BRPI9810870B1

BRPI9810870B1 - Molécula e construto de dna, processos de preparação de uma célula de planta transformada e de produção de uma planta de tabaco transgênica, bem como processo para redução de expressão de um gene de quinolato fosforibosil transferase em uma célula de planta

Info

Publication number: BRPI9810870B1
Application number: BRPI9810870-0A
Authority: BR
Inventors: Mark A. Conkling; Nandini Mendu; Wen Song
Original assignee: North Carolina State University
Priority date: 1997-06-12
Filing date: 1998-06-10
Publication date: 2021-06-01
Also published as: KR20010013663A; US20060191036A1; GR20010300003T1; HUP0003767A2; EA200400186A1; CA2484366A1; LT99142A; YU64899A; CZ367799A3; US7304220B2; KR100365969B1; US20030140366A1; CA2287776A1; JP4095678B2; US7605308B2; CN1304576C; NZ500963A; IL132184A; EA200000007A1; ES2154624T1

Abstract

patente de invenção: <b>"regulação de expressão de quinolato fosforibosil transferase"<d>. dna codificando uma enzima de quinolato fosforibosil transferase de planta (qprtase), e construtos compreendendo tal dna, são fornecidos. processos de alteração de expressão de quinolato fosforibosil transferase são fornecidos.

Description

PESQUISA PATROCINADA FEDERALMENTE

Essa invenção foi feita com apoio do governo, sob a Concessão da Fundação da Ciência Nacional N° MCB-9206506. O governo tem certos direitos a essa invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a quinolato fosforibosil transferase de planta (QPRTase) e ao DNA que codifica essa enzima. Em particular, essa invenção refere-se ao uso de DNA que codifica quinolato fosforibosil transferase para produzir plantas transgênicas tendo níveis de nicotina geneticamente alterados e às plantas assim produzidas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A produção de tabaco com níveis diminuídos de nicotina é de interesse, dadas as questões concernentes à natureza viciante da nicotina. Adicionalmente, plantas de tabaco com níveis extremamente baixos de produção de nicotina, ou sem produção de nicotina, são a- traentes como recipientes para transgenes que expressem produtos co baix mercialmente valiosos, tais como fármacos, componentes de cosméticos ou aditivos para alimentos. Vários processos foram projetados para a remoção de nicotina a partir do tabaco. No entanto, a maioria desses processos removem outros ingredientes a partir do tabaco, além da nicotina, por meio do que se afeta adversamente o tabaco. Técnicas de cultivo de culturas clássicas produziram plantas de tabaco com níveis mais os de nicotina (aproximadamente 8%) do que <£, 4-Xα-^aquelas encontradas em plantas de tabaco de tipo selvagem. Plantas de tabaco e tabaco tendo mesmo outras reduções de teor de nicotina são desejáveis.

Uma abordagem para reduzir o nível de um produto biológico é 5 reduzir a quantidade de uma enzima necessária na via biossintética conduzindo àquele produto. Onde a enzima afetada ocorre naturalmente em uma quantidade limitadora de taxa (relativa a outras enzimas necessárias na Segue-se página 2 via), qualquer redução na abundância daquela enzima diminuirá a produção do produto final. Se a quantidade da enzima não for normalmente limitadora de taxa, a sua presença em uma célula tem que ser reduzida a níveis limitadores de taxa, a fim de diminuir a saída da via. Inversamente, se a quanti- 5 dade de enzima que ocorre naturalmente for limitadora de taxa, então, qualquer aumento na atividade da enzima resultará em um aumento no produto final da via biossintética.

A nicotina é formada primariamente nas raízes da planta de tabaco e é, subsequentemente, transportada à folhas, onde ela é armazenada(Tso, Physiology and Biochemistry of Tobacco Plants, pp. 233-34, Dowden, Hutchinson & Ross, Stroudsburg, Pa. (1972)). Uma etapa obrigatória na bios- síntese de nicotina é a formação de ácido nicotínico a partir de ácido quino- línico, etapa essa que é catalisada pela enzima quinolina fosforibosil transferase ("QPRTase"). A QPRTase parece ser uma enzima limitadora de taxa “15 na via fornecendo ácido nicotínico para a síntese de nicotina no tabaco. Ver, por exemplo, Feth et al., "Regulation in Tobacco Callus of Enzyme Activities of the Nicotine Pathway", Planta, 168, pp. 402-07 (1986); Wagner et al., "The Regulation of Enzyme Activities of the Nicotine Pathway in Tobacco", Physiol. Plant., 68, pp. 667-72 (1986). A modificação dos níveis de nicotinaem plantas de tabaco por regulação anti-sentido de expressão de metil transferase de putrescência (PMTase) é proposta nas patentes norte- americanas 5.369.023 e 5.260.205, para Nakatani e Malik. O pedido PCT WO 94/28142 para Wahad e Malik descreve o DNA que codifica PMT e o uso de construtos de PMT de sentido e de anti-sentido.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um primeiro aspecto da presente invenção é uma molécula de DNA isolada, compreendendo SEQ ID NO:1, sequências de DNA que codificam uma enzima tendo SEQ ID NO:2; sequências de DNA que se hibridizam com tal DNA e que codificam uma enzima de quinolato fosforibosil transfe-rase; e seqüências de DNA que diferem do DNA acima devido à degeneração do código genético. Um peptídeo codificado por tal DNA é um outro aspecto da invenção.

Um outro aspecto da presente invenção é um construto de DNAcompreendendo um promotor operável em uma célula de planta e um segmento de DNA que codifica uma enzima de quinolato fosforibosil transferase posicionada à jusante do promotor e operativamente associada com ele. O DNA que codifica a enzima pode estar na direção de anti-sentido ou de sentido.

Um outro aspecto da presente invenção é um processo de preparação de uma célula de planta transgênica tendo expressão de quinolato fosforibosil transferase (QPRTase) reduzida, dotando-se uma célula de planta de um tipo conhecido para expressar quinolato fosforibosil transferase; transformando-se a célula de planta com um construto de DNA exógeno compreendendo um promotor e DNA compreendendo uma porção de uma seqüência que codifique mRNA de quinolato fosforibosil transferase.

Um outro aspecto da presente invenção é uma planta transgênica da espécie Nicotiana tendo expressão de quinolato fosforibosil transferase (QPRTase) reduzida com relação a uma planta de controle não transformada. As células de tais plantas compreendem um construto de DNA, que inclui um segmento de uma seqüência de DNA que codifica um mRNA de quinolato fosforibosil transferase de planta.

Um outro aspecto da presente invenção é um processo para aredução de expressão de um gene de quinolato fosforibosil transferase em uma célula de planta, por crescimento de uma célula de planta transformada para conter DNA exógeno, em que uma fita transcrita do DNA exógeno é complementar ao mRNA de quinolato fosforibosil transferase endógeno à célula. A transcrição da fita complementar reduz a expressão do gene de quinolato fosforibosil endógeno.

Um outro aspecto da presente invenção é um processo de produção de uma planta de tabaco tendo níveis diminuídos de nicotina nas folhas da planta de tabaco, por crescimento de uma planta de tabaco com células, que compreende uma seqüência de DNA exógena, em que uma fita transcrita da seqüência de DNA exógeno é complementar ao RNA mensageiro de quinolato fosforibosil transferase nas células.

Um outro aspecto da presente invenção é um processo de preparação de uma célula de planta transgênica tendo expressão de quinolato fosforibosil transferase (QPRTase) aumentada, por transformação de uma célula de planta conhecida como expressando quinolato fosforibosil transfe- 5 rase, com um construto de DNA exógeno, que compreende uma sequência de DNA que codifica quinolato fosforibosil transferase.

Um outro aspecto da presente invenção é uma planta de Nicoti- ana transgênica tendo expressão de quinolato fosforibosil transferase (QPRTase) aumentada, em que células da planta transgênica compreendem 10 uma sequência de DNA exógena que codifica uma quinoiato fosforibosil transferase de planta.

Um outro aspecto da presente invenção é um processo para a expressão crescente de um gene de quinolato fosforibosil transferase em uma célula de planta, por crescimento de uma célula de planta transformada - 15 para conter DNA exógeno que codifica quinolato fosforibosil transferase.

Um outro aspecto da presente invenção é um processo de pro- dução de uma planta de tabaco tendo níveis aumentados de nicotina nas folhas, por cresimento de uma planta de tabaco tendo células que contêm uma sequência de DNA exógena que codifica quinolato fosforibosil transfe- 20 rase funcional nas células.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra a via biossintética conduzindo à nicotina. As atividades de enzimas conhecidas como sendo reguladas por Nid e Nic2 são QPRTase (quinolato fosforibosil transferase) e PMTase (metil transfera- 25 se de putrescência).

A Figura 2A fornece a seqüência de ácidos nucléicos de cDNA de NtQPTI (SEQ ID NO:1), com a seqüência codificante (SEQ ID NO:3) mostrada em letras maiúsculas.

A Figura 2B fornece a seqüência de aminoácidos deduzida 30 (SEQ 1D NO:2) da QPRTase de tabaco codificada por cDNA de NtQPTI.

A Figura 3 alinha a seqüência de aminoácidos de NtQPTI deduzida e as seqüências relacionadas de Rhodospirillum rubrum, de Myco- bacterium lepre, de Salmonella typhimurium, de Escherichia coli, humana e de Saccharomyces cerevisiae.

A Figura 4 mostra os resultados de complementaçâo de urn mutante de Escherichia coli carecendo de quinolato fosforibosil transferase 5 (TH265) com cDNA de NtQPTI. As células foram transformadas com umvetor de expressão portanto NtQPTI; o crescimento de células TH265 transformadas, expressando NtQPTI em meio mínimo carecendo de ácido nicotínico, demonstrou que NtQPTI codifica QPRTase.

A Figura 5 compara os níveis de nicotina e os níveis relativos de 10 mRNA de NtQPTI de estado estacionário em mutantes de tabaco Nid e Nic2: Burley 21 de tipo selvagem (Nic1/Nic1 Nic2/Nic2); NicT Burley 21 (nic1/nic1 Nic2/Nic2); Nic2' Burley 21 (Nic1/Nic1 nic2/ntc2); e NicTNicZ Burley 21 (nic1/nic1 nic2/nic2). Barras sólidas indicam níveis transcritos de mRNA; barras hachuradas indicam níveis de nicotina.-15 A Figura 6 plota os níveis relativos de mRNA de NtQPTI ao longo do tempo em plantas de tabaco de topo comparados às plantas de controle sem topo. Barras sólidas indicam níveis transcritos de mRNA; barras hachuradas indicam níveis de nicotina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A nicotina é produzida em plantas de tabaco pela condensaçãode ácido nicotínico e 4-metilaminobutanal. A via biossintética resultando em produção de nicotina é ilustrada na Figura 1. Dois loci reguladores (Nid e Nic2) atuam como reguladores co-dominantes de produção de nicotina. Análises de enzimas de raízes de mutantes Nic simples e duplos mostram 25 que as atividades de duas enzimas, quinolato fosforibosil transferase (QPRTase) e metil transferase de putrescência (PMTase), são diretamente proporcionais aos níveis de biossíntese de nicotina. Uma comparação de atividade de enzima em tecidos de tabaco (raiz e caule) com capacidades diferentes para síntese de nicotina mostra que a atividade de QPRTase está 30 estritamente relacionada com o teor de nicotina (Wagner e Wagner, Planta 165: 532 (1985)). Sauders e Busch (Plant Physiol 64:236 (1979) mostraram que o nível de QPRTase nas raízes de mutantes de baixo teor de nicotina é proporcional aos níveis de nicotina nas folhas.

A presente invenção engloba uma nova seqüência de cDNA (SEQ ID NO:1) que codifica uma quinolato fosforibosil transferase (QPRTase) de SEQ ID NO:2. Uma vez que a atividade de QPRTase está estrítamente correlacionada com o teor de nicotina, a construção de plantas de tabaco transgênicas, nas quais os níveis de QPRTase estão diminuídos nas raízes das plantas (comparados aos níveis em plantas do tipo selvagem), resulta em plantas tendo níveis reduzidos de nicotina nas folhas. A presente invenção fornece processos e construtos de ácido nucléico para produção de tais plantas transgênicas, assim como tais plantas transgênicas. Tais processos incluem a expressão de RNA de NtQPTI de anti- sentido, que diminui a quantidade de QPRTase nas raízes do tabaco. A nicotina tem sido encontrada adicionalmente em espécies e famílias de plantas de não tabaco, embora a quantidade presente seja usualmente muito menor do que em N. tabacum.

A presente invenção também fornece moléculas de DNA recom- binante de sentido e de anti-sentido que codificam QPRTase ou moléculas de RNA de anti-sentido de QPRTase, e vetores compreendendo aquelas moléculas de DNA recombinante, assim como células de plantas transgênicas e plantas transformadas com aquelas moléculas de DNA e vetores. Plantas e células de tabaco transgênicas dessa invenção são caracteriza-das por teor de nicotina mais baixo ou mais elevado, do que plantas e células de tabaco de controle não transformadas.

Plantas de tabaco com níveis extremamente baixos de produção de nicotina, ou sem produção de nicotina, são atraentes como recipientes para transgenes expressando produtos comercialmente valiosos, tais como fármacos, componentes de cosméticos ou aditivos para alimentos. O tabaco é atraente como uma planta recipiente para um transgene que codifique um produto desejável, já que o tabaco é facilmente engenheirado geneticamente e produz uma biomassa muito grande por acre; plantas de tabaco com recursos reduzidos devotadas à produção de nicotina, consequentemente terão mais recursos disponíveis para a produção de produtos de transgene. Processos de transformação de tabaco com transgenes produzindo os produtos desejados são conhecidos na técnica; qualquer técnica adequada pode ser utilizada com as plantas de tabaco com baixo teor de nicotina da presente invenção.

Plantas de tabaco de acordo com a presente invenção, com reduzida expressão de QPRTase e reduzidos níveis de nicotina, serão desejáveis na produção de produtos de tabaco tendo teor de nicotina reduzido. Plantas de tabaco de acordo com a presente invenção serão adequadas para uso em qualquer produto de tabaco tradicional, incluindo, porém, não estando limitados a, tabaco para cachimbo, charuto e cigarro, e tabaco de mascar, e podem estar em qualquer forma, incluindo tabaco em folha, tabaco em farrapos ou tabaco cortado.

Os construtos da presente invenção também podem ser úteis no fornecimento de plantas transgênicas tendo expressão de QPRTase aumentada e teor de nicotina aumentado na planta. Tais construtos, processos usando esses construtos e as plantas assim produzidas podem ser desejáveis na produção de produtos de tabaco tendo teor de nicotina alterado, ou na produção de plantas tendo teor de nicotina aumentado para seus efeitos inseticidas.

Os presentes inventores constataram que o gene de TobRD2 (ver Conkling et al., Plant Phys. 93, 1203 (1990)) codifica uma QPRTase de Nicotiana tabacum, e fornecem aqui a seqüência de cDNA de NtQPTI (anteriormente denominada TobRD2) e a seqüência de aminoácidos da enzima codificada. Comparações da seqüência de aminoácidos de NtQPTI com o banco de dados GenBank revelam similaridade de seqüência limitada com relação a proteínas bacterianas que codificam quinolato fosforibosil transferase (QPRTase) (Figura 3).

Quinolino fosforibosil transferase é necessária para a biossínte- se de nicotina adenina dinucleotídeo (NAD) de novo, tanto em procariontes quanto em eucariontes. Em tabaco, níveis elevados de QPRTase são detectados em raízes, mas, não em folhas. Para determinar que NtQPTI codificou QPRTase, os presentes inventores utilizaram cepa bacteriana de Es- cherichia coli (TH265), um mutante carecendo de quinolino fosforibosil transferase (nadC). Esse mutante não pode crescer em meio mínimo carecendo de ácido nicotínico. No entanto, a expressão da proteína de NtQPTI nessa cepa bacteriana conferiu o fenótipo NadC+ (Figura 4), confirmando 5 que NtQPTI codifica QPRTase.

Os presentes inventores examinaram os efeitos de mutantes Nid e Nic2 em tabaco, e os efeitos de "topping" em plantas de tabaco, em níveis de mRNA de estado estacionário de NtQPTI e em níveis de nicotina. (Remoção de dominância apical por "topping" no início da floração é bem 10 conhecido em resultar em níveis aumentados de biossíntese de nicotina e transporte em tabaco, e é uma prática padrão em produção de tabaco.) Se NtQPTI estiver, de fato, envolvido na biossíntese de nicotina, seria esperado que (1) níveis de mRNA de NtQPTI seriam mais baixos em mutantes duplos Nic1/Nic2 e (2) níveis de mRNA de NtQPTI aumentariam após - 15 "topping". Níveis de mRNA de NtQPTI em mutantes duplos Nic1/Nic2 foram encontrados como sendo 25% daqueles do tipo selvagem (Figura 5). Além disso, dentro de seis horas de "topping", os níveis de mRNA de NtQPTI em plantas de tabaco aumentaram cerca de oito vezes. Portanto, NtQPTI foi determinado como sendo um gene regulador chave na via de biossíntese de 20 nicotina.

Plantas e Células de Plantas Transgênicas

Regulação de expressão de gene em genomas de células de plantas podem ser conseguidos por integração de DNA heterólogo sob o controle transcricional de um promotor, que seja funcional no hospedeiro, e 25 em que a fita transcrita de DNA heterólogo seja complementar à fita de DNA que é transcrita a partir do gene endógeno a ser regulado. O DNA introduzido, a que se refere como DNA de anti-sentido, fornece uma seqüência de RNA que é complementar a mRNAs produzidos de maneira natural (endógeno) e que inibe a expressão do mRNA endógeno. O mecanismo de 30 tal regulação de expressão de gene por anti-sentido não está completamente entendido. Enquanto não se deseje estar preso a qualquer teoria única, observa-se que uma teoria de regulação de anti-sentido propõe que a transcrição de DNA de anti-sentido produza moléculas de RNA, que se liguem a e previnam ou inibam a transcrição de moléculas de mRNA endógeno.

Nos processos da presente invenção, o produto de anti-sentido pode ser complementar às porções codificantes ou não codificantes (ou as duas) de RNA alvo que ocorra naturalmente. A construção de anti-sentido pode ser introduzida nas células de plantas de qualquer maneira adequada, e pode ser integrada ao genoma da planta por transcrição indutível ou constitutiva da seqüência de anti-sentido. Ver, por exemplo, as patentes norte-americanas N°s 5.453.566 e 5.107.065 a Shewmaker et al. (aqui in-corporada por referência em sua totalidade).

Conforme usado aqui, DNA (ou RNA) exógeno ou heterólogo se refere a DNA (ou a RNA) que tenha sido introduzido em uma célula (ou no ancestral da célula) através dos esforços de seres humanos. Tal DNA heterólogo pode ser uma cópia de uma seqüência que seja naturalmente encontrada na célula sendo transformada, ou fragmentos da mesma.

Para produzir uma planta de tabaco tendo níveis de QPRTase diminuídos, e, portanto, teor de nicotina mais baixo, do que uma planta de tabaco de controle não transformada, uma célula de tabaco pode ser transformada com uma unidade transcricional de anti-sentido de QPRT exógena compreendendo uma seqüência de cDNA de QPRT parcial, uma seqüência de cDNA de QPRT de comprimento completo, uma seqüência cromossomial de QPRT parcial, ou uma seqüência cromossomial de QPRT de comprimento completo, na orientação de anti-sentido com seqüências reguladoras ligadas de maneira operável apropriadas. Seqüências reguladoras apropriadas incluem uma seqüência de iniciação de transcrição ("promotor") operável na planta sendo transformada, e uma seqüência de terminação de po- liadenilação / transcrição. Técnicas padrão, tais como mapeamento de restrição, hibridização "Southern blot" e análise de seqüência de nucleotídeos, são, então, empregadas para identificar clones suportando seqüências de QPRTase na orientação de anti-sentido, ligado de maneira operável às se-quências reguladoras. Plantas de tabaco são, então, regeneradas a partir de células transformadas de maneira bem sucedida. É muitíssimo preferível que a seqüência de anti-sentido utilizada seja complementar à seqüência endógena, no entanto, variações menores nas sequências exógenas e endógenas podem ser toleradas. Prefere-se que a seqüência de DNA de anti- sentido seja de similaridade de seqüência suficiente, que seja capaz de ligação à seqüência endógena na célula a ser regulada, sob condições restritivas, conforme descrito abaixo.

A tecnologia de anti-sentido tem sido empregada em vários laboratórios para criar plantas transgênicas, caracterizada por quantidades mais baixas que o normal de enzimas específicas. Por exemplo, plantas com níveis diminuídos de calcona sintase, uma enzima de via biossintética de um pigmento de flor, têm sido produzidos por inserção de um gene de anti- sentido de calcona sintase no genoma de tabaco e de petunia. Essas plantas de tabaco e de petúnia transgênicas produzem flores com coloração mais clara do que a normal (Van der Krol et al., "An Anti-Sense Chalcone Synthase Gene in Transgenic Plants Inhibits Flower Pigmentation", Nature, 333,, pp. 866-69 (1988)). Tecnologia de RNA de anti-sentido também tern sido empregada de maneira bem sucedida para inibir a produção da enzima poligalacturonase em tomates (Smith et al., "Antisense RNA Inhibition of Polygalacturonase Gene Expression in Transgenic Tomatoes", Nature, 334, pp. 724-26 (1988); Sheehy et al., "Reduction of Polygalacturonase Activity in Tomato Fruit by Antisense RNA", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 8805- 09 (1988)), e a pequena subunidade da enzima ribulose bifosfato carboxila- se em tabaco (Rodermel et al., "Nuclear-Organelle Interactions: Nuclear An-tisense Gene Inhibits Ribulose Biphosphate Carboxylase Enzyme Levels in Transformed Tobacco Plants", Cell, 55, pp. 673-81 (1988)). Alternativamente, plantas transgênicas, caracterizadas por quantidades maiores do que o normal de uma dada enzima, podem ser criadas por transformação das plantas com o gene para aquela enzima na orientação de sentido (isto é, normal). Níveis de nicotina nas plantas de tabaco transgênicas da pre-sente invenção podem ser detectados por análises de nicotina padrão. Plantas transformadas, nas quais o nível de QPRTase é reduzida compara- da às plantas de controle não transformadas, conseqüentemente, terão um nível de nicotina reduzido comparadas ao controle; plantas transformadas, nas quais o nível de QPRTase é aumentado comparado às plantas de controle não transformadas, consequentemente, terão um nível de nicotina au- 5 mentado comparado ao controle.

A seqüência heteróloga utilizada nos processos de anti-sentido da presente invenção pode ser selecionada de modo a produzir um produto de RNA complementar à seqüência de mRNA de QPRTase completa, ou a uma porção da mesma. A seqüência pode ser complementar a qualquer se- 10 qüência contígüa do RNA mensageiro natural, isto é, ela pode ser complementar à seqüência de mRNA endógeno proximal ao terminal 5' ou sítio de capeamento, a jusante do sítio de capeamento, entre o sítio de capeamento e o códon de iniciação e pode cobrir toda ou somente uma porção da região não codificante, pode ligar em ponte a região codificante e a não codifican- 15 te, pode ser complementar a toda ou parte da região codificante, complementar ao terminal 31 da região codificante, ou complementar à região 3' não traduzida do mRNA. Seqüências de anti-sentido adequadas podem ser desde pelo menos cerca de 13 a cerca de 15 nucleotídeos, pelo menos cerca de 16 a cerca de 21 nucleotídeos, pelo menos cerca de 20 nucleotídeos, 20 pelo menos cerca de 30 nucleotídeos, pelo menos cerca de 50 nucleotídeos, pelo menos cerca de 75 nucleotídeos, pelo menos cerca de 100 nucleotídeos, pelo menos cerca de 125 nucleotídeos, pelo menos cerca de 150 nucleotídeos, pelo menos cerca de 200 nucleotídeos, ou mais. Em adição, as seqüências podem ser estendidas ou encurtadas nas extremidades 25 3' ou 5' das mesmas.

A seqüência de anti-sentido particular e o comprimento da seqüência de anti-sentido variará dependendo do grau de inibição desejado, a estabilidade da seqüência de anti-sentido, e as similares. Um técnico especializado no assunto da técnica, será guiado na seleção de seqüências de 30 anti-sentido de QPRTase apropriadas, usando-se técnicas disponíveis na técnica e a informação aqui fornecida. Com referência à Figura 2A e SEQ ID NO:1 aqui, um oligonucleotídeo da invenção pode ser um fragmento contí- 12 ' ‘ ’nuo da seqüência de cDNA de QPRTase em orientação de anti-sentido, de qualquer comprimento que seja suficiente para alcançar os efeitos desejados, quando transformado para uma célula de planta de recipiente.

A presente invenção também pode ser usada em processos de co-supressão de sentido de produção de nicotina. DNAs de sentido empregados na realização da presente invenção são de um comprimento suficiente para, quando expressos em uma célula de planta, suprimir a expressão nativa da proteína de QPRTase de planta, conforme descrito aqui naquela célula de planta. Tais DNAs de sentido podem ser essencialmente um DNA genòmico ou complementar completo codificando a enzima QPRTase, ou um fragmento do mesmo, com tais fragmentos tipicamente sendo pelo me-nos 15 nucleotídeos de comprimento. Processos de verificação do comprimento de DNA de sentido, que resulte em supressão da expressão de um gene nativo em uma célula estão disponíveis para aqueles versados no assunto da técnica.

Em uma concretização alternativa da presente invenção, células de planta Nicotiana são transformadas com um construto de DNA contendo um segmento de DNA codificando uma molécula de RNA enzimática (isto é, uma "ribozima"), molécula de RNA enzimática essa está dirigida contra (isto é, cliva) o transcrito de mRNA de DNA codificando QPRTase de planta, conforme descrito aqui. Ribozimas contêm domínios de ligação a substratos que se ligam a regiões acessíveis do mRNA de alvo, e domínios que catalisam a clivagem de RNA, evitando a tradução e a produção de proteínas. Os domínios de ligação podem compreender seqüências de anti-sentido complementares à seqüência de mRNA de alvo; o molde catalítico pode ser um molde de cabeça de martelo ou outros moldes, tais como o molde de grampo de cabelo. Sítios de divagem de ribozima dentro de um RNA de molde, inicialmente, podem ser identificados por varredura da molécula de alvo para sítios de clivagem de ribozima (por exemplo, seqüências GUA, GUU ou GUC). Uma vez identificadas, seqüências de RNA curtas de 15, 20, 30 ou mais ribonucleotídeos correspondendo à região do gene alvo contendo o sítio de clivagem podem ser avaliados com relação às características es- truturais previstas. A adequabilidade de alvos candidatos também podem ser avaliados por testagem de sua acessabilidade à hibridização com oligo- nucleotídeos complementares, usando-se testes de proteção de ribonuclease, conforme são conhecidos na técnica. DNA codificando moléculas de RNA enzimáticas pode ser produzido de acordo com técnicas conhecidas. Ver, por exemplo, T. Cech et al., a patente norte-americana n° 4.987.071; Keene et al., a patente norte-americana n° 5,559.021; Donson et al., a patente norte-americana n° 5,589.367; Torrence et al., a patente norte-americana n° 5,583,032; Joyce, a patente norte-americana n° 5,580.967; Gold et a!., a patente norte-americana n° 5.595.877; Wagner et al., a patente norte- americana n° 5.591.601; e a patente norte-americana n° 5.622.854 (as revelações, das quais devem ser aqui incorporadas por referência em sua totalidade). A produção de uma tal molécula de RNA enzimática em uma célula de planta e o rompimento de produção de proteína de QPRTase reduz a atividade de QPRTase em células de planta, essencialmente da mesma maneira, que a produção de uma molécula de RNA de anti-sentido: isto é, por interrupção de translação de mRNA na célula, que produz a enzima. O termo "ribozima" é aqui usado para descrever um ácido nucléico contendo RNA, que funciona como uma enzima (tal como, uma endo-ribonuclease), e pode ser usado intercambiavelmente com "molécula de RNA enzimático". A presente invenção inclui adicionalmente DNA codificando as ribozimas, DNA codificando ribozimas, que tenha sido inserida em um vetor de expressão, células de hosperdeiro contendo tais vetores, e processos de diminuição de produção de QPRTase em plantas usando-se ribozimas.

Sequências de ácidos nucléicos empregadas na realização da presente invenção incluem aquelas com similaridade de seqüência a SEQ ID NO:1, e codificando uma proteína tendo atividade de quinolato fosforibosil transferase. Essa definição pretende englobar variações alélicas naturais em proteínas de QPRTase. Portanto, seqüências de DNA que se hibridizam com DNA de SEQ ID NO:1 e codificam a expressão de QPRTase, particularmente enzimas de QPRTase de planta, também podem ser empregadas na realização da presente invenção.

Podem existir formas múltiplas de enzima QPRT de tabaco. Formas múltiplas de uma enzima podem ser devidas à modificação pós- traducional de um produto de gene único, ou a formas múltiplas do gene NtQPTI.

Condições que permitem que outras seqüências de DNA, quecodificam a expressão de uma proteína tendo atividade de QPRTase, se hi- bridizem com DNA de SEQ ID NO:1 ou a outras seqüências de DNA codificando a proteína dada como SEQ ID NO:2, podem ser determinadas de uma maneira rotineira. Por exemplo, a hibridização de tais seqüências pode 10 ser realizada sob condições de restrição reduzida ou mesmo condições restritas (por exemplo, condições representadas por uma restrição de lavagem de NaCI 0,3 M, citrato de sódio 0,03 M, SDS a 0,1%, a 60°C ou mesmo 70°C, para DNA codificando a proteína dada como SEQ ID NO:2, aqui em um teste de hibridização in situ padrão. Ver Sambrook et aL, Molecular Clo-ning, A Laboratory Manual (2o Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory)). Em geral, tais seqüências serão pelo menos 65% similares, 75% similares, 80% similares, 85% similares, 90% similares, ou mesmo 95% similares, ou mais, com a seqüência dada aqui como SEQ ID NO:1, ou seqüências de DNA codificando proteínas de SEQ ID NO:2. (Determinações de simílarida- 20 de de seqüência são feitas com as duas seqüências alinhadas para o pa- reamente máximo; intervalos em cada uma das duas seqüências sendo pa- readas são permitidos no pareamente maximizante. Comprimentos de intervalo de 10 ou menos são preferidos, comprimentos de intervalo de 5 ou menos são mais preferidos, e comprimentos de intervalo de 2 ou menos sãoainda mais preferidos).

Procedimentos de hibridização diferencial estão disponíveis, que permitem o isolamento de clones de cDNA, cujos níveis de mRNA são tão baixos quanto cerca de 0,05% de poli(A+)RNA. Ver M. Conkling et al., Plant Physiol. 93, 1203-1211 (1990). Brevemente, bibliotecas de cDNA são 30 selecionadas usando-se sondas de cDNA de fita única de mRNA transcrito reverso a partir de tecido de planta (por exemplo, raízes e/ou folhas). Para seleção diferencial, uma nitrocelulose ou membrana de náilon é embebida em 5xSSC, colocada em um tubo de distribuição de sucção de 96 cavidades, 150 μL de cultura de uma noite estacionária transferida a partir de uma placa mestre para cada cavidade, e vácuo aplicado até que todo o líquido tenha passado através do filtro. 150 μl de solução desnaturante (NaOH 0,5 M, NaCI 1,5 M) é colocada em càda cavidade usando-se um pipetador múltiplo e deixado repousar cerca de 3 minutos. A sucção é aplicada conforme acima e o filtro é removido e neutralizado em Tris-HCI 0,5 M (pH 8,0), NaCI 1,5 M. Então, ela é cozinhada 2 horas in vacuo e incubada com as sondas relevantes. Por uso de filtros de membrana de náilon e mantendo-se as placas mestre armazenadas a -70°C em DMSO a 7%, filtros podem ser selecionados em tempos múltiplos com sondas múltiplas e clones apropriados podem ser recuperados depois de vários anos de armazenamento.

Conforme usado aqui, o termo "gene” refere-se a uma seqüência de DNA que incorpore (1) sinais reguladores à montante (5') incluindo o promotor, (2) uma região codificante especificando o produto, proteína ou RNA do gene, (3) regiões a jusante (3’) incluindo terminação de transcrição e sinais de poliadenilação e (4) seqüências associadas necessárias para expressão eficiente e específica.

A seqüência de DNA da presente invenção pode consistir essencialmente na seqüência aqui fornecida (SEQ ID NO:1), ou seqüências de nucleotídeos equivalentes representando alelos ou variantes polimórficas desses genes, ou regiões codificantes dos mesmos.

O uso da frase "similaridade de seqüência substancial" no presente relatório descritivo e nas reivindicações significa que seqüências de DNA, RNA ou de aminoácidos, que tem variações leves e sem conseqüên- cias das seqüências reais reveladas e reivindicadas aqui são consideradas como sendo equivalentes às seqüências da presente invenção. Nesse respeito, "variações leves e sem conséqüências" significa que seqüências "similares" (isto é, as seqüências que têm similaridade de seqüência substancial com o DNA, o RNA ou as proteínas revelados e reivindicados aqui) serão funcionalmente equivalentes às seqüências reveladas e reivindicadas na presente invenção. Seqüências funcionalmente equivalentes funcionarão i*: : •: • *» *’∑16 : • ••• ’ * %• :substancialmente da mesma maneira para produzir substancialmente as mesmas composições que as composições de ácidos nucléicos e de aminoácidos reveladas e reivindicadas aqui.

Seqüências de DNA aqui fornecidas podem ser transformadas em uma variedade de células de hospedeiros. Uma variedade de células de hospedeiros adequadas, tendo propriedades de crescimento e de manejo desejáveis, estão prontamente disponíveis na técnica.

O uso da frase "isolado" ou "substancialmente puro", no presente relatório descritivo e nas reivindicações, como um modificador de DNA, RNA, polipeptídeos ou proteínas significa que o DNA, o RNA, os poli- peptídeos ou as proteínas assim designadas foram separadas a partir de seus ambientes celulares in vivo através dos esforços de seres humanos.

Conforme usado aqui, uma "seqüência de DNA nativa" ou "seqüência de DNA natural" significa uma seqüência de DNA, que pode ser isolada a partir de tecido ou de células não transgênicas. Seqüências de DNA nativas são aquelas, que não tenham sido alteradas artificialmente, tais como por mutagênese sítio dirigida. Uma vez que seqüências de DNA nativas sejam identificadas, moléculas de DNA tendo seqüências de DNA nativas podem ser sintetizadas quimicamente ou produzidas usando-se pro-cedimentos de DNA recombinante, como são conhecidos na técnica. Conforme usado aqui, uma seqüência de DNA de planta nativa é aquela, que pode ser isolada a partir de tecido ou de células de plantas não transgêni- cos. Conforme usado aqui, uma seqüência de DNA de tabaco nativa é aquela, que pode ser isolada a partir de tecido ou de células de tabaco não transgênicas.

Construtos de DNA, ou "cassetes de transcrição", da presente invenção incluem, 51 a 3' na direção de transcrição, um promotor conforme discutido aqui, uma seqüência de DNA conforme discutida aqui, associada de maneira operativa com o promotor, e, opcionalmente, uma seqüência de terminação incluindo sinal de parada para RNA polimerase e um sinal de poliadenilação para poliadenilase. Todas essas regiões reguladoras devem ser capazes de operação nas células do tecido a ser transformado. Qual- quer sinal de terminação adequado pode ser empregado na realização da presente invenção, exemplos dos mesmos incluindo, mas, não estando limitados a, o terminador de nopalina sintase (nos), o terminador de octapina sintase (ocs), o terminador de CaMV, ou sinais de terminação nativos deri- 5 vados a partir do mesmo gene que a região de iniciação transcriciona! ou derivados a partir de um gene diferente. Ver, por exemplo, Rezian et al. (1988) supra, e Rodermel et al. (1988), supra.

O termo "associado de maneira operativa", conforme usado aqui, refere-se a seqüências de DNA em uma única molécula de DNA, que 10 estão associadas, de modo que a função de uma seja afetada pela outra.

Portanto, um promotor está associado de maneira operativa com um DNA, quando ele for capaz de afetar a transcrição daquele DNA (isto é, o DNA está sob o controle transcricional do promotor). O promotor é dito estar "a montante" do DNA, que, por sua vez, é dito estar "a jusante" do promotor.•15 O cassete de transcrição pode ser fornecido em um construto de

DNA, que também tenha pelo menos um sistema de replicação.Para conveniência, é comum ter um sistema de replicação funcional em Escherichia co- li, tal como ColE1, pSC101, pACYC184, ou os similares. Dessa maneira, em cada estágio depois de cada manipulação, o construto resultante pode ser 20 clonado, seqüenciado e a correção da manipulação é determinada. Em adição, ou no lugar do sistema de replicação de E. coli, um sistema de replicação de faixa de hospedeiro ampla pode ser empregado, tal como os sistemas de replicação dos plasmídeos de incompatibilidade com P-1, por exemplo, pRK290. Em adição ao sistema de replicação, freqüentemente, haverá 25 pelo menos um marcador presente, que pode ser útil em um ou mais hospedeiros, ou diferentes marcadores para hospedeiros individuais. Isto é, um marcador pode ser empregado para seleção em um hospedeiro procariótico, enquanto que outro marcador pode ser empregado para seleção em um hospedeiro eucariótico, particularmente o hospedeiro de planta. Os marca- 30 dores podem ser proteção contra um biocida, tais como antibióticos, toxinas, metais pesados, ou os similares; podem fornecer complementação, conferindo prototrofia a um hospedeiro auxotrófico; ou podem fornecer um fenóti- po visível através da produção de um novo composto na planta.

Os vários fragmentos compreendendo os vários construtos, cassetes de transcrição, marcadores, e os similares, podem ser introduzidos de maneira consecutiva por clivagem com enzimas de restrição de um sistema de replicação apropriado, e inserção do construto ou fragmento particular no sítio disponível. Depois de ligação e de clonagem, o construto de DNA pode ser isolado para manipulação ulterior. Todas essas técnicas estão amplamente exempliçadas na literatura, conforme exemplificado por J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2o Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory).

Vetores, que podem ser usados para transformar tecido de plantas com construtos de ácidos nucléicos da presente invenção, incluem tanto vetores de Agrobacterium quanto vetores balísticos, assim como vetores adequados para transformação mediada por DNA.

O termo "promotor" refere-se a uma região de uma seqüência de DNA que incorpore os sinais necessários para a expressão eficiente de uma seqüência codificante. Isso pode incluir seqüências, às quais uma RNA po- limerase se ligue, mas, não está limitado a tais seqüências, e pode incluir regiões, às quais outras proteínas reguladoras se liguem, em conjunto com regiões envolvidas no controle de tradução de proteínas e podem incluir seqüências codificantes.

Promotores empregados na realização da presente invenção podem ser promotores ativos de maneira constitutiva. Inúmeros promotores ativos de maneira constitutiva, que são operáveis em plantas, estão disponíveis. Um exemplo preferido é o promotor 35S de Vírus do Mosaico da Couve-Flor (CaMV), que é expresso de maneira constitutiva na maioria dos tecidos de plantas. Alternativamente, o promotor pode ser um promotor específico de raiz ou promotor específico do córtex da raiz, conforme explicado em maiores detalhes abaixo.

Seqüências de anti-sentido têm sido expressas em plantas de tabaco transgênicas, utilizando-se o promotor 35S de Vírus do Mosaico da Couve-Flor (CaMV). Ver, por exemplo, Cornelissen et al., "Both RNA Levei and Translation Efficiency are Reduced by Anti-Sense RNA Transgenic Tobacco", Nucleic Acid Res. 17, pp. 833-43 (1989); Rezaian et al., "Anti-Sense RNAs of Cucumber Mosaic Virus in Transgenic Plants Assessed for Control of the Virus", Plant Molecular Biology 11, pp. 463-71 (1988); Roderme! et al., "Nuclear-Organelle Interactions: Nuclear Antisense Gene Inhibits Ribulose Bisphosphate Carboxylase Enzyme Levels in Transformed Tobacco Plants", Cell 55, pp. 673-81 (1988); Smith et al., "Antisense RNA Inhibits of Polygalacturonase Gene Expression in Transgenic Tomatoes", Nature 334, pp. 724-26 (1988); Vander Krol et al., "An Anti-Sense Chaicone Synthase Gene in Transgenic Plants Inhibits Flower Pigmentation", Nature 333, pp. 866-69 (1988).

Uso do promotor 35S de CaMV para expressão de QRTPase nas células de tabaco transformadas e plantas dessa invenção é preferida. O uso do promotor de CaMV para a expressão de outros genes recombi- nantes em raízes de tabaco tem sido bem descrito (Lam et al., "Site-Specific Mutations Alter In Vitro Factor Binding and Change Promoter Expression Pattern in Transgenic Plants", Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, pp. 7890-94 (1989); Poulsen et al., "Dissection of 5' Upstream Sequences for Selective Expression of the Nicotiana plumbaginifolia rbcS-8B Gene", Mol. Gen. Genet. 214, pp. 16-23(1988)).

Outros promotores, que são ativos somente em tecidos de raízes (promotores específicos de raízes) são, também, particularmente adequados aos processos da presente invenção. Ver, por exemplo, a patente norte-americana n° 5.459.252 a Conkling et al.; Yamamoto et al., The Plant Cell, 3:371 (1991). O promotor específico de córtex de raiz de TobRD2 também pode ser utilizado. Ver, por exemplo, o pedido de patente norte-americano SN 08/508.786, agora permitido, a Conkling et a!.; PCT WO 9705261. Todas as patentes citadas aqui são pretendidos serem incorporados por referência em sua totalidade.

As moléculas de DNA recombinante de QPRTase e vetores usados para produzir as células de tabaco transformadas e plantas dessa invenção podem compreender adicionalmente um gene de marcador sele- cionável dominante. Marcadores selecionáveis dominantes adequados para uso em tabaco incluem, inter alia, genes de resistência a antibióticos codificando neomicina fosfotransferase (NPTII), higromicina fosfotransferase (HPT) e cloranfenicol acetiltransferase (CAT). Outro marcador selecionável dominante bem conhecido adequado para uso em tabaco é um mutante de gene de dihidrofolato redutase, que codifica dihidrofolato redutase resistente a metotrexato. Vetores de DNA contendo genes de resistência a antibiótico adequados, e os antibióticos correspondentes, estão comercialmente disponíveis.

Células de tabaco transformadas são removidas por seleção da população circundante de células não transformadas por colocação da população mistas de células em um meio de cultura contendo uma concentração apropriada do antibiótico (ou outro composto normalmente tóxico às células de tabaco), contra o qua! o produto de gene de marcador selecionável dominante escolhido confere resistência. Portanto, somente aquelas células de tabaco que tenham sido transformadas sobreviverão e multiplicar-se-ão.

Processos de preparação de plantas recombinantes da presente invenção, em geral, envolvem, primeiro, o fornecimento de uma célula de planta capaz de regeneração (a célula de planta, tipicamente, residindo em um tecido capaz de regeneração). A célula de planta é, então, transformada com um construto de DNA compreendendo um cassete de transcrição da presente invenção (conforme descrito acima) e uma planta recombinante é regenerada a partir da célula de planta transformada. Conforme explicado abaixo, a etapa de transformação é realizada por técnicas, conforme são conhecidas na técnica, incluindo, mas, não estando limitadas a, o bombar-deamento da célula de planta com micropartículas portanto o cassete de transcrição, infectando a célula com uma Agrobacterium tumefaciens contendo um plasmídeo de Ti portando o cassete de transcrição, ou qualquer outra técnica adequada para a produção de uma planta transgênica.

Inúmeros sistemas de vetores de Agrobacterium úteis na realização da presente invenção são conhecidos. Por exemplo, a patente norte- americana n° 4.459.355 revela um processo para plantas suscetíveis trans- formantes, incluindo "dicots", com uma cepa de Agrobacterium contendo o plasmídeo de Ti. A transformação de plantas de madeira com um vetor de Agrobacterium é revelada na patente norte-americana n° 4.795.855. Além disso, a patente norte-americana n° 4.940.838 a Schilperoort et al., revela um vetor de Agrobacterium binário (isto é, um em que o Agrobacterium contém um plasmídeo tendo a região vir de um plasmídeo de Ti, mas, ne-nhuma região T, e um segundo plasmídeo tendo uma região T, mas, nenhuma região vir) útil na realização da presente invenção.

Micropartículas portanto um construto de DNA da presente invenção, micropartículas essas são adequadas para a transformação balística de uma célula de planta, são também úteis para a preparação de plantas transformadas da presente invenção. A micropartícula é propelida para uma célula de planta para produzir uma célula de planta trasnformada, e uma planta é regenerada a partir da célula de planta transformada. Qualquer metodologia de transformação de célula balística e aparelho adequadas podem ser usadas na prática da presente invenção. Exemplos de aparelhos e procedimentos são revelados em Sanford e Wolf, patente norte-americana n° 4.945.050, e na Christou et al., patente norte-americana n° 5.015.580. Quando se usa procedimentos de transformação balística, o cassete de transformação pode ser incorporado em um plasmídeo capaz de replicação em ou de interação na célula a ser transformada. Exemplos de micropartículas adequadas para uso em tais sistemas incluem esferas de ouro de 1 a 5 μm. O construto de DNA pode ser depositado na micropartícula por qualquer técnica adequada, tal como por precipitação.

Espécies de plantas podem ser transformadas com o construto de DNA da presente invenção pela transformação mediada por DNA de protoplastos de células de plantas e regeneração subseqüente da planta de acordo com procedimentos bem conhecidos na técnica. A fusão de proto- plastps de tabaco com lipossomas contendo DNA ou via eletroporação é conhecida na técnica. (Shillito et al., "Direct Gene Transfer to Protoplasts of Dicotyledonous and Monocotyledonous Plants by a Number of Methods, In- eluding Electroporation", Methods in Enzymology 153, pp. 313-36 (1987)).

Conforme usado aqui, transformação refere-se à introdução de DNA exógeno em células, de modo a produzir células transgênicas transformadas de maneira estável com o DNA exógeno.

Células transformadas são induzidas a regenerar plantas de tabaco intactas, através da aplicação de célula de tabaco e técnicas de cultura de tecidos, que são bem conhecidas na técnica. O processo de regeneração de plantas é escolhido, de modo a ser compatível com o processo de transformação. A presença estável e a orientação da seqüência de QPRTase em plantas de tabaco transgênicas pode ser verificada por hereditariedade Mendeliana da seqüência de QPRTase, conforme revelada por proces-sos padrão de análise de DNA aplicados à progenia resultante de cruzamentos controlados. Depois de regeneração de plantas de tabaco transgênicas a partir de células transformadas, a seqüência de DNA introduzida é prontamente transferida a outras variedades de tabaco, por meio de práticas de cultivo de plantas convencionais e sem experimentação excessiva.

Por exemplo, para analisar a segregação do transgene, plantas transformadas regeneradas (Ro) podem ser crescidas até a maturidade, testadas para níveis de nicotina, e desgeneradas para produzir plantas Ri. Uma porcentagem de plantas Ri portanto o transgene são homozigotas para o transgene. Para identificar plantas Ri homozigotas, plantas Ri transgênicas são crescidas até a maturidade e desgeneradas. Plantas Ri homozigotas produzirão progenia R2, em que cada planta de progenia porta o transgene; progenia de plantas Ri heterozigotas se segregar-se-ão em 3:1.

Uma vez que a nicotina serve como um pesticida natural, que ajuda a proteger as plantas de tabaco de danos por pestes. Portanto, ela pode ser desejável para transformar adicionalmente plantas com baixo teor de nicotina ou sem nicotina, produzidas pelos presentes processos com um transgene (tal como Bacillus thuringiensis), que conferirá proteção contra insetos adicional.

Uma planta preferida para uso nos presentes processos são espécies de Nicotiana, ou tabaco, incluindo N. tabacum, N. rústica e N. gluti- nosa. Qualquer cepa ou variedade de tabaco pode ser usada. São preferidas cepas que já sejam baixas em teor de nicotina, tal como mutantes duplos de Nic1/Nic2.

Qualquer tecido de planta capaz de propagação clonal subsequente, seja por organogênese ou seja por embriogênese, pode ser transformado com um vetor da presente invenção. O termo "organogênese", conforme é usado aqui, significa um processo, pelo qual brotos e raízes são desenvolvidos de maneira seqüencial a partir de centros meristemáticos; o termo "embriogênese", conforme usado aqui, significa um processo pelo qual brotos e raízes se desenvolvem em conjunto de uma maneira concer-tada (não seqüencialmente), seja a partir de células somáticas ou seja a partir de gametas. O tecido particular escolhido variará dependendo dos sistemas de propagação clonais disponíveis para, e melhor adequados para, a espécie particular sendo transferida. Exemplos de alvos de tecidos incluem discos de folhas, pólen, embriões, cotilédones, hipocotilédones, tecido de caule, tecido meristemático existente (por exemplo, meristemas apicais, botões auxiliares e meristemas de raiz), e tecido de meristema induzido (por exemplo, meristema de cotilédone e meristema de hipocotilédone).

Plantas da presente invenção podem tomar uma variedade de formas. As plantas podem ser quimeras de plantas transformadas e células não transformadas; as plantas podem ser transformantes clonais (por exemplo, todas as células transformadas para conter o cassete de transcrição); as plantas podem compreender enxertos de tecidos transformados e não transformados (por exemplo, um rizoma de raiz transformado enxertado em uma muda não transformada em espécie de citrus). As plantas transformadas podem ser propagadas por uma variedade de meios, tal como por propagação clonal ou técnicas de cultivo clássicas. Por exemplo, a primeira geração (ou T1) de plantas transformadas pode ser desgeneradas para dar segunda geração (ou T2) homozigota de plantas transformadas, e as plantas T2 ulteriormente propagadas por meio de técnicas de cultivo clássicas. Um marcador selecionável dominante (tal como nptll) pode ser associado com o cassete de transcrição para auxiliar no cultivo. *** • ■*. *: *•;24 • 5 - v 4 •

Em vista do acima exposto, será evidente que plantas, que possam ser empregadas na prática da presente invenção, incluem aquelas do gênero Nicotiana.

Aqueles familiarizados com os processos de DNA recombinan- tes descritos acima reconhecerão que se pode empregar uma molécula de cDNA de QPRTase de comprimento completo ou um gene cromossomial de QPRTase de comprimento completo, ligado na orientação de sentido, com seqüências reguladoras ligadas de maneira operativa apropriada, para construir células e plantas de tabaco transgênica. (Aqueles técnicos especializados no assunto da técnica, também reconhecerão que seqüências reguladoras apropriadas para a expressão de genes na orientação de sentido incluem qualquer uma das seqüências de início de translação eucariótica conhecidas, em adição ao promotor e às seqüências de terminação de po- liadenilação / transcrição descritas acima). Tais plantas de tabaco transformadas são caracterizadas por níveis aumentados de QPRTase, e, portanto, por teor de nicotina mais elevado do que plantas de tabaco de controle não transformadas.

Deve ser entendido, portanto, que o uso de seqüências de DNA de QPRTase para diminuir ou para aumentar os níveis de enzima de QPRTase, e, por meio disso, diminuir ou aumentar o teor de nicotina em plantas de tabaco, recai dentro do escopo da presente invenção.

Conforme usado, uma cultura compreende uma pluralidade de plantas da presente invenção, e do mesmo gênero, plantadas em conjunto em um campo agrícola. Por "campo agrícola" entende-se uma porção de solo ou uma estufa. Portanto, a presente invenção fornece um processo de produção de uma cultura de plantas tendo atividade de QPRTase alterada e, portanto, tendo níveis de nicotina aumentados ou diminuídos, comparados a uma cultura similar de plantas não transformadas da mesma espécie e variedade.

Os exemplos que se seguem são mostrados para ilustrar a presente invenção, e não devem ser construídos como limitantes da mesma.

EXEMPLO 1

Isolamento e SeqüenciamentocDNA de TobRD2 (Conkling et al., Plant Phys. 93, 1203 (1990)) foi seqüenciado e é fornecido aqui como SEQ ID NO:1, e a seqüência de aminoácidos deduzida como SEQ ID NO:2. A seqüência de aminoácidos deduzida foi prevista ser uma proteína cistosólica. Embora os genes de QPTase de planta não tenham sido relatados, comparações da seqüência de aminoácidos de NtPT1 com o banco de dados GenBank (Figura 3) revelaram similaridade de seqüência limitada com relação a certas proteínas bacterianas e a outras proteínas; atividade de quinolato fosforibosil transferase (QPRTase) foi demonstrada para os genes de S. typhimurium, E. coli e N. tabacum. A QTPase codificada por NtQPTI tem similaridade com relação ao fragmento de peptídeo deduzido codificado por uma seqüência de Arabi- dopsis EST (etiqueta de seqüência de expressão) (número de acesso do GenBank F20096), que pode representar parte de um gene de QPTase de Arabidopsis.

EXEMPLO 2 HibridízacÕes In Situ

Para determinar a distribuição espacial de transcritos de mRNA de TobRD2 nos vários tecidos da raiz, hibridizações in situ foram realizadas em plantas não transformadas. Hibridizações in situ de fita de anti-sentido de TobRD2 ao mRNA de TobRD2 em tecido de raiz foram feitas usando técnicas, conforme descritas em Meyerowitz, Plant Mol. Biol. Rep. 5, 242 (1987) e Smith et al.. Plant Mol. Biol. Rep. 5, 237 (1987). Raízes de sementes de tabaco (Nicotiana tabacum) de sete dias de idade foram fixadas em glutaraldeido tamponado com fosfato, incrustradas em Paraplast Plus (Monoject Inc., St. Louis, MO) e seccionadas em espessura de 8 mm para se obter seções transversais e longitudinais. Transcritos de TobRD2 de anti- sentido, sintetizados in vitro na presença de 35S-ATP, foram usadas como sondas. O RNA marcado foi hidrolisado por tratamento alcalino para dar 100 a 200 bases de comprimento médio antes de usar.

As hibridizações foram feitas em formamida a 50% durante 16 horas a 42°C, com aproximadamente 5 x 106 contagens por minutos (cpm) de RNA marcado por mililitro de solução de hibridização. Depois de exposição, as lâminas foram reveladas e visualizadas sob microscopia de campo claro e escuro.

O sinal de hibridização foi localizado na camada cortical de células nas raízes (resultados não mostrados). A comparação das imagens tando de campo claro quanto de campo escuro das mesmas seções localizadas em transcritos de TobRD2 com as células parenquimatosas do córtex de raiz. Nenhum sinal de hibridização foi visível na epiderme o no esteio. EXEMPLO 3

Níveis de mRNA de TobRD2 em Mutantes de Tabaco Nid e Nic2 e Correlação com Níveis de Nicotina

Níveis de mRNA de estado estacionário de TobRD2 foram examinados em plantas de tabaco mutantes de Nid e Nic2. Nid e Nic2 são conhecidos em regular a atividade de quinolato fosforibosil transferase e atividade de metil transferase de putrescência, e são reguladores co- dominantEs de produção de nicotina. Os resultados presentes são ilustrados nas Figuras 5A e 5B e mostram que a expressão de TobRD2 é regulada por Nid e Nic2.

RNA foi isolado a partir das raízes de plantas de tabaco Burley 21 de tipo selvagem (Nic1/Nic1 Nic2/Nic2); raízes de Nid-Burley 21 (nic1/nic1 Nic2/Nic2); raízes de Nic2-Burley 21 (Nid/Nid nic2/nic2); e raízes de Nic1-Nic2-Burley 21 (nic1/nid nic2/nic2).

Quatro linhagens de tabaco Burley 21 (nic) foram crescidas, a partir de semente no solo, durante um mes e transferidas a câmaras hidro- pônicas, em solução nutriente aerada, em uma estufa, durante um mês. Essas linhagens eram isogênicas, exceto para os dois loci de baixo teor de nicotina, e tinham genótipos de Nic1/Nic1 Nic2/Nic2, Nic1/Nic1 nic2/nic2, nid/nid Nic2/Nic2, nid/nic1 nic2/nic2. As raízes foram coletadas desde cerca de 20 plantas para cada genótipo e reunidas para o isolamento de RNA. O RNA total (1 μg) a partir de cada genótipo foi eletroforisado através de um gel de agarose a 1% contendo formaldeído 1,1 M e transferido para uma membrana de náilon de acordo com Sambrook et al. (1989). As membranas foram hibridizadas com fragmentos de cDNA de TobRD2 marcados com 32P. A intensidade relativa dos transcritos de TobRD2 foram medidas por densitometria. A Figura 5 (barras sólidas) ilustra os níveis de transcritos relativos (comparados a Nic1/NicNic2/Nic2) para cada um dos quatro genó- tipos. O teor de nicotina relativo (comparado a Nid/Nic Nic2/Nic2) dos quatro genótipos é mostrado pelas barras hachuradas.

A Figura 5 compara graficamente o nível de mRNA de TobRD2 de estado estacionário, usando o nível encontrado em Burely 21 de tipo selvagem (Nid/Nic Nic2/Nic2) como a quantidade de referência. Níveis de mRNA de TobRD2 em mutantes duplos de Nic1/Nic2 foram aproximadamente 25% daqueles de tabaco de tipo selvagem. A Figura 5B compara adicionalmente os níveis relativos de nicotina nas linhagens isogênicas próximas de tabaco estudadas nesse exemplo (barras sólidas indicam nível de transcrito de TobRD2; barras hachuradas indicam o nível de nicotina). Houve uma correlação próxima entre os níveis de nicotina e os níveis de de transcrito de TobRD2.

EXEMPLO 4

O Efeito de "Topping" em Níveis de mRNA de TobRD2

É bem conhecido no estado da técnica que a remoção da cabeça da flor de uma planta de tabaco (topping) aumenta o crescimento da raiz e aumenta o teor de nicotina das folhas daquela planta. O "topping" da planta é uma prática padrão em cultivo de tabaco comercial, e o tempo ótimo para "topping" uma dada planta de tabaco, sob um conjunto conhecido de condições de crescimento, pode ser prontamente determinado por um técnico versado no assunto.

Plantas de tabaco (N. tabacum SR1) foram cultivadas, a partir de semente no solot durante um mes e transferidas para potes contendo areia. Plantas foram crescidas em uma estufa durante outros dois meses até que elas iniciarão à floração. As cabeças das flores e dois nodos foram, então, removidos a partir de quatro plantas (topping). Uma porção das raízes foi coletada a partir de cada planta, depois do tempo indicado e reuni- das para extração de RNA. Plantas de controle não foram decapitadas. O RNA total (1 μg) a partir de cada ponto de tempo foi eletroforisado através de um gel de agarose a 1% contendo formaldeído 1,1 M e transferido para uma membrana de náilon de acordo com Sambrook et al. (1989). As membranas foram hibridizadas com fragmentos de cDNA de TobRD2 marcados com 32P. A intensidade relativa dos transcritos de TobRD2 foram medidas por densitometria. A Figura 6 ilustra os níveis de transcritos relativos (comparados ao tempo zero) para cada ponto de tempo com "topping" (barras sólidas) ou sem "topping" (barras hachuradas).

Níveis de TobRD2 relativos foram determinados em tecido de raiz durante 24 horas; os resultados são mostrados na Figura 6 (barras sólidas indicam níveis de transcrito de TobRD2 em plantas de topo; barras hachuradas indicam os níveis de transcrito de TobRD2 em controles sem topo. Dentro de seis horas de "topping" de plantas de tabaco, os níveis de mRNA de TobRD2 aumentaram aproximadamente oito vezes nas plantas de topo; nenhum aumento foi visto nas plantas de controle durante o mesmo período de tempo.

EXEMPLO 5

Compiementação de Mutante Bacteriano Carecendo de QPRTase com DNA de SEQ IP NO:1

A cepa de Escherichia coli TH265 é um mutante carecendo de quinolato fosforibosil transferase (nadC-), e, portanto, não pode crescer em meio carecendo de ácidos nicotínicos.

Células TH265 foram transformadas com um vetor de expressão (pWS161) contendo DNA de SEQ ID NO:1, ou transformadas com o vetor de expressão (pKK233) somente. O crescimento das bactérias transformadas foi comparado ao crescimento de transformantes de TH265 (pKK233), e ao crescimento do mutante de nadC- de TH265 não transformado. O crescimento foi comparado em meios mínimos de ME (carecendo de ácido nicotínico) e em meios mínimos de ME com ácido nicotínico adicionado.A cepa de E. coli com a mutação de de QPTase (nadC), TH265 foi gentilmente fornecida pelo Dr. K. T. Hughes (Hughes et al., J. Bact. 175:479 (1993). As células foram mantidas em meios LB e as células competentes foram preparadas conforme descrito em Sambrook et al. (1989). Um plasmídeo de expressão foi construído em pKK2233 (Brosius, 1984) com o cDNA de TobRD2 clonado sob o controle do promotor Tac. O plasmí- 5 deo resultante, pWS161, foi transformado em células TH265. As células transformadas foram, então, colocadas em placas de agar de meios mínimos (Vogel e Bonner, 1956) com ou sem ácido nicotínico (0,0002%) como suplemento. Células TH265 isoladas e TH265 transformado com pKK2233 foram plaqueadas em placas similares, para uso como controles.10 Os resultados são mostrados na Figura 4. Somente o TH265transformado com DNA de SEQ ID NO;1 crescido em meios carecendo de ácido nicotínico. Esses resultados mostram que a expressão de DNA de SEQ ID NO:1 em células bacterianas TH265 conferiram o fenótipo NadC+ nessas células, confirmando que essa seqüência codifica QPRTase. A no- - 15 menclatura TobRD2 foi, então, modificada para NtQPTI.

EXEMPLO 6

Transformação de Plantas de TabacoO DNA de SEQ ID NO:1, em orientação de anti-sentido, está ligado de maneira operativa a um promotor de planta (promotor específico decórtex de raiz de CaMV 35S ou de TobRD2) para produzir dois diferentes cassetes de DNA: promotor de CaMV 355/anti-sentido SEQ ID NO:1 de anti- sentido e promotor de TobRD2 / SEQ ID NO:1.

Uma linhagem de tabaco de tipo selvagem e uma linhagem de tabaco de baixo teor de nicotina são selecionadas para transformação, porexemplo, tabaco Buriey 21 de tipo selvagem (Nid+/Nic2+) e Burley 21 nic17nic2" homozigoto. Uma pluralidade de células de plantas de tabaco a partir de cada linhagem são transformadas usando-se cada um dos cassetes de DNA. A transformação é conduzida usando-se um vetor de Agrobac- terium, por exemplo, um vetor binário de Agrobacterium portando seqüên-cias de borda de Ti e o gene nptll (conferindo resistência à kanamicina e sob o controle do promotor nos (nptll)).Células transformadas são selecionadas e regeneradas em ■^■Aapr%../) f %30 FIs. g*' Rub. uAtm - ■»»»»&*Vθzplantas de tabaco transgênicas (Ro). As plantas Ro são crescidas até a matu- ’ridade e testadas para níveis de nicotina; um subconjunto das plantas de tabaco transformadas exibem níveis de nicotina significativamente mais baixos comparados a plantas de controle não transformadas.

Plantas Ro são, então, desgeneradas e a segregação do trans-gene é analisada na progenia Ri. A progenia Ri é crescida até a maturidade e desgeneradas; a segregação do transgene entre a progenia R2 indica quais plantas Ri são homozigotas para 0 transgene.

Claims

1. Molécula de DNA, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:1.

2. Construto de DNA, caracterizado pelo fato de que compreende na direção 5' a 3', um promotor operável em uma célula de planta e uma molécula de DNA, como definida na reivindicação 1, posicionado a montante do dito promotor e associado de maneira operativa com ele.

3. Construto de DNA, caracterizado pelo fato de que compreende na direção 5' a 3', um promotor de planta e uma molécula de DNA, como definida na reivindicação 1, posicionado a montante a partir do dito promotor e associado de maneira operativa com ele, a dita molécula de DNA na orientação de anti-sentido.

4. Construto de DNA de acordo com a reivindicação 2 ou 3, ca-racterizado pelo fato de que o dito promotor é constitutivamente ativo em células de planta.

5. Construto de DNA de acordo com a reivindicação 2 ou 3, ca-racterizado pelo fato de que o dito promotor é ativo de maneira seletiva em células de tecidos de raízes de plantas.

6. Construto de DNA de acordo com a reivindicação 2 ou 3, ca-racterizado pelo fato de que o dito promotor é ativo de maneira seletiva em células de tecidos de córtex de raízes de plantas.

7. Construto de DNA de acordo com a reivindicação 2 ou 3, ca-racterizado pelo fato de que o dito construto compreende adicionalmente um plasmídeo.

8. Construto de DNA de acordo com a reivindicação 2 ou 3, ca-racterizado pelo fato de que é realizado por um vetor de transformação de planta.

9. Construto de DNA de acordo com a reivindicação 2 ou 3, ca-racterizado pelo fato de que é realizado por um vetor de transformação de planta, vetor de transformação de planta que é um vetor de Agrobacteríum tumefaciens.

10. Processo de preparação de uma célula de planta transformada Nicotiana tendo reduzida produção de quinolato fosforibosil transferase (QPRTase), caracterizado pelo fato de que compreende:fornecimento de uma célula de planta Nicotiana de um tipo conhecido para produção de quinolato fosforibosil transferase com um construto de DNA exógeno, o qual compreende, na direção 5' a 3', um promotor operável na célula de planta e um DNA operavelmente associado ao dito promotor, para produzir célula transformada de planta, a dita célula transformada de planta tendo reduzida produção de quinolato fosforibosil transferase quando comparada a uma célula de planta não transformada, e em que o dito DNA compreende pelo menos 30 nucleotídeos da sequência de nu- cleotídeos de SEQ ID NO:1.

11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o dito DNA está em orientação de anti-sentido.

12. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o dito DNA está em orientação de sentido.

13. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a regeneração de uma planta a partir da dita célula de planta transformada.

14. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o dito promotor é ativo de maneira constitutiva.

15. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o dito promotor é ativo de maneira seletiva em células de tecido de raiz de planta.

16. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o dito promotor é ativo de maneira seletiva em células de tecido de córtex de raiz de planta.

17. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de transformação é realizada por bombardeamento da dita célula de planta com micropartículas portando o dito construto de DNA.

18. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de transformação é realizada por infecção da dita célula de planta com um Agrobacterium tumefaciens contendo um plasmídeo de Ti portando o dito construto de DNA.

19. Processo de produção de sementes de tabaco transgênicas, caracterizado pelo fato de que compreende a coleta de sementes a partir de uma planta de tabaco transgênica produzida pelo processo como definido na reivindicação 13.

20. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a dita célula de planta transformada possui um RNA mensageiro endógeno expresso para a quinolato fosforibosil transferase e em que o dito DNA é complementar ao dito RNA mensageiro de quinolato fosforibosil transferase (mRNA de QPRT) expresso na dita célula de planta em uma região selecionada a partir de:(a) a sequência 5' não traduzida do dito mRNA de QPRT;(b) a sequência 3' não traduzida do dito mRNA de QPRT; e(c) a região traduzida do dito mRNA de QPRT.

21. Processo para a redução de expressão de um gene de quinolato fosforibosil transferase em uma célula de planta, caracterizado pelo fato de que compreende:o cultivo de uma célula de planta transformada para conter DNA exógeno, em que uma fita transcrita do dito DNA exógeno é complementar ao RNA mensageiro de quinolato fosforibosil transferase endógeno à dita célula de planta, por meio do qual a transcrição da dita fita complementar reduz a expressão do dito gene de quinolato fosforibosil transferase, e em que o dito DNA exógeno compreende pelo menos 30 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:1.

22. Processo de produção de uma planta de tabaco transgênica tendo o nível de nicotina diminuído nas folhas da dita planta de tabaco, caracterizado pelo fato de que compreende:a transformação de uma célula de planta de tabaco com uma molécula de DNA exógeno compreendendo pelo menos 30 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:1 para obter uma célula de tabaco transformada; eo crescimento da dita célula de planta transformada de tabaco em uma planta transgênica de tabaco em que a dita planta transgênica de tabaco possui um nível diminuído de nicotina nas suas folhas.