CN1838878A - 低危害的烟草产品 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一些方法，包括使用遗传修饰(GM)烟草的方法，用于开发和生产消费者可以接受的PREP，其包括：1)生产低焦油比尼古丁比例的香烟，其允许吸烟者当全部烟雾的释放被降低时，还能够比传统香烟更有效地获得满足量的尼古丁；这样降低了吸烟者存在于传统低产量香烟的“代偿作用”；2)通过遗传方法和通过从烟草中提取尼古丁并将其与基因修饰尼古丁降低的烟草结合，以降低烟草产品中有害的烟草特有亚硝胺；3)生产改良的膨胀烟草，其使用遗传修饰尼古丁提高的烟草；以及4)生产再造烟草，其包括下列的任何结合：遗传修饰尼古丁提高的烟草、遗传修饰尼古丁降低的烟草、烟草叶碎片和新收获的冻干烟草。
Description
临时申请的优先权
本专利申请要求2003年8月19日提交的美国临时申请No.60/496,290的优先权，其全部内容在此引为参考。
技术领域
本发明涉及低危害的烟草产品领域，其包括但不限于含有基因修饰烟草的香烟以及生产这种香烟的方法。
背景技术
烟草的使用被认为是美国主要疾病和死亡的可避免原因(美国卫生与公众服务部(U.S.DHHS)2000年1月，2010年健康人)。在过去的几十年中，公共健康团体已经反复强调吸烟对健康的重要影响。根据最近的预防医学官方报告(吸烟对健康的影响，2004预防医学官方报告)可以归因于吸烟的心血管疾病、呼吸疾病和癌症是大量的并正在增长。。据疾病控制中心估计，在美国每年有超过440,000的早期死亡归结于吸烟(疾病控制中心，TargetingTobacco Use，2004)。
尽管在过去30年中吸烟率在发达国家已经变得稳定，甚至在某些国家已经降低，但是在同一时期发展中国家的吸烟率和香烟消费率已经得到了提高，并且在可以预见的未来可能会这样持续下去。目前的计划表明，如果烟草的全球性流行保持不变的话(世界健康组织，2004)，全世界吸烟者的数目会从目前的13亿增长到2025的17亿以上(部分因为全球人口的增加)。
全球的总香烟消费持续增长。就消费量而言，全世界香烟的消费在1995～1999年之间增长了4％，从4.763万亿香烟到4.953万亿香烟。香烟支配着生产烟草产品的市场，其占了全球市场量的96％(世界烟草产品市场，由Euromonitor International出版，2000版，第2页)。在2002年，全球市场增长到5.322万亿香烟(Action on Smoking and Health，Factsheet No：18；2004年1月)。
考虑到这些数字的巨大及其增长率，就可清楚的认识到人们将会在未来长时间内吸烟。可以预测，到21世纪末吸烟会导致全球10亿人早期死亡。目前的统计证明每消费300万香烟就有大约1个人死于肺癌(Nature CancerReviews，2001年10月)。
解决这种健康保障难题的理想方法是所有吸烟者戒烟。然而，这种方法似乎不切实际。因为全球烟草产品消费的提高，来自反烟草游说团体的禁酒反烟草政策已经大部分失败了。在其普遍流行的西方世界，这些政策在过去20年里已经很难降低吸烟率了。相当高百分比的吸烟者没有打算要戒烟。尽管只在美国数千万的人已经戒烟，许多是在接受多种形式的尼古丁替代治疗(NRT)之前，但一部分吸烟者不能成功戒烟。缺少有效的策略来降低吸烟对这两组的不利影响。
应美国食品及药物管理局的要求，国家科学院医学研究院(IOM)最近出版的报告为解决目前僵局的可能方法建立了基础。所得到的656页标题为“
Clearing the Smoke：Assessing The Science Base For Tobacco Harm Reduction”(IOM Report)的报告表明了公共健康对低潜在危害烟草产品(PREP)的迫切需要，特别是香烟(医学研究院，华盛顿，DC：NationalAcademy Press，2001)。
IOM报告的第一个结论是“对于许多归结于烟草使用的疾病，通过降低烟草有毒物的危害来降低疾病的风险是可行的。这个结论是基于这样的研究证明：对于许多疾病降低烟草烟雾危害能够导致疾病发生率的降低，完全节制会提供最大的好处”(IOM Report Executive Summary，第4页)。
因此，如果考虑到所有经济和政治动因的话，PREP是公共健康政策的必需品。基于科学的PREP的市场和调节，需要被考虑作为对烟草的全面公共政策策略的一部分。全球降低烟草的使用，包括对成年人合理的烟草市场限制，对儿童出售和市场的严格强制执行，和吸烟有害影响的教育，需要与用于消费的PREP降低烟草对社会的整体危害的有效性并行实施。
香烟烟雾由两相构成，微粒相，其通常称为“焦油”或者微粒物质；和气相，其含有气体和半挥发性化合物。“焦油”的通用定义是“无尼古丁的干烟雾”或者“无尼古丁的干微粒物质”(NFDPM)。更特别的，“焦油”是从烟雾中分离的全部微粒物质，不包括水和生物碱，包括但不限于尼古丁。大约4/5(重量)的烟草烟雾由周围空气构成，其包括一氧化碳、二氧化碳、水、氢气、甲烷、氮气和氧气。剩余的1/5包括微粒相与半挥发性化合物。焦油占香烟烟雾的少于10(重量)％。而焦油组分含有大部分毒性最大的化合物。
香烟烟雾是非常复杂的化学化合物的混合物。对香烟烟雾的多年化学分析已经证明有6000种以上的组分(焦油加气体)。在香烟烟雾的焦油部分已经鉴定了大约4800种化合物(Green and Rodgman，Recent Advances in TobaccoScience，22：131-304，1996)。与灵敏的生物化验结合的分析方法已经在烟草烟雾中鉴定出了69种致癌物质(The Changing Cigarette：Chemical Studies andBioassays，Dietrich and IlseHoffman，第5章，Smoking and Tobacco ControlMonograph No.13，NIH Pub.No.02-5074，2001年10月)。
然而，研究人员越来越清楚的是，不是所有的香烟烟雾组分都具有相同的毒性。特别的，1964年第一份关于吸烟的美国预防医学官方报告(SurgeonGeneral′s report)得出的结论是，尼古丁在吸烟者吸入的水平上可能是没有毒的，据此推断出对吸烟者最初的药理结果不是所急切渴望的(Gori，第3页，Virtually Safe Cigarettes-Reviving an Opportunity Once Tragically Rejected2000)。事实上，预防医学官方报告指出“没有可以接受的证据支持长期暴露到尼古丁会造成目标性能的危险性功能变化或者退化性疾病”(U.S.SurgeonGeneral Report 1964，第74页)。实际上，美国食品及药物管理局目前允许出售尼古丁片和尼古丁咀嚼胶，以作为戒烟用具，其可能含有比一盒香烟更多的尼古丁。
“生物碱”是复杂的含氮化合物，其天然出现在植物中，并对人类和动物产生药理学影响。“尼古丁”是出售的香烟烟草中的主要天然生物碱，其占角蒿(Nicotiana tabacum)生物碱含量的大约90％。烟草中的其它主要生物碱包括柯替宁、去甲基尼古丁、米喔斯明(myosmine)、烟碱烯、新烟碱、去氢新烟碱(J.C.Leffingwell，第8章，Leaf Chemistry，Tobacco：Production，Chemistry and Technology，第275页，1999)。次要的烟草生物碱包括尼古丁-n-氧化物、N-甲基去氢新烟碱、N-甲基新烟碱、假氧尼古丁、2，3-邻联吡啶及其它(“Biosynthesis and Metabolism of the Tobacco Alkaloids”，Edward LeeteAlkaloids：Chemical and Biological Perspectives，Volume I，S.William Pelletier，Ed.1983)。某些尼古丁对人类的通常影响是提高血压和心率以及精力集中和短时记忆的提高。尼古丁类似物和化合物是最近许多研究的对象，因为它们有希望用在治疗某些疾病例如老年痴呆症和帕金森症中。与尼古丁相比，其它烟草生物碱具有相似但降低的活性。
对香烟烟雾释放最常见的检测被报道为焦油和尼古丁。在美国和许多其它国家，在所有消费香烟广告中表明了香烟焦油和尼古丁的产量。在许多国家，焦油、尼古丁甚至一氧化碳的产量(每支香烟)需要印在香烟的包装上。在过去的几十年中，香烟的设计创新主要大大地集中在降低焦油和尼古丁的产量上，其基于美国预防医学和公共健康委员会“越少越好”的信条(参见图1)。
在美国，焦油、尼古丁和一氧化碳的产量是用联邦贸易委员会(FTC)吸烟机检测方法来获得，其定义焦油的测量为在香烟被机器吸时剑桥板(Cambridge pad)所捕获的物质，减去尼古丁与水(Pillsbury等，1969，“Tarand nicotine in cigarette smoke”
J.Assoc.Off.Analytical Chem.，52，458-62)。特别的，FTC香烟检测方法通过模拟每58秒钟吸35ml体积的香烟烟雾2秒钟，其中没有过滤嘴流通孔(如果有的话)被堵塞，直到燃烧线到达水松纸外加2mm，或者距离无滤嘴香烟底部23mm的线。这种FTC吸烟机检测方法从1967年就已经在美国应用以确定香烟烟雾焦油和尼古丁的产量。在1980年，在这种方法中又加入了对一氧化碳产量的确定。
1967年，当FTC介绍其检测方法的时候，公布了消息并解释检测的目的“不是为了确定任何人类吸烟者所吸入的焦油和尼古丁的量，而是为了确定按照所规定的方法当香烟被机器吸时所产生焦油和尼古丁的量”。然而，该方法主要的作用在于提供精确的方法来按照焦油、尼古丁和一氧化碳产量来对香烟进行分级和比较。
国际标准化组织(ISO)开发了非常类似的用于检测香烟中焦油、尼古丁和一氧化碳产量的吸烟机检测方法(ISO，1991“Cigarettes-determination oftotal and nicotine-free dry particulate matter using a routine analytical smokingmachine”ISO：4387：1991)。
FTC和ISO吸烟方法在下面的8个方面有区别。
●FTC方法限定用于平衡和检测的实验室条件为75°F±1°F(23.8℃±1℃)，相对湿度为60％±2％。平衡的时间为最短24小时，最长14天。相比较而言，ISO的规格是进行平衡时为22℃±1℃和60％±2％的相对湿度，进行测试时为22℃±2℃和60％±5％。平衡的时间为最短48小时，最长10天。
●FTC限定香烟烟蒂长度为最短23mm或者水松纸外加3mm，无论哪一个都是较长的。ISO限定香烟烟蒂长度为最长23mm或者水松纸外加3mm，或者过滤嘴外加8mm。两种方法均限定无滤嘴香烟的烟蒂长度为23mm。
●ISO限定烟灰缸的位置在吸烟机中香烟的下方20～60mm的位置。FTC没有限定位置。
●ISO限定了可重复使用的两层咬合过滤嘴支持器。该过滤嘴支持器包含剑桥板(Cambridge pad)并使用合成橡胶穿孔垫圈以部分挡住香烟的烟蒂。FTC方法限定了剑桥过滤嘴板(Cambridge filter pad)的使用，但没有限定过滤嘴板支持器的装配。
●ISO方法限定在香烟水平上通过香烟的气流。FTC限定使用监测香烟来调节气流。
●ISO程序限定了擦拭所使用过滤嘴支持器外的过剩总微粒物质(TPM)的步骤。使用两个独立的四分之一未使用的已调节好过滤嘴板来擦拭过滤嘴支持器的内表面。FTC方法使用背面(收集TPM的背面)来擦拭过滤嘴支持器的内表面。
●ISO限定每个剑桥板使用20ml提取溶液以分析TPM中的尼古丁和水。FTC程序限定每个剑桥板10ml。
●ISO为尼古丁和水的气相色谱限定内标。FTC程序没有确定内标。
这些区别典型地导致ISO方法所检测到的释放比FTC方法略低。在FTC和ISO方法之间的测量值，在检测的探测限度内，或者对于大约10mg以上产量的香烟大约不超过0.4mg焦油和0.04mg尼古丁。
对FTC/ISO(“FTC/ISO方法”或者“FTC或者ISO方法”)吸烟机检测方法的主要缺点是它们不能够精确地预测个别吸烟者暴露到来自吸特定香烟的焦油、尼古丁或者一氧化碳的水平(National Cancer Institute Smoking andTobacco Control Monograph 13，“Risks Associated with Smoking Cigaretteswith Low Machine-measured Yields of Tar and Nicotine”)。这些方法在标准的条件下得到检测结果。然而，在多数情况下，个体的吸烟行为可以与标准的机器吸烟有很大的不同。
与通过FTC/ISO方法所得到的数据相比，人吸烟者可以被暴露到每只香烟极端不同的焦油、尼古丁和一氧化碳水平(对于完全相同的品牌型号香烟)，这依赖于多种因素，其包括吸烟者吞吐的频率和这种吞吐所吸入的体积、在被排出之前吸入烟所保持的时间、在特定时间周期内所吸香烟的数目以及所吸香烟的百分比(多长的烟被吸掉)。
两个人吸完全相同的品牌型号香烟以及相同的每日香烟数目不必然被暴露到相同水平的焦油、尼古丁和一氧化碳。而且，个体吸烟者在不同的时间也被暴露到不同水平的每只烟的焦油、尼古丁和一氧化碳。例如，如果吸烟者在穿越大西洋的航线上，并且8个小时没有吸烟，他(她)会非常猛烈地吸下一支烟并被暴露到比他(她)的平均每只烟更高水平的焦油、尼古丁和一氧化碳。另一方面，如果吸烟者在短时间内已经吸了比平时多的烟，接下来的吸烟会不太强烈，因此会将吸烟者暴露到比其平时低的焦油、尼古丁和一氧化碳(以每只烟为基础)。其它因素包括压力会影响人吸烟的频率和强烈程度。压力通常会提高吸烟者的尼古丁消费(IOM Report第254页)。
根据FTC/ISO方法，带过滤嘴的香烟可以被设计成产生较少的焦油、尼古丁和一氧化碳。这可以通过降低每次吞吐这些烟的残余产量来达到。已知可以通过下列的改进来获得较低焦油、较低尼古丁和较低一氧化碳的香烟(“Cigarette Design”，Lynn T.Kozlowski等，NCI Monograph 13，第2章，第15页)：
●使过滤嘴更有效，这样能过滤掉更多的烟；
●使用更多孔的烟纸；
●增加过滤嘴材料周围设置的通风孔数量(包括增大孔的尺寸)，以便当吸烟者吸烟的时候，会有更多的空气进入烟雾混合物质，这样稀释了所吸入烟雾的量；
●通过烟纸或者填充物内的化学添加剂，提高香烟的燃烧速度；
●使用更高百分比的再造片烟草，其从包括烟草茎和粉末的烟草碎片制得。
●使用膨胀烟草，其造成每只香烟更少的焦油和尼古丁，因为用烟草叶较少的物质填充了香烟杆；
●降低香烟的直径，这样降低了填充物的质量；以及
●提高水松纸的长度，其改变烟蒂的长度。
图1从历史上将这些方法列在一起，显示了焦油和尼古丁产量的降低。
“再造烟草”(“Recon”)是烟草填充物的重要部分，其由烟草粉末和其它烟草碎片制成，并被加工成片状和切成条带以类似烟草。除了节约成本外，再造烟草对于香烟口味的贡献也是非常重要，其通过利用氨和糖之间的反应来产生风味。
“膨胀烟草”是烟草填充物另一个重要的部分，其通过适当气体的膨胀而得到加工，这样烟草被“吹大”，其结果是降低的密度和更高的填充能力。其降低了香烟中所使用烟草的重量。其优点是，膨胀烟草降低了焦油、尼古丁和一氧化碳的释放并发现在例如制造低焦油、低尼古丁和低一氧化碳释放香烟方面有用处。
在较少程度上，香烟烟雾所产生的尼古丁和焦油水平也依赖于用于生产香烟的烟草类型和物种。美国品牌的香烟通常使用的三种类型烟草：烤烟、伯莱芋叶(burley)和东方型(oriental)。将这些进行混合就生产了被称为“美国品牌”的香烟。通常，伯莱芋(burley)叶具有最高水平的尼古丁，接着是烤烟和东方型(oriental)。多数被加工的烟草在15％潮湿的情况下含有大约1～3(重量)％的尼古丁。在所制成的香烟中生物碱的含量小于新收获的用于制造香烟的烟草叶中的量，因为在处理、储藏和制造过程中会有损失。
“处理”是熟化的过程，其降低潮湿和引起叶绿素的分解，这为烟草叶提供了金黄色，并通过该过程淀粉变成了糖类。因此，与新收获的绿叶相比，被处理烟草具有更高的还原糖含量和更低的淀粉含量。“烤烟烟草”是指一种在通风的房间内用热量对烟草进行干燥的方法，其特征是颜色均一、高还原糖含量、机体中等到重并且烟雾性能特别柔和(Bacon，E.W.，Wenger，R.&Bullock，J.F.(1952)，Chemical changes in tobacco during flue-curing，Ind.Eng.Chem.，44，292)。
针对实际所有可购买烟草填充物，已知通过改变香烟杆任何组分的设计，如上所讨论的，用FTC/ISO方法所测量的焦油和尼古丁的水平可以在带过滤嘴香烟中从大约1mg焦油和0.05mg尼古丁变化为大约20mg焦油和1.8mg尼古丁。
如果香烟被设计为“更淡香型”，通过FTC/ISO方法所测量的焦油、尼古丁和一氧化碳的水平可能以微小的不同速率降低。然而，在尼古丁没有以大约相同百分比降低的情况下，焦油和一氧化碳的水平不能以任何相当大的百分比降低，反之亦然。尽管每个FTC/ISO方法的焦油和尼古丁产量已经在过去50年中得到降低，香烟的“焦油比尼古丁产量比例”却保持相当稳定，这可以从图1和图2中看出。
这里所使用的术语“香烟”被定义为“杆”加上“填充物”。香烟“杆”包括香烟纸、过滤嘴、滤棒(plug wrap，用于含有过滤材料)、水松纸其连接香烟纸(包括填充物)到过滤嘴、以及所有将这些组分连接在一起的粘接剂。“无过滤嘴香烟”杆的唯一组分是香烟纸和将其封装的粘接剂。“填充物”包括(1)全部烟草，其包括但不限于再造和膨胀烟草，(2)非烟草替代品(包括但不限于草药、非烟草植物草料和其它可以与烟草一起卷在香烟纸内的物种)，(3)包装，(4)香料，以及(5)所有其它的添加剂(其被混合入烟草和替代物中并被卷入香烟)。这里所使用的术语“香烟”被定义为(A)任何包在纸内的烟草卷或者任何不含烟草的其它物质，以及(B)任何包在含有烟草的物质内的烟草卷，因为其外形、填充物中所使用烟草的类型或者其包装和标记，其作为(A)小段中所描述的香烟可以提供给消费者或者被消费者购买(1967 Federal Cigarette Labeling And Advertising Act，U.S.FTC)。
这里使用的术语“无过滤嘴杆”、“浓香型杆(full-flavor rod)”、“淡香型杆(light rod)”和“超淡香型杆(ultra-light rod)”被分别定义为无过滤嘴香烟去掉其填充物、浓香型香烟去掉其填充物、淡香型香烟去掉其填充物以及超淡香型杆香烟去掉其填充物。
这里所使用的香烟的“焦油比尼古丁产量比例”或者“TNR”是通过焦油产量除以尼古丁产量计算出来的，其中两个产量都是用FTC或者ISO方法测量的。
在美国和全世界大部分的香烟类型是通过诸如浓香型、淡香型和超淡香型的分类进行区分的。这种标记通常出现在香烟的包装和广告上。这样的分类记载了香烟强度，这是通过FTC或者ISO方法所测量的焦油和尼古丁水平的作用。更强口味的香烟或者浓香型的香烟具有更高的焦油和尼古丁产量。下面是在美国通常通过FTC方法所鉴定的香烟的分类或者“强度”：
●“浓香型香烟”(每支香烟15mg或者更多的焦油)
●“淡香型香烟”(每支香烟7～14mg的焦油)
●“超淡香型香烟”(每支香烟6mg或者更少的焦油)
消费者决定是否吸浓香型香烟还是淡香型香烟主要基于通过FTC/ISO方法所得出的焦油和尼古丁水平，这是有问题的(“Public Understanding ofRisk and Reasons for Smoking Low-Yield Products”，Neil Weinstein，NCIMonograph 13，第6章)。因为人与吸烟机的吸烟是不同的，消费者可能更期待具有低焦油的香烟(“Consumer Perception of Cigarette Yields：Is the MessageRelevant？”Gio Gori，
Regulatory Toxicology and Pharmacology第12卷，64-681990)。吸烟者不应该错误地相信从浓香型香烟(Marlborot浓香型产生15mg焦油和1.1mg尼古丁)转成淡香型香烟(Marlborot淡香型产生11mg焦油和0.8mg尼古丁)必然能够降低吸烟相关的风险。
如果淡香型香烟吸烟者与浓香型香烟吸烟者相比(以及超淡香型吸烟者与淡香型吸烟者相比，超淡香型吸烟者与浓香型香烟吸烟者相比)，和/或当通常吸浓香型香烟或者淡香型香烟的个体吸烟者转到产量减低的香烟，或者偶尔吸产量降低的香烟，在某些程度上会出现下面的某些或者全部吸烟行为：
●每支烟进行更多的吞吐；
●更大的单个吞吐或者吞吐体积(例如可能消耗55ml烟对比35ml)；
●单次吞吐持续时间的变化(例如4秒对比2秒)，因此，产生了更热的锥形温度，其与提高的烟雾诱变性相关*；
●在排出前，烟雾在肺中保持更长的持续时间；
●更深地吸入肺中；
●淡香型香烟吸烟者会用手指和嘴唇堵住过滤嘴流通孔；以及
●在给定时间周期内吸更多的烟。
*(“Effect of pyrolysis temperature on the mutagenicity of tobacco smokecondensate”，White，J.L.等，Food and Chemical Toxicology 39，第499～505页2001)。如IOM报告所描述的，“为了维持所希望的尼古丁吸入量，许多改为低产量产品的吸烟者也按照前面所描述的改变他们吸烟方式。这样，他们暴露到烟草有毒物比通过标准检测所预测的要高，并且持续使用这些产品的人没有通过变换成这样而显著降低其疾病风险”(IOM Report第2页)。
在浓香型、淡香型和超淡香型香烟的吸烟者中所观察到的吸烟行为的差别被总称为“代偿作用”(“Compensatory Smoking of Low Yield Cigarettes”，Neal Benowitz，NCI专论13)。“代偿作用”是由于烟草烟雾中尼古丁的量降低而引起的更强烈地吸烟。吸烟者通过更强烈地(比高产量烟)吸低产量烟来达到补偿，进而获得了其所希望的烟雾尼古丁影响和口感，这是重要的感觉性能(Jed E.Rose，“The role of upper airway stimulation in smoking，”Nicotine Replacement：A Critical Evaluation，第95～106页，1988年)。
威尔科克斯组已经得出结论：与对照组相比，变换到低焦油和尼古丁香烟的吸烟者会通过提高他们每日的香烟消费来进行代偿。从四组中汇集的数据未能够显示出低焦油香烟在肺癌风险方面有统计学上的显著益处，甚至在不同的吸烟水平中(Tang等，1995b)，如另外一个大组研究(Sidney等，1993)。Lee和Garfinkel提供了肺癌风险和所吸香烟类型的总结(Lee和Garfinkel，1981)，没能够证明基于焦油含量的风险的显著降低(IOM Report第401页)。最近，吸烟者在下呼吸道患腺癌增加，据估计是由于所谓的低产量产品的吸烟代偿。这些产品的吸烟者为增加尼古丁剂量吸入得更深。(IOM报告，285页)
接下来，30年倾向于“更淡香型”香烟的消费并没有对吸烟者的健康有益处。通常，通过代偿，淡香型香烟吸烟者吸入与浓香型香烟相同的焦油和尼古丁。当然，淡香型香烟的确与浓香型香烟的口味不同，正是这些口味的区别使大多数吸烟者选择他们所选择的品牌型号。然而，仅仅在美国，目前有数百万从更高产量香烟转变来的淡香型和超淡香型香烟吸烟者。
图2表示了通过FTC方法得到的某些美国品牌型号的焦油和尼古丁产量。“品牌型号”是品牌家族内不同的版本或者型号(例如Marlborot超淡香型国王过滤嘴盒)。图2还表示这种品牌型号TNR结果。无论品牌型号是国王型(通常长度为85mm)、100型(长度为100mm)、浓香型香烟、淡香型香烟还是超淡香型香烟，它们的TNR结果在数值上是相对接近的。超淡香型倾向于有些较低的TNR，这主要是因为一个事实即：这种香烟的设计了更多的通风，以比尼古丁略高的速度降低了焦油的产量(通过FTC/ISO方法)。图2中TNR简单的平均值是14.22。
1998年FTC报告中焦油和尼古丁的销售重量平均为12.0mg焦油和0.88mg尼古丁，这样得出13.64的TNR。图1说明在1950年，平均TNR为大约14.44(大约39mg焦油/大约2.7mg尼古丁)。这些数字说明了从大约1950年到目前，美国香烟的平均TNR一直相当稳定。
1998的FTC报告在2000年被公开，其覆盖了1998年的香烟品牌，也是FTC选择公开香烟中焦油、尼古丁和一氧化碳产量的最后一年。在所评价的1294种香烟品牌类型中，只有3种所算出的TNR小于8。事实上，总共只有8种所计算出的TNR小于10。这些包括1种Rothmans、3种CanadianPlayers、2种Old Gold、1种Now、以及1种Carlton。然而，报告中只是列出了焦油、尼古丁和一氧化碳的数目，从这些数字中可以通过焦油产量除以尼古丁产量来容易地计算出TNR。两种其它的Carlton品牌类型产生具有＜0.5的焦油和0.1的尼古丁。由于不能确定焦油产量的真实原始数字，以及由于在这些水平上凑整的很大影响，因此这两种品牌类型的数字似乎不能反映在先技术。
3种TNR小于8的品牌类型中的两种(Carlton 100过滤嘴软包装和Now国王过滤嘴软包装)，在1998年的FTC报告中报告为产生1mg焦油和0.2mg尼古丁，因此TNR为5。然而，这两种品牌类型的TNR主要因为小数目凑整的性能而得到的。从1998年的FTC报告中“焦油和一氧化碳的等级被凑成最接近的毫克(mg)，0.5mg或者更高的数目被进上去，0.4mg或者更低的数目被舍下来。尼古丁的数值被凑成最近的0.1mg。0.05mg或者更高的数目被进上去，0.04mg或者更低的数目被舍下来。”因此，释放1.4mg焦油和0.15mg尼古丁的超淡香型香烟会被报道为1mg焦油和0.2mg尼古丁(TNR为5)，尽管实际的TNR应为9.33。因为烟雾的微弱(口味的缺乏)以及过多的吸阻，释放1mg焦油和0.1mg尼古丁的香烟具有低的消费者接受性。在2000年，按照FTC方法产生1～3mg焦油的香烟品牌类型只占美国市场的1.3％。92％的产生3mg或者更少焦油的品牌类型在其包装上印有FTC焦油和尼古丁量。这与产生12mg或者更多焦油的品牌类型形成对比，其中只有0.01(1％)在在其包装上印有FTC焦油和尼古丁量(FTC Cigarette Report for2000，2002年第15页)。
FTC凑整程序的进一步的资料是有关1998FTC报告中TNR为5的这两种品牌类型，并且看来不能精确反映在先技术的是在于硬包装版的Carlton100过滤嘴软包装品牌类型列出了1mg焦油和0.1mg尼古丁的等级(TNR为10)。可以推断软包装版中“0.2”mg尼古丁凑整数字实际上在原始数据中是接近0.15mg的尼古丁。相似地，薄荷醇版的Now国王过滤嘴软包装所列等级是1mg焦油和0.1尼古丁，其也意味着无薄荷醇版的“0.2”mg尼古丁凑整数字极有可能在原始数据中是接近0.15mg的尼古丁。同样，在2000、2001和2002年的FTC报告中列举了Carlton(100过滤嘴软包装)品牌类型，报告称其产生1mg焦油和0.1mg尼古丁(TNR为10)，而不是1998年FTC报告中的1mg焦油和0.2mg尼古丁(TNR为5)。
在12个品牌类型中(在全部1294个中)有10个产生1mg焦油，也产生0.1mg尼古丁(TNR为10)。上面已经介绍了另外的两个(Carlton100过滤嘴软包装和Now国王过滤嘴软包装)。在焦油方面，FTC的凑整程序可能并非常可能有利于降低这两种低产量品牌类型的TNR。可能制造商将这些1mg焦油品牌类型定位在大约1.4mg焦油和0.14mg尼古丁，其是为能够在品牌的包装上宣传1mg焦油水平和实际产量(没有凑整的)为1mg或者更少焦油的口味不佳而考虑的平衡。这是最有可能为什么非常相似的品牌类型(硬包装对软包装，以及薄荷醇对无薄荷醇)会因为凑整而不相同(TNR为5对10)。这样，这两种品牌类型似乎不能反映在先技术。
在1998年FTC报告中的第三种TNR小于8的品牌类型是Old Gold无过滤嘴硬包装，其TNR为5.55(10mg焦油和1.8mg尼古丁)。这个无过滤嘴品牌类型的目录似乎是错误的。在1998年FTC报告中列有72种无过滤嘴品牌类型。在Old Gold无过滤嘴硬包装之后，其中TNR最低的是EnglishOvals无过滤嘴硬包装，其TNR为13(26mg焦油和2.0mg尼古丁)。事实上，72组无过滤嘴品牌类型中，除了Old Gold无过滤嘴硬包装以外，焦油产量最低的是Picayune普通无过滤嘴软包装浓香型。这种品牌类型的产量是18mg焦油和1.2mg尼古丁(TNR为15)。
由于可以向FTC自由索取信息，在2003年10月，FTC公开了1999～2002年的相似报告。Old Gold无过滤嘴硬包装并没有出现在这四年的报告的任何一份中或者1997年的FTC的报告中。在这5份FTC报告(1997、1999、2000、2001和2002)中只列举了一种Old Gold无过滤嘴品牌类型即是Old Gold无过滤嘴软包装，其在1997产生25mg焦油和1.8mg尼古丁(TNR为13.8)，在1999产生26mg焦油和1.9mg尼古丁(TNR为13.68)，在2000产生27mg焦油和1.9mg尼古丁(TNR为14.2)，在2001产生27mg焦油和2.0mg尼古丁(TNR为13.5)。没有理由解释软包装品牌类型产生与硬包装品牌类型实质上(或者甚至可以忽略的)不同水平的焦油。在2002年的FTC报告中没有列举Old Gold品牌类型。
对于2002年的FTC报告，在1250个中只有下面的四个品牌类型算出的TNR小于8：
●Merit国王过滤嘴最终版：1mg焦油，0.2尼古丁(TNR为5)；
●Now国王过滤嘴薄荷醇软包装，超淡香型：1mg焦油，0.2尼古丁(TNR为5)；
●Now国王过滤嘴软包装，超淡香型：1mg焦油，0.2尼古丁(TNR为5)；
●Now100过滤嘴软包装，超淡香型：2mg焦油，0.3尼古丁(TNR为6.66)。
也列举了另一个和Merit国王过滤嘴最终版完全相同的品牌类型，而这个产生1mg焦油和0.1mg尼古丁(TNR为10)。相信这些品牌类型的低TNR是因为与1998年FTC报告所列举的同样的原因，并且不能精确反映在先技术。在2002年的FTC报告中总共有5个品牌类型(在1250个中)所算出的TNR大于8而小于10。其包括3种Canadian Players、1种Carltong和1种其它的Merit。
在香烟PREP方面，最近的倾向是降低烟草烟雾中所选择的致癌物质。在美国已经问世了两种香烟PREP：由Brown & Williamson烟草公司制造的Advance，以及由Vector烟草股份有限公司制造的Omni。Advance达到烟草特有亚硝胺(TSNA)的降低，其利用与特定过滤技术结合的烟草叶处理技术的专利(参见美国专利No.5,803,081、5,845,647、6135,121、6,202,649、6,311,695、6,338,348、6,350,479、6,425,401、RE38,123以及6,569,470)和专利申请(参见美国专利公开No.20020174874以及20030018997)。
Omni通过使用加入到填充物和活性炭过滤中的钯催化体系(参见美国专利公开No.20030000538)降低了多环芳香烃(PAH)、TSNA和邻苯二酚。Omni国王型号浓香型具有15mg焦油和1.0mg尼古丁(TNR为15)。Advance淡香型国王盒具有10mg焦油和0.8mg尼古丁(TNR为12.5)。
设计PREP的主要难题是需要多年的临床研究来了解PREP与传统香烟相比所降低的风险(如果有的话)。与Advance和Omni相似的，特别确实的是，PREP没有降低全部烟草烟雾释放只是降低了烟草烟雾中的某些化合物。
多环芳香烃(PAH)是在烟草中天然发现的脂类和萜烯不完全燃烧的结果。科学界认为这些化合物是烟草烟雾中潜在的致癌物质。在烟草的处理过程中和在吸烟的过程中形成了烟草特有亚硝胺(TSNA)(Hoffman，D.，Dong，M.，和Hecht，S.S.1977年，Origin in tobacco smoke of N-nitrosonornicotine，a tobacco-specific carcinogen.Brief communication，J.Natl.Cancer Inst.，58，1841～4)。这些也被考虑为潜在的致癌物质。TSNA是通过在烟草中天然发现的亚硝基化剂和生物碱的反应形成的，并且也是烟草烟雾中的致癌物质(美国专利公开No.20040144397)。
尽管有这些潜在致癌物质的降低，在烟草烟雾中仍然存在其它致癌物质，这些在技术方面还没有涉及到。同时，许多其它不能引起癌症但对人类健康的其他方面例如心血管和呼吸疾病有害的化合物并没有被降低。
Eclipsed和Accord提供了尽可能接近传统香烟而最少或者没有烟草燃烧(高温分解)的吸烟体验。这些产品的预期优点是烟草在传统香烟的燃烧中产生的化合物，在形成过程中显著降低。这些化合物通常被认为对吸烟者是有毒的。因为这两个品牌并不像传统香烟一样吸烟，因此它们并没有完全被市场所接受。
这两种产品的吸烟体验均依赖于下面的概念。两种产品的烟雾浮质是通过对含高含量甘油的烟草材料进行加热而形成的，而不是燃烧烟草。甘油加热时，快速蒸发，形成了可吸入浮质，其与香烟烟雾有非常相似的外观和感觉。进一步，对这些产品中所含烟草材料进行加热会释放烟草内在的挥发性香料以及尼古丁。任何加入的烟草挥发性香料也会被释放到烟雾浮质中。
Eclipsed和Accord使用不同的方法对在它们各自产品内的烟草材料加热。Accord依赖于被认为是“点火器”的设备，其含有电池、电路和可以对插入设备的香烟进行加热的加热器。按照这种模式进行设计是为了每支插入设备的香烟释放6口烟。必须使用特别为这种设备制造的香烟以达到适当的性能。
Eclipsed依赖于可燃烧的碳末端，如果点燃的话，其提供加热源以形成来自包含在产品中烟草材料的烟雾浮质。Eclipsed具有与传统香烟相似的外形，但与传统香烟相比，其不能被消耗成灰。
如果需要通过FTC方法确定所释放焦油和尼古丁的话，这两种产品都面临挑战。烟蒂长度确定是没有意义的，因为在其被吞吐时没有产品被消耗。每种产品的吞吐数目是受其设计性能限制的。Eclipsed的吞吐数目是由碳加热源调节的，Accord被电子限定为6次吞吐。最后，Accord并不是按照FTC方法所描述的“点燃”。
已知高尼古丁含量没有被基因修饰的黄花烟草(Nicotiana rustica)能够与角蒿(Nicotiana tabacum)杂交以产生新的植物(Wernsman，E.A.等Principles of Cultivar Development，第2卷，Crop Species，Ed.W.R.Fehr，Macmillan，New York 1987年)。由美国农业部最初和部分开发的Y-1烟草是这样杂交的实施例。然而，这样的品种需要比通过转基因方法多许多年以创造尼古丁提高的烟草。通过转基因方法制造尼古丁提高的烟草与植物杂交技术相比的其它优点是，转基因工艺可以对任何商业化的烟草[烤烟、伯莱芋叶(burley)和东方型烟(oriental)]或者烟草的栽培品种(或者变种)进行，这样保持了大多数亲代烟草系在基因修饰之前的特性。角蒿(N.tabacum)品种的所希望商业化特征会在其与黄花烟草(N.rustica)杂交时受到负面影响。
图3说明在美国全部吸烟相关死亡中只有36.4％是由癌症造成的，而公众的感觉是癌症是吸烟对健康最大的有害影响。事实上，心血管疾病引起了这种死亡的42.4％，呼吸疾病引起了这种死亡的21.2％。流行病学研究显示在吸入烟的总量降低时，风险的确有实质的降低(U.S.Surgeon General，1964年、1979年和1989年)。由于不知道许多毒素中哪种造成特异的毒害效果，因此降低全部烟草烟雾释放有利于对吸烟者创造有效的PREP，而不只是降低少数致癌物质的烟雾成份。
IOM报告得出结论是“尼古丁是对于烟草产品的成功至关重要的因素之一”(第29页)。因此，将尼古丁保持在令人愉悦的水平，同时降低更多种烟草的有毒组分，将是毒害降低的另一种通用策略(IOM报告第29页)。通过降低被吸入的每支烟全部烟草烟雾的量和/或降低每日吸烟的数目，所有致癌物质和有害气体将被按照相似的百分比降低。考虑到吸烟者代偿的倾向性，达到全部烟草烟雾释放的最有效方法是降低香烟的TNR。使用TNR降低的香烟，吸烟者吸入包括焦油和一氧化碳的全部烟草烟雾的每次吞吐水平将在多种情况下被降低，而同时保持吸烟者所必需的尼古丁水平。
根据流行病学证据，风险与所吸烟的量线性相关。降低剂量的证据是低危害香烟规定的基础(Gori，2002 Coresta Congress)。“剂量响应关系”被定义为在疾病风险消退和暴露消退之间的联系(例如剂量越高，疾病发生频率越高)。“目前可以得到的数据能够对暴露到全部烟草烟雾和主要疾病之间的剂量响应关系进行估计，尽管不精确，其中主要疾病是能够被监测以进行毒害降低潜力评价的”(IOM报告第9页)。因为剂量响应关系通常存在于整个烟草烟雾，因此，能够降低对吸烟者全部烟雾释放的低TNR香烟的好处，会被公共健康调控者迅速地做出评估和认可，例如美国食品及药物管理局(FDA)。
在图2中，如果将通过FTC方法得到的15mg Marlboro浓香型国王所产生焦油与通过FTC方法得到的11mg Marlboro淡香型国王所产生焦油相比较的话，会观察到4mg焦油的降低。表面上，这可以说明吸烟者将通过变换为淡香型产品而少吸入4mg焦油。然而分别为13.64和13.75的TNR值说明，从每支烟吸入每mg尼古丁的焦油量的角度考虑，在变换后没有带来改进。由于在从浓香型改变到淡香型或者超淡香型香烟，以及从淡香型改变到超淡香型香烟时会出现代偿作用，因此，在人类吸烟行为方面，TNR值能够提供香烟品牌真实烟雾释放更精确的表示方法。
已知吸烟者的动机涉及很多因素，例如口味、感觉和行为动机，其中尼古丁的药理学功能到目前为止是最重要的。除了极端低产量香烟外，吸烟者通常设法使用任何品牌香烟中平均约1mg尼古丁(每支烟)，而不考虑基于标准的FTC吸烟机的机器产量(Gori，第3页Virtually Safe Cigarettes-Revivingan Opportunity Once Tragically Rejected，2000)。“吸烟者吸入尼古丁的最大限度是大约每支烟2mg。每支烟吞吐的平均次数为大约8次。这样，每次吞吐最多释放250微克对于满足高峰需要是足够的，尽管通常吸烟者会排出并吸入少于这个最大的释放量”(Gori，Gio，Less Hazardous Cigarettes，TobaccoReporter，第31页，2004年6月)。
在英国医学期刊的论文(BMJ，1976年第1卷，第1430～1433页)和1980年班伯利报告(Banbury Report)(#3 A Safe Cigarette，第297～310页)中，Michael Russell提倡用低焦油、中等尼古丁和低一氧化碳的香烟作为那时市场上可购买香烟的更安全的替代品。互联网上德国烟草工业研究的综述说明，科学家认为更安全的香烟应该具有更高的尼古丁比焦油比例(更低的TNR)(
Tobacco Control 2000；9：242～248，第4页)。
所希望的低危害的香烟，应该尽可能清洁和有效地释放吸烟者所希望每支烟尼古丁的水平，同时保持可以接受的口味。事实上，在低TNR香烟的许多情况下可以出现“反代偿作用”，这是由于吸烟者吸入更少的烟草烟雾，同时得到了令人满意量的尼古丁。“反代偿作用”被定义为因为尼古丁在烟草烟雾中含量的提高，而降低吸烟的强度。
低TNR香烟对不吸烟者也有好处。通过有效地将尼古丁释放给吸烟者，每日就会吸更少的烟，并且每支烟也较少的被吸掉，这会产生较少的侧流烟(从香烟点燃的末端产生，主要是在吞吐之间)以及较少的环境烟草烟雾(空气中的烟雾，由呼出的主流烟和侧流烟组成)。主流烟(全部烟草烟雾主流)是从(吸烟者的)“嘴”中或者被吸香烟的烟蒂末端(过滤嘴尖)冒出的(IOMReport第283页)。
因此，需要低TNR香烟，其能更有效的提供尼古丁的生理作用，而没有同样多的有害焦油和气体。
发明内容
本发明提供了一种香烟，其包括烟草属(Nicotiana)物种的、尼古丁提高的转基因植物或者植物部分，并且用FTC或者ISO方法测量，其焦油比尼古丁的产量比例在大约3和～大约8之间。与生产转基因植物或者植物部分的未转化亲代植物或者植物部分相比，尼古丁提高的转基因植物或者植物部分表现出增加的尼古丁，并含有和表达至少一种异源核酸，其上调尼古丁在这种转基因植物或者植物部分中的生产。与未转化的对照植物或者植物部分相比，尼古丁提高的转基因植物或者植物部分含有和表达异源DNA，其至少编码在烟草中生物合成尼古丁必需的酶的片段，转基因植物或者植物部分表现出与未转化对照植物或者植物部分相比提高水平的所述酶，以及与未转化对照植物或者植物部分相比提高的尼古丁含量。
酶可以从精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉酸转磷酸核糖酶(QPT)以及S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)中选择。植物物种可以是角蒿。
香烟可以产生焦油大约1mg和尼古丁为大约0.12mg～大约0.34mg之间，焦油大约2mg和尼古丁为大约0.25mg～大约0.68mg之间，焦油大约3mg和尼古丁为大约0.36mg～大约1.0mg之间，焦油大约4mg和尼古丁为大约0.5mg～大约1.36mg之间，焦油大约5mg和尼古丁为大约0.62mg～大约1.7mg之间，焦油大约6mg和尼古丁为大约0.75mg～大约2.0mg之间，焦油大约7mg和尼古丁为大约0.87mg～大约2.33mg之间，焦油大约8mg和尼古丁为大约1.0mg～大约2.66mg之间。本发明也包括一种香烟，其含有烟草属(Nicotiana)物种的、提高尼古丁的转基因植物或者植物部分。
本发明还包括一种制造香烟的方法，其包括提供烟草属(Nicotiana)物种的、与未转化对照植物或者植物部分相比生物碱提高的转基因植物或者植物部分，将植物与角蒿(Nicotiana tabacum)物种的植物杂交以获得子代植物，以及生产含有所述子代植物的香烟。用FTC或者ISO方法测量，该香烟可以具有大约在3和～大约8之间的焦油比尼古丁的产量比例。
本发明还包括一种制造香烟的方法，其包括提供尼古丁降低的转基因的角蒿(Nicotiana tabacum)植物或者植物部分，与未转化对照植物或者植物部分相比其具有降低的尼古丁含量，将尼古丁降低的植物与黄花烟草(Nicotianarustica)植物杂交以获得子代植物，以及生产含有所述子代植物的香烟。与生产所述转基因植物或者植物部分的角蒿(Nicotiana tabacum)植物相比，子代植物或者植物部分表现出提高的尼古丁。子代植物可以用于香烟，用FTC或者ISO方法测量，该香烟可以具有大约在3～大约8之间的焦油比尼古丁产量比例。
本发明还包括一种制造香烟的方法，其包括提供烟草属(Nicotiana)物种的、与未转化对照植物或者植物部分相比尼古丁提高的转基因植物或者植物部分，从植物或者植物部分生产再造烟草，以及生产含有所述再造烟草的香烟。用FTC或者ISO方法测量，该香烟可以具有大约在3～大约8之间的焦油比尼古丁的产量比例。
本发明还包括一种制造香烟的方法，其包括提供烟草属(Nicotiana)物种的、与未转化对照植物或者植物部分相比尼古丁提高的转基因植物或者植物部分，从植物或者植物部分生产膨胀烟草，以及生产含有所述膨胀烟草的香烟。用FTC或者ISO方法测量，该香烟可以具有大约在3～大约8之间的焦油比尼古丁的产量比例。
本发明还包括一种香烟，其包括烟草属(Nicotiana)物种的转基因植物或者植物部分，与生产转基因植物或者植物部分的未转化亲代植物或者植物部分相比表现出提高的尼古丁，以及与含有未转化亲代植物或者植物部分的对照香烟相比具有更低的焦油比尼古丁的产量比例。
本发明还包括一种制造香烟的方法，其包括提供烟草属(Nicotiana)物种的、与未转化对照植物或者植物部分相比尼古丁提高的转基因植物或者植物部分，从转基因植物或者植物部分中提取尼古丁，提供烟草属(Nicotiana)物种的植物或者植物部分，将提取的尼古丁加入到物种中以形成尼古丁提高的植物原料；生产具有尼古丁提高植物原料的香烟。尼古丁可以是尼古丁的有机酸盐。
本发明还包括一种制造香烟的方法，其包括提供烟草属(Nicotiana)物种的、与未转化对照植物或者植物部分相比尼古丁提高的转基因植物或者植物部分，从转基因植物或者植物部分中提取尼古丁，提供烟草属(Nicotiana)物种的第二植物或者植物部分，将提取的尼古丁加入到第二植物或者植物部分中以形成尼古丁提高的植物原料，生产含有尼古丁提高的植物原料的香烟，并且与含有未加入所提取尼古丁的第二植物或者植物部分的对照香烟相比具有更低的焦油比尼古丁的产量比例。
本发明还包括一种制造香烟的方法，其包括提供烟草属(Nicotiana)物种的、与未转化对照植物或者植物部分相比尼古丁降低的转基因植物或者植物部分，从转基因植物或者植物部分生产香烟烟草，将尼古丁加入到香烟烟草中，生产含有所述香烟烟草的香烟，并且烟草特有亚硝胺水平低于大约每克烟草0.5微克。尼古丁可以是尼古丁的有机酸盐或合成的尼古丁。烟草特有亚硝胺水平可以低于大约每克烟草0.05微克(50ppb)，并且烟草可以具有在大约3～大约8之间的焦油比尼古丁产量比例。
本发明还包括一种制造烟草产品的方法，其包括提供烟草属(Nicotiana)物种的转基因植物或者植物部分，其与生产所述转基因植物或者植物部分的未转化亲代植物或者植物部分相比表现出尼古丁降低，从转基因植物或者植物部分生产烟草，将尼古丁加入到烟草中，以及生产含有该烟草的产品，并且烟草特有亚硝胺水平比含有未转化亲代植物或者植物部分的对照产品相比更低。与未转化的对照植物或者植物部分相比，尼古丁降低的转基因植物或者植物部分可以含有和表达至少一种异源核酸，其下调尼古丁在转基因植物或者植物部分中的生产。尼古丁降低的转基因植物或者植物部分可以含有和表达异源DNA，其至少编码在烟草中生物合成尼古丁必需的酶的片段，转基因植物或者植物部分表现出与未转化对照植物或者植物部分相比降低水平的所述酶，以及与未转化对照植物或者植物部分相比降低的尼古丁含量。烟草特有亚硝胺水平可以低于大约每克烟草1微克(1ppm)。烟草产品的形式可以选自烟叶、烟草碎片和烟丝，并且可以从鼻烟、烟斗烟草、雪茄烟草、咀嚼烟草以及香烟烟草中选择。
本发明还包括一种制造膨胀烟草的方法，其包括提供烟草属(Nicotiana)物种的、与未转化对照植物或者植物部分相比尼古丁提高的转基因植物或者植物部分，从转基因植物或者植物部分生产烟草，和对烟草进行膨胀。
本发明还包括一种制造再造烟草的方法，其包括提供从烟草属(Nicotiana)物种的、与未转化对照植物或者植物部分相比尼古丁提高的转基因植物或者植物部分，烟草属(Nicotiana)物种的、与未转化对照植物或者植物部分相比尼古丁降低的转基因植物或者植物部分，脱蛋白质烟草纤维和冻干烟草中选择的植物原料，以及重建植物原料。
本发明还包括一种制造再造烟草的方法，其包括提供烟草属(Nicotiana)物种的、与未转化对照植物或者植物部分相比尼古丁降低的转基因植物或者植物部分，并重建转基因植物或者植物部分。植物物种可以从角蒿(Nicotianatabacum)和黄花烟草(Nicotiana rustica)中选择。再造烟草可以进一步含有重建脱蛋白质烟草纤维。本发明还包括一种香烟，其包括这样的再造烟草并含有与包括未转化亲代植物或者植物部分的对照香烟相比降低的TSNA产量。这里所使用的TSNA可以从NNN、NNK、NAT和NAB中选择，与含有未转化亲代植物或者植物部分的对照香烟相比，香烟可以具有产量降低的、从苯并[a]芘、苯酚和邻苯二酚中选择的化合物。
本发明还包括一种制造再造烟草的方法，其包括提供烟草属(Nicotiana)物种的、与未转化对照植物或者植物部分相比尼古丁提高的转基因植物或者植物部分，并重建所述转基因植物或者植物部分。该方法可以进一步包括在收获后对转基因植物或者植物部分进行冻干。
本发明还包括制造和生产用于低TNR香烟的新烟草品种的方法，以便这种香烟更利于生产消费者能够接受的产品。这样的品种包括将转基因高尼古丁特性与高还原糖背景和转基因高糖特性结合。其它用于提高低TNR香烟消费者可接受性的新品种包括将转基因高尼古丁特性与转基因高脂肪酸特性结合。这样的方法降低了低TNR香烟烟雾的pH。
本发明还包括向低TNR香烟的烟草或者填充物中添加糖、脂肪酸、柠檬酸、乳酸和苹果酸的方法，以降低这种香烟烟雾的pH以生产更多消费者可以接受的产品。
附图说明
图1是表示在1950年～1995年之间美国香烟焦油和尼古丁平均产量的图表。
图2是表示某些香烟品牌的焦油和尼古丁的产量(按照2003年)比较以及它们TNR结果的表。
图3是表示在1990年～1994年之间美国香烟相关死亡原因的圆形分析图。
图4是说明尼古丁降低的转基因植物系植物特征的表。
图5是某种烟草生物碱和TSNA通路的示意图。
图6是吡啶生物碱在烟草属(Nicotiana)中生物合成的示意图(Antisense-mediated down-regulation of putrescine N-methyltransferase activityin transgenic Nicotiana tabacum L.can lead to elevated levels of anatabine at theexpense of nicotine；Yupynn Chintapakorn和John D.Hamill；植物分子生物学53：87-105，2003)。
具体实施方式
本发明的一些方面通过限制对吸烟者的焦油释放，降低了香烟的焦油比尼古丁的产量比例(TNR)，同时提供能够维持吸烟者满意的充分量的尼古丁。结果是获得一种香烟，其可有效地为吸烟者提供令人愉悦量的尼古丁，而有较少的有害焦油和气体。当前淡香型和超淡香型的商业香烟不能有效地为吸烟者释放令人愉悦水平的尼古丁，其导致被称作代偿作用的猛烈的吸烟行为，这可能对吸烟者造成更大的伤害。这是因为这样的香烟同时以大约相同的比例降低了焦油和尼古丁。
结合不同水平的过滤和/或烟雾稀释，本发明为提高香烟填充物的尼古丁含量，提供了通过烟草植物内的遗传学方法或者通过为填充物添加尼古丁，进而允许维持香烟尼古丁对吸烟者的释放，而优选地降低香烟焦油的释放。
这里所使用的“尼古丁提高的转基因植物”意味着一种重组(或者“转基因”)烟草植物，其含有比产生转基因植物的未转基因“亲代”(或者未修饰的“对照”)植物更高的尼古丁含量。
这里所使用的“生物碱提高的转基因植物”意味着一种重组(或者“转基因”)烟草植物，其含有比产生转基因植物的未转基因“亲代”(或者未修饰的“对照”)植物更高的全部生物碱含量。
这里所使用的“尼古丁降低的转基因植物”意味着一种重组(或者“转基因”)烟草植物，其含有比生产转基因植物的未转基因“亲代”(或者未修饰的“对照”)植物少于一半、优选少于25％、更优选少于20％或者少于10％的尼古丁含量。可以理解的是，在这种用来进行本发明的转基因植物中，可以保留某些低水平残余尼古丁，与相应的未修饰的对照植物相比大约为至少1％或者5％。
这里所使用的“尼古丁”(C10H14N2)包括尼古丁的类似物(除非尼古丁指的是全部生物碱)、尼古丁的两个异构体、合成的尼古丁以及尼古丁的有机酸盐。
用于本方法的植物是烟草属(Nicotiana)的物种或烟草，其包括但不限于角蒿(Nicotiana tabacum)、黄花烟(Nicotiana rustica)、粉蓝烟草(Nicotianaglauca)、Nicotiana excelsior、本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)、Nicotianasylvestris、克力夫兰烟(Nicotiana clevelandii)以及Nicotiana attenuata。这里所使用的“烟草”意味着和包括烟草属(Nicotiana)的任何植物、品种、杂交、或者杂种。可以使用烟草的任何株系或品种。这些烟草植物被基因修饰以根据所需目的提高或者降低尼古丁含量，这在下面将详细描述。术语“植物”包括其物理和化学部分，例如植物部分、植物提取物、水解产物等。
这里所使用的本发明“低TNR香烟”或者“低焦油比尼古丁产量比例香烟”意味着这样一种香烟，其含有提高的尼古丁重组烟草植物或者植物部分，其包括但不限于来自这些植物或者植物部分的尼古丁。
1.低TNR香烟(使用尼古丁提高的转基因烟草)、新烟草品种的生产，以及可接受性更高的低TNR香烟
通常，用于进行本发明第一方面的尼古丁提高的转基因烟草植物是重组烟草植物，其含有和表达异源核苷酸，其表达上调植物中的酶(例如精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉酸转磷酸核糖酶(QPT)以及S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS))，这样提高了尼古丁在植物中的产量。在M.Conkling等的PCT申请WO98/56923(1998年12月17日公布)和M.Timko的PCT申请WO00/67558(2000年11月16日公布)中公开了适当的重组植物。通常，异源核苷酸包括至少编码需要被上调酶核酸的片断。
在该实施方式中，尼古丁提高的烟草被混合入烟草的填充物中，以得到所希望的低TNR香烟。通过结合浓香型杆，优选淡香型杆，更优选超淡香型杆，尼古丁提高烟草(其可以包括传统烟草的混合物)的香烟目前可以有效地释放吸烟者所希望的每支香烟尼古丁的量，而释放更少的焦油和有害气体。所发明的低TNR香烟也可以通过使用无过滤嘴杆来达到，因为无过滤嘴香烟的吸烟者将仍然具有提高量的尼古丁，这样在某些情况下会降低焦油和有害气体的吸入。因此，TNR降低的香烟是所发明PREP的主要目的。
一个特别的实施方式使用尼古丁提高的重组植物，其具有相对于未转化对照植物提高的喹啉酸转磷酸核糖酶(QPRTase)表达，这种重组植物包括含有外源DNA构建(construct)的重组植物细胞，该外源DNA构建含有以从5’到3’方向可在这种植物细胞中进行操作的启动子，以及编码至少植物喹啉酸转磷酸核糖酶mRNA片断的异源DNA，这种异源DNA与这种启动子可操作地相连，与未转化对照植物相比，这种植物表现出了提高的QPRTase表达和尼古丁含量。
另一个实施例可以通过尼古丁提高的重组植物进行，其具有相对于未转化对照植物具有提高的腐胺N-甲基转移酶(PMTase)表达，这种重组植物包括含有外源DNA构建的重组植物细胞，该外源DNA构建含有以从5’到3’方向可在这种植物细胞中进行操作的启动子以及编码至少植物PMT mRNA片断的异源DNA，这种异源DNA与这种启动子可操作地相连，与这种异源DNA是按照有义或者反义方向联系的；与未转化对照植物相比，这种植物表现出了提高的PMT表达和尼古丁含量。
可以以类似的方式通过上面列举的其它酶进行其它的实施方式。
上述核酸构建可以在上述构建的上游(5’-)和/或下游(3’-)含有隔离元件，例如Thompson等在美国专利NO.6,100,448和6,037,525中所描述的。另外，如上述核酸构建可以在上述构建的上游和/或下游含有基质(或者支架)附着区域，例如Thompson等在美国专利NO.5,773,695和5,773,689中所描述的。
在另一个实施方式中，所使用植物可以含有一些重组核酸，其上调一些尼古丁合成通路中的酶。这样，描述为含有至少一种重组核酸的植物可以包括含有多种这样的重组核酸。使用一个以上重组核酸的好处是，尼古丁或者其它生物碱的水平可以被提高到更高的水平(与只使用一种这样的核酸相比)和可以适应(如果希望的话)不同的所希望生物碱的比值(例如尼古丁占全部生物碱的比例)。
在另一个实施方式中，相同的植物或者细胞可以含有至少一种重组核酸，其上调尼古丁或者生物碱合成通路中的酶，同时也含有至少一种重组核酸，其下调尼古丁或者生物碱合成通路中的酶。作为实施例，如果PMT被上调，QPT被下调，尼古丁占全部生物碱的比例就会提高。这个比例优选接近于有助于防止NAT、NAB和可能其它的TSNA形成的比例。参看图5和图6。
在另一个实施例中，本发明使用尼古丁提高的重组植物，其具有相对于未转化对照植物QPRT和PMT均提高的表达，这种重组植物包括重组植物细胞，该重组植物细胞含有(i)第一外源DNA构建，其含有以从5’到3’方向可在这种植物细胞中进行操作的启动子，以及编码至少植物喹啉酸转磷酸核糖酶mRNA片断的异源DNA，这种异源DNA与这种启动子可操作地相连；和(ii)第二外源DNA构建，其含有以从5’到3’方向可在这种植物细胞中进行操作的启动子，以及编码至少植物PMT mRNA片断的异源DNA，这种异源DNA与这种启动子可操作地相连，与未转化对照植物相比，这种植物表现出了提高的QPRT和PMT表达以及尼古丁含量。这里所使用的QPT、QPRT和QPRTase是可以互换的。PMT和PMTase也是可以互换的。
可以用于进行这些实施方式的重组植物的实施例包括但不限于用编码烟草喹啉酸转磷酸核糖酶(NtQPT1)的DNA(参见，例如Conkling等的PCT申请WO 98/5556923)；编码烟草腐胺N-甲基转移酶(PMT)例如PMT1、PMT2、PMT3以及PMT4的DNA；编码烟草精氨酸脱羧酶例如ADC1和ADC2的DNA；编码烟草鸟氨酸脱羧酶(ODC)的DNA；编码烟草S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)的DNA；编码烟草NADH脱氢酶的DNA；以及编码烟草磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)的DNA转化的已知植物(其是已知并在M.Timko等的PCT申请WO 00/67558中所描述)。
美国专利No.6,423,520、6,586,661、5,260,205、5369,023、5,668,295和美国公开申请No.20030018997也描述了通过基因修饰尼古丁生物合成通路中的QPRT或者PMT改变烟草植物尼古丁含量的方法。
通过上述每种方法，被转化的尼古丁提高的烟草植物每种个体的尼古丁含量是可变的。因此，如果烟草植物系希望具有约6.2％的尼古丁含量(以干重为基础)，对于本领域技术人员，其将进行合理数目的植物基因转化以获得具有这种尼古丁含量的纯合植物。
来自含有单个基因座的初级转化子自花授精的种子将有三种不同的基因型，因为转基因(其赋予高尼古丁)按照1∶2∶1进行分离，其中25％将不携带转基因，50％是转基因的杂合体，还有25％是转基因的纯合体。杂合类种子的子代又将按照1∶2∶1进行分离。纯合级的种子对于进一步繁殖是最有用的，因为其全部子代的100％将携带转基因(如果植物是自花授精的话，其将带有两个拷贝；如果纯合转基因植物与未转基因植物进行杂交的话，其将带有一个拷贝)。如果将来自纯合子代自花授精的种子种在田里的话，在相似的气候、土壤和种植条件下，它们将含有与亲代植物非常相似的尼古丁提高的含量。
生产尼古丁提高的烟草的这种遗传实施例，与直接为所加工的烟草加入尼古丁或者尼古丁的有机酸盐相比，可以更经济地实现商业用尼古丁提高的烟草产品的生产。类似的，转基因尼古丁提高的烟草也将比加入合成的尼古丁或者尼古丁类似物要更经济。由于种植了附加用于尼古丁提取的烟草，因此节约了劳动、时间和各种资源，不必要进行提取尼古丁以及接着将这种尼古丁加入到所加工的烟草中。一旦生产了转基因植物，它们可以在内部非常有效地生产附加的所需尼古丁，而没有额外成本的增加。
目前，在包括美国的许多国家禁止将尼古丁和尼古丁的有机酸盐加入到烟草产品中(如美国专利No.4,830,028、4,836,224和5,031,646所述)。在许多国家尼古丁和尼古丁的有机酸盐不在允许用于烟草产品的添加剂的列表中。这里所使用的术语“烟草产品”包括但不限于香烟、雪茄、香烟烟草、烟斗烟草、咀嚼烟草、鼻烟、锭剂(lozenges)和任何其它尼古丁释放设备，其不是在尼古丁代替治疗中所使用的尼古丁代替产品。
上述低TNR香烟实施方式的另一个优点是，尼古丁提高的烟草比从原料中机械提取尼古丁、传输并将其在加工的过程中加入到烟草中要更安全，因为纯形式的尼古丁是高度毒性的。尼古丁难以以纯的形式维持，因为其容易被氧化。储藏纯尼古丁将增加成本和风险。
上述方法潜在的缺点可能是来自高水平生物碱所产生的提高的TSNA，其是亚硝胺的前体。这将通过降低全部烟雾(其中含有TSNA)释放来得到弥补。TSNA只是烟草烟雾中多种致癌物质中的一种。伴随低TNR香烟的适当处理方法将这种潜在缺点降低到可以接受的水平(Peele，D.M.等，Formationof Tobacco Specific Nitrosamines in Flue-Cured Tobacco CORESTA 1999AGRO-PHYTO Proceedings，苏州，中国1999)。
在全部烟雾对吸烟者(包括焦油与有害气体)的释放方面，与平均淡香型或者超淡香型传统香烟相比，如果低TNR香烟产生35％的降低，而其TSNA的产量是稍高的话，可以猜测流行病学研究将最终证明这种实施方式将具有显著降低风险的优点。
这种实施方式的低TNR香烟优选采用来自转基因角蒿(Nicotianatabacum)品种或者栽培品种的烟草原料，与缺少转基因的品种或者栽培品种相比，其具有如上所述的提高的尼古丁水平的表现型特征，并且相对于普遍商业化的品种和栽培品种所表现的糖含量值范围，被处理还原糖的含量是相当高的。烟草品种还原糖含量的优选范围是大约11％～20％，或者更优选为20％以上。这种非常高糖含量角蒿(N.tabacum)的例证是K 394、NC 2326和GL 939，其具有3年平均的、被处理的还原糖含量分别为15.7％、15.5％和15.2％(2000 Official Flue-Cured Variety Test at the University of Georgia，Tifton)。
在这一点上，术语“栽培品种”和“品种”对于定义一组物种角蒿(N.tabacum)内是同义使用的，即该物种内具有某种稳定的特征将其从典型形式以及从其它可能品种中分离出来。而具有至少一种区别性特性时，品种也可以有在品种内的个体之间大量全部变异的特征，其主要基于在后代的子代中特性的孟德尔分离。与“品种”不同的是，“系”代表一组植物，其代表通常(尽管不是唯一的)利用数代自花授粉所得到的在个体之间有较少的变异。另外，为本发明的目的，“系”被定义为完全广泛地包括一组植物，其从单个亲代植物使用组织培养技术进行植物无性繁殖。在美国专利No.4,326,358和4,381,624中描述了这种系开发新杂种的应用。
“尼古丁缓冲物”帮助维持香烟烟雾的pH。因为在香烟烟雾中，尼古丁是主要的挥发性碱，因此烟雾的pH在感官感觉中具有重要的作用。糖作为尼古丁缓冲物，其降低了由于尼古丁增加所引起的粗糙感，因此，高糖含量是有益的，无论糖是烟草植物中天然的或者在烟草加工过程中加入的，例如作为高果糖玉米浆、蔗糖、转化糖、欧亚甘草提取物、长豆角豆和提取物、可可粉和可可粉提取物。
“还原糖”是任何具有自由或者潜在自由的醛基或者酮基的糖(单糖或者多糖)。葡萄糖和果糖通过降低烟雾pH和有效地降低“自由”未质子化尼古丁的量来作为香烟烟雾中尼古丁缓冲物。还原糖平衡烟雾的气味，例如，通过改善尼古丁和其他烟草生物碱的感觉影响。通常，在烟草品种中，在相同品种内，相同植物系内在糖含量和生物碱含量之间有由种植条件所引起的逆关系。例如，在烟草土壤中氮越低，尼古丁水平越低，但糖水平越高。增加的雨水会产生更低的尼古丁水平和更高的糖水平。
低TNR香烟可能产生粗糙和刺激的烟雾，特别是对咽喉和鼻的刺激。这种粗糙的来源归于“自由”或者“挥发性”未质子化尼古丁在烟雾中的量。通常，烟雾的pH为5.4，尼古丁被100％质子化。如果烟雾的pH提高到5.4以上的话，会有更多的“自由”尼古丁出现在烟雾中，这是粗燥的原因。香烟烟雾的pH主要是由烟草填充物中糖和生物碱的含量所决定的。糖的燃烧产生了酸性副产品，其降低了pH并有助于降低粗糙。例如，含有全部烤烟烟草的香烟(其通常比如果它们同时含有烤烟和伯莱芋叶烟草时，具有更高的糖含量)具有烟雾pH为大约5.0～大约6.0，其被计算为产生0～1％的未质子化尼古丁。
更高尼古丁的烟草例如伯莱芋叶(其通常含有比烤烟烟草低的糖含量)，将通常产生具有更高烟雾pH的烟雾。美国品牌香烟(烤烟烟草与伯莱芋叶混合并可能有东方型烟草)具有烟雾pH为大约5.5～大约6.5，其被计算为产生0.3～3％的未质子化尼古丁(Morie，G.P.，1972年Fraction of protonated andunprotonated nicotine in tobacco smoke at various pH values Tob.Sci.，16，167)。这样，从TNR低于大约9的转基因高尼古丁烟草产生的香烟通常具有高于6.5的pH，并可能被认为对吸烟者是粗糙的，除非在填充物中有足够的糖或者其它尼古丁缓冲物。通过使用非常高糖的烟草或者向填充物中加入足够的糖，pH将会降低并且低TNR香烟将具有可以接受的口味。如下面所述的，这种pH的降低也可以通过提高脂肪酸在填充物中的含量来达到。
本发明的另一个实施方式提供了一种制造香烟的方法，其包括提供烟草属(Nicotiana)物种的、与未转化对照植物或者植物部分相比生物碱提高的转基因植物或者植物部分，将植物与角蒿(Nicotiana tabacum)物种的植物杂交以获得子代植物，以及生产含子代植物的香烟，用FTC或者ISO方法测量，香烟具有在大约3和大约8之间的焦油比尼古丁产量比例。这种新植物的优点是各种烟草属(Nicotiana)物种提高的多种生物碱除了尼古丁(包括单一的尼古丁比全部生物碱的比例)与角蒿(Nicotiana tabacum)的希望特性相结合。例如，在粉蓝烟草(Nicotiana glauca)中的主要生物碱是新烟碱。美国专利No.6,534,527描述粉蓝烟草(N.glauca)在满足尼古丁需要方面有作用。
本发明的另一个实施方式提供了一种制造香烟的方法，其包括提供尼古丁降低的转基因角蒿(Nicotiana tabacum)植物或者植物部分，其具有与未转化对照植物或者植物部分相比降低的尼古丁含量，将尼古丁降低的植物与黄花烟草(Nicotiana rustica)杂交以得到子代植物，以及生产含有子代植物的香烟，其中子代植物或者植物部分表现出与生产所述转基因植物或者植物部分的角蒿(Nicotiana tabacum)相比提高的尼古丁。接着，子代植物被用作生产用FTC或者ISO方法测量，具有在大约3和大约8之间焦油比尼古丁产量比例的香烟。这种新植物的优点也是可以得到单一的尼古丁比全部生物碱的比例。
根据传统的繁殖技术，如Wernsman等在2 PRINCIPLES OF CULTIVARDEVELOPMENT：CROP SPECIES(Macmillan 1997)中所描述的，从含有适当转基因的烟草材料所再生的稳定转化子被用于将高尼古丁特性介导入商业上可接受的遗传背景，这样获得了烟草的栽培品种或者品种，其将高尼古丁水平与高糖含量在一定范围内相结合，例如大约14％～大约20％，更优选大约20％～大约30％，更优选30％以上。为了这种实施方式的目的，尽管可以使用任何高糖烟草背景，但所得到栽培品种或者品种优选为烤烟型。在进行几轮杂交和选择后，所选择子代为具有高尼古丁和高糖含量。
由于烟草适于遗传研究，任何转基因都可以通过使用植物分子生物学已知的技术和方法被转入适当的烟草背景。如Miki等在METHODS IN PLANTMOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY(CRC Press 1993)中所描述的任何转染、感染、转化、自然摄取、电转化和粒子枪都可以应用于将转基因转入遗传背景。例如与本实施方式结合，赋予高糖表型的基因被转入寄主烟草植物细胞，这样产生了表达提高糖含量的植物。例如，用编码上调糖合成酶或者转录因子的基因转化烟草细胞，例如基因赋予水平提高的葡萄糖和果糖。通过下面的选择，选择了具有提高糖含量的子代植物。
作为本发明的例证，赋予高尼古丁表型的转基因可以被转入高糖烟草背景。任何编码赋予提高的尼古丁生物合成产品的基因或者部分基因都可以应用于转化。这种方面考虑的例证是编码精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉酸转磷酸核糖酶(QPT)以及S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)的基因。一旦将赋予高尼古丁表型的转基因转入高糖烟草植物，按通常的做法进行接下来的几轮选择以鉴定和选择联合分离高尼古丁和高糖含量的烟草系。尼古丁和糖的含量用标准方法进行分析。
在另一个实施方式中，赋予高尼古丁表型的转基因被转入表达提高脂肪酸合成的植物。使用已知的植物分子生物学技术，任何提供提高脂肪酸合成的基因或者部分基因都可以被应用于转化。这方面的例证是编码和/或者调解饱和脂肪酸合成的基因，例如编码硬脂酸和棕榈酸的基因。使用本领域已知技术例如PCR、Northern分析和层析分析对子代植物进行提高的脂肪酸合成分析。在对具有提高的脂肪酸合成的稳定系进行鉴定和选择后，赋予高尼古丁表型的转基因被转入提高脂肪酸合成系内。进行按照传统方法接下来的几轮选择以鉴定和选择联合分离高尼古丁和提高脂肪酸含量的烟草系。尼古丁和脂肪酸的水平用标准方法进行分析。
品种或者栽培品种被认为是特殊特性的“纯种”，如果其对于所涉及的特性是遗传纯合体的话，当品种或者栽培品种是自花传粉的话，将在子代中观察不到特性显著量的独立分离。在测量本文材料的纯种特征中，烟草繁殖领域的技术人员能够知道烟草叶的糖水平在纯系植物中有变化，因为各种农作物并没有被暴露到相同水平的阳光下。即使在同一植物中，也存在糖水平的变化。这样，较低的叶子通常被较高的叶子所遮蔽，而在一排边上的植物倾向于比在一排中间的植物接受更多的阳光。由于这些原因，糖水平通常随着茎位置从下向上沿着植物而增长。通过普通的实验，根据本发明的一个实施方式，在开发栽培品种或者品种时，普通育种师能够将这些和其它因素考虑进去的是高尼古丁水平和非常高糖含量的纯种。
在另一个实施方式中，通过向烟草填充物中加入适当量的还原糖，降低了从发明对象中所产生烟雾中提高的尼古丁的任何潜在的粗糙感。典型的，这些还原糖以高果糖玉米浆、蜜或者欧亚甘草的形式被加入到烟草外包装。典型得到的适宜结果是，烟草填充物的糖比尼古丁比例在干重的基础上为大约3.3份糖比1份尼古丁(Status update of sugar/nicotine balance technologyassessment 1992 RJ Reynolds documents，Bates512842551/2)。
然而，这个比例可以根据吸烟者口味标准进行调整，这样糖/尼古丁比例的范围在大约3～大约5之间。如前面所述的，在调整糖添加剂时，低TNR香烟烟雾的pH及其填充物还原糖的量必须被考虑到。为了这项分析，通过进行提取和气相色谱分析确定尼古丁在烟草中的含量。天然烟草糖水平通过提取和用高效液相色谱进行分析来确定。得到天然尼古丁和糖基于干重的量后，确定添加糖的量以得到所希望的比例。
在另一个实施方式中，可以使用脂肪酸作为尼古丁缓冲物。例如肉豆蔻酸和棕榈酸可以加入到烟草填充物中起尼古丁缓冲物作用。同样，在高奶油脂肪可可粉或者椰子油中发现的脂肪酸可以加入到烟草包装。另一方面，烟草植物可以被基因修饰以生产烟草叶组织中提高的脂肪酸。
可以理解的是本发明的烟草植物可以不是“转基因的”，也就是不含有来自其它生物而整合到其染色体的核酸序列，尼古丁、糖或者脂肪酸的水平通过使用特定核酸序列的靶向突变产生植物或者植物细胞而得到修饰，其中靶向突变是通过使用诱导DNA损伤或者重组的核酸(Beetham等1999；Zhu等2002；WO 03/013226)或者使用被修饰的病毒，其可以产生与这里所描述的“尼古丁提高的转基因植物”、“尼古丁降低的转基因植物”、“糖提高的转基因植物”以及脂肪酸提高的转基因植物相似的最终产物。“精确育种”方法(美国专利公开No.20040107455)可以用来产生这里所描述的“尼古丁提高的转基因植物”、“尼古丁降低的转基因植物”、“糖提高的转基因植物”以及脂肪酸提高的转基因植物，在此方法中只有从目的物种衍生而来的核酸序列或者性别兼容的物种被转入到靶植物的基因组中。
2.低TNR香烟(通过添加来自尼古丁提高的转基因植物的尼古丁)
如上所述，本发明的第二方面是一种方法，其将从尼古丁提高的转基因植物中提取的尼古丁或者含尼古丁部分，按照所希望的水平添加到传统烟草或者尼古丁降低的烟草中。
美国专利4,830,028、4,836,224和5,031,646描述了通过添加尼古丁的有机酸盐对香烟填充物所作的修饰。特别的，他们选择以这种方式添加尼古丁为了降低焦油比尼古丁产量比例。在Brown和Williamson烟草公司在美国医学联盟杂志(第274卷No.3第228页1995)的综述中描述了由美国专利3,258,015和3,356,094(Battelle)所覆盖的方式。这些专利描述了以这种方式加入尼古丁的浮质，其可以将所发明香烟的焦油比尼古丁产量比例降低到传统香烟的四分之一。
将从尼古丁提高的转基因植物得到的含尼古丁部分、尼古丁或者尼古丁的有机酸盐加入到传统的烟草或者尼古丁降低的转基因植物中，其通过喷洒或者使用任何烟草加工领域的方法和附加应用的方法，加到整个叶子上或者烟丝上，其利用(或者不利用)溶解用的丙二醇或者任何其它溶剂或者水。加入到所设计低TNR香烟尼古丁的量是下面各项的函数：(1)所使用烟草混合物中尼古丁含量和类型(美国混合烟丝烟草通常含有大约2～2.5％的尼古丁)；(2)烟杆的规格，并考虑到挥发性或者多孔性；(3)所希望的香烟的TNR；以及(4)所希望的特定焦油产量。
例如，假设香烟制造商希望制造低TNR香烟，其产生8mg焦油和与按照FTC/ISO方法所得到其浓香型品牌类型所产生的相同的1.2mg尼古丁。其浓香型品牌类型产生16mg焦油，因此，新型品牌类型TNR的目标是浓香型品牌类型的一半。同时希望使用相同的填充物，并加入尼古丁以制造低TNR香烟。
在开发产生8mg焦油和1.2mg尼古丁的产品的过程中，开发商一开始加入的尼古丁的含量是其浓香型品牌类型填充物的大约两倍。本领域技术人员可以理解的是，淡香型杆额外的通风会以稍高于尼古丁产生的速度降低焦油的产量，这样填充物中加倍的尼古丁可能会有点太高。然而，在烟草加工和香烟制造过程中，一些尼古丁可能会损失，因此，加倍的尼古丁是合理的。还必须估计到的是，在加入尼古丁后，在烟草加工之前，来自这种烟草被贮藏时间的影响。由于这些工艺的标准和方法对于每个制造商是不同的，因此可以理解的是某些试验和误差是必须的。
制造商最初可以选择通常每支香烟产生8mg焦油的淡香型杆。所希望的结果是产生8mg焦油和1.2mg尼古丁的香烟，这样去掉了多于一半的焦油，而保持与多数浓香型香烟相同的尼古丁产量。
在加入尼古丁或者尼古丁有机酸盐之后，湿度大约13％的所选择烟草量被放置于香烟制造机的储料器中。接着香烟制造机将卷烟传送到另一个机器，其将过滤嘴放置在无过滤嘴的卷烟上。如果要生产的是无过滤嘴香烟的话，可以省略这个步骤。
使用FCT/ISO方法对所制成的香烟进行检测，这样可以估计最后的结果。如果香烟产生8mg焦油和1.2mg尼古丁(TNR为6.66)，而且所有上述考虑都解决了的话，则就完成了开发。如果在集中组中，由于额外的尼古丁，香烟被评定为粗糙，则需要向填充物中加入添加剂以帮助缓解这个问题。
如果所制造香烟产生多于或者少于所希望产量，可以进行较小的调节。这包括改变香烟杆中组分的一种。某些杆组分可以通过改变过滤嘴的类型、香烟纸、滤棒、水松纸(其连接香烟杆到过滤嘴)、通风孔及其相结合的相应变化而得到修饰。例如，如果香烟产生9mg焦油和1.3mg尼古丁的话，过滤和/或者稀释会被稍稍提高以按照相似的比例降低焦油和尼古丁产量。这通常通过制定通风孔的大小和数量以及过滤嘴滤棒的多孔性来完成，以达到所希望的产量。如果焦油产量达到目标，而尼古丁产量比所希望的高或者低的话，则可以相应地调整所加入尼古丁的水平。
大部分品牌的香烟填充物中有从大约10％(在高级品牌中)～大约30％(在打折品牌中)的再造烟草，尽管其不是填充物中的必要部分。本发明的另一个实施方式是将尼古丁加入到香烟填充物的再造部分，为给香烟提供更低的TNR。对加入到低TNR香烟中尼古丁量的调节是另外可以变化的，其可以由制造商来完成。因此，填充物的尼古丁含量是烟草中尼古丁含量加填充物中任何再造烟草尼古丁含量的函数，其包括尼古丁提高的再造烟草和/或尼古丁降低的再造烟草或者两者都有。可以使用这三者的任何结合。
来自Philip Morris Document网站的1975年的文章(Bates 2056140416标题为Low Delivery Cigarettes and Increased Nicotine/Tar Ratios，A Replication)描述了具有提高的尼古丁/焦油比例香烟的口味评价的结果。发现具有10mg焦油释放和尼古丁/焦油比例为0.09(等价的TNR为11)在可接受性和强度方面与TNR为16.66(当时为18mg焦油、1.03mg尼古丁，尼古丁/焦油比例为0.06)的Marlboro浓香型对照是相同的。
本领域技术人员可以理解的是，从尼古丁提高的再造烟草中提取用于上述实施方式的尼古丁，比从传统烟草中提取要更经济和有效，因为只要培养和处理较少的植物就可以获得充分量的尼古丁。
3.烟草产品中有害的烟草特有亚硝胺的降低
在烟草工业中，已经知道烟草特有亚硝胺(TSNA)通常被称作烟草的致癌物质，其主要在处理烟草的过程中形成。尽管烟草中还有其它的TSNA，通常被认为毒性最大的四种如下：N’-亚硝基去甲基烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N’-亚硝基新烟草碱(NAT)和N’-亚硝基新烟碱(NAB)。在处理烟草中的TSNA是由次要生物碱前体(Wiemik等，1995，Effect of air-curing on the chemical composition of tobacco，Recent Advances in Tobacco Science，21，39-80)形成的。这里所使用的烟草特有亚硝胺或者TSNA是从NNN、NNK、NAT和NAB中选择的。
TSNA主要是在溶剂提取后用化学发光检测通过气相色谱进行分析的(Charles Risner等，Quantification of Tobacco Specific Nitrosamines inTobacco，Tobacco Science，38(1-6)，1994年)。用于分离和分析的可以选择的方法是使用超临界流体提取和气相色谱/质谱检测(Siqing Song等，Supercritical fluid extraction and GC/MS for the analysis of tobacco-specificnitrosamines in cigarettes，Analytical Chemistry，1999年第71卷1303-1308)。最近，已经提出了使用醋酸铵提取，接着用使用质谱(MS/MS)的液相色谱的快速方法(Karl Wagner等，The rapid and quantitative analysis of tobaccospecific nitrosamines in whole tobacco and mainstream smoke using LC/MS/MSwith positive ion electrospray，第55届烟草科学研究会议2001)。
亚硝胺的水平通常与尼古丁含量正相关，因为生物碱通常与尼古丁含量成正比出现。通常，对于大多数角蒿(Nicotiana tabacum)的品种，尼古丁占植物总生物碱含量的大约90％。因此，本发明的另一个实施方式是使用尼古丁降低的转基因烟草并以自由碱或者与有机酸结合的形式加入所提取的尼古丁、从有机酸衍生的尼古丁盐(衍生于传统的或者基因修饰的尼古丁提高烟草)或者合成的尼古丁，以制造实质没有亚硝胺或者次要生物碱的香烟或者其它烟草产品，而其产生了传统量的尼古丁。该方法使用基因修饰的尼古丁减低烟草，其通过加入只是足够的尼古丁以提供按照FTC/ISO方法与传统香烟相同的产量，例如每支香烟0.05～1.5mg。
用基因方法改变烟草中生物碱的含量，已经通过改变喹啉酸转磷酸核糖酶(QPT)和腐胺N-甲基转移酶(PMT)来进行。图4显示如何在伯莱芋叶(burley)品种中通过降低QPTase降低包括去甲基烟碱的生物碱以得到低生物碱转基因品种，其被命名为Vector 21～41。该烟草品种含有非常低水平的TSNA。Vector 21～41由植物品种保护局保藏，其植物品种保藏号为200100039。
“生产转化的根系，其与对照相比含有被显著降低的PMT活性，伴随有尼古丁含量的降低”(Yupynn Chintapakorn and John D.Hamill，植物分子生物学53：87-105，2003 2003 Kluwer Academic Publishers.87)。次要生物碱之一的去甲基烟碱与烟草质量和香烟口味负相关(Natural Tobacco Flavor，Roberts，D.L.，
RecentAdvances in Tobacco Science，14，第49～81页，1988年)。所生产的带有尼古丁作为唯一生物碱的香烟产品单独在这个基础上是高度可接受的。
用于进行本发明的尼古丁降低的烟草植物通常是重组烟草植物，其含有和表达异源核苷酸，该核苷酸的表达下调植物中的酶例如喹啉酸转磷酸核糖酶(QPTase)、腐胺N-甲基转移酶(PMTase)、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、S-腺苷甲硫氨酸合成酶，NADH脱氢酶、或磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)，进而降低了植物中尼古丁的产量。在M.Conkling等的PCT申请WO98/56923(1998年12月17日公布)和M.Timko的PCT申请WO00/67558(2000年11月16日公布)中公开了合适的重组植物。通常，异源核苷酸包括至少编码被下调酶核酸的片断，在有义方向或反义方向。
优选的是，尼古丁降低的烟草也含有水平减低的烟草特有亚硝胺(例如至少90、95或者99重量％或者更多)，这是与没有发现相应尼古丁降低的植物相比。
本发明的另一个实施方式使用尼古丁降低的重组植物，其具有相对于未转化对照植物降低的喹啉酸转磷酸核糖酶(QPRTase)表达，这种重组植物包括含有外源DNA构建的重组植物细胞，该外源DNA构建含有以从5’到3’方向可在这种植物细胞中进行操作的启动子，以及编码至少植物喹啉酸转磷酸核糖酶mRNA片断的异源DNA，这种异源DNA与这种启动子可操作地相连，其中异源DNA是按照有义或者反义方向的，与未转化对照植物相比，这种植物表现出了降低的QPRTase表达和降低尼古丁含量。
本发明的一个实施方式使用尼古丁降低的重组植物，其具有相对于未转化对照植物降低的腐胺N-甲基转移酶(PMTase)表达，这种重组植物包括含有外源DNA构建的重组植物细胞，该外源DNA构建含有以从5’到3’方向可在这种植物细胞中进行操作的启动子，以及编码至少植物PMT mRNA片断的异源DNA，这种异源DNA与这种启动子可操作地相连，其中异源DNA是按照有义或者反义方向的，与未转化对照植物相比，这种植物表现出了降低的PMT表达和降低尼古丁含量。可以以类似的方式通过上面列举的其它酶进行其它的实施方式。
上述核酸构建可以在上述构建的上游(5’-)和/或下游(3’-)含有隔离元件，例如Thompson等在美国专利NO.6,100,448和6,037,525中所描述的。另外，如上述核酸构建可以包括在上述构建的上游和/或下游含有基质(或者支架)附着区域，例如Thompson等在美国专利NO.5,773,695和5,773,689中所描述的。
在本发明另一个实施方式中，所使用植物可以含有一些重组核酸，其下调一些尼古丁合成通路中的酶。使用一个以上重组核酸的好处是尼古丁水平可以被降低到更高的水平(比只使用一种这样的核酸)，可以到零，和可以适应(如果希望的话)不同的所希望生物碱的比值(例如尼古丁占全部生物碱的比例)。
这样，本发明的另一个实施例使用尼古丁降低的重组植物，其具有相对于未转化对照植物QPRTase和PMTase均降低的表达，这种重组植物包括重组植物细胞，该重组植物细胞含有(i)第一外源DNA构建，其含有以从5’到3’方向可在这种植物细胞中进行操作的启动子，以及编码至少植物喹啉酸转磷酸核糖酶mRNA片断的异源DNA，这种异源DNA与这种启动子可操作地相连；和(ii)第二外源DNA构建，其含有以从5’到3’方向可在这种植物细胞中进行操作的启动子，以及编码至少植物PMT mRNA片断的异源DNA，这种异源DNA与这种启动子可操作地相连并且这种异源DNA是以有义或者反义方向，与未转化对照植物相比，这种植物表现出了降低的PMT表达和尼古丁含量。可以理解的是，这里描述了有义和反义下调，也可以使用其它的技术，例如使用反转重复，其产生诱导基因沉默的dsRNA，核酶或者干扰互补mRNA。也可以理解的是可以使用能够降低一个以上酶活性的单个DNA构建。例如，可以使用一种DNA构建来降低QPRTase和PMTase。
可以用于进行本发明的核酸序列的实施例包括但不限于已知编码烟草喹啉酸转磷酸核糖酶(NtQPT1)的DNA(参见，例如Conkling等的PCT申请WO 98/5556923)；编码烟草腐胺N-甲基转移酶例如PMT1、PMT2、PMT3以及PMT4的DNA；编码烟草精氨酸脱羧酶例如ADC1和ADC2的DNA；编码烟草鸟氨酸脱羧酶(ODC)的DNA；编码烟草S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)的DNA；编码烟草NADH脱氢酶的DNA；以及编码烟草磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)的DNA(它们是已知的并在M.Timko等的PCT申请WO 00/67558所描述)。
允许编码具有上述酶活性的蛋白表达的其它DNA序列与上述DNA或者与编码上面提供酶蛋白的其他DNA序列杂交的条件，可以按照通常方法来确定。例如，这种序列的杂交可以在严格性降低或甚至在严格的条件下进行(例如条件为清洗严格为0.3M NaCl、0.03M柠檬酸钠、0.1％SDS在60℃甚至70℃下，DNA在标准原位杂交试验中编码上述给定的蛋白质，参见J.Sambrook等的分子克隆：实验室手册(1989年第二版，冷泉港实验室))。通常，这种序列与上述给出的序列或者编码上述给出蛋白质的DNA序列有至少65％的相似性、75％的相似性、80％的相似性、85％的相似性、90％的相似性，或甚至95％的相似性或者更高。(对序列相似性的确定是对两条排好的序列的最大匹配进行的，在匹配最大化中允许在两条被匹配的序列中任何一条存在缺口。优选长度为10或者更少的缺口，更优选长度为5或者更少的缺口，更加优选长度为2或者更少的缺口。)
本发明方法中可以选择使用异源序列，以便能够产生与编码酶序列的整个信息或者其部分互补的RNA产物。序列可以与天然信使RNA的任何邻近序列互补，也就是其可以和邻近5’-末端或者加帽位点、加帽位点的上游、在加帽位点和起始密码子之间邻近的内源mRNA序列互补，并可以覆盖全部或者一部分非编码区，可以连接非编码区和编码区，可以和全部或者部分编码区互补，和编码区3’-末端互补或者和mRNA的3’-未翻译区互补。适当的反义序列可以从至少大约12、14或者15～大约15、25或者35个核苷酸，至少大约50个核苷酸，至少大约75个核苷酸，至少大约100个核苷酸，至少大约125个核苷酸，至少大约150个核苷酸，至少大约200个核苷酸，或者更多。另外，序列可以在其3’或5’末端被延伸或者缩短(例如通过加入1～4或者8个额外的核酸残基)。反义产品可以与天然出现的靶RNA的编码区或者非编码区(或者二者)互补。特别的反义序列和反义序列的长度将随着所希望抑制程度、反义序列的稳定性等而变化。使用本领域可以获得的技术及其所提供的信息，本领域技术人员能够在选择恰当的酶反义序列中得到指导。
如上所述的，本发明可以用达到尼古丁产量有义共抑制的植物进行。进行本发明的有义DNA具有足够的长度，以便当在植物细胞中表达时，如这里所述的，能够抑制植物酶在植物细胞中的原始表达。这种有义DNA可以本质上是编码酶的全基因组或者互补DNA，或者是其通常为至少15个核苷酸长度的片段。确定引起细胞中原始基因表达抑制的有义DNA长度的方法，对本领域技术人员来说是可以得到的。本发明也可以使用含有编码双链RNA的DNA的植物，其中RNA包括反义序列和有义序列互补，其如果表达的话，可以抑制或者沉默含有该序列的内源基因。适当的互补区可以是从至少大约20至25个核苷酸，并可被至少大约5个核苷酸分开。
在本发明另一个实施方式中，烟草属(Nicotiana)植物细胞被用含有编码酶RNA分子(例如“核酶”)的DNA片段的DNA构建所转化，酶RNA分子直接针对于(例如剪切)编码这里所述植物酶的DNA的mRNA转录子。核酶含有基质结合域，其结合到靶mRNA可及区域，以及催化RNA检测的结合域，其阻止翻译和产生蛋白质。结合域可以含有和靶mRNA序列互补的反义序列；催化基元(catalytic motif)可以是锤头状基元(hammerhead motif)或者是其他类型的基元，例如发夹式基元(hairpin motif)。RNA靶内的核酶剪切位点可以首先被扫描靶分子寻找核酶剪切位点(例如GUA、GUU或者GUC序列)而得到鉴别。一旦被鉴别，相应于含剪切位点靶基因区域的15、20、30或者更多核糖核苷酸的短RNA序列可以被评估为预测的结构特征。使用本领域已知的核酸酶保护试验，通过检测其与互补寡居核苷酸的杂交，候选靶的适宜性也可以得到评估。编码酶RNA分子的DNA可以根据已知技术来生产。参见例如T.Cech等的美国专利No.4,987,071；Donson等的美国专利No.5,589,367；Torrence等的美国专利No.5,583,032；Joyce的美国专利No.5,580,967；Wagner等的美国专利No.5,591,601；美国专利No.5,622,854。这种酶RNA分子在植物细胞中的产生和酶蛋白生产的破坏与反义RNA分子生产本质上相同的方式降低了植物细胞中酶的活性：也就是通过破坏产生酶的细胞中mRNA的翻译。术语“核酶”在这里是用来表示含RNA的核酸，其行使酶的功能(例如核酸内切酶)，其与“酶RNA分子”是可以相互交换使用的。
在本发明的另一个实施方式中，尼古丁产量的下调可以通过采用干扰互补mRNA，利用mRNA翻译抑制来达到，如美国专利No.5,272,065所述。
为了生产比未转化对照烟草植物相比具有下降的酶水平和较低尼古丁水平的烟草植物，烟草细胞可以被外源转录单元转化，其含有部分酶核酸序列，全长酶核酸序列，以有义或者反义方向具有适当的可操作连接的调控序列或者编码上述核酶的序列。适当的调控序列包括转录起始序列(“启动子”)其在被转化植物中可以操作，以及聚腺苷酸化(poly(A))/转录终止序列。标准技术例如限制性图谱、DNA印迹法(Southern blot)杂交和核酸序列分析，用于鉴定携带反义方向可操作的连接到调控序列的酶序列的克隆。接着从成功转化的细胞中再生烟草植物。最优选的是所使用反义与内源序列互补，然而，可以允许外源和内源的少量突变。优选的是具有充分序列相似性的反义DNA序列，其能够在下面描述的严格条件下结合到细胞内要被调节的内源序列。对于本领域技术人员，用于生产重组烟草植物的详细技术是已知的，其在如上所述的M.Conkling等的PCT申请WO98/56923(1998年12月17日公布)和M.Timko的PCT申请WO00/67558(2000年11月16日公布)中有更详细的描述。
如美国专利No.6,586,661所述，尼古丁降低的烟草品种Vector伯莱芋叶21～41是通过对伯莱芋叶21LA进行基因修饰而开发的。伯莱芋叶21LA是伯莱芋叶21的品种，其与伯莱芋叶21相比，具有实质降低水平的尼古丁。(例如伯莱芋叶21LA具有伯莱芋叶21的8％的尼古丁水平，参见Legg等1971年Can.J.Venet.Cytol.13：287～91；Legg等1969等J.Hered.60：213-17)。Vector伯莱芋叶21～41与亲代品种伯莱芋叶21LA最相似的。通常，Vector伯莱芋叶21～41与伯莱芋叶21LA在除了生物碱含量外(例如尼古丁和去甲基烟碱)的所有分析的特征方面是相似的。Vector伯莱芋叶21～41可以通过其实质降低的尼古丁、去甲基烟碱和总生物碱含量与亲代伯莱芋叶21LA区别开。
如图4所示的，Vector 21～41中总生物碱浓度降低到亲代伯莱芋叶21LA的大约10％。与伯莱芋叶21LA相比，在Vector伯莱芋叶21～41中，尼古丁和去甲基烟碱的浓度分别小于6.7％和32％。QPRTase水平与尼古丁和包括反过来又分别产生NAB和NAT的新烟碱和新烟草碱的其它生物碱正相关。参见图5。
在本发明的另一个实施方式中，向尼古丁降低的烟草(与传统烟草相比)加入相同量的尼古丁或者尼古丁的有机酸盐和尼古丁类似物，以形成具有降低TNSA的烟草产品。对于烟草加工领域的技术人员，可以使用传统的方法包括使用烟草添加剂和调味剂将尼古丁加入到这种烟草产品中。
本发明的另一个实施方式是向尼古丁降低的烟草(与传统烟草相比)加入更高量的尼古丁以制造低TNR香烟。这种方法的主要优点是当处理烟草时，在烟草上实质上没有形成亚硝胺，因为缺少尼古丁或者次要的生物碱。通过这种方法产生的香烟不仅具有低TNR香烟的优点，如果QPRT被降低或者去除的话，也实质上不含有亚硝胺或者次要生物碱。本发明的另一个实施方式是使用尼古丁降低的烟草，接着加入尼古丁，这样在下面的产品中有传统量的尼古丁：雪茄填充物或包装纸、香烟用手工卷制烟草、烟斗烟、咀嚼烟草、鼻烟、再造烟草和所有其他类型的无烟烟草。优点是这些产品都具有相当低的TSNA和/或次要烟草生物碱。
4.使用尼古丁提高的转基因烟草生产改良的膨胀或者充气烟草
已经出版了超过150份涉及烟草膨胀的专利(例如美国专利号3,991,772)。膨胀工艺为烟草提供了更大的填充能力，因此在香烟中使用了更小量的烟草。使用膨胀烟草的优点是降低焦油释放。膨胀烟草在制造低焦油释放香烟方面是特别有用的。据报道，宣称是最低焦油和尼古丁释放的Carlton香烟是由非常大含量的膨胀烟草制成的。然而，膨胀烟草的使用也会导致降低的尼古丁释放，这可能导致代偿作用。
膨胀的尼古丁提高转基因烟草的主要好处是降低了焦油释放而大体保持了尼古丁释放，其结果是一种焦油释放降低和TNR降低的香烟。例如，混合来自转基因烟草提高的尼古丁的烟草混合物可以释放1.6mg焦油和2.0mg尼古丁。提供烟草填充物100％膨胀的烟草，这是未膨胀烟草的大约一半的重量，但其在香烟中占有相同的体积。在没有过滤嘴通风的情况下，该香烟烟雾的释放为大约8mg焦油和1.0mg尼古丁，TNR为8。
在本发明中可以使用任何本领域已知的膨胀方法。目前最常用的方法使用了液态二氧化碳(美国专利No.4,340,073和4,336,814)。也已经使用了液态丙烷来制造商业香烟，其主要是在欧洲(美国专利No.4,531,529)。液态丙烷比液态二氧化碳有优势，因为可以在200％的范围内有更高的膨胀率。在压力下，液态二氧化碳(或者液态丙烷)透入烟草细胞结构。如果对烟草进行快速加热，二氧化碳(或者液态丙烷)会将细胞膨胀到其予处理的大小。
本发明的另一个实施方式使用尼古丁提高的转基因烟草，优选的烟草是从高糖和/或高脂肪酸背景中制造的，并从这样的转基因烟草中制造了膨胀的烟草以生产低TNR香烟。
另一个实施方式是使用脱蛋白质烟草，优选从尼古丁降低的转基因烟草中提取，并从这种脱蛋白质烟草生产膨胀烟草。生产含有脱蛋白质的膨胀烟草和尼古丁提高转基因烟草的香烟。
5.再造烟草的生产
本发明的另一个实施方式是生产低危害的烟草产品，其可以包括低TNR香烟，通过使用在上面1～3中的发明、脱蛋白质烟草纤维、以及冷冻干燥的烟草与再造烟草结合和联合来生产。
在二十世纪50年代期间开始了生产再造烟草(“Recon”)片。描述这种工艺的美国专利包括No.3,499,454、4,182,349、4,962,774以及6,761,175。传统上Recon是从烟草茎和/或较小叶微粒生产的，其近似于典型的造纸工艺。再造烟草焦油和尼古丁的产量比来自相同质量整烟叶的要低。这种工艺包括加工要制成Recon的各种烟草部分。在生产Recon片后，将其切成与从整烟叶制成的碎烟草的大小和形状。接着将这种被切的recon与碎烟草混合并准备进行制造香烟。
香烟可以被制成全部recon、无recon或者其任意组合。多数最主要的品牌在填充物中含有至少10％的Recon。
用于recon的尼古丁提高转基因烟草的主要好处是，这种烟草会降低香烟的焦油产量，而大体保持尼古丁的产量。
本发明的另一个实施方式是加入尼古丁或者尼古丁盐，来生产recon，其是从尼古丁降低的转基因烟草或者任何非烟草植物制成，包括但不限于草药混合物，以便当燃烧这种再造片时，产生较少传统香烟所产生的烟草特有亚硝胺和其它致癌物质，仍具有使人满意的尼古丁量。
本发明的另一个实施方式是使用尼古丁提高的转基因烟草，优选这种烟草是从高糖和/或高脂肪酸背景制成的，并从这种转基因烟草制成recon以生产低TNR香烟。另一个实施方式在加工过程中提高了recon的糖含量、脂肪酸含量或者二者均提高。
由烟草纤维生产recon
在美国专利No.4,289,147和No.4,347,324中描述了从烟草中脱去蛋白质进而制造“脱蛋白质烟草纤维”的过程。在脱蛋白质后，烟草纤维是主要的副产品。脱蛋白质烟草中保留的纤维能够以任何百分比作为再造烟草的成份。从脱蛋白质烟草制成的香烟具有与传统香烟不同的口味。然而，可以加入适当量的添加剂，包括调味剂和尼古丁，以帮助提高这种口味的不足。
含有脱蛋白质烟草的香烟具有比传统香烟显著的优点，因为其可以产生水平降低的致癌物质和有害的燃烧产物。“烤烟片中71％的蛋白质含量降低会导致热解浓缩物的TA98艾姆斯氏试验突变率中81％的降低”(Clapp，W.L.等，Reduction in Ames Salmonella mutagenicity of cigarette mainstream smokecondensate by tobacco protein removal
Mutation Research第446卷第167～174页，1999年)。该领域以前的研究已经确定烟叶蛋白质可能是烟草烟雾浓缩物中诱变剂的主要前体(Matsumoto等，Mutagenicities of the pyrolysis ofpeptides and proteins
Mutation Research第56卷第281～288页1978年)。
从基因修饰尼古丁降低的烟草(例如Vector 21～41)中提取烟草纤维能够从烟草中有效地去除实质上所有的致癌TSNA，因为亚硝胺需要相对高含量的尼古丁和其它的生物碱以在可检测的水平上形成。参见图4。
因此，有优势的是在低危害的香烟或者其它烟草产品中利用尼古丁降低的烟草以进一步降低亚硝胺。在工艺中，尼古丁可以被省去或者以后再加入，其也可以是尼古丁盐的形式。
多环芳香烃(PAH)是从氨基酸、糖、石蜡、萜烯、植物甾醇类、纤维素和烟草其它组分的高温热解中形成的。大部分这些组分在烟草纤维中被大大地降低，其有效地降低了PAH的形成。被认为是香烟烟雾中致癌辅助因素的邻苯二酚和苯酚也将会被降低，因为在烟草纤维中有低水平的可溶糖。
在吸只含有烟草纤维的香烟时，与用整烟叶制成的香烟相比，有害气相化合物例如氰化氢、一氧化氮和一氧化碳也会被降低。氰化氢是在燃烧蛋白质和叶绿素时形成的。一氧化氮是在燃烧可溶蛋白、叶绿素、硝酸盐和生物碱时形成的。这些组分在脱蛋白质烟草中不以有效量存在。烟草纤维含有大约85％的较少淀粉和纤维质材料，这样降低了一氧化碳的主要热解前体。
本发明的另一个实施方式是生产再造烟草，其含有从传统烟草衍生的被提取的烟草纤维、尼古丁降低的转基因烟草或者尼古丁提高的转基因烟草。
由冻干烟草生产Recon
如果避开了烟草处理工艺，实质上没有TSNA会出现在传统的烟草产品中，例如香烟、雪茄填充物或者包装纸、香烟用手工卷制烟草、烟斗烟、咀嚼咽、鼻烟、再造烟草和其它用冻干烟草制成的制备物实质上不含TSNA，因为去除了传统的处理工艺。
本发明的另一个实施方式是通过使用冻干法加工新收获的烟草来实质上去除TSNA。这通过利用位于临近烟草农场的冻干设备来加工新收获的烟草而完成的。以这种方法所加工的烟草可能以有植物间距的传统的方式生长，或者以生物质方式(biomass setting)生长。除了降低与处理工艺相关成本的经济上的优点外，烟草目前可以生物质方式生长，其每英亩可以创造几十万磅的新烟草。
通过以生物质方式培养烟草并立即冻干以制造香烟、手工卷制烟草、烟斗烟、雪茄填充物或者包装纸、咀嚼烟、鼻烟和其它版本的无烟烟草，不仅通过免除将每种植物从温室转到田间的过程，而且还通过免去传统的收获和处理烟草，从而减少了劳动力。同时，为这个目的所需的农田也大大地减少。生长在生物质中1英亩烟草的产量与大约100英亩以传统方式生长的烟草相等。
“烟草生物质”是通过直接播种一英亩的土地，其中在田地的每个几英尺内有大量的烟草籽。与用传统的间隙种植烟草不同，当以生物质的方式种植烟草时，单个植物不再能够被区分开。一英亩的烟草生物质具有连续、密集和绿色地毯的外观，美国专利申请No.20020197688公开了这种方法。
冻干方式从新收获烟草生物质的重量中除去了大部分的水(～80％)。得到冻干烟草(“FDT”)。FDT被容易地研磨成细颗粒，其适合被加工成再造烟草片(recon)。这种recon可以被切和制成任何形式的烟草产品，例如香烟的填充物、手工卷制烟草、烟斗烟、雪茄填充物或者包装纸、咀嚼烟、鼻烟和其它形式的无烟烟草。可以在recon工艺中加入调味剂和添加剂，包括糖。
这种recon可以从100％FDT或者以任何消费者优选的比例制成。冻干工艺可能对这种烟草产品的口味有负面影响。因此，FDT还可以以任何百分比与传统磨碎的被处理烟草混合，以便混合物能够被制成再造烟草。可选择的，FDT可以以任何百分比与任何形式传统烟草混合，有益于制造香烟、手工卷制烟草、烟斗烟、雪茄填充物或者包装纸、咀嚼烟、鼻烟和其它版本的无烟烟草，以满足物质市场的需要。
本发明的另一个实施方式是如上所述使用基因修饰的尼古丁降低烟草以降低TSNA，这样形成了这种香烟、手工卷制烟草、烟斗烟、雪茄填充物或者包装纸、咀嚼烟、鼻烟和其它版本的无烟烟草不致瘾和无任何亚硝胺的附加优点。
本发明的另一个实施方式是将尼古丁以释放所需生理反应的量加回到FDT中，以用于香烟、雪茄填充物或者包装纸、香烟用手工卷制烟草、烟斗烟、咀嚼烟、鼻烟和其它版本的无烟烟草，以便其实质不含TSNA。从绿叶得到烟草纤维所生产的香烟将具有进一步降低的TSNA，因为其在处理的烟草中被大量发现。
在本发明的另一个实施方式中，黄花烟草(Nicotiana rustica)和/或尼古丁提高的转基因角蒿(Nicotiana tabacum)在收获后被冻干并加入到recon中。好处是为低TNR香烟保持了高生物碱含量，以及节省了烟草处理步骤。同时没有出现与高生物碱烟草相联系的TSNA的提高。
Claims (148)
1.一种香烟，其包括：
烟草属(Nicotiana)物种的、尼古丁提高的转基因植物或者植物部分，其中所述植物或者植物部分表达至少一种异源核酸，其上调尼古丁在这种转基因植物或者植物部分中的生产；和
用FTC或者ISO方法测量，焦油比尼古丁的产量比例在大约3和大约8之间。
2.根据权利要求1所述的香烟，其中与生产所述转基因植物或者植物部分的未转化亲代植物或者植物部分相比，所述尼古丁提高的转基因植物或者植物部分表现出提高的尼古丁。
3.根据权利要求1所述的香烟，其中与未转化对照植物或者植物部分相比，所述尼古丁提高的转基因植物或者植物部分含有和表达异源DNA，其至少编码在烟草中生物合成尼古丁必需的酶的片段，所述转基因植物或者植物部分表现出与未转化对照植物或者植物部分相比提高水平的所述酶，以及与未转化对照植物或者植物部分相比提高的尼古丁含量。
4.根据权利要求3所述的香烟，其中所述酶是从精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉酸转磷酸核糖酶(QPT)以及S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)中选择的。
5.根据权利要求1所述的香烟，其中所述的植物物种是角蒿(Nicotianatabacum)。
6.根据权利要求5所述的香烟，其中所述产量为焦油大约1mg，尼古丁为大约0.12mg和大约0.34mg之间。
7.根据权利要求5所述的香烟，其中所述产量为焦油大约2mg，尼古丁为大约0.25mg和大约0.68mg之间。
8.根据权利要求5所述的香烟，其中所述产量为焦油大约3mg，尼古丁为大约0.36mg和大约1.0mg之间。
9.根据权利要求5所述的香烟，其中所述产量为焦油大约4mg，尼古丁为大约0.5mg和大约1.36mg之间。
10.根据权利要求5所述的香烟，其中所述产量为焦油大约5mg，尼古丁为大约0.62mg和大约1.70mg之间。
11.根据权利要求5所述的香烟，其中所述产量为焦油大约6mg，尼古丁为大约0.75mg和大约2.0mg之间。
12.根据权利要求5所述的香烟，其中所述产量为焦油大约7mg，尼古丁为大约0.87mg和大约2.33mg之间。
13.根据权利要求5所述的香烟，其中所述产量为焦油大约8mg，尼古丁为大约1.0mg和大约2.66mg之间。
14.根据权利要求1所述的香烟，其中所述产量比例大于大约3而小于大约5。
15.一种香烟，其包括烟草属(Nicotiana)物种的、尼古丁提高的转基因植物或者植物部分，其中所述植物或者植物部分表达至少一种异源核酸，其上调尼古丁在所述转基因植物或者植物部分中的生产。
16.根据权利要求15所述的香烟，其中与生产所述转基因植物或者植物部分的未转化亲代植物或者植物部分相比，所述尼古丁提高的转基因植物或者植物部分表现出提高的尼古丁。
17.根据权利要求15所述的香烟，其中与未转化对照植物或者植物部分相比，所述尼古丁提高的转基因植物或者植物部分含有和表达异源DNA，其至少编码在烟草中生物合成尼古丁必需的酶的片段，所述转基因植物表现出与未转化对照植物或者植物部分相比提高水平的所述酶，以及与未转化对照植物或者植物部分相比提高的尼古丁含量。
18.根据权利要求17所述的香烟，其中所述酶是从精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉酸转磷酸核糖酶(QPT)以及S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)中选择的。
19.根据权利要求15所述的香烟，其中所述的植物物种是角蒿(Nicotianatabacum)。
20.一种制造香烟的方法，其包括：
提供烟草属(Nicotiana)物种的、与未转化对照植物或者植物部分相比生物碱提高的转基因植物或者植物部分；
将所述植物与角蒿(Nicotiana tabacum)物种的植物杂交以生产子代植物，其中所述子代植物具有尼古丁提高的表型；和
生产含有所述子代植物的香烟，并且用FTC或者ISO方法测量，香烟具有焦油比尼古丁的产量比例在大约3和大约8之间。
21.权利要求20的香烟。
22.根据权利要求21所述的香烟，其中所述转基因植物物种是角蒿(Nicotiana tabacum)。
23.一种制造香烟的方法，其包括：
提供烟草属(Nicotiana)物种的、与未转化对照植物或者植物部分相比尼古丁减少的转基因植物或者植物部分；
将所述尼古丁降低的植物与角蒿(Nicotiana tabacum)物种的植物杂交以获得子代转基因植物或者植物部分；和
生产含有所述子代植物或者植物部分香烟。
24.根据权利要求23所述的方法，其中与所述尼古丁减少的植物或者植物部分相比，所述子代植物或者植物部分含有提高的尼古丁。
25.根据权利要求23所述的方法，其中与所述角蒿(Nicotiana tabacum)植物物种相比，所述子代植物或者植物部分含有降低的尼古丁。
26.权利要求23的香烟。
27.根据权利要求26所述的香烟，并且用FTC或者ISO方法测量，具有焦油比尼古丁的产量比例在大约3和大约8之间。
28.一种制造香烟的方法，其包括：
提供烟草属(Nicotiana)物种的、与未转化对照植物或者植物部分相比尼古丁提高的转基因植物或者植物部分，其中所述植物或者植物部分表达至少一种异源核酸，其上调尼古丁在所述转基因植物或者植物部分中的生产；
从所述植物或者植物部分生产再造烟草；和
生产含有所述再造烟草的香烟。
29.权利要求28的香烟。
30.根据权利要求29所述的香烟，其中与生产所述转基因植物或者植物部分的未转化亲代植物或者植物部分相比，所述尼古丁提高的转基因植物或者植物部分表现出提高的尼古丁。
31.根据权利要求29所述的香烟，其中与未转化对照植物或者植物部分相比，所述尼古丁提高的转基因植物或者植物部分含有和表达异源DNA，其至少编码在烟草中生物合成尼古丁必需的酶的片段，所述转基因植物或者植物部分表现出与未转化对照植物或者植物部分相比提高水平的所述酶，以及与未转化对照植物或者植物部分相比提高的尼古丁含量。
32.根据权利要求31所述的香烟，其中所述酶是从精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉酸转磷酸核糖酶(QPT)以及S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)中选择的。
33.根据权利要求29所述的香烟，并且用FTC或者ISO方法测量，具有焦油比尼古丁的产量比例在大约3和大约8之间。
34.一种制造香烟的方法，其包括：
提供烟草属(Nicotiana)物种的、与未转化对照植物或者植物部分相比尼古丁提高的转基因植物或者植物部分，其中所述植物或者植物部分表达至少一种异源核酸，其上调尼古丁在所述转基因植物或者植物部分中的生产；
从所述植物或者植物部分生产膨胀烟草；和
生产含有所述膨胀烟草的香烟。
35.权利要求34的香烟。
36.根据权利要求35所述的香烟，其中与生产所述转基因植物或者植物部分的未转化亲代植物或者植物部分相比，所述尼古丁提高的转基因植物或者植物部分表现出提高的尼古丁。
37.根据权利要求35所述的香烟，其中与未转化对照植物或者植物部分相比，所述尼古丁提高的转基因植物或者植物部分含有和表达异源DNA，其至少编码在烟草中生物合成尼古丁必需的酶的片段，所述转基因植物或者植物部分表现出与未转化对照植物或者植物部分相比提高水平的所述酶，以及与未转化对照植物或者植物部分相比提高的尼古丁含量。
38.根据权利要求37所述的香烟，其中所述酶是从精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉酸转磷酸核糖酶(QPT)以及S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)中选择的。
39.一种香烟，其包括：
烟草属(Nicotiana)物种的转基因植物或者植物部分，其与生产所述转基因植物或者植物部分的未转化亲代植物或者植物部分相比表现出提高的尼古丁，其中所述植物或者植物部分表达至少一种异源核酸，其上调尼古丁在这种转基因植物或者植物部分中的生产；和
与含有所述未转化亲代植物或者植物部分的对照香烟相比，具有更低的焦油比尼古丁的产量比例。
40.根据权利要求39所述的香烟，其中与所述的未转化对照植物或者植物部分相比，所述的尼古丁提高的转基因植物或者植物部分含有和表达异源DNA，其至少编码在烟草中合成尼古丁必需的酶的片段，所述转基因植物或者植物部分表现出与所述未转化对照植物或者植物部分相比提高水平的所述酶，以及与未转化对照植物或者植物部分相比提高的尼古丁含量。
41.根据权利要求40所述的香烟，其中所述酶是从精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉酸转磷酸核糖酶(QPT)以及S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)中选择的。
42.根据权利要求39所述的香烟，其中所述的植物物种是角蒿(Nicotianatabacum)。
43.根据权利要求39所述的香烟，其中所述产量比例大于大约3而小于大约5。
44.一种制造香烟的方法，其包括：
提供烟草属(Nicotiana)物种的、与未转化对照植物或者植物部分相比尼古丁提高的转基因植物或者植物部分，其中所述植物或者植物部分表达至少一种异源核酸，其上调尼古丁在所述转基因植物或者植物部分中的生产；
从所述转基因植物或者植物部分中提取尼古丁；
提供烟草属(Nicotiana)物种的植物或者植物部分；
将所述提取的尼古丁加入到所述物种中以形成尼古丁提高的植物原料；
生产含有所述尼古丁提高的植物原料的香烟。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述尼古丁是尼古丁的有机酸盐。
46.权利要求44的香烟。
47.根据权利要求46所述的香烟，其中与生产所述转基因植物或者植物部分的未转化亲代植物或者植物部分相比，所述尼古丁提高的转基因植物或者植物部分表现出提高的尼古丁。
48.根据权利要求46所述的香烟，其中与未转化对照植物或者植物部分相比，所述尼古丁提高的转基因植物或者植物部分含有和表达异源DNA，其至少编码在烟草中生物合成尼古丁必需的酶的片段，所述转基因植物或者植物部分表现出与未转化对照植物或者植物部分相比提高水平的所述酶，以及与未转化对照植物或者植物部分相比提高的尼古丁含量。
49.根据权利要求48所述的香烟，其中所述酶是从精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉酸转磷酸核糖酶(QPT)以及S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)中选择的。
50.根据权利要求46所述的香烟，其中所述的植物物种是角蒿(Nicotianatabacum)。
51.根据权利要求46所述的香烟，并且用FTC或者ISO方法测量，具有焦油比尼古丁的产量比例在大约3和大约8之间。
52.根据权利要求51所述的香烟，其中所述产量为焦油大约1mg，尼古丁为大约0.12mg和大约0.34mg之间。
53.根据权利要求51所述的香烟，其中所述产量为焦油大约2mg，尼古丁为大约0.25mg和大约0.68mg之间。
54.根据权利要求51所述的香烟，其中所述产量为焦油大约3mg，尼古丁为大约0.36mg和大约1.0mg之间。
55.根据权利要求51所述的香烟，其中所述产量为焦油大约4mg，尼古丁为大约0.5mg和大约1.36mg之间。
56.根据权利要求51所述的香烟，其中所述产量为焦油大约5mg，尼古丁为大约0.62mg和大约1.70mg之间。
57.根据权利要求51所述的香烟，其中所述产量为焦油大约6mg，尼古丁为大约0.75mg和大约2.0mg之间。
58.根据权利要求51所述的香烟，其中所述产量为焦油大约7mg，尼古丁为大约0.87mg和大约2.33mg之间。
59.根据权利要求51所述的香烟，其中所述产量为焦油大约8mg，尼古丁为大约1.0mg和大约2.66mg之间。
60.根据权利要求1所述的香烟，其中所述产量比例大于大约3而小于大约5。
61.一种制造香烟的方法，其包括：
提供烟草属(Nicotiana)物种的、与未转化对照植物或者植物部分相比尼古丁提高的转基因植物或者植物部分，其中所述植物或者植物部分表达至少一种异源核酸，其上调尼古丁在所述转基因植物或者植物部分中的生产；
从所述转基因植物或者植物部分中提取尼古丁；
提供烟草属(Nicotiana)物种的第二植物或者植物部分；
将所述提取的尼古丁加入到所述第二植物或者植物部分中以形成尼古丁提高的植物原料；
生产含有所述尼古丁提高的植物原料的香烟，并且其具有与含有所述未加入所述所提取尼古丁的第二植物或者植物部分的对照香烟相比更低的焦油比尼古丁的产量比例。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述尼古丁是尼古丁的有机酸盐。
63.权利要求61的香烟。
64.根据权利要求63所述的香烟，其中与生产所述转基因植物或者植物部分的未转化亲代植物或者植物部分相比，所述尼古丁提高的转基因植物或者植物部分表现出提高的尼古丁。
65.根据权利要求63所述的香烟，其中与未转化对照植物或者植物部分相比，所述尼古丁提高的转基因植物或者植物部分含有和表达异源DNA，其至少编码在烟草中生物合成尼古丁必需的酶的片段，所述转基因植物或者植物部分表现出与未转化对照植物或者植物部分相比提高水平的所述酶，以及与未转化对照植物或者植物部分相比提高的尼古丁含量。
66.根据权利要求65所述的香烟，其中所述酶是从精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉酸转磷酸核糖酶(QPT)以及S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)中选择的。
67.根据权利要求63所述的香烟，其中所述的植物物种是角蒿(Nicotianatabacum)。
68.一种制造香烟的方法，其包括：
提供烟草属(Nicotiana)物种的、与未转化对照植物或者植物部分相比尼古丁减少的转基因植物或者植物部分，其中所述植物或者植物部分表达至少一种异源核酸，其下调尼古丁在所述转基因植物或者植物部分中的生产；
从所述转基因植物或者植物部分生产香烟烟草；
将尼古丁加入到所述香烟烟草中；和
生产含有所述香烟烟草的香烟，并且其具有烟草特有亚硝胺水平低于大约每克烟草0.5毫克。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述尼古丁是尼古丁的有机酸盐、尼古丁类似物或者合成的尼古丁。
70.权利要求68的香烟。
71.根据权利要求70所述的香烟，其中与生产所述转基因植物或者植物部分的未转化亲代植物或者植物部分相比，所述尼古丁降低的转基因植物或者植物部分表现出降低的尼古丁。
72.根据权利要求70所述的香烟，其中所述尼古丁降低的转基因植物或者植物部分含有和表达异源DNA，其至少编码在烟草中生物合成尼古丁必需的酶的片段，所述转基因植物或者植物部分表现出与未转化对照植物或者植物部分相比降低水平的所述酶，以及与未转化对照植物或者植物部分相比降低的尼古丁含量。
73.根据权利要求72所述的香烟，其中所述酶是从精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉酸转磷酸核糖酶(QPT)以及S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)中选择的。
74.根据权利要求70所述的香烟，其中所述的植物物种是角蒿(Nicotianatabacum)。
75.根据权利要求70所述的香烟，其中所述烟草特有亚硝胺水平低于大约每克烟草0.05微克(50ppb)。
76.根据权利要求70所述的香烟，并且其具有焦油比尼古丁的产量比例在大约3和大约8之间。
77.一种制造烟草产品的方法，其包括：
提供烟草属(Nicotiana)物种的转基因植物或者植物部分，其与生产所述转基因植物或者植物部分的未转化亲代植物或者植物部分相比表现出尼古丁减少，其中所述植物或者植物部分表达至少一种异源核酸，其下调尼古丁在所述转基因植物或者植物部分中的生产；
从所述转基因植物或者植物部分生产烟草；
将尼古丁加入到所述烟草中；和
生产含有所述烟草的香烟，并且与含有所述未转化亲代植物或者植物部分的对照产品相比，其具有更低的烟草特有亚硝胺水平。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述尼古丁是尼古丁的有机酸盐或者合成的尼古丁。
79.权利要求77的烟草产品。
80.根据权利要求79所述的烟草产品，其中所述尼古丁降低的转基因植物或者植物部分含有和表达异源DNA，其至少编码在烟草中生物合成尼古丁必需的酶的片段，所述转基因植物或者植物部分表现出与未转化对照植物或者植物部分相比降低水平的所述酶，以及与未转化对照植物或者植物部分相比提高的尼古丁含量。
81.根据权利要求80所述的烟草产品，其中所述酶是从精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉酸转磷酸核糖酶(QPT)以及S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)中选择的。
82.根据权利要求79所述的烟草产品，其中所述的植物物种是角蒿(Nicotiana tabacum)。
83.根据权利要求79所述的烟草产品，其中所述烟草特有亚硝胺水平低于大约每克烟草1微克(1ppm)。
84.根据权利要求79所述的烟草产品，其中所述烟草产品的形式是以从烟草叶、烟草碎片和烟丝中选择的。
85根据权利要求79所述的烟草产品，其中所述烟草产品是从鼻烟、烟斗烟草、雪茄烟草、咀嚼烟草以及香烟烟草中选择的。
86.-种制造膨胀烟草的方法，其包括：
提供烟草属(Nicotiana)物种的、与未转化对照植物或者植物部分相比尼古丁提高的转基因植物或者植物部分，其中所述植物或者植物部分表达至少一种异源核酸，其上调尼古丁在所述转基因植物或者植物部分中的生产；
从所述转基因植物或者植物部分生产烟草；和
对所述烟草进行膨胀。
87.权利要求86的膨胀烟草。
88.根据权利要求87所述的膨胀烟草，其中与生产所述转基因植物或者植物部分的未转化亲代植物或者植物部分相比，所述尼古丁提高的转基因植物或者植物部分表现出提高的尼古丁。
89.根据权利要求87所述的膨胀烟草，其中与未转化对照植物或者植物部分相比，所述尼古丁提高的转基因植物或者植物部分含有和表达异源DNA，其至少编码在烟草中生物合成尼古丁必需的酶的片段，所述转基因植物或者植物部分表现出与未转化对照植物或者植物部分相比提高水平的所述酶，以及与未转化对照植物或者植物部分相比提高的尼古丁含量。
90.根据权利要求89所述的膨胀烟草，其中所述酶是从精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉酸转磷酸核糖酶(QPT)以及S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)中选择的。
91.根据权利要求87所述的膨胀烟草，其中所述的植物物种是角蒿(Nicotiana tabacum)。
92.一种制造再造烟草的方法，其包括：
提供植物原料，其从(a)烟草属(Nicotiana)物种的、与未转化对照植物或者植物部分相比尼古丁提高的转基因植物或者植物部分，其中所述植物或者植物部分表达至少一种异源核酸，其上调尼古丁在所述转基因植物或者植物部分中和所述香烟中的生产，(b)烟草属(Nicotiana)物种的、与未转化对照植物或者植物部分相比尼古丁降低的转基因植物或者植物部分，其中所述植物或者植物部分表达至少一种异源核酸，其下调尼古丁在所述转基因植物或者植物部分中的生产、(c)脱蛋白质烟草纤维和(d)冻干烟草中选择；和
重建所述植物原料。
93.权利要求92所述的再造烟草。
94.一种制造再造烟草的方法，其包括：
提供烟草属(Nicotiana)物种的、与未转化对照植物或者植物部分相比尼古丁降低的转基因植物或者植物部分，其中所述植物或者植物部分表达至少一种异源核酸，其下调尼古丁在所述转基因植物或者植物部分中的生产；和
重建所述转基以植物或者植物部分。
95.权利要求94所述的再造烟草。
96.根据权利要求95所述的再造烟草，其中与生产所述转基因植物或者植物部分的未转化亲代植物或者植物部分相比，所述尼古丁降低的转基因植物或者植物部分表现出降低的尼古丁。
97.根据权利要求95所述的再造烟草，其中所述尼古丁降低的转基因植物或者植物部分含有和表达异源DNA，其至少编码在烟草中生物合成尼古丁必需的酶的片段，所述转基因植物或者植物部分表现出与未转化对照植物或者植物部分相比降低水平的所述酶，以及与未转化对照植物或者植物部分相比降低的尼古丁含量。
98.根据权利要求97所述的再造烟草，其中所述酶是从精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉酸转磷酸核糖酶(QPT)以及S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)中选择的。
99.根据权利要求95所述的再造烟草，其中所述的植物物种是从角蒿(Nicotiana tabacum)和黄花烟草(Nicotiana rustica)中选择的。
100.根据权利要求95所述的再造烟草，其进一步含有重建脱蛋白质烟草纤维。
101.一种香烟，其含有权利要求95所述的再造烟草，并且其具有与含有所述未转化亲代植物或者植物部分的对照香烟相比降低的烟草特有亚硝胺(TSNA)产量。
102.根据权利要求101所述的香烟，其中所述TSNA是从N’-亚硝基去甲基烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N’-亚硝基新烟草碱(NAT)和N’-亚硝基新烟碱(NAB)选择的。
103.根据权利要求101所述的香烟，其中与含有所述未转化亲代植物或者植物部分的对照香烟相比，所述香烟具有产量降低的从苯并[a]芘、苯酚和邻苯二酚中选择的化合物。
104.一种制造再造烟草的方法，其包括：
提供烟草属(Nicotiana)物种的、与未转化对照植物或者植物部分相比尼古丁提高的转基因植物或者植物部分，其中所述植物或者植物部分表达至少一种异源核酸，其上调尼古丁在所述转基因植物或者植物部分中的生产；和
重建所述植物或者植物部分。
105.权利要求104所述的再造烟草。
106.根据权利要求105所述的再造烟草，其中与生产所述转基因植物或者植物部分的未转化亲代植物或者植物部分相比，所述尼古丁提高的转基因植物或者植物部分表现出提高的尼古丁。
107.根据权利要求105所述的再造烟草，其中与未转化对照植物或者植物部分相比，所述尼古丁提高的转基因植物或者植物部分含有和表达异源DNA，其至少编码在烟草中生物合成尼古丁必需的酶的片段，所述转基因植物表现出与未转化对照植物或者植物部分相比提高水平的所述酶，以及与未转化对照植物或者植物部分相比提高的尼古丁含量。
108.根据权利要求107所述的再造烟草，其中所述酶是从精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉酸转磷酸核糖酶(QPT)以及S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)中选择的。
109.根据权利要求105所述的再造烟草，其中所述的植物物种是角蒿(Nicotiana tabacum)。
110.根据权利要求104所述的方法，并进一步包括在收获后对所述转基因植物或者植物部分进行冻干。
111.一种烟草品种，其特征是高尼古丁特性和高处理的还原糖含量，其中所述特性是通过转基因赋予的。
112.根据权利要求111所述的烟草品种，其中所述品种是用于所述高尼古丁特性和所述糖含量中至少一个的纯种。
113.根据权利要求111所述的烟草品种，其中所述糖含量在大约14％和大约30％之间。
114.一种烟草品种，其特征是高尼古丁特性和高脂肪酸含量，其中所述特性是通过转基因赋予的。
115.根据权利要求114所述的烟草品种，其中所述品种是用于所述高尼古丁特性和所述脂肪酸含量中至少一个的纯种。
116.一种用于提高植物内尼古丁和处理的还原糖含量的方法，其包括：
用赋予尼古丁提高表型的转基因对具有提高了处理的还原糖含量的植物进行转化；
从所述转化的植物再生子代植物；和
选择具有提高了尼古丁和处理的还原糖含量的子代植物。
117.一种用于提高植物内尼古丁的方法，其包括：
用赋予尼古丁提高表型的转基因对具有提高了脂肪酸合成的植物进行转化；
从所述转化的植物再生子代植物；和
选择具有提高了尼古丁和脂肪酸水平的子代植物。
118.一种烟草品种，其特征是高尼古丁特性和处理的还原糖含量为至少15％，其中所述特性是通过转基因赋予的。
119.根据权利要求118所述的烟草品种，其中所述品种是用于所述特性和所述处理的还原糖含量中至少一个的纯种。
120.根据权利要求111所述的烟草品种，其中所述品种具有大于3.5％的总生物碱含量。
121.一种烟草品种，其特征是大于3.3％的高尼古丁含量和高处理的还原糖特性，其中所述特性是通过转基因赋予的。
122.根据权利要求121所述的烟草品种，其中所述品种是用于所述糖特性和所述尼古丁含量中至少一个的纯种。
123.根据权利要求121所述的烟草品种，其中所述品种的所述处理的还原糖含量大于15％。
124.一种香烟，其包括：
烟草属(Nicotiana)物种的、尼古丁提高的转基因植物或者植物部分；
用FTC或者ISO方法测量，焦油比尼古丁的产量比例在大约3和大约8之间；和
填充物，其具有大于大约3.5的糖比尼古丁比例。
125.根据权利要求124所述的香烟，其中与生产所述转基因植物或者植物部分的未转化亲代植物或者植物部分相比，所述尼古丁提高的转基因植物或者植物部分表现出提高的尼古丁。
126.根据权利要求124所述的香烟，其中所述尼古丁提高的转基因植物或者植物部分含有和表达异源核酸，其上调尼古丁在这种转基因植物或者植物部分中的生产。
127.根据权利要求124所述的香烟，其中与未转化对照植物或者植物部分相比，所述尼古丁提高的转基因植物或者植物部分含有和表达异源DNA，其至少编码在烟草中生物合成尼古丁必需的酶的片段，所述转基因植物或者植物部分表现出与未转化对照植物或者植物部分相比提高水平的所述酶，以及与未转化对照植物或者植物部分相比提高的尼古丁含量。
128.根据权利要求127所述的香烟，其中所述酶是从精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉酸转磷酸核糖酶(QPT)以及S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)中选择的。
129.一种香烟，其包括：
烟草属(Nicotiana)物种的尼古丁提高转基因植物或者植物部分；
用FTC或者ISO方法测量，焦油比尼古丁的产量比例在大约3和大约8之间；和
香烟烟雾，其具有大于大约6的pH。
130.根据权利要求129所述的香烟，其中与生产所述转基因植物或者植物部分的未转化亲代植物或者植物部分相比，所述尼古丁提高的转基因植物或者植物部分表现出提高的尼古丁。
131.根据权利要求130所述的香烟，其中所述尼古丁提高的转基因植物或者植物部分含有和表达异源核酸，其上调尼古丁在这种转基因植物或者植物部分中的生产。
132.根据权利要求129所述的香烟，其中与未转化对照植物或者植物部分相比，所述尼古丁提高的转基因植物或者植物部分含有和表达异源DNA，其至少编码在烟草中生物合成尼古丁必需的酶的片段，所述转基因植物或者植物部分表现出与未转化对照植物或者植物部分相比提高水平的所述酶，以及与未转化对照植物或者植物部分相比提高的尼古丁含量。
133.根据权利要求132所述的香烟，其中所述酶是从精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉酸转磷酸核糖酶(QPT)以及S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)中选择的。
134.一种香烟，其包括：
烟草属(Nicotiana)物种的、尼古丁提高的转基因植物或者植物部分；
用FTC或者ISO方法测量，焦油比尼古丁的产量比例在大约3和大约8之间；
香烟烟雾，其具有大于大约6的pH；和
填充物，其具有大于大约3.5的糖比尼古丁比例。
135.一种制造具有第一生物碱量或者相对量提高的植物或者植物细胞培养的方法，其包括：
通过将编码QPT或者PMT的核酸导入植物细胞，以提高从喹啉酸转磷酸核糖酶(QPT)和腐胺N-甲基转移酶(PMT)中选择的第一酶的表达；
利用将核酸导入第二植物细胞中，通过提高或者降低，改变至少一种参与第二生物碱生物合成或者所述第二生物碱代谢或者其前体的附加酶的表达；和
生产含有所述第一细胞和所述第二细胞的植物或者植物细胞培养，其中与所述第二生物碱相比所述第一生物碱的量或者所述第一生物碱的相对量在所述植物或者植物细胞培养中要高于从未修饰植物细胞或者只是所述第一酶的表达被提高的植物细胞衍生而来的植物或者植物细胞培养。
136.权利要求135的方法，其中所述第一生物碱和所述第二生物碱是从尼古丁-柯替宁、去甲基尼古丁、米喔斯明、烟碱烯、新烟碱、去氢新烟碱、尼古丁-n-氧化物、N-甲基去氢新烟碱、N-甲基新烟碱、假氧尼古丁、2，3-邻联吡啶中选择的。
137.权利要求135的方法，其中所述附加酶是从精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉酸转磷酸核糖酶(QPT)以及S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)中选择的。
138.权利要求135的方法，其中所述第一生物碱是尼古丁，所述第一酶是PMT，所述附加酶是减少的QPT以及第二生物碱是新烟碱。
139.根据权利要求135所述的方法，其中所述第一生物碱是尼古丁，所述第一酶是PMT，所述附加酶是减少的QPT以及第二生物碱是新烟碱。
140.根据权利要求135所述的方法，其中所述第一生物碱是尼古丁，所述第一酶是PMT，所述附加酶是减少的QPT以及所述第二生物碱是去甲烟碱。
141.根据权利要求138、139或者140所述的烟草植物。
142.根据权利要求141所述的烟草，并与未被修饰的烟草原代植物相比含有降低的TSNA。
143.一种香烟，其含有权利要求142的烟草。
144.一种香烟，其含有：
烟草属(Nicotiana)物种的、尼古丁提高的转基因植物或者植物部分，其中作为将合成或者重组核酸导入所述植物或者植物部分或者原代植物内的结果，尼古丁在所述植物或者植物部分的产量被上调；和
用FTC或者ISO方法测量，焦油比尼古丁的产量比例在大约3和大约8之间。
145.根据权利要求144所述的香烟，其中与生产所述转基因植物或者植物部分的未转化亲代植物或者植物部分相比，所述尼古丁提高的转基因植物或者植物部分表现出提高的尼古丁。
146.根据权利要求144所述的香烟，其中与未转化对照植物或者植物部分相比，所述尼古丁提高的转基因植物或者植物部分含有和表达异源DNA，其至少编码在烟草中生物合成尼古丁必需的酶的片段，所述转基因植物或者植物部分表现出与未转化对照植物或者植物部分相比提高水平的所述酶，以及与未转化对照植物或者植物部分相比提高的尼古丁含量。
147.根据权利要求146所述的香烟，其中所述酶是从精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMTase)、喹啉酸转磷酸核糖酶(QPTase)以及S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)中选择的。
148.一种制造膨胀烟草的方法，其包括：
提供脱蛋白质烟草；
将所述烟草进行膨胀；和
生产含有所述烟草的香烟。
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