SK161899A3 - Isolated dna molecule, dna construct, a plant cell and a transgenic plant, a peptide, method for the preparation of the transgenic plant cell, a transgenic plant seed, method for producing a tobacco plant and method for decreasing and increasing gene expression - Google Patents

Description

IZOLOVANÁ DNA MOLEKULA, DNA KONŠTRUKT, RASTLINNÁ BUNKA A TRANSGÉNNA RASTLINA, PEPTID, SPÔSOB PRÍPRAVY TRANSGÉNNEJ RASTLINNEJ BUNKY, OSIVO TRANSGÉNNEJ RASTLINY, SPÔSOB PRODUKCIE TABAKOVEJ RASTLINY A SPÔSOB ZNÍŽENIA A ZVÝŠENIA EXPRESIE GÉNU

FEDERÁLNE SUBVENCOVANÝ VÝSKUM

Tento vynález vznikol na základe štátnej dotácie s Povolením Národného Vedeckého Ústavu č. MCB-9206506. Na i tento vynález môže si štát nárokovať isté práva.

Oblasť techniky

Uvedený vynález sa týka rastlinnej chinolát-fosforibozyltrasferázy a DNA kódujúcej tento enzým. Detailnejšie sa uvádzaný vynález týka použitia DNA kódujúcej chinolátfosforibozyl-transferázu na produkciu transgénnych rastlín majúcich geneticky premenené úrovne nikotínu a takto produkovaných rastlín.

Doterajší stav techniky

Predmetom záujmu je produkcia tabakových rastlín so zníženými úrovňami nikotínu vzhladom na návykovú vlastnosť na nikotín. Dodatočne sú tabakové rastliny s extrémne nízkymi úrovňami produkcie nikotínu alebo žiadnou produkciou nikotínu zaujímavé ako recipienty transgénov zhodnocujúcich obchodne úžitkové produkty, také ako farmaceutické prostriedky, kozmetické prostriedky alebo odstránenie nikotínu z tabaku spôsobov. Avšak väčšina týchto spôsobov odstraňuje z tabaku spoločne s nikotínom aj ďalšie zložky, čím nepriaznivo ovplyvňuje tabak. Klasické techniky pestovania kultúry produkujú tabakové rastliny s nižšími úrovňami nikotínu potravinárske bol navrhnutý prísady. Na rad rôznych (približne 8%), ako sú úrovne pozorované v zlých typoch tabakových rastlín. Žiadané sú tabakové rastliny a tabak majúci dokonca ďalšiu redukciu obsahu nikotínu. Jedným spôsobom zníženia úrovne biologického produktu je zníženie množstva požadovaného enzýmu biosyntetickou cestou vytvárajúci žiadaný produkt. Pokial sa ovplyvnený enzým prirodzene nachádza v množstve obmedzujúcom rýchlosť reakcie (pozorované s ďalšími enzýmami nevyhnutnými pre biosyntézu), bude akékoľvek zníženie tohto množstva enzýmu znižovať produkciu konečného produktu. Ak však množstvo enzýmu rýchlosť bežne neobmedzuje, musí jeho prítomnosť v bunke byť znížená na úrovne obmedzujúce rýchlosť reakcie s cieľom znížiť množstvo konečného produktu biosyntézy. Opačne, ak prirodzene sa vyskytujúce množstvo enzýmu obmedzuje rýchlosť, potom akékoľvek zvýšenie aktivity enzýmu povedie k zvýšeniu objemu biosyntetického konečného produktu. Nikotín sa tvorí pôvodne v koreňoch tabakovej rastliny a je následne transportovaný do listov, kde je skladovaný (Tso, Fyziológia a biochémia tabakových rastlín, str. 233-34, Dowden, Hutchinson & Ross, Stroudsburg, Pa (1972)). Povinným krokom biosyntézy nikotínu je vytváranie kyseliny nikotínovej z kyseliny chinolínovej, teda krok, ktorý je katalyzovaný enzýmom chinolínfosforibozyl-transferázou („QPRTáza). QPRTáza sa prejavuje ako enzým ovplyvňujúci rýchlosť reakcie v priebehu biosyntézy, dodávajúci kyselinu nikotínovú na syntézu nikotínu v tabaku. Pozri napr. Feth a spol., „Regulácia aktivity enzýmov nikotínovej cesty v tabakovom kale, Planta, 168, str. 402-07 (1986); Wagner a spol., „Regulácia aktivity enzýmov nikotínovej cesty v tabaku, Physiol. Plánt., 68, str. 667-72 (1986). Modifikácia úrovní nikotínu v rastlinách tabaku pozitívnou reguláciou hnilobnej metyl-transferázy (PMTáza) je navrhnutá v US patentoch 5 369 023 a 5 260 205, od Nakatani a Malik. PCT prihláška WO 94/28142 od Wahad a Malik popisuje DNA kódujúcu PMT a použitie antikódujúcich a kódujúcich PMT konštruktov.

Podstata vynálezu

Prvým hľadiskom predloženého vynálezu je izolovaná DNA molekula obsahujúca SEQ ID č. : 1; DNA sekvencie, ktoré kódujú enzým obsahujúci SEQ ID č. : 2; DNA sekvencie, ktoré hybridizujú na uvádzanej DNA a ktoré kódujú enzým chinolátfosforibozyl-transferázu; a DNA sekvencie, ktoré sa líšia od vyššie uvedených DNA sekvencií vďaka degenerácii genetického kódu. Peptid kódovaný uvádzanými DNA je ďalším hľadiskom vynálezu.

Ďalším hladiskom predloženého vynálezu je DNA konštrukt obsahujúci promótor schopný pôsobiť v rastlinnej bunke a DNA časť, kódujúca enzým chinolát-fosforibozyl-transferázu, umiestnenú v smere z promótora a na tento účinne pripojenú. DNA kódujúca enzým môže byť v kódujúcom alebo antikódujúcom smere.

Ďalším hľadiskom predloženého vynálezu je spôsob prípravy transgénnej rastlinnej bunky majúcej zníženú expresiu chinolát-fosforibozyl-transferázy (QPRTáza) zaistením rastlinnej bunky známeho typu na expresiu chinolátfosforibozyl-transferázy; transformáciu rastlinnej bunky e>ogénnym DNA konštruktom obsahujúcim promótor a DNA tvorenú ča'ťou sekvencie kódujúcej mRNA (mediátorová RNA) chinolátfosforibozyl-transferázy.

Ďalším hladiskom predloženého vynálezu je transgénna rastlina druhu Nicotiana majúca zníženú expresiu chinolátfosforibozyl-transferázy (QPRTáza) oproti ne-transformovanej kontrolnej rastline. Bunky uvádzaných rastlín obsahujú DNA konštrukt, ktorý zahrňuje časť DNA sekvencie kódujúcej mRNA rastlinné chinolát-fosforibozyl-transferázy.

Ďalším hľadiskom predloženého vynálezu je spôsob zníženia expresie génu chinolát-fosforibozyl-transferázy v rastlinnej bunke pestovaním rastlinnej bunky transformovanej na obsah exogénnej DNA, kedy transkriptný reťazec exogénnej DNA je doplnkový k mRNA, chinolát-fosforibozyl-transferázy, ktorá je pre bunku endogénna. Transkripcia doplnkového reťazca znižuje expresiu endogénneho génu chinolát-fosforibozyl.

Ďalším hladiskom predloženého vynálezu je spôsob produkcie tabakovej rastliny so zníženými úrovňami nikotínu v jej listoch pestovaním tabakovej rastliny s bunkami, ktoré obsahujú exogénnu DNA sekvenciu, kde transkripčný reťazec exogénnej DNA sekvencie je doplňujúcim k endogénnej chinolátfosforibozyl-transferáza-mediátorovej RNA v bunkách.

Ďalším hladiskom vynálezu je spôsob tvorby transgénnej rastlinnej bunky majúcej zvýšenú expresiu chinolátfosforibozyl-transferázy (QPRTáza) transfomáciou rastlinnej bunky známej pre expresiu chinolát-fosforibozyl-transferázy exogénnym DNA konštruktom, ktorý obsahuje DNA sekvenciu kódujúcu chinolát-fosforibozyl-transferázu.

Ďalším hladiskom predloženého vynálezu je transgénna Nicotiana rastlina majúca zvýšenú expresiu chinolátfosforibozyl-transférazy (QPRTáza), keď bunky transgénnej rastliny obsahujú exogénnu DNA sekvenciu kódujúcu rastlinnú chinolát-fosforibozyl-transferázu.

Ďalším hľadiskom vynáleze je spôsob zvýšenia expresie génu chinolát-fosforibozyl-transferáza v rastlinnej bunke pestovaním rastlinnej bunky trasnformovanej na obsah exogénnej DNA kódujúcej chinolát-fosforibozyl-transferázu.

Ďalším hladiskom predloženého vynálezu je spôsob produkcie tabakovej rastliny majúcej zvýšené úrovne nikotínu v ich listoch pestovaním tabakovej rastliny zahrňujúcej bunky, ktoré obsahujú exogénnu DNA sekvenciu kódujúcu chinolátfosforibozyl-transferázu, účinnú v bunkách.

Nikotín tabakových rastlín je produkovaný kondenzáciou kyseliny nikotínovej a 4-metylaminobutanolu. Biosyntetická cesta vedúca k produkcii nikotínu je znázornená na obrázku 1. Dve regulačné miesta génov v chromozóme (Nicl a Nic2) pôsobia ako ko-dominantné (úrovňové) regulátory produkcie nikotínu. Analýza enzýmov v koreňoch jednoduchého a dvojitého Nie mutantu ukazuje, že aktivita dvoch enzýmov, chinolátfosforibozyl-transferázy (QPRTáza)a hnilobnej metyltransferázy (PMTáza), je priamo úmerná úrovniam biosyntézy nikotínu.

Porovnanie aktivity enzýmov v tabakových tkanivách (koreňoch a kalu) s rôznou schopnosťou syntézy nikotínu ukazuje, že aktivita QPRTázy je v presnom vzájomnom vzťahu (koreluje) s obsahom nikotínu (Wagner a Wagner, Planta 165:532(1985)). Saunders a Bush (Plánt Physiol 64:236 (1979) preukazujú, že úroveň QPRTázy v koreňoch mutantov s nízkymi úrovňami nikotínu je priamo úmerná k úrovni nikotínu v listoch.

Predložený vynález zahrňuje novú cDNA sekvenciu (SEQ ID č.:l) kódujúcu rastlinnú chinolát-fosforibozyl-transferázu (QPRTáza) sekvencie SEQ ID č.:2. Vzhľadom na to, že aktivita QPRTázy je v presnom korelačnom vzťahu s obsahom nikotínu, transgénne tabakové rastliny, v ktorých úrovne QPRTázy sú v koreňoch rastliny znížené (porovnané s úrovňami divokých typov rastlín), vedú k rastlinám majúcim znížené úrovne nikotínu v listoch. Predložený vynález poskytuje metódy a konštrukty nukleových kyselín pre produkciu uvádzaných transgénnych rastlín, rovnako ako aj uvádzané transgénne rastliny. Uvádzané metódy zahrňujú expresiu kódujúcu NtQPTl RNA, ktorá znižuje množstvo QPRTázy v koreňoch tabakových rastlín. Nikotín bol dostatočne pozorovaný v netabakových druhoch a čeľadiach rastlín, hoci prítomné množstvo je obvykle oveľa nižšie ako v N. tabacum.

Predložený vynález taktiež zaisťuje molekuly antikódujúce a kódujúce rekombinantnú DNA kódujúcu QPRTázu alebo molekuly antimediátorovej (pozitívnej) RNA QPRTázy a vektory obsahujúce uvádzané molekuly rekombinantnej DNA, rovnako ako bunky transgénnych rastlín a rastliny transformované uvádzanými DNA molekulami a vektormi. Trangénne tabakové bunky a rastliny tohto vynálezu sú charakteristické nižším alebo vyšším obsahom nikotínu, oproti netransformovaným kontrolným tabakovým bunkám a rastlinám.

Tabakové rastliny s extrémne nízkymi úrovňami produkcie nikotínu alebo so žiadnou produkciou nikotínu sú zaujímavé ako recipienty transgénov vytvárajúcich obchodne hodnotné produkty, také ako farmaceutické prostriedky, kozmetické prostriedky alebo potravinárske prísady. Tabak je zaujímavý ako recipientná rastlina transgénu kódujúceho žiadaný produkt, pretože je ľahko geneticky upraviteľný a produkuje veľké množstvo biomasy na jeden aker; tabakové rastliny so zníženými zdrojmi týkajúcimi sa produkcie nikotínu, budú v zhode s tým zahrňovať viac zdrojov využiteľných pre produkciu transgénnych produktov. Metódy transformácie tabaku transgénami produkujúcimi požadované produkty sú v odbore známe; použitý môže byť akýkoľvek vhodný spôsob využívajúci tabakové rastliny s nízkym obsahom nikotínu v zhode s predloženým vynálezom.

Tabakové rastliny so zníženou expresiou QPRTázy a zníženými úrovňami nikotínu, v zhode s predloženým vynálezom budú potrebné pre produkciu tabakových výrobkov majúcich znížený obsah nikotínu. Tabakové rastliny v zhode s predloženým vynálezom budú vhodné na použitie v akomkoľvek tradičnom tabakovom produkte, zahrňujúcom, ale nijako obmedzeným na, tabak do fajky, cigary a cigaretový tabak a žuvací tabak, tabakový produkt môže byť v akejkoľvek forme zahrňujúci listový tabak, sekaný tabak a rezaný tabak.

Uskutočnenia predloženého vynálezu môžu byť taktiež vhodné na zaistenie transgénnych rastlín majúcich zvýšenú expresiu

Ί

QPRTázy a zvýšený obsah nikotínu v rastline. Uvedené uskutočnenia, použitia týchto uskutočnení a rastliny takto produkované môžu byť potrebné na výrobu tabakových produktov majúcich upravený obsah nikotínu alebo na produkciu rastlín majúcich obsah nikotínu zvýšený pre jeho insekticídne účinky.

Súčasní vynálezcovia zistili, že TobRD2 gén (pozri Conkling a spol., Plánt Phys. 93, 1203 (1990)) kóduje QPRTázu Nicotiana tabacum a na tomto mieste poskytuje cDNA sekvenciu NtQPTl (skôr označovanú ako TobRD2) a aminokyselinovú sekvenciu kódovaného enzýmu. Porovnanie NtQPTl aminokyselinovej sekvencie s GenBank databázou ukazuje obmedzenú podobnosť sekvencie k bakteriálnym proteínom, ktoré kódujú chinolát-fosforibozyl-transferázu (QPRTáza) (obrázok

3) .

Chinolát-fosforibozyl-transferáza je nevyhnutná na biosyntézu nového nikotín-adeníndinukloetidu (NAD) ako v prokaryonoch, tak aj v eurokaryonoch. V tabaku sú vysoké úrovne QPRTázy zistené v koreňoch, ale nie v listoch. Na určenie, že NtQPTl kóduje QPRTázu, súčasní vynálezcovia použili Escherichia coli druh baktérií (TH265), mutant bez chinolát-fosforibozyl-trasnferázy (nadC). Tento mutant nemôže rásť na minimálnom médiu bez kyseliny nikotínovej. Avšak, expresia NtQPTl proteinu v tomto bakteriálnom druhu dodala NadC⁺ fenotyp (obrázok 4) potvrdzujúci, že NtQPTl kóduje

QPRTázu.

Súčasní vynálezcovia skúmali účinky Nicl a Nic2 mutantov v tabaku a vplyvy upravených tabakových rastlín na úrovni ustáleného stavu mRNA NtQPTl a úrovne nikotínu. (Odstránenie apikálnej dominancie vrchnou úpravou na začiatku obdobia kvetu je dobre známe a vedie k zvýšenej úrovni biosyntézy nikotínu a transportu nikotínu v tabaku a je bežnou praxou pri produkcii tabaku). Ak NtQPTl je v skutočnosti zahrnuté pri biosyntéze nikotínu, očakávaním bude, že (1) NtQPTl mRNA úrovne budú nižšie v Nicl/Nic2 dvojmutantoch a (2) NtQPTl mRNA úrovne budú zvýšené po vrchnej úprave. NtQPTl mRNA úrovne v Nicl/Nic2 dvojitých mutantoch boli pozorované približne 25% úrovní divokého typu (obrázok 5). Ďalej, po šiestich hodinách od uskutočnenia vrchnej úpravy, NtQPTl mRNA úrovne tabakových rastlín sa zvýšili asi osemkrát. NtQPTl bolo takto zistené ako kľúčový kontrolný gén spôsobu biosyntézy nikotínu.

Transgénne rastlinné bunky a rastliny

Kontroly expresie génu v rastlinných bunkových genómoch je možné dosiahnuť zapojením heterológnej DNA pod transkripčnú kontrolu promótora účinného v hostiteľovi, pričom transkripčný reťazec heterológnej DNA je doplnkovým k reťazcu DNA, ktorý je prepísaný z upravovaného endogénneho génu. Zavedená DNA, označovaná ako kódujúca DNA, zaisťuje RNA sekvenciu, ktorá je doplnková k prírodné produkovaným (endogénnym) mRNA kyselinám a ktorá potlačuje expresiu endogénnej mRNA. Mechanizmus uvedenej regulácie expresie génu kódovaním nie je celkom jasný. Bez toho, aby sme si želali byť obmedzení iba na jednu jednotlivú teóriu, je známe, že jedna teória regulácie kódovaním ponúka, aby transkripcia kódujúca DNA vytvárala RNA molekuly, ktoré sa viažu na a ochraňujú alebo potláčajú transkripciu molekúl endogénnych mRNA.

Kódujúci produkt môže byť podľa metód predloženého vynálezu doplnkovým ku kódujúcej alebo nekódujúcej (alebo obidvom) časti prirodzene sa vyskytujúcej koncovej RNA. Kódujúci konštrukt môže byť zavedený do rastlinných buniek akýmkoľvek vhodným spôsobom a môže byť zapojený do rastlinného genómu pre indukovateľnú alebo konštitutívnu transkripciu pozitívnej (kódujúcej) sekvencie. Pozri US patent 5 453 566 a 5 107 065, od Shewmaker a spol., (v texte zahrnutý poznámkami).

Pojmy exogénna alebo heterológna DNA (alebo RNA), ako sú použité v texte, sa vzťahujú na DNA (alebo RNA), ktorá bola zavedená do bunky (alebo predchodcov buniek) úpravou uskutočnenou človekom. Uvedená heterológna DNA môže byť kópiou sekvencie, ktorá sa prirodzene nachádza v bunkách určených na transformáciu alebo v jej častiach.

Na produkciu tabakovej rastliny majúcej znížené úrovne QPRTázy a z toho dôvodu nižší obsah nikotínu, ako netransformovaná kontrolná tabaková rastlina, môžu byť tabakové bunky transformované exogénnym QPRT kódujúcim transkripčným celkom obsahujúcim neúplnú QPRT cDNA sekvenciu, plnú dĺžku QPRT cDNA sekvencie, neúplnú QPRT chromozomálnu sekvenciu alebo plnú dĺžku QPRT chromozomálnej sekvencie, v pozitívnej (kódujúcej) orientácii s vhodnými účinne prepojenými kontrolnými sekvenciami. Vhodné kontrolné sekvencie zahrňujú iniciačnú sekvenciu transkripcie („promótor) účinnú v rastlinách, ktoré majú byť transformované a polyadenylačnú/transkripčnú cielovú koncovú sekvenciu. Na určenie klonov nesúcich sekvencie QPRTázy v kódujúcom (pozitívnom) smere účinne pripojené na kontrolné sekvencie sú použité bežné techniky, také ako reštrikčné mapovanie, Southernova hybridizácia a analýza nukleotidovej sekvencie. Tabakové rastliny sú následne regenerované z úspešne transformovaných buniek. Najvýhodnejšie je, aby použitá kódujúca sekvencia bola doplňujúca k endogénnej sekvencií, avšak malé obmeny exogénnych a endogénnych sekvencií môžu byť taktiež tolerované. Je výhodné, aby kódujúca DNA sekvencia bola dostatočne sekvenčne príbuzná tak, aby bola schopná väzby na endogénnu sekvenciu v kontrolovanej bunke za prísnych podmienok, ktoré sú popísané ďalej v texte.

Na vytváranie transgénnych rastlín charakterizovaných nižším ako obvyklým množstvom špecifického enzýmu bola použitá v niekoľkých laboratóriách technológia kódovania. Napr., rastliny s nižšími úrovňami chalkonsyntázy, enzýmu kvetného pigmentu biosyntetickej cesty, boli vytvorené dodaním antimediátorového génu chlakonsyntázy do genómu tabaku a petúnie. Tieto transgénne rastliny tabaku a petúnií vytvárajú kontrolnými nikotínu kvety svetlejšie, ako je ich obvyklé zafarbenie (Van der Krol a spol., „Antimediátorový gén chalkonsyntázy v transgénnych rastlinách potláča kvetnú pigmentáciu”, Náture, 333, str. 86669 (1988)) . Kódujúca RNA technológia bola taktiež úspešne použitá na potlačenie produkcie enzýmu polygalakturonázy v paradajkách (Smith a spol., „Potlačenie expresie génu polygalakturonázy u transgénnych paradajok antimediátorovou RNA”, Náture, 334, str. 724-26 (1988); Sheehy a spol., „Redukcia aktivity polygalakturonázy v paradajkách antimediátorovou RNA”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, str. 8805-09 (1988)) a malých dielčich častí enzýmu ribulózabisfosfát-karboxylóza v tabaku (Rodermel a spol.- „Vzájomné pôsobenie jadrových častí: Jadrový antimediátorový gén potláča úrovne enzýmu ribulóza-bisfosfát-karboxyláza v transformovaných tabakových rastlinách), Celí, 55, str. 673-81 (1988)).

Transgénne rastliny charakterizované vyššími než obvyklými množstvami uvedeného enzýmu môžu byť prípadne produkované transformáciou rastlín génom pre tento enzým v negatívnom (tj. normálnom) smere. Úrovne nikotínu v transgénnych tabakových rastlinách predloženého vynálezu môžu byť zistené obvyklou skúškou prítomnosti nikotínu. Transformované rastliny, v ktorých je úroveň QPRTázy v porovnaní s netransformovanými rastlinami znížená, budú porovnaní s kontrolnou transformované rastliny, v ktorých je úroveň QPRTázy oproti netransformovaným kontrolným rastlinám zvýšená, budú mať zhodne úroveň nikotínu pri porovnaní s kontrolnou úrovňou zvýšenú.

Heterológna sekvencia použitá v spôsoboch kódovania predloženého vynálezu môže byť volená tak, aby bol vytvorený RNA produkt doplnkový k celej mRNA sekvencii QPRTázy alebo k jej časti. Sekvencia môže byť doplnková k hociktorej susediacej sekvencii prirodzenej mediátorovej RNA, tj. môže byť doplnková k endogénnej mRNA sekvencii promaximálne na 5'mať zhodne úroveň úrovňou zníženú;

konci alebo v mieste prekrytia, v smere od miesta prekrytia, medzi miestom prekrytia a iniciačným kodónom a môže tvoriť celok alebo iba časť nekódovanej oblasti, môže tvoriť mostík nekódovanej a kódovanej oblasti, byť doplnková k celku alebo časti kódovanej oblasti, doplnková k 3'- nepremenenej oblasti mRNA. Vhodné kódujúce sekvencie môžu byť aspoň od asi 13 do asi 15 nukleotidov, aspoň asi 16 až asi 21 nukleotidov, aspoň asi 20 nukleotidov, aspoň asi 30, 50 alebo 75 nukleotidov, aspoň asi 100 nukleotidov, aspoň asi 125 nukleotidov, aspoň asi 150 nukleotidov, aspoň asi 200 nukleotidov alebo viacej. Dodatočne, sekvencie môžu byť predĺžené alebo skrátené na 3' alebo 5' ich koncoch.

Jednotlivé kódujúce sekvencie a dĺžka kódujúcej sekvencie sa bude meniť podľa stupňa požadovaného útlmu, stability kódujúcej sekvencie a podobných. Pracovník skúsený v odbore bude inštruovaný vo výbere vhodných kódujúcich sekvencií QPRTázy použitím metód dostupných v odbore a informácií poskytnutých v tomto texte.

S ohľadom na obrázok 2A a SEQ ID č.:l uvedenou v texte, oligonukleotid vynálezu môže predstavovať súvislú dielčiu časť cDNA sekvencie QPRTázy v pozitívnej orientácii akejkoľvek dĺžky, ktorá je dostatočná na dosiahnutie požadovaných účinkov, pokiaľ je táto transformovaná do recipientnej rastlinnej bunky.

Predložený vynález môže byť taktiež použitý v spôsoboch antikódujúceho spoločného potlačenia produkcie nikotínu. Antikódujúce DNA sekvencie použité v uskutočnení predloženého vynálezu majú dĺžku dostatočnú, ak sa prejavujú v rastlinnej bunke, na potlačenie prirodzenej expresie rastlinného proteínu QPRTázy podía uvádzaného textu v tejto rastlinnej bunke. Uvedené antikódujúce DNA sekvencie môžu byť základne celkom genómové alebo doplnkové DNA kódujúcej enzým QPRTáza alebo jeho dielčie časti, uvádzané dielčie časti majú obvykle dĺžku aspoň 15 nukleotidov. Metódy zistenia dĺžky antikódujúcej DNA, ktorá vedie k potlačeniu expresie natívneho génu v bunke, sú pracovníkom skúseným v odbore dostupné.

Podlá ďalšieho možného predmetu predloženého vynálezu, rastlinné bunky Nicotiana sú transformované DNA konštruktom obsahujúcim DNA časť kódujúcu enzymatickú RNA molekulu (tj. „ribozym), ktorej enzymatická RNA molekula je orientovaná proti (tj. rozštiepeniu) mRNA-transkriptu DNA kódujúcej rastlinnú QPRTázu podľa popisu v texte. Ribozymy obsahujú substrátové väzbové úseky, ktoré sa viažu k prístupným úsekom cieľovej mRNA a oblasti, ktoré katalyzujú rozštiepenie RNA, zamedzujúcej premiestnenie a produkciu proteínu. Väzbové úseky môžu zahrňovať kódujúce sekvencie doplnkové k cieľovej mRNA sekvencii; katalytický motív môže predstavovať kladivový motív alebo iné motívy, také ako vlásenkový motív. Štiepne miesta ribozymu vo vnútri cieľovej RNA môžu byť pôvodne identifikované prehliadaním cieľovej molekuly na štiepne miesta ribozymu (napr. GUA, GUU alebo GUC sekvencie). Akonáhle sú identifikované tieto miesta, krátke RNA sekvencie 15, 20, 30 alebo ribonukleotidov, odpovedajúce oblasti cieľového génu, zahrňujúce štiepne miesto, môžu byť ohodnotené predpokladanými štrukturálnymi vlastnosťami. Vhodnosť možných cieľových miest môže byť taktiež ohodnotená skúškou ich prítomnosti pre hybridizáciu voľnými oligonukleotidmi použitím skúšky protekcie ribonukleázy, ktorá je v odbore známa. DNA sekvencie kódujúce enzymatické RNA molekuly môžu byť produkované známymi technikami. Pozri napr. T. Cech a spol., U. S. Patent 4 987 071; Keene a spol., U.S. Patent 5 559 021; Donson a spol., U.S. Patent 5 589 367; Torrence a spol., U.S. Patent 5 583 032; Joyce, U.S. Patent 5 580 967; Gold a spol., a U.S. Patent 5 595 877; Wagner a spol., U.S. Patent 5 591 601; a U.S. Patent 5 622 854 (opisy ktorých sú v texte zahrnuté poznámkami celkovo). Produkcia uvedenej enzymatickej RNA molekuly v rastlinnej bunke a prerušenie produkcie proteínu QPRTáza znižuje aktivitu QPRTázy v rastlinných bunkách v základe rovnakým spôsobom ako produkciu kódujúcej RNA molekuly: t j. prerušením kódovania mRNA v bunke, ktorá produkuje enzým. Pojem „ribozym, použitý v texte, popisuje kyselinu nukleovú obsahujúcu RNA, ktorá pôsobí ako enzým (taký ako endoribonukleáza) a môže byť použitý vzájomne zamenitelne za „enzymatickú RNA molekulu. Predložený vynález ďalej zahrňuje DNA kódujúcu ribozymy, DNA kódujúcu ribozymy, ktorá bola vložená do expresívneho vektora, hostiteľské bunky obsahujúce uvedené vektory a metódu zníženia produkcie QPRTázy v rastlinách použitím ribozymov.

Sekvencie nukleových kyselín použité na uskutočnenie predloženého vynálezu zahrňujú sekvencie so sekvenčnými podobnosťami k SEQ ID č.:l a kódujúci proteín majúci aktivitu chinolát-fosforibozyl-transferázy. Táto definícia by mala podchytiť prírodné alelické variácie proteínov QPRTázy. DNA sekvencie, ktoré hybridizujú na DNA sekvencie SEQ ID č.:l a kód expresie QPRTázy, predovšetkým rastlinných enzýmov QPRTázy, môžu byť takto použité na uskutočnenie predloženého vynálezu.

Môžu existovať početné formy QPRT enzýmu tabaku. Početné formy enzýmu môžu existovať vďaka post-kódujúcej modifikácii jednotlivého génového produktu alebo vzhľadom na početné formy NtQPTl génu.

Podmienky, ktoré povoľujú iné DNA sekvencie kódujúce expresiu proteínu majúceho aktivitu QPRTázy k hybridizácii na DNA SEQ ID č. : 1 alebo na iné DNA sekvencie kódujúce proteín uvedené ako SEQ ID č. : 1 alebo na iné DNA sekvencie kódujúce proteín uvedené ako SEQ ID č. : 2, môžu byť stanovené bežným spôsobom. Napr. hybridizácia takýchto sekvencií môže byť uskutočnená pri menej prísnych podmienkach alebo dokonca velmi prísnych podmienkach (napr. podmienkach uvedených pre presné premývanie 0,3 M a NaCl, 0,03 M citrátu sodného, 0,1 % SDS pri 60°C alebo dokonca 70°C na DNA kódujúcu proteín uvedenú v texte ako SEQ ID č. : 2 štandardnou skúškou hybridizácie in situ). Pozri J. Sambrook a spol., Molekulárne klonovanie, Laboratórny manuál (druhé vydanie 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory)). Všeobecne, uvedené sekvencie budú aspoň zo 65 % podobné, 75% podobné, 80% podobné, 85% podobné, 90% podobné alebo dokonca 95% podobné alebo viacej s postupnosťou uvedenou tu ako SEQ ID č. : 1 alebo DNA sekvencie kódujúce proteíny sekvencie SEQ ID č. : 2. (Určenie sekvenčnej podobnosti bolo urobené využitím dvoch sekvencii orientovaných na maximálne porovnanie; rozdiely v jednej z dvoch porovnávaných postupností sú pre maximálne porovnanie povolené. Dĺžky rozdielov 10 alebo nižšie sú výhodné, dĺžky rozdielov 5 alebo nižšie sú výhodnejšie a dĺžky rozdielov 2 alebo nižšie sú ešte výhodnejšie).

Dostupné sú rôzne metódy hybridizácie, ktoré berú do úvahy izoláciu cDNA klonov, ktorých mRNA úrovne sú čo najnižšie, asi 0,05 % poly(A⁺) RNA. Pozri M. Conkling a spol., Plánt Physiol. 93, 1203-1211 (1990). V stručnosti, cDNA knižnice sú prehľadané použitím jedno-reťazcových cDNA nukleotidových sond reverznej transkripčnej mRNA z rastlinného tkaniva (napr. koreňov a/alebo listov). Nitrocelulózová alebo nylonová membrána je na ciele diferenciálneho prehľadávania namočená v 5xSSC, umiestnená v 96 komorovom sacom kolektore, 150 μΐ kultúry ustálenej počas noci je prenesené zo vzorkovej očkovacej platne do každej komory a aplikované je vákuum, pokial všetka tekutina neprešla cez filter. 150 μΐ denaturačného roztoku (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl) je umiestnené v každej komore použitím zloženej pipety a ponechané asi 3 minúty usadzovať. Je aplikované satie, ako je uvedené vyššie a filter je odstránený a neutralizovaný v 0,5 M tris-HCl (pH 8,0), 1,5 M NaCl. Tento je následne sušený vo vákuu a inkubovaný s príslušnou nukleotidovou sondou. Použitím filtrov nylonových membrán a ponechaním vzorkovej očkovacej plochy skladovanej pri teplote -70°C v 7% DMSO, môžu byť filtre niekoľkokrát presievané mnohými nukleotidovými sondami a odpovedajúce klony izolované po niekoľkoročnom skladovaní.

Pojem „gén, ako je použitý v texte, označuje DNA sekvenciu, ktorá inkorporuje (1) protismerne (5') regulačné signály zahrňujúce promótor, (2) kódujúci oblasť špecifikujúcej produkt, protein alebo RNA génu, (3) v smere (3') oblasti zahrňujúcej transkripčné zakončenie a polyadenylačné signály a (4) pričlenené sekvencie požadované na účinnú a špecifickú expresiu.

DNA sekvencia predloženého vynálezu sa môže v základe zostaviť zo sekvencie poskytnutej v texte vynálezu (SEQ ID č. :1) alebo ekvivalentných nukleotidových sekvencii predstavujú cich alely alebo polymorfné varianty týchto génov alebo ich kódujúcich oblastí.

Použitie frázy „podstatná sekvenčná podobnosť v prezentovanej špecifikácii a nárokoch označuje, že DNA, RNA alebo aminokyselinové sekvencie, ktoré majú nepatrné a nevyplývajúce sekvenčné variácie zo skutočných sekvencii popísaných a nárokovaných vo vynáleze sú považované za ekvivalentné k sekvenciám predloženého vynálezu. V tomto ohľade „nepatrné a nevyplývajúce sekvenčné variácie označujú, že „podobné sekvencie (tj. sekvencie, ktoré majú podstatnú sekvenčnú podobnosť s DNA, RNA alebo proteínmi opísanými a nárokovanými v texte) budú funkčne rovnocenné k sekvenciám popísaným a nárokovaným v predkladanom vynáleze. Funkčne rovnocenné sekvencie budú pôsobiť v podstate rovnakým spôsobom na produkciu v podstate rovnakých prostriedkov ako kyselina nukleová a aminokyselinové prostriedky popísané a nárokované vynálezom.

DNA sekvencie popísané týmto vynálezom môžu byť transformované do rozmanitých hostiteľských buniek. Rozmanitosť vhodných hostiteľských buniek majúcich požadovaný rast a vlastnosti ošetrenia je ľahko dostupná v odbore.

Použitie frázy „izolované alebo „podstatne čisté v predkladanej špecifikácii a nárokoch ako modifikátora DNA, RNA, polypeptidov alebo proteínov označuje, že DNA, RNA, polypeptidy alebo proteíny takto označené boli separované z ich in vivo bunkového prostredia úpravou urobenou človekom.

Pojmy „prirodzená DNA sekvencia alebo „prírodná DNA sekvencia ako sú použité v texte, označujú DNA sekvenciu, ktorá môže byť izolovaná z netransgénnych buniek alebo tkanív. Prirodzené DNA sekveňcie sú také, ktoré neboli pozmenené synteticky, také ako miestne cielené mutagenézy. Akonáhle sú identifikované prírodné DNA sekveňcie, DNA molekuly majúce prírodné DNA sekveňcie, môžu byť syntetizované chemicky alebo produkované použitím rekombinantných DNA procedúr, známych v odbore. Ako je použité v texte, prírodná rastlinná DNA sekvencia je taká, ktorá môže byť izolovaná z netransgénnych rastlinných buniek alebo tkanív. Ako je použité, prírodná tabaková DNA sekvencia je tá, ktorá môže byť izolovaná z netransgénnyych tabakových buniek alebo tkanív.

DNA konštrukt alebo „transkripčné kazety predloženého vynálezu zahrňujú, v smere transkripcie 5' k 3', promótor podlá diskusie uvedenej v texte, DNA sekvenciu diskutovanú v texte účinne spojenú s promótorom a voliteľne koncovou sekvenciou zahrňujúcou koncový signál RNA polymerázy a polyadenylačný signál pre polyadenyláciu. Všetky z týchto regulačných oblastí by mali byť schopné pôsobenia v bunkách tkaniva určeného na transformáciu. V uskutočnení vynálezu môže byť použitý akýkoľvek vhodný koncový signál, ich príklady zahrňujú, ale nie sú týmto zoznamom vo svojom rozsahu nijako limitované, terminátor nopalinsyntáza (nos), terminátor oktapinsyntáza (ocs) , CaMV terminátor alebo prírodné koncové signály odvodené z rovnakého génu ako transkripčné iniciačná oblasť alebo odvodené z rôznych génov. Pozri napr. Rezian a spol. (1988), uvedené vyššie a Rodermel a spol. (1988), uvedené vyššie.

takto účinne	spojený s	DNA,
transkripciu	tejto DNA	(tj.
promótorom).	Promótor	je

Pojem „účinné spojenie, ako je použitý v texte, označuje DNA sekvencie na jednotlivej DNA molekule, ktoré sú spojené tak, že pôsobenie jednej je ovplyvnené druhou. Promótor je 3kiaľ je tento schopný ovplyvniť )NA je transkripčne kontrolovaná sdený ako „protismerný z DNA, ktorá je obrátene uvedená ako „v smere z promótora.

Transkripčná kazeta môže byť zaistená v DNA konštrukte, ktorý taktiež má aspoň jeden replikačný systém. Pre lepšie pochopenie, je bežné mať replikačný systém funkčný v Escherichia coli, také ako ColEl, pSCIOl, pACYC184 alebo podobné. Týmto spôsobom môže byť výsledný konštrukt v každom stave po každej manipulácii klonovaný, sekvenčné zoradený a stanovená správnosť úpravy. V dodatku alebo namiesto E. coli replikačného systému môže byť použité široké spektrum hostiteľských replikačných systémov, takých ako replikačné systémy P-l inkompatibilných plazmidov, napr. pRK290. V dodatku k replikačnému systému bude často existovať aspoň jeden prítomný signálny znak (indikátor), ktorý môže byť použiteľný v jednom alebo viacerých hostiteľských systémoch alebo rôzne signálne znaky individuálnych hostiteľských systémov. Tj. jeden signálny znak môže byť použitý na selekciu v prokaryontnom hostiteľovi, zatiaľ čo iný signálny znak môže byť použitý na selekciu v eukaryontnom hostiteľovi, predovšetkým rastlinnom hostiteľovi. Signálne znaky môžu byť ochranou proti biocidom, takým ako antibiotiká, toxíny, ťažké kovy alebo podobné; môžu zaisťovať doplnenie pridaním prototropie do auxotrofného hostitela; alebo môžu poskytnúť zrejmý fenotyp cez produkciu novej zlúčeniny v rastline.

Rôzné malé časti obsahujúce rôzne konštrukty, transkripčné kazety, signálne znaky a podobné môžu byť následne zavedené štiepením reštrikčným enzýmom vhodného replikačného systému a zapojením jednotlivého konštruktu alebo dielčej časti do dostupného miesta. DNA konštrukt môže byť izolovaný na ďalšie úpravy následne po ligácii a klonovaní. Všetky tieto techniky sú viac ako dostačujúco doložené príkladmi v literatúre, napr. J. Sambrook a spol., Klonovanie molekúl, Laboratórny manuál (druhé vydanie, 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory).

Vektory, ktoré môžu byť použité na transformáciu rastlinného tkaniva konštruktami nukleových kyselín predloženého vynálezu zahrňujú ako Agrobacterium vektory a balistické vektory, rovnako ako vektory vhodné pre DNAsprostredkovanú transformáciu.

Pojem „promótor označuje oblasť DNA sekvencie, ktorá inkorporuje nevyhnutné signály pre účinnú expresiu kódujúcej sekvencie. Tieto môžu zahrňovať sekvencie, ku ktorým sa viaže RNA polymeráza, ale nie sú týmito typmi sekvencií limitované a môžu zahrňovať oblasti, ku ktorým sa viažu iné regulačné proteíny, spolu s oblasťami zahrnutými v regulačnej časti kódovania proteínu a môžu zahrňovať kódujúce sekvencie.

Promótory použité v uskutočnení predloženého vynálezu môžu predstavovať konštitutívne aktívne promótory. Dostupný je celý rad konštitutívnych aktívnych promótorov, ktoré sú účinné v rastlinách. Výhodným príkladom je Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) 35S promótor, ktorý je konštitutívne vyjadrený vo väčšine rastlinných tkanív. V inom prípade, promótor môže predstavovať promótor špecifikovaný pre korene alebo promótor špecifikovaný pre korene a kôru, ako je detailnejšie vysvetlené ďalej v texte.

Kódujúce sekvencie boli vyjadrené v transgénnych tabakových rastlinách použitím Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) 35S promótora. Pozri napr. Cornelissen a spol., „Ako RNA úroveň, tak aj účinnosť kódovania sú v transgénnom tabaku redukované antimediátorovou RNA, Nukleové kyseliny Res. 17, str. 833-43, (1989); Rezaian a spol., „Antimediátorové RNA uhorkového mozaikovitého vírusu v transgénnych rastlinách určené na kontrolu vírusu, Molekulárna biológia rastlín 11, str. 463-71 (1988); Rodermel a spol., „Vzájomné pôsobenie vied) USA 86, „Rozčlenenie 5' (1989); Poulsen postupností pre a spol., selektívnu Mol. Gen.

nukleárnych organel. Nukleárny antimediátorový gén potláča úrovne enzýmu ribulózobifosfát-karboxylóza v transformovaných tabakových rastlinách, Celí 55, str. 673-81 (1988); Smith a spoi., „Antimediátorová RNA inhibícia expresie génu polygalakturonázy v transgénnych paradajkách, Náture 334, str. 724-26 (1988); Van der Krol a spol., „Antimediátorový gén chalkonsyntáza v transgénnych rastlinách potláčajúci pigmentáciu kvetov, Náture 333, str. 866-69 (1988).

Použitie CaMV 35S promótora na expresiu QPRTázy v transformovaných tabakových bunkách a rastlinách vynálezu je výhodné. Použitie CaMV promótora na expresiu iných rekombinantných génov v koreňoch tabaku bolo presne popísané (Lam a spol., „Miestne špecifické mutácie menia in vitro faktor väzbovosti a menia formu expresie génu transgénnych rastlín, Proc. Nat. Acad. Sci. (Rokovanie národnej akadémie str. 7890-94 protismerných expresiu génu Nicotiana plumbaginifolia rbcS-8B,

Benet. (Molekulárna génová genetika) 214, str. 16-23 (1988)).

Ďalšie promótory, ktoré sú aktívne iba v koreňových tkanivách (promótory špecifické v koreňoch) sú taktiež pre metódy predloženého vynálezu velmi výhodné. Pozri, napr. U. S. patent 5 459 252, od Conkling a spol.; Yamamoto a spol.,

Rastlinná bunka, 3:371 (1991). TobRD2 špecifický promótor koreňov-kôry môže byť taktiež použitý. Pozri, napr. U.S. patent SN 08/508 786, teraz prístupná, od Conkling a spol., PCT WO 9705261. Všetky patenty citované v texte sú určené na začlenenie v texte poznámkami v ich celistvosti.

QPRTáza rekombinantnej DNA molekuly a vektory použité na produkciu transformovaných tabakových buniek a rastlín tohto vynálezu môžu ďalej obsahovať dominantný voliteľný signálny gén. Vhodné dominantné voliteľné signálne znaky na použitie v tabaku zahrňujú okrem iného antibiotické rezistentné gény kódujúce neomycinfosfotransferázu (NPTII), hydromycinfosfotransferázu (HPT) a chloramfenikolacetyltransferázu (HPT) a chloramfenikolacetyltransferázu (CAT). Iný dobre známy dominantný voliteľný signálny znak vhodný na použitie v tabaku predstavuje génový mutant dihydrofolátreduktázy, ktorý kóduje dihydrofolátreduktázu odolnú oproti metotrexáze. DNA vektory obsahujúce vhodné antibiotické rezistentné gény a odpovedajúce antibiotiká sú obchodne dostupné.

Transformované tabakové bunky sú volené z mnohopočetných netrasformovaných buniek umiestnením zmiešaného množstva buniek do kultivačného prostredia obsahujúceho vhodnú koncentráciu antibiotík (alebo iných zlúčenín bežne toxických na tabakové bunky), proti ktorým je produkt zvoleného dominantného signálneho génu rezistentný. Takto iba takéto tabakové bunky, ktoré boli transformované, zostávajú živé a rozmnožujú sa.

Spôsoby tvorby rekombinatných rastlín predloženého vynálezu, všeobecne zahrňujú najskôr zaistenie rastlinnej bunky schopnej regenerácie (rastlinná bunka obvykle sa nachádza v tkanive schopnom regenerácie). Rastlinná bunka je následne transformovaná DNA konštruktom obsahujúcim transkripčnú kazetu predloženého vynálezu (ako je uvedené v texte) a rekombinantná rastlina je regenerovaná z transformovanej rastlinnej bunky. Ako je vysvetlené nižšie, krok transformácie je urobený technikami, ktoré sú v odbore dobre známe, tieto zahrňujú, ale nie sú uvedenými príkladmi limitované, ostrelovanie rastlinnej bunky mikročasticami nesúcimi transkripčnú kazetu, infikovanie bunky Agrobacterium tumefaciens obsahujúcim Tiplazmid nesúci transkripčnú kazetu alebo akúkolvek inú techniku vhodnú na produkciu transgénnej rastliny.

Rad Agrobacterium vektorových systémov použiteľných na uskutočnenie predloženého vynálezu je známych. Napr. U.S.

patent 4 459 355 popisuje metódu transformácie prístupných rastlín, vrátane dikotóv, Agrobacterium druhom obsahujúcim Tiplazmid. Transformácia drevín Agrobacterium vektorom je popísaná v U.S. patente 4 795 855, ďalej LJ.S. patente 4 795 855. U.S. patent 4 940 838, od Schilperoort a spol., popisuje binárny Agrobacterium vektor (tj. vektor, v ktorom Agrobacterium obsahuje jeden plazmid majúci oblasť Tiplazmidu, ale žiadnu T oblasť a druhý plazmid majúci T oblasť, ale žiadnu vírovú oblasť) použitelný na uskutočnenie predloženého vynálezu.

Mikročastice nesúce DNA konštrukt predloženého vynálezu, ktoré sú vhodné na transformáciu ostreľovaním rastlinnej bunky, sú taktiež použiteľné na vytváranie transformovaných rastlín predloženého vynálezu. Mikročastica je vháňaná do rastlinnej bunky na produkciu transformovanej rastlinnej bunky a z transformovanej rastlinnej bunky je vytvorená rastlina. Pri uskutočnení predloženého vynálezu môže byť použitý akýkolvek vhodný spôsob transformácie ostreľovania buniek a prístroj. Príklady prístrojov a procedúr sú popísané v Sanford a Wolf, U.S. patent 4 945 050 a v Christou s spol., U.S. patent 5 015 580. Pokial je použitá procedúra transformácie ostreľovaním, transkripčná kazeta môže byť inkorporovaná do plazmidu schopného replikácie alebo viazania (integrácie) v bunke určenej na transformáciu. Príklady mikročastíc vhodných na použitie v uvádzaných systémoch zahrňujú 1 až 5 gm zlaté guľové častice. DNA konštrukt môže byť nanesený na mikročasticu akoukoľvek vhodnou technikou, takou ako vyzrážanie.

Rastlinné druhy môžu byť transformované DNA konštruktom predloženého vynálezu DNA-sprostredkovanou transformáciou protoplastu rastlinnej bunky a následnou regeneráciou rastliny transformovaného protoplastu spôsobmi, ktoré sú v odbore veľmi dobre známe. Fúzia tabakového protoplastu s lipozómami obsahujúcimi DNA alebo spôsobom elektroporácie je v odbore dobre známa. (Shillito a spol., (Priamy prenos génu do protoplastu dvojdeložných alebo jednodeložných rastlín mnohými spôsobmi, zahrňujúcich elektroporáciu. Metódy v enzymológii 153, str. 313-36 (1987)).

regeneráciu kultivačných

Termín „transformácia, ako je použitý v texte, označuje zavedenie exogénnej DNA do buniek na produkciu transgénnych buniek trvalo transformovaných exogénnou DNA.

Transformované bunky sú indukované na intaktných tabakových rastlín cez aplikáciu techník tabakového tkaniva a bunky, ktoré sú v odbore dobre známe. Spôsob regenerácie rastliny je zvolený tak, aby bol kompatibilný s metódou transformácie. Stála prítomnosť a orientácia sekvencie QPRTázy v transgénnych tabakových rastlinách môže byť overená mendelovskou dedičnosťou sekvencie QPRTázy, ako je uvedené v štandardných spôsobch DNA analýzy aplikovaných na potomstvo vznikajúce z kontrolovaného kríženia. Následne po regenerácii transgénnych tabakových rastlín z transformovaných buniek, introdukovaná DNA sekvencia je ľahko transferovaná do iných druhov tabaku pomocou bežnej praxe pestovania rastlín a bez nenáležitého experimentovania.

Napr. na analýzu izolácie transgénu, generované transformované rastliny (Ro) môžu byť pestované do štádia zrelosti, testované pre úrovne nikotínu a samoopelené na produkciu Ri rastlín. Percentuálny podiel Ri rastlín nesúcich transgén je homozygotný vzhľadom na transgén. Na identifikáciu homozygotných Ri rastlín sú pestované transgénne Ri rastliny až do štádia zrelosti a samoopelenia. Homozygotné Ri rastliny budú produkovať R2 potomstvo, v ktorom každá rastlina potomstva nesie transgén; potomstvo heterozygotných Ri rastlín sa bude oddeľovať 3:1.

Nikotín slúži ako prírodný pesticíd, ktorý podporuje ochranu tabakových rastlín pred napadnutím škodlivým hmyzom. Preto sa môže stať žiaduca dodatočná transformácia rastlín s nízkym alebo žiadnym obsahom nikotínu, produkovaných predkladanými spôsobmi, transgény (takým ako je Bacillus thuringiensis) , ktoré dodatočne budú poskytovať ochranu proti hmyzu.

Výhodnými rastlinami vhodnými na použitie v predložených spôsoboch sú druhy Nicotiana alebo tabaku, vrátane N. tabacum,

N. rustica a N. glutinosa. Použité môžu byť akékoľvek druhy alebo čeľade tabaku. Vhodné sú druhy, ktoré už majú nízky obsah nikotínu, také ako Nicl/Nic2 dvojitý mutant.

Akékoľvek rastlinné tkanivo schopné klonovaného šírenia, organogenézy alebo embryogenézy, môže byť transformované vektorom predloženého vynálezu. Termín „organogenéza, ako je použitý v texte, označuje proces, v ktorom sú nadzemné časti rastlín a korene vyvinuté postupne z meristematických stredov; termín „embryogenéza, ako je použitý v texte, označuje spôsob, ktorým sú spoločne vyvinuté nadzemné časti rastliny a koreňové časti rastliny súčasne prebiehajúcim spôsobom (nie následne), buď zo somatických buniek alebo gamiet. Jednotlivé zvolené tkanivá sa budú meniť podľa systému šírenia klonovania dostupného pre a najlepšie sa vhodné individuálne druhy určené na spracovanie. Príkladné cieľové tkanivá zahrňujú listy, peľ, klíčky, deložné lístky, hypokotyl, tkanivá kalu, existujúce meristematické tkanivá (napr. apikálny meristém, laterálny pupeň a koreňový meristém) a indukované meristematické tkanivá (napr. meristém deložných lístkov a meristém hypokotylu).

Rastliny predloženého vynálezu môžu mať rôzne podoby. Rastliny môžu predstavovať chiméry transformovaných buniek a netransformovaných buniek; rastliny môžu predstavovať klonovateľné transformácie (napr. všetky bunky transformované na obsah transkripčnej kazety); rastliny môžu byť očkované transformovanými a netransformovanými tkanivami (napr. transformovaný koreňový zväzok naočkovaný na netransformovaný štep z citrusových plodov). Transformované rastliny môžu byť šírené rôznymi prostriedkami, takými ako klonálne šírenie alebo klasickými technikami pestovania. Napr. prvá generácia (alebo Tl) transformovaných rastlín môže byť samoopelená za vzniku homozygotnej druhej generácie (alebo T2) transformovaných rastlín ďalej rozširovanej klasickými technikami pestovania. Dominantný voliteľný signálny znak (taký ako nptll) môže byť spojený s transkripčnou kazetou uľahčujúcou pestovanie.

Z pohľadu vyššie uvedeného bude jasné, že rastliny, ktoré môžu byť využité v praxi predloženého vynálezu, zahrňujú rastliny Nicotiana.

Tým, ktorí sú veľmi dobre oboznámení so spôsobmi rekombinantných DNA, ktoré sú popísané vyššie, pochopia, že jeden môže použiť plnú dĺžku cDNA molekuly QPRTázy alebo plnú dĺžku chromozomálneho génu QPRTázy, spojených v antikódujúcom smere vhodne účinne spojenými riadiacimi sekvenciami pre konštrukciu transgénnych tabakových buniek a rastlín. (Pracovníci skúsení v odbore budú taktiež chápať, že vhodné riadiace sekvencie pre expresiu génu v antikódujúcom smere zahrňujú akékolvek zo známych eukaryontných kódujúcich začiatočných sekvencií, v dodatku k promótoru a polyadenylačných/transkripčných koncových sekvencií popísaných vyššie). Uvedené transformované tabakové rastliny sú charakterizované zvýšenou úrovňou QPRTázy a teda aj vyšším obsahom nikotínu ako netransformované kontrolné tabakové rastliny.

Malo by byť teda jasné, že použitie DNA sekvencie QPRTázy na zníženie alebo zvýšenie úrovne QPRTázy enzýmu a tým taktiež zníženie alebo zvýšenie obsahu nikotínu v tabakových rastlinách spadá do rozsahu predloženého vynálezu.

Podlá vyjadrenia v texte zahrňuje úroda väčšinu rastlín predloženého vynálezu a rovnakého rodu, ktoré sú pestované spoločne na poľnohospodárskej pôde. Pojem „poľnohospodárska pôda označuje obvyklý malý pozemok alebo skleník. Predložený vynález týmto poskytuje spôsob produkcie úrody rastlín majúci pozmenenú aktivitu QPRTázy a tým majúci znížené alebo zvýšené úrovne nikotínu porovnané s podobnou úrodou netransformovaných rastlín rovnakého druhu a čeľade.

Príklady, ktoré nasledujú, sú zostavené na ilustráciu predloženého vynálezu a nie sú nijako zostavené v zmysle jeho obmedzenia.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 znázorňuje biosyntetickú cestu vedúcu k nikotínu. Aktivita enzýmov známa ako kontrolovateľná pomocou Nicl a Nic2 predstavuje QPRTázu (chinolát-fosforibozyltransférazu) a PMTázu (hnilobná metyl-transferáza).

Obrázok 2A uvádza sekvenciu nukleovej kyseliny NtQPTl cDNA (SEQ ID č. :1) s kódujúcou sekvenciou (SEQ ID č.: 3) znázornenú veľkými písmenami.

Obrázok 2B uvádza odvodenú aminokyselinovú sekvenciu (SEQ ID č. : 2) QPRTázy tabaku kódovanou NtQPTl cDNA.

Obrázok 3 porovnáva odvodenú NtQPTl aminokyselinovú postupnosť a príslušné sekvencie Rhodospirillum rubrum, Mycobacterium lepre, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, ľudské a Saccharomyces cerivisiae.

Obrázok 4 ukazuje výsledky doplnenia mutanta Escherichia coli, ktorému chýba chinolát-fosforibozyl-transferáza (TH65) s NtQPTl cDNA. Bunky boli transformované expresívnym vektorom nesúcim NtQPTl; rast transformovaných TH265 buniek vyjadrujúcich NtQPTl na minimálnom médiu bez kyseliny nikotínovej ukázal, že NtQPTl kóduje QPRTázu.

Obrázok 5 porovnáva úrovne nikotínu a relatívne ustálený stav úrovne NtQPTl mRNA v Nicl a Nic2 tabakových mutantov: platný typ Burley 21 (Nicl/Nicl Nic2/Nic2) ; Nicl Burley 21 (nicl/nicl Nic2/Nic2) ; Nic2 Burley 21 (Nicl/Nicl nic2/nic2) ; a Nicl Nic2 Burley 21 (nicl/nicl nic2/nic2) . Celé stĺpce označujú mRNA transkripčné úrovne; čiarkované stĺpce označujú úrovne nikotínu.

Obrázok 6 graficky znázorňuje relatívne úrovne NtQPTl mRNA za určitý čas v upravených tabakových rastlinách porovnané s neupravenými kontrolnými rastlinami. Celé stĺpce ukazujú mRNA transkripčnej úrovne; čiarkované stĺpce označujú úrovne nikotínu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1 : Izolovanie a sekvenčná analýza

TobRD2 cDNS (Conkling a spol., Phys. 93, 1203 (1990)) bol podrobený sekvenčnej analýze a je v texte označený ako SEQ ID č. :1a odvodená aminokyselinová sekvencia ako SEQ ID č. : 2. Odvodená aminokyselinová postupnosť bola odhadnutá ako cytosolický protein. Hoci rastlinné gény QPTázy neboli uvedené, porovnanie NtPTl aminokyselinovej postupnosti s GenBank databázou (obrázok 3) odhalilo obmedzené sekvenčné podobnosti s istými bakteriálnymi a inými proteínmi; aktivita chinolát-fosforibozyl-transferázy (QPRTáza) bola ukázaná pre

S. typhimurium, E. coli a N. tabacum gény. NtQPTl kódujúci QPTázu má podobnosť k odvodenej dielčej časti peptidu kódovanej Arabidopsis EST (označenie expresie sekvencie) sekvenciou (Genbank Accession number F20096), ktorá môže predstavovať časť génu Arabidopsis QPTáza.

Príklad 2 : In-situ hydridizácia

Na určenie priestorového rozloženia TobRD2 mRNA transkriptov v rôznych tkanivách koreňov, bola v netrasformovaných rastlinách uskutočnená in situ hybridizácia. In situ hydridizácia kódujúca časti reťazca TobRD2 na TobRD2 mRNA v koreňovom tkanive bola robená použitím techník, ktoré boli popísané v Meyerowitz, Plánt Mol. Biol. 5,242 (1987) a Smith a spol., Plánt Mol. Biol. Rep. 5, 237 (1987). Sedem dní staré tabakové (Nicotiana tabacum) koreňové sadenice boli ustálené v glutaraldehyde tlmenom fosfátom, uložené v Paraplast Plus (Monoject Inc., St. Louis, MO) a rozdelené na hrúbku 8 mm na získanie priečnych rovnako ako pozdĺžnych blokov. Kódujúce TobRD2 transkripty, syntetizované in vitro s prítomnosťou 35S-ATP, boli použité ako nukleotidové sondy. Označená RNA bola hydrolyzovaná alkalickou úpravou na získanie % 100 až 200 základnej priemernej dĺžky média pred použitím.

Hybridizácie boli robené v 50% formamide počas 16 hodín pri teplote 42 °C s priemerným 5 x 10⁶ počtom odpočítacích impulzov za minútu (cpm) označenej RNA na milimeter hybridizačného roztoku. Doštičky sa vyvinuli následne po aplikácii požadovaným vplyvom a tieto boli viditeľnené pod svetelnými a tmavými pólami mikroskopu.

Hybridizačný signál bol lokalizovaný v rohovitej vrstve buniek koreňov (výsledky neboli znázornené). Porovnanie ako svetlých, tak aj tmavých obrazov polí rovnakých častí lokalizovalo TobRD2 transkripty parenchymatických buniek vonkajšej kôry koreňov. V epiderme alebo stielke nebol viditelný žiadny hybridizačný signál.

* h

Príklad 3 : TobRD2 mRNA úrovne v Nicl a Nic2 tabakových mutantoch a vzájomný vzťah k úrovni nikotínu

Ustálený stav mRNA úrovne na TobRD2 bol skúšaný v Nicl a Nic2 mutantných tabakových rastlinách. Nicl a Nic2 sú na reguláciu aktivity chinolát-fosforibozyl-transferázy a aktivity hnilobnej metyl-transferázy známe a sú kodominarr nými regulátormi produkcie nikotínu. Prezentované výsledky sú ilustrované na obrázku 5A a 5B, ukazujúcich, že TobRD2 expresia je regulovaná Nicl a Nic2.

RNA bola izolovaná z koreňov divokého typu Burley 21 tabakových rastlín (Nicl/Nicl Nic2/Nic2) ; koreňov Nicl Burley 21 (nicl/nicl Nic2/Nic2) ; koreňov Nic2 - Burley 21 (Nicl/Nicl nic2/nic2) ; a koreňov Nicl-Nic2-Burley 21 (nicl nic2/nic2).

Štyri Burley 21 tabakové rady (nie) boli pestované počas jedného mesiaca v pôde zo semena a premiestnené do hydroponických komôr v prevzdušnenom živnom roztoku v skleníku počas jedného mesiaca. Tieto rady boli izogénne, okrem dvoch loci s nízkym obsahom nikotínu a mali genotypy Nicl/Nicl Nic2/Nic2, Nicl/Nicl nic2/nic2, nicl/nicl Nic2/Nic2, nicl/nicl nic2/nic2. Korene boli zberané z asi 20 rastlín pre každý genotyp a upravené na izoláciu RNA. Celková RNA (lgg) z každého genotypu bola podrobená elektroforézii cez 1% gél agarózy obsahujúci 1,1 M formaldehydu a transferovaná do nylonovej membrány podlá Sambrook a spol. (1989). Membrány boli hybridizované s ³²P-označenými TobRD2 cDNA malými časťami. Relatívne intenzity TobRD2 transkriptov boli merané využitím denzitometrie. Obrázok 5 (celé stĺpce) ilustruje relatívne transkripčné úrovne (porovnané k Nicl/Nicl Nic2/Nic2) pre každý zo štyroch genotypov. Relatívny obsah nikotínu (porovnané k Nicl/Nicl Nic2/Nic2} štyroch genotypov je znázornený čiarkovanými stĺpcami.

Obrázok 5 graficky porovnáva relatívne ustálený stav TobRD2 mRNA úrovne, využitím úrovne zistenej u divokého typu Burley 21 (Nicl/Nicl Nic2/Nic2) ako referenčného (kontrolného) množstva. TobRD2 úrovne mRNA v Nicl/Nic2 dvojitých mutantoch boli približne 25% úrovne divokého typu tabaku. Obrázok 5B ďalej porovnáva relatívne úrovne nikotínu v blízkom izogénnom rade tabaku študované v tomto príklade (celé stĺpce označujú úroveň nikotínu). Existujú tesné vzájomné väzby medzi úrovňami nikotínu a TonRD2 transkripčnými úrovňami.

Príklad 4 : Vplyv nanášania na TobRD2 mRA úrovne

V odbore je známe, že odstránenie hornej časti kvetu tabakovej rastliny (vrchná úprava) zvyšuje rast koreňov a zvyšuje obsah nikotínu v listoch rastliny. Vrchná úprava rastlín je obvyklou praxou pestovania tabaku pre obchodné účely a optimálny čas pre vrchnú úpravu danej tabakovej úrody pri známych podmienkach pestovania môže byť ľahko určený odborným pracovníkom.

Tabakové rastliny (N. tabacum SR1) boli pestované v pôde zo semena počas 1 mesiaca a prenesené do nádob obsahujúcich piesok. Rastliny boli pestované v skleníku ďalšie dva mesiace, pokiaľ nezačali nasadzovať kvety. Horné časti kvetov a dva uzly boli zo štyroch rastlín odstránené (vrchná úprava). Koreňová časť bola z každej rastliny po stanovenom čase pozberaná a nahromadená pre extrakciu RNA. Kontrolné rastliny neboli podrobené vrchnej úprave. Celková RNA (lpg) každého časového bodu bola podrobená elektroforéze cez 1 % gélu agarózy obsahujúceho 1,1 M formaldehydu a transformovaná na nylonovú membránu podlá Sambrook a spol., (1989). Membrány boli hybridizované ³²P-označenými TobRD2 cDNA malými časťami. Relatívne intenzity TobRD2 transkriptov boli merané denzitometriou. Obrázok 6 ilustruje relatívne transkripčné úrovne (porovnané s nulovou hodnotou času) pre každý časový úsek s vrchnou úpravou (celé stĺpce) alebo bez vrchnej úpravy (čiarkované stĺpce).

Relatívne úrovne PobRD2 boli stanovené v koreňovom tkanive po 24 hodinách; výsledky sú znázornené na obrázku 6 (celé stĺpce udávajú TobRD2 transkripčné úrovne v rastlinách s vrchnou úpravou; čiarkované stĺpce udávajú TobRD2 transkripčné úrovne v kontrolných rastlinách bez povrchovej úpravy) . Počas šiestich hodín po uskutočnení vrchnej úpravy tabakových rastlín sa mRNA úrovne pre TobRD2 zvýšili približne 8-krát v rastlinách s vrchnou úpravou; počas rovnakého času nebolo zistené žiadne zvýšenie v kontrolných rastlinách).

Príklad 5 : Doplnenie bakteriálneho mutanta bez QPRtázy DNA sekvencie SEQ ID č. : 1

Escherichia coli druh TH265 predstavuje mutant bez chinolát-fosforibozyl-transferázy (nadC-) a tak nemôže rásť v prostredí bez kyseliny nikotínovej.

TH265 bunky boli transformované expresívnym vektorom (pWSl61) obsahujúcim DNA sekvenciu SEQ ID č. : 1 alebo iba transformované expresívnym vektorom (pKK233). Rast transformovaných baktérií bol porovnávaný s rastom TH265 (pKK233) transformovaného typu a s rastom netransformovaného TH265 nadC- mutantu. Rast bol porovnaný na minimálnom médiu molekulárnou elektronikou (bez kyseliny nikotínovej) a na minimálnom médiu s dodanou kyselinou taktiež molekulárnou elektronikou.

E. coli druh s QPTáza mutáciou (nadC), TH265, bol poskytnutý spôsobom podlá Dr. K. T. Hughes (Hughes a spol., J. Bact. 175:479 (1993). Bunky boli udržiavané na LB médiu a spôsobilé bunky pripravené podía popisu od Sambrook a spol. (1989). Expresívny plazmid bol vytvorený v pKK2233 (Brosius, 1984) s TobRD2 cDNA klonovanou pod kontrolou Tac promótora. Výsledný plazmid, PWS161, bol transformovaný do TH265 buniek. Transformované bunky boli následne očkované na minimálne médium (Vogel a Bonner, 1956) agarové platne bez alebo s využitím kyseliny nikotínovej (0,0002 %) ako suplementu. TH265 bunky samotné a TH265 transformované s pKK2233 boli očkované na podobných doskách za účelom použitia ako kontrolnej vzorky.

Výsledky sú znázornené na obrázku 4. Iba TH265 transformovanej DNA sekvencie SEQ ID č. : 1 rástla v prostredí bez kyseliny nikotínovej. Tieto výsledky ukazujú, že expresia DNA sekvencie SEQ ID č. : 1 v TH265 bakteriálnych bunkách dodáva NadC+ fenotyp k týmto bunkám, potvrdzujúci, že táto sekvencia kóduje QPRTázu. TobRD2 názov bol tak pozmenený na NtQPTl.

Príklad 6 : Transformácia tabakových rastlín

DNA sekvencia SEQ ID č. : 1, v kódujúcom smere, je účinne pripojená na rastlinný promótor (caMV 35S alebo TobRD2 špecifický promótor korene-kôra) na produkciu dvoch rôznych DNA kaziet : CaMV35S promótor/kódujúca SEQ ID č. :1a TobRD2 promótor/kódujúci SEQ ID č. : 1.

Divoký typ tabaku a tabak s nízkym obsahom nikotínu sú vybrané pre transformáciu, napr. divoký typ Burley 21 tabak (Nicl+/Nic2+) a homozygotné nicl-/nic2- Burley 21. Väčšina tabakových rastlinných buniek každého radu sú transformované použitím DNA kazety. Transformácia je uskutočnená použitím Agrobacterium vektora, napr. Agrobacterium- binárneho vektora nesúceho Ti-okrajové sekvencie a nptll gén (dodávajúci odolnosť proti kanamycínu a kontrolovanej nos promótorom (nptll)) .

Transformované bunky sú vybrané a regenerované na transgénne tabakové rastliny (R_o) . Ro rastliny sú pestované do zrelého štádia a testované na úrovne nikotínu; podskupina transformovaných tabakových rastlín ukázala výrazne nižšie úrovne nikotínu v porovnaní s netransformovanými kontrolnými rastlinami. Ro rastliny sú následne samoopelené a v Ri potomstve je analyzované vyštiepenie transgénu. Ri potomstvá sú pestované do zrelého štádia a samoopelenia; vyštiepenie transgénu medzi R2 potomstvom označuje, ktoré Ri rastliny sú homozygotné pre transgén.

SEKVEŇCIE (1) Všeobecné informácie :

(i) Žiadate! : Conkling, Mark A

Mendu, Mandini Song, Wen (ii) Názov vynálezu :

(iii) Počet sekvencií : 4 (iv) Korešpondenčná adresa :

(A)	Adresa Gibson	: Kenneth Sibley, Bell Selt
(B)	Ulica :	Post Office Drawer 34009
(C)	Mesto :	Charlotte
(D)	Štát :	North Carolina
(E)	Krajina	: USA
(F)	Kód : 28234

(v) Údaje o počítačovom systéme (A) Typ média : Floppy disk (B) Počítač : IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém : PC-DOC/S-DOS (D) Software : Patentln Release #1.0. Verzia #1.30 (vi) Bežné údaje o aplikácii :

(A) Číslo aplikácie :

(B) Dátum podania :

(C) Klasifikácia :

(viii) Informácie o zástupcovi/zmocnencovi :

(A) Meno : Sibley, Kenneth D.

(B) Číslo registrácie : 31,665 (C) Referenčné/rokovacie číslo : 5051-338P (ix) Telekomunikačné informácie :

(A) Telefón : 919-420-2200 (B) Telefax : 919-881-3175 (2) Informácie o SEQ ID č. : 1 (i) Charakteristiky sekvencie (A) Dĺžka : 1399 párov báz (B) Typ : kyselina nukleová (C) Typ reťazca : jednoduchý (D) Topológia : lineárna (ii) Typ molekuly : cDNA (ix) Vlastnosti :

(A) Mená/KIúč . CDS (B) Umiestnenie : 52..1104 (x) Popis sekvencie : SEQ ID č. : 1

CAAAAACTAT TTTCCACAAA ATTCATTTCA CAACCCCCCC AAAAAAAAAC C ATG TTT Met Phe

AGA

GCT

AK

CCT

KC

ACT

GCT

ACA

GTG

CAT

CCT

TAT GCA

AK

ACA

GCT

Arg

Ala

íle

Pro

Phe

Thr

Ala

Thr

Val

His

Pro

Tyr Ala

íle

Thr

Ala

5

10

15

CCA

AGG

KG

GTG

GTG

AAA

ATG

TCA

GCA

ATA

GCC

ACC AAG

AAT

ACA

AGA

Pro

Arg

Leu

Val

Val

Lys

Met

Ser

Ala

íle

Ala

Thr Lys

Asn

Thr

Arg

20

25

30

GTG

GAG

TCA

KA

GAG

GTG

AAA

CCA

CCA

GCA

CAC

CCA ACT

TAT

GAT

KA

Val

Glu

Ser

Leu

Glu

Val

Lys

Pro

Pro

Ala

His

Pro Thr

Tyr

Asp

Leu

35

40

45

50

AAG GAA GTT ATG AAA CK GCA CTC TCT GAA GAT GCT GGG AAT TTA GGA Lys Glu Val Met Lys Leu Ala Leu Ser Glu-Asp Ala Gly Asn Leu Gly

60 65

GAT GTG ACT TGT AAG GCG ACA ATT CCT CK GAT ATG GAA TCC GAT GCT Asp Val Thr Cys Lys Ala Thr íle Pro Leu Asp Met Glu Ser Asp Ala

75 80

105

153

201

249

297

CAT

KT

CTA

GCA

AAG

GAA

GAC

GGG

ATC

ATA

GCA

GGA

AK

GCA

CK

GCT

345

His

Phe

Leu

Ala

Lys

Glu

Asp

Gly

íle

íle

Ala

Gly

íle

Ala

Leu

Ala

85

90

95

GAG

ATG

ATA

KC

GCG

GAA

GK

GAT

CCT

TCA

KA

AAG

GTG

GAG

TGG

TAT

393

Glu

Met

íle

Phe

Ala

Glu

Val

Asp

Pro

Ser

Leu

Lys

Val

Glu

Trp

Tyr

100

105

110

GTA

AAT

GAT

GGC

GAT

AAA

GK

CAT

AAA

GGC

KG

AAA

KT

GGC

AAA

GTA

441

Val

Asn

Asp

Gly

Asp

Lys

Val

His

Lys

Gly

Leu

Lys

Phe

Gly

Lys

Val

115

120

125

130

CAA

GGA

AAC

GCT

TAC

AAC

AK

GK

ATA

GCT

GAG

AGG

GK

GK

CTC

AAT

489

Gin

Gly

Asn

Ala

Tyr

Asn

íle

Val

íle

Ala

Glu

Arg

Val

Val

Leu

Asn

135

140

145

KT

ATG

CAA

AGA

ATG

AGT.

GGA

ATA

GCT

ACA

CTA

ACT

AAG

GAA

ATG

GCA

537

Phe

Met

Gin

Arg

Met

Ser

Gly

íle

Ala

Thr

Leu

Thr

Lys

Glu

Met

Ala

150

155

160

GAT

GCT

GCA

CAC

CCT

GCT

TAC

ATC

KG

GAG

ACT

AGG

AAA

ACT

GCT

CCT

585

Asp

Ala

Ala

His

Pro

Ala

Tyr

íle

Leu

Glu

Thr

Arg

Lys

Thr

Ala

Pro

165

170

175

GGA TTA CGT TTG GTG GAT AAA TGG GCG GTA KG ATC GGT GGG GGG AAG 633

Gly Leu Arg Leu Val Asp Lys Trp Ala Val Leu íle Gly Gly Gly Lys

180 185 190

AAT CAC AGA ATG GGC KA TTT GAT ATG GTA ATG ATA AAA GAC AAT CAC 681

Asn His Arg Met Gly Leu Phe Asp Met Val Met íle Lys Asp Asn His

195 200 205 210

ATA TCT GCT GCT GGA GGT GTC GGC AAA GCT CTA AAA TCT GTG GAT CAG 729 íle Ser Ala Ala Gly Gly Val Gly Lys Ala Leu Lys Ser Val Asp Gin

215 220 225

TAT KG GAG CAA AAT AAA CK CAA ATA GGG GK GAG GK GAA ACC AGG 777

Tyr Leu Glu Gin Asn Lys Leu Gin íle Gly Val Glu Val Glu Thr Arg

230 235 240

ACA AK GAA GAA GTA CGT GAG GK CTA GAC TAT GCA TCT CAA ACA AAG 825

Thr íle Glu Glu Val Arg Glu Val Leu Asp Tyr Ala Ser Gin Thr Lys

245 250 255

ACT TCG KG ACT AGG ATA ATG CTG GAC AAT ATG GK GK CCA KA TCT 873

Thr Ser Leu Thr Arg íle Met Leu Asp Asn Met Val Val Pro Leu Ser

260 265 270

AAC GGA GAT AK GAT GTA TCC ATG CK AAG GAG GCT GTA GAA KG ATC 921

Asn Gly Asp íle Asp Val Ser Met Leu Lys Glu Ala Val Glu Leu íle

275 280 285 290

AAT GGG AGG TK GAT ACG GAG GCT TCA GGA AAT GK ACC CK GAA ACA 969

Asn Gly Arg Phe Asp Thr Glu Ala Ser Gly Asn Val Thr Leu Glu Thr

295 300 305

GTA CAC AAG AK GGA CAA ACT GGT GK ACC TAC AK TCT AGT GGT GCC 1017

Val His Lys lie Gly Gin Thr Gly Val Thr Tyr íle Ser Ser Gly Ala

310 315 320

CTG ACG CAT TCC GTG AAA GCA CK GAC AK TCC CTG AAG ATC GAT ACA 1065

Leu Thr His Ser Val Lys Ala Leu Asp íle Ser Leu Lys íle Asp Thr

325 330 335

GAG CTC GCC CK GAA GK GGA AGG CGT ACA AAA CGA GCA TGAGCGCCAT 1114 Glu Leu Ala Leu Glu Val Gly Arg Arg Thr Lys Arg Ala

340 345 350

TACŤTCTGCT ATAGGGKGG AGTAAAAGCA GCTGAATAGC TGAAAGGTGC AAATAAGAAT 1174

CATTKACTA GKGTCAAAC AAAAGATCCT TCACTGTGTA ATCAAACAAA AAGATGTAAA 1234

KGCTGGAAT ATCTCAGATG GCTCTTKCC AACCKAKG CKGAGKGG TAATKCAK 1294

ATAGCTKGT TKCATGTK CATGGAAKT GKACAATGA AAATACKGA TKATAAGK 1354

TGGTGTATGT AAAAKCTGT GKACKCAA ATATTKGAG ATGK 1399 (2)

Informácie o SEQ ID č. : 2 (i) Charakteristiky sekvencie (A) Dĺžka : 351 aminokyselín (B) Typ : aminokyselina (C) Topológia : lineárna (ii) Typ molekuly : protein (xi) Popis sekvencie :

Met	Phe	Arg	Ala	íle	Pro	Phe	Thr
1			5
Thr	Ala	Pro	Arg	Leu	Val	Val	Lys
			20
Thr	Arg	Val	Glu	Ser	Leu	Glu	Val
		35					40
Asp	Leu	Lys	Glu	Val	Met	Lys	Leu
	50					55
Leu	Gly	Asp	Val	Thr	Cys	Lys	Ala
65				70
Asp	Ala	His	Phe	Leu	Ala	Lys	Glu
				85
Leu	Ala	Glu	Met	íle	Phe	Ala	Glu
			100
Trp	Tyr	Val	Asn	Asp	Gly	Asp	Lys
		115			120
Lys	Val	Gin	Gly	Asn	Ala	Tyr	Asn
	130				135
Leu	Asn	Phe	Met	Gin	Arg	Met	Ser
145					150
Met	Ala	Asp	Ala	Ala	His	Pro	Ala
			165
Ala	Pro	Gly	Leu	Arg	Leu	Val	Asp
			180
Gly	Lys	Asn	His	Arg	Met	Gly	Leu
		195			200
Asn	His	íle	Ser	Ala	Ala	Gly	Gly
	210					215
Asp	Gin	Tyr	Leu	Glu	Gin	Asn	Lys
225					230

SEQ ID č. : 2

Ala	Thr	Val	His	Pro	Tyr	Ala	íle
	10				15
Met	Ser	Ala	íle	Ala	Thr	Lys	Asn
25					30
Lys	Pro	Pro	Ala	His	Pro	Thr	Tyr
				45
Ala	Leu	Ser	Glu	Asp	Ala	Gly	Asn
			60
Thr	íle	Pfo-	Leu	Asp	Met	Glu	Ser
		75				80
Asp	Gly	íle	íle	Ala	Gly	íle	Ala
90					95
Val	Asp	Pro	Ser	Leu	Lys	Val	Glu
105				110
Val	His	Lys	Gly	Leu	Lys	Phe	Gly
			125
íle	Val	íle	Ala	Glu	Arg	Val	Val
			140
Gly	íle	Ala	Thr	Leu	Thr	Lys	Glu
	155				160
Tyr	íle	Leu	Glu	Thr	Arg	Lys	Thr
170					175
Lys	Trp	Ala	Val	Leu	íle	Gly	Gly
185				190
Phe	Asp	Met	Val	Met	íle	Lys	Asp
			205
Val	Gly	Lys	Ala	Leu	Lys	Ser	Val
	220
Leu	Gin	íle	Gly	Val	Glu	Val	Glu
		235				240

Thr

Arg

Thr

íle

Glu

Glu Val

Arg

Glu

Val

Leu

Asp

Tyr

Ala

Ser

Gin

245

250

255

Thr

Lys

Thr

Ser

Leu

Thr Arg

íle

Met

Leu

Asp

Asn

Met

Val

Val

Pro

260

265

270

Leu

Ser

Asn

Gly

Asp

íle Asp

Val

Ser

Met

Leu

Lys

Glu

Ala

Val

Glu

275

280

285

Leu

íle

Asn

Gly

Arg

Phe Asp

Thr

Glu

Ala

Ser

Gly

Asn

Val

Thr

Leu

290

295

300

Glu

Thr

Val

His

Lys

íle Gly

Gin

Thr

Gly

Val

Thr

Tyr

íle

Ser

Ser

305

310

315

320

Gly

Ala

Leu

Thr

His

Ser Val

Lys

Ala

Leu

Asp

íle

Ser

Leu

Lys

íle

325

330

335

Asp

Thr

Glu

Leu

Ala

Leu Glu

Val

Gly

Arg

Arg

Thr

Lys

Arg

Ala

340

345

350

(2) Informácie o SEQ ID č. : 3 (i) Charakteristiky sekvencie (A) DÍžka : 1053 párov báz (B) Typ : kyselina nukleová (C) Typ reťazca : jednoduchý (D) Topológia : lineárna (ii) Typ molekuly : cDNA (xi) Popis sekvencie : SEQ ID č. : 3

ATGTTľAGAG CTATTCCTTT CACTGCTACA GTGCATCCTT ATGCAATTAC AGCTCCAAGG 60 TTGGTGGTGA AAATGTCAGC AATAGCCACC AAGAATACAA GAGTGGAGTC ATTAGAGGTG 120 AAACCACCAG CACACCCAAC TTATGATTTA AAGGAAGTTA TGAAACTTGC ACTCTCTGAA 180 GATGCTGGGA ATTTAGGAGA TGTGACTTGT AAGGCGACAA TTCCTCTTGA TATGGAATCC 240 GATGCTCATT TTCTAGCAAA GGAAGACGGG ATCATAGCAG GAATTGCACT TGCTGAGATG 300 ATATTCGCGG AAGTTGATCC TTCATTAAAG GTGGAGTGGT ATGTAAATGA TGGCGATAAA 360 GTTCATAAAG GCTTGAAATT TGGCAAAGTA CAAGGAAACG CTTACAACAT TGTTATAGCT 420 GAGAGGGTTG TTCTCAATTT TATGCAAAGA ATGAGTGGAA TAGCTACACT AACTAAGGAA 480 ATGGCAGATG CTGCACACCC TGCTTACATC TTGGAGACTA GGAAAACTGC TCCTGGATTA 540 CGTTTGGTGG ATAAATGGGC GGTATTGATC GGTGGGGGGA AGAATCACAG AATGGGCTTA 600

TTTGATATGG TAATGATAAA AGACAATCAC ATATCTGCTG CTGGAGGTGT CGGCAAAGCT 660 CTAAAATCTG TGGATCAGTA TTTGGAGCAA AATAAACTTC AAATAGGGGT TGAGGTTGAA 720 ACCAGGACAA TTGAAGAAGT ACGTGAGGTT CTAGACTATG CATCTCAAAC AAAGACTTCG 780 TTGACTAGGA TAATGCTGGA CAATATGGTT GTTCCATTAT CTAACGGAGA TATTGATGTA 840 TCCATGCTTA AGGAGGCTGT AGAATTGATC AATGGGAGGT TTGATACGGA GGCTTCAGGA 900 AATGTTACCC TTGAAACAGT ACACAAGATT GGACAAACTG GTGTTACCTA CATTTCTAGT 960 GGTGCCCTGA CGCATTCCGT GAAAGCACTT GACATTTCCC TGAAGATCGA TACAGAGCTC 1020 GCCCHGAAG TTGGAAGGCG TACAAAACGA GCA 1053

Claims (40)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaná DNA molekula obsahujúca sekvenciu zvolenú zo skupiny zahrňujúcej :

   (a) SEQ ID č. : 1 (b) DNA sekveňcie, ktoré kódujú enzým majúci SEQ ID č. : 2 (c) DNA sekveňcie, ktoré hybridizujú na izolovanú DNA sekvenciu (a) alebo (b) uvedenú vyššie a ktoré kódujú enzým chinolát-fosforibozyl-transferázu ; a (d) DNA sekveňcie, ktoré sa líšia od DNA (a), (b) alebo (c) uvedených vyššie, vďaka degenerácii genetického kódu.
2. 2. DNA konštrukt obsahujúci expresívnu kazetu, vyznačujúci sa tým, že konštrukt obsahuje v smere 5'k 3' promótor účinný v rastlinnej bunke a DNA časť podlá nároku 1 umiestnenú v smere od uvedeného promótora a účinne s týmto spojenú.
3. 3. DNA konštrukt obsahujúci expresívnu kazetu, vyznačujúci sa tým, že konštrukt obsahuje v smere 5'k 3' rastlinný promótor a DNA časť podľa nároku 1 umiestnenú v smere uvedeného promótora a účinne s týmto spojenú, uvedená DNA časť je v kódujúcom smere.
4. 4. DNA konštrukt, vyznačujúci sa tým, že obsahuje v smere 5' k 3' promótor účinný v rastlinnej bunke a DNA kódujúcu chinolát-fosforibozyl-transferázu, uvedená DNA je účinne spojená s uvedeným promótorom.
5. 5. DNA konštrukt, vyznačujúci sa tým, že obsahuje v smere 5' k 3' promótor účinný v rastlinnej bunke a DNA kódujúcu rastlinnú chinolát-fosforibozyl-transferázu, uvedená DNA je v kódujúcom smere a účinne spojená s uvedeným promótorom.

   DNA konštrukt podlá nároku 2, tým, že jeho promótor v rastlinných bunkách.

   3, 4 alebo 5, vyznačujúci sa je konštitutívne aktívny
6. 7. DNA konštrukt podlá nároku 2, 3, 4 alebo 5, vyznačujúci sa tým, že jeho uvedený promótor je selektívne aktívny v bunkách rastlinného koreňového tkaniva.
7. 8. DNA konštrukt podlá nároku 2, 3, 4 alebo 5, vyznačujúci sa tým, že jeho uvedený promótor je selektívne aktívny v bunkách rastlinného tkaniva kôry koreňov.
8. 9. DNA konštrukt podlá nárokov 2, 3, 4 alebo 5, vyznačujúci sa tým, že uvedený konštrukt ďalej obsahuje plazmid.
9. 10. DNA konštrukt podlá nároku 2, 3, 4 alebo 5, vyznačujúci sa tým, že je prenášaný rastlinným transformačným vektorom.
10. 11. DNA konštrukt podľa nároku 2, 3, 4 alebo 5, vyznačujúci sa tým, že je prenášaný rastlinným transformačným vektorom, pričom rastlinný transformačný vektor predstavuje Agrobacterium tumefaciens vektor.
11. 12. Rastlinná bunka obsahujúca DNA konštrukt podľa nároku 2, 3,

    4 alebo 5.
12. 13. Transgénna rastlina obsahujúca rastlinné bunky podľa nároku

    12.
13. 14. Peptid majúci sekvenciu SEQ ID č. : 2.
14. 15. Peptid kódovaný DNA sekvenciou zvolenou zo skupiny zahrňujúcej :

    (a) SEQ ID č. : 1 (b) DNA sekvencie, ktoré hybridizujú na izolovanú DNA bodu (a) vyššie a ktoré kódujú enzým chinolát-fosforibozyltransferázu ; a (c) DNA sekvencia, ktorá sa odlišujú od DNA bodu (a) alebo (b) vyššie vďaka degenerácii genetického kódu.
15. 16. Spôsob prípravy transgénnej rastlinnej bunky majúci zníženú expresiu chinolát-fosforibozyl-transferázy (QPRTázy), vyznačujúci sa tým, že uvedený spôsob zahrňuje :

    •prípravu rastlinnej bunky známeho typu na expresiu chinolát-fosforibozyl-transferázy;

    •prípravu exogénneho DNA konštruktu, konštrukt obsahuje v smere 5' k 3' promótor účinný v rastlinnej bunke a DNA obsahujúcu časť sekvencie kódujúcu mRNA chinolátfosforibozyl-transferázu, uvedená DNA je účinne spojená s uvedeným promótorom ; a • transformáciu uvedenej rastlinnej bunky uvedeným DNA konštruktom na produkciu transformovaných buniek, uvedená rastlinná bunka má zníženú expresiu QPRTázy v porovnaní s netransformovanou bunkou.
16. 17. Spôsob podlá nároku 16, vyznačujúci sa tým, že uvedená DNA obsahujúca časť sekvencie kódujúcej mRNA chinolátfosforibasyl-transferázy je v kódujúcom smere.
17. 18. Spôsob podlá nároku 16, vyznačujúci sa tým, že uvedená DNA obsahujúca časť sekvencie kódujúcej mRNA chinolátfodforibosyl-transferázy je v antikódujúcom smere.
18. 19. Spôsob podlá nároku 16, vyznačujúci sa tým, že uvedená rastlinná bunka predstavuje Nicotiana tabacum.
19. 20. Spôsob podlá nároku 16, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahrňuje regeneráciu rastliny z uvedenej transformovanej rastlinnej bunky.

    21. Spôsob podľa promótor je k( nároku inštitút 16, :ívne vyznačujúci aktívny. sa tým, že uvedený 22. Spôsob podlá nároku 16, vyznačujúci sa tým, že uvedený promótor je selektívne aktívny v bunkách rastlinného koreňového tkaniva. 23. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že uvedený

    promótor je selektívne aktívny k bunkám rastlinného tkaniva koreňovej kôry.
20. 24. Spôsob podlá nároku 16, vyznačujúci sa tým, že uvedený krok transformácie je uskutočňovaný ostrelovaním uvedenej rastlinnej bunky mikročasticami nesúcimi uvedený DNA konštrukt.
21. 25. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že uvedený krok transformácie je uskutočňovaný infikovaním uvedenej rastlinnej bunky s Agrobacterium tumefaciens obsahujúcim Tiplazmid nesúci uvedený DNA konštrukt.
22. 26. Spôsob produkcie osiva transgénneho tabaku, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje zber osiva z transgénnej tabakovej rastliny produkovanej spôsobom podľa nároku 19.
23. 27. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že uvedená exogénna DNA sekvencia je doplňujúca k uvedenej mediátorovej RNA chinolát-fosforibozyl-transferázy (QPRT mRNA) expresívnej v uvedenej rastlinnej bunke v oblasti zvolenej z ;

    (a) 5'- nepremenená sekvencia uvedenej QPRT mRNA;

    (b) 3'- nepremenená sekvencia uvedenej QPRT mRNA ; a (c) premenená oblasť uvedenej QPRT mRNA.
24. 28. Spôsob podía nároku 16, vyznačujúci sa tým, že uvedená exogénna DNA sekvencia je doplnková aspoň na 15 nukleotidoch uvedenej mediátorovej RNA chinolátfosforibozyl-transferázy expresívnej v uvedenej rastlinnej bunke.
25. 29. Spôsob podía nároku 16, vyznačujúci sa tým, že uvedená exogénna DNA sekvencia je doplnková aspoň na 200 nukleotidoch uvedenej mediátorovej RNA chinolátfosforibozyl-transferázy expresívnej v uvedenej rastlinnej bunke.
26. 30. Spôsob podía nároku 16, vyznačujúci sa tým, že uvedená exogénna DNA sekvencia obsahuje chinolát-fosforibozyltransferázu, kódujúcu sekvenciu zvolenú z DNA sekvencií nároku 1.
27. 31. Transgénna rastlina druhu Nicotiana, vyznačujúca sa tým, že táto má zníženú expresiu chinolát-fosforibozyl-transferázy (QPRTáza) oproti netransformovanej kontrolnej rastline, uvedená transgénna rastlina obsahuje transgénne rastlinné bunky obsahujúce :

    • exogénny DNA konštrukt obsahujúci v smere 5'k 3'promótor účinný v uvedenej rastlinnej bunke a DNA obsahujúcu časť DNA sekvencie, ktorá kóduje rastlinnú mRNA chinolátfosforibozyl-transferázu, uvedená DNA je účinne spojená s uvedeným promótorom ;

    uvedená rastlina prejavuje zníženú expresiu QPRTázy v porovnaní s netransformovanou kontrolnou rastlinou.
28. 32. Spôsob podía nároku 31, vyznačujúci sa tým, že uvedená časť

    DNA obsahujúcej časť DNA sekvencie kódujúcej mRNA chinolátfosforibozyl-transferázu je v kódujúcom smere.
29. 33. Spôsob podľa nároku 31, vyznačujúci sa tým, že uvedená časť

    DNA obsahujúcej časť DNA sekvencie kódujúcej mRNA chinolátfosforibozyl-transferázu je v antikódujúcom smere.
30. 34. Transgénna rastlina druhu Nicotiana, vyznačujúca sa tým, že táto má zníženú expresiu chinolát-fosforibozyl-transferázy (QPRTáza) oproti netransformovanej kontrolnej rastline, kedy uvedená transgénna rastlina predstavuje potomstvo rastlín podľa nároku 31.
31. 35. Osivo transgénnej rastliny druhov Nicotiana, vyznačujúce sa tým, že toto má zníženú expresiu chinolát-fosforibozyltransferázy (QPRTázy) oproti netransformovanej kontrolnej rastline, keď uvedená transgénna rastlina je rastlinou podľa nároku 31 alebo jej potomstvom.
32. 36. Úroda, vyznačujúca sa tým, že obsahuje väčšinu rastlín podľa nároku 31 rastúcich spoločne na poľnohospodárskom pozemku.
33. 37. Spôsob zníženia expresie génu chinolát-fosforibozyltransferázy v rastlinnej bunke, vyznačujúci sa tým, že spôsob zahrňuje :

    • pestovanie rastlinnej bunky transformovanej na obsah exogénnej DNA, keď prenesený reťazec uvedenej exogénnej DNA je doplnkovým k mRNA chinolát-fosforibozyltransferáze endogénnej v uvedenej bunke, čím transkripcia uvedeného doplnkového reťazca znižuje expresiu uvedeného génu chinolát-fosforibozylu.
34. 38. Spôsob produkcie tabakovej rastliny so zníženými úrovňami nikotínu v listoch uvedenej tabakovej rastliny, vyznačujúci sa tým, že uvedený spôsob zahrňuje :

    pestovanie tabakovej rastliny alebo rastlín ich potomstva, pričom uvedená rastlina obsahuje bunky obsahujúce DNA konštrukt zahrňujúci transkripčnú iniciačnú oblasť účinnú v uvedenej rastline a exogénna DNA sekvenciu účinne spojenú s uvedenou transkripčnou iniciačnou oblasťou, kedy prenesený reťazec uvedenej DNA sekvencie je doplňujúcim k endogénnej mediátorovej RNA chinolát-fosforibozyl-transferáze v uvedených bunkách.
35. 39. Spôsob prípravy transgénnej rastlinnej bunky majúcej zvýšenú expresiu chinolát-fosforibozyl-transferázy (QPRTázy), vyznačujúci sa tým, že uvedený spôsob zahrňuje :

    • zaistenie rastlinnej bunky známeho typu na expresiu chinolát-fosforibozyl-transferázy ;

    • zaistenie exogénneho DNA konštruktu, ktorý obsahuje v smere od 5'k 3'promótor účinný v rastlinnej bunke a DNA sekvenciu kódujúcu chinolát-fosforibozyltransferázu, uvedená DNA sekvencia je účinne spojená s uvedeným promótorom ; a • transformáciu uvedenej rastlinnej bunky uvedeným DNA konštruktom na produkciu transformovaných buniek, uvedená rastlinná bunka majúca zvýšenú expresiu QPRTázy v porovnäní s netransformovanou bunkou.
36. 40. Transgénna rastlina druhov Nicotiana, vyznačujúca sa tým, že má zvýšenú expresiu chinolát-fosforibozyl-transerázy (QPRTázy) oproti netransformovanej kontrolnej rastline, uvedená transgénna rastlina obsahuje transgénne rastlinné bunky obsahujúce :

    • exogénny DNA konštrukt obsahujúci v smere 5'k 3'promótor účinný v uvedenej rastlinnej bunke a DNA sekvenciu kódujúcu rastlinnú chinolát-fosforibozyl-transferázu, uvedená DNA je účinne spojená s uvedeným promótorom ; uvedená rastlina prejavuje zvýšenú expresiu QPRTázy v porovnaní s netransformovanou kontrolnou rastlinou.
37. 41. Transgénna rastlina druhu Nicotiana, vyznačujúca sa tým, že má zvýšenú expresiu chinolát-fosforibozyl-transferázy (QPRTázy) oproti netransformovanej kontrolnej rastline, kedy uvedená transgénna rastlina je potomstvom rastliny podlá nároku 74.
38. 42. Spôsob zvýšenia expresie génu chinolát-fosforibozyltransferázy v rastlinnej bunke, vyznačujúci sa tým, že uvedený spôsob zahrňuje :

    • pestovanie rastlinnej bunky transformovanej na obsah exogénnej DNA, keď uvedená exogénna DNA kóduje chinolátfosforibozyl-transferázu.
39. 43. Spôsob podľa nároku 38, vyznačujúci sa tým, že uvedená transformovaná rastlinná bunka je získaná spôsobom zahrňujúcim :

    • začlenenie konštruktu obsahujúceho v smere transkripcie promótor funkčný v uvedenej rastlinnej bunke a DNA sekvenciu kódujúcu chinolát-fosforibozyltransferázu funkčnú v uvedenej bunke do genómu hostiteľskej rastlinnej bunky, uvedená DNA sekvencia je účinne spojená s uvedeným promótorom a transkripčnou koncovou oblasťou funkčnou v uvedenej bunke, čím je získaná transformovaná rastlinná bunka.
40. 44. Spôsob produkcie tabakovej rastliny so zvýšenou úrovňou nikotínu v listoch uvedenej tabakovej rastliny, vyznačujúci sa tým, že uvedený spôsob zahrňuje :

    • pestovanie tabakovej rastliny alebo jej rastlinného potomstva, kedy uvedená rastlina obsahuje bunky obsahujúce DNA konštrukt zahrňujúci transkripčnú iniciačnú oblasť funkčnú v uvedenej rastline a exogénnu DNA sekvenciu účinne spojenú s uvedenou transkripčnou iniciačnou oblasťou, kedy uvedená DNA sekvencia kóduje chinolát-fosforibozyl-transferázu funkčnú v uvedených bunkách.