DE60117228T2

DE60117228T2 - Defensine aus Arthropoden

Info

Publication number: DE60117228T2
Application number: DE60117228T
Authority: DE
Inventors: James K. Landenburg Presnail; Zude Des Plains Weng; James F. Newark Wong
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2000-04-14
Filing date: 2001-04-12
Publication date: 2006-11-09
Anticipated expiration: 2021-04-13
Also published as: EP1647557A3; US20020069427A1; EP1647557B1; DE60117228D1; EP1146052A2; US6777592B2; EP1146052B1; DE60136981D1; EP1647557A2; EP1146052A3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung liegt auf dem Gebiet der Pflanzenmolekularbiologie. Genauer gesagt betrifft diese Erfindung Nucleinsäurefragmente, die Arthropoden-Defensin kodieren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Defensine sind kleine, basische, Cystein-reiche Proteine, die durch die Erzeugung multimerer Poren in äußeren oder inneren biologischen Membranen, die zu Membranzerreißung und -depolarisation führen, breite antimikrobielle Aktivität haben. Sie haben eine breite phylogenetische Verteilung, wobei sie in Arthropoden, Säugetieren und Pflanzen gefunden worden sind.
Pflanzen-Defensine sind erst kürzlich identifiziert worden und sind nicht so gut charakterisiert wie ihre tierischen Gegenstücke. Mehrere Beobachtungslinien lassen jedoch die Wichtigkeit von Defensinen bei der Vermittlung von Resistenz des Wirts gegenüber mikrobiellem Angriff vermuten. Es wurde gezeigt, daß Pflanzen-Defensine einen schnellen K⁺-Efflux und Ca²⁺-Influx in fungalen Hyphen ebenso wie Alkalinisierung des Inkubationsmediums induzieren. Der Wirkmechanismus scheint jedoch keine direkten Defensin-Membran-Wechselwirkungen zu beinhalten, sondern eher ein anderes, möglicherweise Rezeptorvermitteltes Ereignis (Thevissen K. et al., (1996) J. Biol. Chem. 271:15018–15025). Es wurde auch gezeigt, daß sich Defensine bei Herausforderung durch fungale Pathogene systemisch ansammeln (Manners J.M. et al., (1998) Plant Mol. Biol. 38:1071–1080; Terras F.R. et al., (1998) Planta 206:117–124; Terras, F.R. et al., (1995) Plant Cell 7:573–588). Weiterhin wurde gefunden, daß transgener Tabak, der konstitutiv ein Rettich-Defensin exprimierte, verbesserte Resistenz gegen Infektion durch ein fungales Pathogen aufwies (Terras, F. R. et al., (1995) vorstehend).
Es wurde gezeigt, daß Pflanzen-Defensine durch künstliche Trockenheit (Maitra, N. und Cushman, J.C., (1998) Plant Physiol. 118:1536) und Salzstreß (Yamada, S. et al., (1997) Plant Physiol. 115:314) induziert werden, was vermuten läßt, daß diese Proteine eine allgemeinere Rolle in der Streßtoleranz spielen können, eine, die nicht auf Angriff durch Pathogene beschränkt ist.
Bei tierischen Systemen wurde über eine Beteiligung von Defensinen an einer systemischen Reaktion in Organismen sowohl von Wirbellosen (Mitta et al. (1999) J Cell Sci 112:4233242) als auch von Wirbeltieren (Panyutich et al. (1993) J Lab Clin Med 122:202–207) berichtet. Bei Menschen waren Plasmakonzentrationen von neutrophilen Defensinen bei Patienten mit Septikämie oder bakterieller Meningitis erhöht (Panyutich et al. (1993) J Lab Clin Med 122:202–207). Bei Muscheln (Mytilus galloprovincialis) wurde eine Zunahme in der plasmatischen Konzentration des MGD1-Defensins 24 Stunden nach bakterieller Herausforderung beobachtet (Mitta et al. (1999) J Cell Sci 112:4233–4242). Jedoch nahm gleichzeitig die MGD-Messenger-Konzentration dramatisch ab, welches nicht der bei Insekten beobachtete Fall ist, was einen Unterschied in der Regulierung der Defensingenexpression zwischen den Spezies anzeigt (Mitta et al. (1999) J Cell Sci 112:4233–4242).
Es hat Anstrengungen gegeben, kurze neue Peptide mit einer starken und breiten antibakteriellen Aktivität gentechnisch herzustellen, wobei Defensin als Ausgangspunkt verwendet wurde. Zum Beispiel haben, ausgehend von einem Oryctes-rhinoceros-Defensin, Ishibashi et al. (1999) [Eur J Biochem 266:616-623] fünf neue 9-mer-Peptide synthetisiert, die starke antibakterielle Aktivität und keine hämolytische Aktivität hatten.
Defensine sind früher aus Skorpionen, nämlich Androctonus australis (Ehret-Sabatier et al. (1996) J Biol Chem 271:29537–29544) und Leiurus quinquestriatus (Cociancich et al. (1993) Biochem Biophys Res Commun 194:17–22), isoliert worden. Im Gegensatz zu Muschel-Defensinen, deren Konzentration nach bakterieller Herausforderung erhöht ist, sind Skorpiondefensine konstitutiv in der Hämolymphe vorhanden (Ehret-Sabatier et al. (1996) J Biol Chem 271:29537–29544).
Isolation von mehr Nucleinsäurefragmenten, die Arthropoden-Defensin kodieren, kann zu einem besseren Verständnis des Wirkungsmechanismus von Defensin führen. Es ist möglich, daß mit diesen Nucleinsäurefragmenten in der Hand Defensine und/oder neue Peptide mit variierenden Graden von Cytotoxizität und unterschiedlichen Aktivitätsspekiren gestaltet werden können und transgene Pflanzen mit erhöhter Pathogenresistenz und Streßtoleranz erzeugt werden können.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes Polynucleotid, umfassend: (a) eine Nucleotidsequenz, kodierend ein Polypeptid, umfassend mindestens 30 Aminosäuren, wobei die Aminosäuresequenz des Polypeptids und die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 mindestens 80%, 85%, 90% oder 95% Identität, basierend auf dem Clustal-Ausrichtungsverfahren, haben, oder (b) das Komplement der Nucleotidsequenz, wobei das Komplement und die Nucleotidsequenz die gleiche Anzahl von Nucleotiden enthalten und zu 100% komplementär sind. Das Polypeptid umfaßt vorzugsweise die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2. Die Nucleotidsequenz umfaßt vorzugsweise die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO:1. Das Polypeptid ist vorzugsweise ein Defensin.
In einer zweiten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein chimäres Gen, umfassend irgendeines von den isolierten Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung, operabel verknüpft mit einer regulatorischen Sequenz, und eine Zelle, eine Pflanze und einen Samen, umfassend das chimäre Gen.
In einer dritten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Vektor, umfassend irgendeines der isolierten Polynucleotide der vorliegenden Erfindung.
In einer vierten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynucleotidfragment, umfassend eine Nucleotidsequenz, umfaßt durch eines der Polynucleotide der vorliegenden Erfindung, wobei die Nucleotidsequenz mindesten 30, 40 oder 60 Nucleotide enthält.
In einer fünften Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Transformieren einer Zelle, umfassend Transformieren einer Zelle mit irgendeinem der isolierten Polynucleotide der vorliegenden Erfindung, und die durch dieses Verfahren transformierte Zelle. Vorteilhafterweise ist diese Zelle eukaryotisch, z.B. eine Hefe- oder Pflanzenzelle, oder prokaryotisch, z.B. ein Bakterium.
In einer sechsten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen einer transgenen Pflanze, umfassend Transformieren einer Pflanzenzelle irgendeinem der isolierten Polynucleotide der vorliegenden Erfindung und Regenerieren einer Pflanze aus der transformierten Pflanzenzelle, die durch dieses Verfahren erzeugte transgene Pflanze, und den von dieser transgenen Pflanze erhaltenen Samen.
In einer siebenten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, umfassend mindestens 30 Aminosäuren, wobei die Aminosäuresequenz und die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 mindestens 80%, 85%, 90% oder 95% Identität, basierend auf dem Clustal-Ausrichtungsverfahren, haben. Die Aminosäuresequenz umfaßt vorzugsweise die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2. Das Polypeptid ist vorzugsweise ein Defensin.
In einer achten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Virus, vorzugsweise ein Baculovirus, umfassend irgendeines von den isolierten Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung oder eines von den chimären Genen der vorliegenden Erfindung.
In einer neunten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Auswählen eines isolierten Polynucleotids, das das Niveau der Expression eines Defensinproteins oder die Enzymaktivität in einer Wirtszelle, vorzugsweise einer Pflanzenzelle, beeinflußt, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: (a) Konstruieren eines isolierten Polynucleotids der vorliegenden Erfindung oder eines isolierten chimären Gens der vorliegenden Erfindung; (b) Einführen des isolierten Polynucleotids oder des isolierten chimären Gens in eine Wirtszelle; (c) Messen des Niveaus des Defensinproteins oder der Enzymaktivität in der das isolierte Polynucleotid enthaltenden Wirtszelle; und (d) Vergleichen des Niveaus des Defensinproteins oder der Enzymaktivität in der das isolierte Polynucleotid enthaltenden Wirtszelle mit dem Niveau des Defensinproteins oder der Enzymaktivität in der Wirtszelle, die das isolierte Polynucleotid nicht enthält.
In einer zehnten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhalt eines Nucleinsäurefragments, kodierend einen wesentlichen Anteil eines Defensinproteins, vorzugsweise eines Pflanzen- oder Arthropoden-Defensinproteins, umfassend die Schritte: Synthetisieren eines Oligonucleotidprimers, umfassend eine Nucleotidsquenz von mindestens einem von 60 (vorzugsweise mindestens einem von 40, am meisten bevorzugt von mindestens einem von 30) zusammenhängenden Nucleotiden, abgeleitet von einer Nucleotidsequenz von SEQ ID NO:1 und dem Komplement einer derartigen Nucleotidsquenz; und Amplifizieren eines Nucleinsäurefragments (vorzugsweise eine cDNA, insertiert in einem Klonierungsvektor) unter Verwendung eines Oligonucleotidprimers. Das amplifizierte Nucleinsäurefragement kodiert vorzugsweise einen wesentlichen Anteil einer Defensinproteinaminosäuresequenz.
In einer elften Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhalt eines Nucleinsäurefragments, kodierend die ganze oder einen wesentlichen Anteil der Aminosäuresequenz, kodierend ein Defensinprotein, umfassend die Schritte: Sondieren einer cDNA oder Genbank mit einem isolierten Polynucleotid der vorliegenden Erfindung; Identifizieren eines DNA-Klons, der mit einem isolierten Polynucleotid der vorliegenden Erfindung hybridisiert; Isolieren des identifizierten DNA-Klons; und Sequenzieren der cDNA oder des genomischen Fragments, das den isolierten DNA-Klon umfaßt.
In einer zwölften Ausführungsform betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur positiven Selektion einer transformierten Zelle, umfassend: (a) Transformieren einer Wirtszelle mit dem chimären Gen der vorliegenden Erfindung oder einer Expressionskassette der vorliegenden Erfindung; und (b) Züchten der transfomierten Wirtszelle, vorzugsweise einer Pflanzenzelle, wie beispielsweise ein Monokotyl oder ein Dikotyl, unter Bedingungen, die Expression des Defensinpolynucleotids in einer Menge erlauben, die ausreichend ist, um eine Nullmutante zu komplementieren, um ein positives Selektionsmittel bereitzustellen.
In einer dreizehnten Ausführungsform betrifft diese Erfindung ein Verfahren zum Ändern des Niveaus der Expression eines Defensinproteins in einer Wirtszelle, umfassend: (a) Transformieren einer Wirtszelle mit einem chimären Gen der vorliegenden Erfindung; und (b) Züchten der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die zur Expression des chimären Gens geeignet sind, wobei die Expression des chimären Gens zur Erzeugung geänderter Niveaus des Defensinproteins in der transformierten Wirtszelle führt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG UND DER SEQUENZAUFLISTUNGEN
Die Erfindung kann aus der folgenden ausführlichen Beschreibung und der begleitenden Zeichnung sowie der Sequenzauflistung, die einen Teil dieser Anmeldung bilden, vollständiger verstanden werden.
1 veranschaulicht die Aminosäuresequenzausrichtung zwischen dem Defensin, kodiert durch die Nucleotidsequenzen, abgeleitet von Scolopendra canidens DS Klon asc1.pk031.n7 (SEQ ID NO:2) und dem Defensin, isoliert aus Androctonus australis hector (NCBI GenBank Identifier (GI) Nr. 6014948; SEQ ID NO:3). Aminosäuren, die zwischen den zwei Sequenzen mit einer Aminosäure an dieser Position konserviert sind, sind mit einem Stern (*) angezeigt. Striche werden von dem Programm verwendet, um die Ausrichtung der Sequenzen zu maximieren. In der Ausrichtung stellt SEQ ID NO:3 die reife Proteinsequenz dar. Deshalb ist es wahrscheinlich, daß die 24 Aminosäuren in SEQ ID NO:2, die der anfänglichen Gly (G) in SEQ ID NO:3 vorangehen, ein Signalpeptid darstellen.
Tabelle 1 führt das Polypeptid, das hier beschrieben wird, die Bezeichnung des cDNA-Klons, der das Nucleinsäurefragment umfaßt, das ein Polypeptid kodiert, das alles oder einen wesentlichen Anteil von diesem Polypeptid darstellt, und den entsprechenden Identifier (SEQ ID NO:), wie sie in der angefügten Sequenzauflistung verwendet werden, auf. Tabelle 1 identifiziert auch den cDNA-Klon als individuellen EST („EST"), wobei die Sequenz des gesamten cDNA-Inserts den angegebenen cDNA-Klon („FIS"), einen Contig, zusammengefügt aus zwei oder mehreren ESTs („Contig"), einen Contig, zusammengefügt aus einem FIS und einem oder mehreren ESTs oder einer PCR-Fragmentsequenz („Contig*"), umfaßt oder wobei eine Sequenz das gesamte Protein, abgeleitet von einem EST, einem FIS, einem Contig oder einem FIS und einer PCR-Fragmentsequenz („CGS"), kodiert. Die SEQ ID NOs: 1, 2 und 3, die hier dargestellt sind, entsprechen den SEQ ID NOs: 1, 2 bzw. 3, die in der vorläufigen US-Patentanmeldung 60/197279, eingereicht am 14. April 2000, dargestellt sind. Die hier angefügten Sequenzbeschreibungen und die Sequenzauflistung erfüllen die Regeln, die die Nucleotid- und/oder Aminosäuresequenz-Offenbarungen in Patentanmeldungen bestimmen, wie sie in 37 C.F.R. § 1.821-1.825 angegeben sind.
TABELLE 1 – ARTHROPODEN-DEFENSINE
Die Sequenzauflistung enthält den Einbuchstabencode für Nucleotidsequenzmerkmale und die Dreibuchstabencodes für Aminosäuren, wie sie in Übereinstimmung mit den IUPAC-IUBMB-Standards definiert sind, die in Nucleic Acids Res. 13:3021–3030 (1985) und in dem Biochemical J. 219 (Nr. 2): 345–373 (1984) beschrieben sind. Die Symbole und das Format, die für die Nucleotid- und Aminosäuresequenzdaten verwendet wurden, erfüllen die Regeln, die in 37 C.F.R. § 1.822 angegeben sind.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In dem Zusammenhang dieser Offenbarung soll eine Anzahl von Begriffen benutzt werden. Die Begriffe „Polynucleotid", „Polynucleotidsequenz", „Nucleinsäuresequenz" und „Nucleinsäurefragment"/"isoliertes Nucleinsäurefragment" werden hier austauschbar verwendet. Diese Begriffe umfassen Nucleotidsequenzen und dergleichen. Ein Polynucleotid kann ein Polymer von RNA oder DNA sein, das einzel- oder doppelsträngig ist, das gegebenenfalls synthetische, nichtnatürliche oder veränderte Nucleotidbasen enthält. Ein Polynucleotid in der Form eines Polymers von DNA kann aus einem oder mehreren Segmenten von cDNA, genomischer DNA, synthetischer DNA oder Gemischen davon bestehen. Ein isoliertes Polynucleotid der vorliegenden Erfindung kann mindestens 60 zusammenhängende Nucleotide einschließen, vorzugsweise mindestens 40 zusammenhängende Nucleotide, am meisten bevorzugt mindestens 30 zusammenhängende Nucleotide, abgeleitet von SEQ ID NO:1, oder das Komplement derartiger Sequenzen.
Der Begriff „isoliertes Polynucleotid" bezeichnet ein Polynucleotid, das im wesentlichen frei von anderen Nucleinsäuresequenzen ist, wie beispielsweise und nicht begrenzt auf andere chromosomale und extrachromosomale DNA und RNA. Isolierte Polynucleotide können von einer Wirtszelle gereinigt werden, in welcher sie natürlicherweise vorkommen. Herkömmliche Nucleinsäure-Reinigungsverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, können verwendet werden, um isolierte Polynucleotide zu erhalten. Der Begriff umschließt auch rekombinante Polynucleotide und chemisch synthetisierte Polynucleotide.
Der Begriff „rekombinant" bedeutet zum Beispiel, daß eine Nucleinsäuresquenz durch eine künstliche Kombination von zwei ansonsten getrennten Segmenten der Sequenz hergestellt wird, z. B. durch chemische Synthese oder durch die Manipulation isolierter Nucleinsäuren durch Techniken genetischer Veränderung.
Wie hier verwendet bezeichnet „Contig" eine Nucleotidsequenz, die aus zwei oder mehreren konstituierenden Nucleotidsequenzen zusammengefügt ist, die gemeinsame oder überlappende Regionen von Sequenzhomologie teilen. Zum Beispiel können die Nucleotidsequenzen von zwei oder mehreren Nucleinsäurefragmenten verglichen und ausgerichtet werden, um gemeinsame oder überlappende Sequenzen zu identifizieren. Wo gemeinsame oder überlappende Sequenzen zwischen zwei oder mehreren Nucleinsäurefragmenten existieren, können die Sequenzen (und so ihre entsprechenden Nucleinsäurefragmente) zu einer einzigen zusammenhängenden Nucleotidsequenz zusammengefügt werden.
Wie hier verwendet bezeichnet „im wesentlichen ähnlich" Nucleinsäurefragmente, wobei Änderungen in einer oder mehreren Nucleotidbasen zu Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren führen, aber nicht die funktionellen Eigenschaften des Polypeptids, kodiert durch die Nucleotidsequenz, beeinflussen. „Im wesentlichen ähnlich" bezeichnet auch Nucleinsäurefragmente, wobei Änderungen in einer oder mehreren Nucleotidbasen die Fähigkeit des Nucleinsäurefragments, eine Änderung der Genexpression durch Genausschaltung zum Beispiel durch Antisense- oder Cosuppressionstechnologie zu vermitteln, nicht beeinflussen. „Im wesentlichen ähnlich" bezeichnet auch Modifizierungen der Nucleinsäurefragmente der vorliegenden Erfindung, wie beispielsweise Deletion oder Insertion von einem oder mehreren Nucleotiden, die die funktionellen Eigenschaften des resultierenden Transkripts, vis-a'-vis der Fähigkeit, Genausschaltung oder die Änderung der funktionellen Eigenschaften des resultierenden Proteinmoleküls zu vermitteln, nicht wesentlich beeinflussen. Es ist deshalb selbstverständlich, daß die Erfindung mehr als die speziellen, exemplarischen Nucleotid- oder Aminosäuresequenzen umschließt und funktionelle Äquivalente davon einschließt. Die Begriffe „im wesentlichen ähnlich" und „entsprechend im wesentlichen" sind hier austauschbar verwendet.
Im wesentlichen ähnliche Nucleinsäurefragmente können durch Screenen von Nucleinsäurefragmenten ausgewählt werden, die Subfragmente oder Modifizierungen der Nucleinsäurefragmente der vorliegenden Erfindung darstellen, wobei ein oder mehrere Nucleotide wegen ihrer Fähigkeit, das Niveau des Polypeptids, kodiert durch das unmodifizierte Nucleinsäurefragment in einer Pflanze oder Pflanzenzelle, zu beeinflussen, substituiert, deletiert und/oder insertiert sind. Zum Beispiel kann ein im wesentlichen ähnliches Nucleinsäurefragment, das mindestens 30 zusammenhängende Nucleotide, abgeleitet aus dem vorliegenden Nucleinsäurefragment, darstellt, konstruiert und in eine Pflanze oder Pflanzenzelle eingeführt werden. Das Niveau des Polypeptids, kodiert durch das unmodifizierte Nucleinsäurefragment, das in einer Pflanze oder Pflanzenzelle, ausgesetzt dem im wesentlichen ähnlichen Nucleinfragment, vorhanden ist, kann dann mit dem Niveau des Polypeptids in einer Pflanze oder Pflanzenzelle, die nicht dem im wesentlichen ähnlichen Nucleinsäurefragment ausgesetzt ist, verglichen werden.
Zum Beispiel ist auf dem Fachgebiet bekannt, daß Antisense-Suppression und Cosuppression von Genexpression unter Verwendung von Nucleinsäurefragmenten, die weniger als die gesamte Kodierungsregion eines Gens darstellen, und durch Verwendung von Nucleinsäurefragmenten, die nicht 100 %ige Sequenzidentität mit dem zu unterdrückenden Gen teilen, bewerkstelligt werden können. Darüber hinaus sind Veränderungen in einem Nucleinsäurefragment, die zu der Erzeugung einer chemisch äquivalenten Aminosäure an einer gegebenen Stelle führen, aber nicht die funktionellen Eigenschaften des kodierten Polypeptids beeinflussen, auf dem Fachgebiet bekannt. So kann ein Codon für die Aminosäure Alanin, eine hydrophobe Aminosäure, durch ein Codon, das einen anderen, weniger hydrophoben Rest, wie beispielsweise Glycin, oder einen stärker hydrophoben Rest, wie beispielsweise Valin, Leucin oder Isoleucin, kodiert, substituiert werden. Ähnlich kann von Änderungen, die zu Substitution von einem negativ geladenen Rest für einen anderen, wie beispielsweise Asparaginsäure für Glutaminsäure, oder einem positiv geladenen Rest für einen anderen, wie beispielsweise Lysin für Arginin, führen, auch erwartet werden, daß ein funktionell äquivalentes Produkt erzeugt wird. Von Nucleotidänderungen, die zu Veränderung der N-terminalen und C-terminalen Anteile des Polypeptidmoleküls führen, würde ebenfalls nicht erwartet werden, daß sie die Aktivität des Polypeptids verändern. Jede der vorgeschlagenen Modifizierungen ist Routine auf dem Fachgebiet, wie es die Bestimmung der Erhaltung von biologischer Aktivität der kodierten Produkte ist. Infolgedessen kann ein isoliertes Polynucleotid, umfassend eine Nucleotidsequenz von mindestens 60 (vorzugsweise mindestens 40, am meisten bevorzugt mindestens 30) zusammenhängenden Nucleotiden, abgeleitet von einer Nucleotidsequenz von SEQ ID NO:1 und dem Komplement einer derartigen Nucleotidsequenz, in Verfahren zum Auswählen eines isolierten Polynucleotids, das die Expression eines Defensinpolypeptids in einer Wirtszelle beeinflußt, verwendet werden. Ein Verfahren zum Auswählen eines isolierten Polynucleotids, das das Niveau der Expression eines Polypeptids in einem Virus oder in einer Wirtszelle (eukaryotisch, wie beispielsweise Pflanze oder Hefe, prokaryotisch, wie beispielsweise bakteriell) beeinflußt, kann die Schritte umfassen: Konstruieren eines isolierten Polynucleotids der vorliegenden Erfindung oder eines isolierten chimären Gens der vorliegenden Erfindung; Einführen des isolierten Polynucleotids oder des isolierten chimären Gens in eine Wirtszelle; Messen des Niveaus eines Polypeptids oder der Enzymaktivität in der das isolierte Polynucleotid enthaltenden Wirtszelle; und Vergleichen des Niveaus eines Polypeptids oder der Enzymaktivität in der das isolierte Polypeptid enthaltenden Wirtszelle mit dem Niveau eines Polypeptids oder der Enzymaktivität in einer Wirtszelle, die das isolierte Polynucleotid nicht enthält.
Darüber hinaus können im wesentlichen ähnliche Nucleinsäurefragmente auch durch ihre Fähigkeit zum Hybridisieren gekennzeichnet werden. Abschätzungen derartiger Homologie werden durch entweder DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung unter Bedingungen von Stringenz bereitgestellt, wie für den Fachmann selbstverständlich ist (Hames und Higgins, Hrsg. (1985) Nucleic Acid Hybridisation (Nucleinsäurehybridisierung), IRL Press, Oxford, UK). Stringenzbedingungen können angepaßt werden, um auf mäßig ähnliche Fragmente, wie beispielsweise homologe Sequenzen von entfernt verwandten Organismen, bis zu höchst ähnlichen Fragmenten, wie beispielsweise Gene, die funktionelle Enzyme von eng verwandten Organismen duplizieren, zu screenen. Waschungen nach der Hybridisierung bestimmen die Stringenzbedingungen. Ein Satz bevorzugter Bedingungen verwendet eine Serie von Waschungen, beginnend mit 6X SSC, 0,5% SDS bei Raumtemperatur für 15 min, dann wiederholt mit 2X SSC, 0,5% SDS bei 45°C für 30 min und dann zweimal wiederholt mit 0,2X SSC, 0,5% SDS bei 50°C für 30 min. Ein stärker bevorzugter Satz stringenter Bedingungen verwendet höhere Temperaturen, bei denen die Waschungen identisch zu den vorstehenden sind, ausgenommen, daß die Temperatur der finalen zwei 30-min-Waschungen in 0,2X SSC, 0,5% SDS auf 60°C erhöht wurde. Ein anderer bevorzugter Satz hochgradig stringenter Bedingungen verwendet zwei finale Waschungen in 0,1X SSC, 0,1% SDS bei 65°C.
Im wesentlichen ähnliche Nucleinsäurefragmente der vorliegenden Erfindung können auch durch die Prozent Identität der Aminosäuresequenzen, die sie kodieren, mit den hier offenbarten Aminosäuresequenzen gekennzeichnet werden, wie sie durch Algorithmen, die gewöhnlich vom Fachmann angewendet werden, bestimmt werden. Geeignete Nucleinsäurefragmente (isolierte Polynucleotide der vorliegenden Erfindung) kodieren Polypeptide, die zu mindestens etwa 70% identisch, vorzugsweise zu mindestens etwa 80% identisch mit den Aminosäuresequenzen sind, über die hier berichtet wird. Bevorzugte Nucleinsäurefragmente kodieren Aminosäuresequenzen, die zu mindestens etwa 85% identisch mit den Aminosäuresequenzen sind, über die hier berichtet wird. Stärker bevorzugte Nucleinsäurefragmente kodieren Aminosäuresequenzen, die zu mindestens etwa 90% identisch mit den Aminosäuresequenzen sind, über die hier berichtet wird. Am meisten bevorzugt sind Nucleinsäurefragmente, die Aminosäuresequenzen kodieren, die zu mindestens etwa 95% identisch mit den Aminosäuresequenzen sind, über die hier berichtet wird. Geeignete Nucleinsäurefragmente haben nicht nur die vorstehenden Identitäten, sondern kodieren typischerweise ein Polypeptid mit mindestens 30 oder 50 Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 100 Aminosäuren, stärker bevorzugt mindestens 150 Aminosäuren, noch stärker bevorzugt mindestens 200 Aminosäuren und am meisten bevorzugt mindestens 250 Aminosäuren. Berechnungen der Sequenzausrichtungen und der Prozent Identität wurden unter Verwendung des Megalign-Programms des LASERGENE-Bioinformatik-Programmpakets (DNASTAR Inc., Madison, WI) durchgeführt. Mehrfache Ausrichtung der Sequenzen wurde unter Verwendung des Clustal-Verfahrens der Ausrichtung (Higgins und Sharp (1989) CABIOS. 5:151–153) mit den Default-Parametern (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10) durchgeführt. Default-Parameter für paarweise Ausrichtungen unter Verwendung des Clustal-Verfahrens waren KTUPLE 1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 und DIAGONALS SAVED=5.
Ein „wesentlicher Anteil" einer Aminosäure- oder Nucleotidsequenz umfaßt eine Aminosäure- oder eine Nucleotidsequenz, die ausreichend ist, um eine mutmaßliche Identifikation des Proteins oder Gens zu liefern, das die Aminosäure- oder Nucleotidsequenz umfaßt. Aminosäure- und Nucleotidsequenzen können entweder manuell durch einen Fachmann oder durch Verwendung von computergestützten Sequenzvergleichs- und Identifikationshilfsprogrammen, die Algorithmen wie beispielsweise BLAST anwenden (Basic Local Alignment Search Tool (Grundlegendes Suchwerkzeug zur lokalen Ausrichtung)); Altschul et al. (1993) J. Mol. Biol. 215:403–410; siehe auch www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), bewertet werden. Im allgemeinen ist eine Sequenz von zehn oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren oder dreißig oder mehr zusammenhängenden Nucleotiden notwendig, um eine Polypeptid- oder Nucleinsäuresequenz mutmaßlich als homolog zu einem bekannten Protein oder Gen zu identifizieren. Darüber hinaus können im Hinblick auf Nucleotidsequenzen genspezifische Oligonucleotidsonden, umfassend 30 oder mehr zusammenhängende Nucleotide, in sequenzabhängigen Verfahren von Genidentifikation (z.B. Southern-Hybridisierung) und -isolation (z.B. in-situ-Hybridisierung von Bakterienkolonien oder Bakteriophagenplaquen) verwendet werden. Außerdem können kurze Oligonucleotide von 12 oder mehr Nucleotiden als Amplifikationsprimer in der PCR verwendet werden, um ein spezielles Nucleinsäurefragment zu erhalten, das die Primer umfaßt. Dementsprechend umfaßt ein „wesentlicher Anteil" einer Nucleotidsequenz eine Nucleotidsequenz, die spezifische Identifizierung und/oder Isolierung eines die Sequenz umfassenden Nucleinsäurefragments liefert. Die vorliegende Beschreibung lehrt Aminosäure- und Nucleotidsequenzen, die Polypeptide kodieren, die ein oder mehrere spezielle Pflanzenproteine umfassen. Der Fachmann, der die Sequenzen, wie sie hier berichtet werden, benutzt, kann nun alle oder einen wesentlichen Anteil der offenbarten Sequenzen für Zwecke verwenden, die dem Fachmann bekannt sind. Dementsprechend umfaßt die vorliegende Erfindung die vollständigen Sequenzen, wie sie in der begleitenden Sequenzauflistung berichtet werden, ebenso wie wesentliche Anteile dieser Sequenzen, wie sie vorstehend definiert sind.
„Codondegeneriertheit" bezeichnet Divergenz im genetischen Code, die Variation der Nucleotidsequenz gestattet, ohne die Aminosäuresequenz eines kodierten Polypeptids zu beeinflussen. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Nucleinsäurefragment, umfassend eine Nucleotidsequenz, die alle oder einen wesentlichen Anteil der hier angegebenen Aminosäuresequenzen kodiert. Der Fachmann ist sich des „Codon-Bias" bewußt, der durch eine spezielle Wirtszelle bei der Verwendung von Nucleotidcodons zur Spezifizierung einer gegebenen Aminosäure gezeigt wird. Daher ist es, wenn ein Nucleinsäurefragment für verbesserte Expression in einer Wirtszelle synthetisiert wird, wünschenswert, das Nucleinsäurefragment so zu gestalten, daß seine Frequenz der Codonverwendung sich der Frequenz der bevorzugten Codonverwendung der Wirtszelle annähert.
„Synthetische Nucleinsäurefragmente" können aus Oligonucleotidbausteinen zusammengefügt werden, die chemisch unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren synthetisiert werden. Diese Bausteine werden ligiert und annelliert, um größere Nucleinsäurefragmente zu erzeugen, welche dann enzymatisch zusammengefügt werden können, um das gesamte gewünschte Nucleinsäurefragment zu konstruieren. „Chemisch synthetisiert" bedeutet in bezug auf ein Nucleinsäurefragment, daß die Nucleotidkomponenten in vitro zusammengefügt wurden. Manuelle chemische Synthese von Nucleinsäurefragmenten kann unter Verwendung gut etablierter Verfahrensweisen bewerkstelligt werden, oder es kann automatisierte chemische Synthese durchgeführt werden, indem eine von einer Anzahl von im Handel erhältlichen Maschinen verwendet wird. Dementsprechend können die Nucleinsäurefragmente für optimale Genexpression, basierend auf einer Optimierung der Nucleotidsequenz, um den Codon-Bias der Wirtszelle wiederzuspiegeln, maßgeschneidert werden. Der Fachmann erkennt die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Genexpression, wenn die Codonverwendung in Richtung derjenigen Codons, die von dem Wirt begünstigt werden, verzerrt ist. Die Bestimmung bevorzugter Codons kann auf einem Überblick von Genen basieren, die von der Wirtszelle abgeleitet wurden, wo Sequenzinformation erhältlich ist.
„Gen" bezeichnet ein Nucleinsäurefragment, das ein spezifisches Protein einschließlich regulatorischer Sequenzen, die der kodierenden Sequenz vorausgehen (5' nicht kodierende Sequenzen) und folgen (3' nicht kodierende Sequenzen), exprimiert. „Natives Gen" bezeichnet ein Gen, wie es in der Natur mit seinen eigenen regulatorischen Sequenzen gefunden wird. „Chimäres Gen" bezeichnet ein Gen, das kein natives Gen ist, wobei es regulatorische und kodierende Sequenzen umfaßt, die in der Natur nicht zusammen gefunden werden. Dementsprechend kann ein chimäres Gen regulatorische Sequenzen und kodierende Sequenzen umfassen, die von verschiedenen Quellen abgeleitet sind, oder regulatorische Sequenzen und kodierende Sequenzen, die von der gleichen Quelle abgeleitet sind, aber in einer Weise angeordnet sind, die von der in der Natur gefundenen verschieden ist. „Endogenes Gen" bezeichnet ein natives Gen an seinem natürlichen Standort in dem Genom eines Organismus. Ein „fremdes Gen" bezeichnet ein Gen, das normalerweise nicht in dem Wirtsorganismus gefunden wird, aber das durch Gentransfer in den Wirtsorganimus eingeführt ist. Fremde Gene können native Gene, insertiert in einen nicht-nativen Organismus, oder chimäre Gene umfassen. Ein „Transgen" ist ein Gen, das durch ein Transformationsverfahren in das Genom eingeführt worden ist.
„Kodierende Sequenz" bezeichnet eine Nucleotidsequenz, die für eine spezielle Aminosäuresequenz kodiert. „Regulatorische Sequenzen" bezeichnen Nucleotidseqenzen, die stromaufwärts (5' nicht kodierende Sequenzen), innerhalb oder stromabwärts (3' nicht kodierende Sequenzen) einer kodierenden Sequenz gelegen sind und welche die Transkription, RNA-Verarbeitung oder -Stabilität, oder Translation der assoziierten kodierenden Sequenz beeinflussen. Regulatorische Sequenzen können Promotoren, Translations-Leader-Sequenzen, Introne und Polyadenylierungserkennungssequenzen einschließen.
„Promotor" bezeichnet eine Nucleotidsequenz, die imstande ist, die Expression einer kodierenden Sequenz oder funktionellen RNA zu steuern. Im allgemeinen befindet sich eine kodierende Sequenz 3' zu einer Promotorsequenz. Die Promotorsequenz besteht aus proximalen und mehr distalen stromaufwärts- Elementen, wobei die letzteren Elemente oft als Enhancer bezeichnet werden. Dementsprechend ist ein „Enhancer" eine Nucleotidsequenz, die die Promotoraktivität stimulieren kann und kann ein angeborenes Element des Promotors oder ein heterologes Element, insertiert, um das Niveau oder die Gewebespezifität des Promotors zu erhöhen, sein. Promotoren können in ihrer Gesamtheit von einem nativen Gen abgeleitet sein oder können aus verschiedenen Elementen, abgeleitet von verschiedenen in der Natur gefundenen Promotoren, bestehen oder können sogar synthetische Nucleotidsegmente umfassen. Es ist für den Fachmann selbstverständlich, daß unterschiedliche Promotoren die Expression eines Gens in unterschiedlichen Geweben oder Zelltypen oder auf unterschiedlichen Stufen der Entwicklung oder in Reaktion auf unterschiedliche Umweltbedingungen lenken können. Promotoren, die bewirken, daß ein Nucleinsäurefragment in den meisten Zelltypen zu den meisten Zeiten exprimiert wird, werden gewöhnlich als „konstitutive Promotoren" bezeichnet. Neue Promotoren verschiedener Typen, die in Pflanzenzellen verwendbar sind, werden ständig entdeckt; zahlreiche Beispiele können in der Zusammenstellung von Okamuro und Goldberg (1989) Biochemistry of Plants 15:1–82, gefunden werden. Es wird weiterhin anerkannt, daß, da in den meisten Fällen die exakten Grenzen regulatorischer Sequenzen nicht vollständig definiert worden sind, Nucleinsäurefragmente mit unterschiedlichen Längen identische Promotoraktivität haben können.
„Translations-Leadersequenz" bezeichnet eine Nucleotidsequenz, die sich zwischen der Promotorsequenz eines Gens und der kodierenden Sequenz befindet. Die Translations-Leadersequenz ist in der vollständig verarbeiteten mRNA stromaufwärts von der Translations-Startsequenz vorhanden. Die Translations-Leadersequenz kann Verarbeitung des primären Transkripts zu mRNA, mRNA-Stabilität oder Translationswirksamkeit beeinflussen. Beispiele von Translations-Leadersequenzen sind beschrieben worden (Turner and Foster (1995) Mol. Biotechnol. 3:225–236).
„3' nicht kodierende Sequenzen" bezeichnen Nucleotidsequenzen, die sich stromabwärts von einer kodierenden Sequenz befinden und Polyadenylierungs-Erkennungssequenzen und andere Sequenzen einschließen, die regulatorische Signale kodieren, die imstande sind, mRNA-Verarbeitung oder Genexpression zu beeinflussen. Das Polyadenylierungssignal ist gewöhnlich dadurch gekennzeichnet, daß es die Zugabe von Polyadenylsäureabschnitten zu dem 3'-Ende des mRNA-Vorläufers beeinflußt. Die Verwendung verschiedener 3' nicht kodierender Sequenzen wird beispielhaft von Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell 1:67180 erläutert.
„RNA-Transkript" bezeichnet das Produkt, das aus RNA-Polymerase-katalysierter Transkription einer DNA-Sequenz resultiert. Wenn das RNA-Transkript eine perfekte komplementäre Kopie der DNA-Sequenz ist, wird es als primäres Transkript bezeichnet, oder es kann eine RNA-Sequenz sein, abgeleitet aus posttranskriptioneller Verarbeitung des primären Transkripts, und wird als reife RNA bezeichnet. „Messenger-RNA (mRNA)" bezeichnet die RNA, die ohne Introne ist und die durch die Zelle in Polypeptide translatiert werden kann. „cDNA" bezeichnet DNA, die komplementär zu und abgeleitet von einem mRNA-Templat ist. Die cDNA kann einzelsträngig sein oder durch Verwendung, zum Beispiel, des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I zu doppelsträngiger Form umgewandelt sein. „Sense-RNA" bezeichnet ein RNA-Transkript, das die mRNA einschließt und so durch die Zelle in ein Polypeptid translatiert werden kann. „Antisense-RNA" bezeichnet ein RNA-Transkript, das komplementär zu dem gesamten oder einem Teil eines primären Zieltranskripts oder einer mRNA ist und das die Expression eines Zielgens blockiert (siehe US-Patentschrift 5107065). Die Komplementarität einer Antisense-RNA kann mit einem beliebigen Teil der speziellen Nucleotidsequenz sein, d.h. an der 5' nicht kodierenden Sequenz, 3' nicht kodierenden Sequenz, den Intronen oder der kodierenden Sequenz. „Funktionelle Sequenz" bezeichnet Sense-RNA, Antisense-RNA, Ribozym-RNA oder andere RNA, die nicht translatiert werden kann, aber doch eine Wirkung auf zelluläre Prozesse hat.
Der Begriff „operabel verknüpft" bezeichnet die Assoziation von zwei oder mehreren Nucleinsäurefragmenten auf einem einzelnen Polynucleotid, so daß die Funktion von einem durch den anderen beeinflußt wird. Zum Beispiel ist ein Promotor operabel mit einer kodierenden Sequenz verknüpft, wenn er imstande ist, die Expression dieser kodierenden Sequenz zu beeinflussen (d.h., daß die kodierende Sequenz unter der transkriptionellen Kontrolle des Promotors ist). Kodierende Sequenzen können operabel mit regulatorischen Sequenzen in Sense- oder Antisense-Orientierung verknüpft sein.
Der Begriff „Expression", wie er hier verwendet wird, bezeichnet die Transkription und stabile Akkumulation von Sense-(mRNA) oder Antisense-RNA, abgeleitet von dem Nucleinsäurefragment der Erfindung. Expression kann auch die Translation von mRNA in ein Polypeptid bezeichnen. „Antisense-Hemmung" bezeichnet die Erzeugung von Antisense-RNA-Transkripten, die imstande sind, die Expression des Zielproteins zu unterdrücken. „Überexpression" bezeichnet die Produktion eines Genprodukts in transgenen Organismen, die Niveaus der Produktion in normalen oder nichttransformierten Organismen überschreitet. „Cosuppression" bezeichnet die Erzeugung von Sense-RNA-Transkripten, die imstande sind, die Expression von identischen oder im wesentlichen ähnlichen fremden oder endogenen Genen zu unterdrücken (US-Patentschrift 5231020).
Ein „Protein" oder „Polypeptid" ist eine Kette von Aminosäuren, angeordnet in einer speziellen Ordnung, die durch die kodierende Sequenz in einem das Polypeptid kodierenden Polynucleotid bestimmt wird. Jedes Protein oder Polypeptid hat eine eindeutige Funktion.
„Geänderte Niveaus" oder „geänderte Expression" bezeichnet die Produktion von Genprodukten) in transgenen Organismen in Mengen oder Anteilen, die sich von denen von normalen oder nicht transformierten Organismen unterscheiden.
„Nullmutante" bezeichnet hier eine Wirtszelle, der entweder die Expression eines bestimmten Polypeptids fehlt oder die ein Polypeptid exprimiert, das inaktiv ist oder keine nachweisbare, erwartete enzymatische Funktion hat.
„Reifes Protein" oder der Begriff „reif", wenn er beim Beschreiben eines Proteins verwendet wird, bezeichnen ein post-translational verarbeitetes Polypeptid; d.h. eines, von dem alle Prä- oder Propeptide, die in dem primären Translationsprodukt vorhanden sind, entfernt worden sind. „Vorläuferprotein" oder der Begriff „Vorläufer", wenn er beim Beschreiben eines Proteins verwendet wird, bezeichnen das primäre Produkt der Translation von mRNA, d.h. mit noch vorhandenen Prä- und Propeptiden. Prä- und Propeptide können, ohne aber darauf begrenzt zu sein, intrazelluläre Lokalisationssignale sein.
Ein „Chloroplasten-Transitpeptid" ist eine Aminosäuresequenz, die in Verbindung mit einem Protein translatiert wird und das Protein zu dem Chloroplast oder anderen Plastidtypen lenkt, die in der Zelle vorhanden sind, in welcher das Protein hergestellt wird. „Chloroplasten-Transitsequenz" bezeichnet eine Nucleotidsequenz, die ein Chloroploasten-Transitpeptid kodiert. Ein „Signalpeptid" ist eine Aminosäuresequenz, die in Verbindung mit einem Protein translatiert wird und das Protein zu dem sekretorischen System lenkt (Chrispeels (1991) Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol.42:21–53). Wenn das Protein auf eine Vakuole gelenkt werden soll, kann weiterhin ein vakuolares Zielsteuerungssignal (vorstehend) hinzugegeben werden, oder wenn auf das endoplasmatische Reticulum, kann ein endoplasmatisches Reticulum-Retentionssignal (vorstehend) hinzugegeben werden. Wenn das Protein auf den Nukleus gelenkt werden soll, sollte jedes vorhandene Signalpeptid entfernt werden und statt dessen ein nukleares Lokalisationssignal (Raikhel (1992) Plant Phys. 100:1627–1632) eingeschlossen werden.
„Transformation" bezeichnet den Transfer eines Nucleinsäurefragments in das Genom eines Wirtsorganismus, resultierend in genetisch stabiler Vererbung. Wirtsorganismen, die die transformierten Nucleinsäurefragmente enthalten, werden als „transgene" Organismen bezeichnet. Zu Beispielen von Verfahren der Pflanzentransformation gehört Agrobacterium-vermittelte Transformation (De Blaere et al. (1987) Meth. Enzymol. 143:277) und Transformationstechnologie mit beschleunigten Teilchen oder „Genkanone" (Klein et al. (1987) Nature (London) 327:70–73; US-Patentschrift 4945050. So können isolierte Polynucleotide der vorliegenden Erfindung in rekombinante Konstrukte, typischerweise DNA-Konstrukte, eingebracht werden, die zur Einführung in eine Wirtszelle und zur Replikation in ihr imstande sind. Ein derartiges Konstrukt kann ein Vektor sein, der ein Replikationssystem und Sequenzen einschließt, die zur Transkription und Translation einer Polypeptid kodierenden Sequenz in einer gegebenen Wirtszelle imstande sind. Eine Anzahl von Vektoren, die zur stabilen Transfektion von Pflanzenzellen oder für die Schaffung transgener Pflanzen geeignet sind, wurde bei z.B. Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual (Klonierungsvektoren: Ein Laborhandbuch), 1985, Suppl. 1987; Weissbach und Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology (Verfahren für Pflanzenmolekularbiologie), Academic Press, 1989; und Flevin et al., Plant Molecular Biology Manual (Handbuch für Pflanzenmolekularbiologie), Kluwer Academic Publishers, 1990 beschrieben. Typischerweise schließen Pflanzenexpressionsvektoren zum Beispiel ein oder mehrere klonierte Pflanzengene unter der transkriptionellen Kontrolle von 5'- und 3'-regulatorischen Sequenzen und einen dominanten selektierbaren Marker ein. Derartige Pflanzenexpressionsvektoren können auch eine Promotor-regulatorische Region (z.B. eine regulatorische Region, die induzierbare oder konstitutive, durch Umwelt oder Entwicklung regulierte oder zell- oder gewebespezifische Expression kontrolliert), eine Transkriptionsinitiations-Startstelle, eine Ribosom-Bindungstelle, ein RNA-Verarbeitungssignal, eine Transkriptionsterminations-Stelle und/oder ein Polyadenylierungssignal enthalten.
Hier verwendete Standardtechniken für rekombinante DNA und molekulare Klonierung sind auf dem Fachgebiet bekannt und sind vollständiger bei Sambrook et al. Molecular Kloning: A Laboratory Manual(Molekulare Klonierung: Ein Laborhandbuch); Cold Spring Harbor Laborators Press: Cold Spring Harbor, 1989 (nachstehend „Maniatis") beschrieben.
„PCR" oder „Polymerase-Kettenreaktion" ist dem Fachmann als Technik bekannt, die für die Amplifilcation spezieller DNA-Segmente verwendet wird (US-Patentschriften 4683195 und 4800159).
Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes Polynucleotid, umfassend: (a) eine Nucleotidsequenz, kodierend ein Polypeptid, umfassend mindestens 30 Aminosäuren, wobei die Aminosäuresequenz des Polypeptids und die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 mindestens 80%, 85%, 90% oder 95% Identität, basierend auf dem Clustal-Ausrichtungsverfahren, haben, oder (b) das Komplement der Nucleotidsequenz, wobei das Komplement und die Nucleotidsequenz die gleiche Anzahl von Nucleotiden enthalten und zu 100% komplementär sind. Das Polypeptid umfaßt vorzugsweise die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2. Die Nucleotidsequenz umfaßt vorzugsweise die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO:1. Das Polypeptid ist vorzugsweise ein Defensin.
Nucleinsäurefragmente, die zumindest einen Anteil verschiedener Defensine kodieren, wurden isoliert und durch Vergleich statistischer Pflanzen-cDNA-Sequenzen mit Nucleotid- und Proteinsequenzen enthaltenden öffentlichen Datenbanken unter Verwendung der dem Fachmann bekannten BLAST-Algorithmen identifiziert. Die Nucleinsäurefragmente der vorliegenden Erfindung können zum Isolieren von cDNAs und Genen verwendet werden, die homologe Proteine aus der gleichen oder einer anderen Pflanzenspezies kodieren. Isolation homologer Gene unter Verwendung sequenzabhängiger Protokolle ist auf dem Fachgebiet bekannt. Zu Beispielen sequenzabhängiger Protokolle gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Verfahren der Nucleinsäurehybridisierung und Verfahren von DNA- und RNA-Amplifikation, wie sie durch verschiedene Verwendungen von Technologien zur Nucleinsäureamplifikation beispielhaft erläutert sind (z.B. Polymerase-Kettenreaktion, Lipase-Kettenreaktion).
Zum Beispiel konnten Gene, die andere Arthropoden-Defensine kodieren, als entweder cDNAs oder genomische DNAs, direkt isoliert werden, indem alle oder ein Teil der vorliegenden Nucleinsäurefragmente als DNA-Hybridisierungssonden verwendet werden, um Genbanken von einer gewünschten Pflanze zu screenen, wobei eine dem Fachmann bekannte Methodik angewendet wird. Spezifische Oligonucleotidsonden, die auf den vorliegenden Nucleinsäuresequenzen basieren, können nach Verfahren gestaltet und synthetisiert werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind (Maniatis). Darüber hinaus kann eine ganze Sequenz direkt verwendet werden, um DNA-Sonden nach Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, wie beispielsweise Techniken der statistischen Primer-DNA-Markierung, Nick-Translation, End-Markierung, oder RNA-Sonden unter Verwendung verfügbarer in-vitro-Transskriptionsysteme zu synthetisieren. Außerdem können spezifische Primer gestaltet und verwendet werden, um einen Teil oder alle von den vorliegenden Sequenzen zu amplifizieren. Die resultierenden Amplifikationsprodukte können direkt während Amplifikationsreaktionen markiert oder nach Amplifikationsreaktionen markiert und als Sonden verwendet werden, um cDNA in voller Länge oder genomische Fragmente unter Bedingungen geeigneter Stringenz zu isolieren.
Außerdem können zwei kurze Segmente der vorliegenden Nucleinsäurefragmente in Polymerase-Kettenreaktions-Protokollen verwendet werden, um längere Nucleinsäurefragmente zu amplifizieren, die homologe Gene von DNA oder RNA kodieren. Die Polymerase-Kettenreaktion kann auch an einer Genbank klonierter Nucleinsäurefragmente durchgeführt werden, wobei die Sequenz eines Primers von den vorliegenden Nucleinsäurefragmenten abgeleitet ist und die Sequenz des anderen Primers das Vorhandensein der Polyadenylsäureabschnitte an dem 3' Ende des Pflanzengene kodierenden mRNA-Vorläufers ausnutzt. Alternativ kann die zweite Primersequenz auf Sequenzen basieren, die von dem Klonierungsvektor abgeleitet sind. Zum Beispiel kann der Fachmann dem RACE-Protokoll folgen (Frohman et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8998–9002), um cDNAs zu erzeugen indem PCR verwendet wird, um Kopien von der Region zwischen einem einzelnen Punkt in dem Transkript und dem 3'- oder 5'-Ende zu amplifizieren. Primer, die in der 3'- und 5'-Richtung orientiert sind, können aus den vorliegenden Sequenzen gestaltet werden. Unter Verwendung von im Handel erhältlichen 3'-RACE- oder 5'-RACE-Systemen (BRL) können spezifische 3'- oder 5'-cDNA-Fragmente isoliert werden (Ohara et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5673–5677; Loh et al. (1989) Science 243:217–220). Produkte, die durch die 3'- und 5'-RACE-Verfahren erzeugt wurden, können kombiniert werden, um cDNAs mit voller Länge zu erzeugen (Frohmann und Martin (1989) Techniques 1:165). Infolgedessen kann ein Polynucleotid, umfassend eine Nucleotidsequenz von mindestens 60 (vorzugsweise mindestens 40, am meisten bevorzugt mindestens 30) zusammenhängenden Nucleotiden, abgeleitet von einer Nucleotidsequenz von SEQ ID NO:1 und dem Komplement einer derartigen Nucleotidsequenz, in derartigen Verfahren verwendet werden, um ein Nucleinsäurefragment zu erhalten, das einen wesentlichen Anteil einer Aminosäuresequenz eines Polypeptids kodiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erhalt eines Nucleinsäurefragments, kodierend einen wesentlichen Anteil eines Arthropoden-Defensinpolypeptids, umfassend die Schritte: Synthetisieren eines Oligonucleotidprimers, umfassend eine Nucleotidsequenz von mindestens 60 (vorzugsweise mindestens 40, am meisten bevorzugt mindestens 30) zusammenhängenden Nucleotiden, abgeleitet von einer Nucleotidsequenz von SEQ ID NO:1 und dem Komplement einer derartigen Nucleotidsequenz; und Amplifizieren eines Nucleinsäurefragments (vorzugsweise eine cDNA, insertiert in einen Klonierungsvektor) unter Verwendung des Oligonucleotidprimers. Das amplifizierte Nucleinsäuresefragment kodiert vorzugsweise einen Anteil eines Anthropoden-Defensinpolypeptids.
Verfügbarkeit des vorliegenden Nucleotids und abgeleiteter Aminosäuresequenzen erleichtert immunologisches Screening von cDNA-Expressions-Genbanken. Synthetische Peptide, die Teile der vorliegenden Aminosäuresequenzen darstellen, können synthetisiert werden. Diese Peptide können verwendet werden, um Tiere zu immunisieren, um polyklonale oder monoklonale Antikörper mit Spezifität für die Aminosäuresequenzen umfassenden Peptide oder Proteine herzustellen. Diese Antikörper können dann verwendet werden, um cDNA-Expressions-Genbanken zu screenen, um interessierende cDNA-Klone mit voller Länge zu exprimieren (Lerner (1984) Adv. Immunol. 36:1–34, Maniatis).
In einer anderen Ausführungsform betrifft diese Erfindung Viren und Wirtszellen, umfassend entweder die chimären Gene der Erfindung, wie sie hier beschrieben sind, oder ein isoliertes Polynucleotid der Erfindung, wie es hier beschrieben ist. Beispiele von Wirtszellen, die verwendet werden können, um die Erfindung praktisch auszuführen, schließen, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Hefe, Bakterien und Pflanzen ein.
Wie vorstehend vermerkt wurde, können die Nucleinsäurefragmente der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um transgene Pflanzen zu erzeugen, in denen die offenbarten Polypeptide mit anderen als normalen Niveaus oder in Zelltypen oder Entwicklungsstufen, in denen sie normalerweise nicht gefunden werden, vorhanden sind. Dies würde die Wirkung haben, das Niveau der Resistenz gegen infizierende Organismen und Pathogene in diesen Zellen zu verändern.
Überexpression der Proteine der vorliegenden Erfindung kann erreicht werden, indem zuerst ein chimäres Gen konstruiert wird, in welchem die kodierende Region operabel mit einem Promotor verknüpft ist, der imstande ist, die Expression eines Gens in den gewünschten Geweben mit dem gewünschten Stadium der Entwicklung zu lenken. Das chimäre Gen kann Promotorsequenzen und Translations-Leadersequenzen, abgeleitet von den selben Genen, umfassen. 3'-Nicht-kodierende Sequenzen, die Transkriptionsterminations-Signale kodieren, können ebenfalls bereitgestellt werden. Das vorliegende chimäre Gen kann auch ein oder mehrere Introne umfassen, um die Genexpression zu erleichtern.
Plasmidvektoren, die das vorliegende isolierte Polynucleotid (oder chimäre Gen) umfassen, können konstruiert werden. Die Wahl des Plasmidvektors ist abhängig von dem Verfahren, das verwendet wird, um Wirtspflanzen zu transformieren. Der Fachmann ist sich der genetischen Elemente bewußt, die auf dem Plasmidvektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen, enthaltend das chimäre Gen, erfolgreich zu transformieren, zu selektieren und zu vermehren. Der Fachmann erkennt auch, daß unterschiedliche unabhängige Transformationsereignisse zu unterschiedlichen Niveaus und Mustern der Expression führen (Jones et al. (1985) EMBO J. 4:2411–2418; De Almeida et al. (1989) Mol. Gen. Genetics 218:78–86), und so, daß mehrfache Ereignisse gescreent werden müssen, um Linien zu erhalten, die das gewünschte Niveau und Muster der Expression zeigen. Derartiges Screening kann durch Southern-Analyse von DNA, Northern-Analyse von mRNA-Expression, Western-Analyse von Proteinexpression oder phänotypische Analyse erreicht werden.
Für einige Anwendungen kann es nützlich sein, die vorliegenden Polypeptide zu verschiedenen Zellkompartimenten zu lenken oder ihre Sekretion aus der Zelle zu erleichtern. Es wird so für möglich gehalten, daß das vorstehend beschriebene chimäre Gen weiter ergänzt werden kann, indem die kodierende Sequenz gelenkt wird, um die vorliegenden Polypeptide mit geeigneten intrazellulären zielorientierten Sequenzen, wie beispielsweise Transitsequenzen (Keegstra (1989) Cell 56:247–253), Signalsequenzen oder Sequenzen, die endoplasmatische Reticulum-Lokalisation kodieren (Chrispeels (1991) Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 42:21–53), oder Signale nuklearer Lokalisation (Raikhel (1992) Plant Phys. 100: 1627-1632) mit oder ohne Entfernen zielorientierter Sequenzen, die bereits vorhanden sind, zu kodieren. Wenn auch die zitierten Druckschriften Beispiele von jedem von diesen geben, ist die Liste nicht erschöpfend und es können in der Zukunft mehr zielorientierte Signale zum Gebrauch entdeckt werden.
Es kann auch wünschenswert sein, für einige Anwendungen die Expression von Genen, die die vorliegenden Polypeptide in Pflanzen kodieren, zu verringern oder zu beseitigen. Um dies zu erreichen, kann ein chimäres Gen, das für Cosuppression des vorliegenden Polypeptids gestaltet ist, konstruiert werden, indem ein Gen oder Genfragment, das dieses Polypeptid kodiert, mit Pflanzenpromotorsequenzen verknüpft wird. Alternativ kann ein chimäres Gen, das gestaltet ist, Antisense-RNA für das ganze oder einen Teil des vorliegenden Nucleinsäurefragments zu exprimieren, konstruiert werden, indem das Gen oder Genfragment in rückwärtiger Orientierung mit Pflanzenpromotorsequenzen verknüpft wird. Entweder die Cosuppressions- oder die chimären Antisense-Gene könnten durch Transformation in Pflanzen eingeführt werden, wobei Expression der entsprechenden endogenen Gene verringert oder beseitigt wird.
Molekulargenetische Lösungen für die Erzeugung von Pflanzen mit veränderter Genexpression haben einen entscheidenden Vorteil gegenüber traditionelleren Herangehensweisen zur Pflanzenzüchtung. Änderungen in Pflanzenphänotypen können erzeugt werden, indem spezifisch die Expression von einem oder mehreren Genen durch Antisense-Hemmung oder Cosuppression gehemmt wird (US-Patentschriften 5190931, 5107065 und 5283323). Ein Antisense- oder Cosuppressions-Konstrukt würde als dominanter negativer Regulator der Genaktivität wirken. Wenn auch herkömmliche Mutationen negative Regulation der Genaktivität ergeben können, sind diese Wirkungen sehr wahrscheinlich rezessiv. Die dominante negative Regulation, die mit einer transgenen Herangehensweise verfügbar ist, kann aus einer Perspektive der Züchtung vorteilhaft sein. Außerdem kann die Fähigkeit, die Expression eines speziellen Phänotyps durch die Verwendung von gewebespezifischen Promotoren auf die reproduktiven Gewebe der Pflanze zu beschränken, agronomische Vorteile relativ zu herkömmlichen Mutationen verleihen, welche eine Wirkung in allen Geweben haben können, in denen ein mutantes Gen gewöhnlich exprimiert wird.
Der Fachmann weiß, daß besondere Überlegungen mit der Verwendung von Antisense- oder Cosuppressions-Technologien verbunden sind, um die Expression spezieller Gene zu verringern. Zum Beispiel kann das richtige Niveau der Expression von Sense- oder Antisense-Genen die Verwendung unterschiedlicher chimärer Gene erfordern, die unterschiedliche regulatorische Elemente benutzen, die dem Fachmann bekannt sind. Sobald durch eines der vorstehend beschriebenen Verfahren transgene Pflanzen erhalten werden, wird es notwendig, individuelle Transgene auf diejenigen zu screenen, die den gewünschten Phänotyp am wirksamsten zeigen. Dementsprechend wird der Fachmann Verfahren zum Screenen einer großen Anzahl von Transformanten entwickeln. Die Natur dieser Screenings wird im allgemeinen nach praktischen Gründen ausgewählt. Zum Beispiel kann man screenen, indem man nach Änderungen in der Genexpression sucht, indem Antikörper verwendet werden, die spezifisch für das Protein sind, das durch das Gen kodiert wird, das unterdrückt wird, oder man könnte Assays etablieren, die spezifisch die Enzymaktivität messen. Ein bevorzugtes Verfahren ist eines, das erlaubt, daß eine große Anzahl von Proben schnell verarbeitet wird, da erwartet wird, daß eine große Anzahl von Transformanten für den gewünschten Phänotyp negativ ist.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, umfassend mindestens 30 Aminosäuren, wobei die Aminosäuresequenz und die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 mindestens 80%, 85%, 90% oder 95% Identität, basierend auf dem Clustal-Ausrichtungsverfahren, haben. Die Aminosäuesequenz umfaßt bevorzugt die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2. Das Polypeptid ist vorzugsweise ein Defensin.
Die vorliegenden Polypeptide (oder Anteile davon) können in heterologen Wirtszellen, besonders in den Zellen von mikrobiellen Wirten, erzeugt werden und können verwendet werden, um nach Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, Antikörper für diese Proteine herzustellen. Die Antikörper sind zum Nachweisen der Polypeptide der vorliegenden Erfindung in situ in Zellen oder in vitro in Zellextrakten verwendbar. Bevorzugte heterologe Wirtszellen zur Erzeugung der vorliegenden Polypeptide sind mikrobielle Wirte. Mikrobielle Expressionssysteme und Expressionsvektoren, die regulatorische Sequenzen enthalten, die Expression mit hohem Niveau von fremden Proteinen lenken, sind dem Fachmann bekannt. Alle von diesen könnten verwendet werden, um ein chimäres Gen zur Erzeugung der vorliegenden Polypeptide zu konstruieren. Dieses chimäre Gen könnte dann durch Transformation in geeignete Mikroorganismen eingeführt werden, um Expression mit hohem Niveau von dem kodierten Defensin bereitzustellen. Ein Beispiel eines Vektors für Expression mit hohem Niveau der vorliegenden Polypeptide in einem bakteriellen Wirt wird bereitgestellt (Beispiel 6).
Alle oder ein wesentlicher Teil der Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können auch als Sonden für genetisches oder physikalisches Mapping der Gene, von denen sie ein Teil sind, verwendet werden und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verknüpft sind, verwendet werden. Derartige Information kann bei der Pflanzenzüchtung verwendbar sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln. Zum Beispiel können die vorliegenden Nucleinsäurefragmente als Marker für Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) verwendet werden. Southern Blots (Maniatis) von restrikitionsdigestierter pflanzengenomischer DNA können mit den Nucleinsäurefragmenten der vorliegenden Erfindung sondiert werden. Die resultierenden Bandenmuster können dann genetischen Analysen unter Verwendung von Computerprogrammen wie beispielsweise MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1:174–181) unterworfen werden, um eine Genkarte zu konstruieren. Außerdem können die Nucleinsäurefragmente der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Southern Blots zu sondieren, die Restrikitionsendonuclease-behandelte genomische DNAs einer Gruppe von Individuen enthalten, die Elternteil und Nachkommenschaft einer definierten genetischen Kreuzung repräsentieren. Segregation der DNA-Polymorphismen wird vermerkt und verwendet, um die Position der vorliegenden Nucleinsäuresequenz auf der Genkarte zu berechnen, die zuvor unter Verwendung dieser Population erhalten wurde (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Gent. 32:314–331).
Die Herstellung und Verwendung von Pflanzengen-abgeleiteten Sonden zur Verwendung bei genetischem Mapping ist bei Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4:37–41 beschrieben. Zahlreiche Publikationen beschreiben genetisches Mapping von speziellen cDNA-Klonen unter Verwendung der vorstehend dargelegten Methodik oder von Variationen davon. Zum Beispiel können F2-Kreuzungspopulationen, Rückkreuzungspopulationen, statistische gepaarte Populationen, nahezu isogene Linien und andere Gruppen von Individuen zum Mapping verwendet werden. Derartige Methodiken sind dem Fachmann bekannt.
Nucleinsäuresonden, abgeleitet von den vorliegenden Nucleinsäuresequenzen, können ebenfalls zum physikalischen Mapping (d.h. Plazierung von Sequenzen auf physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al. in Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide (Genomische Analyse bei Nichtsäugern: Ein praktischer Leitfaden), Academic press 1996, S. 319-346, und darin zitierte Druckschriften) verwendet werden.
In einer anderen Ausführungsform können Nucleinsäuresonden, abgeleitet von den vorliegenden Nucleinsäuresequenzen, in direktem Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungs-(FISH)-Mapping verwendet werden (Trask (1991) Trends Genet. 7:149–154). Obwohl derzeitige Verfahren des FISH-Mapping die Verwendung großer Klone (einige bis einige hundert KB; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5:13–20) begünstigen, können Verbesserungen der Empfindlichkeit die Durchführung von FISH-Mapping unter Verwendung kürzerer Sonden erlauben.
Eine Vielzahl von auf Nucleinsäureamplifikation basierenden Verfahren zum genetischen und physikalischen Mapping kann unter Verwendung der vorliegenden Nucleinsäuresequenzen ausgeführt werden. Zu Beispielen gehören Allel-spezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med. 11:95-96), Polymorphismus von PCR-amplifizierten Fragmenten (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16:325–332), Allel-spezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241:1077–1080), Nucleotidextensionsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18:3671), (Radiation Hybrid Mapping (Strahlungshybrid-Mapping) (Walther et al. (1997) Nat. Genet. 7:22–28) und Happy Mapping (Glückliches Mapping) (Dear and Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17:6795–6807). Für diese Verfahren wird die Sequenz eines Nucleinsäurefragments verwendet, um Primerpaare zur Verwendung in der Amplifikationsreaktion oder in Primerextensionsreaktionen zu gestalten und zu erzeugen. Die Gestaltung derartiger Primer ist dem Fachmann bekannt. In Verfahren, die auf PCR basierendes genetisches Mapping anwenden, kann es notwendig sein, DNA-Sequenzunterschiede zwischen den Elterteilen der Mapping-Kreuzung in der Region, die der vorliegenden Nucleinsäuresequenz entspricht, zu identifizieren. Dies ist jedoch im allgemeinen für Mapping-Verfahren nicht notwendig.
Verlust von funktionsmutanten Phänotypen kann für die vorliegenden cDNA-Klone entweder durch Protokolle gezielter Gendisruption oder durch Identifizieren spezifischer Mutanten für diese Gene, enthalten in einer Maispopulation, die Mutationen in allen möglichen Genen trägt (Ballinger und Benzer (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9402–9406); Koes et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:8149– 8153; Bensen et al. (1995) Plant Cell 7:75–84) identifiziert werden. Die letztere Herangehensweise kann auf zwei Wegen bewerkstelligt werden. Zuerst können kurze Segmente der vorliegenden Nucleinsäurefragmente in Polymerase-Kettenreaktions-Protokollen in Verbindung mit einem Mutationsmarkierungssequenz-Primer an DNAs verwendet werden, die aus einer Population von Pflanzen hergestellt sind, in welche Mutator-Transposone oder einige andere mutationsverursachende DNA-Elemente eingeführt worden sind (siehe Bensen, vorstehend). Die Amplifikation eines speziellen DNA-Fragments mit diesen Primern zeigt die Insertion des Mutationsmarkierungselements in oder nahe dem Pflanzengen, das das vorliegende Polypeptid kodiert. Alternativ kann das vorliegende Nucleinsäurefragment als Hybridisierungssonde gegen PCR-Amplifikationsprodukte verwendet werden, die aus der Mutationspopulation unter Verwendung des Mutationsmarkierungssequenz-Primers in Verbindung mit einem Primer der willkürlichen genomischen Stelle, wie beispielsweise dem für einen an der Restriktionsenzym-Stelle verankerten synthetischen Adaptor, erzeugt werden. Mit beiden Verfahren kann eine Pflanze, enthaltend eine Mutation in dem endogenen Gen, kodierend das vorliegende Polypeptid, identifiziert und erhalten werden. Diese mutante Pflanze kann dann verwendet werden, um die natürliche Funktion der hier offenbarten vorliegenden Polypeptide zu bestimmen oder zu bestätigen.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin in den folgenden Beispielen definiert, in denen Teile und Prozente auf das Gewicht bezogen sind und Grade Celsius sind, wenn es nicht anderweitig angegeben ist. Es sollte selbstverständlich sein, daß diese Beispiele, wenn sie auch bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung anzeigen, nur zur Veranschaulichung angegeben sind. Aus der vorstehenden Diskussion und diesen Beispielen kann der Fachmann die wesentlichen Eigenschaften dieser Erfindung in Erfahrung bringen und kann, ohne von deren Geist abzuweichen, verschiedene Änderungen und Modifizierungen der Erfindung machen, um sie an verschiedene Verwendungen und Bedingungen anzupassen. So werden verschiedene Modifizierungen der Erfindung zusätzlich zu denjenigen, die hier gezeigt und beschrieben sind, dem Fachmann aus der vorhergehenden Beschreibung offensichtlich.
BEISPIEL 1
ZUSAMMENSETZUNG DER CDNA-GENBANK, ISOLIERUNG UND SEQUENZIERUNG VON CDNA-KLONEN
Eine cDNA-Genbank, darstellend mRNAs aus Gewebe von Scolopendra candidens DS, wurde hergestellt. Die Eigenschaften der Genbank sind nachstehend beschrieben.
TABELLE 2 – cDNA-Genbank von Scolopendra canidens DS
cDNA-Genbanken können nach einem beliebigen von vielen verfügbaren Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel können die cDNAs in Plasmidvektoren eingeführt werden, indem zuerst die cDNA-Genbanken in Uni-ZAP^TMXR-Vektoren entsprechend dem Protokoll des Herstellers (Stratagene Kloning Systems, La Jolla, CA) hergestellt werden. Die Uni-ZAP^TMXR-Genbanken werden entsprechend dem von Stratagene bereitgestellten Protokoll in Plasmidgenbanken umgewandelt. Nach der Umwandlung sind cDNA-Inserts in dem Plasmidvektor pBluescript enthalten. Außerdem können die cDNAs direkt in vorgeschnittene Bluescript-II-SK(+)-Vektoren (Stratagene) eingeführt werden, wobei T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) verwendet wird, und nachfolgend entsprechend dem Protokoll des Herstellers (GIBCO BRL Products) in DH10B-Zellen transfiziert werden. Sobald die cDNA-Inserts in Plasmidvektoren sind, werden Plasmid-DNAs aus statistisch ausgesuchten Bakterienkolonien, die rekombinante pBluescript-Plasmide enthalten, hergestellt oder die Insert-cDNA-Sequenzen werden über Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von Primern amplifiziert, die spezifisch für Vektorsequenzen sind, die die insertierten cDNA-Sequenzen flankieren. Amplifizierte Insert-DNAs oder Plasmid-DNAs werden in Farbstoff-Primer-Sequenzierungsreaktionen sequenziert, um partielle cDNA-Sequenzen zu erzeugen (exprimierte Sequenzmarkierungen oder „ESTs"; siehe Adams et al., (1991) Science 252:1651–1656). Die resultierenden ESTs werden unter Verwendung eines Fluoreszenzsequenzierers Perkin Elmer Model 377 analysiert.
Werte der Sequenz des vollen Inserts (FIS) werden unter Ausnutzung eines modifizierten Transpositionsprotokolls erzeugt. Klone, identifiziert für FIS, werden aus archivierten Glycerolausgangsstoffen als einzelne Kolonien gewonnen, und Plasmid-DNAs werden über alkalische Lyse isoliert. Isolierte DNA-Template werden in einer auf PCR basierenden Sequenzierungsreaktion mit Vektorvorbereiteten M13 vorwärts- und rückwärts-Oligonucleotiden umgesetzt und auf automatisierte Sequenzierer aufgebracht. Bestätigung der Klonidentifizierung wird durch Sequenzausrichtung auf die ursprüngliche EST-Sequenz, aus der die FIS-Anforderung hergestellt ist, durchgeführt.
Bestätigte Template werden über das Primer-Island-Transpositionskit (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) transponiert, welches auf dem transponierbaren Element Saccharomyces cerevisiae Tyl basiert (Devine and Boeke (1994) Nucleic Acids Res. 22:3765–3772). Das in-vitro-Transpositionssystem plaziert einzigartige Bindungsstellen statistisch überall in einer Population von großen DNA-Molekülen. Die transponierte DNA wird dann verwendet, um elektrokompetente DH10B-Zellen (Gibco BRL/Life Technologies, Rockville, MD) über Elektroporation zu transformieren. Das transponierbare Element enthält einen zusätzlichen selektierbaren Marker (genannt DHFR; Fling und Richards (1983) Nucleic Acids Res. 11:5147-5158), der duale Auswahl auf Agarplatten von nur denjenigen Subklonen, die das integrierte Transposon enthalten, erlaubt. Mehrfache Subklone werden statistisch aus jeder Transpositionsreaktion selektiert, Plasmid-DNAs werden über alkalische Lyse hergestellt und Template werden außerhalb der Stelle des Transpositionsereignisses unter Benutzung von einzigartigen Primern, spezifisch für die Bindungsstellen innerhalb des Transposons sequenziert (ABI-Prism-Farbstoff-Terminator-ReadyReaction-Gemisch).
Sequenzwerte werden gesammelt (ABI Prism Collections) und unter Verwendung von Phred/Phrap zusammengefügt (P. Green, University of Washington, Seattle). Phred/Phrap ist ein Softwareprogramm mit öffentlicher Domäne, welches die ABI-Sequenzwerte wieder liest, die Basen wieder abruft, Qualitätswerte zuordnet und die Grundsignale und Qualitätswerte in editierbare Ausgabekarteien schreibt. Das Phrap- Sequenzzusammenfügungsprogramm verwendet diese Qualitätswerte, um die Genauigkeit der zusammengefügten Sequenz-Contigs zu erhöhen. Zusammenfügungen werden durch den Consed-Sequenzeditor betrachtet (D. Gordon, University of Washington, Seattle).
In einigen von den Klonen entspricht das cDNA-Fragment einem Teil des 3'-Terminus des Gens und bedeckt den gesamten offenen Leserahmen nicht. Um die Stromaufwärts-Information zu erhalten, wird eines von zwei unterschiedlichen Protokollen verwendet. Das erste von diesen Verfahren führt zu der Herstellung eines Fragments von DNA, enthaltend einen Anteil der gewünschten Gensequenz, während das zweite Verfahren zu der Herstellung eines Fragments, enthaltend den gesamten offenen Leserahmen, führt. Alle beide Verfahren verwenden zwei Runden von PCR-Amplifikation, um Fragmente von einer oder mehreren Genbanken zu erhalten. Die Genbanken werden manchmal auf der Basis von vorherigem Wissen ausgewählt, daß das spezielle Gen in einem bestimmten Gewebe zu finden sein sollte, und werden manchmal statistisch ausgewählt. Reaktionen, um das gleiche Gen zu erhalten, können an mehreren Genbanken parallel oder an einem Pool von Genbanken durchgeführt werden. Genbankpoole werden normalerweise hergestellt, indem von 3 bis 5 verschiedene Poole verwendet werden und zu einer gleichmäßigen Verdünnung normiert werden. In der ersten Runde der Amplifikation verwenden beide Verfahren einen vektorspezifischen (vorwärts) Primer, entsprechend einem Anteil des Vektors, gelegen an dem 5'-Terminus des Klons, gekoppelt mit einem genspezifischen (rückwärts) Primer. Das erste Verfahren verwendet eine Sequenz, die komplementär zu einem Teil der bereits bekannten Gensequenz ist, während das zweite Verfahren einen genspezifischen Primer verwendet, der komplementär zu einem Teil der 3'-untranslatierten Region (auch als UTR bezeichnet) ist. In der zweiten Runde der Amplifikation wird für beide Verfahren eine nested-Gruppe von Primern verwendet. Das resultierende DNA-Fragment wird unter Verwendung eines kommerziellen Kits und folgend dem Protokoll des Herstellers in einen pBluescript-Vektor ligiert. Dieser Kit wird aus vielen ausgewählt, die von verschiedenen Lieferanten, einschließlich Invitrogen (Carlsbad, CA), Promega Biotech (Madison, WI) und Gibco-BRL (Gaithersburg, MD) erhältlich sind. Die Plasmid-DNA wird durch ein alkalisches Lyseverfahren isoliert und Sequenzieren und Zusammenfügen unterworfen, indem wie vorstehend Phred/Phrap verwendet wird.
BEISPIEL 2
IDENTIFIZIERUNG VON CDNA-KLONEN
cDNA-Klone, die Defensine kodieren, wurden identifiziert, indem Suchen mit BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al. (1993) J. Mol. Biol. 215:403–410; siehe auch www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST auf Ähnlichkeit mit Sequenzen durchgeführt wurden, die in der BLAST-„nr"-Datenbank (umfassend alle nicht redundanten GenBank-CDS-Translationen, Sequenzen, abgeleitet von der Brookhaven Protein Data Bank mit 3-dimensionaler Struktur, der letzten Hauptausgabe der SWISS- PROT-Proteinsequenz-Datenbank, EMBL, und DDBJ-DatenGenbanken) enthalten sind. Die cDNA-Sequenzen, erhalten in Beispiel 1, wurden auf Ähnlichkeit mit allen öffentlich zugänglichen DNA-Sequenzen, die in der „nr"-Datenbank enthalten sind, analysiert, indem der BLASTN-Algorithmus, bereitgestellt von dem National Center for Biotechnology Information (NCBI) verwendet wurde. Die DNA-Sequenzen wurden in alle Leserahmen translatiert und auf Ähnlichkeit mit allen öffentlich zugänglichen Proteinsequenzen, enthalten in der „nr" Datenbank, unter Verwendung des BLASTX-Algorithmus (Gish and States (1993) Nat. Genet. 3:266–272), bereitgestellt von dem NCBI, verglichen. Der Bequemlichkeit halber wird der P-Wert (Wahrscheinlichkeit) der Beobachtung einer Übereinstimmung einer cDNA-Sequenz mit einer Sequenz, enthalten in den durchsuchten Datenbanken bloß durch Zufall, wie durch BLAST berechnet, hier als „pLog"-Werte berichtet, die das Negative des Logarithmus des berichteten P-Werts darstellen. Dementsprechend ist, je größer der pLog-Wert ist, die Wahrscheinlichkeit um so größer, daß die cDNA-Sequenz und der BLAST-„Treffer" homologe Proteine darstellen.
ESTs, die der Analyse unterworfen werden, werden mit der Genbank-Datenbank verglichen, wie vorstehend beschrieben ist. ESTs, die Sequenzen mehr 5- oder 3-Prime enthalten, können durch Verwendung des BLASTn-Algorithmus (Altschul et al. (1997) NucleicAcids Res. 25:3389–3402) gegen die firmeneigene DuPont-Datenbank gefunden werden, indem Nucleotidsequenzen verglichen werden, die gemeinsame oder überlappende Regionen von Sequenzhomologie teilen. Wo gemeinsame oder überlappende Sequenzen zwischen zwei oder mehreren Nucleinsäurefragmenten existieren, können die Sequenzen zu einer einzigen zusammenhängenden Nucleotidsequenz zusammengefügt werden, wobei so das ursprüngliche Fragment in entweder die 5- oder die 3-Prime-Richtung ausgedehnt wird. Sobald die meist 5-Prime-EST identifiziert ist, kann ihre vollständige Sequenz durch Full Insert Sequencing (Sequenzieren des vollen Inserts) wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt werden. Homologe Gene, die zu verschiedenen Spezies gehören, können durch Vergleichen der Aminosäuresequenz eines bekannten Gens (von entweder einer firmeneigenen Quelle oder einer öffentlichen Datenbank) gegen eine EST-Datenbank unter Verwendung des tBLASTn-Algorithmus gefunden werden. Der tBLASTn-Algorithmus sucht eine Aminosäureabfrage gegen eine Nucleotiddatenbank, die in allen 6 Leserahmen translatiert ist. Diese Suche erlaubt Unterschiede in der Nucleotidcodonverwendung zwischen verschiedenen Spezies und Codondegeneriertheit.
BEISPIEL 3
KENNZEICHNUNG VON CDNA KLONEN, DIE ARTHROPODEN-DEFENSIN KODIEREN
Die BLASTX-Suche unter Verwendung der EST-Sequenz von dem in Tabelle 3 aufgeführten Klon enthüllte Ähnlichkeit von dem Polypeptid, kodiert durch die cDNA, mit Defensin von Mytilus galloprovincialis (NCBI Genbank Identifier (GI) Nr. 5533299) und Androctonus australis hector (NCBI GenBank Identifier (GI) Nr. 6014948). Angegeben in Tabelle 3 ist das BLAST-Ergebnis für eine Sequenz, kodierend ein gesamtes Protein, abgeleitet von einem EST, einem FIS, einem Contig oder einem FIS und PCR („CGS"):
TABELLE 3 – BLAST-ERGEBNIS FÜR EINE SEQUENZ, KODIEREND POLYPEPTID HOMOLOG ZU DEFENSIN
1 zeigt eine Ausrichtung der Aminosäuresequenz, angegeben in SEQ ID NO: 2, und der Sequenz von Androctonus australis hector (NCBI GenBank Identifier (GI) Nr. 6014948; SEQ ID NO: 3). Der Wert in Tabelle 4 stellt eine Berechnung der Prozent Identität von den Aminosäuresequenzen, angegeben in SEQ ID NO: 2, und der Sequenz von Androctonus australis hector (NCBI GenBank Identifier (GI) Nr: 6014948; SEQ ID NO: 3) dar.
TABELLE 4 – PROZENT IDENTITÄT DER AMINOSÄURESEQUENZ, ABGELEITET VON DER NUCLEOTIDSEQUENZ DES CDNA-KLONS, KODIEREND POLYPEPTID HOMOLOG ZU DEFENSIN
Sequenzausrichtungen und Berechnungen der Prozent Identität wurden unter Verwendung des Megalign-Programms des LASERGENE-Bioinformatik-Programmpakets (DNASTAR Inc., Madison WI) ausgeführt. Mehrfache Ausrichtung der Sequenz wurde unter Verwendung des Clustal-Verfahrens der Ausrichtung (Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151–153) mit den Default-Parametern (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10) durchgeführt. Default-Parameter für paarweise Ausrichtungen unter Verwendung des Clustal-Verfahrens waren KTUPLE 1; GAP PENALTY=3, WINDOW=5, und DIAGONALS SAVED=5. Die Sequenzausrichtung und BLAST-Punktbewertung und Wahrscheinlichkeit zeigen, daß das Nucleinsäurefragment, umfassend den vorliegenden cDNA-Klon, einen wesentlichen Anteil eines Defensins kodiert. Diese Sequenz stellt die erste Sequenz von Scolopendra canidens DS dar, die Defensin kodiert, die dem Anmelder bekannt ist.
BEISPIEL 4
EXPRESSION VON CHIMÄREN GENEN IN MONOKOTYLEN ZELLEN
Ein chimäres Gen, umfassend eine cDNA, kodierend das vorliegende Polypeptid in Sense-Orientierung in bezug auf den Mais-27-kD-Zein-Promotor, der 5' zu dem cDNA-Fragment gelegen ist, und das 10-kD-Zein-3'-Ende, das 3' zu dem cDNA-Fragment gelegen ist, kann konstruiert werden. Das cDNA-Fragment dieses Gens kann durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) des cDNA-Klons unter Verwendung geeigneter Oligonucleotidprimer erzeugt werden. Klonierungsstellen (NcoI oder SmaI) können in die Oligonucleotide eingebracht werden, um richtige Orientierung des DNA-Fragments bereitzustellen, wenn es in den digestierten Vektor pML103 insertiert wird, wie nachstehend beschrieben wird. Amplifikation wird dann in einer Standard-PCR durchgeführt. Die amplifizierte DNA wird dann mit den Restriktionsenzymen NcoI und SmaI digestiert und auf einem Agarosegel fraktioniert. Die geeignete Bande kann aus dem Gel isoliert werden und mit einem 4,9-kb-NcoI-SmaI-Fragment des Plasmids pML103 kombiniert werden. Das Plasmid pML103 ist unter den Bedingungen des Budapester Vertrages bei der ATCC (American Type Culture Collection, 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110–2209) hinterlegt worden und trägt die Zugangsnummer ATCC 97366. Das DNA-Segment von pML103 enthält ein 1,05-kb-SalI-NcoI-Promotorfragment von dem Mais-27-kD-Zein-Gen und ein 0,96-kb-SmaI-SalI-Fragment von dem 3'-Ende von dem Mais 10-kD-Zein-Gen in dem Vektor pGem9Zf(+) (Promega). Vektor und Insert-DNA können bei 15°C über Nacht ligiert werden, im wesentlichen wie beschrieben (Maniatis). Die ligierte DNA kann dann verwendet werden, um E. coli XL1-Blue (Epicurian Coli XL-1 Blue; Stratagene) zu transformieren. Bakterielle Transformanten können durch Restriktionsenzymdigestion von Plasmid-DNA und begrenzte Nucleotidsequenzanalyse unter Verwendung des Dideoxykettenterminations-Verfahrens (Sequenase^TM DNA Sequencing Kit; US Biochemical) gescreent werden. Das resultierende Plasmidkonstrukt würde ein chimäres Gen, kodierend, in der 5'- nach 3'-Richtung, den Mais-27-kD-Zein-Promotor, ein cDNA-Fragment, kodierend das vorliegende Polypeptid, und die 10-kD-Zein-3'-Region umfassen.
Das vorstehend beschriebene chimäre Gen kann dann durch die folgende Verfahrensweise in Maiszellen eingeführt werden. Unreife Maisembryos können von sich entwickelnden Samenkörnern, abgeleitet von Kreuzungen der Inzuchtmaislinien H99 und LH132, abgeschnitten werden. Die Embryos werden 10 bis 11 Tage nach der Befruchtung isoliert, wenn sie 1,0 bis 1,5 mm lang sind. Die Embryos werden dann mit der Achsenseite nach unten und in Kontakt mit agaroseverfestigtem N6-Medium plaziert (Chu et al. (1975) Sci. Sin. Peking 18:659–668). Die Embryos werden bei 27°C im Dunkeln gehalten. Bröckliger embryogener Kallus, bestehend aus undifferenzierten Massen von Zellen mit somatischen Proembryoiden und Embryoiden, getragen auf Suspensorstrukturen, vermehrt sich aus dem Scutellum dieser unreifen Embryos. Der aus dem primären Explantat isolierte embryogene Kallus kann auf N6-Medium kultiviert und auf diesem Medium alle 2 bis 3 Wochen subkultiviert werden.
Das Plasmid, p35S/Ac (erhalten von Dr. Peter Eckes, Hoechst AG., Frankfurt, Deutschland), kann in Transformationsexperimenten verwendet werden, um einen selektierbaren Marker bereitzustellen. Dieses Plasmid enthält das Pat-Gen (siehe die europäische Patentveröffentlichung 0242236), welches Phosphinothricinacetyl-Transferase (PAT) kodiert. Das Enzym PAT überträgt Resistenz gegen herbizide Glutaminsynthetaseinhibitoren, wie beispielsweise Phosphinothricin. Das pat-Gen in p35S/Ac ist unter der Kontrolle des 35S-Promotors von dem Cauliflower Mosaic Virus (Blumenkohlmosaikvirus) (Odell et al. (1985) Nature 313:810–812) und der 3'-Region des Nopalin-Synthase-Gens von der T-DNA des Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens.
Das Teilchenbeschußverfahren (Klein et al. (1987) Nature 327:70–73) kann verwendet werden, um Gene zu den Kalluskulturzellen zu überführen. Nach diesem Verfahren werden Goldteilchen (1 μm im Durchmesser) unter Verwendung der folgenden Technik mit DNA beschichtet. Zehn μg Plasmid-DNAs werden zu 50 μl einer Suspension von Goldteilchen (60 mg pro ml) hinzugegeben. Calciumchlorid (50 μl einer 2,5 M Lösung) und freie Spermidin-Base (20 μl einer 1,0 M Lösung) werden zu den Teilchen hirzugegeben. Die Suspension wird während der Zugabe dieser Lösungen verwirbelt. Nach 10 Minuten werden die Röhrchen kurz zentrifugiert (5 s mit 15000 U/min) und der Überstand wird entfernt. Die Teilchen werden in 200 μl absolutem Ethanol resuspendiert, wieder zentifugiert und der Überstand wird entfernt. Die Ethanolspülung wird wiederum durchgeführt und die Teilchen werden in einem Endvolumen von 30 μl Ethanol resuspendiert. Ein Aliquot (5 μl) von den DNA-beschichteten Goldteilchen kann in die Mitte einer fliegenden Kapton^TM-Scheibe (Bio-Rad Labs) plaziert werden. Die Teilchen werden dann mit einem Biolistic^TMPDS-1000/He (Bio-Rad Instruments, Hercules, CA) in das Maisgewebe hinein beschleunigt, wobei ein Helium-Druck von 1000 psi, ein Spaltabstand von 0,5 cm und ein Flugabstand von 1,0 cm verwendet werden.
Für den Beschuß wird das embryogene Gewebe auf Filterpapier über agaroseverfestigtes N6-Medium plaziert. Das Gewebe ist als dünner Rasen angeordnet und bedeckte eine Kreisfläche von etwa 5 cm im Durchmesser. Die das Gewebe enthaltende Petrischale kann in der Kammer des PDS-1000/He ungefähr 8 cm von dem Halteschirm plaziert werden. Die Luft in der Kammer wird dann zu einem Vakuum von 28 Zoll Hg evakuiert. Der Makroträger wird mit einer Heliumschockwelle beschleunigt, wobei eine Zerreißmembran verwendet wird, die birst, wenn der He-Druck in dem Schockrohr 1000 psi erreicht.
Sieben Tage nach dem Beschuß kann das Gewebe in N6-Medium überführt werden, das Bialophos (5 mg pro Liter) enthält und dem Casein oder Prolin fehlen. Das Gewebe wächst auf diesem Medium langsam weiter. Nach zusätzlichen 2 Wochen kann das Gewebe auf frisches N6-Medium transferiert werden, das Bialophos enthält. Nach 6 Wochen können auf einigen der Platten, die das mit Bialophos ergänzte Medium enthielten, Flächen mit einem Durchmesser von etwa 1 cm von aktiv wachsendem Kallus identifiziert werden. Diese Kalli können weiter wachsen, wenn sie auf dem selektiven Medium subkultiviert werden.
Pflanzen können aus dem transgenen Kallus regeneriert werden, indem zuerst Cluster von Gewebe auf N6-Medium, ergänzt mit 0,2 mg pro Liter 2,4-D, überführt werden. Nach zwei Wochen kann das Gewebe auf Regenerationsmedium überführt werden (Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8:833–839).
BEISPIEL 5
EXPRESSION VON CHIMÄREN GENEN IN DIKOTYLEN ZELLEN
Eine samenspezifische Expressionskassette, bestehend aus dem Promotor und Transskriptionsterminator von dem Gen, kodierend die β-Untereinheit des Samenspeicherproteins Phaseolin aus der Bohne Phaseolus vulgaris (Doyle et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:9228–9238), kann zur Expression der vorliegenden Polypeptide in transformierter Sojabohne verwendet werden. Die Phaseolinkassette schließt etwa 500 Nucleotide stromaufwärts (5') von dem Translationsinitiationscodon und etwa 1650 Nucleotide stromabwärts (3') von dem Translationsstopcodon von Phaseolin ein. Zwischen der 5'- und 3'-Region sind die einzigartigen Restriktionsendonuclease-Stellen Nco I (welche das ATG-Translationsinitiationscodon einschließt), Sma I, Kpn I und Xba I. Die gesamte Kassette ist von Hind-III-Stellen flankiert.
Das cDNA-Fragment dieses Gens kann durch Polymerase-Kettenraktion (PCR) des cDNA-Klons unter Verwendung geeigneter Oligonucleotidprimer erzeugt werden. Klonierungsstellen können in die Oligonucleotide eingebracht werden, um richtige Orientierung des DNA-Fragments bereitzustellen, wenn es in den Expressionssektor insertiert wird. Amplifikation wird dann wie vorstehend beschrieben durchgeführt und das isolierte Fragment wird in einen pUC18-Vektor insertiert, der die Samen-Expressionskassette trägt.
Sojabohnenembryos können dann mit dem Expressionsvektor transformiert werden, der Sequenzen umfaßt, die die vorliegenden Polypeptide kodieren. Zum Induzieren somatischer Embryos können Kotyledone, 3–5 mm in Länge, ausgeschnitten aus der Oberfläche sterilisierter, unreifer Samen des Sojabohnenkultivars A2872, im Licht oder im Dunkeln bei 26°C auf einem geeigneten Agarmedium für 6–10 Wochen kultiviert werden. Somatische Embryos, die sekundäre Embryos erzeugen, werden dann ausgeschnitten und in ein geeignetes flüssiges Medium plaziert. Nach wiederholter Selektion für Cluster von somatischen Embryos, die sich als frühe, kugelig gestufte Embryos vermehrten, werden die Suspensionen gehalten, wie nachstehend beschrieben wird.
Kulturen von embryogener Sojabohnensuspension können in 35 ml flüssigen Medien auf einem Rotationsschüttler, 150 U/min, bei 26°C mit Fluoreszenzlichtern in einem 16:8-Stunden-Tag/Nacht-Schema gehalten werden. Die Kulturen werden alle 2 Wochen subkultiviert, indem ungefähr 35 mg Gewebe in 35 ml flüssiges Medium eingeimpft werden.
Kulturen von embryogener Sojabohnensuspension können dann durch das Verfahren des Beschusses mit einer Teilchenkanone (Klein et al. (1987) Nature (London) 327:70–73, US-Patentschrift 4945050) transformiert werden. Ein Instrument Biolistig PDS1000/HE (Helium-Nachrüstung) von DuPont kann für diese Transformationen verwendet werden.
Ein selektierbares Markergen, das verwendet werden kann, um die Sojabohnentransformation zu erleichtern, ist ein chimäres Gen, bestehend aus dem 35S-Promotor aus dem Cauliflower Mosaic Virus (Blumenkohlmosaikvirus) (Odell et al. (1985) Nature 313:810–812), dem Hygromycin-Phosphotransferase-Gen von dem Plasmid pJR225 (von E. coli; Gritz et al. (1983) Gene 25:179–188) und der 3'-Region des Nopalinsynthase-Gens aus der T-DNA des Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens. Die Samenexpressionskassette, umfassend die Phaseolin-5'-Region, das Fragment, kodierend das vorliegende Polypeptid, und die Phasolin-3'-Region, kann als Restriktionsfragment isoliert werden. Dieses Fragment kann dann in eine einzigartige Restriktionsstelle des das Markergen tragenden Vektors insertiert werden.
Zu 50 μl einer 1-μm-Goldteilchen-Suspension mit 60 mg/ml werden (der Reihe nach) hinzugegeben: 5 μl DNA (1μg/μl), 20 μl Spermidin (0,1 M) und 50 μl CaCl₂ (2,5 M). Die Teilchenzubereitung wird dann für drei Minuten gerührt, für 10 Sekunden in einer Mikrofuge schnell gedreht und der Überstand wird entfernt. Die DNA-beschichteten Teilchen werden dann einmal in 400 μl 70 %igem Ethanol gewaschen und in 40 μl wasserfreiem Ethanol resuspendiert. Die DNA/Teilchen-Suspension kann drei Mal für jeweils eine Sekunde mit Ultraschall behandelt werden. Fünf μl von den DNA-beschichteten Goldteilchen werden dann auf jede Makroträgerscheibe aufgebracht.
Ungefähr 300–400 mg einer zwei Wochen alten Suspensionskultur werden in einer leeren Petrischale von 6015 mm plaziert, und die restliche Flüssigkeit wird mit einer Pipette von dem Gewebe entfernt. Für jedes Transformationsexperiment werden normalerweise ungefähr 5–10 Gewebeplatten beschossen. Der Membranzeneißdruck wird auf 1100 psi eingestellt und die Kammer wird auf ein Vakuum von 28 Zoll Quecksilber evakuiert. Das Gewebe wird ungefähr 3,5 Zoll von dem Rückhalteschirm entfernt plaziert und drei Mal beschossen. Nach dem Beschuß kann das Gewebe in Hälften geteilt und in die Flüssigkeit zurückgelegt und wie vorstehend beschrieben kultiviert werden.
Fünf bis sieben Tage nach dem Beschuß kann das flüssige Medium gegen frisches Medium ausgetauscht werden, und elf bis zwölf Tage nach dem Beschuß gegen frisches Medium, das 50 mg/ml Hygromycin enthält. Dieses selektive Medium kann wöchentlich aufgefrischt werden. Sieben bis acht Wochen nach dem Beschuß kann grünes, transformiertes Gewebe beobachtet werden, das aus untransformierten nekrotischen, embryogenen Clustern wächst. Isoliertes grünes Gewebe wird entnommen und in einzelne Kolben eingeimpft, um neue, klonal vermehrte, transformierte, embryogene Suspensionskulturen zu erzeugen. Jede neue Linie kann als unabhängiges Transformationsereignis behandelt werden. Diese Suspensionen können dann subkultivert und als Cluster von unreifen Embryos gehalten werden oder durch Reifung und Sprossung individueller somatischer Embryos zu ganzen Pflanzen regeneriert werden.
BEISPIEL 6
EXPRESSION CHIMÄRER GENE IN MIKROBIELLEN ZELLEN
Die die vorliegenden Polypeptide kodierenden cDNAs können in den T7-E.-coli-Expressionsvektor pBT430 insertiert werden. Dieser Vektor ist ein Abkömmling von pET-3a (Rosenberg et al. (1987) Gene 56:125–135), welches das bakteriophage T7-RNA-Polymerase/T7-Promotorsystem anwendet. Das Plasmid pBT430 wurde konstruiert, indem zuerst die EcoR-I- und Hind-III-Stellen in pET-3a an ihren ursprünglichen Positionen zerstört wurden. Ein EcoR-I- und Hin-III-Stellen enthaltender Oligonucleotidadapter wurde an der BamH-I-Stelle von pET-3a insertiert. Dies erzeugte pET-3aM mit zusätzlichen einzigartigen Klonierungsstellen zur Insertion von Genen in den Expressionsvektor. Dann wurde die Nde-I-Stelle an der Position der Translationsinitiation in eine Nco-I-Stelle umgewandelt, indem Oligonucleotid-gelenkte Mutagenese verwendet wurde. Die DNA-Sequenz von pET-3aM in dieser Region, 5'-CATATGG, wurde zu 5'-CCCATGG in pBT430 umgewandelt.
Plasmid-DNA, die eine cDNA enthält, kann in geeigneter Weise digestiert werden, um ein Nucleinsäurefragment freizusetzen, das das Protein kodiert. Dieses Fragment kann dann in einem 1 %igen niedrig schmelzenden Agarosegel gereinigt werden. Puffer und Agarose enthalten 10 μg/ml Ethidiumbromid zum Sichtbarmachen des DNA-Fragments. Das Fragment kann dann von dem Agarosegel durch Digestion mit GELase^TM (Epicentre Technologies, Madison, WI) entsprechend den Instruktionen des Herstellers gereinigt, mit Ethanol ausgefällt, getrocknet und in 20 μl Wasser resuspendiert werden. Geeignete Oligonucleotidadapter können unter Verwendung von T4-DNA-Ligase mit dem Fragment ligiert werden (New England Biolabs (NEB), Beverly, MA). Das Fragment, das die ligierten Adapter enthält, kann unter Verwendung niedrig schmelzender Agarose wie vorstehend beschrieben von den überschüssigen Adaptern gereinigt werden. Der Vektor pBT430 wird digestiert, mit alkalischer Phosphatase (NEB) dephosphoryliert und mit Phenol/Chloroform wie vorstehend beschrieben deproteinisiert. Der hergestellte Vektor pBT430 und das Fragment können dann bei 16°C für 15 Stunden ligiert, nachfolgend zu elektrokompetenten DH5-Zellen transformiert werden (GIBCO BRL). Transformanten können auf Agarplatten selektiert werden, die LB-Medium und 100 μg/ml Ampicillin enthalten. Transformanten, die das Gen enthalten, das das vorliegende Polypeptid kodiert, werden dann durch Restriktionsenzymanalyse auf korrekte Orientierung im Hinblick auf den T7-Promotor gescreent.
Für Expression mit hohem Niveau kann ein Plasmid-Klon mit dem cDNA-Insert in der korrekten Orientierung relativ zu dem T7-Promotor in den E.-coli-Stamm BL21(DE3) transformiert werden (Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113–130). Kulturen werden in LB-Medium, das Ampillicin (100 mg/l) enthält, bei 25°C gezüchtet. Bei einer optischen Dichte von ungefähr 1 bei 600 nm, kann IPTG (Isopropylthio-β-galactosid, der Inducer) bis zu einer Endkonzentration von 0,4 mM hinzugegeben werden und die Inkubation kann für 3 h bei 25° fortgesetzt werden. Die Zellen werden dann durch Zentrifugation geerntet und in 50 μl von 50 mM Tris-HCl bei pH 8,0, enthaltend 0,1 mM DTT und 0,2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, resuspendiert. Eine kleine Menge von 1-mm-Glaskügelchen kann hinzugegeben werden und das Gemisch 3 Mal für jedes Mal etwa 5 Sekunden mit einer Mikrosonden-Beschallungsvorrichtung mit Ultraschall behandelt werden. Das Gemisch wird zentrifugiert und die Proteinkonzentration des Überstands bestimmt. Ein μg Protein von der löslichen Fraktion der Kultur kann durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese abgetrennt werden. Gele können auf Proteinbanden, die bei dem erwarteten Molekulargewicht wandern, beobachtet werden.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Isoliertes Polynucleotid, umfassend: (a) eine Nucleotidsequenz, kodierend ein Polypeptid mit Defensinaktivität, wobei die Aminosäuresequenz des Polypeptids und die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 mindestens 80% Identität, basierend auf dem Clustal-Ausrichtungsverfahren, haben, oder (b) das Komplement der Nucleotidsequenz.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz des Polypeptids und die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 mindestens 85% Identität, basierend auf dem Clustal-Ausrichtungsverfahren, haben.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz des Polypeptids und die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 mindestens 90% Identität, basierend auf dem Clustal-Ausrichtungsverfahren, haben.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz des Polypeptids und die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 mindestens 95% Identität, basierend auf dem Clustal-Ausrichtungsverfahren, haben.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 umfasst.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei die Nucleotidsequenz die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO:1 umfasst.
Chimäres Gen, umfassend das Polynucleotid nach Anspruch 1, operabel mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft.
Vektor, umfassend das Polynucleotid nach Anspruch 1.
Isoliertes Polynucleotidfragment, umfassend eine Nucleotidsequenz, enthaltend mindestens 30 Nucleotide, wobei die Nucleotidsequenz, enthaltend mindestens 30 Nucleotide, durch das Polynucleotid nach Anspruch 1 umfasst wird.
Fragment nach Anspruch 9, wobei die Nucleotidsequenz, enthaltend mindestens 30 Nucleotide, mindestens 40 Nucleotide enthält.
Fragment nach Anspruch 9, wobei die Nucleotidsequenz, enthaltend mindestens 30 Nucleotide, mindestens 60 Nucleotide enthält.
Verfahren zum Transformieren einer Zelle, umfassend Transformieren einer Zelle mit dem Polynucleotid nach Anspruch 1.
Zelle, umfassend das chimäre Gen nach Anspruch 7.
Verfahren zum Erzeugen einer transgenen Pflanze, umfassend Transformieren einer Pflanzenzelle mit dem Polynucleotid nach Anspruch 1 und Regenerieren einer Pflanze aus der transformierten Pflanzenzelle.
Pflanze, umfassend das chimäre Gen nach Anspruch 7.
Samen, umfassend das chimäre Gen nach Anspruch 7.
Isoliertes Polypeptid mit Defensinaktivität, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, wobei die Aminosäuresequenz und die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 mindestens 80% Identität, basierend auf dem Clustal-Ausrichtungsverfahren, haben.
Polypeptid nach Anspruch 17, wobei die Aminosäuresequenz und die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 mindestens 85% Identität, basierend auf dem Clustal-Ausrichtungsverfahren, haben.
Polypeptid nach Anspruch 17, wobei die Aminosäuresequenz und die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 mindestens 90% Identität, basierend auf dem Clustal-Ausrichtungsverfahren, haben.
Polypeptid nach Anspruch 17, wobei die Aminosäuresequenz und die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 mindestens 95% Identität, basierend auf dem Clustal-Ausrichtungsverfahren, haben.
Polypeptid nach Anspruch 17, wobei die Aminosäuresequenz die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 umfasst.