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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Molekularbiologie von Pflanzen.
Insbesondere stellt sie Zusammensetzungen und Verfahren bereit,
die zur Modulation der Fettsäuresynthese
in Pflanzen verwendbar sind.
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Fettsäuren (FAs)
sind die Hauptbestandteile von Acyllipiden in Pflanzengeweben. Acyllipide
sind hauptsächlich
als Triacylglycerine in den Ölkörpern von
Geweben vorhanden, die als Nahrungsspeicher dienen, wie zum Beispiel
Samen und die fleischigen Teile von Früchten. Diese Gewebe sind wichtige
kommerzielle Quellen von Fetten und Ölen. Fettsäuren werden ebenfalls als Glycolipide
und Phospholipide in anderen Geweben, wie zum Beispiel Blättern, Wurzeln
oder Trieben, vorgefunden, wo sie integrale Komponenten der verschiedenen
Zellmembranen sind.
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Die
wichtigsten FAs sind gesättigte
oder ungesättigte
Monocarbonsäuren
mit einer unverzweigten geradzahligen Kohlenstoffkette. Die wichtigsten
gesättigten
FAs sind Laurin- (12:0, das heißt,
eine C12-Kette ohne Doppelbindungen), Myristin- (14:0), Palmitin-
(16:0) und Stearinsäure
(18:0). Die wichtigsten ungesättigten
FAs sind Öl- (18:1), Linol- (18:2)
und Linolensäure
(18:3). Lipide des Samenspeichers sammeln größtenteils FAs mit 16 bis 18
Kohlenstoffatomen an. Die Ölsamen
der Cruciferae und einiger anderer Pflanzen sammeln ebenfalls C20-
und C22-FAs an, die zusammen als sehr langkettige Fettsäuren (VLCFAs),
aufgrund ihrer relativ längeren
Kettenlänge
im Vergleich zu den üblicheren
in Pflanzen gefundenen FAs, bezeichnet werden (siehe im Allgemeinen
Stumpf, in Biochemistry of Plants, Band 9, Stumpf Herausg., Academic
Press, New York, 1987) und Browse und Somerville, Ann. Rev. Plant
Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 467–506 (1991).
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Das
Vorhandensein von VLCFAs in pflanzlichen Ölen beeinflusst deren Verwendung
deutlich. Zum Beispiel weist Erucasäure (22:1) schädliche Wirkungen
in Bezug auf die Ernährung
auf und ist folglich in Speiseölen
unerwünscht.
Rapsöl
weist einen natürlichen
hohen Erucasäuregehalt
auf, jedoch sind durch eine gemeinsame Züchtungsanstrengung Canolalinien
entwickelt worden, die beinahe keine Erucasäure haben (Loof und Appleqvist,
in Rapeseed, Appleqvist und Ohlson, Herausg. Elsevier Publishing,
1972). Andererseits haben pflanzliche Öle mit hohem Erucasäuregehalt viele
industriellen Verwendungen gefunden, einschließlich der Verwendung als Dieselkraftstoff
und als Rohstoff für
ein Gebiet von Produkten, einschließlich Lacken, Korrosionshemmstoffen,
Kosmetika, Kunststoffe, Pharmazeutika und Schmiermittel (Murphy,
Tibtech 10: 84–87 (1992).
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Die
Biosynthese von gesättigten
FAs mit einer Kohlenstoffkette bis zu C18 verläuft in dem Chloroplasten über die
sequentielle Kondensation von C2-Einheiten von Acylthioestern. Die
FA-Synthese wird durch die Kondensation von Acetyl-CoA und Malonyl-ACP,
katalysiert durch das kürzlich
entdeckte Enzym β-Ketoacylsynthase
III (KASIII), eingeleitet (Jaworski et al., Plant Physiol. 90: 41–44 (1989)).
Das Enzym Ketoacylsynthase I ist für die Verlängerung von gesättigtem
Acyl-ACP von C4 zu C16 erforderlich. Der letzte Verlängerungsschritt
in dem Chloroplasten von C16 zu C18, wird durch die Ketoacylsynthase
II katalysiert. Auf jede Kondensation folgen drei enzymatische Schritte,
die die Reduktion und Dehydratisierung des β-Ketoacylderivats betreffen,
das durch die Synthese und Reduktion der Doppelbindung in dem entsprechenden
Enoyl-ACP-Zwischenprodukt gebildet wurde (Stumpf, 1987, s. o.).
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Die
Verlängerung
der FA-Kohlenstoffkette von C18 zu C22 findet außerhalb des Chloroplasten durch sequentielle
Addition von zwei C2-Einheiten von Malonyl-CoA zu einem C18-Kohlenstoffskelett
statt, eine Reaktion, die durch einen speziellen Acyl-CoA-Elongasekomplex
katalysiert wird (Stumpf und Pollard, in High and Low Erucic Acid
Rapeseed Oils, Kramer et al. Herausg. Academic Press, 1983). Ob
die zwei Verlängerungsreaktionen
durch ein oder zwei verschiedene Enzymkomplexe ausgeführt werden,
ist nicht klar (Taylor et al., Plant Physiol. 99: 1609–1618 (1992)).
Die gleichen vier vorstehend beschriebenen Reaktionen für die Biosynthese
von C18-FAs haben mit der weiteren Verlängerung von C18 in Pflanzen
zu tun: (i) Kondensation von 18:1 CoA mit Malonyl-CoA unter Bildung
eines β-Ketoacylderivats,
(ii) Reduktion und (iii) Dehydratisierung des β-Ketoacylderivats und (iv) Reduktion
der Doppelbindung (Creach und Lessire JAOCS 70: 1129–133 (1993)). Jedoch
wurde aufgrund der Schwierigkeiten bei der Solubilisierung Membran-gebundener
Enzyme der Elongasekomplex nicht gut charakterisiert. Elongasen
wurden aus mehreren Pflanzen, einschließlich Allium porrum oder Lauch
(Bessoule et al., Arch. Biochem. Biophys. 268: 475–484 (1989)),
Lunaria annua oder Silberblatt (Fehling et al., Biochim.
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Biophys.
Acta 1126: 88–94
(1992)) und Brassica napus oder Raps (Creach und Lessire, 1993,
s. o.) teilweise gereinigt.
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Bei
Arabidopsis führen
Mutationen in einem Gen, dem FAE1-Gen, das mit der Fettsäureverlängerung verbunden
ist, zu einem Mangel an Acylkettenverlängerungsaktivitäten von
C18 zu C20 und von C20 zu C22, und zu stark verringerten Gehalten
an VLCFAs im Samen (James und Dooner, Theor. Appl. Genet. 80: 241–245 (1990);
Lenieux et al., Theor. Appl. Genet. 80: 234–240 (1990); James und Dooner
Theor. Appl. Genet. 82: 409–412
(1991) und Kunst et al., Plant Physiol. Biochem. 30: 425–4343 (1992)).
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Die
FA-Biosynthesegene sind durch die herkömmlichen biochemischen Methoden
der Reinigung des entsprechenden Enzyms zur Erzeugung von Antikörpern oder
Oligonukleotiden, mit denen cDNA-Bibliotheken zu testen sind, isoliert
worden. Darunter sind Gene für
ACP (Schmid und Ohlrogge, Plant Mol. Biol. 15: 765–778 (1990)),
KASII (Internationale Veröffentlichungen
WO92/03564 und WO93/10240), KASIII (Tai und Jaworski, Plant Physiol.
103L 1361–1367
(1993)), Stearoyl-ACP-Desaturase (internationale Veröffentlichung Nr.
WO91/18985), Acyl-ACP-Thioesterasen (U.S. Patent Nr. 5,298,421),
Enoyl-ACP-Reduktase (Kater et al., Plant Molec. Biol. 17: 895–909 (1991)),
3-Ketoacyl-ACP-Reduktase (Klein et al., Mol. Gen. Genet. 233: 122–128 (1992)),
Acyl-ACP:Glycerin-3-P-Acyltransferase (Weber et al., Plant Molec.
Biol. 17: 1067–1076 (1991)).
Andere sind auf der Grundlage der DNA-Homologie zu früher klonierten
Genen aus verwandten Spezies, zum Beispiel Genen für Stearoyl-ACP-Desaturasen (Knutzon
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2624–2628 (1992)) oder Acyl-ACP:Glycerin-3-P-Acyltransferasen
(Nishida et al., Plant Molec. Biol. 21: 267–277 (1993)) isoliert worden.
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Es
sind ebenfalls Gene isoliert worden, die FA-Biosyntheseenzyme in
Arabidopsis kodieren. Beispiele dafür umfassen das FAD3-Gen, das
eine 18:2-Desaturase des endoplasmatischen Retikulums (ER) kodiert (Arondel
et al., Science 258: 1353–1354
(1992)), das FAD3- (Yadav et al., Plant Physiol. 103: 467–476 (1993)) und
das FAD2-Gen, das
ein weiteres ER-Enzym, eine 18:1-Desaturase kodiert (Okuley et al.,
The Plant Cell, 6: 147–158
(1994)).
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Es
gab keine Berichte über
die Isolierung von FAE1-Genen. Die Isolierung dieser Gene wäre insbesondere
zur Modulation der Fettsäuresynthese
in Pflanzen brauchbar. Diese und andere Vorteile werden durch die
vorliegende Erfindung zur Verfügung
gestellt.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt isolierte DNA-Konstrukte zur Verfügung, die
eine Polynukleotidsequenz aus einem FAE1-Gen umfassen, wobei entsprechend
der Definition in Anspruch 1 FAE1-Gene Verlängerungsenzyme kodieren, die
die Umwandlung von C18-FAs zu C20-C22-FAs katalysieren. Eine bevorzugte Ausführungsform
der Gene der Erfindung umfasst Sequenzen, die im Wesentlichen identisch
zu Sequenzen sind, die die SEQ ID Nr: 1 sind, diese enthalten oder
innerhalb dieser enthalten sind.
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DNA-Konstrukte,
die die Polynukleotide der Erfindung umfassen, werden zur Modifikation
der FAE1-Genexpression verwendet und modulieren dabei den FA-Gehalt
in Pflanzenorganen oder -teilen, insbesondere in Samen. Somit kann
ein DNA-Konstrukt
weiterhin einen Promotor umfassen, der funktionsfähig mit der
Polynukleotidsequenz verknüpft
ist. Der Promotor ist vorzugsweise ein Pflanzenpromotor, wie zum
Beispiel ein Samen-spezifischer Promotor. Ist die Unterdrückung eines
endogenen FAE1-Gens erwünscht,
kann die Polynukleotidsequenz mit dem Promotor in Sense- oder Antisense-Orientierungen
verknüpft
sein.
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Die
Erfindung stellt ebenfalls transgene Pflanzen (zum Beispiel Brassica
Pflanzen) zur Verfügung,
die eine rekombinante Expressionskassette umfassen, die einen mit
der Polynukleotidsequenz funktionsfähig verknüpften Pflanzenpromotor umfasst.
Die transgene Pflanze weist in einem oder mehreren Geweben einen
veränderten
FA-Gehalt auf. Für die Verwendung
in Pflanzen, die Speiseöle
produzieren, führt
die Einführung
der rekombinanten Expressionskassetten vorzugsweise zu einer Hemmung
eines endogenen FAE1-Gens, was zu Pflanzen mit einem verringerten
VLCFA-Gehalt führt.
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Die
Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Änderung des FA-Gehalts in einer
Pflanze zur Verfügung.
Das Verfahren umfasst das Einbringen einer rekombinanten Expressionskassette
in Pflanzengewebe, die einen Pflanzenpromotor umfasst, der funktionsfähig mit
einer Polynukleotidsequenz aus einem FAE1-Gen in der Sense- oder Antisense-Orientierung
verknüpft
ist. Der Promotor kann ein Gewebespezifischer Promotor, zum Beispiel
ein Samen-spezifischer Promotor, sein. Die Expressionskassette wird
typischerweise unter Verwendung von Agrobacterium oder anderen Standardmitteln
in Pflanzengewebe eingebracht. Das transformierte Pflanzengewebe
wird zu ganzen Pflanzen regeneriert, wobei die regenerierte Pflanze
die eingebrachte Polynukleotidsequenz transkribiert. Die Pflanzen
werden dann untersucht und bezüglich
eines geänderten FA-Gehalts
ausgewählt.
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Die
Erfindung stellt weiterhin Verfahren zur Isolation eines FAE1-Gens
aus einer Pflanze zur Verfügung.
Das Verfahren kann die Analyse einer DNA-Bibliothek (zum Beispiel
eine cDNA-Bibliothek) umfassen, die aus der Pflanze mit Oligonukleotidsonden,
die eine Polynukleotidsequenz aus einem FAE1-Gen umfassen, hergestellt
wurde.
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Definitionen
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Der
Begriff „Nukleinsäuresequenz" bezieht sich auf
ein einzel- oder doppelsträngiges
Polymer aus Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotidbasen, die vom
5'- zum 3'-Ende hin gelesen werden. Er umfasst selbst-replizierende
Plasmide, infektiöse
Polymere einer DNA oder RNA und nicht funktionale DNA oder RNA.
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Der
Begriff „Promotor" bezieht sich auf
eine Region einer DNA stromaufwärts
vom Transkriptionsstart und hat mit der Erkennung und Bindung von
RNA-Polymerase und anderen Proteinen zur Initiierung der Transkription
zu tun. Ein „Pflanzenpromotor" ist ein Promotor,
der in der Lage ist, die Transkription in Pflanzenzellen zu initiieren.
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Der
Begriff „Pflanze" umfasst ganze Pflanzen,
Pflanzenorgane (zum Beispiel Blätter,
Stiele, Wurzeln, usw.), Samen und Pflanzenzellen und deren Abkömmlinge.
Die Klasse von Pflanzen, die in dem Verfahren der Erfindung verwendet
werden kann, ist im allgemeinen so ausgedehnt wie die Klasse der
höheren
Pflanzen, die für
Transformationstechniken zugänglich
ist, einschließlich
von sowohl Monokotylen als auch Dikotylen, sowie bestimmten niederen
Pflanzen, wie zum Beispiel Algen. Er umfasst Pflanzen aus einer
Vielzahl von ploiden Niveaus, einschließlich polyploid, diploid und
haploid.
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Eine „heterogene
Sequenz" ist eine
Sequenz, die aus einer fremden Spezies stammt, oder, falls sie aus
derselben Spezies stammt, eine, die ausgehend von ihrer ursprünglichen
Form wesentlich modifiziert worden ist. Zum Beispiel stammt ein
heterologer Promoter, der funktionsfähig mit einem Strukturgen verknüpft ist, aus
einer Spezies, die sich von derjenigen unterscheidet, von der das
Strukturgen stammte, oder, falls er von derselben Spezies stammt,
wurde er ausgehend von seiner ursprünglichen Form wesentlich modifiziert.
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Ein „FAE1-Gen", wie es hier verwendet
wird, ist ein Gen, das ein Enzym oder eine Komponente eines Enzyms,
das die Umwandlung von Ölsäure (18:1)
zu Eicosansäure
(20:1) und von Eicosansäure
zu Erucasäure
katalysiert, kodiert.
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Ein
Homologes eines speziellen FAE1-Gens (zum Beispiel SEQ ID Nr: 1)
ist ein zweites Gen in demselben Pflanzentyp oder in einem unterschiedlichen
Pflanzentyp, das eine Polynukleotidsequenz von mindestens 50 aneinandergrenzenden
Nukleotiden, die zu einer Sequenz in dem ersten Gen im wesentlichen
identisch sind (die Bestimmung erfolgt entsprechend der nachstehenden
Beschreibung), aufweist. Es wird angenommen, dass Homologe im Allgemeinen
eine gemeinsame evolutionäre
Vergangenheit aufweisen.
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Eine „Polynukleotidsequenz
aus einem FAE1-Gen" ist
eine Untersequenz oder eine Polynukleotidsequenz eines FAE1-Gens
mit voller Länge,
die, wenn sie in einer transgenen Pflanze vorhanden ist, die gewünschte Wirkung
aufweist, zum Beispiel die Hemmung der Expression des endogenen
FAE1-Gens. Im Falle von sowohl der Expression von Transgenen als
auch der Hemmung von endogenen Genen (zum Beispiel durch Antisense-
oder Sense-Unterdrückung)
wird der Fachmann erkennen, dass die eingeschobene Polynukleotidsequenz
zu einer Sequenz des Gens, von der sie abgeleitet wurde, nicht identisch
sein muss und zu ihr „im
wesentlichen identisch" sein
kann. Wie nachstehend erklärt
ist, werden speziell diese Varianten von diesem Begriff umfasst.
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Für den Fall,
dass die eingeschobene Polynukleotidsequenz zur Herstellung eines
funktionalen Polypeptids transkribiert und translatiert wird, wird
der Fachmann erkennen, dass aufgrund der Codondegeneration eine
Zahl von Polynukleotidsequenzen dasselbe Polypeptid kodieren werden.
Diese Varianten werden ausdrücklich
von dem Begriff „Polynukleotidsequenz
aus einem FAE1-Gen" umfasst.
Zusätzlich
umfasst der Begriff besonders diejenigen Sequenzen mit voller Länge, die
im wesentlichen zu einer FAE1-Gensequenz identisch sind (die Bestimmung
erfolgt entsprechend der nachstehenden Beschreibung) und die Proteine
kodieren, die die Funktion des FAE1-Enzyms behalten. Somit umfasst
der vorstehende Begriff verschiedene Polynukleotidsequenzen, die
eine wesentliche Identität
mit den hier offenbarten Sequenzen aufweisen und die Enzyme kodieren,
die zur Katalyse derselben vorstehend beschriebenen Reaktionen in
der Lage sind.
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Für den Fall,
dass Polynukleotide zur Hemmung der Expression eines endogenen Gens
verwendet werden, muss die eingeführte Sequenz ebenfalls nicht
perfekt identisch zu einer Sequenz des endogenen Zielgens sein.
Die eingeführte
Polynukleotidsequenz wird zu der endogenen Zielsequenz typischerweise
zumindest im Wesentlichen identisch sein (entsprechend der nachstehenden
Bestimmung).
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Zwei
Nukleinsäuresequenzen
oder Polypeptide heißen „identisch", wenn die Sequenz
von Nukleotiden beziehungsweise Aminosäureresten in den zwei Sequenzen
dieselbe ist, wenn sie bezüglich
einer maximalen Übereinstimmung
angeordnet sind, wie es nachstehend beschrieben ist. Die Verwendung
des Begriffs „komplementär zu" soll hier bedeuten,
dass die komplementäre
Sequenz zu der gesamten oder einem Teil einer Referenz-Polynukleotidsequenz
identisch ist.
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Sequenzvergleiche
zwischen zwei (oder mehreren) Polynukleotiden oder Polypeptiden
werden typischerweise durch Vergleich von Sequenzen der zwei Sequenzen über ein „Vergleichsfenster" durchgeführt, um
lokale Regionen mit einer Sequenzähnlichkeit zu identifizieren
und zu vergleichen. Ein „Vergleichsfenster", wie es vorliegend
verwendet wird, bezieht sich auf ein Segment von mindestens ungefähr 20 aneinandergrenzenden
Positionen, normalerweise ungefähr
50 bis ungefähr
200, besonders üblich
ungefähr
100 bis ungefähr 150,
in dem eine Sequenz mit einer Referenzsequenz mit derselben Zahl
an aneinandergrenzenden Positionen verglichen werden kann, nachdem
die zwei Sequenzen optimal angeordnet wurden.
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Eine
optimale Anordnung von Sequenzen für einen Vergleich kann durch
den lokalen Homologie-Algorithmus von Smith und Waterman Adv. Appl.
Math. 2: 482 (1981), durch den Homologie-Anordnungsalgorithmus von
Needleman und Wunsch J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), durch das Verfahren
der Ähnlichkeitssuche nach
Pearson und Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444 (1988),
durch rechnergestützte
Implementierungen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA
in dem Wisconsin Genetics Software Paket, Genetics Computer Group
(GCG), 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch Inspektion durchgeführt werden.
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Der „Prozentsatz
der Sequenzidentität" wird durch Vergleich
von zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster bestimmt,
wobei für
eine optimale Anordnung der zwei Sequenzen der Teil der Polynukleotidsequenz
im Vergleich zu der Referenzsequenz (die keine Additionen oder Deletionen
umfasst) Additionen oder Deletionen (das heißt Lücken) in dem Vergleichsfenster
umfassen kann. Der Prozentsatz wird durch die Bestimmung der Zahl
der Positionen, an denen in beiden Sequenzen die identische Nukleinsäurebase
oder Aminosäurerest
auftritt, woraus sich die Zahl der übereinstimmenden Positionen
ergibt, durch Division der Zahl der übereinstimmenden Positionen
durch die Gesamtzahl von Positionen in dem Vergleichsfenster und
durch Multiplizieren des Ergebnisses mit 100 berechnet, woraus sich
der Prozentsatz der Sequenzidentität ergibt.
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Der
Begriff „wesentliche
Identität" von Polynukleotidsequenzen
bedeutet, dass ein Polynukleotid eine Sequenz umfasst, die mindestens
90% und besonders bevorzugt mindestens 95% Sequenzidentität im Vergleich
zu einer Referenzsequenz unter Verwendung der vorstehend beschriebenen
Programme (vorzugsweise BESTFIT) unter Verwendung von Standardparametern
aufweist. Der Fachmann wird erkennen, dass diese Werte geeignet
angepasst werden können,
um die entsprechende Identität
von Proteinen, die von zwei Nukleotidsequenzen kodiert werden, zu
bestimmen, indem die Codondegeneration, die Aminosäurenähnlichkeit, die
Positionierung des Leserahmens und dergleichen berücksichtigt
werden. Für
diese Zwecke bedeutet eine wesentliche Identität von Aminosäuresequenzen
normalerweise eine Sequenzidentität von mindestens 40%, vorzugsweise
mindestens 60%, bevorzugter mindestens 90% und besonders bevorzugt
mindestens 95%.
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Nukleotidsequenzen,
die im Wesentlichen identisch sind, werden aneinander unter stringenten
Bedingungen hybridisieren. Stringente Bedingungen sind Sequenzabhängig und
werden unter verschiedenen Umständen
unterschiedlich sein. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen
so ausgewählt,
dass sie ungefähr
5°C niedriger
als der thermische Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei
einer definierten Ionenstärke
und pH-Wert liegen. Der Tm-Wert ist die Temperatur (bei einer definierten
Ionenstärke
und pH-Wert), bei der 50% der Zielsequenz an eine perfekt zusammenpassende
Sonde hybridisiert. Stringente Bedingungen werden typischerweise
diejenigen sein, bei denen die Salzkonzentration bei einem pH-Wert
von 7 ungefähr
0,02 molar ist und die Temperatur mindestens ungefähr 60°C beträgt.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
eine Abbildung der Strategie, die zur Isolierung der FA-Biosynthesegene
aus Arabidopsis verwendet wird.
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2 zeigt
einen Vergleich der Nukleotidsequenz von FAE1 um die Stelle des
Einschubs des transponiblen Elements Ac herum.
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3 ist
ein Diagramm der Struktur der genomischen Region von FAE1, einschließlich des
Ortes der cDNA und der Ac-Insertionsstelle in fae1-m1(Ac).
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4 ist
ein Vergleich der Aminosäuresequenzen
von SEQ ID Nr: 2 und SEQ ID Nr: 4 unter Verwendung des BESTFIT-Sequenzvergleichsprogamms.
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BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN
AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die
vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren zur
Regulierung der Fettsäuresynthese
in Pflanzen zur Verfügung.
Die Wirkung eines Enzyms, FAE1, auf die FA-Synthese in Arabidopsis wurde
durch Untersuchung von Mutanten des Gens, welches das Enzym kodiert,
aufgeklärt.
Wie vorstehend bemerkt wurde, wurde eine Mutante mit einer unzureichenden
Oleat (18:1)-Verlängerung
und die nur 0,2% Eicosansäure
in ihrem Samenöl
aufwies, von James und Donner Theor. Appl. Genet. 80: 241–245 (1991)
und Lemieux et al. Theor. Appl. Genet. 80: 234–240 (1990) beschrieben. Gestützt auf
die Isolierung dieser Eigenschaft bestimmten James und Dooner und
Lemieux et al., dass sie durch eine einzelne Kernmutation in einem Gen
verursacht wird, das die letztgenannten Autoren mit FAE1 bezeichnet
haben.
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Die
vorliegende Erfindung stellt klonierte Gene, die das FAE1-Enzym
kodieren, zur Verfügung.
In der vorliegenden Erfindung verwendbare FAE1-Gene umfassen ein
FAE1-Gen, das in Arabidopsis identifiziert wurde, sowie Homologe
in anderen Pflanzen (entweder von der gleichen oder unterschiedlichen
Gattung oder Spezies). Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls
rekombinante Vektoren zur Verfügung,
die Polynukleotidsequenzen aus einem FAE1-Gen, die auf einer Vielzahl
von Wegen verwendet werden können,
umfassen.
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Im
Allgemeinen findet die Erfindung bei der Modulierung des FA-Gehalts
in allen höheren
Pflanzen Verwendung. Die Erfindung findet somit über einen weitreichenden Bereich
von Pflanzenarten, einschließlich von
Spezies der Gattungen Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium,
Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis,
Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Hyoscyamus, Lycopersicon,
Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus,
Lacruca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesia,
Palargonium, Panicum, Penniserum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis,
Cucumis, Browallia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum und
Datura Verwendung.
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Insbesondere
umfassen Pflanzen, für
die die Erfindung zur Modifikation des FA-Gehalts verwendet werden kann, Ölernten
der Cruciferae-Familie: Canola, Raps (Brassica spp.), Krambe (Crambe
spp.), Silberblatt (Lunaria spp.), Lesquerella (Lesquerella spp.)
und andere; die Compositae-Familie: Sonnenblume (Helianthus spp.),
Saflor (Carthamus spp.), Ramtillkraut (Guizotia spp.) und andere;
die Leguminosae- Familie:
Erdnuß (Arachis
spp.), Sojabohne (Glycine spp.) und andere; und Pflanzen anderer
Familien, wie zum Beispiel Mais (Zea spp.), Baumwolle (Gossypiu,
sp.), Jojoba (Simonasia sp.), Flachs (Linum sp.), Sesam (Sesamum spp.),
Rizinusbohne (Ricinus spp.), Olive (Olea spp.), Mohn (Papaver spp.),
Wolfsmilch (Euphorbia, spp.), Sumpfblume (Limnanthes spp.) und Zigarettenblümchen (Cuphea
spp.).
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Wie
vorstehend bemerkt wurde, weisen VLCFAs, insbesondere Erucasäure, schädliche Wirkungen
in Bezug auf die Ernährung
auf und sind somit in Speiseölen
unerwünscht.
Unter Verwendung von Standardtechniken in der Molekularbiologie
von Pflanzen, wie nachstehend beschrieben ist, kann die Erzeugung
von Erucansäure
in Pflanzen, die zur Herstellung von Speiseölen verwendet werden, insbesondere
Raps, Brassica napus, verringert werden.
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Alternativ
dazu finden pflanzliche Öle
mit hohem Gehalt an VLCFAs, insbesondere Erucansäure, vielerlei Verwendung in
der Industrie. Somit kann die Erfindung zur Erhöhung des VLCFA-Gehalts von
Pflanzenölen
durch Überexpression
von FAE1 verwendet werden. Zusätzlich
werden ebenfalls Alkohole, die von den VLCFAs durch Reduktion der
Carboxylgruppe abgeleitet werden, in diesen Pflanzen zunehmen. VLCF-Alkohole
werden mit VLCFAs in Jojobaöl
verestert und können
als Ersatz für
Pottwalöl
in Schmiermitteln von hoher Qualität und als wertvoller Träger für Medikamente
verwendet werden. Zum Beispiel können
Krambe und Jojoba, die zwei aufgrund ihres VLCFA-Gehalts industriell
geschätzte Öle sind,
zur Erhöhung
der Herstellung dieser FAs modifiziert werden. Der C20-C22-FA-Gehalt
von Krambe-Samenöl, der ungefähr 50–60% 22:1
(Salunkhe und Desai, in Postharvest Biotechnology of Oilseeds Seiten
187–197
(CRC Press, Boca Raton, FL, 1986)) beträgt, und von Jojobasamenwachs,
der derzeit ungefähr
54% 20:1 + 22:1 (Salunkhe und Desai, s. o.) beträgt, könnte durch Überexpression von FAE1 erhöht werden.
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Die
Polynukleotide der Erfindung können
ebenfalls zur Modifikation anderer erwünschter Eigenschaften in Pflanzen
verwendet werden. Da die Zusammensetzung der Blattoberflächen deren
Durchlässigkeit
beeinflusst, kann zum Beispiel die Trockenheitstoleranz von Pflanzen
durch Änderung
der Zusammensetzung der FAs, aus denen die kutikularen Wachse des
Blattes (Oberfläche)
bestehen, beeinflusst wer den. Somit kann jede Eigenschaft, bei der
die VLCFA-Synthese von Bedeutung ist, unter Verwendung der Verfahren
der Erfindung geändert
werden.
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FAE1-Polypeptide
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Die
erfindungsgemäßen Enzyme
weisen eine gemeinsame Homologie mit denjenigen von zwei anderen
kondensierenden Enzymen auf, die Malonyl-CoA, Chalkonsynthase (CHS)
und Stilbensynthase (STS) verwenden. Eine Consensus-Sequenz unter
den drei Enzymen wurde aus einem Vergleich ihrer Aminosäuresequenzen,
der mit den CGC-Computerprogammen durchgeführt worden war, offenbart (Devereux
et al., Nuc. Acids. Res. 12: 387–395 (1984)). Sie besteht aus
17 Aminosäuren,
die sich über
eine Region mit 50 Aminosäuren
in der Nähe
des Carboxylendes der Proteine (ausgehend von der Position 392 in
FAE1) erstrecken. Diese Region befindet sich gerade stromaufwärts der
CHS-STS 12 Aminosäuren „Signatursequenz" (Fliegmann et al.,
Plant Mol. Biol. 18: 489–503
(1992)), die in den Proteinen der Erfindung nicht vorkommt.
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Das
FAE1-Protein weist ebenfalls eine gemeinsame Homologie mit einer
konservierten Region in CHS und STS auf, die sich nahe an der aktiven
Cystein-Stelle, die von Lanz et al., J. Biol. Chem. 266: 9971–9976 (1991)
identifiziert wurde, befindet. Diese Region der Homologie {L-A-K-D-L-X(9)-L-V-V} überlappt
jedoch nicht mit der Consensus-Sequenz für die CHS/STS-aktive Stelle
{G-C-(FY)-(GA)-G-G-T-X(2)-R}, sondern liegt unmittelbar angrenzend
an deren Carboxylende.
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Die
Aminosäuresequenz
der erfindungsgemäßen Proteine
ist ebenfalls homolog zu dem Ketoacylsynthase (KAS) III-Enzym von
E. coli und Spinat, dem kondensierenden Enzym, das die FA-Biosynthese
in Bakterien und Pflanzen durch Kopplung von Acetyl-CoA an Malonyl-ACP
initiiert. Insbesondere ist das hier offenbarte FAE1-Protein zu 35% identisch
und zu 47% ähnlich
zu KASIII von E. coli (kodiert durch das fabH-Gen), und zu 32% identisch
und zu 46% ähnlich
zu KASIII von Spinat über
einen 57 Aminosäurestretch,
der ebenfalls bei Position 392 von FAE1 beginnt.
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Die
FAE1-Enzyme der vorliegenden Erfindung besitzen vorzugsweise eine
katalytische Aktivität,
die im Wesentlichen gleich oder höher ist als die Aktivität des in
SEQ ID Nr: 2 ausgeführten
Proteins. Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können natürlich, das
heißt,
einschließlich
eines gesamten nativen FAE1-Enzyms, das aus einer natürlichen
Quelle isoliert und gereinigt wurde, oder synthetisch sein. Derartige
natürliche FAE1-Polypeptide
können
aus Pflanzenmaterial unter Verwendung von in der wissenschaftlichen
Literatur beschriebenen Verfahren, auf die vorstehend verwiesen
wurde, isoliert werden. „Isoliert" soll bedeuten, dass
die FAE1-Proteine aus ihrer nativen Umgebung, wie zum Beispiel aus
dem Pflanzengewebe, indem sie normalerweise vorkommen, entfernt
worden sind. Folglich soll der Begriff „isoliert" das Vorhandensein eines FAE1-Polypeptids
als eine heterologe Komponente einer Zeile oder eines anderen Systems,
wie zum Beispiel ein Mikroorganismus-Expressionswirt oder eine transformierte
höhere
Pflanze, umfassen. Zum Beispiel kann das FAE1-Polypeptid der vorliegenden
Erfindung in einem Mikroorganismuswirt, wie zum Beispiel Bakterien
oder Hefe, exprimiert werden, mit einem DNA-Konstrukt, das das Polypeptid kodiert,
transformiert oder transfiziert werden. Normalerweise wird eine
derartige Expression in Mikroorganismuswirten der erste Schritt
zur Herstellung eines „gereinigten" FAE1-Polypeptids
sein. Alternativ dazu können „isolierte" FAE1-Polypeptide
in transformierten höheren
Pflanzen exprimiert werden, wobei die FAE1-Polypeptide häufig keiner
Form der Reinigung unterzogen werden. Derartige Polypeptide sind
jedoch in dem Sinne isoliert, dass sie aus ihrer nativen Umgebung
entfernt worden sind, wobei sie häufig das Ergebnis der Expression
eines heterologen Gens sind, obwohl sie in machen Fällen das
Ergebnis der Expression eines homologen Gens unter der Kontrolle
eines heterologen Promotors sind. In dem letztgenannten Fall kann
das homologe FAE1-Polypeptid in Pflanzengeweben und zu Zeiten exprimiert
werden, die anders sind, als es normalerweise der Fall wäre.
-
FAE1-Polypeptide
können
aus jeder natürlichen
Quelle, die signifikante Mengen eines natürlichen oder nativen FAE1-Enzyms
besitzt, isoliert und gereinigt werden. Die Isolation und Reinigung
kann durch herkömmliche
chemische Reinigungstechniken, wie zum Beispiel die Flüssigkeitschromatographie,
Affinitätschromatographie,
Gradientenzentrifugation, Gelelektrophorese, Größenausschlußchromatographie, Ionenaustauschchromatographie,
hydrobobe Wechselwirkungschromatographie, Umkehrphasenchromatographie
und dergleichen erreicht werden. Derartige Techniken sind in der
wissenschaftlichen Literatur und in der Patentliteratur gut beschrieben.
Siehe zum Beispiel Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag,
New York (1982).
-
Derartige
Techniken sind zur Isolierung von FAE1-Polypeptiden aus sowohl natürlichen
zellulären Quellen
als auch aus rekombinant modifizierten Expressionswirten geeignet.
-
Die
FAE1-Enzyme der vorliegenden Erfindung können in einer im Wesentlichen
reinen Form erhalten werden. „Im
wesentlichen rein" soll
bedeuten, dass das Polypeptid in einer intermediären oder Endzusammensetzung
und in einer Reinheit von mindestens ungefähr 50%, basierend auf dem Gewicht
des in dem Gesamtgewicht der Zusammensetzung (Gewicht/Gewicht; w/w)
vorhandenen FAE1-Polypeptids, vorkommt und, dass es im wesentlichen
frei von störenden
Proteinen und Verunreinigungen ist, insbesondere von Proteinen und Verunreinigungen,
die die gewünschte
katalytische Aktivität
stören
und/oder die toxisch, immunogen sind, oder die anderweitig die erwünschte Verwendung
eines Endprodukts verhindern. Die FAE1-Polypeptide werden vorzugsweise in einer
Reinheit von mindestens ungefähr
60% w/w, bevorzugter mindestens ungefähr 70% w/w und besonders bevorzugt
von mindestens ungefähr
80% w/w isoliert oder synthetisiert. Normalerweise sind sogar häufig höhere Reinheitsgehalte
von 90% w/w, 95% w/w oder höher
erreichbar. Sehr hohe Reinheitsgehalte, typischerweise von mehr
als 98% w/w und besonders bevorzugt von mehr als 99% w/w können ebenfalls erzielt
werden.
-
Die
erfindungsgemäßen synthetischen
FAE1-Polypeptide können
durch jede der zwei allgemeinen Methoden hergestellt werden. Erstens
können
Polypeptide mit weniger als ungefähr 200 Aminosäuren, normalerweise
weniger als ungefähr
150 Aminosäuren
und vorzugsweise mit weniger als ungefähr 100 Aminosäuren zum
Beispiel durch das gut bekannte Merrifield-Festphasenverfahren synthetisiert
werden, wobei Aminosäuren
sequentiell an eine wachsende Kette addiert werden (Merrifield (1963)
J. Am. Chem. Soc. 85: 2149–2156).
Kommerzielle Systeme, die derartige Festphasentechniken für die automatisierte
Synthese von Polypeptiden verwenden, sind von Anbietern, wie zum
Beispiel Applied Biosystems, Inc., Foster City, Kalifornien, erhältlich.
-
Das
zweite und im allgemeinen bevorzugtere Verfahren zur Synthese der
erfindungsgemäßen FAE1-Polypeptide
betrifft die Expression rekombinanter DNA-Moleküle in kultivierten Zellen,
die das gesamte oder einen gewünschten
Teils eines FAE1-Proteins kodieren. Das rekombinante DNA-Molekül kann entweder ein
natürliches
oder ein synthetisches Gen enthalten, wobei natürliche Gene und cDNA aus Pflanzensamenmaterial
durch herkömmliche
Verfahren, entsprechend der Beschreibung in der vorstehend zitierten
Literatur, erhältlich
sind. Die Isolierung von Polynukleotiden, die ein gewünschtes
FAE1 kodieren, ist nachstehend ausführlich beschrieben.
-
FAE1-kodierende Polynukleotide
-
Der
nachstehende Abschnitt mit Beispielen, der die Isolierung und Charakterisierung
eines FAE1-Gens in Arabidopsis beschreibt, ist beispielhaft für eine allgemeine
Methode zu Isolierung von erfindungsgemäßen Genen. Die Isolierung dieses
Gens gestattet dem Fachmann leicht homologe Gene in Arabidopsis
und anderen Pflanzenspezies zu isolieren. Die isolierten Gene können dann
zum Aufbau rekombinanter Vektoren zur Änderung der FAE1-Genexpression
in transgenen Pflanzen verwendet werden.
-
Im
Allgemeinen sind die Nomenklatur und die nachstehend beschriebenen
Laborverfahren in der rekombinanten DNA-Technologie dem Fachmann
gut bekannt und werden in dem Fachgebiet gewöhnlich verwendet. Standardtechniken
werden zur Klonierung, DNA- und RNA-Isolierung, Amplifikation und
Reinigung verwendet. Im Allgemeinen werden enzymatische Reaktionen,
die die DNA-Ligase, DNA-Polymerase,
Restriktionsendonukleasen und dergleichen betreffen, gemäß den Angaben
des Herstellers durchgeführt.
Diese Techniken und verschiedene andere Techniken werden im Allgemeinen
gemäß Sambrook
et al., Molecular Cloning – A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
New York, (1989) durchgeführt.
-
Die
Isolierung von FAE1-Genen kann durch eine Zahl von Techniken durchgeführt werden.
Zum Beispiel kann die Markierung eines FAE1-Gens mithilfe eines
Transposons die Isolierung des relevanten Gens unterstützen. Die
Transposon-Markierung erfordert die Einführung eines Transposons in
die Pflanze, was zu einer Mutation des Zielgens und zu einer nachweisbaren
phänotypischen Änderung
in der Pflanze führt.
Unter Verwendung einer Sonde für
das Transposon kann dann das mutierte Gen isoliert werden. Unter
Verwendung der DNA, die zu dem Transposon in dem isolierten mutierten
Gen benachbart ist, als Sonde kann das normale Allel von Wildtyp
des Zielgens isoliert werden. Siehe zum Beispiel Haring, et al.,
Plant Mol. Biol. 16: 449–469 (1991)
und Walbot, Ann. Rev. Plant Mol. Biol. 43: 49–82 (1992). Wie nachstehend
gezeigt ist, ist ein besonders brauchbares Transposon-Markierungssystem
das, das in dem U.S. Patent Nr. 5,013,658 veröffentlicht wurde.
-
Ein
alternatives Verfahren verwendet Oligonukleotidsonden zur Identifizierung
des gewünschten
Gens in einer cDNA- oder genomischen DNA-Bibliothek. Zum Aufbau
genomischer Bibliotheken werden große Segmente genomischer DNA
durch Zufallsfragmentierung, zum Beispiel unter Verwendung von Restriktionsendonukleasen,
erzeugt und mit der Vektor-DNA unter Bildung von Concatemeren, die
in den geeigneten Vektor verpackt werden können, ligiert. Zur Herstellung
einer cDNA-Bibliothek wird mRNA aus dem gewünschten Organ, wie zum Beispiel
ein Samen, isoliert und eine cDNA-Bibliothek, die das FAE1-Gentranskript
enthält,
wird aus der mRNA hergestellt. Alternativ dazu kann cDNA aus mRNA
hergestellt werden, die aus anderen Gewebearten (Organen) extrahiert
wurde, in denen FAE1-Gene oder Homologe exprimiert werden, wie zum
Beispiel Samen, Früchte,
Stiele und Wurzeln.
-
Dann
kann die cDNA- oder genomische Bibliothek unter Verwendung einer
Sonde, die auf der Sequenz eines klonierten FAE1-Gens basiert, wie
zum Beispiel das in SEQ ID Nr: 1 gezeigte, gescreent werden. Die
Sonden können
zur Hybridisierung mit genomischen DNA- oder cDNA-Sequenzen verwendet
werden, um homologe Gene in gleichen oder unterschiedlichen Pflanzenspezies
zu isolieren. Die Verwendung derartiger Hybridisierungstechniken
zur Identifizierung homologer Gene ist aus dem Stand der Technik
gut bekannt und muss nicht weiter beschrieben werden.
-
Alternativ
dazu können
Polynukleotide durch gut bekannte Techniken, wie sie in der technischen
Literatur beschrieben sind, synthetisiert werden. Siehe zum Beispiel
Carruthers et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47: 411–418 (1982)
und Adams et al., J. Am. Chem. Soc. 105: 661 (1983). Doppelsträngige DNA-Fragmente
können
dann entweder durch Synthetisieren des komplementären Strangs
und Annealing der Stränge
aneinander unter geeigneten Bedingungen, oder durch Addieren des
komplementären
Strangs unter Verwendung von DNA-Polymerase mit einer geeigneten
Primersequenz erhalten werden.
-
Die
isolierten Sequenzen, die entsprechend der Beschreibung hier hergestellt
wurden, können
in einer Anzahl von Techniken zur Unterdrückung der endogenen FAE1-Genexpression
(das heißt,
zur Hemmung der Verlängerung
von C18-FAs zu C20 und C22) verwendet werden. Zum Beispiel kann
die Antisense-Technologie praktischerweise zur Hemmung der FAE1-Genexpression
verwendet werden. Um dies zu erreichen, wird ein Nukleinsäuresegment
aus dem gewünschten
Gen kloniert und so mit einem Promotor funktionsfähig verknüpft, dass
der Antisense-Strang der RNA transkribiert wird. Dann wird das Konstrukt
in Pflanzen transformiert und es wird der Antisense-Strang der RNA
hergestellt. Es wurde vorgeschlagen, dass in Pflanzenzellen diese
Antisense-RNA die Genexpression hemmt, indem sie die Akkumulation
von mRNA, die das interessierende Enzym kodiert, verhindert. Siehe
zum Beispiel Sheeny et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85: 8805–8809 (1988) und
Hiatt et al., U.S. Patent Nr. 4,801,340.
-
Das
einzuführende
Nukleinsäuresegment
wird im Allgemeinen im Wesentlichen zu mindestens einem Teil des
endogenen FAE1-Gens oder Genen, die unterdrückt werden sollen, identisch
sein. Die Sequenz muss jedoch nicht vollkommen identisch sein, um
die Expression zu hemmen. Die Vektoren der vorliegenden Erfindung
können
so entworfen werden, dass die Hemmwirkung auf andere Proteine innerhalb
einer Familie von Genen zutrifft, die eine Homologie oder im Wesentlichen
eine Homologie mit dem Zielgen aufweisen. Zum Beispiel kann die
Unterdrückung
des in SEQ ID Nr: 1 gezeigten FAE1-Gens dazu dienen, dieselbe unterdrückende Wirkung
anderen FAE1-Genen mit ausreichender Identität aufzuzwingen. Entsprechend
können
Segmente aus FAE1-Genen von Arabidopsis zur Hemmung der Expression
homologer Gene in verwandten Pflanzenspezies, wie zum Beispiel ein
Mitglied der Gattung Brassica, oder als ein Mittel verwendet werden,
um die entsprechenden Sequenzen, die zum Unterdrücken des endogenen Brassica-Gens
zu verwenden sind, zu erhalten.
-
Für die Antisense-Unterdrückung muss
die eingeführte
Sequenz ebenfalls nicht die vollständige Länge bezüglich entweder des primären Transkriptionsprodukts
oder der vollständig
verarbeiteten mRNA aufweisen. Im Allgemeinen kann eine höhere Homologie
verwendet werden, um die Verwendung einer kürzeren Sequenz zu kompensieren.
Weiterhin muss die eingeführte
Sequenz nicht dasselbe Intron- oder Exonmuster aufweisen und die
Homologie der nicht kodierenden Segmente kann gleich wirksam sein.
Normalerweise sollte eine Sequenz, die zwischen ungefähr 30 oder
40 Nukleotiden und ungefähr
2000 Nukleotiden aufweist, verwendet werden, obwohl eine Sequenz
von mindestens ungefähr
100 Nukleotiden bevorzugt ist, eine Sequenz von mindestens ungefähr 200 Nukleotiden
bevorzugter ist und eine Sequenz von mindestens ungefähr 500 Nukleotiden
besonders bevorzugt ist.
-
Katalytische
RNA-Moleküle
oder Ribozyme können
ebenfalls zur Hemmung der Expression von FAE1-Genen verwendet werden.
Es ist möglich,
Ribozyme zu entwerfen, die sich so gut wie mit jeder Ziel-RNA paaren
und das Phosphodiester-Grundgerüst an einer
spezifischen Stelle spalten, wodurch die Ziel-RNA funktional inaktiviert
wird. Bei der Ausführung
dieser Spaltung wird das Ribozym selbst nicht verändert und
es ist daher zum Recycling und Spaltung anderer Moleküle in der
Lage, was es zu einem richtigen Enzym macht. Der Einschluß von Ribozymsequenzen
innerhalb von Antisense-RNAs verleiht diesen eine RNA-Spaltungsaktivität, wodurch
die Aktivität
der Konstrukte erhöht
wird.
-
Eine
Zahl von Klassen von Ribozymen ist identifiziert worden. Eine Klasse
von Ribozymen wird aus einer Zahl kleiner zirkulärer RNAs abgeleitet, die zur
Selbstspaltung und Replikation in Pflanzen in der Lage sind. Die
RNAs replizieren entweder alleine (Viroid-RNAs) oder mit einem Helfervirus
(Satelliten-RNAs). Beispiele umfassen RNAs aus dem Avocadosunblotch
Viroid und die Satelliten-RNAs aus dem Tabakringfleckvirus, dem
vorübergehendes
Streifenvirus bei Luzerne, dem Samttabakmosaikvirus, dem Solanum
nodiflorum-Mosaikvirus und dem unterirdischen Kleemosaikvirus. Der
Entwurf und die Verwendung von Ziel-RNA-spezifischen Ribozymen wird
bei Haseloff et al. Nature, 334: 585–591 (1988) beschrieben.
-
Ein
weiteres Unterdrückungsverfahren
ist die Sense-Unterdrückung.
Kürzlich
wurde gezeigt, dass die Einführung
einer Nukleinsäure,
die in Sense-Orientierung angeordnet ist, ein wirksames Mittel ist,
durch das die Transkription von Zielgenen blockiert werden kann.
Für ein
Beispiel zur Verwendung dieses Verfahrens zur Modulation der Expression
endogener Gene siehe Napoli et al., The Plant Cell 2: 279–289 (1990)
und die U.S. Patente mit den Nummern 5,034,323, 5,231,020 und 5,283,184.
-
Im
Allgemeinen tritt dort, wo die Hemmung der Expression erwünscht ist,
in geringem Ausmaß eine Transkription
der eingeführten
Sequenz auf. Diese Wirkung kann dort auftreten, wo die eingeführte Sequenz keine
kodierende Sequenz per se enthält,
sondern nur Intron- oder nicht translatierte Sequenzen, die zu Sequenzen
homolog sind, die in dem primären
Transkript der endogenen Sequenz vorhanden sind. Die eingeführte Sequenz
wird im Allgemeinen zu der endogenen Sequenz, deren Unterdrückung beabsichtigt
ist, im Wesentlichen identisch sein. Diese minimale Identität wird typischerweise
mehr als ungefähr
65% betragen, jedoch könnte
eine höhere
Identität
eine wirksamere Unterdrückung
der Expression der endogenen Sequenzen zeigen. Eine im Wesentlichen
größere Identität von mehr
als ungefähr
80% ist bevorzugt, obwohl eine Identität von ungefähr 95% bis völlige Identität besonders
bevorzugt wäre.
Wie bei der Antisense-Regulation sollte die Wirkung auf alle anderen
Proteine innerhalb einer ähnlichen
Familie von Genen zutreffen, die eine Homologie oder eine wesentliche
Homologie aufweisen.
-
Für die Sense-Unerdrückung muss
die eingeführte
Sequenz, die weniger als eine vollständige Identität benötigt, nicht
von voller Länge
bezüglich
entweder des primären
Transkriptionsprodukts oder der vollständig verarbeiteten mRNA sein.
Dies kann bevorzugt sein, um die gleichzeitige Herstellung einiger
Pflanzen, die überexprimierende
Pflanzen sind, zu vermeiden. Eine höhere Identität in einer
Sequenz, die weniger als die volle Länge aufweist, kompensiert eine
längere,
weniger identische Sequenz. Weiterhin muss die eingeführte Sequenz
nicht dasselbe Intron- oder Exonmuster aufweisen und die Identität nicht
kodierender Segmente wird gleich wirksam sein. Normalerweise wird
eine Sequenz, die in den vorstehend angemerkten Größenbereichen liegt,
für die
Antisense-Regulation verwendet.
-
Isolierte
Sequenzen, die wie hier beschrieben ist hergestellt werden, können ebenfalls
zur Einführung der
FAE1-Expression oder zur Steigerung oder Erhöhung der endogenen FAE1-Genexpression
(das heißt,
zur Erhöhung
der Herstellung von VLCFAs) verwendet werden. Wird eine Überexpression
des FAE1-Gens erwünscht,
kann ein FAE1-Gen aus einer unterschiedlichen Spezies verwendet
werden, um mögliche
Sense-Unterdrückungswirkungen
zu verringern. Zum Beispiel kann das FAE1-Gen von Arabidopsis zur
Erhöhung
der Expression in Brassica verwendet werden.
-
Der
Fachmann erkennt, dass die Polypeptide, die die FAE1-Gene kodieren,
wie andere Proteine unterschiedliche Domänen aufweisen, die unterschiedliche
Funktionen erfüllen.
Daher müssen
die FAE1-Gensequenzen nicht von vollständiger Länge sein, so lange die gewünschte funktionale
Domäne
des Proteins exprimiert wird. Unter Verwendung verschiedener rekombinanter
DNA-Techniken, die dem Fachmann gut bekannt sind und nachstehend
ausführlich
beschrieben sind, können
ebenfalls leicht modifizierte Proteinketten entworfen werden. Zum
Beispiel können
die Ketten ausgehend von der natürlich
vorkommenden Sequenz auf dem Primärstrukturniveau durch Aminosäuresubstitutionen,
Additionen, Deletionen und dergleichen variieren. Diese Modifikationen
können
in einer Zahl von Kombinationen zur Herstellung der endgültig modifizierten
Proteinkette verwendet werden.
-
Zur
Verwendung isolierter FAE1-Sequenzen in den vorstehenden Techniken
werden rekombinante DNA-Vektoren, die zur Transformation von Pflanzenzellen
geeignet sind, hergestellt. Techniken zur Transformation einer großen Vielzahl
höherer
Pflanzenspezies sind gut bekannt und sind in der technischen und
wissenschaftlichen Literatur beschrieben. Siehe zum Beispiel Weising
et al. Ann. Rev. Genet. 22: 421–477
(1988). Eine DNA-Sequenz, die das gewünschte FAE1-Polypeptid kodiert,
beispielsweise eine cDNA-Sequenz, die ein Protein mit vollständiger Länge kodiert,
wird vorzugsweise mit Transkriptions- und Translationsinitiierungsregulationssequenzen
kombiniert, die die Transkription der Sequenz aus dem FAE1-Gen in
den beabsichtigten Geweben der transformierten Pflanze lenken.
-
Zum
Beispiel kann für
eine Überexprimierung
ein Pflanzenpromotorfragment verwendet werden, das die Expression
von FAE1 in allen Geweben einer regenerierten Pflanze lenkt. Derartige
Promotoren werden hierein als „konstitutive" Promotoren bezeichnet
und sind unter den meisten Umgebungsbedingungen und Entwicklungszuständen oder
bei der Zelldifferenzierung aktiv. Beispiele für konstitutive Promotoren umfassen
die Transkriptionsinitiierungsregion des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV)
35S, den 1'- oder
2'-Promoter, der
von der T-DNA von Agrobacterium tumafaciens abgeleitet ist, und
andere Transkriptionsinitiierungsregionen von verschiedenen Pflanzengenen,
die dem Fachmann bekannt sind.
-
Alternativ
dazu kann der Pflanzenpromotor die Expression des FAE1-Gens in einem
spezifischen Gewebe lenken oder anderweitig unter präziserer
Kontrolle der Umgebung oder Entwicklung sein. Derartige Promotoren
werden hier als „induzierbare" Promotoren bezeichnet.
Beispiele für
Umgebungsbedingungen, die die Transkription durch induzierbare Promotoren
bewirken können,
umfassen anaerobe Bedingungen, erhöhte Temperatur oder das Vorhandensein
von Licht.
-
Beispiele
für Promotoren
unter Entwicklungskontrolle umfassen Promotoren, die die Transkription
nur in bestimmten Geweben initiieren, wie zum Beispiel eine Frucht,
Samen oder Blüten.
Zum Beispiel kann die Verwendung eines Albumin-Napinpromotors von Brassica napus (Lee
et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6181–6185 (1991)) oder des Promotors
aus dem FAE1-Gen von Arabidopsis die Expression des FAE1-Polypeptids
im Samen lenken.
-
Ist
eine geeignete Polypeptidexpression erwünscht, sollte eine Polyadenylierungsregion
am 3'-Ende der kodierenden
Region von FAE1 eingefügt
werden. Die Polyadenylierungsregion kann aus dem natürlichen Gen,
aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus einer T-DNA stammen.
-
Der
Vektor, der die Sequenzen aus einem FAE1-Gen umfasst, wird typischerweise
ein Marker-Gen umfassen, das Pflanzenzellen einen auswählbaren
Phänotyp
verleiht. Zum Beispiel kann der Marker eine Biozidresistenz kodieren,
insbesondere eine Antibiotikumresistenz, wie zum Beispiel eine Resistenz
gegen Kanamycin, G418, Bleomycin, Hygromycin oder eine Herbizidresistenz,
wie zum Beispiel eine Resistenz gegen Chlorsulforon oder Basta.
-
Derartige
DNA-Konstrukte können
in das Genom des gewünschten
Pflanzenwirts durch eine Vielzahl herkömmlicher Techniken eingeführt werden.
Zum Beispiel kann das DNA-Konstrukt direkt in die genomische DNA
der Pflanzenzelle unter Verwendung von Techniken, wie zum Beispiel
Elektroporation und Mikroinjektion von Pflanzenzellprotoplasten,
eingeführt
werden, oder die DNA-Konstrukte können direkt in das Pflanzengewebe
unter Verwendung ballistischer Verfahren, wie zum Beispiel DNA-Teilchenbeschuß eingeführt werden. Alternativ
dazu können
die DNA-Konstrukte
mit geeigneten, die T-DNA flankierenden Regionen kombiniert und in
einen herkömmlichen
Vektor des Wirts Agrobacterium tumefaciens eingeführt werden.
Die Virulenzfunktionen des Wirts Agrobacterium tumefaciens werden
die Insertion des Konstrukts und des benachbarten Markers in die
DNA der Pflanzenzelle lenken, wenn die Zelle durch die Bakterien
infiziert wird.
-
Mikroinjektionstechniken
sind aus dem Stand der Technik bekannt und gut in der wissenschaftlichen Literatur
und in der Patentliteratur beschrieben. Die Einführung von DNA-Konstrukten unter
Verwendung von Polyethylenglycolfällung wird bei Paszkowski et
al. Embo J. 3: 2717–2722
(1984) beschrieben. Elektroporationstechniken sind bei Fromm et
al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824 (1985) beschrieben. Ballistische
Transformationstechniken sind bei Klein et al. Nature 327: 70–73 (1987)
beschrieben.
-
Agrobacterium
tumefaciens-vermittelte Transformationstechniken, einschließlich der
Entschärfung und
Verwendung binärer
Vektoren sind gut in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben.
Siehe zum Beispiel Horsch et al. Science 233: 496–498 (1984)
und Fraley et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803 (1983).
-
Transformierte
Pflanzenzellen, die durch jede der vorstehenden Transformationstechniken
abgeleitet wurden, können
zur Regeneration einer ganzen Pflanze, die den transformierten Genotyp
und somit den gewünschten
FAE1-kontrollierten Phänotyp
besitzt, kultiviert werden. Derartige Regenerationstechniken sind
auf die Manipulation bestimmter Phytohormone in einem Gewebekulturwachstumsmedium
angewiesen, wobei sie typischerweise auf einem Biozid- und/oder
Herbizidmarker beruhen, der zusammen mit den FAE1-Nukleotidsequenzen
eingeführt
worden ist. Die Pflanzenregeneration aus kultivierten Protoplasten
wird bei Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook
of Plant Cell Culture, Seiten 124–176, Mac-Millilan Publishing Company,
New York, 1983; und Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts,
Seiten 21–73,
CRC Press, Boca Raton, 1985, beschrieben. Eine Regeneration kann
ebenfalls aus dem Pflanzenkallus, -explantaten, -organen oder Teilen
davon erhalten werden. Derartige Regenerationstechniken sind allgemein
bei Klee et al. Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467–486 (1987) beschrieben.
-
Die
Verfahren der vorliegenden Erfindung sind insbesondere für den Einbau
der FAE1-Gene in transformierte Pflanzen auf Wegen und unter Umständen verwendbar,
die natürlicherweise
nicht vorgefunden werden. Insbesondere können die FAE1-Polypeptide zu Zeiten
oder in Mengen exprimiert werden, die für natürliche Pflanzen nicht charakteristisch
sind.
-
Der
Fachmann wird erkennen, dass, nachdem die Expressionskassette stabil
in transgene Pflanzen eingebracht und ihre Funktionsfähigkeit
bestätigt
worden ist, sie in andere Pflanzen durch geschlechtliche Kreuzung
eingebracht werden kann. Jede einzelne aus einer Zahl von Standardzuchttechniken
kann in Abhängigkeit
von der zu kreuzenden Spezies verwendet werden.
-
Die
Wirkung der Modifikation der FAE1-Genexpression wird praktischerweise
durch Analyse des FA-Gehalts von Pflanzenmaterial aus der gewünschten
Pflanze nachgewiesen. In Kürze,
Lipide werden aus dem Pflanzenmaterial (zum Beispiel Samen) extrahiert,
FAs werden aus dem Triacylglycerin gespalten und durch Gaschromatographie
analysiert, wie zum Beispiel in James und Dooner Theor. Appl. Genet.
80: 241–245
(1990) beschrieben ist. Zusätzlich
kann die Antisense- oder Sense-Unterdrückung des
endogenen Gens durch eine Verringerung von mRNA-Gehalten, entsprechend
der Messung durch beispielsweise Northern-Blots, nachgewiesen werden.
-
Die
Pflanzenunterdrücker
der Erfindung weisen niedrigere Erucasäuregehalte von weniger als
ungefähr
2% (bezüglich
des gesamten FA-Gehalts im Samen), vorzugsweise weniger als ungefähr 1%, bevorzugter weniger
als ungefähr
0,5% und besonders bevorzugt weniger als ungefähr 0,1% auf. Überexprimierende Pflanzen
der Erfindung weisen Erucasäuregehalte
auf, die wesentliche höher
als die der entsprechenden nicht transformierten Pflanze sind, zum
Beispiel mindestens 10% höher,
vorzugsweise mindestens 20% höher,
bevorzugter mindestens 30% höher
und besonders bevorzugt mindestens 40% oder 50% höher. Bevorzugte
resultierende Gehalte an Erucasäure
in überexprimierenden
Brassica Pflanzen gemäß der Erfin dung
betragen mindestens ungefähr
40% (bezüglich
des gesamten FA-Gehalts im Samen), vorzugsweise mindestens ungefähr 50% und
bevorzugter mindestens ungefähr
60%. Mit anderen Öl-produzierenden
Pflanzen können
sogar höhere
Gehalte erhalten werden, zum Beispiel von mindestens ungefähr 70%,
80% oder 90% zur Erhöhung der
Präferenz.
Die Erucasäure
kann aus den überexprimierenden
Pflanzen der Erfindung unter Verwendung bekannter Verfahren extrahiert
werden. Siehe Salunkhe und Desai (1986), s. o.
-
Die
folgenden Beispiele sind erläuternd
und nicht einschränkend
dargelegt.
-
Beispiel 1
-
Isolierung und Sequenzierung
des FAE1-Gens aus Arabidopsis
-
Die
zur Isolierung der Fa-Biosynthesegene aus Arabidopsis verwendete
Strategie wird in 1 erläutert. In der vorliegenden
Arbeit wird die Transposon-Markierung mit dem autonomen Mais-Element
AC durchgeführt.
-
A. Erzeugung der Mutante
und Ac-Transformation
-
1. Bildung der Mutante
-
Eine
Sammlung von Mutanten wurde induziert und charakterisiert, um die
Genorte genetisch zu definieren, die die FA-Zusammensetzung in Arabidopsis-Samen
(erhältlich
von dem Arabidopsis Biological Resource Center at Ohio State University)
beeinflussen, wie es von James und Dooner (1990), s. o., beschrieben wurde.
-
2. Ac-Transformation
-
68
unabhängige
Einzel-Locus-Arabidopsis-Transformanten, die Ac in der T-DNA trugen,
wurden unter Verwendung der Verfahren von Keller et al., Genetics,
131: 44–459
(1992) erzeugt. Diese Zahl sorgt mit einer Sicherheit von 95% dafür, dass
jedes Gen in dem Arabidopsis-Genom nicht weiter als 15 cM von einem
eingeführten
Ac entfernt ist, wobei eine Zufallsintegration der T-DNA in dem
Genom und eine genetische Karte < 600
M angenommen wird (Koorneeff et al., in Genetic Maps, S. J. O'Brien Herausg. (Cold
Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor (1992)). In Arabidopsis
sowie in Mais und anderen Organismen transponieren Transposonen
der Ac/Ds-Familie vorzugsweise an Stellen, die mit der Donorstelle
verbunden sind (Keller et al., Theor. Appl. Genet. 86: 585–588 (1993)).
Zur Markierung eines spezifischen Gens ist daher die Initiierung
des Markierungsexperiments mit einem Ac- (oder Ds-) Element, das
mit dem interessierenden Gen verknüpft ist, zu bevorzugen. Diese
Methode, die als ortsspezifisches Markieren bezeichnet wird, erfordert
das Kartieren der T-DNA bezüglich
der Zielorte. Eine Bewertung hinsichtlich des Vorhandenseins oder
der Abwesenheit der T-DNA wurde durch den Hyg-R- (Hygromycinresistenz)
Transformationsmarker erleichtert. Die Zahl von Pflanzen mit transponiertem
Ac- (trAc) Elementen, die zur Isolierung einer spezifischen FA-Mutation
erforderlich ist, wurde daher im Vergleich zu derjenigen, die für eine Zufallstransposon-Markierungsmethode
erforderlich ist, stark verringert.
-
3. T-DNA-Lokalisierung
(Kartierung)
-
Von
vierundzwanzig T-DNAs, die auf eines der fünf Arabidopsis-Chromosomen
lokalisiert wurden, waren drei mit FAE1 verknüpft. In den Transformanten
K805, B116 und C231 waren die T-DNAs entsprechend 15, 22 und 40
cM von FAE1 gelegen. FAE1 ist lose mit dem RFLP-Marker 518 verbunden,
den Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6856–6860 (1988)
auf das Chromosom 4. kartierte. Die Verknüpfung der B116 T-DNA mit dem
Marker 518 wurde durch ein Massensegregantanalyseverfahren (Michelmore
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9828–9832 (1991)) bestätigt, bei
dem gepaarte DNA-Proben, die von vereinigten homozygoten Hyg-R/Hyg-R– und +/+-Segreganten
aus einer Hyg-RI+ (WS × Columbia)
Heterozygoten erhalten wurden, bezüglich einer Segregation von
RFLPs bewertet wurden. Eine chromosomale Stelle wurde 24 Einzel-Genorten
zugeordnet. Ac-enthaltende T-DNA-Einschübe durch
die Kombination von Zweipunktkreuzungen und Massensegregantanalysen.
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4. Herstellung von T-DNA
-
In
dem für
die Herleitung der transgenen Linie B116 verwendeten pJJ4404-Konstrukt
liegt Ac in der 5'-untranslatierten
Region des SPT- (Streptomycin-Phosphotransferase)
Gens (Jones et al., Science 244: 204–207 (1989); Keller et al.,
Plant Mol. Biol. 21: 157–170
(1993)). Somatische Ausschnitte von Ac während der Entwicklung der Keimblätter können als
grüne Sektoren
auf einem weißen
Hintergrund in Arabidopsis-Keimlingen, die in Streptomycin keimten,
nachgewiesen werden. Keimexzisionen von Ac führen zu SPT'-vollständigen grünen Keimlingen, von denen ungefähr die Hälfte ein
trAc-Element irgendwo in dem Genom tragen (Dean et al., The Plant
Journal 2: 69–81
(1992)); Keller et al., Genetics 131: 449–459 (1992)). Daher stellt
SPT::Ac einen wirksamen Marker zur Auswahl von Pflanzen dar, die
einer Transposition unterzogen wurden.
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Keimselektionen,
die aus einer Pflanze rückgewonnen
wurden, können
von einem gemeinsamen prämeiotischen
Ereignis abgeleitet werden und tragen dasselbe transponierte Element.
Zur Vermeidung einer ausgedehnten Probennahme von Duplikaten für dasselbe
Transpositionsereignis wurden im Allgemeinen nicht mehr als vier
grüne Keimlingsselektionen
von jeder Pflanze in das Gewächshaus überführt.
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B. Identifikation einer
neuen fae1-Mutation
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1. Isolierung
und Charakterisierung von Keimselektionen
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Grüne SPT'-Keimlinge wurde
auf Streptomycin ausgewählt
(Jones et al., (1989) s. o.), man ließ sie in dem Gewächshaus
zur Reife wachsen und die FA-Zusammensetzung ihrer Samen wurde durch
Gaschromatographie (GC), wie es früher beschrieben wurde (James
und Dooner (1990), s. o.), analysiert. Da fae1 und mehrere andere
Mutationen, die die Fa-Zusammensetzung im Samen beeinflussen, codominant
sind (James und Dooner (1990); Lemieux et al., (1990) s. o.), können sie
in dem heterozygoten Zustand identifiziert werden, was ein klarer
Vorteil ist, wenn man sich mit einem schwierigen Phänotyp, wie
zum Beispiel ein chromatographisches Profil, befasst. Die Selektionen
wurden von Linien getroffen, bei denen Ac entweder mit FAE1 verknüpft oder
nicht verknüpft
war. Tabelle 1 gibt die Zahl der analysierten SPT'-Selektionen, die
Zahl der Pflanzen, die sie herstellten, und den Ort von Ac bezüglich FAE1
in jeder Linie an. Ebenfalls sind Schätzungen der minimalen und maximalen
Zahl an gescreenten unabhängigen
Ac-Reinsertionen, unter der Annahme einer Ac-Reinsertionsfrequenz von 50% (Keller
et al. (1992), s. o.), angegeben. Die minimale Zahl, das heißt, die gescreente
Zahl, wenn alle grünen
Geschwister aus demselben Transpositionsereignis stammen, entspricht der
Hälfte
der Zahl der Elternpflanzen, die die grünen Keimlinge produzierten.
Die maximale Zahl, das heißt, die
gescreente Anzahl, wenn alle Geschwister, die aus unabhängigen Transpositionereignissen
resultierten, entspricht der Hälfte
der Zahl an analysierten Selektionen. Die tatsächliche Zahl untersuchter unabhängiger Ac-Reinsertionen
liegt irgendwo zwischen den zwei Werten, da sowohl klonale als auch
Einzel-Ac-Transpositionsereignisse aus derselben Pflanze rückgewonnen
werden können
(Keller et al. 1992).
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-
2. Identifikation von
Fae1-G309
-
Eine
Gesamtzahl von 721 SPT'-Selektionen
aus B116 wurde analysiert. Pflanzen der B116-Linie produzierten
durchschnittlich > 1%
grüne Selektionen
je Pflanze, jedoch variierten die Prozentsätze stark von Pflanze zu Pflanze.
Eine Selektion, G309, produzierte einen Samen mit dem verringerten
Gehalt von 20:1, der typisch für
eine FAE1/fae1-Heterozygote ist. Nach der Selbstung wies ein viertel
ihrer Abkömmlinge
eine extremere Fa-Zusammensetzung im Samen auf, die von der der
EMS-induzierten
Mutante fae1-2 ununterscheidbar war (bezeichnet als 9A1 in James
und Dooner, 1990). Die neue Mutation wurde bezüglich ihrer Allellität mit fae1-2
getestet. Da den Mutanten eine Komplementierung misslang wurde der
neuen Mutante vorläufig
die Bezeichnung fae1-G309 zugeordnet. Die FA-Zusammensetzungen von
fae1-G309 homozygoten,
heterozygoten und Wildtyp-Samen sind in Tabelle 2A dargestellt:
diejenige der fae1-2 und fae1-2/fae1-G309 Samen in Tabelle 2B.
-
-
C. Beweis, dass die neue
fae1-Mutation durch Ac markiert wird
-
1. Cosegregation
des fae-mutierten Phänotyps
mit einer Ac-hybridisierenden Bande
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Eine
DNA-Analyse des fae1-G309-Derivats zeigte das Vorhandensein einer
neuen Ac-hybridisierenden Bande. Eine DNA-Extraktion und eine DNA-Blot-Analyse
wurden durchgeführt,
wie es früher
beschrieben wurde (Keller et al. (1992), s. o.). Die gekoppelte
Segregation dieser neuen Ac-Bande mit der fae1-Mutation wurde in
dem Selbstabkömmling
einer fae1-G309/Fae1-Heterozygoten getestet. Die segregierenden
Individuen wurden als Fae1/Fae1, Fae1/fae1 oder fae1/fae1 durch
GC-Analyse ihrer Samen-Fa-Zusammensetzung und als Acl(–) oder
+/+ durch DNA-Gelblot-Analyse
eingestuft. Somit konnten sechs Genotypklassen unterschieden werden.
Die DNA aus 54 Individuen wurden mit HindIII verdaut und mit einer
Sonde von dem 5'-Ende von Ac (Kunze
et al., EMBO J. 6: 1555–1563
(1987) hybridisiert. Die Ergebnisse dieser Hybridisierungen zeigten
zwei Ac-hybridisierende Banden, die sich in dem Abkömmling trennten,
eine 3,3-kb und eine 2,4-kb Bande. Die erstere stellt neu transponiertes
Ac (trAc) und die letztere das Ac dar, das an der Stelle von SPT::Ac
in der T-DNA liegt (der eigenbefruchtete Vorgänger war die ursprüngliche
G309-Grünselektion,
SPT'/SPT::Ac).
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Die
Ergebnisse der Cosegregationsanalyse sind in Tabelle 3A dargestellt.
Alle die Individuen, die das neue trAc tragen, waren entweder homozygot
oder heterozygot bezüglich
der neuen fae1-Mutation. Umgekehrt waren alle Individuen, denen
das trAc fehlte, vom Wildtyp. Daher wurden keine Rekombinanten rückgewonnen
(Bindung X2 = 54, P < 0,001).
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Die
DNA aus der Region, die das 5'-Ende
von trAc in der fae1-m1(Ac)-Mutanten flankierte, wurde zum Klonieren
durch inverse PCR erzeugt (Ochman et al., Genetics 120: 621–623 (1988)).
Die DNA wurde aus dem Abkömmling
von fae1-G309 erhalten, der das 3,3-kb Ac-hybridisierende HindIII-Fragment
enthielt, das mit dem fae1-Phänotyp cosegregierte,
dem jedoch die kleinere 2,4-kb Ac-hybridisierende Bande fehlte.
Näherungsweise
0,5 μg genomischer
DNA wurden mit HindIII verdaut und über Nacht bei 16°C unter verdünnten Bedingungen
(200 μl
Reaktionsvolumen) li giert, um den Ringschluss der HindIII-Fragmente
zu begünstigen. Der
Primer FL125, der ausgehend von dem 5'-Ende von Ac nach außen orientiert war (CGGTTATACGATAACGGTCG),
und JK30, gerade 5' von
der ersten HindIII-Stelle in Ac (GTACGATGAAGTGGTTAGCC), wurden zur
Amplifikation von 1,5-kb der genomischen DNA, die das 5'-Ende von trAc flankierte,
verwendet.
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Diese
flankierende DNA wurde zur Rehybridisierung derselben DNA-Gelblots
verwendet. Wie erwartet, wies die neue Sonde dasselbe 3,3-kb Ac-homologe
Fragment nach und zusätzlich
ein neues Fragment mit ungefähr
1,8 kb. Falls Ac tatsächlich
das markierte FAE1-Gen aufwies, sollten alle segregierenden fae1-mutierten
Pflanzen bezüglich
der 3,3-kb Bande homozygot, alle Fae1/fae1-Pflanzen sollten bezüglich der
3,3-kb Bande und der 1,8-kb Bande heterozygot und alle Pflanzen
vom Wildtyp sollten bezüglich
der 1,8 kb-Bande homozygot sein. Die Ergebnisse der Analyse sind
in Tabelle 3B dargestellt. 53 von 54 Segreganten erfüllen die
Erwartung. Die eine Ausnahme (Segregant #5) war heterozygot bezüglich der
3,3-kb trAc-Bande. Für
diese Ausnahme gibt es zwei plausible Erklärungen. (1) Die neue fae-Mutation
wird nicht durch trAc markiert, ist jedoch eng damit verknüpft, und
dieses Individuum ist eine Rekombinante zwischen der fae1-Mutation
und trAc. (2) Die neue fae1-Mutante
wird durch trAc markiert und dieses Individuum ist das Produkt einer
Ac-Exzision, die
die Genfunktion nicht wiederherstellte. Der Segregant #5 wies ebenfalls
eine neue Ac-hybridisierende Bande auf, die in den anderen 53 Geschwistern
abwesend war (Daten sind nicht gezeigt), wobei die Beobachtung darauf
hinweist, dass sie auf die Sekundärtransposition von Ac zurückgeht.
-
-
2. Rückmutation der fae1-Mutante
-
Zur
Bestätigung,
dass die fae1-G309-Mutation durch Ac markiert wurde, wurden Abkömmlinge
mutierter Pflanzen bezüglich
mutmaßlicher
Rückmutanten
gescreent, das heißt,
Individuen mit einer dazwischen liegenden Samen-FA-Zusammensetzung,
die dann bezüglich
eines Ausschneidens von Ac aus der klonierten DNA untersucht werden
konnten. Insgesamt wurden 1052 Abkömmlinge von vier fae1-G309-Pflanzen
gescreent und drei mutmaßliche
Rückmutanten
wurden auf der Basis einer dazwischenliegenden Samen-FA-Zusammensetzung,
die für
Fae1/fae1-Heterozygoten (12–15%
20:1) typisch ist, identifiziert. Unter Verwendung der DNA-Gelblotanalyse
wurde von allen drei Ausnahmen festgestellt, dass sie bezüglich der
3,3-kb Bande in dem ursprünglichen
mutierten Allel und einer 1,8 kb Bande von der Größe eines
Wildtyps heterozygot waren. Dies ist das erwartete Ergebnis, wenn
diese Individuen aus den Ac-Exzisionsereignissen stammen, die die Genfunktion
wiederherstellten.
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Die
DNA um die trAc-Einschubstelle in dem Wildtyp-Vorläuferallel,
die fae1-G309-Mutante
und die drei mutmaßliche
Rückmutanten
wurden durch das von Saiki (1990) beschriebene Polymerasekettenreaktionsverfahren
amplifiziert und sequenziert. Die DNA wurde entweder mit dem Sequenase-Kit
(U.S. Biochemical) oder dem Fmol-Kit (Promega), den Empfehlungen
der Hersteller folgend, sequenziert. Ein Vergleich der Sequenzen ist
in 2 dargestellt.
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Im
Allgemeinen bleibt bei der Exzision von Ac ein 8 bp „Fußabdruck" mit einer gelegentlichen
Deletion oder Addition von Basen zur Wiederherstellung der Leserahmennummer
(ein Mehrfaches von drei) zurück.
Jedoch waren etwas unerwartet die DNA-Sequenzen der drei mutmaßlichen
Rückmutanten
zu denen des Wildtypvorläufers
identisch. Die Sequenz des mutmaßlichen FAE1-Proteins um die
Einschubstelle von Ac herum kann gegenüber Aminosäureänderungen intolerant sein,
so dass nur die seltenen Ereignisse, die nicht nur den richtigen
Leserahmen sondern auch die ursprüngliche Sequenz wiederherstellen,
als Rückmutanten
ausgewählt
werden. In diesem Fall würde
Segregant #5, die Ausnahme aus der Cosegregationsanalyse (Tabelle
3B) ein Ac-Exzisionsereignis darstellen, das die ursprüngliche
Aminosäuresequenz
nicht wiederherstellte und folglich bei der Wiederherstellung der
Genfunktion versagte. Die DNA-Sequenz von Segregant #5 (2)
offenbarte einen 8 bp Fußabdruck
an der Ac-Exzisionsstelle, was darauf hinweist, dass diese Ausnahme
von einer Ac-Exzision stammt, die eine Rahmenverschiebungsmutation
erzeugte und die Genfunktion herauswarf.
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Somit
bestätigen
die Analyse der Rückmutanten
und die eine Null-Ausnahme in dem Cosegregationstest, dass die fae1-G309-Mutante
durch den Einschub von Ac in das FAE1-Gen entstand, dass sie instabil
ist und dass sie die Entstehung neuer Allele an dem FAE1-Locus bewirken
kann. Somit wurde ihr die offizielle Bezeichnung fae1-m1(Ac) gegeben, um
anzuzeigen, dass sie das erste mutable Allel des isolierten FAE1-Locus
ist und dass sie durch Einschub des Transposons Ac entstand.
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D. Funktion des FAE1-Gens
in Arabidopsis
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1. Expression von FAE1
bei der Entwicklung eines Samens
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DA
VCLFAs sich in Samen anhäufen
jedoch nicht in den Blättern
von Arabidopsis (Lemieux et al. (1990), s. o.) sollte FAE1 vorzugsweise
in Samen exprimiert werden. Die Expression des FAE1-Gens wurde durch
Gelblot-Analyse der RNA aus mehreren Geweben: Blatt, unreifen Samen
und unreifen Schoten zuzüglich
Samen (Pools von ~1 Woche und von 2–3 Wochen alten Schoten) untersucht.
Die RNA wurde aus verschiedenen Arabidopsis-Geweben (sich entwickelnde
Schoten, Blättern
und unreife Samen) durch das Phenol-SDS-Verfahren, beschrieben in
Napoli et al., The Plant Cell 2: 279–289 (1990) isoliert, durch
Formaldehyd-Agarosegelelektrophrese getrennt und auf Duralon-UV-Membranen
(Stratagene) geblottet. Es wurde festgestellt, dass die FAE1-Transkripte
sich in Schoten, die sich entwickelnde Samen enthalten, und in Samen, sich
jedoch nicht in Blättern
anhäufen.
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2. Isolierung und Sequenzierung
eines FAE1-cDNA-Klons
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Das
1,5 kb FAE1-IPCR-Fragment wurde als Sonde zur Isolierung von 2 lambda
Klonen aus einer genomischen Bibliothek einer DNA aus Arabidopsis,
Ecotyp Ws, die teilweise mit Sau 3A verdaut war, verwendet und in
lambda-DASH (Stratagene) unter Verwendung der von dem Hersteller
empfohlenen Verfahren ligiert. Das FAE1-Gen wurde in den lambda-Klonen
durch Restriktionsanalyse und durch Verwendung von subklonierten
Regionen als Sonden gegen Schoten-RNA lokalisiert.
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Poly(a)RNA
wurde aus 1 g 2–3
Wochen alten grünen
Schoten unter Verwendung eines Poly ATract System 1000 Kits (Promega),
den Anweisungen des Herstellers folgend, isoliert. Eine unreife
Schoten-cDNA-Bibliothek wurde aus PolyA-RNA unter Verwendung des
lambda-Zap cDNA Synthesekits (Stratagene), den von dem Hersteller
zur Verfügung
gestellten Anweisungen folgend, hergestellt. Ein 1,0 kb BglII- bis HindIII-Fragment
aus dem 5'-Ende
des FAE1-Gens und ein 700 bp BstXI- bis EcoRI-Fragment aus der Mitte
des FAE1-Gens wurden als Sonden zum Screening dieser cDNA-Bibliothek
verwendet. Ein cDNA-Klon, der einen 1,7-kb Einschub mit der ungefähren Größe des FAE1-Transkripts
enthielt, wurde isoliert und sequenziert. Die DNA wurde entweder
mit dem Sequenase-Kit (U.S. Biochemical) oder dem famol-Kit (Promega),
den Empfehlungen der Hersteller folgend, sequenziert.
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Die
cDNA-Nukleotidsequenz wird in SEQ ID Nr: 1 zur Verfügung gestellt.
Sie stimmt mit der Sequenz der genomischen DNA über deren Länge hinweg überein, was darauf hinweist,
dass es in diesem Segment des FAE1-Gens keine Introns gibt. Die
cDNA enthält
einen langen offenen Leserahmen (ORF), scheint jedoch nicht genügend von
der vollen Länge
aufzuweisen. Falls das ATG, das sich in der entsprechenden FAE1-genomischen
Sequenz 20 Nukleotide stromaufwärts
von dem 5'-Ende der cDNA befindet,
das Initiationscodon ist, kodiert der ausgedehnte offene Leserahmen
ein Protein mit 506 Aminosäuren
mit einer vorhergesagten Sequenz, wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigt ist.
Ein Diagramm der Struktur der FAE1-genomischen Region, einschließlich des
Ortes der cDNA und der Ac-Einschubstelle in fae1-m1(Ac) ist in 3 gezeigt.
-
Beispiel 2
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Klonieren der FAE1-cDNA
aus unreifen Embryonen von Brassica napus
-
Eine
c-DNA-Bibliothek von Embryonen von B. napus (Var. Bridger) wurde
in dem Vektor lambda Uni-Zap XR (Stratagene) aus 5 μg PolyA-RNA,
den Anweisungen des Herstellers folgend, konstruiert. Die Bibliothek
wurde bezüglich
FAE1-Klonens folgendermaßen
gescreent. Insgesamt wurden 120.000 Plaques in doppelter Ausfertigung
unter entsprechender Verwendung der 3'- und 5'-Enden der FAE1-genomischen Fragmente aus Arabidopsis
thaliana gescreent. Hybridisierung und Waschungen wurden bei 60°C durchgeführt. Die
Waschlösung
war 0,2 × SSC
und 1% SDS. Aus dem Anfangsscreenen wurden insgesamt 14 potentielle FAE1-Klone,
die entweder nur an die Sonde des 3'-Endes oder sowohl an die 3'- und 5'-Enden hybridisierten, für eine weitere
Reinigung ausgewählt.
Bei einem zweiten Screening ergaben vier der ursprünglichen
14 positive Signale bei beiden Sonden. Diese vier Klone wurden bis
zur Homogenität
gereinigt. Sie wurden als 3B, 4A, 11A und 12B bezeichnet.
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Die
cDNA-Fragmente aus den vier Klonen wurden aus dem lambda-Zap- (Stratagene)
Vektor als Plasmide ausgeschnitten und DNA-Präparate wurden hergestellt.
Sie wurden hinsichtlich der Restriktionsverdaue, PCR und teilweisen
Sequenzierung charakterisiert. HindIII-Restriktionsverdaue der vier
Klone und einer Arabidopsis-cDNA-Kontrolle
zeigten, dass die vier Brassica-Klone sich von demjenigen von Arabidopsis
unterschieden. Während
der Arabidopsis-Klon zu zwei HIII-Fragmenten führte, ergaben drei der Brassica-Klone
nur ein HIII-Fragment. Der Brassica-Klon 11A ergab zwei HIII-Fragmente,
jedoch waren die Fragmentgrößen von denjenigen,
die durch den Arabidopsis-FAE1-cDNA-Klon erzeugt wurden, verschieden.
Die Restriktion mit HIII und XhoI zeigte, dass der Klon 12B von
3A und 4A verschieden war. Eine PCR-Amplifikation von 3A und 11A mit
Primern, die auf der genomischen Sequenz von Arabidopsis-FAE1 basierten,
erzeugte Banden von unterschiedlicher Größe, welche die Nicht-Identität dieser
Klone bestätigten.
Die Teilsequenzen von 3A und 11A zeigten, dass sie an sowohl den
3'- als auch den
5'-Enden der Nukleotidsequenz
zu 95% homolog waren. Die Sequenz ID Nr: 3 ist eine Teilsequenz
der kodierenden Region des Klons 4A, anfangend mit einem Basenpaar, das
sich nähe rungsweise
900 bp stromabwärts
des Translationsstarts befindet. Die Sequenz ID Nr: 4 zeigt die entsprechende
Aminosäuresequenz. 4 zeigt
ein Vergleich dieser Aminosäuresequenz
mit einer entsprechenden Sequenz aus dem Arabidopsis-Protein (SEQ ID Nr:
2). Dieser Vergleich offenbarte eine Ähnlichkeit von 94% zwischen
den zwei Proteinen.
-
Beispiel 3
-
Unterdrückung der
FAE1-Expression in Brassica
-
Die
in Beispiel 1 (SEQ ID Nr: 1) beschriebene FAE1-cDNA mit einer Länge von
1641 bp wird aus dem Vektor als EcoRI/XhoI-Fragment ausgeschnitten
und in das Plasmid p2104-CABL (Harpster et al., Mol. Gen. Genet.
212: 182–190)
kloniert, das mit NcoI und Bam HI verdaut worden war. Alle Restriktionsstellen
werden mit Klenow zur Bildung stumpfer Enden behandelt. Es werden
Standard-Molekularbiologietechniken verwendet (siehe zum Beispiel
Sambrook et al., s. o.). Das Plasmid p2104-CABL weist 1,34 kb der
CaMV 35S-Promotorsequenz, 60 bp der Petunia-CABL22 untranslatierten
Signalsequenz und 260 bp der NOS 3'-Polyadenylierungssequenz auf. Mit dieser
Ligation wird p35S-Fae1-NOS-3' mit
Fae1 in der Transkriptionsorientierung für die Sense-Unterdrückung ausgewählt und
p35S-Fae1-NOS-3' wird
für die
Antisense-Unterdrückung ausgewählt.
-
Die
Genfusionen in p35S-Fae1-NOS3' und
p35S-LeaF-NOS3' werden
als Bgl II/Hind III-Fragmente ausgeschnitten und in den binären Vektor
WTT2143 unter Verwendung von Standardtechniken (Sambrook et al.,
s. o.) kloniert. WTT2143 weist eine p2'-HPT-NOS-3'-Fusion zur Auswahl transformierter
Pflanzen und ein Tetracyclinresistenzgen zur Auswahl des Plasmids
in E. coli und Agrobacterium auf.
-
Die
resultierenden binären
Vektoren werden in Agrobacterium tumefaciens, Stamm LBA4404 durch Konjugation
mobilisiert (Herrera-Estrella und Simpson in C. H. Shaw (Herausg.)
Plant Molecular Biology Seiten 131–158 (1988)).
-
Die
binären
Sense- und/oder Antisense-Fael-Konstrukte werden aus dem Agrobacterium-Stamm,
der sie trägt,
in 5-Tage alte Hypokotylschnitte von Brassica napus cv.
-
Westar
durch Cokultivierung eingeführt.
Transformierte Triebe werden in Gegenwart von Hygromycin B ausgewählt. Das
Agrobacterium wird noch einmal mit 500 mg/ml Cefotaxim ausgewählt und
dem transformierten Gewebe wird die Kallusbildung in Gegenwart von
20 mg/ml Hygromycin B, 3% Sucrose, 0,2 mg/ml 2,4 D und 3 mg/L Kinetin
gestattet. Die Triebe werden auf dem transformierten Kallus unter
Verwendung eines Mediums, das 2,5 μM IBA, 5 mg/L AgNO3,
15 μM Thidiazuron
und 20 mg/L Hygromycin B enthält,
stimuliert. Die Triebe werden in einem Medium, das 0,125 mg/L BAP
und 500 mg/L Geopen enthält,
normalisiert und dann werden in Abwesenheit von Hormonen und Hygromycin
B Wurzeln gezogen.
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Die
transformierten Pflanzen werden zur Reife kultiviert und man lässt sie
sich selbst bestäuben.
Die resultierenden Samen werden durch Gaschromatographie analysiert
(wie in Beispiel 1 und den Verweisen darin beschrieben ist), um
Pflanzen mit einem verringertem Erucasäuregehalt von weniger als 1%
(bezüglich
des Gesamt-FA-Gehalts)
auszuwählen.
-
Beispiel 4
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Überexpression von FAE1 in Brassica
napus
-
Eine Überexpression
von Fae1 wird unter Verwendung der Schritte von Beispiel 3 mit Modifikationen, wie
sie nachfolgend angegeben sind, erhalten. Das gewünschte Ergebnis
ist, dass die Samen der transgenen Pflanzen einen höheren Erucasäuregehalt
aufweisen sollten, als Samen der nicht transformierten Kontrollen. Die
Konstruktionen in Beispiel 3 ergeben keine translationsaktiven Genprodukte.
Eine Translationsaktivität
ist für
eine Überexpression
wichtig. Ein geeignetes Design der p35S-Fae1-NOS3'-Fusion wird unter Verwendung von Standardoligonukleotidmutagenesetechniken
(Sambrokk et al., s. o.) zur Erzeugung einer Nco I-Stelle am Methioninstartpunkt
in dem genomischen Klon von Fae1 und anschließender Fusion von diesem und
der Masse des Gens aus der cDNA an den 35S-Promotor an der Nco I-Stelle in dem Plasmid
2104-CABL erreicht. Nach Transformation, Pflanzenwachstum, Selbstbestäubung und
Gaschromatographieanalyse, wie sie in Beispiel 3 erforderlich war,
werden Pflanzen mit einem Erucasäuregehalt
von mindestens 40% (bezüglich
des Gesamt-FA-Gehalts) ausgewählt.
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Die
vorstehenden Beispiele wurden zur Erläuterung der Erfindung, jedoch
nicht zur Beschränkung
ihres Umfangs bereit gestellt. Andere Varianten der Erfindung sind
für den
Durchschnittsfachmann ohne weiteres offensichtlich und sind von
den beigefügten
Ansprüchen
umfasst. Auf den Offenbarungsgehalt von allen Veröffentlichungen,
Patenten und Patentanmeldungen, die hier zitiert sind wird hiermit
vollständig
Bezug genommen.
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