PT1309698E - Uma enzima citocromo p450 associada com a síntese de grupos a12- epoxi em ácidos gordos de plantas. - Google Patents

Description

ΡΕ1309698 1 DESCRIÇÃO "UMA ENZIMA CITOCROMO P450 ASSOCIADA COM A SÍNTESE DE GRUPOS Δ12-ΕΡΟΧΙ EM ÁCIDOS GORDOS DE PLANTAS"

CAMPO DO INVENTO

Este invento situa-se no campo da biologia molecular de plantas. Mais especificamente, este invento diz respeito a fragmentos de ácido nucleico codificadores de uma enzima citocromo P450, a qual catalisa a síntese de grupos A12-epoxi em ácidos gordos de plantas e sementes. Os produtos desta enzima podem incluir ácidos gordos epoxilados, tais como ácido vernólico.

FUNDAMENTO DO INVENTO

Os ácidos gordos portadores de modificações químicas para além das comuns ligações duplas são encontrados nos lípidos de reserva de muitas sementes de oleaginosas (Badani, R.C. and Patil, K.B. (1981) Prog. Lipid Res. 19:119-153). Algumas destas modificações dotam o ácido gordo com grupos funcionais que são úteis em aplicações industriais; isto contrapõe-se à utilização mais comum dos lípidos de plantas modificados como alimentos. São exemplos a utilização do ácido gordo hidroxilado ácido ricinoleico em lubrificantes e dos ácidos gordos, com cadeia carbonada 2 ΡΕ1309698 de comprimento curto e médio, derivados de óleo de palma em detergentes. Nalguns casos, a composição em ácidos gordos dos lipidos de reserva das sementes de oleaginosas, produzidas em climas temperados, pode ser modificada através da adição de genes derivados de fontes exóticas de forma a que grandes quantidades de ácidos gordos únicos sejam produzidos (Ohlrogge, J.B. (1994) Plant Physiol. 104, 821-826). A epoxidação está entre as modificações conhecidas dos ácidos gordos dos lipidos de reserva nas plantas. 0 ácido vernólico (ácido cis-12-epoxioctadeca-cis-9-enóico) é um exemplo de um ácido gordo epoxilado encontrado em óleos de sementes de espécies tais como Vernonia galamensis e Euphorbia lagascae (Bafor, M. et al. (1993) Arch. Biochem Biophys 303:145-151; e Patente U.S. N° 5846784). O ácido vernólico pode constituir até 60% dos ácidos gordos dos óleos das sementes destas plantas. Os ácidos gordos tais como o ácido vernólico, que possuem a modificação epoxi, podem encontrar utilização como plastificantes, em aplicações de revestimentos com ligações cruzadas e na fixação de tintas de impressão (Perdue, R.E. et al., (1986) Econ. Bot. 40:54-68).

Os resultados de estudos metabólicos anteriores indicam que a actividade catalítica responsável pela introdução do grupo A12-epoxi do ácido vernólico, encontrado em abundância nas sementes de Euphorbia lagascae, encontra-se na fracção de membranas microssomais, mais provavelmente no retículo endoplasmático (Bafor et al. supra). Este estudo 3 ΡΕ1309698 sugere que a actividade catalítica responsável pela formação de epóxido nesta planta é uma enzima da classe mono-oxigenase de citocromo P450. Os genes de Vernonia galamensis e Crepis palaestina foram isolados e, quando expressos em plantas ou leveduras, as proteínas codificadas são capazes de converter o ácido linoleico em ácido vernólico (Lee et al. (1998) Science 280:915-918 e Patente U.S. N° 5846784). Seither et al. (Physiology, Biochemistry and Molecular Biology of Plant Lípids, XX, XX, 1997, pp 389-391) descreve o isolamento dos genes de citocromo P-450 a partir de Vernonia galamensis. WO 98/46762 está relacionada com sequências genéticas que codificam enzimas A12-epoxigenases de ácidos gordos compreendendo a função mista de enzimas mono-oxigenases. Em particular, descreve sequências de cDNA que codificam epoxigenases de ácidos gordos vegetais, em particular a Al2-epoxigenase de Crepis palaestina e homólogos, análogos e seus derivados, e duas enzimas de

Euphorbia lagascae com actividade putativa de epoxigenase. No entanto, demonstrou-se que as actividades de epoxigenase derivadas destas plantas produtoras de ácido vernólico são diferentes da enzima de Euphorbia lagascae. Ao contrário da enzima de Euphorbia lagascae, estas enzimas estão relacionadas com as desaturases de ácidos gordos localizadas no retículo endoplasmático (Publicação PCT N° W094/11516, publicado em 26 de Maio, 1994) . Aparentemente, estas enzimas de epoxidação de ácidos gordos estão relacionadas em sequência com a classe de enzimas 4 ΡΕ1309698 associadas a membranas responsáveis pela des-saturação de ácidos gordos e pela hidroxilação de ácidos gordos (Broun, P. e Somerville, C. (1997) Plant Physiol 113:933-942). Assim, existem duas classes distintas de genes codificadores de enzimas capazes da formação de grupos epóxido no ácido vernólico, uma que é dependente de citocromo P450 e a outra que está relacionada com as desaturases e hidroxi-lases de ácidos gordos. Parece que a epoxigenase responsável pela produção de ácido vernólico nas sementes em desenvolvimento de E. lagascae é uma proteína nova e até agora não caracterizada. 0 isolamento e caracterização de enzimas adicionais responsáveis pela produção de ácido gordo A12-epoxilado expandirá a capacidade de manipular ácidos gordos modificados em plantas. Isto melhorará o trabalho em curso da produção industrial de óleos importantes a partir de culturas agrícolas relevantes do ponto de vista comercial.

SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento descreve uma enzima da classe de citocromo P450 mono-oxigenase, a qual é codificada por um ácido nucleico isolado a partir de uma biblioteca de cDNA de sementes em desenvolvimento de Euphorbia lagascae. Um destes clones, eellc.pk002i4, quando expresso em levedura ou plantas não relacionadas, é suficiente para produzir novos ácidos gordos contendo epóxido, tais como ácido vernólico. Pensa-se que esta seja a primeira caracterização de um polinucleótido vegetal codificador de 5 ΡΕ1309698 uma enzima da classe de citocromo P-450 capaz de produzir ácidos gordos A12-epoxilados.

Numa primeira forma de realização, um polinucleó-tido isolado do invento reivindicado codifica um polipeptí-deo que é uma enzima citocromo P-450, associada com a síntese de ácidos gordos deltal2-epoxilados em que o referido polipeptídeo possui pelo menos 50% de identidade, baseado no método Clustal de alinhamentos, quando comparado com um polipeptídeo de SEQ ID NO:2. Num outro aspecto, este invento também diz respeito ao polinucleótido complementar, em que o polinucleótido complementar possui o mesmo número de nucleótidos da sequência polinucleotídica isolada e é 100% complementar da sequência polinucleotídica isolada.

Numa outra forma de forma de realização, este invento está relacionado com uma construção quimérica, compreendendo o polinucleótido isolado do presente invento operacionalmente ligado a pelo menos uma sequência reguladora adequada.

Numa outra forma de realização, o presente invento diz respeito a uma célula hospedeira isolada compreendendo um gene quimérico do presente invento ou uma polinucleótido isolado do presente invento. A célula hospedeira pode ser eucariótica, como seja uma levedura ou uma célula vegetal, ou procariótica, como seja uma célula bacteriana.

Numa outra forma de realização, o invento também 6 ΡΕ1309698 está relacionado com um método de selecção de um polinu-cleótido isolado, o qual afecta o nível de ácidos gordos A12-epoxilados numa célula hospedeira, o método compreendendo os passos de (a) preparação de um polinucleótido isolado compreendendo a sequência polinucleotídica do presente invento, (b) introdução do polinucleótido isolado numa célula hospedeira e (c) determinação da presença ou ausência de ácidos gordos A12-epoxilados na célula hospedeira. Deve-se entender que muitos organismos podem servir como células hospedeiras adequadas. Células hospedeiras úteis incluem, mas não estão limitadas a bactérias, leveduras, plantas, vírus e animais. Um polinucleótido isolado preferido consiste numa sequência nucleotídica de SEQ ID NO:l.

Numa outra forma de realização, este invento está relacionado com um método de obtenção de um fragmento de ácido nucleico codificador de uma enzima citocromo P-450, com a síntese de ácidos gordos A12-epoxilados compreendendo os passos de: (a) rastreio de uma biblioteca de cDNA ou genómica com um polinucleótido isolado compreendendo a sequência nucleotídica de SEQ ID NO:l e um polinucleótido complementar de tais sequências nucleotídicas; (b) identificação de um clone de DNA que híbrida com um polinucleótido isolado de (a) ou seu complemento; (c) isolamento do clone de DNA identificado; e (d) sequenciação do cDNA ou fragmento genómico inserido no clone de DNA isolado.

Numa outra forma de realização, o presente invento está relacionado com um método para a produção de ácidos 7 ΡΕ1309698 gordos A12-epoxilados numa célula hospedeira, o que consiste em, (a) transformação de uma célula hospedeira com a construção quimérica do presente invento, (b) crescimento das células hospedeiras transformadas do passo (a) e (c) determinação da presença ou ausência de ácidos gordos Δ12-epoxilados nas células transformadas de (b) . Como previa-mente mencionado, qualquer célula hospedeira pode ser utilizada, sendo células hospedeiras preferidas bactérias, leveduras ou plantas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS E LISTAGENS DE SEQUÊNCIAS O invento pode ser melhor compreendido a partir da descrição detalhada que se segue e dos desenhos juntos e Listagem de Sequências que constituem uma parte deste pedido.

Figura 1 mostra uma comparação das sequências de aminoácidos da enzima de Euphorbia lagascae do presente invento (SEQ ID NO:2) e da enzima citocromo P450 da pimenta (Capsicum annum) envolvida em incompatibilidade fúngica.

Figura 2. Análise por cromatografia gasosa de ésteres metílicos de ácidos gordos preparados a partir de células de S. cerevisiae expressando o cDNA de E. lagascae para EST eellc.pk002i4 em meio suplementado com ácido linoleico ou α-linolénico. Os cromatogramas gasosos em A e C mostram ésteres metílicos de ácidos gordos de células de S. cerevisiae portadoras do vector de expressão sem inserto 8 ΡΕ1309698 de cDNA e crescidas na presença dos ácidos linoleico e a-linolénico, respectivamente. Os cromatogramas gasosos mostrados em B e D correspondem a ésteres metilicos de ácidos gordos derivados de células de S. cerevisiae expressando o cDNA de E. lagascae para EST eellc.pk002i4 em meio suplementado com ácido linoleico ou α-linolénico. 0 cromatograma gasoso em E corresponde a ésteres metilicos de ácido gordo preparados a partir de sementes de E. lagascae. Baseado nas análises de espectros de massa mostrados na Figura 3, o pico marcado com "Epoxyl" em B é identificado como o éster metilico de ácido vernólico e o pico marcado com "Epoxy2" em D é tentativamente identificado como o éster metilico do ácido A12-epoxi-octadeca-9,15-dienóico. Os picos marcados com números correspondem a ésteres metilicos dos seguintes ácidos gordos: pico 1, ácido palmitico (16:0); pico 2, ácido palmitoleico (16:1Δ9), pico 3, ácido esteárico (18:0); pico 4, ácido oleico (18:1Δ9); pico 5, ácido linoleico (18:2Δ9,12); e pico 6, ácido a-linoleico (18 :3Δ9,12,15) .

Figura 3. Espectros de massa de derivados de ésteres metilicos do ácido vernólico (A, B) e ácidos gordos epoxilados de células de S. cerevisiae expressando cDNA de E. lagascae para EST eellc.pk002i4, em meio suplementado com ácido linoleico (C, D) ou α-linolénico (E, F) . Os ésteres metilicos de ácidos gordos epoxilados reagiram primeiro em ácido sulfúrico metanólico, o que gera um produto A12-hidroxiM13-metoxi e um produto A13-metoxiM12-hidroxi da abertura do anel epoxi. Os dois produtos obtidos 9 ΡΕ1309698 a partir de um determinado éster metilico de ácido gordo epoxilado foram então convertidos em derivados de trimetilsililo (TMS) para produzir os espectros de massa apresentados nesta figura. Os espectros de massa em A e B foram obtidos a partir de derivados de ácido metil-vernólico derivado das sementes de E. lagascae. Os espectros de massa em C e D foram obtidos a partir de derivados do éster metilico de ácido gordo identificado como "Epoxyl" na Figura 2. Estes derivados foram preparados a partir de extractos de células de S. cerevisíae expressando cDNA de E. lagascae para EST eellc.pk002i4 em meio contendo com ácido linoleico. Os espectros de massa em E e F foram obtidos a partir de derivados de éster metilico de ácidos gordos identificados como "Epoxy2" na Figura 2. Estes derivados foram preparados a partir de extractos de células de S. cerevisíae expressando cDNA de E. lagascae em meios contendo ácido α-linolénico. Conforme indicado, estes espectros de massa são consistentes com derivados de metilA12-epoxi-octadeca-9,15-dienoato.

Figura 4. Análises de cromatografia gasosa de ésteres metilicos de ácidos gordos preparados a partir de calos de tabaco transformados com o vector de expressão (pART/35S) sozinho (A) ou com o vector de expressão contendo a grelha de leitura aberta do cDNA para EST eellc.pk002.i4 sob o controlo do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (B) . No Painel C estão apresentados os ésteres metilicos de ácidos gordos derivados de sementes de Euphorbia lagascae. Como descrito no Exemplo 8, os picos 10 ΡΕ1309698 no painel B que estão marcados como "Epoxyl" e "Epoxy2" correspondem aos ésteres metílicos de ácido vernólico e A12-epoxi-18: 2Δ9'15, respectivamente. Os picos marcados com asteriscos (*) correspondem a fitol. Outros picos marcados correspondem a ésteres metilicos dos seguintes ácidos gordos: 16:0, ácido palmítico; 18:0, ácido esteárico; 18:1, ácido oleico; 18:2, ácido linoleico; 18:3, ácido a-linolé-nico; 20:0, ácido eicosanóico; e 20:1, ácido eicosenóico.

Figura 5. Análises de cromatografia gasosa de ésteres metílicos de ácidos gordos preparados a partir de um embrião de soja somático não transformado (A) e um embrião de soja somático transgénico expressando citocromo P450 A12-epoxigenase de Euphorbia lagascae correspondendo a EST eellc.pk002.i4 (B) . No painel C estão apresentados ésteres metílicos de ácidos gordos derivados de sementes de Euphorbia lagascae. Como descrito no Exemplo 9, os picos no painel B que estão marcados com "Epoxyl" e "Epoxy2" correspondem a ésteres metílicos de ácido vernólico e Δ12-epoxi-18:2Δ9,15, respectivamente. Os picos marcados correspondem a ésters metílicos dos seguintes ácidos gordos: 16:0, ácido palmítico; 18:0, ácido esteárico; 18:1, ácido oleico; 18:2, ácido linoleico; 18:3 e ácido α-linolénico. A Tabela 1 apresenta os polipeptídeos que aqui estão descritos, a designação dos clones de cDNA que compreendem os fragmentos de ácido nucleico codificadores de polipeptídeos representando a totalidade ou uma porção substancial destes polipeptídeos e o correspondente 11 ΡΕ1309698 identificador (SEQ ID NO:) conforme usado na Listagem de Sequências apensa. TABELA 1

Uma enzima de Citocromo P450 associada com a síntese do grupo epóxi de ácido vernólico

Espécies de plantas contendo actividade Designação do SEQ ID NO: Epoxigenase clone (Nucleótido) (Aminoácido) Euphorbia lagascae eellc.pk002.i4 1 2

Outras SEQ ID Nos:4-7 representam sequências iniciadoras de PCR úteis para a clonagem da região codificadora de SEQ ID NO:l. Os detalhes da estratégia podem ser encontrados nos Exemplos 7 e 8. A listagem de sequências contem o código de uma letra para caracteres das sequências nucleotídicas e o código de três letras para os aminoácidos, como definido em conformidade com os padrões da IUPAC-IUBMB descritos em Nucleic Acids Res. 13:3021-3030 (1985) e no Biochemical J. 219(N°2):345-373 (1984)

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Os termos "grupo epoxi", "ácidos gordos epoxige-nados" ou "o produto de uma epoxigenase" referem-se todos à introdução de uma ponte epóxido (um átomo de oxigénio 12 ΡΕ1309698 covalentemente ligado a átomos de carbono que por sua vez estão ligados covalentemente um ao outro, para formar um anel de três elementos que é parte de uma estrutura molecular maior) no local de uma dupla ligação na cadeia acilo de um ácido gordo. "Ácido vernólico" refere-se ao ácido gordo ácido 12-epoxioctadeca-9cis-enóico que contem dezoito átomos de carbono, uma dupla ligação cis entre os átomos de carbono 9 e 10 e um grupo epoxi entre os átomos de carbono 12 e 13. O termo "ácido gordo A13-epoxilado" refere-se a um ácido gordo como seja o ácido vernólico que contem um grupo epoxi entre os átomos de carbono 12 e 13. O termo "enzima citocromo P450 associada com a síntese de ácidos gordos A12-epoxilados" ou "epoxigenase vegetal" são usados indiscriminadamente e destinam-se a definir uma enzima que catalisa a inserção de um grupo epoxi numa ligação dupla existente entre os átomos de carbono 12 e 13 de uma cadeia de ácido gordo. Os substratos para esta enzima podem incluir ácidos linoleicos e α-linoleico, os quais podem estar ligados a um lípido, como seja fosfatidilcolina. Os produtos desta enzima podem incluir ácidos gordos Δ12-epoxilados tais como ácido vernólico e ácido 12-epoxioctadeca-9,15-dienóico. Tais ácidos gordos modificados são encontrados nas sementes e óleos de um limitado número de plantas incluindo Euphorbia lagascae, Vernonia e Crepis. De entre estas três plantas, a espécies de vernonia e Crepis são conhecidas por utilizarem uma enzima desaturase ou hidroxilase divergente para realizar a epoxidação 13 ΡΕ1309698 (Patente U.S. N° 5846784; Pedido de Patente PCT WO 98/46762, publicado em 22 de Outubro, 1998). Em Euphorbia lagascae, a conversão de ácido linoleico em ácido vernólico tem sido descrita como necessitando de uma epoxigenase dependente de citocromo P450 (Bafor et al. (1993) Arch Bioch Biphy 303:145-151).

Os termos "polinucleótido", "sequência polinu-cleotídica", "sequência de ácido nucleico" e "fragmento de ácido nucleico"/"fragmento de ácido nucleico isolado" são aqui usados indiscriminadamente. Estes termos englobam sequências nucleotídicas e similares. Um polinucleotideo pode ser um polímero de RNA ou DNA que é de cadeia simples ou dupla, que facultativamente contem bases nucleotídicas sintéticas, não naturais ou alteradas. Um polinucleótido na forma de um polímero de DNA pode compreender um ou mais segmentos de cDNA, DNA genómico, DNA sintético ou suas misturas. Um polinucleótido isolado do presente invento pode incluir pelo menos um de 30 nucleótidos contíguos, de preferência pelo menos um de 40 nucleótidos contíguos, mais de preferência um de pelo menos 60 nucleótidos contíguos derivados de SEQ ID NO:l ou o complemento de tais sequências .

Como aqui é usado, um "fragmento de ácido nucleico isolado" é um polímero de RNA ou DNA que tem cadeia simples ou dupla, facultativamente contendo bases nucleotídicas sintéticas, não naturais ou alteradas. Um fragmento de ácido nucleico isolado na forma de um polímero de DNA 14 ΡΕ1309698 pode ser constituído por um ou mais segmentos de cDNA, DNA genómico ou DNA sintético. Os nucleótidos (geralmente encontrados na sua forma de 5'-monofosfato) são referidos pela designação de uma única letra como se segue: "A" para adenilato ou desoxiadenilato (para RNA ou DNA, respecti-vamente), "C" para citidilato ou desoxicitidilato, "G" para guanilato ou desoxiguanilato, "U" para uridilato, "T" para desoxitimidilato, "R" para purinas (A ou G), "Y" para pirimidinas (C ou T), "K" para G ou T, "H" para A ou C ou T, "I" para inosina e "N" para qualquer nucleótido. O termo "recombinante" significa, por exemplo, que uma sequência de ácido nucleico é preparada através de uma combinação artificial de dois fragmentos de sequência, que de outra forma estariam separados, ou através da manipulação de ácidos nucleicos isolados por técnicas de engenharia genética.

Os termos "subfragmento que é funcionalmente equivalente" e "subfragmento funcionalmente equivalente" são usados de forma indiscriminada. Estes termos referem-se a uma porção ou subsequência de um fragmento de ácido nucleico isolado, em que a capacidade para alterar a expressão de um gene ou produzir um determinado fenótipo é mantido, quer o fragmento ou subfragmento codifique ou não uma enzima activa. Por exemplo, o fragmento ou subfragmento pode ser usado na projecção de construções quiméricas para produzir o fenótipo pretendido numa planta transformada. As construções quiméricas podem ser projectadas para usar em 15 ΡΕ1309698 co-supressão ou como complemento da cadeia codificadora, através de ligação de um fragmento de ácido nucleico ou seu subfragmento, quer codifique ou não uma enzima activa, na orientação adequada relativamente a uma sequência de promotor vegetal.

Os termos "homologia", "homólogo", "substancialmente semelhante" e "substancialmente correspondente" são usados de forma indiscriminada. Eles referem-se a fragmentos de ácido nucleico em que alterações numa ou mais bases nucleotídicas não afectam a capacidade do fragmento de ácido nucleico para mediar a expressão de genes ou produzir um determinado fenótipo. Estes termos também se referem a modificações dos fragmentos de ácido nucleico do presente invento, tais como deleção ou inserção de um ou mais nucleótidos que não alteram substancialmente as propriedades funcionais do fragmento de ácido nucleico resultante relativamente ao fragmento inicial não modificado. É portanto entendido, como é do conhecimento dos familiarizados com a matéria, que o invento engloba mais do que os exemplos específicos de sequências.

Fragmentos de ácido nucleico substancialmente semelhantes podem ser seleccionados através do rastreio de fragmentos de ácido nucleico representando subfragmentos ou modificações dos fragmentos de ácido nucleico do presente invento, em que um ou mais nucleótidos são substituídos, eliminados e/ou inseridos, relativamente à sua capacidade para afectar o nível do polipeptídeo codificado pelo 16 ΡΕ1309698 fragmento de ácido nucleico numa planta ou célula vegetal. Por exemplo, um fragmento de ácido nucleico substancialmente semelhante, representando pelo menos um de 30 (de preferência 40 e mais de preferência 60) nucleótidos contíguos derivados do presente fragmento de ácido nucleico pode ser construído e introduzido numa planta ou célula vegetal. O nível do polipeptídeo codificado pelo fragmento de ácido nucleico não modificado presente numa planta ou célula vegetal exposta ao fragmento de ácido nucleico substancialmente semelhante pode ser então comparado com o nível do polipeptídeo numa planta ou célula vegetal que não foi exposta ao fragmento de ácido nucleico substancialmente semelhante.

Por exemplo, é bem conhecido na área que a supressão e co-supressão da expressão génica com sequências complementares das sequências codificadoras podem ser conseguidas usando fragmentos de ácido nucleico representando menos da totalidade da região codificadora de um gene e usando fragmentos de ácido nucleico que não partilham 100% de identidade de sequências com o gene expresso. Ainda, alterações num fragmento de ácido nucleico que resulta na produção de um aminoácido quimicamente equivalente num determinado local, mas não afecta as propriedades funcionais do polipeptídeo codificado, são bem conhecidas na área. Assim, um codão para o aminoácido alanina, um aminoácido hidrofóbico, pode ser substituído por um codão codificador de um outro resíduo menos hidrofóbico, como seja glicina, ou um resíduo mais hidrofóbico, 17 ΡΕ1309698 como seja valina, leucina ou isoleucina. De forma semelhante, as alterações que resultam na substituição de um resíduo carregado negativamente por outro, como seja ácido aspártico por ácido glutâmico ou um resíduo carregado positivamente por um outro, como seja lisina por arginina, pode-se também esperar que produza um produto funcionalmente equivalente. As alterações nucleotídicas que resultam na alteração das porções N-terminal e C-terminal da molécula polipeptídica também se espera que não altere a actividade do polipeptídeo. Cada uma das modificações propostas está dentro da rotina dos familiarizados com a matéria, tal como a determinação da retenção de actividade biológica dos produtos codificados. Consequentemente, um polinucleótido isolado compreendendo uma sequência nucleotídica de pelo menos um de 30 (de preferência pelo menos um de 40, mais de preferência pelo menos um de 60) nucleótidos contíguos derivados de uma sequência nucleotídica de SEQ ID NO:l, e o complemento de tais sequências nucleotídicas pode ser usado em métodos de selecção de um polinucleótido isolado que afecte a expressão de um polipeptídeo epoxigenase vegetal numa célula hospedeira. Um método de selecção de um polinucleotídeo isolado que afecte o nível de expressão de um polipeptídeo num vírus ou numa célula hospedeira (eucariótica, como seja planta ou levedura, procariótica como seja bacteriana) pode compreender os passos de: construção de um polinucleótido isolado do presente invento ou um de gene quimérico isolado do presente invento; introdução do polinucleótido isolado ou do gene quimérico isolado numa célula hospedeira; medição 18 ΡΕ1309698 do nível de um polipeptídeo ou actividade enzimática na célula hospedeira contendo o polinucleótido isolado; e comparação do nível de um polipeptídeo ou actividade enzimática na célula hospedeira, contendo o polinucleótido isolado, com o nível de um polipeptídeo ou actividade enzimática numa célula hospedeira que não contem o polinucleótido isolado.

Ainda, os familiarizados com a matéria reconhecem que sequências de ácido nucleico substancialmente semelhantes incluídas neste invento são também definidas pela sua capacidade para hibridar, em condições moderadamente restringentes (por exemplo, 0,5X SSC, 0,1% SDS, 60°C), com as sequências aqui exemplificadas ou com qualquer porção das sequências nucleotídicas aqui descritas e que são funcionalmente equivalentes ao promotor do invento. As condições de restringência podem ser ajustadas ao rastreio de fragmentos moderadamente semelhante, tais como sequências homólogas de organismos distantemente relacionados, com fragmentos altamente semelhantes, como sejam genes que duplicam enzimas funcionais de organismos estreitamente relacionados. As lavagens de pós-hibridação determinam as condições de restringência. Uma série de condições preferidas envolve uma série de lavagens começando com 6X SSC, 0,5% SDS, à temperatura ambiente durante 15 min, depois repetido com 2X SSC, 0,5% SDS a 45°C durante 30 min e depois repetido duas vezes com 0,2X SSC, 0,5% SDS a 50°C durante 30 min. Uma série mais preferida de condições restringentes envolve a utilização de temperaturas mais 19 ΡΕ1309698 elevadas em que as lavagens são idênticas às descritas atrás, excepto a temperatura das duas lavagens finais de 30 min em 0,2X SSC, 0,5% SDS ser aumentada para 60°C. Uma outra série preferida de condições altamente restringentes envolve a utilização de duas lavagens finais em 0,1X SSC, 0,1% SDS a 65°C.

Relativamente ao grau de semelhança substancial entre o mRNA alvo (endógeno) e a região de RNA na construção tendo homologia com o mRNA alvo, tais sequências deverão ter pelo menos 25 nucleótidos de comprimento, de preferência pelo menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1250 ou 1500 nucleótidos de comprimento; e deverão ser pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas. Fragmentos de ácido nucleico substancialmente semelhantes do presente invento podem também ser caracterizados pela percentagem de identidade das sequências de aminoácidos que codificam com as sequências de aminoácidos aqui descritas, conforme determinado pelos algoritmos normalmente empregues pelos familiarizados com a matéria. Fragmentos de ácido nucleico adequados (polinucleótidos isolados do presente invento) codificam polipeptideos que são pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idênticos às sequências de aminoácidos aqui descritas. Compreende-se que qualquer percentagem de identidade inteira entre 50% e 100% será adequada para usar no presente invento. Fragmentos de ácido nucleico adequados não só possuem as identidades atrás referidas, como tipicamente codificam um polipeptideo tendo 20 ΡΕ1309698 pelo menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ou 500 aminoácidos. Os alinhamentos de sequências e os cálculos de percentagens de identidade foram realizadas usando o programa Megalign do local de computação bioinformática LASERGENE (DNASTAR inc., Wl). Alinhamentos múltiplos das sequências foram realizados usando o método Clustal de alinhamento (Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-153) com os parâmetros por defeito (GAP PENALTY = 10, GAP LENGTH PENALTY = 10) . Os parâmetros por defeito de pares de alinhamentos usando o método Clustal foram KTUPLE 1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 e DIAGONALS SAVED=5.

Uma "porção substancial" de uma sequência de aminoácidos ou nucleotidica compreende uma sequência de aminoácidos ou nucleotidica que é suficiente para dar identificação putativa da proteína ou gene contido na sequência de aminoácidos ou nucleotidica. As sequências de aminoácidos ou nucleotidicas podem ser avaliadas manualmente pelos familiarizados com a matéria ou usando comparação de sequências baseada em comparação por computadores e ferramentas de identificação que empregam algoritmos tais como BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410; ver também www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). De um modo geral, uma sequência de dez ou mais aminoácidos contíguos ou trinta ou mais nucleótidos contíguos é necessário de forma a identificar putativamente um polipeptídeo ou sequência de ácido nucleico como homólogo de uma proteína ou gene conhecido. Ainda, relativamente às sequências nucleotí- 21 ΡΕ1309698 dicas, sondas oligonucleotídicas específicas de gene, compreendendo 30 ou mais nucleótidos contíguos, podem ser usadas em métodos de identificação de genes dependentes de sequências (e.g., hibridação Southern) e isolamento (e.g., hibridação in situ de colónias bacterianas ou placas de bacteriófagos). Ainda, oligonucleótidos curtos de 12 ou mais nucleótidos podem ser usados como sequências iniciadoras da amplificação em PCR de forma a obter um fragmento de ácido nucleico particular compreendendo as sequências iniciadoras. Assim, uma "porção substancial" de uma sequência nucleotídica compreende uma sequência nucleotídica que conduzirá à identificação específica e/ou isolamento de um fragmento de ácido nucleico compreendendo a sequência. A presente especificação descreve sequências de aminoácidos e nucleotídicas codificadoras de poli-peptídeos que compreendem uma ou mais proteínas vegetais particulares. Os familiarizados com a matéria, tendo acesso às sequências aqui descritas, podem agora usar a totalidade ou uma porção substancial das sequências descritas para fins conhecidos dos familiarizados com a matéria. "Degenerescência de codões" refere-se a divergência no código genético permitindo variação da sequência nucleotídica sem afectar a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo codificado. Assim, o presente invento está relacionado com qualquer fragmento de ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica as sequências de aminoácidos aqui descritas. Os familiarizados com a matéria sabem do "enviesamento de codões" apresentado 22 ΡΕ1309698 por uma célula hospedeira específica ao usar os codões de nucleótidos para especificar um determinado aminoácido. Assim, quando da síntese de um fragmento de ácido nucleico para o melhoramento da expressão numa célula hospedeira, é desejável projectar o fragmento de ácido nucleico de forma a que a sua frequência de utilização de codões se aproxime a frequência de utilização de codões preferida da célula hospedeira. "Fragmentos de ácido nucleico sintético" podem ser montados a partir de blocos de construção que são sintetizados quimicamente usando procedimentos conhecidos dos familiarizados com a matéria. Estes blocos de construção são ligados e emparelhados para formar fragmentos de ácido nucleico maiores que podem então ser montados enzimaticamente para construir a totalidade do fragmento de ácido nucleico pretendido. "Sintetizado quimicamente", relacionado com um fragmento de ácido nucleico, significa que os nucleótidos componentes foram montados in vitro. A síntese química manual de fragmentos de ácido nucleico pode ser conseguida usando procedimentos bem estabelecidos, ou a síntese química automática pode ser realizada usando uma variedade de máquinas comercializadas. Assim, os fragmentos de ácido nucleico podem ser manipulados para a expressão óptima do gene baseada na optimização da sequência de nucleótidos para reflectir o enviesamento de codões da célula hospedeira. Os familiarizados com a matéria conhecem a probabilidade da expressão com êxito de genes se a utilização de codões for enviesada no sentido dos codões 23 ΡΕ1309698 favorecidos pelo hospedeiro. A determinação de codões preferidos pode ser baseada num estudo de genes derivados da célula hospedeira quando existe informação sobre as sequências. "Gene" refere-se a um fragmento de ácido nucleico que expressa uma proteína específica, incluindo sequências reguladoras antes (sequências não codificadoras 5') e após (sequências não codificadoras 3') a sequência codificadora. "Gene nativo" refere-se a um gene conforme encontrado na natureza com as suas próprias sequências reguladoras. "Gene endógeno" refere-se a um gene nativo na sua localização natural no genoma de um organismo. Um "gene estranho" refere-se a um gene não formalmente encontrado no organismo hospedeiro, mas que é introduzido no organismo hospedeiro por transferência de genes. Os genes estranhos podem compreender genes nativos inseridos num organismo não nativo ou genes quiméricos. Um "transgene" é um gene que foi introduzido no genoma através de um procedimento de transformação. "Sequência codificadora" refere-se a uma sequência nucleotídica que codifica uma sequência de aminoácidos específica. "Sequências reguladoras" refere-se a sequências nucleotídicas localizadas a montante (sequências não codificadoras 5') dentro ou a jusante (sequências não codificadoras 3') de uma sequência codificadora e que influencia a transcrição, processamento ou estabilidade do RNA ou tradução da sequência codificadora associada. Sequências 24 ΡΕ1309698 reguladoras podem incluir promotores, sequências lider da tradução, intrões e sequências de reconhecimento de poliadenilação. "Promotor" refere-se a uma sequência nucleotidica capaz de controlar a expressão de uma sequência codificadora ou RNA funcional. Em geral, uma sequência codificadora está situada 3' relativamente a uma sequência de promotor. A sequência do promotor consiste em elementos a montante proximais e distais, estes últimos elementos muitas vezes são referidos como estimuladores. Assim, um "estimulador" é uma sequência nucleotidica que pode estimular a actividade do promotor e pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para aumentar o nivel ou especificidade de tecido de um promotor. Os promotores podem ser derivados na sua totalidade de um gene nativo, ou podem ser compostos por diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza ou podem mesmo compreender segmentos nucleotídicos sintéticos. Deve ser entendido pelos familiarizados com a matéria que diferentes promotores podem dirigir a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos celulares ou em diferentes fases do desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais. Os promotores que fazem com que um fragmento de ácido nucleico seja expresso na maior parte dos tipos celulares quase permanentemente são, normalmente, referidos como "promotores constitutivos". Novos promotores de vários tipos, úteis em células vegetais, estão a ser constantemente descobertos; numerosos exemplos podem ser 25 ΡΕ1309698 encontrados na compilação de Okamuro and Goldberg (1989) Biochemistry of Plants 15:1-82. É ainda reconhecido que uma vez que na maior parte dos casos as fronteiras exactas das sequências reguladoras não foram totalmente definidas, os fragmentos de ácido nucleico de diferentes comprimentos podem ter actividade idêntica de promotor. "Sequência lider da tradução" refere-se a uma sequência de nucleótidos situada entre a sequência do promotor de um gene e a sequência codificadora. A sequência lider de tradução está presente no mRNA totalmente processado, a montante da sequência de iniciação da tradução. A sequência lider da tradução pode afectar o processamento do transcrito primário em mRNA, a estabilidade do mRNA ou a eficiência da tradução. Foram descritos exemplos de sequências líder da tradução (Turner and Foster (1995) Mol. Biotechnol. 3:225-236). "Sequências não codificadoras 3'" refere-se a sequências nucleotídicas situadas a jusante de uma sequência codificadora e incluem sequências de reconhecimento de poliadenilação e outras sequências codificadoras de sinais reguladores capazes de afectar o processamento de mRNA ou a expressão de genes. O sinal de poliadenilação é geralmente caracterizado por estimular a adição de segmentos de ácido poliadenílico ao extremo 3' do precursor de mRNA. A utilização de diferentes sequências não codificadoras 3’ é exemplificada por ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell 1:671-680. 26 ΡΕ1309698 "Transcripto de RNA" refere-se ao produto resultante da transcrição de uma sequência de DNA catalisada pela RNA polimerase. Quando o transcrito de RNA é uma cópia perfeitamente complementar da sequência de DNA, é referida como o transcrito primário ou pode ser uma sequência de RNA derivada do processamento pós-transcrição do transcrito primário e é referido como RNA maduro. "RNA mensaqeiro (mRNA)" refere-se ao RNA que não possui intrões e que pode ser traduzido em polipeptideos pela célula. "cDNA" refere-se a DNA que é complementar e derivado de uma matriz de mRNA. 0 cDNA pode ser de cadeia simples ou convertido na forma de cadeia dupla usando, por exemplo, o fragmento Klenow da DNA polimerase I. "RNA codificador" refere-se a um transcrito de RNA que inclui o mRNA e assim pode ser traduzido num polipeptideo pela célula. "RNA complementar da sequência codificadora" refere-se a um transcrito de RNA que é complementar da totalidade ou parte de um transcrito primário ou mRNA alvo e que bloqueia a expressão de um gene alvo (ver Patente U.S. N° 5107065, aqui incluída como referência). A complementaridade de um RNA complementar de sequência codificadora pode ser com qualquer parte da sequência nucleotídica específica, i.e., na sequência não codificadora 5', sequência não codificadora 3', intrões ou sequência codificadora. "RNA funcional" refere-se a RNA codificador, RNA complementar de sequências codificadoras, RNA ribozima ou outro RNA que pode não ser traduzido mas ainda tem um efeito nos processos celulares. Os termos "complemento" e "complemento reverso" são aqui usados 27 ΡΕ1309698 indiscriminadamente em relação a transcritos de mRNA e pretendem definir o RNA complementar do mensageiro. 0 termo "ligado operacionalmente" refere-se à associação de sequências de ácido nucleico num único fragmento de ácido nucleico de forma a que a função de um seja regulada pelo outro. Por exemplo um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência codificadora quando é capaz de regular a expressão daquela sequência codificadora (i.e., quando a sequência codificadora está sob o controlo transcricional do promotor). As sequências codificadoras podem estar operacionalmente ligadas a sequências reguladoras numa orientação de codificação ou não codificação. Num outro exemplo, as regiões de RNA complementares do invento podem estar operacionalmente ligadas, directamente ou indirectamente, 5' relativamente ao mRNA alvo ou 3' relativamente ao mRNA alvo ou dentro do mRNA alvo, ou uma primeira região complementar situa-se 5' e o seu complemento situa-se 3' relativamente ao mRNA alvo. 0 termo "expressão", como aqui é usado, refere-se à transcrição e acumulação estável de RNA codificador (mRNA) ou complementar do codificador derivado do fragmento de ácido nucleico do invento. A expressão pode também referir-se à tradução de mRNA numa polipeptideo. "Inibição por complementaridade com sequências codificadoras" refere-se à produção de transcritos de RNA complementares de sequências codificadoras, capazes de suprimir a expressão da proteína alvo. A "sobre-expressão" refere-se à produção 28 ΡΕ1309698 de um produto de gene em organismos transgénicos, que excede os níveis de produção no organismo normal ou não transformado. "Co-supressão" refere-se à produção de transcritos de RNA codificadores capazes de suprimir a expressão de genes estranhos ou endógenos idênticos ou substancialmente semelhantes (Patente U.S. N° 5231020).

Uma "proteína" ou "polipeptídeo" é uma cadeia de aminoácidos arranjada numa ordem específica, determinada pela sequência codificadora presente no polinucleótido codificador do polipeptídeo. Cada proteína ou polipeptídeo tem uma função única. "Níveis alterados" ou "expressão alterada" refere-se à produção de um ou mais produtos de genes em organismos transgénicos, em quantidades ou proporções que diferem das encontradas nos organismos normais ou não transformados. "Proteína madura" ou o termo "maduro" quando usado na descrição de uma proteína refere-se a um polipeptídeo processado pós-tradução, i.e., uma a partir da qual foram removidos pre- ou propeptídeos presentes no produto de tradução primário. "Proteína precursora" ou o termo "precursor" quando usado na descrição de uma proteína refere-se ao produto primário da tradução do mRNA; i.e., como pre- e propeptídeos ainda presentes. Pre- e propeptídeos podem ser mas não estão limitados a sinais de localização intracelular. 29 ΡΕ1309698

Um "peptídeo de trânsito para o cloroplasto" é uma sequência de aminoácidos traduzida conjuntamente com uma proteína e que dirige a proteína para o cloroplasto ou outros tipos de plastos presentes na célula em que a proteína é produzida. "Sequência de trânsito para o cloroplasto" refere-se a uma sequência nucleotídica que codifica um peptídeo de trânsito para o cloroplasto. Um "peptídeo sinal" é uma sequência de aminoácidos traduzida conjuntamente com uma proteína e que dirige a proteína para o sistema secretor (Chrispeels (1991) Ann. Ver. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42:21-53). Se a proteína tiver de ser dirigida para um vacúolo, um sinal de direccionamento vacuolar {supra) pode ainda ser adicionado, ou para o retículo endoplasmático, pode ser adicionado um sinal de retenção no retículo endoplasmático (supra). Se a proteína tiver de ser dirigida para o núcleo, qualquer peptídeo sinal presente deverá ser removido e incluído um sinal de localização nuclear (Raikhel (1992) Plant Phys. 100:1621-1632) . "Transformação" refere-se à transferência de um fragmento de ácido nucleico para o genoma de um organismo hospedeiro, resultando na sua herança geneticamente estável. Organismos hospedeiros contendo os fragmentos de ácido nucleico transformados são referidos como organismo "transgénicos". Exemplos de métodos de transformação de plantas incluem transformação mediada por Agrobacterium (De Blaere et al. (1987) Meth. Enzymol. 143:211) e tecnologia 30 ΡΕ1309698 de transformação por partículas aceleradas ou "pistola de genes" (Klein et al. (1987) Nature (London) 327:70-73; Patente U.S. N° 4945050. Assim, os polinucleótidos isolados do presente invento pode ser incluídos em construções recombinantes, tipicamente construções de DNA, capazes da introdução e replicação numa célula hospedeira. Tal construção pode ser um vector que inclui um sistema de replicação e sequências que sejam capazes de transcrição e tradução de uma sequência codificadora de um polipeptídeo numa determinada célula hospedeira. Uma série de vectores adequados para a transfecção estável de células vegetais ou para o estabelecimento de plantas transgénicas foi descrita em, e.g. Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987; Weissbach and Weissbach, Methods for Planta Molecular Bíology, Academic Press, 1989; e Flevin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Tipicamente, os vectores de expressão em plantas incluem, por exemplo, um ou mais genes vegetais clonados sob o controlo da transcrição de sequências reguladoras 5' e 3' e um marcador seleccionável dominante. Tais vectores de expressão vegetais podem também conter uma região reguladora de um promotor (e.g., uma região reguladora que controla a expressão induzível ou constitutiva, regulada ambientalmente ou druante o desenvolvimento, específica de célula ou tecido), um local de iniciação da transcrição, um local de ligação aos ribossomas, um local de terminação da transcrição e/ou um sinal de poliadenilação. As técnicas convencionais de DNA recombinante e de clonagem molecular aqui usadas são bem 31 ΡΕ1309698 conhecidas na área e estão descritas mais detalhadamente em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (daqui em diante "Maniatis"). "PCR" ou "reacção em cada da polimerase" é do conhecimento geral na área como técnica usada para a amplificação de segmentos de dna específicos (Patente U.S. Nos. 4683195 e 4800159).

Os termos "construção recombinante", "construção de expressão", "construção de expressão recombinante", "construção quimérica" e "gene quimérico" são aqui usados de forma indiscriminada. Tal construção pode ser usada por si só ou conjuntamente com um vector. Se for usado um vector, então a escolha do vector está dependente do método que será usado para transformar plantas hospedeiras, como é do conhecimento dos familiarizados com a matéria. Por exemplo, pode ser usado um vector plasmídico. Os familiarizados com a matéria conhecem os elementos genéticos que devem estar presentes no vector de forma a transformar, seleccionar e propagar células hospedeiras com êxito contendo qualquer dos fragmentos de ácidos nucleicos isolados do invento. Os familiarizados com a matéria reconhecerão igualmente que diferentes acontecimentos de transformação independentes resultarão em diferentes níveis e padrões de expressão (Jones et al., (1985) EMBO J. 4:2411-2418; De Almeida et al., (1989) Mol. Gen. Genetics 218: 78-86) e assim aqueles múltiplos acontecimentos 32 ΡΕ1309698 deverão ser testados de forma a obter linhas que apresentem o nível e padrão de expressão pretendido. Tal rastreio pode ser conseguido por análise Southern do DNA, análise Northern da expressão de mRNA, análise Western da expressão proteica ou análise fenotípica. O presente invento diz respeito a um polinu-cleótido isolado, compreendendo uma sequência nucleotídica seleccionada do grupo consistindo em: (a) primeira sequência nucleotídica codificadora de um polipeptídeo que é uma enzima citocromo P450 associada com a síntese de ácidos gordos delta 12-epoxilados, em que o referido polipeptídeo tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade baseado no método Clustal de alinhamento quando comparado com um polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou (b) uma segunda sequência nucleotídica compreendendo o complemento da primeira sequência nucleotídica.

De preferência, a primeira sequência nucleotídica compreende uma sequência de ácido nucleico seleccionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:l, que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO:2. O presente invento sugere que a actividade catalítica responsável pela formação do grupo epoxi em Euphorbia lagascae é uma enzima da classe de citocromo P450 mono-oxigenase. Pensa-se que nenhum dos genes codificadores deste tipo de actividade tenha sido caracterizado antes deste pedido de patente. Demonstrou-se que as actividades 33 ΡΕ1309698 de epoxigenase de outras plantas produtoras de ácido vernólico são diferentes da enzima de Euphorbia lagascae. Os genes de Verónica galamensis e de Crespi palaestina foram isolados e, quando expressos em plantas ou levedura, as proteínas codificadas são capazes de converter ácido linoleico em ácido vernólico (Lee et al. (1998) Science 280:915-918 e Patente U.S. N° 5846784). Ao contrário da enzima de Euphorbia lagascae, estas enzimas não são dependentes de citocromo P450 mas estão antes relacionadas com desaturases de ácidos gordos localizadas no retículo endoplasmático Publicação PCT N° W094/11516, publicado em 26 de Maio, 1994) . Aparentemente estas enzimas epoxidantes de ácidos gordos estão relacionadas na sequência com a classe de enzimas associadas a membranas responsáveis pela de-saturação de ácidos gordos e hidroxilação de ácidos gordos (Broun, P. e Somerville, C (1997) Plant Physiol 113:933-942) . Assim, existem duas classes distintas de genes codificadores de enzimas capazes de formar o grupo A12-epoxi do ácido vernólico: uma que é dependente de citocromo P450 e a outra que está relacionada com as desaturases e hidroxilases de ácidos gordos.

Os clones de três enzimas diferentes dependentes de citocromo P450 foram identificados entre aproximadamente um total de 1000 sequências expressas (ESTs) geradas a partir de uma biblioteca de cDNA de sementes em desenvolvimento de E. lagascae. Um dos clones, eellc.pk002.i4, foi expresso sob a dependência de um promotor GALl numa estirpe de levedura (Saccharomyces cerevisiae) que contem 34 ΡΕ1309698 uma redutase do citocromo P450 vegetal integrada no seu genoma. As células receberam ácido linoleico exógeno (18:2), que se pensa ser o substrato de ácido gordo para a síntese de ácido vernólico. Nas culturas mantidas a 28°C, o ácido vernólico foi detectado em quantidades de 1 a 5 p/% do ácido gordo total. Este ácido gordo não é normalmente detectado em Saccharomyces cerevisiae. A presença de ácido vernólico em células que expressam eellc,pk002.i4 foi confirmada por análise GC-MS de ésteres metílicos de ácidos gordos preparados por processos de transesterificação básica (metóxido de sódio) ou ácida (ácido sulfúrico/meta-nol) . Este resultado é consistente com o envolvimento de uma enzima dependente de citocromo P450 (correspondendo a eellc.pk002.i4) na síntese de ácido vernólico em sementes de Euphorbia lagascae.

Pensamos que seja a primeira caracterização de um gene vegetal codificador de uma enzima da classe de citocromo P450 capaz de produzir ácidos gordos Δ12-epoxilados.

Os fragmentos de ácido nucleico codificadores de pelo menos uma porção de várias enzimas dependentes de citocromo P450, associadas com a síntese de ácidos gordos vegetais A12-epoxilados, foram isolados e identificados por comparação de sequências de cDNA vegetais ao acaso com bases de dados públicas contendo sequências nucleotídicas e proteicas usando algoritmos BLAST bem conhecidos dos familiarizados com a matéria. Os fragmentos de ácido 35 ΡΕ1309698 nucleico do presente invento podem ser usados para isolar cDNAs e genes codificadores de proteínas homólogas da mesma ou de outra espécie vegetal. O isolamento de genes homólogos usando protocolos dependentes de sequências é bem conhecido na área. Exemplos de protocolos dependentes de sequências incluem, mas não estão limitados a métodos de hibridação de ácido nucleico e métodos de amplificação de DNA e RNA conforme exemplificado por várias utilizações de tecnologias de amplificação de ácido nucleico (e.g., reacção em cadeia da polimerase, reacção em cadeia da ligase).

Por exemplo, os genes codificadores de epoxi-genases vegetais, como cDNA ou como DNA genómico, poderão ser isolados directamente usando a totalidade ou uma porção dos fragmentos de ácido nucleico do presente invento como sondas de hibridação de DNA para o rastreio de bibliotecas, derivadas de qualquer planta com interesse, empregando metodologia bem conhecida dos familiarizados com a matéria. Sondas oligonucleotídicas específicas, baseadas nas sequências de ácido nucleico do presente invento, podem ser projectadas e sintetizadas por métodos conhecidos na área (Maniatis). Ainda, pode ser usada directamente uma sequência completa para sintetizar sondas de DNA por métodos conhecidos dos familiarizados com a matéria, como seja marcação de DNA com sequências iniciadoras ao acaso, translação de cortes, técnicas de marcação de extremos ou sondas de RNA usando sistemas de transcrição in vitro disponíveis. Ainda, sequências iniciadoras específicas 36 ΡΕ1309698 podem ser projectadas e usadas para amplificar uma parte ou a totalidade das presentes sequências. Os produtos de amplificação resultantes podem ser marcados directamente durante as reacções de amplificação, ou marcados após as reacções de amplificação, e usados como sondas para isolar cDNA de tamanho completo ou fragmentos genómicos em condições de restringência adequadas.

Ainda, dois segmentos pequenos dos presentes fragmentos de ácidos nucleicos podem ser usados nos protocolos de reacção em cadeia da polimerase para amplificar fragmentos de ácido nucleico mais longos, codificadores de genes homólogos, a partir de DNA ou RNA. A reacção em cadeia da polimerase pode também ser realizada com uma biblioteca de fragmentos de ácido nucleico clonados, em que a sequência de uma sequência iniciadora deriva dos presentes fragmentos de ácido nucleico e a sequência das outras sequências iniciadoras tira partido da presença dos segmentos de ácido poliadenílico no extremo 3' do mRNA precursor codificador dos genes vegetais. Como alternativa, a segunda sequência iniciadora pode ser baseada nas sequências derivadas do vector de clonagem. Por exemplo, os familiarizados com a matéria podem seguir o protocolo RACE (Frohrnan et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:8998-9002) para gerar cDNAs usando PCR para amplificar cópias da região entre um ponto no transcrito e o extremo 3' ou 5'. As sequências iniciadoras orientadas nas direcções 3' e 5' podem ser projectadas a partir das presentes sequências. Usando sistemas RACE 3' ou RACE 5' 37 ΡΕ1309698 (BRL), podem ser isolados fragmentos de cDNA específicos 3' ou 5' (Ohara et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5673-5677; Loh et al. (1989) Science 243:211-220) . Os produtos gerados pelos processos de RACE 3' e 5' podem ser combinados para gerar cDNAs de tamanho completo (Frohrnan and Martin (1989) Techniques 1:165). Consequentemente, um polinucleótido compreendendo uma sequência nucleotídica de pelo menos um dos 60 (de preferência pelo menos um de 40, mais de preferência um de pelo menos 30) nucleótidos contíguos derivados de uma sequência nucleotídica de SEQ ID NO:l, e o complemento de tais sequências nucleotídicas podem ser usados em tais métodos para obter um fragmento de ácido nucleico codificador de uma porção substancial de uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. A especificação descreve um método de obtenção de um fragmento de ácido nucleico codificador de uma porção substancial de um polipeptídeo de epoxigenase vegetal, de preferência uma porção substancial de um polipeptídeo de epoxigenase vegetal, compreendendo os passos de: síntese de uma sequência iniciadora oligonucleotídica compreendendo uma sequência de ácido nucleico de pelo menos um de 60 (de preferência pelo menos um de 40, mais de preferência pelo menos um de 30) nucleótidos contíguos derivados de uma sequência nucleotídica de SEQ ID NO:l e o complemento de tais sequências nucleotídicas; e amplificação de um fragmento de ácido nucleico (de preferência um cDNA inserido num vector de clonagem) usando a sequência iniciadora oligonucleotídica. O fragmento de ácido nucleico amplifi- 38 ΡΕ1309698 cado, de preferência codificará uma porção de um poli-peptideo epoxigenase. A disponibilidade das presentes sequências nucleotídicas e de aminoácidos deduzidas facilitam o rastreio imunológico das bibliotecas de expressão de cDNA. Os peptideos sintéticos representando porções das presentes sequências de aminoácidos podem ser sintetizadas. Estes peptideos podem ser usados para imunizar animais para produzir anticorpos policlonais ou monoclonais com especificidade para peptideos ou proteínas compreendendo as sequências de aminoácidos. Estes anticorpos podem ser então usados para o rastreio de bibliotecas de expressão de cDNA para isolar clones de cDNA de tamanho completo com interesse (Lerner (1984) Adv. Immunol. 36:1-34; Maniatis).

Numa outra forma de realização, este invento diz respeito a células hospedeiras compreendendo os genes quiméricos do invento como aqui descrito ou um polinucleótido isolado do invento como aqui descrito. Exemplos de células hospedeiras que podem ser usadas para a realização do invento incluem, mas não estão limitados a leveduras, bactérias e plantas.

Conforme referido atrás, os fragmentos de ácido nucleico do presente invento podem ser usados para criar plantas transgénicas em que os polipeptídos descritos estão presentes em níveis maiores ou menores do que o normal, ou em tipos celulares ou fases do desenvolvimento em que não 39 ΡΕ1309698 são normalmente encontrados. Isto terá o efeito de alterar o nível de ácidos gordos contendo grupos epoxi naquelas células. A sobre-expressão das proteínas do presente invento pode ser conseguida construindo primeiro um gene quimérico em que a região codificadora é operacionalmente ligada a um promotor capaz de dirigir a expressão de um gene nos tecidos pretendidos na fase desejada do desenvolvimento. 0 gene quimérico pode compreender sequências do promotor e sequências líder da tradução derivadas dos mesmos genes. Sequências não codificadoras 3' para sinais de terminação da transcrição podem ser igualmente proporcionadas. 0 presente gene quimérico pode igualmente compreender um ou mais intrões de forma a facilitar a expressão do gene.

Podem ser construídos vectores plasmídicos compreendendo o presente polinucleótido isolado (ou gene quimérico). A escolha do vector plasmídico está dependente do método que será usado para transformar plantas hospedeiras. Os familiarizados com a matéria conhecem os elementos genéticos que devem estar presentes no vector plasmídico de forma a transformar, seleccionar e propagar com êxito células hospedeiras contendo o gene quimérico. Os familiarizados com a matéria reconhecerão que diferentes acontecimentos de transformação independentes resultarão em diferentes níveis e padrões de expressão (Jones et al. (1985) EMBO J. 4:2411-2418; De Almeida et al. (1989) Mol. 40 ΡΕ1309698

Gen. Genetics 218:78-86) e assim múltiplos acontecimentos deverão ser testados de forma a obter linhas com o nivel e padrão de expressão pretendidos. Tal rastreio pode ser conseguido por análise Southern de DNA, análise Northern da expressão de mRNA, análise Western da expressão proteica ou análise fenotipica.

Para alguns pedidos de patente poderá ser útil dirigir o polipeptideo em questão para diferentes compartimentos celulares ou facilitar a sua secreção pela célula. Pretende-se assim que o gene quimérico descrito atrás possa ser ainda suplementado de forma a dotar a sequência codificadora do presente polipeptideo com sequências de direccionamento intracelulares adequadas, como sejam sequências de trânsito (Keegstra (1989) Cell 55:247-253), sequências sinal ou sequências codificadoras da localização para o reticulo endoplasmático (Chrispeels (1991) Ann.Ver. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 42:21-53) ou sinais de localização nuclear (Raikhel (1992) Plant Phys. 100:1627-1632) com ou sem remoção das sequências de direccionamento que já existam. Se bem que as referências citadas proporcionem exemplos destas, a lista não é exaustiva e outros sinais de direccionamento podem ser futuramente descobertos.

Pode também ser desejável reduzir ou eliminar a expressão de genes codificadores dos presentes polipeptideos em plantas para algumas aplicações. De forma a conseguir isto, um gene quimérico projectado para a co- 41 ΡΕ1309698 supressão do presente polipeptídeo pode ser construído através da ligação de um gene, ou fragmento de gene, codificador daquele polipeptídeo a sequências promotoras vegetais.

Tanto genes de co-supressão como genes quiméricos complementares das sequências codificadoras poderão ser introduzidos através de transformação nas plantas em que a expressão dos genes correspondentes é reduzida ou eliminada.

Soluções genéticas moleculares para a geração de plantas com expressão génica alterada tem decididamente uma vantagem relativamente a abordagens mais tradicionais de cruzamento de plantas. Podem ser produzidas alterações nos fenótipos das plantas através da inibição específica de um ou mais genes, por inibição ou co-supressão com ácidos nucleicos complementares (Patentes U.S. Nos. 5190931, 5107065 e 5283323) . Uma construção de inibição com ácido nucleico complementar ou co-supressão actuará como regulador negativo dominante da actividade do gene. Ainda que as mutações convencionais possam conferir regulação negativa da actividade génica, estes efeitos são provavelmente recessivos. A regulação negativa dominante, disponível com uma abordagem transgénica, pode ser vantajosa na perspectiva reprodutora. Ainda, a capacidade de restringir a expressão de um fenótipo específico aos tecidos reprodutores da planta, através da utilização de promotores específicos de tecido pode conferir vantagens agronómicas 42 ΡΕ1309698 relativamente às mutações convencionais que podem ter um efeito em todos os tecidos onde um gene mutante é normalmente expresso.

Os familiarizados com a matéria sabem que considerações especiais estão associadas à utilização de tecnologias que usam ácidos nucleicos complementares ou co-supressão para reduzir a expressão de genes particulares. Por exemplo, o nível adequado de expressão de genes codificadores e complementares de genes codificadores pode requerer a utilização de diferentes genes quiméricos usando diferentes elementos reguladores conhecidos dos familiarizados com a matéria. Uma vez obtidas as plantas trans-génicas por um dos métodos atrás descritos, será necessário fazer o rastreio de transgénicos individuais respeitante aos que apresentam mais eficazmente o fenótipo pretendido. Assim, os familiarizados com a matéria desenvolverão métodos para o rastreio de grandes números de transfor-mantes. A natureza destes rastreios, de um modo geral, será escolhida em termos práticos. Por exemplo, pode-se fazer o rastreio observando alterações na expressão do gene usando anticorpos específicos da proteína codificada pelo gene a ser suprimido, ou pode-se estabelecer ensaios que medem especificamente a actividade enzimática. Um método preferido será aquele que permite que grandes números de amostras sejam processados rapidamente, uma vez que se espera que um grande número de transformantes sejam negativos para o fenótipo pretendido. 43 ΡΕ1309698

Um polipeptídeo (ou porções do mesmo) pode ser produzido em células hospedeiras heterólogas, particularmente nas células de hospedeiros microbianas e pode ser usado para preparar anticorpos contra esta proteína por métodos bem conhecidos dos familiarizados com a matéria. Os anticorpos são úteis para a detecção do polipeptídeo do presente invento in situ em células ou in vitro em extractos celulares. Células hospedeiras heterólogas preferidas para a produção do presente polipeptídeo consistem em hospedeiros microbianos. Os sistemas de expressão microbianos e os vectores de expressão contendo sequências reguladoras que dirigem níveis elevados de expressão de proteínas estranhas são bem conhecidos dos familiarizados com a matéria. Qualquer um destes poderá ser usado para construir um gene quimérico para a produção do presente polipeptídeo. Este gene quimérico será então introduzido nos microrganismos adequados, através de transformação, para proporcionar nível elevado de expressão das enzimas dependentes de citocromo P450 associadas com a síntese de ácidos gordos vegetais A12-epoxilados. É proporcionado um exemplo de um vector para elevado nível de expressão do presente polipeptídeo num hospedeiro bacteriano (Exemplo 6). A totalidade ou uma porção substancial dos polinucleótidos do presente invento pode ser igualmente usada como marcador das características associadas a estes genes. Tal informação pode ser útil na reprodução de plantas de forma a desenvolver linhas com os fenótipos pretendidos. Por exemplo, os presentes fragmentos de ácido 44 ΡΕ1309698 nucleico podem ser usados como marcadores de polimorfismo do comprimento de fragmentos de restrição (RFLP). As transferências Southern (Maniatis) do DNA genómico vegetal digerido com enzimas de restrição pode ser hibridado com fragmentos de ácido nucleico do presente invento. Os padrões de bandas resultantes podem ser então sujeitos a análise genética usando programas de computador tais como MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1:174-181) de forma a construir um mapa genético. Ainda, os fragmentos de ácido nucleico do presente invento podem ser usados para o rstreio de transferências Southern, contendo DNAs genómicos tratados com endonucleases de restrição de uma série de indivíduos, representando os progenitores e a progénie de um cruzamento genético definido. A segregação dos polimorfismos de DNA é anotada e usada para calcular a posição da sequência de ácido nucleico com interesse no mapa genético previamente obtido usando esta população (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32:314-331). A produção e a utilização de sondas derivadas de genes vegetais estão descritas em Bernatzky and Tanksley (1986) Plant Mol. Repórter 4:37-41. Numerosas publicações descrevem o mapeamento genético de clones de DNA específicos usando a metodologia descrita ou variações das mesmas. Por exemplo, as populações de F2 intercruzadas, populações de retrocruzamentos, populações conjugadas ao acaso, linhas quase isogénicas e outras séries de indivíduos podem ser usadas no mapeamento. Tais metodologias são conhecidas dos familiarizadas com a matéria. 45 ΡΕ1309698

Sondas de ácido nucleico derivadas das presentes sequências de ácido nucleico podem também ser usadas para o mapeamento fisico (i.e., colocação de sequências em mapas físicos; ver Hoheisel et al. In: Nonmammalian Genomic Analysis: A Praticai Guide, Academic Press 1996, pp. 319-346, e referências citadas).

As sondas de ácido nucleico derivadas das presentes sequências de ácido nucleico podem ser usadas no mapeamento por hibridação in situ de fluorescência directa (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7:149-154). Se bem que os métodos correntes de mapeamento por FISH favoreçam a utilização de clones grandes (vários a várias centenas de KB; ver Laan et al. (1995) Genome Res. 5:13-20), melhoramentos na sensibilidade podem permitir um bom desempenho do mapeamento por FISH usando sondas mais curtas.

Uma variedade de métodos baseados na amplificação de ácido nucleico para mapeamento genético e fisico pode ser realizada usando as presentes sequências de ácido nucleico. Exemplos incluem amplificação especifica de alelo (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med. 11:95-96), polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16:325-332), ligação especifica de alelos (Landegren et al. (1988) Science 241:1077-1080), reacções de extensão de nucleótidos (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18:3671), Mapeamento de Hibridos por Radiação (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7:22-28) e Mapeamento "Happy" 46 ΡΕ1309698 (Dear and Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17:6795-6807). Para estes métodos, a sequência de um fragmento de ácido nucleico é usado para projectar e produzir pares de sequências iniciadoras a usar na reacção de amplificação ou na reacção da extensão de sequências iniciadoras. A projecção de tais sequências iniciadoras é bem conhecida do familiarizados com a matéria. Nos métodos que empregam mapeamento genético baseado em PCR, pode ser necessário identificar diferenças na sequência de DNA entre os progenitores do retrocruzamento na região correspondendo à sequência de ácido nucleico com interesse, isto, no entanto, não é geralmente necessário para os métodos de mapeamento.

Numa outra forma de realização, o presente invento diz respeito a um método de selecção de um polinucleótido isolado que afecta o nivel de ácidos gordos A12-epoxilados numa célula hospedeira adequada, o método compreendendo os passos de, (a) preparação de um polinucleótido isolado compreendendo a sequência polinucleo-tidica do presente invento, (b) introdução do polinucleótido isolado numa célula hospedeira adequada e (c) determinação da presença ou ausência de ácidos gordos Δ12-epoxilados na célula hospedeira de (b).

Ainda numa outra forma de realização, o presente invento está relacionado com um método para a produção de ácidos gordos A12-epoxilados numa célula hospedeira adequada, o qual compreende (a) transformação de uma célula 47 ΡΕ1309698 hospedeira adequada com a construção quimérica do presente invento, (b) crescimento das células hospedeiras transformadas do passo(a) e (c) determinação da presença ou ausência de ácidos gordos A12-epoxilados nas células transformadas de (b) .

EXEMPLOS O presente invento é ainda definido nos Exemplos que se seguem, nos quais partes e percentagens são por peso e os graus são Celsius, a menos que de outra forma seja indicado. Deverá ser compreendido que estes Exemplos, se bem que indicativos das realizações preferidas do invento, são dados apenas a título ilustrativo. Da discussão feita e destes Exemplos, os familiarizados com a matéria podem avaliar as características essenciais do invento e, sem se afastarem do espírito e âmbito do mesmo, podem fazer várias alterações e modificações ao invento para adaptá-lo a várias utilizações e condições. Assim, várias modificações do invento, para além das aqui apresentadas e descritas serão óbvias para os familiarizados com a matéria a partir da descrição anterior. EXEMPLO 1

Composição de bibliotecas de cdna: Isolamento e sequenciação de clones de cDNA

Preparou-se uma biblioteca de cDNA representando 48 ΡΕ1309698 mRNAs derivados de sementes de Euphorbia lagascae. As características da biblioteca estão descritas abaixo. TABELA 2

Biblioteca de cDNA derivado de Euphorbia lagascae

Biblioteca Tecido Clone Eellc Sementes em desenvolvimento de Euphorbia lagascae que podem conter um cito-cromo P450 putativo envolvido na síntese de ácidos gordos epoxilados Eellc.pk002.i4

As bibliotecas de cDNA podem ser preparadas por muitos métodos disponíveis. Por exemplo, os cDNAs podem ser introduzidos em vectores plasmidicos preparando primeiro bibliotecas de CDNA em vectores Uni-ZAP™XR de acordo com o protocolo do fabricante (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) . As bibliotecas Uni-ZAP™XR foram convertidas em bibliotecas plasmídicas de acordo com o protocolo fornecido pela Stratagene. Quando da conversão, os insertos de cDNA estarão inseridos no vector plasmídico pBluescript. Ainda, os cDNAs podem ser introduzidos directamente em vectores Bluescript II SK(+) (Stratagene) usando DNA ligase de T4 (New England Biolabs), seguido de transfecção de células DH10B de acordo com o protocolo do fabricante (GIBCO brl Products). Uma vez os insertos de cDNA nos vectores plasmidicos, os DNAs plasmidicos são preparados a partir de colónias picadas ao acaso, contendo plasmídeos pBluescript recombinantes, ou o inserto das sequências de cDNA são 49 ΡΕ1309698 amplificados via reacção em cadeia com polimerase usando sequências iniciadoras especificas para sequências do vector, as quais flanqueiam as sequências de cDNA inseridas. Os DNAs amplificados inseridos ou os DNAs de plasmídeo são sequenciados em reacções de sequenciação com sequências inciadoras coradas para gerar sequências parciais de cDNA (fragmentos de sequências expressas ou "ESTs"; ver Adams et al., (1991) Science 252:1651-1656) . Os ESTs resultantes foram analisados usando um sequenciador de fluorescência Perkin Elmer Model 377.

Os dados de sequências completas dos insertos (FIS) foram gerados usando um protocolo de transposição modificado. Os clones identificados por FIS foram recuperados a partir de stocks arquivados em glicerol como colónias isoladas e os DNAs de plasmideos foram isolados via lise alcalina. Os moldes de dna isolados reagiram com os oligonucleótidos directo e reverso de Ml3 hibridados com o vector, numa reacção de sequenciação baseada em PCR, e foram aplicados em sequenciadores automáticos. A confirmação da identificação do clone foi efectuada através do alinhamento de sequências com a sequência de EST original a partir da qual se prepara os FIS solicitados.

Os moldes confirmados foram transferidos através do kit de transposição Primer Island (PE Applied Biosystems, Foster City) que se baseia no elemento transponivel Tyl de Saccharomyces cerevisiae (Devine and 50 ΡΕ1309698

Boeke (1994) Nucleic Acids Res. 22:3765-3772). O sistema de transposição in vitro coloca locais de ligação únicos, ao acaso, numa população de grandes moléculas de DNA. O DNA transposto é então usado para transformar células DH10B electrocompetentes (Gibco BRL/Life Technologies, Rockville, MD) via electroporação. O elemento transponivel possui uma marca seleccinável adicional (designada DHFR; Fling and Richards (1983) Nucleic Acids Res. 11:5147-5158), permitindo a dupla selecção em placas de agar apenas dos clones contendo o transposão integrado. Múltiplos subclones foram seleccionados ao acaso a partir de cada reacção de transposição, DNAs de plasmideo foram preparados via lise alcalina e os moldes sequenciados (ABI Prism dye-terminator ReadyReaction mix) a partir do local de transposição, usando sequências iniciadoras únicas especificas dos locais de ligação dentro do transposão.

Os dados da sequência foram colhidos (ABI Prism Collections) e montados usando Phred/Phrap (P. Green, University of Washington, Seattle) . Phred/Phrap é um programa informático público que volta a ler os dados da sequência ABI, revê as bases, atribui valores de qualidade e escreve as bases revistas e os valores de qualidade em ficheiros de dados editáveis. O programa de montagem de sequências Phrap usa estes valores de qualidade para aumentar a precisão das sequências montadas. As sequências montadas são visualizadas pelo editor de sequências Consed (D. Gordon, University of Washington, Seattle) . ΡΕ1309698 51 EXEMPLO 2

Identificação de clones de cDNA

Os clones de DNA codificadores das enzimas citocromo P450 associadas com a sintese de ácidos gordos vegetais A12-epoxilados foram identificados efectuando pesquisas BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al. (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410; ver também www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) relativamente a semelhanças com sequências contidas nas bases de dados BLAST "nr" (compreendendo todas as traduções CDS do GenBank não redundantes, sequências derivadas do Brookhaven Proteína Data Bank de estruturas tridimensionais, a última maior publicação das bases de dados de sequências proteicas SWISS-PROT, bases de dados EMBL e DDBJ). As sequências de cDNA obtidas no Exemplo 1 foram analisadas relativamente a semelhança com todas as sequências de DNA disponíveis ao público contidas nas "nr" bases de dados usando o algoritmo BLASTN proporcionado pelo National Center for Biotechnology Information (NCBI). As sequências de DNA foram traduzidas em todas as grelhas de leitura e comparadas relativamente à semelhança com todas as sequências proteicas disponíveis ao público contidas na base de dados "nr" usando o algoritmo BLASTX (Gish and States (1993) Nat. Genet. 3:266-211) proporcionado pelo NCBI. Por conveniência, o valor de P (probabilidade) da observação de concordância entre uma sequência de cDNA e uma sequência contida nas bases de dados pesquisadas, meramente por acaso conforme calculado 52 ΡΕ1309698 por BLAST, estão aqui descritas como valores de "pLog", os quais representam o negativo do logaritmo do valor de P descrito. Assim, quanto maior o valor de pLog, maior a probabilidade de a sequência de cDNA e a "primeira escolha" de BLAST representarem proteínas homólogas. ESTs submetidas para análise foram comparadas com as bases de dados GenBank como descrito atrás. ESTs que possuem sequências mais 5' ou 3' podem ser encontradas usando o algoritmo BLASTn (Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402) contra a base de dados propriedade da DuPont, comparando as sequências nucleotídicas que partilham regiões comuns ou sobreponíveis de homologia de sequências. Quando sequências comuns ou sobreponíveis existem entre dois ou mais fragmentos de ácido nucleico, as sequências podem ser montadas numa única sequência nucleotídica contígua, prolongando assim o fragmento original na direcção 5' ou 3'. Uma vez identificada a EST mais 5', a sua sequência completa pode ser determinada por Full Insert Sequencing como descrito no Exemplo 1. Os genes homólogos pertencentes a diferentes espécies podem ser encontrados por comparação da sequência de aminoácidos de um gene conhecido (derivado de uma fonte proprietária ou de uma base de dados pública) contra uma base de dados EST usando o algoritmo tBLASTn. O algoritmo tBLASTn pesquisa uma sequência de aminoácidos desconhecida contra uma base de dados nucleotídicas que é traduzida na totalidade das 6 grelhas de leitura. Esta pesquisa tem em consideração as diferenças na utilização de codões nucleotídicos entre diferentes espécies e a degenerescência de codões. ΡΕ1309698 53 EXEMPLO 3

Caracterização de clones de cDNA codificadores de epoxigenases vegetais A pesquisa BLASTX usando as sequências EST derivadas dos clones apresentados na Tabela 3 revelou semelhança dos polipeptídeos codificados pelos cDNAs com um polipeptideo contendo um grupo heme de citocromo P450 envolvido nas interacções de incompatibilidade fúngica da pimenta (Capsicum annuum NCBI General Identifier N° gi 6739506) . Na Tabela 3 estão apresentados os resultados de BLAST para a sequência do inserto de cDNA completo, compreendendo o clone de cDNA indicado ("FIS"), o qual também compreende a sequência completa do gene para uma epoxigenase de Euphorbia: TABELA 3

Resultados de BLAST para sequências codificadoras de polipeptídeos com actividade de epoxigenase vegetal

Clone Estatuto Pontuação pLog BLAST 6739506 eellc,pk002.i4 FIS 122,00 A Figura 1 apresenta um alinhamento da sequência de aminoácidos descrita em SEQ id NO:2 e da sequência da pimenta (SEQ ID NO:3). Os dados na Tabela 4 representam um 54 ΡΕ1309698 cálculo da percentagem de identidade entre as sequências de aminoácidos descritas em SEQ ID NO: 2 e a sequência da pimenta (Capsicum annum) (SEQ ID NO:3). TABELA 4

Percentagem de identidade das sequências de aminoácidos deduzidas das sequências nucleotidicas dos clones de cDNA codificadores de polipeptideos com actividade de epoxigenase vegetal SEQ ID NO. Percentagem de identidade com 6739506 2 40,4%

Os alinhamentos de sequências e os cálculos da percentagem de identidade foram realizados usando o programa Megalign do local de computação bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). O alinhamento múltiplo das sequências foi realizado usando o método de alinhamento Clustal (Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-153) com os parâmetros por defeito (GAP PENALTY = 10, GAP LENGTH PENALTY = 10) . Os parâmetros por defeito para os alinhamentos de pares de sequências usando o método Clustal foram KTUPLE 1, GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 e DIAGONALS SAVED =5. Os alinhamentos de sequências e as pontuações BLAST e as probabilidades indicam que os fragmentos de ácido nucleico compreendendo os presentes clones de cDNA codificam uma porção substancial de uma epoxigenase vegetal. Estas sequências representam as primeiras sequências 55 ΡΕ1309698 conhecidas do Requerente para citocromo P450 codificadoras de uma enzima associada à formação de um grupo A12-epoxi em plantas. EXEMPLO 4

Expressão de genes quiméricos em células de Monocotiledóneas

Pode ser construído um gene quimérico compreendendo um cDNA codificador do polipeptídeo com interesse, na orientação codificadora relativamente ao promotor da zeína de 2 7KD do milho, o qual está situado 5' relativamente ao fragmento de cDNA e o extremo 3' da zeina de 30 KD que está situado 3' relativamente ao fragmento de cDNA. O fragmento de cDNA deste gene pode ser gerado por reacção em cadeia da polimerase (PCR) a partir do clone de cDNA usando sequências iniciadoras oligonucleotídicas adequadas. Os locais de clonagem (Ncol ou Smal) podem ser incorporados nos oligo-nucleótidos para proporcionar a orientação correcta do fragmento de cDNA, quando inserido no vector pMLl03 digerido como descrito abaixo. A amplificação foi então realizada num PCR convencional. O DNA amplificado foi em seguida digerido com as enzimas de restrição Ncol e Smal e fraccionado num gel de agarose. A banda adequada pode ser isolada a partir do gel e combinada com um fragmento Ncol-Smai de 4,9 Kb do plasmídeo pMLl03. O plasmídeo pMLl043 foi depositado sob o termos do Tratado de Budapeste na ATCC (American Type Culture Culture Collection, 10801 University 56 ΡΕ1309698

Blvd., Manassas, VA 20110-2209) e tem o número de acesso ATCC 97366. O fragmento de DNA derivado de pMLl03 possui um fragmento Sall-Ncil de 1,05 Kb do promotor do gene da zeina de 27 KD do milho e um fragmento Smal-Sall de 0,96 Kb do extremo 3' do gene da zeina de 10 KD do milho no vector pGem9Zf( + ) (Promega) . O DNA do vector e inserto podem ser ligados a 15°C durante a noite, essencialmente como descrito (Maniatis). O DNA ligado foi então usado para transformar E. coli XLl-Blue (Epicurian Coli XL-1 Blue™; Stratagene). Os transformantes bacterianos podem ser testados por digestão, com enzimas de restrição, do DNA plasmidico e análise limitada da sequência nucleotidica usando o método de terminação de cadeias didesoxi (Sequenase™DNA Sequencing Kit; U.S. Biochemical). A construção do plasmideo resultante compreenderá um gene quimérico codificador, na direcção 5' para 3', do promotor da zeina de 27 KD do milho, um fragmento de cDNA codificador do presente polipeptídeo e a região 3' da zeina de 10 KD. O gene quimérico atrás descrito pode ser então introduzido nas células de milho pelo processo que se segue. Embriões de milho imaturos podem ser dissecados a partir de cariopses em desenvolvimento derivadas de cruzamentos das linhas singeneicas de milho H99 e LH132. os embriões foram isolados 10 a 11 dias após a polinização, quando têm 1,0 a 1,5 mm de comprimento. Os embriões foram então colocados com o lado axial para baixo e em contacto com meio N6 solidificado com agarose (Chu et al. (1975) 57 ΡΕ1309698

Sei. Sin. Peking 18:659-668). Os embriões foram mantidos no escuro a 72°C. Os calos embrionários somáticos friáveis, consistindo em massas indiferenciadas de células com pro-embrióides e embrióides somáticos nascidos em estruturas suspensoras, proliferam a partir do escutelo destes embriões imaturos. Os calos embrionários isolados a partir dos explantes primários podem ser cultivados em meio N6 e subcultivados neste meio cada 2 a 3 semanas. O plasmideo, p35S/Ac (adquirido ao Dr. Peter Eckes, Hoechst Ag, Frankfurt, Germany) pode ser usado nas experiências de transformação de forma a proporcionar uma marca sleccionável. Este plasmideo possui o gene Pat (ver Publicação de Patente Europeia 0 242 236) que codifica fosfinotricina acetil transferase (PAT). A enzima PAT confere resistência aos herbicidas inibidores da glutamina sintetase tais como fosfinotricina. O gene pat em p35S/Ac está sob o controlo do promotor 35S do Vírus do Mosaico da Couve Flor (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812) e da região 3' do gene da nopalina sintetase derivado do T-DNA do plasmideo Ti de Agrobacterium tumefaciens. O método de bombardeamento de partículas (Klein et al. (1987) Nature 327:70-73) pode ser usado para transferir genes para as células de calo em cultura. De acordo com este método, partículas de ouro (1 pm de diâmetro) são revestidas com dna usando a técnica que se segue. Dez pg de DNAs de plasmideo foram adicionados a 50 pi de uma suspensão de partículas de ouro (60 mg por ml) . 58 ΡΕ1309698

Cloreto de cálcio (50 μΐ de uma solução 2,5 M) e espermidina base livre (20 μΐ de uma solução 1,0 M) foram adicionadas às partículas. A suspensão foi agitada com vortex durante a adição destas soluções. Após 10 minutos, os tubos foram rapidamente centrifugados (5 seg a 15000 rpm) e o sobrenadante removido. As partículas foram ressuspensas em 200 μΐ de etanol absoluto, contrifugadas novamente e o sobrenadante removido. A lavagem com etanol foi realizada novamente e as partículas ressuspensas num volume final de 30 μΐ de etanol. Uma alíquota (5 μΐ) de partículas de ouro revestidas com DNA pode ser colocada no centro de um disco voador Kapton™ (Bio-Rad Labs). As partículas foram então aceleradas na direcção do tecido de milho com um Biolistic™PDS-1000/He (Bio-Rad Instruments, Hercules CA), usando uma pressão de hélio de 1000 psi, uma distância de intervalo de 0,5 cm e uma distância de voo de 1,0 cm.

Para o bombardeamento, o tecido embrionário é colocado em papel de filtro sobre meio N6 solidificado com agarose. O tecido é arranjado como uma camada fina e cobre uma área circular de aproximadamente 5 cm de diâmetro. A placa de petri contendo o tecido pode ser colocada na câmara do PDS-1000/He a aproximadamente 8 cm do écran de paragem. O ar na câmara é então removido com um vácuo de 28 polegadas de Hg. O macroveículo foi acelerado com uma onda de choque de hélio usando uma membrana de ruptura que rebenta quando a pressão de He no tubo de choque atinge 1000 psi. 59 ΡΕ1309698

Sete dias após o bombardeamento, o tecido pode ser transferido para meio N6 que contem glufosinato (2 mg por litro) e não possui caseína ou prolina. O tecido continua a crescer lentamente neste meio. Após mais duas semanas, o tecido pode ser transferido para meio N6 fresco contendo glufosinato. Após 6 semanas, áreas de aproxi-madamente 1 cm de diâmetro de calos em crescimento foram identificadas nalgumas placas contendo o meio suplementado com glufosinato. Estes calos podem continuar a crescer quando subcultivados no meio selectivo.

As plantas podem ser regeneradas a partir de calos transgénicos, transferindo primeiro aglomerados de tecidos para meio N6 suplementado com 0,2 mg por litro de 2,4-D. Após duas semanas o tecido pode ser transferido para meio de regeneração (Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8: 833-839). EXEMPLO 5

Expressão de genes quiméricos em células de dicotiledóneas A cassete de expressão específica de sementes, composta pelos promotor e terminador de transcrição do gene codificador da subunidade β da faseolina, proteína de reserva, derivada do feijão Phaseolus vulgaris (Doyle et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:9228-9238) pode ser usado para a expressão do presente polipeptídeo em soja 60 ΡΕ1309698 transformada. A cassete faseolina inclui cerca de 500 nucleótidos a montante (5') do codão de iniciação da tradução e cerca de 1650 nucleótidos a jusante (3') do codão de paragem da tradução de faseolina. Entre as regiões 5' e 3' estão locais de endonucleases de restrição únicos Ncol (que inclui o codão de iniciação da tradução ATG), Smal, Κρη I e Xbal. Toda a cassete é flanqueada por locais Hindlll. 0 fragmento de cDNA deste gene pode ser gerado por reacção em cadeia da polimerase (PCR) a partir do clone de cDNA usando sequências iniciadoras oligonucleotidicas adequadas. Os locais de clonagem podem ser incorporados nos oligonucleótidos para proporcionar a orientação correcta do fragmento de DNA quando inserido no vector de expressão. A amplificação foi então realizada como descrito atrás e o fragmento isolado inserido num vector pUCl8 portador da cassete de expressão da semente.

Os embriões de soja podem ser então transformados com o vector de expressão compreendendo sequências codificadoras do presente polipeptideo. Para induzir embriões somáticos, cotilédones de 3-5 mm de comprimento dissecados de sementes imaturas do cultivar de soja A2872 com a superfície esterilizada, podem ser cultivados na luz ou no escuro, a 26°C, num meio de agar adequado, durante 6-10 semanas. Os embriões somáticos que produzem embriões secundários são então removidos e colocados num meio líquido adequado. Após selecção repetida dos aglomerados de 61 ΡΕ1309698 embriões somáticos que se multiplicaram como embriões precoces na fase globular, as suspensões são mantidas como descrito abaixo.

Culturas embrionárias de soja em suspensão podem ser mantidas em 35 ml de meio liquido, num agitador rotativo, 150 rpm, a 26°C, com luzes fluorescentes num horário de 16:8 horas de dia/noite. As culturas são subcultivadas de duas em duas semanas através da inoculação de aproximadamente 35 mg de tecido em 35 ml de meio liquido.

Culturas embrionárias de soja em suspensão podem então ser transformadas pelo método de bombardeamento com uma pistola de partículas (Klein et al. (1987) Nature (London) 327:70-73, Patente U.S. N° 4945050). Um instrumento DuPont Biolistic™ PDS1000/HE (retro-ajuste de hélio) pode ser usado para estas transformações.

Um gene para uma marca seleccionável que pode ser usado para facilitar a transformação de soja é um gene quimérico composto pelo promotor 35S derivado de Vírus do Mosaico da Couve Flor (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812), o gene da higromicina fosfotransferase derivado do plasmídeo pJR225 (derivado de E. coli; Gritz et al. (1983) Gene 25:179-188) e a região 3' do gene da nopalina sintetase derivado do T-DNA do plasmídeo Ti de Agrobac-terium tumefaciens. A cassete de expressão da semente compreendendo a região 5' da faseolina, o fragmento codi- 62 ΡΕ1309698 ficador do presente polipeptídeo e a região 3' da faseolina podem ser isolados como um fragmento de restrição. Este fragmento pode ser então inserido num local de restrição único do vector portador do gene da marca. A 50 μΐ de uma suspensão de 60 mg/ml de partículas de ouro de 1 μιη, adicionou-se (por ordem) : 5 μΐ de DNA (1 μq/μl)r 20 μΐ de espermidina (0,1 M) e 50 μΐ de CaCl2 (2,5 M). A preparação de partículas foi então agitada durante três minutos, centrifugada numa microcentrífuga durante 10 segundos e o sobrenadante removido. As partículas revestidas com DNA foram então lavadas uma vez em 400 μΐ de 70% etanol e ressuspensas em 40 μΐ de etanol anidro. A suspensão de DNA/partículas pode ser sonicada três vezes durante um segundo cada. Cinco μΐ das partículas de ouro revestidas com DNA foram então aplicadas em cada disco macroveículo.

Aproximadamente 300-400 mg de uma cultura em suspensão com duas semanas foi colocado numa placa de petri vazia, de 60x15 mm, e o líquido residual foi removido do tecido com uma pipeta. Para cada experiência de transformação, aproximadamente 5-10 placas de tecido foram normal- mente bombardeadas. A pressão de ruptura da membrana foi estabelecida em 1100 psi e a câmara foi sujeita a um vácuo de 28 polegadas de mercúrio. 0 tecido foi colocado a aproximadamente 3,5 polegadas do écran de retenção e bombardeado três vezes. Após bombardeamento, o tecido pode 63 ΡΕ1309698 ser dividido ao meio, colocado novamente em liquido e cultivado como descrito atrás.

Cinco a sete dias após bombardeamento, o meio liquido pode ser substituído por meio fresco e, onze a doze dias após bombardeamento, por meio fresco contendo 50 mg/ml de higromicina. Este meio selectivo pode ser substituído semanalmente. Sete a oito semanas após bombardeamento, pode-se observar o crescimento de tecido verde transformado a partir de aglomerados embrionários necróticos não transformados. O tecido verde isolado foi removido e inoculado em frascos individuais para gerar novas culturas em suspensão embrionárias transformadas e propagadas clonalmente. Cada uma das novas linhas pode ser tratada como um acontecimento de transformação independente. Estas suspensões podem então ser subcultivadas e mantidas como aglomerados de embriões imaturos ou regenerados em plantas completas através da maturação e germinação de embriões somáticos individuais. EXEMPLO 6

Expressão de genes quiméricos em células microbianas

Os cDNAs codificadores do presente polipeptídeo podem ser inseridos no vector de expressão T7 de E. coli pBT430. Este vector é um derivado de pET-3a (Rosenberg et al. (1987) Gene 56:125-135) que emprega o sistema RNA 64 ΡΕ1309698 polimerase de T7/promotor T7. O plasmídeo pBT430 foi construído destruindo primeiro os locais EcoRl e HindIII em pET-3 nas suas posições originais. Um adaptador oligonu-cleotídico contendo os locais EcoRl e HindIII foi inserido no local BamHl de pET-3a. Isto criou pET-3aM com mais locais de clonagem únicos para inserção de genes no vector de expressão. Em seguida, o local Ndel na posição de iniciação da tradução foi convertido num local Ncol usando mutagénese dirigida com oligonucleótidos. A sequência de DNA de pET-3aM nesta região, 5'-CATATGG, foi convertida em 5'-CCCATGG em pBT430. 0 DNA de plasmídeo contendo um cDNA pode ser adequadamente digerido para libertar um fragmento de ácido nucleico codificador da proteína. Este fragmento pode então ser purificado num gel de 1% de agarose de baixo ponto de fusão. 0 tampão e a agarose continham 10 pg/ml de brometo de etídio para visualização do fragmento de DNA. O fragmento pode então ser purificado a partir do gel de agarose por digestão com GELase™ (Epicentre Technologies, Madison, WI) de acordo com as instruções do fabricante, precipitado com etanol, seco e ressuspenso em 20 μΐ de água. Adaptadores oligonucleotídicos adequados podem ser ligados ao fragmento usando DNA ligase de T4 (New England Biolabs (NEB), Beverly, MA). O fragmento contendo os adaptadores ligados pode ser purificado a partir do excesso de adaptadores usando agarose de baixo ponto de fusão como descrito atrás. O vector pBT430 foi digerido, desfosfo-rilado com fosfatase alcalina (NEB) e desproteinizado com 65 ΡΕ1309698 fenol/clorofórmio como descrito abaixo. 0 vector preparado pBT430 e o fragmento podem ser então ligados a 16 °C, durante 15 horas, seguido de transformação em células electrocompetentes DH5 (GIBCO BRL). Os transformantes podem ser seleccionados em placas de agar contendo meio LB e 100 μΐ/ml de ampicilina. os transformantes contendo o gene codificador do presente polipeptideo são então testados relativamente à orientação correcta em relação ao promotor T7 por análise com enzimas de restrição.

Para um elevado nivel de expressão, um clone plasmidico com o inserto de cDNA na orientação correcta relativamente ao promotor de T7 pode ser usado para transformar E. coli estirpe BL21(DE3) (Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113-130). As culturas foram crescidas em meio LB contendo ampicilina (100 mg/ml) a 25°C. Numa densidade óptica a 600 nm de aproximadamente 1, adicionou-se IPTG (isopropiltio-p-galactósido) para uma concentração final de 0,4 mM e a incubação pode ser continuada durante 3 h a 25°C. As células foram então colhidas por centrifugação e ressuspensas em 50 μΐ de Tris-HC1 a pH 8,0 contendo DTT 0,1 mM e fluoreto de fenilme-tilsulfonilo. Uma pequena quantidade de esferas de vidro de 1 mm pode ser adicionada e a mistura sonicada 3 vezes durante cerca de 5 segundo de cada vez com uma micro-sonda de sonicador. A mistura foi centrifugada e a concentração proteica do sobrenadante determinada. Um pg de proteina derivada da fracção solúvel da cultura pode ser separado por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida. Os géis 66 ΡΕ1309698 podem ser observados relativamente às bandas proteicas que migram de acordo com o peso molecular esperado. EXEMPLO 7

Expressão de EST eellc.pk002.i4 de Euphorbia lagascae em Saccharomyces cerevisiae A função da enzima citocromo P450 correspondendo a EST eellc.pk002.i4 foi avaliada pela expressão em Saccharomyces cerevisiae estirpe WHTl [Jung W, et al.r (2000) Nature Biotechnol. 18:208-212]. A linha celular WHT contem o gene da NADPH-citocromo P450 redutase derivada de Helianthus tuberosum para aumento da actividade de citocromo P450 recombinante como anteriormente descrito [Jung W, et ai. (2000) Nature Biotechnol. 18:208-212]. A sequência codificadora de EST eelllc.pk002.i4 foi amplificada por PCR usando o kit Advantage-GC cDNA polymerase (Clontech) e o par de sequências iniciadoras 5'-TCAAGGAGAAAAAACCCCGGA-TCCATGGAGCAGAAAAATCTCTCTTTTCCG-3' (cadeia codificadora; SEQ ID NO:4) e 5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCG-3' (complementar da cadeia codificadora; SEQ ID NO:5). Para além da homologia com a região codificadora de citocromo P450, estas sequências iniciadoras partilham homologia com o vector pRS315 [sokorski and Heiter (1989) Genetics 122:19-27] que foi modificado como anteriormente descrito [Jung et al. (2000) Nature Biotechnol. 18:208-212] através da inserção de promotores bidireccionais GAL1/GAL10. O produto de amplificação resultante foi hibridado com o vector digerido e usado para transformar Saccharomyces cerevisiae 67 ΡΕ1309698 estirpe WHTl em que o plasmídeo de expressão se forma através da reparação de um intervalo. [Hua et al., (1997) Plasmid 38:91-96]. A integração correcta da sequência codificadora de EST eellc.pk002.i4 no vector de expressão foi confirmado por sequenciação de DNA parcial do plasmideo resultante. As células de levedura transformadas foram seleccionadas relativamente à sua capacidade para crescer na ausência de leucina.

As colónias seleccionadas foram crescidas durante 3 dias a 28°C em meio sem leucina [0,17% (p/v) de base azotada de levedura sem aminoácidos (Difco), 0,5% (p/v) sulfato de amónio, 0,01% (p/v) de adenina e 0,07% (p/v) CSM-Leu (BiolOl)] suplementado com glicerol e glucose para uma concentração final de 5% (v/v) e 0,5% (p/v), respectivamente. As células foram então lavadas duas vezes no meio atrás descrito que continha 2% (p/v) de galactose em vez de glicerol e glucose como fonte de carbono. As células lavadas foram então diluidas para uma DCtoo « 0,4 em meio consistindo em 1% (p/v) de extracto de levedura, 2% (p/v) de peptona, 2% (p/v) de galactose, 0,04% (p/v) de adenina e 0,2% (p/v) de tergitol NP-40. O meio foi também suplementado com 0,45 mM de ácido linoleico (18: 2A9cis,12cis) ou ácido a-linolénico (18 :3A9cis'12cis'i5cis^ Estes ácidos gordos foram adicionados para servir como potenciais substratos in vivo para o citocromo P450 recombinante de E. lagascae. As culturas foram mantidas com agitação (250 rpm) a 28°C e crescidos até D06oo « 12. As células de 3 ml de cultura foram colhidas por centrifugação e depois secas sob vácuo. Os ésteres metílicos de ácidos gordos foram 68 ΡΕ1309698 subsequentemente preparados a partir de sedimentos de células secos por transesterificação directa em 1% (p/v) de metóxido de sódio/metanol usando métodos anteriormente descritos [Cahoon et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:2637-2643]. Os ésteres metilicos de ácidos gordos foram então analisados usando um cromatógrafo de gás Hewlett-Packard 6890 dotado de uma coluna Omegawax 320 (30 m x 0,32 mm de diâmetro interno, Supelco). A temperatura do forno foi programada de 220°C (2 min de intervalo) até 240°C a uma velocidade de 20°C/min. Os tempos de retenção dos ésteres metilicos de ácidos gordos epoxilados nas amostras foram comparado com os do éster metilico de ácido vernólico preparado a partir da semente de E. lagascae.

Para confirmar as identidades de quaisquer dos ácidos gordos A12-epoxilados produzidos pelas células de levedura recombinantes, ésteres metilicos de ácidos gordos preparados como descrito atrás foram analisados por espectrometria de massa após modificação dos ácidos, o que proporciona mais caracterização estrutural. A reacção com ácidos dos ésteres metilicos de ácidos gordos Δ12-epoxilados (e.g., ácido vernólico) resulta na abertura do anel epoxi e a geração de dois produtos: (1) um derivado A12-hidroxi/A13-metoxi e (2) um derivado A12-metoxi/A13-hidroxi. Os ésteres metilicos de ácidos gordos obtidos a partir de transesterificação de metóxido de sódio (como descrito atrás) de culturas de S. cerevisiae foram aquecidos a 70°C em 1 ml de 2,5% (v/v) de ácido sulfúrico em metanol durante 20 min. Após arrefecimento, foi 69 ΡΕ1309698 adicionado 1 ml de água e os ésteres metilicos de ácidos gordos foram extraídos com 2 ml de hexano. Os ésteres metilicos de ácido gordo foram então secos sob azoto e subsequentemente reagiram com 0,5 ml do reagente de sililação bis-(trimetilsilil)trifluoroacetamida:trimetil-clorossilano (99:1, v/v) (Supelco) a 50°C durante 30 min para gerar derivados de éter trimetilsililo (TMS) de grupos hidroxilo. Os ésteres metilicos de ácidos gordos modificados foram secos sob azoto, ressuspensos em hexano e depois analisados, usando um cromatógrafo de gas HP6890 ligado a um detector selectivo de massa HP5973 (Hewlett-Packard) operando a um potencial de ionização de impacto electrónico de 70 eV. Os derivados de éster metílico de ácidos gordos epoxilados foram parcialmente resolvidos usando uma coluna HP-INNOWax de 0,25 mm de diâmetro interno (Hewlett-Packard) com a temperatura da estufa programada de 185°C (5 min de intervalo) para 240°C (10 min de intervalo) a 7,5°C/min.

Usando meios suplementados com ácido linoleico, foi detectado um novo ácido gordo em células de S. cerevisiae WHT expressando o citocromo P450 de E. lagascae correspondendo a EST eellc.pk002.i4. O éster metílico deste ácido gordo está indicado como "Epoxy 1" na Fig. 1B. Este ácido gordo não foi detectado nas células contendo apenas o vector de expressão e crescidas em condições semelhantes [Figura IA]. "Epoxy 1" apresentou o mesmo tempo de retenção do éster metílico do ácido vernólico [Figura 1E]. Ainda, os derivados acídicos de metanol deste éster metílico do ácido 70 ΡΕ1309698 gordo apresentaram espectros de massa [Figura 2C-D] idênticos aos derivados de ácido vernólico preparados de forma semelhante [Figura 2A-B]. Baseado nestes dados, "Epoxy 1" na Fig. 1B foi identificado como o éster metilico do ácido vernólico. Este resultado demonstra assim que o citocromo P450 de E. lagascae correspondendo a EST eellc.pk002.i4 funciona como uma epoxigenase de ácido Δ12-linoleico na biossintese de ácido vernólico. A suplementação do meio de crescimento com ácido α-linolénico resultou na produção de um segundo novo ácido gordo pelas células que expressam o citocromo P450 de E. lagascae, correspondendo a EST eellc.pk002.i4. O éster metilico deste ácido gordo, que está marcado com "Epoxy2" na Figura 1D, apresentou um tempo de retenção mais longo do que o ácido metilvernólico [Figura 1E]. Ainda, os espectros de massa dos derivados trimetilsililo dos produtos acídicos de metanol correspondendo a "Epoxy2" foram consistentes com os derivados de éster metilico de ácidos gordos Ci8 contendo um grupo A12epoxi e duas duplas ligações [Figura 2E-F] . dado que o precursor deste produto é 18:3Δ9'12,15 (ácido a-linolénico). "Epoxy2" é assim tentativamente identificado como éster metilico do ácido á12-epoxioctadeca-9,15-dienóico (Δ12-θροχί-18: 2Δ9'15) . Este resultado demonstra que o citocromo P450 de E. lagascae correspondendo a EST eellc.pk002.i4 é igualmente capaz de catalisar a epoxidação Δ12 de ácido α-linolénico. ΡΕ1309698 71 EXEMPLO 8

Expressão do cDNA para EST eellc.pk002.i4 de Euphorbia lagascae em células de tabaco transgénicas A enzima citocromo P450 de Euphorbia lagascae correspondendo ao cDNA para EST eellc.pk002.i4 foi expressa em calos de tabaco (Nicotiana tabacum) sob o controlo do promotor 35S de vírus do mosaico da couve flor de forma a avaliar a sua função em células vegetais transgénicas. Para estes estudos, a grelha de leitura aberta do cDNA para EST eellc.pk002.i4 foi inicialmente amplificada por PCR para gerar locais EcoRI e BamHI flanqueantes destinado a clona-gem no vector de expressão vegetal. A sequência do oligonu-cleótido codificador usado na reacção de amplificação foi 5'-gcggccgcgaattcGGAAAATGGAGCAGAAAAATC-3', SEQ id NO:6; e a sequência do oligonucleótido complementar da sequência codificadora foi 5'-gcggccgcggatccTTAGAACATCGTTAATTAAAG-3', SEQ ID NO:7 (Nota: as bases em minúsculas contêm os locais de restrição adicionados e a sequência flanqueante para facilitar a digestão com enzimas de restrição). A projecção das sequências iniciadoras de PCR foi baseada na sequência do cDNA para EST eellc .pk002. i4 mostrado em SEQ ID NO: 1. Trinta ciclos de amplificação por PCR foram conduzidos num volume de 100 μΐ usando polimerase Pfu (Stratagene) e o molde consistiu no cDNA de EST eellc .pk002. i4 em pBluescript SK(-). O produto desta reacção foi subclonado em pCR-Script AMP (Stratagene). Após digestão com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI, o produto de PCR foi movido de pCR-Script AMP para os locais correspondentes do 72 ΡΕ1309698 vector pART7 [Gleave, A.P. (1992) Plant Mol. Biol. 20:1203-1207]. A construção resultante consistiu na grelha de leitura aberta do cDNA de EST eellc.pk002. i4, fundida no seu extremo 5' com o promotor 35S do virus do mosaico da couve flor e no seu extremo 3' com a porção de terminação da transcrição do gene da octopina sintetase. Estas três elementos da sequência (promotor/grelha de leitura aberta EST eellc.pk002.i4/sequência de terminação 3' de ocs) foram então transferidas como um fragmento Notl para o local correspondente do vector binário pART27, o qual possui uma marca de resistência à canamicina para selecção de células vegetais transformadas [Gleave, A.P. (1992) Plant Mol. Biol. 20:1203-1207]. O plasmideo resultante foi designado pEICytP450. Preparou-se um vector controlo através da inserção do promotor e de elementos de terminação derivados de pART7 no local Notl de pART27. 0 plasmideo resultante foi designado pART27/35S. Os plasmídeos pElCytP450 e pART27/35S foram então usados para transformar células de Agrobacterium tumefaciens LBA4404. As culturas derivadas destas células foram usadas para transformação de discos de folhas de tabaco (Nicotiana tabacum cv. Xanthi) de acordo com o protocolo descrito por Rogers, S.G., Horsch, R.B. and Fraley, R.T. (1986) Methods Enzymol. 118:627-648. Os calos transgénicos derivados destas transformações foram selec-cionados com base na resistência à canamicina conferida pelo vector binário. Ainda, a presença do transgene neste tecido foi confirmada por análise de transferências Northern. A composição em ácidos gordos dos calos de tabaco 73 ΡΕ1309698 resistentes à canamicina, obtidos a partir de transformações de discos de folhas, foi examinada por croma-tografia gasosa (GC). O tecido usado nestas análises foi calo que tinha sido transferido para meio de selecção fresco e crescido durante mais 3 a 4 semanas. Para se obter ésteres metilicos de ácidos gordos para análise por GC, aproximadamente 150 mg de calos de tabaco transgénicos foi homogeneizado em 1 ml de 1% (p/v) de metóxido de sódio em metanol usando métodos descritos por Hitz et al. (1994) Plant Physiol. 105:635-641. Os ésteres metilicos de ácidos gordos resultantes foram analisados usando um cromatógrafo de gás Hewlett-Packard 5890 associado a uma coluna Omegawax 320 (30 m x 0,32 mm de diâmetro interno; Supelco) . A temperatura da estufa foi programada de 180°C (4 min a esta temperatura) para 215°C a uma velocidade de 5°C/min e depois para 240°C a uma velocidade de 20°C/min (0,5 min a esta temperatura) . Para se obter caracterização estrutural adicional, os espectros de massa de ésteres metilicos de ácidos gordos modificados com ácido, derivados de calos de tabaco transgénicos, foram determinados usando cromato-grafia de gás-espectrometria de massa (GC-MS) como descrito no Exemplo 7. Usando estes métodos analíticos, dois ésteres metilicos de ácidos gordos foram detectados em calos de tabaco transformados com pEICytP450, os quais estavam ausentes dos calos com vector controlo (pRT/35S) [Figura 3] . Os picos correspondendo a estes ácidos gordos foram marcados "Epoxyl" e "Epoxy2" no cromatograma de gás mostrado na [Figura 3B]. 0 éster metílico de Epoxy 1 apresentou um tempo de retenção cromatográfico de gás 74 ΡΕ1309698 idêntico ao do ácido metil-vernólico (A12-epoxi-18:1A9cís) em extractos de sementes de Euphorbia lagascae (Fig. 3C) . Ainda, a modificação com ácido e sililação do éster metilico de Epoxyl deu dois compostos com espectros de massa idênticos aos obtidos a partir de modificação semelhante de ácido metil-vernólico (ver Exemplo 7). Epoxyl foi assim identificado como ácido vernólico. O éster metilico do ácido gordo correspondendo a Epoxy2 na Fig. 3B apresentou o mesmo tempo de retenção do éster metilico do ácido 12-epoxioctadeca-9,15-dienóico (A12-epoxi-18:2Δ9'15) descrito no Exemplo 7. Os espectros de massa dos compostos formados a partir da modificação com ácido metanólico e sililação do éster metilico Epoxy2 foram idênticos aos derivados preparados de forma semelhante de metil 12-epoxioctadeca-9,15-dienoato conforme detalhado no Exemplo 7. Epoxy2 foi assim identificado como ácido 12-epoxioctadeca-9,15-dienóico. Baseado nos estudos de adição de substrato com Saccharomyces cerevisiae descrito no Exemplo 7, o ácido vernólico e A12-epoxi-18: 2Δ9'15 nas células de tabaco transgénicas resultam da actividade epoxigenase Δ12 em ácidos linoleico (18:2Δ9'12) e a-linolénico (18 : 3Δ9'12'15), respectivamente .

Conforme resumido na Tabela 5, os calos de tabaco expressando citocromo P450 de Euphorbia lagascae correspondendo a EST eellc.pk002.i4 acumularam ácidos gordos Δ12 epoxilados (ácido vernólico e A12-epoxi-18: 2Δ9'15) em quantidades que excediam 15 p% do total dos ácidos de gordos das amostras transgénicas (TABELA 5). 75 ΡΕ1309698

Estes resultados demonstram assim que a enzima citocromo P450 de Euphorbia lagascae correspondendo a a EST eellc.pk002.i4 pode ser funcionalmente expressa em células vegetais transgénicas para produzir ácidos gordos Δ12 epoxilados. TABELA 5

Composições em ácidos gordos de calos do tabaco transformados com o vector pART27/35S sem o inserto de cDNA (pART27/35S) ou com cDNA de Euphorbia lagascae para EST eellc,pk002.i4 a seguir a um promotor 35S (pELCvt450)

Acido gordo pART27/35S (Vector controlo) (n=3)1 pEICyP450 (n=3) Peso % dos ácidos gordos totais 16:0 18,8 ± 1,6 15,9 ± 0,9 18:0 4,0 ± 0,7 4, 5 ± 0,7 18:1Δ9 2,7 ± 0,9 43,2 ± 2,7 18 : 2Δ9'12 46,4 ± 5,0 14,9 ± 1,7 18: 3Δ9'12'15 27,1 ± 5,4 4,6 ± 0,5 A12-epoxi-18: 1Δ9 N.D.2 13,3 ± 0,7 (ácido vernólico) Δ12-βροχχ-18:2Δ9'15 N.D. 2,2 ± 0,2 Outro3 < 1,0 < 1,5 1 Medições de três amostras independentes de calos transgénicos ± desvio padrão. 2 N.D., Não detectado • 3 Inclui 20:0, 20:1, 22:0 e 22:1. ΡΕ1309698 76 EXEMPLO 9

Produção de ácidos gordos A—-epoxilados em embriões de soja somáticos A enzima citocromo P450 de Euphorbia lagascae, correspondendo ao cDNA para EST eellc.pk002.i4, foi expressa em embriões de soja (Glyciene max) somáticos de forma a examinar a sua actividade numa espécie de cultura trans-génica. A grelha de leitura aberta do cdna para EST eellc.pk002.i4 foi inicialmente amplificada por PCR usando a mesma metodologia e as sequências iniciadoras oligonu-cleotidicas [SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7] descritas no Exemplo 8. O produto de PCR resultante foi subclonado no vector pCR-Script AMP (Stratagene) de acordo com o protocolo do fabricante. 0 produto de PCR foi então transferido como um fragmento Notl derivado do pCR-Script AMP para os locais correspondentes do vector pKS123 de soja, para gerar o plasmideo pKR31. O vector pKS123 é idêntico ao vector anteriormente descrito pKS67 [Publicação de Patente Mundial N° WO 00/11176], excepto serem adicionados dois locais da enzima de restrição Asei, flanqueando os elementos do promotor e de terminação da cassete de expressão vegetal. O plasmideo pKR31 contem a grelha de leitura aberta do cDNA para EST eellc.pk002. i4 fundida no seu extremo 5' com o promotor do gene da subunidade a' de β-conglicinina [Beachy, R.N. et al. (1985) EMBO J. 4:3047- 77 ΡΕ1309698 3053] e no seu extremo 3' com os elementos de terminação derivados do gene da faseolina [Doyle, J.J. et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:9228-9238] . O promotor do gene da subunidade a' de β-conglicinina usado no pKR31 dirige a expressão forte especifica de sementes de transgenes. A selecção bacteriana no vector pKR31 é conferida por um gene de higromicina B fosfotransferase [Gritz, 1. and Davies, J. (1983) Gene 25:179-188] sob o controlo do promotor da RNA polimerase de T7 e a selecção em plantas é conferida por um segundo gene de higromicina B fosfotransferase sob o controlo do promotor 35S do virus do mosaico da couve flor. O plasmideo pKRl foi usado para transformação de embriões somáticos de soja como descrito abaixo.

Para induzir embriões somáticos, cotilédones de 3-5 mm de comprimento dissecados de sementes imaturas com a superfície esterilizada do cultivar de soja A2872, podem ser cultivados na luz ou no escuro a 26°C num meio de agar adequado durante 6-10 semanas. Os embriões somáticos que produzem embriões secundários são então removidos e colocados num meio líquido adequado. Após selecção repetida dos aglomerados de embriões somáticos que se multiplicaram como embriões precoces na fase globular, as suspensões são mantidas como descrito abaixo.

Culturas embrionárias de soja em suspensão podem ser mantidas em 35 ml de meio líquido num agitador rotativo, 150 rpm, a 26°C com luzes fluorescentes num 78 ΡΕ1309698 horário de 16:8 horas de dia/noite. As culturas são subcultivadas de duas em duas semanas através da inoculação de aproximadamente 35 mg de tecido em 35 ml de meio líquido.

Culturas embrionárias de soja em suspensão podem então ser transformadas pelo método de bombardeamento com uma pistola de partículas (Klein et al. (1987) Nature (London) 327:10-13, Patente U.S. N° 4945050). Um instrumento DuPont Biolistic™ PDS1000/HE (retro-ajuste de hélio) foi usado para estas transformações. A 50 ml de uma suspensão de partículas de ouro de lmm a 60 mg/ml foram adicionados (por ordem) : 5 ml de dna (1 mg/ml), 20 ml de espermidina (0,1M) e 50 ml de CaCl2 (2,5 Μ) . A preparação de partículas foi então agitada durante três minutos, centrifugada numa microcentrífuga durante 10 segundos e o sobrenadante removido. As partículas revestidas com DNA foram então lavadas uma vez em 400 ml de 70% etanol e ressuspensas em 40 ml de etanol anidro. A suspensão de DNA/partículas foi sonicada três vezes durante um segundo cada. Cinco ml de partículas de ouro revestidas com DNA foram então aplicados em cada disco macroveículo.

Aproximadamente 300-400 mg de uma cultura em suspensão com duas semanas de idade foi colocada numa placa de petri vazia de 60x15 mm e o líquido residual removido do 79 ΡΕ1309698 tecido com uma pipeta. Para cada experiência de transformação, aproximadamente 5 a 10 placas de tecido foram bombardeadas. A pressão de ruptura da membrana foi estabelecida em 1100 psi e a câmara foi submetida a vácuo de 28 polegadas de mercúrio. O tecido foi colocado a aproximadamente 3,5 polegadas do écran de retenção e bombardeado três vezes. Após bombardeamento, o tecido pode ser dividido ao meio, colocado novamente em liquido e cultivado como descrito atrás.

Cinco a sete dias após bombardeamento, o meio liquido pode ser mudado para meio fresco e, onze a doze dias após bombardeamento, para meio fresco contendo 50 mg/ml de higromicina. Este meio selectivo pode ser substituído semanalmente. Sete a oito semanas após bombardeamento, o tecido verde transformado pode ser observado a crescer a partir de aglomerados embrionários necróticos não transformados. O tecido verde isolado foi removido e inoculado em frascos individuais para gerar novas culturas embrionárias transformadas em suspensão e propagadas clonalmente. Cada uma das novas linhas foi então tratada como um acontecimento de transformação independente. Estas suspensões foram então subcultivadas e mantidas como aglomerados de embriões imaturos. Os embriões imaturos nesta fase produzem produtos de reserva, incluindo lípidos de reserva, que são semelhantes em composição a embriões zigóticos numa fase semelhante do desenvolvimento (ver Publicação de Patente Mundial N° WO 94/11516). A expressão do transgene citocromo P450 de Euphorbia lagascae nas 80 ΡΕ1309698 linhas embrionárias seleccionadas em higromicina foi confirmada por amplificação de PCR usando sequências iniciadoras especificas e primeira cadeia de cDNA preparado a partir de TNA total isolado a partir dos embriões transgénicos.

Os embriões de soja somáticos transgénicos selec-cionados e mantidos desta forma foram analisados relativamente à acumulação de ácidos gordos A12-epoxilados usando cromatografia gasosa (GC) ou cromatografia gasosa-espectro-metria de massa (GC-MS). Os embriões individuais expressando a epoxigenase citrocrómio P450 de Euphorbia lagascae, correspondendo a EST eellc.pk002.i4, foram homogeneizados em 1% (p/v) de metóxido de sódio em metanol (como descrito no Exemplo 7) para gerar ésteres metilicos de ácidos gordos a partir de lípidos totais destes tecidos. Os ésteres metilicos de ácidos gordos resultantes deste passo de transesterificação foram analisados por GC e GC-MS usando métodos descritos no Exemplo 7. Em embriões somáticos expressando o cDNA de EST eellc.pk002.i4, foram detectados dois novos ésteres metilicos de ácido gordo que estavam ausentes dos embriões não transformados [Figura 4] . Os picos da cromatografia gasosa, correspondendo a estes ésteres metilicos de ácido gordo foram designados "Epoxyl" e "Epoxy2" na [Figura 4B] . Os ésteres metilicos de ácido gordo correspondendo a Epoxyl e Epoxy2 tinham tempos de retenção idênticos aos do ácido metilvernólico e A12-epoxi-18:2Δ9'15, respectivamente. Ainda, o espectro de massa 81 ΡΕ1309698 obtido após modificação com ácido sulfúrico metanólico (como descrito no Exemplo 7) destes ésteres metilicos de ácidos gordos foram idênticos aos derivados do ácido metilvernólico e A12-epoxi-18: 2Δ9'15 preparados de forma semelhante. Assim, os dois novos ácidos gordos produzidos pelos embriões somáticos de soja, expressando o cDNA para EST eellc.pk002.i4, foram identificados como ácido vernólico (A12-epoxi-18: 1Δ9) e Δ12-βροχί-18:2Δ9'15. Baseado nos estudos de adição de substratos descritos no Exemplo 7, estes ácidos gordos surgem da modificação da dupla ligação Δ12 dos ácidos linoleico e α-linolénico. Estes resultados ainda demonstram que a enzima citocromo P450 codificada pelo cDNA para EST eellc .pk002. i4 funciona in planta como uma epoxigenase Δ12 de ácidos gordos. Estes resultados também demonstram a capacidade de produzir ácidos gordos epoxilados numa espécie cultivada, como seja a soja, através da expressão do cDNA de EST eellc.pk002.i4. A Tabela 6 mostra uma comparação das composições de ácidos gordos de embriões de soja somáticos, não transformados, e embriões derivados da linha transgénica MSE578-6-9 transformada com o cDNA de citocromo P450 de Euphorbia lagascae correspondendo a EST eellc.pk002.i4. Conforme indicado, os ácidos gordos epoxilados acumulam-se em quantidades >7 p% dos ácidos gordos totais das linhas de embriões transgénicos, mas não são detectados nas linhas não transformadas. ΡΕ1309698 82 TABELA 6

Composições em ácidos gordos de embriões de soja somáticos não transformados e da linha embrionária de so~ja MSE578-6-9 transgénica, expressando o cDNA do citocromo P450 de Euphorbia lagascae correspondendo a EST eellc.pk002.i4. Ácido gordo Não transformado (n=3)9 Linha MSE578-6-9 (+CitP450 de E. lagascae) (n=3)

Peso % dos ácidos gordos totais 16:0 14, 2 ± 0 ,2 13,4 ± 0, 6 18:0 3,4 ± 0, 5 3,9 ± 1,0 18:1Δ9 8,7 ± 0, 7 10,5 ± 1,9 18: 2Δ9'12 53,7 ± 3 ,9 46,9 ± 1,9 18: 3Δ9'12'15 19,1 ± 3 ,2 17,1 ± 2,1 vernólico N. D. 2 5,4 ± 0,4 (Δ12 -epoxi-18:1Δ9) Δ12- epoxi-18 : 2Δ9'15 N .D • 1,8 ± 0,1 Outro3 < o, 9 < 1, 0 Valores para três medições separadas ± desvio padrão de embr isolados. 2 N.D., Não detectado. 3 Inclui 20:0, 20:1 e 22:0. ΡΕ1309698 83

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> E.I. du Pont de Nemours and Company < 12 0 > Uma enzima citocromo P450 associada com a sintes de ácidos gordos Δ12 epoxilados

<130> BB1465 PCT < 14 0 > <141> <150> 60/219833 <151> 21 de Julho, 2000 <160> 7 <170> Microsoft Office 97

<210> 1 <211> 1733 <212> DNA <213> Euphorbia lagascae <400> 1 çcat&aaagg aaa&tggagc agaaaaatcfc ctcctttccg agcattfctaa fcaagttfctct €0 gettgfctffca atetfcagtag tãgteatgag gfctgtgçaag âaacagaatc cscctccagg 120

gccatggaag tttccfcatca taggtaatct tcctcattta tfcactcactt cfcgaíctagg ISO ccátg&adgt tttagagect tggctcaaat ttafcggacxst çfctatçagtc ttcaaattgg 340 ccaaghfctca gctgtfcgtca fettcttcagc tgaagcagcg aaagaggtta tgasaasítca 300 ggctg&tgcc ttcgccoaae gccctateçt cttggacçoa cagattgtgt ttt&ta&tcg 350 çaaag&tgte ttgtttgctt cafcatggaga tc&*tegagg cagstga«g* a#«tttggai 420 acttg&attt ctgagtgçça aaaaagfcfcca aíacrtccagg ttaatccg&g aggaagsaafc 480 ggaggstgeo atcacattcc tccgttcgaa agecggatct ccggteaata fcfcacaaagat 540 cátttatggc attataattt ega£<5âtgat aag*«ç&tcç gttggtaatt gtaagcaaaa 600 agsasgáttg ctgagtgtfg ccgatgcagt caatgaggca çegacgsgfct fctggcaecgc 660 agacgctttt ccgacgtgga aattacttca otatatâatt ggagctgagt caaaacccag 720 gegtttgc&t c&ggsgàttg âcgatatact fcgaagsgatt cttaatgaac aoaaagccaa 760 taagcctttc gaagcggata actfcaafcgrga tgttctatfcg aatcttcaaa aaastggaaa 640 cgttccagtg ccagtgacaa acgaaagcat caaagcatcc gttttgoaaa tgtttactgc 300 cgçgagegaa acaactfcega aagçtacags atgggtaatg gcagagcfcça tgaaasatcc §60 aaefcgaaefca agaaaagsae aagaagaagf tagaeaagta tttggtgaaa tgggasaagt 1020 tgatgaatca agatfcfcc-atg atttg&aatfe cttcaagtta gtggftaaag aasctct&ag 1000 attacatcct ccggrfctgtct tgattccçag ggagigtaga gasacascac gaattgatgg 11,§0 atatga&att catccgaaca ctegasttgt tgtgaatgct tgggegatag gaagagatcc 1200 taatacttgg tcggaacctg gaa&gtfcfcaa cecxgaaagg tttaaagxtt gtgçaattga 1260· ttateaaggg acçacstttg asctggtacc atttggtgca ggaaaaagaa tatgtcetgg 1320 cattacltca çcfcstfcacca atttggagta tgtesttata aatctattat afceettttaa 1380 tfcgggaacfcg gccgatggaa ttscacctaa aacacttgat atgacfcgaag etattggegg 1440 tgowctcaçg aaasasatag atcttaagtt gattcctatfc ccatatcaãg ttagcttagg 1300 ctcaaatatt tcttgattae staggagggt tgaaat&tat ataatsaaefc ttaafetaaog 1560 atgttctaat aiggtttggg tgagfctataa taggtfctfccc accgatcata taagtagcct 1620 “cfttgatgg atgggtfcsga ttataatgag tfcgtgggttg gatttttaga tgggttaaat. 16S0 gatttggatg gataataata aattgaaatg tttfcetttfcfc caaatccgaa aaa 1733

<210> 2 <211> 500 <212> PRT <213> Euphorbia lagascae 84 ΡΕ1309698 < 4 0 0 > 2

Met Glu Gin Lys Asn Leu Ser Ph© Pro Ser Ile Leu Ile Ser Phe í 5 10 15 J:B:1 Vai Leu ile Leu Val Val vai Met Arg Leu Trp Lys Lys Gin Agr 20 25 30 Pro Pro Pro 33 Gly Pro Trp Lys Lhe 40 Pro· íie Ile Sly Aísn 45 Xj^ÍI Pro Kl a Leu ΙίίΗΐ Leu Thr Ser Asp Leu Gly His Glu Arg Phe Arg Ala Leu Ais SQ 55 ÊH Gin Ile Tyr Gly Pro Vai Met Ser Lsu Gin lie Gly Gin Val Ser Ala 65 70 75 eo Vcil Vai Ile Ser Ser Ala Glu Ala Alí; Lys Glu Val Met Lys Thr Gin 85 SO 95 Alà Asp Ala Ph© Ala Gin Arg Pro lie Val Leu Asp Ala Gin Ile Val 100 105 110 Tyr As;·. Arg Lys Asp Vai reu Pha Ala Ser Tyr Gly .Asp His «tp xrp 115 120 125 Arg Gin Met Lys UVS Ile Trp Ué Leu Glu Fhe Leu Ser Lys Lys 130 135 140 VS-I Gin Ser Ser Arg Leu lie Arg Glu Glu Xjf I vi Met Glu Asp Ala n® 14 5 150 1 C.c. 160 •TV; P ΑΦ Leu Arg Ser Lys Ala Gly Ser Pro Val Asn Ile Thr Lys 11® 163 170 175 Ile Tyr Gly Ile Ile lis Ser Ile Met Ile Arg Thr Ser Val Gly Asn ISO 185 * Í£'Õ cys Lys Gin Lys Glu Arg Leu Leu Ser Vãl Ala Aso Ala Val &SSS G.iu 2 35 200 205 AI· ti Ala Thr Ser Phsa Èly Thr Ala Asp Âi-3 Ph® Pro Thr Trp Lys Leii 219 215 220 Xj;8U Bis Tyr Ile Ile Èly AÍa Glu Ser Lys Pro Arg Arg Leu Glu 225 230 2.35 240 V:: X Xl lie Asp Asp IX© Lsu Glu Glu lie Leu Asn Glu His Lys Ais Asn 245 250 255 "ly$ Pro Phe Glu. Ala Asp Asn Leu Met Asp Val Leu Asn Leu Glfi 260 265 270 Lys As π G-y As n Val Pro Vai Pro Vai Thr Asrs Glu Ser Ile Lys Ala 275 280 285 S&z Vai Leu «•'v ‘1 IA. 115 .iFl Phe Thr Ala Gly Ser Glu Thr Thr Lys Ala 290 2&g 300 85 ΡΕ1309698

Glu Trp Val Met Ala Glu .Lys Pro Thr Glu Leu Arg 305 310 33.5 320 Lys Ala Gin Gly Glu Val Arg Glr. Val 330 í"»l '1 'íly W. »3 Met Gly Lys Val 323 335 Asp Glu Ser Arg Phs Ris Asp Leu Lys PiíS 5'ba Lys Lsu Val Val Lys 340 345 350 Glu Thr Leu Arg Leu His Pro Pro Val Val Leu lie Pro Arg Glu Cys 355 3«0 363 Arg Glu Thr Thr Arg Ile Asp Sly Tyr Glu nê His Pro Asn Thr Arg 370 375 330 Ile vai Vai As:: Ala Tm Ala Ile Glv Arg hH> Pro Asn Thr Trp Ser 3§ 5 390 395 400 vV;s vi Pro siy Lys Phe Asn Pro Glu Axx$ Lys Asp Cys Ala Ile Asp 405 410 415 Tyr Lvs Gly The Thr Phe Glu Leu Val Pro Bhs Gly Ala Gly 430 Lys Arg 420 425 , lie Cys Pro Gly Ile Thr Ser Ais Ile Thr AiS Y** L&u Glu Tvr Val Ile 440 445 Ile Asn Leu Leu Tyr His Asa Trp Giu Lsu Ais Asp Gly Ile Thr 4 50 455 4 69 Prí> Gin T h. r Leu Asp Met Thr Glu Ala Ile Gly Gly Ala Leu Arg Lys 455 470 475 4 8 0 Lys Ila Asp Leu Lyg Leu Ile Pro Ile Pm fyr Gin Val Ser Leú Gy 4SS 498 495

Ser Asn Xle Ser 500

<210> 3 <211> 502 <212> PRT <213> Capsicum annuum <400> 3

Sfet Glu Ile SA.xXl Phe Thr Asn hm Val Ala Phe Leu Leu Phe Leu Ser 1*. 5 10 15 Ser Ile Ile Leu 20 Leu Leu Lys Lys Trp 25 Lys Thr Gin Lys Leu 30 Asn Leu Pro Pro Gly 35 Pr-O Trp Lys* Leu Pro PM 40 II® Gly Ser Leu 45 His His ΙίΦΙΙ AaS vai Ala Gly Pro Leu Pro His His Gly Leu Lys Asn L«a Ala Lys 50 55 60 Leu Tyr Gly Pro Leu Met His Leu Arg Leu Gly G-lU Xle Pro Thr Val 65 70 75; 80 86 ΡΕ1309698 11e He Ser Ser Sso Arg Met Ala 85

Leu Ai a Phe Ala Thr Ary Pro Lys 100

Tyr Asp Ser Thr Asp Ile Ala Phe 1.15 120

Gin Xis Arg Lys He Cys Ile Leu 130 ' 135

Lys phe Phe Ser Ser lia Arg Gin 145 ISO

Ser He Arg Thr Met £xo Asn Phe 165

Phe Trp Phe Thr Ssr Ssr Vai Thr 130

Cys Arg Asp Gin Asp Lys Léu Xis 1S5 200

Leu Thr Gly Giy Phs Ser lie Ais 210 ' 315

Leu Mis Asp Vai Giy Giy Ser Lys

225 ' 23G

Lys Ile Asp Glu lie Leu Glu Eis 24S &rg Ala Asp Gly Gin Lys Gly &sn 260

Ile Asp Vai Ley. Leu Arg Vai Arg 275 280

Ile Thr Asp Asp Asn Ile Lys Ser 29D ' 295

Gly Ser Glu Thr Ser Ser Thr Thr 305 31B

Lys Giu Vai Leu Lys Thr His Ase S0 35

Leu Vai Vai Ala Asp II® Vai Hii .10 5 ' 110

Ser Pro Tyr Giy Giu Tyr Trp Arc 125

Giu Leu Lsu Ser Ma Lys Met Vai 140

Asp Giu Leu Ser Mat Mel; Vai Sei 155 1SC

Pro V&l Asn Leu Thr Asp Lys 11? 170 " 175

Cys Arg Sar Ala Leu Gly Lys Ile 185 ' 1:90

Ile Phs Met Arg Glu Ile lie Set 205

Asp Phe Phe Pro Thr Trp Lys Met 220

Thr Arg Leu Leu Lys Ala Eis Atg 235 240

Vhl Vai Asn Glu His Lys Gin Asn 250 255

Gly Giu Phe Gly Gly Giu Asp Leu 265 ' 270

Giu Ser Giy Glu Vai Gin lie Ser 265

Ile LôU Vai Asp Met P.hs Sar Ala. 300

Ile Ile Trp Ala Leu Ala Glu Mst 315 320

Met Lvs Lys Pro Ser Vai L®u Âlã 325

Vai Leu Lys Glu Lys Lys Gly Phe 340

Lys Tyr Leu Lys Leu Vai Ile Lys 355 ~ 360 lie Pro- Leu Leu Vai Pro Arg Giu 370 375

Giy Tyr Asn Ile Pro Phe Lys Thr 385 ' 390

Lyís Ala Gin Tila Giu Vai Arg Gin 330 335

Gin Gin lie Asp Leu Asp Glu Leu 345 350

Glu Thr Leu Arg Met Sis Pro Pro 355

Cys Met Lys Asp Thr Lys Ile Asp 380

Arg Vai Ile Vai Asn Ala Trp Ala 39:5 400 87 ΡΕ1309698 lie Giy Arg Asp Pro Giu 405 S-ei: Trp Asp 7 410 Pro oJLy. Ssr Phe Ser 4.15 Pro G1h Arg Phe G1 u Asa Ser Se.í Phe Leu Giy Ssr His J! 1 s; Gin 420 4 25 430 Fhs IX® Frc Gay Ala Sly Arg Arg Cys Pro Giy Ket Leu Phe 43-5 440 445 Giy Léu Ala Aar; Vai Gvly Gin Pro Leu Α,ί« Gin Leu. Leis Tyr Eis Phe 450 455 4SQ Arg Lys Pro Asa Giy Gin Ssr li is Asn Leu Asp Met Thr 4 65 4 70 475 4â0 Glu Ser Pro Giy lia Ser Ma Thr Arg Lys Asp Asp Leu Vai Leu XI®

Ala Thr Pro Tyr Asp Pr; SÓO <210> 4 < 211 > 51 <212> D NA < 213 > construção sintética <400> 4 tcaaggagaa aaaaccccgg atccatggag cagaaaaatc tctcttttcc g 51

<210> 5 <211> 35 < 212 > DNA <213> construção sintética <400> 5 ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gggcg 35

<210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> construção sintética <400> 6 gcggccgcga attcggaaaa tggagcagaa aaatc 35

<210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> construção sintética <400> 7 gcggccgcgg atccttagaa catcgttaat taaag 35

Lisboa 12 de Junho de 2007

Claims (18)

1. ΡΕ1309698 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um polinucleótido isolado compreendendo uma sequência nucleotidica seleccionada do grupo consistindo em: (a) uma primeira sequência nucleotidica codificadora de um polipeptideo que é uma enzima citocromo P450, associada com a síntese de ácidos deltal2-epoxilados, em que o referido polipeptideo possui pelo menos 50% de identidade, baseado no método Clustal de alinhamento, quando comparado com um polipeptideo de SEQ ID NO:2; e (b) uma segunda sequência nucleotidica compreendendo uma sequência complementar da primeira sequência nucleotidica.
2. 2. Um polinucleótido isolado como reivindicado na reivindicação 1, em que na parte (a), o polipeptideo possui pelo menos 55% de identidade, baseado no método Clustal de alinhamento, quando comparado com um polipeptideo de SEQ ID NO:2.
3. 3. Um polinucleótido isolado como reivindicado na reivindicação 1, em que na parte (a), o polipeptideo possui pelo menos 60% de identidade, baseado no método Clustal de alinhamento, quando comparado com um poli-peptídeo de SEQ ID NO:2. 2 ΡΕ1309698
4. 4. Um polinucleótido isolado como reivindicado na reivindicação 1, em que na parte (a), o polipeptídeo possui pelo menos 65% de identidade, baseado no método Clustal de alinhamento, quando comparado com um poli peptídeo de SEQ ID NO:2.
5. 5. Um polinucleótido isolado como reivindicado na reivindicação 1, em que na parte (a), o polipeptídeo possui pelo menos 70% de identidade, baseado no método Clustal de alinhamento, quando comparado com um poli peptídeo de SEQ ID NO:2.
6. 6. Um polinucleótido isolado como reivindicado na reivindicação 1, em que na parte (a), o polipeptídeo possui pelo menos 75% de identidade, baseado no método Clustal de alinhamento, quando comparado com um poli peptídeo de SEQ ID NO:2.
7. 7. Um polinucleótido isolado como reivindicado na reivindicação 1, em que na parte (a), o polipeptídeo possui pelo menos 80% de identidade, baseado no método Clustal de alinhamento quando comparado com um polipeptídeo de SEQ ID NO:2.
8. 8. Um polinucleótido isolado como reivindicado na reivindicação 1, em que na parte (a), o polipeptídeo possui pelo menos 85% de identidade baseado no método Clustal de alinhamento, quando comparado com um polipeptídeo de SEQ ID NO:2. 3 ΡΕ1309698
9. 9. Um polinucleótido isolado como reivindicado na reivindicação 1, em que na parte (a), o polipeptideo possui pelo menos 90% de identidade, baseado no método Clustal de alinhamento, quando comparado com um polipeptideo de SEQ ID NO:2.
10. 10. Um polinucleótido isolado como reivindicado na reivindicação 1, em que na parte (a), o polipeptideo possui pelo menos 95% de identidade, baseado no método Clustal de alinhamento, quando comparado com um polipeptideo de SEQ ID NO:2.
11. 11. Uma construção quimérica compreendendo o polinucleótido isolado de qualquer uma das reivindicações 1 a 10 operacionalmente ligado a pelo menos uma sequência reguladora adequada.
12. 12. Uma célula hospedeira isolada compreendendo a construção quimérica da reivindicação 11.
13. 13. Uma célula hospedeira isolada compreendendo um polinucleótido isolado de qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
14. 14. A célula hospedeira da Reivindicação 13 em que a célula hospedeira é seleccionada do grupo consistindo em levedura, bactéria e planta. 4 ΡΕ1309698
15. 15. Um método de selecção de um polinucleótido isolado que afecta o nível de ácidos gordos deltal2-epoxilados numa célula hospedeira, o método compreendendo os passos de: (a) preparação de um polinucleótido isolado compreendendo a sequência polinucleotídica de qualquer uma das reivindicações 1 a 10; (b) introdução do polinucleótido isolado numa célula hospedeira; (c) determinação da presença ou ausência de ácidos gordos deltal2 epoxilados na célula hospedeira de (b).
16. 16. O método da Reivindicação 15, em que o polinucleótido isolado consiste numa sequência polinucleotídica de SEQ ID NO:1
17. 17. Um método de obtenção de um fragmento de ácido nucleico codificador de uma enzima citocromo P450 associada com a síntese de ácidos delta-12 epoxilados compreendendo os passos de: (a) hibridação de uma biblioteca de cDNA ou genómica com um polinucleótido isolado compreendendo a sequência nucleotídica de SEQ ID NO:l e uma sequência complementar de tais sequências nucleotídicas; 5 ΡΕ1309698 (b) identificação de um clone de DNA que híbrida com o polinucleotídeo de (a) ou com o seu complemento; (c) isolamento do clone de DNA identificado; e (d) sequenciação de um fragmento de cDNA ou genómico inserido no clone de DNA isolado
18. 18. Um método para a produção de ácidos gordos delta-12 epoxilados numa célula hospedeira que compreende: (a) transformação de uma célula hospedeira com a construção dimérica da reivindicação 11; (b) crescimento das células hospedeiras transformadas do passo (a); e (c) determinação da presença ou ausência de ácidos gordos delta-12 epoxilados nas células transformadas de (b) . Lisboa, 12 de Junho de 2007