DE69533516T2

DE69533516T2 - Fae1gene und deren anwendungen

Info

Publication number: DE69533516T2
Application number: DE69533516T
Authority: DE
Inventors: Jr. Douglas W. JAMES; Eda Lim; Janis Keller; Hugo K. Dooner
Original assignee: Cargill Inc
Current assignee: Cargill Inc
Priority date: 1994-10-26
Filing date: 1995-10-23
Publication date: 2005-08-18
Anticipated expiration: 2015-10-24
Also published as: DK0788542T3; ATE276368T1; US6124524A; CA2203754A1; CA2203754C; WO1996013582A1; AU703957B2; DE69533516D1; EP0788542A1; US6184355B1; EP0788542A4; EP0788542B1; AU3969995A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Molekularbiologie von Pflanzen. Insbesondere stellt sie Zusammensetzungen und Verfahren bereit, die zur Modulation der Fettsäuresynthese in Pflanzen verwendbar sind.
Fettsäuren (FAs) sind die Hauptbestandteile von Acyllipiden in Pflanzengeweben. Acyllipide sind hauptsächlich als Triacylglycerine in den Ölkörpern von Geweben vorhanden, die als Nahrungsspeicher dienen, wie zum Beispiel Samen und die fleischigen Teile von Früchten. Diese Gewebe sind wichtige kommerzielle Quellen von Fetten und Ölen. Fettsäuren werden ebenfalls als Glycolipide und Phospholipide in anderen Geweben, wie zum Beispiel Blättern, Wurzeln oder Trieben, vorgefunden, wo sie integrale Komponenten der verschiedenen Zellmembranen sind.
Die wichtigsten FAs sind gesättigte oder ungesättigte Monocarbonsäuren mit einer unverzweigten geradzahligen Kohlenstoffkette. Die wichtigsten gesättigten FAs sind Laurin- (12:0, das heißt, eine C12-Kette ohne Doppelbindungen), Myristin- (14:0), Palmitin- (16:0) und Stearinsäure (18:0). Die wichtigsten ungesättigten FAs sind Öl- (18:1), Linol- (18:2) und Linolensäure (18:3). Lipide des Samenspeichers sammeln größtenteils FAs mit 16 bis 18 Kohlenstoffatomen an. Die Ölsamen der Cruciferae und einiger anderer Pflanzen sammeln ebenfalls C20- und C22-FAs an, die zusammen als sehr langkettige Fettsäuren (VLCFAs), aufgrund ihrer relativ längeren Kettenlänge im Vergleich zu den üblicheren in Pflanzen gefundenen FAs, bezeichnet werden (siehe im Allgemeinen Stumpf, in Biochemistry of Plants, Band 9, Stumpf Herausg., Academic Press, New York, 1987) und Browse und Somerville, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 467–506 (1991).
Das Vorhandensein von VLCFAs in pflanzlichen Ölen beeinflusst deren Verwendung deutlich. Zum Beispiel weist Erucasäure (22:1) schädliche Wirkungen in Bezug auf die Ernährung auf und ist folglich in Speiseölen unerwünscht. Rapsöl weist einen natürlichen hohen Erucasäuregehalt auf, jedoch sind durch eine gemeinsame Züchtungsanstrengung Canolalinien entwickelt worden, die beinahe keine Erucasäure haben (Loof und Appleqvist, in Rapeseed, Appleqvist und Ohlson, Herausg. Elsevier Publishing, 1972). Andererseits haben pflanzliche Öle mit hohem Erucasäuregehalt viele industriellen Verwendungen gefunden, einschließlich der Verwendung als Dieselkraftstoff und als Rohstoff für ein Gebiet von Produkten, einschließlich Lacken, Korrosionshemmstoffen, Kosmetika, Kunststoffe, Pharmazeutika und Schmiermittel (Murphy, Tibtech 10: 84–87 (1992).
Die Biosynthese von gesättigten FAs mit einer Kohlenstoffkette bis zu C18 verläuft in dem Chloroplasten über die sequentielle Kondensation von C2-Einheiten von Acylthioestern. Die FA-Synthese wird durch die Kondensation von Acetyl-CoA und Malonyl-ACP, katalysiert durch das kürzlich entdeckte Enzym β-Ketoacylsynthase III (KASIII), eingeleitet (Jaworski et al., Plant Physiol. 90: 41–44 (1989)). Das Enzym Ketoacylsynthase I ist für die Verlängerung von gesättigtem Acyl-ACP von C4 zu C16 erforderlich. Der letzte Verlängerungsschritt in dem Chloroplasten von C16 zu C18, wird durch die Ketoacylsynthase II katalysiert. Auf jede Kondensation folgen drei enzymatische Schritte, die die Reduktion und Dehydratisierung des β-Ketoacylderivats betreffen, das durch die Synthese und Reduktion der Doppelbindung in dem entsprechenden Enoyl-ACP-Zwischenprodukt gebildet wurde (Stumpf, 1987, s. o.).
Die Verlängerung der FA-Kohlenstoffkette von C18 zu C22 findet außerhalb des Chloroplasten durch sequentielle Addition von zwei C2-Einheiten von Malonyl-CoA zu einem C18-Kohlenstoffskelett statt, eine Reaktion, die durch einen speziellen Acyl-CoA-Elongasekomplex katalysiert wird (Stumpf und Pollard, in High and Low Erucic Acid Rapeseed Oils, Kramer et al. Herausg. Academic Press, 1983). Ob die zwei Verlängerungsreaktionen durch ein oder zwei verschiedene Enzymkomplexe ausgeführt werden, ist nicht klar (Taylor et al., Plant Physiol. 99: 1609–1618 (1992)). Die gleichen vier vorstehend beschriebenen Reaktionen für die Biosynthese von C18-FAs haben mit der weiteren Verlängerung von C18 in Pflanzen zu tun: (i) Kondensation von 18:1 CoA mit Malonyl-CoA unter Bildung eines β-Ketoacylderivats, (ii) Reduktion und (iii) Dehydratisierung des β-Ketoacylderivats und (iv) Reduktion der Doppelbindung (Creach und Lessire JAOCS 70: 1129–133 (1993)). Jedoch wurde aufgrund der Schwierigkeiten bei der Solubilisierung Membran-gebundener Enzyme der Elongasekomplex nicht gut charakterisiert. Elongasen wurden aus mehreren Pflanzen, einschließlich Allium porrum oder Lauch (Bessoule et al., Arch. Biochem. Biophys. 268: 475–484 (1989)), Lunaria annua oder Silberblatt (Fehling et al., Biochim.
Biophys. Acta 1126: 88–94 (1992)) und Brassica napus oder Raps (Creach und Lessire, 1993, s. o.) teilweise gereinigt.
Bei Arabidopsis führen Mutationen in einem Gen, dem FAE1-Gen, das mit der Fettsäureverlängerung verbunden ist, zu einem Mangel an Acylkettenverlängerungsaktivitäten von C18 zu C20 und von C20 zu C22, und zu stark verringerten Gehalten an VLCFAs im Samen (James und Dooner, Theor. Appl. Genet. 80: 241–245 (1990); Lenieux et al., Theor. Appl. Genet. 80: 234–240 (1990); James und Dooner Theor. Appl. Genet. 82: 409–412 (1991) und Kunst et al., Plant Physiol. Biochem. 30: 425–4343 (1992)).
Die FA-Biosynthesegene sind durch die herkömmlichen biochemischen Methoden der Reinigung des entsprechenden Enzyms zur Erzeugung von Antikörpern oder Oligonukleotiden, mit denen cDNA-Bibliotheken zu testen sind, isoliert worden. Darunter sind Gene für ACP (Schmid und Ohlrogge, Plant Mol. Biol. 15: 765–778 (1990)), KASII (Internationale Veröffentlichungen WO92/03564 und WO93/10240), KASIII (Tai und Jaworski, Plant Physiol. 103L 1361–1367 (1993)), Stearoyl-ACP-Desaturase (internationale Veröffentlichung Nr. WO91/18985), Acyl-ACP-Thioesterasen (U.S. Patent Nr. 5,298,421), Enoyl-ACP-Reduktase (Kater et al., Plant Molec. Biol. 17: 895–909 (1991)), 3-Ketoacyl-ACP-Reduktase (Klein et al., Mol. Gen. Genet. 233: 122–128 (1992)), Acyl-ACP:Glycerin-3-P-Acyltransferase (Weber et al., Plant Molec. Biol. 17: 1067–1076 (1991)). Andere sind auf der Grundlage der DNA-Homologie zu früher klonierten Genen aus verwandten Spezies, zum Beispiel Genen für Stearoyl-ACP-Desaturasen (Knutzon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2624–2628 (1992)) oder Acyl-ACP:Glycerin-3-P-Acyltransferasen (Nishida et al., Plant Molec. Biol. 21: 267–277 (1993)) isoliert worden.
Es sind ebenfalls Gene isoliert worden, die FA-Biosyntheseenzyme in Arabidopsis kodieren. Beispiele dafür umfassen das FAD3-Gen, das eine 18:2-Desaturase des endoplasmatischen Retikulums (ER) kodiert (Arondel et al., Science 258: 1353–1354 (1992)), das FAD3- (Yadav et al., Plant Physiol. 103: 467–476 (1993)) und das FAD2-Gen, das ein weiteres ER-Enzym, eine 18:1-Desaturase kodiert (Okuley et al., The Plant Cell, 6: 147–158 (1994)).
Es gab keine Berichte über die Isolierung von FAE1-Genen. Die Isolierung dieser Gene wäre insbesondere zur Modulation der Fettsäuresynthese in Pflanzen brauchbar. Diese und andere Vorteile werden durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte DNA-Konstrukte zur Verfügung, die eine Polynukleotidsequenz aus einem FAE1-Gen umfassen, wobei entsprechend der Definition in Anspruch 1 FAE1-Gene Verlängerungsenzyme kodieren, die die Umwandlung von C18-FAs zu C20-C22-FAs katalysieren. Eine bevorzugte Ausführungsform der Gene der Erfindung umfasst Sequenzen, die im Wesentlichen identisch zu Sequenzen sind, die die SEQ ID Nr: 1 sind, diese enthalten oder innerhalb dieser enthalten sind.
DNA-Konstrukte, die die Polynukleotide der Erfindung umfassen, werden zur Modifikation der FAE1-Genexpression verwendet und modulieren dabei den FA-Gehalt in Pflanzenorganen oder -teilen, insbesondere in Samen. Somit kann ein DNA-Konstrukt weiterhin einen Promotor umfassen, der funktionsfähig mit der Polynukleotidsequenz verknüpft ist. Der Promotor ist vorzugsweise ein Pflanzenpromotor, wie zum Beispiel ein Samen-spezifischer Promotor. Ist die Unterdrückung eines endogenen FAE1-Gens erwünscht, kann die Polynukleotidsequenz mit dem Promotor in Sense- oder Antisense-Orientierungen verknüpft sein.
Die Erfindung stellt ebenfalls transgene Pflanzen (zum Beispiel Brassica Pflanzen) zur Verfügung, die eine rekombinante Expressionskassette umfassen, die einen mit der Polynukleotidsequenz funktionsfähig verknüpften Pflanzenpromotor umfasst. Die transgene Pflanze weist in einem oder mehreren Geweben einen veränderten FA-Gehalt auf. Für die Verwendung in Pflanzen, die Speiseöle produzieren, führt die Einführung der rekombinanten Expressionskassetten vorzugsweise zu einer Hemmung eines endogenen FAE1-Gens, was zu Pflanzen mit einem verringerten VLCFA-Gehalt führt.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Änderung des FA-Gehalts in einer Pflanze zur Verfügung. Das Verfahren umfasst das Einbringen einer rekombinanten Expressionskassette in Pflanzengewebe, die einen Pflanzenpromotor umfasst, der funktionsfähig mit einer Polynukleotidsequenz aus einem FAE1-Gen in der Sense- oder Antisense-Orientierung verknüpft ist. Der Promotor kann ein Gewebespezifischer Promotor, zum Beispiel ein Samen-spezifischer Promotor, sein. Die Expressionskassette wird typischerweise unter Verwendung von Agrobacterium oder anderen Standardmitteln in Pflanzengewebe eingebracht. Das transformierte Pflanzengewebe wird zu ganzen Pflanzen regeneriert, wobei die regenerierte Pflanze die eingebrachte Polynukleotidsequenz transkribiert. Die Pflanzen werden dann untersucht und bezüglich eines geänderten FA-Gehalts ausgewählt.
Die Erfindung stellt weiterhin Verfahren zur Isolation eines FAE1-Gens aus einer Pflanze zur Verfügung. Das Verfahren kann die Analyse einer DNA-Bibliothek (zum Beispiel eine cDNA-Bibliothek) umfassen, die aus der Pflanze mit Oligonukleotidsonden, die eine Polynukleotidsequenz aus einem FAE1-Gen umfassen, hergestellt wurde.
Definitionen
Der Begriff „Nukleinsäuresequenz" bezieht sich auf ein einzel- oder doppelsträngiges Polymer aus Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotidbasen, die vom 5'- zum 3'-Ende hin gelesen werden. Er umfasst selbst-replizierende Plasmide, infektiöse Polymere einer DNA oder RNA und nicht funktionale DNA oder RNA.
Der Begriff „Promotor" bezieht sich auf eine Region einer DNA stromaufwärts vom Transkriptionsstart und hat mit der Erkennung und Bindung von RNA-Polymerase und anderen Proteinen zur Initiierung der Transkription zu tun. Ein „Pflanzenpromotor" ist ein Promotor, der in der Lage ist, die Transkription in Pflanzenzellen zu initiieren.
Der Begriff „Pflanze" umfasst ganze Pflanzen, Pflanzenorgane (zum Beispiel Blätter, Stiele, Wurzeln, usw.), Samen und Pflanzenzellen und deren Abkömmlinge. Die Klasse von Pflanzen, die in dem Verfahren der Erfindung verwendet werden kann, ist im allgemeinen so ausgedehnt wie die Klasse der höheren Pflanzen, die für Transformationstechniken zugänglich ist, einschließlich von sowohl Monokotylen als auch Dikotylen, sowie bestimmten niederen Pflanzen, wie zum Beispiel Algen. Er umfasst Pflanzen aus einer Vielzahl von ploiden Niveaus, einschließlich polyploid, diploid und haploid.
Eine „heterogene Sequenz" ist eine Sequenz, die aus einer fremden Spezies stammt, oder, falls sie aus derselben Spezies stammt, eine, die ausgehend von ihrer ursprünglichen Form wesentlich modifiziert worden ist. Zum Beispiel stammt ein heterologer Promoter, der funktionsfähig mit einem Strukturgen verknüpft ist, aus einer Spezies, die sich von derjenigen unterscheidet, von der das Strukturgen stammte, oder, falls er von derselben Spezies stammt, wurde er ausgehend von seiner ursprünglichen Form wesentlich modifiziert.
Ein „FAE1-Gen", wie es hier verwendet wird, ist ein Gen, das ein Enzym oder eine Komponente eines Enzyms, das die Umwandlung von Ölsäure (18:1) zu Eicosansäure (20:1) und von Eicosansäure zu Erucasäure katalysiert, kodiert.
Ein Homologes eines speziellen FAE1-Gens (zum Beispiel SEQ ID Nr: 1) ist ein zweites Gen in demselben Pflanzentyp oder in einem unterschiedlichen Pflanzentyp, das eine Polynukleotidsequenz von mindestens 50 aneinandergrenzenden Nukleotiden, die zu einer Sequenz in dem ersten Gen im wesentlichen identisch sind (die Bestimmung erfolgt entsprechend der nachstehenden Beschreibung), aufweist. Es wird angenommen, dass Homologe im Allgemeinen eine gemeinsame evolutionäre Vergangenheit aufweisen.
Eine „Polynukleotidsequenz aus einem FAE1-Gen" ist eine Untersequenz oder eine Polynukleotidsequenz eines FAE1-Gens mit voller Länge, die, wenn sie in einer transgenen Pflanze vorhanden ist, die gewünschte Wirkung aufweist, zum Beispiel die Hemmung der Expression des endogenen FAE1-Gens. Im Falle von sowohl der Expression von Transgenen als auch der Hemmung von endogenen Genen (zum Beispiel durch Antisense- oder Sense-Unterdrückung) wird der Fachmann erkennen, dass die eingeschobene Polynukleotidsequenz zu einer Sequenz des Gens, von der sie abgeleitet wurde, nicht identisch sein muss und zu ihr „im wesentlichen identisch" sein kann. Wie nachstehend erklärt ist, werden speziell diese Varianten von diesem Begriff umfasst.
Für den Fall, dass die eingeschobene Polynukleotidsequenz zur Herstellung eines funktionalen Polypeptids transkribiert und translatiert wird, wird der Fachmann erkennen, dass aufgrund der Codondegeneration eine Zahl von Polynukleotidsequenzen dasselbe Polypeptid kodieren werden. Diese Varianten werden ausdrücklich von dem Begriff „Polynukleotidsequenz aus einem FAE1-Gen" umfasst. Zusätzlich umfasst der Begriff besonders diejenigen Sequenzen mit voller Länge, die im wesentlichen zu einer FAE1-Gensequenz identisch sind (die Bestimmung erfolgt entsprechend der nachstehenden Beschreibung) und die Proteine kodieren, die die Funktion des FAE1-Enzyms behalten. Somit umfasst der vorstehende Begriff verschiedene Polynukleotidsequenzen, die eine wesentliche Identität mit den hier offenbarten Sequenzen aufweisen und die Enzyme kodieren, die zur Katalyse derselben vorstehend beschriebenen Reaktionen in der Lage sind.
Für den Fall, dass Polynukleotide zur Hemmung der Expression eines endogenen Gens verwendet werden, muss die eingeführte Sequenz ebenfalls nicht perfekt identisch zu einer Sequenz des endogenen Zielgens sein. Die eingeführte Polynukleotidsequenz wird zu der endogenen Zielsequenz typischerweise zumindest im Wesentlichen identisch sein (entsprechend der nachstehenden Bestimmung).
Zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptide heißen „identisch", wenn die Sequenz von Nukleotiden beziehungsweise Aminosäureresten in den zwei Sequenzen dieselbe ist, wenn sie bezüglich einer maximalen Übereinstimmung angeordnet sind, wie es nachstehend beschrieben ist. Die Verwendung des Begriffs „komplementär zu" soll hier bedeuten, dass die komplementäre Sequenz zu der gesamten oder einem Teil einer Referenz-Polynukleotidsequenz identisch ist.
Sequenzvergleiche zwischen zwei (oder mehreren) Polynukleotiden oder Polypeptiden werden typischerweise durch Vergleich von Sequenzen der zwei Sequenzen über ein „Vergleichsfenster" durchgeführt, um lokale Regionen mit einer Sequenzähnlichkeit zu identifizieren und zu vergleichen. Ein „Vergleichsfenster", wie es vorliegend verwendet wird, bezieht sich auf ein Segment von mindestens ungefähr 20 aneinandergrenzenden Positionen, normalerweise ungefähr 50 bis ungefähr 200, besonders üblich ungefähr 100 bis ungefähr 150, in dem eine Sequenz mit einer Referenzsequenz mit derselben Zahl an aneinandergrenzenden Positionen verglichen werden kann, nachdem die zwei Sequenzen optimal angeordnet wurden.
Eine optimale Anordnung von Sequenzen für einen Vergleich kann durch den lokalen Homologie-Algorithmus von Smith und Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), durch den Homologie-Anordnungsalgorithmus von Needleman und Wunsch J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), durch das Verfahren der Ähnlichkeitssuche nach Pearson und Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444 (1988), durch rechnergestützte Implementierungen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA in dem Wisconsin Genetics Software Paket, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch Inspektion durchgeführt werden.
Der „Prozentsatz der Sequenzidentität" wird durch Vergleich von zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster bestimmt, wobei für eine optimale Anordnung der zwei Sequenzen der Teil der Polynukleotidsequenz im Vergleich zu der Referenzsequenz (die keine Additionen oder Deletionen umfasst) Additionen oder Deletionen (das heißt Lücken) in dem Vergleichsfenster umfassen kann. Der Prozentsatz wird durch die Bestimmung der Zahl der Positionen, an denen in beiden Sequenzen die identische Nukleinsäurebase oder Aminosäurerest auftritt, woraus sich die Zahl der übereinstimmenden Positionen ergibt, durch Division der Zahl der übereinstimmenden Positionen durch die Gesamtzahl von Positionen in dem Vergleichsfenster und durch Multiplizieren des Ergebnisses mit 100 berechnet, woraus sich der Prozentsatz der Sequenzidentität ergibt.
Der Begriff „wesentliche Identität" von Polynukleotidsequenzen bedeutet, dass ein Polynukleotid eine Sequenz umfasst, die mindestens 90% und besonders bevorzugt mindestens 95% Sequenzidentität im Vergleich zu einer Referenzsequenz unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Programme (vorzugsweise BESTFIT) unter Verwendung von Standardparametern aufweist. Der Fachmann wird erkennen, dass diese Werte geeignet angepasst werden können, um die entsprechende Identität von Proteinen, die von zwei Nukleotidsequenzen kodiert werden, zu bestimmen, indem die Codondegeneration, die Aminosäurenähnlichkeit, die Positionierung des Leserahmens und dergleichen berücksichtigt werden. Für diese Zwecke bedeutet eine wesentliche Identität von Aminosäuresequenzen normalerweise eine Sequenzidentität von mindestens 40%, vorzugsweise mindestens 60%, bevorzugter mindestens 90% und besonders bevorzugt mindestens 95%.
Nukleotidsequenzen, die im Wesentlichen identisch sind, werden aneinander unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Stringente Bedingungen sind Sequenzabhängig und werden unter verschiedenen Umständen unterschiedlich sein. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so ausgewählt, dass sie ungefähr 5°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und pH-Wert liegen. Der Tm-Wert ist die Temperatur (bei einer definierten Ionenstärke und pH-Wert), bei der 50% der Zielsequenz an eine perfekt zusammenpassende Sonde hybridisiert. Stringente Bedingungen werden typischerweise diejenigen sein, bei denen die Salzkonzentration bei einem pH-Wert von 7 ungefähr 0,02 molar ist und die Temperatur mindestens ungefähr 60°C beträgt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Abbildung der Strategie, die zur Isolierung der FA-Biosynthesegene aus Arabidopsis verwendet wird.
2 zeigt einen Vergleich der Nukleotidsequenz von FAE1 um die Stelle des Einschubs des transponiblen Elements Ac herum.
3 ist ein Diagramm der Struktur der genomischen Region von FAE1, einschließlich des Ortes der cDNA und der Ac-Insertionsstelle in fae1-m1(Ac).
4 ist ein Vergleich der Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nr: 2 und SEQ ID Nr: 4 unter Verwendung des BESTFIT-Sequenzvergleichsprogamms.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren zur Regulierung der Fettsäuresynthese in Pflanzen zur Verfügung. Die Wirkung eines Enzyms, FAE1, auf die FA-Synthese in Arabidopsis wurde durch Untersuchung von Mutanten des Gens, welches das Enzym kodiert, aufgeklärt. Wie vorstehend bemerkt wurde, wurde eine Mutante mit einer unzureichenden Oleat (18:1)-Verlängerung und die nur 0,2% Eicosansäure in ihrem Samenöl aufwies, von James und Donner Theor. Appl. Genet. 80: 241–245 (1991) und Lemieux et al. Theor. Appl. Genet. 80: 234–240 (1990) beschrieben. Gestützt auf die Isolierung dieser Eigenschaft bestimmten James und Dooner und Lemieux et al., dass sie durch eine einzelne Kernmutation in einem Gen verursacht wird, das die letztgenannten Autoren mit FAE1 bezeichnet haben.
Die vorliegende Erfindung stellt klonierte Gene, die das FAE1-Enzym kodieren, zur Verfügung. In der vorliegenden Erfindung verwendbare FAE1-Gene umfassen ein FAE1-Gen, das in Arabidopsis identifiziert wurde, sowie Homologe in anderen Pflanzen (entweder von der gleichen oder unterschiedlichen Gattung oder Spezies). Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls rekombinante Vektoren zur Verfügung, die Polynukleotidsequenzen aus einem FAE1-Gen, die auf einer Vielzahl von Wegen verwendet werden können, umfassen.
Im Allgemeinen findet die Erfindung bei der Modulierung des FA-Gehalts in allen höheren Pflanzen Verwendung. Die Erfindung findet somit über einen weitreichenden Bereich von Pflanzenarten, einschließlich von Spezies der Gattungen Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lacruca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesia, Palargonium, Panicum, Penniserum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browallia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum und Datura Verwendung.
Insbesondere umfassen Pflanzen, für die die Erfindung zur Modifikation des FA-Gehalts verwendet werden kann, Ölernten der Cruciferae-Familie: Canola, Raps (Brassica spp.), Krambe (Crambe spp.), Silberblatt (Lunaria spp.), Lesquerella (Lesquerella spp.) und andere; die Compositae-Familie: Sonnenblume (Helianthus spp.), Saflor (Carthamus spp.), Ramtillkraut (Guizotia spp.) und andere; die Leguminosae- Familie: Erdnuß (Arachis spp.), Sojabohne (Glycine spp.) und andere; und Pflanzen anderer Familien, wie zum Beispiel Mais (Zea spp.), Baumwolle (Gossypiu, sp.), Jojoba (Simonasia sp.), Flachs (Linum sp.), Sesam (Sesamum spp.), Rizinusbohne (Ricinus spp.), Olive (Olea spp.), Mohn (Papaver spp.), Wolfsmilch (Euphorbia, spp.), Sumpfblume (Limnanthes spp.) und Zigarettenblümchen (Cuphea spp.).
Wie vorstehend bemerkt wurde, weisen VLCFAs, insbesondere Erucasäure, schädliche Wirkungen in Bezug auf die Ernährung auf und sind somit in Speiseölen unerwünscht. Unter Verwendung von Standardtechniken in der Molekularbiologie von Pflanzen, wie nachstehend beschrieben ist, kann die Erzeugung von Erucansäure in Pflanzen, die zur Herstellung von Speiseölen verwendet werden, insbesondere Raps, Brassica napus, verringert werden.
Alternativ dazu finden pflanzliche Öle mit hohem Gehalt an VLCFAs, insbesondere Erucansäure, vielerlei Verwendung in der Industrie. Somit kann die Erfindung zur Erhöhung des VLCFA-Gehalts von Pflanzenölen durch Überexpression von FAE1 verwendet werden. Zusätzlich werden ebenfalls Alkohole, die von den VLCFAs durch Reduktion der Carboxylgruppe abgeleitet werden, in diesen Pflanzen zunehmen. VLCF-Alkohole werden mit VLCFAs in Jojobaöl verestert und können als Ersatz für Pottwalöl in Schmiermitteln von hoher Qualität und als wertvoller Träger für Medikamente verwendet werden. Zum Beispiel können Krambe und Jojoba, die zwei aufgrund ihres VLCFA-Gehalts industriell geschätzte Öle sind, zur Erhöhung der Herstellung dieser FAs modifiziert werden. Der C20-C22-FA-Gehalt von Krambe-Samenöl, der ungefähr 50–60% 22:1 (Salunkhe und Desai, in Postharvest Biotechnology of Oilseeds Seiten 187–197 (CRC Press, Boca Raton, FL, 1986)) beträgt, und von Jojobasamenwachs, der derzeit ungefähr 54% 20:1 + 22:1 (Salunkhe und Desai, s. o.) beträgt, könnte durch Überexpression von FAE1 erhöht werden.
Die Polynukleotide der Erfindung können ebenfalls zur Modifikation anderer erwünschter Eigenschaften in Pflanzen verwendet werden. Da die Zusammensetzung der Blattoberflächen deren Durchlässigkeit beeinflusst, kann zum Beispiel die Trockenheitstoleranz von Pflanzen durch Änderung der Zusammensetzung der FAs, aus denen die kutikularen Wachse des Blattes (Oberfläche) bestehen, beeinflusst wer den. Somit kann jede Eigenschaft, bei der die VLCFA-Synthese von Bedeutung ist, unter Verwendung der Verfahren der Erfindung geändert werden.
FAE1-Polypeptide
Die erfindungsgemäßen Enzyme weisen eine gemeinsame Homologie mit denjenigen von zwei anderen kondensierenden Enzymen auf, die Malonyl-CoA, Chalkonsynthase (CHS) und Stilbensynthase (STS) verwenden. Eine Consensus-Sequenz unter den drei Enzymen wurde aus einem Vergleich ihrer Aminosäuresequenzen, der mit den CGC-Computerprogammen durchgeführt worden war, offenbart (Devereux et al., Nuc. Acids. Res. 12: 387–395 (1984)). Sie besteht aus 17 Aminosäuren, die sich über eine Region mit 50 Aminosäuren in der Nähe des Carboxylendes der Proteine (ausgehend von der Position 392 in FAE1) erstrecken. Diese Region befindet sich gerade stromaufwärts der CHS-STS 12 Aminosäuren „Signatursequenz" (Fliegmann et al., Plant Mol. Biol. 18: 489–503 (1992)), die in den Proteinen der Erfindung nicht vorkommt.
Das FAE1-Protein weist ebenfalls eine gemeinsame Homologie mit einer konservierten Region in CHS und STS auf, die sich nahe an der aktiven Cystein-Stelle, die von Lanz et al., J. Biol. Chem. 266: 9971–9976 (1991) identifiziert wurde, befindet. Diese Region der Homologie {L-A-K-D-L-X(9)-L-V-V} überlappt jedoch nicht mit der Consensus-Sequenz für die CHS/STS-aktive Stelle {G-C-(FY)-(GA)-G-G-T-X(2)-R}, sondern liegt unmittelbar angrenzend an deren Carboxylende.
Die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Proteine ist ebenfalls homolog zu dem Ketoacylsynthase (KAS) III-Enzym von E. coli und Spinat, dem kondensierenden Enzym, das die FA-Biosynthese in Bakterien und Pflanzen durch Kopplung von Acetyl-CoA an Malonyl-ACP initiiert. Insbesondere ist das hier offenbarte FAE1-Protein zu 35% identisch und zu 47% ähnlich zu KASIII von E. coli (kodiert durch das fabH-Gen), und zu 32% identisch und zu 46% ähnlich zu KASIII von Spinat über einen 57 Aminosäurestretch, der ebenfalls bei Position 392 von FAE1 beginnt.
Die FAE1-Enzyme der vorliegenden Erfindung besitzen vorzugsweise eine katalytische Aktivität, die im Wesentlichen gleich oder höher ist als die Aktivität des in SEQ ID Nr: 2 ausgeführten Proteins. Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können natürlich, das heißt, einschließlich eines gesamten nativen FAE1-Enzyms, das aus einer natürlichen Quelle isoliert und gereinigt wurde, oder synthetisch sein. Derartige natürliche FAE1-Polypeptide können aus Pflanzenmaterial unter Verwendung von in der wissenschaftlichen Literatur beschriebenen Verfahren, auf die vorstehend verwiesen wurde, isoliert werden. „Isoliert" soll bedeuten, dass die FAE1-Proteine aus ihrer nativen Umgebung, wie zum Beispiel aus dem Pflanzengewebe, indem sie normalerweise vorkommen, entfernt worden sind. Folglich soll der Begriff „isoliert" das Vorhandensein eines FAE1-Polypeptids als eine heterologe Komponente einer Zeile oder eines anderen Systems, wie zum Beispiel ein Mikroorganismus-Expressionswirt oder eine transformierte höhere Pflanze, umfassen. Zum Beispiel kann das FAE1-Polypeptid der vorliegenden Erfindung in einem Mikroorganismuswirt, wie zum Beispiel Bakterien oder Hefe, exprimiert werden, mit einem DNA-Konstrukt, das das Polypeptid kodiert, transformiert oder transfiziert werden. Normalerweise wird eine derartige Expression in Mikroorganismuswirten der erste Schritt zur Herstellung eines „gereinigten" FAE1-Polypeptids sein. Alternativ dazu können „isolierte" FAE1-Polypeptide in transformierten höheren Pflanzen exprimiert werden, wobei die FAE1-Polypeptide häufig keiner Form der Reinigung unterzogen werden. Derartige Polypeptide sind jedoch in dem Sinne isoliert, dass sie aus ihrer nativen Umgebung entfernt worden sind, wobei sie häufig das Ergebnis der Expression eines heterologen Gens sind, obwohl sie in machen Fällen das Ergebnis der Expression eines homologen Gens unter der Kontrolle eines heterologen Promotors sind. In dem letztgenannten Fall kann das homologe FAE1-Polypeptid in Pflanzengeweben und zu Zeiten exprimiert werden, die anders sind, als es normalerweise der Fall wäre.
FAE1-Polypeptide können aus jeder natürlichen Quelle, die signifikante Mengen eines natürlichen oder nativen FAE1-Enzyms besitzt, isoliert und gereinigt werden. Die Isolation und Reinigung kann durch herkömmliche chemische Reinigungstechniken, wie zum Beispiel die Flüssigkeitschromatographie, Affinitätschromatographie, Gradientenzentrifugation, Gelelektrophorese, Größenausschlußchromatographie, Ionenaustauschchromatographie, hydrobobe Wechselwirkungschromatographie, Umkehrphasenchromatographie und dergleichen erreicht werden. Derartige Techniken sind in der wissenschaftlichen Literatur und in der Patentliteratur gut beschrieben. Siehe zum Beispiel Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York (1982).
Derartige Techniken sind zur Isolierung von FAE1-Polypeptiden aus sowohl natürlichen zellulären Quellen als auch aus rekombinant modifizierten Expressionswirten geeignet.
Die FAE1-Enzyme der vorliegenden Erfindung können in einer im Wesentlichen reinen Form erhalten werden. „Im wesentlichen rein" soll bedeuten, dass das Polypeptid in einer intermediären oder Endzusammensetzung und in einer Reinheit von mindestens ungefähr 50%, basierend auf dem Gewicht des in dem Gesamtgewicht der Zusammensetzung (Gewicht/Gewicht; w/w) vorhandenen FAE1-Polypeptids, vorkommt und, dass es im wesentlichen frei von störenden Proteinen und Verunreinigungen ist, insbesondere von Proteinen und Verunreinigungen, die die gewünschte katalytische Aktivität stören und/oder die toxisch, immunogen sind, oder die anderweitig die erwünschte Verwendung eines Endprodukts verhindern. Die FAE1-Polypeptide werden vorzugsweise in einer Reinheit von mindestens ungefähr 60% w/w, bevorzugter mindestens ungefähr 70% w/w und besonders bevorzugt von mindestens ungefähr 80% w/w isoliert oder synthetisiert. Normalerweise sind sogar häufig höhere Reinheitsgehalte von 90% w/w, 95% w/w oder höher erreichbar. Sehr hohe Reinheitsgehalte, typischerweise von mehr als 98% w/w und besonders bevorzugt von mehr als 99% w/w können ebenfalls erzielt werden.
Die erfindungsgemäßen synthetischen FAE1-Polypeptide können durch jede der zwei allgemeinen Methoden hergestellt werden. Erstens können Polypeptide mit weniger als ungefähr 200 Aminosäuren, normalerweise weniger als ungefähr 150 Aminosäuren und vorzugsweise mit weniger als ungefähr 100 Aminosäuren zum Beispiel durch das gut bekannte Merrifield-Festphasenverfahren synthetisiert werden, wobei Aminosäuren sequentiell an eine wachsende Kette addiert werden (Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149–2156). Kommerzielle Systeme, die derartige Festphasentechniken für die automatisierte Synthese von Polypeptiden verwenden, sind von Anbietern, wie zum Beispiel Applied Biosystems, Inc., Foster City, Kalifornien, erhältlich.
Das zweite und im allgemeinen bevorzugtere Verfahren zur Synthese der erfindungsgemäßen FAE1-Polypeptide betrifft die Expression rekombinanter DNA-Moleküle in kultivierten Zellen, die das gesamte oder einen gewünschten Teils eines FAE1-Proteins kodieren. Das rekombinante DNA-Molekül kann entweder ein natürliches oder ein synthetisches Gen enthalten, wobei natürliche Gene und cDNA aus Pflanzensamenmaterial durch herkömmliche Verfahren, entsprechend der Beschreibung in der vorstehend zitierten Literatur, erhältlich sind. Die Isolierung von Polynukleotiden, die ein gewünschtes FAE1 kodieren, ist nachstehend ausführlich beschrieben.
FAE1-kodierende Polynukleotide
Der nachstehende Abschnitt mit Beispielen, der die Isolierung und Charakterisierung eines FAE1-Gens in Arabidopsis beschreibt, ist beispielhaft für eine allgemeine Methode zu Isolierung von erfindungsgemäßen Genen. Die Isolierung dieses Gens gestattet dem Fachmann leicht homologe Gene in Arabidopsis und anderen Pflanzenspezies zu isolieren. Die isolierten Gene können dann zum Aufbau rekombinanter Vektoren zur Änderung der FAE1-Genexpression in transgenen Pflanzen verwendet werden.
Im Allgemeinen sind die Nomenklatur und die nachstehend beschriebenen Laborverfahren in der rekombinanten DNA-Technologie dem Fachmann gut bekannt und werden in dem Fachgebiet gewöhnlich verwendet. Standardtechniken werden zur Klonierung, DNA- und RNA-Isolierung, Amplifikation und Reinigung verwendet. Im Allgemeinen werden enzymatische Reaktionen, die die DNA-Ligase, DNA-Polymerase, Restriktionsendonukleasen und dergleichen betreffen, gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt. Diese Techniken und verschiedene andere Techniken werden im Allgemeinen gemäß Sambrook et al., Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989) durchgeführt.
Die Isolierung von FAE1-Genen kann durch eine Zahl von Techniken durchgeführt werden. Zum Beispiel kann die Markierung eines FAE1-Gens mithilfe eines Transposons die Isolierung des relevanten Gens unterstützen. Die Transposon-Markierung erfordert die Einführung eines Transposons in die Pflanze, was zu einer Mutation des Zielgens und zu einer nachweisbaren phänotypischen Änderung in der Pflanze führt. Unter Verwendung einer Sonde für das Transposon kann dann das mutierte Gen isoliert werden. Unter Verwendung der DNA, die zu dem Transposon in dem isolierten mutierten Gen benachbart ist, als Sonde kann das normale Allel von Wildtyp des Zielgens isoliert werden. Siehe zum Beispiel Haring, et al., Plant Mol. Biol. 16: 449–469 (1991) und Walbot, Ann. Rev. Plant Mol. Biol. 43: 49–82 (1992). Wie nachstehend gezeigt ist, ist ein besonders brauchbares Transposon-Markierungssystem das, das in dem U.S. Patent Nr. 5,013,658 veröffentlicht wurde.
Ein alternatives Verfahren verwendet Oligonukleotidsonden zur Identifizierung des gewünschten Gens in einer cDNA- oder genomischen DNA-Bibliothek. Zum Aufbau genomischer Bibliotheken werden große Segmente genomischer DNA durch Zufallsfragmentierung, zum Beispiel unter Verwendung von Restriktionsendonukleasen, erzeugt und mit der Vektor-DNA unter Bildung von Concatemeren, die in den geeigneten Vektor verpackt werden können, ligiert. Zur Herstellung einer cDNA-Bibliothek wird mRNA aus dem gewünschten Organ, wie zum Beispiel ein Samen, isoliert und eine cDNA-Bibliothek, die das FAE1-Gentranskript enthält, wird aus der mRNA hergestellt. Alternativ dazu kann cDNA aus mRNA hergestellt werden, die aus anderen Gewebearten (Organen) extrahiert wurde, in denen FAE1-Gene oder Homologe exprimiert werden, wie zum Beispiel Samen, Früchte, Stiele und Wurzeln.
Dann kann die cDNA- oder genomische Bibliothek unter Verwendung einer Sonde, die auf der Sequenz eines klonierten FAE1-Gens basiert, wie zum Beispiel das in SEQ ID Nr: 1 gezeigte, gescreent werden. Die Sonden können zur Hybridisierung mit genomischen DNA- oder cDNA-Sequenzen verwendet werden, um homologe Gene in gleichen oder unterschiedlichen Pflanzenspezies zu isolieren. Die Verwendung derartiger Hybridisierungstechniken zur Identifizierung homologer Gene ist aus dem Stand der Technik gut bekannt und muss nicht weiter beschrieben werden.
Alternativ dazu können Polynukleotide durch gut bekannte Techniken, wie sie in der technischen Literatur beschrieben sind, synthetisiert werden. Siehe zum Beispiel Carruthers et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47: 411–418 (1982) und Adams et al., J. Am. Chem. Soc. 105: 661 (1983). Doppelsträngige DNA-Fragmente können dann entweder durch Synthetisieren des komplementären Strangs und Annealing der Stränge aneinander unter geeigneten Bedingungen, oder durch Addieren des komplementären Strangs unter Verwendung von DNA-Polymerase mit einer geeigneten Primersequenz erhalten werden.
Die isolierten Sequenzen, die entsprechend der Beschreibung hier hergestellt wurden, können in einer Anzahl von Techniken zur Unterdrückung der endogenen FAE1-Genexpression (das heißt, zur Hemmung der Verlängerung von C18-FAs zu C20 und C22) verwendet werden. Zum Beispiel kann die Antisense-Technologie praktischerweise zur Hemmung der FAE1-Genexpression verwendet werden. Um dies zu erreichen, wird ein Nukleinsäuresegment aus dem gewünschten Gen kloniert und so mit einem Promotor funktionsfähig verknüpft, dass der Antisense-Strang der RNA transkribiert wird. Dann wird das Konstrukt in Pflanzen transformiert und es wird der Antisense-Strang der RNA hergestellt. Es wurde vorgeschlagen, dass in Pflanzenzellen diese Antisense-RNA die Genexpression hemmt, indem sie die Akkumulation von mRNA, die das interessierende Enzym kodiert, verhindert. Siehe zum Beispiel Sheeny et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85: 8805–8809 (1988) und Hiatt et al., U.S. Patent Nr. 4,801,340.
Das einzuführende Nukleinsäuresegment wird im Allgemeinen im Wesentlichen zu mindestens einem Teil des endogenen FAE1-Gens oder Genen, die unterdrückt werden sollen, identisch sein. Die Sequenz muss jedoch nicht vollkommen identisch sein, um die Expression zu hemmen. Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können so entworfen werden, dass die Hemmwirkung auf andere Proteine innerhalb einer Familie von Genen zutrifft, die eine Homologie oder im Wesentlichen eine Homologie mit dem Zielgen aufweisen. Zum Beispiel kann die Unterdrückung des in SEQ ID Nr: 1 gezeigten FAE1-Gens dazu dienen, dieselbe unterdrückende Wirkung anderen FAE1-Genen mit ausreichender Identität aufzuzwingen. Entsprechend können Segmente aus FAE1-Genen von Arabidopsis zur Hemmung der Expression homologer Gene in verwandten Pflanzenspezies, wie zum Beispiel ein Mitglied der Gattung Brassica, oder als ein Mittel verwendet werden, um die entsprechenden Sequenzen, die zum Unterdrücken des endogenen Brassica-Gens zu verwenden sind, zu erhalten.
Für die Antisense-Unterdrückung muss die eingeführte Sequenz ebenfalls nicht die vollständige Länge bezüglich entweder des primären Transkriptionsprodukts oder der vollständig verarbeiteten mRNA aufweisen. Im Allgemeinen kann eine höhere Homologie verwendet werden, um die Verwendung einer kürzeren Sequenz zu kompensieren. Weiterhin muss die eingeführte Sequenz nicht dasselbe Intron- oder Exonmuster aufweisen und die Homologie der nicht kodierenden Segmente kann gleich wirksam sein. Normalerweise sollte eine Sequenz, die zwischen ungefähr 30 oder 40 Nukleotiden und ungefähr 2000 Nukleotiden aufweist, verwendet werden, obwohl eine Sequenz von mindestens ungefähr 100 Nukleotiden bevorzugt ist, eine Sequenz von mindestens ungefähr 200 Nukleotiden bevorzugter ist und eine Sequenz von mindestens ungefähr 500 Nukleotiden besonders bevorzugt ist.
Katalytische RNA-Moleküle oder Ribozyme können ebenfalls zur Hemmung der Expression von FAE1-Genen verwendet werden. Es ist möglich, Ribozyme zu entwerfen, die sich so gut wie mit jeder Ziel-RNA paaren und das Phosphodiester-Grundgerüst an einer spezifischen Stelle spalten, wodurch die Ziel-RNA funktional inaktiviert wird. Bei der Ausführung dieser Spaltung wird das Ribozym selbst nicht verändert und es ist daher zum Recycling und Spaltung anderer Moleküle in der Lage, was es zu einem richtigen Enzym macht. Der Einschluß von Ribozymsequenzen innerhalb von Antisense-RNAs verleiht diesen eine RNA-Spaltungsaktivität, wodurch die Aktivität der Konstrukte erhöht wird.
Eine Zahl von Klassen von Ribozymen ist identifiziert worden. Eine Klasse von Ribozymen wird aus einer Zahl kleiner zirkulärer RNAs abgeleitet, die zur Selbstspaltung und Replikation in Pflanzen in der Lage sind. Die RNAs replizieren entweder alleine (Viroid-RNAs) oder mit einem Helfervirus (Satelliten-RNAs). Beispiele umfassen RNAs aus dem Avocadosunblotch Viroid und die Satelliten-RNAs aus dem Tabakringfleckvirus, dem vorübergehendes Streifenvirus bei Luzerne, dem Samttabakmosaikvirus, dem Solanum nodiflorum-Mosaikvirus und dem unterirdischen Kleemosaikvirus. Der Entwurf und die Verwendung von Ziel-RNA-spezifischen Ribozymen wird bei Haseloff et al. Nature, 334: 585–591 (1988) beschrieben.
Ein weiteres Unterdrückungsverfahren ist die Sense-Unterdrückung. Kürzlich wurde gezeigt, dass die Einführung einer Nukleinsäure, die in Sense-Orientierung angeordnet ist, ein wirksames Mittel ist, durch das die Transkription von Zielgenen blockiert werden kann. Für ein Beispiel zur Verwendung dieses Verfahrens zur Modulation der Expression endogener Gene siehe Napoli et al., The Plant Cell 2: 279–289 (1990) und die U.S. Patente mit den Nummern 5,034,323, 5,231,020 und 5,283,184.
Im Allgemeinen tritt dort, wo die Hemmung der Expression erwünscht ist, in geringem Ausmaß eine Transkription der eingeführten Sequenz auf. Diese Wirkung kann dort auftreten, wo die eingeführte Sequenz keine kodierende Sequenz per se enthält, sondern nur Intron- oder nicht translatierte Sequenzen, die zu Sequenzen homolog sind, die in dem primären Transkript der endogenen Sequenz vorhanden sind. Die eingeführte Sequenz wird im Allgemeinen zu der endogenen Sequenz, deren Unterdrückung beabsichtigt ist, im Wesentlichen identisch sein. Diese minimale Identität wird typischerweise mehr als ungefähr 65% betragen, jedoch könnte eine höhere Identität eine wirksamere Unterdrückung der Expression der endogenen Sequenzen zeigen. Eine im Wesentlichen größere Identität von mehr als ungefähr 80% ist bevorzugt, obwohl eine Identität von ungefähr 95% bis völlige Identität besonders bevorzugt wäre. Wie bei der Antisense-Regulation sollte die Wirkung auf alle anderen Proteine innerhalb einer ähnlichen Familie von Genen zutreffen, die eine Homologie oder eine wesentliche Homologie aufweisen.
Für die Sense-Unerdrückung muss die eingeführte Sequenz, die weniger als eine vollständige Identität benötigt, nicht von voller Länge bezüglich entweder des primären Transkriptionsprodukts oder der vollständig verarbeiteten mRNA sein. Dies kann bevorzugt sein, um die gleichzeitige Herstellung einiger Pflanzen, die überexprimierende Pflanzen sind, zu vermeiden. Eine höhere Identität in einer Sequenz, die weniger als die volle Länge aufweist, kompensiert eine längere, weniger identische Sequenz. Weiterhin muss die eingeführte Sequenz nicht dasselbe Intron- oder Exonmuster aufweisen und die Identität nicht kodierender Segmente wird gleich wirksam sein. Normalerweise wird eine Sequenz, die in den vorstehend angemerkten Größenbereichen liegt, für die Antisense-Regulation verwendet.
Isolierte Sequenzen, die wie hier beschrieben ist hergestellt werden, können ebenfalls zur Einführung der FAE1-Expression oder zur Steigerung oder Erhöhung der endogenen FAE1-Genexpression (das heißt, zur Erhöhung der Herstellung von VLCFAs) verwendet werden. Wird eine Überexpression des FAE1-Gens erwünscht, kann ein FAE1-Gen aus einer unterschiedlichen Spezies verwendet werden, um mögliche Sense-Unterdrückungswirkungen zu verringern. Zum Beispiel kann das FAE1-Gen von Arabidopsis zur Erhöhung der Expression in Brassica verwendet werden.
Der Fachmann erkennt, dass die Polypeptide, die die FAE1-Gene kodieren, wie andere Proteine unterschiedliche Domänen aufweisen, die unterschiedliche Funktionen erfüllen. Daher müssen die FAE1-Gensequenzen nicht von vollständiger Länge sein, so lange die gewünschte funktionale Domäne des Proteins exprimiert wird. Unter Verwendung verschiedener rekombinanter DNA-Techniken, die dem Fachmann gut bekannt sind und nachstehend ausführlich beschrieben sind, können ebenfalls leicht modifizierte Proteinketten entworfen werden. Zum Beispiel können die Ketten ausgehend von der natürlich vorkommenden Sequenz auf dem Primärstrukturniveau durch Aminosäuresubstitutionen, Additionen, Deletionen und dergleichen variieren. Diese Modifikationen können in einer Zahl von Kombinationen zur Herstellung der endgültig modifizierten Proteinkette verwendet werden.
Zur Verwendung isolierter FAE1-Sequenzen in den vorstehenden Techniken werden rekombinante DNA-Vektoren, die zur Transformation von Pflanzenzellen geeignet sind, hergestellt. Techniken zur Transformation einer großen Vielzahl höherer Pflanzenspezies sind gut bekannt und sind in der technischen und wissenschaftlichen Literatur beschrieben. Siehe zum Beispiel Weising et al. Ann. Rev. Genet. 22: 421–477 (1988). Eine DNA-Sequenz, die das gewünschte FAE1-Polypeptid kodiert, beispielsweise eine cDNA-Sequenz, die ein Protein mit vollständiger Länge kodiert, wird vorzugsweise mit Transkriptions- und Translationsinitiierungsregulationssequenzen kombiniert, die die Transkription der Sequenz aus dem FAE1-Gen in den beabsichtigten Geweben der transformierten Pflanze lenken.
Zum Beispiel kann für eine Überexprimierung ein Pflanzenpromotorfragment verwendet werden, das die Expression von FAE1 in allen Geweben einer regenerierten Pflanze lenkt. Derartige Promotoren werden hierein als „konstitutive" Promotoren bezeichnet und sind unter den meisten Umgebungsbedingungen und Entwicklungszuständen oder bei der Zelldifferenzierung aktiv. Beispiele für konstitutive Promotoren umfassen die Transkriptionsinitiierungsregion des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) 35S, den 1'- oder 2'-Promoter, der von der T-DNA von Agrobacterium tumafaciens abgeleitet ist, und andere Transkriptionsinitiierungsregionen von verschiedenen Pflanzengenen, die dem Fachmann bekannt sind.
Alternativ dazu kann der Pflanzenpromotor die Expression des FAE1-Gens in einem spezifischen Gewebe lenken oder anderweitig unter präziserer Kontrolle der Umgebung oder Entwicklung sein. Derartige Promotoren werden hier als „induzierbare" Promotoren bezeichnet. Beispiele für Umgebungsbedingungen, die die Transkription durch induzierbare Promotoren bewirken können, umfassen anaerobe Bedingungen, erhöhte Temperatur oder das Vorhandensein von Licht.
Beispiele für Promotoren unter Entwicklungskontrolle umfassen Promotoren, die die Transkription nur in bestimmten Geweben initiieren, wie zum Beispiel eine Frucht, Samen oder Blüten. Zum Beispiel kann die Verwendung eines Albumin-Napinpromotors von Brassica napus (Lee et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6181–6185 (1991)) oder des Promotors aus dem FAE1-Gen von Arabidopsis die Expression des FAE1-Polypeptids im Samen lenken.
Ist eine geeignete Polypeptidexpression erwünscht, sollte eine Polyadenylierungsregion am 3'-Ende der kodierenden Region von FAE1 eingefügt werden. Die Polyadenylierungsregion kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus einer T-DNA stammen.
Der Vektor, der die Sequenzen aus einem FAE1-Gen umfasst, wird typischerweise ein Marker-Gen umfassen, das Pflanzenzellen einen auswählbaren Phänotyp verleiht. Zum Beispiel kann der Marker eine Biozidresistenz kodieren, insbesondere eine Antibiotikumresistenz, wie zum Beispiel eine Resistenz gegen Kanamycin, G418, Bleomycin, Hygromycin oder eine Herbizidresistenz, wie zum Beispiel eine Resistenz gegen Chlorsulforon oder Basta.
Derartige DNA-Konstrukte können in das Genom des gewünschten Pflanzenwirts durch eine Vielzahl herkömmlicher Techniken eingeführt werden. Zum Beispiel kann das DNA-Konstrukt direkt in die genomische DNA der Pflanzenzelle unter Verwendung von Techniken, wie zum Beispiel Elektroporation und Mikroinjektion von Pflanzenzellprotoplasten, eingeführt werden, oder die DNA-Konstrukte können direkt in das Pflanzengewebe unter Verwendung ballistischer Verfahren, wie zum Beispiel DNA-Teilchenbeschuß eingeführt werden. Alternativ dazu können die DNA-Konstrukte mit geeigneten, die T-DNA flankierenden Regionen kombiniert und in einen herkömmlichen Vektor des Wirts Agrobacterium tumefaciens eingeführt werden. Die Virulenzfunktionen des Wirts Agrobacterium tumefaciens werden die Insertion des Konstrukts und des benachbarten Markers in die DNA der Pflanzenzelle lenken, wenn die Zelle durch die Bakterien infiziert wird.
Mikroinjektionstechniken sind aus dem Stand der Technik bekannt und gut in der wissenschaftlichen Literatur und in der Patentliteratur beschrieben. Die Einführung von DNA-Konstrukten unter Verwendung von Polyethylenglycolfällung wird bei Paszkowski et al. Embo J. 3: 2717–2722 (1984) beschrieben. Elektroporationstechniken sind bei Fromm et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824 (1985) beschrieben. Ballistische Transformationstechniken sind bei Klein et al. Nature 327: 70–73 (1987) beschrieben.
Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformationstechniken, einschließlich der Entschärfung und Verwendung binärer Vektoren sind gut in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben. Siehe zum Beispiel Horsch et al. Science 233: 496–498 (1984) und Fraley et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803 (1983).
Transformierte Pflanzenzellen, die durch jede der vorstehenden Transformationstechniken abgeleitet wurden, können zur Regeneration einer ganzen Pflanze, die den transformierten Genotyp und somit den gewünschten FAE1-kontrollierten Phänotyp besitzt, kultiviert werden. Derartige Regenerationstechniken sind auf die Manipulation bestimmter Phytohormone in einem Gewebekulturwachstumsmedium angewiesen, wobei sie typischerweise auf einem Biozid- und/oder Herbizidmarker beruhen, der zusammen mit den FAE1-Nukleotidsequenzen eingeführt worden ist. Die Pflanzenregeneration aus kultivierten Protoplasten wird bei Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, Seiten 124–176, Mac-Millilan Publishing Company, New York, 1983; und Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, Seiten 21–73, CRC Press, Boca Raton, 1985, beschrieben. Eine Regeneration kann ebenfalls aus dem Pflanzenkallus, -explantaten, -organen oder Teilen davon erhalten werden. Derartige Regenerationstechniken sind allgemein bei Klee et al. Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467–486 (1987) beschrieben.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind insbesondere für den Einbau der FAE1-Gene in transformierte Pflanzen auf Wegen und unter Umständen verwendbar, die natürlicherweise nicht vorgefunden werden. Insbesondere können die FAE1-Polypeptide zu Zeiten oder in Mengen exprimiert werden, die für natürliche Pflanzen nicht charakteristisch sind.
Der Fachmann wird erkennen, dass, nachdem die Expressionskassette stabil in transgene Pflanzen eingebracht und ihre Funktionsfähigkeit bestätigt worden ist, sie in andere Pflanzen durch geschlechtliche Kreuzung eingebracht werden kann. Jede einzelne aus einer Zahl von Standardzuchttechniken kann in Abhängigkeit von der zu kreuzenden Spezies verwendet werden.
Die Wirkung der Modifikation der FAE1-Genexpression wird praktischerweise durch Analyse des FA-Gehalts von Pflanzenmaterial aus der gewünschten Pflanze nachgewiesen. In Kürze, Lipide werden aus dem Pflanzenmaterial (zum Beispiel Samen) extrahiert, FAs werden aus dem Triacylglycerin gespalten und durch Gaschromatographie analysiert, wie zum Beispiel in James und Dooner Theor. Appl. Genet. 80: 241–245 (1990) beschrieben ist. Zusätzlich kann die Antisense- oder Sense-Unterdrückung des endogenen Gens durch eine Verringerung von mRNA-Gehalten, entsprechend der Messung durch beispielsweise Northern-Blots, nachgewiesen werden.
Die Pflanzenunterdrücker der Erfindung weisen niedrigere Erucasäuregehalte von weniger als ungefähr 2% (bezüglich des gesamten FA-Gehalts im Samen), vorzugsweise weniger als ungefähr 1%, bevorzugter weniger als ungefähr 0,5% und besonders bevorzugt weniger als ungefähr 0,1% auf. Überexprimierende Pflanzen der Erfindung weisen Erucasäuregehalte auf, die wesentliche höher als die der entsprechenden nicht transformierten Pflanze sind, zum Beispiel mindestens 10% höher, vorzugsweise mindestens 20% höher, bevorzugter mindestens 30% höher und besonders bevorzugt mindestens 40% oder 50% höher. Bevorzugte resultierende Gehalte an Erucasäure in überexprimierenden Brassica Pflanzen gemäß der Erfin dung betragen mindestens ungefähr 40% (bezüglich des gesamten FA-Gehalts im Samen), vorzugsweise mindestens ungefähr 50% und bevorzugter mindestens ungefähr 60%. Mit anderen Öl-produzierenden Pflanzen können sogar höhere Gehalte erhalten werden, zum Beispiel von mindestens ungefähr 70%, 80% oder 90% zur Erhöhung der Präferenz. Die Erucasäure kann aus den überexprimierenden Pflanzen der Erfindung unter Verwendung bekannter Verfahren extrahiert werden. Siehe Salunkhe und Desai (1986), s. o.
Die folgenden Beispiele sind erläuternd und nicht einschränkend dargelegt.
Beispiel 1
Isolierung und Sequenzierung des FAE1-Gens aus Arabidopsis
Die zur Isolierung der Fa-Biosynthesegene aus Arabidopsis verwendete Strategie wird in 1 erläutert. In der vorliegenden Arbeit wird die Transposon-Markierung mit dem autonomen Mais-Element AC durchgeführt.
A. Erzeugung der Mutante und Ac-Transformation
1. Bildung der Mutante
Eine Sammlung von Mutanten wurde induziert und charakterisiert, um die Genorte genetisch zu definieren, die die FA-Zusammensetzung in Arabidopsis-Samen (erhältlich von dem Arabidopsis Biological Resource Center at Ohio State University) beeinflussen, wie es von James und Dooner (1990), s. o., beschrieben wurde.
2. Ac-Transformation
68 unabhängige Einzel-Locus-Arabidopsis-Transformanten, die Ac in der T-DNA trugen, wurden unter Verwendung der Verfahren von Keller et al., Genetics, 131: 44–459 (1992) erzeugt. Diese Zahl sorgt mit einer Sicherheit von 95% dafür, dass jedes Gen in dem Arabidopsis-Genom nicht weiter als 15 cM von einem eingeführten Ac entfernt ist, wobei eine Zufallsintegration der T-DNA in dem Genom und eine genetische Karte < 600 M angenommen wird (Koorneeff et al., in Genetic Maps, S. J. O'Brien Herausg. (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor (1992)). In Arabidopsis sowie in Mais und anderen Organismen transponieren Transposonen der Ac/Ds-Familie vorzugsweise an Stellen, die mit der Donorstelle verbunden sind (Keller et al., Theor. Appl. Genet. 86: 585–588 (1993)). Zur Markierung eines spezifischen Gens ist daher die Initiierung des Markierungsexperiments mit einem Ac- (oder Ds-) Element, das mit dem interessierenden Gen verknüpft ist, zu bevorzugen. Diese Methode, die als ortsspezifisches Markieren bezeichnet wird, erfordert das Kartieren der T-DNA bezüglich der Zielorte. Eine Bewertung hinsichtlich des Vorhandenseins oder der Abwesenheit der T-DNA wurde durch den Hyg-R- (Hygromycinresistenz) Transformationsmarker erleichtert. Die Zahl von Pflanzen mit transponiertem Ac- (trAc) Elementen, die zur Isolierung einer spezifischen FA-Mutation erforderlich ist, wurde daher im Vergleich zu derjenigen, die für eine Zufallstransposon-Markierungsmethode erforderlich ist, stark verringert.
3. T-DNA-Lokalisierung (Kartierung)
Von vierundzwanzig T-DNAs, die auf eines der fünf Arabidopsis-Chromosomen lokalisiert wurden, waren drei mit FAE1 verknüpft. In den Transformanten K805, B116 und C231 waren die T-DNAs entsprechend 15, 22 und 40 cM von FAE1 gelegen. FAE1 ist lose mit dem RFLP-Marker 518 verbunden, den Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6856–6860 (1988) auf das Chromosom 4. kartierte. Die Verknüpfung der B116 T-DNA mit dem Marker 518 wurde durch ein Massensegregantanalyseverfahren (Michelmore et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9828–9832 (1991)) bestätigt, bei dem gepaarte DNA-Proben, die von vereinigten homozygoten Hyg-R/Hyg-R– und +/+-Segreganten aus einer Hyg-RI+ (WS × Columbia) Heterozygoten erhalten wurden, bezüglich einer Segregation von RFLPs bewertet wurden. Eine chromosomale Stelle wurde 24 Einzel-Genorten zugeordnet. Ac-enthaltende T-DNA-Einschübe durch die Kombination von Zweipunktkreuzungen und Massensegregantanalysen.
4. Herstellung von T-DNA
In dem für die Herleitung der transgenen Linie B116 verwendeten pJJ4404-Konstrukt liegt Ac in der 5'-untranslatierten Region des SPT- (Streptomycin-Phosphotransferase) Gens (Jones et al., Science 244: 204–207 (1989); Keller et al., Plant Mol. Biol. 21: 157–170 (1993)). Somatische Ausschnitte von Ac während der Entwicklung der Keimblätter können als grüne Sektoren auf einem weißen Hintergrund in Arabidopsis-Keimlingen, die in Streptomycin keimten, nachgewiesen werden. Keimexzisionen von Ac führen zu SPT'-vollständigen grünen Keimlingen, von denen ungefähr die Hälfte ein trAc-Element irgendwo in dem Genom tragen (Dean et al., The Plant Journal 2: 69–81 (1992)); Keller et al., Genetics 131: 449–459 (1992)). Daher stellt SPT::Ac einen wirksamen Marker zur Auswahl von Pflanzen dar, die einer Transposition unterzogen wurden.
Keimselektionen, die aus einer Pflanze rückgewonnen wurden, können von einem gemeinsamen prämeiotischen Ereignis abgeleitet werden und tragen dasselbe transponierte Element. Zur Vermeidung einer ausgedehnten Probennahme von Duplikaten für dasselbe Transpositionsereignis wurden im Allgemeinen nicht mehr als vier grüne Keimlingsselektionen von jeder Pflanze in das Gewächshaus überführt.
B. Identifikation einer neuen fae1-Mutation
1. Isolierung und Charakterisierung von Keimselektionen
Grüne SPT'-Keimlinge wurde auf Streptomycin ausgewählt (Jones et al., (1989) s. o.), man ließ sie in dem Gewächshaus zur Reife wachsen und die FA-Zusammensetzung ihrer Samen wurde durch Gaschromatographie (GC), wie es früher beschrieben wurde (James und Dooner (1990), s. o.), analysiert. Da fae1 und mehrere andere Mutationen, die die Fa-Zusammensetzung im Samen beeinflussen, codominant sind (James und Dooner (1990); Lemieux et al., (1990) s. o.), können sie in dem heterozygoten Zustand identifiziert werden, was ein klarer Vorteil ist, wenn man sich mit einem schwierigen Phänotyp, wie zum Beispiel ein chromatographisches Profil, befasst. Die Selektionen wurden von Linien getroffen, bei denen Ac entweder mit FAE1 verknüpft oder nicht verknüpft war. Tabelle 1 gibt die Zahl der analysierten SPT'-Selektionen, die Zahl der Pflanzen, die sie herstellten, und den Ort von Ac bezüglich FAE1 in jeder Linie an. Ebenfalls sind Schätzungen der minimalen und maximalen Zahl an gescreenten unabhängigen Ac-Reinsertionen, unter der Annahme einer Ac-Reinsertionsfrequenz von 50% (Keller et al. (1992), s. o.), angegeben. Die minimale Zahl, das heißt, die gescreente Zahl, wenn alle grünen Geschwister aus demselben Transpositionsereignis stammen, entspricht der Hälfte der Zahl der Elternpflanzen, die die grünen Keimlinge produzierten. Die maximale Zahl, das heißt, die gescreente Anzahl, wenn alle Geschwister, die aus unabhängigen Transpositionereignissen resultierten, entspricht der Hälfte der Zahl an analysierten Selektionen. Die tatsächliche Zahl untersuchter unabhängiger Ac-Reinsertionen liegt irgendwo zwischen den zwei Werten, da sowohl klonale als auch Einzel-Ac-Transpositionsereignisse aus derselben Pflanze rückgewonnen werden können (Keller et al. 1992).
2. Identifikation von Fae1-G309
Eine Gesamtzahl von 721 SPT'-Selektionen aus B116 wurde analysiert. Pflanzen der B116-Linie produzierten durchschnittlich > 1% grüne Selektionen je Pflanze, jedoch variierten die Prozentsätze stark von Pflanze zu Pflanze. Eine Selektion, G309, produzierte einen Samen mit dem verringerten Gehalt von 20:1, der typisch für eine FAE1/fae1-Heterozygote ist. Nach der Selbstung wies ein viertel ihrer Abkömmlinge eine extremere Fa-Zusammensetzung im Samen auf, die von der der EMS-induzierten Mutante fae1-2 ununterscheidbar war (bezeichnet als 9A1 in James und Dooner, 1990). Die neue Mutation wurde bezüglich ihrer Allellität mit fae1-2 getestet. Da den Mutanten eine Komplementierung misslang wurde der neuen Mutante vorläufig die Bezeichnung fae1-G309 zugeordnet. Die FA-Zusammensetzungen von fae1-G309 homozygoten, heterozygoten und Wildtyp-Samen sind in Tabelle 2A dargestellt: diejenige der fae1-2 und fae1-2/fae1-G309 Samen in Tabelle 2B.
C. Beweis, dass die neue fae1-Mutation durch Ac markiert wird
1. Cosegregation des fae-mutierten Phänotyps mit einer Ac-hybridisierenden Bande
Eine DNA-Analyse des fae1-G309-Derivats zeigte das Vorhandensein einer neuen Ac-hybridisierenden Bande. Eine DNA-Extraktion und eine DNA-Blot-Analyse wurden durchgeführt, wie es früher beschrieben wurde (Keller et al. (1992), s. o.). Die gekoppelte Segregation dieser neuen Ac-Bande mit der fae1-Mutation wurde in dem Selbstabkömmling einer fae1-G309/Fae1-Heterozygoten getestet. Die segregierenden Individuen wurden als Fae1/Fae1, Fae1/fae1 oder fae1/fae1 durch GC-Analyse ihrer Samen-Fa-Zusammensetzung und als Acl(–) oder +/+ durch DNA-Gelblot-Analyse eingestuft. Somit konnten sechs Genotypklassen unterschieden werden. Die DNA aus 54 Individuen wurden mit HindIII verdaut und mit einer Sonde von dem 5'-Ende von Ac (Kunze et al., EMBO J. 6: 1555–1563 (1987) hybridisiert. Die Ergebnisse dieser Hybridisierungen zeigten zwei Ac-hybridisierende Banden, die sich in dem Abkömmling trennten, eine 3,3-kb und eine 2,4-kb Bande. Die erstere stellt neu transponiertes Ac (trAc) und die letztere das Ac dar, das an der Stelle von SPT::Ac in der T-DNA liegt (der eigenbefruchtete Vorgänger war die ursprüngliche G309-Grünselektion, SPT'/SPT::Ac).
Die Ergebnisse der Cosegregationsanalyse sind in Tabelle 3A dargestellt. Alle die Individuen, die das neue trAc tragen, waren entweder homozygot oder heterozygot bezüglich der neuen fae1-Mutation. Umgekehrt waren alle Individuen, denen das trAc fehlte, vom Wildtyp. Daher wurden keine Rekombinanten rückgewonnen (Bindung X² = 54, P < 0,001).
Die DNA aus der Region, die das 5'-Ende von trAc in der fae1-m1(Ac)-Mutanten flankierte, wurde zum Klonieren durch inverse PCR erzeugt (Ochman et al., Genetics 120: 621–623 (1988)). Die DNA wurde aus dem Abkömmling von fae1-G309 erhalten, der das 3,3-kb Ac-hybridisierende HindIII-Fragment enthielt, das mit dem fae1-Phänotyp cosegregierte, dem jedoch die kleinere 2,4-kb Ac-hybridisierende Bande fehlte. Näherungsweise 0,5 μg genomischer DNA wurden mit HindIII verdaut und über Nacht bei 16°C unter verdünnten Bedingungen (200 μl Reaktionsvolumen) li giert, um den Ringschluss der HindIII-Fragmente zu begünstigen. Der Primer FL125, der ausgehend von dem 5'-Ende von Ac nach außen orientiert war (CGGTTATACGATAACGGTCG), und JK30, gerade 5' von der ersten HindIII-Stelle in Ac (GTACGATGAAGTGGTTAGCC), wurden zur Amplifikation von 1,5-kb der genomischen DNA, die das 5'-Ende von trAc flankierte, verwendet.
Diese flankierende DNA wurde zur Rehybridisierung derselben DNA-Gelblots verwendet. Wie erwartet, wies die neue Sonde dasselbe 3,3-kb Ac-homologe Fragment nach und zusätzlich ein neues Fragment mit ungefähr 1,8 kb. Falls Ac tatsächlich das markierte FAE1-Gen aufwies, sollten alle segregierenden fae1-mutierten Pflanzen bezüglich der 3,3-kb Bande homozygot, alle Fae1/fae1-Pflanzen sollten bezüglich der 3,3-kb Bande und der 1,8-kb Bande heterozygot und alle Pflanzen vom Wildtyp sollten bezüglich der 1,8 kb-Bande homozygot sein. Die Ergebnisse der Analyse sind in Tabelle 3B dargestellt. 53 von 54 Segreganten erfüllen die Erwartung. Die eine Ausnahme (Segregant #5) war heterozygot bezüglich der 3,3-kb trAc-Bande. Für diese Ausnahme gibt es zwei plausible Erklärungen. (1) Die neue fae-Mutation wird nicht durch trAc markiert, ist jedoch eng damit verknüpft, und dieses Individuum ist eine Rekombinante zwischen der fae1-Mutation und trAc. (2) Die neue fae1-Mutante wird durch trAc markiert und dieses Individuum ist das Produkt einer Ac-Exzision, die die Genfunktion nicht wiederherstellte. Der Segregant #5 wies ebenfalls eine neue Ac-hybridisierende Bande auf, die in den anderen 53 Geschwistern abwesend war (Daten sind nicht gezeigt), wobei die Beobachtung darauf hinweist, dass sie auf die Sekundärtransposition von Ac zurückgeht.
2. Rückmutation der fae1-Mutante
Zur Bestätigung, dass die fae1-G309-Mutation durch Ac markiert wurde, wurden Abkömmlinge mutierter Pflanzen bezüglich mutmaßlicher Rückmutanten gescreent, das heißt, Individuen mit einer dazwischen liegenden Samen-FA-Zusammensetzung, die dann bezüglich eines Ausschneidens von Ac aus der klonierten DNA untersucht werden konnten. Insgesamt wurden 1052 Abkömmlinge von vier fae1-G309-Pflanzen gescreent und drei mutmaßliche Rückmutanten wurden auf der Basis einer dazwischenliegenden Samen-FA-Zusammensetzung, die für Fae1/fae1-Heterozygoten (12–15% 20:1) typisch ist, identifiziert. Unter Verwendung der DNA-Gelblotanalyse wurde von allen drei Ausnahmen festgestellt, dass sie bezüglich der 3,3-kb Bande in dem ursprünglichen mutierten Allel und einer 1,8 kb Bande von der Größe eines Wildtyps heterozygot waren. Dies ist das erwartete Ergebnis, wenn diese Individuen aus den Ac-Exzisionsereignissen stammen, die die Genfunktion wiederherstellten.
Die DNA um die trAc-Einschubstelle in dem Wildtyp-Vorläuferallel, die fae1-G309-Mutante und die drei mutmaßliche Rückmutanten wurden durch das von Saiki (1990) beschriebene Polymerasekettenreaktionsverfahren amplifiziert und sequenziert. Die DNA wurde entweder mit dem Sequenase-Kit (U.S. Biochemical) oder dem Fmol-Kit (Promega), den Empfehlungen der Hersteller folgend, sequenziert. Ein Vergleich der Sequenzen ist in 2 dargestellt.
Im Allgemeinen bleibt bei der Exzision von Ac ein 8 bp „Fußabdruck" mit einer gelegentlichen Deletion oder Addition von Basen zur Wiederherstellung der Leserahmennummer (ein Mehrfaches von drei) zurück. Jedoch waren etwas unerwartet die DNA-Sequenzen der drei mutmaßlichen Rückmutanten zu denen des Wildtypvorläufers identisch. Die Sequenz des mutmaßlichen FAE1-Proteins um die Einschubstelle von Ac herum kann gegenüber Aminosäureänderungen intolerant sein, so dass nur die seltenen Ereignisse, die nicht nur den richtigen Leserahmen sondern auch die ursprüngliche Sequenz wiederherstellen, als Rückmutanten ausgewählt werden. In diesem Fall würde Segregant #5, die Ausnahme aus der Cosegregationsanalyse (Tabelle 3B) ein Ac-Exzisionsereignis darstellen, das die ursprüngliche Aminosäuresequenz nicht wiederherstellte und folglich bei der Wiederherstellung der Genfunktion versagte. Die DNA-Sequenz von Segregant #5 (2) offenbarte einen 8 bp Fußabdruck an der Ac-Exzisionsstelle, was darauf hinweist, dass diese Ausnahme von einer Ac-Exzision stammt, die eine Rahmenverschiebungsmutation erzeugte und die Genfunktion herauswarf.
Somit bestätigen die Analyse der Rückmutanten und die eine Null-Ausnahme in dem Cosegregationstest, dass die fae1-G309-Mutante durch den Einschub von Ac in das FAE1-Gen entstand, dass sie instabil ist und dass sie die Entstehung neuer Allele an dem FAE1-Locus bewirken kann. Somit wurde ihr die offizielle Bezeichnung fae1-m1(Ac) gegeben, um anzuzeigen, dass sie das erste mutable Allel des isolierten FAE1-Locus ist und dass sie durch Einschub des Transposons Ac entstand.
D. Funktion des FAE1-Gens in Arabidopsis
1. Expression von FAE1 bei der Entwicklung eines Samens
DA VCLFAs sich in Samen anhäufen jedoch nicht in den Blättern von Arabidopsis (Lemieux et al. (1990), s. o.) sollte FAE1 vorzugsweise in Samen exprimiert werden. Die Expression des FAE1-Gens wurde durch Gelblot-Analyse der RNA aus mehreren Geweben: Blatt, unreifen Samen und unreifen Schoten zuzüglich Samen (Pools von ~1 Woche und von 2–3 Wochen alten Schoten) untersucht. Die RNA wurde aus verschiedenen Arabidopsis-Geweben (sich entwickelnde Schoten, Blättern und unreife Samen) durch das Phenol-SDS-Verfahren, beschrieben in Napoli et al., The Plant Cell 2: 279–289 (1990) isoliert, durch Formaldehyd-Agarosegelelektrophrese getrennt und auf Duralon-UV-Membranen (Stratagene) geblottet. Es wurde festgestellt, dass die FAE1-Transkripte sich in Schoten, die sich entwickelnde Samen enthalten, und in Samen, sich jedoch nicht in Blättern anhäufen.
2. Isolierung und Sequenzierung eines FAE1-cDNA-Klons
Das 1,5 kb FAE1-IPCR-Fragment wurde als Sonde zur Isolierung von 2 lambda Klonen aus einer genomischen Bibliothek einer DNA aus Arabidopsis, Ecotyp Ws, die teilweise mit Sau 3A verdaut war, verwendet und in lambda-DASH (Stratagene) unter Verwendung der von dem Hersteller empfohlenen Verfahren ligiert. Das FAE1-Gen wurde in den lambda-Klonen durch Restriktionsanalyse und durch Verwendung von subklonierten Regionen als Sonden gegen Schoten-RNA lokalisiert.
Poly(a)RNA wurde aus 1 g 2–3 Wochen alten grünen Schoten unter Verwendung eines Poly ATract System 1000 Kits (Promega), den Anweisungen des Herstellers folgend, isoliert. Eine unreife Schoten-cDNA-Bibliothek wurde aus PolyA-RNA unter Verwendung des lambda-Zap cDNA Synthesekits (Stratagene), den von dem Hersteller zur Verfügung gestellten Anweisungen folgend, hergestellt. Ein 1,0 kb BglII- bis HindIII-Fragment aus dem 5'-Ende des FAE1-Gens und ein 700 bp BstXI- bis EcoRI-Fragment aus der Mitte des FAE1-Gens wurden als Sonden zum Screening dieser cDNA-Bibliothek verwendet. Ein cDNA-Klon, der einen 1,7-kb Einschub mit der ungefähren Größe des FAE1-Transkripts enthielt, wurde isoliert und sequenziert. Die DNA wurde entweder mit dem Sequenase-Kit (U.S. Biochemical) oder dem famol-Kit (Promega), den Empfehlungen der Hersteller folgend, sequenziert.
Die cDNA-Nukleotidsequenz wird in SEQ ID Nr: 1 zur Verfügung gestellt. Sie stimmt mit der Sequenz der genomischen DNA über deren Länge hinweg überein, was darauf hinweist, dass es in diesem Segment des FAE1-Gens keine Introns gibt. Die cDNA enthält einen langen offenen Leserahmen (ORF), scheint jedoch nicht genügend von der vollen Länge aufzuweisen. Falls das ATG, das sich in der entsprechenden FAE1-genomischen Sequenz 20 Nukleotide stromaufwärts von dem 5'-Ende der cDNA befindet, das Initiationscodon ist, kodiert der ausgedehnte offene Leserahmen ein Protein mit 506 Aminosäuren mit einer vorhergesagten Sequenz, wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigt ist. Ein Diagramm der Struktur der FAE1-genomischen Region, einschließlich des Ortes der cDNA und der Ac-Einschubstelle in fae1-m1(Ac) ist in 3 gezeigt.
Beispiel 2
Klonieren der FAE1-cDNA aus unreifen Embryonen von Brassica napus
Eine c-DNA-Bibliothek von Embryonen von B. napus (Var. Bridger) wurde in dem Vektor lambda Uni-Zap XR (Stratagene) aus 5 μg PolyA-RNA, den Anweisungen des Herstellers folgend, konstruiert. Die Bibliothek wurde bezüglich FAE1-Klonens folgendermaßen gescreent. Insgesamt wurden 120.000 Plaques in doppelter Ausfertigung unter entsprechender Verwendung der 3'- und 5'-Enden der FAE1-genomischen Fragmente aus Arabidopsis thaliana gescreent. Hybridisierung und Waschungen wurden bei 60°C durchgeführt. Die Waschlösung war 0,2 × SSC und 1% SDS. Aus dem Anfangsscreenen wurden insgesamt 14 potentielle FAE1-Klone, die entweder nur an die Sonde des 3'-Endes oder sowohl an die 3'- und 5'-Enden hybridisierten, für eine weitere Reinigung ausgewählt. Bei einem zweiten Screening ergaben vier der ursprünglichen 14 positive Signale bei beiden Sonden. Diese vier Klone wurden bis zur Homogenität gereinigt. Sie wurden als 3B, 4A, 11A und 12B bezeichnet.
Die cDNA-Fragmente aus den vier Klonen wurden aus dem lambda-Zap- (Stratagene) Vektor als Plasmide ausgeschnitten und DNA-Präparate wurden hergestellt. Sie wurden hinsichtlich der Restriktionsverdaue, PCR und teilweisen Sequenzierung charakterisiert. HindIII-Restriktionsverdaue der vier Klone und einer Arabidopsis-cDNA-Kontrolle zeigten, dass die vier Brassica-Klone sich von demjenigen von Arabidopsis unterschieden. Während der Arabidopsis-Klon zu zwei HIII-Fragmenten führte, ergaben drei der Brassica-Klone nur ein HIII-Fragment. Der Brassica-Klon 11A ergab zwei HIII-Fragmente, jedoch waren die Fragmentgrößen von denjenigen, die durch den Arabidopsis-FAE1-cDNA-Klon erzeugt wurden, verschieden. Die Restriktion mit HIII und XhoI zeigte, dass der Klon 12B von 3A und 4A verschieden war. Eine PCR-Amplifikation von 3A und 11A mit Primern, die auf der genomischen Sequenz von Arabidopsis-FAE1 basierten, erzeugte Banden von unterschiedlicher Größe, welche die Nicht-Identität dieser Klone bestätigten. Die Teilsequenzen von 3A und 11A zeigten, dass sie an sowohl den 3'- als auch den 5'-Enden der Nukleotidsequenz zu 95% homolog waren. Die Sequenz ID Nr: 3 ist eine Teilsequenz der kodierenden Region des Klons 4A, anfangend mit einem Basenpaar, das sich nähe rungsweise 900 bp stromabwärts des Translationsstarts befindet. Die Sequenz ID Nr: 4 zeigt die entsprechende Aminosäuresequenz. 4 zeigt ein Vergleich dieser Aminosäuresequenz mit einer entsprechenden Sequenz aus dem Arabidopsis-Protein (SEQ ID Nr: 2). Dieser Vergleich offenbarte eine Ähnlichkeit von 94% zwischen den zwei Proteinen.
Beispiel 3
Unterdrückung der FAE1-Expression in Brassica
Die in Beispiel 1 (SEQ ID Nr: 1) beschriebene FAE1-cDNA mit einer Länge von 1641 bp wird aus dem Vektor als EcoRI/XhoI-Fragment ausgeschnitten und in das Plasmid p2104-CABL (Harpster et al., Mol. Gen. Genet. 212: 182–190) kloniert, das mit NcoI und Bam HI verdaut worden war. Alle Restriktionsstellen werden mit Klenow zur Bildung stumpfer Enden behandelt. Es werden Standard-Molekularbiologietechniken verwendet (siehe zum Beispiel Sambrook et al., s. o.). Das Plasmid p2104-CABL weist 1,34 kb der CaMV 35S-Promotorsequenz, 60 bp der Petunia-CABL22 untranslatierten Signalsequenz und 260 bp der NOS 3'-Polyadenylierungssequenz auf. Mit dieser Ligation wird p35S-Fae1-NOS-3' mit Fae1 in der Transkriptionsorientierung für die Sense-Unterdrückung ausgewählt und p35S-Fae1-NOS-3' wird für die Antisense-Unterdrückung ausgewählt.
Die Genfusionen in p35S-Fae1-NOS3' und p35S-LeaF-NOS3' werden als Bgl II/Hind III-Fragmente ausgeschnitten und in den binären Vektor WTT2143 unter Verwendung von Standardtechniken (Sambrook et al., s. o.) kloniert. WTT2143 weist eine p2'-HPT-NOS-3'-Fusion zur Auswahl transformierter Pflanzen und ein Tetracyclinresistenzgen zur Auswahl des Plasmids in E. coli und Agrobacterium auf.
Die resultierenden binären Vektoren werden in Agrobacterium tumefaciens, Stamm LBA4404 durch Konjugation mobilisiert (Herrera-Estrella und Simpson in C. H. Shaw (Herausg.) Plant Molecular Biology Seiten 131–158 (1988)).
Die binären Sense- und/oder Antisense-Fael-Konstrukte werden aus dem Agrobacterium-Stamm, der sie trägt, in 5-Tage alte Hypokotylschnitte von Brassica napus cv.
Westar durch Cokultivierung eingeführt. Transformierte Triebe werden in Gegenwart von Hygromycin B ausgewählt. Das Agrobacterium wird noch einmal mit 500 mg/ml Cefotaxim ausgewählt und dem transformierten Gewebe wird die Kallusbildung in Gegenwart von 20 mg/ml Hygromycin B, 3% Sucrose, 0,2 mg/ml 2,4 D und 3 mg/L Kinetin gestattet. Die Triebe werden auf dem transformierten Kallus unter Verwendung eines Mediums, das 2,5 μM IBA, 5 mg/L AgNO₃, 15 μM Thidiazuron und 20 mg/L Hygromycin B enthält, stimuliert. Die Triebe werden in einem Medium, das 0,125 mg/L BAP und 500 mg/L Geopen enthält, normalisiert und dann werden in Abwesenheit von Hormonen und Hygromycin B Wurzeln gezogen.
Die transformierten Pflanzen werden zur Reife kultiviert und man lässt sie sich selbst bestäuben. Die resultierenden Samen werden durch Gaschromatographie analysiert (wie in Beispiel 1 und den Verweisen darin beschrieben ist), um Pflanzen mit einem verringertem Erucasäuregehalt von weniger als 1% (bezüglich des Gesamt-FA-Gehalts) auszuwählen.
Beispiel 4
Überexpression von FAE1 in Brassica napus
Eine Überexpression von Fae1 wird unter Verwendung der Schritte von Beispiel 3 mit Modifikationen, wie sie nachfolgend angegeben sind, erhalten. Das gewünschte Ergebnis ist, dass die Samen der transgenen Pflanzen einen höheren Erucasäuregehalt aufweisen sollten, als Samen der nicht transformierten Kontrollen. Die Konstruktionen in Beispiel 3 ergeben keine translationsaktiven Genprodukte. Eine Translationsaktivität ist für eine Überexpression wichtig. Ein geeignetes Design der p35S-Fae1-NOS3'-Fusion wird unter Verwendung von Standardoligonukleotidmutagenesetechniken (Sambrokk et al., s. o.) zur Erzeugung einer Nco I-Stelle am Methioninstartpunkt in dem genomischen Klon von Fae1 und anschließender Fusion von diesem und der Masse des Gens aus der cDNA an den 35S-Promotor an der Nco I-Stelle in dem Plasmid 2104-CABL erreicht. Nach Transformation, Pflanzenwachstum, Selbstbestäubung und Gaschromatographieanalyse, wie sie in Beispiel 3 erforderlich war, werden Pflanzen mit einem Erucasäuregehalt von mindestens 40% (bezüglich des Gesamt-FA-Gehalts) ausgewählt.
Die vorstehenden Beispiele wurden zur Erläuterung der Erfindung, jedoch nicht zur Beschränkung ihres Umfangs bereit gestellt. Andere Varianten der Erfindung sind für den Durchschnittsfachmann ohne weiteres offensichtlich und sind von den beigefügten Ansprüchen umfasst. Auf den Offenbarungsgehalt von allen Veröffentlichungen, Patenten und Patentanmeldungen, die hier zitiert sind wird hiermit vollständig Bezug genommen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes DNA-Konstrukt, welches ein Polynukleotid von mindestens 150 Nukleotiden Länge umfaßt und mindestens 90% Sequenzidentität mit SEQ ID NR: 1 oder dem Komplement davon aufweist, wobei das Polynukleotid mindestens einen Teil eines Enzyms, das die Umwandlung von Ölsäure zu Eicosansäure und von Eicosansäure zu Erucasäure katalysiert, kodiert.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, wobei die Polynukleotidsequenz SEQ ID NR: 1 ist.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, welches weiter einen Promotor umfaßt, der funktionsfähig mit der Polynukleotidsequenz verknüpft ist, wobei die Polynukleotidsequenz vorzugsweise mit dem Promotor in einer Antisense-Orientierung verknüpft ist.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 3, wobei der Promotor ein Pflanzenpromotor, z. B. ein Samen-spezifischer Promotor, ist.
Transgene Pflanze, welche eine rekombinante Expressionskassette, welche einen Pflanzenpromotor umfaßt, der funktionsfähig mit einem wie in Anspruch 1 definierten Polynukleotid oder dem Komplement davon verknüpft ist, umfaßt, wobei die Polynukleotidsequenz vorzugsweise mit dem Promotor in einer Antisense-Orientierung verknüpft ist.
Transgene Pflanze nach Anspruch 5, wobei der Pflanzenpromotor ein heterologer Promotor ist.
Transgene Pflanze nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, wobei die Pflanze Brassica napus ist.
Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die Polynukleotidsequenz SEQ ID NR: 1 ist.
Verfahren zum Modulieren des Fettsäuregehalts in einer Pflanze, wobei das Verfahren das Einbringen einer rekombinanten Expressionskassette, welche einen Pflanzenpromotor, z. B. einen Samen-spezifischen Promotor, der funktionsfähig mit einem wie in Anspruch 1 definierten Polynukleotid oder einem Komplement davon verknüpft ist, umfaßt, in Pflanzengewebe z. B. unter Verwendung von Agrobacterium, wobei das Pflanzengewebe gegebenenfalls von Brassica stammt, das Regenerieren des Pflanzengewebes zu einer ganzen Pflanze, wobei die regenerierte Pflanze die Polynukleotidsequenz transkribiert, und das Auswählen von Pflanzen, die einen veränderten Fettsäuregehalt aufweisen, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Polynukleotidsequenz mit dem Promotor in einer Antisense-Orientierung verknüpft ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Polynukleotidsequenz mit dem Promotor in einer Sense-Orientierung verknüpft ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die Polynukleotidsequenz SEQ ID NR: 1 ist.
Verfahren zum Isolieren eines FAE1-Gens aus einer Pflanze, gegebenenfalls SEQ ID NR: 1, wobei das Verfahren das Analysieren einer DNA-Bibliothek, die z. B. aus der Pflanze hergestellte cDNA umfaßt, mit Oligonukleotid- Sonden, umfassend ein Polynukleotid, das ein Teil von SEQ ID NR: 1 oder ein Komplement davon ist, umfaßt.