイゲル（Ｄｅｔｌｅｆ Ｗｅｉｇｅｌ）博士より供与〕を鋳型とし、表１に示されたプライマーＣＡＣＣ＿ａｍｉＡ、プライマーＰ１０ａｍｉ＿１ ｍｉＲ−ｓ、プライマーＰ１０ａｍｉ１＿ＩＩ ｍｉＲ−ａ、プライマーＰ１０ａｍｉ１＿ＩＩＩ ｍｉＲ−＊ｓ、プライマーＰ１０ａｍｉ１＿ＩＶ ｍｉＲ＊ａ、プライマーａｍｉＢを用いて人工マイクロＲＮＡ(ａｍｉＲＮＡ)を含むヘアピン構造を形成する配列からなるＤＮＡを作製し、ベクター〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製、商品名：ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ〕に導入した。その後、得られた構築物とＬＲクロナーゼとを用い、前記ＤＮＡを前記構築物からバイナリーベクターｐＢ２ＧＷ７〔Ｇｅｎｔ大学ＶＩＢより供与〕に移しかえた。これにより、ストマジェン発現抑制用ベクターを得た。

つぎに、ストマジェン発現抑制用ベクターをアグロバクテリウム（系統ＧＶ３１０１）に導入した。つぎに、得られたアグロバクテリウムをシロイヌナズナＣｏｌ−０系統（ストック番号ＣＳ６００００）に感染させることにより、前記ＤＮＡをシロイヌナズナＣｏｌ−０系統に導入した。その後、得られたシロイヌナズナを生育させ、種子を採取した。採取された種子を、グルホシネートアンモニウム含有ＧＭ培地に播種し、２２℃で光量を一定に維持しながら生育させた。これにより、グルホシネートアンモニウム耐性の個体を選抜した。

選抜された個体（Ｔ１）を、個体ごとに生育させて次世代の種子（Ｔ２）を得た。選抜された個体（Ｔ１）のうちの１０番目の個体（Ｔ１）から得た種子をストマジェン発現抑制株１０（ＳＴＯＭＡＧＥＮ-ＲＮＡｉ）とした。選抜された個体（Ｔ１）のうちの２番目の個体（Ｔ１）から得た種子をストマジェン発現抑制株２とした。

（調製例６）
ストマジェン過剰発現用ベクターを導入したアグロバクテリウム（系統ＧＶ３１０１）を、シロイヌナズナｐＴＭＭ：：ＧＦＰ系統〔島根大学の中川強博士より供与〕に感染させたことを除き、調製例４と同様の操作を行ない、ストマジェン過剰発現ｐＴＭＭ：：ＧＦＰ株を得た。

（試験例１）
植物の表現型に対するストマジェンの作用の評価
シロイナズナＣｏｌ−０系統（ストック番号ＣＳ６００００）〔野生株〕、調製例４で得られたストマジェン過剰発現株１０および調製例５で得られたストマジェン発現抑制株１０（ＳＴＯＭＡＧＥＮ-ＲＮＡｉ）それぞれの成熟した第１葉を採取した。つぎに、前記第１葉を、固定液（エタノール：酢酸（体積比）＝９：１）で７時間以上固定し、その後、抱水クロラール水溶液（抱水クロラール：水：グリセロール（体積比）＝８：２：１）で透明化した。抱水クロラールを水で除いた後、１μｇ／ｍＬサフラニン水溶液〔１μｇサフラニン−Ｏ／ｍＬ水〕で気孔を染色した。その後、前記第１葉の裏側表皮を、微分干渉顕微鏡〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：Ａｘｉｏｓｋｏｐ ｐｌｕｓ顕微鏡〕を用いて観察した。試験例１において、野生株の成熟した第１葉の裏側表皮を観察した結果を示す微分干渉像を図３（ａ）、試験例１において、ストマジェン発現抑制株１０の成熟した第１葉の裏側表皮を観察した結果を示す微分干渉像を図３（ｂ）および試験例１において、ストマジェン過剰発現株１０の成熟した第１葉の裏側表皮を観察した結果を示す微分干渉像を図３（ｃ）に示す。図中、スケールバーは５０μｍを示す。

また、野生株、調製例４で得られたストマジェン過剰発現株２および調製例５で得られたストマジェン発現抑制株２それぞれの発芽後２３日目の子葉、成長が終わった第２節間の茎、成熟した果実、一定の大きさの花についた葯をそれぞれ採取した。つぎに、前記と同様の操作を行なうことにより、前記子葉、茎および果実それぞれを、固定し、透明化した後、気孔を染色した。その後、前記子葉、茎および果実それぞれの表皮を、微分干渉顕微鏡〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：Ａｘｉｏｓｋｏｐ ｐｌｕｓ顕微鏡〕を用いて観察した。また、前記葯の表皮を、共焦点顕微鏡〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：ＬＳＭ５１０ ＭＥＴＡ顕微鏡〕と４８８ｎｍおよび５４４ｎｍの４０ｍＷ Ａｒ／Ｋｒレーザーを用いて観察した。試験例１において、野生株、ストマジェン発現抑制株２およびストマジェン過剰発現株２それぞれにおける子葉、茎および果実の表皮を観察した結果を示す微分干渉像ならびに葯の表皮を観察した結果を示す共焦点顕微鏡像を図４に示す。図中、矢尻は、気孔を示す。また、図中、スケールバーは１００μｍを示す。

また、シロイナズナＣｏｌ−０系統（ストック番号ＣＳ６００００）〔野生株〕、調製例４で得られたストマジェン過剰発現株２および調製例５で得られたストマジェン発現抑制株２それぞれの発芽後２３日目の子葉、成熟した果実または成長が終わった第２節間の茎を採取した。つぎに、前記子葉、果実または茎の表面を、微分干渉顕微鏡〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：Ａｘｉｏｓｋｏｐ ｐｌｕｓ顕微鏡〕を用いて観察し、０．２２ｍｍ²の正方形の範囲における気孔の数を測定した。そして、気孔密度を算出した。なお、統計解析には、統計解析ソフトＲ（ウェブアドレス ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を用いた。試験例１において、ストマジェン遺伝子の発現様式と、子葉、果実および茎の各器官における気孔密度との関係を調べた結果を図５に示す。図中、レーン１は野生株、レーン２はストマジェン発現抑制株２およびレーン３はストマジェン過剰発現株２を示す。

さらに、野生株および調製例４で得られたストマジェン過剰発現株１０それぞれの発芽後２．５日目の子葉を採取した。つぎに、子葉を蛍光色素〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製、商品名：ＦＭ４−６４〕で染色した。染色後の子葉の表皮を、共焦点顕微鏡〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：ＬＳＭ５１０ ＭＥＴＡ顕微鏡〕と４８８ｎｍおよび５４４ｎｍの４０−ｍＷ Ａｒ／Ｋｒレーザーを用いて観察した。試験例１において、野生株における子葉の裏側の表皮を観察した結果を示す共焦点顕微鏡像を図６（ａ）および試験例１において、ストマジェン過剰発現株１０における子葉の裏側の表皮を観察した結果を示す共焦点顕微鏡像を図６（ｂ）に示す。図６（ａ）および（ｂ）それぞれにおいて、右上図は、右下図の四角で示した部分を拡大したものである。図中、水平方向のスケールバーは５０μｍ、垂直方向のスケールバーは５００μｍを示す。

また、野生株および調製例６で得られたストマジェン過剰発現ｐＴＭＭ：：ＧＦＰ株それぞれの発芽後５日目の第１葉を採取した。つぎに、前記第１葉の表皮を、共焦点顕微鏡〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：ＬＳＭ５１０ ＭＥＴＡ顕微鏡〕と４８８ｎｍおよび５４４ｎｍの４０−ｍＷ Ａｒ／Ｋｒレーザーとを用いて観察した。なお、共焦点顕微鏡での観察の際には、励起フィルター〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：ＢＰ４５０−４９０〕、ダイクロニックミラー〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：ＦＴ５１０〕、吸収フィルター〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：ＢＰ５１５−５６５〕を用いた。試験例１において、野生株における第１葉の表皮を観察した結果を示す共焦点顕微鏡像を図７（ａ）および試験例１において、ストマジェン過剰発現ｐＴＭＭ：：ＧＦＰ株における第１葉の表皮を観察した結果を示す共焦点顕微鏡像を図７（ｂ）に示す。図中、スケールバーは５０μｍを示す。

図３、図４および図５に示された結果から、Ａｔ４ｇ１２９７０遺伝子、すなわち、ストマジェン遺伝子を過剰発現した場合（ストマジェン過剰発現株）、野生株やストマジェン発現抑制株と比べて、気孔が存在する様々な器官（葉、子葉、茎、果実、葯）において気孔密度が増加することがわかる。このような現象は、独立に作出した１３系統のＴ２植物（各々７個体）で確認された。かかるストマジェン過剰発現株の表現型は、気孔密度が減少するという表現型を示すＥＰＦ１およびＥＰＦ２の過剰発現株（文献４−６）とは全く逆の表現型である。

なお、ほとんどの双子葉植物では気孔同士は少なくとも一つの「非気孔細胞」によって隔てられており、そのパターンは、ガスの取り込みの効率を上げていると考えられている（文献１２）。図３に示された結果から、ストマジェン遺伝子の過剰発現株の成長した葉では、クラスター化した気孔が多数存在する傾向があることがわかる。一方、図６および図７に示された結果から、未熟な子葉などでは、サテライトメリステモイド（気孔前駆細胞）が孔辺細胞やその前駆細胞に接していることがわかる。これらの結果から、ストマジェン過剰発現株では、気孔系列の細胞の細胞分裂の方向が野生株とは異なることに起因して、野生株とは異なる形態的特徴を示すことが考えられる。

（試験例２）
（１）ストマジェン遺伝子の発現の局在性
ストマジェン遺伝子（ＳＴＯＭＡＧＥＮ）の開始コドン上流２ｋｂｐの領域（プロモーター領域）のＤＮＡを、シロイナズナＣｏｌ−０系統（ＣＳ６００００）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示されたプライマーＰ１０＿ｐｒｏｍ＿ＦおよびプライマーＰ１０＿ｐｒｏｍ＿Ｒを用いてＰＣＲを行なうことにより得た。ＢＰクロナーゼ〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製〕を用い、前記ＤＮＡをベクター〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製、商品名：ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ〕に導入した。その後、得られた構築物とＬＲクロナーゼとを用い、前記ＤＮＡを前記構築物からベクターｐＢＧＷＦＳ７〔Ｇｅｎｔ大学ＶＩＢより供与〕に移しかえた。前記ｐＢＧＷＦＳ７は、プロモーターのためのリポーター遺伝子としてβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を保持している。これにより、プロモーター発現用ベクターを得た。

つぎに、プロモーター発現用ベクターをアグロバクテリウム（系統ＧＶ３１０１）に導入した。つぎに、得られたアグロバクテリウムをシロイヌナズナＣｏｌ−０系統（ストック番号ＣＳ６００００）に感染させることにより、前記ＤＮＡをシロイヌナズナＣｏｌ−０系統に導入した。その後、得られたシロイヌナズナを生育させ、種子を採取した。採取された種子を、グルホシネートアンモニウム含有ＧＭ培地に播種し、２２℃で光量を一定に維持しながら生育させた。これにより、グルホシネートアンモニウム耐性の個体を選抜した。

選抜された個体（Ｔ１）を、個体ごとに生育させて次世代の種子（Ｔ２）を得た。得られた種子（Ｔ２）をｐＳＴＯＭＡＧＥＮ：：ＧＵＳ株とした。そして、発芽後１８日目のｐＳＴＯＭＡＧＥＮ：：ＧＵＳ株の第９葉の横断切片を作製した。得られた横断切片を用い、ストマジェン遺伝子のプロモーターに基づくＧＵＳ活性の発現を調べた。なお、ＧＵＳ活性の発現は、サンプルを４℃で７〜１０時間固定したことを除き、文献２６に記載のＧＵＳ染色の手法と同様に操作を行なうことによって確認した。試験例２において、発芽後１８日目のｐＳＴＯＭＡＧＥＮ：：ＧＵＳ株の第９葉の横断切片を観察した結果を示す顕微鏡像を図８に示す。

図８に示された結果から、ストマジェン遺伝子のプロモーターに基づくＧＵＳ活性の発現は、主に葉肉組織に多く見られる傾向にあることがわかる。したがって、この結果から、ストマジェン遺伝子は、葉肉組織で発現していることが示唆される。

（２）ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション
シロイナズナＣｏｌ−０系統（ストック番号ＣＳ６００００）〔野生株〕の葉と、ストマジェン遺伝子（ＳＴＯＭＡＧＥＮ）のｃＤＮＡ（３０６ｂｐ）を標識したプローブ（センスプローブ）または前記ｃＤＮＡに対応するアンチセンス鎖を標識したプローブ（アンチセンスプローブ）とを用い、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションを行なった。ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションは、文献２４に記載の手法と同様の操作により行なった。試験例２において、葉原基におけるストマジェン遺伝子のアンチセンスプローブを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析を行なった結果を示す顕微鏡像を図９（ａ）および試験例２において、葉原基におけるストマジェン遺伝子のセンスプローブを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析を行なった結果を示す顕微鏡像を図９（ｂ）に示す。

図９（ａ）および（ｂ）に示された結果から、対照であるセンスプローブに起因するシグナルは検出できないのに対して〔図９（ｂ）参照〕、アンチセンスプローブに起因するシグナルが葉肉組織に見られることがわかる〔図９（ａ）参照〕。

これらの結果から、図６および図７で見られたストマジェン過剰発現株における形態的特徴は、ストマジェンの過剰発現に用いられたベクターに含まれる３５Ｓプロモーターを使用したことにより、ストマジェン遺伝子が表皮細胞において過剰に発現したためであると考えられる。

（調製例７）
調製例５において、表１に示されたプライマーＰ１０ａｍｉ１＿Ｉ ｍｉＲ−ｓ、プライマーＰ１０ａｍｉ１＿ＩＩ ｍｉＲ−ａ、プライマーＰ１０ａｍｉ１＿ＩＩＩ ｍｉＲ＊ｓおよびプライマーＰ１０ａｍｉ１＿ＩＶ ｍｉＲ＊ａの代わりに、表１に示されたプライマーＰ１０ａｍｉ２＿ＩｍｉＲ−ｓ、プライマーＰ１０ａｍｉ２＿ＩＩｍｉＲ−ａ、プライマーＰ１０ａｍｉ２＿ＩＩＩｍｉＲ＊ｓおよびプライマーＰ１０ａｍｉ２＿ＩＶｍｉＲ＊ａを用いたことを除き、調製例５と同様の操作を行ない、ストマジェン発現抑制株（ａｍｉ−Ｂ）を得た。なお、ストマジェン発現抑制株（ａｍｉ−Ｂ）では、人工マイクロＲＮＡであるａｍｉ−Ｂによってストマジェンの発現が抑制されている。ストマジェン遺伝子を含む核酸におけるａｍｉ−Ｂの標的配列の位置は、図１０（ａ）に示されるとおりである。

（調製例８）
調製例５において、鋳型として、人工マイクロＲＮＡクローニング用プラスミドｐＲＳ３００の代わりに、シロイナズナＣｏｌ−０系統（ＣＳ６００００）のゲノムＤＮＡを用いたこと、表１に示されたプライマーＣＡＣＣ＿ａｍｉＡ、プライマーＰ１０ａｍｉ＿１ ｍｉＲ−ｓ、プライマーＰ１０ａｍｉ１＿ＩＩ ｍｉＲ−ａ、プライマーＰ１０ａｍｉ１＿ＩＩＩ ｍｉＲ−＊ｓ、プライマーＰ１０ａｍｉ１＿ＩＶ ｍｉＲ＊ａおよびプライマーａｍｉＢの代わりに、表１に示されたプライマーＰ１０＿ＲＮＡｉ＿ＦおよびプライマーＰ１０＿ＲＮＡｉ＿Ｒを用いたことならびにバイナリーベクターｐＢ２ＧＷ７〔Ｇｅｎｔ大学ＶＩＢより供与〕の代わりに、ベクターｐＢ２ＧＷＩ（２）ＷＧ７〔Ｇｅｎｔ大学ＶＩＢより供与〕を用いたことを除き、調製例５と同様の操作を行ない、ストマジェン発現抑制株（ｄｓＲＮＡ）を得た。なお、ストマジェン発現抑制株（ｄｓＲＮＡ）では、ｄｓＲＮＡによってストマジェンの発現が抑制されている。ストマジェン遺伝子を含む核酸におけるｄｓＲＮＡの標的配列の位置は、図１０（ａ）に示されるとおりである。

（試験例３）
シロイナズナＣｏｌ−０系統（ストック番号ＣＳ６００００）〔野生株〕、調製例５で得られたストマジェン発現抑制株（ストマジェン発現抑制株１０、「ａｍｉ−Ａ」ともいう）、調製例７で得られたストマジェン発現抑制株（ａｍｉ−Ｂ）および調製例８で得られたストマジェン発現抑制株（ｄｓＲＮＡ）それぞれの成熟した第１葉を採取した。つぎに、試験例１と同様の操作を行なうことにより、前記第１葉を、固定し、透明化した後、気孔を染色した。その後、前記第１葉の裏側表皮を、微分干渉顕微鏡〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：Ａｘｉｏｓｋｏｐ ｐｌｕｓ顕微鏡〕を用いて観察した。試験例３において、野生株、ストマジェン発現抑制株（ａｍｉ−Ａ）、ストマジェン発現抑制株（ａｍｉ−Ｂ）およびストマジェン発現抑制株（ｄｓＲＮＡ）それぞれの成熟した第１葉の裏側表皮を観察した結果を示す微分干渉像を図１０（ｂ）に示す。図１０（ｂ）中、（Ｉ）は野生株、（ＩＩ）はストマジェン発現抑制株（ａｍｉ−Ａ）、（ＩＩＩ）はストマジェン発現抑制株（ａｍｉ−Ｂ）および（ＩＶ）はストマジェン発現抑制株（ｄｓＲＮＡ）を示す。また、図１０（ｂ）中、スケールバーは５０μｍを示す。

また、シロイナズナＣｏｌ−０系統（ストック番号ＣＳ６００００）〔野生株〕、調製例５で得られたストマジェン発現抑制株（ａｍｉ−Ａ）、調製例７で得られたストマジェン発現抑制株（ａｍｉ−Ｂ）および調製例８で得られたストマジェン発現抑制株（ｄｓＲＮＡ）それぞれの発芽後５日目の第１葉を採取した。つぎに、前記第１葉の表面を、微分干渉顕微鏡〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：Ａｘｉｏｓｋｏｐ ｐｌｕｓ顕微鏡〕を用いて観察し、０．２２ｍｍ²の正方形の範囲における気孔の数を測定した。そして、気孔密度を算出した。なお、統計解析には、統計解析ソフトＲを用いた。さらに、シロイナズナＣｏｌ−０系統（ストック番号ＣＳ６００００）〔野生株〕、調製例５で得られたストマジェン発現抑制株（ａｍｉ−Ａ）の独立した１２系統、調製例７で得られたストマジェン発現抑制株（ａｍｉ−Ｂ）の独立した１２系統および調製例８で得られたストマジェン発現抑制株（ｄｓＲＮＡ）の独立した４系統それぞれの発芽後５日目の第１葉におけるストマジェン遺伝子の発現量を測定した。また、対照として、前記第１葉におけるアクチン８遺伝子の発現量を測定した。発現量の測定は、鋳型として文献２４に従って抽出したＲＮＡと、リアルタイムＰＣＲ用キット〔ライフテクノロジー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社製、商品名：７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ〕と遺伝子発現アッセイ用キット〔ライフテクノロジー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社製、商品名：ＴａｑＭａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ〕とを用いたリアルタイムＰＣＲによって行なった。用いられたＴａｑｍａｎプローブの番号は、ストマジェン遺伝子の発現量の測定の場合、Ａｔ０２２１９５７５＿ｇ１、アクチン８遺伝子の発現量の測定の場合、Ａｔ０２２７０９５８＿ｇＨである。そして、アクチン８遺伝子に対するストマジェン遺伝子の相対発現量を算出した。相対定量のためにｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ法を用いた（文献２５）。試験例３において、気孔密度とストマジェン遺伝子の相対発現量との関係を調べた結果を図１０（ｃ）に示す。図１０（ｃ）中、黒丸はストマジェン発現抑制株（ａｍｉ−Ａ）、黒三角はストマジェン発現抑制株（ａｍｉ−Ｂ）、四角はストマジェン発現抑制株（ｄｓＲＮＡ）を示す。また、図１０（ｃ）において、野生株は相対発現量１を示す。エラーバーは標準偏差を示す。

図１０（ｂ）に示された結果から、ストマジェン発現抑制株（ａｍｉ−Ａ）、ストマジェン発現抑制株（ａｍｉ−Ｂ）およびストマジェン発現抑制株（ｄｓＲＮＡ）それぞれの成熟した第１葉は、図３に示されたストマジェン発現抑制株１０と同様の表現型を示すことがわかる。また、図１０（ｃ）に示された結果から、ストマジェン遺伝子の相対発現量が１である野生株に対して、ストマジェン遺伝子の相対発現量が１未満であるストマジェン発現抑制株（ａｍｉ−Ａ）、ストマジェン発現抑制株（ａｍｉ−Ｂ）およびストマジェン発現抑制株（ｄｓＲＮＡ）では、気孔密度が著しく低いことがわかる。これらの結果から、ストマジェン遺伝子は、気孔の発生に必要であるということが示唆される。

（試験例４）
シロイナズナＣｏｌ−０系統（ストック番号ＣＳ６００００）〔野生株〕、調製例４で得られたストマジェン過剰発現株１０および調製例５で得られたストマジェン発現抑制株１０それぞれの発芽後２３日目の成熟した第１葉を採取した。つぎに、前記第１葉の表面を、微分干渉顕微鏡〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：Ａｘｉｏｓｋｏｐ ｐｌｕｓ顕微鏡〕を用いて観察し、０．２２ｍｍ²の正方形の範囲における気孔の数を測定した。そして、気孔密度を算出した。なお、統計解析には、統計解析ソフトＲを用いた。また、試験例３と同様に操作を行なうことにより、野生株、ストマジェン過剰発現株１０およびストマジェン発現抑制株１０それぞれの発芽後２３日目の成熟した第１葉におけるストマジェン遺伝子の相対発現量を求めた。試験例４において、気孔密度とストマジェン遺伝子の相対発現量との関係を調べた結果を図１１に示す。図中、丸は野生株、三角はストマジェン発現抑制株１０、四角はストマジェン過剰発現株１０およびエラーバーは標準偏差を示す。

また、野生株、ストマジェン過剰発現株１０およびストマジェン発現抑制株１０それぞれの発芽後２３日目の成熟した第１葉の裏側の表皮を微分干渉顕微鏡〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：Ａｘｉｏｓｋｏｐ ｐｌｕｓ顕微鏡〕を用いて観察し、気孔の数および表皮細胞の数を測定した。そして、気孔インデックス〔気孔の数／（気孔の数＋表皮細胞の数）〕を算出した。その結果を表２に示す。

図１１および表２に示された結果から、ストマジェン遺伝子の発現量と気孔密度または気孔インデックスとの間には正の相関があることがわかる。

したがって、これらの結果から、ストマジェン遺伝子が気孔分化の正の制御因子であることが示唆される。

（試験例５）
発芽後９日目（未熟期）および２３日目（成熟期）それぞれのシロイナズナＣｏｌ−０系統（ストック番号ＣＳ６００００）の根、葉または茎から、文献２４に記載の方法に従ってＲＮＡを抽出した。また、シロイナズナＣｏｌ−０系統（ストック番号ＣＳ６００００）の未熟な花芽または未熟な果実から、文献２４に記載の方法に従ってＲＮＡを抽出した。

得られたＲＮＡを鋳型として用い、試験例３と同様の操作を行なうことにより、ＲＴ−ＰＣＲを行なった。そして、アガロースゲル電気泳動法により、根、葉、茎、花芽および果実それぞれにおけるストマジェン遺伝子の発現の有無を調べた。なお、内部対照として、アクチン遺伝子を用いた。試験例５において、根、葉、茎、花芽および果実それぞれにおけるストマジェン遺伝子の発現の有無を調べた結果を示す電気泳動図を図１２に示す。図中、「ｉ」は未熟期および「ｍ」は成熟期を示す。

図１２に示された結果から、ストマジェン遺伝子は、未熟期の葉、茎や花芽などの器官に主に発現していることがわかる。

（試験例６）
試験例２で作製されたｐＳＴＯＭＡＧＥＮ：：ＧＵＳ株の発芽後２日目、９日目または１６日目の未熟な子葉および幼若葉におけるＧＵＳ活性の発現の有無を観察した。試験例６において、ｐＳＴＯＭＡＧＥＮ：：ＧＵＳ株の発芽後２日目におけるストマジェン遺伝子のプロモーターの発現を解析した結果を図１３（ａ）、試験例６において、ｐＳＴＯＭＡＧＥＮ：：ＧＵＳ株の発芽後９日目におけるストマジェン遺伝子のプロモーターの発現を解析した結果を図１３（ｂ）および試験例６において、ｐＳＴＯＭＡＧＥＮ：：ＧＵＳ株の発芽後１６日目におけるストマジェン遺伝子のプロモーターの発現を解析した結果を図１３（ｃ）に示す。図中、「Ｃ」は子葉および「Ｊ」は幼若葉を示す。

図１３に示された結果から、ｐＳＴＯＭＡＧＥＮ：：ＧＵＳにおいて、未熟な子葉や葉ではＧＵＳ活性が確認されたが、十分に発生が進むとＧＵＳ活性が見られなくなることがわかる。また、かかる現象は、図１２に示された結果とも一致している。これらの発現パターンは気孔の発生は未熟期の器官で進むという事実（文献２）と符合している。また、驚くべきことに、ストマジェン遺伝子のプロモーターに基づくＧＵＳ活性は、葉肉組織で確認することができたが、気孔が分化する表皮組織では確認することができなかった（図８参照）。また、ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＮＡハイブリダイゼーション解析においても同様の結果が示された（図９参照）。

これらの結果により、ストマジェンは、葉肉組織で産生されており、表皮へと伝わるシグナルとして気孔の発生を制御していることが推察される。ストマジェン遺伝子（ＳＴＯＭＡＧＥＮ）の発現パターンは、気孔の発生に関与する遺伝子のほとんどが表皮組織に特異的に発現するということ（文献１０、１３、１４）に対して、逆の例となっていることがわかる。

（調製例９〜１１）
Ｖｅｎｕｓに４つのグリシンがＣ末端に結合したもの（Ｖｅｎｕｓ−Ｇ４）をコードするＤＮＡ、カボチャ２Ｓアルブミンのシグナルペプチド（ＳＰ）をコードするＤＮＡおよびストップコドンを除いたストマジェン遺伝子のオープンリーディングフレームをコードするＤＮＡそれぞれをＰＣＲによって作製した。なお、Ｖｅｎｕｓに４つのグリシンがＣ末端に結合したもの（Ｖｅｎｕｓ−Ｇ４）をコードするＤＮＡの作製には、表１に示されたプライマーＰ１０＿Ｆ、Ｐ−Ｖ＿Ｆ、プライマーＰ−Ｖ＿ＲおよびプライマーＶｅｎｕｓ＿Ｒを用いた。カボチャ２ＳアルブミンのシグナルペプチドをコードするＤＮＡの作製には、プライマー２Ｓｓｐ＿Ｆ、２Ｓｓｐ＜――ｐ１０ｍ、２Ｓｓｐ――＞ｐ１０ｍおよびＰ１０＿Ｒを用いた（文献２２参照）。

前記Ｖｅｎｕｓ−Ｇ４をコードするＤＮＡと前記シグナルペプチドをコードするＤＮＡと前記ストップコドンを除いたストマジェン遺伝子のオープンリーディングフレームをコードするＤＮＡとをプライマー伸長法で連結させることで、ストマジェン−Ｖｅｎｕｓ融合遺伝子を作製した。得られた融合遺伝子をベクター〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製、商品名：ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ〕に導入した。その後、得られた構築物とＬＲクロナーゼとを用い、前記ＤＮＡを前記構築物からベクターｐＢ２ＧＷ７〔Ｇｅｎｔ大学ＶＩＢより供与〕に移しかえた。これにより、ストマジェン−Ｖｅｎｕｓ発現用ベクターを得た。

得られたストマジェン−Ｖｅｎｕｓ発現用ベクターをアグロバクテリウム（系統ＧＶ３１０１）に導入した。得られたアグロバクテリウムをシロイヌナズナＣｏｌ−０系統（ストック番号ＣＳ６００００）に感染させることにより、前記ＤＮＡをシロイヌナズナＣｏｌ−０系統に導入した。その後、得られたシロイヌナズナを生育させ、種子を採取した。採取された種子を、グルホシネートアンモニウム含有ＧＭ培地に播種し、２２℃で光量を一定に維持しながら生育させた。これにより、グルホシネートアンモニウム耐性の個体を選抜した。選抜された個体（Ｔ１）を、個体ごとに生育させて次世代の種子（Ｔ２）を得た。Ｔ２種子のうち、グルホシネートアンモニウム含有ＧＭ培地に播種し、２２℃で光量を一定に維持しながら生育させたときに生存個体：死滅個体（数比）が３：１となるものをさらに選抜し、次世代の種子（Ｔ３種子）を採取した。つぎに、Ｔ３種子のうち、グルホシネートアンモニウム含有ＧＭ培地に播種し、２２℃で光量を一定に維持しながら生育させたときに全ての個体が生き残る系統(ホモ個体)を確立した。得られた個体をストマジェン−Ｖｅｎｕｓ発現株とした（調製例９）。

また、前記シグナルペプチドをコードするＤＮＡと前記ストップコドンを除いたストマジェン遺伝子のオープンリーディングフレームをコードするＤＮＡとをプライマー伸長法によって連結させることにより、ＳＴＯＭＡＧＥＮ＊（成熟型ストマジェンのＮ末端にシグナルペプチドが付加されたポリペプチド）をコードするＤＮＡを得た。その後、ストマジェン−Ｖｅｎｕｓ融合遺伝子の代わりに、ＳＴＯＭＡＧＥＮ＊をコードするＤＮＡを用いたことを除き、前記と同様に操作を行ない、ＳＴＯＭＡＧＥＮ＊発現株を得た（調製例１０）。

さらに、前記シグナルペプチドをコードするＤＮＡと前記Ｖｅｎｕｓ−Ｇ４をコードするＤＮＡとをプライマー伸長法によって連結させることにより、シグナルペプチドとＶｅｎｕｓとの融合物（ＳＰ−Ｖｅｎｕｓ）をコードするＤＮＡを得た。ストマジェン−Ｖｅｎｕｓ融合遺伝子の代わりに、ＳＰ−ＶｅｎｕｓをコードするＤＮＡを用いたことを除き、前記と同様に操作を行ない、ＳＰ−Ｖｅｎｕｓ発現株を得た（調製例１１）。

（試験例７）
シロイナズナＣｏｌ−０系統（ストック番号ＣＳ６００００）〔野生株〕、調製例４で得られたストマジェン過剰発現株１０、調製例１０で得られたＳＴＯＭＡＧＥＮ＊発現株および調製例９で得られたストマジェン−Ｖｅｎｕｓ発現株それぞれの発芽後２３日目の第１葉を採取した。前記第１葉の表面を、微分干渉顕微鏡〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：Ａｘｉｏｓｋｏｐ ｐｌｕｓ顕微鏡〕を用いて観察し、０．２２ｍｍ²の正方形の範囲における気孔の数を測定した。そして、気孔密度を算出した。なお、統計解析には、統計解析ソフトＲ（ウェブアドレス ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を用いた。また、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を行なった。試験例７において、ストマジェン遺伝子の発現様式と、気孔密度との関係を調べた結果を図１４に示す。図中、レーン１は野生株、レーン２はストマジェン過剰発現株１０、レーン３はＳＴＯＭＡＧＥＮ＊発現株およびレーン４はストマジェン−Ｖｅｎｕｓ発現株を示す。また、図中、エラーバーは標準偏差およびアスタリスクは野生株に比較してｐ値が０．０１未満であることを示す。

図１４に示された結果から、調製例１０で得られたＳＴＯＭＡＧＥＮ＊発現株および調製例９で得られたストマジェン−Ｖｅｎｕｓ発現株は、ストマジェン発現株と同様の表現型を示すことがわかる。

（試験例８）
調製例９で得られたストマジェン−Ｖｅｎｕｓ発現株の発芽後３日目の子葉を脱塩水または０．８Ｍマンニトールで処理した。処理後の子葉を蛍光色素〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製、商品名：ＦＭ４−６４〕で染色した。

ＦＭ４−６４で染色したストマジェン−Ｖｅｎｕｓ発現株の発芽後３日後の子葉の裏側表皮を共焦点顕微鏡で観察した。このとき、Ｖｅｎｕｓに基づく蛍光の検出には、励起フィルター〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：ＢＰ４５０−４９０〕、ダイクロニックミラー〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：ＦＴ５１０〕、吸収フィルター〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：ＢＰ５１５−５６５〕を用いた。また、ＦＭ４−６４に基づく蛍光の検出には、励起フィルター〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：ＢＰ５１５−５６０）、ダイクロニックミラー〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：ＦＴ５１０〕、吸収フィルター〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：ＢＰ５１５−５６５〕を用いた。試験例８において、ＦＭ４−６４で染色したストマジェン−Ｖｅｎｕｓ発現株の発芽後３日後の子葉の裏側表皮を観察した結果を示す共焦点顕微鏡像を図１５に示す。図中、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は脱塩水で処理した子葉、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）は０．８Ｍマンニトールで処理した子葉である。また、図中、（ａ）および（ｄ）はＦＭ４−６４に基づく蛍光を検出した結果、（ｂ）および（ｅ）はＶｅｎｕｓに基づく蛍光を検出した結果、（ｃ）および（ｆ）はＦＭ４−６４に基づく蛍光を検出した結果とＶｅｎｕｓに基づく蛍光を検出した結果との重ね合わせを示す。

また、調製例９で得られたストマジェン−Ｖｅｎｕｓ発現株の代わりに、調製例１１で得られたＳＰ−Ｖｅｎｕｓ株またはＬｔｉ６ｂ−ＧＦＰ株〔スタンフォード大学、クリス・サマービル（Ｃｒｉｓ Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ）博士より供与〕を用いたことを除き、前記と同様にして、発芽後３日後の子葉の裏側表皮を観察した。なお、ＧＦＰに基づく蛍光の検出には、励起フィルター〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：ＢＰ４５０−４９０〕、ダイクロニックミラー〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：ＦＴ５１０〕、吸収フィルター〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：ＢＰ５１５−５６５〕を用いた。試験例８において、ＦＭ４−６４で染色したＳＰ−Ｖｅｎｕｓ発現株の発芽後３日後の子葉の裏側表皮を観察した結果を示す共焦点顕微鏡像を図１６（Ａ）および試験例８において、ＦＭ４−６４で染色したＬｔｉ６ｂ−ＧＦＰ株の発芽後３日後の子葉の裏側表皮を観察した結果を示す共焦点顕微鏡像を図１６（Ｂ）に示す。図１６（Ａ）および（Ｂ）中、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は脱塩水で処理した子葉、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）は０．８Ｍマンニトールで処理した子葉である。また、図１６（Ａ）中、（ａ）および（ｄ）はＦＭ４−６４に基づく蛍光を検出した結果、（ｂ）および（ｅ）はＶｅｎｕｓに基づく蛍光を検出した結果、（ｃ）および（ｆ）はＦＭ４−６４に基づく蛍光を検出した結果とＶｅｎｕｓに基づく蛍光を検出した結果との重ね合わせを示す。図１６（Ｂ）中、（ａ）および（ｄ）はＦＭ４−６４に基づく蛍光を検出した結果、（ｂ）および（ｅ）はＧＦＰに基づく蛍光を検出した結果、（ｃ）および（ｆ）はＦＭ４−６４に基づく蛍光を検出した結果とＧＦＰに基づく蛍光を検出した結果との重ね合わせを示す。

図１５および図１６に示された結果から、Ｖｅｎｕｓの蛍光は、原形質分離した細胞の外側に見られることがわかる。かかる結果から、ストマジェンが細胞からアポプラストに分泌されていることが示唆される。従来、「葉肉−表皮の相互作用」を考える場合、従来の知見は葉肉組織の空隙と気孔の位置に関係があるかという形態学的な問題に終始していた（文献１２、１５）。しかしながら、本発明者らによるこれらの知見によれば、表皮−葉肉相互作用により気孔密度が制御されているという新規の重要な視点が提供される。

（実施例２）
シロイナズナＣｏｌ−０系統（ストック番号ＣＳ６００００）〔野生型〕または調製例９で得られたストマジェン−Ｖｅｎｕｓ発現株７ｇを破砕した産物を、溶液〔組成：５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１体積％ＣＡＰＳ液〕５ｍＬに溶解させた。つぎに、得られた試料を、タンパク質単離用キット〔ミルテニー・バイオテック（Ｍｉｌｔｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ）社製、商品名：μＭＡＣＳ ＧＦＰ−ｔａｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ〕のａｎｔｉ−ＧＦＰビーズ２００μＬと混ぜた。得られた混合物を４℃で静置した。ビーズを磁性カラムに吸着させた後、ビーズについたタンパク質を前記タンパク質単離用キットに付属の緩衝溶液で溶出させた。

得られた画分と調製例２で得られた抗ストマジェン抗体とを用い、文献２４に記載の方法に準じてウエスタンブロット解析を行なった。なお、抗ストマジェン抗体は、１／１０００の濃度で用いた。二次抗体として、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合型抗ウサギＩｇＧ−ヤギ抗体〔ＧＥヘルスケア社製、商品名：ＮＡ９３４〕を１／５０００の濃度で用いた。実施例２において、ストマジェン−Ｖｅｎｕｓ発現株から得られた画分について、抗ストマジェン抗体を用いたウエスタンブロット解析を行なった結果を図１７に示す。

図１７に示された結果から、単一のバンドが検出されたことから、前記画分には、抗ストマジェン抗体が結合するポリペプチドが含まれていることがわかる。

つぎに、前記画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。得られた分離産物をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、ミリポア社製）にブロットし、ＣＢＢ染色または抗ストマジェン抗体による検出を行なった。そして、抗ストマジェン抗体が結合したバンドに対応するＣＢＢ染色されたバンドを切り出した後、ポリペプチドを抽出した。自動ペプチドシーケンサー〔ライフテクノロジー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社製、商品名：Ｐｒｏｃｉｓｅ ４９２ｃＬＣ〕を用いて、抽出されたポリペプチド（ストマジェン）のＮ末端アミノ酸配列を決定した。実施例２において、ストマジェンーＶｅｎｕｓのＮ末端アミノ酸配列を解析した結果を図１８に示す。

ストマジェン遺伝子は、Ｎ末端側にシグナルペプチドと予測されるアミノ酸配列を有する１０２アミノ酸からなる小さなタンパク質をコードしている（図１参照）。図１８に示された結果から、ストマジェン−Ｖｅｎｕｓ発現株で産生されたポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列は、ＩＧＳＴＡＰＴＸＴＹ（Ｘは決定不能）（配列番号：１の一部のアミノ酸残基）であり、ストマジェン遺伝子から推定されるアミノ酸配列の５８番目のイソロイシンからの配列と同一であることがわかる。

つぎに、前記ポリペプチドを、文献２７に記載の方法に準じて質量分析によって同定した。まず、前記画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、銀染色で染色した。各バンドは、それぞれ、別々に切り出し、緩衝溶液〔組成：５０ｍＭ炭酸アンモニウム（ｐＨ８．０）、２体積％アセトニトリル〕中で、トリプシンまたはリジルエンドペプチダーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で１日間処理することによってゲル内消化を行なった。消化産物を、質量分析装置〔ブルッカー・ダルトニクス（Ｂｒｕｃｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）社製、商品名：ｕｌｔｒａｆｌｅｘ ＴＯＦ／ＴＯＦ〕を用いたマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析法〔ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）〕に供して質量分析を行なった。実施例２において、リジルエンドペプチダーゼを用い、質量分析によってストマジェン−ＶｅｎｕｓのＮ末端アミノ酸配列を解析した結果を図１９（ａ）および実施例２において、トリプシンを用い、質量分析によってストマジェン−ＶｅｎｕｓのＮ末端アミノ酸配列を解析した結果を図１９（ｂ）に示す。

図１９に示された結果から、トリプシン分解産物のアミノ酸配列はＩＧＳＴＡＰＴＣＴＹＮＥＣＲ（配列番号：１の一部のアミノ酸残基）であり、リジルエンドペプチダーゼ分解産物のアミノ酸配列はＩＧＳＴＡＰＴＣＴＹＮＥＣＲＧＣＲＹＫ（配列番号：１の一部のアミノ酸残基）であることがわかる。かかる結果は、ペプチドシークエンサーによる解析結果と一致している。これらの結果から、ストマジェンは、植物の中で６つのシステインを有する４５アミノ酸のペプチドを生じるように切断されていることがわかる。

Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗにより、ストマジェンのイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（Ｏｓ０１ｇ０９１４４００））、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ（ＡＭ４４４７３２））、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ（Ｐｔ０２ｇ２５５７））およびイヌカタヒバ（Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉ（Ｓｍ０８４７１１））それぞれにおけるオーソログを調べた。実施例２において、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗによるストマジェンのイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（Ｏｓ０１ｇ０９１４４００））、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ（ＡＭ４４４７３２））、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ（Ｐｔ０２ｇ２５５７））およびイヌカタヒバ（Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉ（Ｓｍ０８４７１１））それぞれにおけるオーソログのマルチプルアライメントの結果を図２０に示す。

ストマジェンにシグナルペプチドをつけて過剰に発現させた形質転換体（ＳＰ−ストマジェン発現株）では、気孔密度が増加した（１０の独立な系統、Ｔ２植物で観察、図１４参照）。これは、４５アミノ酸のペプチドが気孔分化を誘導するのに十分であることを示している。また、図２０に示された結果から、ストマジェン様のペプチドをコードする遺伝子は様々な植物に見られ、興味深いことに、原始的な維管束植物であるイヌカタヒバ（Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉ）にも見られることがわかる。これらの結果から、ストマジェンは維管束植物に広く分布しているものと考えられる。したがって、かかるストマジェンは、維管束植物をはじめとする植物において機能すると考えられる。

（実施例３）
純度の高いストマジェン（ｓｔｏｍａｇｅｎ）を得るためにタバコの培養細胞ＢＹ−２にストマジェン遺伝子（ＳＴＯＭＡＧＥＮ）を導入した。

トマトモザイクウィルスベクターｐＢＩＣＥＲ８−ＴｏＭＶ−Ｃ０．３−ＨｕＩＦＮγ−ＳＲｚ２２中のＨｕＩＦＮγ遺伝子の領域を、ストマジェンをコードするＤＮＡと置き換え、ストマジェンを発現させるためのベクター（以下、「ストマジェン発現ベクター」という）を得た。

得られたストマジェン発現ベクターを、エストロジェンで誘導される転写因子であるＸＶＥを持つＢＹ−２細胞に導入し、ストマジェン発現ＢＹ−２細胞を得た。つぎに、文献２０に記載の方法に従い、β−エストロジェンによる誘導を行なった。その後、培養物を、１０００００×ｇで１時間の超遠心分離に供して上清（培地上清）を得た。また、細胞を破砕した後、得られた破砕物を８００ｒｐｍで３分間の遠心分離に供して、上清（細胞抽出物）を得た。

前記培地上清または細胞抽出物と調製例２で得られた抗ストマジェン抗体とを用い、文献２４に記載の方法に準じてウエスタンブロット解析を行なった。なお、抗ストマジェン抗体は、１／１０００の濃度で用いた。二次抗体として、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合型抗ウサギＩｇＧ−ヤギ抗体〔ＧＥヘルスケア社製、商品名：ＮＡ９３４〕を１／５０００の濃度で用いた。また、対照として、ＢＹ−２細胞の培養物の上清を用いた。実施例３において、ストマジェン発現ＢＹ−２細胞の培養物について、抗ストマジェン抗体を用いたウエスタンブロット解析を行なった結果を図２１に示す。図中、「Ｃ」は細胞抽出物、「Ｍ」は培地上清を示す。また、図中、「Ｔ」はストマジェン発現ＢＹ−２細胞、「ＮＴ」はＢＹ−２細胞を示す。

図２１に示された結果から、培地上清には、抗ストマジェン抗体が結合するポリペプチド、すなわち、ストマジェンが含まれていることがわかる。そこで、前記培地上清を用い、以下のように操作を行ない、ストマジェンの精製を行なった。前記培地上清を０．２２μｍ孔フィルター〔ミレックス（Ｍｉｌｌｅｘ）社製〕に通して濾過した。得られた濾液を逆相ＨＰＬＣカラム〔ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製、商品名：ｍＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８ ＳＰ４／６〕に充填した後、洗浄溶液〔組成：５体積％メタノール、０．５体積％トリフルオロ酢酸（以下、「ＴＦＡ」という）、残部水〕で前記カラムを洗浄した。つぎに、展開溶媒Ａ〔組成：９０体積％メタノール、０．５体積％ＴＦＡ、残部水〕と、洗浄溶液とを用い、メタノールの濃度勾配が５体積％から９０体積％となるようにリニア勾配をかけて前記カラムに流すことで溶出を行なった。溶出液を１ｍＬ分取した。各画分について、溶媒を蒸発させることにより、約１００μＬに濃縮した。実施例３において、逆相ＨＰＬＣカラムを用いたストマジェンの精製を行なった際のクロマトグラムを図２２に示す。また、実施例３において、逆相ＨＰＬＣカラムを用いたクロマトグラフィーの各画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した結果を示す電気泳動図を図２３に示す。

図２２および図２３に示された結果から、いくつかの画分で約５ｋＤａの大きさのシングルバンドが見られることがわかる。そこで、１０〜１３番目の画分に含まれるストマジェンのＮ末端アミノ酸配列をエドマン分解により決定した。実施例３において、１０〜１３番目の画分に含まれるストマジェンのＮ末端アミノ酸配列をエドマン分解によって解析した結果を図２４に示す。また、実施例３において、精製された組換えストマジェンの電気泳動図を図２５に示す。

図２４および図２５に示された結果から、野生型のストマジェンと同様のＮ末端配列を有する組換えストマジェンが得られていることがわかる。

（実施例４）
シロイヌナズナ〔Ｌｔｉ６ｂ−ＧＦＰ株〕の種子を、滅菌したＢ５メディウム〔日本製薬（株）製、カタログ番号：３９９−００６２１〕で維持して発芽させた。発芽後２日目のＬｔｉ６ｂ−ＧＦＰ株に対して、実施例２で得られた精製組換えストマジェンをその濃度が２μＭとなるように投与した。その後、Ｌｔｉ６ｂ−ＧＦＰ株を２２℃で３日間生育させ、共焦点顕微鏡を用いて子葉の裏側表皮を観察した。対照として、ストマジェンを投与していないＬｔｉ６ｂ−ＧＦＰ株を用い、前記と同様に操作を行ない、子葉の裏側表皮を観察した。実施例４において、精製組換えストマジェンを投与していないＬｔｉ６ｂ−ＧＦＰ発現株の子葉の裏側表皮の共焦点顕微鏡像を図２６（ａ）および実施例４において、精製組換えストマジェン（２μＭ）を投与したＬｔｉ６ｂ−ＧＦＰ発現株の子葉の裏側表皮の共焦点顕微鏡像を図２６（ｂ）に示す。図中、スケールバーは５０μｍを示す。

図２６に示された結果から、精製組換えストマジェンを投与したＬｔｉ６ｂ−ＧＦＰ発現株の子葉の裏側表皮〔図２６（ｂ）参照〕では、精製組換えストマジェンを投与していないＬｔｉ６ｂ−ＧＦＰ発現株の子葉の裏側表皮〔図２６（ａ）参照〕と比べて、気孔の数および気孔密度が増加していることがわかる。なお、液体培養時におけるエチレンの影響は、チオ硫酸銀を用いて評価したところ、ストマジェンの効果は、エチレンとは無関係であることが確認された。したがって、この結果から、ストマジェンを植物に投与することにより、植物における気孔の数および／または気孔密度を増加させることができることが示唆される。

（実施例５）
配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうち５８番目〜１０２番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド（４５アミノ酸）を化学合成した。得られたポリペプチドを含むポリペプチド溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）を、溶液〔２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）、５０ｍＭ塩化ナトリウム〕に溶解させた。その後、得られた試料を、透析膜〔スペクトラム・ラボラトリーズ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製、商品名：Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３ＭＷＣＯ、３５００〕を用い、４℃で１日間、透析用水溶液〔組成：０．５ｍＭグルタチオン（酸化型および還元型の両方、和光純薬（株）製、酸化型について、カタログ番号：０７７−０３３３４、還元型について、カタログ番号：１９４６７９）、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン（ｐＨ８．０）〕に対して透析した。得られた透析産物を、溶液〔２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）、５０ｍＭ塩化ナトリウム〕に対して３回、１．５日間にわたって透析し、グルタチオンを除去した。これにより、合成ストマジェンを得た。なお、得られた合成ストマジェンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、純度などを確認した。

（実施例６）
シロイヌナズナ〔Ｌｔｉ６ｂ−ＧＦＰ株〕の種子を、滅菌したＢ５メディウムで維持して発芽させた。発芽後２日目のＬｔｉ６ｂ−ＧＦＰ株に対して、実施例５で得られた合成ストマジェンをその濃度が３００ｎＭとなるように投与した。その後、Ｌｔｉ６ｂ−ＧＦＰ株を２２℃で３日間生育させた。つぎに、子葉を採取し、その表面を、共焦点顕微鏡〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：ＬＳＭ５１０ ＭＥＴＡ顕微鏡〕を用いて観察し、０．２２ｍｍ²の正方形の範囲における気孔の数を測定した。そして、気孔密度を算出した。なお、統計解析には、統計解析ソフトＲ（ウェブアドレス ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を用いた。なお、対照として、ストマジェンを投与していないＬｔｉ６ｂ−ＧＦＰ株を用い、前記と同様に操作を行ない、気孔密度を算出した。実施例６において、合成ストマジェン量と気孔密度との関係を調べた結果を図２７に示す。

図２７に示された結果から、合成ストマジェンを投与したＬｔｉ６ｂ−ＧＦＰ発現株の子葉の裏側表皮では、合成ストマジェンを投与していないＬｔｉ６ｂ−ＧＦＰ発現株の子葉の裏側表皮と比べて、気孔密度が増加していることがわかる。なお、液体培養時におけるエチレンの影響は、チオ硫酸銀を用いて評価したところ、ストマジェンの効果は、エチレンとは無関係であることが確認された。したがって、この結果から、合成ストマジェンを植物に投与することにより、植物の気孔密度を増加させることができることが示唆される。以上の結果から、ＢＹ−２細胞で発現させた組換えストマジェン（実施例２）および化学合成されたストマジェン（実施例４）の両方とも、気孔密度を濃度依存的に増加させることができることがわかる。かかる結果から、ストマジェンが気孔誘導因子であることが証明された。

（調製例１２）
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｓｔｏｃｋ ｃｅｎｔｅｒ（ＡＢＲＣ，米国）から取り寄せた種子（系統番号ＳＡＩＬ＿３６＿Ｂ６）を発芽させ、芽生えのＤＮＡを抽出して、表１に示されたプライマーｓｐｃｈ ＳＡＩＬ＿３６＿Ｂ６ ＬＰおよびプライマーＳＡＩＬ＿３６＿Ｂ６＿ＲＰを用いてＰＣＲを行うことで、ＳＰＣＨ遺伝子にＴ−ＤＮＡが挿入された個体を選抜した。これにより、ＳＰＣＨ遺伝子を欠損した変異体のシロイヌナズナ（ｓｐｃｈ変異株）を得た。

（調製例１３）
調製例４において、シロイヌナズナＣｏｌ−０系統の代わりに調製例１２で得られたｓｐｃｈ変異株を用いたことを除き、調製例４と同様の操作を行ない、ストマジェン過剰発現ｓｐｃｈ変異株を得た。

（試験例９）
気孔系列の形成は、ＳＰＥＥＣＨＬＥＳＳ（ＳＰＣＨ）と呼ばれるｂＨＬＨ型の転写因子によって開始されると考えられている（文献１３および文献１４を参照）。そこで、調製例１２で得られたｓｐｃｈ変異株および調製例１３で得られたストマジェン過剰発現ｓｐｃｈ変異株を用い、ストマジェンによる影響を調べた。

ｓｐｃｈ変異株の種子またはシロイナズナＣｏｌ−０系統（ストック番号ＣＳ６００００）〔野生株〕の種子を、滅菌したＢ５メディウムで維持して発芽させた。発芽後２日目のｓｐｃｈ変異株または野生株に対して、実施例２で得られた精製組換えストマジェンをその濃度が２μＭとなるように投与した。その後、ｐｃｈ変異株または野生株を２２℃で３日間生育させ、共焦点顕微鏡〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：ＬＳＭ５１０ ＭＥＴＡ顕微鏡〕を用いて子葉の裏側表皮を観察した。対照として、ストマジェンを投与していないｓｐｃｈ株を用い、前記と同様に操作を行ない、子葉の裏側表皮を観察した。試験例９において、精製組換えストマジェンを投与していないｓｐｃｈ変異株の子葉の裏側表皮の共焦点顕微鏡像を図２８（ａ）、試験例９において、精製組換えストマジェン（２μＭ）を投与したｓｐｃｈ変異株の子葉の裏側表皮の共焦点顕微鏡像を図２８（ｂ）および試験例９において、精製組換えストマジェン（２μＭ）を投与した野生株の子葉の裏側表皮の共焦点顕微鏡像を図２８（ｃ）に示す。

また、ｓｐｃｈ変異株、ストマジェン過剰発現ｓｐｃｈ変異株または調製例４で得られたストマジェン過剰発現株（ストマジェン過剰発現株１０）それぞれの発芽後２３日目の子葉を採取した。つぎに、試験例１と同様の操作を行なうことにより、前記子葉を、固定し、透明化した後、気孔を染色した。その後、前記第１葉の裏側表皮を、微分干渉顕微鏡〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：Ａｘｉｏｓｋｏｐ ｐｌｕｓ顕微鏡〕を用いて観察した。試験例９において、ｓｐｃｈ変異株の子葉の裏側表皮を観察した結果を示す微分干渉像を図２８（ｄ）、試験例９において、ストマジェン過剰発現ｓｐｃｈ変異株の子葉の裏側表皮を観察した結果を示す微分干渉像を図２８（ｅ）および試験例９において、ストマジェン過剰発現株の子葉の裏側表皮を観察した結果を示す微分干渉像を図２８（ｆ）に示す。なお、図２８中、スケールバーは５０μｍを示す。

図２８に示された結果から、ｓｐｃｈ変異株にストマジェンを投与した場合およびｓｐｃｈ変異株中においてストマジェンを過剰発現させた場合のいずれにおいても、気孔は増加しないことがわかる〔図２８（ｂ）および（ｅ）参照〕。したがって、これらの結果から、ストマジェン遺伝子は、ＳＰＣＨ遺伝子が支配する経路に依存して気孔を増やしていることが示唆される。

（調製例１４）
調製例１２において、ＡＢＲＣから取り寄せた種子（系統番号ＳＡＩＬ＿３６＿Ｂ６）の代わりに系統番号ＳＡＬＫ＿０１１９５８を用いたこと、表１に示されたプライマーｓｐｃｈ ＳＡＩＬ＿３６＿Ｂ６ ＬＰおよびプライマーＳＡＩＬ＿３６＿Ｂ６＿ＲＰの代わりに表１に示されたプライマーｔｍｍ ＳＡＬＫ＿０１１９５８−ＬＰおよびプライマーＳＡＬＫ＿０１１９５８−ＲＰを用いたこと、を除き、調製例１２と同様の操作を行ない、ＴＭＭ遺伝子を欠損した変異体のシロイヌナズナ（ｔｍｍ変異株）を得た。

（調製例１５）
調製例４において、シロイヌナズナＣｏｌ−０系統の代わりに調製例１４で得られたｔｍｍ変異株を用いたことを除き、調製例４と同様の操作を行ない、ストマジェン過剰発現ｔｍｍ変異株を得た。

（調製例１６）
調製例５において、シロイヌナズナＣｏｌ−０系統の代わりに調製例１４で得られたｔｍｍ変異株を用いたことを除き、調製例５と同様の操作を行ない、ストマジェン発現抑制ｔｍｍ変異株を得た。

（試験例１０）
ＳＰＣＨは、受容体様タンパク質ＴＭＭとそのリガンド候補であるＥＰＦ１とＥＰＦ２の遺伝子発現を制御している（文献５、１３、１４）。ＴＭＭは、気孔の分化において葉では負に働くが、茎では正に働く（文献１６）。一方、ＥＰＦ１とＥＰＦ２は両方の器官で負に働く（文献４、５）。

そこで、まず、ストマジェンと受容体様タンパク質ＴＭＭとの相互作用を調べた。シロイナズナＣｏｌ−０系統（ストック番号ＣＳ６００００）〔野生株〕、調製例５で得られたストマジェン発現抑制株（ストマジェン発現抑制株１０）、調製例４で得られたストマジェン過剰発現株（ストマジェン過剰発現株１０）、調製例１４で得られたｔｍｍ変異株、調製例１５で得られたストマジェン発現抑制ｔｍｍ変異株および調製例１６で得られたストマジェン過剰発現ｔｍｍ変異株それぞれの成熟した茎または第１葉を採取した。つぎに、茎または第１葉の表面を微分干渉顕微鏡〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：Ａｘｉｏｓｋｏｐ ｐｌｕｓ顕微鏡〕を用いて観察し、０．２２ｍｍ²の正方形の範囲における気孔の数を測定した。そして、気孔密度を算出した。なお、統計解析には、統計解析ソフトＲを用いた。なお、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定を行なった。試験例１０において、植物体の種類と茎における気孔密度との関係を調べた結果を図２９（ａ）および試験例１０において、植物体の種類と葉における気孔密度との関係を調べた結果を図２９（ｂ）に示す。図中、レーン１は野生株、レーン２はストマジェン発現抑制株、レーン３はストマジェン過剰発現株、レーン４はｔｍｍ変異株、レーン５はストマジェン発現抑制ｔｍｍ変異株およびレーン６はストマジェン過剰発現ｔｍｍ変異株を示す。

また、試験例１と同様の操作を行なうことにより、野生株、ストマジェン発現抑制株、ストマジェン過剰発現株、ｔｍｍ変異株、ストマジェン発現抑制ｔｍｍ変異株およびストマジェン過剰発現ｔｍｍ変異株それぞれの成熟した第１葉または茎を、固定し、透明化した後、気孔を染色した。その後、前記第１葉の裏側表皮または茎を、微分干渉顕微鏡〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：Ａｘｉｏｓｋｏｐ ｐｌｕｓ顕微鏡〕を用いて観察した。試験例１０において、野生株、ストマジェン発現抑制株、ストマジェン過剰発現株、ｔｍｍ変異株、ストマジェン発現抑制ｔｍｍ変異株およびストマジェン過剰発現ｔｍｍ変異株それぞれの第１葉の裏側表皮を観察した結果を示す微分干渉像を図３０（Ａ）、試験例１０において、野生株、ストマジェン発現抑制株、ストマジェン過剰発現株、ｔｍｍ変異株、ストマジェン発現抑制ｔｍｍ変異株およびストマジェン過剰発現ｔｍｍ変異株それぞれの茎を観察した結果を示す微分干渉像を図３０（Ｂ）に示す。なお、図中、（ａ）は野生株、（ｂ）はストマジェン発現抑制株、（ｃ）はストマジェン過剰発現株、（ｄ）はｔｍｍ変異株、（ｅ）はストマジェン発現抑制ｔｍｍ変異株および（ｆ）はストマジェン過剰発現ｔｍｍ変異株を示す。また、図中、スケールバーは１００μｍを示す。

図２９および図３０に示された結果から、驚くべきことに、ｔｍｍ変異株（１０の独立した系統Ｔ２植物）において、野生株におけるストマジェン遺伝子の発現量の４４．８±１６．７倍の発現量となるようにストマジェン遺伝子の過剰発現を行なっても、葉と茎の両方で気孔の数を増やすことができないことがわかる。また、ストマジェン遺伝子の発現抑制をｔｍｍ変異体（１０の独立した系統Ｔ２植物）で行なっても、効果がないことがわかった（１０の独立の系統Ｔ２植物で観察、図２９および図３０参照）。これらの結果から、ストマジェンが気孔の発生を正に制御するには、ＴＭＭが必要であることを示している。なお、ＥＰＦ１およびＥＰＦ２は、ＴＭＭにリガンドとして結合することで、気孔分化を負に制御していると考えられている。図２９および図３０に示された結果から、ストマジェンは、ＥＰＦ１またはＥＰＦ２と競争的にＴＭＭと結合しているという可能性が示唆される。

（調製例１７）
調製例１２において、ＡＢＲＣから取り寄せた種子（系統番号ＳＡＩＬ＿３６＿Ｂ６）の代わりに系統番号ＳＡＬＫ＿１３７５４９を用いたことならびに表１に示されたプライマーｓｐｃｈ ＳＡＩＬ＿３６＿Ｂ６ ＬＰおよびプライマーＳＡＩＬ＿３６＿Ｂ６＿ＲＰの代わりに表１に示されたプライマーｅｐｆ１ＳＡＬＫ＿１３７５４９−ＬＰおよびプライマーＳＡＬＫ＿１３７５４９−ＲＰを用いたことを除き、調製例１２と同様の操作を行ない、ＥＰＦ１遺伝子を欠損した変異体のシロイヌナズナ（ｅｐｆ１変異株）を得た。

（調製例１８）
調製例５において、シロイヌナズナＣｏｌ−０系統の代わりに調製例１７で得られたｅｐｆ１変異株を用いたことを除き、調製例５と同様の操作を行ない、ストマジェン発現抑制ｅｐｆ１変異株を得た。

（調製例１９）
調製例１２において、ＡＢＲＣから取り寄せた種子（系統番号ＳＡＩＬ＿３６＿Ｂ６）の代わりに系統番号ＳＡＬＫ＿０４７９１８を用いたことならびに表１に示されたプライマーｓｐｃｈ ＳＡＩＬ＿３６＿Ｂ６ ＬＰおよびプライマーＳＡＩＬ＿３６＿Ｂ６＿ＲＰの代わりに表１に示されたプライマーｅｐｆ２ＳＡＬＫ＿０４７９１８−ＬＰおよびプライマーＳＡＬＫ＿０４７９１８−ＲＰを用いたことを除き、調製例１２と同様の操作を行ない、ＥＰＦ２遺伝子を欠損した変異体のシロイヌナズナ（ｅｐｆ２変異株）を得た。

（調製例２０）
調製例５において、シロイヌナズナＣｏｌ−０系統の代わりに調製例２０で得られたｅｐｆ２変異株を用いたことを除き、調製例５と同様の操作を行ない、ストマジェン発現抑制ｅｐｆ２変異株を得た。

（調製例２１）
調製例１７において得られたｅｐｆ１変異株と調製例１９において得られたｅｐｆ２変異株とのかけあわせを行ない、後代のＦ２世代の個体を発芽させたのちＤＮＡを抽出し、表１に示されたプライマーｅｐｆ１ＳＡＬＫ＿１３７５４９−ＬＰおよびプライマーＳＡＬＫ＿１３７５４９−ＲＰならびにプライマーｅｐｆ２ＳＡＬＫ＿０４７９１８−ＬＰおよびプライマーＳＡＬＫ＿０４７９１８−ＲＰを用い、ＥＰＦ１遺伝子およびＥＰＦ２遺伝子双方にＴ−ＤＮＡが挿入されている個体を選抜した。これにより、ＥＰＦ１遺伝子およびＥＰＦ２遺伝子を欠損した二重変異体のシロイヌナズナ（ｅｐｆ２・ｅｐｆ２二重変異株）を得た。

（調製例２２）
調製例５において、シロイヌナズナＣｏｌ−０系統の代わりに調製例２１で得られたｅｐｆ２・ｅｐｆ２二重変異株を用いたことを除き、調製例５と同様の操作を行ない、ストマジェン発現抑制ｅｐｆ２・ｅｐｆ２二重変異株を得た。

（試験例１１）
ストマジェンと、ＥＰＦ１またはＥＰＦ２との「競争的結合」の可能性を調べるために、ｅｐｆ１変異株またはｅｐｆ２変異株に対してストマジェン遺伝子の発現を抑制し、「気孔密度」と「非気孔細胞密度（気孔以外の細胞の密度）」という２つの指標を解析した。

シロイナズナＣｏｌ−０系統（ストック番号ＣＳ６００００）〔野生株〕、調製例５で得られたストマジェン発現抑制株（ストマジェン発現抑制株１０）、調製例１７で得られたｅｐｆ１変異株、調製例１８で得られたストマジェン発現抑制ｅｐｆ１変異株、調製例１９で得られたｅｐｆ２変異株、調製例２０で得られたストマジェン発現抑制ｅｐｆ２変異株、調製例２１で得られたｅｐｆ１・ｅｐｆ２二重変異株および調製例２２で得られたストマジェン発現抑制ｅｐｆ１・ｅｐｆ２二重変異株それぞれの成熟した第１葉を採取した。つぎに、第１葉の表面を微分干渉顕微鏡〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：Ａｘｉｏｓｋｏｐ ｐｌｕｓ顕微鏡〕を用いて観察し、０．２２ｍｍ²の正方形の範囲における気孔の数を測定した。そして、気孔密度および非気孔細胞密度を算出した。また、統計解析には、統計解析ソフトＲを用いた。また、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を行なった。試験例１１において、植物体の種類と気孔密度との関係を調べた結果を図３１に示す。また、試験例１１において、植物体の種類と非気孔細胞密度との関係を調べた結果を図３２に示す。図中、レーン１は野生株、レーン２はストマジェン発現抑制株、レーン３はｅｐｆ１変異株、レーン４はストマジェン発現抑制ｅｐｆ１変異株、レーン５はｅｐｆ２変異株、レーン６はストマジェン発現抑制ｅｐｆ２変異株、レーン７はｅｐｆ１・ｅｐｆ２二重変異株およびレーン８はストマジェン発現抑制ｅｐｆ１・ｅｐｆ２二重変異株を示す。アスタリスクは、ｐ値が０．０１未満であることを示す。

また、野生株、ストマジェン発現抑制株、ｅｐｆ１変異株、ストマジェン発現抑制ｅｐｆ１変異株、ｅｐｆ２変異株、ストマジェン発現抑制ｅｐｆ２変異株、ｅｐｆ１・ｅｐｆ２二重変異株およびストマジェン発現抑制ｅｐｆ１・ｅｐｆ２二重変異株それぞれの成熟した第１葉を採取した。そして、試験例１と同様の操作を行なうことにより、前記第１葉を、固定し、透明化した後、気孔を染色した。その後、前記茎を、微分干渉顕微鏡〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：Ａｘｉｏｓｋｏｐ ｐｌｕｓ顕微鏡〕を用いて観察した。試験例１１において、植物体の第１葉の裏側表皮を観察した結果を示す微分干渉像を図３３に示す。図中、（ａ）は試験例１１において、野生株の第１葉の裏側表皮を観察した結果を示す微分干渉像の図面代用写真、（ｂ）は試験例１１において、ストマジェン発現抑制株の第１葉の裏側表皮を観察した結果を示す微分干渉像の図面代用写真、（ｃ）は試験例１１において、ｅｐｆ１変異株の第１葉の裏側表皮を観察した結果を示す微分干渉像の図面代用写真、（ｄ）は試験例１１において、ストマジェン発現抑制ｅｐｆ１変異株の第１葉の裏側表皮を観察した結果を示す微分干渉像の図面代用写真、（ｅ）は試験例１１において、ｅｐｆ２変異株の第１葉の裏側表皮を観察した結果を示す微分干渉像の図面代用写真、（ｆ）は試験例１１において、ストマジェン発現抑制ｅｐｆ２変異株の第１葉の裏側表皮を観察した結果を示す微分干渉像の図面代用写真、（ｇ）は試験例１１において、ｅｐｆ１・ｅｐｆ２二重変異株の第１葉の裏側表皮を観察した結果を示す微分干渉像の図面代用写真および（ｈ）は試験例１１において、ストマジェン発現抑制ｅｐｆ１・ｅｐｆ２二重変異株の第１葉の裏側表皮を観察した結果を示す微分干渉像の図面代用写真である。図中、スケールバーは１００μｍを示す。

図３１および図３３に示された結果から、ｅｐｆ１変異株およびｅｐｆ２変異株それぞれの気孔密度は、野生株の気孔密度よりも高くなっているが、ｅｐｆ１変異株およびｅｐｆ２変異株それぞれにおいて、ストマジェン遺伝子の発現を抑制させた場合、減少することがわかる。これらの結果から、ストマジェンが気孔密度をＥＰＦ１やＥＰＦ２とは独立に制御していることが示唆される。

一方で、「非気孔細胞密度」を調べると異なった結果が得られた（図３２参照）。ＥＰＦ２は、気孔系列細胞への分化を負に制御する機能をもっている。図３２に示された結果から、ｅｐｆ２変異体の非気孔細胞密度は、野生株の非気孔細胞密度よりも高くなっていることがわかる。また、野生株において、ストマジェン遺伝子の発現が抑制された場合、非気孔細胞密度が減少することがわかる（１４個の独立な系統Ｔ２植物で観察）。一方、ｅｐｆ２変異体において、ストマジェン遺伝子の発現が抑制された場合、非気孔細胞密度が減少しなかった（１１個の独立な系統Ｔ２植物で観察）。これらの結果から、ストマジェンは、ＥＰＦ２に依存した形で気孔系列細胞の分化を制御していると考えられる。以上のことから、ストマジェン遺伝子は、ＥＰＦ２依存的な気孔系列細胞の分化およびＥＰＦ１やＥＰＦ２に非依存的な気孔細胞の分化の２つの機能を持っていることが推察される。

以上の結果から、３つのシグナル伝達因子、すなわち、ストマジェン、ＥＰＦ１およびＥＰＦ２が共通の受容体ＴＭＭを介して気孔分化を制御していると考えられる。これらのシグナル伝達因子に加えて、ＳＤＤ１遺伝子がＴＭＭ遺伝子の上流で働くことが知られている（文献９）。ＳＤＤ１は負の制御因子の前駆体を切断することで気孔の分化を負に制御していると考えられてきた（文献９、１８）。しかしながら、ＳＤＤ１は、ＥＰＦ１およびＥＰＦ２とは遺伝的に独立であることが示されている（文献４〜６）。別の可能性として、ＳＤＤ１は正の制御因子であるストマジェン（ｓｔｏｍａｇｅｎ）を分解することで気孔分化に負の影響を与えている、という仮説が考えられる。

また、以上の結果から、気孔の分化は、促進性シグナルであるストマジェンと、抑制性シグナルであるＥＰＦ１およびＥＰＦ２という２つの相反する性質を有するシグナルによって制御されているということが示唆される。このような双方向的なシグナルによる制御システムは、気孔密度をより厳密に制御するために重要であろう。また、葉肉細胞に由来するストマジェン（ｓｔｏｍａｇｅｎ）が表皮細胞における気孔系列細胞を気孔に分化させるということも示された。このような組織間相互作用は、気孔分化の概念を発展させる。すなわち、「二酸化炭素の効率的な取り込みのために、光合成をする組織（葉肉）が気孔密度を最適化している」という新しい考え方が提供される。また、ストマジェン（ｓｔｏｍａｇｅｎ）は応用上でも重要である。ストマジェン（ｓｔｏｍａｇｅｎ）を遺伝子組み換えするか、あるいは発達中の作物、樹木などの植物に対して直接投与することで気孔の数および／または気孔密度を増加させて二酸化炭素吸収量を増大させることができることが示唆される。

（試験例１２）
調製例５で得られたストマジェン発現抑制株（ストマジェン発現抑制株１０）、シロイナズナＣｏｌ−０系統（ＣＳ６００００）〔野生株〕または調製例４で得られたストマジェン過剰発現株（ストマジェン過剰発現株１０）を短日条件下で９週間生育させた。

光合成測定装置〔ＬＩ−Ｃｏｒ社製、商品名：ＬＩ−６４００〕を、大気ＣＯ₂を用いてキャリブレーションをした。つぎに、光合成測定装置のチャンバーの光強度を設定した。そして、野生株、ストマジェン発現抑制株またはストマジェン過剰発現株の葉を挟み、光合成測定装置の測定値が安定するまで維持した。その後、ストマジェン発現抑制株、野生株またはストマジェン過剰発現株について、光合成速度と、ガス交換能の指標としての気孔コンダクタンスとを測定した。試験例１２において、ストマジェン遺伝子の発現様式と光合成速度との関係を調べた結果を図３４に示す。また、試験例１２において、ストマジェン遺伝子の発現様式と気孔コンダクタンスとの関係を調べた結果を図３５に示す。図中、レーン１はストマジェン発現抑制株、レーン２は野生株およびレーン３はストマジェン過剰発現株を示す。

図３４および図３５に示された結果から、ストマジェン過剰発現株において、光合成速度が最も大きく、かつガス交換能が最も高いことがわかる。一方、図３４および図３５に示された結果から、ストマジェン発現抑制株において、光合成速度が最も小さく、かつガス交換能が最も低いことがわかる。これらの結果から、植物におけるストマジェン遺伝子の発現量が多くなるほど、光合成速度が大きくなり、かつガス交換能が高くなることが示唆される。

（実施例７）
ストマジェンをコードするｃＤＮＡを、ｐＢ２ＧＷ７に導入し、ストマジェン発現用ベクターを得た。得られたストマジェン発現用ベクターを用い、文献２８に記載の手法に準じて、北海道大学山田哲也博士の下で、ストマジェン過剰発現ダイズを作製した。

（試験例１３）
実施例７で得られたストマジェン過剰発現ダイズおよびダイズ（カリユタカ）〔野生株〕それぞれの葉を採取した。つぎに、葉の表面を微分干渉顕微鏡〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：Ａｘｉｏｓｋｏｐ ｐｌｕｓ顕微鏡〕を用いて観察し、０．２２ｍｍ²の正方形の範囲における気孔の数を測定した。そして、気孔密度を算出した。また、統計解析には、統計解析ソフトＲを用いた。試験例１３において、植物体の種類と気孔密度との関係を調べた結果を図３６に示す。図中、レーン１はストマジェン過剰発現ダイズおよびレーン２は野生株を示す。

また、ストマジェン過剰発現ダイズおよびダイズ（カリユタカ）〔野生株〕それぞれの葉を採取した。そして、試験例１と同様の操作を行なうことにより、前記葉を、固定し、透明化した後、気孔を染色した。その後、前記葉を、微分干渉顕微鏡〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：Ａｘｉｏｓｋｏｐ ｐｌｕｓ顕微鏡〕を用いて観察した。試験例１３において、ストマジェン過剰発現ダイズの葉を観察した結果を示す微分干渉像を図３７に示す。また、試験例１３において、ダイズ（カリユタカ）〔野生株〕の葉を観察した結果を示す微分干渉像を図３８に示す。図中、枠で囲った部分は気孔を示す。また、図中、スケールバーは１００μｍを示す。

図３６、図３７および図３８に示された結果から、ダイズにおいて、ストマジェンを過剰発現させた場合にも、ダイズ（カリユタカ）〔野生株〕（図３８参照）と比べて、気孔密度が増加することがわかる。したがって、かかる結果から、ストマジェンを過剰発現させることにより、ダイズにおける気孔の数および／または気孔密度を増加させることができることがわかる。

（試験例１４）
イネ〔系統「日本晴」〕の種子を、脱塩水５ｍＬが入った容器〔５０ｍＬ容、グライナー社製〕に播種した後、８０μＭストマジェン（実施例５で得られた合成ストマジェン）２００μＬを添加した。そして、種子を２２℃で８日間維持した。その後、植物体を、滅菌したＢ５メディウム中、２２℃で生育させた。播種後３２日目のイネの第２葉を採取した。そして、試験例１と同様の操作を行なうことにより、前記第２葉を、固定し、透明化した後、気孔を染色した。その後、前記第２葉の裏側表皮を、微分干渉顕微鏡〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：Ａｘｉｏｓｋｏｐ ｐｌｕｓ顕微鏡〕を用いて観察した。対照として、ストマジェンを投与していないイネを用い、前記と同様に操作を行ない、播種後３２日目のイネの第２葉の裏側表皮を観察した。試験例１４において、合成ストマジェンを投与したイネの第２葉の裏側表皮の微分干渉顕微鏡像を図３９（ａ）および試験例１４において、合成ストマジェンを投与していないイネの第２葉の裏側表皮の微分干渉顕微鏡像を図３９（ｂ）に示す。図中、枠で囲った部分は気孔を示す。図中、スケールバーは５０μｍを示す。

図３９に示された結果から、合成ストマジェンを投与したイネの第２葉の裏側表皮〔図３９（ａ）参照〕では、合成ストマジェンを投与していないイネの第２葉の裏側表皮〔図３９（ｂ）参照〕と比べて、気孔の数および気孔密度が増加していることがわかる。したがって、この結果から、ストマジェンをイネに投与することにより、イネにおける気孔の数および気孔密度を増加させることができることが示唆される。

（実施例８）
ダイズ（カリユタカ）の種子を、培養土を含むポットに播種、発芽させたのち第２葉期まで成育させて、実施例５で得られた合成ストマジェンを、その濃度が１μＭ、１０μＭまたは１００μＭとなるように茎頂に添加した。その後、一週間生育させて、微分干渉顕微鏡〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：Ａｘｉｏｓｋｏｐ ｐｌｕｓ顕微鏡〕を用いて観察し、０．２２ｍｍ²の正方形の範囲における気孔の数を測定した。そして、気孔密度を算出した。また、統計解析には、統計解析ソフトＲを用いた。また、実施例５で得られた合成ストマジェンの代わりに、不活性なポリペプチド（ストマジェンのアミノ酸配列中の６つのシステイン残基がセリンに置換されたポリペプチド）を、その濃度が１００μＭとなるように添加したことを除き、前記と同様の操作を行ない、気孔密度を算出した。実施例８において、ストマジェン濃度と気孔密度との関係を調べた結果を図４０に示す。なお、図中、白三角、白四角および白丸は、それぞれ異なる個体を示す

図４０に示された結果から、ストマジェン濃度と気孔密度とは、正の相関関係を有することがわかる。

（試験例１５）
¹¹Ｃで標識された二酸化炭素（¹¹ＣＯ₂）を含む空気を、シロイナズナＣｏｌ−０系統（ストック番号ＣＳ６００００）〔野生株〕または調製例５で得られたストマジェン発現抑制株（ストマジェン発現抑制株１０）に与えた。その後、ポジトロンイメージング装置〔浜松ホトニクス（株）製、商品名：ＰＥＴＩＳ〕を用いて、野生株またはストマジェン発現抑制株に取り込まれた¹¹ＣＯ₂を測定した。試験例１５において、野生株またはストマジェン発現抑制株に取り込まれた¹¹ＣＯ₂を測定した結果を図４１に示す。図中、（ａ）は通常の写真、（ｂ）はポジトロンイメージを示す。

図４１に示された結果から、正常にストマジェンを発現している野生株における二酸化炭素固定量は、ストマジェン発現抑制株における二酸化炭素固定量と比べて、著しく高くなっていることがわかる。これらの結果から、植物におけるストマジェンの発現により、二酸化炭素固定能が増加することが示唆される。したがって、ストマジェンにより、植物体としての収量の増量を図ることができることが示唆される。

（試験例１６）
実施例５で得られた化学合成ストマジェンを６０℃で５分間（試料番号３）または９０℃で５分間（試料番号４）インキュベーションした。また、実施例５で得られた化学合成ストマジェンを凍結乾燥させた（試料番号５）。

シロイナズナＣｏｌ−０系統（ストック番号ＣＳ６００００）の種子を、滅菌したＢ５メディウムで維持して発芽させた。発芽後２日目のシロイナズナＣｏｌ−０系統（ストック番号ＣＳ６００００）に対して、未処理ストマジェン（試料番号２）、６０℃で５分間インキュベーションしたストマジェン（試料番号３）、９０℃で５分間インキュベーションしたストマジェン（試料番号４）または凍結乾燥させたストマジェン（試料番号５）を、その濃度が３μＭとなるように投与した。

その後、シロイナズナＣｏｌ−０系統（ストック番号ＣＳ６００００）を２２℃で３日間生育させた。つぎに、子葉を採取し、その表面を、共焦点顕微鏡〔ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）社製、商品名：ＬＳＭ５１０ ＭＥＴＡ顕微鏡〕を用いて観察し、０．２２ｍｍ²の正方形の範囲における気孔の数を測定した。そして、気孔密度を算出した。なお、統計解析には、統計解析ソフトＲ（ウェブアドレス ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を用いた。なお、対照として、ストマジェンを投与していないシロイナズナＣｏｌ−０系統（ストック番号ＣＳ６００００）を用い、前記と同様に操作を行ない、気孔密度を算出した（試料番号１）。試験例１６において、試料の種類と気孔密度との関係を調べた結果を図４２に示す。

図４２に示された結果から、ストマジェンは、熱や乾燥に対して安定であることがわかる。

以上の結果から、植物におけるストマジェンの過剰発現または植物に対するストマジェンの投与により、植物における気孔の数および／または気孔密度を増加させることができ、しかも、これにより、植物体としての収量の増量を図ることができることが示唆される。

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８． Ｓｈｐａｋ， Ｅ． Ｄ．， ＭｃＡｂｅｅ， Ｊ． Ｍ．， Ｐｉｌｌｉｔｔｅｒｉ， Ｌ． Ｊ． ＆ Ｔｏｒｉｉ， Ｋ． Ｕ． Ｓｔｏｍａｔａｌ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９， ２９０−２９３ （２００５）．
９． Ｂｅｒｇｅｒ，Ｄ．＆Ａｌｔｍａｎｎ， Ｔ．Ａｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ−ｌｉｋｅ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｏｍａｔａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １４， １１１９−１１３１ （２０００）．
１０． Ｎａｄｅａｕ， Ｊ． Ａ． Ｓｔｏｍａｔａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ： ｎｅｗ ｓｉｇｎａｌｓ ａｎｄ ｆａｔｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ． １２， ２９−３５ （２００９）．
１１． Ｏｂａｙａｓｈｉ， Ｔ．， Ｈａｙａｓｈｉ， Ｓ．， Ｓａｅｋｉ， Ｍ．， Ｏｈｔａ， Ｈ． ＆ Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ， Ｋ． ＡＴＴＥＤ−ＩＩ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｆｏｒ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３７， Ｄ９８７−Ｄ９９１（２００９）．
１２． Ｓａｃｈｓ， Ｔ． Ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｐａｃｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅａｆ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ． Ｉｎ Ｃｌｏｎａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １６１−１８２ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７）．
１３． ＭａｃＡｌｉｓｔｅｒ， Ｃ． Ａ．， Ｏｈａｓｈｉ−Ｉｔｏ， Ｋ． ＆ Ｂｅｒｇｍａｎｎ， Ｄ． Ｃ． Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｓｔｏｍａｔａｌ ｌｉｎｅａｇｅ． Ｎａｔｕｒｅ ４４５， ５３７−５４０ （２００７）．
１４． Ｐｉｌｌｉｔｔｅｒｉ， Ｌ． Ｊ．， Ｓｌｏａｎ， Ｄ． Ｂ．， Ｂｏｇｅｎｓｃｈｕｔｚ， Ｎ． Ｌ． ＆ Ｔｏｒｉｉ， Ｋ． Ｕ． Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｏｍａｔａ． Ｎａｔｕｒｅ ４４５， ５０１−５０５（２００７）．
１５． Ｓｅｒｎａ， Ｌ．， Ｔｏｒｒｅｓ−Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ， Ｊ． ＆ Ｆｅｎｏｌｌ， Ｃ． Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｏｍａｔａｌ ｆａｔｅ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ： ｅｖｉｄｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ． Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌ． １５３， ３９９−４０４ （２００２）．
１６． Ｇｅｉｓｌｅｒ， Ｍ．， Ｙａｎｇ， Ｍ． ＆ Ｓａｃｋ， Ｆ． Ｄ． Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｏｍａｔａｌ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ｉｎ ｏｒｇａｎ ａｎｄ ｓｕｂｏｒｇａｎ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｍｕｔａｎｔｓ ｔｏｏ ｍａｎｙ ｍｏｕｔｈｓ ａｎｄ ｆｏｕｒ ｌｉｐｓ． Ｐｌａｎｔａ ２０５， ５２２−５３０ （１９９８）．
１７． Ｇｅｉｓｌｅｒ， Ｍ．， Ｎａｄｅａｕ， Ｊ． ＆ Ｓａｃｋ， Ｆ． Ｄ． Ｏｒｉｅｎｔｅｄ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｔｈｅ ｓｔｏｍａｔａｌ ｓｐａｃｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｒｅ ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｔｏｏ ｍａｎｙ ｍｏｕｔｈｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １２， ２０７５−２０８６ （２０００）．
１８． ｖｏｎ Ｇｒｏｌｌａ， Ｕ．， Ｂｅｒｇｅｒａ， Ｄ． ＆ Ａｌｔｍａｎｎ， Ｔ． Ｔｈｅ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ−ｌｉｋｅ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ＳＤＤ１ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｓｔｏｍａｔａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ． １４， １５２７−１５３９ （２００２）．
１９． Ｓｃｈｗａｂ， Ｒ．， Ｏｓｓｏｗｓｋｉ， Ｓ．， Ｒｉｅｓｔｅｒ，Ｍ．， Ｗａｒｔｈｍａｎｎ， Ｎ． ＆ Ｗｅｉｇｅｌ， Ｄ． Ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １８， １１２１−１１３３（２００６）．
２０． Ｄｏｈｉ， Ｋ．， Ｔａｍａｉ， Ａ． ＆ Ｍｏｒｉ， Ｍ． Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｔｏｍａｔｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ． Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ． １５３， １６６７−１６７５ （２００８）．
２１． Ｋｏｎｏ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｄ−ｔｙｐｅ ｃｙｃｌｉｎ ＣＹＣＤ４ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｏｍａｔａｌ ｌｉｎｅａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １９， １２６５−１２７７ （２００７）．
２２． Ｈａｒａ−Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， Ｉ．， Ｔａｋｅｕｃｈｉ， Ｙ．， Ｉｎｏｕｅ， Ｋ． ＆ Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， Ｍ． Ｖｅｓｉｃｌｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｔｏ ２Ｓ ａｌｂｕｍｉｎ ｉｎ ｐｕｍｐｋｉｎ． Ｐｌａｎｔ Ｊ． ４， ７９３−８００ （１９９３）．
２３． Ｓｈｉｍａｄａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． ＡｔＶＰＳ２９， ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ａ ｒｅｔｒｏｍｅｒ ｃｏｍｐｌｅｘ， ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｏｒｔｉｎｇ ｏｆ ｓｅｅｄ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ４７， １１８７−１１９４ （２００６）．
２４． Ｋｕｎｉｅｄａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． ＮＡＣ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＮＡＲＳ１／ＮＡＣ２ ａｎｄ ＮＡＲＳ２／ＮＡＭ ｉｎ ｔｈｅ ｏｕｔｅｒ ｉｎｔｅｇｕｍｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２０， ２６３１−２６４２ （２００８）．
２５． Ｌｉｖａｋ， Ｋ． Ｊ． ＆ Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ， Ｔ． Ｄ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅ ２２ＤＤＣ（Ｔ） ｍｅｔｈｏｄ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５， ４０２−４０８（２００１）．
２６． Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｖａｃｕｏｌａｒ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｉｓ ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｌｙｔｉｃ ｖａｃｕｏｌｅｓ ｏｆ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ｕｎｄｅｒ ｖａｒｉｏｕｓ ｓｔｒｅｓｓｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｐｌａｎｔ Ｊ． １９， ４３−５３ （１９９９）．
２７． Ｊｅｎｓｅｎ， Ｏ． Ｎ．， Ｐｏｄｔｅｌｅｊｎｉｋｏｖ， Ａ． ＆ Ｍａｎｎ， Ｍ． Ｄｅｌａｙｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈｅｓ ｂｙ ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍａｐｓ． Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． １０， １３７１−１３７８ （１９９６）．
２８． Ｈｉｒｏｓｈｉ Ｓａｔｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅａｒｌｙ ｓｅｅｄ ｓｅｔ ｉｎ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｓｏｙｂｅａｎ ｖａｒｉｅｔｙ， Ｋａｒｉｙｕｔａｋａ． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４：５３３−５３６ （２００７）．

配列番号：７は、P10_prom_Fの配列である。
配列番号：８は、P10_prom_Rの配列である。
配列番号：９は、P10_Fの配列である。
配列番号：１０は、P10_Rの配列である。
配列番号：１１は、EPF1_Fの配列である。
配列番号：１２は、EPF1_Rの配列である。
配列番号：１３は、GFP-CfusF Bstの配列である。
配列番号：１４は、GFP-CfusR Bstの配列である。
配列番号：１５は、P-V_Fの配列である。
配列番号：１６は、P-V_Rの配列である。
配列番号：１７は、Venus_Rの配列である。
配列番号：１８は、2Ssp_Fの配列である。
配列番号：１９は、2Ssp<--p10mの配列である。
配列番号：２０は、2Ssp-->p10mの配列である。
配列番号：２１は、P10m_Fの配列である。
配列番号：２２は、CACC_amiAの配列である。
配列番号：２３は、P10ami1_I miR-sの配列である。
配列番号：２４は、P10ami1_II miR-aの配列である。
配列番号：２５は、P10ami1_III miR*sの配列である。
配列番号：２６は、P10ami1_IV miR*aの配列である。
配列番号：２７は、P10ami2_ImiR-sの配列である。
配列番号：２８は、P10ami2_IImiR-aの配列である。
配列番号：２９は、P10ami2_IIImiR*sの配列である。
配列番号：３０は、P10ami2_IVmiR*aの配列である。
配列番号：３１は、amiBの配列である。
配列番号：３２は、P10_RNAi_Fの配列である。
配列番号：３３は、P10_RNAi_Rの配列である。
配列番号：３４は、tmm SALK_011958-LPの配列である。
配列番号：３５は、SALK_011958-RPの配列である。
配列番号：３６は、epf1SALK_137549-LPの配列である。
配列番号：３７は、SALK_137549-RPの配列である。
配列番号：３８は、epf2SALK_047918-LPの配列である。
配列番号：３９は、SALK_047918-RPの配列である。
配列番号：４０は、spch SAIL_36_B6 LPの配列である。
配列番号：４１は、SAIL_36_B6_RPの配列である。

Claims (6)

1. 植物における気孔の数および／または密度を増加させる化合物を含有してなる気孔増加剤であって、
   前記化合物が、（Ｉ）配列番号：６に示されるアミノ酸配列、
   （ＩＩ）配列番号：６において、１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有し、かつ植物における気孔形成を正に制御する性質を少なくとも有するポリペプチドを構成するアミノ酸配列、
   （ＩＩＩ）配列番号：６に示されるアミノ酸配列に対して、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ ３の条件でＢＬＡＳＴアルゴリズムでアライメントし算出した配列同一性が、９５％以上であり、かつコードされるポリペプチドが、植物における気孔形成を正に制御する性質を少なくとも有するアミノ酸配列、および
   （ＩＶ）配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードする核酸の相補鎖核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸によりコードされ、かつコードされるポリペプチドが、植物における気孔形成を正に制御する性質を少なくとも有するアミノ酸配列
   からなる群より選ばれたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、気孔増加剤。
2. （Ｉ）配列番号：６に示されるアミノ酸配列、
   （ＩＩ）配列番号：６において、１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有し、かつ植物における気孔形成を正に制御する性質を少なくとも有するポリペプチドを構成するアミノ酸配列、
   （ＩＩＩ）配列番号：６に示されるアミノ酸配列に対して、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ ３の条件でＢＬＡＳＴアルゴリズムでアライメントし算出した配列同一性が、９５％以上であり、かつコードされるポリペプチドが、植物における気孔形成を正に制御する性質を少なくとも有するアミノ酸配列、および
   （ＩＶ）配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードする核酸の相補鎖核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸によりコードされ、かつコードされるポリペプチドが、植物における気孔形成を正に制御する性質を少なくとも有するアミノ酸配列
   からなる群より選ばれたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
3. 植物に、請求項１に記載の気孔増加剤を接触させるか、または植物において、請求項２のポリペプチドを過剰発現させることを特徴とする、植物における気孔の数および／または密度の増加方法。
4. 前記植物が維管束植物である、請求項３に記載の植物における気孔の数および／または密度の増加方法。
5. 請求項３または４に記載の植物における気孔の数および／または密度の増加方法により得られる植物。
6. 植物に、請求項１に記載の気孔増加剤を接触させるか、または植物において、請求項３のポリペプチドを過剰発現させることを特徴とする、植物の収量の増加方法。