KR100365969B1 - 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 발현의 조절 - Google Patents

퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 발현의 조절 Download PDF

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Abstract

본 발명은 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제(QPRTase) 효소를 코딩하는 DNA와, 그러한 DNA를 포함하는 구축체를 제공한다. 또한 본 발명은 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 발현을 변화시키는 방법을 제공한다.

Description

퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 발현의 조절{Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression}
감소된 니코틴 함량을 가지는 담배의 생산은 니코틴의 중독성과 관련하여 흥미있고 당면한 관심사이다. 또한 니코틴 생산이 극도로 조절되거나 니코틴을 생산하지 않는 담배 식물체는 약학, 미용 구성요소 혹은 식품 첨가물과 같은 상업적으로 중요한 산물을 발현하는 형질전환체의 수혜자(recipient)로서 매력적이다. 담배로부터 니코틴을 제거하는 다양한 방법이 고안되어 왔다. 그러나, 이러한 과정의 대부분은 담배로부터 니코틴뿐만 아니라 다른 성분들을 함께 제거하고, 그럼으로써 역으로 담배에 영향을 주었다. 고전적 작물 재배법은 야생형 담배 식물체보다 낮은수준의(약 8%) 니코틴을 함유하는 담배식물체를 생산하여 왔다. 더욱 티코틴 함량이 감소된 담배와 담배 식물체가 요망된다.
생물학적 산물의 양을 줄이는 한가지 방법은 그 산물에 이르는 생합성 경로에서 요구되는 효소의 양을 줄이는 것이다. 영향을 주는 효소가 자연적으로 속도-제한 양(경로에서 요구되는 다른 효소에 상대적으로)으로 나타나는 곳에서, 그 효소의 양을 줄이는 것은 최종 산물의 생산을 감소시킬 것이다. 만약 효소의 양이 정상적으로 속도-제한적이지 않다면, 경로의 산출량을 줄이기 위하여 세포에서 그의 존재는 속도-제한적으로 감소되어야 한다. 반대로, 만약 자연적으로 나타나는 효소의 양이 속도 제한적이라면, 효소의 활성의 어떠한 증가는 생합성 경로의 최종 산물의 증가를 가져올 것이다.
니코틴은 담배식물체의 뿌리에서 처음 형성되고 이어서 잎으로 전달되어 저장된다(Tso,Physiology and Biochemistry of Tobacco Plants, pp.233-34, Dowden, Hutchinson & Ross, Stroudsburg, Pa. (1972)). 니코틴 생합성에서 필수적인 단계는 퀴놀린산으로부터 니코틴산이 형성되는 것이고, 이는 효소 QPRTase에 의하여 촉매되는 단계이다. QPRTase는 담배에서 니코틴 합성을 위한 니코틴산을 제공하는 경로에서 속도-제한 효소인 것으로 보인다(Feth et al., 'Regulation in Tobacco Callus of Enzyme Activity of Nicotine Pathway',Planta168, pp402-07 (1986); Wagner et al., 'The Regulation of Enzyme Activity of Nicotine Pathway in Tobacco',Physiol. Plant. 68, pp667-72(1986)). 나가타니 및 말리크의 미국특허 제 5,260,023호 및 제 5,260,205호에서 푸트레슨스 메틸 트랜스퍼라제(putrescencemethyl transferase, PMTase) 발현의 안티센스 조절에 의하여 담배 식물체에서 니코틴 함량이 변화된 것이 보고되었다. 와하드와 말리크의 PCT 출원 WO 94/28142는 PMT를 코딩하는 DNA와 센스 및 안티센스 PMT 구축체(constructs)의 용도가 개시되어 있다.
본 발명은 국가과학재단 허여 제 MCB-9206506호에 의한 정부지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대하여 권리를 갖는다.
본 발명은 식물 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제(Quinolate Phosphoribosyl Transferase, QPRTase)와 이 효소를 코딩하는 DNA에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 유전적으로 변화된 니코틴 함량을 가지는 형질변환 식물체를 생산하는 데 이용하는 QPRTase를 코딩하는 DNA의 용도와 그렇게 생산된 식물체에 관한 것이다.
도 1은 니코틴에 이르는 생합성 경로를 나타내는 것이다.Nic1과Nic2에 의하여 조절되는 것으로 알려진 효소 활성은 QPRTase 및 PMTase이다.
도 2a는NtQPT1cDNA의 핵산 서열(서열번호 1)을 제공하는 것으로, 코딩 서열(서열번호 3)은 대문자로 표시하였다.
도 2b는NtQPT1cDNA가 코딩하는 담배 QPRTase의 추론된 아미노산 서열(서열번호 2)를 제공한다.
도 3은 추론된NtQPT1아미노산 서열과 로도스피릴럼 루브럼, 마이코박테리움 레프레, 살모넬라 티피무리움, 에스케리챠 콜라이, 인간 및 사카로마이세스 세레비지에의 연관 서열을 배열한 것이다.
도 4는 QPRTase가 결여된 대장균 돌연변이체(TH265)를NtQPT1cDNA로 보충한 결과를 나타낸다. 세포는NtQPT1를 운반하는 발현 벡터로 형질전환되었다;NtQPT1발현하는 형질전환된 TH265 세포가 니코틴이 결여된 최소 배지에서 성장하는 것은NtQPT1가 QPRTase를 코딩하는 것을 입증한다.
도 5는Nic1및Nic2담배 돌연변이체에서 니코틴양과 정상-상태의 상대적NtQPT1mRNA 양을 비교한다. 야생형 벌리(Burley) 21(Nic1/Nic1 Nic2/Nic2);Nic1 - 벌리(nic1/nic1 Nic2/Nic2); Nic2 - 벌리(Nic1/Nic1 nic2/nic2); Nic1 - Nic2 - 벌리(nic1/nic1 nic2/nic2). 검은 막대는 mRNA 전사체의 양을 나타내고; 사선 막대는 니코틴 양을 나타낸다.
도 6은 탑핑(topping)하지 않은 대조 식물체에 비한 탑핑한 담배 식물체의 시간에 따른NtQPT1mRNA의 양을 도시한다. 검은 막대는 mRNA 전사체의 양을 나타내고; 사선 막대는 니코틴 양을 나타낸다.
본 발명의 첫 번째 면은 서열번호 1을 포함하는 정제된 DNA 분자; 서열번호 2를 가지는 효소를 코딩하는 DNA 서열; 상기 DNA와 혼성화하고 QPRTase 효소를 코딩하는 DNA서열; 및 유전적 코드의 퇴화 때문에 상기 DNA와는 상이한 DNA 서열에 관한 것이다. 그러한 DNA에 의하여 코딩되는 펩티드는 본 발명의 다른 면이다.
본 발명의 또 다른 면은 식물 세포에서 기능적인 프로모터와 프로모터의 하류에 위치하고 그것과 작동적으로 연관된 QPRTase 효소를 코딩하는 DNA 절편을 포함하는 DNA 구축체에 관한 것이다. 효소를 코딩하는 DNA는 안티센스 또는 센스 배향일 수 있다.
본 발명의 또 다른 면은 QPRTase를 발현하는 것으로 알려진 식물 세포를 제공하고; 프로모터와 QPRTase mRNA를 코딩하는 서열부위를 포함하는 DNA를 가지는 외인성 DNA 구축체로 식물세포를 형질전환시키는 것에 의하여 감소된 QPRTase 발현을 가지는 형질변환 식물 세포를 만드는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 면은 비-형질전환 대조 식물체에 상대적으로 감소된 QPRTase 발현을 가지는 니코티아나 종의 형질변환 식물체에 관한 것이다. 그러한 식물체의 세포는 식물 QPRTase mRNA를 코딩하는 DNA 서열의 절편을 포함하는 DNA 구축체를 포함한다.
본 발명의 또 다른 면은 외인성 DNA를 가지도록 형질전환된 식물 세포를 성장시키는 것에 의하여 식물 세포에서 QPRTase 유전자의 발현을 감소시키는 방법에 관한 것이며, 이때 외인성 DNA의 전사된 가닥은 세포에 내인성인 QPRTase mRNA에 상보적이다. 상보 가닥의 전사는 내인성 QPRTase 유전자의 발현을 감소시킨다.
본 발명의 또 다른 면은 외인성 DNA 서열을 포함하는 세포로된 담배 식물체를 재배함으로써 담배 식물체 잎의 니코틴 함량이 감소된 담배 식물체를 생산하는 방법에 관한 것이며, 이때 외인성 DNA 서열의 전사된 가닥은 세포에서 내인성 QPRTase mRNA에 상보적이다.
본 발명의 또 다른 면은 QPRTase를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 외인성 DNA 구축체로 QPRTase를 발현하는 것으로 알려진 식물 세포를 형질전환시킴으로써, 증가된 QPRTase 발현을 가지는 형질변환 식물 세포를 만드는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 면은 증가된 QPRTase 발현을 가지는 형질변환된 니코티아나 식물체에 관한 것으로서, 이때 형질변환 식물체의 세포는 식물 QPRTase 를 코딩하는 외인성 DNA를 포함한다.
본 발명의 또 다른 면은 QPRTase 를 코딩하는 외인성 DNA를 포함하도록 형질전환된 식물 세포를 성장시킴으로써 식물 세포에서 QPRTase 유전자의 발현을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 면은 세포에서 기능적인 QPRTase를 코딩하는 외인성 DNA 서열을 포함하는 세포를 가지는 담배 식물체를 재배함으로써, 잎에서 증가된 니코틴함량을 가지는 담배 식물체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
니코틴은 니코틴산과 4-메틸아미노부타날의 축합반응(condensation)에 의하여 담배 식물체에서 생산된다. 니코틴을 생산하는 생합성 경로가 도 1에 도시되어 있다. 두개의 조절 유전자위(Nic1및Nic2)가 니코틴 생산의 공-우성 조절자로 작용한다. 단일 및 이중Nic돌연변이체의 뿌리의 효소 분석에서 QPRTase와 PMTase의 두 효소의 활성이 니코틴 생합성의 수준에 직접적으로 비례한다는 사실을 보여주었다. 니코틴을 합성하는 능력이 상이한 담배 조직(뿌리 및 칼루스)에서의 효소 활성의 비교는 QPRTase 활성이 니코틴 양와 엄격하게 관련된다는 것을 나타낸다(Wagner and Wagner,Planta165:532 (1985)). 샨더스와 부쉬(Saunders and Bush)가 저-니코틴 돌연변이체의 뿌리에서 QPRTase의 수준이 잎에서의 니코틴의 함량에 비례한다는 것을 보였다(Plant Physiol.64:236 (1979)).
본 발명은 서열번호 2의 식물 QPRTase를 코딩하는 새로운 cDNA 서열(서열번호 1)을 제공한다. QPRTase의 활성이 니코틴 양과 엄격하게 연관되어 있기 때문에 식물체 뿌리에서 QPRTase의 양이 감소된(야생형 식물체에서의 수준에 비교하여) 형질변환 담배 식물체의 구축은 잎에서 니코틴의 수준이 감소한 식물체를 만든다. 본 발명은 그러한 형질변환 식물체 뿐만 아니라 형질변환 식물체를 생산하기 위한 핵산 구축체 및 방법을 제공한다. 상기한 방법은 담배 뿌리에서 QPRTase의 양을 낮추는 안티센스NtQPT1RNA를 발현시키는 단계를 포함한다. 또한 니코틴은 비-담배 종 및 과의 식물에서 발견되었으나, 존재하는 양이 일반적으로 N. 타바쿰보다 훨씬 적다.
또한 본 발명은 QPRTase 또는 QPRTase 안티센스 RNA 분자를 코딩하는 센스 및 안티센스 재조합 DNA 분자, 그러한 재조합 DNA 분자를 포함하는 벡터, 그러한 DNA 분자 및 벡터로 형질전환된 식물 세포 및 식물체를 제공한다. 본 발명의 형질변환 담배 세포 및 식물체는 형질전환되지 않은 대조 담배 세포 및 식물체에 비하여 감소된 혹은 증가된 니코틴 함량을 가지는 것을 특징으로 한다.
니코틴 생산이 극도로 억제되거나 전혀 생산되지 않는 담배 식물체는 약품, 미용 조성물 또는 식품 첨가물과 같은 상업적으로 유용한 산물을 발현하는 트랜스진(transgene)을 받아들이는 데 매력적인 수혜자이다. 담배는 쉽게 유전적으로 조작되고 단위 면적당 매우 큰 총량으로 생장하며; 니코틴 생산에 쓰이는 자원이 감소된 담배는 트랜스진 산물의 생산에 이용될 수 있는 더 많은 자원을 가지게 될 것이므로 담배는 원하는 산물을 코팅하는 트랜스진의 수혜 식물체로서 매력적이다. 원하는 산물을 생산하는 트랜스진으로 담배를 형질전환시키는 방법은 공지기술이며; 여하한 적합한 기술도 본 발명의 저-니코틴 담배 식물체에 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 QPRTase 발현이 감소되고 니코틴 함량이 감소된 담배 식물체는 감소된 니코틴 함량을 가지는 담배 산물을 생산하는 데 유용할 것이다. 본 발명에 따른 담배 식물체는 파이프, 시가, 담배 및 씹는 담배를 포함하고 이에 한정되지 않으며, 잎 담배, 조각 담배 혹은 잘린 담배를 포함하는 여하한 형태를 가진 어떠한전통적인 담배 산물에 사용되는 데 적합할 수 있다.
또한 본 발명의 구축체는 식물체에서 증가된 QPRTase 발현과 증가된 니코틴 함량을 가지는 형질전환 식물체를 제공하는 데 이용될 수 있다. 그러한 구축제, 이러한 구축체를 이용하는 방법 및 그렇게 생산된 식물체는 변화된 니코틴 함량을 가지는 담배 산물의 생산 또는 그의 살충효과가 향상된 니코틴 함량을 가진 식물체의 생산에 유용하다.
본 발명자들은TobRD2유전자가 니코티아나 타바쿰 QPRTase를 코딩함을 발견하였으며(Conkling et al.,Plant Phys.93, 1203(1990)), 본 명세서에서는NtQPT1(상기TobRD2로 칭함)의 cDNA 서열과 코딩된 효소의 아미노산 서열을 제공한다.NtQPT1아미노산 서열을 진뱅크 데이타베이스와 비교한 결과 QPRTase를 코딩하는 박테리아 단백질에 제한된 서열 유사도를 나타내었다(도 3).
QPRTase는 진핵세포와 원핵세포에서 니코틴 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD) 의 새로운(de novo) 생합성에 필요하다. 담배에서, QPRTase의 고수준은 뿌리에서 검출되고 잎에서는 그러하지 아니하다.NtQPT1이 QPRTase를 코딩하는 것을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 QPRTase가 결여된 돌연변이체(nadC - )인 대장균 박테리아 균주(TH265)를 이용하였다. 이 돌연변이체는 니코틴산이 결여된 최소배지에서는 자라지 못한다. 그러나, 이 박테리아 균주에서의 NtQPT1 단백질의 발현은NadC + 표현형을 부여하고(도 4 참조),NtQPT1가 QPRTase를 코딩함을 확인하였다.
본 발명자들은 담배에서Nic1및Nic2돌연변이체의 효과와NtQPT1정상-상태mRNA 수준 및 니코틴 함량에 관한 탑핑된 담배 식물체의 효과를 조사하였다(개화시기에 탑핑에 의하여 극 우성을 제거하는 것이 담배에서 니코틴의 생합성과 전달을 향상시키는 것으로 잘 알려져 있으며 담배 생산의 표준 관행이다). 만약NtQPT1이 사실상 담배 생합성에 참여한다면, (1)Nic1/Nic2이중 돌연변이체에서NtQPT1mRNA 수준이 낮아지고, (2)탑핑후에는NtQPT1mRNA 수준이 증가할 것으로 기대된다.Nic1/Nic2이중 돌연변이체에서NtQPT1mRNA 수준이 야생형의 약 25%로 나타났다(도 2 참조). 더욱이, 탑핑 6시간 후에, 담배 식물체에서NtPQT1mRNA의 수준은 약 8배 증가하였다. 그러므로NtPQT1이 니코틴 생합성 경로에서 결정적인 조절 유전자임이 확인되었다.
형질전환 식물 세포 및 식물체
식물세포 게놈에서 유전자 발현의 조절은 숙주세포에서 기능적인 프로모터의 전자 조절하로 이종 DNA가 통합되고, 이종 DNA의 전사된 가닥이 조절될 내인성 유전자로부터 전사되는 DNA 가닥과 상보적일 때 성취될 수 있다. 안티센스 DNA로 일컬어지는 도입된 DNA는 자연적으로 생산된 (내인성) mRNA 에 상보적이고 내인성 mRNA의 발현을 저해하는 RNA 서열을 제공한다. 그러한 안티센스에 의한 유전자 발현의 조절은 완전히 이해되지는 않는다. 어떠한 단일의 이론에 의하여 해결되는 것을 바라지는 않지만, 안티센스 조절의 하나의 이론은 안티센스 DNA의 전사가 내인성 mRNA 분자에 결합하여 이의 전사를 방해하거나 저해하는 RNA 분자를 생산한다는 것이다.
본 발명의 방법에서, 안티센스 산물은 자연적으로 발생하는 표적 RNA 의 코딩부위 혹은 비코딩부위(혹은 둘다)에 상보적일 수 있다. 안티센스 구축체는 어떠한적합한 방식에 의하여도 식물 세포내로 도입될 수 있고, 유도적 혹은 항상적 안티센스 서열의 전사를 위하여 식물 게놈내로 통합될 수 있다(슈마커 등의 미국 특허 제 5,453,566호 및 제 5,107,065호를 참조하고 이들은 그 전체로서 본 명세서에 통합된다).
본 명세서에서 사용되는 것처럼, 외인성 혹은 이종 DNA(혹은 RNA)는 인간의 노력을 통하여 세포(혹은 세포의 선구체)내로 도입되는 DNA(혹은 RNA)를 말한다. 그러한 이종 DNA는 형질전환되는 세포에서 자연적으로 나타나는 서열의 복사물 혹은 그의 절편일 수 있다.
형질전환되지 않은 대조 담배 식물체에 비하여 감소된 PQRTase 수준, 따라서 낮은 니코틴 함량을 가지는 담배 식물체를 생산하기 위하여, 일부 QPRT cDNA 서열, 완전한 길이의 QPRT DNA 서열 또는 완전한 길이의 QPRT 크로모좀 서열을 안티센스 배향으로 적당한 조절 서열과 작동적으로 연결된 상태로 포함하는 외인성 QPRT 안티센스 전사 단위체로 담배 세포를 형질전환시킬 수 있다. 적당한 조절 서열은 형질전환된 식물체에서 기능적인 전사 개시 서열('프로모터') 및 폴리아데닐레이트/전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 제한 지도, 서던 블랏 하이브리디제이션 및 뉴클레오타이드 서열 분석과 같은 표준 기술이 안티센스로 배향되고 조절 서열과 기능적으로 연결된 QPRTase 서열을 포함하는 클론을 동정하는데 이용된다. 그리고나서 담배 식물체는 성공적으로 형질전환된 세포로부터 재생된다. 이용된 안티센스 서열은 내인성 서열에 상보적인 것이 가장 바람직하지만, 외인성 및 내인성 서열에 약간의 변형이 있는 것도 인용될 수 있다. 안티센스 DNA 서열이 하기에 기술될 스트린젠트 조건하에서도 조절되는 세포의 내인성 서열에 결합가능한 정도로 충분한 서열 유사도를 가지는 것이 바람직하다.
안티센스 기술은 특정 효소의 정상양보다 적은 것을 특징으로 하는 형질변환 식물체를 생성하기 위하여 몇몇의 실험실에서 이용되어 왔다. 예를 들어, 챨콘 신테이즈(chalcone synthase), 꽃 색소 생합성 경로의 효소를 낮은 수준으로 가진 식물체가 담배 및 페튜니아 게놈내로 챨콘 신테이즈 안티센스 유전자를 삽입함으로써 생산되었다. 이러한 형질변환 담배 및 페튜니아 식물체는 정상색조보다 옅은 꽃을 피운다(Van der Krol et al., 'An Anti-Sense Chalcone Synthase Gene in Transgenic Plants Inhibits Flower Pigmentation',Nature, 333, pp.866-69 (1988)). 또한 안티센스 RNA 기술은 토마토에서 효소 폴리갈락투로나제의 생산(Smith et al., 'Antisense RNA Inhibition of Polygalacturonase Gene Expression in Transgenic Tomatoes',Nature, 334, pp. 724-26 (1998); Sheehy et al., 'Reduction of Polygalacturonase Activity in Tomato Fruit by Antisense RNA',Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp.8805-09 (1998)) 및 담배에서 효소 리불로스 비스포스페이트 카르복실라제의 작은 서브유니트의 생산(Rodermel et al, 'Nuclear-Organelle Interactions: Nuclear Antisense Gene Inhibits Ribulose Bisphosphate Carboxylase Enzyme Levels In Transformed Tobacco Plants',Cell, 55, pp.673-81 (1998))을 저해하는데 성공적으로 이용되어 왔다. 대체하여 특정 효소의 정상양보다 많은 것을 특징으로 하는 형질변환 식물체는 센스(즉 정상으로)로 배향된 그 효소의 유전자로 식물체를 형질전환시킴으로써 만들 수 있다. 본 발명의 형질변환 담배 식물체의 니코틴 함량은 표준 니코틴 분석법에 의하여 검출될 수 있다. 형질전환되지 않은 대조 식물체에 비하여 QPRTase의 수준이 감소된 형질전환 식물체는 따라서 대조군보다 감소된 니코틴 함량을 가질것이고; 형질전환되지 않은 대조 식물체에 비하여 증가된 QPRTase 수준의 형질전환 식물체는 따라서 대조군에 비하여 증가된 니코틴 함량을 가질 것이다.
본 발명의 안티센스 방법에 이용된 이종 서열은 완전한 QPRTase mRNA 서열에 혹은 그의 일부에 상보적인 RNA 산물을 생성하도록 선택될 수 있다. 그 서열은 자연적인 전령 RNA의 어떠한 인접한 서열, 즉 5'-말단 혹은 캡핑 사이트, 캡핑 사이트의 하류, 캡핑 사이트와 개시코돈의 사이에 인접하는 내인성 mRNA 서열에 상보적일 수 있고, 비코딩 부위의 전부 혹은 일부를 포함할 수 있으며, 비코딩 부위와 코딩부위를 연결할 수 있으며, 코딩 부위의 전부 혹은 일부에 상보적이거나, 코딩 부위의 3'-말단에 상보적이거나 mRNA의 3'-비해독부위에 상보적일 수 있다. 적당한 안티센스 서열은 적어도 약 13에서 15개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 16에서 21개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 20개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 30개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 50개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 75개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 100개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 125개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 150개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 200개의 뉴클레오타이드 혹은 그 이상일 수 있다. 또한, 서열은 그의 3' 혹은 5' 말단에서 연장되거나 짧아질 수 있다.
특정 안티센스 서열과 안티센스 서열의 길이는 원하는 저해정도, 안티센스 서열의 안정성 등에 의존하여 달라질 것이다. 당업자는 당 기술분야에서 이용될 수 있는 기술과 여기에서 제공되는 정보를 이용하여 적당한 QPRTase 안티센스 서열을 선택할 수 있다. 본 명세서의 도 2a와 서열번호 1을 참조하여, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 배향된 QPRTase cDNA 서열의 연속하는 절편일 수 있으며, 수혜 식물 세포로 형질전환될 때 원하는 효과를 성취하기에 충분한 어떠한 길이일 수 있다.
또한 본 발명은 니코틴 생산의 센스 코-서프레션 방법에 이용될 수 있다. 본 발명을 수행하는데 이용되는 센스 DNA는 식물세포에서 발현되었을 때 본 명세서에서 기술된 그러한 식물 세포에서 식물 QPRTase 단백질의 원래의 발현을 서프레스 하기에 충분한 길이이다. 그러한 센스 DNA는 필수적으로 QPRTase 효소 혹은 적어도 15개의 뉴클레오타이드를 포함하는 그의 절편을 코딩하는 완전한 게놈 DNA 또는 cDNA일 수 있다. 불확정한 길이의 센스 DNA로 세포에서 원래의 유전자 발현을 서프레스하는 방법은 당업자에 의하여 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 니코티아나 식물 세포는 효소 RNA 분자(즉 '리보자임')을 코딩하는 DNA 분체를 포함하는 DNA 구축체로 형질전환되고, 효소적 RNA 분자는 본 명세서에 기술된 바와 같이 식물 QPRTase를 코딩하는 DNA의 mRNA 전사체에 대하여 작용(즉, 절단)한다. 리보자임은 표적 mRNA의 접근가능한 부위에 결합하는 기질 결합 도메인과, RNA 절단, 전사 방해 및 단백질 생성을 촉매하는 도메인을 포함한다. 결합 도메인은 표적 mRNA 서열에 상보적인 안티센스 서열을 포함할 수 있으며; 촉매 모티프는 해머헤드 모티프 또는 헤어핀 모티프와 같은 다른 모티프일 수 있다. RNA 표적내의 리보자임 절단 사이트는 처음에 리보자임 절단 사이트(즉,GUA, GUU 또는 GUC서열)를 위한 표적 분자를 스캐닝함으로써 동정될 수 있다. 일단 동정되면, 절단 사이트를 포함하는 표적 유전자 부위에 상응하는 15, 20, 30 혹은 그 이상의 리보뉴클레오타이드의 짧은 RNA 서열의 예견된 구조적 특징이 평가될 수 있다. 또한 후보 표적으로의 적합성은 당분야에 알려진 리보뉴클레이드 보호 분석법을 이용하여 상보적 올리고뉴클레오타이드와 혼성화하는 그들의 접근성을 테스트함으로써 평가될 수 있다. 효소적 RNA 분자를 코딩하는 DNA는 알려진 기술에 따라서 생성될 수 있다(첵 등의 미국특허 제4,987,071호; 킨 등의 미국 특허 제5,559,021호; 돈손 등의 미국특허 제5,589,367호; 토런스 등의 미국특허 제5,583,032호; 조이스의 미국특허 제5,580,967호; 골드 등의 미국특허 제5,595,877호; 와그너 등의 미국특허 제5,591,601호; 및 미국특허 제 5,622,854호를 참조하라. 이들의 개시는 그 전체로서 본 명세서에 참고문헌으로 통합된다.). 식물세포에서 그러한 효소적 RNA 분자의 생산과 QPRTase 단백질 생산의 파괴는 안티센스 RNA 분자의 생산과 같은 방법으로: 즉 효소를 생산하는 세포에서 mRNA의 전사를 파괴함으로써 식물 세포에서 QPRTase 활성을 감소시킨다. 본 명세서에서 사용되는 '리보자임'이라는 용어는 효소(엔도리보뉴클라제와 같은)로서 작용하는 RNA-포함 핵산을 기술하는 것이고 '효소적 RNA 분자'로 교체하여 사용될 수 있다. 나아가 본 발명은 리보자임을 코딩하는 DNA, 발현벡터내로 삽입된 리보자임을 코딩하는 DNA, 그러한 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 리보자임을 이용하여 식물체에서 QPRTase 생산을 감소시키는 방법을 포함한다.
본 발명을 수행하는 데 이용되는 핵산 서열은 서열번호 1과 서열 유사성을 가지고, QPRTase 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 것을 포함한다. 이 정의는 QPRTase의 자연적인 대립형질 변이를 강조하기 위함이다. 따라서, 또한 서열번호 1의 DNA에 혼성화하고 QPRTase, 특히 식물 QPRTase 효소의 발현을 코드하는 DNA 서열은 본 발명을 수행하는 데 이용될 수 있다.
다양한 형태의 담배 QPRT 효소가 존재한다. 효소의 다형태는 단일 유전자 산물의 전사후 변형에 의한 것이거나, 또는NtQPT1유전자의 다형태 때문이다.
QPRTase 활성을 가지는 단백질의 발현을 코드하는 다른 DNA 서열을 서열번호 1의 DNA 또는 서열번호 2의 단백질을 코딩하는 다른 DNA 서열에 혼성화할 수 있게하는 조건은 일상적 방법으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 그러한 서열의 혼성화는 완화된 스트리젠트 혹은 엄격한 스트리젠트 조건하에서 수행될 수 있다(즉, 서열번호 2의 단백질을 코딩하는 DNA를 60℃ 혹은 70℃에서 0.3M NaCl, 0.03M 소디움 시트레이트, 0.1% SDS의 세척 스트리젠시에 의하여 표시되는 조건으로 표준 원 위치(in situ) 혼성화 분석. 샘브룩 등의 논문(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2nd Ed. 1989)(Cold Spring Harbor Laboratory))을 참조하라). 일반적으로, 그러한 서열은 서열번호 1에 주어진 서열 또는 서열번호 2의 단백질을 코딩하는 DNA 서열에 적어도 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상 유사할 것이다(서열 유사도의 결정은 최대로 일치하도록 배열한 두 서열을 가지고 이루어지고, 최대의 일치는 일치된 두 서열중 하나에서 갭을 허용한다. 갭 길이는 10 이하가 바람직하고, 5 이하는 더욱 바람직하며, 2 이하는 더더욱 바람직하다).
분별 혼성화 과정은 mRNA 수준이 약 0.05% 폴리(A+)RNA 정도로 낮은 cDNA 클론의 동정을 가능하게 한다(M. Conkling et al.,Plant Physiol.93, 1203-1211(1990)을 참조). 요약하여, 식물 조직(예를 들어, 뿌리 및/또는 잎)으로부터 분리된 역전사된 mRNA의 단일-가닥 cDNA 프로브를 사용하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝한다. 분별 스크리능을 위하여, 니트로셀룰로오스나 나일론 막을 5xSSC에 적셔서, 96 웰 흡입 매니폴드에 놓은 다음, 150㎕ 정지 오버나잇 배양으로 매스터 플레이트로부터 각 웰로 전이시킨 후, 모든 액이 필터를 통과할 때까지 진공을 걸어주었다. 150㎕의 변성용액(0.5M NaOH, 1.5M NaCl)을 다중 파이펫을 사용하여 각 웰에 놓고 약 3분 동안 방치하였다. 흡입은 상기와 같이 적용하였고, 필터를 제거한 다음 0.5ㅡ트리스 HCl(pH 8.0), 1.5M NaCl에서 중화하였다. 그리고 나서 진공하에서 2 시간 동안 구운 다음에 관련 프로브와 함께 인큐베이트하였다. 나일론 막 필터를 사용하고 매스터 플레이트를 -70℃, 7% DMSO에 보관함으로써, 필터는 다수의 프로브로 다회 스크리닝 할 수 있고 적당한 클론은 저장 몇년후에 회수될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이. '유전자'란 용어는 (1)프로모터를 포함하는 조절 신호의 상류(5')에, (2)유전자의 산물, 단백질 혹은 RNA를 구체화하는 코딩 부위에, (3)전사 종결 신호와 폴리아데닐레이트 신호를 포함하는 부위의 하류(3') 및 (4)효과적이고 구체적인 발현에 필요한 관련된 서열에 삽입되는 DNA 서열을 말한다.
본 발명의 DNA 서열은 본 명세서에서 제공되는 서열(서열번호 1), 혹은 이러한 유전자의 대립형질 혹은 다형변이체를 재현하는 등가의 뉴클레오타이드 서열, 혹은 그들의 코딩 부위를 필수적으로 포함할 수 있다.
본 명세서와 청구항에서 '실질적 서열 유사'란 구의 사용은 본 명세서에 개시되고 청구된 실제 서열로부터 아주 조금 및 전혀 중요하지 않은 서열 변이를 가지는 DNA, RNA 또는 아미노산 서열이 본 발명의 서열과 등가의 것으로 고려된다는 것을 의미한다. 이와 관련하여, '아주 조금 및 전혀 중요하지 않은 서열 변이'는 '유사한' 서열(즉, 본 명세서에 개시되고 청구된 DNA, RNA 또는 단백질과 실질적 서열 유사를 가지는 서열)이 본 발명에 개시되고 청구한 서열과 기능적으로 등가일 것이라는 것을 의미한다. 기능적으로 등가의 서열은 실절적으로 동일한 방법으로 작용하여 본 명세서에 개시되고 청구된 핵산 및 아미노산 조성과 실질적으로 동일한 조성물을 생산할 것이다.
본 명세서에서 제공된 DNA 서열은 다양한 숙주 세포에 형질전환될 수 있다. 바람직한 성장 및 조작 성질을 가지는 다양한 적합한 숙주 세포는 당분야에서 쉽게 이용될 수 있다.
DNA, RNA, 폴리펩타이드 및 단백질의 변형체로서 본 명세서 및 클레임에서 사용된 '정제된' 또는 '실질적으로 순수한'이란 구는 지적된 DNA, RNA, 폴리펩타이드 또는 단백질이 그들의 생체내 세포 환경으로부터 인간의 노력에 의하여 분리된 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, '본래 DNA 서열' 혹은 '자연적 DNA 서열'은 형질변환되지 않은 세포나 조직으로부터 정제된 DNA 서열을 의미한다. 본래 DNA 서열은 부위-특이 돌연변이 형성과 같은 방법에 의하여 인공적으로 변형된 바 없는 것이다. 일단 본래 DNA 서열이 동정되면, 본래 DNA 서열을 가진 DNA 분자는 당업계에서 공지된 재조합 DNA 과정을 사용하여 화학적으로 합성되거나 생산될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 본래 식물 DNA는 형질전환되지 않은 식물세포 또는 조직으로부터 정제될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 본래 담배 DNA 서열은 형질변환되지 않은 담배 세포 또는 조직으로부터 정제될 수 있다.
본 발명의 DNA 구축체, 또는 '전사 카세트'는 5' 에서 3' 방향으로 전사배향되고, 본 명세서에서 논의된 프로모터, 프로모터와 작동적으로 연결된 본 명세서에서 논의된 DNA 서열 및 선택적으로 RNA 폴리머레이즈를 위한 종결 신호를 포함하는 종결 서열과 폴리아데닐레이즈를 위한 폴리아데닐레이트 신호를 포함한다. 어떠힌 적당한 종결 신호도 본 발명을 수행하는 데 이용될 수 있으며, 그들의 예로는 노팔린 신테이즈(nos) 종결자, 옥타파인 신테이즈(ocs) 종결자, 컬리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 종결자 혹은 전사 개시 부위와 동일한 유전자 혹은 상이한 유전자로부터 유래한 본래 종결 신호를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다(Rezian et al., (1988) supra와 Rodermel et al., (1988) supra를 참조).
본 명세서에서 사용된 '작동적으로 연관된'이란 용어는 하나의 기능이 다른 것에 의하여 영향을 받도록 연관된 단일 DNA 분자위의 DNA 서열을 말한다. 따라서, 프로모터가 DNA 전사에 영향을 미칠수 있을 때(즉 DNA 가 프로모터의 전사 조절하에 있다) DNA와 작동적으로 연관된 것이다. 프로모터는 DNA로부터 '상류'에 있다고 말해지면 반대로 DNA는 프로모터의 '하류'에 있다고 말해진다.
전사 카세트는 하나 이상의 복제 시스템을 갖는 DNA 구축체내에서 제공된다. 그것은 ColE1, pSC101, pACYC184 등의 대장균에서 기능적인 복제 시스템을 공통적으로 가진다. 이 방법에서, 각 조직 후의 각 단계에서, 결과적 구축체는 클론되고 서열결정될 수 있고, 조작의 정확성이 확인될 수 있다. 또한 대장균 복제 시스템에 대신하여, P-1 비 경쟁적 플라스미드 즉, pRK290 과 같은 광범위한 숙주 범위 복제 시스템이 이용될 수 있다 복제 시스템에 더하여, 하나 이상의 숙주에서 유용한 하나 이상의 마커가 흔히 존재하거나, 혹은 개별적 숙주를 위한 상이한 마커가 존재한다. 즉, 하나의 마커는 진핵세포 숙주, 특히 식물 숙주에서 선별에 이용될 수 있다. 마커는 항생제, 톡신, 중금속등과 같은 생물독으로부터 보호할 수 있고; 영양요구 숙주에게 기본영양을 제공하는 것에 의하여 보충성을 제공할 수 있으며; 또는 식물체에서 새로운 물질의 생산을 통하여 관찰가능한 표현형을 제공할 수 있다.
다양한 구축체, 전사 카세트, 마커 등을 포함하는 다양한 절편이 적합한 복제 시스템의 제한 효소 절단과, 가능한 사이트로 특정 구축체 또는 절편이 삽입됨에 의하여 연속적으로 도입될 수 있다. 라이게이션과 클로닝 후에, DNA 구축체는 더 부가될 조작을 위하여 정제될 수 있다. 이러한 기술의 모든 것은 샘브룩 등에 의하여 예시된 바와 같이 문리적으로 충분히 예시될 수 있다(J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2d Ed. 1989)(Cold Spring Harbor Laboratory)).
본 발명의 핵산 구축체로 식물 조직을 형질전환시키는 데 이용될 수 있는 벡터는 DNA-매개 형질전환에 적합한 벡터뿐 아니라, 아그로박테리움 벡터와 사출성 벡터 양자를 포함한다.
'프로모터'란 용어는 코딩 서열의 효과적인 발현을 위하여 필요한 신호를 포함하는 DNA 서열 부위를 말한다. 이것은 RNA 폴리머라제가 결합하는 서열을 포함하지만 그러한 서열에 한정되는 것은 아니고, 단백질 해독의 조절에 참여하는 부위와 함께 다른 조절 단백질 부위가 결합하는 부위를 포함할 수 있고, 코딩 서열을 포함할 수도 있다.
본 발명을 수행하는 데 이용되는 프로모터는 항상적으로 활성형인 프로모터일 수 있다. 식물에서 기능적인 많은 항상적 활성형 프로모터가 이용가능하다. 바람직한 실시예는 대부분의 식물 조직에서 항상적으로 발현하는 CaMV 35S 프로모터이다. 다른 것으로, 프로모터는 하기에서 설명될 뿌리-특이 프로모터 혹은 뿌리 피층 특이 프로모터일 수 있다.
안티센스 서열은 CMV 35S 프로모터를 이용하여 형질변환 담배 식물체에서 발현된다(Cornelissen et al., 'Both RNA Level and Translation Efficiency are Reduced by Anti-Sense RNA in Transgenic Tobacco',Nucleic Acids Res.17, pp.833-43(1989); Rezaian et al., 'Anti-Sense RNAs of Cucumber Mosaic Virus inTransgenic Plants Assessed for Control of the Virus',Plant Molecular Biology11, pp.463-71(1988); Rodermel et al., 'Nuclear-Organelle Interaction: Nuclear Antisense Gene Inhibits Ribulose Bisphosphate Carboxylase Enzyme Levels in Transformed Tobacco Plants',Cell55, pp.673-81(1988); Smith et al., 'Antisense RNA Inhibition of Polygalacturonase Gene Expression in Transgenic Tomatoes',Nature334, pp.724-26(1988); Van der Krol et al., 'AnAnti-Sense Chalcone Synthase Gene in Transgenic Plants Inhibits Flower Pigmentation',Nature333, pp.866-69(1988)을 참조하라).
본 발명의 형질전환 담배 세포 및 식물체에서 QPRTase의 발현을 위하여 CaMV 35S 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. 담배 뿌리에서 다른 재조합 유전자를 발현하는 데 CaMV 프로모터를 사용하는 것이 잘 기술되어 있다(Lam et al., 'Site-Specific Mutations Alter In Vitro Factor Binding and Change Promoter Expression Patter in Transgenic Plants',Proc. Nat. Acad. Sci USA86, pp7890-94(1989); Poulsen et al., 'Dissection of 5' Upstream Sequences for Selective Expression of the Nicotiana plumbaginifolia rbsS-8B Gene',Mol. Gen. Genet.214, pp.16-23(1988)).
단지 뿌리 조직에서 활성적인 다른 프로모터(뿌리 특이 프로모터)가 또한 특별히 본 발명의 방법에 적합하다. 콘클링(Conkling) 등의 미국 특허 제5,459,252, 호; 야마모토(Yamamoto) 등의 논문(The Plant Cell, 3:371(1991))을 참조하라. 또한 TobRD2 뿌리-피층 특이 프로모터가 이용될 수 있다. 콘클링 등의 미국 특허출원 SN 08/508,786; PCT WO 9705261 를 참조하라. 여기에서 언급된 모든 특허가 그 전체로서 본 명세서에 참조문헌으로 통합된다.
본 발명의 형질전환된 담배 세포 및 식물체를 생산하는 데 사용된 QPRTase 재조합 DNA 분자와 벡터는 우성 선별 마커 유전자를 더 포함할 수 있다. 담배에 사용되기 적합한 우성 선별 마커는 특히 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPTⅡ), 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제(HPT) 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)를 코딩하는 항생제 저항 유전자를 포함한다. 담배에 사용되기 적합한 다른 잘 알려진 우성 선별 마커는 메토트렉세이트-저항 디히드로폴레이트 리덕테이즈를 코딩하는 돌연변이 디히드로폴레이트 리덕테이즈 유전자이다. 적합한 항생제 저항 유전자를 포함하는 DNA 벡터와 상응하는 항생제는 상업적으로 이용가능하다.
형질전환된 담배 세포는 혼합된 세포군을 선택된 우성 선별 마커 유전자 산물이 저항성을 부여하는 적합한 농도의 항생제(또는 정상적으로 담배 세포에 독성을 갖는 다른 물질)를 포함하는 배양 배지에 둠으로써 주위의 비-형질전환된 세포 군집으로부터 선별된다. 따라서, 형질전환된 담배 세포만이 생존하여 증식할 것이다.
본 발명에서 재조합 식물체를 만드는 방법은 일반적으로, 처음에 재생이 가능한 식물 세포(재생이 가능한 조직에 전형적으로 존재하는 식물 세포)를 제공하는 것을 포함한다. 그리고 나서 식물 세포는 본 발명의 전사 카세트를 포함하는 DNA 구축체로 형질전환되고, 재조합 식물체가 형질전환된 식물 세포로부터 재생된다. 하기에서 설명될 바와 같이, 형질전환 단계는 전사 카세트를 운반하는 마이크로입자로 식물 세포에 총을 쏘는 방법, 전사 카세트를 운반하는 Ti 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 튜머페이슨스로 세포를 감염시키는 방법 또는 형질전환 식물체의 생산에 적합한 다른 기술을 포함하나 이에 한정되지 않는 당업계에 공지된 기술에 의하여 수행된다.
본 발명을 수행하는 이용가능한 수많은 아그로박테리움 벡터 시스템이 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,459,355호는 Ti 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 균주로 양배엽 식물을 포함하는 식물체를 형질전환시키는 방법을 개시한다. 아그로박테리움 벡터로 목재 식물체를 형질전환시키는 것은 미국 특허 제4,795,855호에 개시되어 있다. 나아가 쉴페로트(Schilperoort) 등의 미국특허 제4,940,838호는 본 발명을 수행하는 데 유용한 바이너리 아그로박테리움 벡터(즉, Ti-플라스미드의 vir 부위를 포함하지만 T 부위는 포함하지 않는 하나의 플라스미드와 T 부위는 포함하지만 vir 부위는 포함하지 않는 두번째 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움내에 포함되는 것)를 개시한다.
본 발명의 DNA 구축체를 운반하는 마이크로입자는 식물 세포의 사출성 형질전환에 적합하고, 또한 본 발명의 형질전환된 식물체를 만드는데 유용하다. 마이크로입자는 식물 세포내로 날아들어 형질전환 식물세포를 생산하고, 식물체는 형질전환된 식물 세포로부터 재생된다. 어떠한 적합한 사출성 세포 형질전환 방법과 장치도 본 발명을 실현하는데 사용될 수 있다. 예시적 장치와 방법이 샌포드와 울프의 미국특허 제4,945,050호 및 크리스토우 등의 미국 특허 제5,051,580호에 개시되어 있다. 사출성 형질전환 과정을 사용할 때, 전사 카세트는 복제될 수 있고, 형질전환될 세포에 통합될 수 있는 플라스미드에 삽입될 수 있다. 그러한 시스템에 사용되기 적합한 마이크로입자의 예는 1-5 ㎛의 금으로된 구형이다. DNA 구축체는 침전과 같은 어떠한 적합한 기술에 의하여도 마이크로입자에 적재될 수 있다.
식물 종은 본 발명의 DNA 구축체를 이용하여 식물세포 원형질체의 DNA-매개 형질전환법에 의하여 형질전환될 수 있고, 이어지는 형질전환 원형질체로부터의 식물체의 재생은 그 과정과 함께 당업계에 잘 알려져 있다. DNA-함유 리포좀의 담배 원형질체로의 융합 혹은 엘렉트로포레이션을 통한 방법은 당업계에 잘 알려져있다(Shillito et al., 'Direct Gene Transfer to Protoplasts of Dicotyledonous and Monocotyledonous Plants by a Number of Methods, Including Electroporation',Methods in Enzymology153, pp.313-36(1987)).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 형질전환은 외인성 DNA를 세포내로 도입시키고, 외인성 DNA로 안정적으로 형질전환된 형질전환 세포를 생산하는 것을 말한다.
형질전환된 세포는 담배 세포의 적용과 당업계에 잘 알려져 있는 조직배양 기술을 통하여 살아있는 담배 식물체를 재생하도록 유도된다. 식물체 재생의 방법은 형질전환 방법과 조화되도록 선택된다. 형질전환 담배 식물체에서 QPRTase 서열의 안정적인 존재와 배향은 QPRTase 서열의 멘델 유전에 의하여 확인될 수 있고, 조절된 교배로부터 생산되는 자손에 적용되는 DNA 분석 표준 방법에 의하여 밝혀질수 있다. 형질전환 세포로부터 형질변환 담배 식물체의 재생후에, 도입된 DNA 서열은 쉽게 과도한 실험없이 다른 담배 변이체로 전통적 식물 교배 관습을 통하여 전달된다.
예를 들어, 트랜스진의 격리를 분석하기 위하여, 재생된 형질변환 식물체(R0)는 성숙될 때 까지 성장시켜, 니코틴 함량을 시험하고, R1식물체의 생산을 위한 자가-생식에 제공한다. 트랜스진을 운반하는 R1식물체의 퍼센트는 트랜스진과 동형접합성이다. 동형접합성 R1식물체를 동정하기 위하여, 형질변환된 R1식물체는 성숙될 때까지 성장시켜 자가-생식한다. 동형접합성 R1식물체는 형질변환 R2자손을 생산하고 각 자손 식물체는 트랜스진을 운반할 것이고; 이형접합성 R1식물체는 3:1로 분리될 것이다.
니코틴은 유해물에 의한 손상으로부터 담배 식물체를 보호하는 자연적 농약으로서 제공된다. 그러므로 본 발명에 의하여 생산된 낮은 또는 결여된 니코틴 식물체를 부가적 해충 보호를 위한 트랜스진(예를 들어 바실러스 트린지엔시스)으로 부가적으로 형질전환시키는 것이 바람직하다.
본 방법에 사용되기 바람직한 식물체는 니코티아나 속, 또는 N. 타바쿰, N. 루스티카 및 N. 글루티노사를 포함하는 담배이다. 어떠한 균주 또는 담배의 변이체도 사용될 수 있다. 균주는Nic1/Nic2이중 돌연변이체와 같이 이미 낮은 니코틴 함량을 가지는 것이 바람직하다.
연속적인 클론 증폭이 가능한 어떠한 식물 조직도 기관형성 또는 배형성에 의하여 본 발명의 벡터로 형질전환될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, '기관형성'이란 용어는 분열조직 중심으로부터 줄기와 뿌리가 연속적으로 발달되는 과정을 의미하고; '배형성'이라는 용어는 체세포나 접합체로부터 일치된 태양으로(연속되지 않고) 함께 줄기와 뿌리가 발달하는 과정을 의미한다. 선택된 구체적 조직은 형질전환될 구체적 종에 이용가능하고, 가장 적합한 클론 증식 시스템에 따라서 달라진다. 예시적 조직 표적은 잎 디스크, 화분, 배, 떡잎, 하이퍼코틸, 칼루스조직, 존재하는 분열조직(예를 들어 정단 분열조직, 엽액 눈 및 뿌리 분열조직), 및 유도된 분열조직(예를 들어 떡잎 분열조직 및 하이퍼코틸 분열조직)이다.
본 발명의 식물체는 다양한 형태를 가질수 있다. 식물체는 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포의 키메라일 수 있고; 식물체는 클론 형질전환체(예를 들어 전사 카세트를 포함하도록 형질전환된 모든 세포)일 수 있고; 식물체는 형질전환된 및 형질전환되지 않은 조직의 이식조직(예를 들어, 시트러스 종의 형질전환되지 않은 접가지에 이식된 형질전환된 뿌리 스톡)을 포함할 수 있다. 형질전환된 식물체는 클론 증식 또는 전통적 교배 기술과 같은 다양한 방법에 의하여 증식될 수 있다. 예를 들어, 첫번째 세대(또는 T1) 형질전환된 식물체는 동형접합성 두번째 세대(또는 T2) 형질전환 식물체를 제공하기 위하여 자가생식할 수 있고, T2 식물체는 전통적 교배기술을 통하여 더 증식할 수 있다. 우성 선별 마커(nptⅡ와 같은)는 교배를 도우는 전사 카세트와 연관될 수 있다.
상기한 관점에서, 본 발명을 실현하는 데 이용될 수 있는 식물체가 니코티아나 속을 포함한다는 것은 명백하다.
상기에 기술된 재조합 DNA 방법에 익숙한 사람들은 작동적으로 연관된 적당한 조절 서열과 센스 배향으로 연결된 완전한 길이의 QPRTase cDNA분자나 완전한 길이의 QPRTase 크로모좀 유전자를 형질전환 담배 세포 및 식물체를 구축하는 데 이용할 수 있다는 것을 인지할 것이다.(당업자들은 또한 센스 배향의 유전자의 발현을 위한 적당한 조절 서열이 알려진 진핵 해독 개시 서열의 어느 하나를 상기에서 서술한 프로모터와 폴리아데닐레이트/전사 종결 서열에 부가하여 포함한다는 것을 인지할 것이다.) 그러한 형질전환된 담배 식물체는 증가된 QPRTase 수준과, 형질전환되지 않은 대조 담배 식물체에 배하여 높은 니코틴 함량을 특징으로 한다.
그러므로, QPRT 효소의 수준을 감소시키거나 증가시키기 위하여, 그리고 그에 의하여 담배 식물체에서 니코틴 함량을 증가시키거나 줄이기 위하여 QPRTase DNA 서열을 이용하는 것이 본 발명의 범주내에 포함된다는 것이 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 작물은 본 발명의 식물체와 이와 같은 속의 식물체와, 경작지에서 함께 경작된 식물체의 복수개를 포함한다. '경작지'는 토양의 공통 플랏과 온실을 의미한다. 따라서 본 발명은 변형된 QPRTase 활성을 가지고, 따라서 간은 종과 유사체의 형질전환되지 않은 식물체의 유사한 작물에 비하여 증가되거나 감소된 니코틴 함량을 가지는 식물체의 작물을 생산하는 방법을 제공한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 거기에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1. 정제와 스크리닝
TobRD2 cDNA(Conkling et al.,Plant Phys.93, 1203(1990))가 서열결정되어 서열번호 1로 제공되었으며, 추론된 아미노산 서열이 서열번호 2로 제공되었다. 추론된 아미노산 서열은 세포질 단백질로 예견되었다. 식물 QPTase 유전자가 보고된 바 없었지만,NtPT1아미노산 서열과 진뱅크 데이타 베이스를 비교하여 어떤 박테리아 및 다른 단백질들과 제한된 서열 유사도를 보였다(도 3 참조); 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제(QPRTase) 활성이 S. 티피무리움, 대장균 및 N. 타마쿰 유전자에서 확인되었다. QPTase 를 코딩하는NtQPT1은 아라비돕시스 EST(발현 서열 tag) 서열(진뱅크 기탁번호 F20096)에 의하여 코딩되는 추론된 펩타이드 절편과 유사성을 가지고, 이는 아라비돕시스 QPTase 유전자의 일부를 나타낼 수 있다.
실시예 2. 원 위치 혼성화
뿌리의 다양한 조직에서 TobRD2 mRNA 전사체의 공간적 분포를 알아보기 위하여, 원 위치 혼성화를 형질전환되지 않은 식물체에서 수행하였다. 뿌리 조직에서의 TobRD2 mRNA에 대한 TobRD2의 안티센스 가닥의 원 위치 혼성화를 메이어로이츠(Meyerowitz,Plant Mol. Biol. Rep.5, 242(1987))와 스미스 등(Smith et al.,Plant Mol. Biol. Rep.5, 237(1987))이 개시한 기술을 이용하여 수행하였다. 7일된 담배(니코티아나 타바쿰) 종자 뿌리를 인산염-완충 글루타르알데하이드에 고정하고, 파라플래스트 플러스(ParaPlast Plus: Monojest Inc., St.Louis, MO)에 침지하고, 8mm 두께로 잘라서 세로 조각뿐 아니라 가로 조각을 얻었다. 35S-ATP의 존재하에서 시험관에서 합성된 안티센스 TobRD2 전사체를 프로브로 사용하였다. 라벨된 RNA는 알카라인 처리에 의하여 가수분해되어 사용전에 100에서 200 염기 질량 평균 길이가 되었다.
혼성화는 혼성화 용액 밀리리터 당 약 5×106분당수(cpm) 라벨된 RNA로 50% 포름아마이드에서 16 시간 동안 42℃에서 수행되었다. 노출 후, 슬라이드는 밝고 어두운 필드 현미경하에서 관찰되었다.
혼성화 신호는 뿌리의 피층 세포에 국한되었다. 동일한 조각의 밝고 어두운 필드 영상 양쪽의 비교는 TobRD2 전사체가 뿌리 피층의 유조직 세포에 국한되었다. 혼성화 신호가 표피나 중심주에서는 관찰되지 않았다.
실시예 3. Nic1/Nic2 담배 돌연변이체에서의 TobRD2 mRNA 수준과 니코틴 함량의 연관성
TobRD2정상-상태 mRNA 수준은Nic1및Nic2돌연변이 담배 식물체에서 조사되었다.Nic1와Nic2는 QPRTase 활성과 PMTase 활성을 조절하는 것으로 알려져 있으며, 니코틴 생산의 공-우성 조절자이다. 결과는 도 5a와 5b에 도시되었으며,TobRD2발현이Nic1및Nic2에 의하여 조절되는 것을 보인다.
야생형 버얼리 21 담배 식물체(Nic1/Nic1 Nic2/Nic2)의 뿌리;Nic1-버얼리 21 (nic1/nic1 Nic2/Nic2)의 뿌리;Nic2-버얼리 21 (Nic1/Nic1 nic2/nic2)의 뿌리; 및Nic1-Nic2-버얼리 21 (nic1/nic1 nic2/nic2)의 뿌리로부터 RNA 가 정제되었다.
네개의 버얼리 21 담배 주(nic)는 토양에서 종자로부터 한달동안 성장시키고, 한달동안 온실의 혼입 영양 용액이 있는 수경재배 챔버로 이주시켰다. 이러한 주는 두개의 저-니코틴 유전자위를 제외하고는 동일유전형으로서,Nic1/Nic1 Nic2/Nic2, nic1/nic1 Nic2/Nic2, Nic1/Nic1 nic2/nic2, nic1/nic1 nic2/nic2의 유전형을 가진다. 각 유전형에서 약 20개의 식물체로부터 뿌리를 회수하여 RNA 분리를 위하여 저장하였다. 각 유전형으로부터의 전체 RNA(1㎍)를 1.1M 포름알데하이드를 포함하는 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동시키고, 샘브룩 등에 따라 나일론 막에 전이하였다. 막은32P-라벨된 TobRD2 cDNA 절편으로 혼성화되었다. TobRD2 전사체의 상대적 세기가 덴시토미터에 의하여 측정되었다. 도 5(검은 막대)는 네가지 유전형의 각각에서 상대적 전사체 수준(Nic1/Nic1 Nic2/Nic2와 비교하여)을 도시한다. 네가지 유전형의 상대적 니코틴 함량(Nic1/Nic1 Nic2/Nic2)은 사선 막대로 표시하였다.
도 5는 정상 상태의 상대적TobRD2mRNA 수준을 야생형 버얼리 21(Nic1/Nic1 Nic2/Nic2)에서 발견되는 수준을 참고량으로 하여 그래프적으로 나타낸 것이다.Nic1/Nic2이중 돌연변이체에서의TobRD2mRNA수준은 야생형 담배의 약 25%에 이른다. 도 5b는 본 실시예에서 연구한 담배의 유사유전형 주에서 니코틴의 상대적 함량을 더 비교한 것이다(검은 막대는TobRD2전사체 수준을 나타내고; 사선막대는 니코틴 함량을 나타낸다). 니코틴 함량과TobRD2전사체 수준은 밀접한 관련이 있었다.
실시예 4. TobRD2 mRNA 수준에 미치는 탑핑의 효과
당업계에서 담배 식물체의 화두를 제거하는 것(탑핑)이 뿌리성장을 증가시키고 그 식물체 잎의 니코틴 함량을 증가시킨다는 것이 알려져 있다. 식물체의 탑핑은 상업적 담배 경작에서 표준화된 관행이고, 알려진 성장 조건하의 주어진 담배 식물체를 탑핑시키에 가장 적합한 시간은 당업자에 의하여 쉽게 결정될 수 있다.
담배 식물체(N. tabacumSR1)를 토양에서 한달동안 종자로부터 성장시키고 모래가 포함된 화분으로 이주시켰다. 꽃이 피기 시작할 때까지 온실에서 두달 동안 성장시켰다. 그리고 나서 지정된 시간 후에 각 식물체로부터 뿌리 부위를 회수하였고, RNA 추출을 위하여 제공되었다. 대조 식물체는 킵핑하지 않았다. 각 시간별 총 RNA(1㎍)를 1.1M 포름알데하이드를 포함한 1% 아기로스 겔에서 전기영동한 후 샘브룩 등에 따라 나일론 막에 옮겼다. 막을32P-라벨된 TobRD2 cDNA절편과 혼성화하였다. TobRD2 전사체의 상대적 양은 덴시토미터로 측정하였다. 도 6은 각 시간별로 탑핑된 식물체(검은 막대)와 탐핑하지 않은 식물체(사선 막대)의 상대적 전사체 수준(0시에 비교하여)을 도시한 것이다.
상대적TobRD2수준은 뿌리 조직에서 24시간 경과하여 결정하였다; 결과를 도 6에 나타내었다(검은 막대는 탑핑된 식물체에서TobRD2전사체 수준을 나타내고; 사선 막대는 탑핑되지 않은 대조군에서의TobRD2전사체 수준을 나타낸다.). 담배 식물체의 탑핑후 6시간 내에,TobRD2의 mRNA 수준은 탑핑된 식물체에서 약 8배 증가하였고; 같은 시간 경과후에 대조 식물체에서는 증가하지 않았다.
실시예 5. 서열변호 1의 DNA로 QPRTase 결손 박테리아 돌연변이체의 보충
대장균 TH265 균주는 QPRTase가 결손된 돌연변이주(nadC-)이고, 따라서 니코틴산이 결여된 배지에서는 성장하지 못한다.
TH265 세포를 서열번호 1의 DNA를 포함하는 발현벡터(pWS161), 또는 발현 벡터(pKK233)만으로 형질전환시켰다. 형질전환된 박테리아의 성장을 TH265(pKK233) 형질전환체의 성장 및 형질전환되지 않은 TH265nadC-돌연변이체의 성장과 비교하였다. 성장은 ME 최소배지(니코틴산이 결여됨)와 니코틴산이 첨가된 ME 최소배지에서 비교하였다.
QPTase 돌연변이(nadC)를 가진 대장균 균주 TH265는 허치스 박사가 제공해 주었다(Hughes et al.,J. Bact.175:479(1993)). 세포는 LB 배지에서 유지되었고 허용세포를 샘브룩 등이 설명한 데로 제조하였다. 발현 플라스미드는 Tac 프로모터의 조절하에 있는 TobRD2 cDNA를 가지고 pKK2233(Brosius, 1984)에 구축하였다. 결과적 플라스미드 pWS161은 TH265 세포에 형질전환시켰다. 그리고 나서 형질전환된 세포는 보충물로 니코틴산(0.0002%)이 첨가되거나 첨가되지 않은 최소 배지(Vogel andBonner, 1956) 아가 플레이트에 도말하였다. TH265 세포 단독으로 및 pKK2233으로 형질전환된 TH265를 대조군으로 사용하기 위하여 유사한 플레이트에 도말하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다. 서열번호 1의 DNA로 형질전환된 TH265 만이 니코틴산이 결여된 배지에서 성장하였다. 이러한 결과는 TH265 박테리아 세포에서 서열번호 1의 DNA의 발현이 이러한 세포에NadC+표현형을 부여함을 보여주는 것이고 이 서열이 QPRTase를 코딩하는 것을 확인하는 것이다. 따라서 TobRD2를NtQPT1으로 명명하였다.
실시예 6. 담배 식물체의 형질전환
안티센스 배향된 서열번호 1의 DNA는 식물 프로모터(CaMV 35S 또는 TobRD2 뿌리-피층 특이 프로모터)와 작동적으로 연결되어 CaMV35S 프로모터/안티센스 서열번호 1 및 TobRD2 프로모터/안티센스 서열번호 1의 두가지의 상이한 DNA 카세트를 생산한다.
야생형 담배주와 저-니코틴 담배주 즉, 야생형 버얼리 21 담배(Nic1+/Nic2+)와 동형접합성nic1-/nic2-버얼리 21을 형질전환시키기 위하여 선별하였다. 각 주로부터 복수의 담배 식물 세포를 각 DNA 카세트를 이용하여 형질전환시켰다. 형질전환은 아그로박테리움 벡터 즉, Ti-경계 서열과nptⅡ유전자(nos프로모터(nptⅡ)의 조절하에서 카나마이신에 대한 저항성을 부여)를 운반하는 아그로박테리움-바이너리 벡터를 이용하여 유도하였다.
형질전환된 세포를 선별하여 형질전환 담배 식물체(R0)로 재생시켰다. R0식물체를 성숙기까지 길러서 니코틴 함량을 조사하였다; 형질전환된 담배 식물체의 일부가 형질전환되지 않은 대조 식물체에 비하여 현저히 낮은 니코틴 함량을 보였다.
그리고 나서 R0식물체를 자가 이식시켰고, 트랜스진의 분리를 R1자손에서 분석하였다. R1자손을 성슥할때까지 길러서, 자가이식시켰다; R2자손가운데 트랜스진의 분리는 R1식물체가 트랜스진이 동형접합성이라는 것을 나타낸다.

Claims (44)

  1. (a) 서열 번호 1;
    (b) 서열 번호 2를 가지는 효소를 코딩하는 DNA 서열;
    (c) 상기 (a) 또는 (b)의 정제된 DNA와 90% 이상의 유사성이 있고, 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 효소를 코드하는 DNA서열; 및
    (d) 유전적 코드의 퇴화 때문에 상기 (a) 또는 (b)의 DNA와는 상이하고, 상기 (a) 또는 (b)에 의하여 코드되는 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 효소를 코드하는 DNA 서열;로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 정제된 DNA 분자.
  2. 발현 카세트를 포함하는 DNA 구축체에 있어서, 5'에서 3'으로 배향되고, 식물세포에서 기능적인 프로모터와 상기 프로모터의 하류에 위치하고 그것과 작동적으로 연관된 제 1 항에 따른 DNA 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 구축체.
  3. 발현 카세트를 포함하는 DNA 구축체에 있어서, 5'에서 3'으로 배향되고, 식물세포 프로모터와 상기 프로모터의 하류에 위치하고 그것과 기능적으로 연관된 제 1 항에 따른 DNA 분자를 포함하며, 상기 DNA 분자는 안티센스로 배향된 것을 특징으로 하는 DNA 구축체.
  4. 5'에서 3'으로 배향되고, 식물세포에서 기능적인 프로모터와 상기 프로모터와 작동적으로 연관되고, 서열번호 1에 따른 서열을 가진 식물 퀴놀레이트 포스로리보실 트랜스퍼라제를 코드하는 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 구축체.
  5. 5'에서 3'으로 배향되고, 식물세포에서 기능적인 프로모터와 상기 프로모터와 안티센스로 배향되고 작동적으로 연관되며, 서열번호 1에 따른 서열을 갖는 식물 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제를 코드하는 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 구축체.
  6. 제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 식물세포에서 항상적으로 활성적인 것을 특징으로 하는 DNA 구축체.
  7. 제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 식물 뿌리조직 세포에서 선택적으로 활성적인 것을 특징으로 하는 DNA 구축체.
  8. 제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 식물 뿌리 피층 조직 세포에서 선택적으로 활성적인 것을 특징으로 하는 DNA 구축체.
  9. 제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 구축체가 플라스미드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 구축체.
  10. 제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 구축체가 식물 형질전환벡터에 의하여 운반되는 것을 특징으로 하는 DNA 구축체.
  11. 제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 구축체가 식물 형질전환 벡터에 의하여 운반되고, 이때 식물 형질전환 벡터는 아그로박테리움 튜머페이슨스(Agrogacterium tumefaciens)인 것을 특징으로 하는 DNA 구축체.
  12. 제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 DNA 구축체을 포함하는 식물 세포.
  13. 제 12 항의 식물 세포를 포함하는 형질변환 식물체.
  14. 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 효소를 코드하는 정제된 펩티드 서열번호2.
  15. (a) 서열 번호 1;
    (b) 상기 (a)의 분리된 DNA와 90% 이상의 유사성이 있고, 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 효소를 코드하는 DNA 서열; 및
    (c) 유전적 코드의 퇴화 때문에 상기 (a) 또는 (b)의 DNA와는 상이하고, 상기 (a) 또는 (b)에 의하여 코드되는 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 효소를 코드하는 DNA 서열;로 구성되는 군으로부터 선택되는 DNA 서열에 의하여 코딩되는 정제된 펩티드.
  16. 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제(QPRTase)를 발현하는 것으로 알려진 타입의 식물 세포를 제공하는 단계;
    5'에서 3'으로 배향되고, 식물세포에서 기능적인 프로모터와 상기 프로모터와 작동적으로 연관된 이종 DNA를 포함하는 외인성 DNA 구축체를 제공하는 단계; 및
    형질전환되지 않은 세포에 비하여 QPRTase 발현이 감소된 형질전환된 식물 세포를 생산하기 위하여 상기 DNA 구축체로 상기 식물 세포를 형질전환시키는 단계를 포함하고, 상기 이종 DNA는
    (a) 서열 번호 1;
    (b) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 효소를 코드하는 DNA 서열;
    (c) 상기 (a) 또는 (b)의 정제된 DNA와 90% 이상의 유사성이 있고, 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 효소를 코드하는 DNA 서열; 및
    (d) 유전적 코드의 퇴화 때문에 상기 (a) 또는 (b)의 DNA와는 상이하고, 상기 (a) 또는 (b)에 의하여 코드되는 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 효소를 코드하는 DNA 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열 중 15 뉴클레오티드 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 감소된 QPRTase 발현을 가지는 형질변환 식물 세포를 제조하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 QPRTase mRNA를 코딩하는 서열의 일부를 포함하는 DNA는 안티센스 배향된 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 16 항에 있어서, 상기 QPRTase mRNA를 코딩하는 서열의 일부를 포함하는 DNA는 센스 배향된 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 16 항에 있어서, 상기 식물 세포는 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 16 항에 있어서, 상기 형질전환된 식물 세포로부터 식물체를 재생시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 16 항에 있어서, 상기 프로모터가 항상적으로 활성적인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 16 항에 있어서, 상기 프로모터가 식물 뿌리 조직 세포에서 선택적으로 활성적인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 16 항에 있어서, 상기 프로모터가 식물 뿌리 피층 조직 세포에서 선택적으로 활성적인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 16 항에 있어서, 상기 형질전환 단계는 상기 식물 세포를 상기 DNA 구축체를 운반하는 미립자로 충격을 가함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 16 항에 있어서, 상기 형질전환 단계는 상기 식물 세포를 상기 DNA 구축체를 운반하는 Ti 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 튜머페이슨스로 감염시킴으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 19 항의 방법에 의하여 생산된 형질변환 담배 식물체로부터 종자를 회수하는 단계를 포함하는 형질변환 담배 종자의 제조방법.
  27. 제 16 항에 있어서, 상기 형질전환 식물세포는 그 안에서 발현되는 내인성 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 메신저 RNA(QPRT mRNA)를 갖고, 상기 이종 DNA 서열은
    (a) 상기 QPRT mRNA의 5'-비해독 서열;
    (b) 상기 QPRT mRNA의 3'-비해독 서열; 및
    (c) 상기 QPRT mRNA의 해독 부위로부터 선택되는 영역에서 상기 QPRT mRNA와 상보적인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 16 항에 있어서, 상기 외인성 DNA 서열은 상기 식물 세포에서 발현된 QPRT mRNA의 15개 이상의 뉴클레오타이드에 상보적인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 16 항에 있어서, 상기 외인성 DNA 서열은 상기 식물 세포에서 발현된 QPRT mRNA의 200개 이상의 뉴클레오타이드에 상보적인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 16 항에 있어서, 상기 외인성 DNA 서열은 제 1 항의 DNA 서열로부터 선택된 QPRTase 코딩 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 형질전환되지 않은 대조 식물체에 비하여 감소된 QPRTase 발현을 가지는 니코티아나 속의 형질변환 식물체에 있어서,
    상기 형질변환 식물체는 5'에서 3'으로 배향되고, 식물세포에서 기능적인 프로모터와 상기 프로모터와 작동적으로 연관된 이종 DNA를 포함하는 외래 DNA 구조체를 포함하는 형질변환 식물 세포를 포함하고,
    상기 식물은 형질전환되지 않은 대조 식물체에 비하여 QPRTase 발현이 감소되고,
    상기 이종 DNA는
    (a) 서열 번호 1;
    (b) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 효소를 코드하는 DNA 서열;
    (c) 상기 (a) 또는 (b)의 정제된 DNA와 90% 이상의 유사성이 있고, 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 효소를 코드하는 DNA 서열; 및
    (d) 유전적 코드의 퇴화 때문에 상기 (a) 또는 (b)의 DNA와는 상이하고, 상기 (a) 또는 (b)에 의하여 코드되는 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 효소를 코드하는 DNA 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열 중 15 뉴클레오티드 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 형질변환 식물체.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 이종 DNA는 안티센스로 배향된 것을 특징으로 하는 형질변환 식물체.
  33. 제 31 항에 있어서, 상기 이종 DNA는 센스로 배향된 것을 특징으로 하는 형질변환 식물체.
  34. 제 31 항의 식물체의 자손인 것을 특징으로 하는, 형질변환되지 않은 대조 식물체에 비하여 감소된 QPRTase 발현을 가지는 니코티아나 속의 형질변환 식물체.
  35. 형질변환 식물체가 제 31 항의 식물체 혹은 그의 자손인 것을 특징으로 하는, 형질전환되지 않은 대조 식물체에 비하여 감소된 QPRTase 발현을 가지는 니코티아나 속의 형질변환 식물체의 종자.
  36. 경작지에서 함께 재배된 제 31 항의 식물체의 복수개를 포함하는 농작물.
  37. 식물 세포에서 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 외인성 DNA를 포함하도록 형질전환된 식물 세포를 성장시키는 단계를 포함하며, 이때 상기 외인성 DNA의 전사되는 가닥은 상기 세포에 내인성인 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 mRNA에 상보적이고, 따라서 상기 상보적 가닥의 전사가 상기 퀴놀레이트 포스포리보실 유전자의 발현을 감소시키고, 상기 외인성 DNA는
    (a) 서열 번호 1;
    (b) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 효소를 코드하는 DNA 서열;
    (c) 상기 (a) 또는 (b)의 정제된 DNA와 90% 이상의 유사성이 있고, 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 효소를 코드하는 DNA 서열; 및
    (d) 유전적 코드의 퇴화 때문에 상기 (a) 또는 (b)의 DNA와는 상이하고, 상기 (a) 또는 (b)에 의하여 코드되는 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 효소를 코드하는 DNA 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열 중 15 뉴클레오티드 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 담배 식물체의 잎에서 감소된 니코틴 함량을 가지는 담배 식물체를 생산하는 방법에 있어서, 상기 방법은 담배 식물체 또는 그의 자손 식물체를 성장시키는 단계를 포함하며, 이때 상기 식물체는 상기 식물체에서 기능적인 전사 개시 부위와 상기 전사 개시 부위에 기능적으로 연결된 외인성 DNA 서열을 포함하는 DNA 구축체를 포함하고, 상기 DNA 서열의 전사된 가닥은 상기 세포에서 내인성 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 메신저 RNA에 상보적이고, 상기 외인성 DNA는
    (a) 서열 번호 1;
    (b) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 효소를 코드하는 DNA 서열;
    (c) 상기 (a) 또는 (b)의 정제된 DNA와 90% 이상의 유사성이 있고, 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 효소를 코드하는 DNA 서열; 및
    (d) 유전적 코드의 퇴화 때문에 상기 (a) 또는 (b)의 DNA와는 상이하고, 상기 (a) 또는 (b)에 의하여 코드되는 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 효소를 코드하는 DNA 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 증가된 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제(QPRTase) 발현을 가지는 형질변환 식물 세포를 제조하는 방법에 있어서, 상기 방법은
    퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제를 발현하는 것으로 알려진 타입의 식물 세포를 제공하는 단계;
    5'에서 3'으로 배향되고, 식물세포에서 기능적인 프로모터와 퀴놀레이트 포스로리보실 트랜스퍼라제를 코딩하는 DNA 절편을 포함하며, 상기 DNA 절편은 상기 프로모터와 작동적으로 연관된 것을 특징으로 하는 외인성 DNA 구축체를 제공하는 단계; 및
    형질전환된 세포를 생성하기 위하여 상기 DNA 구축체로 상기 식물 세포를 셩질전환시키는 단계를 포함하고,
    상기 식물 세포는 형질전환되지 않은 세포에 비하여 증가된 QPRTase 발현을 가지고, 상기 외인성 DNA는
    (a) 서열 번호 1;
    (b) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 효소를 코드하는 DNA 서열;
    (c) 상기 (a) 또는 (b)의 정제된 DNA와 90% 이상의 유사성이 있고, 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 효소를 코드하는 DNA 서열; 및
    (d) 유전적 코드의 퇴화 때문에 상기 (a) 또는 (b)의 DNA와는 상이하고, 상기 (a) 또는 (b)에 의하여 코드되는 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 효소를 코드하는 DNA 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 형질전환되지 않은 대조 식물체에 비하여 증가된 퀴놀레이트 포스로리보실 트랜스퍼라제 발현을 가지는 니코티아나 종의 형질변환 식물체에 있어서,
    상기 형질변환 식물체는 5'에서 3'으로 배향되고, 식물세포에서 기능적인 프로모터와 상기 프로모터와 작동적으로 연관된 식물 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제를 코드하는 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 외인성 DNA 구축체를 포함하는 형질변환 식물 세포를 포함하고,
    형질전환되지 않은 대조 식물체에 비하여 증가된 QPRTase 발현을 보이고, 상기 외인성 DNA는
    (a) 서열 번호 1;
    (b) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 효소를 코드하는 DNA 서열;
    (c) 상기 (a) 또는 (b)의 정제된 DNA와 90% 이상의 유사성이 있고, 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 효소를 코드하는 DNA 서열; 및
    (d) 유전적 코드의 퇴화 때문에 상기 (a) 또는 (b)의 DNA와는 상이하고, 상기 (a) 또는 (b)에 의하여 코드되는 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 효소를 코드하는 DNA 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 형질변환 식물체.
  41. 형질전환되지 않은 대조 식물체에 상대적으로 증가된 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제(QPRTase) 발현을 가지는 니코티아나 종의 형질변환 식물체에 있어서, 상기 형질변환 식물체는 제 40 항에 의한 식물체의 자손인 것을 특징으로 하는 형질변환 식물체.
  42. 식물 세포에서 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 유전자의 발현을 증가시키는 방법에 있어서, 상기 방법은 외인성 DNA를 포함하도록 형질전환된 식물 세포를 성장시키는 단계를 포함하며, 이때 상기 외인성 DNA는 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제를 코딩하고, 상기 외인성 DNA는
    (a) 서열 번호 1;
    (b) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 효소를 코드하는 DNA 서열;
    (c) 상기 (a) 또는 (b)의 정제된 DNA와 90% 이상의 유사성이 있고, 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 효소를 코드하는 DNA 서열; 및
    (d) 유전적 코드의 퇴화 때문에 상기 (a) 또는 (b)의 DNA와는 상이하고, 상기 (a) 또는 (b)에 의하여 코드되는 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 효소를 코드하는 DNA 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 42 항에 있어서, 상기 형질전환 식물 세포가 전사방향으로 배향되고, 상기 식물 세포에서 기능적인 프로모터와 상기 세포에서 기능적인 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제를 코딩하고 상기 프로모터와 작동적으로 연관된 DNA 서열 및 상기 세포에서 기능적인 전사 종결 부위를 포함하는 구축체를 숙주 식물 세포의 게놈내로 통합시켜서, 형질전환된 식물 세포를 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 담배 식물체의 잎에서 증가된 니코틴 함량을 가지는 담배 식물체를 생산하는 방법에 있어서, 상기 방법은 담배 식물체 또는 그의 자손 식물체를 성장시키는 단계를 포함하며, 이때 상기 식물체는 상기 식물체에서 기능적인 전사 개시 부위와 상기 전사 개시 부위에 기능적으로 연결된 외인성 DNA 서열을 포함하는 DNA 구축체를 포함하고, 상기 DNA 서열은 상기 세포에서 기능적인 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제를 코드하고, 상기 DNA는
    (a) 서열 번호 1;
    (b) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 효소를 코드하는 DNA 서열;
    (c) 상기 (a) 또는 (b)의 정제된 DNA와 90% 이상의 유사성이 있고, 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 효소를 코드하는 DNA 서열; 및
    (d) 유전적 코드의 퇴화 때문에 상기 (a) 또는 (b)의 DNA와는 상이하고, 상기 (a) 또는 (b)에 의하여 코드되는 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 효소를 코드하는 DNA 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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