DE60127967T2

DE60127967T2 - Ein mit der synthese von delta-12 epoxy-gruppen in fettsäuren von pflanzen assoziiertes cytochrom p450 enzym

Info

Publication number: DE60127967T2
Application number: DE60127967T
Authority: DE
Inventors: Edgar B. Wilmington CAHOON
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2000-07-21
Filing date: 2001-07-19
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2021-07-20
Also published as: AU2001277924A1; HUP0400496A3; CA2410663C; NO20030229D0; US20040139499A1; JP2004513623A; NO20030229L; CA2410663A1; PT1309698E; WO2002008269A3; DK1309698T3; US20030066103A1; EP1309698A2; MXPA03000507A; EP1309698B1; BR0112566A; WO2002008269A2; DE60127967D1; HUP0400496A2; ATE360075T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Gegenstand der Erfindung ist das Gebiet der Pflanzenmolekularbiologie. Gegenstand dieser Erfindung sind insbesondere Nukleinsäurefragmente, kodierend ein Cytochrom-P450-Enzym, das die Synthese von Δ¹²-Epoxygruppen in Fettsäuren von Pflanzen und Samen katalysiert. Die Produkte dieses Enzyms können Epoxyfettsäuren, wie zum Beispiel Vernolsäure, einschließen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Fettsäuren, die chemische Modifikationen zusätzlich zu den häufigen Doppelbindungen tragen, sind in den Speicherlipiden vieler Ölsamen zu finden (Badami, R.C. und Patil, K.B. (1981) Prog. Lipid Res. 19: 119–153). Einige dieser Modifikationen funktionalisieren die Fettsäure zur Produktion von Produkten, die in industriellen Applikationen nützlich sind; dies steht im Gegensatz zur häufigeren Verwendung von sich von Pflanzen herleitenden Lipiden als Nahrungsmittel. Beispiele sind die Verwendung der hydroxylierten Fettsäure Ricinolsäure in Gleitmitteln, und die Fettsäuren mit kurzer oder mittlerer Kohlenstoffkettenlänge von Palmöl in Detergentien. In einigen Fällen kann die Fettsäurezusammensetzung der Speicherlipide von in gemäßigten Klimazonen produzierten Ölsamen durch die Addition von Genen aus exotischen Quellen dergestalt modifiziert werden, dass große Mengen einzigartiger Fettsäuren produziert werden (Ohlrogge, J.B. (1994) Plant Physiol. 104: 21–826).
Die Epoxidierung befindet sich unter den bekannten Modifikationen an Speicherlipidfettsäuren in Pflanzen. Vernolsäure (cis-12-Epoxyoctadeca-cis-9-ensäure) stellt ein Beispiel einer Epoxyfettsäure dar, die in den Samenölen von Spezies, wie zum Beispiel Vernonia galamensis und Euphorbia lagascae (Bafor, M. et al. (1993) Arch. Biochem. Biophys. 303: 145–151; und US-Patent Nr. 5846784 , zu finden ist. Vemolsäure kann sich aus so vielen wie 60 % der Fettsäuren der Samenöle dieser Pflanzen zusammensetzen. Fettsäuren, wie zum Beispiel Vemolsäure, die die Epoxymodifikation enthalten, können Verwendung als Plastifiziermittel, in Applikationen zur Vernetzung von Beschichtungen und beim Fixieren von Drucktinten finden (Perdue, R.E. et al. (1986) Econ. Bot. 40: 54–68).
Ergebnisse von vorangegangenen metabolischen Studien geben zu erkennen, dass sich die katalytische Aktivität, die für die Einführung des in Abundanz in Samen von Euphorbia lagascae gefundenen Δ¹²-Epoxyteils von Vemolsäure verantwortlich ist, in der mikrosomalen Membranfraktion, am wahrscheinlichsten im endoplasmatischen Retikulum befindet (Bafor et al. vorstehend). Diese Studie deutet darauf hin, dass die katalytische Aktivität, die für die Epoxidbildung in dieser Pflanze verantwortlich ist, ein Enzym der Cytochrom-P450-Monooxygenaseklasse darstellt. Gene von Vernonia galamensis und Crepis palaestina wurden isoliert, und wenn sie in Pflanzen oder Hefe exprimiert werden, sind die kodierten Proteine zur Umwandlung der Linolsäure in Vemolsäure fähig (Lee et al. (1998) Science 280: 915–918, und US-Patent Nr. 5846784 ). Seither et al. (Physiology, Biochemistry and Molecular Biology of Plant Lipids, XX, XX, 1997, S. 389–391) befassen sich mit der Isolierung von Cytochrom-P450-Genen von Vernonia galamensis.
WO 98/46762 betrifft die genetischen Sequenzen, die für Fettsäure-Δ-12-Epoxygenase-Enzyme, umfassend Monooxygenase-Enzyme von gemischter Funktion kodieren. Es offenbart insbesondere cDNA-Sequenzen, die für Pflanzenfettsäure-Epoxygenasen, insbesondere die Δ-12-Epoxygenase von Crepis palaestina und Homologe, Analoge und Derivate davon und zwei Enzyme von Euphorbia lagascae mit putativer Epoxygenase-Aktivität kodieren.
Es wurde jedoch gezeigt, dass sich die Epoxygenase-Aktivitäten von diesen anderen Pflanzen, die Vemolsäure produzieren, vom Enzym von Euphorbia lagascae unterscheiden. Im Gegensatz zum Enzym von Euphorbia lagascae sind diese Enzyme mit den im endoplasmatischen Retikulum lokalisierten Fettsäure-Desaturasen verwandt (PCT-Veröffentlichung Nr. WO 94/11516 , veröffentlicht am 26. Mai 1994). Diese Fettsäure-epoxidierenden Enzyme sind anscheinend hinsichtlich der Sequenz mit der Klasse von Membran-gebundenen Enzymen verwandt, die für die Fettsäure-Desaturierung und Fettsäure-Hydroxylierung verantwortlich sind (Broun, P. und Somerville, C. (1997) Plant Physiol. 113: 933–942). Deshalb gibt es zwei distinkte Klassen von Genen, die für Enzyme codieren, die zur Bildung von Vernolsäure-Epoxidgruppen fähig sind, wobei eine Cytochrom-P450-abhängig ist und die andere mit den Fettsäure-Desaturasen und -Hydroxylasen verwandt ist. Es hat den Anschein, dass die Epoxygenase, die für die Vernolsäureproduktion in sich entwickelnden Samen von E. lagascae verantwortlich ist, ein neues und bisher nicht charakterisiertes Protein darstellt. Die Isolierung und Charakterisierung zusätzlicher Enzyme, die für die Δ¹²-epoxidierte Fettsäureproduktion verantwortlich sind, werden die Fähigkeit zur Manipulation modifizierter Fettsäuren in Pflanzen erweitern. Dies wird die laufenden Arbeiten zur Produktion industriell wichtiger Öle in gewerblich wichtigen Kulturpflanzen weiter vorantreiben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Beschreibung eines Enzyms der Cytochrom-P450-Monoxygenaseklasse, das durch eine Nukleinsäure kodiert ist, die aus einer cDNA-Bibliothek des sich entwickelnden Samens von Euphorbia lagascae isoliert worden ist. Einer der Klone, eellc.pk002.i4, wenn in Hefe oder einer nicht verwandten Pflanze exprimiert, reicht zur Produktion von neuen Epoxidenthaltenden Fettsäuren, wie zum Beispiel Vemolsäure, aus. Es besteht die Annahme, dass es sich hierbei um die erste Charakterisierung eines Pflanzenpolynukleotids handelt, das für ein Enzym der Cytochrom-P450-Klasse kodiert, das zur Produktion von Δ¹²-epoxidierten Fettsäuren fähig ist.
In einer ersten Ausführungsform kodiert ein erfindungsgemäßes isoliertes Polynukleotid für ein Polypeptid, bei dem es sich um ein mit der Synthese von Δ-12-Epoxyfettsäuren assoziiertes Cytochrom-P450-Enzym handelt, worin das Polypeptid eine mindestens 50%ige Identität bezogen auf das Clustal-Alignmentverfahren aufweist, wenn es mit einem Polypeptid von SEQ ID NO:2 verglichen wird. In einem anderen Aspekt betrifft diese Erfindung auch das Komplement, worin das Komplement die gleiche Anzahl von Nukleotiden wie die isolierte Polynukleotidsequenz aufweist und 100%ig komplementär zur isolierten Polynukleotidsequenz ist.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft diese Erfindung ein chimäres Konstrukt, umfassend das erfindungsgemäße isolierte Polynukleotid, das mit mindestens einer geeigneten Regulatorsequenz operativ verknüpft ist.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine isolierte Wirtszelle, umfassend ein erfindungsgemäßes chimäres Gen oder ein erfindungsgemäßes isoliertes Polynukleotid. Die Wirtszelle kann eukaryot, wie zum Beispiel eine Hefe- oder eine Pflanzenzelle, oder prokaryot, wie zum Beispiel eine Bakterienzelle, sein.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft auch ein Verfahren zur Auswahl eines isolierten Polynukleotids, das sich auf den Spiegel von Δ¹²-Epoxyfettsäuren in einer Wirtszelle auswirkt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Herstellen eines isolierten Polynukleotids, umfassend die erfindungsgemäße Polynukleotidsequenz, (b) Einführen des isolierten Polynukleotids in eine Wirtszelle, und (c) Bestimmen der An- oder Abwesenheit der Δ¹²-Epoxyfettsäuren in der Wirtszelle. Man ist der Ansicht, dass viele Organismen als geeignete Wirtszellen dienen können. Nützliche Wirtszellen schließen folgende ein, sind aber nicht beschränkt auf Bakterien, Hefe, Pflanzen, Viren und Tiere. Ein bevorzugtes isoliertes Polynukleotid besteht aus einer Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft ein Verfahren zum Erhalt eines Nukleinsäurefragments, kodierend ein Cytochrom-P450-Enzym, das mit der Synthese von Δ¹²-Epoxyfettsäuren assoziiert ist, umfassend die folgenden Schritte: (a) Sondieren einer cDNA oder genomischen Bibliothek mit einem isolierten Polynukleotid, umfassend die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1 und ein Komplement von solchen Nukleotidsequenzen; (b) Identifizieren eines DNA-Klons, der mit einem isolierten Polynukleotid von (a) oder dem Komplement davon hybridisiert, (c) Isolieren des identifizierten DNA-Klons; und (d) Sequenzieren der cDNA oder des genomischen Fragments, das den isolierten DNA-Klon umfasst.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Δ¹²-Epoxyfettsäuren in einer Wirtszelle, die Folgendes umfasst: (a) Transformieren einer Wirtszelle mit dem erfindungsgemäßen chimären Konstrukt, (b) Züchten der transformierten Wirtszellen von Schritt (a), und (c) Bestimmen der An- oder Abwesenheit von Δ¹²-Epoxyfettsäuren in den transformierten Zellen von (b). Wie bereits zuvor erwähnt wurde, kann jedwede Wirtszelle verwendet werden, wobei es sich bei den bevorzugten Wirten um Bakterien, Hefe oder Pflanzen handelt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN UND DES SEQUENZPROTOKOLLS
Die Erfindung kann besser aus der folgenden ausführlichen Beschreibung und den beiliegenden Zeichnungen und dem Sequenzprotokoll, die einen Teil dieser Anmeldung bilden, verstanden werden.
1 zeigt einen Vergleich der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen des Enzyms von Euphorbia lagascae (SEQ ID NO:2) und dem Cytochrom-P450-Enzym von Paprika (Capsicum annuum), das an der fungalen Inkompatibilität beteiligt ist.
2. Gaschromatographische Analyse von Fettsäuremethylestem, die aus Zellen von S. cerevisiae hergestellt worden sind, die die cDNA von E. lagascae für EST eellc.pk002.i4 in Medien exprimieren, die mit Linol- oder α-Linolensäure supplementiert sind. Die Gaschromatogramme in A und C zeigen Fettsäuremethylester von S. cerevisiae-Zellen, in denen sich der Expressionsvektor ohne cDNA-Insert befindet und in der Anwesenheit exogener Linol- bzw. α-Linolensäuren gezüchtet wird. Die in B und D gezeigten Gaschromatogramme entsprechen den Fettsäuremethylestem von S. cerevisiae-Zellen, die die cDNA von E. lagascae für EST eellc.pk002.i4 in Medien exprimieren, die Linol- bzw. α-Linolensäuren enthalten. Das Gaschromatogramm in E entspricht Fettsäuremethylestem, die aus Samen von E. lagascae hergestellt werden. Basierend auf den in 3 gezeigten massenspektrometrischen Analysen wird der mit „Epoxy1" gekennzeichnete Peak in B als der Methylester von Vemolsäure identifiziert und der als „Epoxy2" gekennzeichnete Peak in D wird unverbindlich als der Methylester von Δ¹²-Epoxy-octadeca- 9,15-diensäure identifiziert. Mit Zahlen gekennzeichnete Peaks entsprechen Methylestern der folgenden Fettsäuren: Peak 1, Palmitinsäure (16:0); Peak 2, Palmitoleinsäure (16:1 Δ^–9), Peak 3, Stearinsäure (18:0); Peak 4, Ölsäure (18:1 Δ^–9); Peak 5, Linolsäure (18:2 Δ^–9,12); und Peak 6, α-Linolensäure (18:3 Δ^–9,12,15)
3. Massenspektren von Derivaten von Methylestern von Vernolsäure (A, B) und Epoxyfettsäuren von S. cerevisiae-Zellen, die die cDNA von E. lagascae für EST eellc.pk002.i4 in Medien exprimieren, die Linolsäure (C, D) oder α-Linolensäure (E, F) enthalten Epoxyfettsäuremethylester wurden zuerst in methanolischer Schwefelsäure zur Reaktion gebracht, die ein Δ¹²-Hydroxy-/Δ¹³-Methoxyprodukt und ein Δ¹³-Methoxy/Δ¹²-Hydroxyprodukt mittels Öffnung des Epoxyrings herbeiführt. Die beiden aus einem gegebenen Epoxyfettsäuremethylester erhaltenen Produkte wurden dann zur Herbeiführung der in dieser Figur gezeigten Massenspektren in Trimethylsilyl-Derivate (TMS-Derivate) umgewandelt. Die Massenspektren in A und B wurden von Derivaten der Methylvernolsäure aus dem Samen von E. lagascae erhalten. Die Massenspektren in C und D wurden von Derivaten des als „Epoxy1" in 2 identifizierten Fettsäuremethylesters erhalten Diese Derivate wurden aus Extrakten von S. cerevisiae-Zellen, die die cDNA von E. lagascae für EST eellc.pk002.i4 in Linolsäure enthaltenden Medien exprimieren, hergestellt. Die Massenspektren in E und F wurden von Derivaten des als „Epoxy2" in 2 identifizierten Fettsäuremethylesters erhalten. Diese Derivate wurden aus Extrakten von S. cerevisiae-Zellen, die die cDNA von E. lagascae in α-Linolensäure enthaltenden Medien exprimiert, hergestellt. Diese Massenspektren sind, wie darauf hingewiesen wird, konsistent mit den Derivaten von Methyl-Δ¹²-epoxyoctadeca-9,15-dienoat.
4. Gaschromatographische Analysen von Fettsäuremethylestem, hergestellt aus Tabakkallus, der mit dem Expressionsvektor (pART/35S) allein (A) oder mit dem Expressionsvektor, enthaltend den offenen Leserahmen der cDNA für EST eellc.pk002.i4 unter Kontrolle des 35S-Promotors des Blumenkohl-Mosaik-Virus (B), transformiert wurde. In Panel C sind Fettsäuremethylester aus den Samen von Euphorbia lagascae ersichtlich. Wie in Beispiel 8 beschrieben, entsprechen die Peaks in Panel B, die als „Epoxy1" und „Epoxy2" gekennzeichnet sind, den Methylestem von Vemolsäure bzw. Δ¹²-Epoxy-18:2Δ^9,15 Die mit Sternchen (*) versehenen Peaks entsprechen Phytol. Weitere gekennzeichnete Peaks entsprechen den Methylestem der folgenden Fettsäuren: 16:0, Palmitinsäure; 18:0, Stearinsäure; 18:1, Ölsäure; 18:2, Linolsäure; 18:3, α-Linolensäure; 20:0, Eicosansäure; und 20:1 Eicosensäure.
5. Gaschromatographische Analysen von Fettsäuremethylestem, hergestellt aus einem nicht transformierten somatischen Sojabohnen-Embryo (A) und einem transgenen somatischen Sojabohnen-Embryo, der die Cytochrom-P450-Δ¹²-Epoxygenase von Euphorbia lagascae, entsprechend EST eellc.pk002.i4 (B), exprimiert. In Panel C sind Fettsäuremethylester aus Samen von Euphorbia lagascae ersichtlich. Wie in Beispiel 9 beschrieben, entsprechen die als „Epoxy1" und „Epoxy2" gekennzeichneten Peaks in Panel B den Methylestem von Vemolsäure bzw. Δ¹²-Epoxy-18:2Δ^9,15 Gekennzeichnete Peaks entsprechen Methylestem der folgenden Fettsäuren: 16:0, Palmitinsäure; 18:0, Stearinsäure; 18:1, Ölsäure; 18:2, Linolsäure; 18:3, α-Linolensäure.
Tabelle 1 listet Folgendes auf: die hierin beschriebenen Polypeptide, die Kennzeichnung der cDNA-Klone, die die Nukleinsäurefragmente umfassen, kodierend für Polypeptide, die alle oder einen wesentlichen Anteil dieser Polypeptide darstellen, und die entsprechende Kennzeichnung (SEQ ID NO:) wie im anhängenden Sequenzprotokoll verwendet. TABELLE 1 Ein mit der Synthese der Epoxygruppe von Vemolsäure assoziiertes Cytochrom-P450-Enzym

Pflanzenspezies, enthaltend Epoxygenase-Aktivität Klon-Bezeichnung SEQ ID NO:

(Nukleotid) (Aminosäure)

Euphorbia lagascae eellc.pk002.i4 1 2
Die zusätzlichen SEQ ID NO:4-7 stellen PCR-Primer dar, die zum Klonieren der Kodierungsregion von SEQ ID NO:1 nützlich sind. Nähere Einzelheiten zur Strategie sind in Beispielen 7 und 8 zu finden.
Das Sequenzprotokoll enthält, wie in Übereinstimmung mit den in Nucleic Acids Res. 13: 3021–3030 (1985) und im Biochemical J. 219 (Nr. 2): 345–373 (1984) beschriebenen IUPAC-IUBMB-Standards definiert, den Einbuchstaben-Code für Nukleotidsequenz-Zeichen und die Dreibuchstaben-Codes für Aminosäuren.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Begriffe „Epoxygruppe", „epoxygenierte Fettsäuren" oder „das Produkt einer Epoxygenase" verweisen alle auf die Einführung einer Epoxidbrücke (eines Sauerstoffatoms, das kovalent an Kohlenstoffatome gebunden ist, die wiederum kovalent aneinander gebunden sind, um einen dreigliedrigen Ring zu bilden, der Teil einer größeren Molekülstruktur darstellt) an der Stelle einer Doppelbindung in der Acylkette einer Fettsäure.
„Vemolsäure" verweist auf die Fettsäure 12-Epoxyoctadeca-9-cis-ensäure, die achtzehn Kohlenstoffatome, eine cis-Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffatomen 9 und 10 und eine Epoxygruppe zwischen den Kohlenstoffatomen 12 und 13 enthält. Der Begriff „Δ¹²-Epoxyfettsäure" verweist auf eine Fettsäure, wie zum Beispiel Vemolsäure, die eine Epoxygruppe zwischen den Kohlenstoffatomen 12 und 13 enthält. Der Begriff „mit der Synthese von Δ¹²-Epoxyfettsäuren assoziiertes Cytochrom-P450-Enzym" oder „Pflanzen-Epoxygenase" werden miteinander austauschbar verwendet und sind zur Definition eines Enzyms beabsichtigt, das die Insertion einer Epoxygruppe an einer bestehenden Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffen 12 und 13 einer Fettsäurekette katalysiert. Die Substrate für dieses Enzym können Linol- und α-Linolensäuren einschließen, die an ein Lipid, wie zum Beispiel Phosphatidylcholin, gebunden sein können. Die Produkte dieses Enzyms können Δ¹²-Epoxyfettsäuren, wie zum Beispiel Vemolsäure und 12-Epoxyoctadeca-9,15-diensäure einschließen. Solche modifizierten Fettsäuren sind in den Samen und Ölen einer begrenzten Anzahl von Pflanzen, einschließlich Euphorbia lagascae, Vernonia und Crepis zu finden. Von diesen drei Pflanzen ist bekannt, dass die Vernonia- und Crepis-Spezies ein divergentes Desaturase- oder Hydroxylase-Enzym zur Durchführung der Epoxidierung benutzen ( US-Patent Nr. 5846784 ; PCT-Anmeldung WO 98/46762 , veröffentlicht am 22. Oktober 1998).
Es wurde mitgeteilt, dass in Euphorbia lagascae für die Umwandlung von Linolsäure in Vemolsäure eine Cytochrom-P450-abhängige Epoxygenase benötigt wird (Bafor et al. (1993) Arch. Bioch. Biophys. 303: 145–151).
Die Begriffe „Polynukleotid", „Polynukleotidsequenz", „Nukleinsäuresequenz" und „Nukleinsäurefragment"/„isoliertes Nukleinsäurefragment" werden hierin miteinander austauschbar verwendet. Diese Begriffe umfassen Nukleotidsequenzen und dergleichen. Ein Polynukleotid kann ein Polymer von RNA oder DNA, die ein- oder doppelsträngig ist, das wahlweise synthetische, nicht natürliche oder veränderte Nukleotidbasen enthält, darstellen. Ein Polynukleotid in der Form eines Polymers von DNA kann aus einem oder mehr Segment(en) von cDNA, genomischer DNA, synthetischer DNA oder Gemischen davon bestehen. Ein erfindungsgemäßes isoliertes Polynukleotid kann mindestens eines von 30 angrenzenden Nukleotiden, bevorzugt mindestens eines von 40 angrenzenden Nukleotiden, am bevorzugtesten eines von mindestens 60 angrenzenden Nukleotiden, die sich von SEQ ID NO:1 herleiten, oder das Komplement solcher Sequenzen einschließen.
Wie hierin verwendet, versteht man unter einem „isolierten Nukleinsäurefragment" ein Polymer von RNA oder DNA, die ein- oder doppelsträngig ist, das wahlweise synthetische, nicht natürliche oder veränderte Nukleotidbasen enthält. Ein isoliertes Nukleinsäurefragment in der Form eines Polymers von DNA kann aus einem oder mehr Segment(en) von cDNA, genomischer DNA oder synthetischer DNA bestehen. Auf Nukleotide (gewöhnlich in ihrer 5'-Monophosphatform gefunden) wird durch ihre Einbuchstaben-Kennzeichnung wie folgt verwiesen: „A" für Adenylat oder Desoxyadenylat (für RNA bzw. DNA), „C" für Cytidylat oder Desoxycytidylat, „G" für Guanylat oder Desoxyguanylat, „U" für Uridylat, „T" für Desoxythymidylat, „R" für Purine (A oder G), „Y" für Pyrimidine (C oder T), „K" für G oder T, „H" für A oder C oder T, „I" für Inosin und „N" für jedwedes Nukleotid.
Unter dem Begriff „rekombinant" versteht man zum Beispiel, dass eine Nukleinsäuresequenz durch eine künstliche Kombination von zwei anderweitig getrennten Segmenten der Sequenz, z. B. durch chemische Synthese oder durch die Manipulation von isolierten Nukleinsäuren durch genetische Manipulationsverfahren, aufgebaut ist.
Die Begriffe „Subfragment, das funktionell äquivalent ist" und „funktionell äquivalentes Subfragment" werden hierin miteinander austauschbar verwendet. Diese Begriffe verweisen auf einen Anteil oder eine Subsequenz eines isolierten Nukleinsäurefragments, in dem die Fähigkeit zur Veränderung der Genexpression oder Produktion eines bestimmten Phänotyps beibehalten wird, ungeachtet, ob das Fragment oder Subfragment für ein aktives Enzym kodiert oder nicht. So kann zum Beispiel das Fragment oder Subfragment beim Design chimärer Konstrukte zur Herstellung des gewünschten Phänotyps in einer transformierten Pflanze verwendet werden. Chimäre Konstrukte können zur Verwendung in Cosuppression oder Antisense durch Verknüpfung eines Nukleinsäurefragments oder -subfragments davon, ungeachtet, ob es für ein aktives Enzym, in der angemessenen Orientierung bezogen auf eine Pflanzen-Promotorsequenz kodiert oder nicht, designiert werden.
Die Begriffe „Homologie", „homolog", „im Wesentlichen ähnlich" und „im Wesentlichen entsprechend" werden hierin miteinander austauschbar verwendet. Sie verweisen auf Nukleinsäurefragmente, worin sich Änderungen in einer oder mehr Nukleotidbase(n) nicht auf die Fähigkeit des Nukleinsäurefragments zur Vermittlung der Genexpression oder Produktion eines bestimmten Phänotyps auswirken. Diese Begriffe verweisen auch auf Modifikationen der erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragmente, wie zum Beispiel Deletion oder Insertion von einem oder mehr Nukleotid(en), das/die die funktionellen Eigenschaften des sich ergebenden Nukleinsäurefragments bezogen auf das initiale, nicht modifizierte Fragment nicht wesentlich verändern. Man sollte deshalb zur Kenntnis nehmen, dass die Erfindung mehr als die spezifischen beispielhaften Sequenzen einschließt, wie der Fachmann erkennen wird.
Es können im Wesentlichen ähnliche Nukleinsäurefragmente durch Screening von Nukleinsäurefragmenten, die Subfragmente oder Modifikationen der erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragmente darstellen, worin ein oder mehr Nukleotid(e) substituiert, deletiert und/oder insertiert ist/sind, auf ihre Fähigkeit, sich auf den Spiegel des Polypeptids auszuwirken, das durch das nicht modifizierte Nukleinsäurefragment in einer Pflanze oder Pflanzenzelle kodiert ist, ausgewählt werden. So kann zum Beispiel ein im Wesentlichen ähnliches Nukleinsäurefragment, das mindestens eines von 30 (bevorzugt 40 und bevorzugter 60) angrenzenden Nukleotiden, die sich von dem vorliegenden Nukleinsäurefragment herleiten, konstruiert und in eine Pflanze oder Pflanzenzelle eingeführt werden. Der Spiegel des durch das nicht modifizierte Nukleinsäurefragment kodierte Polypeptid, das in einer Pflanze oder Pflanzenzelle vorliegt, die dem im Wesentlichen ähnlichen Nukleinsäurefragment ausgesetzt ist, kann dann mit dem Spiegel des Polypeptids in einer Pflanze oder einer Pflanzenzelle verglichen werden, die dem im Wesentlichen ähnlichen Nukleinsäurefragment nicht ausgesetzt wird.
Es ist zum Beispiel im Stand der Technik weithin bekannt, dass die Antisense-Suppression und -Cosuppression der Genexpression unter Verwendung von Nukleinsäurefragmenten, die weniger als die gesamte Kodierungsregion eines Gens darstellen, und unter Verwendung von Nukleinsäurefragment, die sich nicht die 100%ige Sequenzidentität mit dem zu supprimierenden Gen teilen, erreicht werden kann. Überdies sind im Stand der Technik Veränderungen in einem Nukleinsäurefragment, die zur Produktion einer chemisch äquivalenten Aminosäure an einer gegebenen Stelle führen, die sich aber nicht auf die funktionellen Eigenschaften des kodierten Polypeptids auswirken, gut bekannt. Folglich kann ein Codon für die Aminosäure Alanin, eine hydrophobe Aminosäure, durch ein Codon substituiert werden, das für einen anderen, weniger hydrophoben Rest, wie zum Beispiel Glycin, oder einen hydrophoberen Rest, wie zum Beispiel Valin, Leucin oder Isoleucin, kodiert. Auf ähnliche Weise können auch Änderungen, die zur Substitution eines negativ geladenen Rests durch einen anderen, wie zum Beispiel Asparaginsäure durch Glutaminsäure, oder ein positiv geladener Rest durch einen anderen, wie zum Beispiel Lysin durch Arginin, führen, zur Produktion eines funktionell äquivalenten Produkts erwartet werden. Es würde auch nicht erwartet, dass Nukleotidänderungen, die zur Veränderung der N-terminalen und C-terminalen Anteile des Polypeptidmoleküls führen, die Aktivität des Polypeptids verändern. Jede der vorgeschlagenen Modifikationen befindet sich durchaus in den routinemäßigen Fähigkeiten im Stand der Technik, wie dies auch mit der Bestimmung der Beibehaltung der biologischen Aktivität der kodierten Produkte der Fall ist. Folglich können ein isoliertes Polynukleotid, umfassend eine Nukleotidsequenz von mindestens einem von 30 (bevorzugt mindestens einem von 40, am bevorzugtesten mindestens einem von 60) angrenzenden Nukleotiden, die sich von einer Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1 herleiten, und das Komplement solcher Nukleotidsequenzen in Verfahren zur Auswahl eines isolierten Polynukleotids, das sich auf die Expression eines Pflanzen-Epoxygenase-Polypeptids in einer Wirtszelle auswirkt, verwendet werden. Ein Verfahren zur Auswahl eines isolierten Polynukleotids, das sich auf den Expressionsspiegel eines Polypeptids in einem Virus oder in einer Wirtszelle (eukaryot, wie zum Beispiel eine Pflanze oder Hefe, prokaryot, wie zum Beispiel Bakterien) auswirkt, kann die folgenden Schritte umfassen: Konstruieren eines erfindungsgemäßen isolierten Polynukleotids oder eines erfindungsgemäßen isolierten chimären Gens; Einführen des isolierten Polynukleotids oder des isolierten chimären Gens in eine Wirtszelle; Messen des Spiegels eines Polypeptids oder einer Enzymaktivität in der Wirtszelle, enthaltend das isolierte Polynukleotid; und Vergleichen des Spiegels eines Polypeptids oder einer Enzymaktivität in der Wirtszelle, enthaltend das isolierte Polynukleotid, mit dem Spiegel eines Polypeptids oder einer Enzymaktivität in einer Wirtszelle, die das isolierte Polynukleotid nicht enthält.
Der Fachmann erkennt überdies, dass im Wesentlichen ähnliche erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen auch durch ihre Fähigkeit, unter moderat stringenten Bedingungen (zum Beispiel 0,5 × SSC, 0,1 % SDS, 60°C) mit den hierin erläuterten Sequenzen, oder an jedweden Anteil der hierin mitgeteilten Nukleotidsequenzen und die funktionell äquivalent mit dem erfindungsgemäßen Promotor sind, zu hybridisieren. Die Stringenzbedingungen können zum Screening auf moderat ähnliche Fragmente, wie zum Beispiel homologe Sequenzen aus entfernt verwandten Organismen, auf sehr ähnliche Fragmente, wie zum Beispiel Gene, die funktionelle Enzyme aus eng verwandten Organismen duplizieren, angepasst werden. Das Waschen nach der Hybridisierung legt die Stringenzbedingungen fest. Ein Set bevorzugter Bedingungen beinhaltet eine Reihe von Wäschen, beginnend mit 6 × SSC, 0,5 % SDS 15 min bei Raumtemperatur, dann Wiederholung mit 2 × SSC, 0,5 % SDS 30 min bei 45°C und dann zweimalige Wiederholung mit 0,2 × SSC, 0,5 % SDS 30 min bei 50°C. Ein bevorzugteres Set stringenter Bedingungen beinhaltet den Einsatz höherer Temperaturen, worin die Wäschen identisch zu den vorstehenden sind, außer dass die Temperatur der abschließenden beiden Wäschen von 30 min in 0,2 × SSC, 0,5 % SDS auf 60°C erhöht wurde. Ein weiteres bevorzugtes Set hoch stringenter Bedingungen beinhaltet den Einsatz von zwei abschließenden Wäschen in 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C.
In Bezug auf den Grad der erheblichen Ähnlichkeit zwischen der (endogenen) Target-mRNA und der RNA-Region im Konstrukt mit Homologie zur Target-mRNA, sollten solche Sequenzen mindestens eine Länge von 25 Nukleotiden, bevorzugt eine Länge von mindestens 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1250 oder 1500 Nukleotiden aufweisen; und sollten mindestens 50%ig, 55%ig, 60%ig, 65%ig, 70%ig, 75%ig, 80%ig, 85%ig, 90%ig oder 95%ig identisch sein.
Im Wesentlichen ähnliche erfindungsgemäße Nukleinsäurefragmente können auch durch die prozentuale Identität der Aminosäuresequenzen gekennzeichnet sein, die sie für die darin offenbarten Aminosäuresequenzen kodieren, wie durch die vom Fachmann häufig eingesetzten Algorithmen bestimmt wird. Geeignete Nukleinsäurefragmente (erfindungsgemäße isolierte Polynukleotide) kodieren für Polypeptide, die mindestens 50%ig, 55%ig, 60%ig, 65%ig, 70%ig, 75%ig, 80%ig, 85%ig, 90%ig oder 95%ig identisch zu den hierin mitgeteilten Aminosäuresequenzen sind. Man sollte zur Kenntnis nehmen, dass jede ganzzahlige prozentuale Identität von 50 % bis 100 % zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet wäre. Geeignete Nukleinsäurefragmente weisen nicht nur die vorstehenden Identitäten auf, sondern kodieren in der Regel für ein Polypeptid mit mindestens 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 oder 500 Aminosäuren. Sequenz-Alignments und Berechnungen der prozentualen Identität wurden unter Verwendung des MegAlign-Programms der LASERGENE Bioinformatik-Software-Suite (DNASTAR Inc., Madison, WI) durchgeführt. Multiples Alignment der Sequenzen wurde unter Verwendung des Clustal-Alignmentverfahrens (Higgins und Sharp (1989) CABIOS. 5:151–153) mit den Standardparametem (GAP PENALTY = 10, GAP LENGTH PENALTY = 10) durchgeführt. Die Standardparameter für paarweise Alignments unter Verwendung des Clustal-Verfahrens stellten KTUPLE 1, GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 und DIAGONALS SAVED = 5 dar.
Ein „wesentlicher Anteil" einer Aminosäure oder Nuldeotidsequenz umfasst eine Aminosäure oder eine Nukleotidsequenz, die ausreichend ist, um eine putative Identifikation des Proteins oder Gens, das die Aminosäure oder Nukleotidsequenz umfasst, bereitzustellen. Aminosäure- und Nukleotidsequenzen können vom Fachmann entweder manuell oder unter Verwendung eines rechnerbasierten Sequenzvergleichs und von Identifikationswerkzeugen, die Algorithmen, wie zum Beispiel BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al. (1993) J. Mol. Biol. 215: 403–410; siehe auch www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) einsetzen, bewertet werden. Im Allgemeinen ist eine Sequenz von zehn oder mehr angrenzenden Aminosäuren oder dreißig oder mehr angrenzenden Nukleotiden notwendig, um ein Polypeptid oder eine Nukleinsäuresequenz als homolog zu einem bekannten Protein oder Gen putativ zu identifizieren. In Bezug auf Nukleotidsequenzen können überdies Genspezifische Oligonukleotidsonden, umfassend 30 oder mehr angrenzende Nukleotide, in Sequenzabhängigen Verfahren zur Genidentifikation (z. B. Southern-Hybridisierung) und Isolierung (z. B. in situ-Hybridisierung von Bakterienkolonien oder Bakteriophagen-Plaques) verwendet werden. Außerdem können kurze Oligonukleotide von 12 oder mehr Nukleotiden als Amplifikationsprimer in der PCR verwendet werden, um ein bestimmtes Nukleinsäurefragment, umfassend die Primer, zu erhalten. Demzufolge umfasst ein „wesentlicher Anteil" einer Nukleotidsequenz eine Nukleotidsequenz, die eine spezifische Identifikation und/oder Isolierung eines Nukleinsäurefragments, umfassend die Sequenz, bereitstellt. Die vorliegende Patentschrift lehrt Aminosäure- und Nukleotidsequenzen, die für Polypeptide kodieren, die ein oder mehr bestimmte(s) Pflanzenprotein(e) umfassen. Der Fachmann, mit dem Vorteil der hierin mitgeteilten Sequenzen, kann nun alle oder einen wesentlichen Anteil der offenbarten Sequenzen für dem Fachmann bekannte Zwecke einsetzen.
„Codon-Degeneriertheit" verweist auf die Divergenz im genetischen Code, die eine Variation der Nukleotidsequenz zulässt, ohne sich auf die Aminosäuresequenz eines kodierten Polypeptids auszuwirken. Demzufolge betrifft die vorliegende Erfindung jedwedes Nukleinsäurefragment, umfassend eine Nukleotidsequenz, die für die hierin dargelegten Aminosäuresequenzen kodiert. Der Fachmann ist sich des von einer spezifischen Wirtszelle bei Gebrauch von Nukleotid-Codonen zum Spezifizieren einer gegebenen Aminosäure aufgewiesenen „Codon-Bias" bewusst. Wenn deshalb ein Nukleinsäurefragment zur verbesserten Expression in einer Wirtszelle synthetisiert wird, ist das Design des Nukleinsäurefragments dergestalt wünschenswert, dass sich seine Frequenz der Codon-Usage der Frequenz der bevorzugten Codon-Usage der Wirtszelle annähert.
„Synthetische Nukleinsäurefragmente" können aus Oligonukleotidbausteinen assembliert werden, die unter Verwendung von den dem Fachmann bekannten Verfahren chemisch synthetisiert werden. Diese Bausteine werden zur Bildung größerer Nukleinsäurefragmente ligiert und annealt, die dann zum Konstruieren des gesamten gewünschten Nukleinsäurefragments enzymatisch assembliert werden können. Unter „chemisch synthetisiert", versteht man in Bezug auf ein Nukleinsäurefragment, dass die Nukleotidkomponenten in vitro assembliert wurden Die manuelle chemische Synthese von Nukleinsäurefragmenten kann unter Verwendung gut etablierter Verfahren erreicht werden, oder es kann eine automatisierte chemische Synthese unter Verwendung eines von einer Anzahl im Handel erhältlicher Geräte durchgeführt werden. Demzufolge können die Nukleinsäurefragmente zur optimalen Genexpression basierend auf der Optimierung der Nukleotidsequenz maßgeschneidert werden, um die Codon-Bias der Wirtszelle widerzuspiegeln. Der Fachmann erkennt die Likelihood einer erfolgreichen Genexpression, wenn der Codon-Usage auf die Codonen ausgerichtet ist, die vom Wirt bevorzugt werden. Die Bestimmung von bevorzugten Codonen kann auf einem Überblick über Gene basieren, die sich von der Wirtszelle herleiten, wo die Sequenzinformation verrfügbar ist.
Unter „Gen" versteht man ein Nukleinsäurefragment, das ein spezifisches Protein exprimiert, das vorangehende Regulatorsequenzen (5' nicht kodierende Sequenzen) und im Folgenden (3' nicht kodierende Sequenzen) der Kodierungssequenz einschließt. Unter „nativem Gen" versteht man ein Gen mit seinen eigenen Regulatorsequenzen wie es in der Natur vorkommt. Unter „endogenem Gen" versteht man ein natives Gen in seinem natürlichen Umfeld im Genom eines Organismus. Ein „Fremdgen" verweist auf ein Gen, das in der Regel nicht im Wirtsorganismus gefunden wird, das vielmehr durch Gentransfer in den Wirtsorganismus eingeführt wird. Fremdgene können native Gene, die in einen nicht nativen Organismus eingeführt werden, oder chimäre Gene umfassen. Ein „Transgen" stellt ein Gen dar, das mittels eines Transformationsverfahrens in das Genom eingeführt wurde.
Unter „Kodierungssequenz" versteht man eine Nukleotidsequenz, die für eine spezifische Aminosäuresequenz kodiert. Unter „Regulatorsequenzen" versteht man Nukleotidsequenzen, die sich stromaufwärts (5' nicht kodierende Sequenzen) in oder stromabwärts (3' nicht kodierende Sequenzen) von einer Kodierungssequenz befinden, und welche die Transkription, die RNA-Prozessierung oder die Stabilität, oder die Translation der assoziierten Kodierungssequenz beeinflussen. Regulatorsequenzen können Promotoren, Translationsleadersequenzen, Introne und Polyadenylierungs-Erkennungssequenzen einschließen.
„Promotor" verweist auf eine Nukleotidsequenz, die zur Kontrolle der Expression einer Kodierungssequenz oder funktionellen RNA fähig ist. Im Allgemeinen befindet sich eine Kodierungssequenz in 3' zu einer Promotorsequenz. Die Promotorsequenz besteht aus sich proximal und distaleren sich stromaufwärts befindenden Elementen, wobei auf die letzteren Elemente häufig als auf Enhancers verwiesen wird. Demzufolge stellt ein „Enhancer" eine Nukleotidsequenz dar, welche die Promotoraktivität stimulieren kann und bei der es sich um ein innates Element des Promotors oder ein heterologes Element, das zur Förderung des Spiegels oder der Gewebsspezifität eines Promotors insertiert wird, handeln kann. Promotoren können sich vollständig von einem nativen Gen herleiten oder sich aus verschiedenen Elementen zusammensetzen, die sich von verschiedenen in der Natur vorkommenden Promotoren herleiten, oder können sogar synthetische Nukleotidsegmente umfassen. Der Fachmann wird zur Kenntnis nehmen, dass verschiedene Promotoren die Expression eines Gens in verschiedene Gewebe oder Zelltypen, oder auf verschiedenen Entwicklungsstufen, oder als Response auf verschiedene Umweltbedingungen, richten können. Promotoren, die veranlassen, dass ein Nukleinsäurefragment in den meisten Zelttypen vornehmlich exprimiert wird, werden häufig als „konstitutive Promotoren" bezeichnet. Neue Promotoren von in Pflanzenzellen nützlichen verschiedenen Typen werden laufend entdeckt; zahlreiche Beispiele sind in der Aufstellung von Okamuro und Goldberg (1989) Biochemistry of Plants 15: 1–82, zu finden. Es wird weiter erkannt, dass Nukleinsäurefragmente von verschiedenen Längen eine identische Promotor-Aktivität aufweisen können, da in den meisten Fällen die genauen Grenzen von Regulatorsequenzen nicht vollständig definiert wurden.
Unter „Translationsleadersequenz" versteht man eine Nukleotidsequenz, die sich zwischen der Promotorsequenz eines Gens und der Kodierungssequenz befindet. Die Translationsleadersequenz liegt in der vollkommen prozessierten mRNA stromaufwärts von der Translationsstartsequenz vor. Die Translationsleadersequenz kann sich auf die Prozessierung des primären Transkripts zur mRNA, mRNA-Stabilität oder Translationseffizienz auswirken. Beispiele von Translationsleadersequenzen wurden beschrieben (Turner und Foster (1995) Mol. Biotechnol. 3: 225–236).
Unter „3' nicht kodierende Sequenzen" versteht man Nukleotidsequenzen, die sich stromabwärts von einer Kodierungssequenz befinden und Polyadenylierungs-Erkennungssequenzen und andere Sequenzen, kodierend Regulatorsignale, die zur Beeinflussung der mRNA-Prozessierung oder der Genexpression fähig sind, einschließen. Das Polyadenylierungssignal ist gewöhnlich dadurch gekennzeichnet, dass es sich auf die Poladenylsäure-Schwänze am 3'-Ende des mRNA-Vorläufers auswirkt. Die Verwendung von verschiedenen 3' nicht kodierenden Sequenzen wird von Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell 1: 671–680, erläutert.
„RNA-Transkript" verweist auf das Produkt, das sich aus der RNA-Polymerase-katalysierten Transkription einer DNA-Sequenz ergibt. Wenn das RNA-Transkript eine perfekte komplementäre Kopie der DNA-Sequenz darstellt, wird es als das primäre Transkript bezeichnet oder es kann eine RNA-Sequenz darstellen, die sich von der posttranskriptionalen Prozessierung des primären Transkripts herleitet und wird als mature RNA bezeichnet. Unter „Messenger-RNA (mRNA)" versteht man die RNA, die ohne Introne ist und die von der Zelle in Polypeptide translatiert werden kann. Unter „cDNA" versteht man eine DNA, die komplementär zu einem mRNA-Template ist und sich von einem mRNA-Template herleitet. Die cDNA kann einsträngig sein oder wird unter Verwendung von zum Beispiel dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I in die doppelsträngige Form umgewandelt. Unter „Sense-RNA" versteht man ein RNA-Transkript, das die mRNA einschließt, und deshalb von der Zelle in ein Polypeptid translatiert werden kann. Unter „Antisense-RNA" versteht man ein RNA-Transkript, das komplementär zum gesamten oder einem Teil eines primären Target-Transkript(s) oder zur mRNA ist und das die Expression eines Target-Gens blockiert (siehe US-Patent Nr. 5107065 , das hierin unter Bezugnahme inkorporiert ist). Die Komplementarität einer Antisense-RNA kann mit jedwedem Teil der spezifischen Nukleotidsequenz, d. h. an der 5' nicht kodierenden Sequenz, der 3' nicht kodierenden Sequenz, Intronen oder der Kodierungssequenz sein. Die „funktionelle RNA" verweist auf Sense-RNA, Antisense-RNA, Ribozym-RNA oder andere RNA, die gegebenenfalls nicht translatiert sein könnte, aber dennoch eine Wirkung auf die zellulären Vorgänge ausübt. Die Begriffe „Komplement" und „reverses Komplement" werden hierin in Bezug auf mRNA-Transkripte miteinander austauschbar verwendet und sollen die Antisense-RNA der Botschaft definieren.
Der Begriff „operativ verknüpft" verweist auf die Assoziation von Nukleinsäuresequenzen auf einem einzelnen Nukleinsäurefragment, damit die Funktion der einen von der anderen reguliert wird. So wird zum Beispiel ein Promotor operativ mit einer Kodierungssequenz verknüpft, wenn er fähig ist, die Expression von dieser Kodierungssequenz zu regulieren (d. h. dass sich die Kodierungssequenz unter der transkriptionalen Kontrolle des Promotors befindet). Kodierungssequenzen können operativ mit Regulatorsequenzen in einer Sense- oder Antisense-Orientierung verknüpft sein. In einem anderen Beispiel können die erfindungsgemäßen komplementären RNA-Regionen, entweder direkt oder indirekt, 5' mit der Target-mRNA, oder 3' mit der Target-mRNA, oder in der Target-mRNA, operativ verknüpft werden, oder eine erste komplementäre Region stellt 5' dar und ihr. Komplement stellt 3' bezogen auf die Target-mRNA dar.
Der Begriff „Expression", wie hierin verwendet, verweist auf die Transkription und stabile Akkumulation von Sense- (mRNA) oder Antisense-RNA, die sich vom erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragment herleitet. Expression kann auch auf die Translation von mRNA in ein Polypeptid verweisen. Unter „Antisense-Inhibition" versteht man die Produktion von Antisense-RNA-Transkripten, die zur Suppression der Expression des Targetproteins fähig sind. „Überexpression" verweist auf die Produktion eines Genprodukts in transgenen Organismen, die über die Produktionsmengen in normalen oder nicht transformierten Organismen hinausgeht. „Cosuppression" verweist auf die Produktion von Sense-RNA-Transkripten, die zur Suppression der Expression identischer Fremdgene oder im Wesentlichen ähnlichen Fremdgenen oder endogenen Genen fähig ist ( US-Patent Nr. 5231020 ).
Ein „Protein" oder „Polypeptid" stellt eine Kette von Aminosäuren dar, die in einer spezifischen Reihenfolge angeordnet sind, die von der Kodierungssequenz in einem Polynukleotid, kodierend das Polypeptid, bestimmt wird. Jedes Protein oder Polypeptid weist eine einzigartige Funktion auf.
„Veränderte Spiegel" oder „veränderte Expression" verweist auf die Produktion des Genprodukts/der Genprodukte in transgenen Organismen in Mengen oder Proportionen, die sich von denen von normalen oder nicht transformierten Organismen unterscheiden.
Unter „maturem Protein" oder dem Begriff „matur", wenn er zur Beschreibung eines Proteins verwendet wird, versteht man ein posttranslational prozessiertes Polypeptid; d. h. eines, aus dem jedwede Prä- oder Propeptide, die im primären Translationsprodukt anwesend sind, entfernt worden sind. „Vorläuferprotein" oder der Begriff „Vorläufer", wenn er zur Beschreibung eines Proteins verwendet wird, verweist auf das primäre Translationsprodukt von mRNA; d. h. wobei die Prä- und Propeptide noch anwesend sind. Prä- und Propeptide können gegebenenfalls auf intrazelluläre Lokalisierungssignale beschränkt sein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Unter einem „Chloroplasten-Transitpeptid" versteht man eine Aminosäuresequenz, die zusammen mit einem Protein translatiert wird und das Protein an den Chloroplast oder an andere Plastidtypen richtet, die in der Zelle, in der das Protein hergestellt wird, anwesend sind. „Chloroplasten-Transitsequenz" verweist auf eine Nukleotidsequenz, die ein Chloroplasten-Transitpeptid kodiert. Ein „Signalpeptid" stellt eine Aminosäuresequenz dar, die zusammen mit einem Protein translatiert wird und das Protein an das Sekretionssystem richtet (Chrispeels (1991) Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 42: 21–53). Wenn das Protein an eine Vakuole gerichtet werden soll, kann ferner ein vakuoläres Targetsignal (vorstehend) zugefügt werden, oder wenn es an das endoplasmatische Retikulum gerichtet ist, kann ein Retentionssignal im endoplasmatischen Retikulum (vorstehend) zugefügt werden. Wenn das Protein an den Nukleus gerichtet werden soll, sollte jedes anwesende Signalpeptid entfernt und anstelle dessen ein nukleäres Lokalisierungssignal eingeschlossen werden (Raikhel (1992) Plant Phys. 100: 1627–1632).
Unter „Transformation" versteht man den Transfer eines Nukleinsäurefragments in das Genom eines Wirtsorganismus, was in einer genetisch stabilen Vererbung resultiert. Auf Wirtsorganismen, die transformierte Nukleinsäurefragmente enthalten, wird als auf „transgene" Organismen verwiesen. Beispiele von Verfahren zur Pflanzentransformation schließen die Agrobacterium-vermittelte Transformation (De Blaere et al. (1987) Meth. Enzymol. 143: 277) und teilchenbeschleunigte oder „Gen-Gun"-Transformationstechnologie (Klein et al. (1987) Nature (London) 327: 70–73; US-Patent Nr. 4945050 , ein. Folglich können erfindungsgemäße isolierte Polynukleotide in rekombinante Konstrukte, in der Regel DNA-Konstrukte, die zur Einführung in eine und zur Replikation in einer Wirtszelle fähig sind, inkorporiert werden. Bei einem derartigen Konstrukt kann es sich um einen Vektor, der ein Replikationssystem einschließt, und Sequenzen, die zur Transkription und Translation einer Polypeptid kodierenden Sequenz in einer gegebenen Wirtszelle fähig sind, handeln. Eine Anzahl von Vektoren, die für eine stabile Transfektion von Pflanzenzellen oder für die Etablierung transgener Pflanzen geeignet sind, wurden z. B. in Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laborstory Manual, 1985, Supp. 1987; Weissbach und Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; und Flevin et al. Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990, beschrieben. Typische Pflanzen-Expressionsvektoren schließen zum Beispiel ein oder mehr klonierte(s) Pflanzengen(e) unter der transkriptionalen Kontrolle von 5'- und 3'-Regulatorsequenzen und einen dominant selektierbaren Marker ein. Solche Pflanzen-Expressionvektoren können auch eine Promotor-Regulatorregion (z. B. eine Regulatorregion, die induzierbare oder konstitutive Umgebungs- oder Entwicklungsregulierte oder die Zell- oder Gewebsspezifische Expression kontrolliert), einen Transkriptionsinitiierungsstartort, einen Ribosomenbindungsort, ein RNA-Prozessierungssignal, einen Transkriptionsterminierungsort und/oder ein Polyadenylierungssignal enthalten. Die standardmäßige rekombinante DNA und hierin verwendete molekulare Klonierungsverfahren sind im Stand der Technik weithin bekannt und sind ausführlicher in Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laborstory Manual; Cold Spring Harbor Laborstory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (hierin nachstehend „Maniatis") beschrieben.
Die „PCR" oder „Polymerasekettenreaktion" ist im Stand der Technik weithin als ein zur Amplifikation spezifischer DNA-Segmente verwendetes Verfahren bekannt ( US-Patente Nr. 4683195 und 4800159 ).
Die Begriffe „rekombinantes Konstrukt", „Expressionskonstrukt", „rekombinantes Expressionskonstrukt", „chimäres Konstrukt" und „chimäres Gen" werden hierin miteinander austauschbar verwendet. Ein derartiges Konstrukt kann selbst oder zusammen mit einem Vektor verwendet werden. Wird ein Vektor verwendet, dann ist die Wahl des Vektors, wie dem Fachmann bekannt sein wird, abhängig vom Verfahren, das zur Transformation von Wirtspflanzen verwendet wird. So kann zum Beispiel ein Plasmidvektor verwendet werden. Der Fachmann ist sich der genetischen Elemente bewusst, die auf dem Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen, die jedwede der erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsäurefragmente umfassen, erfolgreich zu transformieren, selektieren und propagieren. Der Fachmann wird auch erkennen, dass verschiedene unabhängige Transformationsereignisse verschiedene Expressionsspiegel und -muster ergeben (Jones et al., (1985) EMBO J. 4: 2411–2418; De Almeids et al., (1989) Mol. Gen. Genetics 218: 78–86), und dass mehrfache Ereignisse folglich gescreent werden müssen, um Linien zu erhalten, die den gewünschten Expressionsspiegel und das gewünschte Expressionsmuster aufweisen. Ein derartiges Screening kann mittels der Southem-DNA-Analyse, der Northem-RNA-Expressionsanalyse, der Westem-Proteinexpressionsanalyse oder der Phänotypanalyse erreicht werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes Polynukleotid, umfassend eine Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:

(a) einer ersten Nukleotidsequenz, kodierend ein Polypeptid, bei dem es sich um ein Cytochrom-P450-Enzym handelt, das mit der Synthese von Δ-12-Epoxyfettsäuren assoziiert ist, worin das Polypeptid eine mindestens 50%ige, 55%ige, 60%ige, 65%ige, 70%ige, 75%ige, 80%ige, 85%ige, 90%ige oder 95%ige Identität bezogen auf das Clustal-Alignmentverfahren aufweist, wenn es mit einem Polypeptid von SEQ ID NO:2 verglichen wird, oder
(b) einer zweiten Nukleotidsequenz, umfassend ein Komplement von der ersten Nukleotidsequenz.

Die erste Nukleotidsequenz umfasst bevorzugt eine Nukleinsäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus SEQ ID NO:1, die für das Polypeptid von SEQ ID NO:2 kodiert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist der Hinweis, dass die katalytische Aktivität, die für die Bildung von Epoxygruppen in Euphorbia lagascae verantwortlich ist, ein Enzym der Klasse der Cytochrom-P450-Monooxygenasen darstellt. Es besteht die Annahme, dass keines der Gene, das für diesen Aktivitätstyp kodiert, vor dieser Anmeldung charakterisiert wurde. Es wurde gezeigt, dass Epoxygenase-Aktivitäten von anderen Vemolsäure produzierenden Pflanzen sich vom Enzym von Euphorbia lagascae unterscheiden. Gene von Vernonia galamensis und Crepis palaestina wurden isoliert, und wenn sie in Pflanzen oder Hefe exprimiert werden, sind die kodierten Proteine fähig, Linolsäure in Vemolsäure umzuwandeln (Lee et al. (1998) Science 280: 915–918, und US-Patent Nr. 5846784 ). Im Gegensatz zum Enzym von Euphorbia lagascae sind diese Enzyme nicht Cytochrom-P450-abhängig, sondern sind vielmehr mit den im endoplasmatischen Retikulum lokalisierten Fettsäure-Desaturasen verwandt (PCT-Veröffentlichung Nr. WO 94/11516 , veröffentlicht am 26. Mai 1994). Diese Fettsäure epoxidierenden Enzyme sind scheinbar sequenzmäßig mit der Klasse von Membran-gebundenen Enzymen, die für die Fettsäuredesaturierung und Fettsäurehydroxylierung verantwortlich sind, verwandt (Broun, P. und Somerville, C. (1997) Plant Physiol. 113: 933–942). Deshalb gibt es zwei für Enzyme kodierende distinkte Klassen von Genen, die zur Bildung der Δ¹²-Epoxygruppe von Vemolsäure fähig sind: eine, die Cytochrom-P450-abhängig ist und die andere, die mit den Fettsäure-Desaturasen und -Hydroxylasen verwandt ist.
Es wurden Klone für drei verschiedene Cytochrom-P450-Enzyme unter ca. 1000 insgesamt exprimierten Sequenz-Tags (ESTs), die aus einer cDNA-Bibliothek von einem sich entwickelnden Samen von E. lagascae generiert wurden. Einer der Klone, eellc.pk002.i4, wurde hinter einem GALI-Promotor in einem Hefestamm (Saccharomyces cerevisiae) exprimiert, der eine Pflanzen-Cytochrom-P450-Reduktase in sein Genom integriert enthält. Die Zellen wurden mit exogener Linolsäure (18:2) bereitgestellt, von der angenommen wird, dass es sich um das Fettsäuresubstrat für die Vernolsäure-Synthese handelt. In bei 28°C aufrechterhaltenen Kulturen wurde Vemolsäure in Mengen von 1 bis 5 Gew.-% bezogen auf die Gesamtfettsäure nachgewiesen. Diese Fettsäure wird in der Regel nicht in Saccharomyces cerevisiae nachgewiesen. Die Anwesenheit von Vernolsäure in Zellen, die eellc.pk002.i4 exprimieren, wurde mittels der GC-MS-Analyse von Fettsäuremethylestem, die entweder durch basische (Natriummethoxid) oder saure (Schwefelsäure/Methanol) Umesterungsverfahren hergestellt wurden, nachgewiesen. Dieser Befund ist konsistent mit der Beteiligung eines Cytochrom-P450-Enzyms (entsprechend eellc.pk002.i4) an der Vernolsäuresynthese in Samen von Euphorbia lagascae.
Es wird angenommen, dass es sich hierbei um die erste Charakterisierung eines Pflanzengens handelt, das für ein Enzym der Cytochrom-P450-Klasse kodiert, das zur Produktion von Δ¹²-epoxidierten Fettsäuren fähig ist.
Nukleinsäurefragmente, kodierend mindestens einen Anteil von mehreren mit der Synthese von Pflanzen-Δ¹²-Epoxyfettsäuren assoziierten Cytochrom-P450-Enzymen wurden isoliert und durch Vergleich von Pflanzen-cDNA-Sequenzen nach dem Zufallsprinzip mit öffentlichen Datenbanken, die Nukleotid- und Proteinsequenzen enthalten, unter Verwendung der dem Fachmann gut bekannten BLAST-Algorithmen, identifiziert. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragmente können zum Isolieren von cDNAs und Genen, kodierend für homologe Proteine aus den gleichen oder anderen Pflanzenspezies verwendet werden. Die Isolierung homologer Gene unter Verwendung Sequenzabhängiger Protokolle ist im Stand der Technik weithin bekannt. Beispiele Sequenzabhängiger Protokolle schließen die folgenden ein, sind aber nicht beschränkt auf Verfahren der Nukleinsäurehybridisierung und DNA- und RNA-Amplifikationsverfahren, wie durch verschiedene Einsätze der Nukleinsäure-Amplifikationstechnologien (z. B. der Polymerasekettenreaktion und Ligasekettenreaktion) erläutert wird.
Zum Beispiel könnten Gene, kodierend für eine andere Pflanzen-Epoxygenase, entweder als cDNAs oder genomische DNAs, unter Verwendung der gesamten oder einem Anteil der vorliegenden Nukleinsäurefragmente als DNA-Hybridisierungssonden zum Screening von Bibliotheken von jedweder gewünschten Pflanze, welche die dem Fachmann bekannte Methodik einsetzt, direkt isoliert werden. Spezifische Oligonukleotidsonden, basierend auf den vorliegenden Nukleinsäuresequenzen, können anhand von im Stand der Technik bekannten Verfahren konzipiert und synthetisiert werden (Maniatis). Überdies kann die gesamte Sequenz direkt zum Synthetisieren von DNA-Sonden anhand vom Fachmann bekannten Verfahren, wie zum Beispiel des Random Primer DNA Labeling, der Nick-Translation, der Endmarkierungsverfahren oder RNA-Sonden unter Verwendung von zur Verfügung stehenden in vitro-Transkriptionssystemen verwendet werden. Spezifische Primer können außerdem zum Amplifizieren eines Teils der oder der gesamten vorliegenden Sequenzen konzipiert und verwendet werden. Die sich ergebenden Amplifikationsprodukte können während der Amplifikationsreaktionen direkt markiert oder nach den Amplifikationsreaktionen markiert und als Sonden zum Isolieren von cDNA der vollen Länge oder genomischen Fragmenten unter Bedingungen einer angemessenen Stringenz verwendet werden.
Es können außerdem zwei kurze Segmente der vorliegenden Nukleinsäurefragmente in Polymerasekettenreaktionsprotokollen zum Amplifizieren längerer Nukleinsäurefragmente, die für homologe Gene von DNA oder RNA kodieren, verwendet werden. Die Polymerasekettenreaktion kann auch an einer Bibliothek von klonierten Nukleinsäurefragmenten durchgeführt werden, worin sich die Sequenz von einem Primer von den vorliegenden Nukleinsäurefragmenten herleitet, und die Sequenz des anderen Primers sich die Anwesenheit der Polyadenylsäure-Schwänze am 3'-Ende des mRNA-Vorläufers, kodierend für Pflanzengene, zunutze macht. Als Alternative kann die zweite Primersequenz auf Sequenzen basieren, die sich vom Klonierungsvektor herleiten. So kann zum Beispiel der Fachmann das RACE-Protokoll (Frohman et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998–9002) zum Generieren von cDNAs unter Verwendung der PCR zum Amplifizieren von Kopien von der Region zwischen einem einzelnen Punkt im Transkript und dem 3'- oder 5'-Ende befolgen. In den 3'- und 5'-Richtungen orientierte Primer können aus den vorliegenden Sequenzen konzipiert werden. Unter Verwendung von im Handel erhältlichen 3'-RACE- oder 5'-RACE-Systemen (BRL) können spezifisch 3'- oder 5'-cDNA-Fragmente isoliert werden (Ohara et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5673–5677; Loh et al. (1989) Science 243: 217–220). Anhand der 3'- und 5'-RACE-Verfahren generierte Produkte können zum Generieren von cDNAs voller Länge kombiniert werden (Frohman und Martin (1989) Techniques 1:165). Folglich können ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleotidsequenz von mindestens einem von 60 (bevorzugt von einem von mindestens 40, am bevorzugtesten einem von mindestens 30) angrenzenden Nukleotiden, die sich von einer Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1 herleiten, und das Komplement von solchen Nukleotidsequenzen in solchen Verfahren zum Erhalt eines Nukleinsäurefragments, kodierend für einen wesentlichen Anteil einer Aminosäuresequenz eines Polypeptids, verwendet werden.
Die Patentschrift offenbart ein Verfahren zum Erhalt eines Nukleinsäurefragments, das für einen wesentlichen Anteil eines Pflanzen-Epoxygenase-Polypeptids, bevorzugt einen wesentlichen Anteil eines Pflanzen-Epoxygenase-Polypeptids kodiert, umfassend die Schritte von: Synthetisieren eines Oligonukleotid-Primers, umfassend eine Nukleotidsequenz von mindestens einem von 60 (bevorzugt mindestens einem von 40, am bevorzugtesten mindestens einem von 30) angrenzenden Nukleotiden, die sich von einer Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1 und dem Komplement von solchen Nukleotidsequenzen herleiten; und Amplifizieren eines Nukleinsäurefragments (bevorzugt einer in einem Klonierungsvektor insertierten cDNA) unter Verwendung des Oligonukleotid-Primers. Das amplifizierte Nukleinsäurefragment kodiert bevorzugt einen Anteil eines Pflanzen-Epoxygenase-Polypeptids.
Die Verfügbarkeit des vorliegenden Nukleotids und der abgeleiteten Aminosäuresequenzen fördert das immunologische Screening der cDNA-Expressionsbibliotheken. Synthetische Peptide, die Anteile der vorliegenden Aminosäuresequenzen darstellen, können synthetisiert werden. Diese Peptide können zum Immunisieren von Tieren zur Herstellung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper mit Spezifität für Peptide oder Proteine, die die Aminosäuresequenzen umfassen, verwendet werden. Diese Antikörper können dann zum Screening von cDNA-Expressionsbibliotheken zum Isolieren von cDNA-Klonen voller Länge von Interesse verwendet werden (Lemer (1984) Adv. Immunol. 36: 1–34; Maniatis).
Eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft Wirtszellen, umfassend entweder die erfindungsgemäßen chimären Gene, wie hierin beschrieben, oder ein erfindungsgemäßes isoliertes Polynukleotid wie hierin beschrieben. Beispiele von Wirtszellen, die zur praktischen Ausführung der Erfindung verwendet werden können, schließen folgende ein, sind aber nicht beschränkt auf Hefe, Bakterien und Pflanzen.
Wie vorstehend angemerkt wurde, können die erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragmente zum Herbeiführen transgener Pflanzen verwendet werden, worin die offenbarten Polypeptide bei höheren oder niedrigeren Spiegeln als normal oder in Zelltypen oder Entwicklungsstufen vorliegen, in denen sie in der Regel nicht gefunden werden. Dies würde den Effekt der Veränderung der Fettsäurespiegel, die Epoxidgruppen in diesen Zellen enthalten, aufweisen.
Die Überexpression der erfindungsgemäßen Proteine kann durch zunächst das Konstruieren eines chimären Gens erreicht werden, worin die Kodierungsregion operativ mit einem Promotor verknüpft ist, der zum Richten der Expression eines Gens in den gewünschten Geweben auf der gewünschten Entwicklungsstufe fähig ist. Das chimäre Gen kann Promotor-Sequenzen und Translationsleadersequenzen, die sich von den gleichen Genen herleiten, umfassen. 3' nicht kodierende Sequenzen, kodierend Transkriptionsterminierungssignale können auch bereitgestellt werden. Das vorliegende chimäre Gen kann zur Förderung der Genexpression auch ein oder mehr Intron(e) umfassen.
Plasmidvektoren, umfassend das vorliegende isolierte Polynukleotid (oder chimäre Gen), können konstruiert werden. Die Wahl des Plasmidvektors ist abhängig von dem zur Transformation von Wirtspflanzen verwendeten Verfahren. Der Fachmann kennt die genetischen Elemente, die auf einem Plasmidvektor vorliegen müssen, um die das chimäre Gen enthaltenden Wirtszellen erfolgreich zu transformieren, selektieren und propagieren. Der Fachmann wird auch erkennen, dass verschiedene unabhängige Transformationsereignisse zu verschiedenen Expressionsspiegeln und -mustern führen (Jones et al. (1985) EMBO J. 4: 2411–2418; De Almeids et al. (1989) Mol. Gen. Genetics 218: 78–86) und dass folglich mehrfache Ereignisse gescreent werden müssen, um Linien zu erhalten, die den gewünschten Expressionsspiegel und das gewünschte Expressionsmuster aufweisen. Ein derartiges Screening kann mittels der Southern-DNA-Analyse, der Northern-mRNA-Expressionsanalyse, der Western-Proteinexpressionsanalyse oder der Phänotypanalyse erreicht werden.
Für einige Applikationen könnte es gegebenenfalls nützlich sein, das vorliegende Polypeptid an verschiedene Zellkompartimente zu richten, oder um seine Sekretion aus der Zelle zu fördern. Es wird folglich daran gedacht, dass das vorstehend beschriebene chimäre Gen durch Richten der Kodierungssequenz zum Kodieren des vorliegenden Polypeptids mit geeigneten intrazellulären Targetsequenzen, wie zum Beispiel Transitsequenzen (Keegstra (1989) Cell 56: 247–253), Signalsequenzen oder Sequenzen, kodierend für die Lokalisierung im endoplasmatischen Retikulum (Chrispeels (1991) Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 42: 21–53) oder nukleäre Lokalisierungssignale (Raikhel (1992) Plant Phys. 100: 1627–1632) mit oder ohne Entfernung von Targetsequenzen, die bereits vorliegen, weiter supplementiert werden kann. Während die angegebenen Referenzen Beispiele von jedem von diesen geben, ist die Liste nicht erschöpfend, und es könnten künftig gegebenenfalls mehr nützliche Targetsignale entdeckt werden.
Die Reduktion oder Elimination der Expression von Genen, die für vorliegende Polypeptide in Pflanzen für einige Applikationen kodieren, könnten auch wünschenswert sein. Um dies zu erreichen, kann ein chimäres Gen, das zur Coexpression des vorliegenden Polypeptids bestimmt ist, durch Verknüpfung eines Gens oder Genfragments, das für dieses Polypeptid an Pflanzen-Promotorsequenzen kodiert, konstruiert werden. Als Alternative kann ein chimäres Gen, das zur Expression von Antisense-RNA für alle oder einen Teil des vorliegenden Nukleinsäurefragments bestimmt ist, durch Verknüpfung des Gens oder Genfragments in reverser Orientierung mit den Pflanzen-Promotorsequenzen konstruiert werden. Entweder die chimären Cosuppressions-Gene oder die chimären Antisense-Gene könnten über die Transformation in Pflanzen eingeführt werden, worin die Expression der entsprechenden endogenen Gene reduziert oder eliminiert wird.
Die molekulargenetischen Lösungen zur Generierung von Pflanzen mit veränderter Genexpression weisen einen entschiedenen Vorteil gegenüber den üblicheren Pflanzenzüchtungsansätzen auf. Änderungen der Pflanzenphänotypen können spezifisch durch die Inhibition der Expression von einem oder mehr Gen(en) durch die Antisense-Inhibition oder -Cosuppression produziert werden ( US-Patente Nr. 5190931 , 5107065 und 5283323 ). Ein Antisense- oder Cosuppressionskonstrukt würde als ein dominant negativer Regulator der Genaktivität wirken. Während übliche Mutationen eine negative Regulation der Genaktivität ergeben können, sind diese Wirkungen sehr wahrscheinlich rezessiv. Die bei einem transgenen Ansatz zur Verfügung stehende dominante negative Regulation kann von der Züchtungsperspektive her gesehen vorteilhaft sein. Zusätzlich kann die Fähigkeit hinsichtlich der Restriktion der Expression eines spezifischen Phänotyps auf die reproduktiven Gewebe der Pflanze durch die Verwendung von gewebespezifischen Promotoren agronomische Vorteile in Bezug auf übliche Mutationen verleihen, die eine Wirkung in allen Geweben aufweisen können, in denen ein Mutantengen gewöhnlich exprimiert wird.
Dem Fachmann wird bekannt sein, dass mit der Verwendung von Antisense- oder Cosuppressionstechnologien spezielle Erwägungen assoziiert sind, um die Expression bestimmter Gene zu reduzieren. So kann zum Beispiel der ordnungsgemäße Expressionsspiegel von Sense- oder Antisense-Genen die Verwendung verschiedener chimärer Gene, die sich verschiedene dem Fachmann bekannte Regulatorelemente zunutze machen, erforderlich sein. Sobald mithilfe von einem der vorstehend beschriebenen Verfahren transgene Pflanzen erhalten werden, ist es notwendig, individuelle Transgene auf diejenigen zu screenen, die den gewünschten Phänotyp am wirksamsten aufweisen. Demgemäß wird der Fachmann Screening-Verfahren für eine große Anzahl an Transformanten entwickeln. Die Art dieser Screens wird im Allgemeinen aus praktischen Gründen gewählt. So kann man zum Beispiel screenen, indem man auf Änderungen der Genexpression unter Verwendung von Antikörpern, die für das Protein spezifisch sind, das von dem zu unterdrückenden Gen kodiert ist, achtet; oder man könnte Assays etablieren, die spezifisch die Enzymaktivität messen. Ein bevorzugtes Verfahren stellt eines dar, das die schnelle Prozessierung einer großen Anzahl von Proben erlaubt, da erwartet wird, dass eine große Anzahl an Transformanten für diesen gewünschten Phänotyp negativ ist.
Ein Polypeptid (oder Anteile davon) kann in heterologen Wirtszellen, insbesondere in den Zellen mikrobieller Wirte produziert werden, und kann zur Herstellung von Antikörpern gegen dieses Protein mittels dem Fachmann bekannter Verfahren verwendet werden. Die Antikörper sind zum Nachweis des erfindungsgemäßen Polypeptids in situ in Zellen oder in vitro in Zellextrakten nützlich. Bevorzugte heterologe Wirtszellen zur Herstellung des vorliegenden Polypeptids stellen mikrobielle Wirte dar. Mikrobielle Expressionssysteme und Expressionsvektoren, enthaltend Regulatorsequenzen, die hohe Expressionsspiegel von Fremdproteinen richten, sind dem Fachmann überall bekannt. Jedwede von diesen wären zum Konstruieren eines chimären Gens zur Herstellung eines Polypeptids verwendbar. Dieses chimäre Gen könnte dann über die Transformation in geeignete Mikroorganismen eingeführt werden, um hohe Expressionsspiegel der kodierten Cytochrom-P450-Enzyme bereitzustellen, die mit der Synthese von Pflanzen-Δ¹²-Epoxyfettsäuren assoziiert sind. Ein Beispiel eines Vektors für hohe Expressionsspiegel des vorliegenden Polypeptids in einem Bakterienwirt wird bereitgestellt (Beispiel 6).
Alle oder ein wesentlicher Anteil der erfindungsgemäßen Polynukleotide können auch als Sonden zur genetischen oder physikalischen Kartierung der Gene verwendet werden, so dass sie als ein Teil von und als Marker für mit diesen Genen verknüpften Merkmalen verwendet werden können. Solche Informationen können in der Pflanzenzucht zur Entwicklung von Linien mit den gewünschten Phänotypen nützlich sein. So können zum Beispiel vorliegende Nukleinsäurefragmente als Marker des Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) verwendet werden. Southem-Blots (Maniatis) von restriktionsverdauter Pflanzen-genomischer DNA können mit erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragmenten sondiert werden. Die sich ergebenden Bandingmuster können dann genetischen Analysen unter Verwendung von Computer-Programmen, wie zum Beispiel MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181) unterzogen werden, um eine genetische Karte zu konstruieren. Außerdem können die erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragmente zum Sondieren der Southern-Blots, enthaltend mit Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs von einem Set von Individuen, die Eltern und Nachkommen einer definierten genetischen Kreuzung darstellen, verwendet werden. Die Segregation des DNA-Polymorphismus wird notiert und zur Berechung der Position der vorliegenden Nukleinsäuresequenz in der zuvor erhaltenen genetischen Karte unter Verwendung dieser Population verwendet (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
Die Herstellung und Verwendung von sich von Pflanzengenen herleitenden Sonden zur Verwendung bei der genetischen Kartierung wird in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Zahlreiche Publikationen beschreiben die genetische Kartierung spezifischer cDNA-Klone unter Verwendung der vorstehend dargelegten Methodik oder Variationen davon. Zur Kartierung können zum Beispiel F2-Artenkreuzungspopulationen, Rückkreuzungspopulationen, zufällig gekreuzte Populationen, nahezu isogene Linien und andere Sets von Individuen verwendet werden. Solche Methodiken sind dem Fachmann überall bekannt.
Sich von den vorliegenden Nukleinsäuresequenzen herleitende Nukleinsäuresonden können auch zur physikalischen Kartierung (d. h. zur Platzierung von Sequenzen auf physikalischen Karten verwendet werden; siehe Hoheisel et al. in: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346, und hierin angegebenen Referenzen).
Sich von den vorliegenden Nukleinsäuresequenzen herleitende Nukleinsäuresonden können bei der direkten Kartierung anhand der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) verwendet werden (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154). Obwohl aktuelle Verfahren zur FISH-Kartierung die Verwendung großer Klone (mehrere bis mehrere Hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20) bevorzugen, können Verbesserungen hinsichtlich der Empfindlichkeit die Durchführung der FISH-Kartierung unter Verwendung von kürzeren Sonden erlauben.
Viele verschiedene auf der Nukleinsäure-Amplifikation basierende Verfahren der genetischen und physikalischen Kartierung können unter Verwendung vorliegender Nukleinsäuresequenzen durchgeführt werden. Beispiele schließen folgende ein: die allelespezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med. 11: 95–96), den Polymorphismus von PCR-amplifizierten Fragmenten (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), die allelespezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotid-Extensionsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Bestrahlungshybrid-Kartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy Mapping (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Für diese Verfahren wird die Sequenz eines Nukleinsäurefragments zum Design und Herstellen von Primerpaaren zur Verwendung in der Amplifikationsreaktion oder in Primer-Extensionsreaktionen verwendet. Das Design solcher Primer ist dem Fachmann gut bekannt. In Verfahren, welche die auf der PCR basierende genetische Kartierung einsetzen, kann es notwendig sein, die DNA-Sequenzunterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in der Region, die der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht, zu identifizieren. Dies ist jedoch im Allgemeinen für Kartierungsverfahren nicht notwendig.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur Auswahl eines isolierten Polynukleotids, das sich auf den Spiegel von Δ¹²-Epoxyfettsäuren in einer geeigneten Wirtszelle auswirkt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Herstellen eines isolierten Polynukleotids, umfassend die erfindungsgemäße Polynukleotidsequenz, (b) Einführen des isolierten Polynukleotids in eine geeignete Wirtszelle und (c) Bestimmen der An- oder Abwesenheit von Δ¹²-Epoxyfettsäuren in der transformierten Wirtszelle von (b).
Eine noch andere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Δ¹²-Epoxyfettsäuren in einer geeigneten Wirtszelle, das Folgendes umfasst: a) Transformieren einer geeigneten Wirtszelle mit dem erfindungsgemäßen chimären Konstrukt, (b) Züchten der transformierten Wirtszellen von Schritt (a), und (c) Bestimmen der An- oder Abwesenheit von Δ¹²-Epoxyfettsäuren in den transformierten Zellen von (b).
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung ist in den folgenden Beispielen weiter definiert, worin – sofern nicht anderweitig angegeben wird – Teile und Prozente Gewichtsteile bzw. Gewichtsprozente und die Grade Grad Celsius darstellen. Man sollte zur Kenntnis nehmen, dass diese Beispiele, während sie die bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen angeben, lediglich als Erläuterung gegeben sind. Aus der vorstehenden Besprechung und diesen Beispielen, kann der Fachmann die wesentlichen erfindungsgemäßen Merkmale ermitteln und kann, ohne aus dem Gedanken und dem Umfang davon zu kommen, verschiedene Änderungen und Modifikationen an der Erfindung vornehmen, um sie an verschiedene Verwendungszwecke und Bedingungen anzupassen. Folglich wird der Fachmann verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu den hierin gezeigten und beschriebenen aus der vorstehenden Beschreibung erkennen.
BEISPIEL 1
Zusammensetzung der cDNA-Bibliotheken: Isolierung und Sequenzierung von cDNA-Klonen

Es wurde eine cDNA-Bibliothek, die mRNAs aus dem Samen von Euphorbia lagascae darstellt, hergestellt. Die Merkmale der Bibliothek werden nachstehend beschrieben. TABELLE 2 cDNA-Bibliothek von Euphorbia lagascae

Bibliothek	Gewebe	Klon
eellc	Sich entwickelnder Samen von Euphorbia lagascae, die ein putatives Cytochrom-P450 enthalten könnten, das an der Epoxyfettsäure-Synthese beteiligt ist	eellc.pk002.i4

cDNA-Bibliotheken können durch irgendeines von vielen zur Verfügung stehenden Verfahren hergestellt werden. So können die cDNAs zum Beispiel in Plasmidvektoren eingeführt werden, indem zuerst die cDNA-Bibliotheken in Uni-ZAP^TM XR-Vektoren gemäß der Anleitung des Herstellers hergestellt werden (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). Die Uni-ZAP^TM XR-Bibliotheken werden gemäß der von Stratagene bereitgestellten Anleitung in Plasmidbibliotheken umgewandelt. Nach der Umwandlung sind die cDNA-Inserts im Plasmidvektor pBluescript enthalten. Außerdem können die cDNAs unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) direkt in die vorgeschnittenen Bluescript II SK(+)-Vektoren (Stratagene) eingeführt werden, gefolgt von der Transfektion in DH10B-Zellen gemäß der Anleitung des Herstellers (GIBCO BRL Produkte). Sobald sich die cDNA-Inserts in den Plasmidvektoren befinden, werden die Plasmid-DNAs aus nach dem Zufallsprinzip gewählten Bakterienkolonien hergestellt, die rekombinante pBluescript-Plasmide enthalten, oder die Insert-cDNA-Sequenzen werden über die Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von Primem, die für Vektorsequenzen spezifisch sind, die die insertierten cDNA-Sequenzen flankieren, amplifiziert. Amplifizierte Insert-DNAs oder Plasmid-DNAs werden in Dye-Primer Sequenzierungsreaktionen sequenziert, um partielle cDNA-Sequenzen (exprimierte Sequenz-Tags oder „ESTs"; siehe Adams et al. (1991) Science 252: 1651–1656) zu generieren. Die sich ergebenden ESTs werden unter Verwendung eines Fluoreszenz-Sequenzierers, Modell 377, von Perkin Elmer analysiert.
Full-Insert-Sequenzdaten (FIS-Daten) werden unter Verwendung eines modifizierten Transpositionsprotokolls generiert. Die für FIS identifizierten Klone werden aus archivierten Glycerolstocks als Einzelkolonien zurückgewonnen, und die Plasmid-DNAs werden über die alkalische Lyse isoliert. Die isolierten DNA-Templates werden mit dem Vektor, der mit M13-Vorwärts- und Rückwärts-Oligonukleotiden geprimt ist, in einer auf PCR-basierenden Sequenzierungsreaktion zur Reaktion gebracht und auf automatisierte Sequenzierer geladen. Die Bestätigung der Klonidentifikation wird mittels Sequenz-Alignment mit der originalen EST-Sequenz, von der die FIS-Abfrage vorgenommen wird, durchgeführt.
Bestätigte Templates werden über das Primer Island-Transposition-Kit (PE Applied Biosystems, Foster City, CA), das auf dem Tyl-transponierbaren Element von Saccharomyces cerevisiae basiert (Devine und Boeke (1994) Nucleic Acids Res. 22: 3765–3772), transponiert. Das in vitro-Transpositionsystem platziert nach dem Zufallsprinzip einzigartige Bindungsstellen überall durch eine Population großer DNA-Moleküle. Die transponierte DNA wird dann zum Transformieren elektrokompetenter DH10B-Zellen (Gibco BRL/Life Technologies, Rockville, MD) über Elektroporation verwendet. Das transponierbare Element enthält einen zusätzlichen selektierbaren Marker (bezeichnet als DHFR; Fling und Richards (1983) Nucleic Acids Res. 11: 5147–5158), der die zweifache Selektion auf Agarplatten von nur den Subklonen zulässt, die das integrierte Transposon enthalten. Multiple Subklone werden zufällig aus jeder Transpositionsreaktion ausgewählt, die Plasmid-DNAs werden über die alkalische Lyse hergestellt und die Templates werden nach außen vom Transpositionsereignisort sequenziert (ABI Prism Dye-Terminator Ready Reaction Mix), wobei einzigartige Primer eingesetzt werden, die für die Bindungsstellen im Transposon spezifisch sind.
Die Sequenzdaten werden erhoben (ABI Prism-Datenerhebungen) und unter Verwendung von Phred/Phrap assembliert (P. Green, University of Washington, Seattle). Phred/Phrap stellt ein Software-Programm in der öffentlichen Domäne dar, das die ABI-Sequenzdaten wiederholt liest, die Basen abruft, Qualitätswerte zuordnet und die Basecalls und Qualitätswerte in editierbare Ausgabedateien schreibt. Das Phrap-Sequenz-Assemblierprogramm verwendet diese Qualitätswerte, um die Genauigkeit der assemblierten Sequenz-Contigs zu erhöhen. Assemblierungen werden durch den Consed Sequenz-Editor betrachtet (D. Gordon, University of Washington, Seattle).
BEISPIEL 2
Identifikation von cDNA-Klonen
cDNA-Klone, die für Cytochrom-P450-Enzyme kodieren, die mit der Synthese von PflanzenΔ-12-Epoxyfettsäuren assoziiert sind, wurden wie folgt identifiziert: mittels Durchführung von Suchen mit BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al. (1993) J. Mol. Biol. 215: 403–410; siehe auch www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) nach Ähnlichkeit mit in der BLAST-„nr"-Datenbank enthaltenen Sequenzen, (umfassend alle nicht redundanten GenBank CDS-Translationen, sich von der dreidimensionalen Struktur herleitende Sequenzen von der Brookhaven Protein-Datenbank, die letzte bedeutende Freigabe von der SWISS-PROT-Proteinsequenz-Datenbank, EMBL- und DDBJ-Datenbanken). Die in Beispiel 1 erhaltenen cDNA-Sequenzen wurden auf Ähnlichkeit mit allen öffentlich verfügbaren DNA-Sequenzen, die in der „nr"-Datenbank enthalten sind, unter Verwendung des BLASTN-Algorithmus, der vom National Center for Biotechnology Information (NCBI) bereitgestellt wurde, analysiert. Die DNA-Sequenzen wurden in alle Leserahmen translatiert und auf Ähnlichkeit mit allen öffentlich verfügbaren Proteinsequenzen, die in der „nr"-Datenbank enthalten sind, unter Verwendung des vom NCBI bereitgestellten BLASTX-Algorithmus (Gish und States (1993) Nat. Genet. 3: 266–272) verglichen. Aus Zweckmäßigkeitsgründen wird der P-Wert (Wahrscheinlichkeit) der Beobachtung eines Match von einer cDNA-Sequenz mit einer Sequenz, die in den durchsuchten Datenbanken lediglich durch Zufall, wie mittels BLAST berechnet, enthalten ist, hierin als „pLog"-Werte berichtet, die den negativen Wert des Logarithmus des berichteten P-Werts darstellen. Demzufolge gilt, dass je größer der pLog-Wert, um so größer ist die Likelihood, dass die cDNA-Sequenz und der BLAST „Hit" homologe Proteine darstellen.
Zur Analyse vorgelegte ESTs werden mit der Genbank-Datenbank wie vorstehend beschrieben verglichen. ESTs, die Sequenzen mehr in 5' oder 3' enthalten, können unter Verwendung des BLASTn-Algorithmus gefunden werden (Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 23: 3389–3402) gegenüber der systemgebundenen DuPont-Datenbank, die Nukleotidsequenzen vergleicht, die sich gemeinsame oder überlappende Regionen der Sequenz-Homologie teilen. Wenn gemeinsame oder überlappende Sequenzen zwischen zwei oder mehr Nukleinsäurefragmenten existieren, können die Sequenzen zu einer einzelnen angrenzenden Nukleotidsequenz assembliert werden, wobei sie folglich das Originalfragment in entweder der 5'- oder 3'-Richtung verlängern. Sobald das EST am meisten in 5' identifiziert wird, kann seine komplette Sequenz durch die in Beispiel 1 beschriebene Full-Insert-Sequenzierung bestimmt werden. Homologe Gene, die verschiedenen Spezies angehören, können durch Vergleich der Aminosäuresequenz eines bekannten Gens (aus entweder einer systemgebundenen Quelle oder einer öffentlichen Datenbank) gegenüber einer EST-Datenbank unter Verwendung des tBLASTn-Algorithmus ermittelt werden. Der tBLASTn-Algorithmus durchsucht eine Aminosäureabfrage gegen eine Nukleotid-Datenbank, die in alle 6 Leserahmen translatiert wird. Diese Suche lässt Unterschiede in der Codon-Usage des Nukleotids zwischen verschiedenen Spezies und für Codon-Degeneriertheit zu.
BEISPIEL 3
Charakterisierung von cDNA-Klonen, codierend für Pflanzen-Epoxygenasen
Die BLASTX-Suche unter Verwendung der EST-Sequenzen aus in Tabelle 3 aufgelisteten Klonen ließ eine Ähnlichkeit der Polypeptide, kodiert durch die cDNAs an einem Cytochrom-P450-hämhaltigen Polypeptid erkennen, das an fungalen Inkompatibilitätsinteraktionen von Paprika (Capsicum annuum, NCBI, allgemeine Identifikationsnummer gi 6739506) beteiligt ist. In Tabelle 3 ersichtlich sind die BLAST-Ergebnisse für die Sequenz des gesamten cDNA-Inserts, umfassend den angezeigten cDNA-Klon („FIS"), der auch die komplette Gensequenz für eine Euphorbia-Epoxygenase umfasst: TABELLE 3 BLAST-Ergebnisse für Sequenzen, kodierend für Polypeptide mit Pflanzen-Epoxyoxygenase-Aktivität

Klon Status BLAST pLog-Score 6739506

eellc.pk002.i4 FIS 122,00
1 stellt ein Alignment der in SEQ ID NO:2 dargelegten Aminosäuresequenz und der Paprika-Sequenz (SEQ ID NO:3) dar. Die in Tabelle 4 ersichtlichen Daten stellen eine Berechnung der Identität (%) der in SEQ ID NO:2 dargelegten Aminosäuresequenzen und der Sequenz von Paprika (Capsicum annuum) (SEQ ID NO:3) dar. TABELLE 4 Identität (%) von Aminosäuresequenzen, abgeleitet von den Nukleotidsequenzen von cDNA-Klonen, kodierend für Polyptide mit Pflanzen-Epoxygenase-Aktivität

SEQ ID NO: Identität (%) mit 6739506

2 40,4 %
Berechnungen der Sequenz-Alignments und Identität (%) wurden unter Verwendung des Megalign-Programms der LASERGENE-Bioinformatik-Software-Suite (DNASTAR Inc., Madison, WI) durchgeführt. Es wurde ein multiples Alignment der Sequenzen unter Verwendung des Clustal-Alignmentverfahrens (Higgins und Sharp (1989) CABIOS. 5: 151–153) mit den Standardparametem (GAP PENALTY = 10, GAP LENGTH PENALTY = 10) durchgeführt. Bei den Standardparametern für paarweise Alignments unter Verwendung des Clustal-Verfahrens handelte es sich um KTUPLE 1, GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 und DIAGONALS SAVED = 5. Die Sequenz-Alignments und BLAST-Scores und Wahrscheinlichkeiten weisen darauf hin, dass die Nukleinsäurefragmente, umfassend die vorliegenden cDNA-Klone, einen wesentlichen Anteil einer Pflanzen-Epoxygenase kodieren. Diese Sequenzen stellen die ersten Cytochrom-P450-Sequenzen dar, die für ein Enzym kodieren, das mit der dem Anmelder bekannten Δ¹²-Epoxygruppenbildung in Pflanzen assoziiert ist.
BEISPIEL 4
Expression chimärer Gene in monokotylen Zellen
Ein chimäres Gen, das eine cDNA umfasst, die für das vorliegende Polypeptid in Sense-Orientierung in Bezug auf den Mais-Zein-Promotor (27 kD) kodiert, der sich in 5' zum cDNA-Fragment befindet, und das 3'-Ende von Zein (10 kD) sich in 3' zum cDNA-Fragment befindet, kann konstruiert werden. Das cDNA-Fragment dieses Gens kann durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) des cDNA-Klons unter Verwendung geeigneter Oligonukleotid-Primer generiert werden. Die Klonierungsstellen (NcoI oder SmaI) können in die Oligonukleotide zur Bereitstellung einer ordnungsgemäßen Orientierung des DNA-Fragments, wenn es in den verdauten Vektor pML103 wie nachstehend beschrieben insertiert wird, inkorporiert werden. Die Amplifikation wird dann in einer Standard-PCR durchgeführt. Die amplifizierte DNA wird dann mit den Restriktionsenzymen NcoI und SmaI verdaut und auf einem Agarosegel fraktioniert. Die entsprechende Bande kann aus dem Gel isoliert und mit einem 4,9 kb NcoI-SmaI-Fragment des Plasmids pML103 kombiniert werden. Das Plasmid pML103 wurde unter den Bedingungen des Budapester Vertrags bei der ATCC (American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110–2209) hinterlegt und trägt die Zugangsnummer ATCC 97366. Das DNA-Segment von pML103 enthält ein 1,05 kb SalI-NcoI-Promotorfragment des Mais-Zein-Gens (27 kD) und ein 0,96 kb SmaI-SalI-Fragment vom 3'-Ende des Mais-Zein-Gens (10 kD) im Vektor pGem9Zf(+) (Promega). Vektor- und Insert-DNA können bei 15°C über Nacht, im Wesentlichen wie beschrieben (Maniatis), ligiert werden. Die ligierte DNA kann dann zur Transformation von E. coli XL1-Blue (Epicurian Coli XL-1 Blue^TM; Stratagene) verwendet werden. Bakterientransformanten können mittels des Restriktionsenzym-Verdaus der Plasmid-DNA und einer begrenzten Nukleotidsequenz-Analyse unter Verwendung des Didesoxy-Kettenterminierungsverfahrens (Sequenase^TM DNA Sequencing Kit; U.S. Biochemical) gescreent werden. Das sich ergebende Plasmidkonstrukt würde ein chimäres Gen umfassen, kodierend, in der 5'- bis 3'-Richtung, den Mais-Zein-Promotor (27 kD), ein cDNA-Fragment, kodierend das vorliegende Polypeptid, und die 3'-Region von Zein (10 kD).
Das vorstehend beschriebene chimäre Gen kann durch das folgende Verfahren in Maiszellen eingeführt werden. Immature Mais-Embryos können aus sich entwickelnden Karyopsen, die sich von Kreuzungen der Inzuchtmaislinien H99 und LH132 herleiten, präpariert werden. Die Embryos werden 10 bis 11 Tage nach der Pollinierung, wenn sie 1,0 bis 1,5 mm lang sind, isoliert. Die Embryos werden dann mit der Achsenseite nach unten sehend und in Kontakt mit Agarose-verfestigtem N6-Medium platziert (Chu et al. (1975) Sci. Sin. Peking 18: 659–668). Die Embryos werden bei 27°C im Dunkeln gehalten. Krümeliger embryogener Kallus, bestehend aus nicht differenzierten Zellmassen mit somatischen „Proembryoiden" und Embryoiden, die auf Stützstrukturen getragen werden, proliferieren aus dem Skutellum dieser immaturen Embryos. Der aus dem primären Explantat isolierte embryogene Kallus kann auf N6-Medium 2 bis 3 Wochen kultiviert und auf diesem Medium alle 2 bis 3 Wochen subkultiviert werden.
Das Plasmid, p35S/Ac (erhalten von Dr. Peter Eckes, Hoechst AG, Frankfurt am Main, Deutschland) kann in Transformationsexperimenten verwendet werden, um einen selektierbaren Marker bereitzustellen. Dieses Plasmid enthält das Pat-Gen (siehe Europäische Patentveröffentlichung 0242236 ), das für Phosphinthricin-Acetyltransferase (PAT) kodiert. Das PAT-Enzym verleiht Resistenz gegen herbizide Glutaminsynthetase-Inhibitoren, wie zum Beispiel Phosphinthricin. Das pat-Gen in p35S/Ac befindet sich unter der Kontrolle des 35S-Promotors vom Blumenkohl-Mosaik-Virus (Odell et al. (1985) Nature 313: 810–812) und der 3'-Region des Nopalin-Synthase-Gens aus der T-DNA des Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens.
Das Partikelbombardment-Verfahren (Klein et al. (1987) Nature 327: 70–73) kann zum Transfer von Genen an die Kallus-Kulturzellen verwendet werden. Gemäß diesem Verfahren werden Goldpartikel (1 μm im Durchmesser) unter Verwendung des folgenden Verfahrens mit DNA beschichtet. Es werden 10 μg Plasmid-DNAs 50 μl einer Suspension aus Goldpartikeln (60 mg/ml) zugefügt. Den Partikeln werden Calciumchlorid (50 μl einer 2,5 M Lösung) und Spermidin, freie Base (20 μl einer 1,0 M Lösung), zugefügt. Die Suspension wird während des Zufügens dieser Lösungen gevortext. Nach 10 Minuten werden die Röhrchen kurz zentrifugiert (5 sec bei 15 000 U/min) und der Überstand entfernt. Die Partikel werden in 200 μl absolutem Ethanol resuspendiert, erneut zentrifugiert und der Überstand entfernt. Es wird wieder mit Ethanol gespült und die Partikel in einem endgültigen Volumen von 30 μl Ethanol resuspendiert. Ein Aliquot (5 μl) der DNA-beschichteten Goldpartikel kann in die Mitte eines Kapton^TM „Flying Disc" (Bio-Rad Labs) platziert werden. Die Partikel werden dann mit einem Biolistic^TMPDS-1000/He (Bio-Rad Instruments, Hercules CA) unter Verwendung eines Heliumdrucks von 1000 psi, einer Gap-Distanz von 0,5 cm und einer Flugdistanz von 1,0 cm in das Maisgewebe beschleunigt.
Für das Bombardment wird das embryogene Gewebe auf Filterpapier über ein mit Agarose verfestigtes N6-Medium platziert. Das Gewebe wird als ein dünner Rasen angeordnet und bedeckt eine Kreisfläche von ca. 5 cm im Durchmesser. Die das Gewebe enthaltende Petrischale kann in die Kammer des PDS-1000/He ca. 8 cm vom Stopping-Screen (Stopping-Sieb) entfernt platziert werden. Die Luft in der Kammer wird dann auf ein Vakuum von 28 Inch Hg evakuiert. Der Makrocarrier wird mit einer Helium-Schockwelle unter Verwendung einer Berstmembran, die platzt, wenn der He-Druck im Schockrohr 1000 psi erreicht, beschleunigt.
Sieben Tage nach dem Bombardment kann das Gewebe an N6-Medium, das Glufosinat (2 mg/l) enthält und dem es an Casein oder Prolin mangelt, transferiert werden. Auf diesem Medium wächst das Gewebe langsam weiter. Nach weiteren 2 Wochen kann das Gewebe in frisches N6-Medium, enthaltend Glufosinat, transferiert werden. Nach 6 Wochen können auf einigen der Platten, enthaltend das mit Glufosinat supplementierte Medium, Flächen von ca. 1 cm im Durchmesser mit aktiv wachsendem Kallus identifiziert werden. Diese Kalli können bei Subkultivierung auf dem Selektivmedium weiter wachsen.
Pflanzen können zunächst durch Transfer von Gewebe-Clusters an mit 0,2 mg/l 2,4-D supplementiertes N6-Medium aus dem transgenen Kallus regeneriert werden. Nach zwei Wochen kann das Gewebe an Regenerationsmedium transferiert werden (Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8: 833–839).
BEISPIEL 5
Expression chimärer Gene in dikotylen Zellen
Eine Samen-spezifische Expressionskassette, die sich aus dem Promotor und dem Transkriptionsterminator aus dem Gen, kodierend die β-Untereinheit des Samenspeicherproteins Phaseolin aus der Bohne Phaseolus vulgaris (Doyle et al. (1986) J. Biol Chem. 261: 9228–9238), zusammensetzt, kann zur Expression des vorliegenden Polypeptids in der transformierten Sojabohne verwendet werden. Die Phaseolin-Kassette schließt ca. 500 Nukleotide stromaufwärts (5') vom Translationsinitiierungscodon und ca. 1650 Nukleotide stromabwärts (3') vom Translationsstoppcodon von Phaseolin ein. Zwischen den 5'- und 3'-Regionen befinden sich die einzigartigen Restriktionsendonukleasestellen Nco I (welche das ATG- Translationsinitiierungscodon einschließen), Sma I, Kpn I und Xba I. Die gesamte Kassette ist von Hind III-Stellen flankiert.
Das cDNA-Fragment dieses Gens kann durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) des cDNA-Klons unter Verwendung geeigneter Oligonukleotid-Primer generiert werden. Die Klonierungsstellen können in die Oligonukleotide zur Bereitstellung der richtigen Orientierung des DNA-Fragments, wenn sie in den Expressionsvektor insertiert werden, inkorporiert werden. Die Amplifikation wird dann wie vorstehend beschrieben durchgeführt, und das isolierte Fragment wird in einen pUC 18-Vektor insertiert, der die Samen-Expressionskassette trägt.
Danach können Sojabohnen-Embryos mit dem Expressionsvektor transformiert werden, der Sequenzen umfasst, die für das vorliegende Polypeptid kodieren. Zur Induktion somatischer Embryos, können Kotyledonen, 3–5 mm lang, aus Oberflächen-sterilisierten, immaturen Samen des Sojabohnen-Kultivars A2872 im Hellen oder Dunkeln bei 26°C auf einem geeigneten Agarmedium über 6–10 Wochen kultiviert werden. Somatische Embryos, die sekundäre Embryos produzieren, werden dann ausgeschnitten und in ein geeignetes Flüssigmedium gegeben. Nach wiederholter Selektion auf Cluster somatischer Embryos, welche als frühe Embryos im Globular-Stadium multipliziert werden, werden die Suspensionen wie nachstehend beschrieben aufrechterhalten.
Embryogene Suspensionskulturen von der Sojabohne können in 35 ml Flüssigmedium auf einem rotierenden Schüttelgerät, 150 U/min, bei 26°C mit Fluoreszenzleuchten unter einem Tag/Nacht-Schema von 16:8 Stunden aufrechterhalten werden. Die Kulturen werden alle zwei Wochen durch Inokulation von ca. 35 mg Gewebe in 35 ml Flüssigmedium subkultiviert.
Die embryogenen Suspensionskulturen von der Sojabohne können dann mittels des Partikel-Gun-Bombardment-Verfabrens transformiert werden (Klein et al. (1987) Nature (London) 327: 70–73, US-Patent Nr. 4945050 ). Für diese Transformationen kann ein Biolistic^TM PDS 1000/HE-Instrument (Helium-Retrofit) von DuPont verwendet werden.
Ein selektierbares Markergen, das zur Förderung der Sojabohnen-Transformation verwendet werden kann, stellt ein chimäres Gen dar, das sich aus dem 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (Odell et al. (1985) Nature 313: 810–812), dem Hygromycin-Phosphotransferasegen aus Plasmid pJR225 (von E. coli; Gritz et al. (1983) Gene 25: 179–188) und der 3'-Region des Nopalin-Synthasegens aus der T-DNA des Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens zusammensetzt. Die Samen-Expressionskassette, umfassend die Phaseolin-5'-Region, das Fragment, das das vorliegende Polypeptid kodiert und die Phaseolin-3'-Region können als ein Restriktionsfragment isoliert werden. Dieses Fragment kann dann in eine einzigartige Restriktionsstelle des das Markergen tragenden Vektors insertiert werden.
50 μl einer 60 mg/ml 1-μm-Goldpartikel-Suspension wird (reihenfolglich) Folgendes zugefügt: 5 μl DNA (1 μg/μl), 20 μl Spermidin (0,1 M) und 50 μl CaCl₂ (2,5 M). Die Partikelpräparation wird dann 3 Minuten gerührt, in einer Mikrofuge 10 Sekunden zentrifugiert und der Überstand entfernt. Die mit DNA beschichteten Partikel werden dann einmal in 400 μl 70%igem Ethanol gewaschen und in 40 μl wasserfreiem Ethanol resuspendiert. Die DNA-/Partikelsuspension kann dreimal für jeweils 1 Sekunde beschallt werden. 5 μl der mit DNA beschichteten Goldpartikel werden dann auf jede Makrocarrier-Scheibe geladen.
Ca. 300–400 mg einer zwei Wochen alten Suspensionskultur werden in eine leere Petrischale (60 × 15 mm) gegeben und die restliche Flüssigkeit mit einer Pipette vom Gewebe entfernt. Für jedes Transformationsexperiment werden in der Regel ca. 5–10 Platten bombardiert. Der Berstdruck der Membran ist auf 1100 psi eingestellt, und die Kammer wird auf ein Vakuum von 28 Inch Hg evakuiert. Das Gewebe wird ca. 3,5 Inch vom Rückhalte-Screen (Rückhaltesieb) platziert und dreimal bombardiert. Nach dem Bombardment kann das Gewebe in die Hälfte geteilt und zurück in die Flüssigkeit gegeben und wie vorstehend beschrieben kultiviert werden.
Fünf bis sieben Tage nach dem Bombardment kann das Flüssigmedium mit frischem Medium, und elf bis zwölf Tage nach dem Bombardment mit frischem Medium, enthaltend 50 mg/ml Hygromycin, ausgewechselt werden. Dieses Selektivmedium kann wöchentlich erneuert werden. Sieben bis acht Wochen nach dem Bombardment kann beobachtet werden, dass grünes, transformiertes Gewebe aus nicht transformierten, nekrotischen embryogenen Cluster wächst. Isoliertes grünes Gewebe wird entfernt und in individuelle Flaschen zum Generieren neuer, klonal propagierter, transformierter embryogener Suspensionskulturen inokuliert. Jede neue Linie kann als ein unabhängiges Transformationsereignis behandelt werden. Diese Suspensionen können dann subkultiviert und als Cluster immaturer Embryos aufrechterhalten oder zu vollkommenen Pflanzen durch Maturation und Keimung individueller somatischer Embryos regeneriert werden.
BEISPIEL 6
Expression chimärer Gene in Mikrobenzellen
Die für das vorliegende Polypeptid kodierenden cDNAs können in den T7-Expressionsvektor pBT430 von E. coli insertiert werden. Dieser Vektor stellt ein Derivat von pET-3a (Rosenberg et al. (1987) Gene 56: 125–135) dar, der die Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase/das T7-Promotorsystem einsetzt. Das Plasmid pBT430 wurde zuerst durch Zerstören der EcoR I- und Hind III-Stellen in pET-3 an ihren ursprünglichen Positionen konstruiert. Ein Oligonukleotid-Adapter, enthaltend EcoR I- und Hind III-Stellen, wurde an der BamH I-Stelle von pET-3a insertiert. Dies führte pET-3aM mit zusätzlichen einzigartigen Klonierungsstellen zur Insertion von Genen in den Expressionsvektor herbei. Dann wurde die Nde I-Stelle unter Verwendung der Oligonukleotid-gerichteten Mutagenese an der Position der Translationsinitiierung in eine Nco-I-Stelle umgewandelt. Die DNA-Sequenz von pET-3aM in dieser Region, 5'-CATATGG, wurde in 5'-CCCATGG in pBT430 umgewandelt.
Plasmid-DNA, enthaltend eine cDNA kann zur Freisetzung eines für das Protein kodierenden Nukleinsäurefragments angemessen verdaut werden. Dieses Fragment kann dann auf einem 1%igen niedrig schmelzenden Agarosegel gereinigt werden. Puffer und Agarose enthalten 10 μg/ml Ethidiumbromid für die Sichtbarmachung des DNA-Fragments. Das Fragment kann dann aus dem Agarosegel durch Verdau mit GELase^TM (Epicentre Technologies, Madison, WI) gemäß der Anleitung des Herstellers gereinigt, mit Ethanol präzipitiert, getrocknet und in 20 μl Wasser resuspendiert werden. Geeignete Oligonukleotid-Adapter können unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (New England Biolabs (WEB), Beverly, MA) an das Fragment ligiert werden. Das Fragment, enthaltend die ligierten Adapter, kann aus den überschüssigen Adapter unter Verwendung von niedrig schmelzender Agarose, wie vorstehend beschrieben, gereinigt werden. Der Vektor pBT430 wird verdaut, mit alkalischer Phosphatase (WEB) dephosphoryliert und mit Phenol/Chloroform wie vorstehend beschrieben deproteinisiert. Der hergestellte Vektor pBT430 und das Fragment können dann 15 Stunden bei 16°C ligiert werden, gefolgt von der Transformation in elektrokompetente DH5-Zellen (GIBCO BRL). Die Transformanten können auf Agarplatten, enthaltend LB-Medium und 100 μg/ml Ampicillin, ausgewählt werden. Transformanten, enthaltend das Gen, das für das vorliegende Polypeptid kodiert, werden dann auf die richtige Orientierung in Bezug auf den T7-Promoter durch die Restriktionsenzym-Analyse gescreent.
Zum Erhalt hoher Expressionsspiegel kann ein Plasmidklon mit dem cDNA-Insert in richtiger Orientierung in Bezug auf den T7-Promoter in den E coli-Stamm BL21(DE3) transformiert werden (Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113–130). Kulturen werden in LB-Medium, enthaltend Ampicillin (100 mg/l) bei 25°C gezüchtet. Bei einer optischen Dichte bei 600 nm von ca. 1, kann das IPTG (Isopropylthio-β-galactosid, der Induktor) zugefügt werden, um eine Endkonzentration von 0,4 mM zu erhalten, und die Inkubation kann 3 h bei 25°C fortgesetzt werden. Die Zellen werden dann durch Zentrifugieren gewonnen und in 50 μl 50 mM Tris-HCl bei pH 8,0, enthaltend 0,1 mM DTT und 0,2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid resuspendiert. Eine kleine Menge von 1 mm großen Glasperlen können zugefügt werden und das Gemisch dreimal für ca. 5 Sekunden jedes Mal mit einem Mikrosonden-Ultraschallgert (Sonicator) beschallt werden. Das Gemisch wird zentrifugiert und die Proteinkonzentration des Überstands bestimmt. 1 μg Protein aus der löslichen Fraktion der Kultur kann mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt werden. Die Gele können auf Proteinbanden beobachtet werden, die bei dem erwarteten Molekulargewicht migrieren.
BEISPIEL 7
Expression von EST eellc.pk002.i4 von Euphorbia lagascae in Saccharomyces cerevisiae
Die Funktion des Cytochrom-P450-Enzyms, das dem EST eellc.pk002.i4 entspricht, wurde durch Expression im Saccharomyces cerevisiae-Stamm WHT1 beurteilt [Jung W. el al. (2000) Nature Biotechnol. 18: 208–212]. Die WHT-Zelllinie enthält das Gen für die NADPH-Cytochrom-P450-Reduktase aus Helianthus tuberosum zur Verstärkung der rekombinanten Cytochrom-P450-Aktivität wie zuvor beschrieben [Jung W. et al. (2000) Nature Biotechnol. 18: 208–212]. Die Kodierungssequenz von EST eellc.pk002.i4 wurde durch die PCR unter Verwendung des Advantage-GC-cDNA-Polymerase-Kits (Clontech) und des Primerpaars 5'-TCAAGGAGAAAAAACCCCGGATCCATGGAGCAGAAAAATCTCTCTTTTCCG-3' (Sense; SEQ ID NO:4) und 5'-GGCCAGTGAATrGTAATACGACTCACTATAGGGCG-3' (Antisense; SEQ ID NO:5) amplifrziert. Außer der Homologie zur Cytochrom-P450-Kodierungsregion, teilen sich diese Primer die Homologie mit dem Vektor pRS315 [Sikorski und Heiter (1989) Genetics 122: 19–27], der wie zuvor beschrieben [Jung et al. (2000) Nature Biotechnol. 18: 208–212] durch die Insertion von bidirektionalen GAL1/GAL10-Promotoren modifiziert wurde. Das sich ergebende Amplifikationsprodukt wurde an den verdauten Vektor hybridisiert und in den Saccharomyces cerevisiae-Stamm WHT1 transformiert, wo das Expressionsplasmid durch „Gap-Repair" gebildet wird [Hua et al. (1997) Plasmid 38: 91–96]. Die ordnungsgemäße Integration der Kodierungssequenz des EST eellc.pk002.i4 im Expressionsvektor wurde durch die teilweise DNA-Sequenzierung des sich ergebenden Plasmids bestätigt. Transformierte Hefezellen wurden auf ihre Fähigkeit, bei Abwesenheit von Leucin zu wachsen, ausgewählt.
Ausgewählte Kolonien wurden über 3 Tage bei 28°C in Medien, denen Leucin mangelt [0,17 % (w/v) Hefe-Stickstoff-Basis ohne Aminosäuren (Difco), 0,5 % (w/v) Ammoniumsulfat, 0,01 % (w/v) Adenin und 0,07 % (w/v) CSM-Leu (Bio 101)], supplementiert mit Glycerol und Glucose auf eine Endkonzentration von 5 % (v/v) bzw. 0,5% (w/v) gezüchtet. Die Zellen wurden dann zweimal im vorstehend beschriebenen Medium gewaschen, das als Kohlenstoffquelle 2 % (w/v) Galactose anstelle von Glycerol und Glucose enthielt. Die gewaschenen Zellen wurden dann auf OD₆₀₀ ≈ 0,4 in Medium verdünnt, das aus 1 % (w/v) Hefeextrakt, 2 % (w/v) Pepton, 2 % (w/v) Galactose, 0,04 % (w/v) Adenin und 0,2 % (w/v) Tergitol NP-40 bestand. Das Medium wurde auch mit 0,45 mM von entweder Linolsäure (18 :2Δ^9bis,12cis) oder α-Linolensäure (18: 3Δ^{9cis,12cis,15cis}) supplementiert. Diese Fettsäuren wurden zugefügt, um als potenzielle in vivo-Substrate für das rekombinante Cytochrom-P450 von E. lagascae zu dienen. Die Kulturen wurden durch Schütteln (250 U/min) bei 28°C aufrechterhalten und auf OD₆₀₀ 12 gezüchtet. Zellen aus 3-ml-Kulturen wurden mittels Zentrifugieren gesammelt und dann unter Vakuum getrocknet. Fettsäuremethylester wurden anschließend aus den getrockneten Zellpellets durch direkte Umesterung in 1 % (w/v) Natriummethoxid/Methanol unter Verwendung der zuvor beschriebenen Verfahren hergestellt [Cahoon et al. (2001) J. Biol. Chem. 276: 2637–2643]. Die wiedergefundenen Fettsäuremethylester wurden dann unter Verwendung eines Hewlett-Packard 6890 Gaschromatographen, der mit einer Omegawax-320-Säule (30 m × 0,32 mm Innendurchmesser, Supelco) analysiert. Die Ofentemperatur wurde von 220°C (2 min Haltezeit) bei einer Rate von 20°C/min auf 240°C programmiert. Die Retentionszeiten von Epoxyfettsäuremethylestem in Proben wurden mit denen von aus dem Samen von E. lagascae hergestelltem Vernolsäuremethylester verglichen.
Zur Bestätigung der Identitäten von jedweden durch rekombinante Hefezellen produzierten Δ¹²-Epoxyfettsäuren wurden wie vorstehend beschrieben hergestellte Fettsäuremethylester nach der Säure-Derivatisierung durch Massenspektrometrie analysiert, was eine bessere diagnostische strukturelle Charakterisierung bereitstellt. Die saure Reaktion der Methylester von Δ¹²-Epoxyfettsäuren (z. B. Vemolsäure) führt zur Öffnung des Epoxyrings und der Generierung von zwei Produkten: (1) einem Δ¹²-Hydroxy-/Δ¹³-Methoxyderivat und (2) einem Δ¹²-Methoxy-/Δ¹³-Hydroxyderivat. Die aus der Natriummethoxid-Umesterung erhaltenen Fettsäuremethylester (wie vorstehend beschrieben) von S. cerevisiae-Kulturen wurden 20 mm. bei 70°C in 1 ml 2,5 % (v/v) Schwefelsäure in Methanol erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde 1 ml Wasser zugefügt, und die Fettsäuremethylester wurden mit 2 ml Hexan extrahiert. Die Fettsäuremethylester wurden dann unter Stickstoff getrocknet und anschließend mit 0,5 ml des Silylierungsreagenzes bis-(Trimethylsilyl)trifluoracetamid : Trimethylchlorsilan (99:1, v/v) (Supelco) 30 min bei 50°C zum Generieren von Trimethylsilylether-Derivaten (TMS-Etherderivaten) von Hydroxylgruppen zur Reaktion gebracht. Die derivatisierten Fettsäuremethylester wurden unter Stickstoff getrocknet, in Hexan resuspendiert und dann unter Verwendung eines HP6890 Gaschromatographen, der mit einem HP5973 Massenselektiven Detektor (Hewlett-Packard) verbunden ist, der bei einem Elektronenstoßionisationspotenzial von 70 eV betrieben wird, analysiert. Die Epoxyfettsäuremethylester-Derivate wurden teilweise unter Verwendung einer HP-INNOWax-Säule (30 m × 0,25 mm Innendurchmesser; Hewlett-Packard), wobei die Ofentemperatur von 185°C (5 min Haltezeit) auf 240°C (10 min Haltezeit) bei 7,5°C/min programmiert wurde, analysiert.
Unter Verwendung von mit Linolsäure supplementierten Medien wurde eine neue Fettsäure in WHT-Zellen von S. cerevisiae nachgewiesen, die das Cytochrom-P450 von E. lagascae exprimieren, das dem EST eellc.pk002.i4 entspricht. Der Methylester dieser Fettsäure ist als „Epoxy1" in 1B angezeigt. Diese Fettsäure wurde nicht in Zellen nachgewiesen, die nur den Expressionsvektor enthielten und unter ähnlichen Bedingungen wuchsen [1A]. „Epoxy1" wies die gleiche Retentionszeit wie der Methylester der Vemolsäure auf [1E]. Außerdem wiesen die sauren Methanolderivate von diesem Fettsäuremethylester Massenspektren [2C–2D] auf, die mit denen von ähnlich hergestellten Derivaten von Methylvemolsäure identisch waren [2A–2B]. Basierend auf diesen Daten wird „Epoxy1" in 1B als der Methylester der Vemolsäure identifiziert. Dieser Befund weist folglich nach, dass das Cytochrom-P450 von E. lagascae, das EST eellc.pk002.i4 entspricht, als eine Δ¹²-Linolsäure-Epoxygenase in der Biosynthese von Vemolsäure funktioniert.
Die Supplementierung des Wachstumsmediums mit α-Linolensäure führte zur Produktion einer zweiten neuen Fettsäure durch Zellen, die das Cytochrom-P450 von E. lagascae exprimieren, das dem EST eellc.pk002.i4 entspricht. Dieser Methylester dieser Fettsäure, der als „Epoxy2" in 1D gekennzeichnet ist, wies eine längere Retentionszeit als die von Methylvemolsäure [1E] auf. Außerdem waren die Massenspektren von Trimethylsilyl-Derivaten von sauren Methanolprodukten von „Epoxy2" konsistent mit denen, die aus einem C₁₈-Fettsäuremethylester entstehen, enthaltend eine Δ¹²-Epoxygruppe und zwei Doppelbindungen [2E–2F]. Gesetzt den Fall, dass der Vorläufer dieses Produkts 18:3Δ^9,12,15 (α-Linolensäure) darstellt, wird „Epoxy2" folglich unverbindlich als Methylester von Δ¹²-Epoxyoctadeca-9,15-diensäure (Δ¹²-Epoxy- 18:2Δ^9,12) identifiziert. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass das Cytochrom-P450 von E. lagascae, das dem EST eellc.pk002.i4 entspricht, auch zum Katalysieren der Δ¹²-Epoxidierung von α-Linolensäure fähig ist.
BEISPIEL 8
Expression der cDNA für EST eellc.pk002.i4 von Euphorbia lagascae in transgenen Tabakzellen
Das Cytochrom-P450-Enzym von Euphorbia lagascae, das der cDNA für EST eellc.pk002.i4 entspricht, wurde zur Beurteilung seiner Funktion in transgenen Pflanzenzellen im Kallus von Tabak (Nicotiana tabacum) unter der Kontrolle des 35S-Promotors des Blumenkohl-Mosaik-Virus exprimiert. Für diese Studien wurde der offene Leserahmen der cDNA für EST eellc.pk002.i4 initial durch die PCR amplifiziert, um flankierende EcoRI- und BamHI-Stellen zum Klonieren in den Pflanzen-Expressionsvektor zu generieren. Die Sequenz des in der Amplifikationsreaktion verwendeten Sense-Oligonukleotids stellte 5'-gcggccgcgaattcGGAAAATGGAGCAGAAAAATC-3', SEQ ID NO:6, dar; und die Sequenz des Antisense-Oligonukleotids stellte 5'-gcggccgcggatccTTAGAACATCGTTAATTAAAG-3', SEQ ID NO:7, dar. (Zur Beachtung: die Basen in Kleinbuchstaben enthalten die zugefügten Restriktionsstellen und flankierende Sequenz zur Förderung des Verdaus mit dem Restriktionsenzym). Das Design der PCR-Prinier basierte auf der Sequenz der cDNA für EST eellc.pk002.i4, die in SEQ ID NO:1 ersichtlich ist. In einem 100-μl-Volumen unter Verwendung von Pfu-Polymerase wurden dreißig Zyklen der PCR-Amplifikation (Stratagene) durchgeführt, und das Template bestand aus der cDNA für EST eellc.pk002.i4 in pBluescript SK (–). Das Produkt aus dieser Reaktion wurde in pCR-Script AMP (Stratagene) subkloniert. Nach dem Restriktionsverdau mit EcoRI und BamHI wurde das PCR-Produkt aus pCR-Script AMP an die entsprechende Stelle von Vektor pART7 gebracht [Gleave, A.P. (1992) Plant Mol. Biol. 20: 1203–1207]. Das sich ergebende Konstrukt bestand aus dem offenen Leserahmen der cDNA für EST eellc.pk002.i4, fusioniert an seinem 5'-Ende mit dem 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus und an seinem 3'-Ende mit dem transkriptionalen Terminierungsanteil des Octopinsynthasegens. Diese drei Sequenzelemente (Promotor/offener Leserahmen von EST eellc.pk002.i4/3'-ocs-Terminierungssequenz) wurden dann als ein NotI-Fragment in die entsprechende Stelle des binären Vektors pART27 gebracht, der einen Kanamycin-Resistenzmarker zur Auswahl von transformierten Pflanzenzellen enthält [Gleave, A.P. (1992) Plant Mol. Biol. 20: 1203–1207]. Das sich ergebende Plasmid wurde als pEICytP450 bezeichnet. Es wurde durch die Insertion von Promotor- und Terminierungselementen aus pART7 in die NotI-Stelle von pART27 eine Vektorkontrolle hergestellt. Das sich ergebende Plasmid wurde als pART27/35S bezeichnet. Plasmide pEICytP450 und pART27/35S wurden dann in LBA4404-Zellen von Agrobacterium tumefaciens transformiert. Sich von diesen Zellen herleitende Kulturen wurden für die Transformation von Blattscheiben von Tabak (Nicotiana tabacum cv. Xanthi) gemäß dem von Rogers, S.G., Horsch, R.B. und Fraley, R.T. (1986) Methods Enzymol. 118: 627–648, beschriebenen Protokoll verwendet. Sich von diesen Transformationen herleitender transgener Kallus wurde basierend auf der vom binären Vektor verliehenen Kanamycin-Resistenz ausgewählt. Außerdem wurde die Anwesenheit des Transgens in diesem Gewebe durch die Northern-Blot-Analyse bestätigt.
Die Fettsäurezusammensetzung von Kanamycin-resistentem Tabakkallus, der aus Blattscheiben-Transformationen erhalten wurde, wurde mittels Gaschromatographie (GC) untersucht. Das in diesen Analysen verwendete Gewebe stellte Kallus dar, der in frisches Selektivmedium transferiert wurde und für weitere 3 bis 4 Wochen gezüchtet wurde. Zum Erhalt von Fettsäuremethylestem für die GC-Analysen wurden ca. 150 mg transgener Tabakkallus in 1 ml 1%igem (w/v) Natriummethoxid in Methanol unter Verwendung der von Hitz et al. (1994), Plant Physiol. 105: 635–641, beschriebenen Verfahren homogenisiert. Die sich ergebenden Fettsäuremethylester wurden unter Verwendung eines Hewlett-Packard 5890 Gaschromatographen, der mit einer Omegawax 320-Säule (30 m × 0,32 mm Innendurchmesser; Supelco) ausgerüstet war, analysiert. Die Ofentemperatur wurde von 180°C (4 min Haltezeit) auf 215°C bei einer Rate von 5°C/min und dann auf 240°C bei einer Rate von 20°C/min (0,5 min Haltezeit) programmiert. Zur Bereitstellung einer zusätzlichen strukturellen Charakterisierung wurden die Massenspektren von Säure derivatisierten Fettsäuremethylestem aus dem transgenen Tabakkallus unter Verwendung der Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) wie in Beispiel 7 beschrieben bestimmt. Unter Verwendung dieser analytischen Verfahren wurden zwei Fettsäuremethylester in mit pEICytP450 transformiertem Tabakkallus nachgewiesen, die im Kallus der Vektorkontrolle (pART/35S) abwesend waren [3]. Peaks, die diesen Fettsäuren entsprechen, werden als „Epoxy1" und „Epoxy2" im in [3B] gezeigten Gaschromatogramm gekennzeichnet. Der Methylester von Epoxy1 wies eine gaschromatographische Retentionszeit auf, die mit der von Methylvernolsäure (Δ¹²-Epoxy-18:1Δ^9cis) in Extrakten von Samen von Euphorbia lagascae identisch sind (3C). Außerdem ergab die Säure-Dertvatisierung und -Silylierung des Methylesters von Epoxy1 zwei Verbindungen mit Massenspektren, die identisch mit denen sind, die aus einer ähnlichen Derivatisierung von Methylvemolsäure erhalten wurden (siehe Beispiel 7). Epoxy1 ist folglich als Vemolsäure identifiziert. Der Fettsäuremethylester, der dem Epoxy2 in 3B entspricht, wies die gleiche Retentionszeit auf wie der in Beispiel 7 beschriebene Methylester von 12-Epoxyoctadeca-9,15-diensäure (Δ¹²-Epoxy-18:2Δ^9,15) Die Massenspektren von aus der methanolischen Säure-Derivatisierung und -Silylierung des Methylesters von Epoxy2 gebildeten Verbindungen waren identisch mit denen von auf ähnliche Weise hergestellten Derivaten von Methyl-12-epoxyoctadeca-9,15-dienoat, wie in Beispiel 7 erläutert wird. Epoxy2 ist folglich als 12-Epoxyoctadeca-9,15-diensäure identifiziert. Basierend auf Studien zur Substratbeschickung mit in Beispiel 7 beschriebenem Saccharomyces cerevisiae, ergeben sich Vemolsäure und Δ¹²-Epoxy-18:2Δ^9,15 in den transgenen Tabakzellen aus der Δ¹²-Epoxygenase-Aktivität auf Linolsäure (18:2Δ^9,12) bzw. α-Linolensäure (18:3Δ^9,12,15).
Wie in Tabelle 5 zusammengefasst wird, akkumulierte Tabakkallus, der das dem EST eellc.pk002.i4 entsprechende Cytochrom-P450 von Euphorbia lagascae exprimiert, Δ¹²-Epoxyfettsäuren (Vemolsäure und Δ¹²-Epoxy-18:2Δ^9,15) in Mengen, die über 15 Gew.-% bezogen auf die Gesamtfettsäuren der transgenen Proben hinausgingen (TABELLE 5).

Diese Ergebnisse geben folglich zu erkennen, dass das dem EST eellc.pk002.i4 entsprechende Cytochrom-P450-Enzym von Euphorbia lagascae in transgenen Pflanzenzellen zur Produktion von Δ¹²-Epoxyfettsäuren funktionell exprimiert wird. TABELLE 5 Fettsäurezusammensetzungen von Tabakkallus, transformiert mit dem pAT27/35S-Vektor, dem das cDNA-Insert (pART27/35S) mangelt, oder mit der cDNA von Euphorbia lagascae für EST eellc.pk002.i4 hinter einem 35S-Promotor (pELCytP450)

Fettsäure	pART27/35S (Vektor-Kontrolle) (n = 3)¹	pEICytP450 (n = 3)
	Gew.-% bezogen auf die Gesamtfettsäuren
16:0	18,8 ± 1,6	15,9 ± 0,9
18:0	4,0 ± 0,7	4,5 ± 0,9
18:1Δ⁹	2,7 ± 0,9	43,2 ± 2,7
18:2Δ^9,12	46,4 ± 5,0	14,9 ± 1,7
18:3Δ^9,12,15	27,1 ± 5,4	4,6 ± 0,5
Δ¹²-Epoxy-18:1Δ⁹ (Vemolsäure)	N.D.²	13,3 ± 0,7
Δ¹²-Epoxy-18:2Δ^9,15	N/.D.	2,2 ± 0,2
Weitere³	≤ 1,0	≤ 1,5

¹ Messungen von drei unabhängigen Proben von transgenem Kallus ± Standardabweichung.
² N.D., nicht nachgewiesen.
³ Schließt 20:0, 20:1, 22:0 und 22:1 ein.

BEISPIEL 9
PRODUKTION VON Δ¹²-EPDXYFETTSÄUREN IN SOMATISCHEN SOJABOHNEN-EMBRYOS
Das Cytochrom-P450-Enzym von Euphorbia lagascae, das der cDNA für EST eellc.pk002.i4 entspricht, wurde zur Untersuchung seiner Aktivität in einer transgenen Nutzpflanzenspezies in Embryos von somatischen Sojabohnen (Glycine max) exprimiert. Der offene Leserahmen der cDNA für EST eellc.pk002.i4 wurde initial durch die PCR unter Verwendung der gleichen Methodik und von Oligonukleotid-Primern [SEQ ID NO:6 und SEQ ID NO:7], wie in Beispiel 8 beschrieben, amplifiziert. Das sich ergebende PCR-Produkt wurde in den Vektor pCR-Script AMP (Stratagene) gemäß der Anleitung des Herstellers subkloniert. Das PCR-Produkt wurde dann als ein NotI-Fragment von pCR-Script AMP in die entsprechenden Stellen des Sojabohnen-Expressionsvektors pKS 123 zur Generierung des Plasmids pKR31 gebracht. Vektor pKS 123 ist identisch mit dem zuvor beschriebenen Vektor pKS67 [Weltpatentveröffentlichung Nr. WO 00/11176 ], außer dass zwei AscI-Restriktionsenzymstellen, die den Promotor flankieren, und Terminierungselemente von der Pflanzen-Expressionskassette zugefügt wurden. Plasmid pKR31 enthält den offenen Leserahmen der cDNA für EST eellc.pk002.i4, fusioniert an seinem 5'-Terminus mit dem Promotor des Gens für die α-Untereinheit von β-Conglycinin [Beachy, R.N. et al. (1985) EMBO J. 4: 3047–3053] und an seinem 3'-Ende mit den Terminierungselementen vom Phaseolingen [Doyle, J.J. et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 9228–9238]. Der Promotor des Gens für die α-Untereinheit des in pKR31 verwendeten β-Conglycinins richtet die starke Samen-spezifische Expression von Transgenen. Die Bakterienselektion in Vektor pKR31 wird durch ein Hygromycin B-Phosphotransferasegen [Gritz, L. und Davies, J. (1983) Gene 25: 179–188] unter Kontrolle des T7-RNA-Polymerase-Promotors verliehen, und die Pflanzenselektion wird durch ein zweites Hygromycin B-Phosphotransferasegen unter Kontrolle des 35S-Promotors des Blumenkohl-Mosaik-Virus verliehen. Das Plasmid pKR31 wurde wie nachstehend beschrieben zur Transformation somatischer Sojabohnen-Embryos verwendet.
Zur Induktion somatischer Embryos wurden Kotyledonen von 3–5 mm Länge, präpariert aus Oberflächen-sterilisierten, immaturen Samen eines Sojabohnenkultivars A2872 im Hellen oder Dunkeln bei 26°C auf einem geeigneten Agarmedium 6–10 Wochen kultiviert. Somatische Embryos, die sekundäre Embryos produzieren, wurden dann ausgeschnitten und in ein geeignetes Flüssigmedium gegeben. Nach wiederholter Selektion auf Cluster von somatischen Embryos, die sich als frühe Embryos im Globular-Stadium multiplizierten, wurden die Suspensionen wie nachstehend beschrieben aufrechterhalten.
Die embryogenen Sojabohnen-Suspensionskulturen wurden in 35 ml Flüssigmedium auf einem rotierenden Schüttelgerät, 150 U/min, bei 26°C mit Fluoreszenzleuchten unter einem Tag-/Nacht-Schema von 16:8 Stunden aufrechterhalten. Die Kulturen wurden alle zwei Wochen durch Inokulation von ca. 35 mg Gewebe in 35 ml Flüssigmedium subkultiviert.
Die embryogenen Sojabohnen-Suspensionskulturen wurden dann mit pKR31 mittels des Verfahrens des Partikel-Gun-Bombardments transformiert (Klein, TM. et al. (1987) Nature (London) 327: 70, US-Patent Nr. 4945050 ). Für diese Transformationen wurde ein DuPont-Biolistic PDS1000/HE-Instrument (Helium-Retrofit) verwendet.
50 ml einer 60 mg/ml 1-mm-Goldpartikel-Suspension wurden (reihenfolglich) Folgendem zugefügt: 5 ml DNA (1 mg/ml), 20 ml Spermidin (0,1 M) und 50 ml CaCl₂ (2,5 M). Die Partikel- Präparation wurde dann 3 Minuten gerührt, in einer Mikrofuge 10 Sekunden zentrifugiert und der Überstand entfernt. Die DNA-beschichteten Partikel wurden dann einmal in 400 ml 70%igem Ethanol gewaschen und in 40 ml wasserfreiem Alkohol resuspendiert. Die DNA-/Partikel-Suspension wurde dreimal jeweils eine Sekunde lang beschallt. 5 ml der DNA-beschichteten Goldpartikel wurden dann auf jede Makrocarrier-Scheibe geladen.
Ca. 300–400 mg einer zwei Wochen alten Suspensionskultur wurden in eine leere Petrischale (60 × 15 mm) gegeben und die rückständige Flüssigkeit mit einer Pipette vom Gewebe entfernt. Für jedes Transformationsexperiment wurden ca. 5 bis 10 Gewebeplatten bombardiert. Der Berstdruck der Membran wurde bei 1100 psi eingestellt und die Kammer wurde auf ein Vakuum von 28 Inch Hg evakuiert. Das Gewebe wurde ca. 3,5 Inch vom Stopping-Screen (Stopping-Sieb) entfernt platziert und dreimal bombardiert. Nach dem Bombardment wurden die Gewebe in die Hälfte geteilt und zurück in die Flüssigkeit gegeben und wie oben beschrieben kultiviert.
Fünf bis sieben Tage nach dem Bombardment wurde das Flüssigmedium mit frischem Medium, und elf bis zwölf Tage nach dem Bombardment mit frischem Medium, enthaltend 50 mg/ml Hygromycin, ausgewechselt. Dieses Selektivmedium wurde wöchentlich erneuert. Sieben bis acht Wochen nach dem Bombardment wurde grünes, transformiertes Gewebe beobachtet, das aus nicht transformierten, nekrotischen embryogenen Cluster wuchs. Isoliertes grünes Gewebe wurde entfernt und in individuelle Flaschen zum Generieren neuer, klonal propagierter, transformierter embryogener Suspensionskulturen inokuliert. Jede neue Linie wurde als ein unabhängiges Transformationsereignis behandelt. Diese Suspensionen wurden dann subkultiviert und als Cluster immaturer Embryos aufrechterhalten. Immature Embryos in diesem Stadium produzieren Speicherprodukte, einschließlich Speicherlipide, die hinsichtlich der Zusammensetzung zygoten Embryos in einem ähnlichen Entwicklungsstadium ähnlich sind (siehe Weltpatentveröffentlichung Nr. WO 94/11516 ). Die Expression des Cytochrom-P450-Transgens von Euphorbia lagascae in Hygromycin-selektierten Embryolinien wurde durch die PCR-Amplifikation unter Verwendung Sequenz-spezifischer Primer und First-Strand-cDNA, hergestellt aus der Gesamt-RNA, die aus transgenen Embryos isoliert wurde, bestätigt.
Auf diese Weise selektierte und aufrechterhaltene transgene somatische Sojabohnen-Embryos wurden mittels der Gaschromatographie (GC) oder Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) auf Δ¹²-Epoxyfettsäure-Akkumulation analysiert. Individuelle Embryos, die dem EST eellc.pk002.i4 entsprechende Cytochrom-P450-Epoxygenase von Euphorbia lagascae exprimieren, wurden in 1%igem (w/v) Natriummethoxid in Methanol (wie in Beispiel 7 beschrieben) homogenisiert, um Fettsäuremethylester aus den Gesamtlipiden dieser Gewebe zu generieren. Die sich aus diesem Umesterungsschritt ergebenden Fettsäuremethylester wurden mittels GC and GC-MS unter Verwendung der in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren analysiert. In somatischen Embryos, die die cDNA für EST eellc.pk002.i4 exprimieren, wurden zwei neue Fettsäuremethylester nachgewiesen, die in nicht transformierten Embryos nicht vorhanden waren [4]. Diesen Fettsäuremethylestem entsprechende gaschromatographische Peaks sind in [4B] als „Epoxy1" und „Epoxy2" gekennzeichnet. Die dem Epoxy1 und Epoxy2 entsprechenden Fettsäuremethylester wiesen Retentionszeiten auf, die mit denen der Methylvernolsäure bzw. Δ¹²-Epoxy-18:2 Δ^9,15 identisch waren. Außerdem waren die erhaltenen Massenspektren, die nach der methanolischen Schwefelsäure-Derivatisierung (wie in Beispiel 7 beschrieben) von diesen Fettsäuremethylestem erhalten wurden, identisch mit denen von Derivaten von Methylvernolsäure und Δ¹²-Epoxy-18:2Δ^9,15, die auf ähnliche Weise hergestellt wurden. Folglich werden die beiden neuen Fettsäuren, die von somatischen Sojabohnen-Embryos hergestellt wurden, die cDNA für EST eellc.pk002.i4 exprimieren, als Vemolsäure (Δ¹²-Epoxy-18:1Δ⁹) und Δ¹²-Epoxy-18:26^9,15 identifiziert. Basierend auf in Beispiel 7 beschriebenen Studien zur Substratbeschickung ergeben sich diese Fettsäuren aus der Modifikation der Δ¹²-Doppelbindung von Linolsäure und α-Linolensäure. Diese Ergebnisse weisen ferner darauf hin, dass das Cytochrom-P450-Enzym, das durch die cDNA für EST eellc.pk002.i4 kodiert ist, in planta als eine Δ¹²-Fettsäure-Epoxygenase funktioniert. Diese Ergebnisse weisen auch auf die Fähigkeit zur Produktion von Epoxyfettsäuren in einer Nutzpflanzenspezies, wie zum Beispiel der Sojabohne, über die Expression der cDNA für EST eellc.pk002.i4 hin.
Tabelle 6 zeigt einen Vergleich der Fettsäurezusammensetzungen nicht transformierter somatischer Sojabohnen-Embryos und Embryos aus der transgenen Linie MSE578-6-9, transformiert mit der Cytochrom-P450-cDNA von Euphorbia lagascae, die dem EST eellc.pk002.i4 entspricht.

Epoxyfettsäuren akkumulieren sich, wie ersichtlich ist, in Mengen von > 7 Gew.-% bezogen auf die Gesamtfettsäuren der transgenen Embryolinien, werden aber nicht in nicht transformierten Linien nachgewiesen. TABELLE Fettsäurezusammensetzungen aus nicht transformierten somatischen Sojabohnen-Embryos und der transgenen somatischen Sojabohnen-Embryolinie MSE578-6-9, experimierend die Cytochrom-P450-cDNA von Euphorbia lagascae, die dem EST eellc.pk002.i4 entspricht

Fettsäure	Nicht transformiert (n = 3)¹	Linie MSE578-6-9 (+Cyt-P450 von E. lagascae) (n-3)
	Gew.-% bezogen auf die Gesamtfettsäuren
16:0	14,2 ± 0,2	13,4 ± 0,6
18:0	3,4 ± 0,5	3,9 ± 1,0
18:1Δ⁹	8,7 ± 0,7	10,5 ± 1,9
18:2Δ^9,12	53,7 ± 3,9	46,9 ± 1,9
18:3Δ^9,12,15	19,1 ± 3,2	17,1 ± 2,1
Vemolsäure (Δ¹²-Epoxy-18:1Δ⁹)	N.D.²	5,4 ± 0,4
Δ¹²-Epoxy-18:2Δ^9,15	N.D.	1,8 ± 0,1
Weitere³	≤ 0,9	≤ 1,0

¹ Werte von drei separaten Messungen (± Standardabweichung) von einzelnen Embryos
² N.D., nicht nachgewiesen.
³ Schließt 20:0, 20:1 und 22:0 ein.

Claims

Isoliertes Polynukleotid, umfassend eine Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: (a) einer ersten Nukleotidsequenz, kodierend ein Polypeptid, bei dem es sich um ein Cytochrom-P450-Enzym handelt, das mit der Synthese von Δ-12-Epoxyfettsäuren assoziiert ist, worin das Polypeptid eine mindestens 50%ige Identität bezogen auf das Clustal-Alignmentverfahren aufweist, wenn es mit einem Polypeptid von SEQ ID NO:2 verglichen wird; und (b) einer zweiten Nukleotid-Sequenz, umfassend ein Komplement von der ersten Nukleotidsequenz.
Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 1, worin in Teil (a) das Polypeptid eine mindestens 55%ige Identität bezogen auf das Clustal-Alignmentverfahren aufweist, wenn es mit einem Polypeptid von SEQ ID NO:2 verglichen wird.
Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 1, worin in Teil (a) das Polypeptid eine mindestens 60%ige Identität bezogen auf das Clustal-Alignmentverfahren aufweist, wenn es mit einem Polypeptid von SEQ ID NO:2 verglichen wird.
Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 1, worin in Teil (a) das Polypeptid eine mindestens 65%ige Identität bezogen auf das Clustal-Alignmentverfahren aufweist, wenn es mit einem Polypeptid von SEQ ID NO:2 verglichen wird.
Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 1, worin in Teil (a) das Polypeptid eine mindestens 70%ige Identität bezogen auf das Clustal-Alignmentverfahren aufweist, wenn es mit einem Polypeptid von SEQ ID NO:2 verglichen wird.
Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 1, worin in Teil (a) das Polypeptid eine mindestens 75%ige Identität bezogen auf das Clustal-Alignmentverfahren aufweist, wenn es mit einem Polypeptid von SEQ ID NO:2 verglichen wird.
Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 1, worin in Teil (a) das Polypeptid eine mindestens 80%ige Identität bezogen auf das Clustal-Alignmentverfahen aufweist, wenn es mit einem Polypeptid von SEQ ID NO:2 verglichen wird.
Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 1, worin in Teil (a) das Polypeptid eine mindestens 85%ige Identität bezogen auf das Clustal-Alignmentverfahren aufweist, wenn es mit einem Polypeptid von SEQ ID NO:2 verglichen wird.
Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 1, worin in Teil (a) das Polypeptid eine mindestens 90%ige Identität bezogen auf das Clustal-Alignmentverfahen aufweist, wenn es mit einem Polypeptid von SEQ ID NO:2 verglichen wird.
Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 1, worin in Teil (a) das Polypeptid eine mindestens 95%ige Identität bezogen auf das Clustal-Alignmentverfahren aufweist, wenn es mit einem Polypeptid von SEQ ID NO:2 verglichen wird.
Chimäres Konstrukt, umfassend das isolierte Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 10, das mit mindestens einer geeigneten Regulationssequenz operativ verknüpft ist.
Isolierte Wirtszelle, umfassend das chimäre Konstrukt nach Anspruch 11.
Isolierte Wirtszelle, umfassend ein isoliertes Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
Wirtszelle nach Anspruch 13, worin die Wirtszelle aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Hefe, Bakterien und Pflanzen.
Verfahren des Auswählen eines isolierten Polynukleotids, das sich auf die Konzentration der Δ-12-Epoxyfettsäuren in einer Wirtszelle auswirkt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Herstellen eines isolierten Polynukleotids, umfassend die Polynukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 10; (b) Einführen des isolierten Polynukleotids in eine Wirtszelle; (c) Bestimmen der An- oder Abwesenheit von Δ-12-Epoxyfettsäuren in der Wirtszelle von (b).
Verfahren nach Anspruch 15, worin das isolierte Polynukleotid aus einer Nukelotidsequenz von SEQ ID NO:1 besteht.
Verfahren zum Erhalt eines Nukleinsäurefragments, kodierend ein Cytochrom-P450-Enzym, das mit der Synthese von Δ-12-Epoxyfettsäuren assoziiert ist, umfassend die folgenden Schritte: (a) Sondieren einer cDNA oder genomischen Bibliothek mit einem isolierten Polynukleotid, umfassend die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1 und ein Komplement von solchen Nukleotidsequenzen; (b) Identifizieren eines DNA-Klon, der mit dem Polynukleotid von (a) oder dem Komplement davon hybridisiert; (c) Isolieren des identifizierten DNA-Klon; und (d) Sequenzieren einer cDNA oder eines genomischen Fragments, das den isolierten DNA-Klon umfasst.
Verfahren zur Herstellung von Δ-12-Epoxyfettsäuren in einer Wirtszelle, die Folgendes umfasst: (a) Transformieren einer Wirtszelle mit dem chimären Konstrukt nach Anspruch 11; (b) Züchten der transformierten Wirtszellen von Schritt (a); und (c) Bestimmen der An- oder Abwesenheit von Δ-12-Epoxyfettsäuren in den transformierten Zellen von (b).