NO324872B1 - DNA konstrukt som koder et enzym for regulering av kinolat fosforibosyl transferase ekspresjon, plantecelle og transgen plante som inneholder konstruktet, isolert peptid som er kodet av konstruktet, fremgangsmate til a fremstille plantecellen, til a redusere/oke ekspresjon av kinolat fosforibosyl transferasegenet og til a fremstille en transgen tobakkplante. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse ble gjort med støtte fra regjeringen under National Science Foundation Grant nr. MCB-9206506. Regjeringen har visse rettigheter til denne oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse angår et DNA konstrukt som koder en plante kinolat fosforibosyl transferase (QPRTase), plantecelle som inneholder konstruktet, transgen plante som inneholder cellen, samt isolert peptid som kodes av konstruktet. Spesielt anår oppfinnelsen anvendelse av DNA-kodende kinolat fosforibosyl transferase til å produsere transgene planteceller og planter som har genetisk forandrede nikotinnivåer, og plantene således produsert.

Produksjonen av tobakk med nedsatte nikotinnivåer er av interesse med tanke på nikotinenes tilvennende natur. I tillegg er tobakksplanter med ekstremt lave nivåer av nikotinproduksjon eller ingen nikotinproduksjon attraktive som resipienter for transgener som uttrykker kommersielt verdifulle produkter såsom farmasøytiske midler, kosmetiske komponenter eller mattilsetninger. Forskjellige prosesser er blitt konstruert for å fjerne nikotin fra tobakk. Flesteparten av disse prosessene fjerner imidlertid andre ingredienser fra tobakken i tillegg til nikotin og påvirker derved tobakken på en ugunstig måte. Klassisk dyrkningsteknikk har produsert tobakksplanter med lavere nivåer av nikotin (tilnærmet 8 %) enn den funnet i vildtype tobakksplanter. Tobakksplanter og tobakk som har enda ytterligere reduksjoner i nikotininnhold er ønskelig.

En tilnærming for å redusere nivået av et biologisk produkt er å redusere mengden av nødvendig enzym i den biosyntetiske ruten som fører til produktet. Der hvor det affiserte enzym naturlig forekommer i en hastighetsbegrensende mengde (relativ til andre enzymer som er nødvendige i ruten) vil enhver reduksjon i tilgjengeligheten av enzymet nedsette produksjonen av endeproduktet. Hvis mengden av enzym ikke normalt er hastighetsbegrensende må nærværet i en celle reduseres til hastighetsbegrensende nivåer for å redusere rutens resultat. I motsatt fall, dersom den naturlig forekommende mengde av enzym er hastighetsbegrensende vil enhver økning av enzymets aktivitet resultere i en økning i den biosyntetiske rutes endeprodukt.

Nikotin blir dannet primært i røttene på tobakksplanten og blir deretter transportert til bladene hvor det lagres (Tso, Physiology and Biochemistry of Tobacco Plants, side 233-34, Dowden, Hutchinson & Ross, Stroudsburg, Pa. (1972)). Et obliga-torisk trinn i nikotin biosyntese er dannelsen av nikotinsyre fra kinolinsyre som er katalysert av enzymet kinolin fosforibosyl transferase ("QPRTase"). QPRTase synes å være et hastighetsbegrensende enzym i ruten som tilfører nikotinsyre for nikotinsyntese i tobakk. Se f.eks. Feth et al., "Regulation in Tobacco Callus of Enzyme Activities of the Nicotine Pathway", Planta, 168, sidene 402-07 (1986); Wagner et al., "The Regulation of Enzyme Activities of the Nicotine Pathway in Tobacco", Physiol. Plant., 68, side 667-72 (1986). Modifikasjon av nikotinnivåer i tobakksplanter ved antisensregulering av putrescin metyl transferase (PMTase) ekspresjon er foreslått i US patent nr. 5 369 023 og 5 260 205 til Nakatani og Malik. PCT-søknad WO 94/28142 til Wahad og Malik beskriver DNA-kodende PMT og anvendelse av sens og antisens PMT-konstruksjoner. M. A. Conkling et al. (Plant Physiology, Vol. 93 (3): 1203-1211, 1990) beskriver isolering av fire rotspesifikk cDNA kloner og deres tilsvarende genomiske kloner fra Nicotiana tobacum. Nukleinsyresekvensene for klonene er imidlertid ikke gjengitt.

Det er derfor en hensikt å tilveiebringe nye tobakksplanter med lave nivåer av nikotinproduksjon. Denne hensikt er oppnådd med foreliggende oppfinnelse kjennetegnet ved det som fremgår av de vedlagte krav.

Den første side av den foreliggende oppfinnelse er et isolert DNA-molekyl som omfatter SEKV. ID nr. 1: DNA-sekvenser som koder et enzym som har SEKV. ID nr. 2; DNA-sekvenser som hybridiseres til slikt DNA og som koder et kinolat fosforibosyl transferaseenzym; og DNA-sekvenser som avviker fra det ovennevnte DNA på grunn av degenerering av den genetiske kode. Et peptid kodet av slikt DNA er en ytterligere side av oppfinnelsen.

En ytterligere side av foreliggende oppfinnelse er en DNA-konstruksjon som omfatter en promoter operativ i en plantecelle og et DNA-segment som koder et kinolat fosforibosyl transferase enzym plassert nedstrøms for promoteren og operativt assosiert derved. DNA som koder enzymet kan være i antisens eller sens retning.

En ytterligere side av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte til å fremstille en transgen plantecelle som har redusert kinolat fosforibosyl transferase (QPRTase) ekspresjon, ved å tilveiebringe en plantecelle av en type kjent for å uttrykke kinolat fosforibosyl transferase; å transformere plantecellen med en eksogen DNA-konstruksjon som omfatter en promoter og DNA som omfatter en del av en sekvens som koder kinolat fosforibosyl transferase mRNA.

En ytterligere side av foreliggende oppfinnelse er en transgen plante av arten Nicotiana som har redusert kinolat fosforibosyl transferase (QPRTase) ekspresjon relativ til en ikke-transformert kontrollplante. Cellene i slike planter omfatter en DNA-konstruksjon som inkluderer et segment av en DNA-sekvens som koder en plante kinolat fosforibosyl transferase mRNA.

En ytterligere side av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte til å redusere ekspresjonen av et kinolat fosforibosyltransferasegen i en plantecelle ved å dyrke en plantecelle transformert til å inneholde eksogent DNA, hvor en transkribert tråd av det eksogene DNA er komplementær til kinolat fosforibosyl transferase mRNA endogen i cellen. Transkripsjon av den komplementære tråd reduserer ekspresjon av det endogene kinolat fosforibosyl genet.

En ytterligere side av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte til å produsere en tobakksplante som har reduserte nivåer av nikotin i bladene på tobakksplanten ved å dyrke en tobakksplante med celler som omfatter en eksogen DNA-sekvens, hvor en transkribert tråd av den eksogene DNA-sekvens er komplementær til endogen kinolat fosforibosyl transferase budbringer RNA i cellene.

En ytterligere side av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte til å produsere en transgen plantecelle som har øket kinolat fosforibosyl transferase (QPRTase) ekspresjon, ved å transformere en plantecelle kjent for å uttrykke kinolat fosforibosyl transferase med en eksogen DNA-konstruksjon som omfatter en DNA-sekvens som koder kinolat fosforibosyl transferase.

En ytterligere side av foreliggende oppfinnelse er en transgen Nicotiana plante som har øket kinolat fosforibosyl transferase (QPRTase) ekspresjon, hvor cellene i den transgene plante omfatter en eksogen DNA-sekvens som koder en plante kinolat fosforibosyl transferase.

En ytterligere side av den foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte til å øke ekspresjonen av et kinolat fosforibosyl transferase gen i en plantecelle, ved å dyrke en plantecelle transformert til å inneholde eksogent DNA som koder for kinolat fosforibosyl transferase.

En ytterligere side av den foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte til å produsere en tobakksplante som har et øket nivå av nikotin i bladene, ved å dyrke en tobakksplante som har celler som inneholder en eksogen DNA-sekvens som koder kinolat fosforibosyl transferase funksjonell i cellene. Fig. 1 viser den biosyntetiske ruten som fører til nikotin. Enzymaktiviteter kjent for å bli regulert av Nicl og Nic2 er QPRTase (kinolat fosforibosyl transferase) og PMTase (putrescin metyl transferase). Fig. 2A tilveiebringer nukleinsyresekvensen til NtQPTl cDNA (SEKV. ID nr. 1) med den kodende sekvens (SEKV. ID nr. 3) vist i store bokstaver. Fig. 2B tilveiebringer den deduserte aminosyresekvens (SEKV. ID nr. 2) til tobakk QPRTase kodet av NtQPTl cDNA. Fig. 3 opplinjerer den deduserte NtQPTl aminosyresekvens og beslektede sekvenser av Rhodospirillum rubrum, Mycobacterium lepre, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, mennesker, og Saccharomyces cerevisiae. Fig. 4 viser resultatet av komplementering av en Escherichia coli mutant som mangler kinolat fosforibosyl transferase (TH265) med NtQPTl cDNA. Celler ble transformert med en ekspresjonsvektor som bærer NtQPTl; dyrking av transformert TH265 celler som uttrykker NtQPTl på minimalt medium som mangler nikotinsyre, viste at NtQPTl koder QPRTase. Fig. 5 sammenligner nikotinnivåer og de relative likevektsnivåer NtQTPl mRNA i Nicl ogNic2 tobakkmutanter; vildtype Burley 21 (Nicl/Nicl Nic2/Nic2); Nicl" Burley 21 (nicl/nicl Nic2/Nic2); Nic2" Burley 21 (Nicl/Nicl nic2/nic2); og Nicl"Nic2" Burley 21 (nicl/nicl nic2/nic2). Fylte søyler angir mRNA transkripsjonsnivåer, skraverte stolper angir nikotinnivåer Fig. 6 kartlegger de relative nivåer av NtQPTl mRNA over tid i toppede tobakk-planter sammenlignet med ikke-toppede kontrollplanter. Fylte søyler angir mRNA-transkripsjonsnivåer; skraverte søyler angir nikotinnivåer.

Nikotin blir produsert i tobakksplanter ved kondensering av nikotinsyre og 4-metylaminobutanal. Den biosyntetiske ruten resulterer i nikotinproduksjon som illustrert i fig. 1. To regulatoriske steder (Nicl og Nic2) virker som ko-dominante regulatorer til nikotinproduksjon. Enzymanalyser av røttene av enkle og doble Nie mutanter viser at aktiviteten til to enzymer, kinolat fosforibosyl transferase (QPRTase) og putrescin metyltransferase (PMTase) er direkte proporsjonal til nivåene av nikotinbiosyntese. En sammenligning av enzymaktivitet i tobakkvev (rot og callus) med forskjellig kapasitet for nikotinsyntese viser at QPRTase aktivitet er strengt korrelert med nikotininnhold (Wagner og Wagner,. Planta 165:532 (1985)). Saunders og Bush (Plant Physiol 64:236 (1979) viste at nivået av QPRTase i røttene til mutanter med lav nikotin er proporsjonal med nikotinnivåene i bladene.

Den foreliggende oppfinnelse omfatter en ny cDNA-sekvens (SEKV. ID nr. 1) som koder en plante kinolat fosforibosyl transferase (QPRTase) i SEKV. ID nr. 2. Idet QPRTase aktivitet er strengt korrelert med nikotininnholdet, resulterer konstruksjon av transgene tobakksplanter, i hvilke QPRTase nivåer er senket i planterøttene (sammenlignet med nivåer hos villtype planter) i planter som har reduserte nivåer av nikotin i bladene. Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer fremgangsmåter og nukleinsyrekonsentrasjoner til å produsere slike transgene planter såvel som slike transgene planter. Slike metoder inkluderer ekspresjon av antisens NtQPTl RNA som senker mengden av QPRTase i tobakksrøtter. Nikotin har i tillegg blitt funnet i ikke-tobakksarter og familier av planter selv om mengden vanligvis er mye lavere enn i N. tabacum.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også sens og antisens rekombinante DNA-molékyler som koder for QPRTase eller QPRTase antisens RNA-molekyler, og vektorer som omfatter de rekombinante DNA-molekyler, såvel som transgene planteceller og planter transformert med DNA-molekylene og vektorene. Transgene tobakksplanter og planter i henhold til oppfinnelsen er kjennetegnet ved lavere eller høyere nikotininnhold enn utransformerte kontrolltobakkceller og planter.

Tobakksplanter med ekstremt lave nivåer av nikotinproduksjon, eller ingen nikotinproduksjon, er attraktive som mottagere for transgener som uttrykker kommersielt verdifulle produkter såsom farmasøytiske midler, kosmetiske forbindelser, eller mattilsettinger. Tobakk er attraktiv som en mottagerplante for et transgen som koder et ønskelig produkt, idet tobakk er lett genetisk konstruert og produserer en meget stor biomasse pr. mål; tobakksplanter med reduserte muligheter for nikotinproduksjon vil følgelig ha flere ressurser tilgjengelig for produksjon av transgene produkter. Fremgangsmåte til å transformere tobakk med transgener som produserer ønskede produkter er kjent på området; enhver egnet teknikk kan utnyttes med tobakksplanter med lavt nikotininnhold i henhold til foreliggende oppfinnelse.

Tobakksplanter i henhold til foreliggende oppfinnelse med redusert QPRTase ekspresjon og reduserte nikotinnivåer vil være ønskelig ved produksjon av tobakks-produktet som har redusert nikotininnhold. Tobakksplanter i henhold til den foreliggende oppfinnelse vil være egnet til anvendelse i ethvert tradisjonelt tobakksprodukt, inkludert men ikke begrenset til pipe-, sigar- og sigarettobakk, og tyggetobakk, og kan være i enhver form inkludert bladtobakk, strimlet tobakk eller skåret tobakk.

Konstruksjonene i henhold til foreliggende oppfinnelse kan også være nyttige til å tilveiebringe transgene planter som har øket QPRTase ekspresjon og øket nikotininnhold i planten. Slike konstruksjoner, metoder som bruker disse konstruksjoner og plantene produsert kan være ønskelig ved produksjon av tobakksprodukter som har endret nikotininnhold, eller i produksjon av planter som har nikotininnhold øket for en insekticid virkning.

De foreliggende oppfinnere har oppdaget at TobRD2 genet (se Conkling et al., Plant Phys. 93, 1203 (1990)) koder for en Nicotiana tabacum QPRTase og tilveiebringer heri cDNA-sekvensen til NtQPTl (tidligere betegnet TobRD2) og aminosyresekvensen til det kodede enzym. Sammenligninger av NtQPTl aminosyresekvens med GenBank database gir begrenset sekvenslikhet til bakterielle proteiner som koder kinolat fosforibosyl transferase (QPRTase) (fig. 3).

Kinolat fosforibosyl transferase er nødvendig for de novo nikotin adenin dinukleotid (NAD) biosyntese i både prokaryoter og eukaryoter. I tobakk er høye nivåer av QPRTase oppdaget i røtter, men ikke i bladene. For å bestemme at NtQPTl kodet for QPRTase benyttet foreliggende oppfinnere Escherichia coli bakteriestamme (TH265), en mutant som mangler kinolat fosforibosyl transferase (nadC"). Denne mutant kan ikke vokse på minimumsmedium som mangler nikotinsyre. Imidlertid ga uttrykk av NtQPTl protein i denne bakterielle stamme NadC<+ >fenotypen (fig. 4), og konfirmerte at NtQPTl koder for QPRTase.

Foreliggende oppfinnere undersøkte virkningen av Nicl og Nic2 mutanter hos tobakk, og virkningen av å toppe tobakksplantene, på NtQPTl likevekt mRNA-nivåer og nikotinnivåer. (Fjerning av apikal dominans ved topping ved begynnelsen av blomstring er velkjent for å resultere i økede nivåer av nikotin biosyntese og transport hos tobakk, og er en standard praksis ved tobakksproduksjon). Hvis NtQPTl faktisk er involvert i nikotin biosyntese skulle det være forventet at (1) NtQPTl mRNA-nivåer ville være lavere i Nicl/Nic2 dobbeltmutanter og (2) NtQPTl mRNA-nivåer ville øke etter topping. NtQPTl mRNA-nivåer i Nicl/Nic2 dobbeltmutanter ble funnet å være ca. 25 % av den til villtypen (fig. 5). Videre, innen seks timer etter topping, øket NtQPTl mRNA-nivåer hos tobakksplanter ca. åtte ganger. Derfor ble NtQPTl bestemt å være et nøkkelregulatorisk gen i den nikotin biosyntetiske rute.

Transgene planteceller og planter

Regulering av genekspresjon i plantecellegenomer kan utføres ved integrasjon av heterologt DNA under den transkripsjonelle kontroll av en promoter som er funksjonell i verten, og i hvilke den transkriberte tråd av heterologe DNA er komplementær til tråden av DNA som blir transkribert fra det endogene genet som skal reguleres. Det introduserte DNA, referert til som antisens DNA, tilveiebringer en RNA-sekvens som er komplementær til det naturlig produserte (endogene) mRNA og som inhiberer ekspresjon av det endogene mRNA. Mekanismen til slik genekspresjonsregulering ved antisens er ikke fullstendig forstått. Mens det ikke er ønskelig å bli holdt ansvarlig for en enkelt teori er det bemerket at en teori for antisensregulering foreslår at transkripsjon av antisens DNA produserer RNA-molekyler som bindes til og forhindrer eller inhiberer transkripsjon av endogene mRNA-molekyler.

I fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse kan antisensproduktet være komplementært til kodende eller ikke-kodende (eller begge) deler av naturlig forekommende mål-RNA. Antisenskonstruksjonen kan innføres i plantecellene på enhver egnet måte og kan integreres inn i plantegenomet for induserbar eller konstitutiv transkripsjon av antisenssekvensen. Se f.eks. US patent nr. 5 453 566 og 5 107 065 Shewmaker et al. (som er inkorporert heri i sin helhet som referanse). Som brukt heri refererer eksogene eller heterologe DNA (eller RNA) til DNA (eller RNA) som har blitt innført i en celle (eller i cellens stamfar) gjennom menneskelig differens. Slikt heterologt DNA kan være en kopi av en sekvens som naturlig finnes i cellen som blir transformert eller fragmenter derav.

For å produsere en tobakksplante som har reduserte QPRTase nivåer, og således lavere nikotininnhold enn en utransformert kontroll tobakksplante, kan en tobakkcelle transformeres med en eksogen QPRT antisens transkripsjonen enhet som omfatter en delvis QPRT cDNA-sekvens, en full lengde QPRT cDNA-sekvens, en delvis QPRT kromosomsekvens, eller en full lengde QPRT kromosomsekvens, i antisensorientering med egnede operativt koblede regulatoriske sekvenser. Egnede regulatoriske sekvenser inkluderer en transkripsjonsinitieringssekvens ("promoter") operativ i planten som blir transformert og en polyadenylering/transkrip-sjonsavslutningssekvens. Standard teknikker, såsom restriksjonskartlegging, Southern blot hybridisering, og nukleotidsekvensanalyse blir deretter brukt til å identifisere klonene som bærer QPRTase sekvensene i antisensorienteringen, operativt koblet til de regulatoriske sekvenser. Tobakksplantene blir deretter regenerert fra vellykkede transformerte celler. Det er mest foretrukket at antisenssekvensen brukt er komplementær til den endogene sekvensen, imidlertid kan mindre variasjoner i de eksogene og endogene sekvenser tolereres. Det er foretrukket at antisens DNA-sekvensen er av tilstrekkelig sekvenslikhet til at den er istand til å bindes til den endogene sekvens i cellen som skal reguleres, under strenge betingelser beskrevet nedenfor.

Antisensteknologi er blitt anvendt i flere laboratorier for å danne transgene planter kjennetegnet ved lavere enn normale mengder av spesifikke enzymer. F.eks. har planter med reduserte nivåer av kalkonsyntase, et enzym i blomstpigmentbiosyntet-iske rute, blitt produsert ved å innskyte et kalkonsyntase antisensgen inn i genomet til tobakk og petunia. Disse transgene tobakks- og petuniaplanter produserer blomster med lysere enn normal farging (Van der Krol et al., "An Anti-Sense Chalcone Synthase Gene in Transgenic Plants Inhibits Flower Pigmentation", Nature, 333, side 866-869 (1988)). Antisens RNA-teknologi er også blitt anvendt til å inhibere produksjon av enzymet polygalakturonase hos tomater (Smith et al., "Antisense RNA Inhibition of Polygalacturonase Gene Expression in Transgenic Tomatoes", Nature, 334, side 724-26 (1988); Sheehy et al., "Reduction of Polygalacturonase Activity in Tomato Fruit by Antisense RNA", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 85, side 8805-09 (1988), og den lille underenhet av enzymet ribulose bifosfat karboksylase i tobakk (Rodermel et al., "Nuclear-Organelle Interactions: Nuclear Antisense Gene Inhibits Ribulose Bisphosphate Carbozylase Enzyme Levels in Transformed Tobacco Plants", Cell, 55, side 673-81 (1988). Alternativt kan transgene planter kjennetegnes ved større enn normale mengder av et gitt enzym skapes ved å transformere plantene med genet for det enzym i sens (dvs. normal) orientering. Nivåer av nikotin hos de transgene tobakksplanter i henhold til foreliggende oppfinnelse kan detekteres ved standard nikotinassayer. Transformerte planter, i hvilke nivpet av QPRTase er redusert sammenlignet med utransformerte kontrollplanter vil følgelig ha et redusert nikotinnivå sammenlignet med kontrollen; transformerte planter i hvilke nivået av QPRTase er øket sammenlignet med utransformerte kontrollplanter vil følgelig ha et øket nikotinnivå sammenlignet med kontrollen.

Den heterologe sekvens brukt i antisensmetodene i foreliggende oppfinnelse kan velges slik at de produserer et RNA-produkt komplementært til hele QPRTase mRNA-sekvensen eller til en del derav. Sekvensen kan være komplementær til hver tilstøtende sekvens av den naturlige budbringer RNA, dvs. den kan være komplementær til den endogene mRNA-sekvens proksimal til 5'-avslutningen eller tildekning (capping) setet, nedstrøms for tildekkingssetet, mellom tildekkingssetet og initieringskodonet og kan dekke alle eller bare en del av den ikke-kodende region, kan være brodannende med en ikke-kodende og kodende region, være komplementær til hele eller del av den kodede region, komplementær til 3'-avslutningen av den kodende region, eller komplementær til 3'-utranslaterte region i mRNA. Egnede antisenssekvenser kan være fra minst ca. 13 til ca. 15 nukleotider, minst ca. 16 til ca. 21 nukleotider, minst ca. 20 nukleotider, minst ca. 30 nukleotider, minst ca. 50 nukleotider, minst ca. 75 nukleotider, minst ca. 100 nukleotider, minst ca. 125 nukleotider, minst ca. 150 nukleotider, minst ca. 200 nukleotider eller mer. I tillegg kan sekvensene være forlenget eller forkortet på 3'-eller 5'-endene derav.

Den spesielle antisenssekvens og lengden av antisenssekvensen vil variere avhengig av graden av inhibisjon som er ønsket, stabiliteten av antisenssekvensen og lignende. En person med kunnskap på området vil være veiledet i utvalg av egnede QPRTase antisenssekvenser ved å bruke teknikker som er tilgjengelig på området og informasjon tilveiebragt heri. Med referanse til fig. 2A og SEKV. ID nr. 1 heri, kan et oligonukleotid i henhold til oppfinnelsen være et kontinuerlig fragment av QPRTase cDNA-sekvensen i antisensorientering, av enhver lengde som er egnet til å oppnå de ønskede virkninger når de transformeres inn i en mottaker-plantecelle.

Den foreliggende oppfinnelse kan også anvendes i fremgangsmåter til sens sam-suppresjon av nikotinproduksjon. Sens DNA anvendt til å utføre den foreliggende oppfinnelse er av en lengde tilstrekkelig til, når det uttrykkes i en plantecelle, å undertrykke den naturlige ekspresjon av plante QPRTase protein som beskrevet heri i den plantecellen. Slik sens DNA kan være essensielt en fullstendig genomisk eller komplementær DNA som koder QPRTase enzymet, eller et fragment derav, hvor slike fragmenter typisk er minst 15 nukleotider i lengde. Metoder for å sikre at lengden av sens DNA som resulterer i undertrykkelse av ekspresjon av et naturlig gen i en celle er tilgjengelig for de med kunnskap på området.

I en alternativ utforming av foreliggende oppfinnelse blir Nicotiana plantecelle transformert med en DNA-konstruksjon som inneholder et DNA-segment som koder et enzymatisk RNA-molekyl (dvs. et "ribozym"), som enzymatisk RNA-molekyl er rettet mot (dvs. kløyver) mRNA-transkriptet til den DNA-kodende plante QPRTase som beskrevet heri. Ribozymer inneholdende substratbindende domener som bindes til tilgangsmulige regioner i mål mRNA og domener som katalyserer spalting av RNA, forhindrer translasjon og proteinproduksjon. Bindingsdomenene kan omfatte antisenssekvenser komplementære til mål mRNA-sekvensen: det katalytiske motiv kan være et "hammerhead" motiv eller andre motiver, såsom hårnålsmotivet. Ribozymspaltesteder i RNA-målet kan initielt identifiseres ved å scanne målmolekylet for ribozymspaltingssteder (f.eks. GUA, GUU eller GUC sekvenser). Når de er identifisert, kan korte RNA-sekvenser på 15, 20, 30 eller flere ribonukleotider som tilsvarer regionen i målgenet som inneholder spaltingssetet evalueres for forutbestemte strukturelle trekk. Egnetheten av mål-kandidater kan også evalueres ved å teste deres tilgjengelighet for hybridisering med komplementære oligonukleotider, ved å bruke ribonukleasebeskyttelsesassayer som er kjent på området. DNA-kodende enzymatiske RNA-molekyl er kan frem-stilles i henhold til kjent teknikk. Se f.eks. T. Cech et al., US patent nr. 4 987 071; Keene et al., US patent nr. 5 559 021; Donson et al., US patent nr. 5 589 367; Torrence et al., US patent nr. 5 583 032; Joyce, US patent nr. 5 580 967; Gold et al., US patent nr. 5 595 877; Wagner et al., US patent nr. 5 591 601; og US patent nr. 5 622 854 (hvis beskrivelser er inkorporert heri som referanse i sin helhet). Produksjon av et slikt enzymatisk RNA-molekyl i en plantecelle og avbrytelse av QPRTase proteinproduksjonen reduserer QPRTase aktivitet i plantecellene på essensielt den samme måte som produksjon av et antisens RNA-molekyl: dvs. ved å avbryte translasjon av mRNA i cellen som produserer enzymet. Betegnelsen "ribozym" er brukt heri for å beskrive en RNA-inneholdende nukleinsyre som funksjonerer som et enzym (såsom en endoribonuklease) og som kan anvendes om hverandre med "enzymatisk RNA-molekyl". Den foreliggende oppfinnelse inkluderer videre DNA som koder ribozymer, DNA som koder ribozymer som har blitt innskutt i en ekspresjonsvektor, vertceller som inneholder slike vektorer og fremgangsmåte til å redusere QPRTase produksjon i planter som benytter ribozymer.

Nukleinsyresekvense anvendt for å utføre foreliggende oppfinnelse inkluderer de med sekvenslikhet til SEKV. ID nr. 1, og som koder et protein som har kinolat fosforibosyl transferaseaktivitet. Denne definisjon er ment å omfatte naturlige alleliske variasjoner i QPRTase proteiner. Således DNA-sekvenser som hybridiseres til DNA med SEKV. ID nr. 1 og koder for ekspresjon av QPRTase, spesielt plante QPRTase enzymer, kan også anvendes til å utføre foreliggende oppfinnelse.

Flertallsformer av tobakks QPRT-enzym kan eksistere. Flertallsformer av et enzym kan skyldes post-translasjonelle modifikasjoner av et enkelt genprodukt eller også et flertall former av NtQPTl genet.

Betingelser som tillater andre DNA-sekvenser som koder for ekspresjon av et protein som har QPRTase aktivitet til å hybridiseres til DNA med sekvens-identifikasjon nr. 1, eller til andre DNA-sekvenser som koder proteinet gitt som SEKV. ID nr. 2 kan bestemmes ved rutineteknikk. F.eks. kan hybridisering av slike sekvenser utføres under betingelser med redusert strenghet eller til og med strenge betingelser (f.eks. betingelser representert av en vaskestringens på 0,3 M NaCl, 0,03 M natriumcitrat, 0,1 % SDS ved 60°C eller til og med 70°C til DNA som koder proteinet gitt som SEKV. ID nr. 2 heri på en standard in situ hybridiserings-assay. Se J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2. utgave 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory)). Generelt vil slike sekvenser være minst 65 % like, 75 % like, 80 % like, 85 % like, 90 % like, eller til og med 95 % like, eller mer, med sekvensen gitt heri som SEKV. ID nr. 1, eller DNA-sekvenser som koder proteiner med sekvens SEKV. ID nr. 2. (Bestemmelser av sekvenslikhet blir gjort med de to sekvensene opplinjert for maksimal tilpasning; gap i en av de to sekvensene som blir tillasset blir tillatt ved å maksimere tilpasningen. Gaplengder på 10 eller mindre er foretrukket, gaplengder på 5 eller mindre er mer foretrukket, og gaplengder på 2 eller mindre er mest foretrukket).

Differensialhybridiseringsprosedyrer er tilgjengelig som tillater isolering av cDNA-kloner hvis mRNA-nivåer er så lave som ca. 0,05 % av poly(A<+>)RNA. Se M. Conkling et al., Plant Physiol. 93, 1203-1211 (1990). I korthet blir cDNA-bibliotek screenet ved å bruke enkeltrådet cDNA-prober fra revers transkribert mRNA fra plantevev (f.eks. røtter og/eller blad). For differensiell screening blir en nitrocellulose- eller nylonmembran nedsenket i 5xSSC, plassert i en 96-brønners sugemanifold, 150 ul av stasjonær natten over kultur overført fra en stamplate til hver brønn, og vakuum påført inntil all væske har passert gjennom filteret. 150 (il av denaturerende oppløsning (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl) blir plassert i hver brønn ved å bruke en flerpipetteringsanordning og tillatt å være der ca. 3 min. Sug blir anvendt som ovenfor og filtre fjernet og nøytralisert i 0,5 M Tris-HCl (pH-verdi 8,0), 1,5 M NaCl. Den blir deretter bakt 2 timer i vakuum og inkubert med de relevante prober. Ved å bruke nylonmembranfiltre og å holde stamplaten lagret ved -70°C i 7 % DMSO kan filtrene screenes flere ganger med et flertall av prober og egnede kloner som kan gjenvinnes etter flere års lagring.

Som brukt heri refererer betegnelsen "gen" seg til en DNA-sekvens som inkorporerer (1) oppstrøms (5') regulatoriske signaler inkludert promotoren, (2) en kodende region som spesifiserer produktet, protein eller RNA til genet, (3) ned-strøms (3') regioner som inkluderer transkripsjonsavslutning og polyadenylerings-signaler og (4) assosierte sekvenser nødvendig for effektiv og spesifikk ekspresjon.

DNA-sekvensen i henhold til foreliggende oppfinnelse kan bestå spesielt av sekvensen tilveiebragt heri (SEKV. ID nr. 1) eller ekvivalente nukleotidsekvenser som representerer alleler eller polymorfe varianter av disse gener, eller kodende regioner derav.

Bruk av frasen "hovedsakelig sekvenslikhet" i foreliggende beskrivelse og krav betyr at DNA, RNA eller aminosyresekvenser som har liten sekvensvariasjon eller sekvensvariasjon uten konsekvenser i forhold til de aktuelle beskrevne sekvenser og krevde sekvenser heri vurderes å være ekvivalente til sekvensene i henhold til foreliggende oppfinnelse. I denne forbindelse betyr "liten sekvensvariasjon" eller

"sekvensvariasjon uten konsekvenser" at "liknende" sekvenser (dvs. sekvenser som har hovedsakelig sekvenslikhet med DNA, RNA eller proteiner beskrevet og krevd heri) vil være funksjonelt ekvivalente til sekvensene beskrevet og krevd i den foreliggende oppfinnelse. Funksjonelt ekvivalente sekvenser vil funksjonere hovedsakelig på samme måte for å fremstille hovedsakelig de samme sammensetninger som nukleinsyrer- og aminosyresammensetninger beskrevet og krevd heri.

DNA-sekvenser tilveiebragt heri kan transformeres i et utvalg av vertceller. Et utvalg av egnede vertceller som har ønskede vekst- og behandlingsegenskaper er lett tilgjengelig på området.

Bruk av betegnelsen "isolert" eller "hovedsakelig ren" i den foreliggende beskrivelse og krav som et modifiserende middel for DNA, RNA, polypeptider eller proteiner betyr at de slik konstruerte DNA, RNA, polypeptider eller proteiner er blitt adskilt fra deres in vivo cellulære omgivelser gjennom menneskelige handlinger.

Som brukt heri, en "nativ DNA-sekvens" eller "naturlig DNA-sekvens" betyr at en DNA-sekvens som kan isoleres fra ikke-transgene celler eller vev. Native DNA-sekvenser er de som ikke er blitt kunstig forandret, såsom ved setestyrt mutagenese. Når native DNA-sekvenser er identifisert, kan DNA-molekyler som har native DNA-sekvenser bli kjemisk syntetiserte eller produsert ved å bruke rekombinante DNA-prosedyrer som er kjent på området. Som brukt heri er en nativ plante DNA-sekvens den som kan isoleres fra ikke-transgene planteceller eller vev. Som brukt heri er en nativ tobakks DNA-sekvens den som kan isoleres fra ikke-transgene tobakkceller eller vev.

DNA-konstruksjoner eller "transkripsjonskassetter" i henhold til foreliggende oppfinnelse inkluderer 5' til 3' i transkripsjonsretningen, en promoter som diskutert heri, en DNA-sekvens som diskutert heri operativt assosiert med promotoren, og, eventuelt en avslutningssekvens som inkluderer stoppsignal for RNA-polymerase og et polyadenyleringssignal for polyadenylase. Alle disse regulatoriske regioner skulle være istand til å operere i cellene til vevet som skal transformeres. Ethvert egnet avslutningssignal kan anvendes til å utføre foreliggende oppfinnelse, eksempler derav inkluderer men er ikke begrenset til nopalinsyntase (nos) terminator, oktapinsyntase (oes) terminator, CaMV-terminatoren, eller native termineringssignaler avledet fra det samme gen som den transkripsjonene initieringsregion eller avledet fra et annet gen. Se f.eks. Rezian et al. (1988) supra, og Rodermel et al. (1988), supra.

Betegnelsen "operativt assosiert" som brukt heri, refererer seg til DNA-sekvenser på et enkelt DNA-molekyl som er assosiert slik at funksjonen til den ene blir påvirket av den andre. Således er en promoter operativt aassosiert med et DNA når det er istand til å påvirke transkripsjonen av det DNA, dvs. DNA er under transkripsjonen kontroll av promotoren). Promoteren er sagt å være "oppstrøms" for DNA, som i sin tur er sagt å være "nedstrøms" for promotoren.

Transkripsjonskassetten kan tilveiebringes i en DNA-konstruksjon som også har minst ett replikasjonssystem. For anvendelighet er det vanlig å ha et replikasjonssystem som er funksjonelt i Escherichia coli, såsom ColEl, pSClOl, pACYC184, eller lignende. På denne måte kan på hvert trinn etter hver manipulering den resulterende konstruksjon klones, sekvensert og korrektheten av manipuleringen bli bestemt. I tillegg, eller istedenfor E. coli replikasjonssystem, kan et replikasjonssystem basert på et bredt område av verter anvendes, såsom replikasjonssystemene til P-l inkompabilitetsplasmider, f.eks. pRK290.1 tillegg til replikasjons systemet vil det ofte være minst én markør tilstede som kan være nyttig i én eller flere verter, eller forskjellige markører for individuelle verter. Det vil si én markør kan anvendes for seleksjon i en prokaryotisk vert, mens en annen markør kan anvendes for seleksjon i en eukaryotisk vert, spesielt i plantevert. Markørene kan være beskyttelse mot et biocid, såsom antibiotika, toksiner, tungmetaller, eller lignende; kan tilveiebringe kompiementering, ved å gi protrofi til en euksotropisk vert; eller kan tilveiebringe en synlig fenotyp gjennom produksjon av en ny forbindelse i planten.

De forskjellige fragmenter som omfatter de forskjellige konstruksjoner, transkripsjonskassetter, markører og lignende kan introduseres etter hverandre ved restriksjonsenzymspalting av et egnet replikasjonssystem, og innskudd av den spesielle konstruksjon eller fragment i det tilgjengelige setet. Etter legering og kloning kan DNA-koiistruksjonen isoleres for videre manipulering. Alle disse teknikkene er i stor grad eksemplifisert i litteraturen som eksemplifisert av J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2. utgave, 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory).

Vektorer som kan brukes til å transformere plantevev med nukleinsyrekonstruk-sjoner i henhold til foreliggende oppfinnelse inkluderer både Agrobacterium vektorer og ballistiske vektorer, såvel som vektorer egnet for DNA-mediert transformering.

Betegnelsen "promoter" refererer seg til en region av DNA-sekvensen som inkorporerer de nødvendige signaler for effektiv ekspresjon av en kodende sekvens. Dette kan inkludere sekvenser som en RNA-polymerase bindes til, men er ikke begrenset til slike sekvenser og kan inkludere regioner til hvilke andre regulatoriske proteiner bindes sammen med regioner involvert i kontroll av proteintranslasjon og kan inkludere kodende sekvenser.

Promotorer anvendt til å utføre den foreliggende oppfinnelse kan være konstitutive aktive promotorer. Tallrike konstitutive aktive promotorer som er operative i planter er tilgjengelig. Et foretrukket eksempel er blomkål mosaikkvirus (CaMV) 35S promoter som blir uttrykt konstitutivt i de fleste plantevev. Alternativt kan promoteren være en rotspesifikk promoter eller rot cortex spesifikk promoter, som forklart i større detalj nedenfor.

Antisenssekvenser er blitt uttrykt i transgene tobakksplanter ved å bruke blomkål mosaikkvirus (CaMV) 35S promoteren. Se f.eks. Cornelissen et al., "Both RNA Level and Translation Efficiency are Reduced by Anti-sense RNA in Transgenic Tobacco", Nucleic Acids Res. 17, side 833-43 (1989); Rezaian et al., "Anti-Sense RNAs of Cucumber Mosaic Virus in Transgenic Plants Assessed for Control of the Virus", Plant Molecular Biology 11, side 463-71 (1988); Rodermel et al., "Nuclear-Organelle Interactions: Nuclear Antisense Gene Inhibits Ribulose Bisphosphate Carboxylase Enzyme Levels in Transformed Tobacco Plants", Cell 55, side 673-81

(1988); Smith et al., "Antisense RNA Inhibition of Polygalacturonase Gene Expression in Transgenic Tomatoes", Nature 334, side 724-26 (1988); Van der Krol et al., "An Anti-Sense Chalcone Synthase Gene in Transgenic Plants Inhibits Flower Pigmentation", Nature 333, side 866-69 (1988).

Anvendelse av CaMV 35S promoteren for ekspresjon av QPRTase i de transformerte tobakkceller og planter i henhold til foreliggende oppfinnelse er foretrukket. Anvendelse av CaMV-promoter for ekspresjon av andre rekombinante gener i tobakksrøtter er blitt vel beskrevet (Lam et al., "Site-Specific Mutations Alter In Vitro Factor Binding and Change Promoter Expression Pattern in Transgenic Plants", Proe. Nat. Acad. Sei. USA 86, side 7890-94 (1989); Poulsen et al. "Dissection of 5' Upstream Sequences for Selective Expression of the Nicotiana plumbaginifolia rbcS-8B Gene", Mol. Gen. Genet. 214, side 16-34 (1988)).

Andre promotere som er aktive bare i rotvev (rotspesifikke promotere) er også egnet for metodene av den foreliggende oppfinnelse. Se f.eks. US patent nr. 5 459 252 til Conkling et al.; Yamamoto et al., The Plant Cell, 3:371 (1991). TobRD2 rot-cortex spesifikk promoter kan også benyttes. Se f.eks. US patentsøknad SN 08/508,786, nå akseptert (Conkling et al.) PCT WO 9705261. Alle patenter sitert heri er ment å bli inkorporert som referanse i sin helhet.

QPRTase rekombinante DNA-molekyler og vektorer brukt til å produsere de

transformerte tobakkcellene og plantene i henhold til foreliggende oppfinnelse kan videre omfatte et dominant selekterbart markørgen. Egnede dominante selekterbare markører for anvendelse i tobakk inkluderer blant annet antibiotiske resistensgener som koder for neomycin fosfotransferase (NPTII), hydromycin fosfotransferase (HPT), og kloramfenikol acetyltransferase (CAT). En annen velkjent dominant selekterbar markør egnet for anvendelse i tobakk er et mutant dihydrofolat-reduktasegen som koder metotreksat-resistent dihydrofolatreduktase. DNA-vektorer som inneholder egnede antibiotiske resistensgener og de korresponderende antibiotiske midler er kommersielt tilgjengelige.

Transformerte tobakksceller blir utvalgt av den omgivende populasjon av ikke-transformerte celler ved å plassere den blande populasjonen av celler i et kulturmedium som inneholder en egnet konsentrasjon av det antibiotiske middel (eller annen forbindelse normalt toksisk for tobakkceller) mot hvilke det valgte dominante selekterbare markørgenprodukt gir resistens. Således vil bare de tobakkceller som er blitt transformert overleve og formere seg.

Fremgangsmåter til å fremstille rekombinante planter i henhold til foreliggende oppfinnelse omfatter generelt først å tilveiebringe en plantecelle som er istand til regenerering (den plantecellen er typisk i et vev som er istand til regenerasjon). Plantecellen blir deretter transformert med en DNA-konstruksjon som omfatter en transkripsjonskassett i henhold til foreliggende oppfinnelse (som beskrevet heri) og en rekombinant plante blir gjendannet fra den transformerte plantecelle. Som forklart nedenfor blir transformasjonstrinnet utført ved teknikker som er kjent på området, inkludert men ikke begrenset til å bombardere plantecellen med mikropartikler som bærer transkripsjonskassetten, infiserer cellen med en Agrobacterium tumefaciens som inneholder en Ti plasmid som bærer transkripsjonskassetten, eller enhver annen teknikk som er egnet for produksjon av en transgen plante.

Tallrike Agrobacterium vektorsystemer nyttige til å utføre den foreliggende oppfinnelse er kjent. F.eks. US patent nr. 4 459 355 beskriver en fremgangsmåte til å transformere mottagelige planter, inkludert dikoter, med en Agrobacterium-stamme som inneholder Ti plasmidet. Transformeringen av treplanter med en Agrobacteriumvektor er beskrevet i US patent nr. 4 795 855. Videre beskriver US patent nr. 4 940 838 (Schilperoort et al.) en binær Agrobacteriumvektor (dvs. én i hvilke Agrobacterium inneholder et plasmid som har vir regionen til et Ti plasmid men ingen T region, og et annet plasmid som har en T region men ingen vir region) som er nyttig til å utføre den foreliggende oppfinnelse.

Mikropartikler som bærer en DNA-konstruksjon i henhold til foreliggende oppfinnelse, hvor mikropartiklene er egnet for ballistisk transformering av en plantecelle, er også nyttig til å fremstille transformerte planter i henhold til foreliggende oppfinnelse. Mikropartiklene blir drevet inn i en plantecelle for å fremstille en transformert plantecelle, og en plante blir regenerert fra den transformerte plantecelle. Enhver egnet ballistisk celletransformeringsmetode og apparat kan brukes til å praktisere den foreliggende oppfinnelse. Eksempel på apparater og fremgangsmåter er beskrevet i Sanford og Wolf, US patent nr. 4 945 050 og i Christou et al., US patent nr. 5 015 580. Når det brukes ballistiske transformeringsprosedyrer kan transkripsjonskassetten inkorporeres i et plasmid som er istand til å replikere i eller integrere inn i cellen som skal transformeres. Eksempler på mikropartikler egnet for anvendelse i slike systemer inkluderer 1 -5 um gullkuler. DNA-konstruksjonen kan deponeres på mikropartikkelen ved enhver egnet teknikk, såsom ved utfelling.

Plantearter kan transformeres med DNA-konstruksjonen i henhold til foreliggende oppfinnelse ved DNA-mediert transformasjon av plantecelleprotoplaster og påfølgende regenerasjon av planten fra de transformerte protoplaster i henhold til prosedyrer som er velkjent på området. Fusjon av tobakksprotoplaster med DNA-holdige liposomer eller via elektroporering er kjent på området (Shillito et al., "Direct Gene Transfer to Protbplasts of Dicotyledonous and Monocotyledonous Plants by aNumber of Methods, Including Electroporation", Methods in Enzymology 153, side 313-36 (1987)).

Som brukt heri refererer transformering seg til introduksjon av eksogent DNA i celler, slik at det produseres transgene celler som er stabilt transformert med det eksogene DNA.

Transformerte celler blir indusert til å regenerere intakte tobakksplanter gjennom applikasjon av tobakkcelle- og vevskulturteknikker som er velkjent på området. Fremgangsmåten til planteregenerasjon er valgt slik at den er kompatibel med transformasjonsmetoden. Det stabile nærvær og orientering av QPRTase sekvensen i transgene tobakksplanter kan verifiseres ved Mendelisk arv av QPRTase sekvensen, som klargjort ved standard metoder til DNA-analyse anvendt på etter-kommer fra kontrollerte kryssinger. Etter regenerasjon av transgene tobakksplanter fra transformerte celler blir den introduserte DNA-sekvens lett overført til andre tobakksvarieteter gjennom konvensjonell plantepraksis og uten unødvendig eksperimentering.

For eksempel for å analysere segregering av transgenet, kan regenererte transformerte planter (Ro) dyrkes til modenhet, testet for nikotinnivåer og selvbefruktet (selfed) til å produsere Ri planter. En prosentandel av Ri planter som bærer transgenet er homozygot for transgenet. For å identifiserte homozygote Ri planter blir transgene Ri planter dyrket til modenhet og selvbefruktet. Homozygote Ri planter vil produsere R2 avkom hvor hver avkomsplante bærer transgenet; avkom fra heterozygote Ri planter vil segregere 3:1.

Nikotin tjener som et naturlig pesticid som hjelper til å beskytte tobakksplanten fra skade ved skadedyr. Det er derfor ønskelig i tillegg å transformere planter uten nikotin eller med lavt nikotinnivå fremstilt ved den foreliggende fremgangsmåte med et transgen (såsom Bacillus thuringiensis) som vil gi ytterligere innsektbeskyttelse.

En foretrukket plante til anvendelse i de foreliggende metoder er arter av Nicotiana, eller tobakk, inkludert N. tabacum, N. rustica og N. glutinosa. Enhver stamme eller varietet av tobakk kan anvendes. Foretrukket er stammene som allerede har et lavt nikotininnhold, såsom Nicl/Nic2 dobbeltmutanter.

Ethvert plantevev som er istand til påfølgende klonutbredelse, enten ved organogenese eller embryogenese, kan transformeres med en vektor i henhold til foreliggende oppfinnelse. Betegnelsen "organogenese" som brukt heri betyr en prosess ved hvilken skudd og røtter blir utviklet sekvensielt fra meristematiske sentra; betegnelsen "embryogenese" som brukt heri betyr en prosess med hvilke skudd og røtter utvikles sammen på en styrt måte (ikke sekvensiell), enten fra somatiske celler eller gameter. Det spesielle vev som velges vil variere avhengig av det tilgjengelige klonale utbredelsessystem, og som passer best til de spesielle artene som transformeres. Eksempler på målvev inkluderer bladskiver, pollen, embryo, cotyledon, hypocotyl, callusvev, eksisterende merismatisk vev (f.eks. apikale meristemer, hjelpeknopper, og rotmeristemer), og indusert meristematisk vev (f.eks. cotyledon meristem og hypocotyl meristem).

Planter i henhold til foreliggende oppfinnelse kan ha et utall av former. Plantene kan være kimere fra transformerte celler og ikke-transformerte celler; plantene kan være klonale transformeringer (f.eks. alle celler transformert for å inneholde transkripsjonskassetten); plantene kan omfatte podinger av transformerte og utransformerte vev (f.eks. en transformert rotstokk podet med en utransformert avlegger hos citrusarter). De transformerte planter kan utvikles ved et utvalg av midler, såsom klonutvikling eller klassisk avlingsteknikk. F.eks. kan første generasjon (eller Tl) transformerte planter selvbefruktes for å gi en homozygot annen generasjon (eller T2) transformerte planter, og T2 plantene kan ytterligere utvikles gjennom klassiske avlingsteknikker. En dominant selekterbar markør (såsom nptll) kan assosieres med transkripsjonskassetten for å hjelpe til i avlingen.

I lys av det foregående vil det være klart at planter som kan anvendes til å praktisere foreliggende oppfinnelse inkluderer de av slekten Nicotiana.

De som er familiære med rekombinante DNA-metoder beskrevet ovenfor vil gjenkjenne at man kan anvende et full lengde QPRTase cDNA-molekyl eller et full lengde QPRTase kromosomalt gen, sammenføyd i sensorientering, med egnede operativt koblede regulatoriske sekvenser for å konstruere transgene tobakkceller og planter.

De med kunnskap på området vil også anerkjenne at egnede regulatoriske sekvenser for ekspresjon av gener i sensorienteringen inkluderer enhver av de kjente eukaryote translasjonsstartsekvenser, i tillegg til promoter- og polyadenylerings/transkripsjonsavslutningssekvenser beskrevet ovenfor). Slike transformerte tobakksplanter blir kjennetegnet av økte nivåer av QPRTase og således ved høyere nikotininnhold enn utransformerte kontrolltobakksplanter.

Det skal forstås derfor at anvendelse av QPRTase DNA-sekvenser til å redusere eller øke nivåer av QPRT enzym og derved minske eller øke nikotininnholdet i tobakksplantene faller innenfor idéen til den foreliggende oppfinnelse.

Som brukt heri, omfatter en avling et flertall av planter i henhold til foreliggende oppfinnelse og av samme slekt plantet sammen i et dyrkingsfelt. Ved «dyrkingsfelt» menes en felles jordflekk eller et drivhus. Således tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte til å produsere en avling av planter som har forandret QPTRase aktivitet og således har øket eller minsket nikotinnivåene, sammenlignet med en lignende avling av ikke-transformerte planter av samme art og varietet.

Eksemplene som følger er fremsatt for å illustrere den foreliggende oppfinnelse.

EKSEMPEL 1

Isolering og sekvensering

TobRD2 cDNA (Conkling et al., Plant Phys. 93, 1203 (1990)) ble sekvensert og er tilveiebragt heri som SEKV. ID nr. 1 og den deduserte aminosyresekvens er SEKV. ID nr. 2. Den deduserte aminosyresekvens ble prediktert å være et cytosolisk protein. Skjønt plante QPRTase gener ikke har blitt rapportert, ga sammenligninger av NtPTl aminosyresekvens med GenBank database (fig. 3) begrenset sekvenslikhet til visse bakterielle og andre proteiner; kinolat fosforibosyl transferase

(QPRTase) aktivitet er blitt demonstrert for S. typhimurium, E. coli og N. tabacum gener. NtQPTl kodet QPRTase har likhet til det deduserte peptidfragment kodet ved en Axabidopsis EST (ekspresjons sekvensmerke) sekvens (Genbank aksessjonsnummer F20096), som kan representere del av et Arabidopsis QPTase gen.

EKSEMPEL 2

In- situ hybridiseringer

For å bestemme den romlige distribusjon av TobRD2 mRNA transkripter i forskjellig vev i roten, ble in situ hybridiseringer utført i utransformerte planter. In situ hybridiseringer av antisenstråd til TobRD2 til TobRD2 mRNA i rotvev ble gjort ved å bruke teknikker som beskrevet i Meyerowitz, Plant Mol. Biol. Rep. 5,242 (1987) og Smith et al., Plant Mol. Biol. Rep. 5,237 (1987). Syv dager gamle tobakk (Nicotina tabacum) kimplanterøtter ble fiksert i fosfatbufret glutaraldehyd, innstøpt i Paraplast Plus (Monoject Inc., St. Louis, MO) og snittet med 8 mm tykkelse for å observere transverselle såvel som longitudinelle snitt. Antisens TobRD2 transkripter, syntetisert in vitro i nærvær av 35S-ATP, ble brukt som prober. Det merkede RNA ble hydrolysert ved alkalisk behandling for å gi 100-200 base massegjennomsnittslengde før anvendelse.

Hybridiseringen ble gjort i 50 % formamid i 16 timer ved 42°C, med ca. 5 x IO<6 >tellinger pr. min. (cpm) merket RNA pr. ml hybridiseringsoppløsning. Etter eksponeringen ble glassene fremkalt og visualisert under lys- og mørke-felt mikroskopi.

Hybridiseringssignalet var lokaliesrt til det kortikale lag av cellene i røttene (resultater ikke vist). Sammenligning av både lys- og mørkefeltsbilder av de samme snittene lokaliserte TobRD2 transkripter til de parenchymatiske celler i rotkortex. Intet hybridiseringssignal var synlig i epidermis eller sentralsylinderen.

EKSEMPEL 3

TobRD2 mRNA nivåer i Nicl og Nic2 tobakksmutanter og korrelasjon til nikotinnivåer

TobRD2 mRNA likevektsnivåer ble undersøkt i Nicl og Nic2 mutante tobakksplanter. Nicl og Nic2 er kjent for å regulere kinolat fosforibosyl transferaseaktivitet og putrescens metyltransferaseaktivitet, og er ko-dominante regulatorer for nikotinproduksjon. De foreliggende resultater er illustrert i fig. 5A og 5B og viser at TobRB2 ekspresjon blir regulert av Nicl og Nic2.

RNA ble isolert fra røttene til villtype Burley 21 tobakksplanter (Nicl/Nicl Nic2/Nic2); røtter fra Nicl- Burley 21 (nicl/nicl Nic2/Nic2); røtter av Nic2-Burley 21 (Nicl/Nicl nic2/nic2); og røtter av Nicl- Nic2- Burley 21 (nicl/nicl nic2/nic2). Fire Burley 21 tobakkslinjer (nie) ble dyrke fra frø i jord i én måned og overført til hydropone kamre i luftet næringsoppløsning i et drivhus i én måned. Disse linjene var isogene bortsett fra de to lavnikotinlokaliseringer, og hadde genotypene Nicl /Nicl Nic2/Nic2, Nicl/Nicl nic2/nic2, nicl/nicl Nic2/Nic2, nicl/nicl nic2/nic2. Røtter ble høstet fra ca. 20 planter i hver genotyp og samlet for RNA-isolering. Totalt RNA (1 ug) fra hver genotyp ble elektroforert gjennom en 1 % agarosegel som inneholder 1,1 M formaldehyd og overført til en nylonmembran i henhold til Sambrook et al. (1989). Membranene ble hybridisert med <32>P-merket TobRD2 cDNA-fragmenter. Relativ intensitet til TobRD2 transkripter ble målt ved densitometri. Fig. 5 (fylte søyler) illustrerer de relative transkripsjonsnivåer (sammenlignet med Nicl/Nicl Nic2/Nic2) for hver av de fire genotypene. Det relative nikotininnhold (sammenlignet med Nicl /Nicl Nic2/Nic2) i de fire genotyper er vist ved de skraverte søyler.

Fig. 5 sammenligner grafisk det relative likevektsnivå av TobRD2 mRNA, ved å bruke nivået funnet i villtype Burley 21 (Nicl/Nicl Nic2/Nic2) som referanse-mengde. TobRD2 mRNA-nivåer i Nicl/Nic2 dobbeltmutanter var ca. 25 % av det til villtype tobakk. Fig. 5B sammenligner videre de relative nivåer av nikotin i nære isogene linjer av tobakk studert i dette eksempel (fylte søyler angir TobRD2 transkripsjonsnivå; skraverte søyler indikerer nikotinnivå). Det var en nær korrelasjon mellom nikotinnivåer og TobRD2 transkripsjonsnivåer.

EKSEMPEL 4

Virkning av topping på TobRD2 mRNA- nivåer

Det er velkjent på området at fjerning av blomsterhode i en tobakkplante (topping) øker rotveksten og øker nikotininnholdet i plantens blader. Topping av planten er en standard praksis i kommersiell tobakksdyrking og den optimale tid for topping av en gitt tobakksplante under et gitt sett av dyrkingsbetingelser kan lett bestemmes av en med kunnskap på området.

Tobakksplanter (N. tabacum SRI) ble dyrket fra frø i jord i én måned og overført til potter som inneholdt sand. Plantene ble dyrket i et drivhus i ytterligere to måneder inntil de startet med å sette blomster. Blomsterhodene og to knopper ble deretter fjernet fra fire planter(topping). En porsjon av røttene ble høstet fra hver plante etter den angitte tid og slått sammen for RNA-ekstraksjon. Kontrollplanter ble ikke dekapitert. Total RNA (1 jig) fra hvert tidspunkt ble elektroforert gjennom en 1 % agarosegel som inneholdt 1,1 M formaldehyd og overført til et nylonmembran i henhold til Sambrook et al. (1989). Membranene ble hybridisert med <32>P-merket TobRD2 cDNA fragmenter. Relativ intensitet av TobRD2 transkripter ble målt ved densitometri. Fig. 6 illustrerer de relative transkripsjonsnivåer (sammenlignet med null tid) for hvert tidspunkt med topping (fylte søyler) eller uten topping (skraverte søyler).

Relative TobRD2 nivåer ble bestemt i rotvev over 24 timer; resultatene er vist i fig. 6 (fylte søyler angir TobRD2 transkripsjonsnivåer i toppede planter; skraverte søyler angir TobRD2 transkripsjonsnivåer i ikke-toppede kontroller. Innenfor seks timer etter topping av tobakksplantene, øket mRNA-nivåer til TobRD2 ca. åtte ganger i de toppede planter; ingen økning ble sett i kontrollplanter over samme tidsperiode.

EKSEMPEL 5

Komplementering av bakteriell mutant som mangler QPRTase med DNA i henhold til SEKV. ID nr. 1

Escherichia coli stamme TH265 er en mutant som mangler kinolat fosforibosyl transferase (nadC"), og kan derfor ikke dyrkes på media som mangler nikotinsyrer.

TH265 celler ble transformert med en ekspresjonsvektor (pWS161) som inneholdt DNA i henhold til SEKV. ID nr. 1, eller transformert bare med ekspresjons-vektoren (pKK233). Vekst av de transformerte bakterier ble sammenlignet med vekst av TH265 (pKK233) transformanter og til vekst av den utransformerte TH265 nadC" mutant. Vekst ble sammenlignet på ME minimumsmedium (som mangler nikotinsyre) og på ME minimumsmedium med tilsatt nikotinsyre.

E. coli stammen med QPRTase mutasjon (nadC), TH265 ble vennligst tilveiebragt av Dr. K.T. Hughes (Hughes et al., J. Bact. 175:479 (1993). Cellene ble opprettholdt på LB-media og kompetente celler fremstilt som beskrevet i Sambrook et al. (1989). Et ekspresjonsplasmind ble konstruert i pKK233 (Brosius, 1984) med TobRD2 cDNA klonet under kontroll av Tac-promoteren. Det resulterende plasmid, pWS161, ble transformert inn i TH265 celler. De transformerte celler ble deretter platet på minimumsmedia (Vogel and Bonner, 1956) agarplater med eller uten nikotinsyrer (0,0002 %) som supplement. TH265 celler alene og TH265 transformert med pKK233 ble platet på lignende plater for bruk som kontroller.

Resultatene er vist i fig. 4. Bare TH265 transformert med DNA i henhold til SEKV. ID nr. 1 vokste i media som manglet nikotinsyre. Disse resultater viser at ekspresjon av DNA i henhold til SEKV. ID nr. 1 i TH265 bakterielle celler ga NadC+ fenotypen på disse celler, og konfirmerte at denne sekvensen koder QPRTase. TobRD2 nomenklaturen ble således forandret til NtQPTl.

EKSEMPEL 6

Transformeringav tobakksplanter

DNA i henhold til SEKV. ID nr. 1, i antisensorientering, er operativt koblet til en plantepromoter (CaMV 35S eller TobRD2 rot-cortex spesifikk promoter) for å produsere to forskjellige DNA-kassetter: CaMV35S promoter/antisens SEKV. ID nr. 1 og TobRD2 promoter/antisens SEKV. ID nr. 1.

En villtype tobakkslinje og en lavnikotin tobakkslinje blir valgt for transformering, f.eks. villtype Burley 1 tobakk (Nicl+/Nic2+) og homozygot nicl-/nic2- Burley 21. Et flertall av tobakksplanteceller fra hver linje blir transformert ved å bruke hver av DNA-kassettene. Transformering blir utført ved å bruke en Agrobacterium vektor, f.eks. en Agrobacterium binær vektor som bærer Ti-grensesekvenser og nptll-gen (som gir resistens til kanamycin og under kontroll av nos-promoteren (nptll)).

Transformerte celler blir utvalgt og regenerert i transgene tobakksplanter (Ro). Ro plantene blir dyrket til modenhet og testet for nikotinnivåer; et undersett av de transformerte tobakksplantene utviser signifikant lave nivåer av nikotin sammenlignet med ikke-transformerte kontrollplanter.

Ro planter blir deretter selvbefruktet og segregering av transgenene blir analysret i Ri avkom. Ri avkommet blir dyrket til modenhet og selvbefruktet; segregering av transgene blant R2 avkommet indikerer hvilke Ri planter som er homozygote for transgenet.

Claims (45)

1. Isolert DNA-molekyl, karakterisert ved at det omfatter en nukleotidsekvens valgt fra gruppen som består av: (a) nukleotidsekvensen i SEKV. ID nr. 1; (b) nukleotidsekvensen som koder et enzym som har aminosyresekvensen i SEKV. ID nr. 2; (c) nukleotidsekvensen som hybridiserer til nukleotidsekvensen i (a) eller (b) ovenfor under stringente betingelser, og som koder et kinolat fosforibosyl transferaseenzym; og (d) nukleotidsekvens som avviker fra nukleotidsekvensen i (a), (b) eller (c) ovenfor på grunn av degenerering av den genetiske kode, og som koder et kinolat fosforibosyl transferaseenzym.

2. DNA-konstrukt, karakterisert ved at det omfatter, i 5' til 3' retningen, en promoter som er operativ i en plantecelle og et DNA-molekyl som angitt i krav 1 plassert nedstrøms for nevnte promoter og operativt assosiert med denne.

3. DNA-konstrukt, karakterisert ved at det omfatter, i 5'-3' retningen, en plantepromoter og et DNA-molekyl som angitt i krav 1, plassert nedstrøms fra nevnte promoter og operativt assosiert med den, nevnte DNA-segment i en antisens orientering.

4. DNA-konstrukt, karakterisert ved at det omfatter, i 5' til 3' retningen, en promoter som er operativ i en plantecelle og DNA som koder et plante kinolat fosforibosyl transferaseenzym som har nukleotidsekvensen i SEKV. ID nr. 1, hvor nevnte DNA er operativt assosiert med nevnte promoter.

5. DNA-konstrukt, karakterisert ved at det omfatter i 5' til 3' retningen, en promoter operativ i en plantecelle og DNA som koder et plante kinolat fosforibosyl transferaseenzym som har nukleotidsekvensen i SEKV. ID nr. 1, hvor nevnte DNA er antisensorientert og operativt assosiert med nevnte promoter.

6. DNA-konstrukt som angitt i krav 2, 3, 4 eller 5, karakterisert ved at promoteren er konstitutivt aktiv i planteceller.

7. DNA-konstrukt som angitt i krav 2, 3, 4 eller 5, karakterisert ved at nevnte promoter er selektivt aktiv i planterotvevceller.

8. DNA-konstrukt som angitt i krav 2, 3, 4 eller 5, karakterisert ved at nevnte promoter er selektivt aktiv i planterot-barkvevceller.

9. DNA-konstrukt som angitt i krav 2, 3, 4 eller 5, karakterisert ved at nevnte konstrukt videre omfatter et plasmid.

10. DNA-konstrukt som angitt i krav 2, 3, 4 eller 5, karakterisert ved at den er båret av en plante transformeringsvektor.

11. DNA-konstrukt som angitt i krav 2, 3, 4 eller 5, karakterisert ved at det er båret av en plantetransformeringsvektor, hvor plantetransformeringsvektoren er en Agrobacterium tumefaciens vektor.

12. Plantecelle, karakterisert ved at den inneholder et DNA-konstrukt som angitt i krav 2, 3, 4 eller 5.

13. Transgen plante, karakterisert ved at den omfatter planteceller som angitt i krav 12.

14. Isolert peptid, karakterisert ved det at det omfatter aminosyresekvensen i SEKV. ID nr. 2.

15. Isolert peptid, karakterisert ved at det er kodet av en nukleotidsekvens valgt fra gruppen som består av; (a) nukleotidsekvensen i SEKV. ID nr. 1; b) nukleotidsekvensen som som hybridiserer til nukleotidsekvensen i (a) ovenfor under stringente betingelser og som koder et kinolat fosforibosyl transferaseenzym; og (c) en nukleotidsekvens som avviker fra nukleotidsekvensen i (a) eller (b) ovenfor på grunn av degenerering av den genetiske kode, og som koder et kinolat fosforibosyl transferaseenzym.

16. Fremgangsmåte til å fremstille en transformert plantecelle som har redusert kinolat fosforibosyl transferase (QPRTase) produksjon, karakterisert ved at den omfatter: å transformere en plantecelle av en type kjent for å produsere kinolat fosforibosyl transferase med et eksogent DNA-konstrukt, hvor konstruktet omfatter, i 5' til 3' retningen, en promoter operativ i en plantecelle og et heterologt DNA operativt assosiert med nevnte promoter, for å fremstille en transformert plantecelle, hvor nevnte transformerte plantecelle har redusert produksjon av kinolat fosforibosyl transferase sammenlignet med en utransformert plantecelle, og hvor nevnte heterologe DNA omfatter minst 20 nukleotider av en nukleotidsekvens valgt fra gruppen som består av (a) nukleotidsekvensen i SEKV. ID nr. 1 (b) en nukleotidsekvens som koder et enzym som har aminosyresekvensen i SEKV. ID nr. 2; (c) en nukleotidsekvens som hybridiserer til nukleotidsekvensen i (a) eller (b) ovenfor under stringente betingelser og som koder et kinolat fosforibosyl transferaseenzym; og (d) en nukleotidsekvens som er forskjellig fra nukleotidsekvensen i (a), (b) eller (c) ovenfor på grunn av degenerering av den genetiske kode og som koder et kinolat fosforibosyl transferaseenzym.

17. Fremgangsmåte som angitt i krav 16, karakterisert ved at nevnte heterologe DNA, er antisensorientert.

18. Fremgangsmåte som angitt i krav 16, karakterisert ved at nevnte heterologe DNA, er sensorientert.

19. Fremgangsmåte som angitt i krav 16, karakterisert ved at nevnte plantecelle er fra en Nicotiana tabacum plante.

20. Fremgangsmåte som angitt i krav 16, karakterisert ved at den ytterligere omfatter regenerering av en plante fra nevnte transformerte plantecelle.

21. Fremgangsmåte som angitt i krav 16, karakterisert ved at nevnte promoter er konstitutivt aktivt.

22. Fremgangsmåte som angitt i krav 16, karakterisert ved at nevnte promoter er selektivt aktiv i planterotvevceller.

23. Fremgangsmåte som angitt i krav 16, karakterisert ved at nevnte promoter er selektivt aktiv i planterot-cortexvevceller.

24. Fremgangsmåte som angitt i krav 16, karakterisert ved at nevnte transformeringstrinn blir utført ved å bombardere nevnte plantecelle med mikropartikler som bærer nevnte DNA-konstrukt.

25. Fremgangsmåte som angitt i krav 16, karakterisert ved at nevnte transformeringstrinn blir utført ved å infisere nevnte plantecelle med en Agrobacterium tumefaciens som inneholder et Ti-plasmid som bærer nevnte DNA-konstrukt.

26. Fremgangsmåte til å produsere transgene tobakksfrø, karakterisert ved å samle opp frø fra en transgen tobakksplante fremstilt ved fremgangsmåten som angitt i krav 20.

27. Fremgangsmåte som angitt i krav 16, karakterisert ved at nevnte transformerte plantecelle har endogent kinolat fosforibosyl transferase budbringer RNA uttrykt deri og hvori nevnte heterologe DNA er komplementær til nevnte kinolat fosforibosyl transferase budbringer RNA (QPRT mRNA) uttrykt i nevnte plantecelle i en region valgt fra: (a) den 5'-utranslaterte sekvens av nevnte QPRT mRNA; (b) den 3'-utranslaterte sekvens av nevnte QPRT mRNA; og (c) den translaterte region av nevnte QPRT mRNA.

28. Fremgangsmåte som angitt i krav 27, karakterisert ved at nevnte heterologe DNA er komplementær til minst 15 nukleotider av nevnte kinolat fosforibosyl transferase budbringer RNA uttrykt i nevnte plantecelle.

29. Fremgangsmåte som angitt i krav 27, karakterisert ved at nevnte heterologe DNA er komplementær til minst 200 nukleotider i nevnte kinolat fosforibosyl transferase budbringer RNA uttrykt i nevnte plantecelle.

30. Fremgangsmåte som angitt i krav 16, karakterisert ved at nevnte heterologe DNA omfatter en kinolat fosforibosyl transferase kodende sekvens valgt fra DNA-sekvenser som angitt i krav 1.

31. Transgen plante av slekten Nicotiana som har redusert kinolat fosforibosyl transferase (QPRTase) produksjon relativ til en ikke-transformerte kontrollplante, karakterisert ved at nevnte transgene plante omfatter transgene planteceller som inneholder: et eksogent DNA-konstrukt som omfatter, i 5' til 3' retningen, en promoter operativ i nevnte plantecelle og et heterologt DNA som er operativt assosiert med nevnte promoter; hvor nevnte plante utviser redusert QPRTase produksjon sammenlignet med en ikke-transformert kontrollplante, og; nevnte heterologe DNA omfatter minst 15 nukleotider av en nukleotidsekvens valgt fra gruppen som består av; (a) nukleotidsekvensen i SEKV. ID nr. 1; (b) en nukleotidsekvens som koder et enzym som har aminosyresekvensen i SEKV. ID nr. 2; (c) en nukleotidsekvens som hybridiserer til nukleotidsekvensen i (a) eller (b) ovenfor under stringente betingelser og som koder et kinolat fosforibosyl transferaseenzym; og (d) en nukleotidsekvens som avviker fra nukleotidsekvensen i (a), (b) eller (c) ovenfor på grunn av degenerering av den genetiske kode og som koder et kinolat fosforibosyl transferaseenzym.

32. Transgen plante som angitt i krav 31, karakterisert ved at nevnte heterologe DNA er antisensorientert.

33. Transgen plante som angitt i krav 31, karakterisert ved at nevnte heterologe DNA er sensorientert.

34. Transgen plante av slekten Nicotiana som har redusert kinolat fosforibosyl transferase (QPRTase) produksjon relativ til en ikke-transformert kontrollplante, karakterisert ved at nevnte transgene plante er et avkom av en plante i henhold til krav 31.

35. Frø av en transgen plante av slekten Nicotiana som har redusert kinolat fosforibosyl transferase (QPRTase) produksjon relativ til en ikke-transformert kontrollplante, karakterisert ved at nevnte transgene plante er en plante i henhold til krav 31 eller et avkom derav.

36. Avling, karakterisert ved at den omfatter et flertall av planter som angitt i krav 31 plantet sammen i et landbruksfelt.

37. Fremgangsmåte til å redusere ekspresjon av et kinolat fosforibosyl transferasegen i en plantecelle, karakterisert ved at den omfatter: å dyrke en plantecelle transformert for å inneholde heterologt DNA, hvori en transkribert tråd av nevnte heterologe DNA er komplementær til kinolat fosforibosyl transferase budbringer RNA endogent til nevnte plantecelle, hvorved transkripsjon av nevnte komplementære tråd reduserer ekspresjonen av nevnte kinolat fosforibosylgen; og nevnte heterologe DNA omfatter minst 15 nukleotider av nukleotidsekvens valgt fra gruppen som består av; (a) nukleotidsekvensen i SEKV. ID nr. 1; (b) en nukleotidsekvens som koder et enzym som har aminosyresekvensen i SEKV. ID nr. 2; (c) en nukleotidsekvens som hybridiserer til nukleotidsekvensen i (a) eller (b) ovenfor under stringente betingelser og som koder et kinolat fosforibosyl transferaseenzym; og (d) en nukleotidsekvens som avviker fra nukleotidsekvensen i (a), (b) eller (c) ovenfor på grunn av degenerering av den genetiske kode og som koder et kinolat fosforibosyl transferaseenzym.

38. Fremgangsmåte til å produsere en transgen tobakksplante som har et redusert nivå av nikotin i bladene til nevnte tobakksplante, karakterisert ved at den omfatter; å transformere en tobakksplantecelle med et heterologt DNA-molekyl som omfatter minst 30 nukleotider av en nukleotidsekvens valgt fra gruppen som består av; (a) nukleotidsekvensen i SEKV. ID nr. 1; (b) en nukleotidsekvens som koder et enzym som har aminosyresekvensen i SEKV. ID nr. 2; (c) en nukleotidsekvens som hybridiserer til nukleotidsekvensen i (a) eller (b) ovenfor under stringente betingelser og som koder et kinolat fosforibosyl transferaseenzym; og (d) en nukleotidsekvens som avviker fra nukleotidsekvensen i (a), (b) eller (c) ovenfor på grunn av degenerering av den genetiske kode og som koder et kinolat fosforibosyl transferaseenzym; og å dyrke nevnte transformerte tobakksplantecelle i en transgen tobakksplante hvorved nevnte transgene tobakksplante har et redusert nivå av nikotin i bladet.

39. Fremgangsmåte til å fremstille en transformert plantecelle som har øket kinolat fosforibosyl transferase (QPRTase) produksjon, karakterisert ved at den omfatter å transformere en plantecelle som produserer kinolat fosforibosyl transferease med et eksogent DNA-konstrukt, hvor konstruktet omfatter, i 5' til 3' retningen, en promoter operativ i en plantecelle og en heterolog DNA-sekvens som koder kinolat fosforibosyl transferase, til å produsere en transformert plantecelle, hvor nevnte transformerte plantecelle har øket produksjon av kinolat fosforibosyl transferase sammenlignet med utransformert plantecelle, hvori nevnte heterologe DNA-sekvens er valgt fra gruppen som består av; (a) nukleotidsekvensen i SEKV. ID nr. 1; (b) en nukleotidsekvens som koder et enzym som har aminosyresekvensen i SEKV. ID nr. 2; (c) en nukleotidsekvens som hybridiserer til nukleotidsekvensen i (a) eller (b) ovenfor under stringente betingelser og som koder et kinolat fosforibosyl transferaseenzym; og (d) en nukleotidsekvens som avviker fra nukleotidsekvensen i (a), (b) eller (c) ovenfor på grunn av degenerering av den genetiske kode og som koder et kinolat fosforibosyl transferaseenzym.

40. Transgen plante av slekten Nicotiana som har øket kinolat fosforibosyl transferase (QPRTase) produksjon relativ til en ikke-transformert kontrollplante, karakterisert ved at nevnte transgene plante omfatter transformerte planteceller som inneholder; et eksogent DNA-konstrukt som omfatter, i 5' til 3' retningen, en promoter som er operativ i nevnte plantecelle og en heterolog DNA-sekvens som koder et plante kinolat fosforibosyl transferaseenzym, hvor nevnte DNA er operativt assosiert med nevnte promoter; nevnte plante har øket QPRTase produksjon sammenlignet med en ikke-transformert kontrollplante, og hvori nevnte heterologe DNA-sekvens er valgt fra gruppen som består av (a) nukleotidsekvensen i SEKV. ID nr. 1; (b) en nukleotidsekvens som koder et enzym som har aminosyresekvensen i SEKV. ID nr. 2; (c) en nukleotidsekvens som hybridiserer til nukleotidsekvensen i (a) eller (b) ovenfor under stringente betingelser og som koder et kinolat fosforibosyl transferaseenzym; og (d) en nukleotidsekvens som avviker fra nukleotidsekvensen i (a), (b) eller (c) ovenfor på grunn av degenerering av den genetiske kode og som koder et kinolat fosforibosyl transferaseenzym.

41. Transgen plante av slekten Nicotiana som har øket kinolat fosforibosyl transferase (QPRTase) produksjon relativ til en ikke-transformert kontrollplante, karakterisert ved at nevnte transgene plante er et avkom av en plante i henhold til krav 40.

42. Fremgangsmåte til å øke ekspresjon av et kinolat fosforibosyl transferasegen i en plantecelle, karakterisert ved at den omfatter; å dyrke en plantecelle transformert for å inneholde heterologt DNA, hvori nevnte heterologe DNA koder et kinolat fosforibosyl transferaseenzym, og hvori nevnte heterologe DNA er valgt fra gruppen som består av (a) nukleotidsekvensen i SEKV. ID nr. 1; (b) en nukleotidsekvens som koder et enzym som har aminosyresekvensen i SEKV. ID nr. 2; (c) en nukleotidsekvens som hybridiserer til nukleotidsekvensen i (a) eller (b) ovenfor under stringente betingelser og som koder et kinolat fosforibosyl transferaseenzym; og (d) en nukleotidsekvens som avviker fra nukleotidsekvensen i (a), (b) eller (c) ovenfor på grunn av degenerering av den genetiske kode og som koder et kinolat fosforibosyl transferaseenzym.

43. Fremgangsmåte som angitt i krav 42, karakterisert ved at nevnte transformerte plantecelle er oppnådd ved en fremgangsmåte som omfatter; å integrere i genomet til en vertsplantecelle et konstrukt som omfatter, i transkripsjonen, en promoter som er funksjonell i nevnte plantecelle, en DNA-sekvens som koder kinolat fosforibosyl transerase funksjonell i nevnte plantecelle, nevnte DNA-sekvens er operativt assosiert med nevnte promoter, og en transkripsjonen avslutningsregion funksjonell i nevnte celle, hvorved en transformert plantecelle oppnås.

44. Fremgangsmåte til å fremstille en tobakksplante som har et øket nivå av nikotin i bladene til nevnte tobakkplante, karakterisert ved at den omfatter; å dyrke en tobakksplante, eller avkomsplante derav, hvori nevnte plante omfatter celler som inneholder et eksogent DNA-konstrukt som omfatter en transkripsjonen initieringsregion som er funksjonell i nevnte tobakksplante og en heterolog DNA-sekvens operativt koblet til nevnte transkripsjonene initieringsregion, hvori nevnte heterologe DNA-sekvens koder et kinolat fosforibosyl transferaseenzym funksjonell i nevnte celler, og hvori nevnte heterologe DNÅ-sekvens er valgt fra gruppen som består av; (a) nukleotidsekvensen i SEKV. ID nr. 1; (b) en nukleotidsekvens som koder et enzym som har aminosyresekvensen i SEKV. ID nr. 2; (c) en nukleotidsekvens som hybridiserer til nukleotidsekvensen i (a) eller (b) ovenfor under stringente betingelser og som koder et kinolat fosforibosyl transferaseenzym; og (d) en nukleotidsekvens som avviker fra nukleotidsekvensen i (a), (b) eller (c) ovenfor på grunn av degenerering av den genetiske kode og som koder et kinolat fosforibosyl transferaseenzym.

45. Tobakksplanteprodukt, karakterisert ved at den er fremstilt fra en tobakksplante i henhold til ethvert av kravene 31-34, 40 eller 41.